４−ヒドロキシイソロイシン又は２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸の製造法

【課題】ヒドロキシイソロイシン又は２-アミノ-３-メチル-４-ケトペンタン酸の製造方法を提供する。
【解決手段】２-アミノ-３-メチル-４-ケトペンタン酸から４-ヒドロキシイソロイシンを生成する、微生物由来の酵素の存在下で２-アミノ-３-メチル-４-ケトペンタン酸またはその塩を還元反応に供し４-ヒドロキシイソロイシンを生成させる工程を含むことを特徴とする、４-ヒドロキシイソロイシン又はその塩の製造方法。Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの存在下で、Ｌ−イソロイシンを反応させる工程を含む、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法。４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性が低減又は欠失するように改変されている、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有する細菌の存在下で、Ｌ−イソロイシンから（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
スポロボロミセス・グラシリス（Sporobolomyces gracilis）、クリプトコッカス・アルビダス(Cryptococcus albidus)、ロドトゥルラ・マリナ(Rhodotorula marina）、ロドトゥルラ・パリダ（Rhodotorula pallida）、フラボバクテリウム・エステロアロマティクム（Flavobacterium esteroaromaticum）、バシラス・チュリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）、アグロバクテリウム・ラディオバクター(Agrobacterium radiobacter)、プルラリア・プルランス(Pullularia pullulans)、フサリウム・ソラニ(Fusarium solani)、ジベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)、モルティエレラ・イザベリナ(Mortierella isabellina)、モルティエレラ・フミコーラ(Mortierella humicola）、トリコデルマ・レーゼイ(Trichoderma reesei)、オーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、セファロスポリウム・コレミオイデス(Cephalosporium coremioides)、バーティシリウム・アルボ-アトラム（Verticillium albo-atrum）、ピトミセス・メイディカム(Pitomyces maydicum)、ロドコッカス・ルバー(Rhodococcus ruber)、ノカルディア・エスピー（Nocardia sp.）、ストレプトミセス・オリボクロモゲネス（Streptomyces olivochromogenes）、クリニペリス・スティピタリア(Crinipellis stipitaria)、フラムリナ・ベルティペス(Flammulina velutipes)、トリコロマ・マツタケ（Tricholoma matsutake）およびフォミトプシス・プベルタティス(Fomitopsis pubertatis) から選ばれる１種類または２種類以上の微生物に由来する２-アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸還元酵素を２-アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩と接触させ、４-ヒドロキシイソロイシンを生成させる工程を含むことを特徴とする、４-ヒドロキシイソロイシン又はその塩の製造方法。
【請求項２】
微生物が、Sporobolomyces gracilis AKU 4438、Cryptococcus albidus AKU 4507、Rhodotorula marina AKU 4806、Rhodotorula pallida AKU 4810、Flavobacterium esteroaromaticum AKU 146、Bacillus thuringiensis AKU 238、Bacillus thuringiensis ATCC 35646、Agrobacterium radiobacter AKU 301、Pullularia pullulans AKU 3651、Fusarium solani TG-2 AKU 3710、Gibberella fujikuroi AKU 3804、Gibberella fujikuroi AKU 3805、Mortierella isabellina AKU 3999-2、Mortierella humicola AKU 3999-5、Trichoderma reesei AKU 3999-15、Aureobasidium pullulans IFO 4466、Cephalosporium coremioides IG 212、Verticillium albo-atrum IG 504、Pitomyces maydicum IG 611、Rhodococcus ruber NOC 081、Nocardia sp. AKU 2130、Streptomyces olivochromogenes AKU 2301、Crinipellis stipitaria AKU 5507、Flammulina velutipes AKU 5518、AKU 5519、Flammulina velutipes AKU 5520、Flammulina velutipes HATSUYUKI AKU 5608、Tricholoma matsutake IFO 30604およびFomitopsis pubertatis (Lioyd) Imaz. AKU 5709、から選択される微生物である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
酵素が、
（ａ）配列番号１３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および、
（ｂ）配列番号１３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質において１から３０個のアミノ酸残基が付加、欠失、置換または挿入され、かつ、２-アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸還元酵素活性を有するものをコードするＤＮＡ、
から選ばれる一つで形質転換されたエシェリヒア属細菌を培養して得られるものである、請求項１記載の製造方法
【請求項４】
（ａ）配列番号５の塩基配列を含むＤＮＡと、
（ｂ）配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡと、
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列において、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９８％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、
から成る群から選択されるＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡをベクターＤＮＡと連結させることによって得られる組み換えＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３に記載の組み換えＤＮＡで形質転換された細胞。
【請求項７】
培地中で請求項６に記載の細胞を培養し、培地もしくは細胞またはその両方に４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを含む、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法。
【請求項８】
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質と、
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列において、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９８％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
から成る群から選択されるタンパク質。
【請求項９】
２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法であって、
水性溶媒中で、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ、及び
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質と、
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列において、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
から成る群から選択される少なくとも１つの４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの存在下で、Ｌ−イソロイシンを反応させ、
生成する２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸を単離することを含む、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法。
【請求項１０】
２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法であって、
水性溶媒中で、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ、及び
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質と、
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列において、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
と、
から成る群から選択される少なくとも１つの４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼを含有する細菌の存在下で、Ｌ−イソロイシンを反応させ、
生成する２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸を単離することを含む、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法。
【請求項１１】
前記細菌が前記４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性を高めるように改変されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌が、前記Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び前記４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性を高めるように改変されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質の活性が、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることによって高められる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子の発現が、前記タンパク質をコードする該遺伝子の発現制御配列を改変すること、又は該タンパク質をコードする該遺伝子のコピー数を増加させることによって増大される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌がエシェリキア属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、アルトロバクター属、アスペルギルス属又はバチルス属に属する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌が大腸菌（Escherichia coli）、アルトロバクター・シンプレックス（Arthrobacter simplex）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、アルトロバクター・グロビフォルミス（Arthrobactor globiformis）、アルトロバクター・スルフレウス（Arthrobactor sulfureus）、アルトロバクター・ビスコーサス（Arthrobactor viscosus）、又は枯草菌（Bacillus subtilis）に属する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌が細菌培養物、細胞、処理細胞、又は細胞溶解物である、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法であって、
水性溶媒中で、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性の両方を元来有する細菌の存在下で、Ｌ−イソロイシンを反応させ、
生成する（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離することを含み、前記細菌が４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性が低減又は欠失するように改変されている、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法。
【請求項１９】
前記細菌においてＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がオペロンを構成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細菌が、前記Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼの活性を高めるように改変される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌における４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性が、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現の減衰又は抑制によって低減又は欠失する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌がバチルス属、エンテロバクター属、又はシュードモナス属に属する、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌がバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・ワイヘンステファンエンシス（Bacillus weihenstephanensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerance）、又はシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に属する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌が細菌培養物、細胞、処理細胞、又は細胞溶解物である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。

【図１】