髄膜炎菌表面抗原ＮｈｈＡの保存領域を含むタンパク質
【課題】髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）表面抗原の修飾型を構成する新規なタンパク質、およびコードする核酸を提供する。
【解決手段】
修飾された表面タンパク質は、非保存アミノ酸の欠失を有することを特徴とし、それにより髄膜炎菌に対する交差保護的な免疫応答を誘発することができる。本発明は、診断薬、治療薬、予防ワクチン、ならびに医薬品の設計および／またはスクリーニングにおける、修飾された表面抗原の使用にまで及ぶ。修飾された表面抗原は、対応する野生型の表面抗原から予想されるよりも広いスペクトルの髄膜炎菌菌株に対して効果的な免疫化を生じさせるワクチンにおいて特に有用である。
【解決手段】
修飾された表面タンパク質は、非保存アミノ酸の欠失を有することを特徴とし、それにより髄膜炎菌に対する交差保護的な免疫応答を誘発することができる。本発明は、診断薬、治療薬、予防ワクチン、ならびに医薬品の設計および／またはスクリーニングにおける、修飾された表面抗原の使用にまで及ぶ。修飾された表面抗原は、対応する野生型の表面抗原から予想されるよりも広いスペクトルの髄膜炎菌菌株に対して効果的な免疫化を生じさせるワクチンにおいて特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）表面抗原の修飾型を構成する新規なタンパク質、そのような新規なペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸、診断におけるそれらの使用、治療ワクチンおよび予防ワクチンにおけるそれらの使用、ならびに医薬のデザインおよび／またはスクリーニングにおけるこれらの使用に関する。より詳細には、非保存アミノ酸を欠失させることによって、本発明の修飾型表面抗原は、対応する野生型の表面抗原から予想されるよりも広い範囲の髄膜炎菌菌株に対して効果的な免疫化をもたらすワクチンにおいて有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
髄膜炎菌はグラム陰性細菌であり、髄膜炎菌性の髄膜炎および敗血症の原因菌である。その唯一の知られている宿主はヒトであり、集団の約１０％が無症状的に髄膜炎菌を保有する場合がある（Ｃａｕｇａｎｔら、１９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３２ ３２３）。
【０００３】
髄膜炎菌は多糖の莢膜を発現し得る。これにより、この細菌を、発現した莢膜の性質に従って分類することができる。髄膜炎菌の少なくとも１２種の血清群（Ａ、Ｂ、Ｃ、２９−Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺ）が存在する。これらのうち、Ａ、ＢおよびＣの血清群が髄膜炎菌性疾患の９０％を引き起こしている（Ｐｏｏｌｍａｎら、１９９５、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ４ １３）。ＡおよびＣの血清群に対するワクチンを得ることができるが、血清群Ｂの莢膜多糖は免疫原性が良くなく、ヒトにおいて保護を誘導しない。
【０００４】
したがって、他の膜成分および細胞外成分が、現在、ワクチンに含ませるためのその好適性について調べられている。例として、クラス１、２および３の外膜タンパク質（ポリン；ｐｏｒ遺伝子によってコードされる）、ならびにクラス４の外膜タンパク質（Ｒｍｐ）およびクラス５の外膜タンパク質（Ｏｐａｃｉｔｙタンパク質；ｏｐａ遺伝子およびｏｐｃ遺伝子によってコードされる）が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、今日まで、これらの候補物はどれも、特に小児において完全な保護を誘導することができない（Ｒｏｍｅｒｏら、１９９４、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ、７ ５５９；Ｐｏｏｌｍａｎら、１９９５、前掲）。
【０００６】
効果的なワクチンを作製するためには、大部分の菌株に存在し、かつ保護的な免疫応答（例えば、殺菌性抗体）を誘導することができる髄膜炎菌成分を同定することが必要である。
【０００７】
これに関連して、国際公開公報第９９／２４５７８号、同第９９／３６５４４号、同第９９／５８６８３号および同第９９／５７２８０号が参照される。これらはそれぞれが引用により本明細書に組み込むものとされ、そして髄膜炎菌に対して免疫化するワクチンにおいて有用であり得る候補タンパク質を多数記載する。
【０００８】
これに関連して、国際公開公報第９９／３１１３２号、およびＰｅａｋら、２０００、
ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８ ３２９が特に参照される。これらはそれぞれが引用により本明細書に組み込むものとされ、そして髄膜炎菌の多数の異なる菌株から単離された新規な表面抗原を記載する。そのような表面抗原およびその対立遺伝子変異体は、本明細書の目的のためにはＮｈｈＡと呼ばれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明者らは、ＮｈｈＡ表面抗原が、髄膜炎菌の菌株間で変動し得るポリペプチド領域と、菌株間で保存されている他の領域とを有することを発見した。この可変性領域は、髄膜炎菌の特定の菌株に由来するＮｈｈＡ抗原を取り込むワクチンがその特定の菌株に対する優先的な免疫化を生じさせやすいように、免疫原性であり、菌株特異的な免疫応答を誘発しやすいと考えられる。その結果、本発明者らは、野生型ＮｈｈＡによって誘発される免疫応答と同じくらい菌株特異的でない免疫応答を誘発する修飾されたＮｈｈＡポリペプチドを製造することを試みた。この修飾されたＮｈｈＡ抗原は、本明細書下記に記載されるように、髄膜炎菌に対する治療ワクチンおよび／または予防ワクチンを製造するために有用である。免疫応答を主に保存されたエピトープに対して指向させることによって、そのようなワクチンは、野生型ＮｈｈＡによる免疫化の後に期待されるよりも広いスペクトルの髄膜炎菌菌株に対して効果的な免疫化を生じさせるはずである。
【００１０】
したがって、本発明は、一般には、ＮｈｈＡポリペプチドの保存されたアミノ酸を有する単離タンパク質に関する。
したがって、本発明のタンパク質は、対応する野生型ＮｈｈＡポリペプチドと比較して、非保存アミノ酸の１または複数の欠失を有し得る。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、ＮｈｈＡポリペプチドの１２個以上の連続した保存アミノ酸の配列を含み、かつ野生型ＮｈｈＡポリペプチドを含まない単離タンパク質を提供する。
【００１２】
好適には、本発明のタンパク質は免疫応答を誘発することができる。
好ましくは、免疫応答は、該対応する野生型ＮｈｈＡポリペプチドによって誘発される免疫応答よりも小さい菌株特異性を有する。
【００１３】
より好ましくは、該免疫応答は、髄膜炎菌の１または複数の菌株に対する保護をもたらし、またはさらにより好ましくは髄膜炎菌の多数の菌株に対する保護をもたらす。
野生型ＮｈｈＡポリペプチドの配列が図１に例示される（配列番号１〜１０）。
【００１４】
コンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）アミノ酸配列もまた図１に示される（配列番号１１）。
本発明の単離タンパク質は、好ましくは、本明細書では図１におけるＣ１領域、Ｃ２領域、Ｃ３領域、Ｃ４領域およびＣ５領域と呼ばれるＮｈｈＡポリペプチドの定常領域を１つまたは複数含む。
【００１５】
好適には、図１においてＶ１領域、Ｖ２領域、Ｖ３領域またはＶ４領域と呼ばれるＮｈｈＡポリペプチドの可変領域の１または複数の非保存アミノ酸が、野生型ＮｈｈＡポリペプチドに関して欠失していることがこの態様に従って理解される。
【００１６】
好ましくは、Ｖ１領域または少なくともその実質的な部分が欠失している。
特定の態様において、単離タンパク質は、「本発明の修飾されたＮｈｈＡポリペプチド」の例である図５〜９（配列番号２３〜２７）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する。図１４（配列番号３３〜３９）には、Ｎ末端シグナル配列の除去をもたらすこと
が予想される「成熟」ポリペプチドのさらなる例が示される。
【００１７】
第２の態様により、本発明は、第１の態様によるポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
野生型ｎｈｈＡの核酸配列が図２に例示される（配列番号１２〜２１）。
【００１８】
コンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）核酸配列もまた図２に示される（配列番号２２）。
好ましくは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５の領域が、図２に示されるそれぞれのヌクレオチド配列によってコードされる。
【００１９】
好ましくは、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４の領域が、図２に示されるそれぞれのヌクレオチド配列によってコードされる。
特定の態様において、本発明の単離核酸は、「本発明の修飾ｎｈｈＡ核酸」の特定の例である図５〜９（配列番号２８〜３２）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を有する。
【００２０】
第１および第２の態様による本発明は、本発明の単離タンパク質および核酸のホモログ、フラグメント、変異体および誘導体にまで及ぶ。
野生型のＮｈｈＡポリペプチドおよびｎｈｈＡ核酸は本発明の範囲から特に除かれる。
【００２１】
第３の態様において、本発明は、発現ベクターおよび第２の態様による核酸を含む発現構築物にある。この場合、該配列は、該発現ベクターにおいて１または複数の調節核酸に作動的に連結されている。
【００２２】
第４の態様において、本発明は、第３の態様による発現構築物を含む宿主細胞を提供する。
本発明の第５の態様では、第１の態様による組換え単離タンパク質を製造する方法であって、 （ｉ）第３の態様による発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが該宿主細胞において発現されるように培養する工程と、
（ｉｉ）該組換えタンパク質を単離する工程と、
から成る方法を提供する。
【００２３】
第６の態様において、本発明は、本発明のタンパク質、そのフラグメント、変異体または誘導体に結合する抗体または抗体フラグメントを提供する。
第７の態様において、本発明は、髄膜炎菌を含むことが疑われる生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌を検出する方法であって、
（ｉ）生物学的サンプルを個体から単離する工程と、
（ｉｉ）前記の抗体または抗体フラグメントを生物学的サンプルと接触させる工程と、
（ｉｉｉ）髄膜炎菌の存在を示す特異的に結合した抗体または抗体フラグメントを検出する工程と、
から成る方法を提供する。
【００２４】
第８の態様において、髄膜炎菌細菌を含むことが疑われる生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌細菌を検出する方法であって、
（ｉ）生物学的サンプルを患者から単離する工程と
、（ｉｉ）該細菌の存在を示す、前記第２の態様による核酸配列を該サンプルにおいて検出する工程と、
から成る方法を提供する。
【００２５】
第９の態様において、本発明は、髄膜炎菌による個体の感染を診断する方法であって、（ｉ）個体から得られた生物学的サンプルを本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体と接触させる工程と、
（ｉｉ）該ポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体と該サンプル中の髄膜炎菌特異的抗体との複合体の存在の有無を測定する工程であって、該複合体の存在により該感染が示される工程と、
から成る方法を提供する。
【００２６】
好ましくは、個体は哺乳動物である。
より好ましくは、個体はヒトである。
第１０の態様において、本発明はまた、生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌細菌を検出するキットにおける、前記第１の態様による単離タンパク質の使用、前記第２の態様による単離核酸の使用、または上記に記載された抗体もしくは抗体フラグメントの使用にまで及ぶ。
【００２７】
本発明の第１１の態様により、前記第１の態様による単離タンパク質を含む医薬組成物が提供される。
好ましくは、該医薬組成物はワクチンである。
【００２８】
第１２の態様において、本発明は、薬学的に効果的な量の上記ワクチンを投与する工程を含む、髄膜炎菌による患者の感染を防止する方法を提供する。
第１３の態様において、本発明は、前記第１の態様による単離タンパク質、変異体または誘導体の免疫原性フラグメントを同定する方法であって、
（ｉ）該ポリペプチド、変異体または誘導体のフラグメントを製造する工程と、（ｉｉ）該フラグメントを個体に投与する工程と、
（ｉｉｉ）髄膜炎菌および／または該ポリペプチド、変異体もしくは誘導体に特異的に結合するエレメントの産生、および／または髄膜炎菌の感染に対する保護作用を含む該個体における免疫応答を検出する工程と、
から成る方法を提供する。
【００２９】
好ましくは、個体は哺乳動物である。
より好ましくは、個体はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】（Ａ）−（Ｄ）は、１０菌株の髄膜炎菌から得られたＮｈｈＡポリペプチドアミノ酸配列（配列番号１〜１０）とコンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列（配列番号１１）とのアミノ酸アラインメント。このアラインメントで使用された菌株名およびポリペプチド配列は表１の第１欄の菌株名および配列番号に対応する。アミノ酸は標準的な一文字略号によって示される。コンセンサスなアミノ酸は、残基が完全に保存されている場合にだけ示される。保存領域（二重下線部、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５と表記）および可変領域（一本下線部、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４と表記）がコンセンサス配列の下に示される。
【図２】（Ａ）−（Ｆ）は、図１のアミノ酸配列をコードする、１０菌株の髄膜炎菌から得られたｎｈｈＡ核酸のヌクレオチド配列アラインメント。Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４の各領域は図１および表１に記載される通りである。
【図３Ａ】ｐｏｒＡプロモーターに作動的に連結された野生型ＰＭＣ２１のＮｈｈＡをコードするＰＣＲ増幅産物を有するｐＣＯ１４Ｋに対応するプラスミドマップ（スケール通りには縮尺されていない）。黒矢印は、ｐＣＯ１４Ｋ内のｐｏｒＡ遺伝子およびｋａｎＲ遺伝子の配置を示す。ＰＭＣ２１株のｎｈｈＡ遺伝子を増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドプライマーＨＯＭＰ５’およびＨＯＭＰ３’ＡＮが示される。ｎｈｈＡ遺伝子は点線矢印により示され、ｐｏｒＡプロモーターは黒四角により示され、そして実施例２に記載されるようにｐｏｒＡをｎｈｈＡで置換するために使用されたＥａｇＩおよびＮｃｏＩの制限部位が示される。
【図３Ｂ】ｐｏｒＡプロモーターに作動的に連結された野生型ＰＭＣ２１のＮｈｈＡをコードするＰＣＲ増幅産物を有するｐＣＯ１４Ｋに対応するプラスミドマップ（スケール通りには縮尺されていない）。実施例２に記載されるｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）における遺伝子配置。実施例４に記載される変異体を構築するために使用されたＢｇｌＩＩ部位が示される。
【図４Ａ】ＮｈｈＡポリペプチドの特定領域を欠失させるためのスプライスオーバーラップ伸長ＰＣＲ法の概略図。野生型ｎｈｈＡ遺伝子の概略図が図４Ａの上部に示され、組換えｎｈｈＡがこれらの図の下部に示されており、可変領域が黒四角として、定常領域が白四角により示される。矢印はオリゴヌクレオチドプライマーのおおよその位置を示す。垂直なハッチング線は増幅産物を示す。オリゴヌクレオチド配列がｎｈｈＡ核酸の不連続な領域に由来する場合、これは、そのような不連続な領域の間における点線により示される。おおよそのスケールで示される。二重の垂直線は、Ｃ５領域の一部分のみが示されていることを示す。実施例６に記載される方法を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ同様の概略図で、実施例７に記載される方法を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ同様の概略図で、実施例８に記載される方法を示す。
【図５】（Ａ）実施例４で作製されたＰＭＣ２１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２３）。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号２８）。
【図６】（Ａ）実施例５で作製されたＨ４１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２４）。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号２９）。
【図７】（Ａ）実施例６におけるスプライスオーバーラップＰＣＲによって作製されたＰＭＣ２１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２５）。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号３０）。
【図８】（Ａ）実施例７におけるスプライスオーバーラップＰＣＲによって作製されたＰＭＣ２１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２６）。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号３１）。
【図９】（Ａ）実施例８におけるスプライスオーバーラップＰＣＲによって作製されたＰＭＣ２１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２７）。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号３２）。
【図１０】（Ａ）−（Ｂ）野生型ポリペプチド配列およびＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチド配列のアミノ酸アラインメント。これらのポリペプチドは、実施例２、実施例３、実施例４および実施例５に記載されるように作製された。アミノ酸は一文字略号によって示される。表１および図１に規定される保存領域に対応するＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５と記された保存領域が、Ｈ４１およびＰＭＣ２１から得られた全長配列に二重下線を付すことによって示され、そして表１および図１に規定される可変領域に対応するＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４と記された可変領域が、Ｈ４１およびＰＭＣ２１から得られた全長配列に一本下線を付すことによって示される。
【図１１】過剰発現したＮｈｈＡを示すウエスタン免疫ブロット。４５μｇの総細胞タンパク質を、実施例９に記載されるように、４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、その後、ニトロセルロースフィルターに転写して、ウエスタンブロットした。レーン１：野生型レベルのＮｈｈＡ発現を示す親株。レーン２：Ｐ６株（実施例２に記載されるＰＭＣ２１ＮｈｈＡを過剰発現する）。レーン３：ＰΔ６株（実施例４に記載される短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡを過剰発現する）。レーン４：Ｈ１４株（実施例３に記載されるＨ４１ＮｈｈＡを過剰発現する）。レーン５：ＨΔ８株（実施例５に記載される短縮型Ｈ４１ＮｈｈＡを過剰発現する）。レーン６：２Ａ株（ＮｈｈＡの発現が、国際公開公報第９９／３１１３２号に記載されるようにｎｈｈＡ遺伝子の変異により失われている）。標準物の移動が示される：１８５ｋＤａ、１１９ｋＤａ、８５ｋＤａ、６２ｋＤａ、５１．２ｋＤａ、３８．２ｋＤａ、２２．４ｋＤａ。野生型ＮｈｈＡポリペプチドが、レーン１に存在するが、レーン６には存在しない高分子量の免疫反応性バンドとして存在する。
【図１２】単離されたＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチド。ＮｈｈＡポリペプチドを、実施例９に記載されるように単離し、その後、４〜２０％ＳＤ−ＰＡＧＥで分離した。ポリアクリルアミドゲルをクーマシー染色した。レーン１：実施例６に記載される短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドを過剰発現する菌株のＯＭＣ調製物。レーン２：精製された短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド。レーン３：実施例４に記載される短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドを過剰発現する菌株のＯＭＣ調製物。レーン４：精製された短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド。レーン５：実施例２に記載されるＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドを過剰発現する菌株のＯＭＣ調製物。レーン６：精製されたＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド。レーン７：分子量標準物：１７３ｋＤａ、１１１ｋＤａ、８０ｋＤａ、６１ｋＤａ、４９ｋＤａ、３６ｋＤａ。レーン６以外のすべてのレーンにおける高分子量の反応性種はおそらくはＮｈｈＡポリペプチドの多量体を表していることに留意すること。他のバンドは、おそらくは、あまり安定でない形態のＮｈｈＡまたは分解産物である。これらがレーン６には存在しないことに留意すること。
【図１３】抗ＮｈｈＡタンパク質のマウス血清を使用するウエスタン免疫ブロット。すべてのパネルにおいて、レーン１、３、５、７は、ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドを過剰発現する菌株のＯＭＣを含有し、レーン２、４、６および８は、ＮｈｈＡを発現しない２Ａ株のＯＭＣを含有する。パネルＡ：レーン１および２：野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡが１：１０００希釈で接種されたマウスＡ。レーン３および４：野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡが１：１０，０００希釈で接種されたマウスＡ。レーン５および６：野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡが１：１０００希釈で接種されたマウスＢ。レーン７および８：野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡが１：１０，０００希釈で接種されたマウスＢ。パネルＢ：レーン１＆２：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド（実施例４）が１：１０００希釈で接種されたマウスＣ。レーン３＆４：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド（実施例４）が１：１０，０００希釈で接種されたマウスＣ。レーン５＆６：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例４）が１：１０００希釈で接種されたマウスＤ。レーン７および８：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例４）が１：１０００希釈で接種されたマウスＤ。パネルＣ：レーン１＆２：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例６）が１：１０００希釈で接種されたマウスＥ。レーン３および４：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例６）が１：１０，０００希釈で接種されたマウスＥ。レーン５＆６：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例６）が１：１０００希釈で接種されたマウスＦ。レーン７＆８：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例６）が１：１０００希釈で接種されたマウスＦ。
【図１４】（Ａ）−（Ｇ）予測される成熟型ＮｈｈＡポリペプチド欠失変異体。Ａ：実施例２に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３３）；Ｂ：実施例３に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３４）；Ｃ：実施例４に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３５）；Ｄ：実施例５に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３６）；Ｅ：実施例６に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３７）；Ｆ：実施例７に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３８）；およびＧ：実施例８に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３９）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本明細書を通して、別途示されない限り、表現「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、任意の他の要素または要素群を除外することなく、述べられた要素または要素群を包含することを意味することが理解される。
【００３２】
命名法に関して、ＮｈｈＡは、本明細書では本発明のタンパク質が参照されるときに使
用され、一方、ｎｈｈＡは、本明細書では本発明の核酸が参照されるときに使用される。ＮｈｈＡ／ｎｈｈＡのタンパク質および核酸は、例えば国際公開公報第９９／３１１３２号において参照されるＨｉａＮｍ／ｈｉａｎｍのタンパク質および核酸（これらに限定されない）を包含することもまた理解される。
【００３３】
本発明は、少なくとも一部は、１０菌株の髄膜炎菌におけるＮｈｈＡポリペプチドにおける保存領域およびあまり保存されてない領域を解明することによって予測される。対応する領域が、例示されたＮｈｈＡポリペプチドの他の対立遺伝子変異体において保存されていることが予測される。
【００３４】
本発明にとって重要なことは、野生型ＮｈｈＡポリペプチド内の非保存アミノ酸を欠失させて、本発明の修飾されたＮｈｈＡポリペプチドを作製することによって、免疫応答が、その免疫応答を保存されたエピトープに対して指向させることにより１または複数の異種の髄膜炎菌菌株に対する保護をもたらす本発明の該ポリペプチドで免疫化したときに誘発され得るという認識であることが理解される。
【００３５】
本明細書で使用される「非保存」アミノ酸は、１つの髄膜炎菌に由来する野生型ＮｈｈＡポリペプチドには存在するが、１または複数の他の菌株に由来する野生型ＮｈｈＡポリペプチドには存在していないアミノ酸残基である。
【００３６】
好適には、第１の態様のポリペプチドは、対応する野生型の配列に関して、Ｖ１領域、Ｖ２領域、Ｖ３領域またはＶ４領域のいずれかの少なくとも一部が欠失しており、そのため、「欠失変異体」の例としてまとめて示されることがある。
【００３７】
本発明は、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４の領域を、比較的保存されたＣ１〜Ｃ５の領域と比較して、非保存アミノ酸の頻度が比較的多い野生型ＮｈｈＡポリペプチドの領域であるとして同定していることが理解される。
【００３８】
これらのＶ領域のなかで、Ｖ１（超可変）およびＶ２の領域は非保存アミノ酸の最も大きな頻度を有し、一方、Ｖ３およびＶ４は比較的少ない頻度を有する。しかし、Ｖ１領域は、（総アミノ酸に関して）Ｖ２領域よりも、野生型ＮｈｈＡポリペプチドの重要な割合を構成している。したがって、前記第１の態様による単離タンパク質はＶ１領域の少なくとも実質的な部分が欠失していることが好ましい。
【００３９】
該欠失変異体を構築する際には、異なる髄膜炎菌菌株のＮｈｈＡポリペプチド間での領域の「シャフリング」が可能であることもまた当業者によって理解されるであろう。例えば、本発明のＮｈｈＡポリペプチドは、ＰＭＣ２１のＣ５領域とともにＨ４１のＣ１領域を含むことができる。
【００４０】
そのような「シャフリング」は組換えＤＮＡ法には特に十分に適している。
本発明の目的で、「単離された」とは、その天然の状態から取り除かれているか、またはそうでなければヒトの操作に供されている材料を意味する。単離された材料は、その天然の状態で通常それに伴う成分を実質的または本質的に含まなくてもよく、あるいはその天然の状態で通常それに伴う成分とともに人工的な状態で存在するように操作されていてもよい。単離された材料は天然形態または組換え形態であってもよい。
【００４１】
「タンパク質」は、アミノ酸のポリマーを意味する。アミノ酸は、当技術分野において十分に理解されているように、天然型または非天然型のアミノ酸であり得る。
「ペプチド」は、５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質である。
【００４２】
ポリペプチドは、５０個以上のアミノ酸を有するタンパク質である。
本明細書で使用される表現「免疫応答を誘発する」は、本発明の単離されたポリペプチドにより、それが投与される哺乳動物において免疫応答がもたらされ得ることをいう。この場合、応答は、髄膜炎菌および／または該ポリペプチドに対するものである。好ましくは、免疫応答は殺菌性抗体の産生を包含する。より好ましくは、免疫応答は、髄膜炎菌感染に対して保護的である。
【００４３】
「菌株特異的」は、本明細書では、自己の髄膜炎菌菌株に指向するか、または自己の髄膜炎菌菌株に対して少なくとも優勢的に指向する免疫応答の意味で使用される。
本明細書中で使用される「交差反応的」は、１または複数の異種の髄膜炎菌菌株に対する免疫応答が本発明のポリペプチドにより誘発され得ることを意味する。
【００４４】
本明細書中で使用される「交差保護的」は、本発明のポリペプチドにより、免疫応答が誘発され、それにより、１または複数の異種の髄膜炎菌菌株による感染に対する保護がもたらされ得ることを意味する。
【００４５】
したがって、前記に照らして、本発明の該ポリペプチドは、本明細書では、「免疫原」として、または「免疫原性」であると呼ばれることがある。
本発明の目的のために、該修飾されたＮｈｈＡポリペプチドは、図５〜９（配列番号２３〜２７）および図１４に示されるアミノ酸配列により例示されるが、本発明ではまた、例示されたタンパク質のフラグメント、誘導体および変異体（対立遺伝子変異体など）も考えられる。
【００４６】
例えば、アミノ酸を、菌株特異的な免疫原性を低下させるために、図１に示されるＣ１〜Ｃ５の配列のいずれかから欠失させることができ、一方で、Ｖ１〜Ｖ４の領域における非保存アミノ酸は必ずしもすべて欠失させる必要はない。
【００４７】
したがって、本発明の単離タンパク質は、Ｃ１〜Ｃ５およびＶ１〜Ｖ４の領域のフラグメントを含むことができる。
実際、下記の実施例に記載されるように、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位を利用して、安定した免疫原性タンパク質の高レベルな発現を達成するために、Ｃ１領域、Ｃ２領域、Ｃ３領域、Ｃ４領域および／またはＣ５領域あるいはＶ１領域、Ｖ２領域、Ｖ３領域および／またはＶ４領域の１個または数個のアミノ酸を欠失させることは、本発明のポリペプチドを組換えＤＮＡに基づいて製造するためには好都合であり得る。
【００４８】
１つの態様において、「フラグメント」は、該Ｃ１領域、Ｃ２領域、Ｃ３領域、Ｃ４領域またはＣ５領域の１００％未満であるが、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％を構成するアミノ酸配列を含む。
【００４９】
フラグメントは、例えば、Ｃ２領域（配列番号１１）などの１２個もの少数のアミノ酸、あるいは本明細書に記載されるＣ１領域、Ｃ２領域、Ｃ３領域、Ｃ４領域および／またはＣ５領域の一部またはすべてに対応する少なくとも２０個の連続したアミノ酸または１００個を越える連続したアミノ酸を含むペプチドであり得る。
【００５０】
本明細書に例示される他のフラグメントは、図１４に示されるなどの成熟ポリペプチドが形成されるために翻訳後プロセシングを受けている本発明の修飾されたＮｈｈＡポリペプチドである。
【００５１】
別の態様において、「フラグメント」は、例えば、少なくとも６個、好ましくは少なく
とも１０個、より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸の長さである小ペプチドで、本発明の修飾されたＮｈｈＡタンパク質に由来する１または複数の抗原決定基またはエピトープを含む小ペプチドである。２つ以上のペプチドを含むより大きいフラグメントもまた考えられ、これらは、標準的な組換え核酸技術を適用して得ることができ、または従来の液相合成技術もしくは固相合成技術を使用して合成することができる。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎにより編集され、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓにより発行された「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」と題される刊行物に含まれる、ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｈａｒｄによる「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」と題される第９章に記載されるような溶液合成または固相合成を例えば参照することができる。または、ペプチドは、本発明のポリペプチドをプロテイナーゼ（ｅｎｄｏＬｙｓ−Ｃ、ｅｎｄｏＡｒｇ−Ｃ、ｅｎｄｏＧｌｕ−Ｃおよびブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼなど）で消化することによって製造することができる。消化されたフラグメントは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術によって精製することができる。
【００５２】
本明細書で使用される「変異体」ポリペプチドは、１または複数のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されている本発明のポリペプチドである。いくつかのアミノ酸を、ポリペプチドの活性の性質を変化させることなく、ほぼ類似する性質を有する別のアミノ酸に変化させること（保存的置換）ができることが当技術分野では十分に理解されている。ポリペプチドにおける例示的な保存的置換を表２に従って行うことができる。
【００５３】
機能の実質的な変化は、表２に示される置換よりも低い保存的な置換を選択することによって行われる。他の置換は非保存的な置換であるが、これらの比較的少数が許容され得る。一般に、ポリペプチドの性質において最大の変化をもたらす可能性がある置換として、（ａ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）で疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）を置換する置換、または親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）を疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）で置換する置換；（ｂ）システインまたはプロリンで任意の他の残基を置換する置換、またはシステインまたはプロリンを任意の他の残基で置換する置換；（ｃ）電気的陽性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）で電気的陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）を置換する置換、または電気的陽性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）を電気的陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）で置換する置換、あるいは（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例えば、ＰｈｅまたはＴｒｐ）で、小型側鎖を有する残基（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）もしくは側鎖を有しない残基（例えば、Ｇｌｙ）を置換する置換、または嵩高い側鎖を有する残基（例えば、ＰｈｅまたはＴｒｐ）を、小型側鎖を有する残基（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）もしくは側鎖を有しない残基（例えば、Ｇｌｙ）で置換する置換が挙げられる。
【００５４】
用語「変異体」はまた、本明細書に例示される配列の対立遺伝子変異体から作製された本発明のＮｈｈＡポリペプチドを包含する。
ＮｈｈＡポリペプチドの変異体は、用語「ポリペプチドホモログ」の範囲に含まれることがある。
【００５５】
ポリペプチドホモログは、本明細書前記に記載される本発明の修飾されたＮｈｈＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する。
【００５６】
本明細書で一般に使用される「ホモログ」は、場合により、本発明の核酸またはポリペプチドとの規定され得るヌクレオチド配列関係またはアミノ酸配列関係を有する。
例えば、本明細書に例示されるアミノ酸配列とは異なるが、免疫原性で、交差保護免疫
性をもたらすアミノ酸配列を有するようなホモログが考えられる。
【００５７】
野生型のＮｈｈＡポリペプチドおよびｎｈｈＡ核酸は用語「ホモログ」の範囲から特に除かれる。
ホモログの範囲には、髄膜炎菌とは異なる細菌株から単離される、機能的に関連するポリペプチドおよびそのコードする核酸である「オルソログ」が含まれる。
【００５８】
それぞれの核酸間およびそれぞれのポリペプチド間の配列関係を記載するために本明細書で使用される用語には、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」および「実施的な同一性」が含まれる。それぞれの核酸／ポリペプチドはそれぞれ、（１）核酸／ポリペプチドが互いに有する完全な核酸／ポリペプチド配列の１または複数の部分のみ、および（２）核酸／ポリペプチド間で異なる１または複数の部分を含み得るので、配列比較は、配列類似性の局所的領域を同定して比較するために「比較ウインドウ」について配列を比較することによって典型的には行われる。「比較ウインドウ」は、参照配列と比較される典型的には１２個の連続した残基の概念的なセグメントをいう。比較ウインドウは、それぞれの配列を最適にアラインメントするために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウインドウをアラインメントするための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズムのコンピューター化された手段（ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓによるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、これらは引用により本明細書に組み込むものとする）によって、または精査、もしくは選択された様々な方法のいずれかにより得られた最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウについて最大のパーセンテージ相同性をもたらすアラインメント）によって行うことができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５ ３３８９（これは引用により本明細書に組み込むものとする）により記載されるようなＢＬＡＳＴファミリーのプログラムもまた参照することができる。
【００５９】
配列分析の詳細な議論を、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（編者：Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ ＮＹ、１９９５〜１９９９）のユニット１９．３に見出すことができる。
【００６０】
用語「配列同一性」は、比較ウインドウについて配列が同一である範囲を考慮して標準的なアルゴリズムを使用する適切なアラインメントを考慮した正確なヌクレオチド一致またはアミノ酸一致の数を含むようにその最も広い意味で本明細書では使用される。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較ウインドウについて比較し、一致した位置の数を得るために、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両方の配列に存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算して、配列同一性のパーセンテージを得るためにその結果を１００倍することによって計算される。例えば、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータープログラム（ウインドウス用バージョン２．５；Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）から入手可能）により計算される「一致パーセンテージ」を意味することが理解され得る。
【００６１】
したがって、本明細書の前記に規定されるような変異体などの本発明のポリペプチドホモログを組換えＤＮＡ技術によって調製することは十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、本発明の核酸は、例えばトランスポゾン変異誘発法を使用するランダム変異誘発
法または部位特異的変異誘発法のいずれかを使用して変異させることができる。得られたＤＮＡフラグメントは、その後、従来の技術を使用して大腸菌などの好適な発現宿主にクローン化され、そして所望する活性を保持するクローンが検出される。そのようなクローンが、ランダム変異誘発技術を使用して得られた場合、陽性のクローンは、変異を検出するために配列決定しなければならない。
【００６２】
本明細書で使用される「誘導体」ポリペプチドは、当技術分野において理解されるように、例えば、他の化学的成分とのコンジュゲート化または複合体化によって、あるいは翻訳後修飾技術によって変化している本発明のポリペプチドである。そのような誘導体には、アミノ酸欠失体および／または本発明のＮｈｈＡポリペプチドもしくはその変異体に対するアミノ酸付加体が含まれ、該誘導体により免疫応答が誘発される。
【００６３】
アミノ酸の「付加（体）」は、ポリペプチドまたはその変異体と他のポリペプチドまたはタンパク質との融合を包含し得る。これに関連して、本発明のポリペプチドまたは変異体はより大きなポリペプチドに組み込まれ得ることが理解され、そしてそのようなより大きなポリペプチドもまた免疫原性であることが予想され得る。上記に記載されるポリペプチドは、例えば、髄膜炎菌に由来しないさらなるタンパク質に融合させることができる。そのような他のタンパク質は、例として、タンパク質の精製を助けることができる。例えば、ポリヒスチジンタグまたはマルトース結合タンパク質を使用することができる。または、髄膜炎菌に対して効果的な免疫応答を生じさせることができるか、または別の病原体に対する免疫応答を生じさせることができる。他の可能な融合タンパク質は、免疫調節的な応答を生じさせる融合タンパク質である。そのようなタンパク質の具体的な例として、プロテインＡまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる。さらに、ポリペプチドは、それが担体タンパク質として作用する多糖型ワクチン成分に融合させることができる。
【００６４】
本発明により考えられる他の誘導体には、側鎖に対する修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を合成しているときにおける様々な非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の取り込み、ならびに本発明のポリペプチド、フラグメントおよび変異体に立体配座的な制約を負わす架橋剤および他の方法の使用が含まれるが、これらに限定されない。本発明により考えられる側鎖修飾の例には、無水酢酸を用いたアシル化によるなどのアミノ基の修飾；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸を用いたアミノ基のアシル化；メチルアセトイミダートを用いたアミド化；シアナートを用いたアミノ基のカルバモイル化；ピリドキサール−５−ホスファートを用い、その後、ＮａＢＨ４で還元することによるリシンのピリドキシル化；アルデヒドと反応させ、その後、ＮａＢＨ４で還元することによる還元的アルキル化；および２,\~４,\~６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いたアミノ基のトリニトロベンジル化が含まれる。
【００６５】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソウレアの形成を介するカルボジイミド活性化を行い、その後、続いて誘導体化して、例として、対応するアミドにすることによって修飾することができる。
【００６６】
アルギニン残基のグアニジン基は、２,\~３−ブタンジオン、フェニルグリオキサール
およびグリオキサールなどの試薬を用いて複素環縮合生成物を形成させることによって修飾することができる。
【００６７】
スルフヒドリル基は、システイン酸への過ギ酸酸化などの方法；４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、４−クロロメルクリ安息香酸；２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、フェニル水銀塩化物および他の水銀化合物を使用する水銀誘導体の形成；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換
マレイミドとの反応；ヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いたカルボキシメチル化；ならびにアルカル性ｐＨでシアナートを用いたカルバモイル化によって修飾することができる。
【００６８】
トリプトファン残基は、例えば、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル臭化物もしくはハロゲン化スルホニルを用いたインドール環のアルキル化によって、またはＮ−ブロモスクシンイミドを用いた酸化によって修飾することができる。
【００６９】
チロシン残基は、テトラニトロメタンでニトロ化して、３−ニトロチロシン誘導体を形成させることによって修飾することができる。
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ジエチルピロカルボナートを用いたＮ−カルボエトキシル化によって、またはヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化によって修飾することができる。
【００７０】
ペプチド合成時に非天然アミノ酸および誘導体を取り込ませる例には、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニンおよび／またはＤ異性体のアミノ酸の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明によりまた、ヒトにおいて免疫原性にするために、本発明のポリペプチド、フラグメントまたは変異体をジニトロフェノールで共有結合的に修飾することが考えられる。
本発明の単離タンパク質（フラグメント、変異体、誘導体およびホモログを含む）は、当業者に知られている任意の好適な手法によって調製することができる。
【００７２】
例えば、タンパク質は、下記の工程：
（ｉ）１または複数の調節ヌクレオチド配列に作動的に連結された本発明の修飾ｎｈｈＡ核酸を含む発現構築物を調製する工程、
（ｉｉ）好適な宿主細胞を発現構築物でトランスフェクションまたは形質転換する工程、（ｉｉｉ）組換えポリペプチドを該宿主細胞において発現させる工程
を含む手法によって組換えポリペプチドとして調製することができる。
【００７３】
ＰＣＲによって本発明の修飾ｎｈｈＡ核酸を製造することを記載する多数の実施例が下記に示される。
１つの特定の態様において、ＰＣＲは、本明細書下記に記載されるようなスプライスオーバーラップＰＣＲである。この方法は、Ｈｏら、１９８９、Ｇｅｎｅ
７７ ５１において、そしてＨｏｒｔｏｎら、１９８９、Ｇｅｎｅ ７７ ６１によって記載される方法に基づく。これらはともに参照にとして本明細書に組み入れられる。
【００７４】
宿主細胞での発現のために、組換え核酸は、発現ベクターにおいて１または複数の調節配列に作動的に連結される。
「発現ベクター」は、プラスミドなどの自己複製する染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【００７５】
「作動的に連結された」により、該調節ヌクレオチド配列（１つまたは複数）が、転写を開始または調節またはそうでなければ制御するように本発明の組換え核酸に対して配置されていることが意味される。
【００７６】
様々な調節ヌクレオチド配列が、一般に、発現のために使用される宿主細胞に適している。多数のタイプの適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が様々な宿主細胞について
当技術分野では知られている。
【００７７】
典型的には、該１または複数の調節ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびにエンハンサー配列または活性化因子配列を含むことができるが、これらに限定されない。
【００７８】
当技術分野において知られている構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが本発明により考えられる。これらのプロモーターは、天然に存在するプロモーター、または２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。
【００７９】
好ましい態様において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は当技術分野では十分に知られており、使用される宿主細胞によって変化する。
【００８０】
ある態様において、発現ベクターは、下記に詳しく記載されるように、ｐｏｒＡプロモーターおよびカナマイシン選択性遺伝子を有するｐＣＯ１４Ｋである。この態様により、宿主細胞は、大腸菌および髄膜炎菌からなる群より選択される細菌である。
【００８１】
発現ベクターはまた、（典型的には、発現ベクターにより提供される）融合パートナーを含むことができ、その結果、本発明の組換えポリペプチドは、該融合パートナーとの融合ポリペプチドとして発現される。融合パートナーの主な利点は、融合パートナーにより、該融合ポリペプチドの同定および／または精製が助けられるということである。
【００８２】
該融合ポリペプチドを発現させるためには、融合パートナーおよび本発明のヌクレオチド配列の翻訳リーディングフレームが一致するように本発明によるヌクレオチド配列を発現ベクターに連結することが必要である。
【００８３】
融合パートナーの十分に知られている例には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびヘキサヒスチジン（ＨＩＳ６）が含まれるが、これらに限定されない。これらは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの精製には特に有用である。アフィニティークロマトグラフィーによって融合ポリペプチドを精製する場合、アフィニティークロマトグラフィーについて適切なマトリックスは、それぞれ、グルタチオン結合樹脂、アミロース結合樹脂、およびニッケル結合樹脂またはコバルト結合樹脂である。多くのそのようなマトリックスは、（ＨＩＳ６）融合パートナーについて有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムなどの「キット」の形態で得ることができる。
【００８４】
好ましい融合パートナーはＭＢＰであり、これは本明細書の実施例１１に記載される。
当技術分野において十分に知られている別の融合パートナーは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。この融合パートナーは、本発明の融合ポリペプチドを蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって同定できるようにする蛍光「タグ」として役立つ。ＧＦＰタグは、本発明の融合ポリペプチドの細胞レベル以下での局在化を評価するときに、または本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞を単離するために有用である。蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー方法がこの後者の適用において特に有用である。
【００８５】
好ましくは、融合パートナーはまた、第Ｘａ因子またはトロンビンなどのプロテアーゼ
切断部位を有する。これにより、適切なプロテアーゼは本発明の融合ポリペプチドを部分的に消化し、それにより本発明の組換えポリペプチドを融合ポリペプチドから遊離させることができる。遊離したポリペプチドは、その後、続くクロマトグラフィー分離によって融合パートナーから単離することができる。
【００８６】
本発明による融合パートナーはまた、特異的な抗体が得られる短いペプチド配列であることが通常である「エピトープタグ」をその範囲内に含む。特異的なモノクローナル抗体が容易に得られるエピトープタグの十分に知られている例として、ｃ−ｍｙｃタグ、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタグおよびＦＬＡＧタグが挙げられる。
【００８７】
本明細書前記のように、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドホモログをコードする核酸を含む該発現構築物で形質転換された宿主細胞を培養することによって製造することができる。タンパク質発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択とともに変化する。これは、日常的な実験によって当業者により容易に確認される。
【００８８】
発現に好適な宿主細胞は原核生物性または真核生物性であり得る。本発明に従ってポリペプチドを発現させるための１つの好ましい宿主細胞は細菌である。使用される細菌は大腸菌または髄膜炎菌であり得る。
【００８９】
好ましい態様において、宿主細胞は、ＰｏｒＡ、Ｏｐａ、Ｏｐｃまたは莢膜多糖を発現しないように改変され、かつ所望するリポ多糖表現型を発現する髄膜炎菌である。
あるいはまた、宿主細胞は、例えば、バキュロウイルス発現システムとともに用いることができるＳＦ９細胞などの昆虫細胞であり得る。
【００９０】
組換えタンパク質は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）（特に第１６節および第１７節）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（編者：Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．１９９５〜１９９９）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）（特に第１０章および第１６章）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ（編者：Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．１９９５〜１９９９）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）（特に第１章、第５章および第６章）に記載されるような標準的なプロトコルを使用して当業者によって都合よく調製することができる。
【００９１】
本発明の組換え修飾ＮｈｈＡタンパク質の好ましい発現方法および発現したタンパク質の検出方法は本明細書下記の実施例に示される。 ヌクレオチド配列
本発明は、本発明の修飾されたＮｈｈＡタンパク質をコードする単離核酸を提供する。
【００９２】
好ましくは、該単離核酸は、図１および図２に記載されるような１または複数のＮｈｈＡポリペプチド定常（Ｃ）領域をコードするヌクレオチド配列を有する。単離核酸は、図１および図２において同様に認められるような１または複数の非保存（Ｖ領域）アミノ酸をさらにコードすることができる。
【００９３】
そのような単離核酸の具体的な態様が配列番号２８〜３２および図５〜９に示される。
本明細書で使用される用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡおよびＤＮＡを意味し、該ＤＮＡはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む。
【００９４】
「ポリヌクレオチド」は８０個以上の連続したヌクレオチドを有する核酸であり、「オリゴヌクレオチド」は８０個未満の連続したヌクレオチドを有する。
「プローブ」は、例えば、ノーザンブロッティングまたはサザンブロッティングにおいて相補的な配列を検出するために好適に標識された一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。
【００９５】
「プライマー」は、通常、好ましくは１５個〜５０個の連続したヌクレオチドを有する一本鎖のオリゴヌクレオチドであり、これは、相補的な核酸「テンプレート」にアニーリングすることができ、かつＴａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）などのＤＮＡポリメラーゼの作用によってテンプレートに依存した様式で伸長させることができる。
【００９６】
本発明によりまた、本明細書前記に定義された本発明の核酸のホモログが考えられる。
そのような核酸ホモログは、全長の野生型ＮｈｈＡポリヌクレオチドをコードする核酸を含まない。
【００９７】
例えば、核酸ホモログは、免疫化によって髄膜炎菌に対する交差保護的な免疫性をもたらすために有用であり得る、本発明のＮｈｈＡのＶ領域およびＣ領域に構造的に関連するペプチドおよびポリペプチドをコードする。
【００９８】
１つの態様において、核酸ホモログは、本発明のポリペプチドホモログ（その変異体、フラグメントおよび誘導体を含む）をコードする。
別の態様において、核酸ホモログは、本発明の核酸と少なくとも６０％（好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する。
【００９９】
さらに別の態様において、核酸ホモログは、少なくとも低ストリンジェンシーの条件のもとで、好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシーの条件のもとで、そしてより好ましくは高ストリンジェンシーの条件のもとで、本発明の核酸にハイブリダイゼーションする。
【０１００】
「ハイブリダイゼーションするおよびハイブリダイゼーション」は、本明細書では、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列が対形成して、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッドが生じることを示すために使用される。相補的なヌクレオチド配列を含むハイブリッドの配列は、当技術分野において十分に知られているように相補的なプリン間およびピリミジン環で塩基対形成することによって生じる。
【０１０１】
これに関連して、修飾されたプリン（例えば、イノシン、メチルイノシンおよびメチルアデノシン）および修飾されたピリミジン（チオウリジンおよびメチルシトシン）もまた塩基対形成に関与し得ることが理解される。
【０１０２】
本明細書で使用される「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション時における温度およびイオン強度の条件ならびにある種の有機溶媒および／または界面活性剤の存在の有無をいう。ストリンジェンシーが高いほど、大きなレベルの相補性がハイブリダイゼーション中のヌクレオチド配列間に必要になる。
【０１０３】
「ストリンジェントな条件」は、高頻度の相補的な塩基を有する核酸のみがハイブリダイゼーションするそのような条件を示す。
本明細書では、低ストリンジェンシーの条件に対する参照には下記が含まれ、包含される：
（ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションについて、少なくとも約１％ｖ／ｖ〜少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩、そして４２℃での洗浄について、少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩；および
（ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションについて、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、そして室温での洗浄について、（ｉ）２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、または（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳ。
【０１０４】
中程度のストリンジェンシーの条件には下記が含まれ、包含される：
（ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションについて、少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩、そして４２℃での洗浄について、少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩；および
（ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションについて、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、そして室温での洗浄について、（ａ）２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、または（ｂ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳ。
【０１０５】
高ストリンジェンシーの条件には下記が含まれ、包含される：
（ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションについて、少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩、そして４２℃での洗浄について、少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩；
（ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションについて、１％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、そして６５℃を越える温度で約１時間の洗浄について、（ａ）０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、または（ｂ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳ；および（ｉｉｉ）６８℃以上で約２０分間の洗浄について、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ。
【０１０６】
一般に、洗浄は、Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％−１２℃で行われる。一般に、二重鎖ＤＮＡのＴｍは、ミスマッチした塩基の数が１％増大する毎に約１℃低下する。
上記にもかかわらず、ストリンジェントな条件は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら
（前掲）の第２．９章および第２．１０章に記載される（これは引用により本明細書に
組み込むものとする）、当技術分野では十分に知られている。当業者はまた、様々な要因を操作して、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化できることを認識する。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高い程度のハイブリダイゼーションを保証するために役立ち得る。
【０１０７】
典型的には、相補的なヌクレオチド配列が、ヌクレオチドをマトリックス（好ましくは、ニトロセルロースなどの合成メンブラン）に固定化する工程、ハイブリダイゼーション工程および検出工程を含むブロッティング技術によって同定される。サザンブロッティングが、相補的なＤＮＡ配列を同定するために使用され、ノーザンブロッティングが、相補的なＲＮＡ配列を同定するために使用される。ドットブロッティングおよびスロットブロッティングを、相補的なＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡのポリヌクレオチド配列を同定するために使用することができる。そのような技術は当業者によって十分に知られており、Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲）の２．９．１頁〜２．９．２０頁に記載されている。そのような方法によれば、サザンブロッティングは、ＤＮＡ分子をゲル電気泳動でサイズに従って分離すること、サイズ分離したＤＮＡを合成メンブランに転写すること、およびメンブランに結合させたＤＮＡを相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることを含む。
【０１０８】
ドットブロッティングおよびスロットブロッティングでは、ＤＮＡサンプルが合成メンブランに直接適用され、その後、上記のようにハイブリダイゼーションが行われる。
ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーにおいて相補的な核酸を同定するときには、プラークハイブリダイゼーションまたはコロニーハイブリダイゼーションの方法などによる代わりのブロッティング工程が使用される。この手法の他の典型的な例が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）の第８章〜第１２章に記載される（これは引用により本明細書に組み込むものとする）。
【０１０９】
典型的には、下記の一般的な手法を使用して、ハイブリダイゼーション条件を決定することができる。核酸は、上記に記載されるように合成メンブランにブロッティング／転写される。本発明の野生型ヌクレオチド配列が、上記に記載されるように標識され、その後、固定化されたヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションするこの標識された核酸の能力が分析される。
【０１１０】
当業者は、多数の要因がハイブリダイゼーションに影響することを認識する。放射能標識されたポリヌクレオチド配列の比活性は、検出可能なシグナルを得るためには、典型的には約１０８ｄｐｍ／μｇ以上にすべきである。比活性が１０８〜１０９ｄｐｍ／μｇである放射能標識されたヌクレオチド配列により、約０．５ｐｇのＤＮＡを検出することができる。検出を可能にするためには、十分なＤＮＡがメンブランに固定化されなければならないことが当技術分野では十分に知られている。ＤＮＡを過剰に固定化することが望ましい（通常的には１μｇ〜１０μｇ）。１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸（ＭＷ５００,\~０００）またはポリエチレングリコール６０００などの不活性なポリマーをハイブリ
ダイゼーション時に添加することによりまた、ハイブリダイゼーションの感度を増大させることができる（Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲）の２．１０．１０を参照のこと）。
【０１１１】
メンブランに固定化された核酸と標識された核酸とのハイブリダイゼーションから意味のある結果を達成するためには、十分な量の標識された核酸を、洗浄後に、固定化された核酸にハイブリダイゼーションさせなければならない。洗浄により、標識された核酸に対する所望する程度の相補性を有する固定化された核酸に対してのみ、標識された核酸がハイブリダイゼーションすることが保証される。
【０１１２】
固定化された核酸にハイブリダイゼーションした標識された核酸を検出する方法は、当技術分野では実施者に十分に知られている。そのような方法には、オートラジオグラフィー、化学発光、蛍光および比色法による検出が含まれる。
【０１１３】
別の態様において、本発明の核酸ホモログは下記の手法：
（ｉ）好適な宿主から核酸抽出物を得ること、
（ｉｉ）それぞれのプライマーが本発明のヌクレオチド配列の一部を含む、必要な場合には縮重しているプライマーを作製すること、および
（ｉｉｉ）該プライマーを使用して、核酸増幅技術により１または複数の増幅産物を該核酸抽出物から増幅すること
に従って調製することができる。
【０１１４】
好適には、宿主は細菌である。
好ましくは、宿主はナイセリア属の宿主である。
より好ましくは、宿主は髄膜炎菌またはナイセリア・ラクタミカ（Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ）である。
【０１１５】
核酸配列増幅法による有用なプライマーは、本明細書下記に詳しく記載される配列番号
４０〜５１を含む。
好適な核酸増幅技術は当業者には十分に知られており、これには下記が含まれる：例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲）の第１５章（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；例えば、米国特許第５，４２２，２５２号（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるような鎖置換増幅（ＳＤＡ）；例えば、Ｌｉｕら、１９９６、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８ １５８７、ならびに国際公開公報第９２／０１８１３号およびＬｉｚａｒｄｉら
（国際公開公報第９７／１９１９３号）（これらは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるようなローリングサークル複製（ＲＣＰ）；例えば、Ｓｏｏｋｎａｎａｎら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７ １０７７（これは引用により本明細書に組み込むものとする）により記載されるような核酸配列型増幅（ＮＡＳＢＡ）；および例えば、Ｔｙａｇｉら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３ ５３９５（これは引用により本明細書に組み込むものとする）により記載されるようなＱ−βレプリカーゼ増幅。
【０１１６】
本明細書で使用される「増幅産物」は、核酸増幅技術によって得られた核酸生成物をいう。
抗体 本発明によりまた、本発明の単離タンパク質、フラグメント、変異体および誘導体に対する抗体が考えられる。本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。抗体製造、精製および使用に適用され得る十分に知られている様々なプロトコルを、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ ＮＹ、１９９１〜１９９４）の第２章、およびＨａｒｌｏｗ、Ｅ．＆Ｌａｎｅ、Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）に見出すことができる。これらはともに引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１１７】
一般に、本発明の抗体は、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体に結合させられるか、またはそれらとコンジュゲート化される。例えば、抗体はポリクローナル抗体を含み得る。そのような抗体は、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体を産生種（マウスまたはウサギが含まれ得る）に注射して、ポリクローナル抗血清を得ることによって調製することができる。ポリクローナル抗体を製造する方法は当業者には十分に知られている。使用され得る例示的なプロトコルが、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）およびＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８、前掲）に記載される。
【０１１８】
産生種において得られるポリクローナル抗体の代わりに、モノクローナル抗体を、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６、４９５による論文（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるような標準的な方法を使用して、または、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）に記載されるそのより最近の改変法により、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体の１つまたは複数が接種された産生種に由来する脾臓または他の抗体産生細胞を不死化することによって製造することができる。
【０１１９】
本発明はまた、その範囲内において、上記に示されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のＦｃフラグメントまたはＦａｂフラグメントを含む抗体を包含する。または、抗体は、本発明のポリペプチドに対する単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）を含み得る。そのようなｓｃＦｖは、例えば、米国特許第５,０９１，５１３号、欧州特許第２３９，４０
０号、またはＷｉｎｔｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３４９ ２９
３による論文にそれぞれ記載される方法に従って調製することができる。これらは引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１２０】
本発明の抗体は、天然または組換えの髄膜炎菌ポリペプチドを単離する際のアフィニティークロマトグラフィーのために使用することができる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）の第９．５章に記載される免疫アフィニティークロマトグラフィー手法を参照することができる。
【０１２１】
抗体は、
（ｉ）発現ライブラリーをスクリーニングして、本発明の変異体ポリペプチドを同定するために、
（ｉｉ）免疫反応性フラグメントもしくは免疫反応制エピトープを同定するために、かつ／または
（ｉｉｉ）髄膜炎菌感染を検出するために
使用することができる。これらは本明細書下記に記載されるが、本発明はこれらの特定の使用に限定されない。
【０１２２】
髄膜炎菌の検出
個体における髄膜炎菌の存在または非存在は、該個体から生物学的サンプルを単離して、上記に記載される抗体または抗体フラグメントを生物学的サンプルと混合し、そしてサンプル中の髄膜炎菌の存在を示す特異的に結合した抗体または抗体フラグメントを検出することによって決定することができる。
【０１２３】
本明細書で使用される用語「生物学的サンプル」は、患者などの個体に由来する、抽出、未処理、処理、希釈または濃縮され得るサンプルをいう。好適には、生物学的サンプルは、全血、血清、血漿、唾液、尿、汗、腹水、腹膜液、滑液、羊水、脳脊髄液、皮膚生検物などからなる群より選択される。
【０１２４】
複合体の形成を明らかにする好適な技術はどれも使用することができる。例えば、標識が結合している本発明による抗体または抗体フラグメントを免疫アッセイにおいて用いることができる。そのような免疫アッセイとして、当業者に十分に知られている放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および免疫クロマトグラフィー技術（ＩＣＴ）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１２５】
例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）の第７章を参照することができる。これには、本発明に従って使用され得る様々な免疫アッセイが開示されている。免疫アッセイとして、当技術分野において理解されているような競合的アッセイを挙げることができる。
【０１２６】
抗体または抗体フラグメントと結合した標識は下記を含むことができる：
（Ａ）抗体または抗体フラグメントに対する標識の直接的な結合、
（Ｂ）抗体または抗体フラグメントに対する標識の間接的な結合、すなわち、
抗体または抗体フラグメントにその後で結合する別のアッセイ試薬に対する標識の結合、および
（Ｃ）抗体または抗体フラグメントのその後の反応生成物に対する結合。
【０１２７】
標識は、発色体、触媒、酵素、蛍光体、化学発光分子、ユーロピウム（Ｅｕ３4\~）な
どのランタニドイオン、放射性同位体および直接的な可視標識からなる群より選択することができる。直接的な可視標識の場合には、コロイド状の金属粒子または非金属粒子、色素粒子、酵素または基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、あるいはシグナ
ル生成物質などを含有する他の小胞を使用することができる。
【０１２８】
標識として有用な非常に多くの酵素が、米国特許明細書第４，３６６，２４１号、同第４，８４３，０００号および同第４，８４９，３３８号に開示されている（これらはすべて引用により本明細書に組み込むものとする）。本発明において有用な酵素標識には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが含まれる。酵素標識は、単独で、または溶液中の別の酵素と組み合わせて使用することができる。
【０１２９】
好適には、蛍光体は、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＬ）またはＲ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）を含む群より選択される。
【０１３０】
本発明はまた、髄膜炎菌による患者の感染を検出する方法にまで及ぶ。該方法は、患者に由来する生物学的サンプルを本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体と接触させる工程、および該ポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体と該血清中の髄膜炎菌特異的抗体との複合体の存在または非存在を決定する工程を含む。この場合、該複合体の存在により、該感染が示される。
【０１３１】
好ましい態様において、上記複合体の検出は、当技術分野において十分に知られているように、該ポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体を好適な標識で検出可能に修飾し、そして、例えば、上記に記載されるような免疫アッセイにおいてそのような修飾された化合物を使用することによって行われる。
【０１３２】
別の態様において、本発明は、髄膜炎菌細菌を含有することが疑われる生物学的サンプルにおける髄膜炎菌細菌を検出する方法を提供する。該方法は、患者から生物学的サンプルを単離する工程、該細菌の存在を示す本発明による核酸配列を該サンプルにおいて検出する工程を含む。該核酸配列の検出は、任意の好適な技術を使用して明らかにすることができる。例えば、標識された本発明による核酸を、当技術分野において十分に知られているように、患者から得られた核酸抽出物のサザンブロットにおけるプローブとして使用することができる。
【０１３３】
あるいはまた、標識された本発明による核酸は、患者から得られたＲＮＡ抽出物のノーザンブロットにおけるプローブとして利用することができる。
好ましくは、患者から得られた核酸抽出物は、本発明による核酸配列のセンス配列およびアンチセンス配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマー、またはその隣接配列と同時に、ＰＣＲなどの核酸増幅反応において、または例えば、国際公開公報第８９／０９３８５号（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるようなリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）において利用される。
【０１３４】
様々な自動化された固相検出技術もまた適している。例えば、非常に大規模な固定化プライマーアレイ（ＶＬＳＩＰＳ（商標））が、例えば、Ｆｏｄｏｒら
（１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１ ７６７）およびＫａｚａｌら（１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２ ７５３）により記載されるように核酸を検出するために使用される。上記の一般的な技術は当業者には十分に知られている。
【０１３５】
医薬組成物
本発明のさらなる特徴は、髄膜炎菌による感染から患者を保護する医薬組成物における有効成分としての、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体（「免疫
原因子」）の使用である。
【０１３６】
好適には、医薬組成物は、医薬として許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
「医薬として許容される担体、希釈剤または賦形剤」により、全身投与において安全に使用され得る固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質が意味される。特定の投与経路に依存して、当技術分野において十分に知られている様々な担体を使用することができる。これらの担体は、糖類、デンプン類、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸塩緩衝化溶液、乳化剤、等張的生理的食塩水、および塩類（塩酸塩、臭化物および硫酸塩を含む無機酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩およびマロン酸塩などの有機酸塩など）、および無パイロジェン水を含む群より選択することができる。
【０１３７】
医薬として許容される担体、希釈剤および賦形剤を記載する有用な参考文献はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ、１９９１）である。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１３８】
安全な投与経路はどれも、患者に本発明の組成物を与えるために用いることができる。例えば、経口的、直腸的、非経口的、舌下、口内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮的などを用いることができる。筋肉内注射および皮下注射が、例えば、免疫原組成物、ワクチンおよびＤＮＡワクチンを投与するために適している。
【０１３９】
投薬形態物には、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、溶液剤、シロップ、トローチ、カプセル、坐薬、エアロゾル剤、経皮パッチなどが含まれる。これらの投薬形態物にはまた、この目的のために特に設計された注射用または埋め込み用の徐放性デバイス、またはこの様式でさらに作用するように改変された他の形態のインプラントを挙げることができる。治療剤の制御された放出は、治療剤を、例えば、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸ならびにある種のセルロース誘導体（ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）を含む疎水性ポリマーで被覆することによって達成することができる。さらに、制御された放出は、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを使用することによって達成することができる。
【０１４０】
経口投与または非経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、粉末もしくは顆粒として、または水性液体、非水性液体、水中油型エマルションもしくは油中水型液体エマルションにおける溶液もしくは懸濁物として、本発明の１または複数の治療剤の所定量をそれぞれが含有する、カプセル、サッシェ剤または錠剤などの個別ユニット物として提供され得る。そのような組成物は、任意の製薬方法によって調製することができるが、すべての方法は、上記に記載されるような１または複数の免疫原因子を、１または複数の必要な成分を構成する担体とともに一緒にする工程を含む。一般に、組成物は、本発明の免疫原因子を液体担体または細かく分割された固体担体またはその両方と均一かつ十分に混合し、その後、必要な場合には、生成物を所望する剤形に成形することによって調製される。
【０１４１】
上記組成物は、投薬配合物と適合し得る様式で、そして髄膜炎菌感染から患者を保護するために免疫原性的に効果的であるような量で投与することができる。患者に投与される用量は、本発明の範囲においては、髄膜炎菌レベルの低下などの患者において都合の良い応答が長時間もたらされるか、または髄膜炎菌による感染を阻害するために十分でなければならない。投与される免疫原因子の量は、処置される対象者、ならびにその年齢、性別、体重および全体的な健康状態に依存し得る。これに関連して、投与するために必要な免疫原因子の正確な量は医師の判断に依存する。
【０１４２】
髄膜炎菌に対する処置または予防において投与される免疫原因子の効果的な量を決定する際に、医師は、循環している血漿中レベル、疾患の進行、および抗髄膜炎菌抗体の産生を評価することができる。いずれの場合においても、本発明の免疫原因子の好適な投薬量は当業者によって容易に決定することができる。そのような投薬量は、本発明の免疫原因子がナノグラム〜ミリグラムの程度であり得る。 上記組成物は治療ワクチンまたは予防ワクチンとして使用することができる。したがって、本発明は、本発明の免疫原因子の１つまたは複数を有効成分として含有するワクチンの製造にまで及ぶ。様々な適用可能な手法が、そのようなワクチンを製造するために考えられる。例示的な手法には、例えば、ＮＥＷ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＶＡＣＣＩＮＥＳ（１９９７、Ｌｅｖｉｎｅら、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｅｌ、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載される手法が含まれる。
【０１４３】
本発明による免疫原因子は、他の抗原のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを含む他の抗原と混合、コンジュゲート化または融合することができる。さらに、本発明による免疫原因子は、下記に記載されるように担体にコンジュゲート化することができる。
【０１４４】
本発明のハプテン性ペプチド（すなわち、コンジュゲート抗体と反応するが、それ自身は免疫応答を誘発することができないペプチド）が使用される場合、それを免疫原性担体とコンジュゲート化することができる。有用な担体が当技術分野では十分に知られており、これには、例えば、チログロブリン；アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）；破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス、大腸菌、ブドウ球菌および連鎖球菌に由来するトキシン、トキソイドもしくはトキシンの任意の変異交差反応性物質（ＣＲＭ）；ポリ（リシン：アルギン酸）などのポリアミノ酸；インフルエンザ；ロタウイルスＶＰ６、パルボウイルスのＶＰ１およびＶＰ２；Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質；Ｂ型肝炎ウイルスの組換えワクチンなどが含まれる。または、担体タンパク質または他の免疫原タンパク質のフラグメントまたはエピトープを使用することができる。例えば、本発明のハプテン性ペプチドを、細菌トキシン、トキソイドまたはＣＲＭのＴ細胞エピトープに結合させることができる。これに関連して、米国特許第５，７８５，９７３号を参照することができる。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１４５】
さらに、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体は、髄膜炎菌に対するか、または他の細菌もしくはウイルスに対するワクチン組成物における担体タンパク質として作用し得る。
【０１４６】
本発明の免疫原因子は、髄膜炎菌の抗原と組み合わせて、またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、大腸菌、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの病原性細菌を含む他の生物の抗原と組み合わせて多価サブユニットワクチンとして投与することができる。代わりに、またはさらに、本発明の免疫原因子は、髄膜炎菌のオリゴ糖成分または多糖成分と同時に投与することができる。
【０１４７】
ワクチンはまた、本明細書前記に規定されるような医薬として許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有することができる。
ワクチンおよび免疫原組成物は、当技術分野において十分に知られているようなアジュバントを含むことができる。本発明により考えられるアジュバントには、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物、Ｎ、Ｎ−ジコクタデシル−Ｎ’、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール類などの表面活性物質；ピランなどのポリアミン、デキストラン硫酸、ポリＩＣカルボポール；ムラミルジペプチドなどのペプチドおよび誘導体、ジメチルグリ
シン、ツフツィン；オイルエマルション；ならびにリン酸アルミニウム、水酸化アルミまたはミョウバンなどのミネラルゲル；リンホトキシン類、ＱｕｉｌＡおよび免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
アジュバントの例に関して、国際公開公報第９９／３６５４４号もまた参照される。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
ＤＮＡ送達によるワクチン接種
本発明の修飾されたＮｈｈＡタンパク質を含む発現構築物は、宿主を予防的または治療的に処置するためにヒトに投与することができる。これに関連して、発現構築物は、１または複数の修飾されたＮｈｈＡペプチド、ポリペプチド、これらのフラグメントまたは誘導体（これらはまとめて「免疫原因子」と呼ばれる）をコードすることができる。
【０１４９】
発現構築物にはまた、遺伝子治療構築物が挙げられ、これには、ワクシニアなどの特殊化された遺伝子治療ベクター、および遺伝子治療において有用なウイルスベクターが用いられる。後者には、Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉら、２０００、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８ ４７６、Ｂｒａｕｎ−Ｆａｌｃｏら、１９９９、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６ ４３２に記載されるなどのアデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のベクター、Ｂｕｃｈｓｈａｃｈｅｒら、２０００、Ｂｌｏｏｄ ９５ ２４９９に記載されるなどのレトロウイルスおよびレンチウイルスのベクター、ならびに単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来するベクターが含まれる。遺伝子治療ベクターおよび送達方法の一般的な総説を、Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６ ３５に見出すことができる。ナイセリア属細菌のタンパク質を使用する遺伝子治療に関して潜在的に好適な多数のベクター、および送達方法を記載する例示的な参考文献は、国際公開公報第９９／３６５４４号である。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１５０】
本発明の免疫原因子は、弱毒化ウイルス宿主により発現させることができる。「弱毒化ウイルス宿主」により、天然で実質的に無毒性であるか、または実質的に無毒性にされている、いずれかのウイルスベクターが意味される。ウイルスは、任意の好適な物理的手段（例えば、熱処理）または化学的手段（例えば、ホルムアルデヒド処理）によって実質的に無毒性にすることができる。「実質的に無毒性」により、その感染性が破壊されているウイルスが意味される。理想的には、ウイルスの感染性は、ウイルスの免疫原性を運ぶタンパク質に影響を及ぼすことなく破壊される。前記から、弱毒化ウイルス宿主が生ウイルスまたは不活化ウイルスを含むことが理解される。
【０１５１】
本発明によるワクチンにおいて有用であり得る弱毒化ウイルス宿主は、アデノウイルス、サイトメガロウイルスおよび好ましくはポックスウイルス（ワクシニアなど）を含むウイルスベクター（例えば、ＰａｏｌｅｔｔｉおよびＰａｎｉｃａｌｉ、米国特許第４，６０３，１１２号（これは引用により本明細書に組み込むものとする）を参照のこと）、ならびに弱毒化されたサルモネラ属菌株（例えば、Ｓｔｏｃｋｅｒ、米国特許第４，５５０，０８１号（これは引用により本明細書に組み込むものとする）を参照のこと）を含むことができる。生ワクチンは、実質的に長く持続する免疫性をもたらし得る長期間の刺激を生じさせるので特に好都合である。ナイセリア属細菌のタンパク質を使用する免疫化に関して潜在的に好適な様々なウイルスベクター、および送達方法を記載する別の例示的な参考文献は、国際公開公報第９９／３６５４４号である。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１５２】
多価ワクチンは、髄膜炎菌の種々のエピトープ（例えば、髄膜炎菌の他の表面タンパク質またはエピトープ）を発現する１または複数の微生物から調製することができる。さらに、他の病原性微生物のエピトープをワクチンに組み入れることができる。
【０１５３】
好ましい態様において、本発明による核酸配列を発現させるための組換えワクシニアウイルスの構築が含まれる。宿主に導入したとき、組換えワクシニアウイルスは免疫原因子を発現し、それにより宿主のＣＴＬ応答を誘発する。例えば、米国特許第４，７２２，８４８号を参照することができる。これは引用により本明細書に組み込むものとする。これには、免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法が記載されている。
【０１５４】
本発明の免疫原因子を用いた治療的投与または免疫化のために有用な広範囲の他のベクターが、本開示から当業者には明らかになる。
さらなる態様において、ヌクレオチド配列は、当技術分野において知られているような「裸のＤＮＡ」ワクチンの形態でワクチンとして使用することができる。例えば、本発明の発現ベクターを哺乳動物に導入することができる。この場合、発現ベクターは、例えば、Ｂａｒｒｙ、Ｍ．ら （１９９５、Ｎａｔｕｒｅ、３７７：６３２−６３５）（これは
引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるように、宿主が免疫応答を高めるポリペプチドのインビボでの産生を生じさせる。
【０１５５】
検出キット
本発明はまた、生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌を検出するためのキットを提供する。キットは、用いられる試験方法の性質に依存して、上記に記載される１または複数の特定の因子を含有する。これに関連して、キットは、本発明によるポリペプチド、フラグメント、変異体、誘導体、抗体、抗体フラグメントまた核酸の１つまたは複数を含むことができる。キットはまた、標識を検出するために適切な試薬、陽性対照物および陰性対照物、洗浄液、希釈緩衝液などを必要な場合には含むことができる。例えば、核酸に基づく検出キットは、（ｉ）本発明による核酸（これは陽性対照物として使用することができる）、（ｉｉ）本発明によるオリゴヌクレオチドプライマー、および必要な場合には、用いられる核酸増幅技術に依存するＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼなどを含むことができる。
【０１５６】
免疫反応性フラグメントの調製
本発明はまた、本発明によるポリペプチド、変異体または誘導体の免疫反応性フラグメントを同定する方法にまで及ぶ。この方法は、本質的には、ポリペプチド、変異体または誘導体のフラグメントを作製して、フラグメントを哺乳動物に投与すること、および哺乳動物における免疫応答を検出することを含む。そのような応答には、髄膜炎菌および／または該ポリペプチド、変異体もしく誘導体と特異的に結合するエレメントの産生、ならびに／あるいは髄膜炎菌感染に対する保護作用が含まれる。
【０１５７】
上記方法で免疫反応性について特定のフラグメントを試験する前に、様々な予測方法を使用して、特定のフラグメントが、天然の抗原と交差反応する抗体を得るために使用できるかどうかを推定することができる。これらの予測方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら
（前掲）の第１１．１４章に記載されるようにアミノ末端またはカルボキシ末端の配列に基づくことができる。または、これらの予測方法は、例えば、Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７ １０５）およびＨｏｐｐ＆Ｗｏｏｄｓ（１９８３、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０ ４８３）（これらは引用により本明細書に組み込むものとする）によって記載されるように親水性の予測に基づくか、または例えば、Ｃｈｏｏ＆Ｆａｓｍａｎ（１９８７、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７ ２５１）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）によって記載されるように二次構造の予測に基づくことができる。
【０１５８】
さらに、「エピトープマッピング」では、本発明のモノクローナル抗体を使用して、交
差保護をもたらすその能力を最初に調べ、その後、該抗体により認識されるエピトープを同定することによって交差反応性のエピトープが同定される。例示的な方法が、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）に示されている。
【０１５９】
一般には、１０残基〜１５残基からなるペプチドフラグメントにより最適な結果が得られる。６残基もの小さいペプチドまたは２０残基もの大きいペプチドも問題なく機能している。そのようなペプチドフラグメントは、その後、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら （前掲
）の第１１．１４節および第１１．１５節に記載されるように、キーホルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体分子に化学的にカップリングすることができる。
【０１６０】
ペプチドは、例えば、Ｈｏｏｇｅｒｈｏｕｔら （１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．６３ ３４７３）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるように合成的に環状化され得ることもまた理解される。
【０１６１】
ペプチドは、例えば、上記に議論されているように動物を免疫化するために使用することができる。ペプチドが選択された天然のポリペプチドまたは元のポリペプチドに対する抗体の力価を、その後、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら （前掲）の第１１．１６節および第
１１４節に記載されるように、例えば、放射免疫アッセイまたはＥＬＩＳＡによって測定することができる。
【０１６２】
その後、抗体は、当技術分野において十分に知られているように、硫酸アンモニウム分画またはクロマトグラフィーによって動物の適切な生物学的体液から精製することができる。抗体精製に対する例示的なプロトコルが、Ａｕｓｕｂｅｌら （前掲）の第１０．１
１節および第１１．１３節に示されている。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１６３】
天然のポリペプチドまたは元のポリペプチドに対する抗体の免疫反応性は、例えば、ウエスタンブロットなどの任意の適切な手法によって決定することができる。
機能的な遮断剤
国際公開公報第９９／３１１３２号に開示された様々な野生型のＮｈｈＡ／ＨｉａＮｍポリペプチドは接着性を有すると考えられている。これらのポリペプチドは、実際、表面抗原であるインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の付着因子とのある程度の類似性を有する。具体的には、これらのポリペプチドは、インフルエンザ菌のＨｉａタンパク質に対して約６７％の相同性であり（Ｂａｒｅｎｋａｍｐ＆Ｓｔ．Ｇｅｍｅ ＩＩＩ、１９９６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９
１２１５）、インフルエンザ菌のＨｓｆタンパク質に対して７４％の相同性である（Ｓｔ．Ｇｅｍｅ ＩＩＩら、１９９６、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
１７８
６２８１；および米国特許第５，６４６，２５９号）。これらの比較については、３のギャップ加重および０．０１の長さ加重が、ＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒａｕｘ、１９８４、前掲）を使用して使用された。したがって、これらのポリペプチドの機能を妨げることは、髄膜炎菌細菌が細胞に接着して侵入することがこれらのポリペプチドにより妨げられるので著しく治療的に有益である。機能を妨げることはいくつかの方法で達成することができる。
【０１６４】
例えば、本発明のポリペプチドと相互作用する細胞表面上の受容体を阻止する化学試薬またはポリペプチドなどの成分を投与することができる。これらは、受容体の部位を感染性生物と競合する。そのような成分は、例えば、本発明のポリペプチド、特にこれらのフ
ラグメントまたは機能的等価体、ならびに模倣体を含むことができる。
【０１６５】
用語「模倣体」は、本明細書において、タンパク質またはペプチドの特定の機能的領域に類似するように設計されている化学物質を示すために使用される。細菌が細胞表面に結合することを阻止する上記に記載された抗体に対して惹起された抗イディオタイプ抗体もまた使用することができる。または、本発明のポリペプチドにおける受容体結合部位と相互作用する成分は、髄膜炎菌による細胞感染を効果的に防止することができる。そのような成分は、阻止性の抗体、ペプチドまたは他の化学試薬を含むことができる。
【０１６６】
そのような成分、医薬として許容される担体と組み合わせられている医薬組成物、および髄膜炎菌感染に罹患している患者をそのような成分または組成物の投与により処置する方法はすべて、本発明のさらなる態様を構成する。
【０１６７】
本発明のポリペプチドは、上記方法においてそれらが使用される化合物をスクリーニングする際に使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、標識と結合させて、試験中の試薬の存在下で細胞培養物にさらすことができる。標識されたポリペプチドが細胞表面に結合することを阻害する試薬の能力を、その後、観測することができる。そのようなスクリーニングでは、標識されたポリペプチドを、大腸菌などの生物に対して直接使用することができる。または、髄膜炎菌そのものを、ポリペプチドの修飾された検出可能な形態を発現するように操作することができる。操作された髄膜炎菌菌株をこの方法において使用することは、タンパク質の三次構造が、野生型の細菌で発現した三次構造とより密接に類似する可能性が大きくなるので好ましい。
【０１６８】
本発明を容易に理解して、実際に実行し得るために、特に好ましい態様が、次に、下記の非限定的な実施例として記載される。
実施例１
ＮｈｈＡポリペプチドの定常領域および可変領域の同定
本発明者らは、１０菌株の髄膜炎菌間において保存的および／または非保存的であるＮｈｈＡアミノ酸配列を解明した。非保存領域は４つの可変領域（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４）に分けられ、定常領域はＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５に分けられる（これらは図１および表１に示される；配列番号１〜１１）。対応するヌクレオチド配列比較が図２に示される（配列番号１２〜２２）。
【０１６９】
実施例２
ＰＭＣ２１のＮｈｈＡポリペプチドの過剰発現
髄膜炎菌の菌株ＰＭＣ２１のｎｈｈＡ遺伝子によってコードされるＮｈｈＡタンパク質を、ｎｈｈＡ遺伝子がプロモーターに作動的に連結されている発現構築物を作製することによって過剰発現させた。
【０１７０】
下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、髄膜炎菌ＰＭＣ２１株のｎｈｈＡ核酸のオープンリーディングフレームをＰＣＲによって増幅した：
ＨＯＭＰ５’：
【０１７１】
【表１】
【０１７２】
これは、ＥａｇＩ制限部位（下線部）と、ＮｈｈＡの最初の７アミノ酸をコードする配列（「 」）とを含む。
ＨＯＭＰ３’ＡＮ：
【０１７３】
【表２】
【０１７４】
これは、ＮｃｏＩ制限部位（下線部）と、ｃ３株のｎｈｈＡオープンリーディングフレームの終了部の後の配列４８〜６１のヌクレオチドの逆相補鎖（太字）とを含む。
増幅産物は、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩの制限エンドヌクレアーゼで続いて消化される制限部位を含有した。
【０１７５】
サブクローニングのために使用されたプラスミドはｐＣＯ１４Ｋであった。このプラスミドは、髄膜炎菌菌株２９９６の隣接配列とともに髄膜炎菌の強く発現するクラス１の外膜タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置するｐｏｒＡプロモーターと、Ｒｏｕｐｐｅ ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｔら （Ｉｎｆｅｃｔ
Ｉｍｍｕｎ １９９６ ６４ ２７４５）によって記載されるような選択用のカナマイシン耐性遺伝子とを含有する。
【０１７６】
消化された増幅産物を、その後、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩの制限エンドヌクレアーゼで消化されたｐＣＯ１４Ｋに連結した。連結により、ｐｏｒＡオープンリーディングフレームの大部分がｎｈｈＡ増幅産物で置換された（図３）。これにより、配列番号１に示されるように５９１アミノ酸のポリペプチドをコードする組換え核酸発現構築物（配列番号１２に示されるオープンリーディングフレーム）が作製された。
【０１７７】
これは、強力なｐｏｒＡプロモーターの制御下で本発明のｎｈｈＡ核酸の発現を行わせる。翻訳は、ＨＯＭＰ５’の３１位から始まるＡＴＧコドンから開始される。ｐｏｒＡとｎｈｈＡとの融合体の形成を防止するために、ＨＯＭＰ５’配列は、上記の開始用ＡＴＧの前にＴＡＡ停止コドンを含有する。
【０１７８】
得られたプラスミドｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）を制限消化により線状化し、そしてＪａｎｉｋら（１９７６、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４ ７１）によって記載される方法を使用して髄膜炎菌７Ｇ２株を形質転換するために使用した。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する固体培地において、５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベーションすることによって選択した。カナマイシン耐性コロニーを選択し、一晩培養し、そして総細胞タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動的に分離し、その後、Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用してニトロセルロースメンブランに転写することによってＮｈｈＡポリペプチ
ドの過剰発現についてスクリーニングした。その後、メンブランをウサギ抗ＮｈｈＡ血清（国際公開公報第９９／３１１３２号に記載）およびアルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と順次インキュベーションし、その後、比色検出をＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。親株と比較して、より高いレベルでＮｈｈＡポリペプチドを発現するクローンを１つ単離した（図１１）。コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４、配列番号３３）が生成することが示される。
【０１７９】
このプラスミド構築物ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）は髄膜炎菌の任意の形質転換受容性菌株に形質転換することができる。
実施例３
Ｈ４１のＮｈｈＡポリペプチドの過剰発現
髄膜炎菌のＨ４１株のｎｈｈＡ遺伝子によってコードされるＮｈｈＡタンパク質を、実施例２に記載されるのと同じ方法を使用して過剰発現させた。これにより、配列番号２に示されるように５９１アミノ酸のポリペプチドをコードする組換え核酸発現構築物（配列番号１３に示されるオープンリーディングフレーム）が作製された。本実施例では、得られたプラスミドｐＩＰ５２（Ｈ４１）を線状化して、髄膜炎菌の７Ｇ２株に形質転換した。カナマイシン耐性コロニーを分析して、ウエスタン免疫ブロットによって調べたときにＮｈｈＡの過剰発現を示すコロニーを１つ選んだ（図１１）。コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４、配列番号３４）が生成することが示される。
【０１８０】
この方法は、他の髄膜炎菌菌株の野生型ｎｈｈＡ配列を含有する発現構築物を作製するために用いることができる。
実施例４
都合のよい制限部位を使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築
参照を容易にするために、ＰＭＣ２１株のｎｈｈＡ核酸によってコードされるＮｈｈＡポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１に示される。本発明者らは、菌株間の最も大きな可変性の領域を欠失させた野生型ＰＭＣ２１ｎｈｈＡの欠失変異体を作製した。野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドのアミノ酸１〜５４をコードする増幅産物を、下記のプライマーを使用してｎｈｈＡ核酸テンプレートからＰＣＲ増幅によって作製した：
ＨＯＭＰ５’：
【０１８１】
【表３】
【０１８２】
これは、過剰発現構築物ｐＩＰ５２を作製するために使用された同じオリゴヌクレオチドである。
ＮＨ３’ＢＧ：
【０１８３】
【表４】
【０１８４】
これは、ＢｇｌＩＩ制限部位（下線部）と、アミノ酸１３４（二重下線）および野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡのアミノ酸４９〜５４をコードする配列の逆相補鎖（太字）とを含む。
得られた増幅産物はＥａｇＩおよびＢｇｌＩＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を含んだ。ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）は、ｎｈｈＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始部の２０ｂｐ上流に単一のＥａｇＩ部位を含み、ＯＲＦ内に位置する単一のＢｇｌＩＩ部位を含む（図３を参照のこと）。したがって、ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）および増幅産物を、ＥａｇＩおよびＢｇｌＩＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に供し、連結して、コンピテントなＤＨ５α株の大腸菌細菌を形質転換するために使用した。これにより、ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）のＥａｇＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントがＰＣＲ産物で置換される。これにより、図５（配列番号２３）に示されるように５１２アミノ酸のポリペプチドをコードする組換え核酸発現構築物（図５に示されるオープンリーディングフレーム；配列番号２８）が作製された。このアミノ酸配列は野生型配列のアミノ酸１〜５４および１３４〜５９２を含み、それにより、野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドのＶ１領域の大部分、Ｖ２領域およびＣ２領域のすべて、ならびにＣ３領域の一部が欠失している。
【０１８５】
このプラスミドを制限消化により線状化して、髄膜炎菌の７Ｇ２株に形質転換した。実施例１に記載されるような方法を使用して、短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡを過剰発現するコロニーを１つ単離した（図１１）。
【０１８６】
コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４、配列番号３５）が生成することが示される。切断され得るシグナル配列の存在を確認するために、そして過剰発現したタンパク質の同一性を確認するために、外膜タンパク質を、界面活性剤サルコシルに溶解しない画分を単離することによって半精製した。
【０１８７】
単離された膜タンパク質を電気泳動で分離し、その後、ナイロンメンブランに転写した。過剰発現したタンパク質の位置がクーマシー染色によって明らかにされた。メンブランのこの領域を切り出して、タンパク質のＮ末端配列を決定した。このタンパク質の最初の１１アミノ酸はＸＸＥＴＤＬＴＳＶＧＴであった。これは、本実施例において規定される発現構築物によって発現することが予測されるアミノ酸配列のアミノ酸残基５２〜６２（６２を含む）に対応する。
【０１８８】
これは、ポリヌクレオチド配列内に存在する制限部位を使用した欠失体の例である。この構築物は任意の形質転換受容性の髄膜炎菌に形質転換することができる。
実施例５
都合のよい制限部位を使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築
Ｈ４１の野生型ｎｈｈＡ配列を含有する発現構築物を、実施例２に記載されるように作製した。得られた発現構築物をｐＩＰ５２（Ｈ４１）と名付けた。欠失変異体を、本実施例に概略される方法を使用して作製した。この場合、使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは下記の通りである：
ＨＯＭＰ５’：
【０１８９】
【表５】
【０１９０】
これは、過剰発現構築物ｐＩＰ５２を作製するために使用された同じオリゴヌクレオチドである。
ＮＨ３’ＳＴＵ
【０１９１】
【表６】
【０１９２】
これは、ＳｔｕＩ制限部位（下線部）と、アミノ酸１３４（二重下線）および野生型Ｈ４１ＮｈｈＡのアミノ酸４９〜５４をコードする配列の逆相補鎖（太字）とを含む。
得られた増幅産物は単一のＥａｇＩおよびＳｔｕＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。発現構築物ｐＩＰ５２（Ｈ４１）はこれらの制限部位を含有する。したがって、ｐＩＰ５２（Ｈ４１）および増幅産物を、ＥａｇＩおよびＳｔｕＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に供し、連結して、コンピテントなＤＨ５α株の大腸菌細菌を形質転換するために使用した。この連結により、ｐＩＰ５２（Ｈ４１）のＥａｇＩ／ＳｔｕＩフラグメントがＰＣＲ産物で置換される。これにより、図６および配列番号２４に示されるように５１３アミノ酸のポリペプチドをコードする組換え核酸発現構築物（図６および配列番号２９に示されるオープンリーディングフレーム）が作製された。このアミノ酸配列は野生型配列のアミノ酸１〜５４および１３４〜５９３を含み、それにより、野生型Ｈ４１ＮｈｈＡポリペプチドのＶ１領域の大部分、Ｖ２領域およびＣ２領域のすべて、ならびにＣ３領域の一部が欠失している。
【０１９３】
このプラスミドを制限消化により線状化して、髄膜炎菌の７Ｇ２株に形質転換した。実施例１に記載されるような方法を使用して、短縮型Ｈ４１ＮｈｈＡを過剰発現するコロニーを１つ単離した（図１１）。
【０１９４】
コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４、配列番号３６）が生成することが示される。
【０１９５】
この構築物は任意のコンピテントな髄膜炎菌に形質転換することができる。
実施例６
スプライスオーバーラップＰＣＲを使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築
ＮｈｈＡをコードするヌクレオチドから可変領域を欠失するために都合の良い制限部位を使用することに加えて、変異体はまた、Ｈｏら（１９８９、前掲）およびＨｏｒｔｏｎ、Ｒ．Ｍ．ら （１９８９、前掲）により記載されるような「スプライスオーバーラップ
発現」ＰＣＲの使用によっても構築することができる。この方法では、定常領域をコードするが、可変領域が欠失しているポリヌクレオチドを作製することができる（図５Ａ、５Ｂ、５Ｃを参照のこと）。
【０１９６】
本実施例では、Ｃ１領域およびＣ５領域を含有し、他の領域のすべてを欠失させた構築物が作製された（図５Ａを参照のこと）
下記のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＭＣ２１株の染色体ＤＮＡからＣ１領域（図１を参照のこと）に対応するＤＮＡを増幅するためにＰＣＲ反応において使用した：
ＨＯＭＰ５’：
【０１９７】
【表７】
【０１９８】
これは、過剰発現構築物ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）を作製するために使用された同じオリゴヌクレオチドである。
ＳＯ−Ｃ：
【０１９９】
【表８】
【０２００】
この配列は、ＰＭＣ２１株の野生型ＮｈｈＡのＣ５領域の開始部のアミノ酸２３７〜２４１（下線部）およびＣ１領域の終了部のアミノ酸４５〜５２（太字）をコードする配列の逆相補鎖である。
この反応の増幅産物はＨＯＭＰ５’／ＳＯ−Ｃである。
【０２０１】
下記のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＭＣ２１株の染色体ＤＮＡからＣ５を増幅するためにＰＣＲ反応において使用した：
ＳＯ−Ｄ：
【０２０２】
【表９】
【０２０３】
これはＣ５の開始部のアミノ酸２３７〜２４４をコードする（下線部はプライマーＳＯ−Ｃの逆相補鎖を示す）
ＨＯ３’ＡＮ：
【０２０４】
【表１０】
【０２０５】
これは、ｐＩＰ５２の構築において使用された同じプライマーである。
この反応の増幅産物はＳＯ−Ｄ／ＨＯ３’ＡＮである。
ＨＯＭＰ５’／ＳＯ−ＣおよびＳＯ−Ｄ／ＨＯ３’ＡＮの増幅産物を、電気泳動で分離した後のアガロースゲルから精製し、混合して、ＨＯＭＰ５’およびＨＯ３’ＡＮのプライマーを使用するさらなる増幅に供した。得られた増幅産物は、ＰＭＣ２１の野生型ＮｈｈＡのアミノ酸１〜５２および３３７〜５９１をコードする。この増幅産物を、実施例１に記載されるように、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩを用いた制限消化に供し、そしてｐＣＯ１４Ｋにクローン化した。この組換え分子はＣ１およびＣ５を含有し、したがってＶ１〜Ｖ４およびＣ２〜Ｃ４の領域を欠失している。このオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が図７および配列番号３０に示され、このヌクレオチド配列に由来する予想されるポリペプチド配列が図７および配列番号２５に示される。
【０２０６】
このプラスミドを制限消化により線状化して、髄膜炎菌の７Ｇ２株に形質転換した。実施例２に記載されるような方法を使用して、短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡを過剰発現するコロニーを１つ単離した。
【０２０７】
コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４；配列番号３７）が生成することが示される。 このプラスミドは髄膜炎菌の任意の形質転換受容性菌株に形質転換することができる。
【０２０８】
実施例７
スプライスオーバーラップＰＣＲを使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築
類似する方法を使用して、ＮｈｈＡの様々な領域をコードする組換えポリヌクレオチドを作製できることが理解される。下記の方法を使用して、Ｃ１、Ｃ４、Ｖ４およびＣ５の領域を含む構築物を作製することができる（図５Ｂを参照のこと）。
【０２０９】
Ｃ１領域が、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される：
ＨＯＭＰ５’：
【０２１０】
【表１１】
【０２１１】
ＳＯ−Ｅ：
【０２１２】
【表１２】
【０２１３】
これは、ＰＭＣ２１株の野生型ＮｈｈＡのＣ４領域の開始部のアミノ酸２１１〜２１５（下線部）およびＣ１領域の終了部（太字）の逆相補鎖をコードする。
この反応の増幅産物はＨＯＭＰ５’／ＳＯ−Ｅである。
【０２１４】
下記のオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＭＣ２１株の染色体ＤＮＡから領域Ｃ４−Ｖ４−Ｃ５を増幅するためにＰＣＲ反応において使用される：
ＳＯ−Ｆ：
【０２１５】
【表１３】
【０２１６】
これはＣ４の開始部のアミノ酸２１１〜２１８をコードする（下線部はプライマーＳＯ−Ｅの逆相補鎖を示す）
ＨＯ３’ＡＮ：
【０２１７】
【表１４】
【０２１８】
この反応の増幅産物はＳＯ−Ｆ／ＨＯＭＰ３’である。
ＨＯＭＰ５’／ＳＯ−ＥおよびＳＯ−Ｆ／ＨＯ３’ＡＮの増幅産物は、電気泳動で分離された後のアガロースゲルから精製され、混合されて、ＨＯＭＰ５’およびＨＯ３’ＡＮのプライマーを使用するさらなる増幅に供される。得られる生成物は、ＰＭＣ２１の野生型ＮｈｈＡのアミノ酸１〜５２および２１１〜５９１をコードする。この増幅産物は、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩを用いた制限消化に供され、そしてｐＣＯ１４Ｋにクローン化される。この組換え分子は、Ｃ１、Ｃ４、Ｖ４およびＣ５を含有し、したがってＶ１〜Ｖ３およびＣ２〜Ｃ３の領域を欠失している。このオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が図８および配列番号３１に示され、このヌクレオチド配列に由来する予想されるポリペプチド配列が図８および配列番号２６に示される。コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４；配列番号３８）が生成することが示される。
【０２１９】
この構築物は任意の形質転換受容性の髄膜炎菌に形質転換することができる。
実施例８
スプライスオーバーラップＰＣＲを使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築
類似する方法を使用して、ＮｈｈＡの様々な領域をコードする組換えポリヌクレオチドを作製できることが理解される。下記の方法を使用して、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５の領域を含む構築物を作製することができる（図５Ｃを参照のこと）。
【０２２０】
Ｃ１およびＣ２が、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される：
ＨＯＭＰ５’：
【０２２１】
【表１５】
【０２２２】
ＳＯ−Ｇ：
【０２２３】
【表１６】
【０２２４】
これは、ＰＭＣ２１株のＣ３領域の開始部のアミノ酸１２５〜１２９（下線部）、Ｃ２領域のすべて（アミノ酸１０９〜１２０、太字で二重下線部）、およびＣ１領域の終了部（アミノ酸４６〜５２、太字）の逆相補鎖をコードする。
この反応の増幅産物はＨＯＭＰ５’／ＳＯ−Ｇである。
【０２２５】
Ｃ３領域およびＣ４領域の一部が、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される：
ＳＯ−Ｈ：
【０２２６】
【表１７】
【０２２７】
これはＣ３の開始部のアミノ酸１２５〜１３２をコードする（下線部はプライマーＳＯ−Ｇの逆相補鎖を示す）
ＳＯ−Ｉ：
【０２２８】
【表１８】
【０２２９】
これは、Ｃ３領域の終了部のアミノ酸１８２〜８８（下線部）、およびＣ４領域のアミノ酸２１１〜２２２（太字）の逆相補鎖をコードする。
この反応の増幅産物はＳＯ−Ｈ／ＳＯ−Ｉである。
【０２３０】
ＨＯＭＰ５’／ＳＯ−ＧおよびＳＯ−Ｈ／ＳＯ−Ｉの増幅産物は、電気泳動で分離された後のアガロースゲルから精製され、混合されて、ＨＯＭＰ５’およびＳＯ−Ｉのプライマーを使用するさらなる増幅に供され、アミノ酸１〜５２、１０３〜１１４、１２５〜１８８および２１１〜２２２（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４の一部の領域）をコードする生成物が得られる。
【０２３１】
Ｃ５領域およびＣ４領域の一部が、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される：
ＳＯ−Ｊ：
【０２３２】
【表１９】
【０２３３】
これは、ＰＭＣ２１株の野生型ＮｈｈＡのＣ４のアミノ酸２１８〜２２９およびＣ５のアミノ酸２３７〜２４３をコードする（太字下線部はプライマーＳＯ−Ｉの逆相補鎖を示す）
ＨＯ３’ＡＮ：
【０２３４】
【表２０】
【０２３５】
この反応の増幅産物はＳＯ−Ｊ／ＨＯ３’ＡＮである。
ＨＯＭＰ５’／ＳＯ−ＩおよびＳＯ−Ｊ／ＨＯ３’ＡＮの増幅産物は、電気泳動で分離された後のアガロースゲルから精製され、混合されて、ＨＯＭＰ５’およびＨＯ３’ＡＮのプライマーを使用するさらなる増幅に供される。得られる生成物は、ＰＭＣ２１株の野生型ＮｈｈＡのアミノ酸１〜５２、１０３〜１１４、１２５〜１８８、２１１〜２２９および２３７〜５９１をコードする。得られた生成物は、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩを用いた制限消化に供され、そしてｐＣＯ１４Ｋにクローン化される。この組換え分子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５の領域を含有し、したがってＶ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４の領域を欠失している。このオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が図９および配列番号３２に示され、このヌクレオチド配列に由来する予想されるポリペプチド配列が図９および配列番号２７に示される。コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の４９アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４；配列番号３９）が生成することが示される。
【０２３６】
この構築物は髄膜炎菌の任意の形質転換受容性菌株に形質転換することができる。
実施例９ 過剰発現したＮｈｈＡポリヌクレオチドの精製
前記実施例に記載されるような組換えＮｈｈＡポリペプチドは下記の手法によって単離することができる。細菌を５％ＣＯ２の雰囲気において３７℃で一晩（１２時間〜１４時間）生育させる（本実施例では、培地は、Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ塩基が補充されたＢＨＩ寒天であった。他の生育培地が当業者には十分に知られている）。１０枚の２５ｍＬ寒天平板に由来する細菌を集め、ＨＣｌでｐＨ８．０に調節された１０ｍＭ Ｔｒｉｓの２５ｍＬに懸濁した。２％サルコシルを含有する等容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加え、混合物を４℃で１時間穏やかに混合した。これを１００，０００ｘｇにおいて２０℃で７０分間遠心分離して、上清を捨てた。ペレットを、２５ゲージの針に通すことによって、１％サルコシルを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）の２５ｍＬに再懸濁した。これを１００，０００ｘｇにおいて２０℃で７０分間遠心分離して、上清を捨てた。ペレットを、２５ゲージの針に通すことによって、１０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。この画分は、細胞のサルコシル不溶性成分を含み、外膜タンパク質が濃縮されている。（さらなる工程を、残留するサルコシル界面活性剤を除くために取り入れることができる。それにより、タンパク質溶液は、４℃において、例えば、１０
ｍＭのＴｒｉｓ．Ｃｌ（ｐＨ８．０）またはＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）の１００倍容量〜１０００倍容量に対して４時間〜８時間の４回のサイクルにわたって透析される）。
【０２３７】
２８０ｎｍの波長における吸光度によって、またはＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用することによって懸濁物中のタンパク質濃度を測定した後、１％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）、２％β−メルカプトエタノールを含有する溶液に１０ｍｇのタンパク質を含有する約１ｍＬの溶液をＢｉｏＲａｄ ｍｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａｎＩＩ装置において１．５ｍｍ厚の６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。高分子量のＮｈｈＡを、ＢｉｏＲａｄ「ｍｉｎｉ Ｗｈｏｌｅ ｇｅｌ Ｅｌｕｔｅｒ」を使用してゲルから溶出させた。各溶出画分の約１０％を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、その後、クーマシー染色することによって調べた。他のタンパク質を本質的に含まないＮｈｈＡ含有画分をまとめた。この手順は、実施例２に記載されるような過剰発現させた成熟ＮｈｈＡ（配列番号１）、実施例４に記載されるような過剰発現させたＢｇｌＩＩ欠失変異体ＮｈｈＡ（配列番号２３）、および実施例６に記載されるような過剰発現させたＮｈｈＡ欠失変異体（配列番号２５）を単離するために行われた。単離タンパク質は図１２に示される。
【０２３８】
実施例１０
精製されたＮｈｈＡ欠失変異体ポリヌクレオチドの免疫原性
マウスに、精製された野生型ＮｈｈＡポリヌクレオチド、および前記実施例に記載される欠失変異体を接種した。１つの群において、各Ｂａｌｂ／ｃマウスには、約１３０μｇのＰＭＣ２１ＮｈｈＡがＭＰＬ＋ＴＤＭ（商標）アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）とともに０日目に皮下接種され、そして１４日目に１１５μｇが皮下接種された。別の群では、各マウスには、約１２０μｇのタンパク質がＭＰＬ＋ＴＤＭ（商標）アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）とともに０日目に皮下接種され、そして１４日目に１９０μｇが皮下接種された。さらに別の群では、各マウスには、約２６０μｇのタンパク質がＭＰＬ＋ＴＤＭ（商標）アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）とともに０日目に皮下接種され、そして１４日目に１２４０μｇが皮下接種された。血液サンプルを２１日目に採取して、血清を抽出した。これらの血清を、全長型のＰＭＣ２１ＮｈｈＡを認識する抗体の存在についてウエスタン免疫ブロットで試験した（図１３）。Ｐ６（ＰＭＣ２１のＮｈｈＡを過剰発現する）および２Ａ株（ＮｈｈＡの発現が失われている）のＯＭＣ調製物（５ｍｇ）を、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｎｉ ＰｒｏｔｅａｎＩＩ電気泳動装置を使用して６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をニトロセルロースに電気泳動的に転写して、フィルターを３ｍｍ細片に切断し、その後、５％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキングした。マウス血清を５％スキムミルク粉末で１：１０００倍および１：１００００倍に希釈して、ニトロセルロース細片とともにインキュベーションした。抗体の結合を、アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を使用し、その後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ）を用いた比色検出により検出した。図１３から理解され得るように、ＮｈｈＡ欠失変異体または全長型の成熟ＮｈｈＡポリペプチドを接種することによって、全長型の成熟ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドに対する免疫応答を誘発させることが可能である。
【０２３９】
実施例１１
大腸菌における欠失変異体の発現
本発明の変異体ポリペプチドを髄膜炎菌において発現させることに加えて、本発明の変異体ポリペプチドは大腸菌細菌においても発現させることができる。実施例４〜８の組換えｎｈｈＡ欠失変異体はどれも、ＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用することができる。使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは、国際公開公報第９９／３１１３２号に記載される通りであり得る（その明細書の配列番号２４および配列番号２５など）。増幅産物をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの酵素で制限消化して、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで
制限消化されたプラスミドｐＭＡＬＣ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と連結し、得られたプラスミドをコンピテントな大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。得られた菌株は、ｐＭＡＬＣ２の製造者が指示する条件を使用して高レベルの組換えタンパク質を発現させるために誘導することができる。得られる組換えタンパク質は、マルトース結合タンパク質と本発明の欠失変異体ＮｈｈＡポリペプチドとの融合体である。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離、その後、Ｍｉｎｉ−Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｅｌｕｔｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を製造者の説明書に従って使用する電気溶出によって半精製することができる。その後、半精製された融合タンパク質は、ＰＢＳに対して透析され、その後、プロテアーゼ酵素の第Ｘａ因子で消化して、マルトース結合タンパク質成分を組換えＮｈｈＡタンパク質から切断することができる。組換えＮｈｈＡタンパク質は、例えば、Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ ＵＳＡ、１９９３）によって記載されるような標準的な方法によって精製することができる。
【０２４０】
本明細書中を通して、目的は、本発明をいずれか１つの態様または特徴の特定の集合に限定することなく、本発明の好ましい態様を記載することである。したがって、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な改変および変化を例示された特定の態様において行い得ることが当業者によって理解される。
【０２４１】
本明細書で参照されるすべてのコンピュータープログラム、アルゴリズム、特許および科学的文献は参照により組み込むものとする。
【０２４２】
【表２１】
【０２４３】
【表２２】
【０２４４】
（表の説明）
表１：髄膜炎菌の示された１０菌株のそれぞれから得られたＮｈｈＡポリペプチドの保存領域（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５）および可変領域（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４）のアミノ酸の同定。関連する配列番号もまた示される。第１欄＝菌株名。配列番号１〜９は同時係属中の出願である国際公開公報第９９／３１１３２号に以前に記載された。Ｚ２４９１株のＮｈｈＡおよびｎｈｈＡの配列はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｎ＿ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ／から得られた。第２欄＝Ｃ１領域のアミノ酸番号。第３欄＝Ｖ１領域のアミノ酸番号。第４欄＝Ｃ２領域のアミノ酸番号。第５欄＝Ｖ２領域のアミノ酸番号。第６欄＝Ｃ３領域のアミノ酸番号。第７欄＝Ｖ２領域のアミノ酸番号。第８欄＝Ｃ４領域のアミノ酸番号。第９欄＝Ｖ４領域のアミノ酸番号。第１０欄＝Ｃ５領域のアミノ酸番号。コンセンサス配列（配列番号１１）のアミノ酸番号もまた示されていることには留意すること。
【０２４５】
表２：アミノ酸置換の表
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）表面抗原の修飾型を構成する新規なタンパク質、そのような新規なペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸、診断におけるそれらの使用、治療ワクチンおよび予防ワクチンにおけるそれらの使用、ならびに医薬のデザインおよび／またはスクリーニングにおけるこれらの使用に関する。より詳細には、非保存アミノ酸を欠失させることによって、本発明の修飾型表面抗原は、対応する野生型の表面抗原から予想されるよりも広い範囲の髄膜炎菌菌株に対して効果的な免疫化をもたらすワクチンにおいて有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
髄膜炎菌はグラム陰性細菌であり、髄膜炎菌性の髄膜炎および敗血症の原因菌である。その唯一の知られている宿主はヒトであり、集団の約１０％が無症状的に髄膜炎菌を保有する場合がある（Ｃａｕｇａｎｔら、１９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３２ ３２３）。
【０００３】
髄膜炎菌は多糖の莢膜を発現し得る。これにより、この細菌を、発現した莢膜の性質に従って分類することができる。髄膜炎菌の少なくとも１２種の血清群（Ａ、Ｂ、Ｃ、２９−Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺ）が存在する。これらのうち、Ａ、ＢおよびＣの血清群が髄膜炎菌性疾患の９０％を引き起こしている（Ｐｏｏｌｍａｎら、１９９５、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ４ １３）。ＡおよびＣの血清群に対するワクチンを得ることができるが、血清群Ｂの莢膜多糖は免疫原性が良くなく、ヒトにおいて保護を誘導しない。
【０００４】
したがって、他の膜成分および細胞外成分が、現在、ワクチンに含ませるためのその好適性について調べられている。例として、クラス１、２および３の外膜タンパク質（ポリン；ｐｏｒ遺伝子によってコードされる）、ならびにクラス４の外膜タンパク質（Ｒｍｐ）およびクラス５の外膜タンパク質（Ｏｐａｃｉｔｙタンパク質；ｏｐａ遺伝子およびｏｐｃ遺伝子によってコードされる）が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、今日まで、これらの候補物はどれも、特に小児において完全な保護を誘導することができない（Ｒｏｍｅｒｏら、１９９４、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ、７ ５５９；Ｐｏｏｌｍａｎら、１９９５、前掲）。
【０００６】
効果的なワクチンを作製するためには、大部分の菌株に存在し、かつ保護的な免疫応答（例えば、殺菌性抗体）を誘導することができる髄膜炎菌成分を同定することが必要である。
【０００７】
これに関連して、国際公開公報第９９／２４５７８号、同第９９／３６５４４号、同第９９／５８６８３号および同第９９／５７２８０号が参照される。これらはそれぞれが引用により本明細書に組み込むものとされ、そして髄膜炎菌に対して免疫化するワクチンにおいて有用であり得る候補タンパク質を多数記載する。
【０００８】
これに関連して、国際公開公報第９９／３１１３２号、およびＰｅａｋら、２０００、
ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８ ３２９が特に参照される。これらはそれぞれが引用により本明細書に組み込むものとされ、そして髄膜炎菌の多数の異なる菌株から単離された新規な表面抗原を記載する。そのような表面抗原およびその対立遺伝子変異体は、本明細書の目的のためにはＮｈｈＡと呼ばれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明者らは、ＮｈｈＡ表面抗原が、髄膜炎菌の菌株間で変動し得るポリペプチド領域と、菌株間で保存されている他の領域とを有することを発見した。この可変性領域は、髄膜炎菌の特定の菌株に由来するＮｈｈＡ抗原を取り込むワクチンがその特定の菌株に対する優先的な免疫化を生じさせやすいように、免疫原性であり、菌株特異的な免疫応答を誘発しやすいと考えられる。その結果、本発明者らは、野生型ＮｈｈＡによって誘発される免疫応答と同じくらい菌株特異的でない免疫応答を誘発する修飾されたＮｈｈＡポリペプチドを製造することを試みた。この修飾されたＮｈｈＡ抗原は、本明細書下記に記載されるように、髄膜炎菌に対する治療ワクチンおよび／または予防ワクチンを製造するために有用である。免疫応答を主に保存されたエピトープに対して指向させることによって、そのようなワクチンは、野生型ＮｈｈＡによる免疫化の後に期待されるよりも広いスペクトルの髄膜炎菌菌株に対して効果的な免疫化を生じさせるはずである。
【００１０】
したがって、本発明は、一般には、ＮｈｈＡポリペプチドの保存されたアミノ酸を有する単離タンパク質に関する。
したがって、本発明のタンパク質は、対応する野生型ＮｈｈＡポリペプチドと比較して、非保存アミノ酸の１または複数の欠失を有し得る。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、ＮｈｈＡポリペプチドの１２個以上の連続した保存アミノ酸の配列を含み、かつ野生型ＮｈｈＡポリペプチドを含まない単離タンパク質を提供する。
【００１２】
好適には、本発明のタンパク質は免疫応答を誘発することができる。
好ましくは、免疫応答は、該対応する野生型ＮｈｈＡポリペプチドによって誘発される免疫応答よりも小さい菌株特異性を有する。
【００１３】
より好ましくは、該免疫応答は、髄膜炎菌の１または複数の菌株に対する保護をもたらし、またはさらにより好ましくは髄膜炎菌の多数の菌株に対する保護をもたらす。
野生型ＮｈｈＡポリペプチドの配列が図１に例示される（配列番号１〜１０）。
【００１４】
コンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）アミノ酸配列もまた図１に示される（配列番号１１）。
本発明の単離タンパク質は、好ましくは、本明細書では図１におけるＣ１領域、Ｃ２領域、Ｃ３領域、Ｃ４領域およびＣ５領域と呼ばれるＮｈｈＡポリペプチドの定常領域を１つまたは複数含む。
【００１５】
好適には、図１においてＶ１領域、Ｖ２領域、Ｖ３領域またはＶ４領域と呼ばれるＮｈｈＡポリペプチドの可変領域の１または複数の非保存アミノ酸が、野生型ＮｈｈＡポリペプチドに関して欠失していることがこの態様に従って理解される。
【００１６】
好ましくは、Ｖ１領域または少なくともその実質的な部分が欠失している。
特定の態様において、単離タンパク質は、「本発明の修飾されたＮｈｈＡポリペプチド」の例である図５〜９（配列番号２３〜２７）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する。図１４（配列番号３３〜３９）には、Ｎ末端シグナル配列の除去をもたらすこと
が予想される「成熟」ポリペプチドのさらなる例が示される。
【００１７】
第２の態様により、本発明は、第１の態様によるポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
野生型ｎｈｈＡの核酸配列が図２に例示される（配列番号１２〜２１）。
【００１８】
コンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）核酸配列もまた図２に示される（配列番号２２）。
好ましくは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５の領域が、図２に示されるそれぞれのヌクレオチド配列によってコードされる。
【００１９】
好ましくは、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４の領域が、図２に示されるそれぞれのヌクレオチド配列によってコードされる。
特定の態様において、本発明の単離核酸は、「本発明の修飾ｎｈｈＡ核酸」の特定の例である図５〜９（配列番号２８〜３２）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を有する。
【００２０】
第１および第２の態様による本発明は、本発明の単離タンパク質および核酸のホモログ、フラグメント、変異体および誘導体にまで及ぶ。
野生型のＮｈｈＡポリペプチドおよびｎｈｈＡ核酸は本発明の範囲から特に除かれる。
【００２１】
第３の態様において、本発明は、発現ベクターおよび第２の態様による核酸を含む発現構築物にある。この場合、該配列は、該発現ベクターにおいて１または複数の調節核酸に作動的に連結されている。
【００２２】
第４の態様において、本発明は、第３の態様による発現構築物を含む宿主細胞を提供する。
本発明の第５の態様では、第１の態様による組換え単離タンパク質を製造する方法であって、 （ｉ）第３の態様による発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが該宿主細胞において発現されるように培養する工程と、
（ｉｉ）該組換えタンパク質を単離する工程と、
から成る方法を提供する。
【００２３】
第６の態様において、本発明は、本発明のタンパク質、そのフラグメント、変異体または誘導体に結合する抗体または抗体フラグメントを提供する。
第７の態様において、本発明は、髄膜炎菌を含むことが疑われる生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌を検出する方法であって、
（ｉ）生物学的サンプルを個体から単離する工程と、
（ｉｉ）前記の抗体または抗体フラグメントを生物学的サンプルと接触させる工程と、
（ｉｉｉ）髄膜炎菌の存在を示す特異的に結合した抗体または抗体フラグメントを検出する工程と、
から成る方法を提供する。
【００２４】
第８の態様において、髄膜炎菌細菌を含むことが疑われる生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌細菌を検出する方法であって、
（ｉ）生物学的サンプルを患者から単離する工程と
、（ｉｉ）該細菌の存在を示す、前記第２の態様による核酸配列を該サンプルにおいて検出する工程と、
から成る方法を提供する。
【００２５】
第９の態様において、本発明は、髄膜炎菌による個体の感染を診断する方法であって、（ｉ）個体から得られた生物学的サンプルを本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体と接触させる工程と、
（ｉｉ）該ポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体と該サンプル中の髄膜炎菌特異的抗体との複合体の存在の有無を測定する工程であって、該複合体の存在により該感染が示される工程と、
から成る方法を提供する。
【００２６】
好ましくは、個体は哺乳動物である。
より好ましくは、個体はヒトである。
第１０の態様において、本発明はまた、生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌細菌を検出するキットにおける、前記第１の態様による単離タンパク質の使用、前記第２の態様による単離核酸の使用、または上記に記載された抗体もしくは抗体フラグメントの使用にまで及ぶ。
【００２７】
本発明の第１１の態様により、前記第１の態様による単離タンパク質を含む医薬組成物が提供される。
好ましくは、該医薬組成物はワクチンである。
【００２８】
第１２の態様において、本発明は、薬学的に効果的な量の上記ワクチンを投与する工程を含む、髄膜炎菌による患者の感染を防止する方法を提供する。
第１３の態様において、本発明は、前記第１の態様による単離タンパク質、変異体または誘導体の免疫原性フラグメントを同定する方法であって、
（ｉ）該ポリペプチド、変異体または誘導体のフラグメントを製造する工程と、（ｉｉ）該フラグメントを個体に投与する工程と、
（ｉｉｉ）髄膜炎菌および／または該ポリペプチド、変異体もしくは誘導体に特異的に結合するエレメントの産生、および／または髄膜炎菌の感染に対する保護作用を含む該個体における免疫応答を検出する工程と、
から成る方法を提供する。
【００２９】
好ましくは、個体は哺乳動物である。
より好ましくは、個体はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】（Ａ）−（Ｄ）は、１０菌株の髄膜炎菌から得られたＮｈｈＡポリペプチドアミノ酸配列（配列番号１〜１０）とコンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列（配列番号１１）とのアミノ酸アラインメント。このアラインメントで使用された菌株名およびポリペプチド配列は表１の第１欄の菌株名および配列番号に対応する。アミノ酸は標準的な一文字略号によって示される。コンセンサスなアミノ酸は、残基が完全に保存されている場合にだけ示される。保存領域（二重下線部、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５と表記）および可変領域（一本下線部、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４と表記）がコンセンサス配列の下に示される。
【図２】（Ａ）−（Ｆ）は、図１のアミノ酸配列をコードする、１０菌株の髄膜炎菌から得られたｎｈｈＡ核酸のヌクレオチド配列アラインメント。Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４の各領域は図１および表１に記載される通りである。
【図３Ａ】ｐｏｒＡプロモーターに作動的に連結された野生型ＰＭＣ２１のＮｈｈＡをコードするＰＣＲ増幅産物を有するｐＣＯ１４Ｋに対応するプラスミドマップ（スケール通りには縮尺されていない）。黒矢印は、ｐＣＯ１４Ｋ内のｐｏｒＡ遺伝子およびｋａｎＲ遺伝子の配置を示す。ＰＭＣ２１株のｎｈｈＡ遺伝子を増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドプライマーＨＯＭＰ５’およびＨＯＭＰ３’ＡＮが示される。ｎｈｈＡ遺伝子は点線矢印により示され、ｐｏｒＡプロモーターは黒四角により示され、そして実施例２に記載されるようにｐｏｒＡをｎｈｈＡで置換するために使用されたＥａｇＩおよびＮｃｏＩの制限部位が示される。
【図３Ｂ】ｐｏｒＡプロモーターに作動的に連結された野生型ＰＭＣ２１のＮｈｈＡをコードするＰＣＲ増幅産物を有するｐＣＯ１４Ｋに対応するプラスミドマップ（スケール通りには縮尺されていない）。実施例２に記載されるｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）における遺伝子配置。実施例４に記載される変異体を構築するために使用されたＢｇｌＩＩ部位が示される。
【図４Ａ】ＮｈｈＡポリペプチドの特定領域を欠失させるためのスプライスオーバーラップ伸長ＰＣＲ法の概略図。野生型ｎｈｈＡ遺伝子の概略図が図４Ａの上部に示され、組換えｎｈｈＡがこれらの図の下部に示されており、可変領域が黒四角として、定常領域が白四角により示される。矢印はオリゴヌクレオチドプライマーのおおよその位置を示す。垂直なハッチング線は増幅産物を示す。オリゴヌクレオチド配列がｎｈｈＡ核酸の不連続な領域に由来する場合、これは、そのような不連続な領域の間における点線により示される。おおよそのスケールで示される。二重の垂直線は、Ｃ５領域の一部分のみが示されていることを示す。実施例６に記載される方法を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ同様の概略図で、実施例７に記載される方法を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ同様の概略図で、実施例８に記載される方法を示す。
【図５】（Ａ）実施例４で作製されたＰＭＣ２１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２３）。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号２８）。
【図６】（Ａ）実施例５で作製されたＨ４１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２４）。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号２９）。
【図７】（Ａ）実施例６におけるスプライスオーバーラップＰＣＲによって作製されたＰＭＣ２１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２５）。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号３０）。
【図８】（Ａ）実施例７におけるスプライスオーバーラップＰＣＲによって作製されたＰＭＣ２１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２６）。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号３１）。
【図９】（Ａ）実施例８におけるスプライスオーバーラップＰＣＲによって作製されたＰＭＣ２１のＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２７）。（Ｂ）コードするヌクレオチド配列（配列番号３２）。
【図１０】（Ａ）−（Ｂ）野生型ポリペプチド配列およびＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチド配列のアミノ酸アラインメント。これらのポリペプチドは、実施例２、実施例３、実施例４および実施例５に記載されるように作製された。アミノ酸は一文字略号によって示される。表１および図１に規定される保存領域に対応するＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５と記された保存領域が、Ｈ４１およびＰＭＣ２１から得られた全長配列に二重下線を付すことによって示され、そして表１および図１に規定される可変領域に対応するＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４と記された可変領域が、Ｈ４１およびＰＭＣ２１から得られた全長配列に一本下線を付すことによって示される。
【図１１】過剰発現したＮｈｈＡを示すウエスタン免疫ブロット。４５μｇの総細胞タンパク質を、実施例９に記載されるように、４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、その後、ニトロセルロースフィルターに転写して、ウエスタンブロットした。レーン１：野生型レベルのＮｈｈＡ発現を示す親株。レーン２：Ｐ６株（実施例２に記載されるＰＭＣ２１ＮｈｈＡを過剰発現する）。レーン３：ＰΔ６株（実施例４に記載される短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡを過剰発現する）。レーン４：Ｈ１４株（実施例３に記載されるＨ４１ＮｈｈＡを過剰発現する）。レーン５：ＨΔ８株（実施例５に記載される短縮型Ｈ４１ＮｈｈＡを過剰発現する）。レーン６：２Ａ株（ＮｈｈＡの発現が、国際公開公報第９９／３１１３２号に記載されるようにｎｈｈＡ遺伝子の変異により失われている）。標準物の移動が示される：１８５ｋＤａ、１１９ｋＤａ、８５ｋＤａ、６２ｋＤａ、５１．２ｋＤａ、３８．２ｋＤａ、２２．４ｋＤａ。野生型ＮｈｈＡポリペプチドが、レーン１に存在するが、レーン６には存在しない高分子量の免疫反応性バンドとして存在する。
【図１２】単離されたＮｈｈＡ欠失変異体ポリペプチド。ＮｈｈＡポリペプチドを、実施例９に記載されるように単離し、その後、４〜２０％ＳＤ−ＰＡＧＥで分離した。ポリアクリルアミドゲルをクーマシー染色した。レーン１：実施例６に記載される短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドを過剰発現する菌株のＯＭＣ調製物。レーン２：精製された短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド。レーン３：実施例４に記載される短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドを過剰発現する菌株のＯＭＣ調製物。レーン４：精製された短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド。レーン５：実施例２に記載されるＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドを過剰発現する菌株のＯＭＣ調製物。レーン６：精製されたＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド。レーン７：分子量標準物：１７３ｋＤａ、１１１ｋＤａ、８０ｋＤａ、６１ｋＤａ、４９ｋＤａ、３６ｋＤａ。レーン６以外のすべてのレーンにおける高分子量の反応性種はおそらくはＮｈｈＡポリペプチドの多量体を表していることに留意すること。他のバンドは、おそらくは、あまり安定でない形態のＮｈｈＡまたは分解産物である。これらがレーン６には存在しないことに留意すること。
【図１３】抗ＮｈｈＡタンパク質のマウス血清を使用するウエスタン免疫ブロット。すべてのパネルにおいて、レーン１、３、５、７は、ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドを過剰発現する菌株のＯＭＣを含有し、レーン２、４、６および８は、ＮｈｈＡを発現しない２Ａ株のＯＭＣを含有する。パネルＡ：レーン１および２：野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡが１：１０００希釈で接種されたマウスＡ。レーン３および４：野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡが１：１０，０００希釈で接種されたマウスＡ。レーン５および６：野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡが１：１０００希釈で接種されたマウスＢ。レーン７および８：野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡが１：１０，０００希釈で接種されたマウスＢ。パネルＢ：レーン１＆２：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド（実施例４）が１：１０００希釈で接種されたマウスＣ。レーン３＆４：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチド（実施例４）が１：１０，０００希釈で接種されたマウスＣ。レーン５＆６：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例４）が１：１０００希釈で接種されたマウスＤ。レーン７および８：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例４）が１：１０００希釈で接種されたマウスＤ。パネルＣ：レーン１＆２：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例６）が１：１０００希釈で接種されたマウスＥ。レーン３および４：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例６）が１：１０，０００希釈で接種されたマウスＥ。レーン５＆６：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例６）が１：１０００希釈で接種されたマウスＦ。レーン７＆８：短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡ（実施例６）が１：１０００希釈で接種されたマウスＦ。
【図１４】（Ａ）−（Ｇ）予測される成熟型ＮｈｈＡポリペプチド欠失変異体。Ａ：実施例２に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３３）；Ｂ：実施例３に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３４）；Ｃ：実施例４に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３５）；Ｄ：実施例５に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３６）；Ｅ：実施例６に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３７）；Ｆ：実施例７に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３８）；およびＧ：実施例８に記載される予測される成熟タンパク質（配列番号３９）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本明細書を通して、別途示されない限り、表現「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、任意の他の要素または要素群を除外することなく、述べられた要素または要素群を包含することを意味することが理解される。
【００３２】
命名法に関して、ＮｈｈＡは、本明細書では本発明のタンパク質が参照されるときに使
用され、一方、ｎｈｈＡは、本明細書では本発明の核酸が参照されるときに使用される。ＮｈｈＡ／ｎｈｈＡのタンパク質および核酸は、例えば国際公開公報第９９／３１１３２号において参照されるＨｉａＮｍ／ｈｉａｎｍのタンパク質および核酸（これらに限定されない）を包含することもまた理解される。
【００３３】
本発明は、少なくとも一部は、１０菌株の髄膜炎菌におけるＮｈｈＡポリペプチドにおける保存領域およびあまり保存されてない領域を解明することによって予測される。対応する領域が、例示されたＮｈｈＡポリペプチドの他の対立遺伝子変異体において保存されていることが予測される。
【００３４】
本発明にとって重要なことは、野生型ＮｈｈＡポリペプチド内の非保存アミノ酸を欠失させて、本発明の修飾されたＮｈｈＡポリペプチドを作製することによって、免疫応答が、その免疫応答を保存されたエピトープに対して指向させることにより１または複数の異種の髄膜炎菌菌株に対する保護をもたらす本発明の該ポリペプチドで免疫化したときに誘発され得るという認識であることが理解される。
【００３５】
本明細書で使用される「非保存」アミノ酸は、１つの髄膜炎菌に由来する野生型ＮｈｈＡポリペプチドには存在するが、１または複数の他の菌株に由来する野生型ＮｈｈＡポリペプチドには存在していないアミノ酸残基である。
【００３６】
好適には、第１の態様のポリペプチドは、対応する野生型の配列に関して、Ｖ１領域、Ｖ２領域、Ｖ３領域またはＶ４領域のいずれかの少なくとも一部が欠失しており、そのため、「欠失変異体」の例としてまとめて示されることがある。
【００３７】
本発明は、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４の領域を、比較的保存されたＣ１〜Ｃ５の領域と比較して、非保存アミノ酸の頻度が比較的多い野生型ＮｈｈＡポリペプチドの領域であるとして同定していることが理解される。
【００３８】
これらのＶ領域のなかで、Ｖ１（超可変）およびＶ２の領域は非保存アミノ酸の最も大きな頻度を有し、一方、Ｖ３およびＶ４は比較的少ない頻度を有する。しかし、Ｖ１領域は、（総アミノ酸に関して）Ｖ２領域よりも、野生型ＮｈｈＡポリペプチドの重要な割合を構成している。したがって、前記第１の態様による単離タンパク質はＶ１領域の少なくとも実質的な部分が欠失していることが好ましい。
【００３９】
該欠失変異体を構築する際には、異なる髄膜炎菌菌株のＮｈｈＡポリペプチド間での領域の「シャフリング」が可能であることもまた当業者によって理解されるであろう。例えば、本発明のＮｈｈＡポリペプチドは、ＰＭＣ２１のＣ５領域とともにＨ４１のＣ１領域を含むことができる。
【００４０】
そのような「シャフリング」は組換えＤＮＡ法には特に十分に適している。
本発明の目的で、「単離された」とは、その天然の状態から取り除かれているか、またはそうでなければヒトの操作に供されている材料を意味する。単離された材料は、その天然の状態で通常それに伴う成分を実質的または本質的に含まなくてもよく、あるいはその天然の状態で通常それに伴う成分とともに人工的な状態で存在するように操作されていてもよい。単離された材料は天然形態または組換え形態であってもよい。
【００４１】
「タンパク質」は、アミノ酸のポリマーを意味する。アミノ酸は、当技術分野において十分に理解されているように、天然型または非天然型のアミノ酸であり得る。
「ペプチド」は、５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質である。
【００４２】
ポリペプチドは、５０個以上のアミノ酸を有するタンパク質である。
本明細書で使用される表現「免疫応答を誘発する」は、本発明の単離されたポリペプチドにより、それが投与される哺乳動物において免疫応答がもたらされ得ることをいう。この場合、応答は、髄膜炎菌および／または該ポリペプチドに対するものである。好ましくは、免疫応答は殺菌性抗体の産生を包含する。より好ましくは、免疫応答は、髄膜炎菌感染に対して保護的である。
【００４３】
「菌株特異的」は、本明細書では、自己の髄膜炎菌菌株に指向するか、または自己の髄膜炎菌菌株に対して少なくとも優勢的に指向する免疫応答の意味で使用される。
本明細書中で使用される「交差反応的」は、１または複数の異種の髄膜炎菌菌株に対する免疫応答が本発明のポリペプチドにより誘発され得ることを意味する。
【００４４】
本明細書中で使用される「交差保護的」は、本発明のポリペプチドにより、免疫応答が誘発され、それにより、１または複数の異種の髄膜炎菌菌株による感染に対する保護がもたらされ得ることを意味する。
【００４５】
したがって、前記に照らして、本発明の該ポリペプチドは、本明細書では、「免疫原」として、または「免疫原性」であると呼ばれることがある。
本発明の目的のために、該修飾されたＮｈｈＡポリペプチドは、図５〜９（配列番号２３〜２７）および図１４に示されるアミノ酸配列により例示されるが、本発明ではまた、例示されたタンパク質のフラグメント、誘導体および変異体（対立遺伝子変異体など）も考えられる。
【００４６】
例えば、アミノ酸を、菌株特異的な免疫原性を低下させるために、図１に示されるＣ１〜Ｃ５の配列のいずれかから欠失させることができ、一方で、Ｖ１〜Ｖ４の領域における非保存アミノ酸は必ずしもすべて欠失させる必要はない。
【００４７】
したがって、本発明の単離タンパク質は、Ｃ１〜Ｃ５およびＶ１〜Ｖ４の領域のフラグメントを含むことができる。
実際、下記の実施例に記載されるように、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位を利用して、安定した免疫原性タンパク質の高レベルな発現を達成するために、Ｃ１領域、Ｃ２領域、Ｃ３領域、Ｃ４領域および／またはＣ５領域あるいはＶ１領域、Ｖ２領域、Ｖ３領域および／またはＶ４領域の１個または数個のアミノ酸を欠失させることは、本発明のポリペプチドを組換えＤＮＡに基づいて製造するためには好都合であり得る。
【００４８】
１つの態様において、「フラグメント」は、該Ｃ１領域、Ｃ２領域、Ｃ３領域、Ｃ４領域またはＣ５領域の１００％未満であるが、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％を構成するアミノ酸配列を含む。
【００４９】
フラグメントは、例えば、Ｃ２領域（配列番号１１）などの１２個もの少数のアミノ酸、あるいは本明細書に記載されるＣ１領域、Ｃ２領域、Ｃ３領域、Ｃ４領域および／またはＣ５領域の一部またはすべてに対応する少なくとも２０個の連続したアミノ酸または１００個を越える連続したアミノ酸を含むペプチドであり得る。
【００５０】
本明細書に例示される他のフラグメントは、図１４に示されるなどの成熟ポリペプチドが形成されるために翻訳後プロセシングを受けている本発明の修飾されたＮｈｈＡポリペプチドである。
【００５１】
別の態様において、「フラグメント」は、例えば、少なくとも６個、好ましくは少なく
とも１０個、より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸の長さである小ペプチドで、本発明の修飾されたＮｈｈＡタンパク質に由来する１または複数の抗原決定基またはエピトープを含む小ペプチドである。２つ以上のペプチドを含むより大きいフラグメントもまた考えられ、これらは、標準的な組換え核酸技術を適用して得ることができ、または従来の液相合成技術もしくは固相合成技術を使用して合成することができる。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎにより編集され、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓにより発行された「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」と題される刊行物に含まれる、ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｈａｒｄによる「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」と題される第９章に記載されるような溶液合成または固相合成を例えば参照することができる。または、ペプチドは、本発明のポリペプチドをプロテイナーゼ（ｅｎｄｏＬｙｓ−Ｃ、ｅｎｄｏＡｒｇ−Ｃ、ｅｎｄｏＧｌｕ−Ｃおよびブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼなど）で消化することによって製造することができる。消化されたフラグメントは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術によって精製することができる。
【００５２】
本明細書で使用される「変異体」ポリペプチドは、１または複数のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されている本発明のポリペプチドである。いくつかのアミノ酸を、ポリペプチドの活性の性質を変化させることなく、ほぼ類似する性質を有する別のアミノ酸に変化させること（保存的置換）ができることが当技術分野では十分に理解されている。ポリペプチドにおける例示的な保存的置換を表２に従って行うことができる。
【００５３】
機能の実質的な変化は、表２に示される置換よりも低い保存的な置換を選択することによって行われる。他の置換は非保存的な置換であるが、これらの比較的少数が許容され得る。一般に、ポリペプチドの性質において最大の変化をもたらす可能性がある置換として、（ａ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）で疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）を置換する置換、または親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）を疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）で置換する置換；（ｂ）システインまたはプロリンで任意の他の残基を置換する置換、またはシステインまたはプロリンを任意の他の残基で置換する置換；（ｃ）電気的陽性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）で電気的陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）を置換する置換、または電気的陽性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）を電気的陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）で置換する置換、あるいは（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例えば、ＰｈｅまたはＴｒｐ）で、小型側鎖を有する残基（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）もしくは側鎖を有しない残基（例えば、Ｇｌｙ）を置換する置換、または嵩高い側鎖を有する残基（例えば、ＰｈｅまたはＴｒｐ）を、小型側鎖を有する残基（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）もしくは側鎖を有しない残基（例えば、Ｇｌｙ）で置換する置換が挙げられる。
【００５４】
用語「変異体」はまた、本明細書に例示される配列の対立遺伝子変異体から作製された本発明のＮｈｈＡポリペプチドを包含する。
ＮｈｈＡポリペプチドの変異体は、用語「ポリペプチドホモログ」の範囲に含まれることがある。
【００５５】
ポリペプチドホモログは、本明細書前記に記載される本発明の修飾されたＮｈｈＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する。
【００５６】
本明細書で一般に使用される「ホモログ」は、場合により、本発明の核酸またはポリペプチドとの規定され得るヌクレオチド配列関係またはアミノ酸配列関係を有する。
例えば、本明細書に例示されるアミノ酸配列とは異なるが、免疫原性で、交差保護免疫
性をもたらすアミノ酸配列を有するようなホモログが考えられる。
【００５７】
野生型のＮｈｈＡポリペプチドおよびｎｈｈＡ核酸は用語「ホモログ」の範囲から特に除かれる。
ホモログの範囲には、髄膜炎菌とは異なる細菌株から単離される、機能的に関連するポリペプチドおよびそのコードする核酸である「オルソログ」が含まれる。
【００５８】
それぞれの核酸間およびそれぞれのポリペプチド間の配列関係を記載するために本明細書で使用される用語には、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」および「実施的な同一性」が含まれる。それぞれの核酸／ポリペプチドはそれぞれ、（１）核酸／ポリペプチドが互いに有する完全な核酸／ポリペプチド配列の１または複数の部分のみ、および（２）核酸／ポリペプチド間で異なる１または複数の部分を含み得るので、配列比較は、配列類似性の局所的領域を同定して比較するために「比較ウインドウ」について配列を比較することによって典型的には行われる。「比較ウインドウ」は、参照配列と比較される典型的には１２個の連続した残基の概念的なセグメントをいう。比較ウインドウは、それぞれの配列を最適にアラインメントするために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウインドウをアラインメントするための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズムのコンピューター化された手段（ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓによるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、これらは引用により本明細書に組み込むものとする）によって、または精査、もしくは選択された様々な方法のいずれかにより得られた最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウについて最大のパーセンテージ相同性をもたらすアラインメント）によって行うことができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５ ３３８９（これは引用により本明細書に組み込むものとする）により記載されるようなＢＬＡＳＴファミリーのプログラムもまた参照することができる。
【００５９】
配列分析の詳細な議論を、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（編者：Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ ＮＹ、１９９５〜１９９９）のユニット１９．３に見出すことができる。
【００６０】
用語「配列同一性」は、比較ウインドウについて配列が同一である範囲を考慮して標準的なアルゴリズムを使用する適切なアラインメントを考慮した正確なヌクレオチド一致またはアミノ酸一致の数を含むようにその最も広い意味で本明細書では使用される。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較ウインドウについて比較し、一致した位置の数を得るために、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両方の配列に存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算して、配列同一性のパーセンテージを得るためにその結果を１００倍することによって計算される。例えば、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータープログラム（ウインドウス用バージョン２．５；Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）から入手可能）により計算される「一致パーセンテージ」を意味することが理解され得る。
【００６１】
したがって、本明細書の前記に規定されるような変異体などの本発明のポリペプチドホモログを組換えＤＮＡ技術によって調製することは十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、本発明の核酸は、例えばトランスポゾン変異誘発法を使用するランダム変異誘発
法または部位特異的変異誘発法のいずれかを使用して変異させることができる。得られたＤＮＡフラグメントは、その後、従来の技術を使用して大腸菌などの好適な発現宿主にクローン化され、そして所望する活性を保持するクローンが検出される。そのようなクローンが、ランダム変異誘発技術を使用して得られた場合、陽性のクローンは、変異を検出するために配列決定しなければならない。
【００６２】
本明細書で使用される「誘導体」ポリペプチドは、当技術分野において理解されるように、例えば、他の化学的成分とのコンジュゲート化または複合体化によって、あるいは翻訳後修飾技術によって変化している本発明のポリペプチドである。そのような誘導体には、アミノ酸欠失体および／または本発明のＮｈｈＡポリペプチドもしくはその変異体に対するアミノ酸付加体が含まれ、該誘導体により免疫応答が誘発される。
【００６３】
アミノ酸の「付加（体）」は、ポリペプチドまたはその変異体と他のポリペプチドまたはタンパク質との融合を包含し得る。これに関連して、本発明のポリペプチドまたは変異体はより大きなポリペプチドに組み込まれ得ることが理解され、そしてそのようなより大きなポリペプチドもまた免疫原性であることが予想され得る。上記に記載されるポリペプチドは、例えば、髄膜炎菌に由来しないさらなるタンパク質に融合させることができる。そのような他のタンパク質は、例として、タンパク質の精製を助けることができる。例えば、ポリヒスチジンタグまたはマルトース結合タンパク質を使用することができる。または、髄膜炎菌に対して効果的な免疫応答を生じさせることができるか、または別の病原体に対する免疫応答を生じさせることができる。他の可能な融合タンパク質は、免疫調節的な応答を生じさせる融合タンパク質である。そのようなタンパク質の具体的な例として、プロテインＡまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる。さらに、ポリペプチドは、それが担体タンパク質として作用する多糖型ワクチン成分に融合させることができる。
【００６４】
本発明により考えられる他の誘導体には、側鎖に対する修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を合成しているときにおける様々な非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の取り込み、ならびに本発明のポリペプチド、フラグメントおよび変異体に立体配座的な制約を負わす架橋剤および他の方法の使用が含まれるが、これらに限定されない。本発明により考えられる側鎖修飾の例には、無水酢酸を用いたアシル化によるなどのアミノ基の修飾；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸を用いたアミノ基のアシル化；メチルアセトイミダートを用いたアミド化；シアナートを用いたアミノ基のカルバモイル化；ピリドキサール−５−ホスファートを用い、その後、ＮａＢＨ４で還元することによるリシンのピリドキシル化；アルデヒドと反応させ、その後、ＮａＢＨ４で還元することによる還元的アルキル化；および２,\~４,\~６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いたアミノ基のトリニトロベンジル化が含まれる。
【００６５】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソウレアの形成を介するカルボジイミド活性化を行い、その後、続いて誘導体化して、例として、対応するアミドにすることによって修飾することができる。
【００６６】
アルギニン残基のグアニジン基は、２,\~３−ブタンジオン、フェニルグリオキサール
およびグリオキサールなどの試薬を用いて複素環縮合生成物を形成させることによって修飾することができる。
【００６７】
スルフヒドリル基は、システイン酸への過ギ酸酸化などの方法；４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、４−クロロメルクリ安息香酸；２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、フェニル水銀塩化物および他の水銀化合物を使用する水銀誘導体の形成；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換
マレイミドとの反応；ヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いたカルボキシメチル化；ならびにアルカル性ｐＨでシアナートを用いたカルバモイル化によって修飾することができる。
【００６８】
トリプトファン残基は、例えば、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル臭化物もしくはハロゲン化スルホニルを用いたインドール環のアルキル化によって、またはＮ−ブロモスクシンイミドを用いた酸化によって修飾することができる。
【００６９】
チロシン残基は、テトラニトロメタンでニトロ化して、３−ニトロチロシン誘導体を形成させることによって修飾することができる。
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ジエチルピロカルボナートを用いたＮ−カルボエトキシル化によって、またはヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化によって修飾することができる。
【００７０】
ペプチド合成時に非天然アミノ酸および誘導体を取り込ませる例には、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニンおよび／またはＤ異性体のアミノ酸の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明によりまた、ヒトにおいて免疫原性にするために、本発明のポリペプチド、フラグメントまたは変異体をジニトロフェノールで共有結合的に修飾することが考えられる。
本発明の単離タンパク質（フラグメント、変異体、誘導体およびホモログを含む）は、当業者に知られている任意の好適な手法によって調製することができる。
【００７２】
例えば、タンパク質は、下記の工程：
（ｉ）１または複数の調節ヌクレオチド配列に作動的に連結された本発明の修飾ｎｈｈＡ核酸を含む発現構築物を調製する工程、
（ｉｉ）好適な宿主細胞を発現構築物でトランスフェクションまたは形質転換する工程、（ｉｉｉ）組換えポリペプチドを該宿主細胞において発現させる工程
を含む手法によって組換えポリペプチドとして調製することができる。
【００７３】
ＰＣＲによって本発明の修飾ｎｈｈＡ核酸を製造することを記載する多数の実施例が下記に示される。
１つの特定の態様において、ＰＣＲは、本明細書下記に記載されるようなスプライスオーバーラップＰＣＲである。この方法は、Ｈｏら、１９８９、Ｇｅｎｅ
７７ ５１において、そしてＨｏｒｔｏｎら、１９８９、Ｇｅｎｅ ７７ ６１によって記載される方法に基づく。これらはともに参照にとして本明細書に組み入れられる。
【００７４】
宿主細胞での発現のために、組換え核酸は、発現ベクターにおいて１または複数の調節配列に作動的に連結される。
「発現ベクター」は、プラスミドなどの自己複製する染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【００７５】
「作動的に連結された」により、該調節ヌクレオチド配列（１つまたは複数）が、転写を開始または調節またはそうでなければ制御するように本発明の組換え核酸に対して配置されていることが意味される。
【００７６】
様々な調節ヌクレオチド配列が、一般に、発現のために使用される宿主細胞に適している。多数のタイプの適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が様々な宿主細胞について
当技術分野では知られている。
【００７７】
典型的には、該１または複数の調節ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびにエンハンサー配列または活性化因子配列を含むことができるが、これらに限定されない。
【００７８】
当技術分野において知られている構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが本発明により考えられる。これらのプロモーターは、天然に存在するプロモーター、または２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。
【００７９】
好ましい態様において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は当技術分野では十分に知られており、使用される宿主細胞によって変化する。
【００８０】
ある態様において、発現ベクターは、下記に詳しく記載されるように、ｐｏｒＡプロモーターおよびカナマイシン選択性遺伝子を有するｐＣＯ１４Ｋである。この態様により、宿主細胞は、大腸菌および髄膜炎菌からなる群より選択される細菌である。
【００８１】
発現ベクターはまた、（典型的には、発現ベクターにより提供される）融合パートナーを含むことができ、その結果、本発明の組換えポリペプチドは、該融合パートナーとの融合ポリペプチドとして発現される。融合パートナーの主な利点は、融合パートナーにより、該融合ポリペプチドの同定および／または精製が助けられるということである。
【００８２】
該融合ポリペプチドを発現させるためには、融合パートナーおよび本発明のヌクレオチド配列の翻訳リーディングフレームが一致するように本発明によるヌクレオチド配列を発現ベクターに連結することが必要である。
【００８３】
融合パートナーの十分に知られている例には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびヘキサヒスチジン（ＨＩＳ６）が含まれるが、これらに限定されない。これらは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの精製には特に有用である。アフィニティークロマトグラフィーによって融合ポリペプチドを精製する場合、アフィニティークロマトグラフィーについて適切なマトリックスは、それぞれ、グルタチオン結合樹脂、アミロース結合樹脂、およびニッケル結合樹脂またはコバルト結合樹脂である。多くのそのようなマトリックスは、（ＨＩＳ６）融合パートナーについて有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムなどの「キット」の形態で得ることができる。
【００８４】
好ましい融合パートナーはＭＢＰであり、これは本明細書の実施例１１に記載される。
当技術分野において十分に知られている別の融合パートナーは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。この融合パートナーは、本発明の融合ポリペプチドを蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって同定できるようにする蛍光「タグ」として役立つ。ＧＦＰタグは、本発明の融合ポリペプチドの細胞レベル以下での局在化を評価するときに、または本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞を単離するために有用である。蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー方法がこの後者の適用において特に有用である。
【００８５】
好ましくは、融合パートナーはまた、第Ｘａ因子またはトロンビンなどのプロテアーゼ
切断部位を有する。これにより、適切なプロテアーゼは本発明の融合ポリペプチドを部分的に消化し、それにより本発明の組換えポリペプチドを融合ポリペプチドから遊離させることができる。遊離したポリペプチドは、その後、続くクロマトグラフィー分離によって融合パートナーから単離することができる。
【００８６】
本発明による融合パートナーはまた、特異的な抗体が得られる短いペプチド配列であることが通常である「エピトープタグ」をその範囲内に含む。特異的なモノクローナル抗体が容易に得られるエピトープタグの十分に知られている例として、ｃ−ｍｙｃタグ、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタグおよびＦＬＡＧタグが挙げられる。
【００８７】
本明細書前記のように、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドホモログをコードする核酸を含む該発現構築物で形質転換された宿主細胞を培養することによって製造することができる。タンパク質発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択とともに変化する。これは、日常的な実験によって当業者により容易に確認される。
【００８８】
発現に好適な宿主細胞は原核生物性または真核生物性であり得る。本発明に従ってポリペプチドを発現させるための１つの好ましい宿主細胞は細菌である。使用される細菌は大腸菌または髄膜炎菌であり得る。
【００８９】
好ましい態様において、宿主細胞は、ＰｏｒＡ、Ｏｐａ、Ｏｐｃまたは莢膜多糖を発現しないように改変され、かつ所望するリポ多糖表現型を発現する髄膜炎菌である。
あるいはまた、宿主細胞は、例えば、バキュロウイルス発現システムとともに用いることができるＳＦ９細胞などの昆虫細胞であり得る。
【００９０】
組換えタンパク質は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）（特に第１６節および第１７節）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（編者：Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．１９９５〜１９９９）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）（特に第１０章および第１６章）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ（編者：Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．１９９５〜１９９９）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）（特に第１章、第５章および第６章）に記載されるような標準的なプロトコルを使用して当業者によって都合よく調製することができる。
【００９１】
本発明の組換え修飾ＮｈｈＡタンパク質の好ましい発現方法および発現したタンパク質の検出方法は本明細書下記の実施例に示される。 ヌクレオチド配列
本発明は、本発明の修飾されたＮｈｈＡタンパク質をコードする単離核酸を提供する。
【００９２】
好ましくは、該単離核酸は、図１および図２に記載されるような１または複数のＮｈｈＡポリペプチド定常（Ｃ）領域をコードするヌクレオチド配列を有する。単離核酸は、図１および図２において同様に認められるような１または複数の非保存（Ｖ領域）アミノ酸をさらにコードすることができる。
【００９３】
そのような単離核酸の具体的な態様が配列番号２８〜３２および図５〜９に示される。
本明細書で使用される用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡおよびＤＮＡを意味し、該ＤＮＡはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む。
【００９４】
「ポリヌクレオチド」は８０個以上の連続したヌクレオチドを有する核酸であり、「オリゴヌクレオチド」は８０個未満の連続したヌクレオチドを有する。
「プローブ」は、例えば、ノーザンブロッティングまたはサザンブロッティングにおいて相補的な配列を検出するために好適に標識された一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。
【００９５】
「プライマー」は、通常、好ましくは１５個〜５０個の連続したヌクレオチドを有する一本鎖のオリゴヌクレオチドであり、これは、相補的な核酸「テンプレート」にアニーリングすることができ、かつＴａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）などのＤＮＡポリメラーゼの作用によってテンプレートに依存した様式で伸長させることができる。
【００９６】
本発明によりまた、本明細書前記に定義された本発明の核酸のホモログが考えられる。
そのような核酸ホモログは、全長の野生型ＮｈｈＡポリヌクレオチドをコードする核酸を含まない。
【００９７】
例えば、核酸ホモログは、免疫化によって髄膜炎菌に対する交差保護的な免疫性をもたらすために有用であり得る、本発明のＮｈｈＡのＶ領域およびＣ領域に構造的に関連するペプチドおよびポリペプチドをコードする。
【００９８】
１つの態様において、核酸ホモログは、本発明のポリペプチドホモログ（その変異体、フラグメントおよび誘導体を含む）をコードする。
別の態様において、核酸ホモログは、本発明の核酸と少なくとも６０％（好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する。
【００９９】
さらに別の態様において、核酸ホモログは、少なくとも低ストリンジェンシーの条件のもとで、好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシーの条件のもとで、そしてより好ましくは高ストリンジェンシーの条件のもとで、本発明の核酸にハイブリダイゼーションする。
【０１００】
「ハイブリダイゼーションするおよびハイブリダイゼーション」は、本明細書では、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列が対形成して、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッドが生じることを示すために使用される。相補的なヌクレオチド配列を含むハイブリッドの配列は、当技術分野において十分に知られているように相補的なプリン間およびピリミジン環で塩基対形成することによって生じる。
【０１０１】
これに関連して、修飾されたプリン（例えば、イノシン、メチルイノシンおよびメチルアデノシン）および修飾されたピリミジン（チオウリジンおよびメチルシトシン）もまた塩基対形成に関与し得ることが理解される。
【０１０２】
本明細書で使用される「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション時における温度およびイオン強度の条件ならびにある種の有機溶媒および／または界面活性剤の存在の有無をいう。ストリンジェンシーが高いほど、大きなレベルの相補性がハイブリダイゼーション中のヌクレオチド配列間に必要になる。
【０１０３】
「ストリンジェントな条件」は、高頻度の相補的な塩基を有する核酸のみがハイブリダイゼーションするそのような条件を示す。
本明細書では、低ストリンジェンシーの条件に対する参照には下記が含まれ、包含される：
（ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションについて、少なくとも約１％ｖ／ｖ〜少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩、そして４２℃での洗浄について、少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩；および
（ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションについて、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、そして室温での洗浄について、（ｉ）２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、または（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳ。
【０１０４】
中程度のストリンジェンシーの条件には下記が含まれ、包含される：
（ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションについて、少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩、そして４２℃での洗浄について、少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩；および
（ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションについて、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、そして室温での洗浄について、（ａ）２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、または（ｂ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳ。
【０１０５】
高ストリンジェンシーの条件には下記が含まれ、包含される：
（ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションについて、少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩、そして４２℃での洗浄について、少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩；
（ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションについて、１％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、そして６５℃を越える温度で約１時間の洗浄について、（ａ）０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、または（ｂ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳ；および（ｉｉｉ）６８℃以上で約２０分間の洗浄について、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ。
【０１０６】
一般に、洗浄は、Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％−１２℃で行われる。一般に、二重鎖ＤＮＡのＴｍは、ミスマッチした塩基の数が１％増大する毎に約１℃低下する。
上記にもかかわらず、ストリンジェントな条件は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら
（前掲）の第２．９章および第２．１０章に記載される（これは引用により本明細書に
組み込むものとする）、当技術分野では十分に知られている。当業者はまた、様々な要因を操作して、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化できることを認識する。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高い程度のハイブリダイゼーションを保証するために役立ち得る。
【０１０７】
典型的には、相補的なヌクレオチド配列が、ヌクレオチドをマトリックス（好ましくは、ニトロセルロースなどの合成メンブラン）に固定化する工程、ハイブリダイゼーション工程および検出工程を含むブロッティング技術によって同定される。サザンブロッティングが、相補的なＤＮＡ配列を同定するために使用され、ノーザンブロッティングが、相補的なＲＮＡ配列を同定するために使用される。ドットブロッティングおよびスロットブロッティングを、相補的なＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡのポリヌクレオチド配列を同定するために使用することができる。そのような技術は当業者によって十分に知られており、Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲）の２．９．１頁〜２．９．２０頁に記載されている。そのような方法によれば、サザンブロッティングは、ＤＮＡ分子をゲル電気泳動でサイズに従って分離すること、サイズ分離したＤＮＡを合成メンブランに転写すること、およびメンブランに結合させたＤＮＡを相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることを含む。
【０１０８】
ドットブロッティングおよびスロットブロッティングでは、ＤＮＡサンプルが合成メンブランに直接適用され、その後、上記のようにハイブリダイゼーションが行われる。
ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーにおいて相補的な核酸を同定するときには、プラークハイブリダイゼーションまたはコロニーハイブリダイゼーションの方法などによる代わりのブロッティング工程が使用される。この手法の他の典型的な例が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）の第８章〜第１２章に記載される（これは引用により本明細書に組み込むものとする）。
【０１０９】
典型的には、下記の一般的な手法を使用して、ハイブリダイゼーション条件を決定することができる。核酸は、上記に記載されるように合成メンブランにブロッティング／転写される。本発明の野生型ヌクレオチド配列が、上記に記載されるように標識され、その後、固定化されたヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションするこの標識された核酸の能力が分析される。
【０１１０】
当業者は、多数の要因がハイブリダイゼーションに影響することを認識する。放射能標識されたポリヌクレオチド配列の比活性は、検出可能なシグナルを得るためには、典型的には約１０８ｄｐｍ／μｇ以上にすべきである。比活性が１０８〜１０９ｄｐｍ／μｇである放射能標識されたヌクレオチド配列により、約０．５ｐｇのＤＮＡを検出することができる。検出を可能にするためには、十分なＤＮＡがメンブランに固定化されなければならないことが当技術分野では十分に知られている。ＤＮＡを過剰に固定化することが望ましい（通常的には１μｇ〜１０μｇ）。１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸（ＭＷ５００,\~０００）またはポリエチレングリコール６０００などの不活性なポリマーをハイブリ
ダイゼーション時に添加することによりまた、ハイブリダイゼーションの感度を増大させることができる（Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲）の２．１０．１０を参照のこと）。
【０１１１】
メンブランに固定化された核酸と標識された核酸とのハイブリダイゼーションから意味のある結果を達成するためには、十分な量の標識された核酸を、洗浄後に、固定化された核酸にハイブリダイゼーションさせなければならない。洗浄により、標識された核酸に対する所望する程度の相補性を有する固定化された核酸に対してのみ、標識された核酸がハイブリダイゼーションすることが保証される。
【０１１２】
固定化された核酸にハイブリダイゼーションした標識された核酸を検出する方法は、当技術分野では実施者に十分に知られている。そのような方法には、オートラジオグラフィー、化学発光、蛍光および比色法による検出が含まれる。
【０１１３】
別の態様において、本発明の核酸ホモログは下記の手法：
（ｉ）好適な宿主から核酸抽出物を得ること、
（ｉｉ）それぞれのプライマーが本発明のヌクレオチド配列の一部を含む、必要な場合には縮重しているプライマーを作製すること、および
（ｉｉｉ）該プライマーを使用して、核酸増幅技術により１または複数の増幅産物を該核酸抽出物から増幅すること
に従って調製することができる。
【０１１４】
好適には、宿主は細菌である。
好ましくは、宿主はナイセリア属の宿主である。
より好ましくは、宿主は髄膜炎菌またはナイセリア・ラクタミカ（Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ）である。
【０１１５】
核酸配列増幅法による有用なプライマーは、本明細書下記に詳しく記載される配列番号
４０〜５１を含む。
好適な核酸増幅技術は当業者には十分に知られており、これには下記が含まれる：例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲）の第１５章（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；例えば、米国特許第５，４２２，２５２号（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるような鎖置換増幅（ＳＤＡ）；例えば、Ｌｉｕら、１９９６、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８ １５８７、ならびに国際公開公報第９２／０１８１３号およびＬｉｚａｒｄｉら
（国際公開公報第９７／１９１９３号）（これらは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるようなローリングサークル複製（ＲＣＰ）；例えば、Ｓｏｏｋｎａｎａｎら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７ １０７７（これは引用により本明細書に組み込むものとする）により記載されるような核酸配列型増幅（ＮＡＳＢＡ）；および例えば、Ｔｙａｇｉら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３ ５３９５（これは引用により本明細書に組み込むものとする）により記載されるようなＱ−βレプリカーゼ増幅。
【０１１６】
本明細書で使用される「増幅産物」は、核酸増幅技術によって得られた核酸生成物をいう。
抗体 本発明によりまた、本発明の単離タンパク質、フラグメント、変異体および誘導体に対する抗体が考えられる。本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。抗体製造、精製および使用に適用され得る十分に知られている様々なプロトコルを、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ ＮＹ、１９９１〜１９９４）の第２章、およびＨａｒｌｏｗ、Ｅ．＆Ｌａｎｅ、Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）に見出すことができる。これらはともに引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１１７】
一般に、本発明の抗体は、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体に結合させられるか、またはそれらとコンジュゲート化される。例えば、抗体はポリクローナル抗体を含み得る。そのような抗体は、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体を産生種（マウスまたはウサギが含まれ得る）に注射して、ポリクローナル抗血清を得ることによって調製することができる。ポリクローナル抗体を製造する方法は当業者には十分に知られている。使用され得る例示的なプロトコルが、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）およびＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８、前掲）に記載される。
【０１１８】
産生種において得られるポリクローナル抗体の代わりに、モノクローナル抗体を、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６、４９５による論文（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるような標準的な方法を使用して、または、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）に記載されるそのより最近の改変法により、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体の１つまたは複数が接種された産生種に由来する脾臓または他の抗体産生細胞を不死化することによって製造することができる。
【０１１９】
本発明はまた、その範囲内において、上記に示されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のＦｃフラグメントまたはＦａｂフラグメントを含む抗体を包含する。または、抗体は、本発明のポリペプチドに対する単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）を含み得る。そのようなｓｃＦｖは、例えば、米国特許第５,０９１，５１３号、欧州特許第２３９，４０
０号、またはＷｉｎｔｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３４９ ２９
３による論文にそれぞれ記載される方法に従って調製することができる。これらは引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１２０】
本発明の抗体は、天然または組換えの髄膜炎菌ポリペプチドを単離する際のアフィニティークロマトグラフィーのために使用することができる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）の第９．５章に記載される免疫アフィニティークロマトグラフィー手法を参照することができる。
【０１２１】
抗体は、
（ｉ）発現ライブラリーをスクリーニングして、本発明の変異体ポリペプチドを同定するために、
（ｉｉ）免疫反応性フラグメントもしくは免疫反応制エピトープを同定するために、かつ／または
（ｉｉｉ）髄膜炎菌感染を検出するために
使用することができる。これらは本明細書下記に記載されるが、本発明はこれらの特定の使用に限定されない。
【０１２２】
髄膜炎菌の検出
個体における髄膜炎菌の存在または非存在は、該個体から生物学的サンプルを単離して、上記に記載される抗体または抗体フラグメントを生物学的サンプルと混合し、そしてサンプル中の髄膜炎菌の存在を示す特異的に結合した抗体または抗体フラグメントを検出することによって決定することができる。
【０１２３】
本明細書で使用される用語「生物学的サンプル」は、患者などの個体に由来する、抽出、未処理、処理、希釈または濃縮され得るサンプルをいう。好適には、生物学的サンプルは、全血、血清、血漿、唾液、尿、汗、腹水、腹膜液、滑液、羊水、脳脊髄液、皮膚生検物などからなる群より選択される。
【０１２４】
複合体の形成を明らかにする好適な技術はどれも使用することができる。例えば、標識が結合している本発明による抗体または抗体フラグメントを免疫アッセイにおいて用いることができる。そのような免疫アッセイとして、当業者に十分に知られている放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および免疫クロマトグラフィー技術（ＩＣＴ）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１２５】
例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）の第７章を参照することができる。これには、本発明に従って使用され得る様々な免疫アッセイが開示されている。免疫アッセイとして、当技術分野において理解されているような競合的アッセイを挙げることができる。
【０１２６】
抗体または抗体フラグメントと結合した標識は下記を含むことができる：
（Ａ）抗体または抗体フラグメントに対する標識の直接的な結合、
（Ｂ）抗体または抗体フラグメントに対する標識の間接的な結合、すなわち、
抗体または抗体フラグメントにその後で結合する別のアッセイ試薬に対する標識の結合、および
（Ｃ）抗体または抗体フラグメントのその後の反応生成物に対する結合。
【０１２７】
標識は、発色体、触媒、酵素、蛍光体、化学発光分子、ユーロピウム（Ｅｕ３4\~）な
どのランタニドイオン、放射性同位体および直接的な可視標識からなる群より選択することができる。直接的な可視標識の場合には、コロイド状の金属粒子または非金属粒子、色素粒子、酵素または基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、あるいはシグナ
ル生成物質などを含有する他の小胞を使用することができる。
【０１２８】
標識として有用な非常に多くの酵素が、米国特許明細書第４，３６６，２４１号、同第４，８４３，０００号および同第４，８４９，３３８号に開示されている（これらはすべて引用により本明細書に組み込むものとする）。本発明において有用な酵素標識には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが含まれる。酵素標識は、単独で、または溶液中の別の酵素と組み合わせて使用することができる。
【０１２９】
好適には、蛍光体は、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＬ）またはＲ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）を含む群より選択される。
【０１３０】
本発明はまた、髄膜炎菌による患者の感染を検出する方法にまで及ぶ。該方法は、患者に由来する生物学的サンプルを本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体と接触させる工程、および該ポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体と該血清中の髄膜炎菌特異的抗体との複合体の存在または非存在を決定する工程を含む。この場合、該複合体の存在により、該感染が示される。
【０１３１】
好ましい態様において、上記複合体の検出は、当技術分野において十分に知られているように、該ポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体を好適な標識で検出可能に修飾し、そして、例えば、上記に記載されるような免疫アッセイにおいてそのような修飾された化合物を使用することによって行われる。
【０１３２】
別の態様において、本発明は、髄膜炎菌細菌を含有することが疑われる生物学的サンプルにおける髄膜炎菌細菌を検出する方法を提供する。該方法は、患者から生物学的サンプルを単離する工程、該細菌の存在を示す本発明による核酸配列を該サンプルにおいて検出する工程を含む。該核酸配列の検出は、任意の好適な技術を使用して明らかにすることができる。例えば、標識された本発明による核酸を、当技術分野において十分に知られているように、患者から得られた核酸抽出物のサザンブロットにおけるプローブとして使用することができる。
【０１３３】
あるいはまた、標識された本発明による核酸は、患者から得られたＲＮＡ抽出物のノーザンブロットにおけるプローブとして利用することができる。
好ましくは、患者から得られた核酸抽出物は、本発明による核酸配列のセンス配列およびアンチセンス配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマー、またはその隣接配列と同時に、ＰＣＲなどの核酸増幅反応において、または例えば、国際公開公報第８９／０９３８５号（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるようなリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）において利用される。
【０１３４】
様々な自動化された固相検出技術もまた適している。例えば、非常に大規模な固定化プライマーアレイ（ＶＬＳＩＰＳ（商標））が、例えば、Ｆｏｄｏｒら
（１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１ ７６７）およびＫａｚａｌら（１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２ ７５３）により記載されるように核酸を検出するために使用される。上記の一般的な技術は当業者には十分に知られている。
【０１３５】
医薬組成物
本発明のさらなる特徴は、髄膜炎菌による感染から患者を保護する医薬組成物における有効成分としての、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体（「免疫
原因子」）の使用である。
【０１３６】
好適には、医薬組成物は、医薬として許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
「医薬として許容される担体、希釈剤または賦形剤」により、全身投与において安全に使用され得る固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質が意味される。特定の投与経路に依存して、当技術分野において十分に知られている様々な担体を使用することができる。これらの担体は、糖類、デンプン類、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸塩緩衝化溶液、乳化剤、等張的生理的食塩水、および塩類（塩酸塩、臭化物および硫酸塩を含む無機酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩およびマロン酸塩などの有機酸塩など）、および無パイロジェン水を含む群より選択することができる。
【０１３７】
医薬として許容される担体、希釈剤および賦形剤を記載する有用な参考文献はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ、１９９１）である。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１３８】
安全な投与経路はどれも、患者に本発明の組成物を与えるために用いることができる。例えば、経口的、直腸的、非経口的、舌下、口内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮的などを用いることができる。筋肉内注射および皮下注射が、例えば、免疫原組成物、ワクチンおよびＤＮＡワクチンを投与するために適している。
【０１３９】
投薬形態物には、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、溶液剤、シロップ、トローチ、カプセル、坐薬、エアロゾル剤、経皮パッチなどが含まれる。これらの投薬形態物にはまた、この目的のために特に設計された注射用または埋め込み用の徐放性デバイス、またはこの様式でさらに作用するように改変された他の形態のインプラントを挙げることができる。治療剤の制御された放出は、治療剤を、例えば、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸ならびにある種のセルロース誘導体（ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）を含む疎水性ポリマーで被覆することによって達成することができる。さらに、制御された放出は、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを使用することによって達成することができる。
【０１４０】
経口投与または非経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、粉末もしくは顆粒として、または水性液体、非水性液体、水中油型エマルションもしくは油中水型液体エマルションにおける溶液もしくは懸濁物として、本発明の１または複数の治療剤の所定量をそれぞれが含有する、カプセル、サッシェ剤または錠剤などの個別ユニット物として提供され得る。そのような組成物は、任意の製薬方法によって調製することができるが、すべての方法は、上記に記載されるような１または複数の免疫原因子を、１または複数の必要な成分を構成する担体とともに一緒にする工程を含む。一般に、組成物は、本発明の免疫原因子を液体担体または細かく分割された固体担体またはその両方と均一かつ十分に混合し、その後、必要な場合には、生成物を所望する剤形に成形することによって調製される。
【０１４１】
上記組成物は、投薬配合物と適合し得る様式で、そして髄膜炎菌感染から患者を保護するために免疫原性的に効果的であるような量で投与することができる。患者に投与される用量は、本発明の範囲においては、髄膜炎菌レベルの低下などの患者において都合の良い応答が長時間もたらされるか、または髄膜炎菌による感染を阻害するために十分でなければならない。投与される免疫原因子の量は、処置される対象者、ならびにその年齢、性別、体重および全体的な健康状態に依存し得る。これに関連して、投与するために必要な免疫原因子の正確な量は医師の判断に依存する。
【０１４２】
髄膜炎菌に対する処置または予防において投与される免疫原因子の効果的な量を決定する際に、医師は、循環している血漿中レベル、疾患の進行、および抗髄膜炎菌抗体の産生を評価することができる。いずれの場合においても、本発明の免疫原因子の好適な投薬量は当業者によって容易に決定することができる。そのような投薬量は、本発明の免疫原因子がナノグラム〜ミリグラムの程度であり得る。 上記組成物は治療ワクチンまたは予防ワクチンとして使用することができる。したがって、本発明は、本発明の免疫原因子の１つまたは複数を有効成分として含有するワクチンの製造にまで及ぶ。様々な適用可能な手法が、そのようなワクチンを製造するために考えられる。例示的な手法には、例えば、ＮＥＷ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＶＡＣＣＩＮＥＳ（１９９７、Ｌｅｖｉｎｅら、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｅｌ、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載される手法が含まれる。
【０１４３】
本発明による免疫原因子は、他の抗原のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを含む他の抗原と混合、コンジュゲート化または融合することができる。さらに、本発明による免疫原因子は、下記に記載されるように担体にコンジュゲート化することができる。
【０１４４】
本発明のハプテン性ペプチド（すなわち、コンジュゲート抗体と反応するが、それ自身は免疫応答を誘発することができないペプチド）が使用される場合、それを免疫原性担体とコンジュゲート化することができる。有用な担体が当技術分野では十分に知られており、これには、例えば、チログロブリン；アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）；破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス、大腸菌、ブドウ球菌および連鎖球菌に由来するトキシン、トキソイドもしくはトキシンの任意の変異交差反応性物質（ＣＲＭ）；ポリ（リシン：アルギン酸）などのポリアミノ酸；インフルエンザ；ロタウイルスＶＰ６、パルボウイルスのＶＰ１およびＶＰ２；Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質；Ｂ型肝炎ウイルスの組換えワクチンなどが含まれる。または、担体タンパク質または他の免疫原タンパク質のフラグメントまたはエピトープを使用することができる。例えば、本発明のハプテン性ペプチドを、細菌トキシン、トキソイドまたはＣＲＭのＴ細胞エピトープに結合させることができる。これに関連して、米国特許第５，７８５，９７３号を参照することができる。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１４５】
さらに、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体は、髄膜炎菌に対するか、または他の細菌もしくはウイルスに対するワクチン組成物における担体タンパク質として作用し得る。
【０１４６】
本発明の免疫原因子は、髄膜炎菌の抗原と組み合わせて、またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、大腸菌、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの病原性細菌を含む他の生物の抗原と組み合わせて多価サブユニットワクチンとして投与することができる。代わりに、またはさらに、本発明の免疫原因子は、髄膜炎菌のオリゴ糖成分または多糖成分と同時に投与することができる。
【０１４７】
ワクチンはまた、本明細書前記に規定されるような医薬として許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有することができる。
ワクチンおよび免疫原組成物は、当技術分野において十分に知られているようなアジュバントを含むことができる。本発明により考えられるアジュバントには、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物、Ｎ、Ｎ−ジコクタデシル−Ｎ’、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール類などの表面活性物質；ピランなどのポリアミン、デキストラン硫酸、ポリＩＣカルボポール；ムラミルジペプチドなどのペプチドおよび誘導体、ジメチルグリ
シン、ツフツィン；オイルエマルション；ならびにリン酸アルミニウム、水酸化アルミまたはミョウバンなどのミネラルゲル；リンホトキシン類、ＱｕｉｌＡおよび免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
アジュバントの例に関して、国際公開公報第９９／３６５４４号もまた参照される。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
ＤＮＡ送達によるワクチン接種
本発明の修飾されたＮｈｈＡタンパク質を含む発現構築物は、宿主を予防的または治療的に処置するためにヒトに投与することができる。これに関連して、発現構築物は、１または複数の修飾されたＮｈｈＡペプチド、ポリペプチド、これらのフラグメントまたは誘導体（これらはまとめて「免疫原因子」と呼ばれる）をコードすることができる。
【０１４９】
発現構築物にはまた、遺伝子治療構築物が挙げられ、これには、ワクシニアなどの特殊化された遺伝子治療ベクター、および遺伝子治療において有用なウイルスベクターが用いられる。後者には、Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉら、２０００、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８ ４７６、Ｂｒａｕｎ−Ｆａｌｃｏら、１９９９、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６ ４３２に記載されるなどのアデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のベクター、Ｂｕｃｈｓｈａｃｈｅｒら、２０００、Ｂｌｏｏｄ ９５ ２４９９に記載されるなどのレトロウイルスおよびレンチウイルスのベクター、ならびに単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来するベクターが含まれる。遺伝子治療ベクターおよび送達方法の一般的な総説を、Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６ ３５に見出すことができる。ナイセリア属細菌のタンパク質を使用する遺伝子治療に関して潜在的に好適な多数のベクター、および送達方法を記載する例示的な参考文献は、国際公開公報第９９／３６５４４号である。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１５０】
本発明の免疫原因子は、弱毒化ウイルス宿主により発現させることができる。「弱毒化ウイルス宿主」により、天然で実質的に無毒性であるか、または実質的に無毒性にされている、いずれかのウイルスベクターが意味される。ウイルスは、任意の好適な物理的手段（例えば、熱処理）または化学的手段（例えば、ホルムアルデヒド処理）によって実質的に無毒性にすることができる。「実質的に無毒性」により、その感染性が破壊されているウイルスが意味される。理想的には、ウイルスの感染性は、ウイルスの免疫原性を運ぶタンパク質に影響を及ぼすことなく破壊される。前記から、弱毒化ウイルス宿主が生ウイルスまたは不活化ウイルスを含むことが理解される。
【０１５１】
本発明によるワクチンにおいて有用であり得る弱毒化ウイルス宿主は、アデノウイルス、サイトメガロウイルスおよび好ましくはポックスウイルス（ワクシニアなど）を含むウイルスベクター（例えば、ＰａｏｌｅｔｔｉおよびＰａｎｉｃａｌｉ、米国特許第４，６０３，１１２号（これは引用により本明細書に組み込むものとする）を参照のこと）、ならびに弱毒化されたサルモネラ属菌株（例えば、Ｓｔｏｃｋｅｒ、米国特許第４，５５０，０８１号（これは引用により本明細書に組み込むものとする）を参照のこと）を含むことができる。生ワクチンは、実質的に長く持続する免疫性をもたらし得る長期間の刺激を生じさせるので特に好都合である。ナイセリア属細菌のタンパク質を使用する免疫化に関して潜在的に好適な様々なウイルスベクター、および送達方法を記載する別の例示的な参考文献は、国際公開公報第９９／３６５４４号である。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１５２】
多価ワクチンは、髄膜炎菌の種々のエピトープ（例えば、髄膜炎菌の他の表面タンパク質またはエピトープ）を発現する１または複数の微生物から調製することができる。さらに、他の病原性微生物のエピトープをワクチンに組み入れることができる。
【０１５３】
好ましい態様において、本発明による核酸配列を発現させるための組換えワクシニアウイルスの構築が含まれる。宿主に導入したとき、組換えワクシニアウイルスは免疫原因子を発現し、それにより宿主のＣＴＬ応答を誘発する。例えば、米国特許第４，７２２，８４８号を参照することができる。これは引用により本明細書に組み込むものとする。これには、免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法が記載されている。
【０１５４】
本発明の免疫原因子を用いた治療的投与または免疫化のために有用な広範囲の他のベクターが、本開示から当業者には明らかになる。
さらなる態様において、ヌクレオチド配列は、当技術分野において知られているような「裸のＤＮＡ」ワクチンの形態でワクチンとして使用することができる。例えば、本発明の発現ベクターを哺乳動物に導入することができる。この場合、発現ベクターは、例えば、Ｂａｒｒｙ、Ｍ．ら （１９９５、Ｎａｔｕｒｅ、３７７：６３２−６３５）（これは
引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるように、宿主が免疫応答を高めるポリペプチドのインビボでの産生を生じさせる。
【０１５５】
検出キット
本発明はまた、生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌を検出するためのキットを提供する。キットは、用いられる試験方法の性質に依存して、上記に記載される１または複数の特定の因子を含有する。これに関連して、キットは、本発明によるポリペプチド、フラグメント、変異体、誘導体、抗体、抗体フラグメントまた核酸の１つまたは複数を含むことができる。キットはまた、標識を検出するために適切な試薬、陽性対照物および陰性対照物、洗浄液、希釈緩衝液などを必要な場合には含むことができる。例えば、核酸に基づく検出キットは、（ｉ）本発明による核酸（これは陽性対照物として使用することができる）、（ｉｉ）本発明によるオリゴヌクレオチドプライマー、および必要な場合には、用いられる核酸増幅技術に依存するＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼなどを含むことができる。
【０１５６】
免疫反応性フラグメントの調製
本発明はまた、本発明によるポリペプチド、変異体または誘導体の免疫反応性フラグメントを同定する方法にまで及ぶ。この方法は、本質的には、ポリペプチド、変異体または誘導体のフラグメントを作製して、フラグメントを哺乳動物に投与すること、および哺乳動物における免疫応答を検出することを含む。そのような応答には、髄膜炎菌および／または該ポリペプチド、変異体もしく誘導体と特異的に結合するエレメントの産生、ならびに／あるいは髄膜炎菌感染に対する保護作用が含まれる。
【０１５７】
上記方法で免疫反応性について特定のフラグメントを試験する前に、様々な予測方法を使用して、特定のフラグメントが、天然の抗原と交差反応する抗体を得るために使用できるかどうかを推定することができる。これらの予測方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら
（前掲）の第１１．１４章に記載されるようにアミノ末端またはカルボキシ末端の配列に基づくことができる。または、これらの予測方法は、例えば、Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７ １０５）およびＨｏｐｐ＆Ｗｏｏｄｓ（１９８３、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０ ４８３）（これらは引用により本明細書に組み込むものとする）によって記載されるように親水性の予測に基づくか、または例えば、Ｃｈｏｏ＆Ｆａｓｍａｎ（１９８７、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７ ２５１）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）によって記載されるように二次構造の予測に基づくことができる。
【０１５８】
さらに、「エピトープマッピング」では、本発明のモノクローナル抗体を使用して、交
差保護をもたらすその能力を最初に調べ、その後、該抗体により認識されるエピトープを同定することによって交差反応性のエピトープが同定される。例示的な方法が、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）に示されている。
【０１５９】
一般には、１０残基〜１５残基からなるペプチドフラグメントにより最適な結果が得られる。６残基もの小さいペプチドまたは２０残基もの大きいペプチドも問題なく機能している。そのようなペプチドフラグメントは、その後、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら （前掲
）の第１１．１４節および第１１．１５節に記載されるように、キーホルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体分子に化学的にカップリングすることができる。
【０１６０】
ペプチドは、例えば、Ｈｏｏｇｅｒｈｏｕｔら （１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．６３ ３４７３）（これは引用により本明細書に組み込むものとする）に記載されるように合成的に環状化され得ることもまた理解される。
【０１６１】
ペプチドは、例えば、上記に議論されているように動物を免疫化するために使用することができる。ペプチドが選択された天然のポリペプチドまたは元のポリペプチドに対する抗体の力価を、その後、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら （前掲）の第１１．１６節および第
１１４節に記載されるように、例えば、放射免疫アッセイまたはＥＬＩＳＡによって測定することができる。
【０１６２】
その後、抗体は、当技術分野において十分に知られているように、硫酸アンモニウム分画またはクロマトグラフィーによって動物の適切な生物学的体液から精製することができる。抗体精製に対する例示的なプロトコルが、Ａｕｓｕｂｅｌら （前掲）の第１０．１
１節および第１１．１３節に示されている。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
【０１６３】
天然のポリペプチドまたは元のポリペプチドに対する抗体の免疫反応性は、例えば、ウエスタンブロットなどの任意の適切な手法によって決定することができる。
機能的な遮断剤
国際公開公報第９９／３１１３２号に開示された様々な野生型のＮｈｈＡ／ＨｉａＮｍポリペプチドは接着性を有すると考えられている。これらのポリペプチドは、実際、表面抗原であるインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の付着因子とのある程度の類似性を有する。具体的には、これらのポリペプチドは、インフルエンザ菌のＨｉａタンパク質に対して約６７％の相同性であり（Ｂａｒｅｎｋａｍｐ＆Ｓｔ．Ｇｅｍｅ ＩＩＩ、１９９６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９
１２１５）、インフルエンザ菌のＨｓｆタンパク質に対して７４％の相同性である（Ｓｔ．Ｇｅｍｅ ＩＩＩら、１９９６、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
１７８
６２８１；および米国特許第５，６４６，２５９号）。これらの比較については、３のギャップ加重および０．０１の長さ加重が、ＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒａｕｘ、１９８４、前掲）を使用して使用された。したがって、これらのポリペプチドの機能を妨げることは、髄膜炎菌細菌が細胞に接着して侵入することがこれらのポリペプチドにより妨げられるので著しく治療的に有益である。機能を妨げることはいくつかの方法で達成することができる。
【０１６４】
例えば、本発明のポリペプチドと相互作用する細胞表面上の受容体を阻止する化学試薬またはポリペプチドなどの成分を投与することができる。これらは、受容体の部位を感染性生物と競合する。そのような成分は、例えば、本発明のポリペプチド、特にこれらのフ
ラグメントまたは機能的等価体、ならびに模倣体を含むことができる。
【０１６５】
用語「模倣体」は、本明細書において、タンパク質またはペプチドの特定の機能的領域に類似するように設計されている化学物質を示すために使用される。細菌が細胞表面に結合することを阻止する上記に記載された抗体に対して惹起された抗イディオタイプ抗体もまた使用することができる。または、本発明のポリペプチドにおける受容体結合部位と相互作用する成分は、髄膜炎菌による細胞感染を効果的に防止することができる。そのような成分は、阻止性の抗体、ペプチドまたは他の化学試薬を含むことができる。
【０１６６】
そのような成分、医薬として許容される担体と組み合わせられている医薬組成物、および髄膜炎菌感染に罹患している患者をそのような成分または組成物の投与により処置する方法はすべて、本発明のさらなる態様を構成する。
【０１６７】
本発明のポリペプチドは、上記方法においてそれらが使用される化合物をスクリーニングする際に使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、標識と結合させて、試験中の試薬の存在下で細胞培養物にさらすことができる。標識されたポリペプチドが細胞表面に結合することを阻害する試薬の能力を、その後、観測することができる。そのようなスクリーニングでは、標識されたポリペプチドを、大腸菌などの生物に対して直接使用することができる。または、髄膜炎菌そのものを、ポリペプチドの修飾された検出可能な形態を発現するように操作することができる。操作された髄膜炎菌菌株をこの方法において使用することは、タンパク質の三次構造が、野生型の細菌で発現した三次構造とより密接に類似する可能性が大きくなるので好ましい。
【０１６８】
本発明を容易に理解して、実際に実行し得るために、特に好ましい態様が、次に、下記の非限定的な実施例として記載される。
実施例１
ＮｈｈＡポリペプチドの定常領域および可変領域の同定
本発明者らは、１０菌株の髄膜炎菌間において保存的および／または非保存的であるＮｈｈＡアミノ酸配列を解明した。非保存領域は４つの可変領域（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４）に分けられ、定常領域はＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５に分けられる（これらは図１および表１に示される；配列番号１〜１１）。対応するヌクレオチド配列比較が図２に示される（配列番号１２〜２２）。
【０１６９】
実施例２
ＰＭＣ２１のＮｈｈＡポリペプチドの過剰発現
髄膜炎菌の菌株ＰＭＣ２１のｎｈｈＡ遺伝子によってコードされるＮｈｈＡタンパク質を、ｎｈｈＡ遺伝子がプロモーターに作動的に連結されている発現構築物を作製することによって過剰発現させた。
【０１７０】
下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、髄膜炎菌ＰＭＣ２１株のｎｈｈＡ核酸のオープンリーディングフレームをＰＣＲによって増幅した：
ＨＯＭＰ５’：
【０１７１】
【表１】
【０１７２】
これは、ＥａｇＩ制限部位（下線部）と、ＮｈｈＡの最初の７アミノ酸をコードする配列（「 」）とを含む。
ＨＯＭＰ３’ＡＮ：
【０１７３】
【表２】
【０１７４】
これは、ＮｃｏＩ制限部位（下線部）と、ｃ３株のｎｈｈＡオープンリーディングフレームの終了部の後の配列４８〜６１のヌクレオチドの逆相補鎖（太字）とを含む。
増幅産物は、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩの制限エンドヌクレアーゼで続いて消化される制限部位を含有した。
【０１７５】
サブクローニングのために使用されたプラスミドはｐＣＯ１４Ｋであった。このプラスミドは、髄膜炎菌菌株２９９６の隣接配列とともに髄膜炎菌の強く発現するクラス１の外膜タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置するｐｏｒＡプロモーターと、Ｒｏｕｐｐｅ ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｔら （Ｉｎｆｅｃｔ
Ｉｍｍｕｎ １９９６ ６４ ２７４５）によって記載されるような選択用のカナマイシン耐性遺伝子とを含有する。
【０１７６】
消化された増幅産物を、その後、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩの制限エンドヌクレアーゼで消化されたｐＣＯ１４Ｋに連結した。連結により、ｐｏｒＡオープンリーディングフレームの大部分がｎｈｈＡ増幅産物で置換された（図３）。これにより、配列番号１に示されるように５９１アミノ酸のポリペプチドをコードする組換え核酸発現構築物（配列番号１２に示されるオープンリーディングフレーム）が作製された。
【０１７７】
これは、強力なｐｏｒＡプロモーターの制御下で本発明のｎｈｈＡ核酸の発現を行わせる。翻訳は、ＨＯＭＰ５’の３１位から始まるＡＴＧコドンから開始される。ｐｏｒＡとｎｈｈＡとの融合体の形成を防止するために、ＨＯＭＰ５’配列は、上記の開始用ＡＴＧの前にＴＡＡ停止コドンを含有する。
【０１７８】
得られたプラスミドｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）を制限消化により線状化し、そしてＪａｎｉｋら（１９７６、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４ ７１）によって記載される方法を使用して髄膜炎菌７Ｇ２株を形質転換するために使用した。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する固体培地において、５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベーションすることによって選択した。カナマイシン耐性コロニーを選択し、一晩培養し、そして総細胞タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動的に分離し、その後、Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用してニトロセルロースメンブランに転写することによってＮｈｈＡポリペプチ
ドの過剰発現についてスクリーニングした。その後、メンブランをウサギ抗ＮｈｈＡ血清（国際公開公報第９９／３１１３２号に記載）およびアルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と順次インキュベーションし、その後、比色検出をＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。親株と比較して、より高いレベルでＮｈｈＡポリペプチドを発現するクローンを１つ単離した（図１１）。コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４、配列番号３３）が生成することが示される。
【０１７９】
このプラスミド構築物ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）は髄膜炎菌の任意の形質転換受容性菌株に形質転換することができる。
実施例３
Ｈ４１のＮｈｈＡポリペプチドの過剰発現
髄膜炎菌のＨ４１株のｎｈｈＡ遺伝子によってコードされるＮｈｈＡタンパク質を、実施例２に記載されるのと同じ方法を使用して過剰発現させた。これにより、配列番号２に示されるように５９１アミノ酸のポリペプチドをコードする組換え核酸発現構築物（配列番号１３に示されるオープンリーディングフレーム）が作製された。本実施例では、得られたプラスミドｐＩＰ５２（Ｈ４１）を線状化して、髄膜炎菌の７Ｇ２株に形質転換した。カナマイシン耐性コロニーを分析して、ウエスタン免疫ブロットによって調べたときにＮｈｈＡの過剰発現を示すコロニーを１つ選んだ（図１１）。コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４、配列番号３４）が生成することが示される。
【０１８０】
この方法は、他の髄膜炎菌菌株の野生型ｎｈｈＡ配列を含有する発現構築物を作製するために用いることができる。
実施例４
都合のよい制限部位を使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築
参照を容易にするために、ＰＭＣ２１株のｎｈｈＡ核酸によってコードされるＮｈｈＡポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１に示される。本発明者らは、菌株間の最も大きな可変性の領域を欠失させた野生型ＰＭＣ２１ｎｈｈＡの欠失変異体を作製した。野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドのアミノ酸１〜５４をコードする増幅産物を、下記のプライマーを使用してｎｈｈＡ核酸テンプレートからＰＣＲ増幅によって作製した：
ＨＯＭＰ５’：
【０１８１】
【表３】
【０１８２】
これは、過剰発現構築物ｐＩＰ５２を作製するために使用された同じオリゴヌクレオチドである。
ＮＨ３’ＢＧ：
【０１８３】
【表４】
【０１８４】
これは、ＢｇｌＩＩ制限部位（下線部）と、アミノ酸１３４（二重下線）および野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡのアミノ酸４９〜５４をコードする配列の逆相補鎖（太字）とを含む。
得られた増幅産物はＥａｇＩおよびＢｇｌＩＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を含んだ。ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）は、ｎｈｈＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始部の２０ｂｐ上流に単一のＥａｇＩ部位を含み、ＯＲＦ内に位置する単一のＢｇｌＩＩ部位を含む（図３を参照のこと）。したがって、ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）および増幅産物を、ＥａｇＩおよびＢｇｌＩＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に供し、連結して、コンピテントなＤＨ５α株の大腸菌細菌を形質転換するために使用した。これにより、ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）のＥａｇＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントがＰＣＲ産物で置換される。これにより、図５（配列番号２３）に示されるように５１２アミノ酸のポリペプチドをコードする組換え核酸発現構築物（図５に示されるオープンリーディングフレーム；配列番号２８）が作製された。このアミノ酸配列は野生型配列のアミノ酸１〜５４および１３４〜５９２を含み、それにより、野生型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドのＶ１領域の大部分、Ｖ２領域およびＣ２領域のすべて、ならびにＣ３領域の一部が欠失している。
【０１８５】
このプラスミドを制限消化により線状化して、髄膜炎菌の７Ｇ２株に形質転換した。実施例１に記載されるような方法を使用して、短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡを過剰発現するコロニーを１つ単離した（図１１）。
【０１８６】
コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４、配列番号３５）が生成することが示される。切断され得るシグナル配列の存在を確認するために、そして過剰発現したタンパク質の同一性を確認するために、外膜タンパク質を、界面活性剤サルコシルに溶解しない画分を単離することによって半精製した。
【０１８７】
単離された膜タンパク質を電気泳動で分離し、その後、ナイロンメンブランに転写した。過剰発現したタンパク質の位置がクーマシー染色によって明らかにされた。メンブランのこの領域を切り出して、タンパク質のＮ末端配列を決定した。このタンパク質の最初の１１アミノ酸はＸＸＥＴＤＬＴＳＶＧＴであった。これは、本実施例において規定される発現構築物によって発現することが予測されるアミノ酸配列のアミノ酸残基５２〜６２（６２を含む）に対応する。
【０１８８】
これは、ポリヌクレオチド配列内に存在する制限部位を使用した欠失体の例である。この構築物は任意の形質転換受容性の髄膜炎菌に形質転換することができる。
実施例５
都合のよい制限部位を使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築
Ｈ４１の野生型ｎｈｈＡ配列を含有する発現構築物を、実施例２に記載されるように作製した。得られた発現構築物をｐＩＰ５２（Ｈ４１）と名付けた。欠失変異体を、本実施例に概略される方法を使用して作製した。この場合、使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは下記の通りである：
ＨＯＭＰ５’：
【０１８９】
【表５】
【０１９０】
これは、過剰発現構築物ｐＩＰ５２を作製するために使用された同じオリゴヌクレオチドである。
ＮＨ３’ＳＴＵ
【０１９１】
【表６】
【０１９２】
これは、ＳｔｕＩ制限部位（下線部）と、アミノ酸１３４（二重下線）および野生型Ｈ４１ＮｈｈＡのアミノ酸４９〜５４をコードする配列の逆相補鎖（太字）とを含む。
得られた増幅産物は単一のＥａｇＩおよびＳｔｕＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。発現構築物ｐＩＰ５２（Ｈ４１）はこれらの制限部位を含有する。したがって、ｐＩＰ５２（Ｈ４１）および増幅産物を、ＥａｇＩおよびＳｔｕＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に供し、連結して、コンピテントなＤＨ５α株の大腸菌細菌を形質転換するために使用した。この連結により、ｐＩＰ５２（Ｈ４１）のＥａｇＩ／ＳｔｕＩフラグメントがＰＣＲ産物で置換される。これにより、図６および配列番号２４に示されるように５１３アミノ酸のポリペプチドをコードする組換え核酸発現構築物（図６および配列番号２９に示されるオープンリーディングフレーム）が作製された。このアミノ酸配列は野生型配列のアミノ酸１〜５４および１３４〜５９３を含み、それにより、野生型Ｈ４１ＮｈｈＡポリペプチドのＶ１領域の大部分、Ｖ２領域およびＣ２領域のすべて、ならびにＣ３領域の一部が欠失している。
【０１９３】
このプラスミドを制限消化により線状化して、髄膜炎菌の７Ｇ２株に形質転換した。実施例１に記載されるような方法を使用して、短縮型Ｈ４１ＮｈｈＡを過剰発現するコロニーを１つ単離した（図１１）。
【０１９４】
コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４、配列番号３６）が生成することが示される。
【０１９５】
この構築物は任意のコンピテントな髄膜炎菌に形質転換することができる。
実施例６
スプライスオーバーラップＰＣＲを使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築
ＮｈｈＡをコードするヌクレオチドから可変領域を欠失するために都合の良い制限部位を使用することに加えて、変異体はまた、Ｈｏら（１９８９、前掲）およびＨｏｒｔｏｎ、Ｒ．Ｍ．ら （１９８９、前掲）により記載されるような「スプライスオーバーラップ
発現」ＰＣＲの使用によっても構築することができる。この方法では、定常領域をコードするが、可変領域が欠失しているポリヌクレオチドを作製することができる（図５Ａ、５Ｂ、５Ｃを参照のこと）。
【０１９６】
本実施例では、Ｃ１領域およびＣ５領域を含有し、他の領域のすべてを欠失させた構築物が作製された（図５Ａを参照のこと）
下記のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＭＣ２１株の染色体ＤＮＡからＣ１領域（図１を参照のこと）に対応するＤＮＡを増幅するためにＰＣＲ反応において使用した：
ＨＯＭＰ５’：
【０１９７】
【表７】
【０１９８】
これは、過剰発現構築物ｐＩＰ５２（ＰＭＣ２１）を作製するために使用された同じオリゴヌクレオチドである。
ＳＯ−Ｃ：
【０１９９】
【表８】
【０２００】
この配列は、ＰＭＣ２１株の野生型ＮｈｈＡのＣ５領域の開始部のアミノ酸２３７〜２４１（下線部）およびＣ１領域の終了部のアミノ酸４５〜５２（太字）をコードする配列の逆相補鎖である。
この反応の増幅産物はＨＯＭＰ５’／ＳＯ−Ｃである。
【０２０１】
下記のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＭＣ２１株の染色体ＤＮＡからＣ５を増幅するためにＰＣＲ反応において使用した：
ＳＯ−Ｄ：
【０２０２】
【表９】
【０２０３】
これはＣ５の開始部のアミノ酸２３７〜２４４をコードする（下線部はプライマーＳＯ−Ｃの逆相補鎖を示す）
ＨＯ３’ＡＮ：
【０２０４】
【表１０】
【０２０５】
これは、ｐＩＰ５２の構築において使用された同じプライマーである。
この反応の増幅産物はＳＯ−Ｄ／ＨＯ３’ＡＮである。
ＨＯＭＰ５’／ＳＯ−ＣおよびＳＯ−Ｄ／ＨＯ３’ＡＮの増幅産物を、電気泳動で分離した後のアガロースゲルから精製し、混合して、ＨＯＭＰ５’およびＨＯ３’ＡＮのプライマーを使用するさらなる増幅に供した。得られた増幅産物は、ＰＭＣ２１の野生型ＮｈｈＡのアミノ酸１〜５２および３３７〜５９１をコードする。この増幅産物を、実施例１に記載されるように、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩを用いた制限消化に供し、そしてｐＣＯ１４Ｋにクローン化した。この組換え分子はＣ１およびＣ５を含有し、したがってＶ１〜Ｖ４およびＣ２〜Ｃ４の領域を欠失している。このオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が図７および配列番号３０に示され、このヌクレオチド配列に由来する予想されるポリペプチド配列が図７および配列番号２５に示される。
【０２０６】
このプラスミドを制限消化により線状化して、髄膜炎菌の７Ｇ２株に形質転換した。実施例２に記載されるような方法を使用して、短縮型ＰＭＣ２１ＮｈｈＡを過剰発現するコロニーを１つ単離した。
【０２０７】
コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４；配列番号３７）が生成することが示される。 このプラスミドは髄膜炎菌の任意の形質転換受容性菌株に形質転換することができる。
【０２０８】
実施例７
スプライスオーバーラップＰＣＲを使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築
類似する方法を使用して、ＮｈｈＡの様々な領域をコードする組換えポリヌクレオチドを作製できることが理解される。下記の方法を使用して、Ｃ１、Ｃ４、Ｖ４およびＣ５の領域を含む構築物を作製することができる（図５Ｂを参照のこと）。
【０２０９】
Ｃ１領域が、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される：
ＨＯＭＰ５’：
【０２１０】
【表１１】
【０２１１】
ＳＯ−Ｅ：
【０２１２】
【表１２】
【０２１３】
これは、ＰＭＣ２１株の野生型ＮｈｈＡのＣ４領域の開始部のアミノ酸２１１〜２１５（下線部）およびＣ１領域の終了部（太字）の逆相補鎖をコードする。
この反応の増幅産物はＨＯＭＰ５’／ＳＯ−Ｅである。
【０２１４】
下記のオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＭＣ２１株の染色体ＤＮＡから領域Ｃ４−Ｖ４−Ｃ５を増幅するためにＰＣＲ反応において使用される：
ＳＯ−Ｆ：
【０２１５】
【表１３】
【０２１６】
これはＣ４の開始部のアミノ酸２１１〜２１８をコードする（下線部はプライマーＳＯ−Ｅの逆相補鎖を示す）
ＨＯ３’ＡＮ：
【０２１７】
【表１４】
【０２１８】
この反応の増幅産物はＳＯ−Ｆ／ＨＯＭＰ３’である。
ＨＯＭＰ５’／ＳＯ−ＥおよびＳＯ−Ｆ／ＨＯ３’ＡＮの増幅産物は、電気泳動で分離された後のアガロースゲルから精製され、混合されて、ＨＯＭＰ５’およびＨＯ３’ＡＮのプライマーを使用するさらなる増幅に供される。得られる生成物は、ＰＭＣ２１の野生型ＮｈｈＡのアミノ酸１〜５２および２１１〜５９１をコードする。この増幅産物は、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩを用いた制限消化に供され、そしてｐＣＯ１４Ｋにクローン化される。この組換え分子は、Ｃ１、Ｃ４、Ｖ４およびＣ５を含有し、したがってＶ１〜Ｖ３およびＣ２〜Ｃ３の領域を欠失している。このオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が図８および配列番号３１に示され、このヌクレオチド配列に由来する予想されるポリペプチド配列が図８および配列番号２６に示される。コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の５１アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４；配列番号３８）が生成することが示される。
【０２１９】
この構築物は任意の形質転換受容性の髄膜炎菌に形質転換することができる。
実施例８
スプライスオーバーラップＰＣＲを使用するＮｈｈＡ欠失変異体の構築
類似する方法を使用して、ＮｈｈＡの様々な領域をコードする組換えポリヌクレオチドを作製できることが理解される。下記の方法を使用して、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５の領域を含む構築物を作製することができる（図５Ｃを参照のこと）。
【０２２０】
Ｃ１およびＣ２が、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される：
ＨＯＭＰ５’：
【０２２１】
【表１５】
【０２２２】
ＳＯ−Ｇ：
【０２２３】
【表１６】
【０２２４】
これは、ＰＭＣ２１株のＣ３領域の開始部のアミノ酸１２５〜１２９（下線部）、Ｃ２領域のすべて（アミノ酸１０９〜１２０、太字で二重下線部）、およびＣ１領域の終了部（アミノ酸４６〜５２、太字）の逆相補鎖をコードする。
この反応の増幅産物はＨＯＭＰ５’／ＳＯ−Ｇである。
【０２２５】
Ｃ３領域およびＣ４領域の一部が、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される：
ＳＯ−Ｈ：
【０２２６】
【表１７】
【０２２７】
これはＣ３の開始部のアミノ酸１２５〜１３２をコードする（下線部はプライマーＳＯ−Ｇの逆相補鎖を示す）
ＳＯ−Ｉ：
【０２２８】
【表１８】
【０２２９】
これは、Ｃ３領域の終了部のアミノ酸１８２〜８８（下線部）、およびＣ４領域のアミノ酸２１１〜２２２（太字）の逆相補鎖をコードする。
この反応の増幅産物はＳＯ−Ｈ／ＳＯ−Ｉである。
【０２３０】
ＨＯＭＰ５’／ＳＯ−ＧおよびＳＯ−Ｈ／ＳＯ−Ｉの増幅産物は、電気泳動で分離された後のアガロースゲルから精製され、混合されて、ＨＯＭＰ５’およびＳＯ−Ｉのプライマーを使用するさらなる増幅に供され、アミノ酸１〜５２、１０３〜１１４、１２５〜１８８および２１１〜２２２（すなわち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４の一部の領域）をコードする生成物が得られる。
【０２３１】
Ｃ５領域およびＣ４領域の一部が、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される：
ＳＯ−Ｊ：
【０２３２】
【表１９】
【０２３３】
これは、ＰＭＣ２１株の野生型ＮｈｈＡのＣ４のアミノ酸２１８〜２２９およびＣ５のアミノ酸２３７〜２４３をコードする（太字下線部はプライマーＳＯ−Ｉの逆相補鎖を示す）
ＨＯ３’ＡＮ：
【０２３４】
【表２０】
【０２３５】
この反応の増幅産物はＳＯ−Ｊ／ＨＯ３’ＡＮである。
ＨＯＭＰ５’／ＳＯ−ＩおよびＳＯ−Ｊ／ＨＯ３’ＡＮの増幅産物は、電気泳動で分離された後のアガロースゲルから精製され、混合されて、ＨＯＭＰ５’およびＨＯ３’ＡＮのプライマーを使用するさらなる増幅に供される。得られる生成物は、ＰＭＣ２１株の野生型ＮｈｈＡのアミノ酸１〜５２、１０３〜１１４、１２５〜１８８、２１１〜２２９および２３７〜５９１をコードする。得られた生成物は、ＥａｇＩおよびＮｃｏＩを用いた制限消化に供され、そしてｐＣＯ１４Ｋにクローン化される。この組換え分子は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５の領域を含有し、したがってＶ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４の領域を欠失している。このオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が図９および配列番号３２に示され、このヌクレオチド配列に由来する予想されるポリペプチド配列が図９および配列番号２７に示される。コンピュータープログラムＳＩＧＣＬＥＡＶＥ（ｗｗｗ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕにおいて提供されるｅＧＣＧ群のプログラムの一部）を使用した予想されるアミノ酸配列の分析により、最初の４９アミノ酸が切断されて、成熟ポリペプチド（図１４；配列番号３９）が生成することが示される。
【０２３６】
この構築物は髄膜炎菌の任意の形質転換受容性菌株に形質転換することができる。
実施例９ 過剰発現したＮｈｈＡポリヌクレオチドの精製
前記実施例に記載されるような組換えＮｈｈＡポリペプチドは下記の手法によって単離することができる。細菌を５％ＣＯ２の雰囲気において３７℃で一晩（１２時間〜１４時間）生育させる（本実施例では、培地は、Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ塩基が補充されたＢＨＩ寒天であった。他の生育培地が当業者には十分に知られている）。１０枚の２５ｍＬ寒天平板に由来する細菌を集め、ＨＣｌでｐＨ８．０に調節された１０ｍＭ Ｔｒｉｓの２５ｍＬに懸濁した。２％サルコシルを含有する等容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加え、混合物を４℃で１時間穏やかに混合した。これを１００，０００ｘｇにおいて２０℃で７０分間遠心分離して、上清を捨てた。ペレットを、２５ゲージの針に通すことによって、１％サルコシルを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）の２５ｍＬに再懸濁した。これを１００，０００ｘｇにおいて２０℃で７０分間遠心分離して、上清を捨てた。ペレットを、２５ゲージの針に通すことによって、１０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。この画分は、細胞のサルコシル不溶性成分を含み、外膜タンパク質が濃縮されている。（さらなる工程を、残留するサルコシル界面活性剤を除くために取り入れることができる。それにより、タンパク質溶液は、４℃において、例えば、１０
ｍＭのＴｒｉｓ．Ｃｌ（ｐＨ８．０）またはＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）の１００倍容量〜１０００倍容量に対して４時間〜８時間の４回のサイクルにわたって透析される）。
【０２３７】
２８０ｎｍの波長における吸光度によって、またはＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用することによって懸濁物中のタンパク質濃度を測定した後、１％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）、２％β−メルカプトエタノールを含有する溶液に１０ｍｇのタンパク質を含有する約１ｍＬの溶液をＢｉｏＲａｄ ｍｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａｎＩＩ装置において１．５ｍｍ厚の６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。高分子量のＮｈｈＡを、ＢｉｏＲａｄ「ｍｉｎｉ Ｗｈｏｌｅ ｇｅｌ Ｅｌｕｔｅｒ」を使用してゲルから溶出させた。各溶出画分の約１０％を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、その後、クーマシー染色することによって調べた。他のタンパク質を本質的に含まないＮｈｈＡ含有画分をまとめた。この手順は、実施例２に記載されるような過剰発現させた成熟ＮｈｈＡ（配列番号１）、実施例４に記載されるような過剰発現させたＢｇｌＩＩ欠失変異体ＮｈｈＡ（配列番号２３）、および実施例６に記載されるような過剰発現させたＮｈｈＡ欠失変異体（配列番号２５）を単離するために行われた。単離タンパク質は図１２に示される。
【０２３８】
実施例１０
精製されたＮｈｈＡ欠失変異体ポリヌクレオチドの免疫原性
マウスに、精製された野生型ＮｈｈＡポリヌクレオチド、および前記実施例に記載される欠失変異体を接種した。１つの群において、各Ｂａｌｂ／ｃマウスには、約１３０μｇのＰＭＣ２１ＮｈｈＡがＭＰＬ＋ＴＤＭ（商標）アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）とともに０日目に皮下接種され、そして１４日目に１１５μｇが皮下接種された。別の群では、各マウスには、約１２０μｇのタンパク質がＭＰＬ＋ＴＤＭ（商標）アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）とともに０日目に皮下接種され、そして１４日目に１９０μｇが皮下接種された。さらに別の群では、各マウスには、約２６０μｇのタンパク質がＭＰＬ＋ＴＤＭ（商標）アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）とともに０日目に皮下接種され、そして１４日目に１２４０μｇが皮下接種された。血液サンプルを２１日目に採取して、血清を抽出した。これらの血清を、全長型のＰＭＣ２１ＮｈｈＡを認識する抗体の存在についてウエスタン免疫ブロットで試験した（図１３）。Ｐ６（ＰＭＣ２１のＮｈｈＡを過剰発現する）および２Ａ株（ＮｈｈＡの発現が失われている）のＯＭＣ調製物（５ｍｇ）を、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｎｉ ＰｒｏｔｅａｎＩＩ電気泳動装置を使用して６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をニトロセルロースに電気泳動的に転写して、フィルターを３ｍｍ細片に切断し、その後、５％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキングした。マウス血清を５％スキムミルク粉末で１：１０００倍および１：１００００倍に希釈して、ニトロセルロース細片とともにインキュベーションした。抗体の結合を、アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を使用し、その後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ）を用いた比色検出により検出した。図１３から理解され得るように、ＮｈｈＡ欠失変異体または全長型の成熟ＮｈｈＡポリペプチドを接種することによって、全長型の成熟ＰＭＣ２１ＮｈｈＡポリペプチドに対する免疫応答を誘発させることが可能である。
【０２３９】
実施例１１
大腸菌における欠失変異体の発現
本発明の変異体ポリペプチドを髄膜炎菌において発現させることに加えて、本発明の変異体ポリペプチドは大腸菌細菌においても発現させることができる。実施例４〜８の組換えｎｈｈＡ欠失変異体はどれも、ＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用することができる。使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは、国際公開公報第９９／３１１３２号に記載される通りであり得る（その明細書の配列番号２４および配列番号２５など）。増幅産物をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの酵素で制限消化して、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで
制限消化されたプラスミドｐＭＡＬＣ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と連結し、得られたプラスミドをコンピテントな大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。得られた菌株は、ｐＭＡＬＣ２の製造者が指示する条件を使用して高レベルの組換えタンパク質を発現させるために誘導することができる。得られる組換えタンパク質は、マルトース結合タンパク質と本発明の欠失変異体ＮｈｈＡポリペプチドとの融合体である。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離、その後、Ｍｉｎｉ−Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｅｌｕｔｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を製造者の説明書に従って使用する電気溶出によって半精製することができる。その後、半精製された融合タンパク質は、ＰＢＳに対して透析され、その後、プロテアーゼ酵素の第Ｘａ因子で消化して、マルトース結合タンパク質成分を組換えＮｈｈＡタンパク質から切断することができる。組換えＮｈｈＡタンパク質は、例えば、Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ ＵＳＡ、１９９３）によって記載されるような標準的な方法によって精製することができる。
【０２４０】
本明細書中を通して、目的は、本発明をいずれか１つの態様または特徴の特定の集合に限定することなく、本発明の好ましい態様を記載することである。したがって、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な改変および変化を例示された特定の態様において行い得ることが当業者によって理解される。
【０２４１】
本明細書で参照されるすべてのコンピュータープログラム、アルゴリズム、特許および科学的文献は参照により組み込むものとする。
【０２４２】
【表２１】
【０２４３】
【表２２】
【０２４４】
（表の説明）
表１：髄膜炎菌の示された１０菌株のそれぞれから得られたＮｈｈＡポリペプチドの保存領域（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５）および可変領域（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４）のアミノ酸の同定。関連する配列番号もまた示される。第１欄＝菌株名。配列番号１〜９は同時係属中の出願である国際公開公報第９９／３１１３２号に以前に記載された。Ｚ２４９１株のＮｈｈＡおよびｎｈｈＡの配列はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｎ＿ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ／から得られた。第２欄＝Ｃ１領域のアミノ酸番号。第３欄＝Ｖ１領域のアミノ酸番号。第４欄＝Ｃ２領域のアミノ酸番号。第５欄＝Ｖ２領域のアミノ酸番号。第６欄＝Ｃ３領域のアミノ酸番号。第７欄＝Ｖ２領域のアミノ酸番号。第８欄＝Ｃ４領域のアミノ酸番号。第９欄＝Ｖ４領域のアミノ酸番号。第１０欄＝Ｃ５領域のアミノ酸番号。コンセンサス配列（配列番号１１）のアミノ酸番号もまた示されていることには留意すること。
【０２４５】
表２：アミノ酸置換の表
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮｈｈＡポリペプチドの１つまたは複数の保存領域（Ｃ）の５０個以上の連続したアミノ酸を含む単離タンパク質であって、該保存領域（Ｃ）が
（ｉ）配列番号１１の残基１〜５０、
（ｉｉ）配列番号１１の残基１０９〜１２０、
（ｉｉｉ）配列番号１１の残基１３５〜１９８、
（ｉｖ）配列番号１１の残基２２１〜２３９、および
（ｖ）配列番号１１の残基２４９〜６０４
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
前記単離タンパク質が野生型ＮｈｈＡポリペプチドではなく、
配列番号１１の残基５１〜１０８が欠失している単離タンパク質。
【請求項２】
前記保存領域（Ｃ）が、
（ｉ）配列番号１の残基１〜５０、
（ｉｉ）配列番号２の残基１〜５０、
（ｉｉｉ）配列番号３の残基１〜５０、
（ｉｖ）配列番号４の残基１〜５０、
（ｖ）配列番号５の残基１〜５０、
（ｖｉ）配列番号６の残基１〜５０、
（ｖｉｉ）配列番号７の残基１〜５０、
（ｖｉｉｉ）配列番号８の残基１〜５０、
（ｉｘ）配列番号９の残基１〜５０、
（ｘ）配列番号１０の残基１〜５０、
（ｘｉ）配列番号１の残基１２５〜１８８、
（ｘｉｉ）配列番号２の残基１２５〜１８８、
（ｘｉｉｉ）配列番号３の残基１２２〜１８５、
（ｘｉｖ）配列番号４の残基１２７〜１９０、
（ｘｖ）配列番号５の残基１２５〜１８８、
（ｘｖｉ）配列番号６の残基１３２〜１９５、
（ｘｖｉｉ）配列番号７の残基１３１〜１９４、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号８の残基１３１〜１９４、
（ｘｉｘ）配列番号９の残基１２７〜１９０、
（ｘｘ）配列番号１０の残基１２５〜１８８、
（ｘｘｉ）配列番号１の残基２１１〜２２９、
（ｘｘｉｉ）配列番号２の残基２１１〜２２９、
（ｘｘｉｉｉ）配列番号３の残基２０６〜２２４、
（ｘｘｉｖ）配列番号４の残基２１３〜２３１、
（ｘｘｖ）配列番号５の残基２１１〜２２９、
（ｘｘｖｉ）配列番号６の残基２１８〜２３６、
（ｘｘｖｉｉ）配列番号７の残基２１７〜２３５、
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号８の残基２１７〜２３５、
（ｘｘｉｘ）配列番号９の残基２１３〜２３１、
（ｘｘｘ）配列番号１０の残基２０９〜２２７、
（ｘｘｘｉ）配列番号１の残基２３７〜５９１、
（ｘｘｘｉｉ）配列番号２の残基２３７〜５９２、
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号３の残基２３５〜５８９、
（ｘｘｘｉｖ）配列番号４の残基２３９〜５９４、
（ｘｘｘｖ）配列番号５の残基２３７〜５９１、
（ｘｘｘｖｉ）配列番号６の残基２４４〜５９９、
（ｘｘｘｖｉｉ）配列番号７の残基２４３〜５９８、
（ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号８の残基２４３〜５９８、
（ｘｘｘｉｘ）配列番号９の残基２３９〜５９４、及び
（ｘｘｘｘ）配列番号１０の残基２３７〜５９２
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
【請求項３】
ＮｈｈＡポリペプチドの１つまたは複数の可変（Ｖ）領域のアミノ酸をさらに含む、請求項１または２に記載の単離タンパク質。
【請求項４】
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離タンパク質のうちの少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含む免疫原性フラグメントを有する単離タンパク質。
【請求項６】
前記単離タンパク質と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、野生型ＮｈｈＡポリペプチドではない請求項１に記載の単離タンパク質の変異体。
【請求項７】
前記単離タンパク質と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、野生型ＮｈｈＡポリペプチドではない請求項６に記載の変異体。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に単離タンパク質または請求項６もしくは請求項７に記載の変異体と、融合パートナーとを含む単離融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に単離タンパク質、請求項６もしくは請求項７に記載の変異体、および請求項８に記載の融合タンパク質のうちの１つまたは複数の単離タンパク質と、医薬として許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
ワクチンである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に単離タンパク質、請求項６もしくは請求項７に記載の変異体、または請求項８に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項１２】
（ｉ）配列番号２２の残基１〜１５０、
（ｉｉ）配列番号２２の残基３２５〜３６１、
（ｉｉｉ）配列番号２２の残基４０３〜５９５、
（ｉｖ）配列番号２２の残基６６１〜７１７、および
（ｖ）配列番号２２の残基７４５〜１８１５
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１１に記載の単離核酸。
【請求項１３】
配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１２に記載の単離核酸。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の単離核酸を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
細菌である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１４に記載の発現ベクターと、医薬として許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離タンパク質の交差反応性エピトープと結合するモノクローナル抗体または抗原結合モノクローナル抗体のフラグメント。
【請求項２０】
組換えタンパク質を製造する方法であって、
（ｉ）請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞を、宿主細胞中で組換えタンパク質が発現されるよう培養する工程、および
（ｉｉ）前記組換えタンパク質を単離する工程
からなる方法。
【請求項２１】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染の予防又は治療のための処理に使用される請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
【請求項２２】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染の予防又は治療のための処理に使用される請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染の予防又は治療のための処理に使用される請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染がヒトにおける感染である請求項２１に記載の単離タンパク質。
【請求項２５】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染がヒトにおける感染である請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染がヒトにおける感染である請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を含むことが疑われる生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌を検出する方法であって、
（ｉ）請求項１９に記載のモノクローナル抗体または抗原結合モノクローナル抗体のフラグメントを、哺乳動物から得られた生物学的サンプルと組み合わせる工程、および
（ｉｉ）髄膜炎菌の存在を示す特異的に結合した抗体または抗体フラグメントを検出する工程、
からなる方法。
【請求項２８】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を含むことが疑われる生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌を検出する方法であって、
（ｉ）患者から得た生物学的サンプルを、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離タンパク質または請求項８に記載の融合タンパク質と接触させる工程、および
（ｉｉ）前記単離タンパク質または前記融合タンパク質と、前記生物学的サンプル中の髄膜炎菌特異的抗体との間の複合体の存在または不在を決定する工程であって、該複合体の存在は感染を存在を示す工程、
から成る方法。
【請求項２９】
生物学的サンプル中の髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を検出する方法であって、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の単離核酸を用いて前記生物学的サンプル中の髄膜炎菌を検出する工程を含む方法。
【請求項１】
ＮｈｈＡポリペプチドの１つまたは複数の保存領域（Ｃ）の５０個以上の連続したアミノ酸を含む単離タンパク質であって、該保存領域（Ｃ）が
（ｉ）配列番号１１の残基１〜５０、
（ｉｉ）配列番号１１の残基１０９〜１２０、
（ｉｉｉ）配列番号１１の残基１３５〜１９８、
（ｉｖ）配列番号１１の残基２２１〜２３９、および
（ｖ）配列番号１１の残基２４９〜６０４
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
前記単離タンパク質が野生型ＮｈｈＡポリペプチドではなく、
配列番号１１の残基５１〜１０８が欠失している単離タンパク質。
【請求項２】
前記保存領域（Ｃ）が、
（ｉ）配列番号１の残基１〜５０、
（ｉｉ）配列番号２の残基１〜５０、
（ｉｉｉ）配列番号３の残基１〜５０、
（ｉｖ）配列番号４の残基１〜５０、
（ｖ）配列番号５の残基１〜５０、
（ｖｉ）配列番号６の残基１〜５０、
（ｖｉｉ）配列番号７の残基１〜５０、
（ｖｉｉｉ）配列番号８の残基１〜５０、
（ｉｘ）配列番号９の残基１〜５０、
（ｘ）配列番号１０の残基１〜５０、
（ｘｉ）配列番号１の残基１２５〜１８８、
（ｘｉｉ）配列番号２の残基１２５〜１８８、
（ｘｉｉｉ）配列番号３の残基１２２〜１８５、
（ｘｉｖ）配列番号４の残基１２７〜１９０、
（ｘｖ）配列番号５の残基１２５〜１８８、
（ｘｖｉ）配列番号６の残基１３２〜１９５、
（ｘｖｉｉ）配列番号７の残基１３１〜１９４、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号８の残基１３１〜１９４、
（ｘｉｘ）配列番号９の残基１２７〜１９０、
（ｘｘ）配列番号１０の残基１２５〜１８８、
（ｘｘｉ）配列番号１の残基２１１〜２２９、
（ｘｘｉｉ）配列番号２の残基２１１〜２２９、
（ｘｘｉｉｉ）配列番号３の残基２０６〜２２４、
（ｘｘｉｖ）配列番号４の残基２１３〜２３１、
（ｘｘｖ）配列番号５の残基２１１〜２２９、
（ｘｘｖｉ）配列番号６の残基２１８〜２３６、
（ｘｘｖｉｉ）配列番号７の残基２１７〜２３５、
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号８の残基２１７〜２３５、
（ｘｘｉｘ）配列番号９の残基２１３〜２３１、
（ｘｘｘ）配列番号１０の残基２０９〜２２７、
（ｘｘｘｉ）配列番号１の残基２３７〜５９１、
（ｘｘｘｉｉ）配列番号２の残基２３７〜５９２、
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号３の残基２３５〜５８９、
（ｘｘｘｉｖ）配列番号４の残基２３９〜５９４、
（ｘｘｘｖ）配列番号５の残基２３７〜５９１、
（ｘｘｘｖｉ）配列番号６の残基２４４〜５９９、
（ｘｘｘｖｉｉ）配列番号７の残基２４３〜５９８、
（ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号８の残基２４３〜５９８、
（ｘｘｘｉｘ）配列番号９の残基２３９〜５９４、及び
（ｘｘｘｘ）配列番号１０の残基２３７〜５９２
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
【請求項３】
ＮｈｈＡポリペプチドの１つまたは複数の可変（Ｖ）領域のアミノ酸をさらに含む、請求項１または２に記載の単離タンパク質。
【請求項４】
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離タンパク質のうちの少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含む免疫原性フラグメントを有する単離タンパク質。
【請求項６】
前記単離タンパク質と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、野生型ＮｈｈＡポリペプチドではない請求項１に記載の単離タンパク質の変異体。
【請求項７】
前記単離タンパク質と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、野生型ＮｈｈＡポリペプチドではない請求項６に記載の変異体。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に単離タンパク質または請求項６もしくは請求項７に記載の変異体と、融合パートナーとを含む単離融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に単離タンパク質、請求項６もしくは請求項７に記載の変異体、および請求項８に記載の融合タンパク質のうちの１つまたは複数の単離タンパク質と、医薬として許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
ワクチンである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に単離タンパク質、請求項６もしくは請求項７に記載の変異体、または請求項８に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項１２】
（ｉ）配列番号２２の残基１〜１５０、
（ｉｉ）配列番号２２の残基３２５〜３６１、
（ｉｉｉ）配列番号２２の残基４０３〜５９５、
（ｉｖ）配列番号２２の残基６６１〜７１７、および
（ｖ）配列番号２２の残基７４５〜１８１５
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１１に記載の単離核酸。
【請求項１３】
配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１２に記載の単離核酸。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の単離核酸を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
細菌である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１４に記載の発現ベクターと、医薬として許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離タンパク質の交差反応性エピトープと結合するモノクローナル抗体または抗原結合モノクローナル抗体のフラグメント。
【請求項２０】
組換えタンパク質を製造する方法であって、
（ｉ）請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞を、宿主細胞中で組換えタンパク質が発現されるよう培養する工程、および
（ｉｉ）前記組換えタンパク質を単離する工程
からなる方法。
【請求項２１】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染の予防又は治療のための処理に使用される請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
【請求項２２】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染の予防又は治療のための処理に使用される請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染の予防又は治療のための処理に使用される請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染がヒトにおける感染である請求項２１に記載の単離タンパク質。
【請求項２５】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染がヒトにおける感染である請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染がヒトにおける感染である請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を含むことが疑われる生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌を検出する方法であって、
（ｉ）請求項１９に記載のモノクローナル抗体または抗原結合モノクローナル抗体のフラグメントを、哺乳動物から得られた生物学的サンプルと組み合わせる工程、および
（ｉｉ）髄膜炎菌の存在を示す特異的に結合した抗体または抗体フラグメントを検出する工程、
からなる方法。
【請求項２８】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を含むことが疑われる生物学的サンプルにおいて髄膜炎菌を検出する方法であって、
（ｉ）患者から得た生物学的サンプルを、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離タンパク質または請求項８に記載の融合タンパク質と接触させる工程、および
（ｉｉ）前記単離タンパク質または前記融合タンパク質と、前記生物学的サンプル中の髄膜炎菌特異的抗体との間の複合体の存在または不在を決定する工程であって、該複合体の存在は感染を存在を示す工程、
から成る方法。
【請求項２９】
生物学的サンプル中の髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を検出する方法であって、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の単離核酸を用いて前記生物学的サンプル中の髄膜炎菌を検出する工程を含む方法。
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１２−５１９０２（Ｐ２０１２−５１９０２Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１８２９６（Ｐ２０１１−２１８２９６）
【出願日】平成２３年９月３０日（２０１１．９．３０）
【分割の表示】特願２００１−５６１０３４（Ｐ２００１−５６１０３４）の分割
【原出願日】平成１３年１月２５日（２００１．１．２５）
【出願人】（５００４４６９３７）ザ ユニバーシティ オブ クイーンズランド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＱＵＥＥＮＳＬＡＮＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月３０日（２０１１．９．３０）
【分割の表示】特願２００１−５６１０３４（Ｐ２００１−５６１０３４）の分割
【原出願日】平成１３年１月２５日（２００１．１．２５）
【出願人】（５００４４６９３７）ザ ユニバーシティ オブ クイーンズランド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＱＵＥＥＮＳＬＡＮＤ
【Ｆターム（参考）】
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