骨形成促進剤
【課題】安価且つ安全で効果の高い骨形成促進剤を提供すること。
【解決手段】本発明の骨形成促進剤は、ホスファチジン酸を有効成分として含有する。例えば、大豆、菜種、米等の植物素材由来、イカや魚などの水産物由来、卵黄などの動物素材由来のリン脂質を含有する天然レシチンをホスホリパーゼＤなどの酵素により酵素処理して調製したホスファチジン酸を有効成分としていることから、日常的に摂取可能で副作用がなく、飲食物に含ませることも可能である。
【解決手段】本発明の骨形成促進剤は、ホスファチジン酸を有効成分として含有する。例えば、大豆、菜種、米等の植物素材由来、イカや魚などの水産物由来、卵黄などの動物素材由来のリン脂質を含有する天然レシチンをホスホリパーゼＤなどの酵素により酵素処理して調製したホスファチジン酸を有効成分としていることから、日常的に摂取可能で副作用がなく、飲食物に含ませることも可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化社会が進むにつれて、骨粗鬆症、骨折、腰痛などの骨疾患が急増している。骨組織には、骨芽細胞および破骨細胞が存在し、健康な骨は、骨芽細胞による骨の形成と破骨細胞による骨の再吸収とのバランスが保たれている。骨疾患は、このような骨の形成と骨の再吸収とのバランスが崩れることによって引き起こされる。現在、骨疾患を治療するために、エストロゲン類、ビタミンＤ３などの薬剤が使用されている。しかし、これらの薬剤には副作用のおそれがある。
【０００３】
骨疾患を予防するためには、カルシウム塩のサプリメント、牛乳、小魚などのようなカルシウムを多く含む食品などを、日常的に摂取する必要がある。しかし、これらのサプリメント、食品などは、摂取しても速やかに体内に吸収されにくいため、カルシウムの吸収量には限界がある。
【０００４】
例えば、乳清成分タンパク質およびそのペプチド画分が、骨の形成促進および骨の吸収抑制作用を有し、その作用によって骨が強化されることが開示されている（特許文献１〜４）。コラーゲンまたはゼラチンから得られるトリペプチドを有効成分とする骨の強化または密度向上剤（特許文献５）が報告されている。
【０００５】
タンパク質以外の成分を含有する骨形成促進剤などとしては、キノコから単離された（２２Ｅ，２４Ｒ）−エルゴスタ−７，２２−ジエン−３β，５α，６β−トリオールで表される骨形成促進剤（特許文献６）、食用キノコから抽出されるエストロゲン様活性物質を含む骨粗鬆症の予防食品および治療薬（特許文献７）、動物の血漿抽出物を含有する骨形成促進および骨吸収抑制剤（特許文献８）、およびα−オキシ脂肪酸およびスフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とする骨形成促進剤（特許文献９）などが開示されている。
【０００６】
しかし、これらの骨形成促進剤は、副作用のおそれや天然物などから有効成分を単離して調製される為製造コストが高くなるという問題点があった。
【０００７】
他方、安価で大量に製造し得、副作用の心配もない骨形成促進剤として、リゾホスファチジルエタノールアミンなどのリゾレシチンを有効成分とするものが開示されている（特許文献１０）。
【０００８】
ところで、ホスファチジン酸（ＰＡという場合がある）は最も基本的なグリセロリン脂質として古くから研究の対象とされてきた。各種の生体組織からの脂質抽出物中に、代謝中間体或いは前駆体としてわずかながら広く分布している。ＰＡは、脂質性シグナル因子としての機能を持っており、種々のタンパク質と相互作用することが知られている（非特許文献１）。最近では、m―ＴＯＲ（mammalia target of rapamycin）と呼ばれるタンパク質がＰＡによって直接的に活性化されることが報告され注目を集めている（非特許文献２）。他にもＰＡにはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化して毛髪再生を促進する作用（特許文献１１）、腫瘍細胞の膜流動性を向上させ多剤耐性を一変させる作用（特許文献１２）が知られているが、ＰＡが骨形成促進作用を持つことは全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第２８０２４３６号公報
【特許文献２】特許第３０９２８７４号公報
【特許文献３】特許第３６０４１５９号公報
【特許文献４】特許第３０７３４３９号公報
【特許文献５】特開２００２−２５５８４７号公報
【特許文献６】特開２００２−２８４６８９号公報
【特許文献７】特開２００４−２７７４１４号公報
【特許文献８】特開２００５−１０４９０９号公報
【特許文献９】特開２００４−２３１６１６号公報
【特許文献１０】特開２００７−１３７８０４号公報
【特許文献１１】特開２００６−７６９６７号公報
【特許文献１２】特開２００６−１４３７４４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】FEBS Lett. , 531, 65-8, 2002
【非特許文献２】Science, 294, 1942-45, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、副作用の心配がなく、安価に大量に製造し得る、効果の高い骨形成促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ホスファチジン酸に骨形成促進効果をあることを見出し本発明に到達した。
【００１３】
すなわち本発明は、ホスファチジン酸を有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤を要旨とするものである。
【００１４】
また、本発明の第二は、前記した骨形成促進剤を含むことを特徴とする飲食品を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ホスファチジン酸を有効成分とする骨形成促進剤及びそれらを配合した飲食品が提供される。この骨形成促進剤は、日常的に摂取可能で生体親和性に優れ、副作用がなく、そして大量にかつ安価に製造し得る。本発明の骨形成促進剤及びこれを含む飲食品は、日常的に摂取することができるので、骨疾患の予防効果および治療効果が期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
骨の形成は、次のような過程によって行われる。まず、骨芽細胞前駆細胞が、破骨細胞によって形成された骨吸収窩上で活発に増殖する。次いで、増殖した骨芽細胞前駆細胞が、骨芽細胞に分化する。このとき、骨芽細胞の増殖・分化のマーカーの１つであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）が発現して、このＡＬＰの活性が上昇する。次いで、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシンなどの細胞外骨基質タンパク質が合成され、骨基質にハイドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウムが沈着し石灰化が進行し、骨芽細胞中のカルシウムの沈着量が増加する。次いで、骨芽細胞は、周囲の骨基質に埋め込まれて骨細胞となり、造骨活動は停止する。
【００１８】
骨を健康に保つためには、骨を強くする、すなわち上述のように骨の形成を促進させる必要がある。あるいは、骨吸収の抑制、すなわち破骨細胞前駆細胞の増殖抑制、破骨細胞への分化の抑制、成熟破骨細胞の機能の抑制などによっても、骨を健康に保つことができる。
【００１９】
本発明の骨形成促進剤は、必須成分としてホスファチジン酸を単独又は２つ以上組み合わせたものを含有する。本発明に用いられるホスファチジン酸は本発明の効果を損なうものでない限りいかなるものを用いてもよい。例えば、大豆、菜種、米、落花生、トウモロコシ、胡麻、綿実、オリーブ、紅花、ヒマワリ、パーム、パーム核、その他穀物類、種実類、果菜類、葉菜類、茎菜類、根菜類、花菜類等の植物素材由来、イカや魚などの水産物由来、卵黄などの動物素材由来、酵母、カビ、キノコなどの菌類由来や細菌類由来のホスファチジン酸、リン脂質を含有する素材（抽出物なども含む）や各種レシチンをホスホリパーゼなど酵素処理して調製したホスファチジン酸、更には化学合成品や酵素合成品を用いることも可能である。
【００２０】
例えば、ホスファチジン酸はリン脂質を含有する天然レシチンと酵素との反応によって得られる。リン脂質を含有する天然レシチンとしては、例えば、大豆、菜種、米、落花生、トウモロコシ、胡麻、綿実、オリーブ、紅花、ヒマワリ、パーム、パーム核、その他穀物類、種実類、果菜類、葉菜類、茎菜類、根菜類、花菜類等の植物素材由来、イカや魚などの水産物由来、卵黄などの動物素材由来のレシチン、酵母、カビ、キノコなどの菌類や真菌類由来が挙げられるが、リン脂質を含む素材であれば特に限定されない。酵素としては、各種起源のホスホリパーゼＤが用いられる。酵素反応は、例えば、リン脂質を含有する天然レシチンとＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をトリス緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、カルシウムイオン存在下、ＰＬＤを添加して３７℃で撹拌して行う。
【００２１】
ホスホリパーゼＤは、細胞膜の主要構成成分であるホスファチジルコリンを加水分解し、ホスファチジン酸とコリンを産生するリン脂質加水分解酵素である。ホスホリパーゼＤは植物を始め、藻類、哺乳類、粘菌、細菌など生物に広範囲に分布するが、いずれのものを用いても良い。酵素反応条件は使用する酵素の性質に応じて、当業者により適宜決定され得る。
【００２２】
本発明に用いられるホスファチジン酸を構成する脂肪酸は少なくとも一つ以上が不飽和脂肪酸であることが望ましく、その不飽和脂肪酸の不飽和度が１以上で炭素数が４以上であることがより望ましい。より具体的にはブテン酸（Ｃ４：１、例えばクロトン酸、イソクロトン酸など）、ペンテン酸（Ｃ５：１）、ヘキセン酸（Ｃ６：１）、ヘプテン酸（Ｃ７：１）、オクテン酸（Ｃ８：１）、ノネン酸（Ｃ９：１）、デセン酸（Ｃ１０：１）、ウンデセン酸（Ｃ１１：１）、ドデセン酸（Ｃ１２：１、例えばラウロレイン酸など）、トリデセン酸（Ｃ１３：１）、テトラデセン酸（Ｃ１４：１、例えばミリストレイン酸、ミリステライジン酸など）、ペンタデセン酸（Ｃ１５：１）、ヘキサデセン酸（Ｃ１６：１、例えばパルミトレイン酸、パルミテライジン酸など）、ヘプタデセン酸（Ｃ１７：１）、オクタデセン酸（Ｃ１８：１、例えばペトロセリン酸、ペトロセライジン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸など）、ノナデセン酸（Ｃ１９：１）、エイコセン酸（Ｃ２０：１、例えばガドレイン酸、ゴンドレン酸など）、ドコセン酸（Ｃ２２：１、例えばエルカ酸、ブラッシジン酸、セトレイン酸など）、テトラコセン酸（Ｃ２４：１、例えばネルボン酸など）、ヘキサコセン酸（Ｃ２６：１）、オクタコセン酸（Ｃ２８：１）、トリアコンテン酸（Ｃ３０：１）、ペンタジエン酸（Ｃ５：２）、ヘキサジエン酸（Ｃ６：２、例えばソルビン酸など）、ペプタジエン酸（Ｃ７：２）、オクタジエン酸（Ｃ８：２）、ノナジエン酸（Ｃ９：２）、デカジエン酸（Ｃ１０：２）、ウンデカジエン酸（Ｃ１１：２）、ドデカジエン酸（Ｃ１２：２）、トリデカジエン酸（Ｃ１３：２）、テトラデカジエン酸（Ｃ１４：２）、ペンタデカジエン酸（Ｃ１５：２）、ヘキサデカジエン酸（Ｃ１６：２）、ヘプタデカジエン酸（Ｃ１７：２）、オクタデカジエン酸（Ｃ１８：２、例えばリノール酸、リノエライジン酸など）、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２）、ドコサジエン酸（Ｃ２２：２）、テトラコサジエン酸（Ｃ２４：２）、ヘキサコサジエン酸（Ｃ２６：２）、オクタコサジエン酸（Ｃ２８：２）、トリアコンタジエン酸（Ｃ３０：２）、ヘキサデカトリエン酸（Ｃ１６：３）、オクタデカトリエン酸（Ｃ１８：３、例えばα−リノレン酸、γ−リノレン酸、など）、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３、例えばジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸など）、ドコサトリエン酸（Ｃ２２：３）、テトラコサトリエン酸（Ｃ２４：３）、ヘキサコサトリエン酸（Ｃ２６：３）、オクタコサトリエン酸（Ｃ２８：３）、トリアコンタトリエン酸（Ｃ３０：３）、オクタデカテトラエン酸（Ｃ１８：４、例えばステアリドン酸など）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４、例えばアラキドン酸など）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４、例えばアドレン酸など）、テトラコサテトラエン酸（Ｃ２４：４）、ヘキサコサテトラエン酸（Ｃ２６：４）、オクタコサテトラエン酸（Ｃ２８：４）、トリアコンタテトラエン酸（Ｃ３０：４）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５、例えばクルパドノン酸など）、テトラコサペンタエン酸（Ｃ２４：５）、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６）、テトラコサヘキサエン酸（Ｃ２４：６、例えばニシン酸など）、などが挙げられる。
【００２３】
上記に示した直鎖不飽和脂肪酸以外にもルメン酸（Ｃ１８：２）、カレンジン酸（Ｃ１８：３）、ジャカリン酸（Ｃ１８：３）、エレオステアリン酸（Ｃ１８：３）、カタルピン酸（Ｃ１８：３）、プニカ酸（Ｃ１８：３）、ルメレン酸（Ｃ１８：３）のような共役脂肪酸、リシノレイン酸（Ｃ１８：１）やリシネライジン酸（Ｃ１８：１）、ジモルフェコリン酸（Ｃ１８：２）のような水酸化不飽和脂肪酸、ベモリン酸（Ｃ１８：１）のようなエポキシ脂肪酸、ウロフラン酸のようなフラノイド脂肪酸、ミコリン酸のような高分子量の分岐鎖不飽和脂肪酸、その他メトキシ不飽和脂肪酸や環状不飽和脂肪酸などであってもよく、不飽和度が１以上で炭素数が４以上であれば構造や種類は特に限定されない。
【００２４】
本発明の骨形成促進剤は、上記したホスファチジン酸を有効成分として含有するものであるが、ホスファチジン酸の含有量は、本発明の骨形成促進剤中に、好ましくは０．０１１〜１００質量％、より好ましくは０．１〜１００質量％、最も好ましくは、１〜１００質量％の割合で含有される。
【００２５】
本発明の骨形成促進剤には、ホスファチジン酸以外には、由来や調製方法によって異なるが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）等のグリセロリン脂質、アシルグリセロール類（トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール）、遊離脂肪酸類、グリセロールリン酸（ＧＰＡ）、グリセロール、グリセロ糖脂質、ステロール類、スフィンゴ脂質（スフィンゴシン、スフィンゴシン−１−リン酸、スフィンゴミエリン、セラミド、セラミド−１−リン酸、グルコシルセラミド等）などが含有されていてもよい。
【００２６】
本発明の骨形成促進剤は、骨芽細胞前駆細胞の増殖および骨芽細胞への分化を促進し、コラーゲン産生を亢進すると共にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を増強させる。更に本発明の骨形成促進剤は破骨細胞の分化を抑制することにより、骨形成の促進のみならず骨吸収の抑制の両面から骨バランスを骨形成優位の方向にシフトさせる。
【００２７】
また、本発明の骨形成促進剤は、経口摂取可能な形態、例えば粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセルなどの剤型にすることができ、また飲料などの食品に配合することもできる。
【００２８】
本発明の飲食品は、本発明の骨形成促進剤を含むものであり、本発明の飲食品は、日常的に摂取しやすくなり、そのため骨疾患の予防および治療が可能となる。本発明の飲食品の摂取量は特に制限はないが、通常、ホスファチジン酸の量が０．０００１〜１００ｇ／日、好ましくは０．００１〜１０ｇ／日、さらに好ましくは０．０１〜５ｇ／日となるような量である。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は、この範囲に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１
卵黄レシチンＰＬ−３０Ｓ（キユーピー株式会社製）２００ｇにヘプタンとアセトンとの混合溶液（３：１（容量比））２Ｌを加えて溶解し、２０，０００ＵのホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製）を含む酵素溶液（０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ＝５．６）７４０ｍＬを添加して、撹拌しながら３７℃で２０時間酵素反応させた。分液後、ホスファチジン酸を含む有機溶媒層をエバポレーターで減圧濃縮（約３倍濃縮）し、濃縮物の５倍容量のアセトンを加えた。沈殿した不溶物を分別し、減圧乾燥してホスファチジン酸晶析物５０ｇを得た。ＨＰＬＣで測定すると（ＵＶ２０４ｎｍ）、得られた晶析物中にはホスファチジン酸が９０％含まれていた。このホスファチジン酸（ＰＡ）晶析物をそのまま本発明の骨形成促進剤とした。
【００３１】
実施例２
市販の試薬である、１、２−ＤＩｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ （ＤＯＰＡ；ＳＩＧＭＡ社製）を購入し、これを本発明の骨形成促進剤とした（純度９８％）。
【００３２】
比較例１
卵黄レシチンＬＰＬ−３０Ｓ（キユーピー株式会社製）１００ｇにヘプタンとアセトンとの混合溶液（３：１（容量比））１００ｍＬを加えて溶解し、１，００００ＵのホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製）および１．３５モルのエタノールアミンを含む酵素溶液（０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ＝８．０）４０ｍＬを添加して、撹拌しながら３０℃で２０時間酵素反応させた。分液後、ホスファチジルエタノールアミンを含む有機溶媒層をエバポレーターで減圧濃縮（約３倍濃縮）し、濃縮物の５倍容量のアセトンを加えた。沈殿した不溶物を分別し、減圧乾燥してホスファチジルエタノールアミン晶析物２７ｇを得た。
【００３３】
次いで、１３，５００ＵのホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２ナガセ：ナガセケムテックス株式会社製）を含む緩衝液（０．１Ｍトリス緩衝液、５０ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ８）１００ｍＬに、得られたホスファチジルエタノールアミン晶析物９ｇを分散させ、撹拌しながら３０℃で２０時間酵素反応させた。反応終了後、反応液にエタノール１Ｌを添加してリゾホスファチジルエタノールアミンを抽出し、減圧ろ過によってリゾホスファチジルエタノールアミン抽出液を得た。このリゾホスファチジルエタノールアミン抽出液をエバポレーターで減圧濃縮（約３倍濃縮）し、濃縮物の５倍容量のアセトンを加えた。沈殿した不溶物を分別し、減圧乾燥してリゾホスファチジルエタノールアミン晶析物５ｇを得た。ＨＰＬＣで測定すると（ＵＶ２０４ｎｍ）、得られた晶析物中にはＬＰＥが７０％含まれていた。このリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）晶析物を比較例１とした。
【００３４】
試験例１（コラーゲン産生量）
新生マウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１：理研バイオリソースセンター）を２４ウェルプレートに２．５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７度、５％炭酸ガス存在下、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭα培地（和光純薬工業製）で培養した。２４時間後、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＭＥＭα培地（ＦＢＳを含まない）で細胞を洗浄し、実施例１及び２の骨形成促進剤をホスファチジン酸濃度として１０μｇ／ｍｌ含むＭＥＭα培地（０．１％ＢＳＡ添加）と交換した。同様に、比較例１の晶析物をリゾホスファチジルエタノールアミン濃度として１０μｇ／ｍｌ含むＭＥＭα培地（０．１％ＢＳＡ添加）と交換した。３日後に同様の培地と交換し、計７日間培養を継続した。コラーゲン産生量は、−２０度に冷却した７０％エタノールで細胞を固定化した後、Ｓｉｒｃｏｌ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社製）を用いて測定した。細胞増殖活性及びコラーゲン産生促進作用は無添加群の測定値を１００として評価した。
【００３５】
得られた結果を表１に示す。
【００３６】
試験例２（アルカリホスファターゼ活性）
試験例１と同様の方法でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を播種・培養し、４８時間後に、実施例１及び２の骨形成促進剤をホスファチジン酸濃度として１０μｇ／ｍｌ含むＭＥＭα培地（０．１％ＢＳＡ添加）と交換した。同様に、比較例１の晶析物をリゾホスファチジルエタノールアミン濃度として１０μｇ／ｍｌ含むＭＥＭα培地（０．１％ＢＳＡ添加）と交換した。３日後に同様の培地と交換し、計７日間培養を継続した。トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で細胞を洗浄した後、細胞をエッペンチューブに回収して氷冷下で超音波破砕した。遠心分離後の上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でタンパク質含有量を測定し、ラボアッセイＡＬＰ（和光純薬工業製）でアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。ＡＬＰ活性は、タンパク質あたりで規格化して無添加群の測定値を１００として評価した。得られた結果を表１に示す。
【００３７】
試験例３（アリザリンレッドＳ染色）
試験例１と同様の方法でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を播種・培養し、４８時間後に、実施例１及び２の骨形成促進剤をホスファチジン酸濃度として１０μｇ／ｍｌ含む石灰化評価培地と交換した。同様に、比較例１の晶析物をリゾホスファチジルエタノールアミン濃度として１０μｇ／ｍｌ含む石灰化評価培地と交換した。２日または３日ごとに同様の培地と交換し、３２日間培養を継続した。上記の石灰化評価培地は、ＭＥＭαにＦＢＳを１０％、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム（和光純薬工業製）を５０μｇ／ｍｌ、β−グリセロリン酸ナトリウム（和光純薬工業製）を１０ｍＭ含む培地である。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄して−２０度に冷却した７０％エタノールで細胞を固定化した後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）で４０ｍＭに調製したアリザリンレッドＳ（ＷＡＫＯ）溶液を添加して、３７度で１０分間インキュベートした。純水で洗浄した後、細胞に染色された色素の濃さでカルシウム量、すなわち石灰化の度合いを目視で評価した。比較対照群の濃さと同程度の場合を±、やや濃い場合を＋、濃い場合を＋＋、非常に濃い場合を＋＋＋として判定した。得られた結果を表１に示す。
【００３８】
表１から明らかなように、ホスファチジン酸は骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に対してコラーゲン産生促進作用、ＡＬＰ活性増強作用、石灰化促進作用があることが判明した。また、これらの活性はリゾホスファチジルエタノールアミン（比較例１）より高かった。
【００３９】
【表１】
試験例４（破骨細胞分化抑制作用）
ddYマウス（♂、７週齢）の骨髄細胞を１０ｃｍディッシュに播種し（１×１０７ ｃｅｌｌｓ）、３０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（和光純薬工業製）を含む１０％ＦＢＳ−ＭＥＭα培地で１日培養した。非接着性細胞を別の１０ｃｍディッシュに移して、前記と同様の培地でさらに３日間培養してマクロファージ（ＢＭＤＭｓ：Ｂｏｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）を誘導した。誘導したＢＭＤＭｓをセルスクレイパーではがした後、２４ウェルプレートに４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、５０ｎｇ／ｍｌのｒｍＭ−ＣＳＦ（和光純薬工業製）と１００ｎｇ／ｍｌのｒｒｈｓＲＡＮＫＬ（和光純薬工業製）を含む１０％ＦＢＳ−ＭＥＭα培地に、実施例１及び２の骨形成促進剤をホスファチジン酸濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように添加して、破骨細胞への誘導を行った。同様に、比較例１の晶析物をリゾホスファチジルエタノールアミン濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように添加して、破骨細胞への誘導を行った。５日後（３日目に培地交換）、ＴＲＡＰ染色キット（プライマリーセル社）を用いて細胞を染色し、ｗｅｌｌあたりの破骨細胞（赤く染まった巨大細胞）の数をカウントした。破骨細胞数は、無添加群の測定値を１００として評価した。
【００４０】
得られた結果を表２に示した。表２よりホスファチジン酸は破骨細胞形成を抑制することが分かった。則ち、ホスファチジン酸は破骨細胞の形成を抑制することで生体において骨吸収を抑制できることが示された。
【００４１】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明によれば、ホスファチジン酸を有効成分として含有することにより、副作用がなく効果の高い骨形成促進剤を大量にかつ容易に製造し得る。したがって、本発明の骨形成促進剤及びこれを含む飲食品は、日常的に摂取可能であり骨疾患の予防効果および治療効果が期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化社会が進むにつれて、骨粗鬆症、骨折、腰痛などの骨疾患が急増している。骨組織には、骨芽細胞および破骨細胞が存在し、健康な骨は、骨芽細胞による骨の形成と破骨細胞による骨の再吸収とのバランスが保たれている。骨疾患は、このような骨の形成と骨の再吸収とのバランスが崩れることによって引き起こされる。現在、骨疾患を治療するために、エストロゲン類、ビタミンＤ３などの薬剤が使用されている。しかし、これらの薬剤には副作用のおそれがある。
【０００３】
骨疾患を予防するためには、カルシウム塩のサプリメント、牛乳、小魚などのようなカルシウムを多く含む食品などを、日常的に摂取する必要がある。しかし、これらのサプリメント、食品などは、摂取しても速やかに体内に吸収されにくいため、カルシウムの吸収量には限界がある。
【０００４】
例えば、乳清成分タンパク質およびそのペプチド画分が、骨の形成促進および骨の吸収抑制作用を有し、その作用によって骨が強化されることが開示されている（特許文献１〜４）。コラーゲンまたはゼラチンから得られるトリペプチドを有効成分とする骨の強化または密度向上剤（特許文献５）が報告されている。
【０００５】
タンパク質以外の成分を含有する骨形成促進剤などとしては、キノコから単離された（２２Ｅ，２４Ｒ）−エルゴスタ−７，２２−ジエン−３β，５α，６β−トリオールで表される骨形成促進剤（特許文献６）、食用キノコから抽出されるエストロゲン様活性物質を含む骨粗鬆症の予防食品および治療薬（特許文献７）、動物の血漿抽出物を含有する骨形成促進および骨吸収抑制剤（特許文献８）、およびα−オキシ脂肪酸およびスフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とする骨形成促進剤（特許文献９）などが開示されている。
【０００６】
しかし、これらの骨形成促進剤は、副作用のおそれや天然物などから有効成分を単離して調製される為製造コストが高くなるという問題点があった。
【０００７】
他方、安価で大量に製造し得、副作用の心配もない骨形成促進剤として、リゾホスファチジルエタノールアミンなどのリゾレシチンを有効成分とするものが開示されている（特許文献１０）。
【０００８】
ところで、ホスファチジン酸（ＰＡという場合がある）は最も基本的なグリセロリン脂質として古くから研究の対象とされてきた。各種の生体組織からの脂質抽出物中に、代謝中間体或いは前駆体としてわずかながら広く分布している。ＰＡは、脂質性シグナル因子としての機能を持っており、種々のタンパク質と相互作用することが知られている（非特許文献１）。最近では、m―ＴＯＲ（mammalia target of rapamycin）と呼ばれるタンパク質がＰＡによって直接的に活性化されることが報告され注目を集めている（非特許文献２）。他にもＰＡにはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化して毛髪再生を促進する作用（特許文献１１）、腫瘍細胞の膜流動性を向上させ多剤耐性を一変させる作用（特許文献１２）が知られているが、ＰＡが骨形成促進作用を持つことは全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第２８０２４３６号公報
【特許文献２】特許第３０９２８７４号公報
【特許文献３】特許第３６０４１５９号公報
【特許文献４】特許第３０７３４３９号公報
【特許文献５】特開２００２−２５５８４７号公報
【特許文献６】特開２００２−２８４６８９号公報
【特許文献７】特開２００４−２７７４１４号公報
【特許文献８】特開２００５−１０４９０９号公報
【特許文献９】特開２００４−２３１６１６号公報
【特許文献１０】特開２００７−１３７８０４号公報
【特許文献１１】特開２００６−７６９６７号公報
【特許文献１２】特開２００６−１４３７４４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】FEBS Lett. , 531, 65-8, 2002
【非特許文献２】Science, 294, 1942-45, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、副作用の心配がなく、安価に大量に製造し得る、効果の高い骨形成促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ホスファチジン酸に骨形成促進効果をあることを見出し本発明に到達した。
【００１３】
すなわち本発明は、ホスファチジン酸を有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤を要旨とするものである。
【００１４】
また、本発明の第二は、前記した骨形成促進剤を含むことを特徴とする飲食品を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ホスファチジン酸を有効成分とする骨形成促進剤及びそれらを配合した飲食品が提供される。この骨形成促進剤は、日常的に摂取可能で生体親和性に優れ、副作用がなく、そして大量にかつ安価に製造し得る。本発明の骨形成促進剤及びこれを含む飲食品は、日常的に摂取することができるので、骨疾患の予防効果および治療効果が期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
骨の形成は、次のような過程によって行われる。まず、骨芽細胞前駆細胞が、破骨細胞によって形成された骨吸収窩上で活発に増殖する。次いで、増殖した骨芽細胞前駆細胞が、骨芽細胞に分化する。このとき、骨芽細胞の増殖・分化のマーカーの１つであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）が発現して、このＡＬＰの活性が上昇する。次いで、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシンなどの細胞外骨基質タンパク質が合成され、骨基質にハイドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウムが沈着し石灰化が進行し、骨芽細胞中のカルシウムの沈着量が増加する。次いで、骨芽細胞は、周囲の骨基質に埋め込まれて骨細胞となり、造骨活動は停止する。
【００１８】
骨を健康に保つためには、骨を強くする、すなわち上述のように骨の形成を促進させる必要がある。あるいは、骨吸収の抑制、すなわち破骨細胞前駆細胞の増殖抑制、破骨細胞への分化の抑制、成熟破骨細胞の機能の抑制などによっても、骨を健康に保つことができる。
【００１９】
本発明の骨形成促進剤は、必須成分としてホスファチジン酸を単独又は２つ以上組み合わせたものを含有する。本発明に用いられるホスファチジン酸は本発明の効果を損なうものでない限りいかなるものを用いてもよい。例えば、大豆、菜種、米、落花生、トウモロコシ、胡麻、綿実、オリーブ、紅花、ヒマワリ、パーム、パーム核、その他穀物類、種実類、果菜類、葉菜類、茎菜類、根菜類、花菜類等の植物素材由来、イカや魚などの水産物由来、卵黄などの動物素材由来、酵母、カビ、キノコなどの菌類由来や細菌類由来のホスファチジン酸、リン脂質を含有する素材（抽出物なども含む）や各種レシチンをホスホリパーゼなど酵素処理して調製したホスファチジン酸、更には化学合成品や酵素合成品を用いることも可能である。
【００２０】
例えば、ホスファチジン酸はリン脂質を含有する天然レシチンと酵素との反応によって得られる。リン脂質を含有する天然レシチンとしては、例えば、大豆、菜種、米、落花生、トウモロコシ、胡麻、綿実、オリーブ、紅花、ヒマワリ、パーム、パーム核、その他穀物類、種実類、果菜類、葉菜類、茎菜類、根菜類、花菜類等の植物素材由来、イカや魚などの水産物由来、卵黄などの動物素材由来のレシチン、酵母、カビ、キノコなどの菌類や真菌類由来が挙げられるが、リン脂質を含む素材であれば特に限定されない。酵素としては、各種起源のホスホリパーゼＤが用いられる。酵素反応は、例えば、リン脂質を含有する天然レシチンとＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をトリス緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、カルシウムイオン存在下、ＰＬＤを添加して３７℃で撹拌して行う。
【００２１】
ホスホリパーゼＤは、細胞膜の主要構成成分であるホスファチジルコリンを加水分解し、ホスファチジン酸とコリンを産生するリン脂質加水分解酵素である。ホスホリパーゼＤは植物を始め、藻類、哺乳類、粘菌、細菌など生物に広範囲に分布するが、いずれのものを用いても良い。酵素反応条件は使用する酵素の性質に応じて、当業者により適宜決定され得る。
【００２２】
本発明に用いられるホスファチジン酸を構成する脂肪酸は少なくとも一つ以上が不飽和脂肪酸であることが望ましく、その不飽和脂肪酸の不飽和度が１以上で炭素数が４以上であることがより望ましい。より具体的にはブテン酸（Ｃ４：１、例えばクロトン酸、イソクロトン酸など）、ペンテン酸（Ｃ５：１）、ヘキセン酸（Ｃ６：１）、ヘプテン酸（Ｃ７：１）、オクテン酸（Ｃ８：１）、ノネン酸（Ｃ９：１）、デセン酸（Ｃ１０：１）、ウンデセン酸（Ｃ１１：１）、ドデセン酸（Ｃ１２：１、例えばラウロレイン酸など）、トリデセン酸（Ｃ１３：１）、テトラデセン酸（Ｃ１４：１、例えばミリストレイン酸、ミリステライジン酸など）、ペンタデセン酸（Ｃ１５：１）、ヘキサデセン酸（Ｃ１６：１、例えばパルミトレイン酸、パルミテライジン酸など）、ヘプタデセン酸（Ｃ１７：１）、オクタデセン酸（Ｃ１８：１、例えばペトロセリン酸、ペトロセライジン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸など）、ノナデセン酸（Ｃ１９：１）、エイコセン酸（Ｃ２０：１、例えばガドレイン酸、ゴンドレン酸など）、ドコセン酸（Ｃ２２：１、例えばエルカ酸、ブラッシジン酸、セトレイン酸など）、テトラコセン酸（Ｃ２４：１、例えばネルボン酸など）、ヘキサコセン酸（Ｃ２６：１）、オクタコセン酸（Ｃ２８：１）、トリアコンテン酸（Ｃ３０：１）、ペンタジエン酸（Ｃ５：２）、ヘキサジエン酸（Ｃ６：２、例えばソルビン酸など）、ペプタジエン酸（Ｃ７：２）、オクタジエン酸（Ｃ８：２）、ノナジエン酸（Ｃ９：２）、デカジエン酸（Ｃ１０：２）、ウンデカジエン酸（Ｃ１１：２）、ドデカジエン酸（Ｃ１２：２）、トリデカジエン酸（Ｃ１３：２）、テトラデカジエン酸（Ｃ１４：２）、ペンタデカジエン酸（Ｃ１５：２）、ヘキサデカジエン酸（Ｃ１６：２）、ヘプタデカジエン酸（Ｃ１７：２）、オクタデカジエン酸（Ｃ１８：２、例えばリノール酸、リノエライジン酸など）、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２）、ドコサジエン酸（Ｃ２２：２）、テトラコサジエン酸（Ｃ２４：２）、ヘキサコサジエン酸（Ｃ２６：２）、オクタコサジエン酸（Ｃ２８：２）、トリアコンタジエン酸（Ｃ３０：２）、ヘキサデカトリエン酸（Ｃ１６：３）、オクタデカトリエン酸（Ｃ１８：３、例えばα−リノレン酸、γ−リノレン酸、など）、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３、例えばジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸など）、ドコサトリエン酸（Ｃ２２：３）、テトラコサトリエン酸（Ｃ２４：３）、ヘキサコサトリエン酸（Ｃ２６：３）、オクタコサトリエン酸（Ｃ２８：３）、トリアコンタトリエン酸（Ｃ３０：３）、オクタデカテトラエン酸（Ｃ１８：４、例えばステアリドン酸など）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４、例えばアラキドン酸など）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４、例えばアドレン酸など）、テトラコサテトラエン酸（Ｃ２４：４）、ヘキサコサテトラエン酸（Ｃ２６：４）、オクタコサテトラエン酸（Ｃ２８：４）、トリアコンタテトラエン酸（Ｃ３０：４）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５、例えばクルパドノン酸など）、テトラコサペンタエン酸（Ｃ２４：５）、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６）、テトラコサヘキサエン酸（Ｃ２４：６、例えばニシン酸など）、などが挙げられる。
【００２３】
上記に示した直鎖不飽和脂肪酸以外にもルメン酸（Ｃ１８：２）、カレンジン酸（Ｃ１８：３）、ジャカリン酸（Ｃ１８：３）、エレオステアリン酸（Ｃ１８：３）、カタルピン酸（Ｃ１８：３）、プニカ酸（Ｃ１８：３）、ルメレン酸（Ｃ１８：３）のような共役脂肪酸、リシノレイン酸（Ｃ１８：１）やリシネライジン酸（Ｃ１８：１）、ジモルフェコリン酸（Ｃ１８：２）のような水酸化不飽和脂肪酸、ベモリン酸（Ｃ１８：１）のようなエポキシ脂肪酸、ウロフラン酸のようなフラノイド脂肪酸、ミコリン酸のような高分子量の分岐鎖不飽和脂肪酸、その他メトキシ不飽和脂肪酸や環状不飽和脂肪酸などであってもよく、不飽和度が１以上で炭素数が４以上であれば構造や種類は特に限定されない。
【００２４】
本発明の骨形成促進剤は、上記したホスファチジン酸を有効成分として含有するものであるが、ホスファチジン酸の含有量は、本発明の骨形成促進剤中に、好ましくは０．０１１〜１００質量％、より好ましくは０．１〜１００質量％、最も好ましくは、１〜１００質量％の割合で含有される。
【００２５】
本発明の骨形成促進剤には、ホスファチジン酸以外には、由来や調製方法によって異なるが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）等のグリセロリン脂質、アシルグリセロール類（トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール）、遊離脂肪酸類、グリセロールリン酸（ＧＰＡ）、グリセロール、グリセロ糖脂質、ステロール類、スフィンゴ脂質（スフィンゴシン、スフィンゴシン−１−リン酸、スフィンゴミエリン、セラミド、セラミド−１−リン酸、グルコシルセラミド等）などが含有されていてもよい。
【００２６】
本発明の骨形成促進剤は、骨芽細胞前駆細胞の増殖および骨芽細胞への分化を促進し、コラーゲン産生を亢進すると共にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を増強させる。更に本発明の骨形成促進剤は破骨細胞の分化を抑制することにより、骨形成の促進のみならず骨吸収の抑制の両面から骨バランスを骨形成優位の方向にシフトさせる。
【００２７】
また、本発明の骨形成促進剤は、経口摂取可能な形態、例えば粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセルなどの剤型にすることができ、また飲料などの食品に配合することもできる。
【００２８】
本発明の飲食品は、本発明の骨形成促進剤を含むものであり、本発明の飲食品は、日常的に摂取しやすくなり、そのため骨疾患の予防および治療が可能となる。本発明の飲食品の摂取量は特に制限はないが、通常、ホスファチジン酸の量が０．０００１〜１００ｇ／日、好ましくは０．００１〜１０ｇ／日、さらに好ましくは０．０１〜５ｇ／日となるような量である。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は、この範囲に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１
卵黄レシチンＰＬ−３０Ｓ（キユーピー株式会社製）２００ｇにヘプタンとアセトンとの混合溶液（３：１（容量比））２Ｌを加えて溶解し、２０，０００ＵのホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製）を含む酵素溶液（０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ＝５．６）７４０ｍＬを添加して、撹拌しながら３７℃で２０時間酵素反応させた。分液後、ホスファチジン酸を含む有機溶媒層をエバポレーターで減圧濃縮（約３倍濃縮）し、濃縮物の５倍容量のアセトンを加えた。沈殿した不溶物を分別し、減圧乾燥してホスファチジン酸晶析物５０ｇを得た。ＨＰＬＣで測定すると（ＵＶ２０４ｎｍ）、得られた晶析物中にはホスファチジン酸が９０％含まれていた。このホスファチジン酸（ＰＡ）晶析物をそのまま本発明の骨形成促進剤とした。
【００３１】
実施例２
市販の試薬である、１、２−ＤＩｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ （ＤＯＰＡ；ＳＩＧＭＡ社製）を購入し、これを本発明の骨形成促進剤とした（純度９８％）。
【００３２】
比較例１
卵黄レシチンＬＰＬ−３０Ｓ（キユーピー株式会社製）１００ｇにヘプタンとアセトンとの混合溶液（３：１（容量比））１００ｍＬを加えて溶解し、１，００００ＵのホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製）および１．３５モルのエタノールアミンを含む酵素溶液（０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ＝８．０）４０ｍＬを添加して、撹拌しながら３０℃で２０時間酵素反応させた。分液後、ホスファチジルエタノールアミンを含む有機溶媒層をエバポレーターで減圧濃縮（約３倍濃縮）し、濃縮物の５倍容量のアセトンを加えた。沈殿した不溶物を分別し、減圧乾燥してホスファチジルエタノールアミン晶析物２７ｇを得た。
【００３３】
次いで、１３，５００ＵのホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２ナガセ：ナガセケムテックス株式会社製）を含む緩衝液（０．１Ｍトリス緩衝液、５０ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ８）１００ｍＬに、得られたホスファチジルエタノールアミン晶析物９ｇを分散させ、撹拌しながら３０℃で２０時間酵素反応させた。反応終了後、反応液にエタノール１Ｌを添加してリゾホスファチジルエタノールアミンを抽出し、減圧ろ過によってリゾホスファチジルエタノールアミン抽出液を得た。このリゾホスファチジルエタノールアミン抽出液をエバポレーターで減圧濃縮（約３倍濃縮）し、濃縮物の５倍容量のアセトンを加えた。沈殿した不溶物を分別し、減圧乾燥してリゾホスファチジルエタノールアミン晶析物５ｇを得た。ＨＰＬＣで測定すると（ＵＶ２０４ｎｍ）、得られた晶析物中にはＬＰＥが７０％含まれていた。このリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）晶析物を比較例１とした。
【００３４】
試験例１（コラーゲン産生量）
新生マウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１：理研バイオリソースセンター）を２４ウェルプレートに２．５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７度、５％炭酸ガス存在下、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭα培地（和光純薬工業製）で培養した。２４時間後、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＭＥＭα培地（ＦＢＳを含まない）で細胞を洗浄し、実施例１及び２の骨形成促進剤をホスファチジン酸濃度として１０μｇ／ｍｌ含むＭＥＭα培地（０．１％ＢＳＡ添加）と交換した。同様に、比較例１の晶析物をリゾホスファチジルエタノールアミン濃度として１０μｇ／ｍｌ含むＭＥＭα培地（０．１％ＢＳＡ添加）と交換した。３日後に同様の培地と交換し、計７日間培養を継続した。コラーゲン産生量は、−２０度に冷却した７０％エタノールで細胞を固定化した後、Ｓｉｒｃｏｌ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社製）を用いて測定した。細胞増殖活性及びコラーゲン産生促進作用は無添加群の測定値を１００として評価した。
【００３５】
得られた結果を表１に示す。
【００３６】
試験例２（アルカリホスファターゼ活性）
試験例１と同様の方法でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を播種・培養し、４８時間後に、実施例１及び２の骨形成促進剤をホスファチジン酸濃度として１０μｇ／ｍｌ含むＭＥＭα培地（０．１％ＢＳＡ添加）と交換した。同様に、比較例１の晶析物をリゾホスファチジルエタノールアミン濃度として１０μｇ／ｍｌ含むＭＥＭα培地（０．１％ＢＳＡ添加）と交換した。３日後に同様の培地と交換し、計７日間培養を継続した。トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で細胞を洗浄した後、細胞をエッペンチューブに回収して氷冷下で超音波破砕した。遠心分離後の上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でタンパク質含有量を測定し、ラボアッセイＡＬＰ（和光純薬工業製）でアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。ＡＬＰ活性は、タンパク質あたりで規格化して無添加群の測定値を１００として評価した。得られた結果を表１に示す。
【００３７】
試験例３（アリザリンレッドＳ染色）
試験例１と同様の方法でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を播種・培養し、４８時間後に、実施例１及び２の骨形成促進剤をホスファチジン酸濃度として１０μｇ／ｍｌ含む石灰化評価培地と交換した。同様に、比較例１の晶析物をリゾホスファチジルエタノールアミン濃度として１０μｇ／ｍｌ含む石灰化評価培地と交換した。２日または３日ごとに同様の培地と交換し、３２日間培養を継続した。上記の石灰化評価培地は、ＭＥＭαにＦＢＳを１０％、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム（和光純薬工業製）を５０μｇ／ｍｌ、β−グリセロリン酸ナトリウム（和光純薬工業製）を１０ｍＭ含む培地である。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄して−２０度に冷却した７０％エタノールで細胞を固定化した後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）で４０ｍＭに調製したアリザリンレッドＳ（ＷＡＫＯ）溶液を添加して、３７度で１０分間インキュベートした。純水で洗浄した後、細胞に染色された色素の濃さでカルシウム量、すなわち石灰化の度合いを目視で評価した。比較対照群の濃さと同程度の場合を±、やや濃い場合を＋、濃い場合を＋＋、非常に濃い場合を＋＋＋として判定した。得られた結果を表１に示す。
【００３８】
表１から明らかなように、ホスファチジン酸は骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に対してコラーゲン産生促進作用、ＡＬＰ活性増強作用、石灰化促進作用があることが判明した。また、これらの活性はリゾホスファチジルエタノールアミン（比較例１）より高かった。
【００３９】
【表１】
試験例４（破骨細胞分化抑制作用）
ddYマウス（♂、７週齢）の骨髄細胞を１０ｃｍディッシュに播種し（１×１０７ ｃｅｌｌｓ）、３０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（和光純薬工業製）を含む１０％ＦＢＳ−ＭＥＭα培地で１日培養した。非接着性細胞を別の１０ｃｍディッシュに移して、前記と同様の培地でさらに３日間培養してマクロファージ（ＢＭＤＭｓ：Ｂｏｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）を誘導した。誘導したＢＭＤＭｓをセルスクレイパーではがした後、２４ウェルプレートに４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、５０ｎｇ／ｍｌのｒｍＭ−ＣＳＦ（和光純薬工業製）と１００ｎｇ／ｍｌのｒｒｈｓＲＡＮＫＬ（和光純薬工業製）を含む１０％ＦＢＳ−ＭＥＭα培地に、実施例１及び２の骨形成促進剤をホスファチジン酸濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように添加して、破骨細胞への誘導を行った。同様に、比較例１の晶析物をリゾホスファチジルエタノールアミン濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように添加して、破骨細胞への誘導を行った。５日後（３日目に培地交換）、ＴＲＡＰ染色キット（プライマリーセル社）を用いて細胞を染色し、ｗｅｌｌあたりの破骨細胞（赤く染まった巨大細胞）の数をカウントした。破骨細胞数は、無添加群の測定値を１００として評価した。
【００４０】
得られた結果を表２に示した。表２よりホスファチジン酸は破骨細胞形成を抑制することが分かった。則ち、ホスファチジン酸は破骨細胞の形成を抑制することで生体において骨吸収を抑制できることが示された。
【００４１】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明によれば、ホスファチジン酸を有効成分として含有することにより、副作用がなく効果の高い骨形成促進剤を大量にかつ容易に製造し得る。したがって、本発明の骨形成促進剤及びこれを含む飲食品は、日常的に摂取可能であり骨疾患の予防効果および治療効果が期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジン酸を有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤。
【請求項２】
請求項１記載の骨形成促進剤を含むことを特徴とする飲食品。
【請求項１】
ホスファチジン酸を有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤。
【請求項２】
請求項１記載の骨形成促進剤を含むことを特徴とする飲食品。
【公開番号】特開２０１０−１９５７５２（Ｐ２０１０−１９５７５２Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４５９５５（Ｐ２００９−４５９５５）
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【出願人】（０００００４５０３）ユニチカ株式会社 (1,214)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【出願人】（０００００４５０３）ユニチカ株式会社 (1,214)
【Ｆターム（参考）】
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