（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造方法
【課題】（Ｓ）−３−キヌクリジノールを微生物学的に製造する方法を提供する。
【解決手段】３−キヌクリジノンに、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、若しくはシュードクラビバクター（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物、又はその処理物を作用させることにより、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを微生物学的に製造する。本発明によれば、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを選択的にかつ高濃度で得ることができる。
【解決手段】３−キヌクリジノンに、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、若しくはシュードクラビバクター（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物、又はその処理物を作用させることにより、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを微生物学的に製造する。本発明によれば、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを選択的にかつ高濃度で得ることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを選択的に製造する方法に関する。（Ｓ）−３−キヌクリジノールは、医農薬中間体を始め、各種ファインケミカルの中間体として用いられ、産業上有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
微生物学的方法により不斉還元酵素を利用して、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを製造する方法としては次の方法が知られている。
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスポリディウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属に属する微生物からなる群から選ばれる微生物を作用させる方法（特許文献１）がある。この方法では、光学純度は４％ｅｅから最高９５％ｅｅ、蓄積濃度は１．２ｇ／Ｌ〜１．６ｇ／Ｌで（Ｓ）−３−キヌクリジノールを得ている（２５ｍＬの培養液を集菌し、０．５％の３−キヌクリジノンを含む反応液を２ｍＬ添加して、３０℃、３日間反応した結果）が、光学純度と蓄積濃度がともに低いという問題点がある。
【０００３】
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属などに属する微生物からなる群から選ばれる微生物を作用させる方法（特許文献２）がある。この方法では、光学純度は１８％ｅｅから最高１００％ｅｅであり、光学純度が１００％ｅｅの微生物で蓄積濃度は０．３ｇ／Ｌ（１００ｍＬ培養液に、３−キヌクリジノンを８０８ｍｇ添加し、２５℃で５日間培養を継続し、反応を行った結果）で、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを得ているが、蓄積濃度が低いという問題点がある。
【０００４】
ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物を作用させる方法（特許文献３）がある。この方法では、光学純度は最高１００％ｅｅで、蓄積濃度は０．０３ｇ／Ｌ（１００ｍＬ培養液を集菌し、０．５％の３−キヌクリジノンを含む反応液を１５ｍＬ添加して、３０℃、４８時間反応した結果）で得ているが、蓄積濃度が低いという問題点がある。
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−２４３７９５号
【特許文献２】特開平１１−１９６８９０号
【特許文献３】特開２００２−１５３２９３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述のように、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを生産することのできる微生物が報告されているが、光学純度や蓄積濃度が低いという問題点を有していた。
【０００７】
本発明者らは、上記問題点を解決すべき鋭意検討を重ねた結果、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、又はシュードクラビバクター（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物が、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを選択的に著量生成し、蓄積する能力を有していることを見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、３−キヌクリジノンに、ロドコッカス属、若しくはシュードクラビバクター属に属する微生物、又はその処理物を作用させることにより（Ｓ）−３−キヌクリジノールを得ることを特徴とする、（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造方法に関する。
また、本発明は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４３であるロドコッカス クウィングシェンギ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｑｉｎｇｓｈｅｎｇｉｉ） ＹＧＫ−５１４、及び、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４２であるシュードクラビバクター エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ） ＹＧＫ−０３２にも関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを選択的にかつ高濃度で得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
３−キヌクリジノンに、ロドコッカス属、若しくはシュードクラビバクター属に属する微生物、又はその処理物を作用させることにより（Ｓ）−３−キヌクリジノールを選択的にかつ高濃度で製造することができる。
本発明における微生物としては、３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールを著量生成し、蓄積する能力を有する、ロドコッカス属、又はシュードクラビバクター属に属する微生物であればその種及びその起源は何ら問わない。
【００１１】
本発明における微生物として好ましくは、ロドコッカス クウィングシェンギ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｑｉｎｇｓｈｅｎｇｉｉ）、シュードクラビバクター エスピーを挙げることができる。更に好ましくは、ロドコッカス クウィングシェンギ ＹＧＫ−５１４（ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４３）、シュードクラビバクター エスピー ＹＧＫ−０３２（ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４２）を挙げることができる。本菌株は平成２０年８月７日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に上記受託番号で国内寄託されている。
【００１２】
本発明において使用することのできるロドコッカス クウィングシェンギ ＹＧＫ−５１４（ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４３）の菌学的性質は次のとおりである。
１−１．形態的性質
（１）細胞形態：不規則桿菌
（２）幅：０．８μｍ
（３）長さ：２．０〜３．０μｍ
（４）細胞多形成の有無：−
（５）運動性：−
（６）胞子形成：−
１−２．培養的性質
培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地 ３０℃
（１）色：オレンジ色
（２）光沢：＋
（３）色素生産：＋
（４）表面発育の有無：＋
（５）培地の混濁の有無：＋
培養条件：ゼラチン穿刺培養 ３０℃
（６）生育状態：＋
（７）ゼラチン液化：−
培養条件：リトマス・ミルク ３０℃
（８）凝固：−
（９）液化：−
１−３．生理学的性質（＋ｗは弱い反応を表す）
（１）グラム染色：＋
（２）硝酸塩の還元：−
（３）脱窒反応：−
（４）ＭＲテスト：−
（５）ＶＰテスト：−
（６）インドール生産：−
（７）硫化水素の生成：−
（８）デンプンの加水分解：−
（９）クエン酸の利用
Ｋｏｓｅｒ：−
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ：＋
（１０）無機窒素の利用
硝酸塩：＋
アンモニウム塩：＋
（１１）ウレアーゼ活性：−
（１２）カタラーゼ活性：＋
（１３）オキシダーゼ活性：−
（１４）生育の範囲 ｐＨ
５：＋
８：＋
９：＋
（１５）生育の範囲 温度
２０℃：＋
３０℃：＋
３７℃：＋
４５℃：−
（１６）嫌気的生育性：＋ｗ
（１７）Ｏ−Ｆテスト（酸化／発酵）：＋／−
１−４．糖類からの酸生産／ガス生産（＋ｗは弱い反応を表す）
（１）Ｌ−アラビノース：−／−
（２）Ｄ−グルコース：＋ｗ／−
（３）Ｄ−フラクトース：−／−
（４）マルトース：−／−
（５）ラクトース：−／−
（６）Ｄ−ソルビトール：−／−
（７）イノシトール：−／−
（８）Ｄ−キシロース：−／−
（９）Ｄ−マンノース：−／−
（１０）Ｄ−ガラクトース：−／−
（１１）サッカロース：−／−
（１２）トレハロース：−／−
（１３）Ｄ−マンニトール：−／−
（１４）グリセリン：−／−
１−５．その他生理学的性質
（１）β−ガラクトシダーゼ活性：−
（２）アルギニンジヒドロラーゼ活性：−
（３）リジンデカルボキシラーゼ活性：−
（４）トリプトファンデアミナーゼ活性：−
（５）ゼラチナーゼ活性：−
【００１３】
１−６．化学分類学的性質
本菌株よりゲノムＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）の配列を解析した。決定された１４７８ｂｐの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。こうして得られた本菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を用いて、ＤＮＡ塩基配列データベース（アポロンＤＢ−ＢＡ４．０）に対する相同性検索の結果、ロドコッカス由来の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し高い相同性を示し、ロドコッカス クウィングシェンギｄｊｌ−６株〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＤＱ０９０９６１〕の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し１００％の最も高い相同性を示し、ついで、ロドコッカス バイコヌレンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｉｋｏｎｕｒｅｎｓｉｓ）ＧＴＣ１０４１株〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０７１９５１〕の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し９９．８％の相同性を示した。近縁菌群と系統樹を作製した結果、本菌株は、ロドコッカス クウィングシェンギ及び、ロドコッカス バイコヌレンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｉｋｏｎｕｒｅｎｓｉｓ）の１６Ｓ ｒＤＮＡとクラスターを形成し近縁であることが示され、さらに、ロドコッカス クウィングシェンギと同一の分子系統学的位置を示した。
以上の結果より、本菌株は、ロドコッカス クウィングシェンギであると判定した。
【００１４】
本発明において使用することのできるシュードクラビバクター エスピー ＹＧＫ−０３２（ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４２）の菌学的性質は次のとおりである。
１−１．形態的性質
（１）細胞形態：桿菌
（２）幅：０．７−０．８μｍ
（３）長さ：１．０〜１．５μｍ
（４）細胞多形成の有無：−
（５）運動性：−
（６）胞子形成：−
１−２．培養的性質
培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地 ３０℃
（１）色：黄色
（２）光沢：＋
（３）色素生産：＋
（４）表面発育の有無：−
（５）培地の混濁の有無：＋
培養条件：ゼラチン穿刺培養 ３０℃
（６）生育状態：＋
（７）ゼラチン液化：−
培養条件：リトマス・ミルク ３０℃
（８）凝固：−
（９）液化：−
１−３．生理学的性質（＋ｗは弱い反応を表す）
（１）グラム染色：＋
（２）硝酸塩の還元：−
（３）脱窒反応：−
（４）ＭＲテスト：−
（５）ＶＰテスト：−
（６）インドール生産：−
（７）硫化水素の生成：−
（８）デンプンの加水分解：−
（９）クエン酸の利用
Ｋｏｓｅｒ：−
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ：＋
（１０）無機窒素の利用
硝酸塩：−
アンモニウム塩：−
（１１）ウレアーゼ活性：−
（１２）カタラーゼ活性：＋
（１３）オキシダーゼ活性：−
（１４）生育の範囲 ｐＨ
５：−
８：＋
９：＋
（１５）生育の範囲 温度
２０℃：＋
３０℃：＋
３７℃：−
４５℃：−
（１６）嫌気的生育性：＋ｗ
（１７）Ｏ−Ｆテスト（酸化／発酵）：＋／−
１−４．糖類からの酸生産／ガス生産
（１）Ｌ−アラビノース：−／−
（２）Ｄ−グルコース：＋／−
（３）Ｄ−フラクトース：＋／−
（４）マルトース：−／−
（５）ラクトース：−／−
（６）Ｄ−ソルビトール：−／−
（７）イノシトール：−／−
（８）Ｄ−キシロース：−／−
（９）Ｄ−マンノース：＋／−
（１０）Ｄ−ガラクトース：−／−
（１１）サッカロース：＋／−
（１２）トレハロース：−／−
（１３）Ｄ−マンニトール：−／−
（１４）グリセリン：＋／−
１−５．その他生理学的性質
（１）β−ガラクトシダーゼ活性：＋
（２）アルギニンジヒドロラーゼ活性：−
（３）リジンデカルボキシラーゼ活性：−
（４）トリプトファンデアミナーゼ活性：−
（５）ゼラチナーゼ活性：−
【００１５】
１−６．化学分類学的性質
本菌株よりゲノムＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）の配列を解析した。決定された１４８１ｂｐの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。こうし
て得られた本菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号２）を用いて、ＤＮＡ塩基配列データベース（アポロンＤＢ−ＢＡ４．０）に対して相同性を検索し、近縁菌群と系統樹を作製した結果、本菌株はシュードクラビバクター属に属すると推定された。最も近縁であった基準株はシュードクラビバクター ヘルボラス（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｈｅｌｖｏｌｕｓ）ＤＳＭ２０４１９株〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ７７４４０〕であり、９９．７％の相同性を示した。以上の結果より、本菌株は、シュードクラビバクター属に含まれ、既知種では、シュードクラビバクター ヘルボラス（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｈｅｌｖｏｌｕｓ）に最も近縁と考えられる。しかし、両者の１６Ｓ ｒＤＮＡは完全に一致しておらず、本菌株とシュードクラビバクター ヘルボラス（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｈｅｌｖｏｌｕｓ）は種として異なる菌株である可能性も否定できない。これらのことから、本菌株をシュードクラビバクター エスピーであると判定した。
【００１６】
次に、本発明方法において使用するロドコッカス属、及びシュードクラビバクター属に属する微生物の培養方法について説明する。
前記微生物の培養液の調整方法としては、（ア）炭素源及び窒素源を適宜添加した培地に微生物の菌体を接種して同一の該培地中で増殖させて培養液を得る方法、（イ）培養を段階的に行って培養液を得る方法、すなわち、前培養と本培養を組み合わせて培養液を得る方法が挙げられるが、好ましくは（イ）の方法である。（イ）の方法は、まず、前培養として、炭素源及び窒素源を適宜添加した培地に前記微生物の菌体を接種して微生物を増殖させて、本培養で使用する微生物の確保を目的として第一段階の培養液（以下、前培養液という。）を得た後、次に本培養として、容量を増大させた培地に前培養液を加えて、炭素源及び窒素源を適宜添加して微生物を培養することで蓄積反応に十分な酵素の産生を目的として第二段階の培養液（以下、本培養液という。）を得る方法である。しかしながら、前記微生物の菌体を含む培養液の調製方法は、これらの方法に限定されるものではなく、更に、３回以上の培養を組み合わせて行うことも可能である。
【００１７】
前記微生物を培養するための培地は、通常これらの微生物が生育可能な培地であれば特に制限はなく、一般的な微生物用の任意の公知培地を用いることができる。培地の炭素源及び窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸、無機窒素、有機酸、糖類などを使用することができる。また、必要に応じて、微量金属塩、ビタミン類、核酸関連物質、無機塩類などを添加することもできる。
【００１８】
炭素源及び窒素源の供給方法としては、（１）培地作製時にあらかじめ添加しておく方法、（２）微生物の増殖にあわせて、炭素源及び窒素源を連続又は間欠的に供給していく方法を挙げることができる。前記（２）の方法は、微生物の増殖により消費した炭素源及び窒素源を追加していくため、高濃度の炭素源及び窒素源により微生物の生育阻害がある場合でも、微生物の濃度を高くすることができる利点がある。前記（２）の方法を更に具体的に説明すると、微生物が炭素源及び窒素源を消費する速度に合わせて炭素源及び窒素源を添加する方法などがある。例えば、微生物が生育するとともにｐＨが上昇し、かつ、炭素源及び窒素源を含む水溶液が酸性である場合、ｐＨコントローラーを用いて、培養液のｐＨが一定になるように、炭素源及び窒素源を含む酸性の水溶液を添加すると、微生物の増殖の進行とともに、炭素源及び窒素源を少しずつ添加する方法を用いることができる。
【００１９】
更に、培養の際に、前記微生物が有する、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを生成する能力を最大限に引き出すために、糖類、有機酸又はアミノ酸を添加して培養することもできる。特に効果が得られる物質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、スクロース、Ｄ−リボース、マンニトール、グリセロール、Ｄ−キシロース、ソルビトール、Ｄ−ラクトース、マルトース、Ｌ−リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、グルコン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミンなどであり、培地に対して０．１〜５．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２．０ｗ／ｖ％である。なお、本明細書において、ｗ／ｖは質量／容積を、ｖ／ｖは容積／容積を意味する。
【００２０】
前記微生物の培養温度は１０〜３７℃、好ましくは２３〜３２℃である。培養時の培地のｐＨは６．０〜１０．０であり、好ましくはｐＨ６．５〜９．０である。培養は、好気的条件下で行うことが好ましく、液体培養時には通気及び撹拌を行うことが望ましい。培養時間は１０時間〜１週間であり、好ましくは１〜３日間であり、より好ましくは１〜２日である。
培養の進行とともに、酵素生産量も増加していくが、培養の後半には、生育速度の低下とともに、炭素源及び窒素源の消費速度、酵素生産速度も低下し、培養を終了する。炭素源及び窒素源の総添加量、培養時間、菌体の濃度、酵素生産量などから本培養の終了を判断することもできる。
【００２１】
以上のようにして、前記微生物の培養菌体を培養液中に蓄積させ、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応に用いることができる。
［ｉ］得られた培養液はそのまま以下に述べる蓄積反応に使用してもよいし、
［ii］微生物を培養液から回収して反応に使用したり、更に
［iii］微生物の処理物、例えば、破砕物、粗酵素、精製酵素などを反応に使用することもできる。
続いて、前記微生物又はその処理物により、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを生成する反応を行うことができる。この蓄積反応は、バッチ式でも、バイオリアクターなどを用いた連続式でも可能である。バッチ式反応の場合には、数時間から１０日間で行うことができる。
【００２２】
上述の［ｉ］の場合を具体的に説明すると、上記の培養方法で増殖させた前記微生物を含む培養液に、直接、３−キヌクリジノンと糖類、有機酸、アルコール類などを加え、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを系内に蓄積させる反応を開始させることができる。
蓄積反応のｐＨは５．０〜１０．０、好ましくはｐＨ５．０〜８．０である。反応温度は１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃である。基質の３−キヌクリジノンの添加量は、反応液に対して０．１〜１０．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．３〜５．０ｗ／ｖ％である。３−キヌクリジノンの添加は一度に行ってもよいが、高濃度の３−キヌクリジノンによる反応阻害が見られる場合には分割して添加してもよい。
【００２３】
一般的に、３−キヌクリジノン不斉還元酵素は、３−キヌクリジノンの不斉還元反応において、３−キヌクリジノンと等量の還元型補酵素（還元型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、又は還元型ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を還元剤として要求するとされている。３−キヌクリジノンの還元反応後は、補酵素はそれぞれ酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）又は酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＰ＋）へと変換される。
触媒量の補酵素で３−キヌクリジノンの不斉還元反応を進行させるためには、酸化型補酵素のＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋をそれぞれ還元型補酵素のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨへと再生する反応が必要であり、一般的に、この補酵素再生反応には、グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの酸化反応が利用されている。
【００２４】
また、一般的に、グルコースデヒドロゲナーゼなどの補酵素を再生する酵素の供給源として、市販酵素を使用したり、遺伝子組み替えにより補酵素を再生する酵素を生産させることが行われるが、本発明において、補酵素を再生する酵素を添加することなく、糖類、有機酸、アルコール類などを添加するのみで、効率よく３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールへの変換を行うことができる。
【００２５】
糖類、有機酸、アルコール類などとしては、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、スクロース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、ソルビトール、Ｄ−ラクトース、マルトースなどの糖類、クエン酸などの有機酸、エタノールなどのアルコール類などを挙げることができる。糖類、有機酸、アルコール類などの添加量は、３−キヌクリジノンを還元して（Ｓ）−３−キヌクリジノールを生成する反応液に対して０．１〜１５．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．３〜１０．０ｗ／ｖ％である。糖類、有機酸、アルコール類などの添加は一度に行ってもよいが、高濃度の糖類、有機酸、アルコール類などによる反応阻害が見られる場合には分割して添加してもよい。
（Ｓ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応は、前記微生物が十分に増殖して、変換能力が十分となった時点から開始することができるが、前記微生物の増殖が十分でない培養初期段階でも、生育阻害が起こらない濃度範囲で培地に３−キヌクリジノンを添加して、微生物の増殖と（Ｓ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応を同時に行うことができる。
【００２６】
また、上述の［ii］の場合には、上記の培養方法で増殖させた微生物をろ過又は遠心分離により培養液から回収して蓄積反応に使用することができる。すなわち、得られた微生物は３−キヌクリジノンと糖類、有機酸、アルコール類などを含む生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液などの水性溶媒に懸濁して反応に使用することができる。反応条件（ｐＨ、温度、３−キヌクリジノンと糖類、有機酸、アルコール類などの添加量）は［ｉ］の場合と同じである。
【００２７】
更に、上述の［iii］の場合には、前記培養方法で増殖させ、回収した微生物の処理物（例えば、破砕物、粗酵素、精製酵素）は、３−キヌクリジノンと糖類、有機酸、アルコール類などを含む水性溶媒に懸濁して反応に使用することができる。あるいは、微生物又はその処理物を公知の方法で適当な担体に固定化し、その固定化物を水性溶媒と接触させて反応に使用してもよい。前記微生物又はその処理物を使用した蓄積反応に用いる水性溶媒としては、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液などを挙げることができる。反応条件は［ｉ］の場合と同様である。
【００２８】
以上のようにして得られた蓄積反応後の反応液から、必要に応じて、ろ過、遠心分離などにより微生物を除去した後、溶媒で（Ｓ）−３−キヌクリジノールを抽出して、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを回収することができる。粗酵素、精製酵素などの処理物を使用した場合などでは微生物除去操作を省略することができる。また、クロマトグラフィーなどの公知の精製方法により（Ｓ）−３−キヌクリジノールを回収することもできる。
【実施例】
【００２９】
以下に代表的な実施例を示し、本発明の具体的な説明を行うが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
実施例において使用する培地組成を以下に記載する。
（１）培地［Ａ］
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス５．０ｇ、トリプトン２ｇ、Ｄ−グルコース１．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物１．０ｇ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．０５ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．５に調整した培地。
【００３０】
（２）培地［Ｂ］
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス１５．０ｇ、Ｄ−グルコース１０．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物１．０ｇ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ、塩化亜鉛０．１ｇ、硫酸鉄七水和物０．１ｇ、塩化マンガン（II）四水和物０．０５ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．０に調整した培地。
【００３１】
（３）培地［Ｃ］
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス２．０ｇ、Ｄ−グルコース１０．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物１．０ｇ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．２ｇ、塩化マンガン（II）四水和物０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．５に調整した培地。
【００３２】
次に、実施例で使用するＧＣの分析条件を以下に記載する。
［ＧＣの分析条件］
カラム；ＣＰ−ＣＨＩＲＡＳＩＬ−ＤＥＸ ＣＢ（Ｖａｒｉａｎ社製） ２５ｍ×０．２５ｍｍ、
Ｎ２流速；１ｍＬ／分、
カラム温度；１４０℃、
インジェクション温度；２２０℃、
検出；ＦＩＤ、２２０℃、
保持時間；３−キヌクリジノン６．９分、（Ｓ）−３−キヌクリジノール１３．９分、（Ｒ）−３−キヌクリジノール１４．４分
【００３３】
《実施例１：ロドコッカス クウィングシェンギ ＹＧＫ−５１４の静止菌体を用いた（Ｓ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応》
（１）培養
培地［Ａ］１００ｍＬを５００ｍＬ容の三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この三角フラスコに、栄養寒天培地に維持したロドコッカス クウィングシェンギ ＹＧＫ−５１４の菌体を１白金耳接種し、２７℃で２４時間振とう培養し、前培養液とした。
一方、撹拌、通気、温度及びｐＨ調整が可能な２Ｌ容のジャーファーメンターに培地［Ｂ］１Ｌを入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。このジャーファーメンターに、上記前培養液１０ｍＬを加え、撹拌及び通気を実施しながら２７℃及びｐＨ７．０で、２２時間、培養を行い本培養液を得た。
【００３４】
（２）蓄積反応
上記本培養液２５０ｍＬを遠心分離により集菌し静止菌体を得た。これに、３−キヌクリジノン塩酸塩３．０ｗ／ｖ％とＤ−グルコース１０．０ｗ／ｖ％を含む、ｐＨ５．５の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液５０ｍＬを加えて懸濁した。この懸濁液を撹拌下２７℃で反応を開始した。１１９時間後、反応速度が低下したため、反応を終了した。その後、遠心分離により、菌体を除去し、得られた上澄み液０．２５ｍＬに、５０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム水溶液０．２５ｍＬ、クロロホルム１ｍＬを加え、抽出を行った。得られたクロロホルム層をＧＣ分析した結果、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを蓄積濃度２．１６％、収率９６％（［反応後の（Ｓ）−３−キヌクリジノールのモル濃度］÷［添加した３−キヌクリジノンのモル濃度］）で取得した。また、ＧＣ分析では（Ｒ）−３−キヌクリジノールは検出されず、光学純度は１００％ｅｅであった。
【００３５】
《実施例２：シュードクラビバクター エスピー ＹＧＫ−０３２の静止菌体を用いた（Ｓ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応》
（１）培養
培地［Ａ］１００ｍＬを５００ｍＬ容の三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この三角フラスコに、栄養寒天培地に維持したシュードクラビバクター エスピー ＹＧＫ−０３２の菌体を１白金耳接種し、２７℃で２４時間振とう培養し、前培養液とした。
一方、撹拌、通気、温度及びｐＨ調整が可能な２Ｌ容のジャーファーメンターに培地［Ｃ］１Ｌを入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。このジャーファーメンターに、上記前培養液１０ｍＬを加え、撹拌及び通気を実施しながら２７℃及びｐＨ７．５で、２３時間、培養を行い本培養液を得た。
【００３６】
（２）蓄積反応
上記本培養液５００ｍＬを遠心分離により集菌し静止菌体を得た。これに、３−キヌクリジノン塩酸塩５．０ｗ／ｖ％とＤ−グルコース１０．０ｗ／ｖ％、ＮＡＤＨ０．０６％、ＮＡＤＰＨ０．０６％を含む、ｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液５０ｍＬを加えて懸濁した。この懸濁液を撹拌下２７℃で反応を開始した。
反応５０時間後、３−キヌクリジノン塩酸塩の濃度が０．９％まで低下し、さらに、反応が進行していたことから、２５ｗ／ｖ％の３−キヌクリジノン塩酸塩水溶液を６ｍＬ（３−キヌクリジノン塩酸塩として１．５ｇ）とＤ−グルコース２．５ｇを追加し、反応を継続させた。反応２１５時間後、反応速度が低下したため、反応を終了した。その後、遠心分離により、菌体を除去し、得られた上澄み液０．２５ｍＬに、５０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム水溶液０．２５ｍＬ、クロロホルム１ｍＬを加え、抽出を行った。得られたクロロホルム層をＧＣ分析した結果、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを蓄積濃度５．４６％、収率１００％（［反応後の（Ｓ）−３−キヌクリジノールのモル濃度］÷［反応前と追加分の３−キヌクリジノンのモル濃度］）で取得した。また、ＧＣ分析では（Ｒ）−３−キヌクリジノールは検出されず、光学純度は１００％ｅｅであった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを選択的に製造する方法に関する。（Ｓ）−３−キヌクリジノールは、医農薬中間体を始め、各種ファインケミカルの中間体として用いられ、産業上有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
微生物学的方法により不斉還元酵素を利用して、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを製造する方法としては次の方法が知られている。
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスポリディウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属に属する微生物からなる群から選ばれる微生物を作用させる方法（特許文献１）がある。この方法では、光学純度は４％ｅｅから最高９５％ｅｅ、蓄積濃度は１．２ｇ／Ｌ〜１．６ｇ／Ｌで（Ｓ）−３−キヌクリジノールを得ている（２５ｍＬの培養液を集菌し、０．５％の３−キヌクリジノンを含む反応液を２ｍＬ添加して、３０℃、３日間反応した結果）が、光学純度と蓄積濃度がともに低いという問題点がある。
【０００３】
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属などに属する微生物からなる群から選ばれる微生物を作用させる方法（特許文献２）がある。この方法では、光学純度は１８％ｅｅから最高１００％ｅｅであり、光学純度が１００％ｅｅの微生物で蓄積濃度は０．３ｇ／Ｌ（１００ｍＬ培養液に、３−キヌクリジノンを８０８ｍｇ添加し、２５℃で５日間培養を継続し、反応を行った結果）で、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを得ているが、蓄積濃度が低いという問題点がある。
【０００４】
ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物を作用させる方法（特許文献３）がある。この方法では、光学純度は最高１００％ｅｅで、蓄積濃度は０．０３ｇ／Ｌ（１００ｍＬ培養液を集菌し、０．５％の３−キヌクリジノンを含む反応液を１５ｍＬ添加して、３０℃、４８時間反応した結果）で得ているが、蓄積濃度が低いという問題点がある。
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−２４３７９５号
【特許文献２】特開平１１−１９６８９０号
【特許文献３】特開２００２−１５３２９３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述のように、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを生産することのできる微生物が報告されているが、光学純度や蓄積濃度が低いという問題点を有していた。
【０００７】
本発明者らは、上記問題点を解決すべき鋭意検討を重ねた結果、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、又はシュードクラビバクター（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物が、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを選択的に著量生成し、蓄積する能力を有していることを見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、３−キヌクリジノンに、ロドコッカス属、若しくはシュードクラビバクター属に属する微生物、又はその処理物を作用させることにより（Ｓ）−３−キヌクリジノールを得ることを特徴とする、（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造方法に関する。
また、本発明は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４３であるロドコッカス クウィングシェンギ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｑｉｎｇｓｈｅｎｇｉｉ） ＹＧＫ−５１４、及び、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４２であるシュードクラビバクター エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ） ＹＧＫ−０３２にも関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを選択的にかつ高濃度で得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
３−キヌクリジノンに、ロドコッカス属、若しくはシュードクラビバクター属に属する微生物、又はその処理物を作用させることにより（Ｓ）−３−キヌクリジノールを選択的にかつ高濃度で製造することができる。
本発明における微生物としては、３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールを著量生成し、蓄積する能力を有する、ロドコッカス属、又はシュードクラビバクター属に属する微生物であればその種及びその起源は何ら問わない。
【００１１】
本発明における微生物として好ましくは、ロドコッカス クウィングシェンギ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｑｉｎｇｓｈｅｎｇｉｉ）、シュードクラビバクター エスピーを挙げることができる。更に好ましくは、ロドコッカス クウィングシェンギ ＹＧＫ−５１４（ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４３）、シュードクラビバクター エスピー ＹＧＫ−０３２（ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４２）を挙げることができる。本菌株は平成２０年８月７日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に上記受託番号で国内寄託されている。
【００１２】
本発明において使用することのできるロドコッカス クウィングシェンギ ＹＧＫ−５１４（ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４３）の菌学的性質は次のとおりである。
１−１．形態的性質
（１）細胞形態：不規則桿菌
（２）幅：０．８μｍ
（３）長さ：２．０〜３．０μｍ
（４）細胞多形成の有無：−
（５）運動性：−
（６）胞子形成：−
１−２．培養的性質
培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地 ３０℃
（１）色：オレンジ色
（２）光沢：＋
（３）色素生産：＋
（４）表面発育の有無：＋
（５）培地の混濁の有無：＋
培養条件：ゼラチン穿刺培養 ３０℃
（６）生育状態：＋
（７）ゼラチン液化：−
培養条件：リトマス・ミルク ３０℃
（８）凝固：−
（９）液化：−
１−３．生理学的性質（＋ｗは弱い反応を表す）
（１）グラム染色：＋
（２）硝酸塩の還元：−
（３）脱窒反応：−
（４）ＭＲテスト：−
（５）ＶＰテスト：−
（６）インドール生産：−
（７）硫化水素の生成：−
（８）デンプンの加水分解：−
（９）クエン酸の利用
Ｋｏｓｅｒ：−
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ：＋
（１０）無機窒素の利用
硝酸塩：＋
アンモニウム塩：＋
（１１）ウレアーゼ活性：−
（１２）カタラーゼ活性：＋
（１３）オキシダーゼ活性：−
（１４）生育の範囲 ｐＨ
５：＋
８：＋
９：＋
（１５）生育の範囲 温度
２０℃：＋
３０℃：＋
３７℃：＋
４５℃：−
（１６）嫌気的生育性：＋ｗ
（１７）Ｏ−Ｆテスト（酸化／発酵）：＋／−
１−４．糖類からの酸生産／ガス生産（＋ｗは弱い反応を表す）
（１）Ｌ−アラビノース：−／−
（２）Ｄ−グルコース：＋ｗ／−
（３）Ｄ−フラクトース：−／−
（４）マルトース：−／−
（５）ラクトース：−／−
（６）Ｄ−ソルビトール：−／−
（７）イノシトール：−／−
（８）Ｄ−キシロース：−／−
（９）Ｄ−マンノース：−／−
（１０）Ｄ−ガラクトース：−／−
（１１）サッカロース：−／−
（１２）トレハロース：−／−
（１３）Ｄ−マンニトール：−／−
（１４）グリセリン：−／−
１−５．その他生理学的性質
（１）β−ガラクトシダーゼ活性：−
（２）アルギニンジヒドロラーゼ活性：−
（３）リジンデカルボキシラーゼ活性：−
（４）トリプトファンデアミナーゼ活性：−
（５）ゼラチナーゼ活性：−
【００１３】
１−６．化学分類学的性質
本菌株よりゲノムＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）の配列を解析した。決定された１４７８ｂｐの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。こうして得られた本菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を用いて、ＤＮＡ塩基配列データベース（アポロンＤＢ−ＢＡ４．０）に対する相同性検索の結果、ロドコッカス由来の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し高い相同性を示し、ロドコッカス クウィングシェンギｄｊｌ−６株〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＤＱ０９０９６１〕の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し１００％の最も高い相同性を示し、ついで、ロドコッカス バイコヌレンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｉｋｏｎｕｒｅｎｓｉｓ）ＧＴＣ１０４１株〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０７１９５１〕の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し９９．８％の相同性を示した。近縁菌群と系統樹を作製した結果、本菌株は、ロドコッカス クウィングシェンギ及び、ロドコッカス バイコヌレンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｉｋｏｎｕｒｅｎｓｉｓ）の１６Ｓ ｒＤＮＡとクラスターを形成し近縁であることが示され、さらに、ロドコッカス クウィングシェンギと同一の分子系統学的位置を示した。
以上の結果より、本菌株は、ロドコッカス クウィングシェンギであると判定した。
【００１４】
本発明において使用することのできるシュードクラビバクター エスピー ＹＧＫ−０３２（ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４２）の菌学的性質は次のとおりである。
１−１．形態的性質
（１）細胞形態：桿菌
（２）幅：０．７−０．８μｍ
（３）長さ：１．０〜１．５μｍ
（４）細胞多形成の有無：−
（５）運動性：−
（６）胞子形成：−
１−２．培養的性質
培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地 ３０℃
（１）色：黄色
（２）光沢：＋
（３）色素生産：＋
（４）表面発育の有無：−
（５）培地の混濁の有無：＋
培養条件：ゼラチン穿刺培養 ３０℃
（６）生育状態：＋
（７）ゼラチン液化：−
培養条件：リトマス・ミルク ３０℃
（８）凝固：−
（９）液化：−
１−３．生理学的性質（＋ｗは弱い反応を表す）
（１）グラム染色：＋
（２）硝酸塩の還元：−
（３）脱窒反応：−
（４）ＭＲテスト：−
（５）ＶＰテスト：−
（６）インドール生産：−
（７）硫化水素の生成：−
（８）デンプンの加水分解：−
（９）クエン酸の利用
Ｋｏｓｅｒ：−
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ：＋
（１０）無機窒素の利用
硝酸塩：−
アンモニウム塩：−
（１１）ウレアーゼ活性：−
（１２）カタラーゼ活性：＋
（１３）オキシダーゼ活性：−
（１４）生育の範囲 ｐＨ
５：−
８：＋
９：＋
（１５）生育の範囲 温度
２０℃：＋
３０℃：＋
３７℃：−
４５℃：−
（１６）嫌気的生育性：＋ｗ
（１７）Ｏ−Ｆテスト（酸化／発酵）：＋／−
１−４．糖類からの酸生産／ガス生産
（１）Ｌ−アラビノース：−／−
（２）Ｄ−グルコース：＋／−
（３）Ｄ−フラクトース：＋／−
（４）マルトース：−／−
（５）ラクトース：−／−
（６）Ｄ−ソルビトール：−／−
（７）イノシトール：−／−
（８）Ｄ−キシロース：−／−
（９）Ｄ−マンノース：＋／−
（１０）Ｄ−ガラクトース：−／−
（１１）サッカロース：＋／−
（１２）トレハロース：−／−
（１３）Ｄ−マンニトール：−／−
（１４）グリセリン：＋／−
１−５．その他生理学的性質
（１）β−ガラクトシダーゼ活性：＋
（２）アルギニンジヒドロラーゼ活性：−
（３）リジンデカルボキシラーゼ活性：−
（４）トリプトファンデアミナーゼ活性：−
（５）ゼラチナーゼ活性：−
【００１５】
１−６．化学分類学的性質
本菌株よりゲノムＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）の配列を解析した。決定された１４８１ｂｐの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。こうし
て得られた本菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号２）を用いて、ＤＮＡ塩基配列データベース（アポロンＤＢ−ＢＡ４．０）に対して相同性を検索し、近縁菌群と系統樹を作製した結果、本菌株はシュードクラビバクター属に属すると推定された。最も近縁であった基準株はシュードクラビバクター ヘルボラス（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｈｅｌｖｏｌｕｓ）ＤＳＭ２０４１９株〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ７７４４０〕であり、９９．７％の相同性を示した。以上の結果より、本菌株は、シュードクラビバクター属に含まれ、既知種では、シュードクラビバクター ヘルボラス（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｈｅｌｖｏｌｕｓ）に最も近縁と考えられる。しかし、両者の１６Ｓ ｒＤＮＡは完全に一致しておらず、本菌株とシュードクラビバクター ヘルボラス（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｈｅｌｖｏｌｕｓ）は種として異なる菌株である可能性も否定できない。これらのことから、本菌株をシュードクラビバクター エスピーであると判定した。
【００１６】
次に、本発明方法において使用するロドコッカス属、及びシュードクラビバクター属に属する微生物の培養方法について説明する。
前記微生物の培養液の調整方法としては、（ア）炭素源及び窒素源を適宜添加した培地に微生物の菌体を接種して同一の該培地中で増殖させて培養液を得る方法、（イ）培養を段階的に行って培養液を得る方法、すなわち、前培養と本培養を組み合わせて培養液を得る方法が挙げられるが、好ましくは（イ）の方法である。（イ）の方法は、まず、前培養として、炭素源及び窒素源を適宜添加した培地に前記微生物の菌体を接種して微生物を増殖させて、本培養で使用する微生物の確保を目的として第一段階の培養液（以下、前培養液という。）を得た後、次に本培養として、容量を増大させた培地に前培養液を加えて、炭素源及び窒素源を適宜添加して微生物を培養することで蓄積反応に十分な酵素の産生を目的として第二段階の培養液（以下、本培養液という。）を得る方法である。しかしながら、前記微生物の菌体を含む培養液の調製方法は、これらの方法に限定されるものではなく、更に、３回以上の培養を組み合わせて行うことも可能である。
【００１７】
前記微生物を培養するための培地は、通常これらの微生物が生育可能な培地であれば特に制限はなく、一般的な微生物用の任意の公知培地を用いることができる。培地の炭素源及び窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸、無機窒素、有機酸、糖類などを使用することができる。また、必要に応じて、微量金属塩、ビタミン類、核酸関連物質、無機塩類などを添加することもできる。
【００１８】
炭素源及び窒素源の供給方法としては、（１）培地作製時にあらかじめ添加しておく方法、（２）微生物の増殖にあわせて、炭素源及び窒素源を連続又は間欠的に供給していく方法を挙げることができる。前記（２）の方法は、微生物の増殖により消費した炭素源及び窒素源を追加していくため、高濃度の炭素源及び窒素源により微生物の生育阻害がある場合でも、微生物の濃度を高くすることができる利点がある。前記（２）の方法を更に具体的に説明すると、微生物が炭素源及び窒素源を消費する速度に合わせて炭素源及び窒素源を添加する方法などがある。例えば、微生物が生育するとともにｐＨが上昇し、かつ、炭素源及び窒素源を含む水溶液が酸性である場合、ｐＨコントローラーを用いて、培養液のｐＨが一定になるように、炭素源及び窒素源を含む酸性の水溶液を添加すると、微生物の増殖の進行とともに、炭素源及び窒素源を少しずつ添加する方法を用いることができる。
【００１９】
更に、培養の際に、前記微生物が有する、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを生成する能力を最大限に引き出すために、糖類、有機酸又はアミノ酸を添加して培養することもできる。特に効果が得られる物質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、スクロース、Ｄ−リボース、マンニトール、グリセロール、Ｄ−キシロース、ソルビトール、Ｄ−ラクトース、マルトース、Ｌ−リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、グルコン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミンなどであり、培地に対して０．１〜５．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２．０ｗ／ｖ％である。なお、本明細書において、ｗ／ｖは質量／容積を、ｖ／ｖは容積／容積を意味する。
【００２０】
前記微生物の培養温度は１０〜３７℃、好ましくは２３〜３２℃である。培養時の培地のｐＨは６．０〜１０．０であり、好ましくはｐＨ６．５〜９．０である。培養は、好気的条件下で行うことが好ましく、液体培養時には通気及び撹拌を行うことが望ましい。培養時間は１０時間〜１週間であり、好ましくは１〜３日間であり、より好ましくは１〜２日である。
培養の進行とともに、酵素生産量も増加していくが、培養の後半には、生育速度の低下とともに、炭素源及び窒素源の消費速度、酵素生産速度も低下し、培養を終了する。炭素源及び窒素源の総添加量、培養時間、菌体の濃度、酵素生産量などから本培養の終了を判断することもできる。
【００２１】
以上のようにして、前記微生物の培養菌体を培養液中に蓄積させ、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応に用いることができる。
［ｉ］得られた培養液はそのまま以下に述べる蓄積反応に使用してもよいし、
［ii］微生物を培養液から回収して反応に使用したり、更に
［iii］微生物の処理物、例えば、破砕物、粗酵素、精製酵素などを反応に使用することもできる。
続いて、前記微生物又はその処理物により、３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールを生成する反応を行うことができる。この蓄積反応は、バッチ式でも、バイオリアクターなどを用いた連続式でも可能である。バッチ式反応の場合には、数時間から１０日間で行うことができる。
【００２２】
上述の［ｉ］の場合を具体的に説明すると、上記の培養方法で増殖させた前記微生物を含む培養液に、直接、３−キヌクリジノンと糖類、有機酸、アルコール類などを加え、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを系内に蓄積させる反応を開始させることができる。
蓄積反応のｐＨは５．０〜１０．０、好ましくはｐＨ５．０〜８．０である。反応温度は１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃である。基質の３−キヌクリジノンの添加量は、反応液に対して０．１〜１０．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．３〜５．０ｗ／ｖ％である。３−キヌクリジノンの添加は一度に行ってもよいが、高濃度の３−キヌクリジノンによる反応阻害が見られる場合には分割して添加してもよい。
【００２３】
一般的に、３−キヌクリジノン不斉還元酵素は、３−キヌクリジノンの不斉還元反応において、３−キヌクリジノンと等量の還元型補酵素（還元型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、又は還元型ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を還元剤として要求するとされている。３−キヌクリジノンの還元反応後は、補酵素はそれぞれ酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）又は酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＰ＋）へと変換される。
触媒量の補酵素で３−キヌクリジノンの不斉還元反応を進行させるためには、酸化型補酵素のＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋をそれぞれ還元型補酵素のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨへと再生する反応が必要であり、一般的に、この補酵素再生反応には、グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの酸化反応が利用されている。
【００２４】
また、一般的に、グルコースデヒドロゲナーゼなどの補酵素を再生する酵素の供給源として、市販酵素を使用したり、遺伝子組み替えにより補酵素を再生する酵素を生産させることが行われるが、本発明において、補酵素を再生する酵素を添加することなく、糖類、有機酸、アルコール類などを添加するのみで、効率よく３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノールへの変換を行うことができる。
【００２５】
糖類、有機酸、アルコール類などとしては、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、スクロース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、ソルビトール、Ｄ−ラクトース、マルトースなどの糖類、クエン酸などの有機酸、エタノールなどのアルコール類などを挙げることができる。糖類、有機酸、アルコール類などの添加量は、３−キヌクリジノンを還元して（Ｓ）−３−キヌクリジノールを生成する反応液に対して０．１〜１５．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．３〜１０．０ｗ／ｖ％である。糖類、有機酸、アルコール類などの添加は一度に行ってもよいが、高濃度の糖類、有機酸、アルコール類などによる反応阻害が見られる場合には分割して添加してもよい。
（Ｓ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応は、前記微生物が十分に増殖して、変換能力が十分となった時点から開始することができるが、前記微生物の増殖が十分でない培養初期段階でも、生育阻害が起こらない濃度範囲で培地に３−キヌクリジノンを添加して、微生物の増殖と（Ｓ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応を同時に行うことができる。
【００２６】
また、上述の［ii］の場合には、上記の培養方法で増殖させた微生物をろ過又は遠心分離により培養液から回収して蓄積反応に使用することができる。すなわち、得られた微生物は３−キヌクリジノンと糖類、有機酸、アルコール類などを含む生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液などの水性溶媒に懸濁して反応に使用することができる。反応条件（ｐＨ、温度、３−キヌクリジノンと糖類、有機酸、アルコール類などの添加量）は［ｉ］の場合と同じである。
【００２７】
更に、上述の［iii］の場合には、前記培養方法で増殖させ、回収した微生物の処理物（例えば、破砕物、粗酵素、精製酵素）は、３−キヌクリジノンと糖類、有機酸、アルコール類などを含む水性溶媒に懸濁して反応に使用することができる。あるいは、微生物又はその処理物を公知の方法で適当な担体に固定化し、その固定化物を水性溶媒と接触させて反応に使用してもよい。前記微生物又はその処理物を使用した蓄積反応に用いる水性溶媒としては、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液などを挙げることができる。反応条件は［ｉ］の場合と同様である。
【００２８】
以上のようにして得られた蓄積反応後の反応液から、必要に応じて、ろ過、遠心分離などにより微生物を除去した後、溶媒で（Ｓ）−３−キヌクリジノールを抽出して、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを回収することができる。粗酵素、精製酵素などの処理物を使用した場合などでは微生物除去操作を省略することができる。また、クロマトグラフィーなどの公知の精製方法により（Ｓ）−３−キヌクリジノールを回収することもできる。
【実施例】
【００２９】
以下に代表的な実施例を示し、本発明の具体的な説明を行うが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
実施例において使用する培地組成を以下に記載する。
（１）培地［Ａ］
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス５．０ｇ、トリプトン２ｇ、Ｄ−グルコース１．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物１．０ｇ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．０５ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．５に調整した培地。
【００３０】
（２）培地［Ｂ］
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス１５．０ｇ、Ｄ−グルコース１０．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物１．０ｇ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ、塩化亜鉛０．１ｇ、硫酸鉄七水和物０．１ｇ、塩化マンガン（II）四水和物０．０５ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．０に調整した培地。
【００３１】
（３）培地［Ｃ］
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス２．０ｇ、Ｄ−グルコース１０．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物１．０ｇ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．２ｇ、塩化マンガン（II）四水和物０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．５に調整した培地。
【００３２】
次に、実施例で使用するＧＣの分析条件を以下に記載する。
［ＧＣの分析条件］
カラム；ＣＰ−ＣＨＩＲＡＳＩＬ−ＤＥＸ ＣＢ（Ｖａｒｉａｎ社製） ２５ｍ×０．２５ｍｍ、
Ｎ２流速；１ｍＬ／分、
カラム温度；１４０℃、
インジェクション温度；２２０℃、
検出；ＦＩＤ、２２０℃、
保持時間；３−キヌクリジノン６．９分、（Ｓ）−３−キヌクリジノール１３．９分、（Ｒ）−３−キヌクリジノール１４．４分
【００３３】
《実施例１：ロドコッカス クウィングシェンギ ＹＧＫ−５１４の静止菌体を用いた（Ｓ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応》
（１）培養
培地［Ａ］１００ｍＬを５００ｍＬ容の三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この三角フラスコに、栄養寒天培地に維持したロドコッカス クウィングシェンギ ＹＧＫ−５１４の菌体を１白金耳接種し、２７℃で２４時間振とう培養し、前培養液とした。
一方、撹拌、通気、温度及びｐＨ調整が可能な２Ｌ容のジャーファーメンターに培地［Ｂ］１Ｌを入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。このジャーファーメンターに、上記前培養液１０ｍＬを加え、撹拌及び通気を実施しながら２７℃及びｐＨ７．０で、２２時間、培養を行い本培養液を得た。
【００３４】
（２）蓄積反応
上記本培養液２５０ｍＬを遠心分離により集菌し静止菌体を得た。これに、３−キヌクリジノン塩酸塩３．０ｗ／ｖ％とＤ−グルコース１０．０ｗ／ｖ％を含む、ｐＨ５．５の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液５０ｍＬを加えて懸濁した。この懸濁液を撹拌下２７℃で反応を開始した。１１９時間後、反応速度が低下したため、反応を終了した。その後、遠心分離により、菌体を除去し、得られた上澄み液０．２５ｍＬに、５０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム水溶液０．２５ｍＬ、クロロホルム１ｍＬを加え、抽出を行った。得られたクロロホルム層をＧＣ分析した結果、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを蓄積濃度２．１６％、収率９６％（［反応後の（Ｓ）−３−キヌクリジノールのモル濃度］÷［添加した３−キヌクリジノンのモル濃度］）で取得した。また、ＧＣ分析では（Ｒ）−３−キヌクリジノールは検出されず、光学純度は１００％ｅｅであった。
【００３５】
《実施例２：シュードクラビバクター エスピー ＹＧＫ−０３２の静止菌体を用いた（Ｓ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応》
（１）培養
培地［Ａ］１００ｍＬを５００ｍＬ容の三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この三角フラスコに、栄養寒天培地に維持したシュードクラビバクター エスピー ＹＧＫ−０３２の菌体を１白金耳接種し、２７℃で２４時間振とう培養し、前培養液とした。
一方、撹拌、通気、温度及びｐＨ調整が可能な２Ｌ容のジャーファーメンターに培地［Ｃ］１Ｌを入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。このジャーファーメンターに、上記前培養液１０ｍＬを加え、撹拌及び通気を実施しながら２７℃及びｐＨ７．５で、２３時間、培養を行い本培養液を得た。
【００３６】
（２）蓄積反応
上記本培養液５００ｍＬを遠心分離により集菌し静止菌体を得た。これに、３−キヌクリジノン塩酸塩５．０ｗ／ｖ％とＤ−グルコース１０．０ｗ／ｖ％、ＮＡＤＨ０．０６％、ＮＡＤＰＨ０．０６％を含む、ｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液５０ｍＬを加えて懸濁した。この懸濁液を撹拌下２７℃で反応を開始した。
反応５０時間後、３−キヌクリジノン塩酸塩の濃度が０．９％まで低下し、さらに、反応が進行していたことから、２５ｗ／ｖ％の３−キヌクリジノン塩酸塩水溶液を６ｍＬ（３−キヌクリジノン塩酸塩として１．５ｇ）とＤ−グルコース２．５ｇを追加し、反応を継続させた。反応２１５時間後、反応速度が低下したため、反応を終了した。その後、遠心分離により、菌体を除去し、得られた上澄み液０．２５ｍＬに、５０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム水溶液０．２５ｍＬ、クロロホルム１ｍＬを加え、抽出を行った。得られたクロロホルム層をＧＣ分析した結果、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを蓄積濃度５．４６％、収率１００％（［反応後の（Ｓ）−３−キヌクリジノールのモル濃度］÷［反応前と追加分の３−キヌクリジノンのモル濃度］）で取得した。また、ＧＣ分析では（Ｒ）−３−キヌクリジノールは検出されず、光学純度は１００％ｅｅであった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−キヌクリジノンに、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、若しくはシュードクラビバクター（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物、又はその処理物を作用させることにより、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを得ることを特徴とする、（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造方法。
【請求項２】
前記微生物がロドコッカス クウィングシェンギ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｑｉｎｇｓｈｅｎｇｉｉ） ＹＧＫ−５１４（ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４３）である、請求項１記載の（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造方法。
【請求項３】
前記微生物がシュードクラビバクター エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ） ＹＧＫ−０３２（ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４２）である、請求項１記載の（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造方法。
【請求項４】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４３である、ロドコッカス クウィングシェンギ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｑｉｎｇｓｈｅｎｇｉｉ） ＹＧＫ−５１４。
【請求項５】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４２である、シュードクラビバクター エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ） ＹＧＫ−０３２。
【請求項１】
３−キヌクリジノンに、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、若しくはシュードクラビバクター（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物、又はその処理物を作用させることにより、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを得ることを特徴とする、（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造方法。
【請求項２】
前記微生物がロドコッカス クウィングシェンギ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｑｉｎｇｓｈｅｎｇｉｉ） ＹＧＫ−５１４（ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４３）である、請求項１記載の（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造方法。
【請求項３】
前記微生物がシュードクラビバクター エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ） ＹＧＫ−０３２（ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４２）である、請求項１記載の（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造方法。
【請求項４】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４３である、ロドコッカス クウィングシェンギ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｑｉｎｇｓｈｅｎｇｉｉ） ＹＧＫ−５１４。
【請求項５】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１６４２である、シュードクラビバクター エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ） ＹＧＫ−０３２。
【公開番号】特開２０１０−１１５１７３（Ｐ２０１０−１１５１７３Ａ）
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９２０８８（Ｐ２００８−２９２０８８）
【出願日】平成２０年１１月１４日（２００８．１１．１４）
【出願人】（０００２４６３９８）有機合成薬品工業株式会社 (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１４日（２００８．１１．１４）
【出願人】（０００２４６３９８）有機合成薬品工業株式会社 (12)
【Ｆターム（参考）】
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