高分子量の安定なアミロイドβオリゴマーを生成するための組成物および方法
本発明は、安定な可溶性アミロイドβ（Ａβ）オリゴマーの調製のための方法、およびアルツハイマー病および異常なアミロイドβ凝集に関連する他の状態の治療のための抗体の産生のための抗原として使用するその組成物に関する。７．０を超えるｐＨおよび高濃度のＡβを使用するこの方法は、オリゴマーを形成するための、二価アニオンまたはヘリックス誘導溶媒の使用を任意選択で含む。本明細書中の方法によって生成された安定な可溶性Ａβオリゴマーは、動的光散乱技術で測定した場合直径１０〜１００ｎｍの粒子サイズを有し、１００〜５００ｋＤａの分子量を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病および異常なアミロイドβ凝集に関連する他の状態の治療または診断のための抗体の生成のための、抗原またはスクリーニング試薬として使用するための、安定なアミロイドβオリゴマーおよびその組成物の調製のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在限定的な治療しか存在しないアルツハイマー病は、非常に大きな世界的公衆衛生問題を構成している。この疾患は、神経原線維変化およびアミロイド斑の蓄積に関連する進行性の認知症によって特徴付けられ、アミロイド斑は、膜タンパク質前駆体であるアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）からタンパク質分解によって誘導される３９〜４３アミノ酸を含む両親媒性ペプチドであるアミロイドβ（Ａβ）を含む（概説については、Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２４：１１２１−１１５９（２００１）、Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｃｈｅｓｓｅｌｅｔ，Ｍ．Ｆ．編、（２０００）ｐｐ１−４９、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。）。
【０００３】
Ａβの自己会合は、細胞培養物中のニューロンに対する毒性に必要である（Ｐｉｋｅ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５６３：３１１−３１４（１９９１）、Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ａ．およびＹａｎｋｎｅｒ，Ｂ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１２２４３−１２２４７（１９９４）、Ｈｏｗｌｅｔｔ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ４：２３−３２（１９９５））。最初、原線維の形成が毒性種であると考えられていた。しかし、培養物中のニューロンを殺傷するのに必要な原線維Ａβの用量は過剰なようであった（Ｓｅｕｂｅｒｔ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５９：３２５−３２７（１９９２））。引き続く研究により、神経学的機能不全および変性は、Ａβのより小さい可溶性アセンブリ（これは、可溶性オリゴマー（アミロイド由来拡散性リガンド、ＡＤＤＬ）と呼ばれてきた。）に起因し得ることが示されている（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：６４４８−６４５３（１９９８）、Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：８８７６−８８８４（１９９９）、Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２５９４５−２５９５２（１９９９））。特に、可溶性オリゴマーによって誘導される選択的ニューロン変性が実証されている（Ｋｉｍ，Ｈ．−Ｊ．ら、Ｆａｓｅｂ Ｊ．１７（１）：１１８−２０（２００３））。
【０００４】
出願人らは、本明細書中で、高収率での可溶性オリゴマーの調製のための方法およびこの可溶性オリゴマーを安定化する条件を開発した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、Ａβオリゴマーの安定で可溶性の調製物ならびにその組成物および製剤を生成する方法である。この方法は、高濃度のＡβペプチド、７．５を超えるｐＨおよび多価アニオン（例えば、２価アニオンを有する緩衝液）を使用して、Ａβオリゴマーの形成を促進する。さらなる実施形態において、この方法はまた、トリフルオロエタノールおよびグリセロールなどのさらなる添加剤を利用して、オリゴマーの安定性を増強する。
【０００６】
本発明の別の実施形態において、この方法の生成物は、動的光散乱技術によって測定した場合に１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズを有し、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量（Ｍｗ）を有する、安定な可溶性Ａβオリゴマーである。
【０００７】
本発明のなおさらなる実施形態において、この安定な可溶性Ａβオリゴマーは、１０ｎｍ〜５０ｎｍの直径を有し、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａのＭｗを有するオリゴマーの形態で、少なくとも５０％を有するペプチド調製物である。
【０００８】
本発明のなお別の実施形態において、このペプチド調製物は、アルツハイマー病の治療のための治療抗体を生成するために使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
可溶性Ａβオリゴマーの調製のための標準的な手順（「標準プロトコール」）は、Ｆ１２培地（ｐＨ７．４）中４℃で１００μＭまでの濃度での、Ａβペプチドの一晩のインキュベーションを利用する（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：６４４８−６４５３（１９９８）、Ｃｈｒｏｍｙ Ｂ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：１２７４９−１２７６０（２００３）、Ｓｔｉｎｅ Ｗ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１１６１２−１１６２２（２００３））。これらの研究は、これらの条件下で形成された可溶性Ａβオリゴマー調製物が、ゲル電気泳動で分析した場合にトリマー、テトラマー（１２ｋＤａ〜１７ｋＤａ）および５０ｋＤａ〜２００ｋＤａの分子量（Ｍｗ）範囲のより大きいオリゴマーの混合物を含み、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で分析した場合に直径３．５〜１０ｎｍの粒子サイズを有するようであったことを、一貫して実証した。標準プロトコールは、混合物の高い割合がモノマー形態としてなお存在する、可溶性Ａβオリゴマー調製物を生じる。このように、この調製物は、抗原として使用される場合には、免疫応答を生じる傾向がより低く、可溶性Ａβオリゴマーに特異的な抗体を回収することがより困難なものである。
【００１０】
Ａβ原線維形成は、最終βプリーディド（ｂｅｔａ−ｐｌｅａｄｅｄ）コンフォメーションが達成される前に一過的なヘリックス中間体の存在を伴い得る、複雑なプロセスである（Ｗａｌｓｈ．Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２５９４５−２５９５２（１９９９））。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、ヘリックス誘導溶媒トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）の低濃度（Ａβ原線維形成の臨界濃度（約２０μＭ）よりも十分に低い。）が、ｐＨ７．４で原線維形成を誘導することを示している。２０％を超えるＴＦＥ濃度で、このヘリックス構造が優勢となり、原線維の伸長の阻害を導く（Ｆｅｚｏｕｉ，Ｙ．、およびＴｅｐｌｏｗ，Ｄ．Ｂ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３６９４８−３６９５４（２００２））。いずれの理論に束縛されることも望まないが、出願人らは、Ａβのヒスチジン残基のイオン化状態が関連する現象に影響を与えるので、ｐＨをこのイオン化範囲の十分上に上昇させることにより、原線維形成が阻害され、ヘリックス誘導溶媒の少量の添加が構造の形成および引き続く会合を促進する条件が提供されると考えている。したがって、このような条件は、可溶性Ａβオリゴマーの収率および安定性を増強する。以下の実施例に示すように、出願人らは、このような安定な可溶性Ａβオリゴマーを生成した。
【００１１】
本明細書中で使用する場合、用語「可溶性Ａβオリゴマー」は、Ａβペプチドの可溶性のオリゴマー形態を意味する。好ましい実施形態において、可溶性ＡβオリゴマーはＡβ４２のオリゴマー形態であるが、当業者は、Ａβの他の形態（変更および変異を含むものが含まれ得る。）が同様に使用され得ることを認識する。例えば、ネイティブ配列のアミノ酸残基１および２に変異を有する合成ペプチドの使用から得られるＡβの形態が、本明細書中で使用され得る。ネイティブＡβ配列のアミノ酸残基１および２に改変を有するペプチドの例については、ＷＯ０２／０９４９８５およびＷＯ０４／０９９３７６（詳細に示されたかのように、本明細書中に組み込まれる。）を参照のこと。適切なペプチドの別の例には、Ａβペプチドのビオチン化形態の使用が含まれる。
【００１２】
本明細書中で使用する場合、用語「安定な可溶性Ａβオリゴマー」は、本明細書中で特許請求される方法によって生成されるＡβペプチドの可溶性のオリゴマー形態を意味する。「安定な」とは、オリゴマーと比較して少ないモノマーを有し、そのように形成された化溶性Ａβオリゴマーがさらに会合して原線維または凝集物を形成する傾向が実質的により低く、解離してモノマーを形成する傾向がより低い、調製物を意味する。本明細書中で本発明の前に当該分野で公知の標準プロトコールを使用して、約１００μｇ／ｍｌまでのオリゴマー濃度は、約１日の安定性を有した。本明細書中に記載された方法に従って、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度を有する本発明のオリゴマーは、４℃で１週間保存できる。安定性の測定として使用される凝集の程度は、弱いピーク位置の存在または非存在およびプレフィルター上での凝集物の保持に起因する乏しい回収を特異的に決定することによって、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）技術を使用して測定された。
【００１３】
本発明において、出願人らは、増大した濃度（１００μＭより高い）、高いｐＨ（７．５より高いｐＨ）および２価アニオンの使用を含む、標準プロトコールに対して標準的でない条件を使用して、安定な可溶性Ａβオリゴマーの形成を誘導した。出願人らの改善された方法は、動的光散乱によって測定した場合に直径約１０ｎｍ〜５０ｎｍであり、静的光散乱で測定した場合に分子量約１００ｋＤａ〜５００ｋＤａである、安定な可溶性Ａβオリゴマーを主に生成した。好ましい実施形態において、出願人らは、本明細書中で特許請求されるオリゴマーが直径１８ｎｍであり、約１５５，０００Ｄａの測定された分子量（Ｍｗ）を有することを見出した。これらの測定値は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、得られたオリゴマーを独立に架橋および分析することによって確認された。出願人らは、以前の文献の報告は、ＳＤＳ溶液中のトリマーおよびテトラマーの形成、ならびに原子間力顕微鏡測定の間の走査プローブ先端によるポリペプチド鎖の可動フラグメントの除外に起因して、これらのオリゴマーのサイズを過小評価していると考えている。例えば、Ｃｈｒｏｍｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：１２７４９−１２７６０（２００３）は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）に基づく１０ｎｍ未満の直径、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験から決定した場合ほとんどトリマーおよびテトラマーである会合状態を報告している。
【００１４】
本発明の安定な可溶性Ａβオリゴマーは、その高い収率および安定性に起因して、抗原としての使用に適している。このオリゴマーは、ヘリックス誘導溶媒（例えばＴＦＥの５％溶液）の低濃度の存在下で特に安定である。他の有機溶媒（例えば塩化メチレン）は、ヘリックス誘導特性を有し得、オリゴマー形成に使用できる。ヘリックス構造を誘導する特性は、円偏光二色機器において非構造化ペプチドを滴定することによって個々に試験できる。ヘリックス誘導特性を有さないある種の有機溶媒（例えばジメチルスルホキシド）は、最初のモノマーストック溶液中の調製物用に十分適している。
【００１５】
さらに、Ａβは自己抗原であるので、免疫寛容を破壊するために、天然に存在する毒性拡散性オリゴマーと類似の構造を有し、高度に免疫原性のオリゴマーを創出することが有利である。当業者は、大きいアセンブリへと会合する抗原が、一般により免疫原性であることを知っている（例えば、Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４９４２−４９４６（１９９３）を参照のこと。）。構造的に関連する安定な可溶性Ａβオリゴマーの利用能は、治療的モノクローナル抗体の生成、選択および量の制御において有益なものである。このように、本発明の安定な可溶性Ａβオリゴマーは、ＡＤおよび異常なＡβ凝集に関連する他の疾患の治療のための、受動免疫アプローチのための抗原の開発において、改善された調製物を提供する。
【００１６】
本発明の一実施形態は、直径１０ｎｍ〜５０ｎｍであり、サンプル中の優勢な同種集団に相当する、安定な可溶性Ａβオリゴマーを含む。好ましい実施形態において、本発明の可溶性Ａβオリゴマーは、１００μＭより高い濃度、ｐＨ７．５以上および２価アニオンの存在下で形成された場合、ペプチド抗原集団の少なくとも５０％を構成する。より好ましくは、安定な可溶性Ａβオリゴマーは、ペプチド抗原調製物の少なくとも７０％を構成し、最も好ましくは、本発明の安定な可溶性Ａβオリゴマーは、ペプチド抗原調製物の少なくとも９０％を構成する。
【００１７】
固体物質がプローブ先端によって検出される原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）技術を使用した場合、可溶性Ａβオリゴマーの見かけのサイズは、動的光散乱によって決定されたサイズとは異なり得ることに留意すべきである。このような場合、この先端は溶液中に緩く懸濁されたペプチド末端を記録することができないと推定されるので、得られたサイズ決定は、実際のオリゴマーサイズの過小評価であり得る。対照的に、動的光散乱技術を使用した場合、これらの緩く懸濁された末端は、全体的拡散係数に対する実質的な寄与を提供し、得られた流体力学サイズを増加させる傾向がある（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｄ．Ｅ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．３７：４８１４−４８２０（１９７２））。オリゴマーの非構造化外側層の存在は、原線維中のペプチドのＮ末端について報告された構造の欠如と一致している（Ｐｅｔｋｏｖａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１６７４２−１６７４７（２００２））。
【００１８】
いずれの理論に束縛されることも望まないが、出願人らは、本明細書中に記載される安定な可溶性Ａβオリゴマーの特性が、その調製および保存における比較的高いｐＨの使用から一部生じると考えている。Ａβペプチドは、６つの負に荷電したアミノ酸残基（３つのアスパラギン酸残基および３つのグルタミン酸残基）および６つの潜在的に正のアミノ酸残基（１つのアルギニン、１つのリジン残基、１つの末端アミノ基および３つのヒスチジン残基）からなる。ｐＨ６．５で公称イオン化定数ｐＫｉを有する３つのヒスチジン残基の存在は、酸性および中性のｐＨでイオン化する（正になる）傾向があるが、高いｐＨでは中性の（脱プロトン化された）ままである。３つのヒスチジン残基のイオン化は、正味のペプチド電荷の中和および荷電反発の欠如に起因する会合の加速を生じる。対照的に、ヒスチジン残基の脱プロトン化は、会合をより選択的にする３つの負の荷電の全体的な正味の量を生じる。結果として、原線維の形成のための公開されたプロトコールのほとんどは、低いｐＨおよび低いイオン強度（静電相互作用を最大化する条件）の使用を必要とする。このように、当業者は、安定な可溶性Ａβオリゴマーを形成するための即時の方法における上昇したｐＨの出願人らの使用は、原線維を調製する公知の方法の技術とは異なることを認識する。
【００１９】
本明細書中に記載される安定な可溶性Ａβオリゴマーは好ましくは、多価アニオンの存在下で形成および保存される。再度、いずれの理論に束縛されることも望まないが、出願人らは、この優先傾向が、Ａβがホスファチジルイノシトール（リン酸基を含む負に荷電した脂質）を含む脂質膜に対して有する既知の親和性に関連し得ると考えている。多価アニオンの存在に対する優先傾向は、Ａβがモノシアロガングリオシド（ＧＭ１）に対して有する親和性にも関連し得る。ＧＭ１は、水溶液中でミセルへと集合し、負に荷電したカルボキシル基を含むオリゴ糖表面を形成することが知られている。典型的には、リン酸イオンは、一般に選択される多価アニオンである。しかし、リン酸イオンの水酸化アルミニウム含有アジュバント（例えば、Ｍｅｒｃｋアルミニウムアジュバント）への既知の共有結合に起因して（Ｋｌｅｉｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８９：３１１−３２１（２０００））、水酸化アルミニウム含有アジュバントが抗原調製物の一部として使用される場合、硫酸イオンの使用が好ましい。
【００２０】
Ａβの両親媒性特性は、ホスファチジルイノシトール含有膜またはＧＭ１ミセルへと分配するその能力から明らかである。ペプチドの濃度の増大にもかかわらず、ＴＦＥの非存在下で、ペプチドの約１００μＭの濃度がモノマー形態のままであることが明らかである。このような観察は、このペプチドについて報告された界面活性剤様の特性と一致し（Ｋｉｍ，Ｊ．およびＬｅｅ，Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１６（２）：３９３−７（２００４））、このように、この特性は、２００μＭ以上まで濃度を増大させることによって、安定な可溶性Ａβオリゴマーの高収率を達成するために、出願人らによって使用されてきた。対照的に、１００μＭの濃度および生理学的ｐＨ（７．４）でより長い反応時間（７日間）を使用することによってオリゴマーを形成する以前の試みは、原線維の過剰な集団の形成のみを生じた（Ｓｔｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１１６１２−１１６２２（２００３））。
【００２１】
出願人らはまた、Ａβの両親媒性特性およびその界面活性剤様の挙動が、水よりも有意に低い誘電率を有する溶媒（例えば、グリセロール）での希釈の際に、本発明の安定な可溶性Ａβオリゴマーにおいても実証されることを見出した。本発明のこの態様は、元のオリゴマーサンプルがより低い濃度の条件下で適用される必要がある場合にリガンドスクリーニングを含む実験に有用であり得、粒子の解離が最小化される。グリセロールの存在は、希釈後に元のオリゴマー化状態のままであるオリゴマーのより高い割合を生じ、したがって、結合アッセイまたは実験におけるより高い親和性におそらくつながっている。
【００２２】
温度の上昇は凝集を加速することが公知であるため、安定な可溶性Ａβオリゴマーの調製において使用される温度もまた、重要であると考えられる（Ｓｔｉｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１１６１２−１１６２２（２００３））。出願人らは、２℃〜８℃の範囲の温度が、原線維形成を最小化するために使用されるべきであることを見出した。
【００２３】
本発明の一実施形態において、安定なＡβオリゴマーの調製は、原線維形成を最小化することによって、その保存においてオリゴマー形成を加速し、オリゴマーを安定化するために、３７℃でのヘリックス誘導有機溶媒の使用を用いる。このような実施形態において、この方法は、可溶性オリゴマーへのモノマーペプチドの変換を促進し、可溶性オリゴマーを安定化させるために、ＴＦＥを使用する。この安定な可溶性Ａβオリゴマーの形成の方法は、ＴＦＥの毒性が関連ない場合、または例えばアルミニウムアジュバントへの結合後の静置−デキャントアプローチによって除去できる場合に好ましい。このような安定化溶媒の非存在下では、低温（２℃〜８℃）の使用が、比較的高いｐＨおよび濃度に加えて、最適な安定性（最低７日間）を達成するために必要である。
【００２４】
さらに、本明細書中の可溶性Ａβオリゴマーの安定性は、濃度に依存するように見えるので、化学的架橋は、希釈から生じる分解から、このように生成されたオリゴマーを保護し得る。したがって、本発明の一実施形態において、ＳＤＳ処理で試験する場合、グルタルアルデヒドは、分解からこのオリゴマーを保護するために使用される。
【実施例１】
【００２５】
可溶性Ａβオリゴマーの形成およびサイズに対するｐＨの影響
すべての化学物質および試薬は、他に注記しない限りＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。
【００２６】
Ａβペプチド（１−４２）（Ａβ４２）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を、１００％ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）中に溶解し、１．７ｍｌのポリエチレンチューブ中に２ｍｇのアリコートへと分配し、減圧および低温下で、溶媒が蒸発するまで遠心分離した（ＣｅｎｔｒｉＶａｐ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）。乾燥フィルムを湿気から保護し、使用するまで−７０℃で保存した。ペプチドストック溶液を、１００μＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、室温中での平衡化後に２ｍｇの乾燥フィルムに添加することによって調製し、ピペットでの吸引を繰り返すことによって穏やかに混合した。ストック溶液を室温で最大２週間保存した。
【００２７】
Ａβサンプル（１００μＭ）を、４．５と９．０との間の種々のｐＨ値に調整した５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中に調製し、４℃で３日間インキュベートした。これらのサンプルを、卓上遠心機（半径７ｃｍ）で７，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、大きい凝集物または原線維を除去し、次いで０．２２ミクロンのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を通して濾過し、サイズ排除カラムにとって大きすぎる粒子を除去した。各濾液の１０μｌを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム上に注入した。安定な可溶性Ａβオリゴマーのピークは約６．５ｍｌで溶出したが、モノマーについてのピークは約９ｍｌで溶出した。
【００２８】
サイズ排除クロマトグラフィーを、Ｗａｔｅｒｓ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＡＫ １２５ ７．８×３００ｍｍカラムを使用するＡｌｌｉａｎｃｅ（登録商標）ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて実施した。ランニング緩衝液は、１ｍｌ／分で溶出する５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ９）であった。注入したペプチドの最小量は２５μｇであった。フォトダイオードアレイＵＶ検出器を、３．５ｍｍの分解能で、２１０ｎｍと３５０ｎｍとの間での検出のために設定した。オリゴマーおよびモノマーのピークのスペクトルを、ピークの正体を確認するために時々試験した。完全なＵＶ読み出しを、スプレッドシート形式（Ｅｘｃｅｌ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）に移し、２３０ｎｍでのＵＶ吸光度を抽出し、溶出体積に対してプロットした。ある例では、ピーク下の面積を、ビルトイン関数を使用して積分し、オリゴマー画分（即ち、５ｍｌと７．５ｍｌとの間で溶出した総物質の画分）ならびに総回収率を見積もった。
【００２９】
半径約４．５ｃｍのローター中で４０，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ超遠心分離機）して直径約２００ｎｍの凝集物の小さい（５％未満）の画分を除去した後、１Ｗ ４８８ｎｍ Ａｒｇｏｎレーザーを備えたＭａｌｖｅｒｎ ４７００システム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して静的および動的光散乱分析を実施して、オリゴマーのサイズを決定した。典型的には、５つの測定値からの結果（各々３分間実施した。）を平均した。非線形最小二乗法手順（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してデータを分析した。
【００３０】
種々のｐＨレベルで調製した可溶性オリゴマーサンプルの高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）分析の結果を図１Ａ中に示す。ｐＨ４．５およびｐＨ６でインキュベートしたサンプルについてのピーク下の面積は、最初の物質の実質的な喪失が生じたことを示している。ｐＨ６でインキュベートしたサンプルは見るからに濁っており、サンプルのほとんどは、穏やかな遠心分離および０．２２ミクロン（２２０ｎｍ）フィルターを介した濾過の際に除去された。ｐＨ４．５でインキュベートしたサンプルは透明に見えたが、質量の大部分は遠心分離および濾過のステップにおいて失われたので、実質的な原線維／凝集物の形成が生じていた。７．０を上回るｐＨでインキュベートした両方のサンプルは、完全な回収率および質量の大部分がオリゴマーの形態で存在することを示した。本発明の好ましい実施形態において、オリゴマー化の速度の制御を提供するために、ｐＨは８を上回るレベルで維持される。オリゴマーを形成および保存するための２℃〜８℃でのｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の使用は、さらに会合し、ＨＰ−ＳＥＣカラムから溶出しなかった物質のより高い割合によって判断した場合、より低い保存安定性を生じた（示さず。）。
【００３１】
こうして形成されたＡβオリゴマーのサイズを決定するために、出願人らは、サンプルを動的光散乱分析に供した。非線形最小二乗法（ＮＬＬＳ）分析により、質量の大部分が直径約２０ｎｍの粒子として存在し、少量（５％未満）が非常に大きい粒子（直径約２００ｎｍ）として存在することが示された。散乱光の強度は散乱粒子の分子量に比例し、より大きい粒子（１００万ダルトンを超えるＭｗを有すると見積もられた。）は総光散乱強度の約５０％に寄与したので、出願人らは遠心分離ステップを使用してより大きい粒子を除去した。半径４．５ｃｍのローターを用いた４０，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離は、大きい粒子（約２００ｎｍ）のほとんどを除去するのに十分であった。この遠心分離ステップにおける総質量損失は、２７５ｎｍでのＵＶ吸光度によって判断した場合、約３％であった（データ示さず。）。
【００３２】
ｐＨ９で調製し４５０μＭで測定した、遠心分離したＡβオリゴマーサンプルの光散乱分析の結果を図１Ｂ中に示す。散乱光の変動の分析により、拡散係数の決定および結果的に流体力学直径の分布の決定が可能となる。大部分の可溶性Ａβオリゴマーの直径は、非線形最小二乗法を使用して１８．９ｎｍ＋／−０．３ｎｍであることが見出された。Ｄｈ＝２１．４ｎｍ＋／−０．７ｎｍの本質的に同じ結果が、標準プロトコールを使用して形成されたオリゴマーについて以前に得られていた（データ示さず。）。
【実施例２】
【００３３】
可溶性Ａβオリゴマーの形成に対する２価アニオンの影響
この実施例は、Ａβオリゴマーの形成に対する緩衝化成分の価数の影響を示す。緩衝液を５０ｍＭの濃度で調製し、１Ｍ塩酸または水酸化ナトリウムを使用してｐＨを９．０に調整した。２２０μＭのサンプルを４℃で一晩インキュベートし、ＨＰ−ＳＥＣによって分析した。６分と８分との間のピークおよび８分と９．５分との間のピークを積分して、それぞれオリゴマーおよびモノマーのピーク面積を得た。ナトリウムをすべての場合にカチオンとして使用した。
【００３４】
４℃で一晩インキュベートした可溶性Ａβオリゴマーの２２０μＭ調製物のＨＰ−ＳＥＣ分析の結果を図２中に示す。多価アニオン（リン酸塩およびクエン酸塩）を含む調製物は、１価イオン（Ｔｒｉｓおよびホウ酸塩）の存在下で調製したものよりも、可溶性Ａβオリゴマーのかなりより高い割合を示した。
【実施例３】
【００３５】
可溶性Ａβオリゴマーの形成に対するＡβ濃度の影響
この実施例は、可溶性Ａβオリゴマーの形成に対するＡβ濃度の影響を示す。１００％ＤＭＳＯ中のＡβ２０ｍｇ／ｍｌストック溶液を、種々の割合で５０ｍＭリン酸ナトリウム中に溶解し、４℃で一晩インキュベートした。ＨＰ−ＳＥＣ分析を実施し、可溶性Ａβオリゴマーピークの総面積を、モノマーおよびオリゴマーのピークの合計の総面積によって除算した。高濃度のサンプルもまた、４℃でのさらに３日間のインキュベーションの後に試験した。
【００３６】
図３は、Ａβの濃度の増大が、可溶性Ａβオリゴマーの割合の増大を導くことを示す。高濃度のサンプルについて、形成の過程は、一晩のインキュベーション後にほぼ完了する。さらに、増大した濃度の影響は、ペプチドの約９０％がオリゴマー種に変換されるときに飽和するようである。このことは、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）に類似した、ペプチドの溶解限度が存在することを示唆する。
【実施例４】
【００３７】
可溶性Ａβオリゴマーの安定性
この実施例は、４℃での１日間および４日間の保存後の、ＨＰ−ＳＥＣカラムからの可溶性Ａβオリゴマーの回収を示す。総Ａβピーク面積を積分し、公称濃度に対してプロットした。
【００３８】
実施例３に記載した実験を使用して、４℃でインキュベーションしたときの調製物の安定性もまた見積もった。図４は、一晩および４日間のインキュベーション後の種々の濃度での総ピーク面積を示す。ＵＶ検出によって判断した場合、ＨＰ−ＳＥＣカラムから回収された物質の総量は、１日間と４日間との間で変化しなかった。これは、これらの調製物が保存中安定であることを示す。
【実施例５】
【００３９】
可溶性Ａβオリゴマーの形成および安定性に対する温度および賦形剤の影響
この実施例は、可溶性Ａβオリゴマーの形成に対する温度および賦形剤の影響を示す。サンプルを、１００μＭの濃度で調製し、ＨＰ−ＳＥＣによって試験し、その後ピーク積分を実施した。これらのサンプルを、３７℃（図５Ａ）および４℃（図５Ｂ）で評価した。緩衝液は、他に注記しない限り５０ｍＭリン酸ナトリウムであった。
【００４０】
図５Ａ中に見られるように、４０％グリセロールを含むサンプル以外、３７℃でインキュベートしたサンプルにおいて乏しい回収が観察された。対応する４℃のサンプル（図５Ｂ）からの可溶性Ａβオリゴマーの割合の試験により、グリセロールの存在が（コントロールと比較して）可溶性Ａβオリゴマーの形成を阻害することが示された。いずれの理論に束縛されることも望まないが、この阻害は、オリゴマーが既に形成された後にグリセロールを添加した場合に観察された安定化効果の基礎をなし得る。さらに、２価アニオン（リン酸塩および硫酸塩）ならびにプロピレングリコールの存在は、可溶性Ａβオリゴマーの形成を促進するようであった。４℃での可溶性Ａβオリゴマーの形成は、以前の実験（実施例３および４）において観察された安定性と一致する、実際に適用可能な動的規模で生じたようにも見える。さらに、可溶性Ａβオリゴマーが希釈の際に界面活性剤特性と比較して部分的に解離することが注目されたので、かなり低い誘電率を有する不活性賦形剤を試験して、可溶性Ａβオリゴマーの安定性に対するその影響を確立した。図５Ａ中に見られるように、４０％グリセロールは、３７℃でこのような安定化効果を示す。
【実施例６】
【００４１】
希釈溶液における可溶性Ａβオリゴマーの安定性に対するグリセロールの影響
この実施例は、４４０μＭの濃度で調製し、４０％グリセロールの存在下で５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中に４倍希釈した可溶性Ａβオリゴマーの解離の阻害を示す（図６）。同一ではあるがグリセロールを用いずに製剤化したサンプルは、コントロールとして機能した。サンプルを４℃で一晩インキュベートし、その後ＨＰ−ＳＥＣカラム上に注入した。オリゴマーのより高い割合が、グリセロールを含むサンプル中で観察された。
【実施例７】
【００４２】
化学的架橋による可溶性Ａβオリゴマーの安定化
この実施例は、可溶性Ａβオリゴマーを架橋するために必要なグルタルアルデヒドの濃度を示す。最適な条件下で形成されたオリゴマーに関連する潜在的な問題点の１つは、それらが希釈時に解離することである。他方、過剰な化学的修飾は、生理活性の喪失を通常導く。この実施例は、分析目的（生理活性の喪失を伴う比較的高濃度のグルタルアルデヒド）および生物学的実験において使用される物質の調製（生理活性の維持を伴う比較的低濃度のグルタルアルデヒド）のためにオリゴマーを架橋するための架橋剤の最適な濃度を示す。
【００４３】
可溶性Ａβオリゴマーを、グルタルアルデヒドで架橋し、室温で１０分間インキュベートし、次いで１Ｍグリシン、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でクエンチした。次いで、架橋したサンプルを、Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳサンプル緩衝液中０．０２μｇ／μＬの最終濃度に希釈した。分析のために、モノマーまたはオリゴマーのいずれかの形態の０．２８μｇのＡβ（公称濃度）を、４％〜２０％のｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して１２５Ｖで約１００分間の電気泳動によって分離した。次いで、ゲルを銀染色し、可溶性Ａβオリゴマーのサイズ分布を可視化した。グルタルアルデヒド濃度の最適化のために、ＨＦＩＰ乾燥したＡβ４２またはＨＦＩＰ乾燥したＡβ４０を、ＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ、４．４ｍＭ）中に溶解し、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ０．９）に添加し、１．８ｍｇ／ｍＬ（４００μＭ）の最終濃度にして、光から保護して４℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、Ａβタンパク質の３６ｎｇを、０〜０．５％の範囲の種々の濃度のグルタルアルデヒドで架橋した。
【００４４】
以下の図７に示した銀染色したゲルは、この実験から得られたデータの代表である。結果は、０．１％のグルタルアルデヒドが、４℃で一晩のインキュベーションの間に形成された可溶性Ａβ４２オリゴマーを架橋するのに十分であることを示す。０．０１％および０．０５％のグルタルアルデヒドの濃度で、少量のダイマー（８ｋＤａ）がレーン２および３において認められる。レーン５〜１０は、Ａβ４０が主にモノマーで存在し、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）中４℃での２４時間のインキュベーションの間にオリゴマーを形成しないことを示す。１７ｋＤａの範囲で見られたこれらのバンドは、ＳＤＳ添加前に存在しなかったＳＤＳ処理の生成物を示す；サンプル中に元々（即ち、ＳＤＳを添加する前）存在した場合、これらは架橋されていた。したがって、可溶性Ａβオリゴマーは、１５０ｋＤａ（これは、２０ｋＤａの範囲の分子量を示した、当該分野における合意とは対照的である。）の範囲の分子量を有するように見える。
【００４５】
この実施例の結果として、出願人らは、この方法論が、可溶性Ａβオリゴマー調製物の形成をモニターし、サイズ分布を決定するのに有効であると結論付けた。
【実施例８】
【００４６】
５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）における可溶性Ａβオリゴマーの安定性
実施例１〜４に上記したように、Ａβ４２は、２℃〜８℃での保存の間、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中で可溶性Ａβオリゴマーを形成する。しかし、保存の間のこれらのオリゴマー種の形成、生物学的活性および保存安定性に最適な濃度は、決定していなかった。実施例７に記載したように、分析目的でＡβ４２オリゴマー種を架橋するために０．１％グルタルアルデヒドが使用される方法を開発した。これらの架橋種はＳＤＳの存在下で破壊され、したがって、適切なサイズ分布はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定できた。この実施例において、Ａβ４２を、上記５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中、１ｍＭ、８５０μＭ、６５０μＭ、４５０μＭ、２５０μＭおよび１００μＭの濃度で調製した。４℃での１日間、４日間および７日間のインキュベーション後、これらのサンプルを、０．５％グルタルアルデヒドまたは非架橋コントロールとして機能する等量の水で架橋し、次いで実施例７に記載したとおりにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【００４７】
図８中に示されるように、１ｍＭのＡβ４２濃度で、可溶性Ａβオリゴマー（約１５０ｋＤａ、本明細書中以下「１５０ｋＤａ種」、３５マー以上と等価）が、図８Ａのレーン２で観察されるように、４℃での１日のインキュベーション後に形成される。４℃での４日間および７日間の保存後、この種の量は減少し、より高分子量の物質が観察される（図８Ａ、レーン３および４）。同様のパターンが、８５０μＭおよび６５０μＭのＡβ４２ストック濃度で観察されたが（それぞれ、図８Ｂのレーン２、３、４、７、８および９）、１５００ｋＤａ種の相対的な量は、保存期間の間に徐々に減少した。しかし、４５０μＭのＡβ４２ストック濃度では、１５０ｋＤａ種の量は、４℃での保存の７日間の間一定のままであり、より高分子の種はほとんど〜まったく観察されない（図８Ｃのレーン２、３および４）。最後に、２５０μＭおよび１００μＭのＡβ４２ストック濃度は、４℃での１日の保存後にも主にモノマー（約４ｋＤａ）のままである種を生じ、１５０ｋＤａ種はほとんど形成されない（図８Ｄのレーン２および７）。４℃でのさらなる保存時間により、１５０ｋＤａ種の量は増大せず、一方でモノマーの見かけの量は減少しているように見える（図８Ｄのレーン３、４、８および９）。このことは、Ａβ４２ペプチドが経時的に分解していることを示唆する。これらの結果に基づき、出願人らは、４５０μＭのストック濃度のＡβ４２が、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中で比較的安定なオリゴマー種を形成し、４℃で７日間保存され得ると結論付けた。実施例９に示されるＭＴＴアッセイデータに加えて、このデータは、比較的安定な生物活性の可溶性Ａβオリゴマーとしての、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中４５０μＭのＡβ４２ストックの使用を支持する。
【実施例９】
【００４８】
可溶性Ａβオリゴマーの毒性の評価
Ａβ４２は、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中で可溶性Ａβオリゴマーを形成することが、ＨＰ−ＳＥＣによって以前に示されている（実施例１〜４）。これらの可溶性Ａβオリゴマーはまた、ＰＣ−１２ ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド）還元アッセイ（実施例１０）において生理活性であることが示された。これらの種を形成するＡβ４２の臨界濃度および／または最大の細胞生理活性を提供する臨界濃度は知られていなかった。したがって、これらの条件の両方を満たすＡβ４２ストックの臨界濃度を決定するための実験を行った。
【００４９】
ＰＣ−１２細胞を、３０，０００細胞／ウェルでプレートし、３７℃／５％ＣＯ２で一晩増殖させた。可溶性Ａβオリゴマーまたはビヒクルを、１μＭおよび５μＭの濃度で細胞に添加した。３７℃／５％ＣＯ２での４時間のインキュベーション後、ＭＴＴ還元アッセイを実施した（Ｌａｍｂｅｒｔら、２００１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７９、５９５−６０５）。簡潔に述べると、ＭＴＴ（１０μＬ、５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、４時間インキュベートした。可溶化緩衝液（１００μＬ、０．０１Ｎ ＨＣｌ中１０％のＳＤＳ）を添加し、プレートを３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次いで、このアッセイを、Ｔｅｃａｎ Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で５９５ｎｍで定量した。
【００５０】
この実験において、実施例８に記載したように、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中１ｍＭ、８５０μＭ、６５０μＭ、４５０μＭ、２５０μＭおよび１００μＭの濃度でＡβ４２を調製した。４℃での７日間のインキュベーション後、サンプルをＭＴＴアッセイによって試験して、生理活性を決定した。１μＭおよび５μＭの公称濃度で試験したこれらのサンプルについての結果を図９中に示す。結果は、Ａβ４２が、４５０μＭ〜６５０μＭの範囲のストック濃度で高度に生理活性であることを示している。５μＭの試験濃度で、これらのストック濃縮物は約５５％のＭＴＴ還元を示した。対照的に、４５０μＭを下回るストック濃度および６５０μＭを上回るストック濃度は、ほとんど生理活性を有さないことが示され、ＰＣ−１２細胞において８０〜１０５％のＭＴＴ還元を示した。これらの結果に基づき、出願人らは、４５０μＭ〜６５０μＭのストック濃度のＡβ４２が、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中で可溶性Ａβオリゴマーを形成し、２〜８℃での７日間の保存まで、生理活性を保持すると結論付けた。
【実施例１０】
【００５１】
安定な可溶性Ａβオリゴマーの調製
Ａβペプチド（１−４２）（Ａβ４２）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を、１００％ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）中に溶解し、１．７ｍｌのポリプロピレンチューブ中２ｍｇのアリコートへと分配し、溶媒が蒸発するまで減圧および低温下で遠心分離した（ＣｅｎｔｒｉＶａｐ（登録商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）。乾燥フィルムを湿気から保護し、使用するまで−７０℃で保存した。ペプチドストック溶液を、室温での平衡化後に２ｍｇの乾燥フィルムに１００μＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加することによって調製し、ピペットを用いた吸引の繰り返しによって穏やかに混合した。ストック溶液を、最大２週間にわたって室温で保存した。
【００５２】
Ａβストック溶液を、室温でボルテックスしながら５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ９．０）緩衝液中に種々の濃度で添加し、４００μＭと７００μＭとの間の最終ペプチド濃度を得る。サンプルを２〜８℃に移し、使用の前に少なくとも１日間保存する。
【実施例１１】
【００５３】
安定な可溶性Ａβオリゴマー抗原の調製
５０ｍＭ硫酸ナトリウムをリン酸ナトリウムの代わりに使用することを除き、実施例８に記載したとおりに調製した安定な可溶性オリゴマーを準備する。少量の一価緩衝液（例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ）を添加して、ｐＨを８．０より上に維持する。２〜８℃での一晩のインキュベーション後、オリゴマーサンプルを、ボルテックスで混合しながらＭｅｒｃｋアルミニウムアジュバントに添加する。最終緩衝液を、サンプルを遠心分離してａｌｕｍをペレット化することによって誘導し、上清を交換し、抗原−ａｌｕｍ複合体をボルテックスによって再懸濁する。任意選択で、非ａｌｕｍアジュバントを導入してもよい。任意選択で、ａｌｕｍへの結合を最小化する場合、リン酸アルミニウムまたはリン酸ナトリウムで調製したオリゴマーが使用できる。
【実施例１２】
【００５４】
抗体を作製するための、安定な可溶性Ａβオリゴマー抗原調製物の使用
抗原−ａｌｕｍ複合体を動物に、好ましくは反復様式で注射する。この動物を屠殺し、脾臓細胞を骨髄細胞と混合し、融合に供する。次いで、これらの融合ハイブリッド細胞を培養し、これらの培養物から回収した上清を、抗オリゴマー抗体の存在についてスクリーニングする。陽性クローンを、モノクローナル抗体の産生のために増幅する。
【００５５】
あるいは、Ａβオリゴマーを９６ウェルプレート上に固定化し、ファージライブラリーを、Ａβオリゴマー抗原を認識する能力についてスクリーニングする。陽性ファージ種を増幅し、抗体産生に使用する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１Ａ】可溶性Ａβオリゴマー形成に対するｐＨの影響を示すグラフである。Ａβサンプルを、４．５と９．０との間の種々のｐＨ値に調整したナトリウム緩衝液中に調製した。
【図１Ｂ】動的光散乱分析から得たＡβオリゴマーの流体力学直径（Ｄｈ）分布を示すグラフであり、（◇）は質量分率を示し、（＊）は散乱強度分率を示す。
【図２】可溶性Ａβオリゴマーの形成に対する多価イオンの影響を示すグラフである。
【図３】可溶性Ａβオリゴマーの形成に対するＡβペプチド濃度の影響を示すグラフである。
【図４】４℃での１日間および４日間の保存後の、ＨＰ−ＳＥＣカラムからの可溶性Ａβオリゴマー調製物の回収を示すグラフである。総Ａβピーク面積を積分し、公称濃度に対してプロットした。
【図５Ａ】可溶性Ａβオリゴマー形成に対する、温度および種々の賦形剤の影響を示すグラフである。３７℃での種々の賦形剤の影響を示す。
【図５Ｂ】可溶性Ａβオリゴマー形成に対する、温度および種々の賦形剤の影響を示すグラフである。４℃での同じ賦形剤の影響を示す。
【図６】リン酸ナトリウム緩衝液における可溶性Ａβオリゴマー安定性に対するグリセロールの影響を示すグラフである。
【図７】グルタルアルデヒドを用いて実施した、Ａβ４２およびＡβ４０モノマーペプチドの架橋を示す図である。分子量マーカーを、サイズ分布の推定として左側に示す。レーン１〜５はそれぞれ、Ａβ４２、０％、０．０１％、０．０５％、０．１０％および０．５０％のグルタルアルデヒドを含む。レーン６〜１０はそれぞれ、Ａβ４０、０％、０．０１％、０．０５％、０．１０％および０．５０％のグルタルアルデヒドを含む。
【図８Ａ】グルタルアルデヒド架橋サンプルおよび非架橋コントロールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した、４℃（２〜８℃）での保存の１日目、４日目および７日目の、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中の形成された可溶性Ａβオリゴマーの安定性を示す図である。分子量マーカーをサイズ分布の推定として示す。レーン１、ブランク；レーン２〜４、５０ｍＭリン酸塩中１ｍＭストック、０．５％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン５〜７、１ｍＭストック、０％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン８、ＭＷＭ、０．５％グルタルアルデヒド；レーン９、ＭＷＭ、０％グルタルアルデヒド；レーン１０〜１２、８５０μＭストック、０％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目。
【図８Ｂ】グルタルアルデヒド架橋サンプルおよび非架橋コントロールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した、４℃（２〜８℃）での保存の１日目、４日目および７日目の、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中の形成された可溶性Ａβオリゴマーの安定性を示す図である。分子量マーカーをサイズ分布の推定として示す。レーン１、ブランク；レーン２〜４、５０ｍＭリン酸塩中８５０μＭストック、０．５％グルタルアルデヒド、それぞれ、１日目、４日目および７日目；レーン５、ＭＷＭ、０．５％グルタルアルデヒド；レーン６、ＭＷＭ、０％グルタルアルデヒド；レーン７〜１０、６５０μＭストック、０．５％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン１０〜１２、６５０μＭストック、０％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目。
【図８Ｃ】グルタルアルデヒド架橋サンプルおよび非架橋コントロールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した、４℃（２〜８℃）での保存の１日目、４日目および７日目の、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中の形成された可溶性Ａβオリゴマーの安定性を示す図である。分子量マーカーをサイズ分布の推定として示す。レーン１、ブランク；レーン２〜４、５０ｍＭリン酸塩中４５０μＭストック、０．５％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン５〜７、４５０μＭストック、０％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン８、ＭＷＭ、０．５％グルタルアルデヒド；レーン９、ＭＷＭ、０％グルタルアルデヒド；レーン１０〜１２、２５０μＭストック、０％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目。
【図８Ｄ】グルタルアルデヒド架橋サンプルおよび非架橋コントロールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した、４℃（２〜８℃）での保存の１日目、４日目および７日目の、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中の形成された可溶性Ａβオリゴマーの安定性を示す図である。分子量マーカーをサイズ分布の推定として示す。レーン１、ブランク；レーン２〜４、５０ｍＭリン酸塩中２５０μＭストック、０．５％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン５、ＭＷＭ、０．５％グルタルアルデヒド；レーン６、ＭＷＭ、０％グルタルアルデヒド；レーン７〜１０、１００μＭストック、０．５％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン１０〜１２、１００μＭストック、０％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目。
【図９】ＰＣ−１２細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ生理活性に対する、４℃で７日間での５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中のＡβ４２ストック濃度の影響を示すグラフである。黒四角−５マイクロモル濃度の試験濃度、白丸−１マイクロモル濃度の試験濃度。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病および異常なアミロイドβ凝集に関連する他の状態の治療または診断のための抗体の生成のための、抗原またはスクリーニング試薬として使用するための、安定なアミロイドβオリゴマーおよびその組成物の調製のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在限定的な治療しか存在しないアルツハイマー病は、非常に大きな世界的公衆衛生問題を構成している。この疾患は、神経原線維変化およびアミロイド斑の蓄積に関連する進行性の認知症によって特徴付けられ、アミロイド斑は、膜タンパク質前駆体であるアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）からタンパク質分解によって誘導される３９〜４３アミノ酸を含む両親媒性ペプチドであるアミロイドβ（Ａβ）を含む（概説については、Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２４：１１２１−１１５９（２００１）、Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｃｈｅｓｓｅｌｅｔ，Ｍ．Ｆ．編、（２０００）ｐｐ１−４９、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。）。
【０００３】
Ａβの自己会合は、細胞培養物中のニューロンに対する毒性に必要である（Ｐｉｋｅ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５６３：３１１−３１４（１９９１）、Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ａ．およびＹａｎｋｎｅｒ，Ｂ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１２２４３−１２２４７（１９９４）、Ｈｏｗｌｅｔｔ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ４：２３−３２（１９９５））。最初、原線維の形成が毒性種であると考えられていた。しかし、培養物中のニューロンを殺傷するのに必要な原線維Ａβの用量は過剰なようであった（Ｓｅｕｂｅｒｔ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５９：３２５−３２７（１９９２））。引き続く研究により、神経学的機能不全および変性は、Ａβのより小さい可溶性アセンブリ（これは、可溶性オリゴマー（アミロイド由来拡散性リガンド、ＡＤＤＬ）と呼ばれてきた。）に起因し得ることが示されている（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：６４４８−６４５３（１９９８）、Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：８８７６−８８８４（１９９９）、Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２５９４５−２５９５２（１９９９））。特に、可溶性オリゴマーによって誘導される選択的ニューロン変性が実証されている（Ｋｉｍ，Ｈ．−Ｊ．ら、Ｆａｓｅｂ Ｊ．１７（１）：１１８−２０（２００３））。
【０００４】
出願人らは、本明細書中で、高収率での可溶性オリゴマーの調製のための方法およびこの可溶性オリゴマーを安定化する条件を開発した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、Ａβオリゴマーの安定で可溶性の調製物ならびにその組成物および製剤を生成する方法である。この方法は、高濃度のＡβペプチド、７．５を超えるｐＨおよび多価アニオン（例えば、２価アニオンを有する緩衝液）を使用して、Ａβオリゴマーの形成を促進する。さらなる実施形態において、この方法はまた、トリフルオロエタノールおよびグリセロールなどのさらなる添加剤を利用して、オリゴマーの安定性を増強する。
【０００６】
本発明の別の実施形態において、この方法の生成物は、動的光散乱技術によって測定した場合に１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズを有し、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量（Ｍｗ）を有する、安定な可溶性Ａβオリゴマーである。
【０００７】
本発明のなおさらなる実施形態において、この安定な可溶性Ａβオリゴマーは、１０ｎｍ〜５０ｎｍの直径を有し、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａのＭｗを有するオリゴマーの形態で、少なくとも５０％を有するペプチド調製物である。
【０００８】
本発明のなお別の実施形態において、このペプチド調製物は、アルツハイマー病の治療のための治療抗体を生成するために使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
可溶性Ａβオリゴマーの調製のための標準的な手順（「標準プロトコール」）は、Ｆ１２培地（ｐＨ７．４）中４℃で１００μＭまでの濃度での、Ａβペプチドの一晩のインキュベーションを利用する（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：６４４８−６４５３（１９９８）、Ｃｈｒｏｍｙ Ｂ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：１２７４９−１２７６０（２００３）、Ｓｔｉｎｅ Ｗ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１１６１２−１１６２２（２００３））。これらの研究は、これらの条件下で形成された可溶性Ａβオリゴマー調製物が、ゲル電気泳動で分析した場合にトリマー、テトラマー（１２ｋＤａ〜１７ｋＤａ）および５０ｋＤａ〜２００ｋＤａの分子量（Ｍｗ）範囲のより大きいオリゴマーの混合物を含み、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で分析した場合に直径３．５〜１０ｎｍの粒子サイズを有するようであったことを、一貫して実証した。標準プロトコールは、混合物の高い割合がモノマー形態としてなお存在する、可溶性Ａβオリゴマー調製物を生じる。このように、この調製物は、抗原として使用される場合には、免疫応答を生じる傾向がより低く、可溶性Ａβオリゴマーに特異的な抗体を回収することがより困難なものである。
【００１０】
Ａβ原線維形成は、最終βプリーディド（ｂｅｔａ−ｐｌｅａｄｅｄ）コンフォメーションが達成される前に一過的なヘリックス中間体の存在を伴い得る、複雑なプロセスである（Ｗａｌｓｈ．Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２５９４５−２５９５２（１９９９））。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、ヘリックス誘導溶媒トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）の低濃度（Ａβ原線維形成の臨界濃度（約２０μＭ）よりも十分に低い。）が、ｐＨ７．４で原線維形成を誘導することを示している。２０％を超えるＴＦＥ濃度で、このヘリックス構造が優勢となり、原線維の伸長の阻害を導く（Ｆｅｚｏｕｉ，Ｙ．、およびＴｅｐｌｏｗ，Ｄ．Ｂ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３６９４８−３６９５４（２００２））。いずれの理論に束縛されることも望まないが、出願人らは、Ａβのヒスチジン残基のイオン化状態が関連する現象に影響を与えるので、ｐＨをこのイオン化範囲の十分上に上昇させることにより、原線維形成が阻害され、ヘリックス誘導溶媒の少量の添加が構造の形成および引き続く会合を促進する条件が提供されると考えている。したがって、このような条件は、可溶性Ａβオリゴマーの収率および安定性を増強する。以下の実施例に示すように、出願人らは、このような安定な可溶性Ａβオリゴマーを生成した。
【００１１】
本明細書中で使用する場合、用語「可溶性Ａβオリゴマー」は、Ａβペプチドの可溶性のオリゴマー形態を意味する。好ましい実施形態において、可溶性ＡβオリゴマーはＡβ４２のオリゴマー形態であるが、当業者は、Ａβの他の形態（変更および変異を含むものが含まれ得る。）が同様に使用され得ることを認識する。例えば、ネイティブ配列のアミノ酸残基１および２に変異を有する合成ペプチドの使用から得られるＡβの形態が、本明細書中で使用され得る。ネイティブＡβ配列のアミノ酸残基１および２に改変を有するペプチドの例については、ＷＯ０２／０９４９８５およびＷＯ０４／０９９３７６（詳細に示されたかのように、本明細書中に組み込まれる。）を参照のこと。適切なペプチドの別の例には、Ａβペプチドのビオチン化形態の使用が含まれる。
【００１２】
本明細書中で使用する場合、用語「安定な可溶性Ａβオリゴマー」は、本明細書中で特許請求される方法によって生成されるＡβペプチドの可溶性のオリゴマー形態を意味する。「安定な」とは、オリゴマーと比較して少ないモノマーを有し、そのように形成された化溶性Ａβオリゴマーがさらに会合して原線維または凝集物を形成する傾向が実質的により低く、解離してモノマーを形成する傾向がより低い、調製物を意味する。本明細書中で本発明の前に当該分野で公知の標準プロトコールを使用して、約１００μｇ／ｍｌまでのオリゴマー濃度は、約１日の安定性を有した。本明細書中に記載された方法に従って、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度を有する本発明のオリゴマーは、４℃で１週間保存できる。安定性の測定として使用される凝集の程度は、弱いピーク位置の存在または非存在およびプレフィルター上での凝集物の保持に起因する乏しい回収を特異的に決定することによって、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）技術を使用して測定された。
【００１３】
本発明において、出願人らは、増大した濃度（１００μＭより高い）、高いｐＨ（７．５より高いｐＨ）および２価アニオンの使用を含む、標準プロトコールに対して標準的でない条件を使用して、安定な可溶性Ａβオリゴマーの形成を誘導した。出願人らの改善された方法は、動的光散乱によって測定した場合に直径約１０ｎｍ〜５０ｎｍであり、静的光散乱で測定した場合に分子量約１００ｋＤａ〜５００ｋＤａである、安定な可溶性Ａβオリゴマーを主に生成した。好ましい実施形態において、出願人らは、本明細書中で特許請求されるオリゴマーが直径１８ｎｍであり、約１５５，０００Ｄａの測定された分子量（Ｍｗ）を有することを見出した。これらの測定値は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、得られたオリゴマーを独立に架橋および分析することによって確認された。出願人らは、以前の文献の報告は、ＳＤＳ溶液中のトリマーおよびテトラマーの形成、ならびに原子間力顕微鏡測定の間の走査プローブ先端によるポリペプチド鎖の可動フラグメントの除外に起因して、これらのオリゴマーのサイズを過小評価していると考えている。例えば、Ｃｈｒｏｍｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：１２７４９−１２７６０（２００３）は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）に基づく１０ｎｍ未満の直径、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験から決定した場合ほとんどトリマーおよびテトラマーである会合状態を報告している。
【００１４】
本発明の安定な可溶性Ａβオリゴマーは、その高い収率および安定性に起因して、抗原としての使用に適している。このオリゴマーは、ヘリックス誘導溶媒（例えばＴＦＥの５％溶液）の低濃度の存在下で特に安定である。他の有機溶媒（例えば塩化メチレン）は、ヘリックス誘導特性を有し得、オリゴマー形成に使用できる。ヘリックス構造を誘導する特性は、円偏光二色機器において非構造化ペプチドを滴定することによって個々に試験できる。ヘリックス誘導特性を有さないある種の有機溶媒（例えばジメチルスルホキシド）は、最初のモノマーストック溶液中の調製物用に十分適している。
【００１５】
さらに、Ａβは自己抗原であるので、免疫寛容を破壊するために、天然に存在する毒性拡散性オリゴマーと類似の構造を有し、高度に免疫原性のオリゴマーを創出することが有利である。当業者は、大きいアセンブリへと会合する抗原が、一般により免疫原性であることを知っている（例えば、Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４９４２−４９４６（１９９３）を参照のこと。）。構造的に関連する安定な可溶性Ａβオリゴマーの利用能は、治療的モノクローナル抗体の生成、選択および量の制御において有益なものである。このように、本発明の安定な可溶性Ａβオリゴマーは、ＡＤおよび異常なＡβ凝集に関連する他の疾患の治療のための、受動免疫アプローチのための抗原の開発において、改善された調製物を提供する。
【００１６】
本発明の一実施形態は、直径１０ｎｍ〜５０ｎｍであり、サンプル中の優勢な同種集団に相当する、安定な可溶性Ａβオリゴマーを含む。好ましい実施形態において、本発明の可溶性Ａβオリゴマーは、１００μＭより高い濃度、ｐＨ７．５以上および２価アニオンの存在下で形成された場合、ペプチド抗原集団の少なくとも５０％を構成する。より好ましくは、安定な可溶性Ａβオリゴマーは、ペプチド抗原調製物の少なくとも７０％を構成し、最も好ましくは、本発明の安定な可溶性Ａβオリゴマーは、ペプチド抗原調製物の少なくとも９０％を構成する。
【００１７】
固体物質がプローブ先端によって検出される原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）技術を使用した場合、可溶性Ａβオリゴマーの見かけのサイズは、動的光散乱によって決定されたサイズとは異なり得ることに留意すべきである。このような場合、この先端は溶液中に緩く懸濁されたペプチド末端を記録することができないと推定されるので、得られたサイズ決定は、実際のオリゴマーサイズの過小評価であり得る。対照的に、動的光散乱技術を使用した場合、これらの緩く懸濁された末端は、全体的拡散係数に対する実質的な寄与を提供し、得られた流体力学サイズを増加させる傾向がある（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｄ．Ｅ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．３７：４８１４−４８２０（１９７２））。オリゴマーの非構造化外側層の存在は、原線維中のペプチドのＮ末端について報告された構造の欠如と一致している（Ｐｅｔｋｏｖａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１６７４２−１６７４７（２００２））。
【００１８】
いずれの理論に束縛されることも望まないが、出願人らは、本明細書中に記載される安定な可溶性Ａβオリゴマーの特性が、その調製および保存における比較的高いｐＨの使用から一部生じると考えている。Ａβペプチドは、６つの負に荷電したアミノ酸残基（３つのアスパラギン酸残基および３つのグルタミン酸残基）および６つの潜在的に正のアミノ酸残基（１つのアルギニン、１つのリジン残基、１つの末端アミノ基および３つのヒスチジン残基）からなる。ｐＨ６．５で公称イオン化定数ｐＫｉを有する３つのヒスチジン残基の存在は、酸性および中性のｐＨでイオン化する（正になる）傾向があるが、高いｐＨでは中性の（脱プロトン化された）ままである。３つのヒスチジン残基のイオン化は、正味のペプチド電荷の中和および荷電反発の欠如に起因する会合の加速を生じる。対照的に、ヒスチジン残基の脱プロトン化は、会合をより選択的にする３つの負の荷電の全体的な正味の量を生じる。結果として、原線維の形成のための公開されたプロトコールのほとんどは、低いｐＨおよび低いイオン強度（静電相互作用を最大化する条件）の使用を必要とする。このように、当業者は、安定な可溶性Ａβオリゴマーを形成するための即時の方法における上昇したｐＨの出願人らの使用は、原線維を調製する公知の方法の技術とは異なることを認識する。
【００１９】
本明細書中に記載される安定な可溶性Ａβオリゴマーは好ましくは、多価アニオンの存在下で形成および保存される。再度、いずれの理論に束縛されることも望まないが、出願人らは、この優先傾向が、Ａβがホスファチジルイノシトール（リン酸基を含む負に荷電した脂質）を含む脂質膜に対して有する既知の親和性に関連し得ると考えている。多価アニオンの存在に対する優先傾向は、Ａβがモノシアロガングリオシド（ＧＭ１）に対して有する親和性にも関連し得る。ＧＭ１は、水溶液中でミセルへと集合し、負に荷電したカルボキシル基を含むオリゴ糖表面を形成することが知られている。典型的には、リン酸イオンは、一般に選択される多価アニオンである。しかし、リン酸イオンの水酸化アルミニウム含有アジュバント（例えば、Ｍｅｒｃｋアルミニウムアジュバント）への既知の共有結合に起因して（Ｋｌｅｉｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８９：３１１−３２１（２０００））、水酸化アルミニウム含有アジュバントが抗原調製物の一部として使用される場合、硫酸イオンの使用が好ましい。
【００２０】
Ａβの両親媒性特性は、ホスファチジルイノシトール含有膜またはＧＭ１ミセルへと分配するその能力から明らかである。ペプチドの濃度の増大にもかかわらず、ＴＦＥの非存在下で、ペプチドの約１００μＭの濃度がモノマー形態のままであることが明らかである。このような観察は、このペプチドについて報告された界面活性剤様の特性と一致し（Ｋｉｍ，Ｊ．およびＬｅｅ，Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１６（２）：３９３−７（２００４））、このように、この特性は、２００μＭ以上まで濃度を増大させることによって、安定な可溶性Ａβオリゴマーの高収率を達成するために、出願人らによって使用されてきた。対照的に、１００μＭの濃度および生理学的ｐＨ（７．４）でより長い反応時間（７日間）を使用することによってオリゴマーを形成する以前の試みは、原線維の過剰な集団の形成のみを生じた（Ｓｔｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１１６１２−１１６２２（２００３））。
【００２１】
出願人らはまた、Ａβの両親媒性特性およびその界面活性剤様の挙動が、水よりも有意に低い誘電率を有する溶媒（例えば、グリセロール）での希釈の際に、本発明の安定な可溶性Ａβオリゴマーにおいても実証されることを見出した。本発明のこの態様は、元のオリゴマーサンプルがより低い濃度の条件下で適用される必要がある場合にリガンドスクリーニングを含む実験に有用であり得、粒子の解離が最小化される。グリセロールの存在は、希釈後に元のオリゴマー化状態のままであるオリゴマーのより高い割合を生じ、したがって、結合アッセイまたは実験におけるより高い親和性におそらくつながっている。
【００２２】
温度の上昇は凝集を加速することが公知であるため、安定な可溶性Ａβオリゴマーの調製において使用される温度もまた、重要であると考えられる（Ｓｔｉｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１１６１２−１１６２２（２００３））。出願人らは、２℃〜８℃の範囲の温度が、原線維形成を最小化するために使用されるべきであることを見出した。
【００２３】
本発明の一実施形態において、安定なＡβオリゴマーの調製は、原線維形成を最小化することによって、その保存においてオリゴマー形成を加速し、オリゴマーを安定化するために、３７℃でのヘリックス誘導有機溶媒の使用を用いる。このような実施形態において、この方法は、可溶性オリゴマーへのモノマーペプチドの変換を促進し、可溶性オリゴマーを安定化させるために、ＴＦＥを使用する。この安定な可溶性Ａβオリゴマーの形成の方法は、ＴＦＥの毒性が関連ない場合、または例えばアルミニウムアジュバントへの結合後の静置−デキャントアプローチによって除去できる場合に好ましい。このような安定化溶媒の非存在下では、低温（２℃〜８℃）の使用が、比較的高いｐＨおよび濃度に加えて、最適な安定性（最低７日間）を達成するために必要である。
【００２４】
さらに、本明細書中の可溶性Ａβオリゴマーの安定性は、濃度に依存するように見えるので、化学的架橋は、希釈から生じる分解から、このように生成されたオリゴマーを保護し得る。したがって、本発明の一実施形態において、ＳＤＳ処理で試験する場合、グルタルアルデヒドは、分解からこのオリゴマーを保護するために使用される。
【実施例１】
【００２５】
可溶性Ａβオリゴマーの形成およびサイズに対するｐＨの影響
すべての化学物質および試薬は、他に注記しない限りＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。
【００２６】
Ａβペプチド（１−４２）（Ａβ４２）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を、１００％ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）中に溶解し、１．７ｍｌのポリエチレンチューブ中に２ｍｇのアリコートへと分配し、減圧および低温下で、溶媒が蒸発するまで遠心分離した（ＣｅｎｔｒｉＶａｐ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）。乾燥フィルムを湿気から保護し、使用するまで−７０℃で保存した。ペプチドストック溶液を、１００μＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、室温中での平衡化後に２ｍｇの乾燥フィルムに添加することによって調製し、ピペットでの吸引を繰り返すことによって穏やかに混合した。ストック溶液を室温で最大２週間保存した。
【００２７】
Ａβサンプル（１００μＭ）を、４．５と９．０との間の種々のｐＨ値に調整した５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中に調製し、４℃で３日間インキュベートした。これらのサンプルを、卓上遠心機（半径７ｃｍ）で７，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、大きい凝集物または原線維を除去し、次いで０．２２ミクロンのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を通して濾過し、サイズ排除カラムにとって大きすぎる粒子を除去した。各濾液の１０μｌを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム上に注入した。安定な可溶性Ａβオリゴマーのピークは約６．５ｍｌで溶出したが、モノマーについてのピークは約９ｍｌで溶出した。
【００２８】
サイズ排除クロマトグラフィーを、Ｗａｔｅｒｓ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＡＫ １２５ ７．８×３００ｍｍカラムを使用するＡｌｌｉａｎｃｅ（登録商標）ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて実施した。ランニング緩衝液は、１ｍｌ／分で溶出する５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ９）であった。注入したペプチドの最小量は２５μｇであった。フォトダイオードアレイＵＶ検出器を、３．５ｍｍの分解能で、２１０ｎｍと３５０ｎｍとの間での検出のために設定した。オリゴマーおよびモノマーのピークのスペクトルを、ピークの正体を確認するために時々試験した。完全なＵＶ読み出しを、スプレッドシート形式（Ｅｘｃｅｌ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）に移し、２３０ｎｍでのＵＶ吸光度を抽出し、溶出体積に対してプロットした。ある例では、ピーク下の面積を、ビルトイン関数を使用して積分し、オリゴマー画分（即ち、５ｍｌと７．５ｍｌとの間で溶出した総物質の画分）ならびに総回収率を見積もった。
【００２９】
半径約４．５ｃｍのローター中で４０，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ超遠心分離機）して直径約２００ｎｍの凝集物の小さい（５％未満）の画分を除去した後、１Ｗ ４８８ｎｍ Ａｒｇｏｎレーザーを備えたＭａｌｖｅｒｎ ４７００システム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して静的および動的光散乱分析を実施して、オリゴマーのサイズを決定した。典型的には、５つの測定値からの結果（各々３分間実施した。）を平均した。非線形最小二乗法手順（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してデータを分析した。
【００３０】
種々のｐＨレベルで調製した可溶性オリゴマーサンプルの高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）分析の結果を図１Ａ中に示す。ｐＨ４．５およびｐＨ６でインキュベートしたサンプルについてのピーク下の面積は、最初の物質の実質的な喪失が生じたことを示している。ｐＨ６でインキュベートしたサンプルは見るからに濁っており、サンプルのほとんどは、穏やかな遠心分離および０．２２ミクロン（２２０ｎｍ）フィルターを介した濾過の際に除去された。ｐＨ４．５でインキュベートしたサンプルは透明に見えたが、質量の大部分は遠心分離および濾過のステップにおいて失われたので、実質的な原線維／凝集物の形成が生じていた。７．０を上回るｐＨでインキュベートした両方のサンプルは、完全な回収率および質量の大部分がオリゴマーの形態で存在することを示した。本発明の好ましい実施形態において、オリゴマー化の速度の制御を提供するために、ｐＨは８を上回るレベルで維持される。オリゴマーを形成および保存するための２℃〜８℃でのｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の使用は、さらに会合し、ＨＰ−ＳＥＣカラムから溶出しなかった物質のより高い割合によって判断した場合、より低い保存安定性を生じた（示さず。）。
【００３１】
こうして形成されたＡβオリゴマーのサイズを決定するために、出願人らは、サンプルを動的光散乱分析に供した。非線形最小二乗法（ＮＬＬＳ）分析により、質量の大部分が直径約２０ｎｍの粒子として存在し、少量（５％未満）が非常に大きい粒子（直径約２００ｎｍ）として存在することが示された。散乱光の強度は散乱粒子の分子量に比例し、より大きい粒子（１００万ダルトンを超えるＭｗを有すると見積もられた。）は総光散乱強度の約５０％に寄与したので、出願人らは遠心分離ステップを使用してより大きい粒子を除去した。半径４．５ｃｍのローターを用いた４０，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離は、大きい粒子（約２００ｎｍ）のほとんどを除去するのに十分であった。この遠心分離ステップにおける総質量損失は、２７５ｎｍでのＵＶ吸光度によって判断した場合、約３％であった（データ示さず。）。
【００３２】
ｐＨ９で調製し４５０μＭで測定した、遠心分離したＡβオリゴマーサンプルの光散乱分析の結果を図１Ｂ中に示す。散乱光の変動の分析により、拡散係数の決定および結果的に流体力学直径の分布の決定が可能となる。大部分の可溶性Ａβオリゴマーの直径は、非線形最小二乗法を使用して１８．９ｎｍ＋／−０．３ｎｍであることが見出された。Ｄｈ＝２１．４ｎｍ＋／−０．７ｎｍの本質的に同じ結果が、標準プロトコールを使用して形成されたオリゴマーについて以前に得られていた（データ示さず。）。
【実施例２】
【００３３】
可溶性Ａβオリゴマーの形成に対する２価アニオンの影響
この実施例は、Ａβオリゴマーの形成に対する緩衝化成分の価数の影響を示す。緩衝液を５０ｍＭの濃度で調製し、１Ｍ塩酸または水酸化ナトリウムを使用してｐＨを９．０に調整した。２２０μＭのサンプルを４℃で一晩インキュベートし、ＨＰ−ＳＥＣによって分析した。６分と８分との間のピークおよび８分と９．５分との間のピークを積分して、それぞれオリゴマーおよびモノマーのピーク面積を得た。ナトリウムをすべての場合にカチオンとして使用した。
【００３４】
４℃で一晩インキュベートした可溶性Ａβオリゴマーの２２０μＭ調製物のＨＰ−ＳＥＣ分析の結果を図２中に示す。多価アニオン（リン酸塩およびクエン酸塩）を含む調製物は、１価イオン（Ｔｒｉｓおよびホウ酸塩）の存在下で調製したものよりも、可溶性Ａβオリゴマーのかなりより高い割合を示した。
【実施例３】
【００３５】
可溶性Ａβオリゴマーの形成に対するＡβ濃度の影響
この実施例は、可溶性Ａβオリゴマーの形成に対するＡβ濃度の影響を示す。１００％ＤＭＳＯ中のＡβ２０ｍｇ／ｍｌストック溶液を、種々の割合で５０ｍＭリン酸ナトリウム中に溶解し、４℃で一晩インキュベートした。ＨＰ−ＳＥＣ分析を実施し、可溶性Ａβオリゴマーピークの総面積を、モノマーおよびオリゴマーのピークの合計の総面積によって除算した。高濃度のサンプルもまた、４℃でのさらに３日間のインキュベーションの後に試験した。
【００３６】
図３は、Ａβの濃度の増大が、可溶性Ａβオリゴマーの割合の増大を導くことを示す。高濃度のサンプルについて、形成の過程は、一晩のインキュベーション後にほぼ完了する。さらに、増大した濃度の影響は、ペプチドの約９０％がオリゴマー種に変換されるときに飽和するようである。このことは、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）に類似した、ペプチドの溶解限度が存在することを示唆する。
【実施例４】
【００３７】
可溶性Ａβオリゴマーの安定性
この実施例は、４℃での１日間および４日間の保存後の、ＨＰ−ＳＥＣカラムからの可溶性Ａβオリゴマーの回収を示す。総Ａβピーク面積を積分し、公称濃度に対してプロットした。
【００３８】
実施例３に記載した実験を使用して、４℃でインキュベーションしたときの調製物の安定性もまた見積もった。図４は、一晩および４日間のインキュベーション後の種々の濃度での総ピーク面積を示す。ＵＶ検出によって判断した場合、ＨＰ−ＳＥＣカラムから回収された物質の総量は、１日間と４日間との間で変化しなかった。これは、これらの調製物が保存中安定であることを示す。
【実施例５】
【００３９】
可溶性Ａβオリゴマーの形成および安定性に対する温度および賦形剤の影響
この実施例は、可溶性Ａβオリゴマーの形成に対する温度および賦形剤の影響を示す。サンプルを、１００μＭの濃度で調製し、ＨＰ−ＳＥＣによって試験し、その後ピーク積分を実施した。これらのサンプルを、３７℃（図５Ａ）および４℃（図５Ｂ）で評価した。緩衝液は、他に注記しない限り５０ｍＭリン酸ナトリウムであった。
【００４０】
図５Ａ中に見られるように、４０％グリセロールを含むサンプル以外、３７℃でインキュベートしたサンプルにおいて乏しい回収が観察された。対応する４℃のサンプル（図５Ｂ）からの可溶性Ａβオリゴマーの割合の試験により、グリセロールの存在が（コントロールと比較して）可溶性Ａβオリゴマーの形成を阻害することが示された。いずれの理論に束縛されることも望まないが、この阻害は、オリゴマーが既に形成された後にグリセロールを添加した場合に観察された安定化効果の基礎をなし得る。さらに、２価アニオン（リン酸塩および硫酸塩）ならびにプロピレングリコールの存在は、可溶性Ａβオリゴマーの形成を促進するようであった。４℃での可溶性Ａβオリゴマーの形成は、以前の実験（実施例３および４）において観察された安定性と一致する、実際に適用可能な動的規模で生じたようにも見える。さらに、可溶性Ａβオリゴマーが希釈の際に界面活性剤特性と比較して部分的に解離することが注目されたので、かなり低い誘電率を有する不活性賦形剤を試験して、可溶性Ａβオリゴマーの安定性に対するその影響を確立した。図５Ａ中に見られるように、４０％グリセロールは、３７℃でこのような安定化効果を示す。
【実施例６】
【００４１】
希釈溶液における可溶性Ａβオリゴマーの安定性に対するグリセロールの影響
この実施例は、４４０μＭの濃度で調製し、４０％グリセロールの存在下で５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中に４倍希釈した可溶性Ａβオリゴマーの解離の阻害を示す（図６）。同一ではあるがグリセロールを用いずに製剤化したサンプルは、コントロールとして機能した。サンプルを４℃で一晩インキュベートし、その後ＨＰ−ＳＥＣカラム上に注入した。オリゴマーのより高い割合が、グリセロールを含むサンプル中で観察された。
【実施例７】
【００４２】
化学的架橋による可溶性Ａβオリゴマーの安定化
この実施例は、可溶性Ａβオリゴマーを架橋するために必要なグルタルアルデヒドの濃度を示す。最適な条件下で形成されたオリゴマーに関連する潜在的な問題点の１つは、それらが希釈時に解離することである。他方、過剰な化学的修飾は、生理活性の喪失を通常導く。この実施例は、分析目的（生理活性の喪失を伴う比較的高濃度のグルタルアルデヒド）および生物学的実験において使用される物質の調製（生理活性の維持を伴う比較的低濃度のグルタルアルデヒド）のためにオリゴマーを架橋するための架橋剤の最適な濃度を示す。
【００４３】
可溶性Ａβオリゴマーを、グルタルアルデヒドで架橋し、室温で１０分間インキュベートし、次いで１Ｍグリシン、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でクエンチした。次いで、架橋したサンプルを、Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳサンプル緩衝液中０．０２μｇ／μＬの最終濃度に希釈した。分析のために、モノマーまたはオリゴマーのいずれかの形態の０．２８μｇのＡβ（公称濃度）を、４％〜２０％のｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して１２５Ｖで約１００分間の電気泳動によって分離した。次いで、ゲルを銀染色し、可溶性Ａβオリゴマーのサイズ分布を可視化した。グルタルアルデヒド濃度の最適化のために、ＨＦＩＰ乾燥したＡβ４２またはＨＦＩＰ乾燥したＡβ４０を、ＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ、４．４ｍＭ）中に溶解し、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ０．９）に添加し、１．８ｍｇ／ｍＬ（４００μＭ）の最終濃度にして、光から保護して４℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、Ａβタンパク質の３６ｎｇを、０〜０．５％の範囲の種々の濃度のグルタルアルデヒドで架橋した。
【００４４】
以下の図７に示した銀染色したゲルは、この実験から得られたデータの代表である。結果は、０．１％のグルタルアルデヒドが、４℃で一晩のインキュベーションの間に形成された可溶性Ａβ４２オリゴマーを架橋するのに十分であることを示す。０．０１％および０．０５％のグルタルアルデヒドの濃度で、少量のダイマー（８ｋＤａ）がレーン２および３において認められる。レーン５〜１０は、Ａβ４０が主にモノマーで存在し、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）中４℃での２４時間のインキュベーションの間にオリゴマーを形成しないことを示す。１７ｋＤａの範囲で見られたこれらのバンドは、ＳＤＳ添加前に存在しなかったＳＤＳ処理の生成物を示す；サンプル中に元々（即ち、ＳＤＳを添加する前）存在した場合、これらは架橋されていた。したがって、可溶性Ａβオリゴマーは、１５０ｋＤａ（これは、２０ｋＤａの範囲の分子量を示した、当該分野における合意とは対照的である。）の範囲の分子量を有するように見える。
【００４５】
この実施例の結果として、出願人らは、この方法論が、可溶性Ａβオリゴマー調製物の形成をモニターし、サイズ分布を決定するのに有効であると結論付けた。
【実施例８】
【００４６】
５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）における可溶性Ａβオリゴマーの安定性
実施例１〜４に上記したように、Ａβ４２は、２℃〜８℃での保存の間、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中で可溶性Ａβオリゴマーを形成する。しかし、保存の間のこれらのオリゴマー種の形成、生物学的活性および保存安定性に最適な濃度は、決定していなかった。実施例７に記載したように、分析目的でＡβ４２オリゴマー種を架橋するために０．１％グルタルアルデヒドが使用される方法を開発した。これらの架橋種はＳＤＳの存在下で破壊され、したがって、適切なサイズ分布はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定できた。この実施例において、Ａβ４２を、上記５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中、１ｍＭ、８５０μＭ、６５０μＭ、４５０μＭ、２５０μＭおよび１００μＭの濃度で調製した。４℃での１日間、４日間および７日間のインキュベーション後、これらのサンプルを、０．５％グルタルアルデヒドまたは非架橋コントロールとして機能する等量の水で架橋し、次いで実施例７に記載したとおりにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【００４７】
図８中に示されるように、１ｍＭのＡβ４２濃度で、可溶性Ａβオリゴマー（約１５０ｋＤａ、本明細書中以下「１５０ｋＤａ種」、３５マー以上と等価）が、図８Ａのレーン２で観察されるように、４℃での１日のインキュベーション後に形成される。４℃での４日間および７日間の保存後、この種の量は減少し、より高分子量の物質が観察される（図８Ａ、レーン３および４）。同様のパターンが、８５０μＭおよび６５０μＭのＡβ４２ストック濃度で観察されたが（それぞれ、図８Ｂのレーン２、３、４、７、８および９）、１５００ｋＤａ種の相対的な量は、保存期間の間に徐々に減少した。しかし、４５０μＭのＡβ４２ストック濃度では、１５０ｋＤａ種の量は、４℃での保存の７日間の間一定のままであり、より高分子の種はほとんど〜まったく観察されない（図８Ｃのレーン２、３および４）。最後に、２５０μＭおよび１００μＭのＡβ４２ストック濃度は、４℃での１日の保存後にも主にモノマー（約４ｋＤａ）のままである種を生じ、１５０ｋＤａ種はほとんど形成されない（図８Ｄのレーン２および７）。４℃でのさらなる保存時間により、１５０ｋＤａ種の量は増大せず、一方でモノマーの見かけの量は減少しているように見える（図８Ｄのレーン３、４、８および９）。このことは、Ａβ４２ペプチドが経時的に分解していることを示唆する。これらの結果に基づき、出願人らは、４５０μＭのストック濃度のＡβ４２が、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中で比較的安定なオリゴマー種を形成し、４℃で７日間保存され得ると結論付けた。実施例９に示されるＭＴＴアッセイデータに加えて、このデータは、比較的安定な生物活性の可溶性Ａβオリゴマーとしての、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中４５０μＭのＡβ４２ストックの使用を支持する。
【実施例９】
【００４８】
可溶性Ａβオリゴマーの毒性の評価
Ａβ４２は、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中で可溶性Ａβオリゴマーを形成することが、ＨＰ−ＳＥＣによって以前に示されている（実施例１〜４）。これらの可溶性Ａβオリゴマーはまた、ＰＣ−１２ ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド）還元アッセイ（実施例１０）において生理活性であることが示された。これらの種を形成するＡβ４２の臨界濃度および／または最大の細胞生理活性を提供する臨界濃度は知られていなかった。したがって、これらの条件の両方を満たすＡβ４２ストックの臨界濃度を決定するための実験を行った。
【００４９】
ＰＣ−１２細胞を、３０，０００細胞／ウェルでプレートし、３７℃／５％ＣＯ２で一晩増殖させた。可溶性Ａβオリゴマーまたはビヒクルを、１μＭおよび５μＭの濃度で細胞に添加した。３７℃／５％ＣＯ２での４時間のインキュベーション後、ＭＴＴ還元アッセイを実施した（Ｌａｍｂｅｒｔら、２００１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７９、５９５−６０５）。簡潔に述べると、ＭＴＴ（１０μＬ、５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、４時間インキュベートした。可溶化緩衝液（１００μＬ、０．０１Ｎ ＨＣｌ中１０％のＳＤＳ）を添加し、プレートを３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次いで、このアッセイを、Ｔｅｃａｎ Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で５９５ｎｍで定量した。
【００５０】
この実験において、実施例８に記載したように、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中１ｍＭ、８５０μＭ、６５０μＭ、４５０μＭ、２５０μＭおよび１００μＭの濃度でＡβ４２を調製した。４℃での７日間のインキュベーション後、サンプルをＭＴＴアッセイによって試験して、生理活性を決定した。１μＭおよび５μＭの公称濃度で試験したこれらのサンプルについての結果を図９中に示す。結果は、Ａβ４２が、４５０μＭ〜６５０μＭの範囲のストック濃度で高度に生理活性であることを示している。５μＭの試験濃度で、これらのストック濃縮物は約５５％のＭＴＴ還元を示した。対照的に、４５０μＭを下回るストック濃度および６５０μＭを上回るストック濃度は、ほとんど生理活性を有さないことが示され、ＰＣ−１２細胞において８０〜１０５％のＭＴＴ還元を示した。これらの結果に基づき、出願人らは、４５０μＭ〜６５０μＭのストック濃度のＡβ４２が、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中で可溶性Ａβオリゴマーを形成し、２〜８℃での７日間の保存まで、生理活性を保持すると結論付けた。
【実施例１０】
【００５１】
安定な可溶性Ａβオリゴマーの調製
Ａβペプチド（１−４２）（Ａβ４２）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を、１００％ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）中に溶解し、１．７ｍｌのポリプロピレンチューブ中２ｍｇのアリコートへと分配し、溶媒が蒸発するまで減圧および低温下で遠心分離した（ＣｅｎｔｒｉＶａｐ（登録商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）。乾燥フィルムを湿気から保護し、使用するまで−７０℃で保存した。ペプチドストック溶液を、室温での平衡化後に２ｍｇの乾燥フィルムに１００μＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加することによって調製し、ピペットを用いた吸引の繰り返しによって穏やかに混合した。ストック溶液を、最大２週間にわたって室温で保存した。
【００５２】
Ａβストック溶液を、室温でボルテックスしながら５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ９．０）緩衝液中に種々の濃度で添加し、４００μＭと７００μＭとの間の最終ペプチド濃度を得る。サンプルを２〜８℃に移し、使用の前に少なくとも１日間保存する。
【実施例１１】
【００５３】
安定な可溶性Ａβオリゴマー抗原の調製
５０ｍＭ硫酸ナトリウムをリン酸ナトリウムの代わりに使用することを除き、実施例８に記載したとおりに調製した安定な可溶性オリゴマーを準備する。少量の一価緩衝液（例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ）を添加して、ｐＨを８．０より上に維持する。２〜８℃での一晩のインキュベーション後、オリゴマーサンプルを、ボルテックスで混合しながらＭｅｒｃｋアルミニウムアジュバントに添加する。最終緩衝液を、サンプルを遠心分離してａｌｕｍをペレット化することによって誘導し、上清を交換し、抗原−ａｌｕｍ複合体をボルテックスによって再懸濁する。任意選択で、非ａｌｕｍアジュバントを導入してもよい。任意選択で、ａｌｕｍへの結合を最小化する場合、リン酸アルミニウムまたはリン酸ナトリウムで調製したオリゴマーが使用できる。
【実施例１２】
【００５４】
抗体を作製するための、安定な可溶性Ａβオリゴマー抗原調製物の使用
抗原−ａｌｕｍ複合体を動物に、好ましくは反復様式で注射する。この動物を屠殺し、脾臓細胞を骨髄細胞と混合し、融合に供する。次いで、これらの融合ハイブリッド細胞を培養し、これらの培養物から回収した上清を、抗オリゴマー抗体の存在についてスクリーニングする。陽性クローンを、モノクローナル抗体の産生のために増幅する。
【００５５】
あるいは、Ａβオリゴマーを９６ウェルプレート上に固定化し、ファージライブラリーを、Ａβオリゴマー抗原を認識する能力についてスクリーニングする。陽性ファージ種を増幅し、抗体産生に使用する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１Ａ】可溶性Ａβオリゴマー形成に対するｐＨの影響を示すグラフである。Ａβサンプルを、４．５と９．０との間の種々のｐＨ値に調整したナトリウム緩衝液中に調製した。
【図１Ｂ】動的光散乱分析から得たＡβオリゴマーの流体力学直径（Ｄｈ）分布を示すグラフであり、（◇）は質量分率を示し、（＊）は散乱強度分率を示す。
【図２】可溶性Ａβオリゴマーの形成に対する多価イオンの影響を示すグラフである。
【図３】可溶性Ａβオリゴマーの形成に対するＡβペプチド濃度の影響を示すグラフである。
【図４】４℃での１日間および４日間の保存後の、ＨＰ−ＳＥＣカラムからの可溶性Ａβオリゴマー調製物の回収を示すグラフである。総Ａβピーク面積を積分し、公称濃度に対してプロットした。
【図５Ａ】可溶性Ａβオリゴマー形成に対する、温度および種々の賦形剤の影響を示すグラフである。３７℃での種々の賦形剤の影響を示す。
【図５Ｂ】可溶性Ａβオリゴマー形成に対する、温度および種々の賦形剤の影響を示すグラフである。４℃での同じ賦形剤の影響を示す。
【図６】リン酸ナトリウム緩衝液における可溶性Ａβオリゴマー安定性に対するグリセロールの影響を示すグラフである。
【図７】グルタルアルデヒドを用いて実施した、Ａβ４２およびＡβ４０モノマーペプチドの架橋を示す図である。分子量マーカーを、サイズ分布の推定として左側に示す。レーン１〜５はそれぞれ、Ａβ４２、０％、０．０１％、０．０５％、０．１０％および０．５０％のグルタルアルデヒドを含む。レーン６〜１０はそれぞれ、Ａβ４０、０％、０．０１％、０．０５％、０．１０％および０．５０％のグルタルアルデヒドを含む。
【図８Ａ】グルタルアルデヒド架橋サンプルおよび非架橋コントロールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した、４℃（２〜８℃）での保存の１日目、４日目および７日目の、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中の形成された可溶性Ａβオリゴマーの安定性を示す図である。分子量マーカーをサイズ分布の推定として示す。レーン１、ブランク；レーン２〜４、５０ｍＭリン酸塩中１ｍＭストック、０．５％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン５〜７、１ｍＭストック、０％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン８、ＭＷＭ、０．５％グルタルアルデヒド；レーン９、ＭＷＭ、０％グルタルアルデヒド；レーン１０〜１２、８５０μＭストック、０％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目。
【図８Ｂ】グルタルアルデヒド架橋サンプルおよび非架橋コントロールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した、４℃（２〜８℃）での保存の１日目、４日目および７日目の、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中の形成された可溶性Ａβオリゴマーの安定性を示す図である。分子量マーカーをサイズ分布の推定として示す。レーン１、ブランク；レーン２〜４、５０ｍＭリン酸塩中８５０μＭストック、０．５％グルタルアルデヒド、それぞれ、１日目、４日目および７日目；レーン５、ＭＷＭ、０．５％グルタルアルデヒド；レーン６、ＭＷＭ、０％グルタルアルデヒド；レーン７〜１０、６５０μＭストック、０．５％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン１０〜１２、６５０μＭストック、０％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目。
【図８Ｃ】グルタルアルデヒド架橋サンプルおよび非架橋コントロールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した、４℃（２〜８℃）での保存の１日目、４日目および７日目の、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中の形成された可溶性Ａβオリゴマーの安定性を示す図である。分子量マーカーをサイズ分布の推定として示す。レーン１、ブランク；レーン２〜４、５０ｍＭリン酸塩中４５０μＭストック、０．５％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン５〜７、４５０μＭストック、０％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン８、ＭＷＭ、０．５％グルタルアルデヒド；レーン９、ＭＷＭ、０％グルタルアルデヒド；レーン１０〜１２、２５０μＭストック、０％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目。
【図８Ｄ】グルタルアルデヒド架橋サンプルおよび非架橋コントロールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した、４℃（２〜８℃）での保存の１日目、４日目および７日目の、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中の形成された可溶性Ａβオリゴマーの安定性を示す図である。分子量マーカーをサイズ分布の推定として示す。レーン１、ブランク；レーン２〜４、５０ｍＭリン酸塩中２５０μＭストック、０．５％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン５、ＭＷＭ、０．５％グルタルアルデヒド；レーン６、ＭＷＭ、０％グルタルアルデヒド；レーン７〜１０、１００μＭストック、０．５％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目；レーン１０〜１２、１００μＭストック、０％グルタルアルデヒド、それぞれ１日目、４日目および７日目。
【図９】ＰＣ−１２細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ生理活性に対する、４℃で７日間での５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ９．０）緩衝液中のＡβ４２ストック濃度の影響を示すグラフである。黒四角−５マイクロモル濃度の試験濃度、白丸−１マイクロモル濃度の試験濃度。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）有機溶媒中のＡβペプチドの濃縮ストック溶液を得るステップ；および
（ｂ）少なくとも１０ｍＭの２価アニオンを有し、少なくとも７．５のｐＨに緩衝化された水溶液に、前記ペプチドの濃縮ストック溶液を添加して、１００μＭを超える最終ペプチド濃度を有する反応混合物を形成するステップ
を含む、安定な可溶性アミロイドβ（Ａβ）オリゴマーを生成する方法であり、安定な可溶性Ａβオリゴマーが、静置した際にステップ（ｂ）の反応混合物中に形成され、前記反応混合物の少なくとも５０％を構成する前記方法。
【請求項２】
２℃〜８℃の温度でステップ（ｂ）の反応混合物をインキュベートするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サイズ排除クロマトグラフィーによってステップ（ｂ）の反応混合物を分離して、溶出したオリゴマー画分を生成するステップ、および溶出したオリゴマー画分から安定な可溶性Ａβオリゴマーを回収するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）の水溶液へのヘリックス誘導有機溶媒の添加をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ストック溶液が、２００μＭ〜９００μＭのＡβ濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
反応混合物が、７．５〜１１．０のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
２価アニオンが、リン酸イオンおよび硫酸イオンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ヘリックス誘導賦形剤が、２％〜１５％のトリフルオロエタノールである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法によって生成される、安定な可溶性Ａβオリゴマー。
【請求項１０】
５％〜５０％のグリセロールの存在下で保存される、請求項９に記載の安定な可溶性Ａβオリゴマー。
【請求項１１】
直径１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズを有する、請求項９に記載のオリゴマー。
【請求項１２】
１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を有する、請求項９に記載のオリゴマー。
【請求項１３】
動的光散乱技術によって測定した場合に直径１０ｎｍ〜１００ｎｍの寸法の粒子を含む、単離された安定な可溶性Ａβオリゴマー調製物。
【請求項１４】
１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を有する、請求項１３に記載のオリゴマー。
【請求項１５】
（ａ）有機溶媒中のＡβペプチドの濃縮ストック溶液を得るステップ；
（ｂ）少なくとも１０ｍＭの２価アニオンを有し、少なくとも７．５のｐＨに緩衝化された水溶液に、前記ペプチドの濃縮ストック溶液を添加して、１００μＭを超える最終ペプチド濃度を有する反応混合物を形成するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）の反応混合物中に形成された安定な可溶性Ａβオリゴマーをアジュバントと共に製剤化するステップ
を含む、安定な可溶性アミロイドβ（Ａβ）オリゴマーを生成する方法であり、安定な可溶性Ａβオリゴマーが、ステップ（ｂ）の反応混合物の少なくとも５０％を構成する前記方法。
【請求項１６】
２℃〜８℃の温度でステップ（ｂ）の反応混合物をインキュベートするステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サイズ排除クロマトグラフィーによってステップ（ｂ）の反応混合物を分離して、溶出したオリゴマー画分を生成するステップ、および溶出したオリゴマー画分から安定な可溶性Ａβオリゴマーを回収するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）の水溶液へのヘリックス誘導有機溶媒の添加をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ヘリックス誘導賦形剤が、２％〜１５％のトリフルオロエタノールである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法によって生成される、安定な可溶性Ａβオリゴマー。
【請求項２１】
５％〜５０％のグリセロールの存在下で保存される、請求項２０に記載の安定な可溶性Ａβオリゴマー。
【請求項２２】
直径１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズを有する、請求項２０に記載のオリゴマー。
【請求項２３】
１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を有する、請求項２０に記載のオリゴマー。
【請求項１】
（ａ）有機溶媒中のＡβペプチドの濃縮ストック溶液を得るステップ；および
（ｂ）少なくとも１０ｍＭの２価アニオンを有し、少なくとも７．５のｐＨに緩衝化された水溶液に、前記ペプチドの濃縮ストック溶液を添加して、１００μＭを超える最終ペプチド濃度を有する反応混合物を形成するステップ
を含む、安定な可溶性アミロイドβ（Ａβ）オリゴマーを生成する方法であり、安定な可溶性Ａβオリゴマーが、静置した際にステップ（ｂ）の反応混合物中に形成され、前記反応混合物の少なくとも５０％を構成する前記方法。
【請求項２】
２℃〜８℃の温度でステップ（ｂ）の反応混合物をインキュベートするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サイズ排除クロマトグラフィーによってステップ（ｂ）の反応混合物を分離して、溶出したオリゴマー画分を生成するステップ、および溶出したオリゴマー画分から安定な可溶性Ａβオリゴマーを回収するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）の水溶液へのヘリックス誘導有機溶媒の添加をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ストック溶液が、２００μＭ〜９００μＭのＡβ濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
反応混合物が、７．５〜１１．０のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
２価アニオンが、リン酸イオンおよび硫酸イオンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ヘリックス誘導賦形剤が、２％〜１５％のトリフルオロエタノールである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法によって生成される、安定な可溶性Ａβオリゴマー。
【請求項１０】
５％〜５０％のグリセロールの存在下で保存される、請求項９に記載の安定な可溶性Ａβオリゴマー。
【請求項１１】
直径１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズを有する、請求項９に記載のオリゴマー。
【請求項１２】
１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を有する、請求項９に記載のオリゴマー。
【請求項１３】
動的光散乱技術によって測定した場合に直径１０ｎｍ〜１００ｎｍの寸法の粒子を含む、単離された安定な可溶性Ａβオリゴマー調製物。
【請求項１４】
１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を有する、請求項１３に記載のオリゴマー。
【請求項１５】
（ａ）有機溶媒中のＡβペプチドの濃縮ストック溶液を得るステップ；
（ｂ）少なくとも１０ｍＭの２価アニオンを有し、少なくとも７．５のｐＨに緩衝化された水溶液に、前記ペプチドの濃縮ストック溶液を添加して、１００μＭを超える最終ペプチド濃度を有する反応混合物を形成するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）の反応混合物中に形成された安定な可溶性Ａβオリゴマーをアジュバントと共に製剤化するステップ
を含む、安定な可溶性アミロイドβ（Ａβ）オリゴマーを生成する方法であり、安定な可溶性Ａβオリゴマーが、ステップ（ｂ）の反応混合物の少なくとも５０％を構成する前記方法。
【請求項１６】
２℃〜８℃の温度でステップ（ｂ）の反応混合物をインキュベートするステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サイズ排除クロマトグラフィーによってステップ（ｂ）の反応混合物を分離して、溶出したオリゴマー画分を生成するステップ、および溶出したオリゴマー画分から安定な可溶性Ａβオリゴマーを回収するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）の水溶液へのヘリックス誘導有機溶媒の添加をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ヘリックス誘導賦形剤が、２％〜１５％のトリフルオロエタノールである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法によって生成される、安定な可溶性Ａβオリゴマー。
【請求項２１】
５％〜５０％のグリセロールの存在下で保存される、請求項２０に記載の安定な可溶性Ａβオリゴマー。
【請求項２２】
直径１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズを有する、請求項２０に記載のオリゴマー。
【請求項２３】
１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を有する、請求項２０に記載のオリゴマー。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５００３２６（Ｐ２００９−５００３２６Ａ）
【公表日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１９４４３（Ｐ２００８−５１９４４３）
【出願日】平成１８年６月２６日（２００６．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２４７４４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００５３５９
【国際公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２６日（２００６．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２４７４４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００５３５９
【国際公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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