２つの遺伝子の発現の観察による乳癌患者の予後診断
本発明は、乳癌を有する個体における予後と相関する２つの遺伝子、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の発現に関する。具体的には、本発明は、乳癌患者からの試料を、原発腫瘍の除去後数年における高再発リスク又は低再発リスクに層別化する方法を提供する。この分類は、２つの同定遺伝子に関するタンパク質又はｍＲＮＡ発現レベルの分析によって達成できる。本発明はまた、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１を、乳腺癌細胞株において同定し及びヒト患者の大規模コホートにおいて、効果的な転移予測因子として検証する方法を示す。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、核酸又はタンパク質レベルに基づく分子的方法によって、乳癌（ｂｒｅａsｔ ｃａｎｃｅｒ）の再発に有用な情報を提供する最小遺伝子シグネチャー（ｇｅｎｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）に関する。
【０００２】
［背景技術］
乳癌は女性において最も多く見られる癌である。米国では、８人に１人の女性が、８５才までに何らかのタイプの乳癌を発症すると推測される。
【０００３】
大部分の乳癌腫（ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の腫瘍発生メカニズムはほとんど不明であるが、一部の女性に乳癌を発症しやすくする可能性のある遺伝因子がある（Ｍｉｋｉら、１９９４年）。最近になって、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の発見及び特性決定により、家族性乳癌の一因となり得る遺伝因子に関する我々の知識は広がったが、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２と関連するのは乳癌のわずか約５〜１０％である。ＢＲＣＡ１は、ゲノム安定性の維持に重要であるＤＮＡ修復及び細胞周期制御に関与する腫瘍抑制遺伝子である。ＢＲＣＡ１と同様に、ＢＲＣＡ２も乳癌の発症に関与し、ＤＮＡ修復の一翼を担うが、ＢＲＣＡ１とは異なり、卵巣癌には関与しない。他の遺伝子、例えば、ｃ−ｅｒｂ−２（ＨＥＲ２）及びｐ５３も乳癌と関連づけられた（Ｂｅｅｎｋｅｎら、２００１年）。ｃ−ｅｒｂ−２（ＨＥＲ２）及びｐ５３の過剰発現は予後不良と相関性があった。
【０００４】
しかし、今日まで、乳癌と一貫して関連する臨床的に有用な他のマーカーはいずれも、散発性腫瘍、即ち、乳癌の大半を占める、既知の生殖細胞系列変異と現在のところ関連づけられていない腫瘍については確認されていない。
【０００５】
臨床診療では、治療の選択肢、予後診断及び治療反応の可能性は全て、診断によって広く変わってくるので、乳癌の種々のサブタイプの正確な診断が重要である。乳癌の罹患率及び死亡率は、癌の進行の早期に検出されない場合には著しく増加するため、乳癌においては、早期診断及びリスク層別化が極めて重要である。無遠隔転移生存率の正確な診断又は判定がなされれば、腫瘍学者は補助化学療法の適用を個人に合わせてすることができ、予後のより不良な女性に最も積極的な治療を施すことができるであろう。更に、研究対象となりそうな患者を予後診断に従って層別化することができるので、予後不良の正確な予測は新しい乳癌療法の臨床試験に大きな影響を及ぼすであろう。
【０００６】
典型的には、乳癌の診断には、腫瘍の存在の組織病理学的証拠が必要である。診断に加えて、組織病理学検査も、予後及び治療計画の選択に関する情報を提供する。腫瘍サイズ、腫瘍グレード、患者の年齢、及び腫瘍細胞によるリンパ節コロニー形成などの臨床パラメーターに基づいて、予後を確立する場合もある。
【０００７】
診断及び／又は予後診断は、有効性の程度の差はあるが、乳房の外側の直接検査によって又はマンモグラフィー若しくは他のＸ線撮影方法を通して確定できる。しかし、後者のアプローチには、社会的費用及び個人的費用がかなり伴う。
【０００８】
最近になって、ＦＤＡは、ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒの発表された研究（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、２００２年）に基づいて新鮮又は凍結乳癌生検材料において測定された７０個超の遺伝子のｃＤＮＡのマイクロアレイ分析による、乳癌予後診断のための遺伝子発現プロファイリング検査システム、マンマプリント（ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ）（登録商標）を承認した。
【０００９】
この検査は医師専用であるが、やはり、ＤＮＡバイオアナライザー／マイクロアレイスキャナーなどの特殊な計測手段で実施する必要がある。結果は大病院又はこのような複雑な分析を実施する手段及び標準手順を開発した会社しか提供できないので、これは大きな欠点である。
【００１０】
前記から、わずか２つの遺伝子の発現分析の予測予後値に基づく本発明の利点は、容易に理解できる。
【００１１】
１０個の遺伝子の同時分析は実のところアレイ技術を必要とするが、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）Ｇ２（ＣＣＮＧ２）及びＳｈａｒｐ１（ＢＨＬＨＢ３、ＢＨＬＨＥ４１）の発現の単純な評価にはアレイ技術は必要ない。他の側面から見ると、原発性塊（ｐｒｉｍａｒｙ ｍａｓｓ）の評価、リンパ節転移及び癌の病期診断のような、標準的な乳癌予後診断法は、現在では疾患の進行の予測に不十分である。従来の組織学的方法とこの最小シグネチャーによる腫瘍の分子的特性決定とを結びつけることにより、カノニカル基準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｃｒｉｔｅｒｉａ）によって中等度の侵襲（ｍｅｄｉｕｍ−ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）と定義される癌の場合に特に、疾患経過及び再発リスクを予測する、精巧で費用のかからない方法が可能になるであろう。
【００１２】
［発明の概要］
本発明は、試料中のサイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ（Ｇｅｎｅ ＩＤ）＝９０１）遺伝子発現レベルを単独で又はＳｈａｒｐ１（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）遺伝子発現レベルと組み合わせて検出するステップを含む、乳癌患者の再発リスクの評価方法に関する。この検出は、前記試料中の（１つ又は複数の）遺伝子の発現に直接関与するシグナルを測定するステップと、前記シグナルを取得するステップと、乳癌患者の癌再発リスクを評価するステップとを含み、乳癌患者の癌再発リスクを評価する前記ステップを、未知試料中のサイクリンＧ２遺伝子発現値単独のシグネチャースコア又は好ましくはサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両遺伝子発現値のシグネチャースコアを計算することによって行い、前記シグネチャースコアは
【数１】
［式中、
サイクリンＧ２を単独で用いる場合にはＫ＝１であり、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両方を用いる場合にはＫ＝２であり、
【数２】
は未知試料ｉ中のサイクリンＧ２又はＳｈａｒｐ１の発現レベルであり、
【数３】
はそれぞれ、病歴が知られている母集団におけるサイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１の発現レベルの推定平均値及び推定標準偏差値を表す］
と定義され、０未満のシグネチャースコアは乳癌再発リスクの増大を示す。
【００１３】
検出は、分子的手段及び／又は免疫学的手段によって実施できる。この場合、分子的手段とは、ＰＣＲ、マイクロアレイ分析又はノーザンブロットなどの、核酸に基づくアッセイを意味する。
【００１４】
この方法は、
取得シグナルを品質管理するステップと、
シグナルを正規化するステップと、
任意選択で、取得シグナルを再スケーリングするステップと
による、シグナルの統計分析を更に含み、好ましくは、コンピューターで実行されるソフトウェアによって実施する。
【００１５】
本発明は、乳癌患者からの試料においてサイクリンＧ２発現を単独で又はＳｈａｒｐ１発現と組み合わせて評価し、乳癌再発リスクを測定するためのキットであって、好ましくは
サイクリンＧ２特異的試薬、好ましくは配列番号１に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するオリゴヌクレオチド、
Ｓｈａｒｐ１特異的試薬、好ましくは配列番号２に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するオリゴヌクレオチド、
前記方法に関して定義された計算に従って、未知試料のシグネチャースコアを計算し、未知試料を、シグネチャースコアが負の場合には最小シグネチャー低群に又はシグネチャースコアが正である場合には最小シグネチャー高群に分類するための使用説明書
を含み、最小シグネチャー低群への分類が乳癌患者の高い癌再発リスクを示すキットを更に提供する。
【００１６】
好ましい一実施形態によれば、前記使用説明書はソフトウェアによって実施される。任意選択で、キットは、参照標準として、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１標準発現対照高及び低を発現値又は核酸試料として更に含むことができる。前記発現値又は核酸試料は好ましくはそれぞれ、非転移性乳癌細胞株及び／又は高転移性細胞株に由来する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】変異型ｐ５３発現がＴＧＦβプロ遊走性（ｐｒｏ−ｍｉｇｒａｔｏｒｙ）応答を促進することを示す図である。 （Ａ）Ｈ１２９９細胞溶解物−親の、即ち、ｐ５３欠損発現（欠損）又は変異型ｐ５３（ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ）のウェスタンブロット。Ｓｍａｄ３リン酸化（Ｐ−Ｓｍａｄ３）によって観察されるように、ＴＧＦβシグナル伝達カスケード（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅ）は、いずれの細胞株においても同様に活性である。ラミンＢ（Ｌａｍｉｎ−Ｂ）は、添加対照（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）である。 （Ｂ）Ｈ１２９９細胞の形態に対するＴＧＦβ（ＴＧＦβ ５ｎｇ／ｍｌ、２４時間）の作用。 （Ｃ）ＴＧＦβ駆動性遊走に対する変異型ｐ５３の作用を示す、Ｈ１２９９細胞の創傷治癒アッセイ。写真は、培養物スクラッチの３０時間後に撮影した。 （Ｄ）Ｈ１２９９細胞をトランスウェルメンブレン（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）上に播種した。ＴＧＦβと示されている場合、細胞はＴＧＦβ（４ｎｇ／ｍｌ）で処理された。グラフは、１６時間後にトランスウェルを通って遊走した細胞の数を示している。ｐ５３Ｒ１７５Ｈによって再構成されたＨ１２９９細胞のみが、ＴＧＦβに応答して遊走できる能力を獲得している。
【図２】乳癌ｍｄａ−ｍｂ−２３１細胞において、ＴＧＦβ駆動性浸潤及び転移に変異型ｐ５３が必要であることを示す図である。 （Ａ）ｐ５３を標的とするｓｈＲＮＡを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−ｓｈｐ５３）におけるｐ５３タンパク質欠乏を示すウェスタンブロット。ＭＤＡ ｓｈＧＦＰは対照細胞株である。 （Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株のＴＧＦβ依存性遊走のトランスウェルアッセイ。遊走の遮断に続いて起こるＳｍａｄ４欠乏によって証明されるように、この応答は、カノニカルなＳｍａｄシグナル伝達に依存する。これらの細胞においてその固有遺伝座（ｎａｔｕｒａｌ ｌｏｃｕｓ）から発現される内因性変異型ｐ５３が、この作用には必要である。 （Ｃ）１滴のマトリゲル中に埋め込まれたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤活性のアッセイ。パネルは、同一視野の異なる時点での写真を示す。点線は、マトリゲル液滴の縁端部を強調している。対照細胞のみが、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）を回避する能力を有する（矢印）。このプロセスは、ＴＧＦβＲ１阻害剤ＳＢ４３１５４２（５μＭ）での処理によって遮断されるので、ＴＧＦβシグナル伝達に依存する。ＭＤＡ ｓｈｐ５３細胞は、基質分解及び回避についての機能が損なわれている。 （Ｄ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、マトリゲル（登録商標）中にひとたび埋め込まれると、３Ｄ培養条件において紡錘形を呈する（上部パネル）。矢頭は葉状仮足の突起を示している。逆に、ＭＤＡ ｓｈｐ５３は、接着性敷石状細胞のクラスターを形成した（下部パネル）。ＴＧＦβシグナル伝達の阻害は、変異型ｐ５３欠損の表現型効果と一致する（データは示さず）。 （Ｅ及びＦ）ＳＣＩＤマウスの脂肪体にＭＤＡ ｓｈＧＦＰ又はＭＤＡ ｓｈｐ５３細胞を注射した。（Ｅ）原発腫瘍の増殖速度は、２つの細胞集団間で同様であった。（Ｆ）リンパ節転移のスコアが陽性であったマウスの数。 （Ｇ、Ｈ及びＩ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を尾静脈に注射後の肺コロニー形成アッセイ（各細胞株のマウスのｎ＝１０、１×１０６細胞／マウス）。パネルは、ＭＤＡ ｓｈＧＦＰ（Ｇ）又はＭＤＡ ｓｈｐ５３（Ｈ）を注射されたマウスからの肺切片における、ヒトサイトケラチンに代表的な免疫組織化学染色を示している。（Ｉ）グラフは、対照（ｓｈＧＦＰ）及び２つの独立したＭＤＡ ｓｈｐ５３クローン細胞株による肺実質の浸潤を数値化している。
【図３】転移性乳癌細胞における、ＴＧＦβ／変異株−ｐ５３の下流の新種の候補転移抑制因子の同定を示す図である。 （Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のマイクロアレイ分析からのＴＧＦβ標的遺伝子の概略。グラフは、ＭＤＡ ｓｈＧＦＰ細胞株及びＭＤＡ ｓｈｐ５３細胞株の両者における、ＴＧＦβによって制御される遺伝子の機能分類を示す。多くの遺伝子は、細胞浸潤、遊走及び転移（「浸潤プログラム」）に関与するタンパク質をコードする。 （Ｂ）ＴＧＦβ及び変異型ｐ５３によって同時制御される、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の遺伝子。表は、マイクロアレイ発現データからの、示された遺伝子に関するＴＧＦβ誘導レベルを示している。ＭＤＡ ｓｈＧＦＰ試料とＭＤＡ ｓｈｐ５３試料との誘導倍率の差は、ｑ値によって示されるように、統計的に有意である。 （Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＴＧＦβの変異型ｐ５３依存性標的としてのＡＤＡＭＴＳ９、Ｓｈａｒｐ１、サイクリンＧ２、フォリスタチン及びＧＰＲ８７のノーザンブロットによる検証。（＋）と示されている場合、細胞はＴＧＦβ１で２時間処理された。ＧＡＰＤＨは添加対照である。 （Ｄ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＴＧＦβ及び変異型ｐ５３によるＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２発現の制御。ＴＧＦβ１で２時間処理された又は処理されなかったＭＤＡ ｓｈＧＦＰ細胞及びＭＤＡ ｓｈｐ５３細胞のノーザンブロット分析。ＧＡＰＤＨは添加対照である。いずれの遺伝子も、対照細胞ではＴＧＦβによって下方制御されるが、変異型ｐ５３ノックダウン後は下方制御されない。 （Ｅ）Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２は、遊走制御におけるＴＧＦβ／変異型ｐ５３の重要なエフェクターである。示されたｓｉＲＮＡによって一過性に形質転換されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のトランスウェル遊走アッセイ。変異型ｐ５３欠損細胞中における、ＴＧＦβ駆動性遊走の障害は、Ｓｈａｒｐ１又はサイクリンＧ２の同時欠損によってレスキューされることができる。β−アクチンは添加対照である。
【図４】乳癌再発の有力な予測因子としての最小シグネチャーの臨床的検証を示す図である。 ９４０個を超える腫瘍をまとめる５つの独立したデータセットのパネル上での最小シグネチャー（Ｓｈａｒｐ１＋サイクリンＧ２）の予測力の検証（これらのデータの完全記述については表３を参照のこと）。ＮＫＩデータセット（図６を参照のこと）を別に分析した。これらの分析は、ボックスプロットグラフによって視覚化された両遺伝子の一貫した低い又は高い発現によって、腫瘍試料を２つの群に分ける。「低」（青）及び「高」（赤）はそれぞれ、最小シグネチャー低群及び最小シグネチャー高群の呼称である。 左側のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフは、分析された乳癌データセットにおいて、最小シグネチャーに従って層別化された患者に転移がないままである、再発がないままである又は疾患がないままである可能性を示している。ログランク検定のｐ値は、最小シグネチャー高とより長期の生存率との有意な関連を示している。最小シグネチャー低群及び最小シグネチャー高群を生じる教師なしのクラスタリング法（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いても、同様な結果が得られた（データは示さず）。 右側は、比較のための、７０遺伝子シグネチャー（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、２００２年）に従って層別化された同一腫瘍データからのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率グラフ。
【図５】最小シグネチャーが、骨及び肺の遠隔転移リスクのいずれにも関連することを示す図である。 Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線は、最小シグネチャーに従って層別化されたＭＳＫ試料（Ｍｉｎｎら、２００５年）の肺（左側）及び骨（右側）への転移がないままである可能性を示している。最小シグネチャーは、両器官に特異的な転移事象に関する統計的に有意な予測力を有する。
【図６】サイクリンＧ２発現の分析が、ＮＫＩデータセットにおける無転移生存率の予測に十分であることを示す図である。 ＮＫＩデータセット（試料数２９５）においては、わずか１つのサイクリンＧ２の発現データを用いて転移傾向に従って腫瘍を分類することができる。Ｓｈａｒｐ１発現データはＮＫＩデータセットからは入手できないので、本発明者らは、予後良好患者の比率に基づいてサイクリンＧ２発現の閾値を設定した（詳細については、「実験手順」を参照のこと）。サイクリンＧ２に関するボックスプロット及びＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの無転移生存率曲線は、この閾値を用いて得られる。
【図７】最小シグネチャーが、グレード２の腫瘍を、異なる転帰を有する２つの群に分割することを示す図である。 Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ組織学的スケールに従って層別化されたＳｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｕｐｐｓａｌａ及びＮＫＩデータセットからの患者について、再発がないままである、疾患がないままである又は転移がないままである可能性を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線（グレード１ 点線、グレード２ バイオレット色ライン、グレード３ 破線）。最小シグネチャーを適用することよって、グレード２の腫瘍（実線）を更に２つの群に分けた（赤色ライン−グレード２及び最小シグネチャー高、青色ライン−グレード２及び最小シグネチャー低）。特筆すべきは、高群及び低群がそれぞれ、グレード１又はグレード３の患者と同様な無再発生存率を示したことである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義及び略語
ＣＣＮＧ２とも称するサイクリンＧ２は、遺伝子ＩＤ＝９０１（配列番号１）によって同定される。ＤＥＣ２、ＢＨＬＨＢ３、ＢＨＬＨＥ４１とも称するＳｈａｒｐ１（塩基性ヘリックスループヘリックスドメインを含む）は、遺伝子ＩＤ＝７９３６５（配列番号２）によって同定される。
【００１９】
テンプレート
最小シグネチャーのテンプレートは、病歴が知られている患者からの腫瘍試料の母集団においてサイクリンＧ２の単独の又は好ましくはＳｈａｒｐ１と組み合わせた発現レベルを測定することによって得られる。
【００２０】
テンプレートは、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１発現基準（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅ）の決定に使用されるそれぞれの異なるアッセイに関して計算する。
【００２１】
いずれの遺伝子発現レベルを測定する場合にも、テンプレートは、
【数４】
即ち、母集団又はデータセットにおけるサイクリンＧ２発現レベル及び好ましくはＳｈａｒｐ１発現レベルの平均値及び標準偏差によって表す。
【００２２】
非浸潤性及び転移性乳癌を代表する２つの細胞株、ＢＴ２０（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１９）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３０）におけるサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１、又は他の代表的な高標準発現対照及び低標準発現対照の発現レベルを好ましくは、テンプレートの母集団値に加える。
【００２３】
標準発現対照
標準発現対照とは、非浸潤性及び転移性乳癌試料又は細胞株、例えば、ＢＴ２０（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１９）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３０）におけるサイクリンＧ２の単独の又はＳｈａｒｐ１と組み合わせた発現値、又は他の代表的な高い及び低いサイクリンＧ２の単独の又はＳｈａｒｐ１と組み合わせた発現標準の発現値を意味する。
【００２４】
シグネチャースコア（又は発現スコア）
シグネチャースコアは、テンプレートと比較した未知試料中のサイクリンＧ２発現値及び好ましくは更にＳｈａｒｐ１発現値間の差を数値化する。
【００２５】
シグネチャースコアは一般に、
【数５】
［式中、
サイクリンＧ２を単独で用いる場合にはＫ＝１であり、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両方を用いる場合にはＫ＝２であり、
【数６】
は未知試料ｉ中のサイクリンＧ２又はＳｈａｒｐ１の発現レベルであり、
【数７】
はそれぞれ、病歴が知られている母集団におけるサイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１の発現レベルの推定平均値及び推定標準偏差値を表す］
と定義される。
【００２６】
組み合わせて測定されるサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１発現については、
【数８】
＝サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の組合せのシグネチャースコア
［式中、
【数９】
は未知試料ｉ中のＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の発現レベルであり、
【数１０】
はそのテンプレートを定義する］。
【００２７】
最小シグネチャーテンプレートが、サイクリンＧ２単独の発現レベルを測定することによって得られる場合には、シグネチャースコアは、
【数１１】
［式中、
【数１２】
は未知試料ｉ中のサイクリンＧ２の発現レベルであり、
【数１３】
はそのテンプレートを定義する］
として計算される。
【００２８】
最小シグネチャー
最小シグネチャー高は、０より高いシグネチャー（発現）スコアと定義する。
最小シグネチャー低は、０より低いシグネチャー（発現）スコアと定義する。
【００２９】
再発
再発は、乳癌に関連する転移（より一般的には肺又は骨への転移）の発症又は原発性腫瘍手術から１２年以内の乳癌再発と定義する。
【００３０】
対照
アッセイ対照−当業者に知られている「アッセイ対照」は、アッセイが一貫した結果を生じると信頼できる根拠となる、シグナルの基準及び取得の信頼性を評価する。例えば、ＰＣＲに関する陽性「アッセイ対照」は、プライマーを使用するＰＣＲが、期待される長さのＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の増幅をもたらすと予想される既知の核酸混合物である。
内部発現対照−この用語は一般に、ハウスキーピング遺伝子発現対照を示すのに用いる。
【００３１】
［詳細な説明］
本発明は、ｐ５３の変異対立遺伝子がＴＧＦβと協同して、そのプロ浸潤応答及び悪性腫瘍応答を持続するという実験的証拠に基づく。実際に、変異型ｐ５３発現はインビトロの浸潤及びインビボの転移拡散に必要であり、このことは、乳癌の進行におけるこれらの２つの経路間の、これまで確認されていない関連性を明らかにしている。
【００３２】
変異型ｐ５３の方法でＴＧＦβによって活性化されるプロ浸潤経路は、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１遺伝子のダウンレギュレーションを伴う。これらの遺伝子のより低い発現レベルは乳癌のプロ浸潤挙動と、ひいてはより高い癌再発リスクと相関する。
【００３３】
本発明は、サイクリンＧ２が単独で又はサイクリンＧ２がＳｈａｒｐ１と一緒になって（サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１を以下で最小シグネチャー（ＭＳ）と称する）、より複雑な遺伝子セット予測因子に匹敵する予測力を有することを示す。この評価に関与する遺伝子は少数であるため、本発明は、一般に使用される技術及び単純なＰＣＲ装置によって実施できる。
【００３４】
最小シグネチャーと乳癌再発又は転移拡散との相関が、これら２つの遺伝子の発現レベルを用いたいくつかの乳癌データセットに関する統計分析によって確認されたが、１つのデータベースでは、サイクリンＧ２が単独で癌再発を予測することを示した。
【００３５】
この方法は、複数の、好ましくは少なくとも５０〜１００名の、臨床経過観察が知られている腫瘍患者又は入手可能な乳癌患者データセットから、サイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）の発現レベルを好ましくはＳｈａｒｐ１（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）の発現レベルと組み合わせて用いた、大量の最小シグネチャーテンプレートに基づく。
【００３６】
本発明は、未知試料中のサイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）遺伝子発現レベルを単独で又はＳｈａｒｐ１（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）遺伝子発現レベルと組み合わせて検出するステップを含む、乳癌患者の再発リスクを評価する方法を開示する。
【００３７】
本発明は好ましくは、
（ａ）乳癌患者からの試料中のサイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）の遺伝子発現レベルを、好ましくは（１つ又は複数の）Ｓｈａｒｐ１（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）の遺伝子発現レベルと組み合わせて検出する（即ち、マーカー遺伝子発現に関するシグナルを測定及び取得する）ステップと
（ｂ）未知試料中のサイクリンＧ２単独のシグネチャースコア又は好ましくはサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両方のシグネチャースコア（前記シグネチャースコアは、
【数１４】
［式中、
サイクリンＧ２を単独で用いる場合にはＫ＝１であり、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両方を用いる場合にはＫ＝２であり、
【数１５】
は未知試料ｉ中のサイクリンＧ２又はＳｈａｒｐ１の発現レベルであり、
【数１６】
はそれぞれ、病歴が知られている母集団におけるサイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１の発現レベルの推定平均値及び推定標準偏差値を表す］
と定義される）を計算するステップと
（ｃ）未知試料を、当該シグネチャースコアが０より低い場合には最小シグネチャー低群に又は当該シグネチャースコアが０より高い場合には最小シグネチャー高群に分類する（低群への割り付けは高い再発リスクと相関する）ステップと
を含む、乳癌患者の「癌再発」リスクを評価するための方法を含む。
【００３８】
試料は、乳癌生検材料又はリンパ節及び組織切片又は核酸、好ましくはこのような試料から単離されるｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡであることができる。
【００３９】
サイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）を単独で又は好ましくはＳｈａｒｐ１と組み合わせて測定する本発明の方法の高い予測力は、これがＴＧＦβによって制御される４００個を超える遺伝子より優れたわずか２つの遺伝子のシグネチャーであること及び既に提示されているシグネチャーは全て、本発明による２つの遺伝子をいずれも含まず、乳癌再発に関するその予後診断的使用は本明細書中に初めて記載されることから、特に驚くべきことである。
【００４０】
最小シグネチャーテンプレートは、臨床データ及び５〜１２年の生存可能期間が知られている患者の母集団から遺伝子発現データ（即ち、サイクリンＧ２及び好ましくはＳｈａｒｐ１も）を収集することよって用意する。
【００４１】
未知試料中の１つ又は好ましくは２つのマーカー遺伝子の検出を好ましくは、各遺伝子の高発現レベル標準のための対照（対照高 サイクリンＧ２及び対照高 Ｓｈａｒｐ１）及び低発現レベル標準のための対照（対照低 サイクリンＧ２及び対照低 Ｓｈａｒｐ１）において、同時に同一試薬を用いて行う。
【００４２】
標準発現対照高及び低はそれぞれ、既知の患者から又は非浸潤性若しくは転移性乳癌を代表する細胞株（例えば、それぞれ、ＢＴ２０又はＭＤＡ−ＭＢ−４３６）から得ることができる。ＢＴ２０（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１９）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３０）はそれぞれ、非浸潤性及び転移性乳癌を代表する２つの異なる乳癌細胞株である。ＢＴ２０は高レベルの両遺伝子を発現し、逆に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６においてはＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２がダウンレギュレーションされる。したがって、これら２つの細胞株は、入手しやすい高（ＢＴ２０）及び低（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６）標準発現対照を提案されている方法に提供することができる。
【００４３】
更に、正規化のための少なくとも１つの内部発現対照を、同じ反応で測定する。
【００４４】
内部発現対照の選択は、発現レベルの観察に使用される実験技術に左右される。発現データの正規化は、マイクロアレイを用いる場合は計算的方法（全ての遺伝子の平均発現レベルへのスケーリング又はクオンタイル正規化（ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）として）に又は核酸に基づく分子技法、即ち、ＰＣＲ若しくはノーザンブロットの場合は内部対照の発現レベルに基づくことができる。この目的で、例えばＰＣＲに一般に使用されるハウスキーピング遺伝子は、構成的に発現されるＧＡＰＤＨ、β−アクチンなどの中から選択される。免疫検出に基づく方法の場合には、内部対照は好ましくは、ラミンＢ又はＧＡＰＤＨ免疫活性の中から選択する。また、当業者によって知られている更なるアッセイ対照を好ましくは、ステップａ）及びｂ）の信頼性を評価するために前記方法に含めて、アッセイが一貫した結果を生じると信頼できる根拠となる対照を提供する。例えば、ＰＣＲに関する陽性アッセイ対照は、プライマーを使用するＰＣＲが、期待される長さのＤＮＡ断片の増幅をもたらすと予想される既知の核酸混合物である。
【００４５】
サイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１遺伝子発現レベルの測定は、任意の既知の最新の方法によって、例えば、分子選択（即ち、選択的増幅又はハイブリダイゼーション）に基づく分子的手段によって及び／又は免疫学的手段によって評価する。
【００４６】
分子選択（即ち、サイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１に関する配列特異的プローブ又はプライマーとの配列特異的ハイブリダイゼーションによる選択）の後、通常は、分子量に基づく、標的化及び／又は増幅されたポリヌクレオチド分子の分離ステップ、続いて数値化（例えば、デンシトメトリー又は目視検査による）、次いで任意の最新の計算法を用いるデータ正規化（例えば、線形スケーリング又は非線形正規化、及び好ましくは標準発現対照との比較による）を行う。
【００４７】
好ましくは、試料値と最小シグネチャーテンプレートとの比較は、シグネチャースコアの計算によって実施する。
【００４８】
しかし、より一般的には、本発明は、試料中のサイクリンＧ２遺伝子の発現レベルが単独で又は好ましくはＳｈａｒｐ１遺伝子の発現レベルと組み合わさって、０より低いシグネチャースコアを明示する場合には、これが、（乳）癌再発リスクが増大した徴候を示すという定義に基づく。
【００４９】
好ましくは、１つの表現型を有する個体（例えば、未知試料）を、第２の表現型を有する他の個体（例えば、最小シグネチャーテンプレート）と比較及び／又は区別するための統計分析を用いる。好ましくは、これはソフトウェアによって実施する。
【００５０】
したがって、好ましい一実施形態によれば、本発明の方法は、記憶されたテンプレートを検索し、（１種又は複数の）マーカーの（１つ又は複数の）発現レベルシグナルによって試料のシグネチャースコアを数値化し、及び未知試料を高又は低最小シグネチャー群（前記のステップｃ）において明示された通り）に割り付ける、コンピューター上で実行されるソフトウェアによって実施されるステップｂ）とを含む。
【００５１】
より好ましくは、取得された（前記のステップａ）に従って）シグナル（発現データ）の分析は、以下の追加ステップ
アッセイ対照に基づくデータ品質管理、
遺伝子発現レベルの数値化に使用される技術による、技術によって異なるデータの正規化、
好ましくは、例えば、線形又は非線形スケーリングによる、標準発現対照に基づくデータの再スケーリング
によって実施する。
【００５２】
シグナルを好適に分析後、テンプレートを検索し、試料のシグネチャースコアを計算し、未知試料を前記の最小シグネチャー高群又は低群（ステップｃ）で定義された通り）に割り付ける。
【００５３】
シグネチャーテンプレートをコンピューター又はコンピューター可読媒体に記憶させ及びソフトウェアを予後相関シグネチャーに使用する場合には、シグネチャーテンプレートと、試料からのシグネチャースコアとを比較する。これは、言い換えれば、好適に及び好ましく分析される、試料中の２つのマーカー遺伝子のうち１つ又は両方の発現レベルを、患者からの試料又は代わりに若しくは更に、非浸潤性及び転移性乳癌を代表する細胞株からの試料を含む、予後が知られている患者からの試料のプール（即ち、通常は少なくとも５０〜１００個の試料から構成される、数的に好適な試料のプール）から測定された、最小シグネチャー中の同じ遺伝子の発現レベルの分布と比較することを意味する。
【００５４】
次に、２つのマーカー遺伝子のうち１つ又は両方の発現レベルが０より高いシグネチャースコアを決定する場合には、未知試料を、癌再発に関して予後良好と分類する。逆に、シグネチャースコアが０より低い未知試料は、ソフトウェアによって、予後不良の患者からの試料と分類される。
【００５５】
この方法は好ましくはソフトウェアによって実施するが、この実施形態に限定するものではない。実際には、高及び低発現群への割り付けは、試料の絶対的な発現シグナルを、当業者に知られた対照の存在下で目視検査することによって、並びにこれと高及び低シグネチャーテンプレート（又は前記で定義した標準発現対照）とを目視によって又は数的に比較することによっても実施できる。
【００５６】
好ましくは、比較の感度を増加させるために、発現レベルに関連するシグナルを、例えば、１組の対照遺伝子の平均発現レベルなどの種々の技術を用いることによって、正規化することができる。
【００５７】
種々の実施形態において、マーカー発現レベルは、１組の対照マーカーの発現レベルの平均値又は中央値によって正規化する（内部発現対照は、核酸に基づくアッセイの場合にはＧＡＰＤＨ又はβ−アクチン、免疫学に基づくアッセイの場合にはＧＡＰＤＨ及びラミンＢである）。
【００５８】
別の具体的な実施形態において、正規化は、マーカーレベルの標準化によって行う。発現レベルデータは任意の簡便な方法で変換できるが、好ましくは正規化及び比較の実施前に、発現シグナルを対数変換する。次いで、正規化値を、最小シグネチャーテンプレートと比較する。最小シグネチャーテンプレートは、臨床経過観察が知られている腫瘍患者の好適なプールから並びに非浸潤性及び移転性乳癌を代表する種々の乳癌細胞株（例えば、それぞれＢＴ２０及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６）から同じ実験技術及びプロトコールを用いて収集された同じマーカー遺伝子の正規化及び／又は変換発現レベルからなる。
【００５９】
一例として、マーカーがマイクロアレイのプローブによって表される場合には、各マーカーの発現レベルは、任意の非マーカー（即ち、非サイクリンＧ２及び非Ｓｈａｒｐ１）遺伝子を含むマイクロアレイ上に表される遺伝子全てにわたる発現レベルの平均値又は中央値によって正規化することができる。
【００６０】
前述のように、発現レベルの測定は、任意の既知の方法によって実施でき、分子的手段は、例えば、ＰＣＲ（スタンダードＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲ）、ノーザンブロット又はマイクロアレイ分析を含む。
【００６１】
ノーザンブロットによれば、全ＲＮＡ試料が、電気泳動によってサイズに応じて分離され、サイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１に特異的な標識プローブとのハイブリダイゼーションが行われる。
【００６２】
ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲは、予備段階として、ＲＮＡ試料からｃＤＮＡへの逆転写を含み、既知の入手可能なソフトウェアを用いる標準的な配列分析によって、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒ３．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）によって、公開されているサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の配列から同定されたＰＣＲプライマーを用いることによって実施できる。
【００６３】
本発明の、ＰＣＲに基づく分子的方法に好ましいサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１フォワード及びリバースプライマーを、好ましい内部対照遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマーも含めて、下記表に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の場合には、以下の好ましいプライマーを用いる。
【表２】
【００６６】
遺伝子発現分析の最も広く用いられている方法の１つは、（マイクロ）アレイによる。他の種類の発現データ測定の場合と同様に、未知試料の統計分析は、臨床経過観察が知られている乳癌患者からの好適な数（少なくとも５０〜１００個）の測定値を収集することによる、サイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）の単独の又は好ましくはＳｈａｒｐ１（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）と組み合わせた最小シグネチャーテンプレートの予備的評価を含む。これらのデータ、即ち、前述の最小シグネチャーテンプレートを予め定義し、関連情報を次の試料分析のためにコンピューターに記憶させることができる。
【００６７】
本発明の方法を、以下の乳癌マイクロアレイデータセットにおいて検証した。
【表３】
【００６８】
Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の同時発現スコアが高い又は低い値の２つの群のうち１つへの分類は、好ましくは、Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の標準化発現レベルを集計して平均値０の合計スコアを出すことによって実施する。
【００６９】
腫瘍は、合計スコアが負である場合には最小シグネチャー低に分類し、合計スコアが正である場合には最小シグネチャー高に分類する。
【数１７】
【数１８】
前記式中、
【数１９】
は、試料ｉ中のＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の発現レベルであり、
【数２０】
は、データセット全体にわたって計算されたＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の推定平均値及び推定標準偏差値であり、最小シグネチャーテンプレートを表す。
【００７０】
ＮＫＩデータセットの場合には、試料は、方法の予後診断妥当性の最小必要要件に相当するサイクリンＧ２データのみに基づいて、高群及び低群に分類しなければならなかった。このデータセット（腫瘍２９５個）においては、わずか１つのサイクリンＧ２に基づく層別化が、依然として転移を予測する。
【００７１】
実際に、サイクリンＧ２単独の発現レベルを、最小シグネチャーテンプレートの定義に用いる場合、腫瘍は、以下の計算：
【数２１】
【数２２】
［式中、
【数２３】
は、未知試料ｉ中のサイクリンＧ２の発現レベルであり、
【数２４】
は、テンプレートを定義する］
に従って、サイクリンＧ２スコアが負の場合には最小シグネチャー低に、サイクリンＧ２スコアが正の場合には最小シグネチャー高に分類する。
【００７２】
したがって、癌再発リスクは、最小シグネチャー低発現群について「高い」と評価される。
【００７３】
前記に簡単に記載し及び２つのマーカーの検証のための実験パートでより詳細に記載する同一の分析は、任意の新しい又は異なるデータセットについて実施することができる。したがって、更なる実施形態によれば、本発明は、サイクリンＧ２の単独の又はＳｈａｒｐ１と組み合わせた発現値を用いて、乳癌マイクロアレイデータセットを分析する方法に関する。
【００７４】
前記方法を前記データセット全てに適用することによって、特筆すべきことに、本発明の予後診断方法が、単変量のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率分析を用いて検定を行った場合に、「高」群に比較して再発をきたす有意に高い可能性を示す（ｐ値は、データセットに応じて、０．０２〜３Ｅ−０５の範囲であった）、低レベルの最小シグネチャーを発現する群において、乳癌再発の有力な予測因子であることが証明された。
【００７５】
興味深いことに、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両発現レベルに基づく最小シグネチャーは、臨床転帰による患者の層別化において、ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒらの２００２年の文献に記載された７０遺伝子プロファイルに遜色なく機能した。
【００７６】
７０個の遺伝子の代わりにわずか２つの遺伝子に基づく最小シグネチャーを用いる利点は、明らかに明白である。
【００７７】
本発明の方法の更なる利点は、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の発現が、骨及び肺への遠隔転移リスクのいずれにも統計的に相関し、したがって、続発性腫瘍形成部位とは独立していることである。
【００７８】
更に、この方法を実施できる最も簡単な方法は、ＰＣＲサーモサイクラー及びゲル電気泳動によるＤＮＡ分離用タンクなどの最小の装置のみを必要とするＰＣＲであるが、本発明はこの実施形態には限定するものではなく、乳癌再発リスクの予後マーカーとしての、サイクリンＧ２の単独の又はＳｈａｒｐ１と組み合わせた発現レベルの検出に適用される場合に、遺伝子発現レベルの測定に一般に使用される、全ての利用可能な方法に関係する。
【００７９】
したがって、本発明の方法は、
標準的ＰＣＲ技術、
リアルタイムＰＣＲ（又はＴａｑ ｍａｎ若しくはＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ技術を用いるＱ−ＰＣＲ）、
他の遺伝子に特異的な配列と場合によって組み合わされるマイクロアレイ、
他の遺伝子に特異的な配列と場合によって組み合わされるディープシーケンシング（ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ｔ Ｈｏｅｎら、２００８）、
ノーザンブロット、
サイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１に対する入手可能な抗体を用いる免疫組織化学染色、
免疫ブロット
などの、遺伝子発現分析技術のうち任意の１つに基づいて、特異的ｍＲＮＡ又はタンパク質産物について遺伝子発現レベルを測定することができる。
【００８０】
発現レベルの好ましい測定技術、定量的ＰＣＲ又は逆転写ｍＲＮＡ ＰＣＲによれば、サイクリンＧ２検出試薬は、配列番号１に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するサイクリンＧ２特異的オリゴヌクレオチドである。
【００８１】
免疫検出の場合は、好ましくは、抗サイクリンＧ２特異抗体を単独で又は抗Ｓｈａｒｐ１特異抗体と組み合わせて使用する。
【００８２】
したがって、要約すると、Ｓｈａｒｐ１発現レベルの検出も含むこの方法の好ましい実施形態によれば、特異的検出試薬は、配列番号２に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド若しくはその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するＳｈａｒｐ１特異的オリゴヌクレオチド、又は抗Ｓｈａｒｐ１特異抗体からなる群から選択される。
【００８３】
本発明の更なる実施形態は、サイクリンＧ２及び好ましくは更にＳｈａｒｐ１遺伝子発現特異的検出手段、即ち、配列番号１に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むポリ又はオリゴヌクレオチドに存するサイクリンＧ２特異的オリゴヌクレオチド又はプローブ、及び好ましくは配列番号２に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むポリ又はオリゴヌクレオチドに存するＳｈａｒｐ１特異的オリゴヌクレオチドを含む、乳癌患者の乳癌再発リスクの評価用キットである。
【００８４】
本発明の更なる実施形態として、本発明は、乳癌患者からの試料中のサイクリンＧ２の単独の又はＳｈａｒｐ１と組み合わせた発現を評価するためのキットであって、少なくともサイクリンＧ２特異的試薬、好ましくは配列番号１に由来する１３−ｍｅｒ又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチド；好ましくは更にＳｈａｒｐ１特異的試薬、好ましくは配列番号２に由来する１３−ｍｅｒ又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチド；前記で定義された最小シグネチャー高群又は低群に未知試料測定値を割り付けるため基準を特定する、未知試料を分析するための使用説明書を含むキットに関する。好ましい一実施形態によれば、統計分析並びに発現データ（試料のシグネチャースコア）と、前記で定義された最小シグネチャーテンプレートとの比較のためのソフトウェア（最小シグネチャー低群への割り付けは乳癌患者の癌再発リスクの増大と相関する）。
【００８５】
このキットは、標準発現対照としての、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１発現対照高及び低（即ち、細胞株ＢＴ２０及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６中においてそれぞれ測定されるサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１発現値）及び希釈緩衝液又はアッセイ緩衝液を更に含むことができる。
【００８６】
使用される遺伝子発現検出方法のそれぞれに有用な特異的試薬は、サイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１に対して特異的であれば、市販試薬であっても、オーダーメイドされてもよい。
【００８７】
抗体、好ましくは精製されたポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、又はオリゴヌクレオチドは、好ましくは蛍光色素、化学発光標識又は色原体で標識でき、ポリヌクレオチドは、例えば３２Ｐでの標識後にノーザンブロットに使用できる。
【００８８】
特異抗体は、直接標識することもできるし、又は二次標識抗体を用いることによって検出することもできる。
【００８９】
キットは、各試料測定値を高い若しくは低い最小シグネチャー（低い最小シグネチャーが乳癌患者の癌再発リスクの増大と相関する）に割り付けるための基準の報告に使用される使用説明書を更に含み、又は好ましくは含む。好ましくは、前記で指定した計算は、ソフトウェアで実施する。
【００９０】
キットは、陰性試料及び陽性試料に存するアッセイ対照、又は内部発現対照を検出するための試薬、並びに任意選択で核酸抽出試薬を含むことができる。
【００９１】
好ましい一実施形態によれば、サイクリンＧ２発現レベル検出のためのＰＣＲプライマー対は、サイクリンＧ２（フォワード）が５’ＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＴＧＣ３’、サイクリンＧ２（リバース）が５’ＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴＡＧＣ３’であり、Ｓｈａｒｐ１（フォワード）が５’ＧＣＡＴＧＡＡＡＣＧＡＧＡＣＧＡＣＡＣＣ３’であり、Ｓｈａｒｐ１（リバース）が５’ＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴＡＧＣ３’である。
【００９２】
比較を行うプライマーは、既知の技術によって同定できる。
【００９３】
半定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は典型的には、当業界で知られているように、内部発現対照としてＧＡＰＤＨ配列を用いて、試料から抽出された全ＲＮＡから精製されたポリＡ＋ＲＮＡをレトロ転写する（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｂｉｎｇ）ことによって実施する。
各遺伝子の発現レベルは、デンシトメトリー分析又は目視検査によって得られ、標準発現対照との比較を実施して、サイクリンＧ２単独について又はサイクリンＧ２とＳｈａｒｐ１との組合せについて低発現群を定義する。
【００９４】
別の実施形態によれば、キットは、特異抗体及び関連対照などの、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１発現の免疫学的検出のための手段を含む。
【００９５】
本発明の方法によって得られる結果は、乳癌患者の再発リスクの第１の層別化を提示する。
【００９６】
前述のように、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の予後徴候は、医師にとって最も重要な指標の１つとなるが、医師は、年齢、腫瘍サイズ、腋窩リンパ節の状態、腫瘍の組織型、病理学的グレード及びホルモン受容体の状態などの、乳癌の他の既知の予後因子及び予測因子と合わせて予後評価を行わなければならない。
【００９７】
実際に、実験パート、実施例６により詳細に報告するように、モデル２において、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓｏｔｉｒｉｏｕら、２００６年）からの腫瘍１８７個のデータセットについて行った、腫瘍直径、エストロゲン受容体の状態（ＥＲ 陽性対陰性）、リンパ節の状態（陽性対陰性）、腫瘍グレード（グレード２対グレード１及びグレード３対グレード１）及び治療状況（タモキシフェン有対無）を含む、臨床診療に一般に使用される他の予測因子の多変量Ｃｏｘ比例ハザード分析は、最小シグネチャーに関して非常に有意である（ｐ＝０．００５４）（表４）。
【００９８】
したがって、最小シグネチャーは、標準的な臨床的予測因子によってもたらされる以上の新しい予後情報を加える、無再発生存率の有意な予測因子となる。また、最小シグネチャーは、多変量モデルだけでなく、任意の単一の臨床的予測因子を用いて計算される任意のモデルにも、予後値を加える。実際に、単一の臨床的変数＋最小シグネチャー（例えば、リンパ節の状態＋最小シグネチャー）を用いて得られたモデルの残差逸脱度と、１つの臨床変数のみを用いて得られたモデルの残差逸脱度との間には、各臨床予測因子について有意差がある。
【００９９】
更に、本発明の方法は、従来の予後マーカーによって、明白に不良な転帰又は明確に良好な転帰と秘密で割り付けられた、乳癌患者の５０％超に相当する患者に関して、予後徴候を得るのに特に有用である。
【０１００】
本方法の特に妥当な点は、この方法が、腫瘍の大部分に相当する、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍスケールによって中等度（グレード２）に分類される、予後の不確かな腫瘍（Iｖｓｈｉｎａら、２００６年）に有効に適用されることである。複数の独立したデータセットのグレード２の腫瘍に適用された場合、最小シグネチャーはグレード２の試料を、それぞれグレード１及びグレード３に相当する転帰を有する２つの群に層別化した。
【０１０１】
したがって、行われる分割は、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍスケールに従ってグレード２に分類される乳房腫瘍患者を、より正確に分類し及び場合によっては異なる治療カテゴリー又は臨床試験に割り付けるための層別化に適用される、本発明の方法の好ましい一実施形態である。
【実施例】
【０１０２】
実験パート
材料及び方法
細胞培養及びトランスフェクション
Ｈ１２９９、及び変異型ｐ５３ Ｒ１７５Ｈを発現するその派生細胞株は、Ｇ．Ｂｌａｎｄｉｎｏから寄贈されたものである（Ｓｔｒａｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００２年）。
【０１０３】
Ｈ１２９９非小細胞肺癌細胞は、ＤＭＥＭ、１０％血清、１ｍＭグルタミン中で維持した。ＴＧＦβ処理は、ＤＭＥＭ ０．２％血清中で行った（ＴＧＦβは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから提供された）。ｐ５３Ｒ１７５Ｈ Ｈ１２９９細胞は、変異型ｐ５３Ｒ１７５Ｈ対立遺伝子に対するポナステロン誘導ｃＤＮＡをコードする、安定にトランスフェクトされたプラスミドを発現する。ｐ５３発現は、細胞をポナステロン−Ａ（Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ−Ａ）（Ａｌｅｘｉｓ、３ｍＭ）と共に１６時間インキュベートしてから処理することによって誘導した。
【０１０４】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２６）は、１０％血清、２ｍＭグルタミンを添加したＤＭＥＭとＦ１２との１：１混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で維持した。
【０１０５】
ＴＧＦβ処理に関しては、細胞を２４時間、血清欠乏にし、次いで血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２中ＴＧFβ１（５ｎｇ／ｍｌ）で処理した。
【０１０６】
ｓｉＲＮＡ（ｓｉは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ））のトランスフェクションについては、ＲＮＡｉ Ｍａｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｄｓＲＮＡオリゴ（１０ピコモル／ｃｍ２）をトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ（ｓｈは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）又はｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）の標的とされる配列のリストを、表１に示す。
【０１０７】
【表４】
【０１０８】
安定発現細胞株の作製
低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現コンストラクトは、アニールしたＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＳＵＰＥＲ−ｒｅｔｒｏ−ｐｕｒｏ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）中でクローン化することによって作製した。プラスミドは全て、シーケンシングによって制御した。
【０１０９】
安定なノックダウンのために、リン酸カルシウムを用いて２９３ｇｐ（Ｍ．Ｔｒｉｐｏｄｉから寄贈されたもの）中にｓｈＲＮＡ（ｐＳｕｐｅｒＲｅｔｒｏ）及びＶＳＶエンベロープを発現させるプラスミドをトランスフェクトすることによって、レトロウイルス粒子を得た。トランスフェクションの２日後に、上精を収集し、濾過し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の感染に用いた。ピューロマイシン耐性に関して選別後、形質導入細胞を、標的タンパク質のダウンレギュレーションについて検証した。
【０１１０】
遊走及び浸潤アッセイ
創傷閉鎖実験（ｗｏｕｎｄ−ｃｌｏｓｕｒｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）のために、Ｈ１２９９細胞を６ウェルプレートに蒔き、コンフルエントまで培養した。細胞をｐ２００チップでスクラッチし（時間０）、低血清に移し、前述のようにして処理した。
【０１１１】
遊走アッセイについては、トランスウェル遊走アッセイを、２４ウェルＰＥＴインサート（Ｆａｌｃｏｎ ポアサイズ８．０ｍｍ）中で行った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に関しては、細胞を１０ｃｍのディッシュ中に蒔き、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、８時間後に、一晩、血清欠乏にした。次いで、５００００又は１０００００個の細胞をトランスウェルインサート中に蒔き（各試料について少なくとも３つのレプリカ）、未処理のままにしておくか又はＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍｌ）で処理した。Ｈ１２９９に関しては、細胞をトランスウェル中の１０％血清中に蒔いたが、次に０．２％血清に変えた。いずれの細胞株についても、トランスウェルの上部の細胞を綿棒で除去し、遊走細胞をＰＦＡ４％中で固定し、クリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ）０．５％で染色した。フィルターを写真撮影し、細胞総数をカウントした。いずれの実験も、独立して少なくとも３回繰り返した。
【０１１２】
図２Ｃに示されるマトリゲル浸潤アッセイについては、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び派生細胞株を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１：２に希釈されたマトリゲルグロースファクターレデュースト（Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の液滴（１００ｍｌ）中に再懸濁させた。
【０１１３】
インビボ転移アッセイ
マウスは、特定病原体除去（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）（ＳＰＦ）動物施設中に収容し、承認された施設内基準（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐａｄｏｖａ）に準拠して処理した。乳癌転移の異種移植研究については、ｓｈＧＦＰ−又はｓｈｐ５３−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（細胞数１×１０６／マウス）を、週齢を５〜７週に適合させたＳＣＩＤ雌マウスの乳腺脂肪体に一側的に注射した。６週間後、マウスを屠殺し、リンパ節転移の存在について調べた。他の器官（肝臓、肺、腹膜）への肉眼で見える転移はまれであった。注射部位における腫瘍増殖を、反復キャリパー測定によって観察した。肺コロニー形成アッセイに関しては、細胞をＰＢＳ １００ｍｌ中に再懸濁させ、ＳＣＩＤマウスの尾静脈に接種した。４週間後、動物を屠殺し、その後の組織学的分析のために肺を摘出した。
【０１１４】
組織学及び免疫組織化学
組織学的検査のための組織を、標準的な方法によって、４％緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、パラフィン包埋した。
【０１１５】
図２Ｇ〜Ｉに示した実験については、肺の連続切片を、互いに１５０ｍｍの間隔で切断し、最初にヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオシン（Ｅｏｓｉｎ）（Ｈ＆Ｅ）で染色し、次いでヒトサイトケラチン発現のために、抗ヒトサイトケラチン（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）マウスモノクローナル抗体（クローンＭＮＦ１１６）（Ｄａｋｏ）で処理した。免疫組織化学染色は、間接免疫ペルオキシダーゼ染色技術（Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｖｉｓｉｏｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）を用いて行った。
【０１１６】
本発明者らは、肺当たり５つの連続切片においてサイトケラチン陽性領域を数値化した。腫瘍細胞で覆われた領域を、切片当たり４つのオーバーラップしない視野（各切片の５０〜８０％をカバーする）からＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて測定した。
【０１１７】
抗体及びウェスタンブロット法
ウェスタンブロット分析を、前述のようにして行った（Ｐｉｃｃｏｌｏら、１９９９年）。簡潔に言えば、タンパク質を、１０％ ＮｕＰａｇｅ（登録商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で分離し、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）Ｐ（登録商標）メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。スーパーシグナルウェストピコ（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ−ｐｉｃｏ）（登録商標）及び−ｄｕｒａＨＲＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、化学発光を可視化させた。抗ヒトｐ５３ ＤＯ−１モノクローナル抗体及び抗ラミンポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗ホスホＳｍａｄ３ポリクローナル抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した。
【０１１８】
ノーザンブロット法
６ｃｍディッシュ中に蒔いた細胞から、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって全ＲＮＡを抽出した。試料当たり１０ｍｇの全ＲＮＡを、６％ホルムアルデヒド／１％アガロースゲル中に添加して分離させ、ジーンスクリーンプラス（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅnＰｌｕｓ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上に上向き毛細管転写（ｕｐｗａｒｄ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）によってブロットし、紫外線架橋させた。メンブレンを、ＵＬＴＲＡｈｙｂ−Ｏｌｉｇｏ溶液（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて４２℃において５時間プレハイブリダイズさせ、４２℃において，一晩３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。メンブレンを６８℃において２×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ溶液で洗浄し、オートラジオグラフィーに暴露した。全プローブを、ランダムプライマー増幅によって得た。Ｓｈａｒｐ１、サイクリンＧ２及びフォリスタチンプローブテンプレートは、ＲＺＰＤ ＥＳＴから入手した（それぞれ、ＨＵ３＿ｐ９８３Ｂ０１２０Ｄ、ＨＵ３＿ｐ９８３Ｄ０１４０Ｄ２及びＲＺＰＤ ＥＳＴ ＨＵ３＿ｐ９８３Ｄ０１１３Ｄ２）。ＧＰＲ８７及びＡＤＡＭＴＳ９プローブは、ＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニングによって得た。全てのプローブを、シーケンシングによって検証した。
【０１１９】
ＲＴ−ＰＣＲ
ポリ（Ａ）＋−ＲＮＡは、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による全ＲＮＡ精製後に、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びオリゴ−ｄ（Ｔ）プライマーでレトロ転写した。標準的なＲＴ−ＰＣＲの場合には、各ｃＤＮＡ試料２μｌをＰＣＲチューブに等分し、次いでＥＸＴａｑ用マスターＰＣＲミックス（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を加える。サイクル条件は、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒である（Ｃｏｒｄｅｎｏｎｓｉら、２００３年）。全てのＰＣＲプライマーのリストを、表２に示す。
【０１２０】
【表５】
【０１２１】
ＤｙＮＡｍｏ ＨＳ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いる７５００Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することによって、サイクリンＧ２及びＧＡＰＤＨに関するＱ−ＰＣＲを行った。
【０１２２】
マイクロアレイ分析
ＭＤＡ ｓｈＧＦＰ及びｓｈｐ５３細胞を２４時間、血清欠乏にし、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２中において、未処理のままにしておくか又はＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍｌ、３時間）で処理した。４つの条件（非処理ｓｈＧＦＰ、ＴＧＦβ処理ｓｈＧＦＰ、非処理ｓｈｐ５３、ＴＧＦβ処理ｓｈｐ５３）のそれぞれについて、４つのレプリカを作製した（試料計１６個）。全ＲＮＡを、メーカーの使用説明書に従ってトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出した。マイクロアレイハイブリダイゼーションのための試料調製は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘジーンチップ（登録商標）発現分析技術マニュアルに記載されたようにして実施した。簡潔に言えば、全ＲＮＡ１５μｇを用いて、二本鎖ｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を作製した。ビオチン標識ｃＲＮＡの合成は、バイオアレイＴＭ高収量ＴＭ ＲＮＡ転写標識キット（ＥＮＺＯ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を用いて行った。ｃＲＮＡ断片化の長さは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザー（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて確認した。各群について４つの生物学的ｍＲＮＡ複製物を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ジーンチップ（登録商標）ヒトゲノムＨＧ−Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイ上でハイブリダイズした。
【０１２３】
データ分析は全て、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒライブラリー及びＲ統計パッケージを用いてＲで行った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ．／、Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２００８年）。具体的には、ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＡｆｆｙＱＣＲｅｐｏｒｔ及びＡｆｆｙＰＬＭを、標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ品質管理手順に用いた。プローブレベルシグナルは、ロバストなマルチアレイ平均手順ｒｍａ（Ｉｒｉｚａｒｒｙら、２００３年）を用いて、発現値に変換した。ＲＭＡにおいて、ＰＭ値をバックグラウンド補正し、クオンタイル正規化を用いて正規化し、発現基準を、中央値ポリッシュ集計を用いて計算した。全アレイ中の全対数シグナルの平均標準偏差より低い標準偏差（例えば、０．２）を有するＲＭＡデータをフィルター処理によって除去した。フィルター処理されたデータセットは、更なる分析に使用される２２６４４個のプローブセットをもたらした。異なって発現された遺伝子を、マイクロアレイの有意性分析ｓａｍｒ（Ｔｕｓｈｅｒら、２００１年）を用いて同定した。ＳＡＭは、誤発見率（Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ）（ＦＤＲ）を制御しながら、マイクロアレイにおいて有意な遺伝子を検出するための統計的手法である。ＳＡＭは、データの重複順列を用いて、任意の遺伝子の発現レベルが生理的状態に有意に関連するかどうかを判定し、有意差はｑ値、即ち、遺伝子が「異なって発現された」とみなされる最も低い誤発見率によって数値化する（Ｓｔｏｒｅｙ、２００２年）。
【０１２４】
ＴＧＦβ標的遺伝子の同定
発現がＴＧＦβで改善されている遺伝子を同定するために、本発明者らはＴＧＦβ処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ｓｈＧＦＰ又はｓｈｐ５３）の発現プロファイルを、それらの非処理対照と比較し、ｑ値が≦０．１であるそれらの転写物を選択した。この選択は、ＴＧＦβ誘導倍率の下限（又は減少）を１．５に設定することによって、更に精密化した。この組合せフィルターを用いて、本発明者らは、非処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１試料とＴＧＦβ処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１試料との間で異なって制御された４４７個の遺伝子を同定することが可能であった。異なって発現された遺伝子は、ＤＡＶＩＤ（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）、京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）及びＮＣＢＩ遺伝子データベース（ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）に従って機能的に分類した。既知の機能と関連する２９２個の遺伝子のうち、１４７個の遺伝子が、細胞運動、浸潤プロセス及び転移に関与することが報告された。変異型ｐ５３依存的にＴＧＦβ１によって制御される遺伝子は、ｓｈＧＦＰ中ではＴＧＦβによる有意な制御を示すと確認されたが、ｐ５３欠乏細胞では確認されなかった（ｑ値≦０．１、図３Ｂ参照）。得られた５個の遺伝子を、ノーザンブロット分析によって検証した。
【０１２５】
実施例１
ＴＧＦβへの細胞応答に対する変異型ｐ５３の作用。
本発明者らは、ＴＧＦβへの細胞応答に対する変異型ｐ５３の作用を精査しようと努めた。この目的を達成するために、本発明者らは、ホットスポットｐ５３Ｒ１７５Ｈ変異対立遺伝子をコードする誘導発現ベクターによって安定的に再構成されたｐ５３欠損Ｈ１２９９細胞を用いた。Ｐ−Ｓｍａｄ３の活性化によって判断されるように、この細胞株は、親のＨ１２９９に比較して、ＴＧＦβに対して同様な応答性を保有していた（図１Ａ）。
【０１２６】
ｐ５３Ｒ１７５Ｈを有するＨ１２９９細胞のＴＧＦβ処理により、細胞はその立方上皮形状を捨て、糸状仮足突起及び葉状仮足などの多数の動的突起（ｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎ）を特徴とするより間葉性の表現型を獲得するので、著しい形態変化を引き起こした（図１Ｂ）。これらは、親細胞にも野生型ｐ５３で再構成された細胞にも存在しなかった（図１Ｂ及び図示していないデータ）。変異型ｐ５３の発現が、ＴＧＦβを受容する細胞に更に遊走性を与えるかどうかを調べるために、本発明者らは創傷アッセイを用いた。創傷アッセイにおいて、細胞は、細胞間接触を破壊し、分極し、ピペット先端部でコンフルエントな培養物をスクラッチすることによって作られた傷に遊走するように誘導される。３０時間のＴＧＦβ処理後、親（ｐ５３欠損）Ｈ１２９９細胞は十分に遊走しなかったが、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ発現細胞はほとんど完全に傷に浸潤した（図１Ｃ）。この作用を増殖のバイアスではなく細胞遊走に帰するために、本発明者らは、ＢｒｄＵの取り込みを観察し、ＴＧＦβ処理対照又は変異型ｐ５３発現細胞間に差がないことを見出した（データは示さず）。独立した、細胞運動性の測定手段として、本発明者らは、トランスウェル−遊走アッセイにおいて、親世代のＨ１２９９細胞、野生型又は変異型ｐ５３再構成Ｈ１２９９細胞の挙動を調べた。図１Ｄは、変異型ｐ５３の発現はＴＧＦβプロ遊走性応答の獲得と一致するが、野生型ｐ５３は一致しないことを示している。
【０１２７】
これらのデータは、変異型ｐ５３の獲得を、ＴＧＦβ誘導上皮可塑性及び遊走、発現がＴＧＦβ浸潤性に重要な表現型に関連づけている（Ｇｕｐｔａ及びＭａｓｓａｇｕｅ、２００６年）。
【０１２８】
実施例２
インビトロにおいて、変異型ｐ５３とＴＧＦβとは共同で乳癌細胞の細胞形状及び浸潤性を制御する。
内在性変異型ｐ５３を有する転移癌細胞中における上皮可塑性及び遊走の増大の実際要件を明らかにするために、本発明者らは、浸潤性乳癌の確立されたモデル、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中で、内在性変異型ｐ５３（ｐ５３Ｒ２８０Ｋ）を安定的にノックダウンした（Ａｒｔｅａｇａら、１９９３年；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、１９９９年；Ｄｅｃｋｅｒｓら、２００６年；Ｐａｄｕａら、２００８年）。細胞に、ｓｈＧＦＰ（対照）又はｐ５３を標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈｐ５３）を発現するレトロウイルスベクターを形質導入し（表１参照）、次いで薬剤選択を行って、陽性のトランスフェクタントを集積した。免疫ブロット法によれば、ｓｈｐ５３の発現は、変異型ｐ５３タンパク質の内在レベルを＞９０％減少させた（図２Ａ）。トランスウェル−遊走アッセイにおいて、ＴＧＦβは、対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において強力なプロ遊走性応答のトリガーとなった。注目すべきことに、この応答は、変異型ｐ５３欠乏細胞中では失われていた（図２Ｂ）。２つの独立した抗ｐ５３ ｓｉＲＮＡ配列を用いたｐ５３の一過性欠乏時にも、同様な結果が得られた（データは示さず）。１滴のマトリゲル中に埋め込まれると、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＴＧＦβ依存性の分散、細胞外基質分解及び遊走を示し（図２Ｃ及び２Ｄ）、これはインビボ浸潤性を再現している（Ａｌｂｉｎｉ、１９９８年）。本発明者らは、これらの活性には変異型ｐ５３の発現が必要であることを見出した。これらのデータは、少なくともインビトロにおいて、変異型ｐ５３とＴＧＦβとが協力して、乳癌細胞の細胞形状及び浸潤性を制御することを示唆している。
【０１２９】
実施例３
変異型ｐ５３発現は、インビボにおいてＴＧＦβ応答性を効率的な転移拡散の方向に導くのに極めて重要な役割を果たす。
複数の証拠が、インビボにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の転移拡散が、自己分泌ＴＧＦβの制御を受けていることを示している（Ａｒｔｅａｇａら、１９９３年；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、１９９９年；Ｄｅｃｋｅｒｓら、２００６年；Ｐａｄｕａら、２００８年）。変異型ｐ５３がインビボにおいて、ＴＧＦβによって促進される悪性挙動に関連した重要性を持つかどうかを試験するために、本発明者らは、免疫不全マウスの乳腺脂肪体にｓｈＧＦＰ−又はｓｈｐ５３−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注射した。２つの細胞集団は、インビトロでは同様な速度で増殖し（データは示さず）、インビボでは同様な速度及びサイズで原発性腫瘍を形成した（図２Ｅ）。これは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中の高レベルの変異型ｐ５３が、増殖にも原発性腫瘍形成にも必須でないことを示している。移植の６週間後に、マウスを屠殺し、転移性病変の有無を調べた。
【０１３０】
同所注射を行ったＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、肺転移が非常に少ないが、リンパ節には効率的に転移する。転移拡散を数値化するために、本発明者らは、ヒト乳癌における全身性疾患の読み出し情報である、対側リンパ節のコロニー形成を観察した（Ｓｉｎｇｌｅｔａｒｙら、２００６年）。特筆すべきことに、ｓｈＧＦＰ細胞を注射したマウスでは、リンパ節転移に関して陰性のスコアを示したのは２２匹のうち１匹のみであったのに対して、ｓｈｐ５３欠乏腫瘍を保有しているマウスでは、２２匹のうち１０匹において転移がないままであった（図２Ｆ）ことから、変異型ｐ５３発現の抑制は、対照細胞と比較した場合に、リンパ節転移の数を大幅に減少させた。
【０１３１】
変異型ｐ５３を浸潤性に関連づけるこれらの結果をインビボで裏付けるために、本発明者らは、ヌードマウスに対照及びｓｈｐ５３−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を静脈注射した。独立した２つのクローンを用いて、本発明者らは、変異型ｐ５３の欠乏が、肺へのコロニー形成に対して顕著な影響を及ぼし、転移小結節を数及びサイズにおいて明白に減少させる（図２Ｇ〜２Ｉ）ことを見出した。このように、変異型ｐ５３発現は、ＴＧＦβ応答性を効率的な転移拡散の方向に導くのに極めて重要な役割を果たしている。
【０１３２】
実施例４
変異型ｐ５３及びＴＧＦβによって同時制御される遺伝子セットの同定。
次に、本発明者らは、変異型ｐ３５及びＴＧＦβが浸潤及び転移を制御する特異遺伝子発現プログラムを精査しようと努めた。この遺伝子セットを同定するために、本発明者らは、対照及び変異型ｐ５３欠乏ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＴＧＦβトランスクリプトームプロファイルを比較した。本発明者らは、ＴＧＦβが４００個を超える遺伝子を制御する可能性があることを見出した。それらの大多数は、変異型ｐ５３の存在には依存せずに発現された。
【０１３３】
変異型ｐ５３非依存性標的の中のいくつかは、ＰＡＩ１／ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＪｕｎＢ及びＳｍａｄ７などの直接的なＳｍａｄ標的として既に文献記載されていた（Ｍａｓｓａｇｕｅ及びＧｏｍｉｓ、２００６年）。更に、肺又は骨特異的転移に関連する遺伝子（ＡＮＧＰＴＬ４、ＮＥＤＤ９、ＩＬ１１及びＣＴＧＦ）（Ｐａｄｕａら、２００８年）を含めて、一般的な上皮性「ＴＧＦβ応答分類指標（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）」に既に関連づけられている多くの遺伝子も発見された。これらの標的の同定の成功は、ＴＧＦβ誘導悪性腫瘍において重要な役割を果たす可能性がある新規遺伝子を同定する本発明者らの手法を検証した。興味深いことに、本発明者らは、細胞の運動、浸潤又は転移に関与していると既にみなされている１４７個の遺伝子に注目した（図３Ａ及び示していないデータ）。
【０１３４】
しかし、ＴＧＦβは、その前転移機能（ｐｒｏ−ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の発揮に、変異型ｐ５３の存在を必要とする。したがって、本発明者らは、変異型ｐ３５及びＴＧＦβによって同時制御されるはるかに小さい遺伝子セットに限定して着目した。特筆すべきことに、これに必要だったのはわずか５個の遺伝子、Ｓｈａｒｐ１／ＤＥＣ２／ＢＨＬＨＢ３／ＢＨＬＨＥ４１、サイクリンＧ２／ＣＣＮＧ２、ＡＤＡＭＴＳ９、フォリスタチン及びＧＰＲ８７である（図３Ｂ及び３Ｃ参照）。特に、本発明者らは、変異型ｐ５３を介してＴＧＦβによって負に制御される２つの候補転移抑制因子、Ｓｈａｒｐ１及びＣｙｌｉｎＧ２に着目した（図３Ｄ）。Ｓｈａｒｐ１は、ＩＤ−タンパク質に類似した（即ち、ＭｙｏＤ阻害アッセイにおいて）阻害性の塩基性ヘリックスループヘリックスである（Ｌｉら、２００３年）が、その生物学的役割はその他の点ではほとんど不明である。サイクリンＧ２は、非定型「阻害性」サイクリンとみなされるが、微小管細胞骨格の動態に影響を与える可能性もある。興味深いことに、サイクリンＧ２は、細胞分裂の間に、母中心小体（ｃｅｎｔｒｉｏｌｅ）を取り囲む中心体（ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ）との会合によって、非対称的に受け継がれる（Ａｒａｃｈｃｈｉｇｅ Ｄｏｎら、２００６年）。
【０１３５】
実施例５
同定された遺伝子セットのインビトロにおける生物学的検証。
これらの遺伝子を変異型ｐ５３／ＴＧＦβ経路のエフェクターとして機能的に検証するために、本発明者らは、エピスタシス実験を行い、Ｓｈａｒｐ１又はサイクリンＧ２の欠乏が、ｐ５３欠乏細胞においてＴＧＦβ誘導遊走をレスキューできるかどうかを試験した。図３Ｅに示されるように、Ｓｈａｒｐ１又はサイクリンＧ２のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、ｓｈｐ５３ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においてＴＧＦβ依存性プロ遊走活性を回復させる（図３Ｅのレーン３及び４とレーン２とを比較）。したがって、これらの分子は、ＴＧＦβ前浸潤性応答に拮抗して、転移抑制因子として作用する。インビトロにおいて浸潤挙動に拮抗するのに必須の遺伝子を同定した後、本発明者らは、転移抑制因子としてのそれらの臨床的関連性を解明しようと努めた。ヒトの原発性腫瘍の最近のトランスクリプトームプロファイリングは、高い転移リスク及び低い無病生存率を予測する遺伝子一式又は「シグネチャー」を同定した（Ｆａｎら、２００６年；ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、２００２年）。原発性腫瘍におけるＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の検出が生物学的に有意義であるならば、これらの遺伝子の発現減少は臨床転帰不良と関連づけられることが予想される可能性がある。意外なことに、Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２は、乳癌転移の既知のシグネチャー、即ち７０遺伝子シグネチャー、再発スコアなどには含まれない（Ｆａｎら、２００６年）。
【０１３６】
実施例６
統計分析及び他の遺伝子セットとの比較による、同定された遺伝子セットの予後値の検証。
乳癌データセット
Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の予後値を評価するために、本発明者らは６つの異なるデータセットを収集した（表３）。各データセットについて、本発明者らは、生存率分析を行い、最小シグネチャーが臨床的に異なる群に患者を分類できるかどうかを試験した。各データセットを、互いに独立して処理して、種々の研究間の最初の差（例えば、患者コホート、マイクロアレイタイプ、試料処理プロトコール）を維持した。
【０１３７】
Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２（最小シグネチャー、ＭＳ）の予後値を評価するために、本発明者らは、利用可能な遺伝子発現データセットを利用して、９００個までの原発乳癌を、生存率及び遠隔再発を含む関連臨床データと共にまとめた。
【０１３８】
【表６】
【０１３９】
本発明者らは、乳癌遺伝子発現データセットを臨床情報と共にＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＧＥＯ／）、スタンフォードマイクロアレイデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ５．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／）、又は著者の個人的ウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｐｕｂｓ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｗｏｕｎｄ＿ＮＫＩ／ｅｘｐｌｏｒｅ．ｈｔｍｌ）からダウンロードした。
【０１４０】
表３は、データセット及びそれらのソースの完全なリストを表している。ＥＭＣ、ＭＳＫ及びＮＫＩの研究を除き、全ての試料について生データ（例えば、ＣＥＬファイル）を入手できた。全ての分析試料について詳細な臨床情報を獲得できた。データセットは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ及びデュアルチャンネルｃＤＮＡマイクロアレイプラットフォームの両者を含んでいた。全てのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータは、同じＨＧ−Ｕ１３３Ａプラットフォームに由来するので、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘジーンチップアレイの種々の作製にわたってプローブセットをマッピングする方法は必要なかった。ＣＥＬファイルを入手できる場合には、ＲＭＡアルゴリズムを用いて強度シグナルから発現値を生成し、値をバックグラウンド補正し、クオンタイル正規化を用いて正規化し、中央値ポリッシュ集計を用いて発現基準を計算した。ＥＭＣ、ＭＳＫ及びＮＫＩの研究の場合は、データはダウンロードしたまま用いた。具体的には、ＥＭＣ及びＭＳKデータセットにおいては、発現値は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＭＡＳ ５．０アルゴリズムを用いて計算した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイにおいて、サイクリンＧ２は３つのプローブセット（２０２７６９＿ａｔ、２０２７７０＿ｓ＿ａｔ及び２１１５５９＿ｓ＿ａｔ）によって表され、Ｓｈａｒｐ１はプローブセット２２１５３０＿ｓ＿ａｔのみによって表される。
【０１４１】
ＮＫＩデータセットに用いるＡｇｉｌｅｎｔ、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓアレイは、サイクリンＧ２に対しては単一のプローブを有するが、Ｓｈａｒｐ１に対してはプローブを含まない。
【０１４２】
最小シグネチャー分類
Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の高い又は低い同時発現スコアによって２つの試料群を同定するために、本発明者らは、Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の標準化発現レベルを集計して平均値０の合計スコアを出すことによって、分類規則を定義した。
【０１４３】
次に、腫瘍を、合計スコアが負である場合には最小シグネチャー低に分類し、合計スコアが正である場合には最小シグネチャー高に分類した。
【数２５】
【数２６】
前記式中、
【数２７】
は、試料ｉ中のＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の発現レベルであり、
【数２８】
は、データセット全体にわたって計算されたＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の推定平均値及び推定標準偏差値である。
【０１４４】
Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、ＮＣＩ及びＵｐｐｓａｌａの研究については、ＲＭＡから得られた発現値に基づくこの分類を適用した。一方、ＥＭＣ及びＭＳＫについては、発現値はダウンロードしたまま使用している。ＥＭＣデータセットについては、発現データは対数変換（ｌｏｇ２−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）してある。
【０１４５】
ＮＫＩデータセットについては、試料は、サイクリンＧ２データのみに基づいて、高群及び低群に分類しなければならなかった。
【０１４６】
サイクリンＧ２発現レベルの適切な閾値を決定するために、本発明者らは臨床パラメーターを用いて、臨床転帰良好な患者、即ち、少なくとも５年の追跡後に転移のないままであるリンパ節陰性の患者の割合を数値化した（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、２００２年）。試料の約３１％（２９５個の腫瘍のうち９２個）がこれらの基準を満たしたので、サイクリンＧ２発現値の６９番目のパーセンタイル（即ち、０．０７８）を、高群又は低群への腫瘍分類にカットオフとして用いた。所与の試料のサイクリンＧ２発現レベルがサイクリンＧ２値の６９番目のパーセンタイルよりも高い場合には試料を最小シグネチャー高と称し、そうでない場合には、最小シグネチャー低と称した。この選択の背後にある論理的根拠は、患者の約３１％が最小シグネチャー高に分類されると予想されたことである。
【０１４７】
試料はまた、目的変数なしのクラスタリング法（Ｐｏｌｌａｒｄ、２００５年）を用いてＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の発現レベルに基づいて、最小シグネチャー高群及び最小シグネチャー低群に分類した。
【０１４８】
特に、ＭＳＫ及びＥＭＣデータセットの分類にはそれぞれ、ユークリッド距離及び完全又はＷａｒｄ連結基準を用いる凝集型クラスタリングを用い、ＮＣＩ試料にはユークリッド距離を用いる分割型クラスタリング（ｄｉａｎａ）を適用し、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ及びＵｐｐｓａｌａデータセットにｋ平均パーティショニングアルゴニズム（ｋ−ｍｅａｎｓ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いた。ＮＫＩ試料には、サイクリンＧ２についての遺伝子発現データしか入手できないので、クラスタリング法は適用しなかった。
【０１４９】
本発明者らは、分析するデータセット全てについて最小シグネチャー及び７０遺伝子シグネチャーの成績（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を比較した。ＮＫＩ以外の全てのデータセットはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイに由来するので、本発明者らはまず、７０遺伝子シグネチャーをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットにマッピングし、次いで、４８個の固有のＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ ＩＤに相当する、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａプラットフォーム中の７５プローブセットへのＮＫＩの７０遺伝子予後不良シグネチャーマップを得た。シグネチャーを構成する遺伝子数のこのような減少を考慮し及び本発明者らが異なる患者分類モデルを用いた事実を踏まえて、本発明者らは、数の減少した遺伝子リストに基づいて作成された異なるモデル（即ち、目的変数なしのクラスタリング）の予後成績が、全シグネチャーに基づくｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒのモデルの予後成績と同様であるかどうかを検証した。したがって、本発明者らは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ及びＲｏｓｅｔｔａプラットフォームの両者に存在する４８個の固有の遺伝子と、目的変数なしのクラスタリングに基づく分類モデルとを用いて、ＮＫＩ試料を分類した。２００２年にｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒらによって及び２００５年にＭｉｎｎらによって既に報告された成績に一致して、本発明者らは、数の減少したシグネチャーへの目的変数なしのクラスタリングの使用が、分類指標の成績にほとんど影響を与えていないことを見出した。したがって、他の全てのデータセット中の試料を、この数の減少した７０遺伝子シグネチャー及び目的変数なしのクラスタリングを用いて２つの群に分類した。特に、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍの研究には、Ｗａｒｄアルゴリズム（Ｗａｒｄ、１９６３年）に基づく凝集型階層モデルを用い、Ｕｐｐｓａｌａ及びＥＣＭの研究はＰＡＭアルゴニズム（Ｋａｕｆｍａｎ及びＲｏｕｓｓｅｅｕｗ、１９９０年）を用いて分類した。最後に、ＭＳＫの研究に関しては、本発明者らは、Ｍｉｎｎら（２００５年）によって示された分類を用いた。
【０１５０】
生存率分析
最小シグネチャーの予後値を評価するために、本発明者らは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ、１９７８年）を用いて、患者が高群又は低群のいずれに属するかに従って、患者に転移がないままである（ＭＳＫ及びＮＫＩ）、腫瘍再発がないままである（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ及びＮＣＩ）及び癌の疾患がないままである（Ｕｐｐｓａｌａ）可能性を推定した。これらの研究成果を確認するために、生存率曲線を、ログランク検定又はマンテル−ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）検定（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ及びＦｌｅｍｉｎｇ、１９８２年）を用いて、即ち、最小シグネチャー高の生存率を裏付ける片側対立仮説に対比して、差のない帰無仮説を検定して、比較した。Ｐ値は、標準漸近正規分布（ｓｔａｎｄａｒｄ ｎｏｒｍａｌ ａｓｙｍｐｔｏｔｉｃ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）に従って計算し、ボンフェローニ−ホルム（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ）の逐次多重検定法（Ｄｕdｏｉｔ、２００３年）に従って補正を行って、族当たりの過誤率（ｆａｍｉｌｙ−ｗｉｓｅ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）を制御した。合計スコアを用いて定義される最小シグネチャー高群と最小シグネチャー低群とを比較した場合、補正ｐ値は全て、有意水準α＝０．０５で有意であった。クラスタリング法を用いて定義される最小シグネチャー高群及び最小シグネチャー低群について繰り返した同じ生存率分析でも同様な結果が得られ、ｐ値は、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍでは０．０００２６、ＮＣＩでは０．０００８３、ＥＭＣでは０．０２５１、Ｕｐｐｓａｌａでは０．００２５、ＭＳＫでは０．００８８７であった。
【０１５１】
最後に、生存率分析を、高群及び低群に割り付けられた試料のサブセットに適用し、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍスケールによって中等度（グレード２）に分類した。この場合も、族当たりの過誤率をα＝０．０５に制御することによって、全ての帰無仮説は棄却された。ＮＣＩデータセットについては、グレード２の腫瘍の無再発生存率曲線は低分化のグレード３の腫瘍の曲線と統計的に有意差がなかったので、この分析は実施できなかった。Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍスケールによる腫瘍の分類に関する情報は、ＭＳＫ及びＥＭＣデータセットにおいては有効でない。
【０１５２】
結論
各データセットにおいてＳｈａｒｐ１及びＣｙｌｃｉｎＧ２の発現がそれぞれ高レベル及び低レベルの２つの腫瘍群を定義した（図４）後に、単変量のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率分析を用いて検定を行った場合、特筆すべきことに、低レベルの最小シグネチャーを発現する群は、「高」群に比較して再発をきたす確率が有意に高かったことが発見された（ｐ値は、データセットに応じて、０．０２〜３Ｅ−０５の範囲であった）。
【０１５３】
興味深いことに、臨床転帰による患者の層別化において、ＭＳは７０遺伝子プロファイルに遜色ない機能を示した（図４）。
【０１５４】
Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の発現は、これらのアッセイにおける最小シグネチャーの予測力に対して相乗的であり、骨及び肺への遠隔転移リスクのいずれにも関連する（図５）。それでも、Ｓｈａｒｐ１発現データが有効でない、ＮＫＩデータセット（２９５個の腫瘍）（Ｆａｎら、２００６年）などの患者のデータセットにおいては、サイクリンＧ２のみに基づく層別化が、依然として転移を予測する（図６参照）。
【０１５５】
Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いた多変量分析
最小シグネチャーの予後値を更に評価するために、本発明者らは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓｏｔｉｒｉｏｕら、２００６年）からの１８７個の腫瘍のデータセットについて多変量のＣｏｘ比例ハザード分析を行った。特に、ＮＣＩの研究からの１８７個の腫瘍に関する再発リスクを、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデリング（Ｃｏｘ、１９７２年）によって調べた。
【０１５６】
生存率と、最小シグネチャー予測因子及び臨床診療に一般に使用される他の予測因子（腫瘍直径、エストロゲン受容体の状態（ＥＲ 陽性対陰性）、リンパ節の状態（陽性耐陰性）、腫瘍グレード（グレード２対グレード１及びグレード３対グレード１）及び治療状況（タモキシフェン有対無）を含む）との相関を具体的に調べた。
【０１５７】
本発明者らは、最初に臨床的変数のみを用いることによって（モデル１）、次いで最小シグネチャー予測因子を加えることによって（モデル２）、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルに当てはめた。結果を表４及び５に示す。これらの表から、最小シグネチャーが依然として無転移生存率の有意な予測因子であり、したがって、標準的な臨床的予測因子によってもたらされる以上の新しい予後情報を加えたことが示される。
【０１５８】
表４ Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いた、ＮＣＩデータセットに関する再発リスクの多変量分析
モデル１において、腫瘍サイズ及びグレード２（対グレード１）の共変量は、α＝０．０５において統計的に有意な係数を有する。しかし、最小シグネチャーを組み込んだ場合（モデル２）、全ての他の共変量を一定に保ちながら、「低」群に割り当てると、再発ハザードが平均してｅ０．７０６＝２．０２６倍、有意に増加し、即ち、新しい予後情報を加える。
【０１５９】
モデル１ 臨床的変数のみを用いた多変量分析
モデル１は、ｎ＝１５９の観察結果を用いて得た。その残差逸脱度（即ち、−部分対数尤度×２）はＲＤ１＝４９２．８７７４に等しい。
【０１６０】
【表７】
【０１６１】
モデル２ 臨床的変数及び最小シグネチャーを用いた多変量分析
モデル２は、ｎ＝１５９の観察結果を用いて得た。その残差逸脱度（即ち、−部分対数尤度×２）はＲＤ２＝４８６．８３６９に等しい。
【０１６２】
【表８】
【０１６３】
モデル１とモデル２とを比較して、最小シグネチャーが臨床的変数以上の追加の予後情報を加えるかどうかを評価できる。特に、これは、モデル２（ＲＤ２＝４８６．８３６９）の残差逸脱度からモデル１（ＲＤ１＝４９２．８７７４）の残差逸脱度を差し引き、この差（ＲＤ１−ＲＤ２＝６．０４０４３）を自由度１のχ二乗分布に対比して検定することによって、得られる。この差は自由度１のχ二乗分布の０．９５クオンタイルを超える（ｐ値＝０．０１３９８）ので、最小シグネチャーは無再発生存率の有意な予測因子であり、標準的な臨床的予測因子以上の新しい予後情報を加える。
【０１６４】
【表９】
【０１６５】
更に、最小シグネチャーは、多変量モデルだけでなく、任意の単一の臨床的予測因子を用いて作成された任意のモデルにも予後値を加える。実際、単一の臨床的変数及び最小シグネチャー（例えば、腫瘍直径＋最小シグネチャー）を用いて得られたモデルの残差逸脱度と、１つの臨床的変数のみを用いて得られたモデルの残差逸脱度との差は、いずれの臨床的予測因子の場合も有意である。
【０１６６】
前記データから、本発明が、転移リスクを評価するための追加的な予後診断ツールを提供し、したがって、補助療法が有効な患者を特定することが確認された。
【０１６７】
更に、好適例は、腫瘍の大部分に相当し、予後が不確かな、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍスケールによって中程度（グレード２）に分類される腫瘍（Ｉｖｓｈｉｎａら、２００６年）である。複数の独立したデータセットのグレード２の腫瘍に適用する場合、最小シグネチャーはこれらの患者を、それぞれグレード１及びグレード３に相当する転帰を有する２つ群に分割した（図７）。この結果は、全ての他の、更に複雑な分子的方法によっては得られなかったものであり、したがって本発明に特有である。
【０１６８】
参考文献
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Ｄｅｃｋｅｒｓ， Ｍ．， ｖａｎ Ｄｉｎｔｈｅｒ， Ｍ．， Ｂｕｉｊｓ， Ｊ．， Ｑｕｅ， Ｉ．， Ｌｏｗｉｋ， Ｃ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｕｉｊｍ， Ｇ．， ａｎｄ ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ， Ｐ． （２００６）． Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｓｍａｄ４ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｏ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６， ２２０２−２２０９．
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Ｆａｎ， Ｃ．， Ｏｈ， Ｄ．Ｓ．， Ｗｅｓｓｅｌｓ， Ｌ．， Ｗｅｉｇｅｌｔ， Ｂ．， Ｎｕｙｔｅｎ， Ｄ．Ｓ．， Ｎｏｂｅｌ， Ａ．Ｂ．， ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ， Ｌ．Ｊ．， ａｎｄ Ｐｅｒｏｕ， Ｃ．Ｍ． （２００６）． Ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３５５， ５６０−５６９．
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ｔ Ｈｏｅｎ， Ｐ．Ａ．， Ａｒｉｙｕｒｅｋ， Ｙ．， Ｔｈｙｇｅｓｅｎ， Ｈ．Ｈ．， Ｖｒｅｕｇｄｅｎｈｉｌ， Ｅ．， Ｖｏｓｓｅｎ， Ｒ．Ｈ．， ｄｅ Ｍｅｎｅｚｅｓ， Ｒ．Ｘ．， Ｂｏｅｒ， Ｊ．Ｍ．， ｖａｎ Ｏｍｍｅｎ， Ｇ．Ｊ．， ａｎｄ ｄｅｎ Ｄｕｎｎｅｎ， Ｊ．Ｔ． （２００８）． Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｓ ｍａｊｏｒ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ， ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒ−ｌａｂ ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｖｅｒ ｆｉｖｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６， ｅ１４１．
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Ｉｒｉｚａｒｒｙ， Ｒ．Ａ．， Ｂｏｌｓｔａｄ， Ｂ．Ｍ．， Ｃｏｌｌｉｎ， Ｆ．， Ｃｏｐｅ， Ｌ．Ｍ．， Ｈｏｂｂｓ， Ｂ．， ａｎｄ Ｓｐｅｅｄ， Ｔ．Ｐ． （２００３）． Ｓｕｍｍａｒｉｅｓ ｏｆ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ ｐｒｏｂｅ ｌｅｖｅｌ ｄａｔａ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１， ｅ１５．
Ｉｖｓｈｉｎａ， Ａ．Ｖ．， Ｇｅｏｒｇｅ， Ｊ．， Ｓｅｎｋｏ， Ｏ．， Ｍｏｗ， Ｂ．， Ｐｕｔｔｉ， Ｔ．Ｃ．， Ｓｍｅｄｓ， Ｊ．， Ｌｉｎｄａｈｌ， Ｔ．， Ｐａｗｉｔａｎ， Ｙ．， Ｈａｌｌ， Ｐ．， Ｎｏｒｄｇｒｅｎ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （２００６）． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｇｒａｄｅ ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ ｎｅｗ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６， １０２９２−１０３０１．
Ｌｉ， Ｙ．， Ｘｉｅ， Ｍ．， Ｓｏｎｇ， Ｘ．， Ｇｒａｇｅｎ， Ｓ．， Ｓａｃｈｄｅｖａ， Ｋ．， Ｗａｎ， Ｙ．， ａｎｄ Ｙａｎ， Ｂ． （２００３）． ＤＥＣ１ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＥＣ２ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｅ−ｂｏｘ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７８， １６８９９−１６９０７．
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Ｍｉｎｎ， Ａ．Ｊ．， Ｇｕｐｔａ， Ｇ．Ｐ．， Ｓｉｅｇｅｌ， Ｐ．Ｍ．， Ｂｏｓ， Ｐ．Ｄ．， Ｓｈｕ， Ｗ．， Ｇｉｒｉ， Ｄ．Ｄ．， Ｖｉａｌｅ， Ａ．， Ｏｌｓｈｅｎ， Ａ．Ｂ．， Ｇｅｒａｌｄ， Ｗ．Ｌ．， ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ， Ｊ． （２００５）． Ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｔｏ ｌｕｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ４３６， ５１８−５２４．
Ｐａｄｕａ， Ｄ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ．Ｈ．， Ｗａｎｇ， Ｑ．， Ｎａｄａｌ， Ｃ．， Ｇｅｒａｌｄ， Ｗ．Ｌ．， Ｇｏｍｉｓ， Ｒ．Ｒ．， ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ， Ｊ． （２００８）． ＴＧＦｂｅｔａ ｐｒｉｍｅｓ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ ｆｏｒ ｌｕｎｇ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｓｅｅｄｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｌｉｋｅ ４． Ｃｅｌｌ １３３， ６６−７７．
Ｐａｗｉｔａｎ， Ｙ．， Ｂｊｏｈｌｅ， Ｊ．， Ａｍｌｅｒ， Ｌ．， Ｂｏｒｇ， Ａ．Ｌ．， Ｅｇｙｈａｚｉ， Ｓ．， Ｈａｌｌ， Ｐ．， Ｈａｎ， Ｘ．， Ｈｏｌｍｂｅｒｇ， Ｌ．， Ｈｕａｎｇ， Ｆ．， Ｋｌａａｒ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２００５）． Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｓｐａｒｅｓ ｅａｒｌｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ： ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｉｎ ｔｗｏ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｃｏｈｏｒｔｓ． Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７， Ｒ９５３−９６４．
Ｐｉｃｃｏｌｏ， Ｓ．， Ａｇｉｕｓ， Ｅ．， Ｌｅｙｎｓ， Ｌ．， Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ， Ｓ．， Ｇｒｕｎｚ， Ｈ．， Ｂｏｕｗｍｅｅｓｔｅｒ， Ｔ．， ａｎｄ Ｄｅ Ｒｏｂｅｒｔｉｓ， Ｅ．Ｍ． （１９９９）． Ｔｈｅ ｈｅａｄ ｉｎｄｕｃｅｒ Ｃｅｒｂｅｒｕｓ ｉｓ ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ Ｎｏｄａｌ， ＢＭＰ ａｎｄ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３９７， ７０７−７１０．
Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｋ．Ｓ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ， Ｍ．Ｊ． （２００５）． Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄａｔａ ｗｉｔｈ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｒ． Ｕ．Ｃ． Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｐａｐｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｐａｐｅｒ １６７．
Ｐｒｅｎｔｉｃｅ， Ｒ．Ｌ．， Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ， Ｌ． Ａ． （１９７８）． Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｒｏｕｐｅｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｄａｔａ ｗｉｔｈ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｄａｔａ． Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ３４， ５７−６７．
Ｓｉｎｇｌｅｔａｒｙ， Ｓ．Ｅ．， ａｎｄ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ， Ｊ．Ｌ． （２００６）． Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｇｉｎｇ： ｗｏｒｋｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｉｘｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＪＣＣ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ． ＣＡ： ａ ｃａｎｃｅｒ ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ５６， ３７−４７．
Ｓｏｔｉｒｉｏｕ， Ｃ．， Ｗｉｒａｐａｔｉ， Ｐ．， Ｌｏｉ， Ｓ．， Ｈａｒｒｉｓ， Ａ．， Ｆｏｘ， Ｓ．， Ｓｍｅｄｓ， Ｊ．， Ｎｏｒｄｇｒｅｎ， Ｈ．， Ｆａｒｍｅｒ， Ｐ．， Ｐｒａｚ， Ｖ．， Ｈａｉｂｅ−Ｋａｉｎｓ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． （２００６）． Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ： ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｇｒａｄｅ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ９８， ２６２−２７２．
Ｓｔｏｒｅｙ， Ｊ．Ｄ． （２００２）． Ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ−Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ６４， ４７９−４９８．
Ｔｕｓｈｅｒ， Ｖ．Ｇ．， Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ， Ｒ．， ａｎｄ Ｃｈｕ， Ｇ． （２００１）． Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８， ５１１６−５１２１．
ｖａｎ ’ｔ Ｖｅｅｒ， Ｌ．Ｊ．， Ｄａｉ， Ｈ．， ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ， Ｍ．Ｊ．， Ｈｅ， Ｙ．Ｄ．， Ｈａｒｔ， Ａ．Ａ．， Ｍａｏ， Ｍ．， Ｐｅｔｅｒｓｅ， Ｈ．Ｌ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｏｙ， Ｋ．， Ｍａｒｔｏｎ， Ｍ．Ｊ．， Ｗｉｔｔｅｖｅｅｎ， Ａ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （２００２）． Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ ４１５， ５３０−５３６．
ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ， Ｍ．Ｊ．， Ｈｅ， Ｙ．Ｄ．， ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ， Ｌ．Ｊ．， Ｄａｉ， Ｈ．， Ｈａｒｔ， Ａ．Ａ．， Ｖｏｓｋｕｉｌ， Ｄ．Ｗ．， Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｇ．Ｊ．， Ｐｅｔｅｒｓｅ， Ｊ．Ｌ．， Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｃ．， Ｍａｒｔｏｎ， Ｍ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２００２）． Ａ ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４７， １９９９−２００９．
Ｗａｎｇ， Ｘ．Ｊ．， Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ， Ｄ．Ａ．， Ｊｉａｎｇ， Ａ．， Ｈｅ， Ｄ．， Ｚｈｏｎｇ， Ｌ．， Ｍｅｄｉｎａ， Ｄ．， Ｂｒｉｎｋｌｅｙ， Ｂ．Ｒ．， ａｎｄ Ｒｏｏｐ， Ｄ．Ｒ． （１９９８）． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｐ５３ ｍｕｔａｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７， ３５−４５．
Ｗａｒｄ， Ｊ．Ｈ． （１９６３）． Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐｉｎｇ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ａｎ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ３０１， ９．
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、核酸又はタンパク質レベルに基づく分子的方法によって、乳癌（ｂｒｅａsｔ ｃａｎｃｅｒ）の再発に有用な情報を提供する最小遺伝子シグネチャー（ｇｅｎｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）に関する。
【０００２】
［背景技術］
乳癌は女性において最も多く見られる癌である。米国では、８人に１人の女性が、８５才までに何らかのタイプの乳癌を発症すると推測される。
【０００３】
大部分の乳癌腫（ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の腫瘍発生メカニズムはほとんど不明であるが、一部の女性に乳癌を発症しやすくする可能性のある遺伝因子がある（Ｍｉｋｉら、１９９４年）。最近になって、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の発見及び特性決定により、家族性乳癌の一因となり得る遺伝因子に関する我々の知識は広がったが、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２と関連するのは乳癌のわずか約５〜１０％である。ＢＲＣＡ１は、ゲノム安定性の維持に重要であるＤＮＡ修復及び細胞周期制御に関与する腫瘍抑制遺伝子である。ＢＲＣＡ１と同様に、ＢＲＣＡ２も乳癌の発症に関与し、ＤＮＡ修復の一翼を担うが、ＢＲＣＡ１とは異なり、卵巣癌には関与しない。他の遺伝子、例えば、ｃ−ｅｒｂ−２（ＨＥＲ２）及びｐ５３も乳癌と関連づけられた（Ｂｅｅｎｋｅｎら、２００１年）。ｃ−ｅｒｂ−２（ＨＥＲ２）及びｐ５３の過剰発現は予後不良と相関性があった。
【０００４】
しかし、今日まで、乳癌と一貫して関連する臨床的に有用な他のマーカーはいずれも、散発性腫瘍、即ち、乳癌の大半を占める、既知の生殖細胞系列変異と現在のところ関連づけられていない腫瘍については確認されていない。
【０００５】
臨床診療では、治療の選択肢、予後診断及び治療反応の可能性は全て、診断によって広く変わってくるので、乳癌の種々のサブタイプの正確な診断が重要である。乳癌の罹患率及び死亡率は、癌の進行の早期に検出されない場合には著しく増加するため、乳癌においては、早期診断及びリスク層別化が極めて重要である。無遠隔転移生存率の正確な診断又は判定がなされれば、腫瘍学者は補助化学療法の適用を個人に合わせてすることができ、予後のより不良な女性に最も積極的な治療を施すことができるであろう。更に、研究対象となりそうな患者を予後診断に従って層別化することができるので、予後不良の正確な予測は新しい乳癌療法の臨床試験に大きな影響を及ぼすであろう。
【０００６】
典型的には、乳癌の診断には、腫瘍の存在の組織病理学的証拠が必要である。診断に加えて、組織病理学検査も、予後及び治療計画の選択に関する情報を提供する。腫瘍サイズ、腫瘍グレード、患者の年齢、及び腫瘍細胞によるリンパ節コロニー形成などの臨床パラメーターに基づいて、予後を確立する場合もある。
【０００７】
診断及び／又は予後診断は、有効性の程度の差はあるが、乳房の外側の直接検査によって又はマンモグラフィー若しくは他のＸ線撮影方法を通して確定できる。しかし、後者のアプローチには、社会的費用及び個人的費用がかなり伴う。
【０００８】
最近になって、ＦＤＡは、ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒの発表された研究（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、２００２年）に基づいて新鮮又は凍結乳癌生検材料において測定された７０個超の遺伝子のｃＤＮＡのマイクロアレイ分析による、乳癌予後診断のための遺伝子発現プロファイリング検査システム、マンマプリント（ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ）（登録商標）を承認した。
【０００９】
この検査は医師専用であるが、やはり、ＤＮＡバイオアナライザー／マイクロアレイスキャナーなどの特殊な計測手段で実施する必要がある。結果は大病院又はこのような複雑な分析を実施する手段及び標準手順を開発した会社しか提供できないので、これは大きな欠点である。
【００１０】
前記から、わずか２つの遺伝子の発現分析の予測予後値に基づく本発明の利点は、容易に理解できる。
【００１１】
１０個の遺伝子の同時分析は実のところアレイ技術を必要とするが、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）Ｇ２（ＣＣＮＧ２）及びＳｈａｒｐ１（ＢＨＬＨＢ３、ＢＨＬＨＥ４１）の発現の単純な評価にはアレイ技術は必要ない。他の側面から見ると、原発性塊（ｐｒｉｍａｒｙ ｍａｓｓ）の評価、リンパ節転移及び癌の病期診断のような、標準的な乳癌予後診断法は、現在では疾患の進行の予測に不十分である。従来の組織学的方法とこの最小シグネチャーによる腫瘍の分子的特性決定とを結びつけることにより、カノニカル基準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｃｒｉｔｅｒｉａ）によって中等度の侵襲（ｍｅｄｉｕｍ−ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）と定義される癌の場合に特に、疾患経過及び再発リスクを予測する、精巧で費用のかからない方法が可能になるであろう。
【００１２】
［発明の概要］
本発明は、試料中のサイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ（Ｇｅｎｅ ＩＤ）＝９０１）遺伝子発現レベルを単独で又はＳｈａｒｐ１（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）遺伝子発現レベルと組み合わせて検出するステップを含む、乳癌患者の再発リスクの評価方法に関する。この検出は、前記試料中の（１つ又は複数の）遺伝子の発現に直接関与するシグナルを測定するステップと、前記シグナルを取得するステップと、乳癌患者の癌再発リスクを評価するステップとを含み、乳癌患者の癌再発リスクを評価する前記ステップを、未知試料中のサイクリンＧ２遺伝子発現値単独のシグネチャースコア又は好ましくはサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両遺伝子発現値のシグネチャースコアを計算することによって行い、前記シグネチャースコアは
【数１】
［式中、
サイクリンＧ２を単独で用いる場合にはＫ＝１であり、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両方を用いる場合にはＫ＝２であり、
【数２】
は未知試料ｉ中のサイクリンＧ２又はＳｈａｒｐ１の発現レベルであり、
【数３】
はそれぞれ、病歴が知られている母集団におけるサイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１の発現レベルの推定平均値及び推定標準偏差値を表す］
と定義され、０未満のシグネチャースコアは乳癌再発リスクの増大を示す。
【００１３】
検出は、分子的手段及び／又は免疫学的手段によって実施できる。この場合、分子的手段とは、ＰＣＲ、マイクロアレイ分析又はノーザンブロットなどの、核酸に基づくアッセイを意味する。
【００１４】
この方法は、
取得シグナルを品質管理するステップと、
シグナルを正規化するステップと、
任意選択で、取得シグナルを再スケーリングするステップと
による、シグナルの統計分析を更に含み、好ましくは、コンピューターで実行されるソフトウェアによって実施する。
【００１５】
本発明は、乳癌患者からの試料においてサイクリンＧ２発現を単独で又はＳｈａｒｐ１発現と組み合わせて評価し、乳癌再発リスクを測定するためのキットであって、好ましくは
サイクリンＧ２特異的試薬、好ましくは配列番号１に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するオリゴヌクレオチド、
Ｓｈａｒｐ１特異的試薬、好ましくは配列番号２に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するオリゴヌクレオチド、
前記方法に関して定義された計算に従って、未知試料のシグネチャースコアを計算し、未知試料を、シグネチャースコアが負の場合には最小シグネチャー低群に又はシグネチャースコアが正である場合には最小シグネチャー高群に分類するための使用説明書
を含み、最小シグネチャー低群への分類が乳癌患者の高い癌再発リスクを示すキットを更に提供する。
【００１６】
好ましい一実施形態によれば、前記使用説明書はソフトウェアによって実施される。任意選択で、キットは、参照標準として、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１標準発現対照高及び低を発現値又は核酸試料として更に含むことができる。前記発現値又は核酸試料は好ましくはそれぞれ、非転移性乳癌細胞株及び／又は高転移性細胞株に由来する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】変異型ｐ５３発現がＴＧＦβプロ遊走性（ｐｒｏ−ｍｉｇｒａｔｏｒｙ）応答を促進することを示す図である。 （Ａ）Ｈ１２９９細胞溶解物−親の、即ち、ｐ５３欠損発現（欠損）又は変異型ｐ５３（ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ）のウェスタンブロット。Ｓｍａｄ３リン酸化（Ｐ−Ｓｍａｄ３）によって観察されるように、ＴＧＦβシグナル伝達カスケード（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅ）は、いずれの細胞株においても同様に活性である。ラミンＢ（Ｌａｍｉｎ−Ｂ）は、添加対照（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）である。 （Ｂ）Ｈ１２９９細胞の形態に対するＴＧＦβ（ＴＧＦβ ５ｎｇ／ｍｌ、２４時間）の作用。 （Ｃ）ＴＧＦβ駆動性遊走に対する変異型ｐ５３の作用を示す、Ｈ１２９９細胞の創傷治癒アッセイ。写真は、培養物スクラッチの３０時間後に撮影した。 （Ｄ）Ｈ１２９９細胞をトランスウェルメンブレン（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）上に播種した。ＴＧＦβと示されている場合、細胞はＴＧＦβ（４ｎｇ／ｍｌ）で処理された。グラフは、１６時間後にトランスウェルを通って遊走した細胞の数を示している。ｐ５３Ｒ１７５Ｈによって再構成されたＨ１２９９細胞のみが、ＴＧＦβに応答して遊走できる能力を獲得している。
【図２】乳癌ｍｄａ−ｍｂ−２３１細胞において、ＴＧＦβ駆動性浸潤及び転移に変異型ｐ５３が必要であることを示す図である。 （Ａ）ｐ５３を標的とするｓｈＲＮＡを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−ｓｈｐ５３）におけるｐ５３タンパク質欠乏を示すウェスタンブロット。ＭＤＡ ｓｈＧＦＰは対照細胞株である。 （Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株のＴＧＦβ依存性遊走のトランスウェルアッセイ。遊走の遮断に続いて起こるＳｍａｄ４欠乏によって証明されるように、この応答は、カノニカルなＳｍａｄシグナル伝達に依存する。これらの細胞においてその固有遺伝座（ｎａｔｕｒａｌ ｌｏｃｕｓ）から発現される内因性変異型ｐ５３が、この作用には必要である。 （Ｃ）１滴のマトリゲル中に埋め込まれたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤活性のアッセイ。パネルは、同一視野の異なる時点での写真を示す。点線は、マトリゲル液滴の縁端部を強調している。対照細胞のみが、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）を回避する能力を有する（矢印）。このプロセスは、ＴＧＦβＲ１阻害剤ＳＢ４３１５４２（５μＭ）での処理によって遮断されるので、ＴＧＦβシグナル伝達に依存する。ＭＤＡ ｓｈｐ５３細胞は、基質分解及び回避についての機能が損なわれている。 （Ｄ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、マトリゲル（登録商標）中にひとたび埋め込まれると、３Ｄ培養条件において紡錘形を呈する（上部パネル）。矢頭は葉状仮足の突起を示している。逆に、ＭＤＡ ｓｈｐ５３は、接着性敷石状細胞のクラスターを形成した（下部パネル）。ＴＧＦβシグナル伝達の阻害は、変異型ｐ５３欠損の表現型効果と一致する（データは示さず）。 （Ｅ及びＦ）ＳＣＩＤマウスの脂肪体にＭＤＡ ｓｈＧＦＰ又はＭＤＡ ｓｈｐ５３細胞を注射した。（Ｅ）原発腫瘍の増殖速度は、２つの細胞集団間で同様であった。（Ｆ）リンパ節転移のスコアが陽性であったマウスの数。 （Ｇ、Ｈ及びＩ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を尾静脈に注射後の肺コロニー形成アッセイ（各細胞株のマウスのｎ＝１０、１×１０６細胞／マウス）。パネルは、ＭＤＡ ｓｈＧＦＰ（Ｇ）又はＭＤＡ ｓｈｐ５３（Ｈ）を注射されたマウスからの肺切片における、ヒトサイトケラチンに代表的な免疫組織化学染色を示している。（Ｉ）グラフは、対照（ｓｈＧＦＰ）及び２つの独立したＭＤＡ ｓｈｐ５３クローン細胞株による肺実質の浸潤を数値化している。
【図３】転移性乳癌細胞における、ＴＧＦβ／変異株−ｐ５３の下流の新種の候補転移抑制因子の同定を示す図である。 （Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のマイクロアレイ分析からのＴＧＦβ標的遺伝子の概略。グラフは、ＭＤＡ ｓｈＧＦＰ細胞株及びＭＤＡ ｓｈｐ５３細胞株の両者における、ＴＧＦβによって制御される遺伝子の機能分類を示す。多くの遺伝子は、細胞浸潤、遊走及び転移（「浸潤プログラム」）に関与するタンパク質をコードする。 （Ｂ）ＴＧＦβ及び変異型ｐ５３によって同時制御される、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の遺伝子。表は、マイクロアレイ発現データからの、示された遺伝子に関するＴＧＦβ誘導レベルを示している。ＭＤＡ ｓｈＧＦＰ試料とＭＤＡ ｓｈｐ５３試料との誘導倍率の差は、ｑ値によって示されるように、統計的に有意である。 （Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＴＧＦβの変異型ｐ５３依存性標的としてのＡＤＡＭＴＳ９、Ｓｈａｒｐ１、サイクリンＧ２、フォリスタチン及びＧＰＲ８７のノーザンブロットによる検証。（＋）と示されている場合、細胞はＴＧＦβ１で２時間処理された。ＧＡＰＤＨは添加対照である。 （Ｄ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＴＧＦβ及び変異型ｐ５３によるＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２発現の制御。ＴＧＦβ１で２時間処理された又は処理されなかったＭＤＡ ｓｈＧＦＰ細胞及びＭＤＡ ｓｈｐ５３細胞のノーザンブロット分析。ＧＡＰＤＨは添加対照である。いずれの遺伝子も、対照細胞ではＴＧＦβによって下方制御されるが、変異型ｐ５３ノックダウン後は下方制御されない。 （Ｅ）Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２は、遊走制御におけるＴＧＦβ／変異型ｐ５３の重要なエフェクターである。示されたｓｉＲＮＡによって一過性に形質転換されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のトランスウェル遊走アッセイ。変異型ｐ５３欠損細胞中における、ＴＧＦβ駆動性遊走の障害は、Ｓｈａｒｐ１又はサイクリンＧ２の同時欠損によってレスキューされることができる。β−アクチンは添加対照である。
【図４】乳癌再発の有力な予測因子としての最小シグネチャーの臨床的検証を示す図である。 ９４０個を超える腫瘍をまとめる５つの独立したデータセットのパネル上での最小シグネチャー（Ｓｈａｒｐ１＋サイクリンＧ２）の予測力の検証（これらのデータの完全記述については表３を参照のこと）。ＮＫＩデータセット（図６を参照のこと）を別に分析した。これらの分析は、ボックスプロットグラフによって視覚化された両遺伝子の一貫した低い又は高い発現によって、腫瘍試料を２つの群に分ける。「低」（青）及び「高」（赤）はそれぞれ、最小シグネチャー低群及び最小シグネチャー高群の呼称である。 左側のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフは、分析された乳癌データセットにおいて、最小シグネチャーに従って層別化された患者に転移がないままである、再発がないままである又は疾患がないままである可能性を示している。ログランク検定のｐ値は、最小シグネチャー高とより長期の生存率との有意な関連を示している。最小シグネチャー低群及び最小シグネチャー高群を生じる教師なしのクラスタリング法（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いても、同様な結果が得られた（データは示さず）。 右側は、比較のための、７０遺伝子シグネチャー（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、２００２年）に従って層別化された同一腫瘍データからのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率グラフ。
【図５】最小シグネチャーが、骨及び肺の遠隔転移リスクのいずれにも関連することを示す図である。 Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線は、最小シグネチャーに従って層別化されたＭＳＫ試料（Ｍｉｎｎら、２００５年）の肺（左側）及び骨（右側）への転移がないままである可能性を示している。最小シグネチャーは、両器官に特異的な転移事象に関する統計的に有意な予測力を有する。
【図６】サイクリンＧ２発現の分析が、ＮＫＩデータセットにおける無転移生存率の予測に十分であることを示す図である。 ＮＫＩデータセット（試料数２９５）においては、わずか１つのサイクリンＧ２の発現データを用いて転移傾向に従って腫瘍を分類することができる。Ｓｈａｒｐ１発現データはＮＫＩデータセットからは入手できないので、本発明者らは、予後良好患者の比率に基づいてサイクリンＧ２発現の閾値を設定した（詳細については、「実験手順」を参照のこと）。サイクリンＧ２に関するボックスプロット及びＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの無転移生存率曲線は、この閾値を用いて得られる。
【図７】最小シグネチャーが、グレード２の腫瘍を、異なる転帰を有する２つの群に分割することを示す図である。 Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ組織学的スケールに従って層別化されたＳｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｕｐｐｓａｌａ及びＮＫＩデータセットからの患者について、再発がないままである、疾患がないままである又は転移がないままである可能性を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線（グレード１ 点線、グレード２ バイオレット色ライン、グレード３ 破線）。最小シグネチャーを適用することよって、グレード２の腫瘍（実線）を更に２つの群に分けた（赤色ライン−グレード２及び最小シグネチャー高、青色ライン−グレード２及び最小シグネチャー低）。特筆すべきは、高群及び低群がそれぞれ、グレード１又はグレード３の患者と同様な無再発生存率を示したことである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義及び略語
ＣＣＮＧ２とも称するサイクリンＧ２は、遺伝子ＩＤ＝９０１（配列番号１）によって同定される。ＤＥＣ２、ＢＨＬＨＢ３、ＢＨＬＨＥ４１とも称するＳｈａｒｐ１（塩基性ヘリックスループヘリックスドメインを含む）は、遺伝子ＩＤ＝７９３６５（配列番号２）によって同定される。
【００１９】
テンプレート
最小シグネチャーのテンプレートは、病歴が知られている患者からの腫瘍試料の母集団においてサイクリンＧ２の単独の又は好ましくはＳｈａｒｐ１と組み合わせた発現レベルを測定することによって得られる。
【００２０】
テンプレートは、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１発現基準（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅ）の決定に使用されるそれぞれの異なるアッセイに関して計算する。
【００２１】
いずれの遺伝子発現レベルを測定する場合にも、テンプレートは、
【数４】
即ち、母集団又はデータセットにおけるサイクリンＧ２発現レベル及び好ましくはＳｈａｒｐ１発現レベルの平均値及び標準偏差によって表す。
【００２２】
非浸潤性及び転移性乳癌を代表する２つの細胞株、ＢＴ２０（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１９）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３０）におけるサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１、又は他の代表的な高標準発現対照及び低標準発現対照の発現レベルを好ましくは、テンプレートの母集団値に加える。
【００２３】
標準発現対照
標準発現対照とは、非浸潤性及び転移性乳癌試料又は細胞株、例えば、ＢＴ２０（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１９）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３０）におけるサイクリンＧ２の単独の又はＳｈａｒｐ１と組み合わせた発現値、又は他の代表的な高い及び低いサイクリンＧ２の単独の又はＳｈａｒｐ１と組み合わせた発現標準の発現値を意味する。
【００２４】
シグネチャースコア（又は発現スコア）
シグネチャースコアは、テンプレートと比較した未知試料中のサイクリンＧ２発現値及び好ましくは更にＳｈａｒｐ１発現値間の差を数値化する。
【００２５】
シグネチャースコアは一般に、
【数５】
［式中、
サイクリンＧ２を単独で用いる場合にはＫ＝１であり、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両方を用いる場合にはＫ＝２であり、
【数６】
は未知試料ｉ中のサイクリンＧ２又はＳｈａｒｐ１の発現レベルであり、
【数７】
はそれぞれ、病歴が知られている母集団におけるサイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１の発現レベルの推定平均値及び推定標準偏差値を表す］
と定義される。
【００２６】
組み合わせて測定されるサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１発現については、
【数８】
＝サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の組合せのシグネチャースコア
［式中、
【数９】
は未知試料ｉ中のＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の発現レベルであり、
【数１０】
はそのテンプレートを定義する］。
【００２７】
最小シグネチャーテンプレートが、サイクリンＧ２単独の発現レベルを測定することによって得られる場合には、シグネチャースコアは、
【数１１】
［式中、
【数１２】
は未知試料ｉ中のサイクリンＧ２の発現レベルであり、
【数１３】
はそのテンプレートを定義する］
として計算される。
【００２８】
最小シグネチャー
最小シグネチャー高は、０より高いシグネチャー（発現）スコアと定義する。
最小シグネチャー低は、０より低いシグネチャー（発現）スコアと定義する。
【００２９】
再発
再発は、乳癌に関連する転移（より一般的には肺又は骨への転移）の発症又は原発性腫瘍手術から１２年以内の乳癌再発と定義する。
【００３０】
対照
アッセイ対照−当業者に知られている「アッセイ対照」は、アッセイが一貫した結果を生じると信頼できる根拠となる、シグナルの基準及び取得の信頼性を評価する。例えば、ＰＣＲに関する陽性「アッセイ対照」は、プライマーを使用するＰＣＲが、期待される長さのＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の増幅をもたらすと予想される既知の核酸混合物である。
内部発現対照−この用語は一般に、ハウスキーピング遺伝子発現対照を示すのに用いる。
【００３１】
［詳細な説明］
本発明は、ｐ５３の変異対立遺伝子がＴＧＦβと協同して、そのプロ浸潤応答及び悪性腫瘍応答を持続するという実験的証拠に基づく。実際に、変異型ｐ５３発現はインビトロの浸潤及びインビボの転移拡散に必要であり、このことは、乳癌の進行におけるこれらの２つの経路間の、これまで確認されていない関連性を明らかにしている。
【００３２】
変異型ｐ５３の方法でＴＧＦβによって活性化されるプロ浸潤経路は、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１遺伝子のダウンレギュレーションを伴う。これらの遺伝子のより低い発現レベルは乳癌のプロ浸潤挙動と、ひいてはより高い癌再発リスクと相関する。
【００３３】
本発明は、サイクリンＧ２が単独で又はサイクリンＧ２がＳｈａｒｐ１と一緒になって（サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１を以下で最小シグネチャー（ＭＳ）と称する）、より複雑な遺伝子セット予測因子に匹敵する予測力を有することを示す。この評価に関与する遺伝子は少数であるため、本発明は、一般に使用される技術及び単純なＰＣＲ装置によって実施できる。
【００３４】
最小シグネチャーと乳癌再発又は転移拡散との相関が、これら２つの遺伝子の発現レベルを用いたいくつかの乳癌データセットに関する統計分析によって確認されたが、１つのデータベースでは、サイクリンＧ２が単独で癌再発を予測することを示した。
【００３５】
この方法は、複数の、好ましくは少なくとも５０〜１００名の、臨床経過観察が知られている腫瘍患者又は入手可能な乳癌患者データセットから、サイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）の発現レベルを好ましくはＳｈａｒｐ１（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）の発現レベルと組み合わせて用いた、大量の最小シグネチャーテンプレートに基づく。
【００３６】
本発明は、未知試料中のサイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）遺伝子発現レベルを単独で又はＳｈａｒｐ１（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）遺伝子発現レベルと組み合わせて検出するステップを含む、乳癌患者の再発リスクを評価する方法を開示する。
【００３７】
本発明は好ましくは、
（ａ）乳癌患者からの試料中のサイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）の遺伝子発現レベルを、好ましくは（１つ又は複数の）Ｓｈａｒｐ１（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）の遺伝子発現レベルと組み合わせて検出する（即ち、マーカー遺伝子発現に関するシグナルを測定及び取得する）ステップと
（ｂ）未知試料中のサイクリンＧ２単独のシグネチャースコア又は好ましくはサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両方のシグネチャースコア（前記シグネチャースコアは、
【数１４】
［式中、
サイクリンＧ２を単独で用いる場合にはＫ＝１であり、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両方を用いる場合にはＫ＝２であり、
【数１５】
は未知試料ｉ中のサイクリンＧ２又はＳｈａｒｐ１の発現レベルであり、
【数１６】
はそれぞれ、病歴が知られている母集団におけるサイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１の発現レベルの推定平均値及び推定標準偏差値を表す］
と定義される）を計算するステップと
（ｃ）未知試料を、当該シグネチャースコアが０より低い場合には最小シグネチャー低群に又は当該シグネチャースコアが０より高い場合には最小シグネチャー高群に分類する（低群への割り付けは高い再発リスクと相関する）ステップと
を含む、乳癌患者の「癌再発」リスクを評価するための方法を含む。
【００３８】
試料は、乳癌生検材料又はリンパ節及び組織切片又は核酸、好ましくはこのような試料から単離されるｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡであることができる。
【００３９】
サイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）を単独で又は好ましくはＳｈａｒｐ１と組み合わせて測定する本発明の方法の高い予測力は、これがＴＧＦβによって制御される４００個を超える遺伝子より優れたわずか２つの遺伝子のシグネチャーであること及び既に提示されているシグネチャーは全て、本発明による２つの遺伝子をいずれも含まず、乳癌再発に関するその予後診断的使用は本明細書中に初めて記載されることから、特に驚くべきことである。
【００４０】
最小シグネチャーテンプレートは、臨床データ及び５〜１２年の生存可能期間が知られている患者の母集団から遺伝子発現データ（即ち、サイクリンＧ２及び好ましくはＳｈａｒｐ１も）を収集することよって用意する。
【００４１】
未知試料中の１つ又は好ましくは２つのマーカー遺伝子の検出を好ましくは、各遺伝子の高発現レベル標準のための対照（対照高 サイクリンＧ２及び対照高 Ｓｈａｒｐ１）及び低発現レベル標準のための対照（対照低 サイクリンＧ２及び対照低 Ｓｈａｒｐ１）において、同時に同一試薬を用いて行う。
【００４２】
標準発現対照高及び低はそれぞれ、既知の患者から又は非浸潤性若しくは転移性乳癌を代表する細胞株（例えば、それぞれ、ＢＴ２０又はＭＤＡ−ＭＢ−４３６）から得ることができる。ＢＴ２０（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１９）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３０）はそれぞれ、非浸潤性及び転移性乳癌を代表する２つの異なる乳癌細胞株である。ＢＴ２０は高レベルの両遺伝子を発現し、逆に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６においてはＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２がダウンレギュレーションされる。したがって、これら２つの細胞株は、入手しやすい高（ＢＴ２０）及び低（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６）標準発現対照を提案されている方法に提供することができる。
【００４３】
更に、正規化のための少なくとも１つの内部発現対照を、同じ反応で測定する。
【００４４】
内部発現対照の選択は、発現レベルの観察に使用される実験技術に左右される。発現データの正規化は、マイクロアレイを用いる場合は計算的方法（全ての遺伝子の平均発現レベルへのスケーリング又はクオンタイル正規化（ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）として）に又は核酸に基づく分子技法、即ち、ＰＣＲ若しくはノーザンブロットの場合は内部対照の発現レベルに基づくことができる。この目的で、例えばＰＣＲに一般に使用されるハウスキーピング遺伝子は、構成的に発現されるＧＡＰＤＨ、β−アクチンなどの中から選択される。免疫検出に基づく方法の場合には、内部対照は好ましくは、ラミンＢ又はＧＡＰＤＨ免疫活性の中から選択する。また、当業者によって知られている更なるアッセイ対照を好ましくは、ステップａ）及びｂ）の信頼性を評価するために前記方法に含めて、アッセイが一貫した結果を生じると信頼できる根拠となる対照を提供する。例えば、ＰＣＲに関する陽性アッセイ対照は、プライマーを使用するＰＣＲが、期待される長さのＤＮＡ断片の増幅をもたらすと予想される既知の核酸混合物である。
【００４５】
サイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１遺伝子発現レベルの測定は、任意の既知の最新の方法によって、例えば、分子選択（即ち、選択的増幅又はハイブリダイゼーション）に基づく分子的手段によって及び／又は免疫学的手段によって評価する。
【００４６】
分子選択（即ち、サイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１に関する配列特異的プローブ又はプライマーとの配列特異的ハイブリダイゼーションによる選択）の後、通常は、分子量に基づく、標的化及び／又は増幅されたポリヌクレオチド分子の分離ステップ、続いて数値化（例えば、デンシトメトリー又は目視検査による）、次いで任意の最新の計算法を用いるデータ正規化（例えば、線形スケーリング又は非線形正規化、及び好ましくは標準発現対照との比較による）を行う。
【００４７】
好ましくは、試料値と最小シグネチャーテンプレートとの比較は、シグネチャースコアの計算によって実施する。
【００４８】
しかし、より一般的には、本発明は、試料中のサイクリンＧ２遺伝子の発現レベルが単独で又は好ましくはＳｈａｒｐ１遺伝子の発現レベルと組み合わさって、０より低いシグネチャースコアを明示する場合には、これが、（乳）癌再発リスクが増大した徴候を示すという定義に基づく。
【００４９】
好ましくは、１つの表現型を有する個体（例えば、未知試料）を、第２の表現型を有する他の個体（例えば、最小シグネチャーテンプレート）と比較及び／又は区別するための統計分析を用いる。好ましくは、これはソフトウェアによって実施する。
【００５０】
したがって、好ましい一実施形態によれば、本発明の方法は、記憶されたテンプレートを検索し、（１種又は複数の）マーカーの（１つ又は複数の）発現レベルシグナルによって試料のシグネチャースコアを数値化し、及び未知試料を高又は低最小シグネチャー群（前記のステップｃ）において明示された通り）に割り付ける、コンピューター上で実行されるソフトウェアによって実施されるステップｂ）とを含む。
【００５１】
より好ましくは、取得された（前記のステップａ）に従って）シグナル（発現データ）の分析は、以下の追加ステップ
アッセイ対照に基づくデータ品質管理、
遺伝子発現レベルの数値化に使用される技術による、技術によって異なるデータの正規化、
好ましくは、例えば、線形又は非線形スケーリングによる、標準発現対照に基づくデータの再スケーリング
によって実施する。
【００５２】
シグナルを好適に分析後、テンプレートを検索し、試料のシグネチャースコアを計算し、未知試料を前記の最小シグネチャー高群又は低群（ステップｃ）で定義された通り）に割り付ける。
【００５３】
シグネチャーテンプレートをコンピューター又はコンピューター可読媒体に記憶させ及びソフトウェアを予後相関シグネチャーに使用する場合には、シグネチャーテンプレートと、試料からのシグネチャースコアとを比較する。これは、言い換えれば、好適に及び好ましく分析される、試料中の２つのマーカー遺伝子のうち１つ又は両方の発現レベルを、患者からの試料又は代わりに若しくは更に、非浸潤性及び転移性乳癌を代表する細胞株からの試料を含む、予後が知られている患者からの試料のプール（即ち、通常は少なくとも５０〜１００個の試料から構成される、数的に好適な試料のプール）から測定された、最小シグネチャー中の同じ遺伝子の発現レベルの分布と比較することを意味する。
【００５４】
次に、２つのマーカー遺伝子のうち１つ又は両方の発現レベルが０より高いシグネチャースコアを決定する場合には、未知試料を、癌再発に関して予後良好と分類する。逆に、シグネチャースコアが０より低い未知試料は、ソフトウェアによって、予後不良の患者からの試料と分類される。
【００５５】
この方法は好ましくはソフトウェアによって実施するが、この実施形態に限定するものではない。実際には、高及び低発現群への割り付けは、試料の絶対的な発現シグナルを、当業者に知られた対照の存在下で目視検査することによって、並びにこれと高及び低シグネチャーテンプレート（又は前記で定義した標準発現対照）とを目視によって又は数的に比較することによっても実施できる。
【００５６】
好ましくは、比較の感度を増加させるために、発現レベルに関連するシグナルを、例えば、１組の対照遺伝子の平均発現レベルなどの種々の技術を用いることによって、正規化することができる。
【００５７】
種々の実施形態において、マーカー発現レベルは、１組の対照マーカーの発現レベルの平均値又は中央値によって正規化する（内部発現対照は、核酸に基づくアッセイの場合にはＧＡＰＤＨ又はβ−アクチン、免疫学に基づくアッセイの場合にはＧＡＰＤＨ及びラミンＢである）。
【００５８】
別の具体的な実施形態において、正規化は、マーカーレベルの標準化によって行う。発現レベルデータは任意の簡便な方法で変換できるが、好ましくは正規化及び比較の実施前に、発現シグナルを対数変換する。次いで、正規化値を、最小シグネチャーテンプレートと比較する。最小シグネチャーテンプレートは、臨床経過観察が知られている腫瘍患者の好適なプールから並びに非浸潤性及び移転性乳癌を代表する種々の乳癌細胞株（例えば、それぞれＢＴ２０及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６）から同じ実験技術及びプロトコールを用いて収集された同じマーカー遺伝子の正規化及び／又は変換発現レベルからなる。
【００５９】
一例として、マーカーがマイクロアレイのプローブによって表される場合には、各マーカーの発現レベルは、任意の非マーカー（即ち、非サイクリンＧ２及び非Ｓｈａｒｐ１）遺伝子を含むマイクロアレイ上に表される遺伝子全てにわたる発現レベルの平均値又は中央値によって正規化することができる。
【００６０】
前述のように、発現レベルの測定は、任意の既知の方法によって実施でき、分子的手段は、例えば、ＰＣＲ（スタンダードＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲ）、ノーザンブロット又はマイクロアレイ分析を含む。
【００６１】
ノーザンブロットによれば、全ＲＮＡ試料が、電気泳動によってサイズに応じて分離され、サイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１に特異的な標識プローブとのハイブリダイゼーションが行われる。
【００６２】
ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲは、予備段階として、ＲＮＡ試料からｃＤＮＡへの逆転写を含み、既知の入手可能なソフトウェアを用いる標準的な配列分析によって、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒ３．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）によって、公開されているサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の配列から同定されたＰＣＲプライマーを用いることによって実施できる。
【００６３】
本発明の、ＰＣＲに基づく分子的方法に好ましいサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１フォワード及びリバースプライマーを、好ましい内部対照遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマーも含めて、下記表に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の場合には、以下の好ましいプライマーを用いる。
【表２】
【００６６】
遺伝子発現分析の最も広く用いられている方法の１つは、（マイクロ）アレイによる。他の種類の発現データ測定の場合と同様に、未知試料の統計分析は、臨床経過観察が知られている乳癌患者からの好適な数（少なくとも５０〜１００個）の測定値を収集することによる、サイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）の単独の又は好ましくはＳｈａｒｐ１（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）と組み合わせた最小シグネチャーテンプレートの予備的評価を含む。これらのデータ、即ち、前述の最小シグネチャーテンプレートを予め定義し、関連情報を次の試料分析のためにコンピューターに記憶させることができる。
【００６７】
本発明の方法を、以下の乳癌マイクロアレイデータセットにおいて検証した。
【表３】
【００６８】
Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の同時発現スコアが高い又は低い値の２つの群のうち１つへの分類は、好ましくは、Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の標準化発現レベルを集計して平均値０の合計スコアを出すことによって実施する。
【００６９】
腫瘍は、合計スコアが負である場合には最小シグネチャー低に分類し、合計スコアが正である場合には最小シグネチャー高に分類する。
【数１７】
【数１８】
前記式中、
【数１９】
は、試料ｉ中のＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の発現レベルであり、
【数２０】
は、データセット全体にわたって計算されたＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の推定平均値及び推定標準偏差値であり、最小シグネチャーテンプレートを表す。
【００７０】
ＮＫＩデータセットの場合には、試料は、方法の予後診断妥当性の最小必要要件に相当するサイクリンＧ２データのみに基づいて、高群及び低群に分類しなければならなかった。このデータセット（腫瘍２９５個）においては、わずか１つのサイクリンＧ２に基づく層別化が、依然として転移を予測する。
【００７１】
実際に、サイクリンＧ２単独の発現レベルを、最小シグネチャーテンプレートの定義に用いる場合、腫瘍は、以下の計算：
【数２１】
【数２２】
［式中、
【数２３】
は、未知試料ｉ中のサイクリンＧ２の発現レベルであり、
【数２４】
は、テンプレートを定義する］
に従って、サイクリンＧ２スコアが負の場合には最小シグネチャー低に、サイクリンＧ２スコアが正の場合には最小シグネチャー高に分類する。
【００７２】
したがって、癌再発リスクは、最小シグネチャー低発現群について「高い」と評価される。
【００７３】
前記に簡単に記載し及び２つのマーカーの検証のための実験パートでより詳細に記載する同一の分析は、任意の新しい又は異なるデータセットについて実施することができる。したがって、更なる実施形態によれば、本発明は、サイクリンＧ２の単独の又はＳｈａｒｐ１と組み合わせた発現値を用いて、乳癌マイクロアレイデータセットを分析する方法に関する。
【００７４】
前記方法を前記データセット全てに適用することによって、特筆すべきことに、本発明の予後診断方法が、単変量のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率分析を用いて検定を行った場合に、「高」群に比較して再発をきたす有意に高い可能性を示す（ｐ値は、データセットに応じて、０．０２〜３Ｅ−０５の範囲であった）、低レベルの最小シグネチャーを発現する群において、乳癌再発の有力な予測因子であることが証明された。
【００７５】
興味深いことに、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両発現レベルに基づく最小シグネチャーは、臨床転帰による患者の層別化において、ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒらの２００２年の文献に記載された７０遺伝子プロファイルに遜色なく機能した。
【００７６】
７０個の遺伝子の代わりにわずか２つの遺伝子に基づく最小シグネチャーを用いる利点は、明らかに明白である。
【００７７】
本発明の方法の更なる利点は、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の発現が、骨及び肺への遠隔転移リスクのいずれにも統計的に相関し、したがって、続発性腫瘍形成部位とは独立していることである。
【００７８】
更に、この方法を実施できる最も簡単な方法は、ＰＣＲサーモサイクラー及びゲル電気泳動によるＤＮＡ分離用タンクなどの最小の装置のみを必要とするＰＣＲであるが、本発明はこの実施形態には限定するものではなく、乳癌再発リスクの予後マーカーとしての、サイクリンＧ２の単独の又はＳｈａｒｐ１と組み合わせた発現レベルの検出に適用される場合に、遺伝子発現レベルの測定に一般に使用される、全ての利用可能な方法に関係する。
【００７９】
したがって、本発明の方法は、
標準的ＰＣＲ技術、
リアルタイムＰＣＲ（又はＴａｑ ｍａｎ若しくはＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ技術を用いるＱ−ＰＣＲ）、
他の遺伝子に特異的な配列と場合によって組み合わされるマイクロアレイ、
他の遺伝子に特異的な配列と場合によって組み合わされるディープシーケンシング（ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ｔ Ｈｏｅｎら、２００８）、
ノーザンブロット、
サイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１に対する入手可能な抗体を用いる免疫組織化学染色、
免疫ブロット
などの、遺伝子発現分析技術のうち任意の１つに基づいて、特異的ｍＲＮＡ又はタンパク質産物について遺伝子発現レベルを測定することができる。
【００８０】
発現レベルの好ましい測定技術、定量的ＰＣＲ又は逆転写ｍＲＮＡ ＰＣＲによれば、サイクリンＧ２検出試薬は、配列番号１に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するサイクリンＧ２特異的オリゴヌクレオチドである。
【００８１】
免疫検出の場合は、好ましくは、抗サイクリンＧ２特異抗体を単独で又は抗Ｓｈａｒｐ１特異抗体と組み合わせて使用する。
【００８２】
したがって、要約すると、Ｓｈａｒｐ１発現レベルの検出も含むこの方法の好ましい実施形態によれば、特異的検出試薬は、配列番号２に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド若しくはその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するＳｈａｒｐ１特異的オリゴヌクレオチド、又は抗Ｓｈａｒｐ１特異抗体からなる群から選択される。
【００８３】
本発明の更なる実施形態は、サイクリンＧ２及び好ましくは更にＳｈａｒｐ１遺伝子発現特異的検出手段、即ち、配列番号１に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むポリ又はオリゴヌクレオチドに存するサイクリンＧ２特異的オリゴヌクレオチド又はプローブ、及び好ましくは配列番号２に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むポリ又はオリゴヌクレオチドに存するＳｈａｒｐ１特異的オリゴヌクレオチドを含む、乳癌患者の乳癌再発リスクの評価用キットである。
【００８４】
本発明の更なる実施形態として、本発明は、乳癌患者からの試料中のサイクリンＧ２の単独の又はＳｈａｒｐ１と組み合わせた発現を評価するためのキットであって、少なくともサイクリンＧ２特異的試薬、好ましくは配列番号１に由来する１３−ｍｅｒ又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチド；好ましくは更にＳｈａｒｐ１特異的試薬、好ましくは配列番号２に由来する１３−ｍｅｒ又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチド；前記で定義された最小シグネチャー高群又は低群に未知試料測定値を割り付けるため基準を特定する、未知試料を分析するための使用説明書を含むキットに関する。好ましい一実施形態によれば、統計分析並びに発現データ（試料のシグネチャースコア）と、前記で定義された最小シグネチャーテンプレートとの比較のためのソフトウェア（最小シグネチャー低群への割り付けは乳癌患者の癌再発リスクの増大と相関する）。
【００８５】
このキットは、標準発現対照としての、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１発現対照高及び低（即ち、細胞株ＢＴ２０及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６中においてそれぞれ測定されるサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１発現値）及び希釈緩衝液又はアッセイ緩衝液を更に含むことができる。
【００８６】
使用される遺伝子発現検出方法のそれぞれに有用な特異的試薬は、サイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１に対して特異的であれば、市販試薬であっても、オーダーメイドされてもよい。
【００８７】
抗体、好ましくは精製されたポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、又はオリゴヌクレオチドは、好ましくは蛍光色素、化学発光標識又は色原体で標識でき、ポリヌクレオチドは、例えば３２Ｐでの標識後にノーザンブロットに使用できる。
【００８８】
特異抗体は、直接標識することもできるし、又は二次標識抗体を用いることによって検出することもできる。
【００８９】
キットは、各試料測定値を高い若しくは低い最小シグネチャー（低い最小シグネチャーが乳癌患者の癌再発リスクの増大と相関する）に割り付けるための基準の報告に使用される使用説明書を更に含み、又は好ましくは含む。好ましくは、前記で指定した計算は、ソフトウェアで実施する。
【００９０】
キットは、陰性試料及び陽性試料に存するアッセイ対照、又は内部発現対照を検出するための試薬、並びに任意選択で核酸抽出試薬を含むことができる。
【００９１】
好ましい一実施形態によれば、サイクリンＧ２発現レベル検出のためのＰＣＲプライマー対は、サイクリンＧ２（フォワード）が５’ＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＴＧＣ３’、サイクリンＧ２（リバース）が５’ＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴＡＧＣ３’であり、Ｓｈａｒｐ１（フォワード）が５’ＧＣＡＴＧＡＡＡＣＧＡＧＡＣＧＡＣＡＣＣ３’であり、Ｓｈａｒｐ１（リバース）が５’ＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴＡＧＣ３’である。
【００９２】
比較を行うプライマーは、既知の技術によって同定できる。
【００９３】
半定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は典型的には、当業界で知られているように、内部発現対照としてＧＡＰＤＨ配列を用いて、試料から抽出された全ＲＮＡから精製されたポリＡ＋ＲＮＡをレトロ転写する（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｂｉｎｇ）ことによって実施する。
各遺伝子の発現レベルは、デンシトメトリー分析又は目視検査によって得られ、標準発現対照との比較を実施して、サイクリンＧ２単独について又はサイクリンＧ２とＳｈａｒｐ１との組合せについて低発現群を定義する。
【００９４】
別の実施形態によれば、キットは、特異抗体及び関連対照などの、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１発現の免疫学的検出のための手段を含む。
【００９５】
本発明の方法によって得られる結果は、乳癌患者の再発リスクの第１の層別化を提示する。
【００９６】
前述のように、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の予後徴候は、医師にとって最も重要な指標の１つとなるが、医師は、年齢、腫瘍サイズ、腋窩リンパ節の状態、腫瘍の組織型、病理学的グレード及びホルモン受容体の状態などの、乳癌の他の既知の予後因子及び予測因子と合わせて予後評価を行わなければならない。
【００９７】
実際に、実験パート、実施例６により詳細に報告するように、モデル２において、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓｏｔｉｒｉｏｕら、２００６年）からの腫瘍１８７個のデータセットについて行った、腫瘍直径、エストロゲン受容体の状態（ＥＲ 陽性対陰性）、リンパ節の状態（陽性対陰性）、腫瘍グレード（グレード２対グレード１及びグレード３対グレード１）及び治療状況（タモキシフェン有対無）を含む、臨床診療に一般に使用される他の予測因子の多変量Ｃｏｘ比例ハザード分析は、最小シグネチャーに関して非常に有意である（ｐ＝０．００５４）（表４）。
【００９８】
したがって、最小シグネチャーは、標準的な臨床的予測因子によってもたらされる以上の新しい予後情報を加える、無再発生存率の有意な予測因子となる。また、最小シグネチャーは、多変量モデルだけでなく、任意の単一の臨床的予測因子を用いて計算される任意のモデルにも、予後値を加える。実際に、単一の臨床的変数＋最小シグネチャー（例えば、リンパ節の状態＋最小シグネチャー）を用いて得られたモデルの残差逸脱度と、１つの臨床変数のみを用いて得られたモデルの残差逸脱度との間には、各臨床予測因子について有意差がある。
【００９９】
更に、本発明の方法は、従来の予後マーカーによって、明白に不良な転帰又は明確に良好な転帰と秘密で割り付けられた、乳癌患者の５０％超に相当する患者に関して、予後徴候を得るのに特に有用である。
【０１００】
本方法の特に妥当な点は、この方法が、腫瘍の大部分に相当する、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍスケールによって中等度（グレード２）に分類される、予後の不確かな腫瘍（Iｖｓｈｉｎａら、２００６年）に有効に適用されることである。複数の独立したデータセットのグレード２の腫瘍に適用された場合、最小シグネチャーはグレード２の試料を、それぞれグレード１及びグレード３に相当する転帰を有する２つの群に層別化した。
【０１０１】
したがって、行われる分割は、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍスケールに従ってグレード２に分類される乳房腫瘍患者を、より正確に分類し及び場合によっては異なる治療カテゴリー又は臨床試験に割り付けるための層別化に適用される、本発明の方法の好ましい一実施形態である。
【実施例】
【０１０２】
実験パート
材料及び方法
細胞培養及びトランスフェクション
Ｈ１２９９、及び変異型ｐ５３ Ｒ１７５Ｈを発現するその派生細胞株は、Ｇ．Ｂｌａｎｄｉｎｏから寄贈されたものである（Ｓｔｒａｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００２年）。
【０１０３】
Ｈ１２９９非小細胞肺癌細胞は、ＤＭＥＭ、１０％血清、１ｍＭグルタミン中で維持した。ＴＧＦβ処理は、ＤＭＥＭ ０．２％血清中で行った（ＴＧＦβは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから提供された）。ｐ５３Ｒ１７５Ｈ Ｈ１２９９細胞は、変異型ｐ５３Ｒ１７５Ｈ対立遺伝子に対するポナステロン誘導ｃＤＮＡをコードする、安定にトランスフェクトされたプラスミドを発現する。ｐ５３発現は、細胞をポナステロン−Ａ（Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ−Ａ）（Ａｌｅｘｉｓ、３ｍＭ）と共に１６時間インキュベートしてから処理することによって誘導した。
【０１０４】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２６）は、１０％血清、２ｍＭグルタミンを添加したＤＭＥＭとＦ１２との１：１混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で維持した。
【０１０５】
ＴＧＦβ処理に関しては、細胞を２４時間、血清欠乏にし、次いで血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２中ＴＧFβ１（５ｎｇ／ｍｌ）で処理した。
【０１０６】
ｓｉＲＮＡ（ｓｉは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ））のトランスフェクションについては、ＲＮＡｉ Ｍａｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｄｓＲＮＡオリゴ（１０ピコモル／ｃｍ２）をトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ（ｓｈは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）又はｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）の標的とされる配列のリストを、表１に示す。
【０１０７】
【表４】
【０１０８】
安定発現細胞株の作製
低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現コンストラクトは、アニールしたＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＳＵＰＥＲ−ｒｅｔｒｏ−ｐｕｒｏ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）中でクローン化することによって作製した。プラスミドは全て、シーケンシングによって制御した。
【０１０９】
安定なノックダウンのために、リン酸カルシウムを用いて２９３ｇｐ（Ｍ．Ｔｒｉｐｏｄｉから寄贈されたもの）中にｓｈＲＮＡ（ｐＳｕｐｅｒＲｅｔｒｏ）及びＶＳＶエンベロープを発現させるプラスミドをトランスフェクトすることによって、レトロウイルス粒子を得た。トランスフェクションの２日後に、上精を収集し、濾過し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の感染に用いた。ピューロマイシン耐性に関して選別後、形質導入細胞を、標的タンパク質のダウンレギュレーションについて検証した。
【０１１０】
遊走及び浸潤アッセイ
創傷閉鎖実験（ｗｏｕｎｄ−ｃｌｏｓｕｒｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）のために、Ｈ１２９９細胞を６ウェルプレートに蒔き、コンフルエントまで培養した。細胞をｐ２００チップでスクラッチし（時間０）、低血清に移し、前述のようにして処理した。
【０１１１】
遊走アッセイについては、トランスウェル遊走アッセイを、２４ウェルＰＥＴインサート（Ｆａｌｃｏｎ ポアサイズ８．０ｍｍ）中で行った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に関しては、細胞を１０ｃｍのディッシュ中に蒔き、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、８時間後に、一晩、血清欠乏にした。次いで、５００００又は１０００００個の細胞をトランスウェルインサート中に蒔き（各試料について少なくとも３つのレプリカ）、未処理のままにしておくか又はＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍｌ）で処理した。Ｈ１２９９に関しては、細胞をトランスウェル中の１０％血清中に蒔いたが、次に０．２％血清に変えた。いずれの細胞株についても、トランスウェルの上部の細胞を綿棒で除去し、遊走細胞をＰＦＡ４％中で固定し、クリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ）０．５％で染色した。フィルターを写真撮影し、細胞総数をカウントした。いずれの実験も、独立して少なくとも３回繰り返した。
【０１１２】
図２Ｃに示されるマトリゲル浸潤アッセイについては、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び派生細胞株を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１：２に希釈されたマトリゲルグロースファクターレデュースト（Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の液滴（１００ｍｌ）中に再懸濁させた。
【０１１３】
インビボ転移アッセイ
マウスは、特定病原体除去（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）（ＳＰＦ）動物施設中に収容し、承認された施設内基準（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐａｄｏｖａ）に準拠して処理した。乳癌転移の異種移植研究については、ｓｈＧＦＰ−又はｓｈｐ５３−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（細胞数１×１０６／マウス）を、週齢を５〜７週に適合させたＳＣＩＤ雌マウスの乳腺脂肪体に一側的に注射した。６週間後、マウスを屠殺し、リンパ節転移の存在について調べた。他の器官（肝臓、肺、腹膜）への肉眼で見える転移はまれであった。注射部位における腫瘍増殖を、反復キャリパー測定によって観察した。肺コロニー形成アッセイに関しては、細胞をＰＢＳ １００ｍｌ中に再懸濁させ、ＳＣＩＤマウスの尾静脈に接種した。４週間後、動物を屠殺し、その後の組織学的分析のために肺を摘出した。
【０１１４】
組織学及び免疫組織化学
組織学的検査のための組織を、標準的な方法によって、４％緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、パラフィン包埋した。
【０１１５】
図２Ｇ〜Ｉに示した実験については、肺の連続切片を、互いに１５０ｍｍの間隔で切断し、最初にヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオシン（Ｅｏｓｉｎ）（Ｈ＆Ｅ）で染色し、次いでヒトサイトケラチン発現のために、抗ヒトサイトケラチン（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）マウスモノクローナル抗体（クローンＭＮＦ１１６）（Ｄａｋｏ）で処理した。免疫組織化学染色は、間接免疫ペルオキシダーゼ染色技術（Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｖｉｓｉｏｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）を用いて行った。
【０１１６】
本発明者らは、肺当たり５つの連続切片においてサイトケラチン陽性領域を数値化した。腫瘍細胞で覆われた領域を、切片当たり４つのオーバーラップしない視野（各切片の５０〜８０％をカバーする）からＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて測定した。
【０１１７】
抗体及びウェスタンブロット法
ウェスタンブロット分析を、前述のようにして行った（Ｐｉｃｃｏｌｏら、１９９９年）。簡潔に言えば、タンパク質を、１０％ ＮｕＰａｇｅ（登録商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で分離し、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）Ｐ（登録商標）メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。スーパーシグナルウェストピコ（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ−ｐｉｃｏ）（登録商標）及び−ｄｕｒａＨＲＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、化学発光を可視化させた。抗ヒトｐ５３ ＤＯ−１モノクローナル抗体及び抗ラミンポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗ホスホＳｍａｄ３ポリクローナル抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した。
【０１１８】
ノーザンブロット法
６ｃｍディッシュ中に蒔いた細胞から、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって全ＲＮＡを抽出した。試料当たり１０ｍｇの全ＲＮＡを、６％ホルムアルデヒド／１％アガロースゲル中に添加して分離させ、ジーンスクリーンプラス（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅnＰｌｕｓ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上に上向き毛細管転写（ｕｐｗａｒｄ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）によってブロットし、紫外線架橋させた。メンブレンを、ＵＬＴＲＡｈｙｂ−Ｏｌｉｇｏ溶液（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて４２℃において５時間プレハイブリダイズさせ、４２℃において，一晩３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。メンブレンを６８℃において２×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ溶液で洗浄し、オートラジオグラフィーに暴露した。全プローブを、ランダムプライマー増幅によって得た。Ｓｈａｒｐ１、サイクリンＧ２及びフォリスタチンプローブテンプレートは、ＲＺＰＤ ＥＳＴから入手した（それぞれ、ＨＵ３＿ｐ９８３Ｂ０１２０Ｄ、ＨＵ３＿ｐ９８３Ｄ０１４０Ｄ２及びＲＺＰＤ ＥＳＴ ＨＵ３＿ｐ９８３Ｄ０１１３Ｄ２）。ＧＰＲ８７及びＡＤＡＭＴＳ９プローブは、ＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニングによって得た。全てのプローブを、シーケンシングによって検証した。
【０１１９】
ＲＴ−ＰＣＲ
ポリ（Ａ）＋−ＲＮＡは、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による全ＲＮＡ精製後に、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びオリゴ−ｄ（Ｔ）プライマーでレトロ転写した。標準的なＲＴ−ＰＣＲの場合には、各ｃＤＮＡ試料２μｌをＰＣＲチューブに等分し、次いでＥＸＴａｑ用マスターＰＣＲミックス（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を加える。サイクル条件は、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒である（Ｃｏｒｄｅｎｏｎｓｉら、２００３年）。全てのＰＣＲプライマーのリストを、表２に示す。
【０１２０】
【表５】
【０１２１】
ＤｙＮＡｍｏ ＨＳ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いる７５００Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することによって、サイクリンＧ２及びＧＡＰＤＨに関するＱ−ＰＣＲを行った。
【０１２２】
マイクロアレイ分析
ＭＤＡ ｓｈＧＦＰ及びｓｈｐ５３細胞を２４時間、血清欠乏にし、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２中において、未処理のままにしておくか又はＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍｌ、３時間）で処理した。４つの条件（非処理ｓｈＧＦＰ、ＴＧＦβ処理ｓｈＧＦＰ、非処理ｓｈｐ５３、ＴＧＦβ処理ｓｈｐ５３）のそれぞれについて、４つのレプリカを作製した（試料計１６個）。全ＲＮＡを、メーカーの使用説明書に従ってトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出した。マイクロアレイハイブリダイゼーションのための試料調製は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘジーンチップ（登録商標）発現分析技術マニュアルに記載されたようにして実施した。簡潔に言えば、全ＲＮＡ１５μｇを用いて、二本鎖ｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を作製した。ビオチン標識ｃＲＮＡの合成は、バイオアレイＴＭ高収量ＴＭ ＲＮＡ転写標識キット（ＥＮＺＯ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を用いて行った。ｃＲＮＡ断片化の長さは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザー（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて確認した。各群について４つの生物学的ｍＲＮＡ複製物を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ジーンチップ（登録商標）ヒトゲノムＨＧ−Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイ上でハイブリダイズした。
【０１２３】
データ分析は全て、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒライブラリー及びＲ統計パッケージを用いてＲで行った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ．／、Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２００８年）。具体的には、ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＡｆｆｙＱＣＲｅｐｏｒｔ及びＡｆｆｙＰＬＭを、標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ品質管理手順に用いた。プローブレベルシグナルは、ロバストなマルチアレイ平均手順ｒｍａ（Ｉｒｉｚａｒｒｙら、２００３年）を用いて、発現値に変換した。ＲＭＡにおいて、ＰＭ値をバックグラウンド補正し、クオンタイル正規化を用いて正規化し、発現基準を、中央値ポリッシュ集計を用いて計算した。全アレイ中の全対数シグナルの平均標準偏差より低い標準偏差（例えば、０．２）を有するＲＭＡデータをフィルター処理によって除去した。フィルター処理されたデータセットは、更なる分析に使用される２２６４４個のプローブセットをもたらした。異なって発現された遺伝子を、マイクロアレイの有意性分析ｓａｍｒ（Ｔｕｓｈｅｒら、２００１年）を用いて同定した。ＳＡＭは、誤発見率（Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ）（ＦＤＲ）を制御しながら、マイクロアレイにおいて有意な遺伝子を検出するための統計的手法である。ＳＡＭは、データの重複順列を用いて、任意の遺伝子の発現レベルが生理的状態に有意に関連するかどうかを判定し、有意差はｑ値、即ち、遺伝子が「異なって発現された」とみなされる最も低い誤発見率によって数値化する（Ｓｔｏｒｅｙ、２００２年）。
【０１２４】
ＴＧＦβ標的遺伝子の同定
発現がＴＧＦβで改善されている遺伝子を同定するために、本発明者らはＴＧＦβ処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ｓｈＧＦＰ又はｓｈｐ５３）の発現プロファイルを、それらの非処理対照と比較し、ｑ値が≦０．１であるそれらの転写物を選択した。この選択は、ＴＧＦβ誘導倍率の下限（又は減少）を１．５に設定することによって、更に精密化した。この組合せフィルターを用いて、本発明者らは、非処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１試料とＴＧＦβ処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１試料との間で異なって制御された４４７個の遺伝子を同定することが可能であった。異なって発現された遺伝子は、ＤＡＶＩＤ（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）、京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）及びＮＣＢＩ遺伝子データベース（ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）に従って機能的に分類した。既知の機能と関連する２９２個の遺伝子のうち、１４７個の遺伝子が、細胞運動、浸潤プロセス及び転移に関与することが報告された。変異型ｐ５３依存的にＴＧＦβ１によって制御される遺伝子は、ｓｈＧＦＰ中ではＴＧＦβによる有意な制御を示すと確認されたが、ｐ５３欠乏細胞では確認されなかった（ｑ値≦０．１、図３Ｂ参照）。得られた５個の遺伝子を、ノーザンブロット分析によって検証した。
【０１２５】
実施例１
ＴＧＦβへの細胞応答に対する変異型ｐ５３の作用。
本発明者らは、ＴＧＦβへの細胞応答に対する変異型ｐ５３の作用を精査しようと努めた。この目的を達成するために、本発明者らは、ホットスポットｐ５３Ｒ１７５Ｈ変異対立遺伝子をコードする誘導発現ベクターによって安定的に再構成されたｐ５３欠損Ｈ１２９９細胞を用いた。Ｐ−Ｓｍａｄ３の活性化によって判断されるように、この細胞株は、親のＨ１２９９に比較して、ＴＧＦβに対して同様な応答性を保有していた（図１Ａ）。
【０１２６】
ｐ５３Ｒ１７５Ｈを有するＨ１２９９細胞のＴＧＦβ処理により、細胞はその立方上皮形状を捨て、糸状仮足突起及び葉状仮足などの多数の動的突起（ｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎ）を特徴とするより間葉性の表現型を獲得するので、著しい形態変化を引き起こした（図１Ｂ）。これらは、親細胞にも野生型ｐ５３で再構成された細胞にも存在しなかった（図１Ｂ及び図示していないデータ）。変異型ｐ５３の発現が、ＴＧＦβを受容する細胞に更に遊走性を与えるかどうかを調べるために、本発明者らは創傷アッセイを用いた。創傷アッセイにおいて、細胞は、細胞間接触を破壊し、分極し、ピペット先端部でコンフルエントな培養物をスクラッチすることによって作られた傷に遊走するように誘導される。３０時間のＴＧＦβ処理後、親（ｐ５３欠損）Ｈ１２９９細胞は十分に遊走しなかったが、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ発現細胞はほとんど完全に傷に浸潤した（図１Ｃ）。この作用を増殖のバイアスではなく細胞遊走に帰するために、本発明者らは、ＢｒｄＵの取り込みを観察し、ＴＧＦβ処理対照又は変異型ｐ５３発現細胞間に差がないことを見出した（データは示さず）。独立した、細胞運動性の測定手段として、本発明者らは、トランスウェル−遊走アッセイにおいて、親世代のＨ１２９９細胞、野生型又は変異型ｐ５３再構成Ｈ１２９９細胞の挙動を調べた。図１Ｄは、変異型ｐ５３の発現はＴＧＦβプロ遊走性応答の獲得と一致するが、野生型ｐ５３は一致しないことを示している。
【０１２７】
これらのデータは、変異型ｐ５３の獲得を、ＴＧＦβ誘導上皮可塑性及び遊走、発現がＴＧＦβ浸潤性に重要な表現型に関連づけている（Ｇｕｐｔａ及びＭａｓｓａｇｕｅ、２００６年）。
【０１２８】
実施例２
インビトロにおいて、変異型ｐ５３とＴＧＦβとは共同で乳癌細胞の細胞形状及び浸潤性を制御する。
内在性変異型ｐ５３を有する転移癌細胞中における上皮可塑性及び遊走の増大の実際要件を明らかにするために、本発明者らは、浸潤性乳癌の確立されたモデル、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中で、内在性変異型ｐ５３（ｐ５３Ｒ２８０Ｋ）を安定的にノックダウンした（Ａｒｔｅａｇａら、１９９３年；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、１９９９年；Ｄｅｃｋｅｒｓら、２００６年；Ｐａｄｕａら、２００８年）。細胞に、ｓｈＧＦＰ（対照）又はｐ５３を標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈｐ５３）を発現するレトロウイルスベクターを形質導入し（表１参照）、次いで薬剤選択を行って、陽性のトランスフェクタントを集積した。免疫ブロット法によれば、ｓｈｐ５３の発現は、変異型ｐ５３タンパク質の内在レベルを＞９０％減少させた（図２Ａ）。トランスウェル−遊走アッセイにおいて、ＴＧＦβは、対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において強力なプロ遊走性応答のトリガーとなった。注目すべきことに、この応答は、変異型ｐ５３欠乏細胞中では失われていた（図２Ｂ）。２つの独立した抗ｐ５３ ｓｉＲＮＡ配列を用いたｐ５３の一過性欠乏時にも、同様な結果が得られた（データは示さず）。１滴のマトリゲル中に埋め込まれると、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＴＧＦβ依存性の分散、細胞外基質分解及び遊走を示し（図２Ｃ及び２Ｄ）、これはインビボ浸潤性を再現している（Ａｌｂｉｎｉ、１９９８年）。本発明者らは、これらの活性には変異型ｐ５３の発現が必要であることを見出した。これらのデータは、少なくともインビトロにおいて、変異型ｐ５３とＴＧＦβとが協力して、乳癌細胞の細胞形状及び浸潤性を制御することを示唆している。
【０１２９】
実施例３
変異型ｐ５３発現は、インビボにおいてＴＧＦβ応答性を効率的な転移拡散の方向に導くのに極めて重要な役割を果たす。
複数の証拠が、インビボにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の転移拡散が、自己分泌ＴＧＦβの制御を受けていることを示している（Ａｒｔｅａｇａら、１９９３年；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、１９９９年；Ｄｅｃｋｅｒｓら、２００６年；Ｐａｄｕａら、２００８年）。変異型ｐ５３がインビボにおいて、ＴＧＦβによって促進される悪性挙動に関連した重要性を持つかどうかを試験するために、本発明者らは、免疫不全マウスの乳腺脂肪体にｓｈＧＦＰ−又はｓｈｐ５３−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注射した。２つの細胞集団は、インビトロでは同様な速度で増殖し（データは示さず）、インビボでは同様な速度及びサイズで原発性腫瘍を形成した（図２Ｅ）。これは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中の高レベルの変異型ｐ５３が、増殖にも原発性腫瘍形成にも必須でないことを示している。移植の６週間後に、マウスを屠殺し、転移性病変の有無を調べた。
【０１３０】
同所注射を行ったＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、肺転移が非常に少ないが、リンパ節には効率的に転移する。転移拡散を数値化するために、本発明者らは、ヒト乳癌における全身性疾患の読み出し情報である、対側リンパ節のコロニー形成を観察した（Ｓｉｎｇｌｅｔａｒｙら、２００６年）。特筆すべきことに、ｓｈＧＦＰ細胞を注射したマウスでは、リンパ節転移に関して陰性のスコアを示したのは２２匹のうち１匹のみであったのに対して、ｓｈｐ５３欠乏腫瘍を保有しているマウスでは、２２匹のうち１０匹において転移がないままであった（図２Ｆ）ことから、変異型ｐ５３発現の抑制は、対照細胞と比較した場合に、リンパ節転移の数を大幅に減少させた。
【０１３１】
変異型ｐ５３を浸潤性に関連づけるこれらの結果をインビボで裏付けるために、本発明者らは、ヌードマウスに対照及びｓｈｐ５３−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を静脈注射した。独立した２つのクローンを用いて、本発明者らは、変異型ｐ５３の欠乏が、肺へのコロニー形成に対して顕著な影響を及ぼし、転移小結節を数及びサイズにおいて明白に減少させる（図２Ｇ〜２Ｉ）ことを見出した。このように、変異型ｐ５３発現は、ＴＧＦβ応答性を効率的な転移拡散の方向に導くのに極めて重要な役割を果たしている。
【０１３２】
実施例４
変異型ｐ５３及びＴＧＦβによって同時制御される遺伝子セットの同定。
次に、本発明者らは、変異型ｐ３５及びＴＧＦβが浸潤及び転移を制御する特異遺伝子発現プログラムを精査しようと努めた。この遺伝子セットを同定するために、本発明者らは、対照及び変異型ｐ５３欠乏ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＴＧＦβトランスクリプトームプロファイルを比較した。本発明者らは、ＴＧＦβが４００個を超える遺伝子を制御する可能性があることを見出した。それらの大多数は、変異型ｐ５３の存在には依存せずに発現された。
【０１３３】
変異型ｐ５３非依存性標的の中のいくつかは、ＰＡＩ１／ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＪｕｎＢ及びＳｍａｄ７などの直接的なＳｍａｄ標的として既に文献記載されていた（Ｍａｓｓａｇｕｅ及びＧｏｍｉｓ、２００６年）。更に、肺又は骨特異的転移に関連する遺伝子（ＡＮＧＰＴＬ４、ＮＥＤＤ９、ＩＬ１１及びＣＴＧＦ）（Ｐａｄｕａら、２００８年）を含めて、一般的な上皮性「ＴＧＦβ応答分類指標（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）」に既に関連づけられている多くの遺伝子も発見された。これらの標的の同定の成功は、ＴＧＦβ誘導悪性腫瘍において重要な役割を果たす可能性がある新規遺伝子を同定する本発明者らの手法を検証した。興味深いことに、本発明者らは、細胞の運動、浸潤又は転移に関与していると既にみなされている１４７個の遺伝子に注目した（図３Ａ及び示していないデータ）。
【０１３４】
しかし、ＴＧＦβは、その前転移機能（ｐｒｏ−ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の発揮に、変異型ｐ５３の存在を必要とする。したがって、本発明者らは、変異型ｐ３５及びＴＧＦβによって同時制御されるはるかに小さい遺伝子セットに限定して着目した。特筆すべきことに、これに必要だったのはわずか５個の遺伝子、Ｓｈａｒｐ１／ＤＥＣ２／ＢＨＬＨＢ３／ＢＨＬＨＥ４１、サイクリンＧ２／ＣＣＮＧ２、ＡＤＡＭＴＳ９、フォリスタチン及びＧＰＲ８７である（図３Ｂ及び３Ｃ参照）。特に、本発明者らは、変異型ｐ５３を介してＴＧＦβによって負に制御される２つの候補転移抑制因子、Ｓｈａｒｐ１及びＣｙｌｉｎＧ２に着目した（図３Ｄ）。Ｓｈａｒｐ１は、ＩＤ−タンパク質に類似した（即ち、ＭｙｏＤ阻害アッセイにおいて）阻害性の塩基性ヘリックスループヘリックスである（Ｌｉら、２００３年）が、その生物学的役割はその他の点ではほとんど不明である。サイクリンＧ２は、非定型「阻害性」サイクリンとみなされるが、微小管細胞骨格の動態に影響を与える可能性もある。興味深いことに、サイクリンＧ２は、細胞分裂の間に、母中心小体（ｃｅｎｔｒｉｏｌｅ）を取り囲む中心体（ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ）との会合によって、非対称的に受け継がれる（Ａｒａｃｈｃｈｉｇｅ Ｄｏｎら、２００６年）。
【０１３５】
実施例５
同定された遺伝子セットのインビトロにおける生物学的検証。
これらの遺伝子を変異型ｐ５３／ＴＧＦβ経路のエフェクターとして機能的に検証するために、本発明者らは、エピスタシス実験を行い、Ｓｈａｒｐ１又はサイクリンＧ２の欠乏が、ｐ５３欠乏細胞においてＴＧＦβ誘導遊走をレスキューできるかどうかを試験した。図３Ｅに示されるように、Ｓｈａｒｐ１又はサイクリンＧ２のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、ｓｈｐ５３ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においてＴＧＦβ依存性プロ遊走活性を回復させる（図３Ｅのレーン３及び４とレーン２とを比較）。したがって、これらの分子は、ＴＧＦβ前浸潤性応答に拮抗して、転移抑制因子として作用する。インビトロにおいて浸潤挙動に拮抗するのに必須の遺伝子を同定した後、本発明者らは、転移抑制因子としてのそれらの臨床的関連性を解明しようと努めた。ヒトの原発性腫瘍の最近のトランスクリプトームプロファイリングは、高い転移リスク及び低い無病生存率を予測する遺伝子一式又は「シグネチャー」を同定した（Ｆａｎら、２００６年；ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、２００２年）。原発性腫瘍におけるＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の検出が生物学的に有意義であるならば、これらの遺伝子の発現減少は臨床転帰不良と関連づけられることが予想される可能性がある。意外なことに、Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２は、乳癌転移の既知のシグネチャー、即ち７０遺伝子シグネチャー、再発スコアなどには含まれない（Ｆａｎら、２００６年）。
【０１３６】
実施例６
統計分析及び他の遺伝子セットとの比較による、同定された遺伝子セットの予後値の検証。
乳癌データセット
Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の予後値を評価するために、本発明者らは６つの異なるデータセットを収集した（表３）。各データセットについて、本発明者らは、生存率分析を行い、最小シグネチャーが臨床的に異なる群に患者を分類できるかどうかを試験した。各データセットを、互いに独立して処理して、種々の研究間の最初の差（例えば、患者コホート、マイクロアレイタイプ、試料処理プロトコール）を維持した。
【０１３７】
Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２（最小シグネチャー、ＭＳ）の予後値を評価するために、本発明者らは、利用可能な遺伝子発現データセットを利用して、９００個までの原発乳癌を、生存率及び遠隔再発を含む関連臨床データと共にまとめた。
【０１３８】
【表６】
【０１３９】
本発明者らは、乳癌遺伝子発現データセットを臨床情報と共にＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＧＥＯ／）、スタンフォードマイクロアレイデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ５．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／）、又は著者の個人的ウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｐｕｂｓ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｗｏｕｎｄ＿ＮＫＩ／ｅｘｐｌｏｒｅ．ｈｔｍｌ）からダウンロードした。
【０１４０】
表３は、データセット及びそれらのソースの完全なリストを表している。ＥＭＣ、ＭＳＫ及びＮＫＩの研究を除き、全ての試料について生データ（例えば、ＣＥＬファイル）を入手できた。全ての分析試料について詳細な臨床情報を獲得できた。データセットは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ及びデュアルチャンネルｃＤＮＡマイクロアレイプラットフォームの両者を含んでいた。全てのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータは、同じＨＧ−Ｕ１３３Ａプラットフォームに由来するので、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘジーンチップアレイの種々の作製にわたってプローブセットをマッピングする方法は必要なかった。ＣＥＬファイルを入手できる場合には、ＲＭＡアルゴリズムを用いて強度シグナルから発現値を生成し、値をバックグラウンド補正し、クオンタイル正規化を用いて正規化し、中央値ポリッシュ集計を用いて発現基準を計算した。ＥＭＣ、ＭＳＫ及びＮＫＩの研究の場合は、データはダウンロードしたまま用いた。具体的には、ＥＭＣ及びＭＳKデータセットにおいては、発現値は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＭＡＳ ５．０アルゴリズムを用いて計算した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイにおいて、サイクリンＧ２は３つのプローブセット（２０２７６９＿ａｔ、２０２７７０＿ｓ＿ａｔ及び２１１５５９＿ｓ＿ａｔ）によって表され、Ｓｈａｒｐ１はプローブセット２２１５３０＿ｓ＿ａｔのみによって表される。
【０１４１】
ＮＫＩデータセットに用いるＡｇｉｌｅｎｔ、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓアレイは、サイクリンＧ２に対しては単一のプローブを有するが、Ｓｈａｒｐ１に対してはプローブを含まない。
【０１４２】
最小シグネチャー分類
Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の高い又は低い同時発現スコアによって２つの試料群を同定するために、本発明者らは、Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の標準化発現レベルを集計して平均値０の合計スコアを出すことによって、分類規則を定義した。
【０１４３】
次に、腫瘍を、合計スコアが負である場合には最小シグネチャー低に分類し、合計スコアが正である場合には最小シグネチャー高に分類した。
【数２５】
【数２６】
前記式中、
【数２７】
は、試料ｉ中のＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の発現レベルであり、
【数２８】
は、データセット全体にわたって計算されたＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の推定平均値及び推定標準偏差値である。
【０１４４】
Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、ＮＣＩ及びＵｐｐｓａｌａの研究については、ＲＭＡから得られた発現値に基づくこの分類を適用した。一方、ＥＭＣ及びＭＳＫについては、発現値はダウンロードしたまま使用している。ＥＭＣデータセットについては、発現データは対数変換（ｌｏｇ２−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）してある。
【０１４５】
ＮＫＩデータセットについては、試料は、サイクリンＧ２データのみに基づいて、高群及び低群に分類しなければならなかった。
【０１４６】
サイクリンＧ２発現レベルの適切な閾値を決定するために、本発明者らは臨床パラメーターを用いて、臨床転帰良好な患者、即ち、少なくとも５年の追跡後に転移のないままであるリンパ節陰性の患者の割合を数値化した（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、２００２年）。試料の約３１％（２９５個の腫瘍のうち９２個）がこれらの基準を満たしたので、サイクリンＧ２発現値の６９番目のパーセンタイル（即ち、０．０７８）を、高群又は低群への腫瘍分類にカットオフとして用いた。所与の試料のサイクリンＧ２発現レベルがサイクリンＧ２値の６９番目のパーセンタイルよりも高い場合には試料を最小シグネチャー高と称し、そうでない場合には、最小シグネチャー低と称した。この選択の背後にある論理的根拠は、患者の約３１％が最小シグネチャー高に分類されると予想されたことである。
【０１４７】
試料はまた、目的変数なしのクラスタリング法（Ｐｏｌｌａｒｄ、２００５年）を用いてＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の発現レベルに基づいて、最小シグネチャー高群及び最小シグネチャー低群に分類した。
【０１４８】
特に、ＭＳＫ及びＥＭＣデータセットの分類にはそれぞれ、ユークリッド距離及び完全又はＷａｒｄ連結基準を用いる凝集型クラスタリングを用い、ＮＣＩ試料にはユークリッド距離を用いる分割型クラスタリング（ｄｉａｎａ）を適用し、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ及びＵｐｐｓａｌａデータセットにｋ平均パーティショニングアルゴニズム（ｋ−ｍｅａｎｓ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いた。ＮＫＩ試料には、サイクリンＧ２についての遺伝子発現データしか入手できないので、クラスタリング法は適用しなかった。
【０１４９】
本発明者らは、分析するデータセット全てについて最小シグネチャー及び７０遺伝子シグネチャーの成績（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を比較した。ＮＫＩ以外の全てのデータセットはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイに由来するので、本発明者らはまず、７０遺伝子シグネチャーをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットにマッピングし、次いで、４８個の固有のＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ ＩＤに相当する、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａプラットフォーム中の７５プローブセットへのＮＫＩの７０遺伝子予後不良シグネチャーマップを得た。シグネチャーを構成する遺伝子数のこのような減少を考慮し及び本発明者らが異なる患者分類モデルを用いた事実を踏まえて、本発明者らは、数の減少した遺伝子リストに基づいて作成された異なるモデル（即ち、目的変数なしのクラスタリング）の予後成績が、全シグネチャーに基づくｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒのモデルの予後成績と同様であるかどうかを検証した。したがって、本発明者らは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ及びＲｏｓｅｔｔａプラットフォームの両者に存在する４８個の固有の遺伝子と、目的変数なしのクラスタリングに基づく分類モデルとを用いて、ＮＫＩ試料を分類した。２００２年にｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒらによって及び２００５年にＭｉｎｎらによって既に報告された成績に一致して、本発明者らは、数の減少したシグネチャーへの目的変数なしのクラスタリングの使用が、分類指標の成績にほとんど影響を与えていないことを見出した。したがって、他の全てのデータセット中の試料を、この数の減少した７０遺伝子シグネチャー及び目的変数なしのクラスタリングを用いて２つの群に分類した。特に、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍの研究には、Ｗａｒｄアルゴリズム（Ｗａｒｄ、１９６３年）に基づく凝集型階層モデルを用い、Ｕｐｐｓａｌａ及びＥＣＭの研究はＰＡＭアルゴニズム（Ｋａｕｆｍａｎ及びＲｏｕｓｓｅｅｕｗ、１９９０年）を用いて分類した。最後に、ＭＳＫの研究に関しては、本発明者らは、Ｍｉｎｎら（２００５年）によって示された分類を用いた。
【０１５０】
生存率分析
最小シグネチャーの予後値を評価するために、本発明者らは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ、１９７８年）を用いて、患者が高群又は低群のいずれに属するかに従って、患者に転移がないままである（ＭＳＫ及びＮＫＩ）、腫瘍再発がないままである（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ及びＮＣＩ）及び癌の疾患がないままである（Ｕｐｐｓａｌａ）可能性を推定した。これらの研究成果を確認するために、生存率曲線を、ログランク検定又はマンテル−ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）検定（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ及びＦｌｅｍｉｎｇ、１９８２年）を用いて、即ち、最小シグネチャー高の生存率を裏付ける片側対立仮説に対比して、差のない帰無仮説を検定して、比較した。Ｐ値は、標準漸近正規分布（ｓｔａｎｄａｒｄ ｎｏｒｍａｌ ａｓｙｍｐｔｏｔｉｃ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）に従って計算し、ボンフェローニ−ホルム（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ）の逐次多重検定法（Ｄｕdｏｉｔ、２００３年）に従って補正を行って、族当たりの過誤率（ｆａｍｉｌｙ−ｗｉｓｅ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）を制御した。合計スコアを用いて定義される最小シグネチャー高群と最小シグネチャー低群とを比較した場合、補正ｐ値は全て、有意水準α＝０．０５で有意であった。クラスタリング法を用いて定義される最小シグネチャー高群及び最小シグネチャー低群について繰り返した同じ生存率分析でも同様な結果が得られ、ｐ値は、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍでは０．０００２６、ＮＣＩでは０．０００８３、ＥＭＣでは０．０２５１、Ｕｐｐｓａｌａでは０．００２５、ＭＳＫでは０．００８８７であった。
【０１５１】
最後に、生存率分析を、高群及び低群に割り付けられた試料のサブセットに適用し、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍスケールによって中等度（グレード２）に分類した。この場合も、族当たりの過誤率をα＝０．０５に制御することによって、全ての帰無仮説は棄却された。ＮＣＩデータセットについては、グレード２の腫瘍の無再発生存率曲線は低分化のグレード３の腫瘍の曲線と統計的に有意差がなかったので、この分析は実施できなかった。Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍスケールによる腫瘍の分類に関する情報は、ＭＳＫ及びＥＭＣデータセットにおいては有効でない。
【０１５２】
結論
各データセットにおいてＳｈａｒｐ１及びＣｙｌｃｉｎＧ２の発現がそれぞれ高レベル及び低レベルの２つの腫瘍群を定義した（図４）後に、単変量のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率分析を用いて検定を行った場合、特筆すべきことに、低レベルの最小シグネチャーを発現する群は、「高」群に比較して再発をきたす確率が有意に高かったことが発見された（ｐ値は、データセットに応じて、０．０２〜３Ｅ−０５の範囲であった）。
【０１５３】
興味深いことに、臨床転帰による患者の層別化において、ＭＳは７０遺伝子プロファイルに遜色ない機能を示した（図４）。
【０１５４】
Ｓｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の発現は、これらのアッセイにおける最小シグネチャーの予測力に対して相乗的であり、骨及び肺への遠隔転移リスクのいずれにも関連する（図５）。それでも、Ｓｈａｒｐ１発現データが有効でない、ＮＫＩデータセット（２９５個の腫瘍）（Ｆａｎら、２００６年）などの患者のデータセットにおいては、サイクリンＧ２のみに基づく層別化が、依然として転移を予測する（図６参照）。
【０１５５】
Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いた多変量分析
最小シグネチャーの予後値を更に評価するために、本発明者らは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓｏｔｉｒｉｏｕら、２００６年）からの１８７個の腫瘍のデータセットについて多変量のＣｏｘ比例ハザード分析を行った。特に、ＮＣＩの研究からの１８７個の腫瘍に関する再発リスクを、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデリング（Ｃｏｘ、１９７２年）によって調べた。
【０１５６】
生存率と、最小シグネチャー予測因子及び臨床診療に一般に使用される他の予測因子（腫瘍直径、エストロゲン受容体の状態（ＥＲ 陽性対陰性）、リンパ節の状態（陽性耐陰性）、腫瘍グレード（グレード２対グレード１及びグレード３対グレード１）及び治療状況（タモキシフェン有対無）を含む）との相関を具体的に調べた。
【０１５７】
本発明者らは、最初に臨床的変数のみを用いることによって（モデル１）、次いで最小シグネチャー予測因子を加えることによって（モデル２）、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルに当てはめた。結果を表４及び５に示す。これらの表から、最小シグネチャーが依然として無転移生存率の有意な予測因子であり、したがって、標準的な臨床的予測因子によってもたらされる以上の新しい予後情報を加えたことが示される。
【０１５８】
表４ Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いた、ＮＣＩデータセットに関する再発リスクの多変量分析
モデル１において、腫瘍サイズ及びグレード２（対グレード１）の共変量は、α＝０．０５において統計的に有意な係数を有する。しかし、最小シグネチャーを組み込んだ場合（モデル２）、全ての他の共変量を一定に保ちながら、「低」群に割り当てると、再発ハザードが平均してｅ０．７０６＝２．０２６倍、有意に増加し、即ち、新しい予後情報を加える。
【０１５９】
モデル１ 臨床的変数のみを用いた多変量分析
モデル１は、ｎ＝１５９の観察結果を用いて得た。その残差逸脱度（即ち、−部分対数尤度×２）はＲＤ１＝４９２．８７７４に等しい。
【０１６０】
【表７】
【０１６１】
モデル２ 臨床的変数及び最小シグネチャーを用いた多変量分析
モデル２は、ｎ＝１５９の観察結果を用いて得た。その残差逸脱度（即ち、−部分対数尤度×２）はＲＤ２＝４８６．８３６９に等しい。
【０１６２】
【表８】
【０１６３】
モデル１とモデル２とを比較して、最小シグネチャーが臨床的変数以上の追加の予後情報を加えるかどうかを評価できる。特に、これは、モデル２（ＲＤ２＝４８６．８３６９）の残差逸脱度からモデル１（ＲＤ１＝４９２．８７７４）の残差逸脱度を差し引き、この差（ＲＤ１−ＲＤ２＝６．０４０４３）を自由度１のχ二乗分布に対比して検定することによって、得られる。この差は自由度１のχ二乗分布の０．９５クオンタイルを超える（ｐ値＝０．０１３９８）ので、最小シグネチャーは無再発生存率の有意な予測因子であり、標準的な臨床的予測因子以上の新しい予後情報を加える。
【０１６４】
【表９】
【０１６５】
更に、最小シグネチャーは、多変量モデルだけでなく、任意の単一の臨床的予測因子を用いて作成された任意のモデルにも予後値を加える。実際、単一の臨床的変数及び最小シグネチャー（例えば、腫瘍直径＋最小シグネチャー）を用いて得られたモデルの残差逸脱度と、１つの臨床的変数のみを用いて得られたモデルの残差逸脱度との差は、いずれの臨床的予測因子の場合も有意である。
【０１６６】
前記データから、本発明が、転移リスクを評価するための追加的な予後診断ツールを提供し、したがって、補助療法が有効な患者を特定することが確認された。
【０１６７】
更に、好適例は、腫瘍の大部分に相当し、予後が不確かな、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍスケールによって中程度（グレード２）に分類される腫瘍（Ｉｖｓｈｉｎａら、２００６年）である。複数の独立したデータセットのグレード２の腫瘍に適用する場合、最小シグネチャーはこれらの患者を、それぞれグレード１及びグレード３に相当する転帰を有する２つ群に分割した（図７）。この結果は、全ての他の、更に複雑な分子的方法によっては得られなかったものであり、したがって本発明に特有である。
【０１６８】
参考文献
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Ｄｅｃｋｅｒｓ， Ｍ．， ｖａｎ Ｄｉｎｔｈｅｒ， Ｍ．， Ｂｕｉｊｓ， Ｊ．， Ｑｕｅ， Ｉ．， Ｌｏｗｉｋ， Ｃ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｕｉｊｍ， Ｇ．， ａｎｄ ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ， Ｐ． （２００６）． Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｓｍａｄ４ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｏ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６， ２２０２−２２０９．
Ｄｕｄｏｉｔ， Ｓ．， Ｐｏｐｐｅｒ Ｓｈａｆｆｅｒ． Ｊ．， Ｂｏｌｄｒｉｃｋ， Ｊ．Ｃ． （２００３）． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １８， ７１−１０３．
Ｆａｎ， Ｃ．， Ｏｈ， Ｄ．Ｓ．， Ｗｅｓｓｅｌｓ， Ｌ．， Ｗｅｉｇｅｌｔ， Ｂ．， Ｎｕｙｔｅｎ， Ｄ．Ｓ．， Ｎｏｂｅｌ， Ａ．Ｂ．， ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ， Ｌ．Ｊ．， ａｎｄ Ｐｅｒｏｕ， Ｃ．Ｍ． （２００６）． Ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３５５， ５６０−５６９．
Ｇｕｐｔａ， Ｇ．Ｐ．， ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ， Ｊ． （２００６）． Ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ： ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ． Ｃｅｌｌ １２７， ６７９−６９５．
Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｐ．， ａｎｄ Ｆｌｅｍｉｎｇ， Ｔ．Ｒ． （１９８２）． Ａ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｒａｎｋ ｔｅｓｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｃｅｎｓｏｒｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｄａｔａ． Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ ６９， ４．
ｔ Ｈｏｅｎ， Ｐ．Ａ．， Ａｒｉｙｕｒｅｋ， Ｙ．， Ｔｈｙｇｅｓｅｎ， Ｈ．Ｈ．， Ｖｒｅｕｇｄｅｎｈｉｌ， Ｅ．， Ｖｏｓｓｅｎ， Ｒ．Ｈ．， ｄｅ Ｍｅｎｅｚｅｓ， Ｒ．Ｘ．， Ｂｏｅｒ， Ｊ．Ｍ．， ｖａｎ Ｏｍｍｅｎ， Ｇ．Ｊ．， ａｎｄ ｄｅｎ Ｄｕｎｎｅｎ， Ｊ．Ｔ． （２００８）． Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｓ ｍａｊｏｒ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ， ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒ−ｌａｂ ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｖｅｒ ｆｉｖｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６， ｅ１４１．
Ｈａｒｔｉｇａｎ， Ｊ．Ａ．， ａｎｄ Ｗｏｎｇ， Ｍ．Ａ． （１９７９）． Ａ Ｋ−ｍｅａｎｓ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２８， ９．
Ｉｒｉｚａｒｒｙ， Ｒ．Ａ．， Ｂｏｌｓｔａｄ， Ｂ．Ｍ．， Ｃｏｌｌｉｎ， Ｆ．， Ｃｏｐｅ， Ｌ．Ｍ．， Ｈｏｂｂｓ， Ｂ．， ａｎｄ Ｓｐｅｅｄ， Ｔ．Ｐ． （２００３）． Ｓｕｍｍａｒｉｅｓ ｏｆ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ ｐｒｏｂｅ ｌｅｖｅｌ ｄａｔａ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１， ｅ１５．
Ｉｖｓｈｉｎａ， Ａ．Ｖ．， Ｇｅｏｒｇｅ， Ｊ．， Ｓｅｎｋｏ， Ｏ．， Ｍｏｗ， Ｂ．， Ｐｕｔｔｉ， Ｔ．Ｃ．， Ｓｍｅｄｓ， Ｊ．， Ｌｉｎｄａｈｌ， Ｔ．， Ｐａｗｉｔａｎ， Ｙ．， Ｈａｌｌ， Ｐ．， Ｎｏｒｄｇｒｅｎ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （２００６）． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｇｒａｄｅ ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ ｎｅｗ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６， １０２９２−１０３０１．
Ｌｉ， Ｙ．， Ｘｉｅ， Ｍ．， Ｓｏｎｇ， Ｘ．， Ｇｒａｇｅｎ， Ｓ．， Ｓａｃｈｄｅｖａ， Ｋ．， Ｗａｎ， Ｙ．， ａｎｄ Ｙａｎ， Ｂ． （２００３）． ＤＥＣ１ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＥＣ２ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｅ−ｂｏｘ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７８， １６８９９−１６９０７．
Ｍｉｋｉ， Ｙ．， Ｓｗｅｎｓｅｎ， Ｊ．， Ｓｈａｔｔｕｃｋ−Ｅｉｄｅｎｓ， Ｄ．， Ｆｕｔｒｅａｌ， Ｐ．Ａ．， Ｈａｒｓｈｍａｎ， Ｋ．， Ｔａｖｔｉｇｉａｎ， Ｓ．， Ｌｉｕ， Ｑ．， Ｃｏｃｈｒａｎ， Ｃ．， Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｌ．Ｍ．， Ｄｉｎｇ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ． （１９９４）． Ａ ｓｔｒｏｎｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ ＢＲＣＡ１． Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ２６６， ６６−７１．
Ｍｉｌｌｅｒ， Ｌ．Ｄ．， Ｓｍｅｄｓ， Ｊ．， Ｇｅｏｒｇｅ， Ｊ．， Ｖｅｇａ， Ｖ．Ｂ．， Ｖｅｒｇａｒａ， Ｌ．， Ｐｌｏｎｅｒ， Ａ．， Ｐａｗｉｔａｎ， Ｙ．， Ｈａｌｌ， Ｐ．， Ｋｌａａｒ， Ｓ．， Ｌｉｕ， Ｅ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （２００５）． Ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｐ５３ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ， ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ， ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０２， １３５５０−１３５５５．
Ｍｉｎｎ， Ａ．Ｊ．， Ｇｕｐｔａ， Ｇ．Ｐ．， Ｓｉｅｇｅｌ， Ｐ．Ｍ．， Ｂｏｓ， Ｐ．Ｄ．， Ｓｈｕ， Ｗ．， Ｇｉｒｉ， Ｄ．Ｄ．， Ｖｉａｌｅ， Ａ．， Ｏｌｓｈｅｎ， Ａ．Ｂ．， Ｇｅｒａｌｄ， Ｗ．Ｌ．， ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ， Ｊ． （２００５）． Ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｔｏ ｌｕｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ４３６， ５１８−５２４．
Ｐａｄｕａ， Ｄ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ．Ｈ．， Ｗａｎｇ， Ｑ．， Ｎａｄａｌ， Ｃ．， Ｇｅｒａｌｄ， Ｗ．Ｌ．， Ｇｏｍｉｓ， Ｒ．Ｒ．， ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ， Ｊ． （２００８）． ＴＧＦｂｅｔａ ｐｒｉｍｅｓ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ ｆｏｒ ｌｕｎｇ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｓｅｅｄｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｌｉｋｅ ４． Ｃｅｌｌ １３３， ６６−７７．
Ｐａｗｉｔａｎ， Ｙ．， Ｂｊｏｈｌｅ， Ｊ．， Ａｍｌｅｒ， Ｌ．， Ｂｏｒｇ， Ａ．Ｌ．， Ｅｇｙｈａｚｉ， Ｓ．， Ｈａｌｌ， Ｐ．， Ｈａｎ， Ｘ．， Ｈｏｌｍｂｅｒｇ， Ｌ．， Ｈｕａｎｇ， Ｆ．， Ｋｌａａｒ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２００５）． Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｓｐａｒｅｓ ｅａｒｌｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ： ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｉｎ ｔｗｏ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｃｏｈｏｒｔｓ． Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７， Ｒ９５３−９６４．
Ｐｉｃｃｏｌｏ， Ｓ．， Ａｇｉｕｓ， Ｅ．， Ｌｅｙｎｓ， Ｌ．， Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ， Ｓ．， Ｇｒｕｎｚ， Ｈ．， Ｂｏｕｗｍｅｅｓｔｅｒ， Ｔ．， ａｎｄ Ｄｅ Ｒｏｂｅｒｔｉｓ， Ｅ．Ｍ． （１９９９）． Ｔｈｅ ｈｅａｄ ｉｎｄｕｃｅｒ Ｃｅｒｂｅｒｕｓ ｉｓ ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ Ｎｏｄａｌ， ＢＭＰ ａｎｄ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３９７， ７０７−７１０．
Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｋ．Ｓ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ， Ｍ．Ｊ． （２００５）． Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄａｔａ ｗｉｔｈ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｒ． Ｕ．Ｃ． Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｐａｐｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｐａｐｅｒ １６７．
Ｐｒｅｎｔｉｃｅ， Ｒ．Ｌ．， Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ， Ｌ． Ａ． （１９７８）． Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｒｏｕｐｅｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｄａｔａ ｗｉｔｈ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｄａｔａ． Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ３４， ５７−６７．
Ｓｉｎｇｌｅｔａｒｙ， Ｓ．Ｅ．， ａｎｄ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ， Ｊ．Ｌ． （２００６）． Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｇｉｎｇ： ｗｏｒｋｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｉｘｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＪＣＣ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ． ＣＡ： ａ ｃａｎｃｅｒ ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ５６， ３７−４７．
Ｓｏｔｉｒｉｏｕ， Ｃ．， Ｗｉｒａｐａｔｉ， Ｐ．， Ｌｏｉ， Ｓ．， Ｈａｒｒｉｓ， Ａ．， Ｆｏｘ， Ｓ．， Ｓｍｅｄｓ， Ｊ．， Ｎｏｒｄｇｒｅｎ， Ｈ．， Ｆａｒｍｅｒ， Ｐ．， Ｐｒａｚ， Ｖ．， Ｈａｉｂｅ−Ｋａｉｎｓ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． （２００６）． Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ： ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｇｒａｄｅ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ９８， ２６２−２７２．
Ｓｔｏｒｅｙ， Ｊ．Ｄ． （２００２）． Ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ−Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ６４， ４７９−４９８．
Ｔｕｓｈｅｒ， Ｖ．Ｇ．， Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ， Ｒ．， ａｎｄ Ｃｈｕ， Ｇ． （２００１）． Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８， ５１１６−５１２１．
ｖａｎ ’ｔ Ｖｅｅｒ， Ｌ．Ｊ．， Ｄａｉ， Ｈ．， ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ， Ｍ．Ｊ．， Ｈｅ， Ｙ．Ｄ．， Ｈａｒｔ， Ａ．Ａ．， Ｍａｏ， Ｍ．， Ｐｅｔｅｒｓｅ， Ｈ．Ｌ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｏｙ， Ｋ．， Ｍａｒｔｏｎ， Ｍ．Ｊ．， Ｗｉｔｔｅｖｅｅｎ， Ａ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （２００２）． Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ ４１５， ５３０−５３６．
ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ， Ｍ．Ｊ．， Ｈｅ， Ｙ．Ｄ．， ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ， Ｌ．Ｊ．， Ｄａｉ， Ｈ．， Ｈａｒｔ， Ａ．Ａ．， Ｖｏｓｋｕｉｌ， Ｄ．Ｗ．， Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｇ．Ｊ．， Ｐｅｔｅｒｓｅ， Ｊ．Ｌ．， Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｃ．， Ｍａｒｔｏｎ， Ｍ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２００２）． Ａ ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４７， １９９９−２００９．
Ｗａｎｇ， Ｘ．Ｊ．， Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ， Ｄ．Ａ．， Ｊｉａｎｇ， Ａ．， Ｈｅ， Ｄ．， Ｚｈｏｎｇ， Ｌ．， Ｍｅｄｉｎａ， Ｄ．， Ｂｒｉｎｋｌｅｙ， Ｂ．Ｒ．， ａｎｄ Ｒｏｏｐ， Ｄ．Ｒ． （１９９８）． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｐ５３ ｍｕｔａｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７， ３５−４５．
Ｗａｒｄ， Ｊ．Ｈ． （１９６３）． Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐｉｎｇ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ａｎ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ３０１， ９．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のサイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）の遺伝子発現レベルを単独で又はＳｈａｒｐ１（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）の遺伝子発現レベルと組み合わせて検出するステップを含む、乳癌患者の再発リスクの評価方法。
【請求項２】
前記検出が、シグナルを測定するステップと、それを取得するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
未知試料中のサイクリンＧ２単独のシグネチャースコア又は好ましくはサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両方のシグネチャースコアを計算するステップを更に含み、前記シグネチャースコアが
【数１】
［式中、
サイクリンＧ２を単独で用いる場合にはＫ＝１であり、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両方を用いる場合にはＫ＝２であり、
【数２】
は未知試料ｉ中のサイクリンＧ２又はＳｈａｒｐ１の発現レベルであり、
【数３】
はそれぞれ、病歴が知られている乳癌患者母集団における、サイクリンＧ２発現レベルの単独の又はＳｈａｒｐ１発現レベルと組み合わされた推定平均値及び推定標準偏差値を表す］
と定義され、０以下のシグネチャースコアが乳癌再発リスクの増大を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出が、分子的手段及び／又は免疫学的手段によって実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記分子的手段が、ＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ディープシーケンシング、ノーザンブロットからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲ又は定量的ＰＣＲである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、乳癌生検材料又は前記乳癌生検材料から単離された核酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
取得シグナルを品質管理するステップと、
シグナルを正規化するステップと、
任意選択で、シグナルを再スケーリングするステップと
を更に含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ｉ）病歴が知られている試料の母集団におけるＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２発現値の平均及び標準偏差
【数４】
に存する最小シグネチャーテンプレートを定義するステップと、
ｉｉ）未知試料中のサイクリンＧ２遺伝子発現又はサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１遺伝子発現に関する、請求項３に記載のシグネチャースコアを計算するステップと、
ｉｉｉ）計算
【数５】
【数６】
［式中、
【数７】
は未知試料中のＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の発現レベルであり、
【数８】
は、病歴が知られている試料から構成されるデータセット全体にわたって計算されたＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の推定平均値及び推定標準偏差値である］
に従って、未知試料を、そのシグネチャースコアが負である場合には最小シグネチャー低群に又はそのシグネチャースコアが正である場合には最小シグネチャー高群に分類するステップと
を更に含み、最小シグネチャー低群への分類が乳癌患者の高い癌再発リスクを示す、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも
シグナルを取得するステップと、
取得シグナルを品質管理するステップと、
取得シグナルを正規化するステップと
を、コンピューターで実行されるソフトウェアによって実施する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９に記載のステップｉ）〜ｉｉｉ）も、コンピューターで実行されるソフトウェアによって実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
サイクリンＧ２及び好ましくは更にＳｈａｒｐ１の遺伝子発現データに関する、請求項９に記載のｉ）の最小シグネチャーテンプレートを計算するステップを含む、サイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１の遺伝子発現データを含む乳癌データセットの分析方法。
【請求項１３】
乳癌患者の癌再発リスクの評価へのサイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）遺伝子発現の使用。
【請求項１４】
Ｓｈａｒｐ１遺伝子発現（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）の評価を更に含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍスケールに従って中等度（グレード２）に分類された乳房腫瘍の更なる分割のための、請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記サイクリンＧ２遺伝子発現が、
ｉ）配列番号１に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するサイクリンＧ２特異的オリゴヌクレオチド、
ｉｉ）抗サイクリンＧ２特異抗体
からなる群から選択される検出試薬によって測定される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記Ｓｈａｒｐ１遺伝子発現が、
ｉ）配列番号２に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するＳｈａｒｐ１特異的オリゴヌクレオチド、
ｉｉ）抗Ｓｈａｒｐ１特異抗体
からなる群から選択される検出試薬によって測定される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
乳癌患者からの試料においてサイクリンＧ２発現を単独で又はＳｈａｒｐ１発現と組み合わせて評価し、癌再発リスクを測定するためのキットであって、
サイクリンＧ２特異的試薬、好ましくは配列番号１に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するオリゴヌクレオチド、
Ｓｈａｒｐ１特異的試薬、好ましくは配列番号２に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するオリゴヌクレオチド、
請求項９に記載のｉ）〜ｉｉｉ）の計算に従って、未知試料のシグネチャースコアを計算し、未知試料を、シグネチャースコアが負の場合には最小シグネチャー低群に又はシグネチャースコアが正である場合には最小シグネチャー高群に分類するための使用説明書
を含み、最小シグネチャー低群への分類が、乳癌患者の高い癌再発リスクを示すキット。
【請求項１９】
前記使用説明書がソフトウェアに含まれている、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
参照標準として、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１標準発現対照高及び低、発現値又は核酸試料を更に含む、請求項１８又は１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記発現値又は核酸試料が、非転移性乳癌細胞株及び／又は高転移性細胞株に由来する、請求項２０に記載のキット。
【請求項１】
試料中のサイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）の遺伝子発現レベルを単独で又はＳｈａｒｐ１（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）の遺伝子発現レベルと組み合わせて検出するステップを含む、乳癌患者の再発リスクの評価方法。
【請求項２】
前記検出が、シグナルを測定するステップと、それを取得するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
未知試料中のサイクリンＧ２単独のシグネチャースコア又は好ましくはサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両方のシグネチャースコアを計算するステップを更に含み、前記シグネチャースコアが
【数１】
［式中、
サイクリンＧ２を単独で用いる場合にはＫ＝１であり、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１の両方を用いる場合にはＫ＝２であり、
【数２】
は未知試料ｉ中のサイクリンＧ２又はＳｈａｒｐ１の発現レベルであり、
【数３】
はそれぞれ、病歴が知られている乳癌患者母集団における、サイクリンＧ２発現レベルの単独の又はＳｈａｒｐ１発現レベルと組み合わされた推定平均値及び推定標準偏差値を表す］
と定義され、０以下のシグネチャースコアが乳癌再発リスクの増大を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出が、分子的手段及び／又は免疫学的手段によって実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記分子的手段が、ＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ディープシーケンシング、ノーザンブロットからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲ又は定量的ＰＣＲである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、乳癌生検材料又は前記乳癌生検材料から単離された核酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
取得シグナルを品質管理するステップと、
シグナルを正規化するステップと、
任意選択で、シグナルを再スケーリングするステップと
を更に含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ｉ）病歴が知られている試料の母集団におけるＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２発現値の平均及び標準偏差
【数４】
に存する最小シグネチャーテンプレートを定義するステップと、
ｉｉ）未知試料中のサイクリンＧ２遺伝子発現又はサイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１遺伝子発現に関する、請求項３に記載のシグネチャースコアを計算するステップと、
ｉｉｉ）計算
【数５】
【数６】
［式中、
【数７】
は未知試料中のＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の発現レベルであり、
【数８】
は、病歴が知られている試料から構成されるデータセット全体にわたって計算されたＳｈａｒｐ１及びサイクリンＧ２の推定平均値及び推定標準偏差値である］
に従って、未知試料を、そのシグネチャースコアが負である場合には最小シグネチャー低群に又はそのシグネチャースコアが正である場合には最小シグネチャー高群に分類するステップと
を更に含み、最小シグネチャー低群への分類が乳癌患者の高い癌再発リスクを示す、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも
シグナルを取得するステップと、
取得シグナルを品質管理するステップと、
取得シグナルを正規化するステップと
を、コンピューターで実行されるソフトウェアによって実施する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９に記載のステップｉ）〜ｉｉｉ）も、コンピューターで実行されるソフトウェアによって実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
サイクリンＧ２及び好ましくは更にＳｈａｒｐ１の遺伝子発現データに関する、請求項９に記載のｉ）の最小シグネチャーテンプレートを計算するステップを含む、サイクリンＧ２及び／又はＳｈａｒｐ１の遺伝子発現データを含む乳癌データセットの分析方法。
【請求項１３】
乳癌患者の癌再発リスクの評価へのサイクリンＧ２（遺伝子ＩＤ＝９０１）遺伝子発現の使用。
【請求項１４】
Ｓｈａｒｐ１遺伝子発現（遺伝子ＩＤ＝７９３６５）の評価を更に含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍスケールに従って中等度（グレード２）に分類された乳房腫瘍の更なる分割のための、請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記サイクリンＧ２遺伝子発現が、
ｉ）配列番号１に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するサイクリンＧ２特異的オリゴヌクレオチド、
ｉｉ）抗サイクリンＧ２特異抗体
からなる群から選択される検出試薬によって測定される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記Ｓｈａｒｐ１遺伝子発現が、
ｉ）配列番号２に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するＳｈａｒｐ１特異的オリゴヌクレオチド、
ｉｉ）抗Ｓｈａｒｐ１特異抗体
からなる群から選択される検出試薬によって測定される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
乳癌患者からの試料においてサイクリンＧ２発現を単独で又はＳｈａｒｐ１発現と組み合わせて評価し、癌再発リスクを測定するためのキットであって、
サイクリンＧ２特異的試薬、好ましくは配列番号１に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するオリゴヌクレオチド、
Ｓｈａｒｐ１特異的試薬、好ましくは配列番号２に由来する１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はその相補配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドに存するオリゴヌクレオチド、
請求項９に記載のｉ）〜ｉｉｉ）の計算に従って、未知試料のシグネチャースコアを計算し、未知試料を、シグネチャースコアが負の場合には最小シグネチャー低群に又はシグネチャースコアが正である場合には最小シグネチャー高群に分類するための使用説明書
を含み、最小シグネチャー低群への分類が、乳癌患者の高い癌再発リスクを示すキット。
【請求項１９】
前記使用説明書がソフトウェアに含まれている、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
参照標準として、サイクリンＧ２及びＳｈａｒｐ１標準発現対照高及び低、発現値又は核酸試料を更に含む、請求項１８又は１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記発現値又は核酸試料が、非転移性乳癌細胞株及び／又は高転移性細胞株に由来する、請求項２０に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５１５５３８（Ｐ２０１２−５１５５３８Ａ）
【公表日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４６６１８（Ｐ２０１１−５４６６１８）
【出願日】平成２１年１月２１日（２００９．１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０６４３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８３８８０
【国際公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（５０２０３５１２８）ユニヴァーシタ デグリ ステューディ ディ パドヴァ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２１日（２００９．１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０６４３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８３８８０
【国際公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（５０２０３５１２８）ユニヴァーシタ デグリ ステューディ ディ パドヴァ (2)
【Ｆターム（参考）】
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