魚介類用感染防御剤
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用感染防御剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、魚介類用感染防御剤、魚介類用飼料、及び魚介類生存率改善方法に関する。
【背景技術】
従来から、魚介類の養殖場において、養殖飼料の散逸による底質の悪化や過密養殖等の環境悪化にともない、魚介類の感染症が多発しており、魚介類養殖産業に甚大な被害をもたらしている。魚介類の感染防御剤として、抗生物質が汎用されており、また、生物製剤も知られている。生物製剤としては、例えば、バチラス・サチラス、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム・グルタニカム、エセリシア・コリ、ラクトバチラス・アシドフィラス、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトマイセス・タナシエンシス又はビフィドバクテリウム・サーモフィラムなどの細菌の殺菌処理物を含有する魚類・甲殼類のウイルス病及び細菌病の予防治療剤が報告されている（特許文献１、２）。
また、アルテロモナス・ハロプランクテイスを甲殻類の養殖に使用することにより、病害の発生を抑制すると共に、甲殻類の個体の成長を促進する方法が報告されている（特許文献３）。さらに、エンテロコッカス・フェシウムを配合したことを特徴とする魚介類用飼料（特許文献４）や通常の酵母よりセレンを多く含有するパンイーストを含有する養魚用飼料が報告されている（特許文献５）。
しかしながら、抗生物質を感染防御剤として用いる場合、抗生物質が魚介類に残留し、耐性菌の発現やその魚介を食した人体への悪影響が懸念される。また、特許文献１、２の生物製剤は、抗菌力や保存安定性、水中安定性において必ずしも満足すべきものではない。さらに、特許文献３〜５の生菌を用いる生物製剤は、製造工程や製剤の保存に厳密な管理が必要であるという問題点がある。
【特許文献１】特開平６−１８１６５６号公報
【特許文献２】特開平４−１９３８３２号公報
【特許文献３】特開平５−７６３５１号公報
【特許文献４】特許第２７２７５１７号
【特許文献５】特許第３０１３８７１号
【発明の開示】
本発明は、顕著な抗菌力を示し、保存安定性、水中安定性に優れた、生物製剤としての魚介類用感染防御剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物を含有する生物製剤が、上記問題点を一挙に解決することを見出した。
すなわち、本発明は、
（１） ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用感染防御剤、
（２） ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７）であることを特徴とする上記（１）記載の魚介類用感染防御剤、
（３） ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物の含有量が、全体量に対して０．０１〜９５質量％であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の魚介類用感染防御剤、
（４） 細菌感染防御剤であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、
（５） ウィルス感染防御剤であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、
（６） 寄生虫感染防御剤であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、
（７） 魚介類が淡水魚又は海水魚であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、
（８） 魚介類が甲殻類であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、
（９） 補体活性増強効果又は好中球数増加効果を奏する上記（１）〜（８）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、
（１０） 上記（１）〜（９）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤を含有する魚介類用飼料、及び
（１１） 上記（１）記載の魚介類用感染防御剤又は上記（１０）記載の魚介類用飼料を魚介類に投与することを特徴とする魚介類の生存率改善方法、
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明に用いられるラクトバチルス・プランタラムに属する菌の代表的なものとして、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７、ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ １１４９基準株、ラクトバチルス・プランタラムＬ−０５１（微工研菌寄第１１９１２号）などを挙げることができるが、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が最も好ましい。上記のラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７号（平成７年１１月３０日に寄託されたＦＥＲＭ Ｐ−１５３１７号より移管）として寄託されている。
上記の本発明に用いる菌は天然培地、合成培地、半合成培地などの培地に培養することにより得ることができる。培地としては、窒素源および炭素源を含有するものが用いられる。窒素源としては、たとえば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等が用いられ、炭素源としては、たとえば、グルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等が用いられる。このほか、無機質として、たとえば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデンなどを添加することができ、更に各種ビタミン類その他を添加することができる。培養温度は約２５〜４０℃、好ましくは約２７〜３５℃であり、培養時間は約１２〜４８時間程度であり、通気振盪してもよい。培地のｐＨは約３〜６、好ましくは約４〜６である。
培養終了後、菌体を採取した後、死菌体を調製してもよいし、又は菌体を培養液から一旦分離することなく、培養液中の菌体を死菌体にし、その死菌体を採取してもよい。菌体を採取する方法としては、例えば培養液に蒸留水を加え、遠心分離などの手段により上清を除き、必要によりその操作を繰り返し、遠心分離や濾過等により菌体を採取する方法がある。死菌体は、採取された生菌あるいは生菌を含んだ培養液ごと、たとえば加熱、紫外線照射、ホルマリン処理などにより不活性化することにより得られる。加熱処理により死菌体を得る場合、加熱温度は通常約６０〜１００℃、好ましくは約７０〜９０℃である。加熱手段としては、ヒーターを用いる公知の手段であってよい。加熱時間は所望の温度に達した後、通常約５〜４０分、好ましくは約１０〜３０分である。死菌体の処理物は、例えば、死菌体を凍結乾燥や噴霧乾燥することによって得られる。また、死菌体にデキストリンやセルロースなどの適当な賦形剤を加えて、これを凍結乾燥や噴霧乾燥することによっても得られる。死菌体の処理物はまた、死菌体の抽出物であってもよい。
本発明における魚介類としては、特に限定されず、淡水魚、海水魚、甲殻類のいずれであってもよく、また、養殖魚類、観賞魚類のいずれであってもよい。淡水魚としては、ウナギ、コイ、ニジマス、アユ、ティラピア、フナ、金魚類（例えば、ランチュウ、和金、コメット、朱文金、オランダシシガシラ、出目金等）、グッピー、アピストグラマ、ディスカス等が挙げられ、海水魚としては、クロマグロ、ブリ、タイ、ギンザケ、マアジ、ヒラメ、カレイ、クロソイ、トラフグ、カンパチ等が挙げられる。また、淡水魚及び海水魚のいずれにも属するものとして、サケ・マス類等が挙げられる。甲殻類としては、クルマエビ、ブラックタイガー、ウシエビ、コウライエビ、ガザミ等が挙げられる。
魚介類の病気の原因は、病原性細菌、ウイルス、寄生虫等による感染症が主であり、これらの感染症のいずれに対しても本発明の魚介類用感染防御剤は適用できる。細菌感染における細菌としては、大腸菌、サルモネラ菌、パスツレラ菌、ビブリオ病菌、連鎖球菌、糸状菌などが挙げられる。ウイルス感染におけるウイルスとしては、バキュロウィルス、ラブドウィルス、エビ類を死滅させるウイルス（ＰＲＤＶ：Ｐｅｎａｅｉｄ Ｒｏｄ−Ｓｈａｐｅｄ ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓ）などが挙げられる。寄生虫感染における寄生虫としては、通称はだむしと呼ばれる皮膚寄生虫｛例えば、ベネデニア・セリオラエ（Ｂｅｎｅｄｅｎｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）、ベネデニア・ホシナイ（Ｂｅｎｅｄｅｎｉａ ｈｏｓｈｉｎａｉ）、ベネデニア・エピネフェリ（Ｂｅｎｅｄｅｎｉａ ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｉ）、ネオベニデニア・エスピー（Ｎｅｏｂｅｎｅｄｅｎｉａ ｓｐ．）など｝、通称えらむしと呼ばれる魚鰓寄生虫｛例えば、ヘテラキシネ・ヘテロセルカ（Ｈｅｔｅｒａｘｉｎｅ ｈｅｔｅｒｏｃｅｒｃａ）、ゼウクサプタ・ジャポニカ（Ｚｅｕｘａｐｔａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、ビバギナ・タイ（Ｂｉｖａｇｉｎａ ｔａｉ）など｝、コクシジウムなどが挙げられる。なお、前記コクシジウムには、トラ河豚が罹患する通称コクシジウム症の原因である粘液胞子虫や微胞子虫などの寄生虫が含まれる。
本発明の魚介類用の感染防御剤は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物そのものであってよいし、死菌体又はその処理物を賦形剤又は希釈剤と混合した製剤であってもよい。製剤全体に対する死菌体又はその処理物の配合割合は好ましくは約０．０１〜９５質量％であり、より好ましくは約０．１〜５０質量％である。剤型としては、ペレット剤、錠剤、液剤、粉剤、粒剤、ペースト剤などが挙げられる。そのような製剤は魚介類に接触させたり、経口で与えることができる。
固状の賦形剤又は希釈剤としては、例えば、魚粉、骨粉、スキムミルク、綿実粕、小麦粉、小麦胚芽、米ぬか、ビール酵母、セルロース、ビタミン類（例えばβ−カロチン、ビタミンＤ３、メナジオン一亜硫酸水素ナトリウム、α−トコフェロール、チアミン一硝酸塩、リボフラビン、ピリドキシン一塩酸塩、シアノコバラミン、ビオチン、イノシトール、ニコチン酸、パントテン酸カルシウム、葉酸、塩化コリン、パラアミノ安息香酸、ビタミンＣ等）、又はミネラル類（例えば硫酸マグネシウム、リン酸２ナトリウム、リン酸２ナトリウムカリウム、クエン酸鉄、乳酸カルシウム、水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガン、ヨウ素酸カルシウム、硫酸コバルト等）などのいわゆる飼料原料が挙げられる。液状の賦形剤又は希釈剤としては、水あるいは水とアルコールとの混合物などが挙げられる。本発明の魚介類用感染防御剤は、ラクトバチルス・プランタムの死菌体又はその処理物を上記した賦形剤又は希釈剤と混合することによって容易に製造できる。混合に際して、所望により加熱し、フレーク状製剤を得ることもできる。このようにして製造された本発明の製剤は、魚介類用の飼料として使用されてよい。飼料として使用される場合、飼料中の死菌体又はその処理物の濃度は好ましくは約０ｐｐｍを超え２００ｐｐｍ以下であり、より好ましくは約０．１〜２００ｐｐｍであり、最も好ましくは０．１〜５０ｐｐｍである。
本発明製剤の魚介類感染防御のメカニズムは、補体活性増強及び好中球数増加によるものと考えられる。
本発明の魚介類用感染防御剤を、魚介類に投与すると魚介類の感染症を有効に予防又は治療することができ、魚介類の体重増加が観察され、魚介類の成長、生存率がアップする。
本発明の魚介類用感染防御剤は、上記乳酸菌の死菌体又はその処理物に換算して、魚介類の体重１ｋｇ当たり１日０．０００５〜５ｍｇ与えるのが好ましく、０．００５〜０．５ｍｇ与えるのがより好ましく、０．００５〜０．１２５ｍｇ与えるのが最も好ましい。
【実施例】
以下、本発明を実施例によって説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。なお、実施例中の「％」は「質量％」を意味する。
【実施例１】
［ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７）の死菌体を含むペレット剤の製造］
（菌の培養）
グルコース１％、酵母エキス１％、ポリペプトン０．５％、肉エキス０．２％、酢酸ナトリウム０．２％、硫酸マンガン・４水和物０．００１％、硫酸鉄・７水和物０．００１％、食塩０．００１％、ショ糖脂肪酸エステル０．０５％含む培地６Ｌにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７）株を接種し、３２℃で２４時間培養した。培養後、培養液を５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離し菌体を集めた。得られた菌体を生理食塩水によく分散し、５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離した後、上清を除き菌体を集めた。この操作を３回繰り返した後、菌体をイオン交換水に分散し、７０℃１０分間加熱した後、凍結乾燥することにより、加熱死菌体を約７ｇ得た。
（死菌体からペレット剤の製造）
ブラウンフィッシュミール６５．６質量部、α−スターチ３．４質量部、デキストリン３．４質量部、ダイズレシチン４．２質量部、メナジオン一亜硫酸水素ナトリウム０．０１４２８質量部、チアミン一硝酸塩０．０１７９７質量部、リボフラビン０．０５９８１質量部、ピリドキシン一塩酸塩０．０１４２８質量部、シアノコバラミン０．００００２質量部、セルロース０．５９８６９質量部、ビオチン０．００１８１質量部、イノシトール１．１９７６９質量部、ニコチン酸０．２３９５４質量部、パントテン酸カルシウム０．０８３８６質量部、葉酸０．００４５質量部、塩化コリン２．４４８５５質量部、パラアミノ安息香酸０．１１９２９質量部、ビタミンＣ０．０４６８１質量部、ミネラルミックス４．３質量部、イノシン酸０．１質量部、ベタイン０．６質量部、アラニン０．４質量部及び活性化グルテン５．０質量部からなる飼料原料をよく混合し、キッチンエンドで１０分間混合した。これに、ビタミン含有鱈肝油（鱈肝油７質量部に、β−カロチン０．０２９９６質量部、ビタミンＤ３０．００３０１質量部、α−トコフェロール０．１１９９３質量部を加え、超音波洗浄機を用いて混合したもの）を加えた。これに、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７加熱死菌体を所定濃度となるように加えた後、α−セルロースを加え、全量を１００質量部に調整して死菌体含有飼料とした。加熱死菌体の添加濃度は、死菌体含有飼料中、それぞれ０、２０ｐｐｍの２水準とした。
上記で得られた死菌体含有飼料に水を該飼料に対して４０質量％となるように加え１０分間混ぜ合わせた。得られた混合物をチョッパーで２回ひき、直径１．２ｃｍのペレット状飼料を作製した。それをオーブンで乾燥させ、水分含量が全体の１０％以下にしたものを試験飼料とした。なお、上記ミネラルミックスの組成を下記第１表に示す。
［好中球数の増加効果］
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７）の加熱死菌体を０ｐｐｍ（対照飼料）或いは２０ｐｐｍ（試験飼料）濃度で含有した飼料（水分１０質量％以下、直径１．２ｃｍのペレット状）を、２年間飼育したマダイ（体重：１．１１±０．２２ｋｇ）に与えた。すなわち、マダイを５００Ｌ円形ポリエチレンタンクに３尾ずつ収容し、これを一試験区当り２タンクずつセットし、注水率５Ｌ／分、水温２４．０℃で飼育し、給餌は朝夕の一日二回行い、体重の１〜５質量％を与えた。給餌１週目の浮き袋に滲出した好中球数の測定を行った。
浮き袋から好中球の回収は、エンドウらの方法（Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ ｓｃｉｅｎｃｅ ６４（４），６４４−６４５（１９９７））に従った。得られた好中球浮遊液（ハンクス緩衝液）にトリパンブルー染色液を加え、死細胞を染色した後、血球計測版にて生細胞数を測定した。結果を第２表に示した。
第２表に示したように試験飼料摂取マダイは、給餌前及び対照食摂取マダイと比較して著しく好中球の増加を示した。このことより、試験飼料摂取により、免疫機能が上昇し感染防御能が高まったことがわかる。
【実施例２】
［血清の殺菌能増加効果］
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７）の加熱死菌体を０ｐｐｍ（対照飼料）或いは２０ｐｐｍ（試験飼料）濃度で含有した飼料（水分１０質量％以下、直径１．２ｃｍのペレット状）を、実施例１と同一の方法で製造し、２年間飼育したマダイ（体重：１．１１±０．２２ｋｇ）に与えた。すなわち、マダイを５００Ｌ円形ポリエチレンタンクに３尾ずつ収容し、これを一試験区当り２タンクずつセットし、注水率５Ｌ／分、水温２４．０℃で飼育し、給餌は朝夕の一日二回行い、体重の１〜５質量％を与えた。給餌２週目に尾部より末梢血をスピッツ管に採血し、２４時間冷所に保存した後、スピッツ管の壁面にガラス棒を沿わせて血餅を剥がし、遠心分離機（３０００ｒｐｍ、１５分、４℃）を用いて血清を調製した。血清の殺菌活性は、大腸菌に対する殺菌能をヤマモト及びイイダの方法（Ｆｉｓｈ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３０（２）１２３−１２４（１９９５））の方法に従って測定することにより評価した。結果を第３表にまとめた。
第３表に示したように、試験飼料摂取魚は、血清による大腸菌殺菌能が高く、補体活性の上昇が示され、免疫機能増強による感染防御能の向上が認められた。
【産業上の利用可能性】
本発明によって、顕著な抗菌力を示し、保存安定性、水中安定性に優れた、生物製剤としての魚介類用感染防御剤を提供できる。
【技術分野】
本発明は、魚介類用感染防御剤、魚介類用飼料、及び魚介類生存率改善方法に関する。
【背景技術】
従来から、魚介類の養殖場において、養殖飼料の散逸による底質の悪化や過密養殖等の環境悪化にともない、魚介類の感染症が多発しており、魚介類養殖産業に甚大な被害をもたらしている。魚介類の感染防御剤として、抗生物質が汎用されており、また、生物製剤も知られている。生物製剤としては、例えば、バチラス・サチラス、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム・グルタニカム、エセリシア・コリ、ラクトバチラス・アシドフィラス、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトマイセス・タナシエンシス又はビフィドバクテリウム・サーモフィラムなどの細菌の殺菌処理物を含有する魚類・甲殼類のウイルス病及び細菌病の予防治療剤が報告されている（特許文献１、２）。
また、アルテロモナス・ハロプランクテイスを甲殻類の養殖に使用することにより、病害の発生を抑制すると共に、甲殻類の個体の成長を促進する方法が報告されている（特許文献３）。さらに、エンテロコッカス・フェシウムを配合したことを特徴とする魚介類用飼料（特許文献４）や通常の酵母よりセレンを多く含有するパンイーストを含有する養魚用飼料が報告されている（特許文献５）。
しかしながら、抗生物質を感染防御剤として用いる場合、抗生物質が魚介類に残留し、耐性菌の発現やその魚介を食した人体への悪影響が懸念される。また、特許文献１、２の生物製剤は、抗菌力や保存安定性、水中安定性において必ずしも満足すべきものではない。さらに、特許文献３〜５の生菌を用いる生物製剤は、製造工程や製剤の保存に厳密な管理が必要であるという問題点がある。
【特許文献１】特開平６−１８１６５６号公報
【特許文献２】特開平４−１９３８３２号公報
【特許文献３】特開平５−７６３５１号公報
【特許文献４】特許第２７２７５１７号
【特許文献５】特許第３０１３８７１号
【発明の開示】
本発明は、顕著な抗菌力を示し、保存安定性、水中安定性に優れた、生物製剤としての魚介類用感染防御剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物を含有する生物製剤が、上記問題点を一挙に解決することを見出した。
すなわち、本発明は、
（１） ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用感染防御剤、
（２） ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７）であることを特徴とする上記（１）記載の魚介類用感染防御剤、
（３） ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物の含有量が、全体量に対して０．０１〜９５質量％であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の魚介類用感染防御剤、
（４） 細菌感染防御剤であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、
（５） ウィルス感染防御剤であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、
（６） 寄生虫感染防御剤であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、
（７） 魚介類が淡水魚又は海水魚であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、
（８） 魚介類が甲殻類であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、
（９） 補体活性増強効果又は好中球数増加効果を奏する上記（１）〜（８）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、
（１０） 上記（１）〜（９）のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤を含有する魚介類用飼料、及び
（１１） 上記（１）記載の魚介類用感染防御剤又は上記（１０）記載の魚介類用飼料を魚介類に投与することを特徴とする魚介類の生存率改善方法、
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明に用いられるラクトバチルス・プランタラムに属する菌の代表的なものとして、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７、ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ １１４９基準株、ラクトバチルス・プランタラムＬ−０５１（微工研菌寄第１１９１２号）などを挙げることができるが、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が最も好ましい。上記のラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７号（平成７年１１月３０日に寄託されたＦＥＲＭ Ｐ−１５３１７号より移管）として寄託されている。
上記の本発明に用いる菌は天然培地、合成培地、半合成培地などの培地に培養することにより得ることができる。培地としては、窒素源および炭素源を含有するものが用いられる。窒素源としては、たとえば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等が用いられ、炭素源としては、たとえば、グルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等が用いられる。このほか、無機質として、たとえば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデンなどを添加することができ、更に各種ビタミン類その他を添加することができる。培養温度は約２５〜４０℃、好ましくは約２７〜３５℃であり、培養時間は約１２〜４８時間程度であり、通気振盪してもよい。培地のｐＨは約３〜６、好ましくは約４〜６である。
培養終了後、菌体を採取した後、死菌体を調製してもよいし、又は菌体を培養液から一旦分離することなく、培養液中の菌体を死菌体にし、その死菌体を採取してもよい。菌体を採取する方法としては、例えば培養液に蒸留水を加え、遠心分離などの手段により上清を除き、必要によりその操作を繰り返し、遠心分離や濾過等により菌体を採取する方法がある。死菌体は、採取された生菌あるいは生菌を含んだ培養液ごと、たとえば加熱、紫外線照射、ホルマリン処理などにより不活性化することにより得られる。加熱処理により死菌体を得る場合、加熱温度は通常約６０〜１００℃、好ましくは約７０〜９０℃である。加熱手段としては、ヒーターを用いる公知の手段であってよい。加熱時間は所望の温度に達した後、通常約５〜４０分、好ましくは約１０〜３０分である。死菌体の処理物は、例えば、死菌体を凍結乾燥や噴霧乾燥することによって得られる。また、死菌体にデキストリンやセルロースなどの適当な賦形剤を加えて、これを凍結乾燥や噴霧乾燥することによっても得られる。死菌体の処理物はまた、死菌体の抽出物であってもよい。
本発明における魚介類としては、特に限定されず、淡水魚、海水魚、甲殻類のいずれであってもよく、また、養殖魚類、観賞魚類のいずれであってもよい。淡水魚としては、ウナギ、コイ、ニジマス、アユ、ティラピア、フナ、金魚類（例えば、ランチュウ、和金、コメット、朱文金、オランダシシガシラ、出目金等）、グッピー、アピストグラマ、ディスカス等が挙げられ、海水魚としては、クロマグロ、ブリ、タイ、ギンザケ、マアジ、ヒラメ、カレイ、クロソイ、トラフグ、カンパチ等が挙げられる。また、淡水魚及び海水魚のいずれにも属するものとして、サケ・マス類等が挙げられる。甲殻類としては、クルマエビ、ブラックタイガー、ウシエビ、コウライエビ、ガザミ等が挙げられる。
魚介類の病気の原因は、病原性細菌、ウイルス、寄生虫等による感染症が主であり、これらの感染症のいずれに対しても本発明の魚介類用感染防御剤は適用できる。細菌感染における細菌としては、大腸菌、サルモネラ菌、パスツレラ菌、ビブリオ病菌、連鎖球菌、糸状菌などが挙げられる。ウイルス感染におけるウイルスとしては、バキュロウィルス、ラブドウィルス、エビ類を死滅させるウイルス（ＰＲＤＶ：Ｐｅｎａｅｉｄ Ｒｏｄ−Ｓｈａｐｅｄ ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓ）などが挙げられる。寄生虫感染における寄生虫としては、通称はだむしと呼ばれる皮膚寄生虫｛例えば、ベネデニア・セリオラエ（Ｂｅｎｅｄｅｎｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）、ベネデニア・ホシナイ（Ｂｅｎｅｄｅｎｉａ ｈｏｓｈｉｎａｉ）、ベネデニア・エピネフェリ（Ｂｅｎｅｄｅｎｉａ ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｉ）、ネオベニデニア・エスピー（Ｎｅｏｂｅｎｅｄｅｎｉａ ｓｐ．）など｝、通称えらむしと呼ばれる魚鰓寄生虫｛例えば、ヘテラキシネ・ヘテロセルカ（Ｈｅｔｅｒａｘｉｎｅ ｈｅｔｅｒｏｃｅｒｃａ）、ゼウクサプタ・ジャポニカ（Ｚｅｕｘａｐｔａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、ビバギナ・タイ（Ｂｉｖａｇｉｎａ ｔａｉ）など｝、コクシジウムなどが挙げられる。なお、前記コクシジウムには、トラ河豚が罹患する通称コクシジウム症の原因である粘液胞子虫や微胞子虫などの寄生虫が含まれる。
本発明の魚介類用の感染防御剤は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物そのものであってよいし、死菌体又はその処理物を賦形剤又は希釈剤と混合した製剤であってもよい。製剤全体に対する死菌体又はその処理物の配合割合は好ましくは約０．０１〜９５質量％であり、より好ましくは約０．１〜５０質量％である。剤型としては、ペレット剤、錠剤、液剤、粉剤、粒剤、ペースト剤などが挙げられる。そのような製剤は魚介類に接触させたり、経口で与えることができる。
固状の賦形剤又は希釈剤としては、例えば、魚粉、骨粉、スキムミルク、綿実粕、小麦粉、小麦胚芽、米ぬか、ビール酵母、セルロース、ビタミン類（例えばβ−カロチン、ビタミンＤ３、メナジオン一亜硫酸水素ナトリウム、α−トコフェロール、チアミン一硝酸塩、リボフラビン、ピリドキシン一塩酸塩、シアノコバラミン、ビオチン、イノシトール、ニコチン酸、パントテン酸カルシウム、葉酸、塩化コリン、パラアミノ安息香酸、ビタミンＣ等）、又はミネラル類（例えば硫酸マグネシウム、リン酸２ナトリウム、リン酸２ナトリウムカリウム、クエン酸鉄、乳酸カルシウム、水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガン、ヨウ素酸カルシウム、硫酸コバルト等）などのいわゆる飼料原料が挙げられる。液状の賦形剤又は希釈剤としては、水あるいは水とアルコールとの混合物などが挙げられる。本発明の魚介類用感染防御剤は、ラクトバチルス・プランタムの死菌体又はその処理物を上記した賦形剤又は希釈剤と混合することによって容易に製造できる。混合に際して、所望により加熱し、フレーク状製剤を得ることもできる。このようにして製造された本発明の製剤は、魚介類用の飼料として使用されてよい。飼料として使用される場合、飼料中の死菌体又はその処理物の濃度は好ましくは約０ｐｐｍを超え２００ｐｐｍ以下であり、より好ましくは約０．１〜２００ｐｐｍであり、最も好ましくは０．１〜５０ｐｐｍである。
本発明製剤の魚介類感染防御のメカニズムは、補体活性増強及び好中球数増加によるものと考えられる。
本発明の魚介類用感染防御剤を、魚介類に投与すると魚介類の感染症を有効に予防又は治療することができ、魚介類の体重増加が観察され、魚介類の成長、生存率がアップする。
本発明の魚介類用感染防御剤は、上記乳酸菌の死菌体又はその処理物に換算して、魚介類の体重１ｋｇ当たり１日０．０００５〜５ｍｇ与えるのが好ましく、０．００５〜０．５ｍｇ与えるのがより好ましく、０．００５〜０．１２５ｍｇ与えるのが最も好ましい。
【実施例】
以下、本発明を実施例によって説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。なお、実施例中の「％」は「質量％」を意味する。
【実施例１】
［ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７）の死菌体を含むペレット剤の製造］
（菌の培養）
グルコース１％、酵母エキス１％、ポリペプトン０．５％、肉エキス０．２％、酢酸ナトリウム０．２％、硫酸マンガン・４水和物０．００１％、硫酸鉄・７水和物０．００１％、食塩０．００１％、ショ糖脂肪酸エステル０．０５％含む培地６Ｌにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７）株を接種し、３２℃で２４時間培養した。培養後、培養液を５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離し菌体を集めた。得られた菌体を生理食塩水によく分散し、５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離した後、上清を除き菌体を集めた。この操作を３回繰り返した後、菌体をイオン交換水に分散し、７０℃１０分間加熱した後、凍結乾燥することにより、加熱死菌体を約７ｇ得た。
（死菌体からペレット剤の製造）
ブラウンフィッシュミール６５．６質量部、α−スターチ３．４質量部、デキストリン３．４質量部、ダイズレシチン４．２質量部、メナジオン一亜硫酸水素ナトリウム０．０１４２８質量部、チアミン一硝酸塩０．０１７９７質量部、リボフラビン０．０５９８１質量部、ピリドキシン一塩酸塩０．０１４２８質量部、シアノコバラミン０．００００２質量部、セルロース０．５９８６９質量部、ビオチン０．００１８１質量部、イノシトール１．１９７６９質量部、ニコチン酸０．２３９５４質量部、パントテン酸カルシウム０．０８３８６質量部、葉酸０．００４５質量部、塩化コリン２．４４８５５質量部、パラアミノ安息香酸０．１１９２９質量部、ビタミンＣ０．０４６８１質量部、ミネラルミックス４．３質量部、イノシン酸０．１質量部、ベタイン０．６質量部、アラニン０．４質量部及び活性化グルテン５．０質量部からなる飼料原料をよく混合し、キッチンエンドで１０分間混合した。これに、ビタミン含有鱈肝油（鱈肝油７質量部に、β−カロチン０．０２９９６質量部、ビタミンＤ３０．００３０１質量部、α−トコフェロール０．１１９９３質量部を加え、超音波洗浄機を用いて混合したもの）を加えた。これに、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７加熱死菌体を所定濃度となるように加えた後、α−セルロースを加え、全量を１００質量部に調整して死菌体含有飼料とした。加熱死菌体の添加濃度は、死菌体含有飼料中、それぞれ０、２０ｐｐｍの２水準とした。
上記で得られた死菌体含有飼料に水を該飼料に対して４０質量％となるように加え１０分間混ぜ合わせた。得られた混合物をチョッパーで２回ひき、直径１．２ｃｍのペレット状飼料を作製した。それをオーブンで乾燥させ、水分含量が全体の１０％以下にしたものを試験飼料とした。なお、上記ミネラルミックスの組成を下記第１表に示す。
［好中球数の増加効果］
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７）の加熱死菌体を０ｐｐｍ（対照飼料）或いは２０ｐｐｍ（試験飼料）濃度で含有した飼料（水分１０質量％以下、直径１．２ｃｍのペレット状）を、２年間飼育したマダイ（体重：１．１１±０．２２ｋｇ）に与えた。すなわち、マダイを５００Ｌ円形ポリエチレンタンクに３尾ずつ収容し、これを一試験区当り２タンクずつセットし、注水率５Ｌ／分、水温２４．０℃で飼育し、給餌は朝夕の一日二回行い、体重の１〜５質量％を与えた。給餌１週目の浮き袋に滲出した好中球数の測定を行った。
浮き袋から好中球の回収は、エンドウらの方法（Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ ｓｃｉｅｎｃｅ ６４（４），６４４−６４５（１９９７））に従った。得られた好中球浮遊液（ハンクス緩衝液）にトリパンブルー染色液を加え、死細胞を染色した後、血球計測版にて生細胞数を測定した。結果を第２表に示した。
第２表に示したように試験飼料摂取マダイは、給餌前及び対照食摂取マダイと比較して著しく好中球の増加を示した。このことより、試験飼料摂取により、免疫機能が上昇し感染防御能が高まったことがわかる。
【実施例２】
［血清の殺菌能増加効果］
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７）の加熱死菌体を０ｐｐｍ（対照飼料）或いは２０ｐｐｍ（試験飼料）濃度で含有した飼料（水分１０質量％以下、直径１．２ｃｍのペレット状）を、実施例１と同一の方法で製造し、２年間飼育したマダイ（体重：１．１１±０．２２ｋｇ）に与えた。すなわち、マダイを５００Ｌ円形ポリエチレンタンクに３尾ずつ収容し、これを一試験区当り２タンクずつセットし、注水率５Ｌ／分、水温２４．０℃で飼育し、給餌は朝夕の一日二回行い、体重の１〜５質量％を与えた。給餌２週目に尾部より末梢血をスピッツ管に採血し、２４時間冷所に保存した後、スピッツ管の壁面にガラス棒を沿わせて血餅を剥がし、遠心分離機（３０００ｒｐｍ、１５分、４℃）を用いて血清を調製した。血清の殺菌活性は、大腸菌に対する殺菌能をヤマモト及びイイダの方法（Ｆｉｓｈ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３０（２）１２３−１２４（１９９５））の方法に従って測定することにより評価した。結果を第３表にまとめた。
第３表に示したように、試験飼料摂取魚は、血清による大腸菌殺菌能が高く、補体活性の上昇が示され、免疫機能増強による感染防御能の向上が認められた。
【産業上の利用可能性】
本発明によって、顕著な抗菌力を示し、保存安定性、水中安定性に優れた、生物製剤としての魚介類用感染防御剤を提供できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用感染防御剤。
【請求項２】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７）であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項３】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物の含有量が、全体量に対して０．０１〜９５質量％であることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項４】
細菌感染防御剤であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項５】
ウィルス感染防御剤であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項６】
寄生虫感染防御剤であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項７】
魚介類が淡水魚又は海水魚であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項８】
魚介類が甲殻類であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項９】
補体活性増強効果又は好中球数増加効果を奏する請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項１０】
請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤を含有する魚介類用飼料。
【請求項１１】
飼料中の乳酸菌の死菌体又はその処理物の濃度が、０を超え２００ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の魚介類用飼料。
【請求項１２】
請求の範囲第１項に記載の魚介類用感染防御剤又は請求の範囲第１０項に記載の魚介類用飼料を魚介類に投与することを特徴とする魚介類の生存率改善方法。
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用感染防御剤。
【請求項２】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７）であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項３】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の死菌体又はその処理物の含有量が、全体量に対して０．０１〜９５質量％であることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項４】
細菌感染防御剤であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項５】
ウィルス感染防御剤であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項６】
寄生虫感染防御剤であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項７】
魚介類が淡水魚又は海水魚であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項８】
魚介類が甲殻類であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項９】
補体活性増強効果又は好中球数増加効果を奏する請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。
【請求項１０】
請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤を含有する魚介類用飼料。
【請求項１１】
飼料中の乳酸菌の死菌体又はその処理物の濃度が、０を超え２００ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の魚介類用飼料。
【請求項１２】
請求の範囲第１項に記載の魚介類用感染防御剤又は請求の範囲第１０項に記載の魚介類用飼料を魚介類に投与することを特徴とする魚介類の生存率改善方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８４９２２
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４０４５（Ｐ２００５−５０４０４５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３８８４
【国際出願日】平成１６年３月２２日（２００４．３．２２）
【出願人】（０００２３８５１１）武田食品工業株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３８８４
【国際出願日】平成１６年３月２２日（２００４．３．２２）
【出願人】（０００２３８５１１）武田食品工業株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]