高感度のマーカー分析および分子検出のための方法および組成物
分子の高感度検出のための方法、キット、および組成物を開示する。これらの方法、キット、および組成物は、試料中の分子の濃度を１フェムトモル、１アトモル、またはそれ以下のレベルまで決定する際に有用である。これらの方法、キット、および組成物は、試料の希釈を必要としないで、広範囲、例えば７ｌｏｇの範囲にわたる濃度の決定も可能にする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の単一タンパク質分子を検出するためのアナライザーシステムキットであって、前記キットは、アナライザーと、蛍光部分および前記タンパク質分子の結合相手を含む少なくとも１つの標識とを含み、前記アナライザーは、
ａ）前記蛍光部分を刺激するための電磁放射線源、
ｂ）前記標識を通過させるためのキャピラリーフローセル、
ｃ）前記キャピラリーフローセル内で前記標識を移動するための原動力源、
ｄ）前記電磁放射線源から放出される電磁放射線を受け取るための、前記キャピラリーフローセル内に画定されるインタロゲーション空間、および
ｅ）前記刺激された蛍光部分の電磁気特性を測定するための、前記インタロゲーション空間に作動可能に接続された電磁放射線検出器
を含み、前記蛍光部分は該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによって前記スポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下であるキット。
【請求項２】
前記電磁放射線源がレーザーであり、前記レーザーは少なくとも約３、５、１０または２０ｍＷの出力を有する、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項３】
前記蛍光部分が蛍光分子を含む、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項４】
前記蛍光分子が色素分子である、請求項３に記載のアナライザーシステム。
【請求項５】
前記色素分子が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含み、前記インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役物質を含む、請求項４に記載のアナライザーシステム。
【請求項６】
前記インタロゲーション空間を１つだけ含む、請求項１に記載のアナライザーシステムキット。
【請求項７】
前記電磁放射線源が連続波電磁放射線源である、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項８】
前記連続波電磁放射線源が発光ダイオードまたは連続波レーザーである、請求項７に記載のアナライザーシステム。
【請求項９】
前記原動力が圧力である、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項１０】
前記検出器がアバランシェフォトダイオード検出器である、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項１１】
前記インタロゲーション空間にレーザー光を屈折させ、前記刺激された色素分子を画像化するための共焦点光学配置をさらに含み、前記共焦点光学配置は少なくとも約０．８の開口数を有する対物レンズを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
複数の試料を自動的に採取し、試料容器と前記インタロゲーション空間の間の流体連通(fluid communication)を提供することが可能な試料採取システムをさらに含む、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項１３】
前記インタロゲーション空間と流体連通した試料回収システムをさらに含み、前記回収システムは前記試料の実質的にすべてを回収することが可能である、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項１４】
生体試料中のタンパク質の単一分子の有無を判定する方法であって、前記分子を標識で標識する工程と、単一分子検出器で前記標識の有無を検出する工程とを含み、前記標識は、その蛍光部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができる蛍光部分を含み、該レーザーは該蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、該レーザーによって該スポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である方法。
【請求項１５】
前記試料中の前記単一分子の検出限界は、約１０、１、０．１、０．０１または０．００１フェムトモル未満である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出限界が約１フェムトモル未満である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出工程が前記蛍光部分によって放出される電磁放射線を検出することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記単一分子検出器がインタロゲーション空間を１つだけ含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記蛍光部分を電磁放射線に曝露することをさらに含み、前記電磁放射線はレーザーによって提供される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記レーザーが約２０ｍＷ未満の出力で前記部分を刺激する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記レーザーが約１０００、２５０、１００、５０、２５または１０マイクロ秒未満の間、前記部分を刺激する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識が前記分子との結合に特異的な結合相手をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記結合相手が抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光部分が蛍光色素分子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記色素分子が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含み、該インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役物質を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記色素分子がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択されるＡｌｅｘＦｌｕｏｒ分子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２７】
前記色素分子がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素分子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記蛍光部分が複数のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７分子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７分子が約２〜４個のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７分子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記蛍光部分が量子ドットである、請求項１４に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料中のタンパク質の濃度を測定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３２】
前記標識の有無の前記検出が、
（ｉ）前記試料の一部をインタロゲーション空間に通過させる工程と、
（ｉｉ）前記標識が存在する場合、前記蛍光部分を刺激して光子を放出するのに十分な電磁放射線への曝露を前記インタロゲーション空間に享受させる工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の前記曝露の間に放出される光子を検出する工程と
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３３】
前記インタロゲーション空間のバックグラウンド光子レベルを決定することをさらに含み、前記バックグラウンドレベルは、工程（ｉｉ）の場合と同様であるが前記インタロゲーション空間における標識なしで電磁放射線を該インタロゲーション空間に享受させた場合の該インタロゲーション空間の平均光子放出を表す、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｉｉｉ）で検出される光子の量を閾値光子レベルと比較することをさらに含み、ここで、前記閾値光子レベルは前記バックグラウンド光子レベルの関数であり、工程（ｉｉｉ）で検出される光子の量が閾値レベルよりも多い場合は前記標識が存在することを示し、工程（ｉｉｉ）で検出される光子の量が閾値レベル以下である場合は前記標識が無いことを示す、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
対象における生物学的状態の有無を判断するための方法であって、
ａ）前記対象から得られる試料のイムノアッセイを実施する工程であって、前記イムノアッセイはマーカーの複数の標識を前記試料中の複数の前記マーカー分子に結合することを含み、前記標識は前記マーカーに特異的であり、１つの標識はマーカー１分子と結合し、前記標識は、蛍光部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができる蛍光部分と結合した抗体を含み、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である工程と、
ｂ）単一分子検出器で単一の標識を検出することを含む、前記標識を検出する工程と、
ｃ）工程ｂ）で検出される標識数に基づいて前記試料中の前記マーカーの濃度を決定する工程と
を含む方法。
【請求項３６】
工程ｂ）で得られる前記濃度を、前記生物学的状態の有無を示すことが既知である前記マーカーの濃度または濃度範囲と比較することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
蛍光部分に結合する生体分子の結合相手を含む、前記生体分子を検出するための標識であって、前記蛍光部分は該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下であり、前記蛍光部分は約２〜４個の蛍光実体を含む標識。
【請求項３８】
前記生体分子がタンパク質または小分子である、請求項３７に記載の標識。
【請求項３９】
前記生体分子がタンパク質である、請求項３８に記載の標識。
【請求項４０】
前記蛍光実体が蛍光色素分子を含む、請求項３７に記載の標識。
【請求項４１】
前記蛍光色素分子が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含み、該インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役物質を含む、請求項３７に記載の標識。
【請求項４２】
前記色素分子がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択されるＡｌｅｘＦｌｕｏｒ分子である、請求項４０に記載の標識。
【請求項４３】
前記色素分子がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素分子である、請求項４２に記載の標識。
【請求項４４】
前記結合相手が抗体である、請求項３７に記載の標識。
【請求項４５】
前記色素分子が第１の型および第２の型の色素分子を含む、請求項３７に記載の標識タンパク質。
【請求項４６】
前記第１の型および第２の型の色素分子が異なる発光スペクトルを有する、請求項４５に記載の標識タンパク質。
【請求項４７】
色素分子の第１の型の数と第２の型の数との比が、約３：１、２：１、１：１、１：２または１：３である、請求項４６に記載の標識タンパク質。
【請求項４８】
試料中の種の濃度を決定するアナライザーであって、少なくとも約１０５の濃度のダイナミックレンジにわたって前記濃度を決定することができるアナライザー。
【請求項４９】
前記ダイナミックレンジが約１フェムトモルから約１００ピコモルである、請求項４８に記載のアナライザー。
【請求項５０】
生物学的状態のマーカーを確立する方法であって、
ｉ）第１の集団から得られる生体試料中の前記マーカーの濃度範囲を確立する工程を含み、該確立工程は前記マーカーの単一分子を検出することによって前記生体試料中の前記マーカーの濃度を測定することを含む、方法。
【請求項５１】
前記第１の集団が前記生物学的状態を示さない集団である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
第２の集団から得られる生体試料中の前記マーカーのレベル範囲の範囲を確立する工程をさらに含み、前記第２の集団のメンバーが前記生物学的状態を示し、前記確立工程が、前記マーカーの単一分子を検出することによって前記生体試料中の前記マーカーのレベルを測定することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１および第２の集団が異なる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第２の集団の少なくとも１つのメンバーは前記第１の集団のメンバーであるか、または前記第１の集団の少なくとも１つのメンバーは前記第２の集団のメンバーである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
第２の集団の実質的にすべてのメンバーが前記生物学的状態を発現した第１の集団のメンバーである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記マーカーの単一分子の前記検出が、前記マーカーの検出限界が約１０００、１００、５０、２０、１０、５、１、または０．５フェムトモル未満の前記試料中の前記マーカーである方法を用いて実施される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記生物学的状態が表現型の状態、生物に影響を及ぼす状態、発現状態、年齢、健康、病状、疾患、疾患過程、病状期、感染、毒性、または化学因子、環境因子、もしくは薬物因子に対する応答（例えば薬物応答フェノタイピング、薬物毒性フェノタイピング、または薬剤効果フェノタイピング）である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記生物学的状態が病状である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記マーカーがポリペプチドまたは小分子である、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
前記状態が疾患状態である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記疾患状態が、癌、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経疾患、感染症、および妊娠関連障害からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記状態が病状期の状態である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記病状期の状態が癌病状期の状態である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記状態が治療応答の状態である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
前記治療が薬物治療である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記応答が治療効果および副作用からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記応答が治療効果である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記応答が副作用である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記副作用が有害作用である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記検出が、蛍光部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができる蛍光部分を含む標識で前記マーカーを標識することを含み、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である、請求項５０に記載の方法。
【請求項７１】
前記蛍光部分が、少なくとも１つの置換インドリウム環系を含む分子を含み、該インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役物質基を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記蛍光部分が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される色素を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記標識が前記マーカーの結合相手をさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記結合相手が前記マーカーに特異的な抗体を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗体がポリクローナル抗体を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１および第２の範囲に基づいて前記マーカーの閾値レベルを確立することをさらに含み、個体から得られる生体試料中の前記閾値レベルを上回るレベルの前記マーカーの存在は、前記個体における前記生物学的状態の存在の実質的により高い可能性を示す、請求項５０に記載の方法。
【請求項７９】
生物の生物学的状態の有無を検出するための方法であって、
ｉ）前記生物から得られる生体試料中のマーカーの濃度を測定する工程、この場合、前記マーカーは請求項５０に記載の方法によって確立されるマーカーである、および
ｉｉ）前記生物の前記マーカーの濃度に基づいて前記生物学的状態の有無を判定する工程
を含む方法。
【請求項８０】
生物の生物学的状態の有無を検出するための方法であって、
ｉ）前記生物から得られる複数の生体試料中のマーカーの濃度を測定する工程、この場合、前記マーカーは請求項５０に記載の方法によって確立されるマーカーである、および
ｉｉ）前記複数の試料中の前記マーカーの前記濃度に基づいて前記生物学的状態の有無を判定する工程
を含む方法。
【請求項８１】
前記試料は異なる種類のものである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記判定工程が、前記異なる種類の試料中の前記マーカーの濃度の比較に基づく、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記試料が同じ種類であり、間隔をあけて採取される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記生体試料が血液、血漿または血清である、請求項５０に記載の方法。
【請求項８５】
生物の生物学的状態と関連する１つ以上のマーカーを請求項１に記載のシステムを用いて特定する工程と、前記１つ以上のマーカーを、前記生物の前記生物学的状態の有無を検出するための診断薬として商品化する工程とを含むビジネス方法。
【請求項８６】
前記１つ以上のマーカーがポリペプチドまたは小分子である、請求項８５に記載のビジネス方法。
【請求項８７】
前記１つ以上のマーカーが新規の化学実体である、請求項８５に記載のビジネス方法。
【請求項８８】
報酬に対して診断サービスを実施する工程をさらに含む、請求項８５に記載のビジネス方法。
【請求項８９】
前記１つ以上のバイオマーカーに基づく診断製品を販売する工程をさらに含む、請求項８５に記載のビジネス方法。
【請求項９０】
生物の生物学的状態と関連する１つ以上のマーカーを請求項５０１に記載のシステムを用いて特定する工程と、前記生物が前記生物学的状態を有するか否かを判定する診断サービスを提供する工程とを含むビジネス方法。
【請求項９１】
前記診断サービスがＣＬＩＡ認定の研究所によって提供される、請求項９０に記載のビジネス方法。
【請求項９２】
前記診断サービスが医療サービス提供者、保険業者、または患者に提供される、請求項９１に記載のビジネス方法。
【請求項９３】
マーカーを検出するための標識であって、前記標識は前記マーカーの結合相手および蛍光部分を含み、前記蛍光部分は該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である標識。
【請求項９４】
前記蛍光部分が蛍光分子を含む、請求項９３に記載の標識。
【請求項９５】
前記蛍光部分が複数の蛍光分子を含む、請求項９４に記載の標識。
【請求項９６】
前記標識が約２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１０、３〜８、３〜６個の蛍光分子を含む、請求項９５に記載の標識。
【請求項９７】
前記標識が約２〜４個の蛍光分子を含む、請求項９６に記載の標識。
【請求項９８】
前記蛍光色素分子が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含み、該インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役物質を含む、請求項９７に記載の標識。
【請求項９９】
前記蛍光分子が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される、請求項９７に記載の標識。
【請求項１００】
前記蛍光分子が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される、請求項９に記載の標識。
【請求項１０１】
前記結合相手が抗体を含む、請求項９３に記載の標識。
【請求項１０２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０１に記載の標識。
【請求項１０３】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１０２に記載の標識。
【請求項１０４】
前記抗体が炎症マーカーに特異的である、請求項１０１に記載の標識。
【請求項１０５】
前記抗体が、ケモカイン、成長因子、プロテアーゼおよび阻害剤、細胞接着分子、幹細胞因子、シグナル伝達およびアポトーシスの分子、神経栄養因子、ならびに発現タンパク質からなる群から選択されるマーカーに特異的である、請求項１０４に記載の標識。
【請求項１０６】
前記抗体が成長因子に特異的である、請求項１０５に記載の標識。
【請求項１０７】
前記抗体がサイトカインに特異的である、請求項１０１に記載の標識。
【請求項１０８】
前記サイトカインが、請求項１０８に記載の標識。
【請求項１０９】
前記蛍光部分が蛍光分子を含む、請求項１０１に記載の標識。
【請求項１１０】
前記蛍光部分が複数の蛍光分子を含む、請求項１１０に記載の標識。
【請求項１１１】
前記標識が約２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１０、３〜８、３〜６個の蛍光分子を含む、請求項１１１に記載の標識。
【請求項１１２】
前記標識が約２〜４個の蛍光分子を含む、請求項１１２に記載の標識。
【請求項１１３】
前記蛍光色素分子が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含み、該インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役物質を含む、請求項１１２に記載の標識。
【請求項１１４】
前記蛍光分子が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される、請求項１１２に記載の標識。
【請求項１１５】
前記蛍光分子が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される、請求項１０１に記載の標識。
【請求項１１６】
前記蛍光分子がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７分子である、請求項１０１に記載の標識。
【請求項１】
試料中の単一タンパク質分子を検出するためのアナライザーシステムキットであって、前記キットは、アナライザーと、蛍光部分および前記タンパク質分子の結合相手を含む少なくとも１つの標識とを含み、前記アナライザーは、
ａ）前記蛍光部分を刺激するための電磁放射線源、
ｂ）前記標識を通過させるためのキャピラリーフローセル、
ｃ）前記キャピラリーフローセル内で前記標識を移動するための原動力源、
ｄ）前記電磁放射線源から放出される電磁放射線を受け取るための、前記キャピラリーフローセル内に画定されるインタロゲーション空間、および
ｅ）前記刺激された蛍光部分の電磁気特性を測定するための、前記インタロゲーション空間に作動可能に接続された電磁放射線検出器
を含み、前記蛍光部分は該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによって前記スポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下であるキット。
【請求項２】
前記電磁放射線源がレーザーであり、前記レーザーは少なくとも約３、５、１０または２０ｍＷの出力を有する、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項３】
前記蛍光部分が蛍光分子を含む、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項４】
前記蛍光分子が色素分子である、請求項３に記載のアナライザーシステム。
【請求項５】
前記色素分子が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含み、前記インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役物質を含む、請求項４に記載のアナライザーシステム。
【請求項６】
前記インタロゲーション空間を１つだけ含む、請求項１に記載のアナライザーシステムキット。
【請求項７】
前記電磁放射線源が連続波電磁放射線源である、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項８】
前記連続波電磁放射線源が発光ダイオードまたは連続波レーザーである、請求項７に記載のアナライザーシステム。
【請求項９】
前記原動力が圧力である、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項１０】
前記検出器がアバランシェフォトダイオード検出器である、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項１１】
前記インタロゲーション空間にレーザー光を屈折させ、前記刺激された色素分子を画像化するための共焦点光学配置をさらに含み、前記共焦点光学配置は少なくとも約０．８の開口数を有する対物レンズを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
複数の試料を自動的に採取し、試料容器と前記インタロゲーション空間の間の流体連通(fluid communication)を提供することが可能な試料採取システムをさらに含む、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項１３】
前記インタロゲーション空間と流体連通した試料回収システムをさらに含み、前記回収システムは前記試料の実質的にすべてを回収することが可能である、請求項１に記載のアナライザーシステム。
【請求項１４】
生体試料中のタンパク質の単一分子の有無を判定する方法であって、前記分子を標識で標識する工程と、単一分子検出器で前記標識の有無を検出する工程とを含み、前記標識は、その蛍光部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができる蛍光部分を含み、該レーザーは該蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、該レーザーによって該スポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である方法。
【請求項１５】
前記試料中の前記単一分子の検出限界は、約１０、１、０．１、０．０１または０．００１フェムトモル未満である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出限界が約１フェムトモル未満である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出工程が前記蛍光部分によって放出される電磁放射線を検出することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記単一分子検出器がインタロゲーション空間を１つだけ含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記蛍光部分を電磁放射線に曝露することをさらに含み、前記電磁放射線はレーザーによって提供される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記レーザーが約２０ｍＷ未満の出力で前記部分を刺激する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記レーザーが約１０００、２５０、１００、５０、２５または１０マイクロ秒未満の間、前記部分を刺激する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識が前記分子との結合に特異的な結合相手をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記結合相手が抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光部分が蛍光色素分子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記色素分子が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含み、該インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役物質を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記色素分子がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択されるＡｌｅｘＦｌｕｏｒ分子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２７】
前記色素分子がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素分子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記蛍光部分が複数のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７分子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７分子が約２〜４個のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７分子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記蛍光部分が量子ドットである、請求項１４に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料中のタンパク質の濃度を測定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３２】
前記標識の有無の前記検出が、
（ｉ）前記試料の一部をインタロゲーション空間に通過させる工程と、
（ｉｉ）前記標識が存在する場合、前記蛍光部分を刺激して光子を放出するのに十分な電磁放射線への曝露を前記インタロゲーション空間に享受させる工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の前記曝露の間に放出される光子を検出する工程と
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３３】
前記インタロゲーション空間のバックグラウンド光子レベルを決定することをさらに含み、前記バックグラウンドレベルは、工程（ｉｉ）の場合と同様であるが前記インタロゲーション空間における標識なしで電磁放射線を該インタロゲーション空間に享受させた場合の該インタロゲーション空間の平均光子放出を表す、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｉｉｉ）で検出される光子の量を閾値光子レベルと比較することをさらに含み、ここで、前記閾値光子レベルは前記バックグラウンド光子レベルの関数であり、工程（ｉｉｉ）で検出される光子の量が閾値レベルよりも多い場合は前記標識が存在することを示し、工程（ｉｉｉ）で検出される光子の量が閾値レベル以下である場合は前記標識が無いことを示す、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
対象における生物学的状態の有無を判断するための方法であって、
ａ）前記対象から得られる試料のイムノアッセイを実施する工程であって、前記イムノアッセイはマーカーの複数の標識を前記試料中の複数の前記マーカー分子に結合することを含み、前記標識は前記マーカーに特異的であり、１つの標識はマーカー１分子と結合し、前記標識は、蛍光部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができる蛍光部分と結合した抗体を含み、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である工程と、
ｂ）単一分子検出器で単一の標識を検出することを含む、前記標識を検出する工程と、
ｃ）工程ｂ）で検出される標識数に基づいて前記試料中の前記マーカーの濃度を決定する工程と
を含む方法。
【請求項３６】
工程ｂ）で得られる前記濃度を、前記生物学的状態の有無を示すことが既知である前記マーカーの濃度または濃度範囲と比較することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
蛍光部分に結合する生体分子の結合相手を含む、前記生体分子を検出するための標識であって、前記蛍光部分は該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下であり、前記蛍光部分は約２〜４個の蛍光実体を含む標識。
【請求項３８】
前記生体分子がタンパク質または小分子である、請求項３７に記載の標識。
【請求項３９】
前記生体分子がタンパク質である、請求項３８に記載の標識。
【請求項４０】
前記蛍光実体が蛍光色素分子を含む、請求項３７に記載の標識。
【請求項４１】
前記蛍光色素分子が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含み、該インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役物質を含む、請求項３７に記載の標識。
【請求項４２】
前記色素分子がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択されるＡｌｅｘＦｌｕｏｒ分子である、請求項４０に記載の標識。
【請求項４３】
前記色素分子がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素分子である、請求項４２に記載の標識。
【請求項４４】
前記結合相手が抗体である、請求項３７に記載の標識。
【請求項４５】
前記色素分子が第１の型および第２の型の色素分子を含む、請求項３７に記載の標識タンパク質。
【請求項４６】
前記第１の型および第２の型の色素分子が異なる発光スペクトルを有する、請求項４５に記載の標識タンパク質。
【請求項４７】
色素分子の第１の型の数と第２の型の数との比が、約３：１、２：１、１：１、１：２または１：３である、請求項４６に記載の標識タンパク質。
【請求項４８】
試料中の種の濃度を決定するアナライザーであって、少なくとも約１０５の濃度のダイナミックレンジにわたって前記濃度を決定することができるアナライザー。
【請求項４９】
前記ダイナミックレンジが約１フェムトモルから約１００ピコモルである、請求項４８に記載のアナライザー。
【請求項５０】
生物学的状態のマーカーを確立する方法であって、
ｉ）第１の集団から得られる生体試料中の前記マーカーの濃度範囲を確立する工程を含み、該確立工程は前記マーカーの単一分子を検出することによって前記生体試料中の前記マーカーの濃度を測定することを含む、方法。
【請求項５１】
前記第１の集団が前記生物学的状態を示さない集団である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
第２の集団から得られる生体試料中の前記マーカーのレベル範囲の範囲を確立する工程をさらに含み、前記第２の集団のメンバーが前記生物学的状態を示し、前記確立工程が、前記マーカーの単一分子を検出することによって前記生体試料中の前記マーカーのレベルを測定することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１および第２の集団が異なる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第２の集団の少なくとも１つのメンバーは前記第１の集団のメンバーであるか、または前記第１の集団の少なくとも１つのメンバーは前記第２の集団のメンバーである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
第２の集団の実質的にすべてのメンバーが前記生物学的状態を発現した第１の集団のメンバーである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記マーカーの単一分子の前記検出が、前記マーカーの検出限界が約１０００、１００、５０、２０、１０、５、１、または０．５フェムトモル未満の前記試料中の前記マーカーである方法を用いて実施される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記生物学的状態が表現型の状態、生物に影響を及ぼす状態、発現状態、年齢、健康、病状、疾患、疾患過程、病状期、感染、毒性、または化学因子、環境因子、もしくは薬物因子に対する応答（例えば薬物応答フェノタイピング、薬物毒性フェノタイピング、または薬剤効果フェノタイピング）である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記生物学的状態が病状である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記マーカーがポリペプチドまたは小分子である、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
前記状態が疾患状態である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記疾患状態が、癌、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経疾患、感染症、および妊娠関連障害からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記状態が病状期の状態である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記病状期の状態が癌病状期の状態である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記状態が治療応答の状態である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
前記治療が薬物治療である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記応答が治療効果および副作用からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記応答が治療効果である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記応答が副作用である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記副作用が有害作用である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記検出が、蛍光部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができる蛍光部分を含む標識で前記マーカーを標識することを含み、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である、請求項５０に記載の方法。
【請求項７１】
前記蛍光部分が、少なくとも１つの置換インドリウム環系を含む分子を含み、該インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役物質基を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記蛍光部分が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される色素を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記標識が前記マーカーの結合相手をさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記結合相手が前記マーカーに特異的な抗体を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗体がポリクローナル抗体を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１および第２の範囲に基づいて前記マーカーの閾値レベルを確立することをさらに含み、個体から得られる生体試料中の前記閾値レベルを上回るレベルの前記マーカーの存在は、前記個体における前記生物学的状態の存在の実質的により高い可能性を示す、請求項５０に記載の方法。
【請求項７９】
生物の生物学的状態の有無を検出するための方法であって、
ｉ）前記生物から得られる生体試料中のマーカーの濃度を測定する工程、この場合、前記マーカーは請求項５０に記載の方法によって確立されるマーカーである、および
ｉｉ）前記生物の前記マーカーの濃度に基づいて前記生物学的状態の有無を判定する工程
を含む方法。
【請求項８０】
生物の生物学的状態の有無を検出するための方法であって、
ｉ）前記生物から得られる複数の生体試料中のマーカーの濃度を測定する工程、この場合、前記マーカーは請求項５０に記載の方法によって確立されるマーカーである、および
ｉｉ）前記複数の試料中の前記マーカーの前記濃度に基づいて前記生物学的状態の有無を判定する工程
を含む方法。
【請求項８１】
前記試料は異なる種類のものである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記判定工程が、前記異なる種類の試料中の前記マーカーの濃度の比較に基づく、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記試料が同じ種類であり、間隔をあけて採取される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記生体試料が血液、血漿または血清である、請求項５０に記載の方法。
【請求項８５】
生物の生物学的状態と関連する１つ以上のマーカーを請求項１に記載のシステムを用いて特定する工程と、前記１つ以上のマーカーを、前記生物の前記生物学的状態の有無を検出するための診断薬として商品化する工程とを含むビジネス方法。
【請求項８６】
前記１つ以上のマーカーがポリペプチドまたは小分子である、請求項８５に記載のビジネス方法。
【請求項８７】
前記１つ以上のマーカーが新規の化学実体である、請求項８５に記載のビジネス方法。
【請求項８８】
報酬に対して診断サービスを実施する工程をさらに含む、請求項８５に記載のビジネス方法。
【請求項８９】
前記１つ以上のバイオマーカーに基づく診断製品を販売する工程をさらに含む、請求項８５に記載のビジネス方法。
【請求項９０】
生物の生物学的状態と関連する１つ以上のマーカーを請求項５０１に記載のシステムを用いて特定する工程と、前記生物が前記生物学的状態を有するか否かを判定する診断サービスを提供する工程とを含むビジネス方法。
【請求項９１】
前記診断サービスがＣＬＩＡ認定の研究所によって提供される、請求項９０に記載のビジネス方法。
【請求項９２】
前記診断サービスが医療サービス提供者、保険業者、または患者に提供される、請求項９１に記載のビジネス方法。
【請求項９３】
マーカーを検出するための標識であって、前記標識は前記マーカーの結合相手および蛍光部分を含み、前記蛍光部分は該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である標識。
【請求項９４】
前記蛍光部分が蛍光分子を含む、請求項９３に記載の標識。
【請求項９５】
前記蛍光部分が複数の蛍光分子を含む、請求項９４に記載の標識。
【請求項９６】
前記標識が約２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１０、３〜８、３〜６個の蛍光分子を含む、請求項９５に記載の標識。
【請求項９７】
前記標識が約２〜４個の蛍光分子を含む、請求項９６に記載の標識。
【請求項９８】
前記蛍光色素分子が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含み、該インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役物質を含む、請求項９７に記載の標識。
【請求項９９】
前記蛍光分子が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される、請求項９７に記載の標識。
【請求項１００】
前記蛍光分子が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される、請求項９に記載の標識。
【請求項１０１】
前記結合相手が抗体を含む、請求項９３に記載の標識。
【請求項１０２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０１に記載の標識。
【請求項１０３】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１０２に記載の標識。
【請求項１０４】
前記抗体が炎症マーカーに特異的である、請求項１０１に記載の標識。
【請求項１０５】
前記抗体が、ケモカイン、成長因子、プロテアーゼおよび阻害剤、細胞接着分子、幹細胞因子、シグナル伝達およびアポトーシスの分子、神経栄養因子、ならびに発現タンパク質からなる群から選択されるマーカーに特異的である、請求項１０４に記載の標識。
【請求項１０６】
前記抗体が成長因子に特異的である、請求項１０５に記載の標識。
【請求項１０７】
前記抗体がサイトカインに特異的である、請求項１０１に記載の標識。
【請求項１０８】
前記サイトカインが、請求項１０８に記載の標識。
【請求項１０９】
前記蛍光部分が蛍光分子を含む、請求項１０１に記載の標識。
【請求項１１０】
前記蛍光部分が複数の蛍光分子を含む、請求項１１０に記載の標識。
【請求項１１１】
前記標識が約２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１０、３〜８、３〜６個の蛍光分子を含む、請求項１１１に記載の標識。
【請求項１１２】
前記標識が約２〜４個の蛍光分子を含む、請求項１１２に記載の標識。
【請求項１１３】
前記蛍光色素分子が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含み、該インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役物質を含む、請求項１１２に記載の標識。
【請求項１１４】
前記蛍光分子が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される、請求項１１２に記載の標識。
【請求項１１５】
前記蛍光分子が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される、請求項１０１に記載の標識。
【請求項１１６】
前記蛍光分子がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７分子である、請求項１０１に記載の標識。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１４Ｆ】
【図１５】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１４Ｆ】
【図１５】
【公表番号】特表２００９−５３６７２７（Ｐ２００９−５３６７２７Ａ）
【公表日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０４２７７（Ｐ２００９−５０４２７７）
【出願日】平成１９年４月４日（２００７．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８３９４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４８３７１
【国際公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【出願人】（５０８２９６３４７）シングレックス，インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月４日（２００７．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８３９４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４８３７１
【国際公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【出願人】（５０８２９６３４７）シングレックス，インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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