高コハク酸生産細菌
本発明は、好気性条件下および嫌気性条件下でコハク酸を生産する高い能力を有する、ハイブリッドのコハク酸生産系に関する。好気性条件下および嫌気性条件下の両方において機能し得るハイブリッドの細菌のコハク酸生産系の代謝工学は、生産プロセスをより効率的にし、かつプロセスの制御および最適化をより容易にする。この細菌は、好気性条件下および嫌気性条件下の両方において、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸またはグリオキシル酸の生産を連続的に増大する、不活化タンパク質を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の分野）
本発明は、大腸菌内で設計され、好気性条件下および嫌気性条件下の両方において高レベルのコハク酸を生産するように操作されたハイブリッドのコハク酸生産系に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
有用な特製薬品のコハク酸およびその誘導体は、広範な産業上の用途を有する。コハク酸は、食物、医薬、プラスティック、化粧品および織物のための原料として使用され、そして、めっきおよび排ガス消毒において使用される（非特許文献１）。コハク酸は、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）、テトラヒドロフランおよびγ−ブチロラクトンのようなプラスティックの前駆体のための供給原料として役立ち得る。さらに、コハク酸およびＢＤＯは、ポリエステルのためのモノマーとして使用され得る。コハク酸のコストを下げることができれば、コハク酸は、他の大半の薬品を生産するための中間の供給原料としてより有用になる（非特許文献２）。コハク酸とともに、他の４炭素のジカルボン酸（例えば、リンゴ酸およびフマル酸）もまた、供給原料の可能性を有する。
【０００３】
グルコース、キシロース、ソルビトールおよび他の「生態系を保護する（ｇｒｅｅｎ）」再生可能な供給原料（この場合において、発酵プロセスを介して）からのコハク酸、リンゴ酸およびフマル酸の生産は、これらの酸を再生不能な供給源から誘導する、よりエネルギー集約的な方法に取って代わる手段である。コハク酸は、プロピオン酸生産細菌の嫌気性発酵の間に生成される中間体であるが、これらのプロセスは、低収量と低濃度とをもたらす。酸の混合物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発酵から生成されることが長い間公知であった。しかしながら、発酵されるグルコース１モルあたりに対して、１．２モルのギ酸、０．１モル〜０．２モルの乳酸および０．３モル〜０．４モルのコハク酸しか生成されない。その結果、カルボン酸を発酵的に生成させる努力により、所望の産物に変換されない、比較的大量の増殖物質（例えば、グルコース）をもたらした。
【０００４】
慣習的に、コハク酸は嫌気性条件下で大腸菌により生成される。コハク酸の収量および生産性を増大させるために、大腸菌の嫌気性での中心的な代謝経路を代謝的に操作する、多くの試みがなされた（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。生産条件の最適化と組み合わせた遺伝工学はまた、コハク酸生産を増大させることが示されてきた。一例は、二段階発酵生産方式を使用する、コハク酸生産変異体の大腸菌株の増殖であり、この方式は、最初の好気性の増殖段階、それに続く嫌気性の生産段階または／および二酸化炭素、水素もしくは両方のガスの混合物を使用する嫌気性発酵のヘッドスペース（ｈｅａｄｓｐａｃｅ）条件の変更を含む（Ｎｇｈｉｅｍら（１９９９）の特許文献１、非特許文献１３）。このプロセスは、好気性段階の間のコハク酸生産の欠如およびコハク酸生産のための嫌気性増殖段階の厳密な要件により制限される。
【０００５】
詳細には、特定の経路の増幅、追加または低減を介して酵素レベルを操作することは、所望の産物の高い収量をもたらし得る。大腸菌の混合酸の発酵経路を利用する、嫌気性条件下でのコハク酸生産のための種々の遺伝的改良が記載されている。一例は、大腸菌からのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）の過剰発現である（非特許文献１４）。別の例において、フマル酸からコハク酸への変換は、大腸菌においてネイティブのフマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）を過剰発現させることによって改善された（非特許文献１５、非特許文献１６）。特定の酵素は大腸菌に固有ではないが、コハク酸生産を増大させるのに役立ち得る可能性がある。Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ由来のピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）を大腸菌へ導入することにより、コハク酸生産が増大された（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献１７）。他の代謝工学（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ストラテジーとしては、コハク酸の競合経路を不活化することが挙げられる。リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、不活性化されたピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）遺伝子および乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）遺伝子を有する宿主で過剰発現させた場合、コハク酸が主要な発酵産物となった（非特許文献１１、非特許文献８）。同一の変異体株（ｐｆｌ−およびｌｄｈ−）における不活性なグルコースホスホトランスフェラーゼ系（ｐｔｓＧ）はまた、大腸菌におけるより高いコハク酸生産を得ること、および増殖を改善することが示された（非特許文献４）。
【０００６】
代謝工学は、代謝経路のスループットを操作することにより、プロセス生産性を相当に改善する可能性を有する。特に、特定の経路の増幅、追加または欠失により酵素レベルを操作することは、所望の産物の高い収量をもたらし得る。ハイブリッドのコハク酸生産系は、好気性条件下および嫌気性条件下の両方において、コハク酸生産を可能にする。環境の酸素状態からコハク酸生産を脱共役させることは、大量のコハク酸が生産され得る可能性を有する。
【０００７】
関与する工程は、細菌種の好気性および嫌気性の中心的経路の数学的モデリングから最初に生成された、２つの最適な経路の設計を明らかにする。両方の条件の最適な設計により決定されるように、タンパク質は不活化され得る。本質的にカルボン酸生産を改善するのに必要なタンパク質の追加はまた、活性化または過剰発現され得る。
【特許文献１】米国特許第５，８６９，３０１号明細書
【非特許文献１】Ｚｅｉｋｕｓら、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）５１：５４５−５２
【非特許文献２】ＶａｒａｄａｒａｊａｎおよびＭｉｌｌｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（１９９９）１５：８４５−５４
【非特許文献３】Ｂｕｎｃｈら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）１４３：１８７−１９５
【非特許文献４】Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００１）６７：１４８−５４
【非特許文献５】Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９８）７０−７２：１８７−９８
【非特許文献６】Ｇｏｋａｒｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔ．（１９９８）２０：７９５−８
【非特許文献７】Ｇｏｋａｒｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）６６：１８４４−５０
【非特許文献８】ＨｏｎｇおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）５８：２８６−９０
【非特許文献９】Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２００４）２０：１５９９−６０４
【非特許文献１０】Ｍａｔ−Ｊａｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９８９）１７１：３４２−８
【非特許文献１１】ＳｔｏｌｓおよびＤｏｎｎｅｌｌｙ、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９７）６３：２６９５−７０１
【非特許文献１２】Ｖｅｍｕｒｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００２）６８：１７１５−２７
【非特許文献１３】Ｖｅｍｕｒｉら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）２８：３２５−３２
【非特許文献１４】Ｍｉｌｌａｒｄら、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６）６２：１８０８−１０
【非特許文献１５】Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８３）４５：１８３８−４７
【非特許文献１６】Ｗａｎｇら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）７０−７２：９１９−２８
【非特許文献１７】Ｇｏｋａｒｎら、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）５６：１８８−９５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
好気性条件下および嫌気性条件下の両方において機能するように設計された、ハイブリッドのカルボン酸生産系を備える細菌が記載される。この細菌は、好気性条件下および嫌気性条件下の両方において、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸またはグリオキシル酸の生産を連続的に増大する、不活化タンパク質を有する。不活化タンパク質は、ＡＣＥＢ、ＡＣＫＡ、ＡＤＨＥ、ＡＲＣＡ、ＦＵＭ、ＩＣＬＲ、ＭＤＨ、ＬＤＨＡ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡ、ＰＴＳＧおよびＳＤＨＡＢから選択され得る。本発明の一実施形態において、ＡＣＫＡ、ＡＤＨＥ、ＩＣＬＲ、ＬＤＨＡ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡ、ＰＴＳＧおよびＳＤＨＡＢが不活化される。本発明の別の実施形態において、ＡＣＥＢ、ＡＣＫＡ、ＡＤＨＥ、ＡＲＣＡ、ＦＵＭ、ＩＣＬＲ、ＭＤＨ、ＬＤＨＡ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡ、ＰＴＳＧおよびＳＤＨＡＢの種々の組み合わせが不活化され、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸およびグリオキシル酸から選択されるカルボン酸の生産が操作される。これらのタンパク質の不活化は、ＡＣＥＡ、ＡＣＥＢ、ＡＣＥＫ、ＡＣＳ、ＣＩＴＺ、ＦＲＤ、ＧＡＬＰ、ＰＥＰＣおよびＰＹＣの過剰発現と組合され得、コハク酸の収量をさらに増大させ得る。
【０００９】
本発明の一実施形態において、ａｃｋＡ遺伝子、ａｄｈＥ遺伝子、ａｒｃＡ遺伝子、ｆｕｍ遺伝子、ｉｃｌＲ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ｌｄｈＡ遺伝子、ｐｏｘＢ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｐｔｓＧ遺伝子およびｓｄｈＡＢ遺伝子が破壊されている破壊株が作製される。本発明の別の実施形態において、ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ａｒｃＡ、ｆｕｍ、ｉｃｌＲ、ｍｄｈ、ｌｄｈＡ、ｐｏｘＢ、ｐｔａ、ｐｔｓＧおよびｓｄｈＡＢの種々の組み合わせが破壊される。以下を含む遺伝子型の変異体株が記載される：
【００１０】
【化１】
以下の株：
【００１１】
【化２】
は、コハク酸生産株の非限定的な例を提供する。コハク酸の収量をさらに増大させるためにＡＣＥＡ、ＡＣＥＢ、ＡＣＥＫ、ＦＲＤ、ＰＥＰＣおよびＰＹＣが過剰発現される、これらの株はまた記載される。
【００１２】
さらに、変異体細菌株によりカルボン酸を生産する好気的な方法、嫌気的な方法および好気的／嫌気的な方法が記載され、この方法は、上記の変異体細菌株により培養物に播種する工程、好気性条件下でこの細菌株を培養する工程、嫌気性条件下でこの細菌株を培養する工程、およびこの培地からカルボン酸を単離する工程による。細菌株は、フラスコ、バイオリアクター、ケモスタットバイオリアクターまたはフェドバッチ（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ）バイオリアクター内で培養され得、カルボン酸を取得し得る。一例において、好気性条件下で細胞を培養し、迅速に高レベルのバイオマスを達成し、その後、コハク酸の収量を増大させるために嫌気性条件下でのコハク酸の生産を続けることによって、カルボン酸の収量はさらに増大される。
【００１３】
１モルの基質あたり、少なくとも２モルのカルボン酸が生産され、好ましくは１モルの基質あたり、少なくとも３モルのカルボン酸が生産される、細菌株および培養方法が記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（本発明の実施形態の説明）
本明細書に記載されるカルボン酸は、構造、ｐＨおよび存在するイオンに依存して、塩、酸、塩基または誘導体であり得る。例えば、用語「コハク酸塩（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）」および「コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）」は、本明細書において交換可能に使用される。コハク酸はまた、ブタン二酸（Ｃ４Ｈ６Ｏ４）とも呼ばれる。本明細書で使用される化学薬品としては、ギ酸、グリオキシル酸、乳酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）およびピルビン酸が挙げられる。細菌の代謝経路（クレブス回路（クエン酸回路、トリカルボン酸回路またはＴＣＡ回路とも呼ばれる）が挙げられる）は、ＬｅｈｎｉｎｇｅｒのＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙおよび他の生化学の教科書に見出され得る。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に結合した」または「作動可能に連結した」は、機能的に結合した核酸配列をいう。
【００１６】
「低下した活性」または「不活化」とは、適切なコントロール種と比べて、タンパク質の活性の少なくとも７５％の低下であるように本明細書で定義される。好ましくは、活性の少なくとも８０％の低下、少なくとも８５％の低下、少なくとも９０％の低下、少なくとも９５％の低下が達成され、そして、最も好ましい実施形態において、この活性は無くなる（１００％）。タンパク質は、インヒビター、突然変異または発現もしくは翻訳の抑圧などによって不活化され得る。
【００１７】
「過剰発現」または「過剰発現された」とは、適切なコントロール種と比べて、少なくとも１５０％のタンパク質の活性であるように本明細書において定義される。過剰発現は、より活性な形態または阻害に耐性である形態を産生するようにタンパク質を突然変異させること、インヒビターを除去すること、あるいは活性化因子を添加することなどによって達成され得る。過剰発現はまた、リプレッサーを除去すること、細胞に複数のコピーの遺伝子を追加すること、または内因性遺伝子をアップレギュレートすることなどによっても達成され得る。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「破壊」および「破壊株」は、遺伝子の活性が低減されるような様式で、ネイティブの遺伝子またはプロモーターが、突然変異、欠失、妨害またはダウンレギュレートされる細胞株をいう。遺伝子は、全体的なゲノムＤＮＡ配列のノックアウトまたは除去によって完全に（１００％）減少され得る。読み枠突然変異、早期の終止コドン、重要な残基の点突然変異または欠失もしくは挿入などを使用することによって、活性なタンパク質の転写および／または翻訳を完全に防止することにより、遺伝子産物を完全に（１００％）不活化することができる。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「組換えの」は、遺伝子操作された物質に関するか、遺伝子操作された物質に由来するか、または遺伝子操作された物質を含むことである。
【００２０】
遺伝子は以下のように短縮される：イソクエン酸リアーゼ（ａｃｅＡ（ｉｃｌとしても公知である））；リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢ）；グリオキシル酸バイパスオペロン（ｓｈｕｎｔ ｏｐｅｒｏｎ）（ａｃｅＢＡＫ）；イソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスホリラーゼ（ａｃｅＫ）；アセテートキナーゼ−ホスホトランスアセチラーゼ（ａｃｋＡ−ｐｔａ）；アコニテートヒドラターゼ１およびアコニテートヒドラターゼ２（ａｃｎＡおよびａｃｎＢ）；アセチルＣｏＡシンテターゼ（ａｃｓ）；アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）；好気呼吸調節制御因子（ａｅｒｏｂｉｃ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）ＡおよびＢ（ａｒｃＡＢ）；過酸化物感受性（ａｒｇ−ｌａｃ）；アルコールアセチルトランスフェラーゼ１およびアルコールアセチルトランスフェラーゼ２（ａｔｆ１およびａｔｆ２）；推定カダベリン／リジンアンチポーター（ｃａｄＲ）；クエン酸シンターゼ（ｃｉｔＺ）；脂肪酸分解レギュロン（ｆａｄＲ）；フマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）；フルクトースレギュロン（ｆｒｕＲ）；フマラーゼＡ、フマラーゼＢまたはフマラーゼＣ（ｆｕｍＡＢＣ）；ガラクトースパーミアーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ）（ｇａｌＰ）；イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ）；イソクエン酸リアーゼ（ｉｃｌ）；ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ｉｃｌＲ）；乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）；リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）；ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）；ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）；ホスホトランスフェラーゼ系遺伝子ＦおよびＧ（ｐｔｓＦおよびｐｔｓＧ）；ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）；グアノシン３’，５’−ビスピロリン酸シンテターゼＩ（ｒｅｌＡ１）；リボソームタンパク質Ｓ１２（ｒｐｓＬ）；ならびにコハク酸デヒドロゲナーゼ（ｓｄｈ）。Δｌａｃ（ａｒｇ−ｌａｃ）２０５（Ｕｌ６９）は、細胞をＨ２Ｏ２に感作させる遺伝子を保持するａｒｇ−ｌａｃ領域の染色体の欠失である（５１）。ＰＹＣは様々な種に由来し得、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｐｙｃは、一例として表現される（ＡＦ０６８７５９）。
【００２１】
略語：アンピシリン（Ａｐ）；オキサシリン（Ｏｘ）；カルベニシリン（Ｃｎ）；クロラムフェニコール（Ｃｍ）；カナマイシン（Ｋｍ）；ストレプトマイシン（Ｓｍ）；テトラサイクリン（Ｔｃ）；ナリジクス酸（Ｎａｌ）；エリスロマイシン（Ｅｍ）；アンピシリン耐性（ＡｐＲ）；チアンフェニコール／クロラムフェニコール耐性（ＴｈｉＲ／ＣｍＲ）；マクロライド、リンコサミド（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ）およびストレプトグラミン（ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ）Ａ耐性（ＭＬＳＲ）；ストレプトマイシン耐性（ＳｍＲ）；カナマイシン耐性（ＫｍＲ）；グラム陰性の複製起点（ＣｏｌＥ１）；ならびにグラム陽性の複製起点（ＯｒｉＩＩ）。一般的な制限酵素および制限部位は、ＮＥＢ（登録商標）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｌＯＬＡＢＳ（登録商標），ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）およびＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）において見出され得る。ＡＴＣＣ（登録商標）：ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＴＹＰＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮＴＭ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）。
【００２２】
本発明の特定の実施形態において使用されるプラスミドおよび株は、表１および表２に示される。ＭＧ１６５５は、Ｆ接合に欠陥を有し、Ｇｕｙｅｒら（１８）に報告されるようにＦ−λ−自然発生変異体である。経路の欠失を、Ｐ１ファージ導入およびλ赤色（ｒｅｄ）リコンビナーゼに基づく１工程の不活化を使用して実行した（１０）。プラスミドおよび変異体大腸菌株の構築を、本明細書に引用され、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（３８）およびＡｕｓｅｂｅｌ（５）に記載される標準的な生化学技術を使用して実行した。
【００２３】
【表１】
各実験のために、適切な場合、株をプラスミドにより新規に形質転換する。単一のコロニーを適切な抗生物質を含むプレート上に再ストリークする。単一のコロニーを、適切な抗生物質を含有する５０ｍｌのＬＢ培地を含む２５０ｍｌ振とうフラスコに移し、１２時間、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で好気的に増殖させる。細胞をＬＢ培地で二回洗い、１％ｖ／ｖで、適切な抗生物質濃度を含有する４００ｍｌのＬＢ培地をそれぞれ含む２Ｌ振とうフラスコに播種し、１２時間、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で好気的に増殖させる。適切な細胞バイオマス（約１．４ｇＣＤＷ）を遠心分離で集め、上清を捨てる。６０ｍｌの好気性ＬＢ培地または６０ｍｌの嫌気性ＬＢ培地（２０ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３を補充したＬＢブロス培地）により細胞を再懸濁し、直ちに約１０ ＯＤ６００の濃度でリアクターに播種する。ＮａＨＣＯ３を培地に添加した。なぜなら、ＮａＨＣＯ３のｐＨ緩衝能力およびＣＯ２を供給する能力により、細胞増殖およびカルボン酸生産を促進したからである。適切な抗生物質を、株に依存して添加する。
【実施例】
【００２４】
（実施例１：乳酸、酢酸およびエタノールの阻害）
好気性条件下および嫌気性条件下の両方においてカルボン酸を生産する、ハイブリッドの細菌株は、バイオマス生成が低い、嫌気性プロセスの制限を克服し得る。バイオマスは、発酵プロセスの開始において、好気性条件下で生成され得る。この段階の間、カルボン酸は、好気的な代謝合成経路により大量に生成され、時間とコストとを節約する。一旦、高いバイオマスが得られると、高い収量で炭素源をカルボン酸へさらに変換するために、嫌気性条件を変換するように環境が切り替えられ得るか、または環境が嫌気性条件を変換することを可能にし得る。再設計された嫌気性コハク酸発酵経路を使用することにより、カルボン酸の収量が、グルコース１モルあたり、２モルまたは３モルよりはるかに多い産物まで増大することが想定される。
【００２５】
まず、カルボン酸生産のため、ＴＣＡ回路への流入を増大させるために、好気性代謝における２つの酢酸経路（ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＸＢ）およびアセテートキナーゼ−ホスホトランスアセチラーゼ（ＡＣＫＡ−ＰＴＡ））を不活化する（図１）。一旦、これらの２つの経路が不活化されると、酢酸生産がかなり低下し、より多くの炭素の流入がＴＣＡ回路を駆動させる。
【００２６】
さらに、乳酸を介しての炭素の流入を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を不活化することにより低下させる。ハイブリッドのコハク酸生産系の嫌気的な設計部分は、大腸菌の混合酸発酵経路における複数の経路の不活化からなる。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨＡ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＥ）は、ＮＡＤＨおよび炭素原子の両方を保存するために不活化される（図１）。ＮＡＤＨは、発酵性のカルボン酸合成経路に必要とされる。炭素の保存は、発酵性のカルボン酸合成経路への炭素の流入を増大させる。
【００２７】
次に、グルコースホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳＧ）もまた、コハク酸合成のためのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）プールを増大させるために不活化される（図１）。ＰＥＰはＯＡＡへの前駆体であり、ＯＡＡはコハク酸合成のための主要な前駆体である。ＰＴＳＧを不活化することはまた、好気性代謝の炭素のスループットを増大させる。これら全ての遺伝的改変により、ここで、ハイブリッドの生産系の好気的な設計は、カルボン酸生産のための２つの経路を含む；そのうちの一方はＴＣＡ回路の酸化的な分岐（ｂｒａｎｃｈ）であり、他方はグリオキシル酸回路である。
【００２８】
この時点において、カルボン酸は、ＴＣＡ回路の酸化的な分岐から生成される。ＴＣＡ回路のタンパク質のいずれか一つの不活化は、分岐されたカルボン酸合成経路を生成する。炭素は、ＯＡＡ−リンゴ酸経路とクエン酸−グリオキシル酸経路またはクエン酸イソクエン酸経路との両方を通って流れる。図２においてコハク酸について実証されるように、分岐されたカルボン酸経路は、好気性代謝および嫌気性代謝の両方を介して、カルボン酸産物の連続的な生産を可能にする。
【００２９】
（実施例２：グリオキシル酸バイパス（ｓｈｕｎｔ）の流入の増大）
以前に示されているように、ネイティブのＡＣＥＡおよびＡＣＥＢの存在は、さらなる発現を必要とせずにカルボン酸生産を駆動するのに十分である。しかしながら、ネイティブの発現レベルは、フィードバック阻害に影響されやすく、かつ環境の好気性条件または嫌気性条件に感受性である。グリオキシル酸バイパスの構成的な活性化は、カルボン酸合成のための高レベルの好気性代謝を維持するのに必須である。この活性化は、ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ＩＣＬＲ）を不活化することにより可能になる。図１に見られるように、グリオキシル酸バイパスの活性化は、高レベルのカルボン酸生産を達成する両方の混合的な発酵環境のを提供する。
【００３０】
（実施例３：コハク酸生産）
コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨＡＢ）の不活化は、好気性条件下でのコハク酸の蓄積を可能にする（図１）。コハク酸は、通常、好気性条件下で蓄積しない。なぜなら、コハク酸は、電子伝達系に電子を供給するため、およびにオキサロ酢酸（ＯＡＡ）を充填するためにＴＣＡ回路で酸化されるからである。図２に示される、分岐された代謝経路は、コハク酸を生成する炭素の流入のための、好気性、嫌気性かつ構成的な経路を提供する。二重の合成経路の存在は、純粋な好気性培養条件または純粋な嫌気性培養条件に対する必要性を軽減させ、より厳密性の低い基準のもとでの産業的な培養条件を可能にする。
【００３１】
（実施例４：カルボン酸生産）
コハク酸生産は、カルボン酸生産のためのプロトタイプの代謝経路として記載される。他のカルボン酸は、ＴＣＡの変換酵素のうちのいずれかを不活化することによる、この系を使用して生産され得る。特に、フマラーゼ（ＦＵＭ）の不活化は、分岐されたフマル酸生産株を生成する。同様に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）の不活化は、分岐されたリンゴ酸生産株を生成する。グリオキシル酸は、リンゴ酸シンターゼ（ＡＣＥＢ）を不活化し、かつイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＣＥＫ）活性を増大させることにより生産され得る。
【００３２】
細菌の生産系を使用する、種々の大量の特製薬品（フマル酸、リンゴ酸、ＯＡＡおよびグリオキシル酸が挙げられる）の生産は、これらの物質のための再生可能かつ低コストの供給源を提供する。好気性条件下および嫌気性条件下の両方においてカルボン酸を生産する細菌株を使用して、培養条件の制限を弱め、それにより大量の薬品生産のコストを軽減する。
【００３３】
（実施例５：収量の増大）
ハイブリッドのコハク酸生産系のための好気性ネットワーク設計および嫌気性ネットワーク設計の両方としては、大腸菌の遺伝子破壊（ΔｓｄｈＡＢ、ΔａｃｋＡ−ｐｔａ、ΔｐｏｘＢ、ΔｉｃｌＲ、ΔｐｔｓＧ、ΔｌｄｈＡおよびΔａｄｈＥ）の種々の組み合わせが挙げられる。さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）およびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）は、単一のプラスミド上の系において同時発現され得る（図１）。ＰＹＣ活性およびＰＥＰＣ活性を増大させることは、顕著にコハク酸合成のためのＯＡＡプールを増大させる。ＰＹＣはピルビン酸を直接ＯＡＡに変換し、ＰＥＰＣはＰＥＰを直接ＯＡＡに変換する。最終的に、ハイブリッドのコハク酸生産は、これらの経路への炭素の流入を駆動するＰＹＣおよびＰＥＰＣの過剰発現とともにコハク酸合成のための３つの経路を含む（図２）。第一の経路は、ＴＣＡ回路の酸化的分岐であり、これは好気的に機能する。第二の経路は、還元的な発酵性のコハク酸合成経路であり、これは嫌気性的に機能する。第三の経路は、グリオキシル酸回路であり、これは、一旦活性化されると、好気的および嫌気性的に機能する。
【００３４】
ハイブリッドのコハク酸生産系へのさらなる改善としては、ピルビン酸をコハク酸合成経路へ導く、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの過剰発現が挙げられる。このことは、あらゆるピルビン酸蓄積を低下させることにより、生産速度を改善し得る。グリオキシル酸回路内の経路はまた、循環効率を改善するために過剰発現され得る（すなわち、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸リアーゼ、リンゴ酸シンターゼ）。グルコース輸送系の操作はまた、コハク酸合成経路への炭素のスループットを改善し得る。一例は、ガラクトースパーミアーゼ（ＧＡＬＰ）である。これは、酢酸生産を低下させる一方で、グルコース取り込みを改善するために潜在的に使用され得る。外的に添加された酢酸の存在下でのアセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）の過剰発現はまた、コハク酸の収量をさらに増大させる潜在的なストラテジーである。理論的に、ＡＣＳは、酢酸を消費してアセチルＣｏＡのプールを増大し得るが、その一方で、ＯＡＡのプールが単純にグルコースから生成され得る。グリオキシル酸回路のＯＡＡ基質要求量とアセチルＣｏＡ基質要求量とを脱共役させることにより、コハク酸についての達成可能な最大限の理論上の収量を生じ得る。ＯＡＡプールを吸い出し得る他の経路を除去することによっても、このプロセスを亢進させ得る。
【００３５】
（実施例６：バッチ発酵）
上記の戦略的な遺伝子操作の全ての結果として、大腸菌の変異体株は、ハイブリッドのコハク酸生産系（図２）として作製される。この変異体株は、いかなる大気の酸素の圧力であっても高レベルのコハク酸を生産し得る。特定のコハク酸合成経路は、常に、環境の酸素状態に依存せずに活発にコハク酸を生産する。この要因は、非常に重要である。なぜなら、これは、高く通気された培養を維持するのに伴う問題を回避し、好気性増殖から嫌気性増殖へ転移する間、細胞が効率的にコハク酸を生産することを可能にするからである。このことは、操作のより高い柔軟性および培養プロトコールのより高い柔軟性を確実にする。発酵器の操作制御パラメータは、大いに広がる。
【００３６】
以前は、好気性バッチ発酵は、バイオマスを増大させることが必要とされた。好気性バッチ発酵は、１．０Ｌ ＮＥＷ ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＢＩＯＦＬＯ １１０ＴＭ発酵器内の６００ｍｌの培地体積により実行されていた。温度は３７℃で維持され、攪拌速度は８００ｒｐｍで一定であった。使用された入り口の気流は１．５Ｌ／ｍｉｎであった。溶存酸素を、ポーラグラフィ酸素電極（ＮＥＷ ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣＴＭ）を使用してモニタリングし、実験を通して８０％より高い飽和状態に維持した。通気を維持し、溶存酸素濃度をモニタリングするために注意が必要とされた。これらの厳密な好気性増殖条件は、大量のモル濃度のカルボン酸収量を代償にしてバイオマスを増大させることを可能にする。ハイブリッドのカルボン酸生産系は、酸素のストリンジェンシーを低下させ、バイオマスの増大と大量の産物の収量との利益を提供する。
【００３７】
（実施例７：ケモスタット発酵）
ケモスタット実験を、０．１ｈｒ−１の希釈率、好気性条件下で実行する。この希釈率は、細菌株の特異的な増殖速度（これは、事前のバッチ培養研究の対数増殖期のデータから得られる）に基づいてカスタマイズされなければならない。６００ｍｌのバッチ培養は、先に記載される培養条件を使用し、そして１．５Ｎ ＨＮＯ３および２Ｎ Ｎａ２ＣＯ３を使用して７．０に制御され得る、ガラス電極を使用してｐＨをモニタリングして、ケモスタット（ｃｈｅｍｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ）により維持され得る。播種後、培養を、１２時間〜１４時間、バッチ様式で増殖させ、その後、ケモスタットを開始するために供給ポンプおよび排出ポンプを起動させる。連続的な培養は、５滞留時間（ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ）後に安定状態に達した。最適な密度および代謝産物を、５および６滞留時間でのサンプルから測定し、次に、安定状態が確立され得ることを確かめるために比較する。
【００３８】
ハイブリッドの生産系により、増殖条件は、酸素負荷の厳密な境界を含まないカルボン酸生産のために最適化され得る。培養条件のわずかな変化は代謝生産を制限せず、それゆえ、酸素負荷は、コストを減らし、生産性を増大させる最適化プロセスの間、重要度は低くなる。
【００３９】
（実施例８：フェドバッチ発酵）
同様に、好気性条件下で実施されるフェドバッチは酸素負荷要求量により同様に制限された。最初の培地体積は、記載されるように１．０−Ｌ発酵器内の４００ｍｌである。グルコースは、バッチ実験結果から得られる、研究される株の特異的な増殖速度にしたがって指数関数的に供給される。グルコース供給のために使用されるプログラムは、ＮＥＷ ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣＴＭのＢＩＯＣＯＭＭＡＮＤ ＰＬＵＳＴＭ ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅである。播種後、バイオリアクター内の培養を、１４時間までバッチ様式で増殖させ、その後、フェドバッチを開始するためにグルコースポンプを起動させる。
【００４０】
ハイブリッドのカルボン酸生産系は、好気性条件下および嫌気性条件下で大量のカルボン酸を生産する高い能力を有する。このコハク酸生産系は、基本的に両方の条件下で機能し得、生産プロセスをより効率的に、かつプロセスの制御および最適化をより容易にし得る。したがって、最も効率的な培養増殖および大量のバイオマス／生体触媒の生産の２つの工程は、好気性条件下でなされ得、この条件において、コハク酸が最も効率的に蓄積され、そして高い細胞密度において酸素が制限されるようになる場合、より多くのモル濃度の効率的な嫌気性変換プロセスが優勢になる。この切り替えの間、培養を分離する必要も、培養を操作的に変更する必要も無いので、大規模リアクターに容易に適合可能である。カルボン酸生産は、グルコース１モルあたり、１モルよりはるかに多いレベルのカルボン酸まで増大され得、いくつかのモデルは、グルコース１モルあたり、２モル、３モル以上の高い収量の産物を予測する。
【００４１】
本明細書に引用される全ての参考文献は、明らかに参考として援用される。参考文献を、便利のために再度、本明細書において列挙する。
【００４２】
【化３】
【００４３】
【化４】
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ハイブリッドのコハク酸生産系の設計および構築。
【図２】大腸菌内のハイブリッドのコハク酸生産系。
【技術分野】
【０００１】
（本発明の分野）
本発明は、大腸菌内で設計され、好気性条件下および嫌気性条件下の両方において高レベルのコハク酸を生産するように操作されたハイブリッドのコハク酸生産系に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
有用な特製薬品のコハク酸およびその誘導体は、広範な産業上の用途を有する。コハク酸は、食物、医薬、プラスティック、化粧品および織物のための原料として使用され、そして、めっきおよび排ガス消毒において使用される（非特許文献１）。コハク酸は、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）、テトラヒドロフランおよびγ−ブチロラクトンのようなプラスティックの前駆体のための供給原料として役立ち得る。さらに、コハク酸およびＢＤＯは、ポリエステルのためのモノマーとして使用され得る。コハク酸のコストを下げることができれば、コハク酸は、他の大半の薬品を生産するための中間の供給原料としてより有用になる（非特許文献２）。コハク酸とともに、他の４炭素のジカルボン酸（例えば、リンゴ酸およびフマル酸）もまた、供給原料の可能性を有する。
【０００３】
グルコース、キシロース、ソルビトールおよび他の「生態系を保護する（ｇｒｅｅｎ）」再生可能な供給原料（この場合において、発酵プロセスを介して）からのコハク酸、リンゴ酸およびフマル酸の生産は、これらの酸を再生不能な供給源から誘導する、よりエネルギー集約的な方法に取って代わる手段である。コハク酸は、プロピオン酸生産細菌の嫌気性発酵の間に生成される中間体であるが、これらのプロセスは、低収量と低濃度とをもたらす。酸の混合物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発酵から生成されることが長い間公知であった。しかしながら、発酵されるグルコース１モルあたりに対して、１．２モルのギ酸、０．１モル〜０．２モルの乳酸および０．３モル〜０．４モルのコハク酸しか生成されない。その結果、カルボン酸を発酵的に生成させる努力により、所望の産物に変換されない、比較的大量の増殖物質（例えば、グルコース）をもたらした。
【０００４】
慣習的に、コハク酸は嫌気性条件下で大腸菌により生成される。コハク酸の収量および生産性を増大させるために、大腸菌の嫌気性での中心的な代謝経路を代謝的に操作する、多くの試みがなされた（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。生産条件の最適化と組み合わせた遺伝工学はまた、コハク酸生産を増大させることが示されてきた。一例は、二段階発酵生産方式を使用する、コハク酸生産変異体の大腸菌株の増殖であり、この方式は、最初の好気性の増殖段階、それに続く嫌気性の生産段階または／および二酸化炭素、水素もしくは両方のガスの混合物を使用する嫌気性発酵のヘッドスペース（ｈｅａｄｓｐａｃｅ）条件の変更を含む（Ｎｇｈｉｅｍら（１９９９）の特許文献１、非特許文献１３）。このプロセスは、好気性段階の間のコハク酸生産の欠如およびコハク酸生産のための嫌気性増殖段階の厳密な要件により制限される。
【０００５】
詳細には、特定の経路の増幅、追加または低減を介して酵素レベルを操作することは、所望の産物の高い収量をもたらし得る。大腸菌の混合酸の発酵経路を利用する、嫌気性条件下でのコハク酸生産のための種々の遺伝的改良が記載されている。一例は、大腸菌からのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）の過剰発現である（非特許文献１４）。別の例において、フマル酸からコハク酸への変換は、大腸菌においてネイティブのフマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）を過剰発現させることによって改善された（非特許文献１５、非特許文献１６）。特定の酵素は大腸菌に固有ではないが、コハク酸生産を増大させるのに役立ち得る可能性がある。Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ由来のピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）を大腸菌へ導入することにより、コハク酸生産が増大された（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献１７）。他の代謝工学（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ストラテジーとしては、コハク酸の競合経路を不活化することが挙げられる。リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、不活性化されたピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）遺伝子および乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）遺伝子を有する宿主で過剰発現させた場合、コハク酸が主要な発酵産物となった（非特許文献１１、非特許文献８）。同一の変異体株（ｐｆｌ−およびｌｄｈ−）における不活性なグルコースホスホトランスフェラーゼ系（ｐｔｓＧ）はまた、大腸菌におけるより高いコハク酸生産を得ること、および増殖を改善することが示された（非特許文献４）。
【０００６】
代謝工学は、代謝経路のスループットを操作することにより、プロセス生産性を相当に改善する可能性を有する。特に、特定の経路の増幅、追加または欠失により酵素レベルを操作することは、所望の産物の高い収量をもたらし得る。ハイブリッドのコハク酸生産系は、好気性条件下および嫌気性条件下の両方において、コハク酸生産を可能にする。環境の酸素状態からコハク酸生産を脱共役させることは、大量のコハク酸が生産され得る可能性を有する。
【０００７】
関与する工程は、細菌種の好気性および嫌気性の中心的経路の数学的モデリングから最初に生成された、２つの最適な経路の設計を明らかにする。両方の条件の最適な設計により決定されるように、タンパク質は不活化され得る。本質的にカルボン酸生産を改善するのに必要なタンパク質の追加はまた、活性化または過剰発現され得る。
【特許文献１】米国特許第５，８６９，３０１号明細書
【非特許文献１】Ｚｅｉｋｕｓら、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）５１：５４５−５２
【非特許文献２】ＶａｒａｄａｒａｊａｎおよびＭｉｌｌｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（１９９９）１５：８４５−５４
【非特許文献３】Ｂｕｎｃｈら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）１４３：１８７−１９５
【非特許文献４】Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００１）６７：１４８−５４
【非特許文献５】Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９８）７０−７２：１８７−９８
【非特許文献６】Ｇｏｋａｒｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔ．（１９９８）２０：７９５−８
【非特許文献７】Ｇｏｋａｒｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）６６：１８４４−５０
【非特許文献８】ＨｏｎｇおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）５８：２８６−９０
【非特許文献９】Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２００４）２０：１５９９−６０４
【非特許文献１０】Ｍａｔ−Ｊａｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９８９）１７１：３４２−８
【非特許文献１１】ＳｔｏｌｓおよびＤｏｎｎｅｌｌｙ、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９７）６３：２６９５−７０１
【非特許文献１２】Ｖｅｍｕｒｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００２）６８：１７１５−２７
【非特許文献１３】Ｖｅｍｕｒｉら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）２８：３２５−３２
【非特許文献１４】Ｍｉｌｌａｒｄら、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６）６２：１８０８−１０
【非特許文献１５】Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８３）４５：１８３８−４７
【非特許文献１６】Ｗａｎｇら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）７０−７２：９１９−２８
【非特許文献１７】Ｇｏｋａｒｎら、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）５６：１８８−９５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
好気性条件下および嫌気性条件下の両方において機能するように設計された、ハイブリッドのカルボン酸生産系を備える細菌が記載される。この細菌は、好気性条件下および嫌気性条件下の両方において、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸またはグリオキシル酸の生産を連続的に増大する、不活化タンパク質を有する。不活化タンパク質は、ＡＣＥＢ、ＡＣＫＡ、ＡＤＨＥ、ＡＲＣＡ、ＦＵＭ、ＩＣＬＲ、ＭＤＨ、ＬＤＨＡ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡ、ＰＴＳＧおよびＳＤＨＡＢから選択され得る。本発明の一実施形態において、ＡＣＫＡ、ＡＤＨＥ、ＩＣＬＲ、ＬＤＨＡ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡ、ＰＴＳＧおよびＳＤＨＡＢが不活化される。本発明の別の実施形態において、ＡＣＥＢ、ＡＣＫＡ、ＡＤＨＥ、ＡＲＣＡ、ＦＵＭ、ＩＣＬＲ、ＭＤＨ、ＬＤＨＡ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡ、ＰＴＳＧおよびＳＤＨＡＢの種々の組み合わせが不活化され、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸およびグリオキシル酸から選択されるカルボン酸の生産が操作される。これらのタンパク質の不活化は、ＡＣＥＡ、ＡＣＥＢ、ＡＣＥＫ、ＡＣＳ、ＣＩＴＺ、ＦＲＤ、ＧＡＬＰ、ＰＥＰＣおよびＰＹＣの過剰発現と組合され得、コハク酸の収量をさらに増大させ得る。
【０００９】
本発明の一実施形態において、ａｃｋＡ遺伝子、ａｄｈＥ遺伝子、ａｒｃＡ遺伝子、ｆｕｍ遺伝子、ｉｃｌＲ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ｌｄｈＡ遺伝子、ｐｏｘＢ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｐｔｓＧ遺伝子およびｓｄｈＡＢ遺伝子が破壊されている破壊株が作製される。本発明の別の実施形態において、ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ａｒｃＡ、ｆｕｍ、ｉｃｌＲ、ｍｄｈ、ｌｄｈＡ、ｐｏｘＢ、ｐｔａ、ｐｔｓＧおよびｓｄｈＡＢの種々の組み合わせが破壊される。以下を含む遺伝子型の変異体株が記載される：
【００１０】
【化１】
以下の株：
【００１１】
【化２】
は、コハク酸生産株の非限定的な例を提供する。コハク酸の収量をさらに増大させるためにＡＣＥＡ、ＡＣＥＢ、ＡＣＥＫ、ＦＲＤ、ＰＥＰＣおよびＰＹＣが過剰発現される、これらの株はまた記載される。
【００１２】
さらに、変異体細菌株によりカルボン酸を生産する好気的な方法、嫌気的な方法および好気的／嫌気的な方法が記載され、この方法は、上記の変異体細菌株により培養物に播種する工程、好気性条件下でこの細菌株を培養する工程、嫌気性条件下でこの細菌株を培養する工程、およびこの培地からカルボン酸を単離する工程による。細菌株は、フラスコ、バイオリアクター、ケモスタットバイオリアクターまたはフェドバッチ（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ）バイオリアクター内で培養され得、カルボン酸を取得し得る。一例において、好気性条件下で細胞を培養し、迅速に高レベルのバイオマスを達成し、その後、コハク酸の収量を増大させるために嫌気性条件下でのコハク酸の生産を続けることによって、カルボン酸の収量はさらに増大される。
【００１３】
１モルの基質あたり、少なくとも２モルのカルボン酸が生産され、好ましくは１モルの基質あたり、少なくとも３モルのカルボン酸が生産される、細菌株および培養方法が記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（本発明の実施形態の説明）
本明細書に記載されるカルボン酸は、構造、ｐＨおよび存在するイオンに依存して、塩、酸、塩基または誘導体であり得る。例えば、用語「コハク酸塩（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）」および「コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）」は、本明細書において交換可能に使用される。コハク酸はまた、ブタン二酸（Ｃ４Ｈ６Ｏ４）とも呼ばれる。本明細書で使用される化学薬品としては、ギ酸、グリオキシル酸、乳酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）およびピルビン酸が挙げられる。細菌の代謝経路（クレブス回路（クエン酸回路、トリカルボン酸回路またはＴＣＡ回路とも呼ばれる）が挙げられる）は、ＬｅｈｎｉｎｇｅｒのＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙおよび他の生化学の教科書に見出され得る。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に結合した」または「作動可能に連結した」は、機能的に結合した核酸配列をいう。
【００１６】
「低下した活性」または「不活化」とは、適切なコントロール種と比べて、タンパク質の活性の少なくとも７５％の低下であるように本明細書で定義される。好ましくは、活性の少なくとも８０％の低下、少なくとも８５％の低下、少なくとも９０％の低下、少なくとも９５％の低下が達成され、そして、最も好ましい実施形態において、この活性は無くなる（１００％）。タンパク質は、インヒビター、突然変異または発現もしくは翻訳の抑圧などによって不活化され得る。
【００１７】
「過剰発現」または「過剰発現された」とは、適切なコントロール種と比べて、少なくとも１５０％のタンパク質の活性であるように本明細書において定義される。過剰発現は、より活性な形態または阻害に耐性である形態を産生するようにタンパク質を突然変異させること、インヒビターを除去すること、あるいは活性化因子を添加することなどによって達成され得る。過剰発現はまた、リプレッサーを除去すること、細胞に複数のコピーの遺伝子を追加すること、または内因性遺伝子をアップレギュレートすることなどによっても達成され得る。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「破壊」および「破壊株」は、遺伝子の活性が低減されるような様式で、ネイティブの遺伝子またはプロモーターが、突然変異、欠失、妨害またはダウンレギュレートされる細胞株をいう。遺伝子は、全体的なゲノムＤＮＡ配列のノックアウトまたは除去によって完全に（１００％）減少され得る。読み枠突然変異、早期の終止コドン、重要な残基の点突然変異または欠失もしくは挿入などを使用することによって、活性なタンパク質の転写および／または翻訳を完全に防止することにより、遺伝子産物を完全に（１００％）不活化することができる。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「組換えの」は、遺伝子操作された物質に関するか、遺伝子操作された物質に由来するか、または遺伝子操作された物質を含むことである。
【００２０】
遺伝子は以下のように短縮される：イソクエン酸リアーゼ（ａｃｅＡ（ｉｃｌとしても公知である））；リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢ）；グリオキシル酸バイパスオペロン（ｓｈｕｎｔ ｏｐｅｒｏｎ）（ａｃｅＢＡＫ）；イソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスホリラーゼ（ａｃｅＫ）；アセテートキナーゼ−ホスホトランスアセチラーゼ（ａｃｋＡ−ｐｔａ）；アコニテートヒドラターゼ１およびアコニテートヒドラターゼ２（ａｃｎＡおよびａｃｎＢ）；アセチルＣｏＡシンテターゼ（ａｃｓ）；アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）；好気呼吸調節制御因子（ａｅｒｏｂｉｃ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）ＡおよびＢ（ａｒｃＡＢ）；過酸化物感受性（ａｒｇ−ｌａｃ）；アルコールアセチルトランスフェラーゼ１およびアルコールアセチルトランスフェラーゼ２（ａｔｆ１およびａｔｆ２）；推定カダベリン／リジンアンチポーター（ｃａｄＲ）；クエン酸シンターゼ（ｃｉｔＺ）；脂肪酸分解レギュロン（ｆａｄＲ）；フマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）；フルクトースレギュロン（ｆｒｕＲ）；フマラーゼＡ、フマラーゼＢまたはフマラーゼＣ（ｆｕｍＡＢＣ）；ガラクトースパーミアーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ）（ｇａｌＰ）；イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ）；イソクエン酸リアーゼ（ｉｃｌ）；ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ｉｃｌＲ）；乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）；リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）；ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）；ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）；ホスホトランスフェラーゼ系遺伝子ＦおよびＧ（ｐｔｓＦおよびｐｔｓＧ）；ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）；グアノシン３’，５’−ビスピロリン酸シンテターゼＩ（ｒｅｌＡ１）；リボソームタンパク質Ｓ１２（ｒｐｓＬ）；ならびにコハク酸デヒドロゲナーゼ（ｓｄｈ）。Δｌａｃ（ａｒｇ−ｌａｃ）２０５（Ｕｌ６９）は、細胞をＨ２Ｏ２に感作させる遺伝子を保持するａｒｇ−ｌａｃ領域の染色体の欠失である（５１）。ＰＹＣは様々な種に由来し得、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｐｙｃは、一例として表現される（ＡＦ０６８７５９）。
【００２１】
略語：アンピシリン（Ａｐ）；オキサシリン（Ｏｘ）；カルベニシリン（Ｃｎ）；クロラムフェニコール（Ｃｍ）；カナマイシン（Ｋｍ）；ストレプトマイシン（Ｓｍ）；テトラサイクリン（Ｔｃ）；ナリジクス酸（Ｎａｌ）；エリスロマイシン（Ｅｍ）；アンピシリン耐性（ＡｐＲ）；チアンフェニコール／クロラムフェニコール耐性（ＴｈｉＲ／ＣｍＲ）；マクロライド、リンコサミド（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ）およびストレプトグラミン（ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ）Ａ耐性（ＭＬＳＲ）；ストレプトマイシン耐性（ＳｍＲ）；カナマイシン耐性（ＫｍＲ）；グラム陰性の複製起点（ＣｏｌＥ１）；ならびにグラム陽性の複製起点（ＯｒｉＩＩ）。一般的な制限酵素および制限部位は、ＮＥＢ（登録商標）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｌＯＬＡＢＳ（登録商標），ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）およびＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）において見出され得る。ＡＴＣＣ（登録商標）：ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＴＹＰＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮＴＭ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）。
【００２２】
本発明の特定の実施形態において使用されるプラスミドおよび株は、表１および表２に示される。ＭＧ１６５５は、Ｆ接合に欠陥を有し、Ｇｕｙｅｒら（１８）に報告されるようにＦ−λ−自然発生変異体である。経路の欠失を、Ｐ１ファージ導入およびλ赤色（ｒｅｄ）リコンビナーゼに基づく１工程の不活化を使用して実行した（１０）。プラスミドおよび変異体大腸菌株の構築を、本明細書に引用され、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（３８）およびＡｕｓｅｂｅｌ（５）に記載される標準的な生化学技術を使用して実行した。
【００２３】
【表１】
各実験のために、適切な場合、株をプラスミドにより新規に形質転換する。単一のコロニーを適切な抗生物質を含むプレート上に再ストリークする。単一のコロニーを、適切な抗生物質を含有する５０ｍｌのＬＢ培地を含む２５０ｍｌ振とうフラスコに移し、１２時間、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で好気的に増殖させる。細胞をＬＢ培地で二回洗い、１％ｖ／ｖで、適切な抗生物質濃度を含有する４００ｍｌのＬＢ培地をそれぞれ含む２Ｌ振とうフラスコに播種し、１２時間、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で好気的に増殖させる。適切な細胞バイオマス（約１．４ｇＣＤＷ）を遠心分離で集め、上清を捨てる。６０ｍｌの好気性ＬＢ培地または６０ｍｌの嫌気性ＬＢ培地（２０ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３を補充したＬＢブロス培地）により細胞を再懸濁し、直ちに約１０ ＯＤ６００の濃度でリアクターに播種する。ＮａＨＣＯ３を培地に添加した。なぜなら、ＮａＨＣＯ３のｐＨ緩衝能力およびＣＯ２を供給する能力により、細胞増殖およびカルボン酸生産を促進したからである。適切な抗生物質を、株に依存して添加する。
【実施例】
【００２４】
（実施例１：乳酸、酢酸およびエタノールの阻害）
好気性条件下および嫌気性条件下の両方においてカルボン酸を生産する、ハイブリッドの細菌株は、バイオマス生成が低い、嫌気性プロセスの制限を克服し得る。バイオマスは、発酵プロセスの開始において、好気性条件下で生成され得る。この段階の間、カルボン酸は、好気的な代謝合成経路により大量に生成され、時間とコストとを節約する。一旦、高いバイオマスが得られると、高い収量で炭素源をカルボン酸へさらに変換するために、嫌気性条件を変換するように環境が切り替えられ得るか、または環境が嫌気性条件を変換することを可能にし得る。再設計された嫌気性コハク酸発酵経路を使用することにより、カルボン酸の収量が、グルコース１モルあたり、２モルまたは３モルよりはるかに多い産物まで増大することが想定される。
【００２５】
まず、カルボン酸生産のため、ＴＣＡ回路への流入を増大させるために、好気性代謝における２つの酢酸経路（ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＸＢ）およびアセテートキナーゼ−ホスホトランスアセチラーゼ（ＡＣＫＡ−ＰＴＡ））を不活化する（図１）。一旦、これらの２つの経路が不活化されると、酢酸生産がかなり低下し、より多くの炭素の流入がＴＣＡ回路を駆動させる。
【００２６】
さらに、乳酸を介しての炭素の流入を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を不活化することにより低下させる。ハイブリッドのコハク酸生産系の嫌気的な設計部分は、大腸菌の混合酸発酵経路における複数の経路の不活化からなる。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨＡ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＥ）は、ＮＡＤＨおよび炭素原子の両方を保存するために不活化される（図１）。ＮＡＤＨは、発酵性のカルボン酸合成経路に必要とされる。炭素の保存は、発酵性のカルボン酸合成経路への炭素の流入を増大させる。
【００２７】
次に、グルコースホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳＧ）もまた、コハク酸合成のためのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）プールを増大させるために不活化される（図１）。ＰＥＰはＯＡＡへの前駆体であり、ＯＡＡはコハク酸合成のための主要な前駆体である。ＰＴＳＧを不活化することはまた、好気性代謝の炭素のスループットを増大させる。これら全ての遺伝的改変により、ここで、ハイブリッドの生産系の好気的な設計は、カルボン酸生産のための２つの経路を含む；そのうちの一方はＴＣＡ回路の酸化的な分岐（ｂｒａｎｃｈ）であり、他方はグリオキシル酸回路である。
【００２８】
この時点において、カルボン酸は、ＴＣＡ回路の酸化的な分岐から生成される。ＴＣＡ回路のタンパク質のいずれか一つの不活化は、分岐されたカルボン酸合成経路を生成する。炭素は、ＯＡＡ−リンゴ酸経路とクエン酸−グリオキシル酸経路またはクエン酸イソクエン酸経路との両方を通って流れる。図２においてコハク酸について実証されるように、分岐されたカルボン酸経路は、好気性代謝および嫌気性代謝の両方を介して、カルボン酸産物の連続的な生産を可能にする。
【００２９】
（実施例２：グリオキシル酸バイパス（ｓｈｕｎｔ）の流入の増大）
以前に示されているように、ネイティブのＡＣＥＡおよびＡＣＥＢの存在は、さらなる発現を必要とせずにカルボン酸生産を駆動するのに十分である。しかしながら、ネイティブの発現レベルは、フィードバック阻害に影響されやすく、かつ環境の好気性条件または嫌気性条件に感受性である。グリオキシル酸バイパスの構成的な活性化は、カルボン酸合成のための高レベルの好気性代謝を維持するのに必須である。この活性化は、ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ＩＣＬＲ）を不活化することにより可能になる。図１に見られるように、グリオキシル酸バイパスの活性化は、高レベルのカルボン酸生産を達成する両方の混合的な発酵環境のを提供する。
【００３０】
（実施例３：コハク酸生産）
コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨＡＢ）の不活化は、好気性条件下でのコハク酸の蓄積を可能にする（図１）。コハク酸は、通常、好気性条件下で蓄積しない。なぜなら、コハク酸は、電子伝達系に電子を供給するため、およびにオキサロ酢酸（ＯＡＡ）を充填するためにＴＣＡ回路で酸化されるからである。図２に示される、分岐された代謝経路は、コハク酸を生成する炭素の流入のための、好気性、嫌気性かつ構成的な経路を提供する。二重の合成経路の存在は、純粋な好気性培養条件または純粋な嫌気性培養条件に対する必要性を軽減させ、より厳密性の低い基準のもとでの産業的な培養条件を可能にする。
【００３１】
（実施例４：カルボン酸生産）
コハク酸生産は、カルボン酸生産のためのプロトタイプの代謝経路として記載される。他のカルボン酸は、ＴＣＡの変換酵素のうちのいずれかを不活化することによる、この系を使用して生産され得る。特に、フマラーゼ（ＦＵＭ）の不活化は、分岐されたフマル酸生産株を生成する。同様に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）の不活化は、分岐されたリンゴ酸生産株を生成する。グリオキシル酸は、リンゴ酸シンターゼ（ＡＣＥＢ）を不活化し、かつイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＣＥＫ）活性を増大させることにより生産され得る。
【００３２】
細菌の生産系を使用する、種々の大量の特製薬品（フマル酸、リンゴ酸、ＯＡＡおよびグリオキシル酸が挙げられる）の生産は、これらの物質のための再生可能かつ低コストの供給源を提供する。好気性条件下および嫌気性条件下の両方においてカルボン酸を生産する細菌株を使用して、培養条件の制限を弱め、それにより大量の薬品生産のコストを軽減する。
【００３３】
（実施例５：収量の増大）
ハイブリッドのコハク酸生産系のための好気性ネットワーク設計および嫌気性ネットワーク設計の両方としては、大腸菌の遺伝子破壊（ΔｓｄｈＡＢ、ΔａｃｋＡ−ｐｔａ、ΔｐｏｘＢ、ΔｉｃｌＲ、ΔｐｔｓＧ、ΔｌｄｈＡおよびΔａｄｈＥ）の種々の組み合わせが挙げられる。さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）およびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）は、単一のプラスミド上の系において同時発現され得る（図１）。ＰＹＣ活性およびＰＥＰＣ活性を増大させることは、顕著にコハク酸合成のためのＯＡＡプールを増大させる。ＰＹＣはピルビン酸を直接ＯＡＡに変換し、ＰＥＰＣはＰＥＰを直接ＯＡＡに変換する。最終的に、ハイブリッドのコハク酸生産は、これらの経路への炭素の流入を駆動するＰＹＣおよびＰＥＰＣの過剰発現とともにコハク酸合成のための３つの経路を含む（図２）。第一の経路は、ＴＣＡ回路の酸化的分岐であり、これは好気的に機能する。第二の経路は、還元的な発酵性のコハク酸合成経路であり、これは嫌気性的に機能する。第三の経路は、グリオキシル酸回路であり、これは、一旦活性化されると、好気的および嫌気性的に機能する。
【００３４】
ハイブリッドのコハク酸生産系へのさらなる改善としては、ピルビン酸をコハク酸合成経路へ導く、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの過剰発現が挙げられる。このことは、あらゆるピルビン酸蓄積を低下させることにより、生産速度を改善し得る。グリオキシル酸回路内の経路はまた、循環効率を改善するために過剰発現され得る（すなわち、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸リアーゼ、リンゴ酸シンターゼ）。グルコース輸送系の操作はまた、コハク酸合成経路への炭素のスループットを改善し得る。一例は、ガラクトースパーミアーゼ（ＧＡＬＰ）である。これは、酢酸生産を低下させる一方で、グルコース取り込みを改善するために潜在的に使用され得る。外的に添加された酢酸の存在下でのアセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）の過剰発現はまた、コハク酸の収量をさらに増大させる潜在的なストラテジーである。理論的に、ＡＣＳは、酢酸を消費してアセチルＣｏＡのプールを増大し得るが、その一方で、ＯＡＡのプールが単純にグルコースから生成され得る。グリオキシル酸回路のＯＡＡ基質要求量とアセチルＣｏＡ基質要求量とを脱共役させることにより、コハク酸についての達成可能な最大限の理論上の収量を生じ得る。ＯＡＡプールを吸い出し得る他の経路を除去することによっても、このプロセスを亢進させ得る。
【００３５】
（実施例６：バッチ発酵）
上記の戦略的な遺伝子操作の全ての結果として、大腸菌の変異体株は、ハイブリッドのコハク酸生産系（図２）として作製される。この変異体株は、いかなる大気の酸素の圧力であっても高レベルのコハク酸を生産し得る。特定のコハク酸合成経路は、常に、環境の酸素状態に依存せずに活発にコハク酸を生産する。この要因は、非常に重要である。なぜなら、これは、高く通気された培養を維持するのに伴う問題を回避し、好気性増殖から嫌気性増殖へ転移する間、細胞が効率的にコハク酸を生産することを可能にするからである。このことは、操作のより高い柔軟性および培養プロトコールのより高い柔軟性を確実にする。発酵器の操作制御パラメータは、大いに広がる。
【００３６】
以前は、好気性バッチ発酵は、バイオマスを増大させることが必要とされた。好気性バッチ発酵は、１．０Ｌ ＮＥＷ ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＢＩＯＦＬＯ １１０ＴＭ発酵器内の６００ｍｌの培地体積により実行されていた。温度は３７℃で維持され、攪拌速度は８００ｒｐｍで一定であった。使用された入り口の気流は１．５Ｌ／ｍｉｎであった。溶存酸素を、ポーラグラフィ酸素電極（ＮＥＷ ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣＴＭ）を使用してモニタリングし、実験を通して８０％より高い飽和状態に維持した。通気を維持し、溶存酸素濃度をモニタリングするために注意が必要とされた。これらの厳密な好気性増殖条件は、大量のモル濃度のカルボン酸収量を代償にしてバイオマスを増大させることを可能にする。ハイブリッドのカルボン酸生産系は、酸素のストリンジェンシーを低下させ、バイオマスの増大と大量の産物の収量との利益を提供する。
【００３７】
（実施例７：ケモスタット発酵）
ケモスタット実験を、０．１ｈｒ−１の希釈率、好気性条件下で実行する。この希釈率は、細菌株の特異的な増殖速度（これは、事前のバッチ培養研究の対数増殖期のデータから得られる）に基づいてカスタマイズされなければならない。６００ｍｌのバッチ培養は、先に記載される培養条件を使用し、そして１．５Ｎ ＨＮＯ３および２Ｎ Ｎａ２ＣＯ３を使用して７．０に制御され得る、ガラス電極を使用してｐＨをモニタリングして、ケモスタット（ｃｈｅｍｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ）により維持され得る。播種後、培養を、１２時間〜１４時間、バッチ様式で増殖させ、その後、ケモスタットを開始するために供給ポンプおよび排出ポンプを起動させる。連続的な培養は、５滞留時間（ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ）後に安定状態に達した。最適な密度および代謝産物を、５および６滞留時間でのサンプルから測定し、次に、安定状態が確立され得ることを確かめるために比較する。
【００３８】
ハイブリッドの生産系により、増殖条件は、酸素負荷の厳密な境界を含まないカルボン酸生産のために最適化され得る。培養条件のわずかな変化は代謝生産を制限せず、それゆえ、酸素負荷は、コストを減らし、生産性を増大させる最適化プロセスの間、重要度は低くなる。
【００３９】
（実施例８：フェドバッチ発酵）
同様に、好気性条件下で実施されるフェドバッチは酸素負荷要求量により同様に制限された。最初の培地体積は、記載されるように１．０−Ｌ発酵器内の４００ｍｌである。グルコースは、バッチ実験結果から得られる、研究される株の特異的な増殖速度にしたがって指数関数的に供給される。グルコース供給のために使用されるプログラムは、ＮＥＷ ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣＴＭのＢＩＯＣＯＭＭＡＮＤ ＰＬＵＳＴＭ ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅである。播種後、バイオリアクター内の培養を、１４時間までバッチ様式で増殖させ、その後、フェドバッチを開始するためにグルコースポンプを起動させる。
【００４０】
ハイブリッドのカルボン酸生産系は、好気性条件下および嫌気性条件下で大量のカルボン酸を生産する高い能力を有する。このコハク酸生産系は、基本的に両方の条件下で機能し得、生産プロセスをより効率的に、かつプロセスの制御および最適化をより容易にし得る。したがって、最も効率的な培養増殖および大量のバイオマス／生体触媒の生産の２つの工程は、好気性条件下でなされ得、この条件において、コハク酸が最も効率的に蓄積され、そして高い細胞密度において酸素が制限されるようになる場合、より多くのモル濃度の効率的な嫌気性変換プロセスが優勢になる。この切り替えの間、培養を分離する必要も、培養を操作的に変更する必要も無いので、大規模リアクターに容易に適合可能である。カルボン酸生産は、グルコース１モルあたり、１モルよりはるかに多いレベルのカルボン酸まで増大され得、いくつかのモデルは、グルコース１モルあたり、２モル、３モル以上の高い収量の産物を予測する。
【００４１】
本明細書に引用される全ての参考文献は、明らかに参考として援用される。参考文献を、便利のために再度、本明細書において列挙する。
【００４２】
【化３】
【００４３】
【化４】
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ハイブリッドのコハク酸生産系の設計および構築。
【図２】大腸菌内のハイブリッドのコハク酸生産系。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）タンパク質、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＸＢ）タンパク質およびホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）タンパク質の低下した活性を含み、かつ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、好気呼吸調節制御因子（ａｅｒｏｂｉｃ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）（ＡＲＣ）、脂肪酸分解レギュロン（ＦＡＤＲ）、フルクトースレギュロン（ＦＲＵＲ）、フマラーゼ（ＦＵＭ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）、イソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ）、ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ＩＣＬＲ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬ）、ホスホトランスフェラーゼ系Ｆ（ＰＴＳＦ）およびホスホトランスフェラーゼ系Ｇ（ＰＴＳＧ）ならびにコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）からなる群より選択される１つ以上のタンパク質の低下した活性をさらに含む、改変された細菌。
【請求項２】
ＡＣＫ、ＡＤＨ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡおよびＳＤＨの低下した活性を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項３】
ＡＣＫ、ＡＤＨ、ＩＣＬＲ、ＬＤＨ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡおよびＳＤＨの低下した活性を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項４】
ＡＣＫ、ＡＤＨ、ＩＣＬＲ、ＬＤＨ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡ、ＰＴＳＧおよびＳＤＨの低下した活性を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項５】
ＡＣＫ、ＡＤＨ、ＩＣＬＲ、ＬＤＨ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡ、ＰＴＳＧおよびＳＤＨの低下した活性を含み、ＧＡＬＰの増加した活性を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項６】
ＳＢＳ５５２ＭＧ、ＭＢＳ５５３ＭＧおよびＭＢＳ５５４ＭＧからなる群より選択される、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項７】
イソクエン酸リアーゼ（ＡＣＥＡ）、リンゴ酸シンターゼ（ＡＣＥＢ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスホリラーゼ（ＡＣＥＫ）、アコニターゼ（ＡＣＮ）、アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）、クエン酸シンターゼ（ＣＩＴＺ）、フマル酸レダクターゼ（ＦＲＤ）、ガラクトースパーミアーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ）（ＧＡＬＰ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）からなる群より選択される１つ以上のタンパク質の低下した活性を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項８】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、アセテートキナーゼ（ａｃｋ）、好気呼吸調節制御因子（ａｒｃ）、脂肪酸分解レギュロン（ｆａｄＲ）、フマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）、フルクトースレギュロン（ｆｒｕＲ）、フマラーゼ（ｆｕｍ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ）、イソクエン酸リアーゼ（ｉｃｌ）、ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ｉｃｌＲ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、ホスホトランスフェラーゼ系Ｆ（ｐｔｓＦ）およびホスホトランスフェラーゼ系Ｇ（ｐｔｓＧ）ならびにコハク酸デヒドロゲナーゼ（ｓｄｈ）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の破壊を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項９】
イソクエン酸リアーゼ（ａｃｅＡ）、リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスホリラーゼ（ａｃｅＫ）、アコニターゼ（ａｃｎ）、アセチルＣｏＡシンテターゼ（ａｃｓ）、クエン酸シンターゼ（ｃｉｔＺ）、ガラクトースパーミアーゼ（ｇａｌＰ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項１０】
アセテートキナーゼ（ａｃｋ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）の破壊を含み、かつ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、好気呼吸調節制御因子（ａｒｃ）、脂肪酸分解レギュロン（ｆａｄＲ）、フマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）、フルクトースレギュロン（ｆｒｕＲ）、フマラーゼ（ｆｕｍ）、ガラクトースパーミアーゼ（ｇａｌＰ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ）、イソクエン酸リアーゼ（ｉｃｌ）、ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ｉｃｌＲ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）、ホスホトランスフェラーゼ系Ｆ（ｐｔｓＦ）およびホスホトランスフェラーゼ系Ｇ（ｐｔｓＧ）ならびにコハク酸デヒドロゲナーゼ（ｓｄｈ）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の破壊をさらに含む、遺伝子操作された細菌細胞。
【請求項１１】
ａｃｋ−ｐｔａ、ａｄｈ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢおよびｓｄｈの破壊を含む、請求項１０に記載の遺伝子操作された細菌細胞。
【請求項１２】
ａｃｋ、ａｄｈ、ｉｃｌＲ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢ、ｐｔａおよびｓｄｈの破壊を含む、請求項１０に記載の遺伝子操作された細菌細胞。
【請求項１３】
ａｃｋ、ａｄｈ、ｉｃｌＲ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢ、ｐｔａ、ｐｔｓＧおよびｓｄｈの破壊を含む、請求項１０に記載の遺伝子操作された細菌細胞。
【請求項１４】
ａｃｋ、ａｄｈ、ｉｃｌＲ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢ、ｐｔａ、ｐｔｓＧおよびｓｄｈの破壊を含み、ＧＡＬＰの増大した活性を含む、請求項１０に記載の遺伝子操作された細菌細胞。
【請求項１５】
イソクエン酸リアーゼ（ａｃｅＡ）、リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスホリラーゼ（ａｃｅＫ）、アコニターゼ（ａｃｎ）、アセチルＣｏＡシンテターゼ（ａｃｓ）、クエン酸シンターゼ（ｃｉｔＺ）、ガラクトースパーミアーゼ（ｇａｌＰ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）からなる群より選択される遺伝子の過剰発現を含む、請求項１０に記載の遺伝子操作された細菌細胞。
【請求項１６】
細菌培養中でカルボン酸を生産する方法であって、該方法は、
ａ）培養中に細菌を提供する工程であって、ここで、該細菌は、ＡＣＫタンパク質、ＰＯＸＢタンパク質およびＰＴＡタンパク質の低下した活性を含み、さらに、
ｉ）ＡＤＨ、ＡＲＣ、ＦＡＤＲ、ＦＲＤ、ＦＲＵＲ、ＦＵＭ、ＩＣＤ、ＩＣＬ、ＩＣＬＲ、ＬＤＨ、ＭＤＨ、ＰＦＬ、ＰＴＡ、ＰＴＳＦ、ＰＴＳＧおよびＳＤＨからなる群より選択される１つ以上のタンパク質の低下した活性、
ｉｉ）ＡＣＥＡ、ＡＣＥＢ、ＡＣＥＫ、ＡＣＮ、ＡＣＳ、ＣＩＴＺ、ＧＡＬＰ、ＰＥＰＣおよびＰＹＣからなる群より選択される１つ以上のタンパク質の低下した活性、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両方を含む、工程；
ｂ）該細菌に糖基質を供給する工程；
ｃ）好気性条件下で、該細菌が該糖を代謝して十分なバイオマスになることを可能にする工程；
ｄ）嫌気性条件下で、該細菌が該糖を代謝してカルボン酸生産を最大限にすることを可能にする工程；ならびに、
ｅ）該カルボン酸を該培養から回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記細菌が、ａｃｋ、ａｄｈ、ｉｃｌＲ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢ、ｐｔａ、ｐｔｓＧおよびｓｄｈの破壊を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌が、ａｃｋ、ａｄｈ、ｉｃｌＲ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢ、ｐｔａ、ｐｔｓＧおよびｆｕｍの破壊を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌が、ａｃｋ、ａｄｈ、ｉｃｌＲ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢ、ｐｔａ、ｐｔｓＧおよびｍｄｈの破壊を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記細菌が、イソクエン酸リアーゼ（ＡＣＥＡ）、リンゴ酸シンターゼ（ＡＣＥＢ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスホリラーゼ（ＡＣＥＫ）、アコニターゼ（ＡＣＮ）、アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）、クエン酸シンターゼ（ＣＩＴＺ）、フマル酸レダクターゼ（ＦＲＤ）、ガラクトースパーミアーゼ（ＧＡＬＰ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）からなる群より選択されるタンパク質の増加した活性を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養が、フラスコ培養、バッチ培養、フェドバッチ培養またはケモスタット培養である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養が好気性での増殖条件であり、ヘッドガス（ｈｅａｄ ｇａｓ）を交換することなく、カルボン酸生産が嫌気性条件下で続けられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記カルボン酸が、グルコース１モルあたり２モルより多く回収される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記カルボン酸が、グルコース１モルあたり３モルより多く回収される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）タンパク質、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＸＢ）タンパク質およびホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）タンパク質の低下した活性を含み、かつ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、好気呼吸調節制御因子（ａｅｒｏｂｉｃ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）（ＡＲＣ）、脂肪酸分解レギュロン（ＦＡＤＲ）、フルクトースレギュロン（ＦＲＵＲ）、フマラーゼ（ＦＵＭ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）、イソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ）、ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ＩＣＬＲ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬ）、ホスホトランスフェラーゼ系Ｆ（ＰＴＳＦ）およびホスホトランスフェラーゼ系Ｇ（ＰＴＳＧ）ならびにコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）からなる群より選択される１つ以上のタンパク質の低下した活性をさらに含む、改変された細菌。
【請求項２】
ＡＣＫ、ＡＤＨ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡおよびＳＤＨの低下した活性を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項３】
ＡＣＫ、ＡＤＨ、ＩＣＬＲ、ＬＤＨ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡおよびＳＤＨの低下した活性を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項４】
ＡＣＫ、ＡＤＨ、ＩＣＬＲ、ＬＤＨ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡ、ＰＴＳＧおよびＳＤＨの低下した活性を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項５】
ＡＣＫ、ＡＤＨ、ＩＣＬＲ、ＬＤＨ、ＰＯＸＢ、ＰＴＡ、ＰＴＳＧおよびＳＤＨの低下した活性を含み、ＧＡＬＰの増加した活性を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項６】
ＳＢＳ５５２ＭＧ、ＭＢＳ５５３ＭＧおよびＭＢＳ５５４ＭＧからなる群より選択される、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項７】
イソクエン酸リアーゼ（ＡＣＥＡ）、リンゴ酸シンターゼ（ＡＣＥＢ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスホリラーゼ（ＡＣＥＫ）、アコニターゼ（ＡＣＮ）、アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）、クエン酸シンターゼ（ＣＩＴＺ）、フマル酸レダクターゼ（ＦＲＤ）、ガラクトースパーミアーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ）（ＧＡＬＰ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）からなる群より選択される１つ以上のタンパク質の低下した活性を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項８】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、アセテートキナーゼ（ａｃｋ）、好気呼吸調節制御因子（ａｒｃ）、脂肪酸分解レギュロン（ｆａｄＲ）、フマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）、フルクトースレギュロン（ｆｒｕＲ）、フマラーゼ（ｆｕｍ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ）、イソクエン酸リアーゼ（ｉｃｌ）、ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ｉｃｌＲ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、ホスホトランスフェラーゼ系Ｆ（ｐｔｓＦ）およびホスホトランスフェラーゼ系Ｇ（ｐｔｓＧ）ならびにコハク酸デヒドロゲナーゼ（ｓｄｈ）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の破壊を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項９】
イソクエン酸リアーゼ（ａｃｅＡ）、リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスホリラーゼ（ａｃｅＫ）、アコニターゼ（ａｃｎ）、アセチルＣｏＡシンテターゼ（ａｃｓ）、クエン酸シンターゼ（ｃｉｔＺ）、ガラクトースパーミアーゼ（ｇａｌＰ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の過剰発現を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項１０】
アセテートキナーゼ（ａｃｋ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）の破壊を含み、かつ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、好気呼吸調節制御因子（ａｒｃ）、脂肪酸分解レギュロン（ｆａｄＲ）、フマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）、フルクトースレギュロン（ｆｒｕＲ）、フマラーゼ（ｆｕｍ）、ガラクトースパーミアーゼ（ｇａｌＰ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ）、イソクエン酸リアーゼ（ｉｃｌ）、ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ｉｃｌＲ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）、ホスホトランスフェラーゼ系Ｆ（ｐｔｓＦ）およびホスホトランスフェラーゼ系Ｇ（ｐｔｓＧ）ならびにコハク酸デヒドロゲナーゼ（ｓｄｈ）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の破壊をさらに含む、遺伝子操作された細菌細胞。
【請求項１１】
ａｃｋ−ｐｔａ、ａｄｈ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢおよびｓｄｈの破壊を含む、請求項１０に記載の遺伝子操作された細菌細胞。
【請求項１２】
ａｃｋ、ａｄｈ、ｉｃｌＲ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢ、ｐｔａおよびｓｄｈの破壊を含む、請求項１０に記載の遺伝子操作された細菌細胞。
【請求項１３】
ａｃｋ、ａｄｈ、ｉｃｌＲ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢ、ｐｔａ、ｐｔｓＧおよびｓｄｈの破壊を含む、請求項１０に記載の遺伝子操作された細菌細胞。
【請求項１４】
ａｃｋ、ａｄｈ、ｉｃｌＲ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢ、ｐｔａ、ｐｔｓＧおよびｓｄｈの破壊を含み、ＧＡＬＰの増大した活性を含む、請求項１０に記載の遺伝子操作された細菌細胞。
【請求項１５】
イソクエン酸リアーゼ（ａｃｅＡ）、リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスホリラーゼ（ａｃｅＫ）、アコニターゼ（ａｃｎ）、アセチルＣｏＡシンテターゼ（ａｃｓ）、クエン酸シンターゼ（ｃｉｔＺ）、ガラクトースパーミアーゼ（ｇａｌＰ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）からなる群より選択される遺伝子の過剰発現を含む、請求項１０に記載の遺伝子操作された細菌細胞。
【請求項１６】
細菌培養中でカルボン酸を生産する方法であって、該方法は、
ａ）培養中に細菌を提供する工程であって、ここで、該細菌は、ＡＣＫタンパク質、ＰＯＸＢタンパク質およびＰＴＡタンパク質の低下した活性を含み、さらに、
ｉ）ＡＤＨ、ＡＲＣ、ＦＡＤＲ、ＦＲＤ、ＦＲＵＲ、ＦＵＭ、ＩＣＤ、ＩＣＬ、ＩＣＬＲ、ＬＤＨ、ＭＤＨ、ＰＦＬ、ＰＴＡ、ＰＴＳＦ、ＰＴＳＧおよびＳＤＨからなる群より選択される１つ以上のタンパク質の低下した活性、
ｉｉ）ＡＣＥＡ、ＡＣＥＢ、ＡＣＥＫ、ＡＣＮ、ＡＣＳ、ＣＩＴＺ、ＧＡＬＰ、ＰＥＰＣおよびＰＹＣからなる群より選択される１つ以上のタンパク質の低下した活性、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両方を含む、工程；
ｂ）該細菌に糖基質を供給する工程；
ｃ）好気性条件下で、該細菌が該糖を代謝して十分なバイオマスになることを可能にする工程；
ｄ）嫌気性条件下で、該細菌が該糖を代謝してカルボン酸生産を最大限にすることを可能にする工程；ならびに、
ｅ）該カルボン酸を該培養から回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記細菌が、ａｃｋ、ａｄｈ、ｉｃｌＲ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢ、ｐｔａ、ｐｔｓＧおよびｓｄｈの破壊を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌が、ａｃｋ、ａｄｈ、ｉｃｌＲ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢ、ｐｔａ、ｐｔｓＧおよびｆｕｍの破壊を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌が、ａｃｋ、ａｄｈ、ｉｃｌＲ、ｌｄｈ、ｐｏｘＢ、ｐｔａ、ｐｔｓＧおよびｍｄｈの破壊を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記細菌が、イソクエン酸リアーゼ（ＡＣＥＡ）、リンゴ酸シンターゼ（ＡＣＥＢ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスホリラーゼ（ＡＣＥＫ）、アコニターゼ（ＡＣＮ）、アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）、クエン酸シンターゼ（ＣＩＴＺ）、フマル酸レダクターゼ（ＦＲＤ）、ガラクトースパーミアーゼ（ＧＡＬＰ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）からなる群より選択されるタンパク質の増加した活性を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養が、フラスコ培養、バッチ培養、フェドバッチ培養またはケモスタット培養である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養が好気性での増殖条件であり、ヘッドガス（ｈｅａｄ ｇａｓ）を交換することなく、カルボン酸生産が嫌気性条件下で続けられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記カルボン酸が、グルコース１モルあたり２モルより多く回収される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記カルボン酸が、グルコース１モルあたり３モルより多く回収される、請求項１６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５１３０２３（Ｐ２００８−５１３０２３Ａ）
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３２５６８（Ｐ２００７−５３２５６８）
【出願日】平成１７年９月１６日（２００５．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３３４０８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３４１５６
【国際公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（５０４０８００８７）ライス ユニバーシティー (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１６日（２００５．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３３４０８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３４１５６
【国際公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（５０４０８００８７）ライス ユニバーシティー (6)
【Ｆターム（参考）】
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