高分子化合物結晶化促進装置
【課題】タンパク質などの高分子化合物の結晶化を促進して、従来に比して短時間でタンパク質などの高分子化合物の結晶を得ることができるようにするとともに、結晶化の効率を向上させてその歩留まりを高める。
【解決手段】高分子化合物溶液の液滴に対してパルスレーザービームを照射して高分子化合物の結晶化を促進する高分子化合物結晶化促進装置において、パルスレーザービームを出力するパルスレーザービーム出力手段と、上記レーザー発振器から出力されたパルスレーザービームを所定のパルス列に制御して切り出すシャッター手段とを有し、上記シャッター手段によって切り出されたパルスレーザービームのパルス列や照射強度が制御されたパルス列を高分子化合物溶液の液滴に対して照射する。
【解決手段】高分子化合物溶液の液滴に対してパルスレーザービームを照射して高分子化合物の結晶化を促進する高分子化合物結晶化促進装置において、パルスレーザービームを出力するパルスレーザービーム出力手段と、上記レーザー発振器から出力されたパルスレーザービームを所定のパルス列に制御して切り出すシャッター手段とを有し、上記シャッター手段によって切り出されたパルスレーザービームのパルス列や照射強度が制御されたパルス列を高分子化合物溶液の液滴に対して照射する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子化合物結晶化促進装置に関し、さらに詳細には、高分子化合物としてタンパク質の結晶化を促進する際に用いて好適な高分子化合物結晶化促進装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトを含む多くの生物種のＤＮＡ塩基配列の解読が急速に進み、これら大量のゲノム配列情報から抽出される膨大な数の遺伝子について、個々の遺伝子にコードされるタンパク質の立体構造を明らかにして、機能との関係を解明することが重要な課題となってきている。
【０００３】
こうしたタンパク質の立体構造を明らかにする構造ゲノム科学における構造解析の対象となるタンパク質は、ヒトの遺伝子に関して言えば約１０万種類ほどにおよび、その数は極めて多い。
【０００４】
ここで、タンパク質の立体構造は、千種類から数千種類の基本構造単位の組み合わせから形成されており、その組み合わせによって機能の多様性が実現されていると考えられている。このため、これら基本構造単位を全て解明することにより、タンパク質の構造と機能の関係を明らかにすることを目標とした体系的・網羅的な構造解析の研究が鋭意進められている。
【０００５】
一般に、体系的・網羅的な構造解析の研究を効率的に進めていくためには、その構造解析における各工程を高速化・自動化することが要求される。
【０００６】
特に、タンパク質は、変性、分解あるいは吸着などにより失活あるいは損失するものであるため、目的とするタンパク質試料を調製するに際しては、これらの損失を避けながら、できるだけ短時間に効率良く一連の操作を行うことが望ましいものであり、構造解析における各工程の高速化・自動化は火急の課題となっている。
【０００７】
ところで、タンパク質の構造解析の手法の一つとしてＸ線法が知られているが、このＸ線法においては、目的とするタンパク質を精製・濃縮した後に結晶化し、その結晶化したタンパク質を測定用試料として用いるため、タンパク質の結晶化を短時間かつ高効率で行うことが要求されていた。
【０００８】
ここで、Ｘ線法による構造解析の測定用試料として用いることのできるタンパク質結晶を調製する際に用いるタンパク質の結晶化の手法としては、蒸気拡散法の一種であるハンギングドロップ法が一般に広く用いられている。
【０００９】
このハンギングドロップ法とは、沈殿剤を混合したタンパク質溶液をカバーグラスの上に滴下し、当該カバーグラスを液滴がぶら下がる状態に引っ繰り返して予め沈殿剤などを充填した結晶化プレートのウェルに封じ固定し、これを２０℃以下に一定時間保存するという手法である。
【００１０】
上記したハンギングドロップ法によれば、カバーグラスに付着した液滴は自然拡散し、これにより目的とするタンパク質が結晶成長して、Ｘ線法による構造解析の測定用試料として用いることのできるタンパク質結晶を得ることができるものである。
【００１１】
なお、Ｘ線法による構造解析の測定用試料として用いることのできるタンパク質結晶を得る際に、上記したハンギングドロップ法以外によく用いられている手法としては、例えば、シッティングドロップ法などが知られている。
【００１２】
ところが、このような従来のハンギングドロップ法やシッティングドロップ法によれば、タンパク質をＸ線法による構造解析に適した結晶にまで成長させるには長時間を要するとともに、結晶化の効率が劣りその歩留まりは非常に低いという問題点があった。
【００１３】
即ち、ハンギングドロップ法やシッティングドロップ法は、沈殿剤の濃度や分子量などとタンパク質の特性とが最適になった条件（最適条件）下においてのみ構造解析に適した結晶が析出されるものであり、かつ、析出までに数十時間から数週間と時間がかかるものであった。
【００１４】
さらに、ハンギングドロップ法やシッティングドロップ法により新規なタンパク質の結晶を得る場合には、上記したような最適条件を得るまでに、一つのタンパク質に対して、例えば、約１００種類以上の沈殿剤などを手作業で組み合わせる必要があり、より一層作業時間を要するものとなっていた。
【００１５】
近年、こうしたＸ線法による構造解析に適した結晶にまで成長させるには長時間を要するというハンギングドロップ法やシッティングドロップ法に対して、タンパク質溶液にレーザービームを照射することにより結晶化を促進するという手法が報告されている（非特許文献１および非特許文献２参照）。
【００１６】
しかしながら、上記非特許文献１および非特許文献２に開示された手法によれば、結晶化を促進するためのレーザービームの照射条件が異なる各種のタンパク質に対して効率よく作業することが困難であり、汎用性に欠けるという問題点があった。
【００１７】
例えば、新規なタンパク質については、その結晶化を促進するためのレーザービームの照射条件が不明であるため、照射条件を種々に変更してレーザービームを照射する必要があるが、上記非特許文献１および非特許文献２に開示された手法では、照射条件を種々に変更してレーザービームを照射することについては何らの考慮も払われておらず、こうした作業を効率よく行うことができないという問題点があった。
【非特許文献１】Ｈ．Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ， Ｌａｓｅｒ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ． Ｖｏｌ．４２， Ｎｏ．７Ｂ， ｐｐ．Ｌ７９８−Ｌ８００ （２００３）
【非特許文献２】Ｈ．Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ， Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｌａｓｅｒ Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ， Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ． Ｖｏｌ．４３， Ｎｏ．１０Ｂ， ｐｐ．Ｌ１３７６−Ｌ１３７８（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、従来の技術の有する上記したような種々の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、タンパク質などの高分子化合物の結晶化を促進して、従来に比して短時間でタンパク質などの高分子化合物の結晶を得ることができるようにするとともに、結晶化の効率を向上させてその歩留まりを高めた高分子化合物結晶化促進装置を提供しようとするものである。
【００１９】
また、本発明の目的とするところは、結晶化工程における作業性の向上を図り、結晶化を促進するためのレーザービームの照射条件が異なる各種のタンパク質などの高分子化合物に対しても、効率よく作業することが可能な汎用性に優れた高分子化合物結晶化促進装置を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記目的を達成するために、本発明は、所定のパルス列に制御して切り出されたパルスレーザービームや所定の照射強度に制御されたパルスレーザービームをタンパク質溶液などの高分子化合物溶液の液滴に照射して、タンパク質などの高分子化合物の結晶成長を促進するようにしたものである。
【００２１】
従って、本発明によれば、結晶化を促進するためのレーザービームの照射条件が異なる各種のタンパク質などの高分子化合物や新規なタンパク質などの高分子化合物に対しても、パルス列や照射強度を制御することにより照射条件を変化させてレーザービームを照射することが可能となる。
【００２２】
このため、本発明によれば、従来に比して短時間でタンパク質などの高分子化合物の結晶を得ることができるようになり、結晶化の効率を向上させてその歩留まりを高め、構造解析のハイスループット化を図ることが可能となる。
【００２３】
また、本発明によれば、結晶化工程における作業性の向上を図ることができ、結晶化を促進するためのレーザービームの照射条件が異なる各種のタンパク質などの高分子化合物に対しても効率よく作業することが可能となり、本発明は極めて汎用性に優れている。
【００２４】
つまり、本発明によれば、タンパク質などの高分子化合物の結晶化の工程における作業効率が飛躍的に向上し、短時間処理が可能となる。
【００２５】
即ち、本発明のうち請求項１に記載の発明は、高分子化合物溶液の液滴に対してパルスレーザービームを照射して高分子化合物の結晶化を促進する高分子化合物結晶化促進装置において、パルスレーザービームを出力するパルスレーザービーム出力手段と、上記レーザー発振器から出力されたパルスレーザービームを所定のパルス列に制御して切り出すシャッター手段とを有し、上記シャッター手段によって切り出されたパルスレーザービームのパルス列を高分子化合物溶液の液滴に対して照射するようにしたものである。
【００２６】
また、本発明のうち請求項２に記載の発明は、本発明のうち請求項１に記載の発明において、上記シャッター手段は、パルスピッカーまたはデジタルマイクロミラーデバイスであるようにしたものである。
【００２７】
また、本発明のうち請求項３に記載の発明は、本発明のうち請求項１または２のいずれか１項に記載の発明において、さらに、上記パルスレーザービームの上記液滴への照射強度を所定の照射強度に制御する照射強度制御手段を有するようにしたものである。
【００２８】
また、本発明のうち請求項４に記載の発明は、本発明のうち請求項３に記載の発明において、上記照射強度制御手段は、デジタルマイクロミラーデバイスであるようにしたものである。
【００２９】
また、本発明のうち請求項５に記載の発明は、本発明のうち請求項１、２、３または４のいずれか１項に記載の発明において、さらに、上記パルスレーザービームの偏光を所定の偏光に制御する偏光制御手段を有するようにしたものである。
【００３０】
また、本発明のうち請求項６に記載の発明は、本発明のうち請求項５に記載の発明において、上記偏光制御手段は、上記パルスレーザービームの光路上に挿脱自在に配置された１／４波長板であるようにしたものである。
【００３１】
また、本発明のうち請求項７に記載の発明は、本発明のうち請求項１、２、３、４、５または６のいずれか１項に記載の発明において、上記高分子化合物は、タンパク質であるようにしたものである。
【００３２】
また、本発明のうち請求項８に記載の発明は、本発明のうち請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれか１項に記載の発明において、上記液滴は、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法またはサンドイッチドロップ法を実施する容器内に配置されたものである。
【００３３】
また、本発明のうち請求項９に記載の発明は、本発明のうち請求項１、２、３、４、５、６、７または８のいずれか１項に記載の発明において、上記パルスレーザービーム出力手段は、モード同期フェムト秒パルスレーザービームを出力するフェムト秒レーザ発振器であるようにしたものである。
【発明の効果】
【００３４】
本発明は、以上説明したように構成されているので、タンパク質などの高分子化合物の結晶化が促進され、従来に比して短時間でタンパク質などの高分子化合物の結晶を得ることができるようになるとともに、結晶化の効率が向上してその歩留まりが高まるという優れた効果を奏する。
【００３５】
また、本発明は、以上説明したように構成されているので、結晶化工程における作業性の向上が図られ、結晶化を促進するためのレーザービームの照射条件が異なる各種のタンパク質などの高分子化合物に対しても効率のよい作業を行うことを可能とするものであって、極めて汎用性に優れているという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、添付の図面を参照しながら、本発明による高分子化合物結晶化促進装置の実施の形態の一例を詳細に説明するものとする。
【００３７】
図１（ａ）（ｂ）には、本発明による高分子化合物結晶化促進装置の第１の実施の形態が示されている。なお、図１（ａ）は高分子化合物結晶化促進装置の概念構成説明図であり、また、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ領域を拡大して示した概略断面構成説明図である。
【００３８】
この高分子化合物結晶化促進装置１０は、蒸気拡散法であるハンギングドロップ法によりタンパク質溶液などの高分子溶液の液滴１２がセットされた結晶化プレート容器１４と、パルスレーザービームを出力するパルスレーザービーム出力手段としてモード同期フェムト秒パルスレーザービームを出力するフェムト秒レーザー発振器１６と、フェムト秒レーザー発振器１６から出力されたフェムト秒レーザービームのパルス列を間引くことによって当該フェムト秒レーザービームのパルス列を切り出すシャッター機能と当該シャッター機能のシャッター速度を制御する機能と当該フェムト秒レーザービームのパルス列の繰り返し周波数を可変する機能とを備えたシャッター手段としてのパルスピッカー１８と、パルスピッカー１８から出力されたフェムト秒レーザービームの液滴１２への照射強度を制御して当該照射強度を結晶成長のための最適値に調整する照射強度制御手段としてのデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ：Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ）２０と、パルスピッカー１８とデジタルマイクロミラーデバイス２０とをシステム化して自動制御するパーソナルコンピューター２２と、デジタルマイクロミラーデバイス２０から出力されたフェムト秒レーザービームを所定の方向に反射する全反射ミラー２４と、全反射ミラー２４から出力されたフェムト秒レーザービームを結晶化プレート容器１４にセットされた液滴１２のなかで結晶化すべき対象の液滴１２に一点集光する集光手段としての集光レンズ２６とを有して構成されている。
【００３９】
以下に、上記した高分子化合物結晶化促進装置１０の各構成について詳細に説明すると、まず、結晶化プレート容器１４は、従来より公知のものを適宜に選択して用いることが可能であるが、一度に高分子溶液の液滴１２を複数セットすることができるものが好ましい。
【００４０】
次に、フェムト秒レーザー発振器１６は、例えば、パルス幅が１７０ｆｓであり、出力パワーが１．１Ｗであり、波長が１０６０ｎｍであり、繰り返し周波数が５０ＭＨｚであるものを用いることができる。なお、図２には、フェムト秒レーザー発振器１６から出力されるフェムト秒レーザービームの出力パルスの模式図が示されている。
【００４１】
次に、パルスピッカー１８は、従来より公知のものを適宜に選択して用いることが可能であるが、フェムト秒レーザービームのパルス列を切り出すシャッター機能と、当該シャッター機能のシャッター速度を制御する機能と、当該フェムト秒レーザービームのパルス列の繰り返し周波数を可変する機能とを備えるように構成する。
【００４２】
より詳細には、このパルスピッカー１８は、フェムト秒レーザ発振器１６から出力されたフェムト秒レーザービームのパルス列を切り出すゲートタイムがｎｓオーダーであって、１パルス〜∞パルスまで任意に切り出す、即ち、シャッターとして動作することができるようになされているものであって、シャッター速度がｎｓオーダー〜∞のシャッター動作を行うものである。これにより、フェムト秒レーザービームの所要のパルス列が得られることになる。
【００４３】
また、パルスピッカー１８は、パルス列の繰り返し周波数を４Ｈｚ〜４ＭＨｚの範囲で可変できるようになされているとともに、さらに照射回数を０〜４０００００ショットまで可変できるようになされている。なお、これらの制御は、パーソナルコンピューター２２により実行される。
【００４４】
従って、こうしたパルスピッカー１８を用いることにより、高分子化合物溶液の液滴１２へ照射されるフェムト秒レーザービームの照射条件を任意に制御できることになり、多種類のタンパク質などのような種々の高分子化合物に対してそれぞれ最適な照射条件を設定することができるようになる。
【００４５】
次に、図３に示すデジタルマイクロミラーデバイス２０の概念構成説明図ならびに図４に示すデジタルマイクロミラーデバイス２０の動作原理図を参照しながら、デジタルマイクロミラーデバイス２０について説明する。
【００４６】
デジタルマイクロミラーデバイス２０は、図３に示すように、ＸＹ平面上において、パーソナルコンピューター２２により制御されるＸアドレス指定手段２０ａとＹアドレス指定手段２０ｂとによりそれぞれ指定されるＸアドレスとＹアドレスとの交点である各ＸＹ座標上に、マイクロミラー２０ｃをアレイ状にそれぞれ配設して構成されている。なお、このようにアレイ状に配設された多数のマイクロミラー２０ｃのそれぞれをミラーピクセル（ｍｉｒｒｏｒ ｐｉｘｅｌ）と称する。
【００４７】
デジタルマイクロミラーデバイス２０が、例えば、プロジェクションディスプレイなどで用いられている０．７インチ型で１０２４×７６８ピクセル搭載のものと同様な構成の場合には、マイクロミラー２０ｃはＸアドレス上に１０２４個配置されるともにＹアドレス上に７６８個配置されるように構成されており、全部で７８６４３２（１０２４×７６８＝７８６４３２（ピクセル：ｐｉｘｅｌｓ））個配置されている。
【００４８】
こうしたデジタルマイクロミラーデバイス２０は、半導体を用いたマイクロマシニング技術により製造することができるものであり、各マイクロミラー２０ｃは回転軸（図示せず。）にそれぞれ固定されている。そして、デジタルマイクロミラーデバイス２０は、パーソナルコンピューター２２の制御によってＸアドレス指定手段２０ａとＹアドレス指定手段２０ｂとにより指定されるＸＹ座標上のミラーピクセルたるマイクロミラー２０ｃのみを、駆動手段（図示せず。）によって初期位置から回転軸を回転中心として所定の角度α（αは、例えば、ｌ２゜である。）だけ回転することができるように設定されている（図４を参照する。）。
【００４９】
なお、図４においては、初期位置にあるマイクロミラー２０ｃを実線で示し、所定の角度αだけ回転した状態のマイクロミラー２０ｃを破線で示している。
【００５０】
ここで、図４に示すように、デジタルマイクロミラーデバイス２０には斜めから光が入射するように光の入射方向が設定されており、ＸＹアドレスにより選択されたマイクロミラー２０ｃが初期位置から１２゜回転した状態がオン（ＯＮ）状態であり、デジタルマイクロミラーデバイス２０に入射した光は、デジタルマイクロミラーデバイス２０内に配置された集光レンズ２０ｄを通して照射光としてデジタルマイクロミラーデバイス２０の外部へ導出される。一方、マイクロミラー２０ｃが初期位置にある状態がオフ（ＯＦＦ）状態であり、デジタルマイクロミラーデバイス２０に入射した光は、デジタルマイクロミラーデバイス２０内に配置された光吸収板２０ｅに吸収されて、デジタルマイクロミラーデバイス２０の外部へ導出されることはない。
【００５１】
上記した動作原理に基づいて、アレイ上に配置された各マイクロミラー２０ｃのオン状態とオフ状態とを適宜に選択することにより、デジタルマイクロミラーデバイス２０から外部へ導出可能な照射光の出力状態、即ち、照射強度を、全てのマイクロミラー２０ｃをオン状態とした最大出力状態（デジタルマイクロミラーデバイス２０の１００％の出力状態である。）から全てのマイクロミラー２０ｃをオフ状態として外部へ照射光を全く出力しない状態（デジタルマイクロミラーデバイス２０の０％の出力状態である。）までの間で適宜に制御することができる。
【００５２】
即ち、デジタルマイクロミラーデバイス２０においては、アレイ状に配列された、例えば、７８６４３２個の各マイクロミラー２０ｃを傾斜するか否か、即ち、オン状態とするかオフ状態とするかを選択することにより、デジタルマイクロミラーデバイス２０に入射された光の経路を変化させることができるものであり、この動作原理を応用して、デジタルマイクロミラーデバイス２０に入射したフェムト秒レーザービームを０〜１００％の任意の照射強度でデジタルマイクロミラーデバイス２０の外部へ出力することができる。
【００５３】
従って、従来の減光フィルター（ＮＤフィルター）の装着による照射強度の調整に比べて、任意の光照射強度を容易に設定することができる。
【００５４】
ここで、アレイ上に配置された各マイクロミラー２０ｃのオン状態とオフ状態とは、例えば、以下に説明する２通りの手法により制御することができる。
【００５５】
まず、第１の手法は、図５（ａ）（ｂ）（ｃ）に示す、所謂、チェッカーボードパターンによるマイクロミラー２０ｃのオン状態とオフ状態との制御方法である。
【００５６】
この図５（ａ）（ｂ）（ｃ）に示す第１の手法においては、所望の照射強度に応じてオン状態のマイクロミラー２０ｃの数とオフ状態のマイクロミラー２０ｃの数とを設定するものである。
【００５７】
即ち、照射強度を１００％としたい場合には、全てのマイクロミラー２０ｃをオン状態とする（図５（ａ）参照）。また、照射強度を５０％としたい場合には、半数のマイクロミラー２０ｃをオン状態とし、残りの半数のマイクロミラー２０ｃをオフ状態とするものであり、その際に、オン状態とオフ状態とが交互に千鳥状に配置されるチェッカーボードパターンとする（図５（ｂ）参照）。さらに、照射強度を０％としたい場合には、全てのマイクロミラー２０ｃをオフ状態とする（図５（ｃ）参照）。なお、上記以外の照射強度を設定する際には、オン状態のマイクロミラー２０ｃの数とオフ状態のマイクロミラー２０ｃの数とを照射強度に応じて調整することにより、所望の照射強度を得ることができるものであり、その際に、オン状態のマイクロミラー２０ｃとオフ状態のマイクロミラー２０ｃとがなるべく交互に配置されるようにする。
【００５８】
次に、図６（ａ）（ｂ）（ｃ）ならびに図７を参照しながら、第２の手法について説明すると、この第２の手法は、全てのマイクロミラー２０ｃのオン状態とオフ状態とを２５６段階の階調に応じて制御するという方法である。
【００５９】
即ち、全てのマイクロミラー２０ｃをオン状態とした状態において、照射強度を１００％と定義する全てのマイクロミラー２０ｃのオン状態継続時間（以下、単に「オン状態継続時間」と称する。）を時間Ｔとして予め設定するとともに、全てのマイクロミラー２０ｃがオフ状態とされたとき、即ち、オン状態継続時間が０の場合を照射強度０％と定義しておき、この時間Ｔを２５６段階の分解能で制御することにより、画像処理における２５６階調のグレースケールと同様に２５６通りの照射強度が簡単に得られるようになる。
【００６０】
図７には、縦軸に照射強度をとり、かつ、横軸に階調およびオン状態継続時間をとったグラフが示されているが、このグラフに示されているように、オン状態継続時間を変化することにより、照射時間をリニアに変化することができる。
【００６１】
つまり、照射強度を１００％としたい場合には、全てのマイクロミラー２０ｃをオン状態とするとともにオン状態継続時間を時間Ｔとする（図６（ａ）参照）。また、照射強度を５０％としたい場合には、全てのマイクロミラー２０ｃをオン状態とするとともにオン状態継続時間を時間Ｔ／２とする（図６（ｂ）参照）。さらに、照射強度を０％としたい場合には、全てのマイクロミラー２０ｃをオフ状態としてオン状態継続時間を０とする（図６（ｃ）参照）。なお、上記以外の照射強度を設定する際には、図７に示すように照射強度に応じてオン状態継続時間を調整することにより、所望の照射強度を得ることができる。
【００６２】
従って、デジタルマイクロミラーデバイス２０によれば、レーザービームの出力側に偏光板や減光フィルタを挿入するという従来の照射強度を可変する手法と比較すると、非常に簡単な方法と構造とにより照射強度を任意に可変することができる。
【００６３】
なお、上記した第１の手法ならびに第２の手法の制御は、パーソナルコンピューター２２により実行される。
【００６４】
次に、パルスピッカー１８によりパルス列を切り出されるとともにデジタルマイクロミラーデバイス２０により照射強度を制御されたフェムト秒レーザービームを、高分子化合物溶液の液滴１２へ一点集光する照射手法について説明する。
【００６５】
上記したように、高分子化合物結晶化促進装置１０においては、フェムト秒レーザービームを高分子化合物溶液の液滴１２へ集光する集光手段として、集光レンズ２６がデジタルマイクロミラーデバイス２０の後段に配設されている。この集光レンズ２６としては、この実施の形態においては、倍率が２０倍であってＮＡが０．７の高倍率・高開口数対物レンズを用いている。こうした集光レンズ２６を持つ光学系を用いて、フェムト秒レーザービームを絞り込み、単位面積当りのレーザービームの照射強度としてＧＷ／ｃｍ２オーダーの値を得ることができるようになされている。
【００６６】
以上の構成において、高分子化合物結晶化促進装置１０により、高分子化合物として、例えば、目的のタンパク質を精製・濃縮して結晶を生成するには、まず、種々の沈殿剤３０を調製し、結晶化プレート容器１４のウェル１４ａに注入する。
【００６７】
次に、上記のタンパク質の溶液をピペッティングで結晶化プレート容器１４のカバーグラス１４ｂに滴下して液滴１２を形成する。それから、カバーグラス１４ｂを液滴１２がぶら下がる状態に引っ繰り返して予め沈殿剤３０を充填したウェル１４ａに被せ、カバーグラス１４ｂとウェル１４ａとをグリースにより封じる。
【００６８】
上記したような準備の後に、タンパク質の液滴１２に対して、フェムト秒レーザー発振器１６により出力されたフェムト秒レーザービームのパルス列をパルスピッカー１８、デジタルマイクロミラーデバイス２０、全反射ミラー２４ならびに集光レンズ２６を介して照射する。
【００６９】
即ち、フェムト秒レーザ発振器１６から出力されたモード同期フェムト秒パルスレーザービームは、そのパルス列をパルスピッカー１８により切り出されてパルス列の繰り返し周波数やショット数（照射回数）が調整され、それからデジタルマイクロミラーデバイス２０により照射強度を調整された後に集光レンズ２６へ入射され、液滴１２に対して１点集光されて照射される。
【００７０】
従って、この高分子化合物結晶化促進装置１０においては、最適な結晶化促進条件を得るために、パルスレーザービームのパルス列の繰り返し周波数、ショット数あるいは照射強度を極めて容易に調整することができる。
【００７１】
ここで、図８ならびに図９には、高分子化合物結晶化促進装置１０を用いて、高分子化合物溶液として、
・タンパク質：Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、 濃度５０ｍｇ／ｍｌ
・緩衝溶液：ＨＥＰＥＳ ０．１Ｍ、ｐＨ７．３
・ＮａＣｌ：０．２Ｍ
のタンパク質溶液の液滴１２から結晶を析出した本願発明者の実験結果が示されている。
【００７２】
この実験においては、デジタルマイクロミラーデバイス２０により制御されるフェムト秒レーザービームの液滴１２への照射強度は２２０ＧＷ／ｃｍ２であり、これを照射強度１００％としてその状態を維持し、パルスピッカー１８により制御されるシャッターの周波数（Ｈｚ）とショット（ｓｈｏｔ）数とを変化させ、複数のサンプルにフェムト秒レーザービームを照射し、これらのサンプルから結晶が析出されたサンプル数を計数した。
【００７３】
なお、図８には、パルスピッカー１８により制御されるシャッターの周波数（Ｈｚ）とショット（ｓｈｏｔ）数とに関して結晶化されたサンプル数を示す実験結果の測定値が示されている。また、図９は、図８に対応する図表であって、図８の測定値について、実験したサンプル数に対する結晶化されたサンプル数の割合を百分率で示したものである。
【００７４】
一方、図１０には、パルスピッカー１８により繰り返し周波数を４ＭＨｚに固定するとともにショット数を４０００ショットに固定し、デジタルマイクロミラーデバイス２０により制御されるフェムト秒レーザービームの液滴１２への照射強度を変化させた実験の実験結果が示されており、デジタルマイクロミラーデバイス２０により制御されるフェムト秒レーザービームの液滴１２への照射強度と実際の結晶化確率との関係を示すグラフが示されている。
【００７５】
ここで、この実験においては、照射強度２２０ＧＷ／ｃｍ２を照射強度１００％として示しており、また、タンパク質溶液などのその他の実験条件は上記と同じであって、複数のサンプルにフェムト秒レーザービームを照射し、これらのサンプルから結晶が析出されたサンプル数を計数した。
【００７６】
これら図８乃至図１０に示す本願発明者の実験結果から明らかなように、結晶化、即ち、結晶析出の促進には最適な条件が存在するものである。
【００７７】
つまり、タンパク質分子は、レーザービーム照射のような外部エネルギーを印加しない場合にはランダムな方向に散在している。ところが、タンパク質分子の電子励起エネルギーを超えるようなレーザービームを照射した場合には、当該タンパク質分子は異方性を持ち、当該タンパク質分子はある一定の方向に配向する。この場合、レーザービームの照射により、タンパク質分子には熱エネルギーが蓄積される。
【００７８】
ここで、もし、タンパク質分子に蓄積された熱エネルギーが十分放散される時間間隔を保って、再度レーザービームの行うならば、タンパク質分子は更に異方性を持ち、その結果、結晶核が生成されて結晶が析出される。
【００７９】
このように、パルスレーザービーム、特に、フェムト秒レーザービームなどのような短パルスレーザビームの照射がタンパク質の結晶析出に有効である。また、結晶核の生成過程や結晶析出過程においては、結晶核や析出した結晶を損傷しない程度の熱エネルギー、即ち、照射強度範囲とパルス数が存在する。
【００８０】
上記した本願発明者の実験においては、照射強度２２０ＧＷ／ｃｍ２、繰り返し周波数０．４ＭＨｚ、４０００ショットが結晶析出に有効であった。
【００８１】
図１１には、上記した実験に使用したタンパク質溶液の液滴１２に対して、フェムト秒レーザービームを照射強度２２０ＧＷ／ｃｍ２、繰り返し周波数０．４ＭＨｚ、４０００ショットで照射した際に得られた結晶の一例の顕微鏡写真が示されている。
【００８２】
なお、集光レンズ２６を介して液滴１２に照射されたフェムト秒レーザービームの照射強度は、以下のようにして計算した。
【００８３】
集光レンズ２６を取り外してステージ上でレーザー出力を測定した値：３００ｍＷ
集光レンズ２６の波長１０６０ｎｍのフェムト秒レーザービームの透過率：約６０％
集光レンズ２６下でのレーザー出力：３００ｍＷ×０．６＝１８０ｍＷ
フェムト秒レーザー発振器１６のパラメータ
繰り返し周波数：５０ＭＨｚ
パルス幅：２００ｆｓ
ピーク波長：１０６０ｎｍ
なお、フェムト秒レーザー発振器１６から出力されるフェムト秒レーザービームのパルス幅１７０ｆｓであるが、パルスピッカー１８、デジタルマイクロミラーデバイス２０、全反射ミラー２４および集光レンズ２６を通過するため２００ｆｓに広がると見積もった。
【００８４】
単位パルスあたりのエネルギー：１８０ｍＷ／５０ＭＨｚ＝３．２ｎＪ
単位パルスあたりのパワー：３．２ｎＪ／０．２ｐｓ＝１８ｋＷ＝１８×１０−６ＧＷ ・・・ 式１
集光レンズ２６の倍率は２０倍で、ＮＡ＝０．４の場合、焦点を結んだときにフェムト秒レーザービームが照射される面積は、以下のようになる。
【００８５】
ビームスポット径：１．２２×１０６０ｎｍ／０．４＝３２３３ｎｍ＝３．２μｍ
ビームの照射面積：１．６μｍ×１．６μｍ×π＝８．０４μｍ２＝８．０４×１０−８ｃｍ２ ・・・ 式２
上記の式１および式２より、
サンプル上での１パルス当たりのパワー密度：１８／８．０４×１０２ＧＷ／ｃｍ２
となる。
【００８６】
上記したように、この高分子化合物結晶化促進装置１０によれば、パルスピッカー１８によるパルスの切り出しの可変制御ならびに繰り返し周波数の可変制御、デジタルマイクロミラーデバイス２０による照射強度の可変制御あるいは集光レンズ２６による液滴１２の一点集光などによって、タンパク質分子に超短時間で大照射強度のフェムト秒レーザービームを照射することができ、その結果、結晶核が生成され、かつ、タンパク質分子内におけるフェムト秒レーザービームによる熱エネルギーを効率良く放散することができるので、蓄積熱による生成結晶核の損傷なしに、タンパク質分子の配向を行い、析出された結晶成長を促進する。
【００８７】
即ち、高分子化合物結晶化促進装置１０によれば、結晶化促進条件を任意に変えることができ、種々のタンパク質溶液を容易に結晶化することができるようになる。
【００８８】
つまり、高分子化合物結晶化促進装置１０を用いると、結晶成長まで長時間要することなく、タンパク質溶液を結晶化することが可能となり、構造解析用試料供給に要する時間を著しく短縮することが可能となる。
【００８９】
一方、引用文献１または引用文献２に開示された技術では、倍率が１０倍でありＮＡが０．４の対物レンズを用いており、単位面積当りの照射強度は高くない。また、シャッター機能も備えておらず、２００ｆｓ、１ＫＨｚ固定の繰り返しパルスを照射している。従って、タンパク質分子の配向を任意に制御することはできず、種々のタンパク質溶液を結晶化することもできない。
【００９０】
次に、図１２には、本発明による高分子化合物結晶化促進装置の他の実施の形態の概念構成説明図が示されている。なお、図１に示す構成と同一または相当する構成には、図１に示す構成と同一の符号を付して示すことにより、その重複する説明は適宜に省略するものとする。
【００９１】
この高分子化合物結晶化促進装置１００は、高分子化合物の結晶化促進におけるレーザー偏光モード依存性に対応するための偏光モード切替機構を備えたものである。
【００９２】
即ち、高分子化合物においては、レーザーの偏光モードが直線偏光であるか円偏光であるかによって、結晶化状態が異なることが知られている。例えば、尿素の場合では、直線偏光においては分子は長手方向に伸張して異方性を持って整列し、一方、円偏光においては分子は伸張しない状態が得られる。
【００９３】
このため、高分子化合物結晶化促進装置１００においては、タンパク質を含む種々の高分子化合物結晶化促進に対応するために、直線偏光と円偏光とを切換えることができる機構が配設されている。
【００９４】
即ち、高分子化合物結晶化促進装置１００は、直線偏光モードのフェムト秒レーザービームを出力するフェムト秒レーザービーム発振器１０２を備え、フェムト秒レーザービーム発振器１０２から出力されたフェムト秒レーザービームをフィルタリングするレーザーラインフィルター１０４と、レーザーラインフィルター１０２から出力されたフェムト秒レーザービームのビーム径を拡大するビームエクスパンダー１０６とを有しており、ビームエクスパンダー１０６によりビーム径を拡大されたフェムト秒レーザービームが、パルスピッカー１８へ入力されるようになされている。
【００９５】
そして、パルスピッカー１８、デジタルマイクロミラーデバイス２０を経由して出力されたフェムト秒レーザービームは、ダイクロイックミラー１０８により反射されて、ダイクロイックミラー１０８により反射されたパルスレーザービームの光路上に挿脱自在に配置された１／４波長板１１０へ入射される。この１／４波長板１１０は、パーソナルコンピューター２２によって制御されるモーター（図示せず。）によって駆動されて、ダイクロイックミラー１０８により反射されたパルスレーザービームの光路上に挿入されたり、あるいは、ダイクロイックミラー１０８により反射されたパルスレーザービームの光路上から排除されたりする。
【００９６】
なお、符号１１２は、ダイクロイックミラー１０８を透過した液滴１２の画像を観察するためのＣＣＤカメラであり、また、符号１１４は、ダイクロイックミラー１０８を透過した液滴１２からの反射光をＣＣＤカメラ１１２へ集光するための集光レンズである。
【００９７】
以上の構成において、１／４波長板１１０がダイクロイックミラー１０８により反射されたパルスレーザービームの光路上に挿入されている場合には、液滴１２へ照射されるフェムト秒レーザービームの偏光モードは直線偏光から円偏光に変換される。一方、１／４波長板１１０がダイクロイックミラー１０８により反射されたパルスレーザービームの光路上に挿入されていない場合には、液滴１２へ照射されるフェムト秒レーザービームの偏光モードは直線偏光のまま維持される。
【００９８】
従って、高分子化合物結晶化促進装置１００によれば、偏光モードを直線偏光と円偏光とに適宜変更して、液滴１２へフェムト秒レーザービームを照射することができるので、高分子化合物の結晶化促進におけるレーザー偏光モード依存性に対応してフェムト秒レーザービームを照射することができるようになる。
【００９９】
なお、上記した実施の形態は、以下の（１）乃至（６）に示すように変形することができるものである。
【０１００】
（１）上記した実施の形態においては、高分子化合物としてタンパク質を例示して示したが、高分子化合物はタンパク質に限られるものではないことは勿論であり、本発明は、樹脂、糖類、脂質あるいは核酸などのような種々の生理活性機能を有する物質の結晶化促進に用いることができる。
【０１０１】
（２）上記した実施の形態においては、パルスレーザーとしてフェムト秒レーザーを例示して示したが、パルスレーザーはフェムト秒レーザーに限られるものではないことは勿論であり、例えば、ナノ秒パルスレーザーやピコ秒パルスレーザーなどの短パルスレーザーを用いることができる。
【０１０２】
（３）上記した実施の形態においては、シャッター手段をパルスピッカーにより構成し、照射強度制御手段をデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）により構成し、あるいは、偏光制御手段をパルスレーザービームの光路上に挿脱自在に配置された１／４波長板により構成するようにしたが、シャッター手段、照射強度制御手段、偏光制御手段の具体的構成はこれらに限られるものではないことは勿論であり、パルスレーザーの種類などに応じて適宜に変更するようにしてもよい。
【０１０３】
例えば、上記した実施の形態においては、シャッター手段をパルスピッカーにより構成したが、これに代えて、シャッター手段をデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）により構成してもよい。シャッター手段をデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）により構成する場合には、単一のデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）によりシャッター手段と照射強度制御手段とを構成することが可能となり、装置全体の構成を簡略化することができる。
【０１０４】
なお、シャッター手段としてデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を用いた場合には、フェムト秒レーザービームのパルス列を切り出すゲートタイムは、例えば、２μｓ以下であり、シャッター速度は２μｓ以下〜∞のシャッター動作を行うものである。
【０１０５】
（４）上記した実施の形態においては、結晶化プレート容器として、蒸気拡散法であるハンギングドロップ法によりタンパク質溶液などの高分子溶液の液滴がセットされるようにしたものを用いたが、これに限られるものではないことは勿論であり、シッティングドロップ法やサンドイッチドロップ法によりタンパク質溶液などの高分子溶液の液滴がセットされるようにした結晶化プレート容器を用いるようにしてもよい。
【０１０６】
（５）上記した実施の形態においては、フェムト秒レーザー発振器の仕様などについて、具体的な数値を挙げて示したが、これらは単に理解を容易にするために示したに過ぎないものであり、本発明は、上記した実施の形態に示した数値に限定されるものではない。
【０１０７】
（６）上記した実施の形態ならびに上記した（１）乃至（５）に示す変形例は、適宜に組み合わせるようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明は、タンパク質をはじめとして、糖類、樹脂、脂質あるいは核酸などの結晶を生成する際に利用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１（ａ）（ｂ）は本発明による高分子化合物結晶化促進装置の第１の実施の形態を示し、図１（ａ）は高分子化合物結晶化促進装置の概念構成説明図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ領域を拡大して示した概略断面構成説明図である。
【図２】図２は、フェムト秒レーザー発振器から出力されるフェムト秒レーザービームの出力パルスの模式図である。
【図３】図３は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の概念構成説明図である。
【図４】図４は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の動作原理図である。
【図５】図５（ａ）（ｂ）（ｃ）は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）にアレイ上に配置されたマイクロミラーのオン状態とオフ状態との制御の第１の手法を示す説明図である。
【図６】図６（ａ）（ｂ）（ｃ）は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）にアレイ上に配置されたマイクロミラーのオン状態とオフ状態との制御の第２の手法を示す説明図である。
【図７】図７は、図６（ａ）（ｂ）（ｃ）に示す第２の手法による制御状態を示すグラフであり、縦軸に照射強度をとり、横軸に階調およびオン状態継続時間をとったグラフである。
【図８】図８は、本願発明者の実験結果を示すグラフである。
【図９】図９は、本願発明者の実験結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本願発明者の実験結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本願発明者の実験により得られた結晶の一例の顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、本発明による高分子化合物結晶化促進装置の他の実施の形態の概念構成説明図である。
【符号の説明】
【０１１０】
１０ 高分子化合物結晶化促進装置
１２ 液滴
１４ 結晶化プレート容器
１６ フェムト秒レーザー発振器
１８ パルスピッカー
２０ デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ：Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ）
２２ パーソナルコンピューター
２４ 全反射ミラー
２６ 集光レンズ
１００ 高分子化合物結晶化促進装置
１０２ フェムト秒レーザービーム発振器
１０４ レーザーラインフィルター
１０６ ビームエクスパンダー
１０８ ダイクロイックミラー
１１０ １／４波長板
１１２ ＣＣＤカメラ
１１４ 集光レンズ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子化合物結晶化促進装置に関し、さらに詳細には、高分子化合物としてタンパク質の結晶化を促進する際に用いて好適な高分子化合物結晶化促進装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトを含む多くの生物種のＤＮＡ塩基配列の解読が急速に進み、これら大量のゲノム配列情報から抽出される膨大な数の遺伝子について、個々の遺伝子にコードされるタンパク質の立体構造を明らかにして、機能との関係を解明することが重要な課題となってきている。
【０００３】
こうしたタンパク質の立体構造を明らかにする構造ゲノム科学における構造解析の対象となるタンパク質は、ヒトの遺伝子に関して言えば約１０万種類ほどにおよび、その数は極めて多い。
【０００４】
ここで、タンパク質の立体構造は、千種類から数千種類の基本構造単位の組み合わせから形成されており、その組み合わせによって機能の多様性が実現されていると考えられている。このため、これら基本構造単位を全て解明することにより、タンパク質の構造と機能の関係を明らかにすることを目標とした体系的・網羅的な構造解析の研究が鋭意進められている。
【０００５】
一般に、体系的・網羅的な構造解析の研究を効率的に進めていくためには、その構造解析における各工程を高速化・自動化することが要求される。
【０００６】
特に、タンパク質は、変性、分解あるいは吸着などにより失活あるいは損失するものであるため、目的とするタンパク質試料を調製するに際しては、これらの損失を避けながら、できるだけ短時間に効率良く一連の操作を行うことが望ましいものであり、構造解析における各工程の高速化・自動化は火急の課題となっている。
【０００７】
ところで、タンパク質の構造解析の手法の一つとしてＸ線法が知られているが、このＸ線法においては、目的とするタンパク質を精製・濃縮した後に結晶化し、その結晶化したタンパク質を測定用試料として用いるため、タンパク質の結晶化を短時間かつ高効率で行うことが要求されていた。
【０００８】
ここで、Ｘ線法による構造解析の測定用試料として用いることのできるタンパク質結晶を調製する際に用いるタンパク質の結晶化の手法としては、蒸気拡散法の一種であるハンギングドロップ法が一般に広く用いられている。
【０００９】
このハンギングドロップ法とは、沈殿剤を混合したタンパク質溶液をカバーグラスの上に滴下し、当該カバーグラスを液滴がぶら下がる状態に引っ繰り返して予め沈殿剤などを充填した結晶化プレートのウェルに封じ固定し、これを２０℃以下に一定時間保存するという手法である。
【００１０】
上記したハンギングドロップ法によれば、カバーグラスに付着した液滴は自然拡散し、これにより目的とするタンパク質が結晶成長して、Ｘ線法による構造解析の測定用試料として用いることのできるタンパク質結晶を得ることができるものである。
【００１１】
なお、Ｘ線法による構造解析の測定用試料として用いることのできるタンパク質結晶を得る際に、上記したハンギングドロップ法以外によく用いられている手法としては、例えば、シッティングドロップ法などが知られている。
【００１２】
ところが、このような従来のハンギングドロップ法やシッティングドロップ法によれば、タンパク質をＸ線法による構造解析に適した結晶にまで成長させるには長時間を要するとともに、結晶化の効率が劣りその歩留まりは非常に低いという問題点があった。
【００１３】
即ち、ハンギングドロップ法やシッティングドロップ法は、沈殿剤の濃度や分子量などとタンパク質の特性とが最適になった条件（最適条件）下においてのみ構造解析に適した結晶が析出されるものであり、かつ、析出までに数十時間から数週間と時間がかかるものであった。
【００１４】
さらに、ハンギングドロップ法やシッティングドロップ法により新規なタンパク質の結晶を得る場合には、上記したような最適条件を得るまでに、一つのタンパク質に対して、例えば、約１００種類以上の沈殿剤などを手作業で組み合わせる必要があり、より一層作業時間を要するものとなっていた。
【００１５】
近年、こうしたＸ線法による構造解析に適した結晶にまで成長させるには長時間を要するというハンギングドロップ法やシッティングドロップ法に対して、タンパク質溶液にレーザービームを照射することにより結晶化を促進するという手法が報告されている（非特許文献１および非特許文献２参照）。
【００１６】
しかしながら、上記非特許文献１および非特許文献２に開示された手法によれば、結晶化を促進するためのレーザービームの照射条件が異なる各種のタンパク質に対して効率よく作業することが困難であり、汎用性に欠けるという問題点があった。
【００１７】
例えば、新規なタンパク質については、その結晶化を促進するためのレーザービームの照射条件が不明であるため、照射条件を種々に変更してレーザービームを照射する必要があるが、上記非特許文献１および非特許文献２に開示された手法では、照射条件を種々に変更してレーザービームを照射することについては何らの考慮も払われておらず、こうした作業を効率よく行うことができないという問題点があった。
【非特許文献１】Ｈ．Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ， Ｌａｓｅｒ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ． Ｖｏｌ．４２， Ｎｏ．７Ｂ， ｐｐ．Ｌ７９８−Ｌ８００ （２００３）
【非特許文献２】Ｈ．Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ， Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｌａｓｅｒ Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ， Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ． Ｖｏｌ．４３， Ｎｏ．１０Ｂ， ｐｐ．Ｌ１３７６−Ｌ１３７８（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、従来の技術の有する上記したような種々の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、タンパク質などの高分子化合物の結晶化を促進して、従来に比して短時間でタンパク質などの高分子化合物の結晶を得ることができるようにするとともに、結晶化の効率を向上させてその歩留まりを高めた高分子化合物結晶化促進装置を提供しようとするものである。
【００１９】
また、本発明の目的とするところは、結晶化工程における作業性の向上を図り、結晶化を促進するためのレーザービームの照射条件が異なる各種のタンパク質などの高分子化合物に対しても、効率よく作業することが可能な汎用性に優れた高分子化合物結晶化促進装置を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記目的を達成するために、本発明は、所定のパルス列に制御して切り出されたパルスレーザービームや所定の照射強度に制御されたパルスレーザービームをタンパク質溶液などの高分子化合物溶液の液滴に照射して、タンパク質などの高分子化合物の結晶成長を促進するようにしたものである。
【００２１】
従って、本発明によれば、結晶化を促進するためのレーザービームの照射条件が異なる各種のタンパク質などの高分子化合物や新規なタンパク質などの高分子化合物に対しても、パルス列や照射強度を制御することにより照射条件を変化させてレーザービームを照射することが可能となる。
【００２２】
このため、本発明によれば、従来に比して短時間でタンパク質などの高分子化合物の結晶を得ることができるようになり、結晶化の効率を向上させてその歩留まりを高め、構造解析のハイスループット化を図ることが可能となる。
【００２３】
また、本発明によれば、結晶化工程における作業性の向上を図ることができ、結晶化を促進するためのレーザービームの照射条件が異なる各種のタンパク質などの高分子化合物に対しても効率よく作業することが可能となり、本発明は極めて汎用性に優れている。
【００２４】
つまり、本発明によれば、タンパク質などの高分子化合物の結晶化の工程における作業効率が飛躍的に向上し、短時間処理が可能となる。
【００２５】
即ち、本発明のうち請求項１に記載の発明は、高分子化合物溶液の液滴に対してパルスレーザービームを照射して高分子化合物の結晶化を促進する高分子化合物結晶化促進装置において、パルスレーザービームを出力するパルスレーザービーム出力手段と、上記レーザー発振器から出力されたパルスレーザービームを所定のパルス列に制御して切り出すシャッター手段とを有し、上記シャッター手段によって切り出されたパルスレーザービームのパルス列を高分子化合物溶液の液滴に対して照射するようにしたものである。
【００２６】
また、本発明のうち請求項２に記載の発明は、本発明のうち請求項１に記載の発明において、上記シャッター手段は、パルスピッカーまたはデジタルマイクロミラーデバイスであるようにしたものである。
【００２７】
また、本発明のうち請求項３に記載の発明は、本発明のうち請求項１または２のいずれか１項に記載の発明において、さらに、上記パルスレーザービームの上記液滴への照射強度を所定の照射強度に制御する照射強度制御手段を有するようにしたものである。
【００２８】
また、本発明のうち請求項４に記載の発明は、本発明のうち請求項３に記載の発明において、上記照射強度制御手段は、デジタルマイクロミラーデバイスであるようにしたものである。
【００２９】
また、本発明のうち請求項５に記載の発明は、本発明のうち請求項１、２、３または４のいずれか１項に記載の発明において、さらに、上記パルスレーザービームの偏光を所定の偏光に制御する偏光制御手段を有するようにしたものである。
【００３０】
また、本発明のうち請求項６に記載の発明は、本発明のうち請求項５に記載の発明において、上記偏光制御手段は、上記パルスレーザービームの光路上に挿脱自在に配置された１／４波長板であるようにしたものである。
【００３１】
また、本発明のうち請求項７に記載の発明は、本発明のうち請求項１、２、３、４、５または６のいずれか１項に記載の発明において、上記高分子化合物は、タンパク質であるようにしたものである。
【００３２】
また、本発明のうち請求項８に記載の発明は、本発明のうち請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれか１項に記載の発明において、上記液滴は、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法またはサンドイッチドロップ法を実施する容器内に配置されたものである。
【００３３】
また、本発明のうち請求項９に記載の発明は、本発明のうち請求項１、２、３、４、５、６、７または８のいずれか１項に記載の発明において、上記パルスレーザービーム出力手段は、モード同期フェムト秒パルスレーザービームを出力するフェムト秒レーザ発振器であるようにしたものである。
【発明の効果】
【００３４】
本発明は、以上説明したように構成されているので、タンパク質などの高分子化合物の結晶化が促進され、従来に比して短時間でタンパク質などの高分子化合物の結晶を得ることができるようになるとともに、結晶化の効率が向上してその歩留まりが高まるという優れた効果を奏する。
【００３５】
また、本発明は、以上説明したように構成されているので、結晶化工程における作業性の向上が図られ、結晶化を促進するためのレーザービームの照射条件が異なる各種のタンパク質などの高分子化合物に対しても効率のよい作業を行うことを可能とするものであって、極めて汎用性に優れているという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、添付の図面を参照しながら、本発明による高分子化合物結晶化促進装置の実施の形態の一例を詳細に説明するものとする。
【００３７】
図１（ａ）（ｂ）には、本発明による高分子化合物結晶化促進装置の第１の実施の形態が示されている。なお、図１（ａ）は高分子化合物結晶化促進装置の概念構成説明図であり、また、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ領域を拡大して示した概略断面構成説明図である。
【００３８】
この高分子化合物結晶化促進装置１０は、蒸気拡散法であるハンギングドロップ法によりタンパク質溶液などの高分子溶液の液滴１２がセットされた結晶化プレート容器１４と、パルスレーザービームを出力するパルスレーザービーム出力手段としてモード同期フェムト秒パルスレーザービームを出力するフェムト秒レーザー発振器１６と、フェムト秒レーザー発振器１６から出力されたフェムト秒レーザービームのパルス列を間引くことによって当該フェムト秒レーザービームのパルス列を切り出すシャッター機能と当該シャッター機能のシャッター速度を制御する機能と当該フェムト秒レーザービームのパルス列の繰り返し周波数を可変する機能とを備えたシャッター手段としてのパルスピッカー１８と、パルスピッカー１８から出力されたフェムト秒レーザービームの液滴１２への照射強度を制御して当該照射強度を結晶成長のための最適値に調整する照射強度制御手段としてのデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ：Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ）２０と、パルスピッカー１８とデジタルマイクロミラーデバイス２０とをシステム化して自動制御するパーソナルコンピューター２２と、デジタルマイクロミラーデバイス２０から出力されたフェムト秒レーザービームを所定の方向に反射する全反射ミラー２４と、全反射ミラー２４から出力されたフェムト秒レーザービームを結晶化プレート容器１４にセットされた液滴１２のなかで結晶化すべき対象の液滴１２に一点集光する集光手段としての集光レンズ２６とを有して構成されている。
【００３９】
以下に、上記した高分子化合物結晶化促進装置１０の各構成について詳細に説明すると、まず、結晶化プレート容器１４は、従来より公知のものを適宜に選択して用いることが可能であるが、一度に高分子溶液の液滴１２を複数セットすることができるものが好ましい。
【００４０】
次に、フェムト秒レーザー発振器１６は、例えば、パルス幅が１７０ｆｓであり、出力パワーが１．１Ｗであり、波長が１０６０ｎｍであり、繰り返し周波数が５０ＭＨｚであるものを用いることができる。なお、図２には、フェムト秒レーザー発振器１６から出力されるフェムト秒レーザービームの出力パルスの模式図が示されている。
【００４１】
次に、パルスピッカー１８は、従来より公知のものを適宜に選択して用いることが可能であるが、フェムト秒レーザービームのパルス列を切り出すシャッター機能と、当該シャッター機能のシャッター速度を制御する機能と、当該フェムト秒レーザービームのパルス列の繰り返し周波数を可変する機能とを備えるように構成する。
【００４２】
より詳細には、このパルスピッカー１８は、フェムト秒レーザ発振器１６から出力されたフェムト秒レーザービームのパルス列を切り出すゲートタイムがｎｓオーダーであって、１パルス〜∞パルスまで任意に切り出す、即ち、シャッターとして動作することができるようになされているものであって、シャッター速度がｎｓオーダー〜∞のシャッター動作を行うものである。これにより、フェムト秒レーザービームの所要のパルス列が得られることになる。
【００４３】
また、パルスピッカー１８は、パルス列の繰り返し周波数を４Ｈｚ〜４ＭＨｚの範囲で可変できるようになされているとともに、さらに照射回数を０〜４０００００ショットまで可変できるようになされている。なお、これらの制御は、パーソナルコンピューター２２により実行される。
【００４４】
従って、こうしたパルスピッカー１８を用いることにより、高分子化合物溶液の液滴１２へ照射されるフェムト秒レーザービームの照射条件を任意に制御できることになり、多種類のタンパク質などのような種々の高分子化合物に対してそれぞれ最適な照射条件を設定することができるようになる。
【００４５】
次に、図３に示すデジタルマイクロミラーデバイス２０の概念構成説明図ならびに図４に示すデジタルマイクロミラーデバイス２０の動作原理図を参照しながら、デジタルマイクロミラーデバイス２０について説明する。
【００４６】
デジタルマイクロミラーデバイス２０は、図３に示すように、ＸＹ平面上において、パーソナルコンピューター２２により制御されるＸアドレス指定手段２０ａとＹアドレス指定手段２０ｂとによりそれぞれ指定されるＸアドレスとＹアドレスとの交点である各ＸＹ座標上に、マイクロミラー２０ｃをアレイ状にそれぞれ配設して構成されている。なお、このようにアレイ状に配設された多数のマイクロミラー２０ｃのそれぞれをミラーピクセル（ｍｉｒｒｏｒ ｐｉｘｅｌ）と称する。
【００４７】
デジタルマイクロミラーデバイス２０が、例えば、プロジェクションディスプレイなどで用いられている０．７インチ型で１０２４×７６８ピクセル搭載のものと同様な構成の場合には、マイクロミラー２０ｃはＸアドレス上に１０２４個配置されるともにＹアドレス上に７６８個配置されるように構成されており、全部で７８６４３２（１０２４×７６８＝７８６４３２（ピクセル：ｐｉｘｅｌｓ））個配置されている。
【００４８】
こうしたデジタルマイクロミラーデバイス２０は、半導体を用いたマイクロマシニング技術により製造することができるものであり、各マイクロミラー２０ｃは回転軸（図示せず。）にそれぞれ固定されている。そして、デジタルマイクロミラーデバイス２０は、パーソナルコンピューター２２の制御によってＸアドレス指定手段２０ａとＹアドレス指定手段２０ｂとにより指定されるＸＹ座標上のミラーピクセルたるマイクロミラー２０ｃのみを、駆動手段（図示せず。）によって初期位置から回転軸を回転中心として所定の角度α（αは、例えば、ｌ２゜である。）だけ回転することができるように設定されている（図４を参照する。）。
【００４９】
なお、図４においては、初期位置にあるマイクロミラー２０ｃを実線で示し、所定の角度αだけ回転した状態のマイクロミラー２０ｃを破線で示している。
【００５０】
ここで、図４に示すように、デジタルマイクロミラーデバイス２０には斜めから光が入射するように光の入射方向が設定されており、ＸＹアドレスにより選択されたマイクロミラー２０ｃが初期位置から１２゜回転した状態がオン（ＯＮ）状態であり、デジタルマイクロミラーデバイス２０に入射した光は、デジタルマイクロミラーデバイス２０内に配置された集光レンズ２０ｄを通して照射光としてデジタルマイクロミラーデバイス２０の外部へ導出される。一方、マイクロミラー２０ｃが初期位置にある状態がオフ（ＯＦＦ）状態であり、デジタルマイクロミラーデバイス２０に入射した光は、デジタルマイクロミラーデバイス２０内に配置された光吸収板２０ｅに吸収されて、デジタルマイクロミラーデバイス２０の外部へ導出されることはない。
【００５１】
上記した動作原理に基づいて、アレイ上に配置された各マイクロミラー２０ｃのオン状態とオフ状態とを適宜に選択することにより、デジタルマイクロミラーデバイス２０から外部へ導出可能な照射光の出力状態、即ち、照射強度を、全てのマイクロミラー２０ｃをオン状態とした最大出力状態（デジタルマイクロミラーデバイス２０の１００％の出力状態である。）から全てのマイクロミラー２０ｃをオフ状態として外部へ照射光を全く出力しない状態（デジタルマイクロミラーデバイス２０の０％の出力状態である。）までの間で適宜に制御することができる。
【００５２】
即ち、デジタルマイクロミラーデバイス２０においては、アレイ状に配列された、例えば、７８６４３２個の各マイクロミラー２０ｃを傾斜するか否か、即ち、オン状態とするかオフ状態とするかを選択することにより、デジタルマイクロミラーデバイス２０に入射された光の経路を変化させることができるものであり、この動作原理を応用して、デジタルマイクロミラーデバイス２０に入射したフェムト秒レーザービームを０〜１００％の任意の照射強度でデジタルマイクロミラーデバイス２０の外部へ出力することができる。
【００５３】
従って、従来の減光フィルター（ＮＤフィルター）の装着による照射強度の調整に比べて、任意の光照射強度を容易に設定することができる。
【００５４】
ここで、アレイ上に配置された各マイクロミラー２０ｃのオン状態とオフ状態とは、例えば、以下に説明する２通りの手法により制御することができる。
【００５５】
まず、第１の手法は、図５（ａ）（ｂ）（ｃ）に示す、所謂、チェッカーボードパターンによるマイクロミラー２０ｃのオン状態とオフ状態との制御方法である。
【００５６】
この図５（ａ）（ｂ）（ｃ）に示す第１の手法においては、所望の照射強度に応じてオン状態のマイクロミラー２０ｃの数とオフ状態のマイクロミラー２０ｃの数とを設定するものである。
【００５７】
即ち、照射強度を１００％としたい場合には、全てのマイクロミラー２０ｃをオン状態とする（図５（ａ）参照）。また、照射強度を５０％としたい場合には、半数のマイクロミラー２０ｃをオン状態とし、残りの半数のマイクロミラー２０ｃをオフ状態とするものであり、その際に、オン状態とオフ状態とが交互に千鳥状に配置されるチェッカーボードパターンとする（図５（ｂ）参照）。さらに、照射強度を０％としたい場合には、全てのマイクロミラー２０ｃをオフ状態とする（図５（ｃ）参照）。なお、上記以外の照射強度を設定する際には、オン状態のマイクロミラー２０ｃの数とオフ状態のマイクロミラー２０ｃの数とを照射強度に応じて調整することにより、所望の照射強度を得ることができるものであり、その際に、オン状態のマイクロミラー２０ｃとオフ状態のマイクロミラー２０ｃとがなるべく交互に配置されるようにする。
【００５８】
次に、図６（ａ）（ｂ）（ｃ）ならびに図７を参照しながら、第２の手法について説明すると、この第２の手法は、全てのマイクロミラー２０ｃのオン状態とオフ状態とを２５６段階の階調に応じて制御するという方法である。
【００５９】
即ち、全てのマイクロミラー２０ｃをオン状態とした状態において、照射強度を１００％と定義する全てのマイクロミラー２０ｃのオン状態継続時間（以下、単に「オン状態継続時間」と称する。）を時間Ｔとして予め設定するとともに、全てのマイクロミラー２０ｃがオフ状態とされたとき、即ち、オン状態継続時間が０の場合を照射強度０％と定義しておき、この時間Ｔを２５６段階の分解能で制御することにより、画像処理における２５６階調のグレースケールと同様に２５６通りの照射強度が簡単に得られるようになる。
【００６０】
図７には、縦軸に照射強度をとり、かつ、横軸に階調およびオン状態継続時間をとったグラフが示されているが、このグラフに示されているように、オン状態継続時間を変化することにより、照射時間をリニアに変化することができる。
【００６１】
つまり、照射強度を１００％としたい場合には、全てのマイクロミラー２０ｃをオン状態とするとともにオン状態継続時間を時間Ｔとする（図６（ａ）参照）。また、照射強度を５０％としたい場合には、全てのマイクロミラー２０ｃをオン状態とするとともにオン状態継続時間を時間Ｔ／２とする（図６（ｂ）参照）。さらに、照射強度を０％としたい場合には、全てのマイクロミラー２０ｃをオフ状態としてオン状態継続時間を０とする（図６（ｃ）参照）。なお、上記以外の照射強度を設定する際には、図７に示すように照射強度に応じてオン状態継続時間を調整することにより、所望の照射強度を得ることができる。
【００６２】
従って、デジタルマイクロミラーデバイス２０によれば、レーザービームの出力側に偏光板や減光フィルタを挿入するという従来の照射強度を可変する手法と比較すると、非常に簡単な方法と構造とにより照射強度を任意に可変することができる。
【００６３】
なお、上記した第１の手法ならびに第２の手法の制御は、パーソナルコンピューター２２により実行される。
【００６４】
次に、パルスピッカー１８によりパルス列を切り出されるとともにデジタルマイクロミラーデバイス２０により照射強度を制御されたフェムト秒レーザービームを、高分子化合物溶液の液滴１２へ一点集光する照射手法について説明する。
【００６５】
上記したように、高分子化合物結晶化促進装置１０においては、フェムト秒レーザービームを高分子化合物溶液の液滴１２へ集光する集光手段として、集光レンズ２６がデジタルマイクロミラーデバイス２０の後段に配設されている。この集光レンズ２６としては、この実施の形態においては、倍率が２０倍であってＮＡが０．７の高倍率・高開口数対物レンズを用いている。こうした集光レンズ２６を持つ光学系を用いて、フェムト秒レーザービームを絞り込み、単位面積当りのレーザービームの照射強度としてＧＷ／ｃｍ２オーダーの値を得ることができるようになされている。
【００６６】
以上の構成において、高分子化合物結晶化促進装置１０により、高分子化合物として、例えば、目的のタンパク質を精製・濃縮して結晶を生成するには、まず、種々の沈殿剤３０を調製し、結晶化プレート容器１４のウェル１４ａに注入する。
【００６７】
次に、上記のタンパク質の溶液をピペッティングで結晶化プレート容器１４のカバーグラス１４ｂに滴下して液滴１２を形成する。それから、カバーグラス１４ｂを液滴１２がぶら下がる状態に引っ繰り返して予め沈殿剤３０を充填したウェル１４ａに被せ、カバーグラス１４ｂとウェル１４ａとをグリースにより封じる。
【００６８】
上記したような準備の後に、タンパク質の液滴１２に対して、フェムト秒レーザー発振器１６により出力されたフェムト秒レーザービームのパルス列をパルスピッカー１８、デジタルマイクロミラーデバイス２０、全反射ミラー２４ならびに集光レンズ２６を介して照射する。
【００６９】
即ち、フェムト秒レーザ発振器１６から出力されたモード同期フェムト秒パルスレーザービームは、そのパルス列をパルスピッカー１８により切り出されてパルス列の繰り返し周波数やショット数（照射回数）が調整され、それからデジタルマイクロミラーデバイス２０により照射強度を調整された後に集光レンズ２６へ入射され、液滴１２に対して１点集光されて照射される。
【００７０】
従って、この高分子化合物結晶化促進装置１０においては、最適な結晶化促進条件を得るために、パルスレーザービームのパルス列の繰り返し周波数、ショット数あるいは照射強度を極めて容易に調整することができる。
【００７１】
ここで、図８ならびに図９には、高分子化合物結晶化促進装置１０を用いて、高分子化合物溶液として、
・タンパク質：Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、 濃度５０ｍｇ／ｍｌ
・緩衝溶液：ＨＥＰＥＳ ０．１Ｍ、ｐＨ７．３
・ＮａＣｌ：０．２Ｍ
のタンパク質溶液の液滴１２から結晶を析出した本願発明者の実験結果が示されている。
【００７２】
この実験においては、デジタルマイクロミラーデバイス２０により制御されるフェムト秒レーザービームの液滴１２への照射強度は２２０ＧＷ／ｃｍ２であり、これを照射強度１００％としてその状態を維持し、パルスピッカー１８により制御されるシャッターの周波数（Ｈｚ）とショット（ｓｈｏｔ）数とを変化させ、複数のサンプルにフェムト秒レーザービームを照射し、これらのサンプルから結晶が析出されたサンプル数を計数した。
【００７３】
なお、図８には、パルスピッカー１８により制御されるシャッターの周波数（Ｈｚ）とショット（ｓｈｏｔ）数とに関して結晶化されたサンプル数を示す実験結果の測定値が示されている。また、図９は、図８に対応する図表であって、図８の測定値について、実験したサンプル数に対する結晶化されたサンプル数の割合を百分率で示したものである。
【００７４】
一方、図１０には、パルスピッカー１８により繰り返し周波数を４ＭＨｚに固定するとともにショット数を４０００ショットに固定し、デジタルマイクロミラーデバイス２０により制御されるフェムト秒レーザービームの液滴１２への照射強度を変化させた実験の実験結果が示されており、デジタルマイクロミラーデバイス２０により制御されるフェムト秒レーザービームの液滴１２への照射強度と実際の結晶化確率との関係を示すグラフが示されている。
【００７５】
ここで、この実験においては、照射強度２２０ＧＷ／ｃｍ２を照射強度１００％として示しており、また、タンパク質溶液などのその他の実験条件は上記と同じであって、複数のサンプルにフェムト秒レーザービームを照射し、これらのサンプルから結晶が析出されたサンプル数を計数した。
【００７６】
これら図８乃至図１０に示す本願発明者の実験結果から明らかなように、結晶化、即ち、結晶析出の促進には最適な条件が存在するものである。
【００７７】
つまり、タンパク質分子は、レーザービーム照射のような外部エネルギーを印加しない場合にはランダムな方向に散在している。ところが、タンパク質分子の電子励起エネルギーを超えるようなレーザービームを照射した場合には、当該タンパク質分子は異方性を持ち、当該タンパク質分子はある一定の方向に配向する。この場合、レーザービームの照射により、タンパク質分子には熱エネルギーが蓄積される。
【００７８】
ここで、もし、タンパク質分子に蓄積された熱エネルギーが十分放散される時間間隔を保って、再度レーザービームの行うならば、タンパク質分子は更に異方性を持ち、その結果、結晶核が生成されて結晶が析出される。
【００７９】
このように、パルスレーザービーム、特に、フェムト秒レーザービームなどのような短パルスレーザビームの照射がタンパク質の結晶析出に有効である。また、結晶核の生成過程や結晶析出過程においては、結晶核や析出した結晶を損傷しない程度の熱エネルギー、即ち、照射強度範囲とパルス数が存在する。
【００８０】
上記した本願発明者の実験においては、照射強度２２０ＧＷ／ｃｍ２、繰り返し周波数０．４ＭＨｚ、４０００ショットが結晶析出に有効であった。
【００８１】
図１１には、上記した実験に使用したタンパク質溶液の液滴１２に対して、フェムト秒レーザービームを照射強度２２０ＧＷ／ｃｍ２、繰り返し周波数０．４ＭＨｚ、４０００ショットで照射した際に得られた結晶の一例の顕微鏡写真が示されている。
【００８２】
なお、集光レンズ２６を介して液滴１２に照射されたフェムト秒レーザービームの照射強度は、以下のようにして計算した。
【００８３】
集光レンズ２６を取り外してステージ上でレーザー出力を測定した値：３００ｍＷ
集光レンズ２６の波長１０６０ｎｍのフェムト秒レーザービームの透過率：約６０％
集光レンズ２６下でのレーザー出力：３００ｍＷ×０．６＝１８０ｍＷ
フェムト秒レーザー発振器１６のパラメータ
繰り返し周波数：５０ＭＨｚ
パルス幅：２００ｆｓ
ピーク波長：１０６０ｎｍ
なお、フェムト秒レーザー発振器１６から出力されるフェムト秒レーザービームのパルス幅１７０ｆｓであるが、パルスピッカー１８、デジタルマイクロミラーデバイス２０、全反射ミラー２４および集光レンズ２６を通過するため２００ｆｓに広がると見積もった。
【００８４】
単位パルスあたりのエネルギー：１８０ｍＷ／５０ＭＨｚ＝３．２ｎＪ
単位パルスあたりのパワー：３．２ｎＪ／０．２ｐｓ＝１８ｋＷ＝１８×１０−６ＧＷ ・・・ 式１
集光レンズ２６の倍率は２０倍で、ＮＡ＝０．４の場合、焦点を結んだときにフェムト秒レーザービームが照射される面積は、以下のようになる。
【００８５】
ビームスポット径：１．２２×１０６０ｎｍ／０．４＝３２３３ｎｍ＝３．２μｍ
ビームの照射面積：１．６μｍ×１．６μｍ×π＝８．０４μｍ２＝８．０４×１０−８ｃｍ２ ・・・ 式２
上記の式１および式２より、
サンプル上での１パルス当たりのパワー密度：１８／８．０４×１０２ＧＷ／ｃｍ２
となる。
【００８６】
上記したように、この高分子化合物結晶化促進装置１０によれば、パルスピッカー１８によるパルスの切り出しの可変制御ならびに繰り返し周波数の可変制御、デジタルマイクロミラーデバイス２０による照射強度の可変制御あるいは集光レンズ２６による液滴１２の一点集光などによって、タンパク質分子に超短時間で大照射強度のフェムト秒レーザービームを照射することができ、その結果、結晶核が生成され、かつ、タンパク質分子内におけるフェムト秒レーザービームによる熱エネルギーを効率良く放散することができるので、蓄積熱による生成結晶核の損傷なしに、タンパク質分子の配向を行い、析出された結晶成長を促進する。
【００８７】
即ち、高分子化合物結晶化促進装置１０によれば、結晶化促進条件を任意に変えることができ、種々のタンパク質溶液を容易に結晶化することができるようになる。
【００８８】
つまり、高分子化合物結晶化促進装置１０を用いると、結晶成長まで長時間要することなく、タンパク質溶液を結晶化することが可能となり、構造解析用試料供給に要する時間を著しく短縮することが可能となる。
【００８９】
一方、引用文献１または引用文献２に開示された技術では、倍率が１０倍でありＮＡが０．４の対物レンズを用いており、単位面積当りの照射強度は高くない。また、シャッター機能も備えておらず、２００ｆｓ、１ＫＨｚ固定の繰り返しパルスを照射している。従って、タンパク質分子の配向を任意に制御することはできず、種々のタンパク質溶液を結晶化することもできない。
【００９０】
次に、図１２には、本発明による高分子化合物結晶化促進装置の他の実施の形態の概念構成説明図が示されている。なお、図１に示す構成と同一または相当する構成には、図１に示す構成と同一の符号を付して示すことにより、その重複する説明は適宜に省略するものとする。
【００９１】
この高分子化合物結晶化促進装置１００は、高分子化合物の結晶化促進におけるレーザー偏光モード依存性に対応するための偏光モード切替機構を備えたものである。
【００９２】
即ち、高分子化合物においては、レーザーの偏光モードが直線偏光であるか円偏光であるかによって、結晶化状態が異なることが知られている。例えば、尿素の場合では、直線偏光においては分子は長手方向に伸張して異方性を持って整列し、一方、円偏光においては分子は伸張しない状態が得られる。
【００９３】
このため、高分子化合物結晶化促進装置１００においては、タンパク質を含む種々の高分子化合物結晶化促進に対応するために、直線偏光と円偏光とを切換えることができる機構が配設されている。
【００９４】
即ち、高分子化合物結晶化促進装置１００は、直線偏光モードのフェムト秒レーザービームを出力するフェムト秒レーザービーム発振器１０２を備え、フェムト秒レーザービーム発振器１０２から出力されたフェムト秒レーザービームをフィルタリングするレーザーラインフィルター１０４と、レーザーラインフィルター１０２から出力されたフェムト秒レーザービームのビーム径を拡大するビームエクスパンダー１０６とを有しており、ビームエクスパンダー１０６によりビーム径を拡大されたフェムト秒レーザービームが、パルスピッカー１８へ入力されるようになされている。
【００９５】
そして、パルスピッカー１８、デジタルマイクロミラーデバイス２０を経由して出力されたフェムト秒レーザービームは、ダイクロイックミラー１０８により反射されて、ダイクロイックミラー１０８により反射されたパルスレーザービームの光路上に挿脱自在に配置された１／４波長板１１０へ入射される。この１／４波長板１１０は、パーソナルコンピューター２２によって制御されるモーター（図示せず。）によって駆動されて、ダイクロイックミラー１０８により反射されたパルスレーザービームの光路上に挿入されたり、あるいは、ダイクロイックミラー１０８により反射されたパルスレーザービームの光路上から排除されたりする。
【００９６】
なお、符号１１２は、ダイクロイックミラー１０８を透過した液滴１２の画像を観察するためのＣＣＤカメラであり、また、符号１１４は、ダイクロイックミラー１０８を透過した液滴１２からの反射光をＣＣＤカメラ１１２へ集光するための集光レンズである。
【００９７】
以上の構成において、１／４波長板１１０がダイクロイックミラー１０８により反射されたパルスレーザービームの光路上に挿入されている場合には、液滴１２へ照射されるフェムト秒レーザービームの偏光モードは直線偏光から円偏光に変換される。一方、１／４波長板１１０がダイクロイックミラー１０８により反射されたパルスレーザービームの光路上に挿入されていない場合には、液滴１２へ照射されるフェムト秒レーザービームの偏光モードは直線偏光のまま維持される。
【００９８】
従って、高分子化合物結晶化促進装置１００によれば、偏光モードを直線偏光と円偏光とに適宜変更して、液滴１２へフェムト秒レーザービームを照射することができるので、高分子化合物の結晶化促進におけるレーザー偏光モード依存性に対応してフェムト秒レーザービームを照射することができるようになる。
【００９９】
なお、上記した実施の形態は、以下の（１）乃至（６）に示すように変形することができるものである。
【０１００】
（１）上記した実施の形態においては、高分子化合物としてタンパク質を例示して示したが、高分子化合物はタンパク質に限られるものではないことは勿論であり、本発明は、樹脂、糖類、脂質あるいは核酸などのような種々の生理活性機能を有する物質の結晶化促進に用いることができる。
【０１０１】
（２）上記した実施の形態においては、パルスレーザーとしてフェムト秒レーザーを例示して示したが、パルスレーザーはフェムト秒レーザーに限られるものではないことは勿論であり、例えば、ナノ秒パルスレーザーやピコ秒パルスレーザーなどの短パルスレーザーを用いることができる。
【０１０２】
（３）上記した実施の形態においては、シャッター手段をパルスピッカーにより構成し、照射強度制御手段をデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）により構成し、あるいは、偏光制御手段をパルスレーザービームの光路上に挿脱自在に配置された１／４波長板により構成するようにしたが、シャッター手段、照射強度制御手段、偏光制御手段の具体的構成はこれらに限られるものではないことは勿論であり、パルスレーザーの種類などに応じて適宜に変更するようにしてもよい。
【０１０３】
例えば、上記した実施の形態においては、シャッター手段をパルスピッカーにより構成したが、これに代えて、シャッター手段をデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）により構成してもよい。シャッター手段をデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）により構成する場合には、単一のデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）によりシャッター手段と照射強度制御手段とを構成することが可能となり、装置全体の構成を簡略化することができる。
【０１０４】
なお、シャッター手段としてデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を用いた場合には、フェムト秒レーザービームのパルス列を切り出すゲートタイムは、例えば、２μｓ以下であり、シャッター速度は２μｓ以下〜∞のシャッター動作を行うものである。
【０１０５】
（４）上記した実施の形態においては、結晶化プレート容器として、蒸気拡散法であるハンギングドロップ法によりタンパク質溶液などの高分子溶液の液滴がセットされるようにしたものを用いたが、これに限られるものではないことは勿論であり、シッティングドロップ法やサンドイッチドロップ法によりタンパク質溶液などの高分子溶液の液滴がセットされるようにした結晶化プレート容器を用いるようにしてもよい。
【０１０６】
（５）上記した実施の形態においては、フェムト秒レーザー発振器の仕様などについて、具体的な数値を挙げて示したが、これらは単に理解を容易にするために示したに過ぎないものであり、本発明は、上記した実施の形態に示した数値に限定されるものではない。
【０１０７】
（６）上記した実施の形態ならびに上記した（１）乃至（５）に示す変形例は、適宜に組み合わせるようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明は、タンパク質をはじめとして、糖類、樹脂、脂質あるいは核酸などの結晶を生成する際に利用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１（ａ）（ｂ）は本発明による高分子化合物結晶化促進装置の第１の実施の形態を示し、図１（ａ）は高分子化合物結晶化促進装置の概念構成説明図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ領域を拡大して示した概略断面構成説明図である。
【図２】図２は、フェムト秒レーザー発振器から出力されるフェムト秒レーザービームの出力パルスの模式図である。
【図３】図３は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の概念構成説明図である。
【図４】図４は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の動作原理図である。
【図５】図５（ａ）（ｂ）（ｃ）は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）にアレイ上に配置されたマイクロミラーのオン状態とオフ状態との制御の第１の手法を示す説明図である。
【図６】図６（ａ）（ｂ）（ｃ）は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）にアレイ上に配置されたマイクロミラーのオン状態とオフ状態との制御の第２の手法を示す説明図である。
【図７】図７は、図６（ａ）（ｂ）（ｃ）に示す第２の手法による制御状態を示すグラフであり、縦軸に照射強度をとり、横軸に階調およびオン状態継続時間をとったグラフである。
【図８】図８は、本願発明者の実験結果を示すグラフである。
【図９】図９は、本願発明者の実験結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本願発明者の実験結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本願発明者の実験により得られた結晶の一例の顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、本発明による高分子化合物結晶化促進装置の他の実施の形態の概念構成説明図である。
【符号の説明】
【０１１０】
１０ 高分子化合物結晶化促進装置
１２ 液滴
１４ 結晶化プレート容器
１６ フェムト秒レーザー発振器
１８ パルスピッカー
２０ デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ：Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ）
２２ パーソナルコンピューター
２４ 全反射ミラー
２６ 集光レンズ
１００ 高分子化合物結晶化促進装置
１０２ フェムト秒レーザービーム発振器
１０４ レーザーラインフィルター
１０６ ビームエクスパンダー
１０８ ダイクロイックミラー
１１０ １／４波長板
１１２ ＣＣＤカメラ
１１４ 集光レンズ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子化合物溶液の液滴に対してパルスレーザービームを照射して高分子化合物の結晶化を促進する高分子化合物結晶化促進装置において、
パルスレーザービームを出力するパルスレーザービーム出力手段と、
前記レーザー発振器から出力されたパルスレーザービームを所定のパルス列に制御して切り出すシャッター手段と
を有し、
前記シャッター手段によって切り出されたパルスレーザービームのパルス列を高分子化合物溶液の液滴に対して照射する
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項２】
請求項１に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、
前記シャッター手段は、パルスピッカーまたはデジタルマイクロミラーデバイスである
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか１項に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、さらに、
前記パルスレーザービームの前記液滴への照射強度を所定の照射強度に制御する照射強度制御手段を有する
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項４】
請求項３に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、
前記照射強度制御手段は、デジタルマイクロミラーデバイスである
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項５】
請求項１、２、３または４のいずれか１項に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、さらに、
前記パルスレーザービームの偏光を所定の偏光に制御する偏光制御手段を有する
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項６】
請求項５に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、
前記偏光制御手段は、前記パルスレーザービームの光路上に挿脱自在に配置された１／４波長板である
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項７】
請求項１、２、３、４、５または６のいずれか１項に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、
前記高分子化合物は、タンパク質である
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項８】
請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれか１項に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、
前記液滴は、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法またはサンドイッチドロップ法を実施する容器内に配置された
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項９】
請求項１、２、３、４、５、６、７または８のいずれか１項に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、
前記パルスレーザービーム出力手段は、モード同期フェムト秒パルスレーザービームを出力するフェムト秒レーザ発振器である
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項１】
高分子化合物溶液の液滴に対してパルスレーザービームを照射して高分子化合物の結晶化を促進する高分子化合物結晶化促進装置において、
パルスレーザービームを出力するパルスレーザービーム出力手段と、
前記レーザー発振器から出力されたパルスレーザービームを所定のパルス列に制御して切り出すシャッター手段と
を有し、
前記シャッター手段によって切り出されたパルスレーザービームのパルス列を高分子化合物溶液の液滴に対して照射する
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項２】
請求項１に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、
前記シャッター手段は、パルスピッカーまたはデジタルマイクロミラーデバイスである
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか１項に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、さらに、
前記パルスレーザービームの前記液滴への照射強度を所定の照射強度に制御する照射強度制御手段を有する
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項４】
請求項３に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、
前記照射強度制御手段は、デジタルマイクロミラーデバイスである
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項５】
請求項１、２、３または４のいずれか１項に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、さらに、
前記パルスレーザービームの偏光を所定の偏光に制御する偏光制御手段を有する
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項６】
請求項５に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、
前記偏光制御手段は、前記パルスレーザービームの光路上に挿脱自在に配置された１／４波長板である
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項７】
請求項１、２、３、４、５または６のいずれか１項に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、
前記高分子化合物は、タンパク質である
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項８】
請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれか１項に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、
前記液滴は、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法またはサンドイッチドロップ法を実施する容器内に配置された
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【請求項９】
請求項１、２、３、４、５、６、７または８のいずれか１項に記載の高分子化合物結晶化促進装置において、
前記パルスレーザービーム出力手段は、モード同期フェムト秒パルスレーザービームを出力するフェムト秒レーザ発振器である
ことを特徴とする高分子化合物結晶化促進装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１１】
【公開番号】特開２００６−３４２０１５（Ｐ２００６−３４２０１５Ａ）
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１６８７８３（Ｐ２００５−１６８７８３）
【出願日】平成１７年６月８日（２００５．６．８）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月８日（２００５．６．８）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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