高機能硝化細菌及び当該細菌を用いた尿素又はアンモニアの浄化方法
【課題】硝化能を有し、化学栄養独立栄養細菌と比較して生育速度が速くかつ保存・輸送特性に優れた新規細菌を提供する。
【解決手段】ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）に属し、かつ芽胞形成能及び硝化能を有する新規細菌。
【解決手段】ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）に属し、かつ芽胞形成能及び硝化能を有する新規細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硝化作用を有する新規細菌及び当該新規細菌を含有する硝化用組成物、並びにこれらを用いた尿素又はアンモニアの浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
浄化槽の微生物相の早期立ち上げや、なんらかの要因で浄化槽中の良好な状態の微生物相が崩壊した場合の解決策の一つとして、有機物等の分解能に優れた微生物を含んだシーディング剤の投入という手段が考えられる（特許文献１、２及び非特許文献１）。これまでのシーディング剤使用の経験から、その効果として汚泥の減容化、硝化・脱窒能の促進が挙げられているが、それら効果の根拠となる個別の微生物の機能について詳しいことは解っていない。シーディング剤の効能については経験的に実証されているものの、シーディング剤を使用することにより、廃水処理にさらなるコストが負荷されることが問題として挙げられる。2005年5月に公布された浄化槽法の改正により、浄化槽設置後一定期間後義務付けられている水質検査の期間を短縮される項目が盛り込まれた。これは浄化槽の能力の向上や、効果的なシーディング剤が使われ始めたことによる。その一方では、浄化槽がより短期間に必要な能力を発揮することが求められることになり、その結果、安価で確実に効果を向上させることができるシーディング剤の供給が求められている。
【０００３】
一般的に硝化反応は好気条件下でニトロソモナス（Nitrosomonas）属細菌に代表されるアンモニア酸化細菌によってアンモニウムイオンが亜硝酸イオンに変換され、生成した亜硝酸イオンは同じく好気条件下でニトロバクター（Nitrobacter）属細菌に代表される亜硝酸酸化細菌によって硝酸イオンに変換されるものと考えられている（特許文献３及び４）。これら硝化反応に関与する細菌は化学栄養独立栄養細菌と呼ばれ、アンモニウムイオンや亜硝酸イオンから受け取った電子のみでエネルギー生産と炭酸ガスの固定を始めとした生合成反応を行っており、大腸菌のような代表的な従属栄養細菌と比較して、生育が極めて遅いのが特徴である。
【０００４】
上記の通り、本来硝化反応を行うと考えられてきた細菌は生育が極めて遅いことから（非特許文献２及び３）、廃水処理設備の好気槽中で増殖し、安定した硝化反応を行うまでに時間がかかるものと考えられる。また別途培養して廃水処理施設の好気槽の立ち上げに投入することは可能であるが、培養に時間がかかることや、液体で運用することが望ましいと考えられることから、調整に時間がかかると共に、保存期間がある程度限られる、輸送の際には水も一緒に輸送しなければならない等、コスト面で好ましくない要因が存在する。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−３１６１９９号
【特許文献２】特許公開２００３−３３４５９８
【特許文献３】特開２００１−２４６３９７号
【特許文献４】特開２００６−３４６５８９号
【非特許文献１】微生物による環境改善 微生物製剤は役に立つのか 中村和憲著（2002年）p126
【非特許文献２】日本微生物生態学会編 微生物の生態19 物質循環における微生物の役割 学会出版センター（1995） p21
【非特許文献３】生物学的排水処理工学 北尾高嶺著 コロナ社（2003）p159
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、上述したような実情に鑑み、廃水等に含まれるアンモニアや尿素を速やかに硝化することができる新規細菌、特に、化学栄養独立栄養細菌と比較して生育速度が速い従属栄養細菌に属し、かつ保存・輸送特性に優れた新規細菌を提供すること、及びこれらを利用した尿素又はアンモニアの浄化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため、家畜ふんや下水消化汚泥などを混合し、堆積一次発酵を行って作製したシーディング剤を分離源として上記特性を有する細菌を単離、同定すべく鋭意検討した結果、公知の細菌には分類されない新規細菌を単離、同定することができた。本発明は、かかる新規細菌が、従属栄養細菌であるブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）に属し、かつ芽胞形成能と硝化能とを有するという知見に基づいている。
【０００８】
本発明に係る新規細菌は、ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillus sp.)に属し、かつ芽胞形成能と硝化能とを有する。このような特性を有する硝化細菌として本発明者らが単離、同定した新規細菌のうち、ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillus sp.)DA2株は、下記表1に記載する菌学的諸性質を有する。
【０００９】
【表１】
【００１０】
ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillussp.)DA2株に関して、DNAを抽出し、PCR法により16S rRNA遺伝子を増幅し、得られた遺伝子の塩基配列をオートシークエンサーで解析し、ブラストサーチにより類似した塩基配列を調べた。その結果に基づき、類似した塩基配列と多重アラインメントを取り、得られた結果に基づき近隣結合法(neighbor-joining法)により系統樹を作成した。上記菌学的性質、及び16S rRNA遺伝子配列に基づく系統学解析で得られた系統樹（図１）に基づいて、ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillus sp.)DA2株は、ブレビバチルス属に分類される新菌種として同定された。
【００１１】
なお、ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株は、2008年9月25日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-21693として寄託されている。
【００１２】
本発明に係る細菌にはさらに、上記ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillus sp.)DA2株の変異株も包含され、この変異株は親株と同様の特性、すなわち芽胞形成能及び硝化能を有する。
【００１３】
本発明はまた、本発明に係る新規細菌を含有する硝化用組成物に関する。本発明に係る硝化用組成物に含有される細菌は、乾燥形態であってもよいし、固相担体に固定化された形態であってもよい。
【００１４】
本発明はさらに、本発明に係る新規細菌又は硝化用組成物と、尿素又はアンモニアを含む浄化対象物とを接触させることを含む尿素又はアンモニアの浄化方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillus sp.)に属しかつ芽胞形成能と硝化能とを有する新規細菌、及び該新規細菌を含有する硝化用組成物を提供することができる。
【００１６】
本発明に係る新規細菌は、これまで一般的に知られている独立栄養性の硝化細菌とは増殖機構そのものが異なる従属栄養性細菌のため、その増殖は迅速かつ安定的で、細菌製剤を作製するための時間を著しく短縮することができる。また本発明に係る新規細菌は芽胞形成能を有するため、培養菌体を乾燥形態の粉末やタブレットとして保存、輸送することができ、その管理や輸送にかかるコストを液体状の細菌製剤と比較して著しく低減することができる。
【００１７】
このような特徴を有する本発明に係る新規細菌及びこれを含有する硝化用組成物は、各種業界から排出されるアンモニアや尿素を含んだ廃水などの処理に広く利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る新規細菌は、ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillus sp.)に属し、かつ芽胞形成能と硝化能とを有している。本明細書で使用する「硝化能」とは、特にアンモニウムイオンを亜硝酸イオンに酸化する能力をいう。
【００１９】
本発明に係る新規細菌は、家畜ふんや脱水した下水消化汚泥などを混合し、堆積一次発酵を行って作製したシーディング剤から単離、同定することができる。
【００２０】
具体的な単離、同定手法としては、前記シーティング剤から細菌株を分離し、アンモニアを基質とした培地において分離株を培養し、亜硝酸生成活性を指標に高い亜硝酸生成活性を有する細菌株を分離し、その後場合により、分離菌体の分類学的位置の決定、芽胞形成能の評価等を行うことが挙げられる。
【００２１】
亜硝酸生成活性は、例えば培養液中の亜硝酸イオンを検出することによって判定する。亜硝酸の検出には、Griess-romijn(GR)試薬であるGriess-romijnnitrite試薬を使用することができる。具体的には、培養液を遠心分離し、上清を試験管に回収してGR nitrite試薬を少量入れて混合後、静置して色の変化を観察することで、培養液中の亜硝酸イオンを検出することができる。亜硝酸イオンの量により、溶液は透明から薄桃、濃い赤色に呈色する。
【００２２】
その他、亜硝酸の検出は、例えば下記実施例に記載されるナフチルエチレンジアミン法によって行うことができる。この手法は、亜硝酸窒素が酸性溶液中で芳香族第一アミン（スルファニル酸等）と反応して生ずるアゾ化合物に芳香族アミン類（ナフチルエチレンジアミン等）を加えてカップリングさせることで生じるジアゾ化合物の赤色の吸光度を測定することで、亜硝酸窒素の濃度を検出する方法である。
【００２３】
分離菌体の分類学的位置の決定は、当業者に公知の手法を定法に従って行えばよく、特別な方法を用いる必要はない。例えば、分離菌体の16S RNA遺伝子の配列情報に基づく系統学的解析によって行うことができる。
【００２４】
分離菌体の芽胞形成能の評価は、決定された分類学的位置に基づいて行ってもよいし、ストレス環境下で芽胞形成の有無を芽胞染色法（Wirtz法、例えばSchaeffer Fulton's modification of Wirtz method SCHAEFFER, A, B., and FULTON, M. 1933. A SIMPLIFIED MRTHOD OF STAINING ENDOSPORS. SCIENCE77:194を参照）による顕微鏡観察によって確認することによって行ってもよい。なお、この場合に使用することができるストレス環境として、高温、毒性化合物への曝露、無栄養環境、低湿度環境などを挙げることができる。特に、低湿度環境を使用することが好ましい。
【００２５】
その他、分離菌体を上記表1に記載する菌学的諸性質について評価することによって本発明に係る新規細菌を単離、同定してもよい。表1に示す菌学的諸性質は、本願発明者らが単離、同定した新規細菌のうち、ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株と命名されかつFERM P-21693として寄託された細菌のものである。
【００２６】
したがって、本発明の硝化細菌は、例えばブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株、及び芽胞形成能と硝化能とを有するその変異株を包含する。本発明に係る細菌の変異株は、当業者に公知の変異処理により前記DA2株から誘導されたものであり、例えばかかる変異処理として、これに限定されるものではないが、親株に対し、紫外線、放射線（例えばγ線）等の照射、メチルニトロソウレアなどの変異原性化学物質を接触させる方法、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）処理、エチルメタンスルホン酸 (EMS)処理などが挙げられる。ただし、本発明の変異株は、上記特性を有し、かつ亜硝酸生成活性に関して、野生型と同等か又はそれを上回る活性を有するものが好ましい。
【００２７】
本発明に係る細菌は、生育速度が遅いと考えられていた従来公知の硝化細菌と異なり、生育速度が速いため、短期間で有効な硝化用組成物として調製することができる。
【００２８】
本発明に係る細菌を培養するのに適した液体培地の組成を下記に例示する：
普通ブイヨン（液体培地組成）
カゼインペプトン 10 g
肉エキス 5 g
塩化ナトリウム 5 g
蒸留水 1 L
（pH 7.0）
【００２９】
その他本発明に係る細菌の培養条件は、上記菌学的諸性質に基づき、当業者が適宜設定することができる。例えば、培養時の温度は16〜44℃の範囲とすることができ、pHは5.0〜8.0の範囲とすることができる。
【００３０】
本発明に係る硝化用組成物（以下、本発明の組成物ともいう）は、本発明の細菌を培養し、この培養物を遠心分離して菌体を回収し、生理食塩水を加えて適当な濃度となるように懸濁することによって調製することができる。また本発明の組成物は、必要に応じて当業者に公知の添加剤を含んでもよい。そのような添加剤として、これに限定されるものではないが、例えば細胞保護剤、pH調整剤等を挙げることができる。本発明の硝化用組成物中に含まれる上記細菌の濃度は、培養方法に応じて適宜選択し得るものであるが、好ましくは組成物100gあたり1x105細胞個数前後の含有を目安とすることができる。
【００３１】
本発明の組成物は、固体形態、半固体形態又は液体形態のいずれの形態で製剤化してもよい。本発明の組成物を液体製剤として調製する場合、例えば以下の手法によって調製することができる。すなわち、本発明の細菌を培養し、この培養物を遠心分離し、菌体を回収し、生理食塩水又は培地などの液体に適当な濃度となるように懸濁することにより調製することができる。
【００３２】
本発明の硝化用組成物は、例えば粉末製剤、タブレットなどの固体形態、又はクリーム・ゼリー状製剤などの半固体形態で製剤化することが好ましい。そのような製剤は、液体製剤と比べて管理及び輸送に関連するコストを著しく低減することができ、また本発明の細菌が芽胞形成能を有するという性質上、乾燥形態でも活性を失わないからである。
【００３３】
粉末製剤は当業者に公知の手法によって調製することができる。例えば、本発明に係る細菌を培養し、この培養物を造粒乾燥や凍結乾燥等によって乾燥することで、粉末製剤とすることができる。例えば、培養液から菌体を遠心分離によって回収し、生理食塩水や新鮮な培地に懸濁した後、造粒乾燥や凍結乾燥等によって乾燥してもよい。pH調整剤や乾燥に対する保護剤などの添加剤は乾燥前に添加することができる。
【００３４】
また、本発明の硝化用組成物は、上記細菌を固相担体に固定化して製造することができる。細菌を固定するための固相担体としては、細菌の固定に使用することのできるものであればいずれでも良く、特に限定されるものではない。例えば、アルギン酸、活性炭、珪藻土セラミック多孔体、軽石等を使用することができる。このような固相担体の形状としては、球状又は円柱状が好適であり、球状の場合、粒径は好ましくは0.3〜2.8mm程度であり、更に好ましくは0.3〜1.2mm程度である。細菌固定化は、当業者に公知の担体結合法（例えば物理吸着法、包括法など）など手法により行うことができる。
【００３５】
上記のようにして単離、同定した細菌は優れた硝化能を有するため、当該細菌又はこれを含有する硝化用組成物を用いることにより、アンモニア又は尿素の新規な廃水浄化方法を構築することができる。すなわち、上記細菌又は硝化用組成物を利用してアンモニア又は尿素を含む浄化対象物を浄化するものであれば処理態様の相違に拘らず全て本発明に係るアンモニア又は尿素の浄化方法（以下、本発明の浄化方法ともいう）に含まれる。
【００３６】
例えば、本発明の浄化方法の浄化対象物は、尿素又はアンモニアを含有するものであれば特に制限されず、例えば尿素又はアンモニアを含む廃水、土壌、汚泥、生ゴミ、家畜糞尿などを挙げることができる。
【００３７】
例えば、本発明に係る細菌又は硝化用組成物と浄化対象物との接触は、細菌の培養液自体又は当該培養液中の湿菌体を浄化対象物に添加することによって、又は固定化担体に固定化された細菌を含む硝化用組成物に浄化対象物を供給することによって、行うことができる。その際、本発明の細菌の性質に基づき、浄化対象物の温度が16〜44℃程度の範囲であることが好ましく、pHが5.0〜8.0の範囲であることが好ましい。また、本発明に使用される細菌量に特に制限はなく、処理対象物中に含まれるアンモニア量、尿素量に応じて当業者は適宜設定することができる。
【００３８】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
[実施例１] 細菌株の分離
牛ふん、脱水下水消化汚泥、木材チップ、種堆肥を所定の割合で混合し、堆積一次発酵後の乾燥、篩い分けをし、1 mm以下にしたシーディング剤を三種類の汚水中で三週間集積培養を行い、細菌株を多数分離し、アンモニアを含んだ培地で分離株を培養後、亜硝酸生成活性を指標に、高い亜硝酸生成活性を有する細菌株を分離した。
【００４０】
具体的には、まず、採取した汚水試料にシーディング剤を接種し、集積培養をおこなった。この間に亜硝酸の検出を行ったところ、培養3週間後に亜硝酸が検出されたことから、培養3週間後の本培養液から約80株の細菌株の分離を行った。亜硝酸の検出は、ナフチルエチレンジアミン法によって行った。第一液（スルファニル酸8 gを5N酢酸 1000 mlに溶解）および第二液（ナフチルエチレンジアミン5 gを5N酢酸 1000 mlに溶解）を等量混合し、5 mlの培養液に対し1 ml添加した。微生物の分離はアンモニアを含むGYP培地（1%グルコース、0.3%塩化アンモニウム、0.05%リン酸二水素カリウム、0.05%リン酸水素ナトリウム、1.5%寒天）およびYP培地（0.3%塩化アンモニウム、0.05%リン酸二水素カリウム、0.05%リン酸水素ナトリウム、1.5%寒天）でおこなった。この分離株にについてGYP培地およびYP培地のそれぞれ寒天を含まない液体培地で培養し、経時的に亜硝酸の生成を検出し、硝化能に優れた菌株としてDA2株選択した。
【００４１】
[実施例２] 分離菌株の分類
実施例１で分離した細菌株（DA2株）は、常法に従って分析したところ、上記表1の菌学的性質を有していた。
【００４２】
このDA2株の帰属分類群の同定は、以下のようにして行った。まず分離した菌株（DA2株）を普通寒天斜面培地で27℃で1〜2日間培養し、光学顕微鏡及び電子顕微鏡で観察したところ、グラム染色陽性の桿菌であり芽胞を有し、運動性を示すことが判明した。また、得られた生理学的、生化学的性状検査結果は、Shida et al. (1996) Proposal for two new genera, Brevibacillus gen. nov. and Aneurinibacillus gen. nov. Int. J. Syst.Bacteriol. 46, 939-946 に記載されているブレビバチルス属細菌の性質と一致していた。
【００４３】
続いて、分離した菌株について、16S rRNA遺伝子配列に基づく分子系統学的解析を行った。培養したDA2株菌から常法によりDNAを抽出し、それを鋳型として16S rRNA遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRにより16S rRNA遺伝子断片を増幅し、次いでその塩基配列を自動シークエンサーを用いて解析した。得られた16S rRNA遺伝子断片の塩基配列について、配列データベースでのBLAST（ブラスト）サーチによる相同性検索を行い、細菌由来16S rRNAの類似配列を調べた。ヒットした類似配列とDA2株菌の16S rRNA遺伝子配列とのアラインメントをとり、近隣結合法により系統樹を作成したところ、この菌がブレビバチルス属に属することが示された（図１）。同属の細菌株の中でもブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacillus choshinensis）およびブレビバチルス・フォルモサス（Brevibacillus formosus）に対して、それぞれ99.1%および98.9%の高い相同性を示した。さらに16S rRNA遺伝子配列に基づく系統分類学上の近縁種の代表株ブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacillus choshinensis）NBRC 15518Tおよびブレビバチルス・フォルモサス（Brevibacillus formosus）NBRC 15716Tに対してDNA-DNA相同性を調べたところ、それぞれ25%および6%でいずれも同種と考えられる値である70%未満であったことからDA2株はいずれの菌株とも同一種でないことが示された。
【００４４】
以上の結果から、実施例１で分離した菌株（DA2株）は、ブレビバチルス属（Brevibacillus）の新菌種に属するものとして同定された。本発明者らは、この分離した菌株を、ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株と名付けた。ブレビバチルス・エスピーDA2株は、2008年9月25日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-21693として寄託されている。
【００４５】
[実施例３] 硝化実験
100 ml容バッフル付き三角フラスコにYP培地（ペプトン, 0.15%; 酵母エキス, 0.2%, pH 7.5）にそれぞれ0.3%の塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素を添加した3種類の培地を作成し、それぞれにブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株を接種し、27 ℃で120 rpmの振とう速度で培養し、培養1日目、3日目、6日目に亜硝酸の生成量を測定した。亜硝酸の定量はサンプル 10 mlにスルファニルアミド液 1 mlを添加後、混合し室温で15分放置し、次にナフチルエチレンジアミン溶液を1 ml添加後、混合し室温で20分放置後、分光光度計で540 nm の吸光値を測定することによって行った。
【００４６】
実験結果を図2に示す。図2において横軸は培養日数で、縦軸は亜硝酸の精製量である。また三角は尿素、四角は硫酸アンモニウム、ひし形は塩化アンモニウムを添加した培地による培養による結果である。培養開始1日目より尿素の分解によって生じる亜硝酸の生成量は塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムを基質とした時の2倍以上であった。さらに3 〜 6 日後まで培養を続けた結果、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムの順に亜硝酸の生成量が多かった。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株の16S rRNA遺伝子に基づく系統的位置を示す図である。
【図２】異なるアンモニア関連化合物を基質とした場合における亜硝酸の生成量の経時的変化を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硝化作用を有する新規細菌及び当該新規細菌を含有する硝化用組成物、並びにこれらを用いた尿素又はアンモニアの浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
浄化槽の微生物相の早期立ち上げや、なんらかの要因で浄化槽中の良好な状態の微生物相が崩壊した場合の解決策の一つとして、有機物等の分解能に優れた微生物を含んだシーディング剤の投入という手段が考えられる（特許文献１、２及び非特許文献１）。これまでのシーディング剤使用の経験から、その効果として汚泥の減容化、硝化・脱窒能の促進が挙げられているが、それら効果の根拠となる個別の微生物の機能について詳しいことは解っていない。シーディング剤の効能については経験的に実証されているものの、シーディング剤を使用することにより、廃水処理にさらなるコストが負荷されることが問題として挙げられる。2005年5月に公布された浄化槽法の改正により、浄化槽設置後一定期間後義務付けられている水質検査の期間を短縮される項目が盛り込まれた。これは浄化槽の能力の向上や、効果的なシーディング剤が使われ始めたことによる。その一方では、浄化槽がより短期間に必要な能力を発揮することが求められることになり、その結果、安価で確実に効果を向上させることができるシーディング剤の供給が求められている。
【０００３】
一般的に硝化反応は好気条件下でニトロソモナス（Nitrosomonas）属細菌に代表されるアンモニア酸化細菌によってアンモニウムイオンが亜硝酸イオンに変換され、生成した亜硝酸イオンは同じく好気条件下でニトロバクター（Nitrobacter）属細菌に代表される亜硝酸酸化細菌によって硝酸イオンに変換されるものと考えられている（特許文献３及び４）。これら硝化反応に関与する細菌は化学栄養独立栄養細菌と呼ばれ、アンモニウムイオンや亜硝酸イオンから受け取った電子のみでエネルギー生産と炭酸ガスの固定を始めとした生合成反応を行っており、大腸菌のような代表的な従属栄養細菌と比較して、生育が極めて遅いのが特徴である。
【０００４】
上記の通り、本来硝化反応を行うと考えられてきた細菌は生育が極めて遅いことから（非特許文献２及び３）、廃水処理設備の好気槽中で増殖し、安定した硝化反応を行うまでに時間がかかるものと考えられる。また別途培養して廃水処理施設の好気槽の立ち上げに投入することは可能であるが、培養に時間がかかることや、液体で運用することが望ましいと考えられることから、調整に時間がかかると共に、保存期間がある程度限られる、輸送の際には水も一緒に輸送しなければならない等、コスト面で好ましくない要因が存在する。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−３１６１９９号
【特許文献２】特許公開２００３−３３４５９８
【特許文献３】特開２００１−２４６３９７号
【特許文献４】特開２００６−３４６５８９号
【非特許文献１】微生物による環境改善 微生物製剤は役に立つのか 中村和憲著（2002年）p126
【非特許文献２】日本微生物生態学会編 微生物の生態19 物質循環における微生物の役割 学会出版センター（1995） p21
【非特許文献３】生物学的排水処理工学 北尾高嶺著 コロナ社（2003）p159
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、上述したような実情に鑑み、廃水等に含まれるアンモニアや尿素を速やかに硝化することができる新規細菌、特に、化学栄養独立栄養細菌と比較して生育速度が速い従属栄養細菌に属し、かつ保存・輸送特性に優れた新規細菌を提供すること、及びこれらを利用した尿素又はアンモニアの浄化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため、家畜ふんや下水消化汚泥などを混合し、堆積一次発酵を行って作製したシーディング剤を分離源として上記特性を有する細菌を単離、同定すべく鋭意検討した結果、公知の細菌には分類されない新規細菌を単離、同定することができた。本発明は、かかる新規細菌が、従属栄養細菌であるブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）に属し、かつ芽胞形成能と硝化能とを有するという知見に基づいている。
【０００８】
本発明に係る新規細菌は、ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillus sp.)に属し、かつ芽胞形成能と硝化能とを有する。このような特性を有する硝化細菌として本発明者らが単離、同定した新規細菌のうち、ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillus sp.)DA2株は、下記表1に記載する菌学的諸性質を有する。
【０００９】
【表１】
【００１０】
ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillussp.)DA2株に関して、DNAを抽出し、PCR法により16S rRNA遺伝子を増幅し、得られた遺伝子の塩基配列をオートシークエンサーで解析し、ブラストサーチにより類似した塩基配列を調べた。その結果に基づき、類似した塩基配列と多重アラインメントを取り、得られた結果に基づき近隣結合法(neighbor-joining法)により系統樹を作成した。上記菌学的性質、及び16S rRNA遺伝子配列に基づく系統学解析で得られた系統樹（図１）に基づいて、ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillus sp.)DA2株は、ブレビバチルス属に分類される新菌種として同定された。
【００１１】
なお、ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株は、2008年9月25日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-21693として寄託されている。
【００１２】
本発明に係る細菌にはさらに、上記ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillus sp.)DA2株の変異株も包含され、この変異株は親株と同様の特性、すなわち芽胞形成能及び硝化能を有する。
【００１３】
本発明はまた、本発明に係る新規細菌を含有する硝化用組成物に関する。本発明に係る硝化用組成物に含有される細菌は、乾燥形態であってもよいし、固相担体に固定化された形態であってもよい。
【００１４】
本発明はさらに、本発明に係る新規細菌又は硝化用組成物と、尿素又はアンモニアを含む浄化対象物とを接触させることを含む尿素又はアンモニアの浄化方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillus sp.)に属しかつ芽胞形成能と硝化能とを有する新規細菌、及び該新規細菌を含有する硝化用組成物を提供することができる。
【００１６】
本発明に係る新規細菌は、これまで一般的に知られている独立栄養性の硝化細菌とは増殖機構そのものが異なる従属栄養性細菌のため、その増殖は迅速かつ安定的で、細菌製剤を作製するための時間を著しく短縮することができる。また本発明に係る新規細菌は芽胞形成能を有するため、培養菌体を乾燥形態の粉末やタブレットとして保存、輸送することができ、その管理や輸送にかかるコストを液体状の細菌製剤と比較して著しく低減することができる。
【００１７】
このような特徴を有する本発明に係る新規細菌及びこれを含有する硝化用組成物は、各種業界から排出されるアンモニアや尿素を含んだ廃水などの処理に広く利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る新規細菌は、ブレビバチルス・エスピー(Brevibacillus sp.)に属し、かつ芽胞形成能と硝化能とを有している。本明細書で使用する「硝化能」とは、特にアンモニウムイオンを亜硝酸イオンに酸化する能力をいう。
【００１９】
本発明に係る新規細菌は、家畜ふんや脱水した下水消化汚泥などを混合し、堆積一次発酵を行って作製したシーディング剤から単離、同定することができる。
【００２０】
具体的な単離、同定手法としては、前記シーティング剤から細菌株を分離し、アンモニアを基質とした培地において分離株を培養し、亜硝酸生成活性を指標に高い亜硝酸生成活性を有する細菌株を分離し、その後場合により、分離菌体の分類学的位置の決定、芽胞形成能の評価等を行うことが挙げられる。
【００２１】
亜硝酸生成活性は、例えば培養液中の亜硝酸イオンを検出することによって判定する。亜硝酸の検出には、Griess-romijn(GR)試薬であるGriess-romijnnitrite試薬を使用することができる。具体的には、培養液を遠心分離し、上清を試験管に回収してGR nitrite試薬を少量入れて混合後、静置して色の変化を観察することで、培養液中の亜硝酸イオンを検出することができる。亜硝酸イオンの量により、溶液は透明から薄桃、濃い赤色に呈色する。
【００２２】
その他、亜硝酸の検出は、例えば下記実施例に記載されるナフチルエチレンジアミン法によって行うことができる。この手法は、亜硝酸窒素が酸性溶液中で芳香族第一アミン（スルファニル酸等）と反応して生ずるアゾ化合物に芳香族アミン類（ナフチルエチレンジアミン等）を加えてカップリングさせることで生じるジアゾ化合物の赤色の吸光度を測定することで、亜硝酸窒素の濃度を検出する方法である。
【００２３】
分離菌体の分類学的位置の決定は、当業者に公知の手法を定法に従って行えばよく、特別な方法を用いる必要はない。例えば、分離菌体の16S RNA遺伝子の配列情報に基づく系統学的解析によって行うことができる。
【００２４】
分離菌体の芽胞形成能の評価は、決定された分類学的位置に基づいて行ってもよいし、ストレス環境下で芽胞形成の有無を芽胞染色法（Wirtz法、例えばSchaeffer Fulton's modification of Wirtz method SCHAEFFER, A, B., and FULTON, M. 1933. A SIMPLIFIED MRTHOD OF STAINING ENDOSPORS. SCIENCE77:194を参照）による顕微鏡観察によって確認することによって行ってもよい。なお、この場合に使用することができるストレス環境として、高温、毒性化合物への曝露、無栄養環境、低湿度環境などを挙げることができる。特に、低湿度環境を使用することが好ましい。
【００２５】
その他、分離菌体を上記表1に記載する菌学的諸性質について評価することによって本発明に係る新規細菌を単離、同定してもよい。表1に示す菌学的諸性質は、本願発明者らが単離、同定した新規細菌のうち、ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株と命名されかつFERM P-21693として寄託された細菌のものである。
【００２６】
したがって、本発明の硝化細菌は、例えばブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株、及び芽胞形成能と硝化能とを有するその変異株を包含する。本発明に係る細菌の変異株は、当業者に公知の変異処理により前記DA2株から誘導されたものであり、例えばかかる変異処理として、これに限定されるものではないが、親株に対し、紫外線、放射線（例えばγ線）等の照射、メチルニトロソウレアなどの変異原性化学物質を接触させる方法、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）処理、エチルメタンスルホン酸 (EMS)処理などが挙げられる。ただし、本発明の変異株は、上記特性を有し、かつ亜硝酸生成活性に関して、野生型と同等か又はそれを上回る活性を有するものが好ましい。
【００２７】
本発明に係る細菌は、生育速度が遅いと考えられていた従来公知の硝化細菌と異なり、生育速度が速いため、短期間で有効な硝化用組成物として調製することができる。
【００２８】
本発明に係る細菌を培養するのに適した液体培地の組成を下記に例示する：
普通ブイヨン（液体培地組成）
カゼインペプトン 10 g
肉エキス 5 g
塩化ナトリウム 5 g
蒸留水 1 L
（pH 7.0）
【００２９】
その他本発明に係る細菌の培養条件は、上記菌学的諸性質に基づき、当業者が適宜設定することができる。例えば、培養時の温度は16〜44℃の範囲とすることができ、pHは5.0〜8.0の範囲とすることができる。
【００３０】
本発明に係る硝化用組成物（以下、本発明の組成物ともいう）は、本発明の細菌を培養し、この培養物を遠心分離して菌体を回収し、生理食塩水を加えて適当な濃度となるように懸濁することによって調製することができる。また本発明の組成物は、必要に応じて当業者に公知の添加剤を含んでもよい。そのような添加剤として、これに限定されるものではないが、例えば細胞保護剤、pH調整剤等を挙げることができる。本発明の硝化用組成物中に含まれる上記細菌の濃度は、培養方法に応じて適宜選択し得るものであるが、好ましくは組成物100gあたり1x105細胞個数前後の含有を目安とすることができる。
【００３１】
本発明の組成物は、固体形態、半固体形態又は液体形態のいずれの形態で製剤化してもよい。本発明の組成物を液体製剤として調製する場合、例えば以下の手法によって調製することができる。すなわち、本発明の細菌を培養し、この培養物を遠心分離し、菌体を回収し、生理食塩水又は培地などの液体に適当な濃度となるように懸濁することにより調製することができる。
【００３２】
本発明の硝化用組成物は、例えば粉末製剤、タブレットなどの固体形態、又はクリーム・ゼリー状製剤などの半固体形態で製剤化することが好ましい。そのような製剤は、液体製剤と比べて管理及び輸送に関連するコストを著しく低減することができ、また本発明の細菌が芽胞形成能を有するという性質上、乾燥形態でも活性を失わないからである。
【００３３】
粉末製剤は当業者に公知の手法によって調製することができる。例えば、本発明に係る細菌を培養し、この培養物を造粒乾燥や凍結乾燥等によって乾燥することで、粉末製剤とすることができる。例えば、培養液から菌体を遠心分離によって回収し、生理食塩水や新鮮な培地に懸濁した後、造粒乾燥や凍結乾燥等によって乾燥してもよい。pH調整剤や乾燥に対する保護剤などの添加剤は乾燥前に添加することができる。
【００３４】
また、本発明の硝化用組成物は、上記細菌を固相担体に固定化して製造することができる。細菌を固定するための固相担体としては、細菌の固定に使用することのできるものであればいずれでも良く、特に限定されるものではない。例えば、アルギン酸、活性炭、珪藻土セラミック多孔体、軽石等を使用することができる。このような固相担体の形状としては、球状又は円柱状が好適であり、球状の場合、粒径は好ましくは0.3〜2.8mm程度であり、更に好ましくは0.3〜1.2mm程度である。細菌固定化は、当業者に公知の担体結合法（例えば物理吸着法、包括法など）など手法により行うことができる。
【００３５】
上記のようにして単離、同定した細菌は優れた硝化能を有するため、当該細菌又はこれを含有する硝化用組成物を用いることにより、アンモニア又は尿素の新規な廃水浄化方法を構築することができる。すなわち、上記細菌又は硝化用組成物を利用してアンモニア又は尿素を含む浄化対象物を浄化するものであれば処理態様の相違に拘らず全て本発明に係るアンモニア又は尿素の浄化方法（以下、本発明の浄化方法ともいう）に含まれる。
【００３６】
例えば、本発明の浄化方法の浄化対象物は、尿素又はアンモニアを含有するものであれば特に制限されず、例えば尿素又はアンモニアを含む廃水、土壌、汚泥、生ゴミ、家畜糞尿などを挙げることができる。
【００３７】
例えば、本発明に係る細菌又は硝化用組成物と浄化対象物との接触は、細菌の培養液自体又は当該培養液中の湿菌体を浄化対象物に添加することによって、又は固定化担体に固定化された細菌を含む硝化用組成物に浄化対象物を供給することによって、行うことができる。その際、本発明の細菌の性質に基づき、浄化対象物の温度が16〜44℃程度の範囲であることが好ましく、pHが5.0〜8.0の範囲であることが好ましい。また、本発明に使用される細菌量に特に制限はなく、処理対象物中に含まれるアンモニア量、尿素量に応じて当業者は適宜設定することができる。
【００３８】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
[実施例１] 細菌株の分離
牛ふん、脱水下水消化汚泥、木材チップ、種堆肥を所定の割合で混合し、堆積一次発酵後の乾燥、篩い分けをし、1 mm以下にしたシーディング剤を三種類の汚水中で三週間集積培養を行い、細菌株を多数分離し、アンモニアを含んだ培地で分離株を培養後、亜硝酸生成活性を指標に、高い亜硝酸生成活性を有する細菌株を分離した。
【００４０】
具体的には、まず、採取した汚水試料にシーディング剤を接種し、集積培養をおこなった。この間に亜硝酸の検出を行ったところ、培養3週間後に亜硝酸が検出されたことから、培養3週間後の本培養液から約80株の細菌株の分離を行った。亜硝酸の検出は、ナフチルエチレンジアミン法によって行った。第一液（スルファニル酸8 gを5N酢酸 1000 mlに溶解）および第二液（ナフチルエチレンジアミン5 gを5N酢酸 1000 mlに溶解）を等量混合し、5 mlの培養液に対し1 ml添加した。微生物の分離はアンモニアを含むGYP培地（1%グルコース、0.3%塩化アンモニウム、0.05%リン酸二水素カリウム、0.05%リン酸水素ナトリウム、1.5%寒天）およびYP培地（0.3%塩化アンモニウム、0.05%リン酸二水素カリウム、0.05%リン酸水素ナトリウム、1.5%寒天）でおこなった。この分離株にについてGYP培地およびYP培地のそれぞれ寒天を含まない液体培地で培養し、経時的に亜硝酸の生成を検出し、硝化能に優れた菌株としてDA2株選択した。
【００４１】
[実施例２] 分離菌株の分類
実施例１で分離した細菌株（DA2株）は、常法に従って分析したところ、上記表1の菌学的性質を有していた。
【００４２】
このDA2株の帰属分類群の同定は、以下のようにして行った。まず分離した菌株（DA2株）を普通寒天斜面培地で27℃で1〜2日間培養し、光学顕微鏡及び電子顕微鏡で観察したところ、グラム染色陽性の桿菌であり芽胞を有し、運動性を示すことが判明した。また、得られた生理学的、生化学的性状検査結果は、Shida et al. (1996) Proposal for two new genera, Brevibacillus gen. nov. and Aneurinibacillus gen. nov. Int. J. Syst.Bacteriol. 46, 939-946 に記載されているブレビバチルス属細菌の性質と一致していた。
【００４３】
続いて、分離した菌株について、16S rRNA遺伝子配列に基づく分子系統学的解析を行った。培養したDA2株菌から常法によりDNAを抽出し、それを鋳型として16S rRNA遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRにより16S rRNA遺伝子断片を増幅し、次いでその塩基配列を自動シークエンサーを用いて解析した。得られた16S rRNA遺伝子断片の塩基配列について、配列データベースでのBLAST（ブラスト）サーチによる相同性検索を行い、細菌由来16S rRNAの類似配列を調べた。ヒットした類似配列とDA2株菌の16S rRNA遺伝子配列とのアラインメントをとり、近隣結合法により系統樹を作成したところ、この菌がブレビバチルス属に属することが示された（図１）。同属の細菌株の中でもブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacillus choshinensis）およびブレビバチルス・フォルモサス（Brevibacillus formosus）に対して、それぞれ99.1%および98.9%の高い相同性を示した。さらに16S rRNA遺伝子配列に基づく系統分類学上の近縁種の代表株ブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacillus choshinensis）NBRC 15518Tおよびブレビバチルス・フォルモサス（Brevibacillus formosus）NBRC 15716Tに対してDNA-DNA相同性を調べたところ、それぞれ25%および6%でいずれも同種と考えられる値である70%未満であったことからDA2株はいずれの菌株とも同一種でないことが示された。
【００４４】
以上の結果から、実施例１で分離した菌株（DA2株）は、ブレビバチルス属（Brevibacillus）の新菌種に属するものとして同定された。本発明者らは、この分離した菌株を、ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株と名付けた。ブレビバチルス・エスピーDA2株は、2008年9月25日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-21693として寄託されている。
【００４５】
[実施例３] 硝化実験
100 ml容バッフル付き三角フラスコにYP培地（ペプトン, 0.15%; 酵母エキス, 0.2%, pH 7.5）にそれぞれ0.3%の塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素を添加した3種類の培地を作成し、それぞれにブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株を接種し、27 ℃で120 rpmの振とう速度で培養し、培養1日目、3日目、6日目に亜硝酸の生成量を測定した。亜硝酸の定量はサンプル 10 mlにスルファニルアミド液 1 mlを添加後、混合し室温で15分放置し、次にナフチルエチレンジアミン溶液を1 ml添加後、混合し室温で20分放置後、分光光度計で540 nm の吸光値を測定することによって行った。
【００４６】
実験結果を図2に示す。図2において横軸は培養日数で、縦軸は亜硝酸の精製量である。また三角は尿素、四角は硫酸アンモニウム、ひし形は塩化アンモニウムを添加した培地による培養による結果である。培養開始1日目より尿素の分解によって生じる亜硝酸の生成量は塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムを基質とした時の2倍以上であった。さらに3 〜 6 日後まで培養を続けた結果、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムの順に亜硝酸の生成量が多かった。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株の16S rRNA遺伝子に基づく系統的位置を示す図である。
【図２】異なるアンモニア関連化合物を基質とした場合における亜硝酸の生成量の経時的変化を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）に属し、かつ芽胞形成能及び硝化能を有する細菌。
【請求項２】
ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株（FERM P-21693）、又は芽胞形成能及び硝化能を有するその変異株である、請求項1記載の細菌。
【請求項３】
請求項1又は2記載の細菌を含有する硝化用組成物。
【請求項４】
固体又は半固体形態である請求項3記載の硝化用組成物。
【請求項５】
細菌は固相担体に固定化された形態である請求項3記載の硝化用組成物。
【請求項６】
請求項1又は2記載の細菌、又は請求項3〜5のいずれか1項記載の硝化用組成物と、尿素又はアンモニアを含む浄化対象物とを接触させることを特徴とする、尿素又はアンモニアの浄化方法。
【請求項１】
ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）に属し、かつ芽胞形成能及び硝化能を有する細菌。
【請求項２】
ブレビバチルス・エスピー（Brevibacillus sp.）DA2株（FERM P-21693）、又は芽胞形成能及び硝化能を有するその変異株である、請求項1記載の細菌。
【請求項３】
請求項1又は2記載の細菌を含有する硝化用組成物。
【請求項４】
固体又は半固体形態である請求項3記載の硝化用組成物。
【請求項５】
細菌は固相担体に固定化された形態である請求項3記載の硝化用組成物。
【請求項６】
請求項1又は2記載の細菌、又は請求項3〜5のいずれか1項記載の硝化用組成物と、尿素又はアンモニアを含む浄化対象物とを接触させることを特徴とする、尿素又はアンモニアの浄化方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１１９９３７（Ｐ２０１０−１１９９３７Ａ）
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９４６０５（Ｐ２００８−２９４６０５）
【出願日】平成２０年１１月１８日（２００８．１１．１８）
【特許番号】特許第４３５２１４６号（Ｐ４３５２１４６）
【特許公報発行日】平成２１年１０月２８日（２００９．１０．２８）
【出願人】（５００３８４６７３）株式会社静内衛生社 (3)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１８日（２００８．１１．１８）
【特許番号】特許第４３５２１４６号（Ｐ４３５２１４６）
【特許公報発行日】平成２１年１０月２８日（２００９．１０．２８）
【出願人】（５００３８４６７３）株式会社静内衛生社 (3)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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