高分子ミセル型光刺激応答性一酸化窒素供与体
【課題】低毒性で高い分散安定性を持ち、体内の標的部位（例えば、ガン組織）に集積し、ＮＯが徐放されることなく、標的部位で光照射時にのみＮＯを生成してその場でＮＯの作用効果を発揮できる化合物または構築物もしくはコンジュゲートの提供。
【解決手段】３−トリフルオロメチル−４−ニトロフェノキシのような低分子ＮＯドナーを水性媒体中で高分子ミセルを形成しうるブロック共重合体（例えば、ポリエチレングリコールとｐ−クロロメチルスチレンとのポリマー）に共有結合せしめた高分子誘導体。
【解決手段】３−トリフルオロメチル−４−ニトロフェノキシのような低分子ＮＯドナーを水性媒体中で高分子ミセルを形成しうるブロック共重合体（例えば、ポリエチレングリコールとｐ−クロロメチルスチレンとのポリマー）に共有結合せしめた高分子誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光刺激によって一酸化窒素を発生する機能を搭載した高分子ミセル形成性ポリマー誘導体およびその使用に関し、より具体的には、一酸化窒素を発生しうる低分子化合物と高分子形成性ポリマーの共有結合誘導体及びその抗ガン剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素（ＮＯ）は、窒素と酸素からなる不対電子をもつフリーラジカルであり、生体内では血管拡張や神経伝達など多くの生理現象における情報伝達物質として関与している。また、免疫システムの一部を担っているマクロファージは、腫瘍細胞や病原菌を認識し、検出した際、大量のＮＯを放出することで、これら外敵のミトコンドリア内電子伝達系の阻害、ＤＮＡ損傷を誘発させる（非特許文献１、非特許文献２）。さらにＮＯは細胞増殖に対し、濃度依存的な影響を及ぼすことが知られており、低濃度のＮＯは細胞増殖を促進するが、高濃度のＮＯは細胞増殖を抑制あるいは細胞死（アポトーシス）を引き起こす（非特許文献３）。つまり、ガン組織などの腫瘍部位で高濃度のＮＯを一時的に発生させることができれば、その増殖を抑制し、ひいては腫瘍部位を死滅させる効果が期待できるのである。
【０００３】
ＮＯは常温、常圧下では反応性の高い気体で、生体内での半減期は約５秒程度である。そのため、ＮＯを水に溶解させ、生体内の特定の箇所で効率的に作用させることは事実上、困難である。そこで、生理条件下でＮＯを発生するＮＯ供与体（ＮＯドナー）が生体内にＮＯを供給する目的で開発されている。例えば、Ｓ−ニトロソ化合物、芳香族Ｎ−ニトロソ化合物、ジアゾニウムジオレート（ＮＯＮＯａｔｅｓ）類、（亜）硝酸エステル化合物、金属ニトロシル、グアニジン類、オキサトリアゾリウム類などが、ＮＯドナーとして知られているが、その殆どは生体環境下で熱やｐＨ、血中に含まれる金属イオンやタンパクの官能基の作用、あるいは酵素による代謝によって徐々に分解され、ＮＯを徐放するものである（非特許文献４）。上述した、ＮＯの抗腫瘍効果を期待する場合、生体内の特定の部位で必要なタイミングでのみＮＯを作用させる、すなわちＮＯ機能の時空間制御が求められるため、これら不特定の場所でＮＯを徐放してしまう従来のＮＯドナーの使用は適さない。
【０００４】
生体内におけるＮＯ機能の時空間制御を達成するため、ニトロベンゼン誘導体の光化学反応を利用したＮＯドナーが、Ｍｉｙａｔａら（非特許文献５、非特許文献６）および、Ｓｏｒｔｉｎｏら（非特許文献７）の研究グループから報告されている。これらのニトロベンゼン誘導体は、光励起状態において分子内原子再配列が誘起されニトロ基の窒素と酸素がＮＯとして放出される。生体環境下において、熱、ｐＨ、金属イオンまたはタンパク質中の官能基によって分解されることのない安定な化合物であり、光照射時にのみ選択的にＮＯを発生することができる。しかしながら、これらのニトロベンゼン誘導体は概して水溶性に極めて乏しく、例えばジメチルスルホキシドなどの有機溶媒を混合した溶液へ溶解させる必要があり、生体への投与に関しては安全面から問題がある。さらに、これらのニトロベンゼン誘導体は低分子化合物であるため、仮に血中に投与できたとしても腎糸球体によるろ過排泄を受け、投与後速やかに体外に排泄されてしまう。Ｓｏｒｔｉｎｏらは、数ナノメートルの粒径の表面がカルボキシル基で安定化された白金ナノ粒子表面に、上記ニトロベンゼン誘導体を適量導入したＮＯキャリアを提案しているが（非特許文献８、非特許文献８）、カルボキシル基の負電荷のみで分散している粒子の生理条件下での分散安定性は極めて低いことが予想され、また担体となる白金粒子の生体内での蓄積による長期毒性も懸念されることから、医薬として使用する際の製剤化を目指す上で大きな問題を抱えている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｔｕｅｈｒら Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８９，１６９，１０１１−１０２０
【非特許文献２】Ｈｉｂｂｓら Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３５，４７３−４７６
【非特許文献３】Ｗｉｎｋら Ｆｒｅｅ Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２００８，４５，１８−３１）
【非特許文献４】日本化学会編、「ＮＯ−化学と生物」季刊化学総説 １９９６
【非特許文献５】Ｆｕｋｕｈａｒａら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００１，１２３，８６６２−８６６６
【非特許文献６】Ｓｕｚｕｋｉら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００５，１２７，１１７２０−１１７２６
【非特許文献７】Ｓｏｒｔｉｎｏら Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００１，１２２６−１２２７
【非特許文献８】Ｃａｒｕｓｏら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９，４８０−４８１
【非特許文献９】Ｂａｒｏｎｅら Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００８，１８，５５３１−５５３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述した先行技術の問題点まとめると下記のとおりである。
１）生体内にＮＯを供給する際にＮＯドナー化合物を使用すると、生体環境下での外的要因によってＮＯドナーが分解し、ＮＯが徐放されてしまうため、場所やタイミングを特定してＮＯを生体内の特定部位に作用させることが困難である。
２）光照射によってＮＯを生成するＮＯドナーを使用すると、一般に、当該ドナーの低い水溶性、また一方で、低分子化合物あることに起因して腎糸球体による生体外へのろ過排泄が懸念される。
３）光応答性ＮＯドナーを担体に担持させることにより開発された白金ナノ粒子キャリア表面に当該ＮＯドナーを適量導入した構築物もしくはコンジュゲートは、実使用（生体）環境での低い分散安定性、標的部位への集積が期待できない。
【０００７】
したがって、低毒性で高い分散安定性を持ち、体内の標的部位（例えば、ガン組織）に集積し、ＮＯが徐放されることなく、標的部位で光照射時にのみＮＯを生成してその場でＮＯの作用効果を発揮できる化合物または構築物もしくはコンジュゲートが提供できれば当該技術分野に新たなステージを提供できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するため、本発明者らは上記低分子ＮＯドナーの新規な誘導体を開発すべく検討した。その結果、当該ドナーを水性媒体中で高分子ミセルを形成しうるブロック共重合体に共有結合せしめた高分子誘導体に由来する高分子ミセルは、結合されている低分子ＮＯドナーが通常の生体環境下で分解されることなく、かつ、ＮＯが徐放されることなく保持される一方で、光刺激に効果的に応答しその場でＮＯを生成できることが確認できた。
【０００９】
より具体的には、生体適合性であり、かつ、水溶性に優れるポリエチレングリコール鎖セグメントと疎水性のポリ（４−クロロメチルスチレン）鎖セグメントを含むブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）の側鎖に、光刺激応答性ＮＯドナーを共有結合を介して
導入することで、光刺激応答性ＮＯドナーを有するブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰ）を効率よく提供できることを見出した。また、このＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰは簡便な透析法によって粒径が４０ｎｍ程度の分散安定性の高い高分子ミセルを形成し、得られた高分子ミセルは生体環境下で光照射によって選択的にＮＯを生成すること、すなわちＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳを用いて低分子ＮＯドナーを高分子化誘導体とすることで、所望の生体内領域で、所望のタイミングでＮＯを発生できる高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体を極めて効率よく提供できることを見出した。さらに、好ましさが劣る場合があるもののＰＣＭＳ鎖に代え一定の疎水性ポリマー鎖を用いたブロック共重合体も同様な特性を有する高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体を提供できることも見出した。
【００１０】
したがって、本発明によれば、一般式（Ｉ）
Ａ−（ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）ｍ−Ｌ１−（ＮＯ−ｄｏｎｏｒ）−Ｚ （Ｉ）
で表され、
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式ＲａＲｂＣＨ−（ここで、Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す。）の基を表し、
Ｌ１は、結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、−（ＣＨ２）ｃＮＨ−、−（ＣＨ２）ｃＣＯ−（ここで、各ｃは１〜５、好ましくは１または２の整数である。）、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−及び−ＣＯＮＨ−からなる群より選ばれる連結基を表し、
ＮＯ−ｄｏｎｏｒは低分子ＮＯドナーが側鎖に共有結合した疎水性ポリマー鎖を表し、
Ｚは水素原子、ヒドロキシ、非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルコキシまたは非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルカルボニルを表し、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表す、
であるＮＯドナーの高分子化誘導体が提供される。
【００１１】
より具体的で、好ましい態様の本発明としては、一般式（ＩＩ）
【００１２】
【化１】
【００１３】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ａＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ａＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでａは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、結合、−Ｏ−、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｂ−Ｏ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−、
−（ＣＨ２）ｂ−ＯＣＯ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨＣＯ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＯ−および−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＮＨ−よりなる群から選ばれる連結基（なお、結合は先頭の−がベンゼン環に結合する方向性をとる）を表し、ｂは０〜３の整数であり、
Ｒは、式
【００１４】
【化２】
【００１５】
の基を表し、
Ｒ１−１は、少なくとも１つがニトロ基に対してオルト位に結合しており、Ｃ１−Ｃ６アルキル、１以上のハロゲン原子で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、モノもしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシ、ジ−もしくはトリ−Ｃ１−Ｃ６アルキルシリル、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ピレニル、フェノキシ、ピロリル、ピリジル、イミダゾール、モルホリル、チオフェニル、チアゾール、アミノ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロキシメチル、アルデヒド、カルボキシル、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、スルホ、スルホン酸エステル、スルホン酸アミドおよびヒドラジドよりなる群から選ばれ、
ｐは１〜４の整数を表し、
−Ｘ−は、結合、−（ＣＨ２）ｄ−、および−（ＣＨ２）ｄ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｅ−（ＣＨ２）ｄ−よりなる群から選ばれ、ｄは１〜６の整数を表し、ｅは０〜３の整数を表し、
Ｌ２は、結合、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
ｍは、２０〜５，０００の整数であり、
ｎは、３〜１，０００の整数であり、かつ、
Ｒは、Ｒの総数ｎの５０％未満、好ましくは３０％未満、より好ましくは１０％未満、特に好ましくは、５％未満が水素原子であることができる、
で表されるＮＯドナーの高分子化誘導体が提供される。
【００１６】
上記のＮＯドナーの高分子化誘導体は、水性媒体中で高分子ミセルを形成し、かかる高分子ミセルは、
ａ）ナノサイズでかつ外殻（シェル）に水溶性高分子ＰＥＧ鎖を有していることから、高い生体適合性と分散安定性を有する；
ｂ）数十ナノメートルの粒径を有しているため、生体内投与時に腎糸球体によるろ過排泄を回避し、かつＥｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）効果によるガン組織への集積効果が期待できる。
【００１７】
また、当該高分子ミセルは、ミセル内核（コア）に、光刺激によって始めてＮＯを生成するＮＯドナー部位が存在していると予測され、ＥＰＲ効果によるガン組織への集積（パッシブターゲッティング）効果に加え、ＮＯドナー集積部位と光照射部位が一致したときにのみに効果が現れるダブルターゲティング効果も期待できる。
【００１８】
したがって、本発明によれば、上記ＮＯドナーの高分子化誘導体を有効成分とし、必要により、希釈剤もしくは製薬学上常用される賦形剤を含んでなる、抗ガン剤も提供される。
【発明の詳細な記述】
【００１９】
以下、本発明の具体的な態様または本発明を規定する用語について説明する。
【００２０】
低分子ＮＯドナーとは、ニトロベンゼン誘導体を包含するニトロ単−乃至多−環芳香族炭化水素であって、光化学反応によりＮＯを生成できる化合物をいう。低分子とは、重合体に対向する概念の化合物であり、本発明により高分子化した場合に、水性媒体中で形成される高分子ミセルの径が数百ｎｍ以下のオーダーになる分子サイズの化合物をいう。
【００２１】
通常、ニトロ単−乃至多−環芳香族炭化水素の光化学反応性は、ニトロ基の配向が大きく影響する。基底状態において、ニトロ基が芳香族環に対し面外配向した場合（芳香環が形成する平面とねじれた配向をとった場合）、ニトロ基の酸素のｐ軌道と、ニトロ基に隣接する芳香環炭素のｐ軌道との重なり生じる。これが光励起状態になると、ニトロ（ＮＯ２）基から亜硝酸エステル（−Ｏ−ＮＯ）基への窒素−酸素原子の再配列（ニトロー亜硝酸エステル光再配列）が誘導され、亜硝酸エステル基が生じる。この反応は、芳香環が形成する平面とニトロ基の配向が垂直に近いほど（すなわち、ねじれが大きいほど）起こりやすい。こうして生成した亜硝酸エステルは、光照射によって容易に炭素−窒素結合が開裂し、一酸化窒素（ＮＯ）を生成する。本発明にいう、限定されるものでないが、光反応によりＮＯを生成できるとは、上記のような反応機序によりＮＯを生成できるものをいう。したがって、典型的な低分子ＮＯドナーまたは低分子ＮＯドナー部分としては、例えば、上記、非特許文献６および７に記載される化合物または当該化合物から水素原子を除去した残基を挙げることができる。
【００２２】
このような低分子ＮＯドナーを高分子化して得られる、本発明に従うＮＯドナーの高分子化誘導体中の低分子ＮＯドナーが側鎖に共有結合した疎水性ポリマー鎖（ＮＯ−ｄｏｎｏｒ）セグメントは、限定されるものでないが、下記の反応性側鎖基を有するポリマー鎖と、必要があれば、低分子ＮＯドナーにそれ自体公知の手段により適当な官能基（−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＣＯＯＨ等）を導入した後に反応せしめて共有結合させることにより形成できる。
【００２３】
反応性側鎖基を有するポリマー鎖の例：
【００２４】
【化３】
【００２５】
ここで、ｐは１または２を表し、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリアミノ酸エステル鎖セグメント；
【００２６】
【化４】
【００２７】
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子またはＣ１−５アルキル基、好ましくはメチル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（（メタ）アクリル酸エステル）鎖セグメント；
【００２８】
【化５】
【００２９】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のスチレン−無水マレイン酸共重合体鎖セグメント；
【００３０】
【化６】
【００３１】
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリリンゴ酸エステル鎖セグメント；
【００３２】
【化７】
【００３３】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリアミック酸鎖セグメント；
【００３４】
【化８】
【００３５】
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリマレイミド鎖セグメント；
【００３６】
【化９】
【００３７】
ここで、Ｌ１は塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（ハロメチルスチレン）鎖セグメント；
【００３８】
【化１０】
【００３９】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（塩化ビニル）鎖セグメント；
【００４０】
【化１１】
【００４１】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の
整数を表す、
のポリ（クロロプレン）鎖セグメント；
【００４２】
【化１２】
【００４３】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（グリシジル メタクリレート）鎖セグメント；
【００４４】
【化１３】
【００４５】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（２−ヒドロキシエチル メタクリレート）鎖セグメント；
【００４６】
【化１４】
【００４７】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリエピクロロヒドリン鎖セグメント；
【００４８】
【化１５】
【００４９】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ−３，３−ビスクロロメチルオキセタン鎖セグメント；
【００５０】
【化１６】
【００５１】
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（オキサゾリン）鎖セグメント；
【００５２】
【化１７】
【００５３】
ここで、ａ及びｂは独立して３〜５００の整数を表す、
のポリシロキサン鎖セグメント；
【００５４】
【化１８】
【００５５】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（ビニルフェニルボロン酸）鎖セグメント；
【００５６】
【化１９】
【００５７】
ここで、ｎはそれぞれ３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
の１−ナイロン鎖セグメント；及び
【００５８】
【化２０】
【００５９】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（ビニルベンズアルデヒド）鎖セグメント。
【００６０】
さらに、上記式（Ｉ）において、
Ｚは水素原子、ヒドロキシ、非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルコキシまたは非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルカルボニルを表す、ジブロック共重合体を挙げることができる。
【００６１】
しかし、特に、ブロック共重合体の反応性基を担持する疎水性鎖セグメントが、式
【００６２】
【化２１】
【００６３】
ここで、Ｌ１は塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す、のポリ（ハロメチルスチレン）鎖セグメントである、ブロック共重合体を好ましく使用できる。
【００６４】
このようなブロック共重合体の一部は公知であり、例えば、疎水性セグメントがポリアミノ酸エステル鎖セグメントを表すものは特許第２６９０２７６号公報（または米国特許第５，４４９，５１３号明細書）等により、また、ポリ（（メタ）アクリル酸エステル鎖セグメントを表すものは特許文献３により公知である。その他のブロック共重合体は上記ブロック共重合体の製造方法または本明細書に後述する製造例１を参照すれば当業者にとって容易に取得できるであろう。なお、本発明で使用するブロック共重合体を規定する一般式中の連結基または反復単位を式で表す場合には、記載されている方向性でそれが一般式中組込まれることが意図されている。
【００６５】
こうして提供できる、低分子ＮＯドナーが側鎖に共有結合した疎水性ポリマー鎖（ＮＯ−ｄｏｎｏｒ）セグメントを含む本発明に従うＮＯドナーの高分子化誘導体の好ましい態様は、上記の一般式（ＩＩ）で表される化合物である。このような一般式（ＩＩ）における、上記式
【００６６】
【化２２】
【００６７】
の基の好ましいものとしては、限定されるものでないが、Ｘに結合するフェニル基を基準にすると、
（ｉ）３−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−４−ニトロフェニル、３−（Ｃ１−Ｃ６分岐アルキル）−４−ニトロフェニル、３，５−ジ−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−４−ニトロフェニル、
（ｉｉ）３−［１個以上のハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素）で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル］−４−ニトロフェニル、３，５−ジ−［１個以上のハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素）で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル］−４−ニトロフェニル、
（ｉｉｉ）３−（モノ−もしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ−４−ニトロフェニル、３，５−ジ−（モノ−もしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ−４−ニトロフェニル、
（ｉｖ）３−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）オキシ−４−ニトロフェニル、３，５−ジ−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）オキシ−４−ニトロフェニル
から選ばれるフェニル基がＸに結合したものを挙げることができる。
【００６８】
以上の化合物を特定する各基または各基の部分について、例えばＣ１−Ｃ１２アルコキシまたはＣ１−Ｃ６アルキルオキシにおけるアルキル部分は、直鎖もしくは分枝のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチルおよびｎ−ドデシル等であることができる。したがって、Ｃ１−Ｃ６アルキルには、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシル等が包含される。
【００６９】
１個以上のハロゲン原子で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルにいうハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である。かようなハロゲン原子で置換されたアルキル基としては、限定されるものでないが、例えば、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、トリブロモメチル、ジクロロマチル、ジブロモメチル、テトラフルオロエチル、テトラクロロエチルおよびテトラブロモエチル等を挙げることができる。
【００７０】
本発明に従う、ＮＯドナーの高分子化誘導体は、水性媒体、例えば、水、燐酸化生理食塩水、または水混和性有機溶媒（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、アセトン、ジメチルアセトアミド、メタノール等）を含有した水溶液中で高分子ミセルを形成できる。
【００７１】
こうして形成された高分子ミセルを、本明細書では、高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体ともいうが、これらは通常、平均径が１００ｎｍ以下のサイズであり、これを構成する高分子誘導体（ブロック共重合体）の１本あたり約１０から２０個程度のＮＯ生成部位が導入されているものが、例えば、製薬学的製剤の有効成分として好ましく使用できる。製薬学的製剤には、必要により、希釈剤、精製水、生理条件下で常用されている緩衝剤による緩衝化水溶液等の希釈剤、または単糖、二糖、オリゴ糖、ポリエチレングリコール、等の当該技術分野で常用されている賦形剤を含めることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】実施例１（ａ）で得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳの１Ｈ−ＮＭＲの測定結果および、対応する構造式を示す。
【図２】実施例１（ｂ）で得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰの１Ｈ−ＮＭＲの測定結果および、対応する構造式を示す。
【図３】実施例１の（ａ）および（ｂ）で得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳおよびＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰそれぞれのＦＴ−ＩＲのスペクトラムである。
【図４】実施例２により得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰの高分子ミセルの動的光散乱測定結果を示す。
【図５】実施例３におけるＥＳＲスペクトラムである。
【図６】実施例４におけるグリース試験の結果を表す。
【図７】実施例５における細胞毒性試験の結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
以下、本発明をさらに具体的に説明するために特定の具体例を記載するが、これは発明の説明を簡潔にするためであり、本発明をこれらの態様に限定することを意味するものでない。
【実施例１】
【００７４】
光刺激応答性ＮＯドナーを有するブロック共重合体の製造
（ａ）片末端にチオール基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＳＨ，Ｍｎ＝５０００）１ｇ、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル１７ｍｇを反応容器に加え、反応容器内の窒素置換を３回繰り返した。さらに、反応容器内に窒素ブローしながらｐ−クロロメチルスチレン１．５ｇ（１．４ｍｌ）、トルエン１２ｍｌを加えた。密閉した反応容器を６０℃まで加熱し、２４時間撹拌した。反応混合物を６００ｍｌのヘキサンに滴下し、生じた白色の沈殿をろ過によって回収した。回収物は、ジエチルエーテルで３回洗浄を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行った。収量は１．２ｇであり、収率は４８．２％であった。得られたポリエチレングリコール−ポリクロロメチルスチレンブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）の組成は、１Ｈ−ＮＭＲの測定結果（図１参照）からＰＥＧセグメントの分子量が５０００ｇ／ｍｏｌ、ＰＣＭＳセグメントの分子量が約１８３０ｇ／ｍｏｌ（重合度ｎ＝１２）と決定した。
【００７５】
（ｂ）ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ１５０ｍｇ、４−ニトロ−（３−トリフルオロメチル）フェノール（ＮＴＰ）１２８ｍｇ、炭酸カリウム２５６ｍｇをそれぞれはかり取り、５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解させた後、遮光条件下で９０℃に加熱して１晩撹拌した。不溶物をろ過で除去した後、ろ液を分画分子量３５００の透析膜に入れ、メタノールに対して透析を行った。透析膜内液を回収し、エバポレートした後の残渣をベンゼンに溶解し、凍結乾燥してＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳの側鎖にさらに、３−トリフルオロメチル−４−ニトロフェノキシ−メチル基の導入された高分子化誘導体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰ）の黄色粉末を得た。回収量は１６１ｍｇ、回収率は８２．５％であった。ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰの構造はＦＴ−ＩＲ（図３参照）および１Ｈ−ＮＭＲによって確認を行い、ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳの全てのクロロメチル基にＮＴＰが導入されていることを確認した（図２参照）。
【実施例２】
【００７６】
高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体の製造
ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰ１０ｍｇをはかり取り、２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解させた。これを分画分子量３５００の透析膜に入れ、室温下、暗所にて純水に対し透析を行った。透析膜内液を回収し、当該ミセル溶液とした。ミセル溶液の濃度は、所定量のミセル溶液を凍結乾燥し、そこに含まれるポリマー重量を測定することによって決定した。得られたミセル溶液の動的光散乱測定から、平均粒径が約４０ｎｍの単峰性の粒度分布を有するミセル様会合体の形成を確認した（図４参照）。
【実施例３】
【００７７】
スピントラップ法による高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体のＮＯ生成能の評価
硫酸第一鉄２２ｍｇとＮ−（ジチオカルバモイル）−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンナトリウム塩（ＭＧＤ）５．５ｍｇを十分に脱酸素処理した純水中で混合し、Ｆｅ（ＩＩ）（ＭＧＤ）２錯体水溶液を調製した。実施例２で調製した高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体中のＮＴＰ部位とＦｅ（ＩＩ）（ＭＧＤ）２錯体のモル比が１：２０となるよう混和し、サンプル溶液を調製した。サンプル溶液を石英セルに入れ、高圧水銀灯を用いて紫外線（３６５ｎｍにて５４ｍＷ／ｃｍ２）を照射した後、この溶液のＥＳＲスペクトルの測定を行ったところ、ニトロソ化されたＦｅ（ＩＩ）（ＭＧＤ）２錯体由来のシグナルが確認され、光照射に伴い高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体からＮＯが生成していることが確認された（図５参照）。
【実施例４】
【００７８】
グリース試験法による高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体の評価
実施例２で製造した高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体溶液を、ＮＴＰユニット換算で１ｍＭとなるように濃度を調製し、石英セルに移して高圧水銀灯を用いて紫外線を照射した。照射を開始してから５、１０、１５および３０分後に溶液をサンプリングし、グリース試験法によって溶液中のＮＯ濃度を比色定量した。グリース試験とは、水中で生成したＮＯが水や溶存酸素との反応を経てＮＯ２−、ＮＯ３−となることを利用して、溶液中のＮＯ２−、ＮＯ３−を定量することによってＮＯ濃度を換算するものである。尚、グ
リース試験は、Ｄｏｊｉｎｄｏ社製のＮＯ２／ＮＯ３Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＣＩＩ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）“Ｇｒｉｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ”を用い、同社推奨プロトコルに従って行った。溶液中におけるＮＯの生成量は、照射時間および照射光強度によって変化した。例えば、３６５ｎｍにて５４ｍＷ／ｃｍ２の紫外線照射を行った場合、開始後１０分で約２０Ｍ、３０分で約６０ＭのＮＯの生成を確認した（図６参照）。
【実施例５】
【００７９】
高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体の細胞毒性評価
９６ｗｅｌｌプレートに、５ｘ１０３個／ｗｅｌｌとなるようにマウス由来結腸ガン細胞（ｃｏｌｏｎ ２６）を播種し、２４時間培養した。ここに実施例２で製造した高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体溶液を添加し、２４時間接触させた後、新しい培地に交換し、水銀ランプを用いて紫外光（３００−３９０ｎｍ，３４ｍＷ／ｃｍ２）を一定時間（最大で１０分間）照射した。その後、さらに培養を続け２４時間後の生細胞数をＤｏｊｉｎｄｏ社製Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８を用いて評価した。その結果、当該ＮＯ供与体は、紫外光を照射しなければ０．４ｍｇ／ｍｌの濃度でも全く細胞毒性を示さないのに対し、同じ条件下でｃｏｌｏｎ ２６と接触させた後、紫外線を照射したものは、有意に生細胞数が減少することが確認された。当該ミセルと接触させなかったｃｏｌｏｎ ２６に対し、同様の紫外線を照射しても細胞毒性は全く見られなかったことから、ここで見られた細胞毒性は、当該ＮＯ供与体を取り込んだｃｏｌｏｎ ２６細胞に紫外線が照射されることによって、細胞内でＮＯが大量に生成し、ガン細胞の増殖が抑制あるいはアポトーシスが誘発されたことに起因するものと考えられる（図７参照）。
【００８０】
以上より、本発明に従う、ＮＯ供与体のＮＯ生成能を評価したところ、光非照射時（暗所）ではＮＯは全く生成しないのに対し、３００ｎｍ以上の紫外光を照射した場合にのみＮＯを生成し、その量は照射波長や強度、時間に依存することが明らかとなった。
【００８１】
さらに当該光刺激応答性ＮＯ供与体を、ガン細胞に一定時間接触させた後、紫外光を照射しその影響を評価したところ、当該ミセルから生成したＮＯに起因する顕著な抗ガン効果が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明によれば、生体内のガン組織へ集積し、且つ集積箇所に光照射を行った時にのみＮＯを生成する高分子ミセル型ＮＯ供与体が提供できる。かような高分子ミセル型ＮＯ供与体は正常組織への副作用の少ない新しい光線力学療法によるガン治療開発が期待できる。したがって、本発明は、医薬製造業で利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光刺激によって一酸化窒素を発生する機能を搭載した高分子ミセル形成性ポリマー誘導体およびその使用に関し、より具体的には、一酸化窒素を発生しうる低分子化合物と高分子形成性ポリマーの共有結合誘導体及びその抗ガン剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素（ＮＯ）は、窒素と酸素からなる不対電子をもつフリーラジカルであり、生体内では血管拡張や神経伝達など多くの生理現象における情報伝達物質として関与している。また、免疫システムの一部を担っているマクロファージは、腫瘍細胞や病原菌を認識し、検出した際、大量のＮＯを放出することで、これら外敵のミトコンドリア内電子伝達系の阻害、ＤＮＡ損傷を誘発させる（非特許文献１、非特許文献２）。さらにＮＯは細胞増殖に対し、濃度依存的な影響を及ぼすことが知られており、低濃度のＮＯは細胞増殖を促進するが、高濃度のＮＯは細胞増殖を抑制あるいは細胞死（アポトーシス）を引き起こす（非特許文献３）。つまり、ガン組織などの腫瘍部位で高濃度のＮＯを一時的に発生させることができれば、その増殖を抑制し、ひいては腫瘍部位を死滅させる効果が期待できるのである。
【０００３】
ＮＯは常温、常圧下では反応性の高い気体で、生体内での半減期は約５秒程度である。そのため、ＮＯを水に溶解させ、生体内の特定の箇所で効率的に作用させることは事実上、困難である。そこで、生理条件下でＮＯを発生するＮＯ供与体（ＮＯドナー）が生体内にＮＯを供給する目的で開発されている。例えば、Ｓ−ニトロソ化合物、芳香族Ｎ−ニトロソ化合物、ジアゾニウムジオレート（ＮＯＮＯａｔｅｓ）類、（亜）硝酸エステル化合物、金属ニトロシル、グアニジン類、オキサトリアゾリウム類などが、ＮＯドナーとして知られているが、その殆どは生体環境下で熱やｐＨ、血中に含まれる金属イオンやタンパクの官能基の作用、あるいは酵素による代謝によって徐々に分解され、ＮＯを徐放するものである（非特許文献４）。上述した、ＮＯの抗腫瘍効果を期待する場合、生体内の特定の部位で必要なタイミングでのみＮＯを作用させる、すなわちＮＯ機能の時空間制御が求められるため、これら不特定の場所でＮＯを徐放してしまう従来のＮＯドナーの使用は適さない。
【０００４】
生体内におけるＮＯ機能の時空間制御を達成するため、ニトロベンゼン誘導体の光化学反応を利用したＮＯドナーが、Ｍｉｙａｔａら（非特許文献５、非特許文献６）および、Ｓｏｒｔｉｎｏら（非特許文献７）の研究グループから報告されている。これらのニトロベンゼン誘導体は、光励起状態において分子内原子再配列が誘起されニトロ基の窒素と酸素がＮＯとして放出される。生体環境下において、熱、ｐＨ、金属イオンまたはタンパク質中の官能基によって分解されることのない安定な化合物であり、光照射時にのみ選択的にＮＯを発生することができる。しかしながら、これらのニトロベンゼン誘導体は概して水溶性に極めて乏しく、例えばジメチルスルホキシドなどの有機溶媒を混合した溶液へ溶解させる必要があり、生体への投与に関しては安全面から問題がある。さらに、これらのニトロベンゼン誘導体は低分子化合物であるため、仮に血中に投与できたとしても腎糸球体によるろ過排泄を受け、投与後速やかに体外に排泄されてしまう。Ｓｏｒｔｉｎｏらは、数ナノメートルの粒径の表面がカルボキシル基で安定化された白金ナノ粒子表面に、上記ニトロベンゼン誘導体を適量導入したＮＯキャリアを提案しているが（非特許文献８、非特許文献８）、カルボキシル基の負電荷のみで分散している粒子の生理条件下での分散安定性は極めて低いことが予想され、また担体となる白金粒子の生体内での蓄積による長期毒性も懸念されることから、医薬として使用する際の製剤化を目指す上で大きな問題を抱えている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｔｕｅｈｒら Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８９，１６９，１０１１−１０２０
【非特許文献２】Ｈｉｂｂｓら Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３５，４７３−４７６
【非特許文献３】Ｗｉｎｋら Ｆｒｅｅ Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２００８，４５，１８−３１）
【非特許文献４】日本化学会編、「ＮＯ−化学と生物」季刊化学総説 １９９６
【非特許文献５】Ｆｕｋｕｈａｒａら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００１，１２３，８６６２−８６６６
【非特許文献６】Ｓｕｚｕｋｉら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００５，１２７，１１７２０−１１７２６
【非特許文献７】Ｓｏｒｔｉｎｏら Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００１，１２２６−１２２７
【非特許文献８】Ｃａｒｕｓｏら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９，４８０−４８１
【非特許文献９】Ｂａｒｏｎｅら Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００８，１８，５５３１−５５３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述した先行技術の問題点まとめると下記のとおりである。
１）生体内にＮＯを供給する際にＮＯドナー化合物を使用すると、生体環境下での外的要因によってＮＯドナーが分解し、ＮＯが徐放されてしまうため、場所やタイミングを特定してＮＯを生体内の特定部位に作用させることが困難である。
２）光照射によってＮＯを生成するＮＯドナーを使用すると、一般に、当該ドナーの低い水溶性、また一方で、低分子化合物あることに起因して腎糸球体による生体外へのろ過排泄が懸念される。
３）光応答性ＮＯドナーを担体に担持させることにより開発された白金ナノ粒子キャリア表面に当該ＮＯドナーを適量導入した構築物もしくはコンジュゲートは、実使用（生体）環境での低い分散安定性、標的部位への集積が期待できない。
【０００７】
したがって、低毒性で高い分散安定性を持ち、体内の標的部位（例えば、ガン組織）に集積し、ＮＯが徐放されることなく、標的部位で光照射時にのみＮＯを生成してその場でＮＯの作用効果を発揮できる化合物または構築物もしくはコンジュゲートが提供できれば当該技術分野に新たなステージを提供できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するため、本発明者らは上記低分子ＮＯドナーの新規な誘導体を開発すべく検討した。その結果、当該ドナーを水性媒体中で高分子ミセルを形成しうるブロック共重合体に共有結合せしめた高分子誘導体に由来する高分子ミセルは、結合されている低分子ＮＯドナーが通常の生体環境下で分解されることなく、かつ、ＮＯが徐放されることなく保持される一方で、光刺激に効果的に応答しその場でＮＯを生成できることが確認できた。
【０００９】
より具体的には、生体適合性であり、かつ、水溶性に優れるポリエチレングリコール鎖セグメントと疎水性のポリ（４−クロロメチルスチレン）鎖セグメントを含むブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）の側鎖に、光刺激応答性ＮＯドナーを共有結合を介して
導入することで、光刺激応答性ＮＯドナーを有するブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰ）を効率よく提供できることを見出した。また、このＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰは簡便な透析法によって粒径が４０ｎｍ程度の分散安定性の高い高分子ミセルを形成し、得られた高分子ミセルは生体環境下で光照射によって選択的にＮＯを生成すること、すなわちＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳを用いて低分子ＮＯドナーを高分子化誘導体とすることで、所望の生体内領域で、所望のタイミングでＮＯを発生できる高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体を極めて効率よく提供できることを見出した。さらに、好ましさが劣る場合があるもののＰＣＭＳ鎖に代え一定の疎水性ポリマー鎖を用いたブロック共重合体も同様な特性を有する高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体を提供できることも見出した。
【００１０】
したがって、本発明によれば、一般式（Ｉ）
Ａ−（ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）ｍ−Ｌ１−（ＮＯ−ｄｏｎｏｒ）−Ｚ （Ｉ）
で表され、
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式ＲａＲｂＣＨ−（ここで、Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す。）の基を表し、
Ｌ１は、結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、−（ＣＨ２）ｃＮＨ−、−（ＣＨ２）ｃＣＯ−（ここで、各ｃは１〜５、好ましくは１または２の整数である。）、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−及び−ＣＯＮＨ−からなる群より選ばれる連結基を表し、
ＮＯ−ｄｏｎｏｒは低分子ＮＯドナーが側鎖に共有結合した疎水性ポリマー鎖を表し、
Ｚは水素原子、ヒドロキシ、非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルコキシまたは非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルカルボニルを表し、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表す、
であるＮＯドナーの高分子化誘導体が提供される。
【００１１】
より具体的で、好ましい態様の本発明としては、一般式（ＩＩ）
【００１２】
【化１】
【００１３】
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ａＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ａＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでａは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、結合、−Ｏ−、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｂ−Ｏ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−、
−（ＣＨ２）ｂ−ＯＣＯ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨＣＯ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＯ−および−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＮＨ−よりなる群から選ばれる連結基（なお、結合は先頭の−がベンゼン環に結合する方向性をとる）を表し、ｂは０〜３の整数であり、
Ｒは、式
【００１４】
【化２】
【００１５】
の基を表し、
Ｒ１−１は、少なくとも１つがニトロ基に対してオルト位に結合しており、Ｃ１−Ｃ６アルキル、１以上のハロゲン原子で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、モノもしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシ、ジ−もしくはトリ−Ｃ１−Ｃ６アルキルシリル、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ピレニル、フェノキシ、ピロリル、ピリジル、イミダゾール、モルホリル、チオフェニル、チアゾール、アミノ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロキシメチル、アルデヒド、カルボキシル、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、スルホ、スルホン酸エステル、スルホン酸アミドおよびヒドラジドよりなる群から選ばれ、
ｐは１〜４の整数を表し、
−Ｘ−は、結合、−（ＣＨ２）ｄ−、および−（ＣＨ２）ｄ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｅ−（ＣＨ２）ｄ−よりなる群から選ばれ、ｄは１〜６の整数を表し、ｅは０〜３の整数を表し、
Ｌ２は、結合、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
ｍは、２０〜５，０００の整数であり、
ｎは、３〜１，０００の整数であり、かつ、
Ｒは、Ｒの総数ｎの５０％未満、好ましくは３０％未満、より好ましくは１０％未満、特に好ましくは、５％未満が水素原子であることができる、
で表されるＮＯドナーの高分子化誘導体が提供される。
【００１６】
上記のＮＯドナーの高分子化誘導体は、水性媒体中で高分子ミセルを形成し、かかる高分子ミセルは、
ａ）ナノサイズでかつ外殻（シェル）に水溶性高分子ＰＥＧ鎖を有していることから、高い生体適合性と分散安定性を有する；
ｂ）数十ナノメートルの粒径を有しているため、生体内投与時に腎糸球体によるろ過排泄を回避し、かつＥｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）効果によるガン組織への集積効果が期待できる。
【００１７】
また、当該高分子ミセルは、ミセル内核（コア）に、光刺激によって始めてＮＯを生成するＮＯドナー部位が存在していると予測され、ＥＰＲ効果によるガン組織への集積（パッシブターゲッティング）効果に加え、ＮＯドナー集積部位と光照射部位が一致したときにのみに効果が現れるダブルターゲティング効果も期待できる。
【００１８】
したがって、本発明によれば、上記ＮＯドナーの高分子化誘導体を有効成分とし、必要により、希釈剤もしくは製薬学上常用される賦形剤を含んでなる、抗ガン剤も提供される。
【発明の詳細な記述】
【００１９】
以下、本発明の具体的な態様または本発明を規定する用語について説明する。
【００２０】
低分子ＮＯドナーとは、ニトロベンゼン誘導体を包含するニトロ単−乃至多−環芳香族炭化水素であって、光化学反応によりＮＯを生成できる化合物をいう。低分子とは、重合体に対向する概念の化合物であり、本発明により高分子化した場合に、水性媒体中で形成される高分子ミセルの径が数百ｎｍ以下のオーダーになる分子サイズの化合物をいう。
【００２１】
通常、ニトロ単−乃至多−環芳香族炭化水素の光化学反応性は、ニトロ基の配向が大きく影響する。基底状態において、ニトロ基が芳香族環に対し面外配向した場合（芳香環が形成する平面とねじれた配向をとった場合）、ニトロ基の酸素のｐ軌道と、ニトロ基に隣接する芳香環炭素のｐ軌道との重なり生じる。これが光励起状態になると、ニトロ（ＮＯ２）基から亜硝酸エステル（−Ｏ−ＮＯ）基への窒素−酸素原子の再配列（ニトロー亜硝酸エステル光再配列）が誘導され、亜硝酸エステル基が生じる。この反応は、芳香環が形成する平面とニトロ基の配向が垂直に近いほど（すなわち、ねじれが大きいほど）起こりやすい。こうして生成した亜硝酸エステルは、光照射によって容易に炭素−窒素結合が開裂し、一酸化窒素（ＮＯ）を生成する。本発明にいう、限定されるものでないが、光反応によりＮＯを生成できるとは、上記のような反応機序によりＮＯを生成できるものをいう。したがって、典型的な低分子ＮＯドナーまたは低分子ＮＯドナー部分としては、例えば、上記、非特許文献６および７に記載される化合物または当該化合物から水素原子を除去した残基を挙げることができる。
【００２２】
このような低分子ＮＯドナーを高分子化して得られる、本発明に従うＮＯドナーの高分子化誘導体中の低分子ＮＯドナーが側鎖に共有結合した疎水性ポリマー鎖（ＮＯ−ｄｏｎｏｒ）セグメントは、限定されるものでないが、下記の反応性側鎖基を有するポリマー鎖と、必要があれば、低分子ＮＯドナーにそれ自体公知の手段により適当な官能基（−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＣＯＯＨ等）を導入した後に反応せしめて共有結合させることにより形成できる。
【００２３】
反応性側鎖基を有するポリマー鎖の例：
【００２４】
【化３】
【００２５】
ここで、ｐは１または２を表し、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリアミノ酸エステル鎖セグメント；
【００２６】
【化４】
【００２７】
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子またはＣ１−５アルキル基、好ましくはメチル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（（メタ）アクリル酸エステル）鎖セグメント；
【００２８】
【化５】
【００２９】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のスチレン−無水マレイン酸共重合体鎖セグメント；
【００３０】
【化６】
【００３１】
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリリンゴ酸エステル鎖セグメント；
【００３２】
【化７】
【００３３】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリアミック酸鎖セグメント；
【００３４】
【化８】
【００３５】
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリマレイミド鎖セグメント；
【００３６】
【化９】
【００３７】
ここで、Ｌ１は塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（ハロメチルスチレン）鎖セグメント；
【００３８】
【化１０】
【００３９】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（塩化ビニル）鎖セグメント；
【００４０】
【化１１】
【００４１】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の
整数を表す、
のポリ（クロロプレン）鎖セグメント；
【００４２】
【化１２】
【００４３】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（グリシジル メタクリレート）鎖セグメント；
【００４４】
【化１３】
【００４５】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（２−ヒドロキシエチル メタクリレート）鎖セグメント；
【００４６】
【化１４】
【００４７】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリエピクロロヒドリン鎖セグメント；
【００４８】
【化１５】
【００４９】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ−３，３−ビスクロロメチルオキセタン鎖セグメント；
【００５０】
【化１６】
【００５１】
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（オキサゾリン）鎖セグメント；
【００５２】
【化１７】
【００５３】
ここで、ａ及びｂは独立して３〜５００の整数を表す、
のポリシロキサン鎖セグメント；
【００５４】
【化１８】
【００５５】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（ビニルフェニルボロン酸）鎖セグメント；
【００５６】
【化１９】
【００５７】
ここで、ｎはそれぞれ３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
の１−ナイロン鎖セグメント；及び
【００５８】
【化２０】
【００５９】
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（ビニルベンズアルデヒド）鎖セグメント。
【００６０】
さらに、上記式（Ｉ）において、
Ｚは水素原子、ヒドロキシ、非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルコキシまたは非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルカルボニルを表す、ジブロック共重合体を挙げることができる。
【００６１】
しかし、特に、ブロック共重合体の反応性基を担持する疎水性鎖セグメントが、式
【００６２】
【化２１】
【００６３】
ここで、Ｌ１は塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す、のポリ（ハロメチルスチレン）鎖セグメントである、ブロック共重合体を好ましく使用できる。
【００６４】
このようなブロック共重合体の一部は公知であり、例えば、疎水性セグメントがポリアミノ酸エステル鎖セグメントを表すものは特許第２６９０２７６号公報（または米国特許第５，４４９，５１３号明細書）等により、また、ポリ（（メタ）アクリル酸エステル鎖セグメントを表すものは特許文献３により公知である。その他のブロック共重合体は上記ブロック共重合体の製造方法または本明細書に後述する製造例１を参照すれば当業者にとって容易に取得できるであろう。なお、本発明で使用するブロック共重合体を規定する一般式中の連結基または反復単位を式で表す場合には、記載されている方向性でそれが一般式中組込まれることが意図されている。
【００６５】
こうして提供できる、低分子ＮＯドナーが側鎖に共有結合した疎水性ポリマー鎖（ＮＯ−ｄｏｎｏｒ）セグメントを含む本発明に従うＮＯドナーの高分子化誘導体の好ましい態様は、上記の一般式（ＩＩ）で表される化合物である。このような一般式（ＩＩ）における、上記式
【００６６】
【化２２】
【００６７】
の基の好ましいものとしては、限定されるものでないが、Ｘに結合するフェニル基を基準にすると、
（ｉ）３−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−４−ニトロフェニル、３−（Ｃ１−Ｃ６分岐アルキル）−４−ニトロフェニル、３，５−ジ−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−４−ニトロフェニル、
（ｉｉ）３−［１個以上のハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素）で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル］−４−ニトロフェニル、３，５−ジ−［１個以上のハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素）で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル］−４−ニトロフェニル、
（ｉｉｉ）３−（モノ−もしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ−４−ニトロフェニル、３，５−ジ−（モノ−もしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ−４−ニトロフェニル、
（ｉｖ）３−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）オキシ−４−ニトロフェニル、３，５−ジ−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）オキシ−４−ニトロフェニル
から選ばれるフェニル基がＸに結合したものを挙げることができる。
【００６８】
以上の化合物を特定する各基または各基の部分について、例えばＣ１−Ｃ１２アルコキシまたはＣ１−Ｃ６アルキルオキシにおけるアルキル部分は、直鎖もしくは分枝のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチルおよびｎ−ドデシル等であることができる。したがって、Ｃ１−Ｃ６アルキルには、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシル等が包含される。
【００６９】
１個以上のハロゲン原子で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルにいうハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である。かようなハロゲン原子で置換されたアルキル基としては、限定されるものでないが、例えば、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、トリブロモメチル、ジクロロマチル、ジブロモメチル、テトラフルオロエチル、テトラクロロエチルおよびテトラブロモエチル等を挙げることができる。
【００７０】
本発明に従う、ＮＯドナーの高分子化誘導体は、水性媒体、例えば、水、燐酸化生理食塩水、または水混和性有機溶媒（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、アセトン、ジメチルアセトアミド、メタノール等）を含有した水溶液中で高分子ミセルを形成できる。
【００７１】
こうして形成された高分子ミセルを、本明細書では、高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体ともいうが、これらは通常、平均径が１００ｎｍ以下のサイズであり、これを構成する高分子誘導体（ブロック共重合体）の１本あたり約１０から２０個程度のＮＯ生成部位が導入されているものが、例えば、製薬学的製剤の有効成分として好ましく使用できる。製薬学的製剤には、必要により、希釈剤、精製水、生理条件下で常用されている緩衝剤による緩衝化水溶液等の希釈剤、または単糖、二糖、オリゴ糖、ポリエチレングリコール、等の当該技術分野で常用されている賦形剤を含めることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】実施例１（ａ）で得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳの１Ｈ−ＮＭＲの測定結果および、対応する構造式を示す。
【図２】実施例１（ｂ）で得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰの１Ｈ−ＮＭＲの測定結果および、対応する構造式を示す。
【図３】実施例１の（ａ）および（ｂ）で得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳおよびＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰそれぞれのＦＴ−ＩＲのスペクトラムである。
【図４】実施例２により得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰの高分子ミセルの動的光散乱測定結果を示す。
【図５】実施例３におけるＥＳＲスペクトラムである。
【図６】実施例４におけるグリース試験の結果を表す。
【図７】実施例５における細胞毒性試験の結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
以下、本発明をさらに具体的に説明するために特定の具体例を記載するが、これは発明の説明を簡潔にするためであり、本発明をこれらの態様に限定することを意味するものでない。
【実施例１】
【００７４】
光刺激応答性ＮＯドナーを有するブロック共重合体の製造
（ａ）片末端にチオール基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＳＨ，Ｍｎ＝５０００）１ｇ、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル１７ｍｇを反応容器に加え、反応容器内の窒素置換を３回繰り返した。さらに、反応容器内に窒素ブローしながらｐ−クロロメチルスチレン１．５ｇ（１．４ｍｌ）、トルエン１２ｍｌを加えた。密閉した反応容器を６０℃まで加熱し、２４時間撹拌した。反応混合物を６００ｍｌのヘキサンに滴下し、生じた白色の沈殿をろ過によって回収した。回収物は、ジエチルエーテルで３回洗浄を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行った。収量は１．２ｇであり、収率は４８．２％であった。得られたポリエチレングリコール−ポリクロロメチルスチレンブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）の組成は、１Ｈ−ＮＭＲの測定結果（図１参照）からＰＥＧセグメントの分子量が５０００ｇ／ｍｏｌ、ＰＣＭＳセグメントの分子量が約１８３０ｇ／ｍｏｌ（重合度ｎ＝１２）と決定した。
【００７５】
（ｂ）ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ１５０ｍｇ、４−ニトロ−（３−トリフルオロメチル）フェノール（ＮＴＰ）１２８ｍｇ、炭酸カリウム２５６ｍｇをそれぞれはかり取り、５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解させた後、遮光条件下で９０℃に加熱して１晩撹拌した。不溶物をろ過で除去した後、ろ液を分画分子量３５００の透析膜に入れ、メタノールに対して透析を行った。透析膜内液を回収し、エバポレートした後の残渣をベンゼンに溶解し、凍結乾燥してＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳの側鎖にさらに、３−トリフルオロメチル−４−ニトロフェノキシ−メチル基の導入された高分子化誘導体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰ）の黄色粉末を得た。回収量は１６１ｍｇ、回収率は８２．５％であった。ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰの構造はＦＴ−ＩＲ（図３参照）および１Ｈ−ＮＭＲによって確認を行い、ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳの全てのクロロメチル基にＮＴＰが導入されていることを確認した（図２参照）。
【実施例２】
【００７６】
高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体の製造
ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＮＴＰ１０ｍｇをはかり取り、２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解させた。これを分画分子量３５００の透析膜に入れ、室温下、暗所にて純水に対し透析を行った。透析膜内液を回収し、当該ミセル溶液とした。ミセル溶液の濃度は、所定量のミセル溶液を凍結乾燥し、そこに含まれるポリマー重量を測定することによって決定した。得られたミセル溶液の動的光散乱測定から、平均粒径が約４０ｎｍの単峰性の粒度分布を有するミセル様会合体の形成を確認した（図４参照）。
【実施例３】
【００７７】
スピントラップ法による高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体のＮＯ生成能の評価
硫酸第一鉄２２ｍｇとＮ−（ジチオカルバモイル）−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンナトリウム塩（ＭＧＤ）５．５ｍｇを十分に脱酸素処理した純水中で混合し、Ｆｅ（ＩＩ）（ＭＧＤ）２錯体水溶液を調製した。実施例２で調製した高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体中のＮＴＰ部位とＦｅ（ＩＩ）（ＭＧＤ）２錯体のモル比が１：２０となるよう混和し、サンプル溶液を調製した。サンプル溶液を石英セルに入れ、高圧水銀灯を用いて紫外線（３６５ｎｍにて５４ｍＷ／ｃｍ２）を照射した後、この溶液のＥＳＲスペクトルの測定を行ったところ、ニトロソ化されたＦｅ（ＩＩ）（ＭＧＤ）２錯体由来のシグナルが確認され、光照射に伴い高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体からＮＯが生成していることが確認された（図５参照）。
【実施例４】
【００７８】
グリース試験法による高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体の評価
実施例２で製造した高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体溶液を、ＮＴＰユニット換算で１ｍＭとなるように濃度を調製し、石英セルに移して高圧水銀灯を用いて紫外線を照射した。照射を開始してから５、１０、１５および３０分後に溶液をサンプリングし、グリース試験法によって溶液中のＮＯ濃度を比色定量した。グリース試験とは、水中で生成したＮＯが水や溶存酸素との反応を経てＮＯ２−、ＮＯ３−となることを利用して、溶液中のＮＯ２−、ＮＯ３−を定量することによってＮＯ濃度を換算するものである。尚、グ
リース試験は、Ｄｏｊｉｎｄｏ社製のＮＯ２／ＮＯ３Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＣＩＩ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）“Ｇｒｉｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ”を用い、同社推奨プロトコルに従って行った。溶液中におけるＮＯの生成量は、照射時間および照射光強度によって変化した。例えば、３６５ｎｍにて５４ｍＷ／ｃｍ２の紫外線照射を行った場合、開始後１０分で約２０Ｍ、３０分で約６０ＭのＮＯの生成を確認した（図６参照）。
【実施例５】
【００７９】
高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体の細胞毒性評価
９６ｗｅｌｌプレートに、５ｘ１０３個／ｗｅｌｌとなるようにマウス由来結腸ガン細胞（ｃｏｌｏｎ ２６）を播種し、２４時間培養した。ここに実施例２で製造した高分子ミセル型光刺激応答性ＮＯ供与体溶液を添加し、２４時間接触させた後、新しい培地に交換し、水銀ランプを用いて紫外光（３００−３９０ｎｍ，３４ｍＷ／ｃｍ２）を一定時間（最大で１０分間）照射した。その後、さらに培養を続け２４時間後の生細胞数をＤｏｊｉｎｄｏ社製Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８を用いて評価した。その結果、当該ＮＯ供与体は、紫外光を照射しなければ０．４ｍｇ／ｍｌの濃度でも全く細胞毒性を示さないのに対し、同じ条件下でｃｏｌｏｎ ２６と接触させた後、紫外線を照射したものは、有意に生細胞数が減少することが確認された。当該ミセルと接触させなかったｃｏｌｏｎ ２６に対し、同様の紫外線を照射しても細胞毒性は全く見られなかったことから、ここで見られた細胞毒性は、当該ＮＯ供与体を取り込んだｃｏｌｏｎ ２６細胞に紫外線が照射されることによって、細胞内でＮＯが大量に生成し、ガン細胞の増殖が抑制あるいはアポトーシスが誘発されたことに起因するものと考えられる（図７参照）。
【００８０】
以上より、本発明に従う、ＮＯ供与体のＮＯ生成能を評価したところ、光非照射時（暗所）ではＮＯは全く生成しないのに対し、３００ｎｍ以上の紫外光を照射した場合にのみＮＯを生成し、その量は照射波長や強度、時間に依存することが明らかとなった。
【００８１】
さらに当該光刺激応答性ＮＯ供与体を、ガン細胞に一定時間接触させた後、紫外光を照射しその影響を評価したところ、当該ミセルから生成したＮＯに起因する顕著な抗ガン効果が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明によれば、生体内のガン組織へ集積し、且つ集積箇所に光照射を行った時にのみＮＯを生成する高分子ミセル型ＮＯ供与体が提供できる。かような高分子ミセル型ＮＯ供与体は正常組織への副作用の少ない新しい光線力学療法によるガン治療開発が期待できる。したがって、本発明は、医薬製造業で利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
Ａ−（ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）ｍ−Ｌ１−（ＮＯ−ｄｏｎｏｒ）−Ｚ （Ｉ）
上式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式ＲａＲｂＣＨ−（ここで、Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す。）の基を表し、
Ｌ１は、結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、−（ＣＨ２）ｃＮＨ−、−（ＣＨ２）ｃＣＯ−（ここで、各ｃは１〜５、好ましくは１または２の整数である。）、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−及び−ＣＯＮＨ−からなる群より選ばれる連結基を表し、
ＮＯ−ｄｏｎｏｒは低分子ＮＯドナーが側鎖に共有結合した疎水性ポリマー鎖を表し、
Ｚは水素原子、ヒドロキシ、非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルコキシまたは非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルカルボニルを表し、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表す、
で示されるＮＯドナーの高分子化誘導体。
【請求項２】
一般式（ＩＩ）
【化１】
上式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ａＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ａＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでａは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、結合、−Ｏ−、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｂ−Ｏ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＯＣＯ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨＣＯ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＯ−および−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＮＨ−よりなる群から選ばれる連結基（なお、結合は先頭の−がベンゼン環に結合する方向性をとる）を表し、ｂは０〜３の整数であり、
Ｒは、式
【化２】
の基を表し、
Ｒ１−１は、少なくとも１つがニトロ基に対してオルト位に結合しており、Ｃ１−Ｃ６
アルキル、１以上のハロゲン原子で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、モノもしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシ、ジ−もしくはトリ−Ｃ１−Ｃ６アルキルシリル、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ピレニル、フェノキシ、ピロリル、ピリジル、イミダゾール、モルホリル、チオフェニル、チアゾール、アミノ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロキシメチル、アルデヒド、カルボキシル、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、スルホ、スルホン酸エステル、スルホン酸アミドおよびヒドラジドよりなる群から選ばれ、
ｐは１〜４の整数を表し、
−Ｘ−は、結合、−（ＣＨ２）ｄ−、および−（ＣＨ２）ｄ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｅ−（ＣＨ２）ｄ−よりなる群から選ばれ、ｄは１〜６の整数を表し、ｅは０〜３の整数を表し、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
ｍは、２０〜５，０００の整数であり、
ｎは、３〜１，０００の整数であり、かつ、
Ｒは、Ｒの総数ｎの５０％未満が水素原子であることができる、
で示されるＮＯドナーの高分子化誘導体。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＮＯドナーの高分子化誘導体を有効成分として含んでなる、抗ガン剤。
【請求項１】
一般式（Ｉ）
Ａ−（ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）ｍ−Ｌ１−（ＮＯ−ｄｏｎｏｒ）−Ｚ （Ｉ）
上式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式ＲａＲｂＣＨ−（ここで、Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す。）の基を表し、
Ｌ１は、結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、−（ＣＨ２）ｃＮＨ−、−（ＣＨ２）ｃＣＯ−（ここで、各ｃは１〜５、好ましくは１または２の整数である。）、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−及び−ＣＯＮＨ−からなる群より選ばれる連結基を表し、
ＮＯ−ｄｏｎｏｒは低分子ＮＯドナーが側鎖に共有結合した疎水性ポリマー鎖を表し、
Ｚは水素原子、ヒドロキシ、非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルコキシまたは非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルカルボニルを表し、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表す、
で示されるＮＯドナーの高分子化誘導体。
【請求項２】
一般式（ＩＩ）
【化１】
上式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ａＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ａＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでａは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、結合、−Ｏ−、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｂ−Ｏ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＯＣＯ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨＣＯ−、−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＯ−および−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＮＨ−よりなる群から選ばれる連結基（なお、結合は先頭の−がベンゼン環に結合する方向性をとる）を表し、ｂは０〜３の整数であり、
Ｒは、式
【化２】
の基を表し、
Ｒ１−１は、少なくとも１つがニトロ基に対してオルト位に結合しており、Ｃ１−Ｃ６
アルキル、１以上のハロゲン原子で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、モノもしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシ、ジ−もしくはトリ−Ｃ１−Ｃ６アルキルシリル、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ピレニル、フェノキシ、ピロリル、ピリジル、イミダゾール、モルホリル、チオフェニル、チアゾール、アミノ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロキシメチル、アルデヒド、カルボキシル、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、スルホ、スルホン酸エステル、スルホン酸アミドおよびヒドラジドよりなる群から選ばれ、
ｐは１〜４の整数を表し、
−Ｘ−は、結合、−（ＣＨ２）ｄ−、および−（ＣＨ２）ｄ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｅ−（ＣＨ２）ｄ−よりなる群から選ばれ、ｄは１〜６の整数を表し、ｅは０〜３の整数を表し、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
ｍは、２０〜５，０００の整数であり、
ｎは、３〜１，０００の整数であり、かつ、
Ｒは、Ｒの総数ｎの５０％未満が水素原子であることができる、
で示されるＮＯドナーの高分子化誘導体。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＮＯドナーの高分子化誘導体を有効成分として含んでなる、抗ガン剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−１７３９６０（Ｐ２０１１−１７３９６０Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３７５５８（Ｐ２０１０−３７５５８）
【出願日】平成２２年２月２３日（２０１０．２．２３）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２３日（２０１０．２．２３）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
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