骨疾患治療剤
【課題】 グリフォラ・ガルガル（Grifola gargal）の子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物の特定と、当該化合物の骨疾患治療剤としての提供。
【解決手段】 ３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン、セレビステロール、及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上を有効成分として含有することを特徴とする骨疾患治療剤を使用する。
【解決手段】 ３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン、セレビステロール、及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上を有効成分として含有することを特徴とする骨疾患治療剤を使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨粗鬆症等の骨疾患の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は、骨形成と骨吸収とを繰り返している。このような骨のライフ・サイクルは、概略次のとおりである。
【０００３】
即ち、軟骨細胞、骨芽細胞及び破骨細胞が、機能的な分業を行い、各細胞が骨の代謝を制御している。骨の代謝は、（１）軟骨内骨化による骨新生と成長、（２）骨形成と骨吸収のサイクルからなるリモデリングによる質的、量的な維持、及び（３）骨折等の損傷における骨再生の三過程に分類される。そして、骨の代謝は、種々のカルシウム代謝ホルモンやサイトカイン、各種細胞内伝達機構や転写因子等を介して、各細胞系の機能や細胞間の相互作用を調節することによって制御されている。
【０００４】
例えば、休止期にある骨の表面が刺激を受けると、破骨細胞に情報が伝達されて骨の吸収が始まる。骨が吸収されているとき、他方では、骨芽細胞による骨の修復、形成が行なわれている。このように、正常な状態にある生体においては、骨の吸収と骨の形成とが並行して行なわれて、骨は新しく生まれ変わっている。
【０００５】
ところで、近年においては、高齢者の骨粗鬆症が注目を浴びている。骨粗鬆症は、骨のリモデリングにおいて、骨の吸収が骨の形成を上回ることによって招来されるものである。従って、骨粗鬆症の予防、治療には、骨吸収を抑制するか、骨形成を促進することが必要である。
【０００６】
このような状況下、種々の骨粗鬆症治療剤や、骨粗鬆症治療効果が期待される漢方薬や食品に由来する成分が提案されている。前者としては、活性型ビタミンＤや特許文献１に記載されたリベロマイシンＡ誘導体等が挙げられる。また、後者としては、特許文献２に記載された冬虫夏草、特許文献３に記載されたエリンギや五加皮の水抽出物、特許文献４に記載された熟地黄や骨砕補の水抽出物、特許文献５に記載されたマコモタケ抽出物等が挙げられる。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３５８９５号公報
【特許文献２】特開２００４−３１５４５４号公報
【特許文献３】特開２００５−３３０２８９号公報
【特許文献４】特開２００５−３３０２９０号公報
【特許文献５】特開２００６−１９３４５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記特許文献の発明者等と同様に、本発明者等も、骨粗鬆症の予防・治療効果があり、副作用の問題の少ない化合物を希求して、研究を重ねてきた。そして、学名がグリフォラ・ガルガル（Grifola gargal；和名：アンニンコウ）である茸の子実体からの抽出物が、破骨細胞形成抑制効果を示すことを見出した。しかし、骨粗鬆症等の骨疾患治療剤としてヒトに摂取させるには、グリフォラ・ガルガルの子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物そのものの方が都合がよい。従って、本発明の目的は、グリフォラ・ガルガルの子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物を特定し、当該化合物を骨疾患治療剤として提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、グリフォラ・ガルガルの子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物を特定するために鋭意研究を重ね、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明は、式（Ｉ）
【化１】
で示される３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン、式（ＩＩ）
【化２】
で示されるセレビステロール、及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上を有効成分として含有することを特徴とする骨疾患治療剤に関する。
【００１１】
前記骨疾患としては、骨粗鬆症が挙げられる。また、前記有効成分は、破骨細胞形成阻害剤として使用されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、安全性が高く、骨粗鬆症等の骨疾患の予防及び治療に有効な骨疾患治療剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に係る骨疾患治療剤の有効成分は、３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン、セレビステロール（cerevisterol）、及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上である。３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オンとセレビステロールは、グリフォラ・ガルガル（Grifola gargal）やカワリハラタケ（Agaricus blazei）に含有されている。セレビステロールは、セレビステリンとも呼称される。
【００１４】
これらの化合物の薬学的に許容される塩とは、例えば、上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、水酸基の水素が、ナトリウム、カリウム、カルシウム等で置換されてアルカリ又はアルカリ土類金属塩となっているものやアンモニウム基で置換されてアンモニウム塩となっているもの、塩酸、硫酸等の無機酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸、グリシン等のアミノ酸が付加した付加塩をいう。しかし、これらに限定されず、薬学的に許容されるものであれば、いずれであってもよい。
【００１５】
３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン及びセレビステロールの各々は、グリフォラ・ガルガルやカワリハラタケの子実体から抽出によって単離することができる。ここで、グリフォラ・ガルガルは、南米原産のグリフォラ属の茸であり、近年、菌床栽培も可能となったものである。グリフォラ・ガルガルの子実体を得るための菌床栽培方法は、例えば特開２００７−２０５６０に開示されている。また、カワリハラタケは、ハラタケ属の茸である。
【００１６】
３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン及びセレビステロールをグリフォラ・ガルガルの子実体から抽出する場合には、例えば、子実体乾燥物をヘキサン等の有機溶媒や水に入れ、可溶性成分を抽出した後、適切な条件下でカラム・クロマトグラフィーを繰り返せばよい。あるいは、エルゴステロールから、又はビタミンＤ類の合成方法を参考にして、有機合成することもできる（例えば、特開平５−１６３２３８及び特開平５−３２０１２７を参照のこと）。
【００１７】
本発明に係る骨疾患治療剤の有効成分は、少なくとも破骨細胞の形成を抑制する作用を示す。従って、本発明の骨疾患治療剤が有効な疾患には、破骨細胞の過剰な形成や機能亢進を伴なって骨量が減少する内因性疾患と、骨折等の外因性疾患とが包含される。骨疾患の具体例としては、骨粗鬆症、破骨細胞腫、骨減少症、骨多孔症、骨軟化症、外傷性骨折、疲労骨折等が挙げられる。
【００１８】
本発明に係る骨疾患治療剤の剤型、投与方法、投与量等は、使用目的や有効成分の物性を考慮して、適宜決定することができる。剤型の例としては、経口投与を目的として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等が、また、非経口投与を目的として、注射剤、吸入剤、座剤、経皮吸収剤等が挙げられる。有効成分と共に使用される添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶剤等が挙げられる。
【００１９】
投与量は、予防であるか治療であるか、疾患の状態、剤型、投与方法、患者の年齢や体重等の諸条件によって異なるが、成人に経口投与する場合であって、３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン又はその薬学的に許容される塩の場合は、通常、０．１乃至２００μｇ／体重１ｋｇ/日、好ましくは０．２乃至５０μｇ／体重１ｋｇ/日であり、セレビステロール又はその薬学的に許容される塩の場合は、通常、０．１乃至２００μｇ／体重１ｋｇ/日、好ましくは０．４乃至１００μｇ／体重１ｋｇ/日である。
【実施例】
【００２０】
以下に、実施例により、本発明を具体的に説明する。
【００２１】
（実施例１）グリフォラ・ガルガルの子実体からの有効成分の抽出、同定
（１）有効成分の有無の判定方法
抽出液や分画液中の有効成分による活性及び細胞毒性の測定は、次のようにして行なった。
【００２２】
（１−１）共存培養法による細胞の培養
マウス（♀、５乃至７週齢）の脛骨及び大腿骨から採取した骨髄細胞１．３×１０８個と、頭蓋骨から採取した骨芽細胞様間質細胞１．０×１０６個とを、１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（Minimun Essential Medium α- Medium）７．２ｍｌに懸濁させた。これを、４８穴の破骨細胞活性アッセイ用基質プレートに、１５０μｌ／ウェルで分注した。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液（濃度：２０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルと、被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの５０μｌ／ウェルとを加え、全量２５０μｌ／ウェルとした。炭酸ガスインキュベータを用い、３７℃、炭酸ガス濃度５％にて７日間培養した。なお、培養３日目には、各ウェル中の上澄み液１００μｌを除去し、代わりに、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液（濃度：４０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルと、被験試料を培養開始前に使用したものの２倍の濃度で含有する被験試料の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液５０μｌ／ウェルとを添加した。
【００２３】
（１−２）ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定
上記のように、骨髄細胞と骨芽細胞様間質細胞とを、活性ビタミンＤ３の存在下で共存培養を行なうと、ＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）を有する破骨様多核細胞（破骨細胞）に分化する。この細胞は、ＴＲＡＰ染色液で染色される。この染色された細胞の数を計測することにより、破骨細胞の形成が抑制されたか否かが分かる。
【００２４】
ＴＲＡＰ染色液は、次のようにして調製した。先ず、５０ｍＭの酒石酸ナトリウムと０．１Ｍの酢酸ナトリウムとを含むＴＲＡＰ緩衝液（ｐＨ＝５．０）を調製した。次に、用時調製で、１．５ｍｇのナフトールＡＳ−ＭＸリン酸塩を、１５０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させた。これにＴＲＡＰ緩衝液１５ｍｌを加え、次に、９ｍｇのファスト・レッド・バイオレットＬＢ塩を加えて溶解させた。
【００２５】
染色は、次のようにして行なった。ウェル中の培養液を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、１０％ホルマリン（＝３．７％ホルムアルデヒド）含有ＰＢＳ溶液を０．５ｍｌ／ウェルで加え、１０分間放置し、細胞をウェルに固定させた。その後、エタノールを０．５ｍｌ／ウェルで加え、１分間放置した。乾燥後、ウェルにＴＲＡＰ染色液０．３ｍｌ／ウェルを加え、室温で３０分間インキュベートさせた。ウェルを蒸留水０．３ｍｌ／ウェルで洗浄し、その後乾燥させた。
【００２６】
顕微鏡下において、ウェル当たりの、ＴＲＡＰ染色液によって染色された核を２個以上有する多核細胞の数を数えた。これが、ウェル当たりの破骨細胞数である。
【００２７】
細胞を培養する際に、被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの（５０μｌ）の代わりに、１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（５０μｌ）を添加したものを用意し、同様に処理した。これがコントロールである。
【００２８】
コントロールのウェル中の細胞数を１００として、被験試料を添加したウェル中の細胞数の割合を算出した。値が小さいほど、破骨細胞形成抑制効果が高い。
【００２９】
なお、図１に、コントロールのウェルの顕微鏡写真を、図２に破骨細胞の形成が抑制されたウェルの顕微鏡写真を示す。
【００３０】
（１−３）ＭＴＴアッセイ法による細胞生存率の測定
ＭＴＴとは、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロミドを指す。この化合物は、水溶性であり、水溶液は黄色を示すが、脱水素酵素によって、ＭＴＴとＮＡＤＨとの間で酸化還元反応が生じると、ＭＴＴが還元されて青色のフォルマゾンとなる。この脱水素酵素は、ミトコンドリアの呼吸鎖に関連する酵素であるので、細胞の健康状態の指標となる。即ち、細胞が元気であれば、酵素活性が高く、フォルマゾンが多く生成されるが、細胞が死んでしまうと、フォルマゾンは生成されない。よって、波長５７０ｎｍにおける吸光度測定によって、生成されたフォルマゾンの量、ひいては細胞の生存率を計測することができる。
【００３１】
ＭＴＴ溶液は、ＭＴＴを１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するＰＢＳ溶液である。共存培養後、培養液を除去せず、１２５μｌ／ウェルの量でＭＴＴ溶液を加えた。次いで、炭酸ガスインキュベータを用い、３７℃、炭酸ガス濃度５％にて２時間インキュベートした。培養液を除去し、１００μｌ／ウェルの量でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えた。フォルマゾンをよく溶解させた後、波長５７０ｎｍにおいてＤＭＳＯ溶液の吸光度を測定した。
【００３２】
細胞を培養する際に、被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの（５０μｌ）の代わりに、１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（５０μｌ）を添加したものを用意し、同様に処理した。これがコントロールである。
【００３３】
コントロールの吸光度を１００として、被験試料を添加した場合の吸光度の割合を算出した。値が小さいほど、細胞生存率又は細胞活性が低く、それは、被験試料の細胞毒性が強いことを示している。
【００３４】
（２）原料
菌床栽培において、種菌の植え付けから約１２０日後にグリフォラ・ガルガル子実体を収穫した。これに、４５℃の温風を一昼夜、その後７０℃の温風を１時間あて、乾燥させた。このようにして温風乾燥されたグリフォラ・ガルガル子実体を、原料として用いた。
【００３５】
（３）有効成分の抽出
抽出方法の概略は、図３及び図６に示すとおりである。具体的には、次のようにして有効成分を抽出した。
【００３６】
（３−１）へキサン抽出
温風乾燥されたグリフォラ・ガルガル子実体５００ｇをヘキサン５ｌに入れ、室温にて放置した。濾過により、へキサン溶液と残渣とに分けた。残渣にヘキサン５ｌを加え、室温にて放置し、更に抽出を行った。濾過により、へキサン溶液と残渣とに分け、更にもう一度、残渣にヘキサン５ｌを加え、室温にて放置して抽出を行った。ヘキサン溶液すべてを合一させ、次いでヘキサンを留去したところ、６．３ｇの固形分（ヘキサン可溶画分）が得られた。
【００３７】
（３−２）フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー（その１）
（３−１）で得られた固形分（５．２ｇ使用）を、フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｎ；関東化学社製；充填剤重量：３５０ｇ；φ４ｃｍ×６０ｃｍ）に供した。具体的には、先ず、上記固形分のヘキサン／酢酸エチル（９：１（容量））溶液をカラムに流し、有効成分をカラムに保持させた。次いで、溶出液として、ヘキサン／酢酸エチル（９：１（容量））混液５００ｍｌ、塩化メチレン５００ｍｌ、塩化メチレン／アセトン（８：２（容量））混液５００ｍｌ、アセトン５００ｍｌ及び１００％エタノール１，０００ｍｌをこの順で流した。
【００３８】
溶出液を２０ｍｌずつ分取し、各々につき、（１−１）及び（１−２）に記載の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。但し、「被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの５０μｌ」の代わりに、「分取した溶出液を６２．５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度（但し、培養開始前の濃度）で含有する１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ５０μｌ」を用いた。
【００３９】
この測定結果を踏まえ、溶出液を１２の群（順に、ＧＡ−Ｈ−１乃至ＧＡ−Ｈ−１２）にまとめた。これら１２の群のそれぞれを被験試料として用い、（１−１）、（１−２）及び（１−３）に記載の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定とＭＴＴアッセイを行った。但し、「被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの５０μｌ」の代わりに、「分取した溶出液を６２．５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度（但し、培養開始前の濃度）で含有する１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ５０μｌ」を用いた。なお、例えば分取した溶出液を６２．５μｇ／ｍｌの濃度で含有する１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭを５０μｌ／ウェルで用いた場合、ウェル中の培養液の全量は２５０μｌであるから、培養液中の溶出液の濃度は１２．５μｇ／ｍｌとなる。また、検体数は、各溶出液の各濃度につき、３点であった。
【００４０】
分取した溶出液を用いた場合のデータを、コントロールの平均値で除した値を、図４及び図５に示す。破骨細胞形成阻害活性が確認されたのは、ＧＡ−Ｈ−６乃至ＧＡ−Ｈ−１１であった。
【００４１】
（３−３）フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー（その２）
（３−２）で得られた画分の中、ＧＡ−Ｈ−８をさらに分画した。
【００４２】
先ず、ＧＡ−Ｈ−８の溶媒を留去したところ、３６８．８ｍｇの固形分が得られた。この固形分を、フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｎ；関東化学社製；充填剤重量：２００ｇ；φ２．５ｃｍ×６０ｃｍ）に供した。具体的には、先ず、上記固形分のヘキサン／酢酸エチル（６：４（容量））溶液をカラムに流し、有効成分をカラムに保持させた。次いで、溶出液として、ヘキサン／酢酸エチル（６：４（容量））混液２００ｍｌ、ヘキサン／酢酸エチル（４：６（容量））混液２００ｍｌ、酢酸エチル２００ｍｌ、酢酸エチル／アセトン（５：５（容量））混液２００ｍｌ、アセトン２００ｍｌ及び１００％エタノール５００ｍｌをこの順で流した。
【００４３】
溶出液を２０ｍｌずつ分取し、各々につき、（１−１）及び（１−２）に記載の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。但し、「被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの５０μｌ」の代わりに、「分取した溶出液を６２．５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度（但し、培養開始前の濃度）で含有する１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ５０μｌ」を用いた。
【００４４】
この測定結果を踏まえ、溶出液を１４の群（順に、ＧＡ−Ｈ−８−１乃至ＧＡ−Ｈ−８−１４）にまとめた。これら１４の群のそれぞれを被験試料として用い、（１−１）、（１−２）及び（１−３）に記載の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定とＭＴＴアッセイを行った。但し、「被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの５０μｌ」の代わりに、「分取した溶出液を６２．５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度（但し、培養開始前の濃度）で含有する１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ５０μｌ」を用いた。また、検体数は、各溶出液の各濃度につき、２点であった。
【００４５】
被験試料を用いた場合のデータを、コントロールの平均値で除した値を図７及び図８に示す。強い破骨細胞形成阻害活性が確認されたのは、ＧＡ−Ｈ−８−８乃至ＧＡ−Ｈ−８−１２であった。
【００４６】
これらの画分を、薄層クロマトグラフィー及びＮＭＲに供したところ、ＧＡ−Ｈ−８−９とＧＡ−Ｈ−８−１０は類似していたので、これらを一緒にした。この画分を、ＧＡ−Ｈ−８−９／１０と名づけた。
【００４７】
（３−４）調製用薄層クロマトグラフィー（その１）
（３−３）で行なった分画によって得られたＧＡ−Ｈ−８−９／１０の溶媒を留去したところ、６６．５ｍｇ（画分９：２１．９ｍｇ；画分１０：４４．６ｍｇ）の固形分が得られた。この固形分を、調製用薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｆ２５４；メルク社製；２０ｃｍ×２０ｃｍ）に供した。塩化メチレン／メタノール（９５：５（容量））混液、酢酸１％で展開させた。
【００４８】
展開後、シリカゲルを２６に分けて掻きとり（ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−１乃至ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−２６）、成分の抽出を行なった。それらの抽出液を用い、前記と同様の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。
【００４９】
この測定結果を踏まえ、ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−２０を、更に精製する画分として選択した。この画分には、４．１ｍｇの固形分が含まれていた。
【００５０】
（３−５）Ｓｅｐ ｐａｋによる前処理とＯＤＳカラムによる高性能液体クロマトグラフィー
（３−４）に記載の処理によって得られた画分ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−２０を、Ｓｅｐ ｐａｋ固層抽出カートリッジ（ウォーターズ社製；ＯＤＳ）に通し、次いでメタノール／水（９：１（容量））混液を流した。得られた溶出部を、高性能液体クロマトグラフ装置に接続されたＯＤＳカラム（資生堂社製；Ｃ１８ Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ ＡＱ）に通し、有効成分を保持させた。メタノール／水（９：１（容量））混液を流し、ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−２０−１乃至ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−２０−１９の画分を得た。
【００５１】
各画分を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。その結果、ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−１３に有効成分が濃縮されていた。
【００５２】
（３−６）有効成分の分取
（３−５）で得られたＧＡ−Ｈ−８−９／１０−２０−１３の溶媒を留去し、残渣として１．４ｍｇの化合物１を得た。
【００５３】
（３−７）調製用薄層クロマトグラフィー（その２）
（３−３）で行なった分画によって得られたＧＡ−Ｈ−８−１２の溶媒を留去したところ、６０．３ｍｇの固形分が得られた。この固形分を、調製用薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｆ２５４；メルク社製；２０ｃｍ×２０ｃｍ）に供した。塩化メチレン／メタノール（９：１（容量））混液、酢酸１％で展開させた。
【００５４】
展開後、シリカゲルを２７に分けて掻きとり（ＧＡ−Ｈ−８−１２−１乃至ＧＡ−Ｈ−８−１２−２７）、成分の抽出を行なった。それらの抽出液を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。また、これらの画分を、薄層クロマトグラフィー及びＮＭＲに供した。その結果、ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７乃至ＧＡ−Ｈ−８−１２−１９は類似していたので、これらを一緒にした。この画分を、ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９と名付けた。なお、画分ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７には２．８ｍｇ、画分ＧＡ−Ｈ−８−１２−１８には２．１ｍｇ、画分ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７には２．１ｍｇの固形分が含まれていた。
【００５５】
（３−８）Ｓｅｐ ｐａｋによる前処理とＯＤＳカラムによる高性能液体クロマトグラフィー
（３−７）に記載の処理によって得られた画分ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９を、Ｓｅｐ ｐａｋ固層抽出カートリッジ（ウォーターズ社製；ＯＤＳ）に通し、次いでメタノール／水（９５：５（容量））混液を流した。得られた溶出部を、高性能液体クロマトグラフ装置に接続されたＯＤＳカラム（資生堂社製；Ｃ１８ Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ ＡＱ）に通し、有効成分を保持させた。メタノール／水（９５：５（容量））混液を流し、ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９−１乃至ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９−３０の画分を得た。
【００５６】
各画分を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。その結果、ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９−１９及びＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９−２３に有効成分が濃縮されていた。
【００５７】
（３−９）有効成分の分取
（３−８）で得られたＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９−１９とＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９−２３を合一させた後、溶媒を留去し、残渣として２．４ｍｇの化合物２を得た。
【００５８】
（４）有効成分の同定
(３−６)で得た化合物１と、（３−９）で得た化合物２の各々を、ＣＤ３ＯＤに溶解させ、ジョエル（JOEL）社製ラムダ５００ＦＴ １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターと、ジョエル（JOEL）社製ラムダ５００ＦＴ １３Ｃ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。
【００５９】
得られたデータを図９（化合物１）及び図１０（化合物２）に示す。これらのデータより、化合物１は、３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン（Ｃ２８Ｈ４４Ｏ３；分子量：４２８）であり、化合物２は、セレビステロール（Ｃ２８Ｈ４６Ｏ３；分子量：４３０）であると同定された。
【００６０】
（実施例２）イン・ビトロにおける破骨細胞の形成抑制に有効な濃度の決定
実施例１の（１−１）に記載した共存培養法において、ウェル当たり、化合物１（３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン）については０．１８７５μｇ、０．３７５μｇ、０．７８１２５μｇをメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈して５０μｌとしたものを、化合物２（セレビステロール）については１．５６２５μｇ、３．１２１５μｇをメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈して５０μｌとしたものを用いた。ウェル中の培養液の量は２５０μｌであるから、培養液中の濃度では、化合物１は０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、３．１２５μｇ／ｍｌであり、化合物２は６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌであった。共存培養終了後、実施例１の（１−２）に記載したＴＲＡＰ染色法と、（１−３）に記載したＭＴＴアッセイ法を行なった。
【００６１】
コントロールは、共存培養法において、被験試料を含まない１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭを、５０μｌ／ウェルの量で用いた。
【００６２】
被験試料（各濃度につき）、コントロール共に、２点ずつ実験を行なった。被験試料を用いた場合のデータを、コントロールの平均値で除した値を図１１（化合物１）及び図１２（化合物２）に示す。
【００６３】
化合物１に関し、３．１２５μｇ／ｍｌとは、７．２９×１０−６Ｍに相当し、化合物２に関し、６．２５μｇ／ｍｌとは、１．４５×１０−５Ｍに相当する。化合物１は、共存培養法で培地中の被験試料濃度７．２９×１０−６Ｍで、細胞毒性は殆ど示さず、破骨細胞形成数は約２０％まで抑制した。また、化合物２を培地中の被験試料濃度１．４５×１０−５Ｍで用いた場合には、ＭＴＴアッセイで約４６％の細胞生存率となり、破骨細胞形成数は約１０％であった。
【００６４】
(実施例３) グリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物の摂取による骨芽細胞と破骨細胞のマーカーの血清又は尿中濃度の変動
８名の被験者の血液及び尿を採取し、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、骨型アルカリホスファターゼ（以上、血清中）及びデオキシピリジノリン（尿中）を、以下の方法で定量した。
【００６５】
（ＧＯＴ及びＧＰＴ） 日本臨床化学会標準法により、定量した。
【００６６】
（骨型ＡＬＰ） 血清中骨型アルカリホスファターゼ測定用キットを用い、マイクロプレートを用いたＥＩＡ法の原理に基づき、骨型ＡＬＰを測定した。このキットでは、マイクロプレートのウェルにマウス抗骨型ＡＬＰモノクローナル抗体が固相化されている。このモノクローナル抗体に骨型ＡＬＰを結合させた後、アルカリホスファターゼの基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸を添加し、結合された骨型ＡＬＰによって酵素反応を生じさせ、酵素反応の生成物であるｐ−ニトロフェノールの発色を測定した。骨型ＡＬＰ濃度は、検量線から求めた。
【００６７】
（ＤＰＤ） 尿中デオキシピリジノリン測定用キットを用い、マイクロプレートを用いた競合法ＥＩＡ法の原理に基づき、ＤＰＤを測定した。このキットでは、マイクロプレートのウェルにマウス抗ＤＰＤモノクローナル抗体が固相化されている。このモノクローナル抗体に、検体中のＤＰＤとアルカリホスファターゼ標識ＤＰＤとを競合的に結合させ、洗浄後、アルカリホスファターゼの基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸を添加し、結合されたアルカリホスファターゼ標識ＤＰＤによって酵素反応を生じさせ、酵素反応の生成物であるｐ−ニトロフェノールの発色を測定した。ＤＰＤ濃度は、検量線から求めた。
【００６８】
次いで、各被験者に、実施例１（２）に記載したグリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物を、１０ｇ／日の量で２週間、経口摂取させた。摂取終了後、８名の被験者の血液及び尿を採取し、ＧＯＴ、ＧＰＴ、骨型アルカリファターゼ（以上、血清中）及びデオキシピリジノリン（尿中）を定量した。なお、グリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物１０ｇ中の有効成分（３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン＋セレビステロール）量は、約５０乃至１００μｇ程度である。
【００６９】
結果を表１に示す。表１から明らかなように、本発明の骨疾患治療剤の有効成分２種類を含有するグリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物の摂取により、骨芽細胞の活性が増強され、また、破骨細胞の活性が低下した。
【００７０】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】共存培養後にＴＲＡＰ染色を行なった、コントロールのウェルの顕微鏡写真である。
【図２】共存培養後にＴＲＡＰ染色を行なった、破骨細胞の形成が抑制されたウェルの顕微鏡写真である。
【図３】グリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物からの、破骨細胞形成抑制活性を示す成分の抽出手順（１）を示す図である。
【図４】フラッシュ・カラム・クロマトグラフィーで分画された各画分の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【図５】フラッシュ・カラム・クロマトグラフィーで分画された各画分の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【図６】図３に示した手順の後に行われた、破骨細胞形成抑制活性を示す成分の抽出手順（２）を示す図である。
【図７】フラッシュ・カラム・クロマトグラフィーで分画された各画分の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【図８】フラッシュ・カラム・クロマトグラフィーで分画された各画分の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【図９】有効成分である化合物１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１０】有効成分である化合物２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１１】化合物１（３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン）の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【図１２】化合物２（セレビステロール）の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨粗鬆症等の骨疾患の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は、骨形成と骨吸収とを繰り返している。このような骨のライフ・サイクルは、概略次のとおりである。
【０００３】
即ち、軟骨細胞、骨芽細胞及び破骨細胞が、機能的な分業を行い、各細胞が骨の代謝を制御している。骨の代謝は、（１）軟骨内骨化による骨新生と成長、（２）骨形成と骨吸収のサイクルからなるリモデリングによる質的、量的な維持、及び（３）骨折等の損傷における骨再生の三過程に分類される。そして、骨の代謝は、種々のカルシウム代謝ホルモンやサイトカイン、各種細胞内伝達機構や転写因子等を介して、各細胞系の機能や細胞間の相互作用を調節することによって制御されている。
【０００４】
例えば、休止期にある骨の表面が刺激を受けると、破骨細胞に情報が伝達されて骨の吸収が始まる。骨が吸収されているとき、他方では、骨芽細胞による骨の修復、形成が行なわれている。このように、正常な状態にある生体においては、骨の吸収と骨の形成とが並行して行なわれて、骨は新しく生まれ変わっている。
【０００５】
ところで、近年においては、高齢者の骨粗鬆症が注目を浴びている。骨粗鬆症は、骨のリモデリングにおいて、骨の吸収が骨の形成を上回ることによって招来されるものである。従って、骨粗鬆症の予防、治療には、骨吸収を抑制するか、骨形成を促進することが必要である。
【０００６】
このような状況下、種々の骨粗鬆症治療剤や、骨粗鬆症治療効果が期待される漢方薬や食品に由来する成分が提案されている。前者としては、活性型ビタミンＤや特許文献１に記載されたリベロマイシンＡ誘導体等が挙げられる。また、後者としては、特許文献２に記載された冬虫夏草、特許文献３に記載されたエリンギや五加皮の水抽出物、特許文献４に記載された熟地黄や骨砕補の水抽出物、特許文献５に記載されたマコモタケ抽出物等が挙げられる。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３５８９５号公報
【特許文献２】特開２００４−３１５４５４号公報
【特許文献３】特開２００５−３３０２８９号公報
【特許文献４】特開２００５−３３０２９０号公報
【特許文献５】特開２００６−１９３４５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記特許文献の発明者等と同様に、本発明者等も、骨粗鬆症の予防・治療効果があり、副作用の問題の少ない化合物を希求して、研究を重ねてきた。そして、学名がグリフォラ・ガルガル（Grifola gargal；和名：アンニンコウ）である茸の子実体からの抽出物が、破骨細胞形成抑制効果を示すことを見出した。しかし、骨粗鬆症等の骨疾患治療剤としてヒトに摂取させるには、グリフォラ・ガルガルの子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物そのものの方が都合がよい。従って、本発明の目的は、グリフォラ・ガルガルの子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物を特定し、当該化合物を骨疾患治療剤として提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、グリフォラ・ガルガルの子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物を特定するために鋭意研究を重ね、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明は、式（Ｉ）
【化１】
で示される３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン、式（ＩＩ）
【化２】
で示されるセレビステロール、及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上を有効成分として含有することを特徴とする骨疾患治療剤に関する。
【００１１】
前記骨疾患としては、骨粗鬆症が挙げられる。また、前記有効成分は、破骨細胞形成阻害剤として使用されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、安全性が高く、骨粗鬆症等の骨疾患の予防及び治療に有効な骨疾患治療剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に係る骨疾患治療剤の有効成分は、３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン、セレビステロール（cerevisterol）、及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上である。３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オンとセレビステロールは、グリフォラ・ガルガル（Grifola gargal）やカワリハラタケ（Agaricus blazei）に含有されている。セレビステロールは、セレビステリンとも呼称される。
【００１４】
これらの化合物の薬学的に許容される塩とは、例えば、上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、水酸基の水素が、ナトリウム、カリウム、カルシウム等で置換されてアルカリ又はアルカリ土類金属塩となっているものやアンモニウム基で置換されてアンモニウム塩となっているもの、塩酸、硫酸等の無機酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸、グリシン等のアミノ酸が付加した付加塩をいう。しかし、これらに限定されず、薬学的に許容されるものであれば、いずれであってもよい。
【００１５】
３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン及びセレビステロールの各々は、グリフォラ・ガルガルやカワリハラタケの子実体から抽出によって単離することができる。ここで、グリフォラ・ガルガルは、南米原産のグリフォラ属の茸であり、近年、菌床栽培も可能となったものである。グリフォラ・ガルガルの子実体を得るための菌床栽培方法は、例えば特開２００７−２０５６０に開示されている。また、カワリハラタケは、ハラタケ属の茸である。
【００１６】
３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン及びセレビステロールをグリフォラ・ガルガルの子実体から抽出する場合には、例えば、子実体乾燥物をヘキサン等の有機溶媒や水に入れ、可溶性成分を抽出した後、適切な条件下でカラム・クロマトグラフィーを繰り返せばよい。あるいは、エルゴステロールから、又はビタミンＤ類の合成方法を参考にして、有機合成することもできる（例えば、特開平５−１６３２３８及び特開平５−３２０１２７を参照のこと）。
【００１７】
本発明に係る骨疾患治療剤の有効成分は、少なくとも破骨細胞の形成を抑制する作用を示す。従って、本発明の骨疾患治療剤が有効な疾患には、破骨細胞の過剰な形成や機能亢進を伴なって骨量が減少する内因性疾患と、骨折等の外因性疾患とが包含される。骨疾患の具体例としては、骨粗鬆症、破骨細胞腫、骨減少症、骨多孔症、骨軟化症、外傷性骨折、疲労骨折等が挙げられる。
【００１８】
本発明に係る骨疾患治療剤の剤型、投与方法、投与量等は、使用目的や有効成分の物性を考慮して、適宜決定することができる。剤型の例としては、経口投与を目的として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等が、また、非経口投与を目的として、注射剤、吸入剤、座剤、経皮吸収剤等が挙げられる。有効成分と共に使用される添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶剤等が挙げられる。
【００１９】
投与量は、予防であるか治療であるか、疾患の状態、剤型、投与方法、患者の年齢や体重等の諸条件によって異なるが、成人に経口投与する場合であって、３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン又はその薬学的に許容される塩の場合は、通常、０．１乃至２００μｇ／体重１ｋｇ/日、好ましくは０．２乃至５０μｇ／体重１ｋｇ/日であり、セレビステロール又はその薬学的に許容される塩の場合は、通常、０．１乃至２００μｇ／体重１ｋｇ/日、好ましくは０．４乃至１００μｇ／体重１ｋｇ/日である。
【実施例】
【００２０】
以下に、実施例により、本発明を具体的に説明する。
【００２１】
（実施例１）グリフォラ・ガルガルの子実体からの有効成分の抽出、同定
（１）有効成分の有無の判定方法
抽出液や分画液中の有効成分による活性及び細胞毒性の測定は、次のようにして行なった。
【００２２】
（１−１）共存培養法による細胞の培養
マウス（♀、５乃至７週齢）の脛骨及び大腿骨から採取した骨髄細胞１．３×１０８個と、頭蓋骨から採取した骨芽細胞様間質細胞１．０×１０６個とを、１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（Minimun Essential Medium α- Medium）７．２ｍｌに懸濁させた。これを、４８穴の破骨細胞活性アッセイ用基質プレートに、１５０μｌ／ウェルで分注した。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液（濃度：２０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルと、被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの５０μｌ／ウェルとを加え、全量２５０μｌ／ウェルとした。炭酸ガスインキュベータを用い、３７℃、炭酸ガス濃度５％にて７日間培養した。なお、培養３日目には、各ウェル中の上澄み液１００μｌを除去し、代わりに、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液（濃度：４０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルと、被験試料を培養開始前に使用したものの２倍の濃度で含有する被験試料の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液５０μｌ／ウェルとを添加した。
【００２３】
（１−２）ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定
上記のように、骨髄細胞と骨芽細胞様間質細胞とを、活性ビタミンＤ３の存在下で共存培養を行なうと、ＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）を有する破骨様多核細胞（破骨細胞）に分化する。この細胞は、ＴＲＡＰ染色液で染色される。この染色された細胞の数を計測することにより、破骨細胞の形成が抑制されたか否かが分かる。
【００２４】
ＴＲＡＰ染色液は、次のようにして調製した。先ず、５０ｍＭの酒石酸ナトリウムと０．１Ｍの酢酸ナトリウムとを含むＴＲＡＰ緩衝液（ｐＨ＝５．０）を調製した。次に、用時調製で、１．５ｍｇのナフトールＡＳ−ＭＸリン酸塩を、１５０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させた。これにＴＲＡＰ緩衝液１５ｍｌを加え、次に、９ｍｇのファスト・レッド・バイオレットＬＢ塩を加えて溶解させた。
【００２５】
染色は、次のようにして行なった。ウェル中の培養液を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、１０％ホルマリン（＝３．７％ホルムアルデヒド）含有ＰＢＳ溶液を０．５ｍｌ／ウェルで加え、１０分間放置し、細胞をウェルに固定させた。その後、エタノールを０．５ｍｌ／ウェルで加え、１分間放置した。乾燥後、ウェルにＴＲＡＰ染色液０．３ｍｌ／ウェルを加え、室温で３０分間インキュベートさせた。ウェルを蒸留水０．３ｍｌ／ウェルで洗浄し、その後乾燥させた。
【００２６】
顕微鏡下において、ウェル当たりの、ＴＲＡＰ染色液によって染色された核を２個以上有する多核細胞の数を数えた。これが、ウェル当たりの破骨細胞数である。
【００２７】
細胞を培養する際に、被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの（５０μｌ）の代わりに、１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（５０μｌ）を添加したものを用意し、同様に処理した。これがコントロールである。
【００２８】
コントロールのウェル中の細胞数を１００として、被験試料を添加したウェル中の細胞数の割合を算出した。値が小さいほど、破骨細胞形成抑制効果が高い。
【００２９】
なお、図１に、コントロールのウェルの顕微鏡写真を、図２に破骨細胞の形成が抑制されたウェルの顕微鏡写真を示す。
【００３０】
（１−３）ＭＴＴアッセイ法による細胞生存率の測定
ＭＴＴとは、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロミドを指す。この化合物は、水溶性であり、水溶液は黄色を示すが、脱水素酵素によって、ＭＴＴとＮＡＤＨとの間で酸化還元反応が生じると、ＭＴＴが還元されて青色のフォルマゾンとなる。この脱水素酵素は、ミトコンドリアの呼吸鎖に関連する酵素であるので、細胞の健康状態の指標となる。即ち、細胞が元気であれば、酵素活性が高く、フォルマゾンが多く生成されるが、細胞が死んでしまうと、フォルマゾンは生成されない。よって、波長５７０ｎｍにおける吸光度測定によって、生成されたフォルマゾンの量、ひいては細胞の生存率を計測することができる。
【００３１】
ＭＴＴ溶液は、ＭＴＴを１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するＰＢＳ溶液である。共存培養後、培養液を除去せず、１２５μｌ／ウェルの量でＭＴＴ溶液を加えた。次いで、炭酸ガスインキュベータを用い、３７℃、炭酸ガス濃度５％にて２時間インキュベートした。培養液を除去し、１００μｌ／ウェルの量でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えた。フォルマゾンをよく溶解させた後、波長５７０ｎｍにおいてＤＭＳＯ溶液の吸光度を測定した。
【００３２】
細胞を培養する際に、被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの（５０μｌ）の代わりに、１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（５０μｌ）を添加したものを用意し、同様に処理した。これがコントロールである。
【００３３】
コントロールの吸光度を１００として、被験試料を添加した場合の吸光度の割合を算出した。値が小さいほど、細胞生存率又は細胞活性が低く、それは、被験試料の細胞毒性が強いことを示している。
【００３４】
（２）原料
菌床栽培において、種菌の植え付けから約１２０日後にグリフォラ・ガルガル子実体を収穫した。これに、４５℃の温風を一昼夜、その後７０℃の温風を１時間あて、乾燥させた。このようにして温風乾燥されたグリフォラ・ガルガル子実体を、原料として用いた。
【００３５】
（３）有効成分の抽出
抽出方法の概略は、図３及び図６に示すとおりである。具体的には、次のようにして有効成分を抽出した。
【００３６】
（３−１）へキサン抽出
温風乾燥されたグリフォラ・ガルガル子実体５００ｇをヘキサン５ｌに入れ、室温にて放置した。濾過により、へキサン溶液と残渣とに分けた。残渣にヘキサン５ｌを加え、室温にて放置し、更に抽出を行った。濾過により、へキサン溶液と残渣とに分け、更にもう一度、残渣にヘキサン５ｌを加え、室温にて放置して抽出を行った。ヘキサン溶液すべてを合一させ、次いでヘキサンを留去したところ、６．３ｇの固形分（ヘキサン可溶画分）が得られた。
【００３７】
（３−２）フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー（その１）
（３−１）で得られた固形分（５．２ｇ使用）を、フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｎ；関東化学社製；充填剤重量：３５０ｇ；φ４ｃｍ×６０ｃｍ）に供した。具体的には、先ず、上記固形分のヘキサン／酢酸エチル（９：１（容量））溶液をカラムに流し、有効成分をカラムに保持させた。次いで、溶出液として、ヘキサン／酢酸エチル（９：１（容量））混液５００ｍｌ、塩化メチレン５００ｍｌ、塩化メチレン／アセトン（８：２（容量））混液５００ｍｌ、アセトン５００ｍｌ及び１００％エタノール１，０００ｍｌをこの順で流した。
【００３８】
溶出液を２０ｍｌずつ分取し、各々につき、（１−１）及び（１−２）に記載の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。但し、「被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの５０μｌ」の代わりに、「分取した溶出液を６２．５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度（但し、培養開始前の濃度）で含有する１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ５０μｌ」を用いた。
【００３９】
この測定結果を踏まえ、溶出液を１２の群（順に、ＧＡ−Ｈ−１乃至ＧＡ−Ｈ−１２）にまとめた。これら１２の群のそれぞれを被験試料として用い、（１−１）、（１−２）及び（１−３）に記載の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定とＭＴＴアッセイを行った。但し、「被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの５０μｌ」の代わりに、「分取した溶出液を６２．５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度（但し、培養開始前の濃度）で含有する１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ５０μｌ」を用いた。なお、例えば分取した溶出液を６２．５μｇ／ｍｌの濃度で含有する１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭを５０μｌ／ウェルで用いた場合、ウェル中の培養液の全量は２５０μｌであるから、培養液中の溶出液の濃度は１２．５μｇ／ｍｌとなる。また、検体数は、各溶出液の各濃度につき、３点であった。
【００４０】
分取した溶出液を用いた場合のデータを、コントロールの平均値で除した値を、図４及び図５に示す。破骨細胞形成阻害活性が確認されたのは、ＧＡ−Ｈ−６乃至ＧＡ−Ｈ−１１であった。
【００４１】
（３−３）フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー（その２）
（３−２）で得られた画分の中、ＧＡ−Ｈ−８をさらに分画した。
【００４２】
先ず、ＧＡ−Ｈ−８の溶媒を留去したところ、３６８．８ｍｇの固形分が得られた。この固形分を、フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｎ；関東化学社製；充填剤重量：２００ｇ；φ２．５ｃｍ×６０ｃｍ）に供した。具体的には、先ず、上記固形分のヘキサン／酢酸エチル（６：４（容量））溶液をカラムに流し、有効成分をカラムに保持させた。次いで、溶出液として、ヘキサン／酢酸エチル（６：４（容量））混液２００ｍｌ、ヘキサン／酢酸エチル（４：６（容量））混液２００ｍｌ、酢酸エチル２００ｍｌ、酢酸エチル／アセトン（５：５（容量））混液２００ｍｌ、アセトン２００ｍｌ及び１００％エタノール５００ｍｌをこの順で流した。
【００４３】
溶出液を２０ｍｌずつ分取し、各々につき、（１−１）及び（１−２）に記載の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。但し、「被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの５０μｌ」の代わりに、「分取した溶出液を６２．５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度（但し、培養開始前の濃度）で含有する１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ５０μｌ」を用いた。
【００４４】
この測定結果を踏まえ、溶出液を１４の群（順に、ＧＡ−Ｈ−８−１乃至ＧＡ−Ｈ−８−１４）にまとめた。これら１４の群のそれぞれを被験試料として用い、（１−１）、（１−２）及び（１−３）に記載の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定とＭＴＴアッセイを行った。但し、「被験試料をメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの５０μｌ」の代わりに、「分取した溶出液を６２．５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度（但し、培養開始前の濃度）で含有する１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ５０μｌ」を用いた。また、検体数は、各溶出液の各濃度につき、２点であった。
【００４５】
被験試料を用いた場合のデータを、コントロールの平均値で除した値を図７及び図８に示す。強い破骨細胞形成阻害活性が確認されたのは、ＧＡ−Ｈ−８−８乃至ＧＡ−Ｈ−８−１２であった。
【００４６】
これらの画分を、薄層クロマトグラフィー及びＮＭＲに供したところ、ＧＡ−Ｈ−８−９とＧＡ−Ｈ−８−１０は類似していたので、これらを一緒にした。この画分を、ＧＡ−Ｈ−８−９／１０と名づけた。
【００４７】
（３−４）調製用薄層クロマトグラフィー（その１）
（３−３）で行なった分画によって得られたＧＡ−Ｈ−８−９／１０の溶媒を留去したところ、６６．５ｍｇ（画分９：２１．９ｍｇ；画分１０：４４．６ｍｇ）の固形分が得られた。この固形分を、調製用薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｆ２５４；メルク社製；２０ｃｍ×２０ｃｍ）に供した。塩化メチレン／メタノール（９５：５（容量））混液、酢酸１％で展開させた。
【００４８】
展開後、シリカゲルを２６に分けて掻きとり（ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−１乃至ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−２６）、成分の抽出を行なった。それらの抽出液を用い、前記と同様の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。
【００４９】
この測定結果を踏まえ、ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−２０を、更に精製する画分として選択した。この画分には、４．１ｍｇの固形分が含まれていた。
【００５０】
（３−５）Ｓｅｐ ｐａｋによる前処理とＯＤＳカラムによる高性能液体クロマトグラフィー
（３−４）に記載の処理によって得られた画分ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−２０を、Ｓｅｐ ｐａｋ固層抽出カートリッジ（ウォーターズ社製；ＯＤＳ）に通し、次いでメタノール／水（９：１（容量））混液を流した。得られた溶出部を、高性能液体クロマトグラフ装置に接続されたＯＤＳカラム（資生堂社製；Ｃ１８ Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ ＡＱ）に通し、有効成分を保持させた。メタノール／水（９：１（容量））混液を流し、ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−２０−１乃至ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−２０−１９の画分を得た。
【００５１】
各画分を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。その結果、ＧＡ−Ｈ−８−９／１０−１３に有効成分が濃縮されていた。
【００５２】
（３−６）有効成分の分取
（３−５）で得られたＧＡ−Ｈ−８−９／１０−２０−１３の溶媒を留去し、残渣として１．４ｍｇの化合物１を得た。
【００５３】
（３−７）調製用薄層クロマトグラフィー（その２）
（３−３）で行なった分画によって得られたＧＡ−Ｈ−８−１２の溶媒を留去したところ、６０．３ｍｇの固形分が得られた。この固形分を、調製用薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｆ２５４；メルク社製；２０ｃｍ×２０ｃｍ）に供した。塩化メチレン／メタノール（９：１（容量））混液、酢酸１％で展開させた。
【００５４】
展開後、シリカゲルを２７に分けて掻きとり（ＧＡ−Ｈ−８−１２−１乃至ＧＡ−Ｈ−８−１２−２７）、成分の抽出を行なった。それらの抽出液を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。また、これらの画分を、薄層クロマトグラフィー及びＮＭＲに供した。その結果、ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７乃至ＧＡ−Ｈ−８−１２−１９は類似していたので、これらを一緒にした。この画分を、ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９と名付けた。なお、画分ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７には２．８ｍｇ、画分ＧＡ−Ｈ−８−１２−１８には２．１ｍｇ、画分ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７には２．１ｍｇの固形分が含まれていた。
【００５５】
（３−８）Ｓｅｐ ｐａｋによる前処理とＯＤＳカラムによる高性能液体クロマトグラフィー
（３−７）に記載の処理によって得られた画分ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９を、Ｓｅｐ ｐａｋ固層抽出カートリッジ（ウォーターズ社製；ＯＤＳ）に通し、次いでメタノール／水（９５：５（容量））混液を流した。得られた溶出部を、高性能液体クロマトグラフ装置に接続されたＯＤＳカラム（資生堂社製；Ｃ１８ Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ ＡＱ）に通し、有効成分を保持させた。メタノール／水（９５：５（容量））混液を流し、ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９−１乃至ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９−３０の画分を得た。
【００５６】
各画分を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。その結果、ＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９−１９及びＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９−２３に有効成分が濃縮されていた。
【００５７】
（３−９）有効成分の分取
（３−８）で得られたＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９−１９とＧＡ−Ｈ−８−１２−１７〜１９−２３を合一させた後、溶媒を留去し、残渣として２．４ｍｇの化合物２を得た。
【００５８】
（４）有効成分の同定
(３−６)で得た化合物１と、（３−９）で得た化合物２の各々を、ＣＤ３ＯＤに溶解させ、ジョエル（JOEL）社製ラムダ５００ＦＴ １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターと、ジョエル（JOEL）社製ラムダ５００ＦＴ １３Ｃ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。
【００５９】
得られたデータを図９（化合物１）及び図１０（化合物２）に示す。これらのデータより、化合物１は、３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン（Ｃ２８Ｈ４４Ｏ３；分子量：４２８）であり、化合物２は、セレビステロール（Ｃ２８Ｈ４６Ｏ３；分子量：４３０）であると同定された。
【００６０】
（実施例２）イン・ビトロにおける破骨細胞の形成抑制に有効な濃度の決定
実施例１の（１−１）に記載した共存培養法において、ウェル当たり、化合物１（３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン）については０．１８７５μｇ、０．３７５μｇ、０．７８１２５μｇをメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈して５０μｌとしたものを、化合物２（セレビステロール）については１．５６２５μｇ、３．１２１５μｇをメタノールに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈して５０μｌとしたものを用いた。ウェル中の培養液の量は２５０μｌであるから、培養液中の濃度では、化合物１は０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、３．１２５μｇ／ｍｌであり、化合物２は６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌであった。共存培養終了後、実施例１の（１−２）に記載したＴＲＡＰ染色法と、（１−３）に記載したＭＴＴアッセイ法を行なった。
【００６１】
コントロールは、共存培養法において、被験試料を含まない１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭを、５０μｌ／ウェルの量で用いた。
【００６２】
被験試料（各濃度につき）、コントロール共に、２点ずつ実験を行なった。被験試料を用いた場合のデータを、コントロールの平均値で除した値を図１１（化合物１）及び図１２（化合物２）に示す。
【００６３】
化合物１に関し、３．１２５μｇ／ｍｌとは、７．２９×１０−６Ｍに相当し、化合物２に関し、６．２５μｇ／ｍｌとは、１．４５×１０−５Ｍに相当する。化合物１は、共存培養法で培地中の被験試料濃度７．２９×１０−６Ｍで、細胞毒性は殆ど示さず、破骨細胞形成数は約２０％まで抑制した。また、化合物２を培地中の被験試料濃度１．４５×１０−５Ｍで用いた場合には、ＭＴＴアッセイで約４６％の細胞生存率となり、破骨細胞形成数は約１０％であった。
【００６４】
(実施例３) グリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物の摂取による骨芽細胞と破骨細胞のマーカーの血清又は尿中濃度の変動
８名の被験者の血液及び尿を採取し、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、骨型アルカリホスファターゼ（以上、血清中）及びデオキシピリジノリン（尿中）を、以下の方法で定量した。
【００６５】
（ＧＯＴ及びＧＰＴ） 日本臨床化学会標準法により、定量した。
【００６６】
（骨型ＡＬＰ） 血清中骨型アルカリホスファターゼ測定用キットを用い、マイクロプレートを用いたＥＩＡ法の原理に基づき、骨型ＡＬＰを測定した。このキットでは、マイクロプレートのウェルにマウス抗骨型ＡＬＰモノクローナル抗体が固相化されている。このモノクローナル抗体に骨型ＡＬＰを結合させた後、アルカリホスファターゼの基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸を添加し、結合された骨型ＡＬＰによって酵素反応を生じさせ、酵素反応の生成物であるｐ−ニトロフェノールの発色を測定した。骨型ＡＬＰ濃度は、検量線から求めた。
【００６７】
（ＤＰＤ） 尿中デオキシピリジノリン測定用キットを用い、マイクロプレートを用いた競合法ＥＩＡ法の原理に基づき、ＤＰＤを測定した。このキットでは、マイクロプレートのウェルにマウス抗ＤＰＤモノクローナル抗体が固相化されている。このモノクローナル抗体に、検体中のＤＰＤとアルカリホスファターゼ標識ＤＰＤとを競合的に結合させ、洗浄後、アルカリホスファターゼの基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸を添加し、結合されたアルカリホスファターゼ標識ＤＰＤによって酵素反応を生じさせ、酵素反応の生成物であるｐ−ニトロフェノールの発色を測定した。ＤＰＤ濃度は、検量線から求めた。
【００６８】
次いで、各被験者に、実施例１（２）に記載したグリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物を、１０ｇ／日の量で２週間、経口摂取させた。摂取終了後、８名の被験者の血液及び尿を採取し、ＧＯＴ、ＧＰＴ、骨型アルカリファターゼ（以上、血清中）及びデオキシピリジノリン（尿中）を定量した。なお、グリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物１０ｇ中の有効成分（３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン＋セレビステロール）量は、約５０乃至１００μｇ程度である。
【００６９】
結果を表１に示す。表１から明らかなように、本発明の骨疾患治療剤の有効成分２種類を含有するグリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物の摂取により、骨芽細胞の活性が増強され、また、破骨細胞の活性が低下した。
【００７０】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】共存培養後にＴＲＡＰ染色を行なった、コントロールのウェルの顕微鏡写真である。
【図２】共存培養後にＴＲＡＰ染色を行なった、破骨細胞の形成が抑制されたウェルの顕微鏡写真である。
【図３】グリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物からの、破骨細胞形成抑制活性を示す成分の抽出手順（１）を示す図である。
【図４】フラッシュ・カラム・クロマトグラフィーで分画された各画分の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【図５】フラッシュ・カラム・クロマトグラフィーで分画された各画分の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【図６】図３に示した手順の後に行われた、破骨細胞形成抑制活性を示す成分の抽出手順（２）を示す図である。
【図７】フラッシュ・カラム・クロマトグラフィーで分画された各画分の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【図８】フラッシュ・カラム・クロマトグラフィーで分画された各画分の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【図９】有効成分である化合物１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１０】有効成分である化合物２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１１】化合物１（３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン）の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【図１２】化合物２（セレビステロール）の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
で示される３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン、式（ＩＩ）
【化２】
で示されるセレビステロール、及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上を有効成分として含有することを特徴とする骨疾患治療剤。
【請求項２】
骨疾患が骨粗鬆症である、請求項１に記載の骨疾患治療剤。
【請求項３】
破骨細胞形成阻害剤である、請求項２に記載の骨疾患治療剤。
【請求項４】
有効成分が３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン及び／又はセレビステロールである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の骨疾患治療剤。
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
で示される３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン、式（ＩＩ）
【化２】
で示されるセレビステロール、及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上を有効成分として含有することを特徴とする骨疾患治療剤。
【請求項２】
骨疾患が骨粗鬆症である、請求項１に記載の骨疾患治療剤。
【請求項３】
破骨細胞形成阻害剤である、請求項２に記載の骨疾患治療剤。
【請求項４】
有効成分が３β，５α−ジヒドロキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−６−オン及び／又はセレビステロールである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の骨疾患治療剤。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図２】
【公開番号】特開２００９−５１７９３（Ｐ２００９−５１７９３Ａ）
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２２３３３（Ｐ２００７−２２２３３３）
【出願日】平成１９年８月２９日（２００７．８．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年３月２５日 社団法人 日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会２００７年度（平成１９年度）大会」に文書をもって発表
【出願人】（０００１４１３８１）株式会社岩出菌学研究所 (14)
【出願人】（５０８０２１０９３）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２９日（２００７．８．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年３月２５日 社団法人 日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会２００７年度（平成１９年度）大会」に文書をもって発表
【出願人】（０００１４１３８１）株式会社岩出菌学研究所 (14)
【出願人】（５０８０２１０９３）
【Ｆターム（参考）】
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