４−ヒドロキシ酸を含むポリヒドロキシアルカノエートポリマー製造のための生物学的システム
【課題】代替ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）のモノマー（例えば、４−ヒドロキシ酪酸／４ＨＢ）を合成する新たな株を作り出すために、さらなる遺伝子がＰＨＢプロデューサーに導入され得る組換えプロセス、また唯一の構成物またはコモノマーいずれかとして４ＨＢを含むＰＨＡを合成する生物を、安定に作る方法を提供する。
【解決手段】ＰＨＡシンターゼ、および４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される、異種酵素をコードする遺伝子を、ゲノムに安定に取り込んだ、組換え宿主を用いる上記方法。
【解決手段】ＰＨＡシンターゼ、および４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される、異種酵素をコードする遺伝子を、ゲノムに安定に取り込んだ、組換え宿主を用いる上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、１９９７年９月１９日に出願された、Ｇｊａｌｔ Ｗ．Ｈｕｉｓｍａｎ、Ｆｒａｎｋ Ａ．Ｓｋｒａｌｙ、Ｄａｖｉｄ Ｐ．Ｍａｒｔｉｎ、およびＯｌｉｖｅｒ Ｐ．Ｐｅｏｐｌｅｓによる、４−ヒドロキシ酸を含むポリヒドロキシアルカノエートポリマー製造のための生物学的システムという名称の、米国特許出願第６０／０５９，３７３号に対して優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキアルカノエート］（ＰＨＡ）は、再生可能資源から生産される、生分解性および生体適合性の熱可塑性物質であり、広範な産業適用および生物医学適用を有する（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６，３８−４４）。近年、単一ポリマーであると考えられたポリ−β−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）が、異なるモノマー組成物および広範な物理的性質を有する、広範なクラスのポリエステルに発展した。現在まで、約１００個の異なるモノマーが、ＰＨＡポリマーに取り込まれた（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，１９９５，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８；２１９−２２８）。ＰＨＡを、それらの側鎖の長さおよびそれらの生合成経路によって２つのグループに大まかに分けることは、有用であった。短い側鎖を有するＰＨＡ、例えば、Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸単位、−ＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ−ここで：ｎは、０または整数であり、そしてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は、飽和および不飽和炭化水素ラジカル；ハロゲン置換およびヒドロキシ置換ラジカル；ヒドロキシラジカル；ハロゲンラジカル；窒素置換ラジカル；酸素置換ラジカル；ならびに水素原子から選択される、のホモポリマーであるポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）は、結晶性の熱可塑性物質であるのに対して、長い側鎖を有するＰＨＡはより弾性がある。前者は、約７０年間知られているのに対して（ＬｅｍｏｉｇｎｅおよびＲｏｕｋｈｅｌｍａｎ，１９２５）、後者の物質は、１９８０年代初期に初めて同定された（ｄｅＳｍｅｔら、１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４；８７０−８７８）。しかし、この指摘の前に、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および、５〜１６個の炭素原子を含む１つ以上の長側鎖ヒドロキシ酸単位両方を含む細菌起源のＰＨＡは同定されている（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ，１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：６９１−６９７；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−５１４；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：７１０−７１６；Ｌｅｅら、１９９５、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：９０１−９０９；Ｋａｔｏら、１９９６，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−３７０；Ａｂｅら、１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１１５−１１９；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９６，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４６：２６１−２６７；米国特許第４，８７６，３３１号）。恐らく、２つの生合成経路の組み合わせが、このヒドロキシ酸モノマーを提供する。これらの後者のコポリマーは、ＰＨＢ−コ−ＨＸと呼ばれる。特定の２成分コポリマーの有用な例は、ＰＨＢ−コ−ヒドロキシヘキサン酸を含む（Ｂｒａｎｄｌら、１９８９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１１：４９−５５；ＡｍｏｓおよびＭｃＩｎｅｒｅｙ，１９９１，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５５：１０３−１０６；Ｓｈｉｏｔａｎｉら、１９９４，米国特許第５，２９２，８６０号）。化学合成法もまた、適用試験のために、この型のラセミＰＨＢコポリマーを調製するために使用されている（ＷＯ ９５／２０６１４、ＷＯ ９５／２０６１５、およびＷＯ ９６／２０６２１）。
【０００３】
非常に多くの微生物が、ＰＨＡポリマーの細胞内保存物を蓄積する能力を有する。ポリヒドロキシアルカノエートは、天然の熱可塑性ポリエステルであるので、それらの適用の大多数は、包装およびコーティング適用に現在使用されている石油化学ポリマーの代用としての適用である。ポリマー産業においてありきたりに行われるような混ぜ合わせおよびブレンドにより得られる性能の拡大に加えて、ＰＨＡポリマーファミリーの広範囲な物理的性質は、対応する広範囲な潜在的な最終用途適用を提供する。ＰＨＡは、ヒドロキシ酸モノマー組成に依存する広範な種々の型において生成され得る（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，１９９５，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９−２２８）。この広範なポリマー組成物は、等しく広範なポリマー物理的性質（４０℃〜１８０℃の融解温度範囲、−３５〜５℃のガラス転移温度、結晶化率を制御する能力と関連する０％〜８０％の結晶度、および５〜５００％の破断伸び（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｒｅａｋ）を含む）を反映する。例えば、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）は、ポリプロピレンの特徴に類似した特徴を有するが、一方、ポリ（３−ヒドロキシオクタン酸（ｏｃｔａｎｏａｔｅ））（（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタン酸および（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサン酸のコポリマー）型は、エラストマーのようにふるまい、そしてより長い側鎖を有するＰＨＡは、ワックスに近い挙動を生じる。ＰＨＡはまた、他のポリマーまたは薬剤により可塑性を持たせられ、そしてそれらとブレンドされ得る。１つの特に有用な形態は、水中のＰＨＡラテックスとしての形態である。
【０００４】
モノマー組成物はまた、有機溶媒中の可溶性に影響を及ぼし、これは、広範な溶媒の選択を可能にする。（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および他のヒドロキシ酸コモノマーのコポリマーは、ＰＨＢホモポリマーの可溶性とは著しく異なる可溶性特徴を有する。
【０００５】
現在まで、ＰＨＡは、限定した商業的利用可能性を経験してきており、コポリマーポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシ吉草酸）（ＰＨＢＶ）だけが有意な量で利用可能である。このコポリマーは、細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（以前は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の発酵により生成されてきた。他のＰＨＡの発酵プロセスは開発されている（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅａｐｌｅｓ，１９９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８−４４）。植物作物もまた、これらのポリマーを生成するために遺伝子操作されている。そしてこれは、植物油と並ぶコスト構造（ｃｏｓｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、および石油に基づくポリマーとの直接的な価格競争力を提供する（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅａｐｌｅｓ，１９９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８−４４）。よりありきたりなポリマー合成アプローチ（対応するラクトンの直接縮合および開環重合を含む）もまた調べられた（ＪｅｓｕｄａｓｏｎおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ，１９９４，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２７：２５９５−２６０２、米国特許第５，２８６，８４２号；米国特許第５，５６３，２３９号；米国特許第５，５１６，８８３号；米国特許第５，４６１，１３９号；カナダ特許出願２，００６，５０８）。
【０００６】
モノマー４−ヒドロキシ酪酸を含むＰＨＡポリマー（ＰＨＢ４ＨＢ、Ｄｏｉ，Ｙ．１９９５，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８，５８５−５９９）、または４−ヒドロキシ吉草酸および４−ヒドロキシヘキサン酸含有ＰＨＡポリエステルの合成は記載されている（Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−５１４およびＶａｌｅｎｔｉｎら、１９９４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：７１０−７１６）。これらのポリエステルは、ＰＨＢＶについて最初に記載された方法と同様の方法を用いて製造され、ここで微生物は、モノマーのＰＨＡポリエステルへの取り込みを促進するために、比較的高価な非炭水化物供給材料を与えられる。例えば、ＰＨＢ４ＨＢ生成は、グルコースおよび４−ヒドロキシ酪酸または４−ヒドロキシ酪酸に変換される基質を、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｋｕｎｉｏｋａ，Ｍ．、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．、およびＤｏｉ，Ｙ．１９８８，Ｐｏｌｙｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９：１７４；Ｄｏｉ，Ｙ．、Ｓｅｇａｗａ，Ａ．、およびＫｕｎｉｏｋａ，Ｍ．１９９０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏ．１２：１０６；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．、Ｄｏｉ，Ｙ．、およびＳｃａｎｄｏｌａ，Ｍ．１９９２，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２５：４２３）、Ａ．ｌａｔｕｓ（Ｈｉｒａｍｉｔｓｕ，Ｍ．、Ｋｏｙａｍａ，Ｎ．、およびＤｏｉ，Ｙ．１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５：４６１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ．、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．およびＤｏｉ，Ｙ．１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４：４４５）、ならびにＣｏｍｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．およびＤｏｉ，Ｙ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１８）に与えることにより達成された。４−ヒドロキシ酪酸に変換される基質は、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，８−オクタンジオール、１，１０−デカンジオール、１，１２−ドデカンジオール、および１，４−ブチロラクトンである。ＰＨＢ４ＨＢコポリマーは、ある範囲のポリマー特性をさらに提供する、ある範囲のモノマー組成物を用いて生成され得る。特に、４ＨＢ量が１０重量％より上に増加すると、融解温度（Ｔｍ）は１３０℃以下に減少し、そして破断伸びは４００％より上に増加する（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．、Ｈｉｒａｍｉｔｓｕ，Ｍ．、およびＤｏｉ，Ｙ．，１９９６，Ｐｏｌｙｍ．Ｉｎｔ．３９：１６９）。
【０００７】
４ＨＢ含有ポリマーの形成はまた、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａまたはＥ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢ−４ＨＢ形成の改善を目的とする研究において、組換え株を用いて研究された。４−ヒドロキシ酪酸を炭素源として使用し得ないＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６変異体が選択された。このような変異体は、コポリマー形成について試験された場合、８４％までの４ＨＢが蓄積ＰＨＡに取り込まれた（Ｋｉｔａｍｕｒａ ＳおよびＹ．Ｄｏｉ，１９９４．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｌａｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ，１２，３７３−３７８頁）。ｐｈｂ遺伝子のさらなるコピーを導入することにより、ＰＨＢ−４ＨＢ蓄積が増強された（Ｌｅｅ，Ｙ．−Ｈ．、Ｐａｒｋ，Ｊ．−Ｓ．、およびＨｕｈ，Ｔ．−Ｌ．１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：７７１−７７４）。
【０００８】
生物学的システムにより４ＨＢ含有ＰＨＡを生成する、より費用効率の高い方法を開発することが望ましい。いくつかの要因；基質費用、発酵時間、および下流プロセシング（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）の効率が、ＰＨＡの経済的な生成に重要である。上記の細菌の一般的な特徴は、それらの増殖速度が遅いこと、多くの場合それらが破砕しにくいこと、そしてそれらの遺伝子工学に対する設備（ａｍｅｎｉｔｙ）が制限されていることである。従って、トランスジェニック生物を用いることによりＰＨＡ生成の経済性を改善するプロセスが開発されてきた。ＰＨＢ４ＨＢ形成は、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来する４−ヒドロキシ酪酸経路を用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて達成された（Ｈｅｉｎ，Ｓ．、Ｓｏｈｌｉｎｇ，Ｂ．、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｇ．、およびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．１９９７．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５３：４１１−４１８）。これらの研究において、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよびＰＨＡシンターゼの両方が、プラスミドによりコードされた。その後の研究により、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来する４−ヒドロキシ酪酸経路は、唯一の炭素源としてグルコースからの細胞乾燥重量の５０％までの、そしてモノマーの２．８％が４ＨＢである、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢ−４ＨＢ形成を支持することが示された。これらの株における４ＨＢモノマーは、ＴＣＡサイクルの中間体であるコハク酸に由来することがもっともらしいようである（Ｖａｌｅｎｔｉｎ，Ｈ．Ｅ．およびＤｅｎｎｉｓ，Ｄ．１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８：３３−３８）。これらの研究は、組換え生成生物としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、およびＰＨＡプロデューサー（例えば、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）に由来するＰＨＡ生合成遺伝子に基づいた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、組換えプロセスを提供することであり、それにより、代替ＰＨＡのモノマー（例えば、４ＨＢ）を合成する新たな株を作り出すために、さらなる遺伝子が、トランスジェニックＰＨＢプロデューサーに導入され得る。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、唯一の構成物またはコモノマーいずれかとして４−ヒドロキシ酪酸を含むＰＨＡを合成するトランスジェニック生物を安定に作る、技術および手順を提供することである。
【００１１】
本発明の目的はまた、新たな４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子のスクリーニングシステムを提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、代替ＰＨＡモノマー内因合成のために、生物学的システムにおいて新たな経路を操作する技術および手順を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される異種酵素をコードする遺伝子をゲノムに安定に取り込んだ、組換え宿主を提供する。
【００１４】
１つの実施形態において、上記宿主は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼの両方をそのゲノムに安定に組み込む。
【００１５】
１つの実施形態において、上記宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００１６】
１つの実施形態において、上記異種酵素がポリヒドロキシアルカノエートシンターゼであり、上記宿主は、４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する内因性酵素を発現する。
【００１７】
１つの実施形態において、上記宿主は、β−ケトチオラーゼおよびアセトアセチルＣｏレダクターゼからなる群より選択される酵素を発現する遺伝子をさらに含む。
【００１８】
別の局面において、本発明は、宿主において４ＨＢを含むポリマーの生成を増強するための方法を提供し、この方法は、以下の工程：ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される異種酵素をコードする遺伝子を、この宿主のゲノムに安定に取り込む工程、を包含する。
【００１９】
１つの実施形態において、上記宿主は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼの両方をそのゲノムに安定に組み込む。
【００２０】
１つの実施形態において、上記方法は、上記異種酵素の発現を増強する工程をさらに包含する。
【００２１】
１つの実施形態において、上記発現は、上記宿主を変異させ、続いて基質として４ＨＢを提供し、そして変異宿主によるポリマー生成についてスクリーニングすることにより増強される。
【００２２】
１つの実施形態において、上記方法は、α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸−コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、および４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素を発現する宿主を提供する工程をさらに包含する。
【００２３】
１つの実施形態において、上記方法は、アルギニン、グルタミン、またはプロリンを分解して、γアミノ酪酸を生成する酵素を発現する宿主を提供する工程をさらに包含する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される異種酵素をコードする遺伝子をゲノムに安定に組み込んだ組換え宿主により生成された、４ＨＢポリマーを提供する。
【００２５】
別の局面において、本発明は、異種種宿主ゲノムへの組み込み後に発現を増強するための、プロモーター制御下の４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする単離遺伝子を含む。
【００２６】
トランスジェニック株を用いる、改善した４ＨＢ含有ＰＨＡ生成プロセスが開発された。必要とされるｐｈｂ遺伝子が染色体に組込まれたトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株が記載される。４ＨＢモノマー合成のために、さらなる遺伝子もまた染色体に組込まれる。後者の遺伝子は、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼを有する広範な生物に由来し、そしてここに記載された操作Ｅ．ｃｏｌｉ株においてこの活性をスクリーニングすることにより同定され得る。さらに、４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性の目的のためにさらに改善され得る、内因性Ｅ．ｃｏｌｉ活性が開示される。新たな経路もまた、４ＨＢ生合成経路の中間体（例えば、α−ケトグルタル酸およびγ−アミノ酪酸）の供給のために開示される。これらの経路の多様性は、安価な炭素源（例えば、糖および脂肪酸）からの４ＨＢ含有ＰＨＡの首尾良い生成に重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−４−ヒドロキシ酪酸）合成の最小の生物学的必要条件が定義された。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａに由来するＰＨＡシンターゼの基質の酵素的合成は、当モル量の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および４−ヒドロキシ酪酸と、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼとのインキュベーションにより達成された。直接酵素的重合と一緒にされたインサイチュでのモノマー−ＣｏＡ合成は、得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲにより決定されるように、ＰＨＢ−４ＨＢコポリマー形成をもたらす。唯一の構成物またはコモノマーいずれかとして４−ヒドロキシ酪酸を含むＰＨＡを合成するトランスジェニック生物を操作する技術および手順が開発された。これらのシステムにおいて、トランスジェニック生物は、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（以前は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、またはＰＨＡを合成し得る他の微生物）、あるいは高等植物または植物構成部分（例えば、油糧穀物（アブラナ属、ヒマワリ、ダイズ、トウモロコシ、ベニバナ、アマ、ヤシもしくはココナツ、またはデンプン蓄積植物（ジャガイモ、タピオカ、キャッサバ））の種子）のいずれかである。４−ヒドロキシ酪酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換し得る酵素をコードする遺伝子の同定のためのスクリーニング手順、および正常代謝産物の流れを、（例えば、コハク酸および／またはグルタミン酸から４−ヒドロキシ酪酸に）向け直すための方法が開発された。グラム陽性絶対嫌気性細菌であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来する４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子をコードする遺伝子が同定され、そしてこれを使用して、４−ヒドロキシ酪酸を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてポリ（４−ヒドロキシ酪酸）蓄積をもたらす４−ヒドロキシル−ＣｏＡに変換するために、この酵素活性をトランスジェニック生物において発現した。トランスジーンから機能的ＰＨＡシンターゼを発現する細菌、ならびにトランスジェニック植物作物においてこれらの遺伝子を発現するための方法が記載される。
【００２８】
新たな４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子についてのスクリーニングシステムもまた記載される。ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子が染色体に組み込まれ、そしてＰＨＡ合成を維持するレベルまで発現された、トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株が開発された。これらのトランスジェニック株を用いて、異なる生物学的供給源に由来するゲノムライブラリーが、代替ＰＨＡ前駆体（例えば、４−ヒドロキシ酪酸）をＰＨＡシンターゼの対応する基質に変換する活性についてスクリーニングされ得る。
【００２９】
代替ＰＨＡモノマー内因合成のために、生物学的システムにおいて新たな経路を操作する技術および手順が提供される。任意のＰＨＡ生成生物（細菌および植物作物を含む）の代謝は、代謝工学によりＰＨＡ合成のための特定の代謝産物を供給するように向け直され得る。このアプローチを有効にするために、共通の代謝中間体のうちの１つから所望のモノマーに導く新たな生化学的経路を開発する必要がある。このような経路は、１つの生物に存在する必要はない。なぜなら、個々の工程が遺伝子工学技術を用いて選択した生成生物において再構成され得るからである。
【００３０】
補充供給原料に由来する代替モノマーの取込みは、特定の欠点を有する。第１に、ファーメンターへの追加供給は、それらが基幹施設を拡大させ、そしてさらなる品質管理を課するので多額の費用がかかる。第２に、モノマー前駆体の追加は、モノマープールおよびＰＨＡ組成物の一定組成を達成するために、きちんと管理される必要がある。Ｐ（４ＨＢ）またはＰＨＢ−コ−４ＨＢ合成のようなＥ．ｃｏｌｉを操作する方法は、唯一の炭素源としての安価な炭水化物供給原料（例えば、グルコース、スクロース、キシロース、およびラクトース）から生じる。λ−ヒドロキシ酪酸分路における酵素活性が高められる一方、この分路から中間体を排出する酵素活性が低減される。代替経路は、コハク酸から４ＨＢを生じる。代謝工学における同様のアプローチにより、現在４−ヒドロキシ酪酸コポリマーを補基質（ｃｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ）から生成し得る生物（例えば、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａ．ｌａｔｕｓ、およびＣｏｍａｍｏｎａｓ）において、ならびに異種ＰＨＡシンターゼ遺伝子（単数または複数）からＰＨＡ合成を発現するトランスジェニック細菌および植物作物システムにおいて、４ＨＢ含有ＰＨＡ生成が適応され得る。
【００３１】
この経路に関与する全ての遺伝子の発現が適切であることは、組換えＥ．ｃｏｌｉ株における効率的なＰＨＡ合成に重要である。このために、目的の遺伝子は、染色体外ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）（これは、本質的に、コピー数効果およびその結果として高発現レベルをもたらす）から発現され得るか、またはより好ましくは、それらは染色体から発現され得る。商品型産物の大規模発酵について、プラスミドに基づくシステムは、プラスミド維持の余分な負担および安定発現問題のために不十分であることが一般的に知られている。これらの欠点は、染色体によりコードされる酵素を使用して、発現が十分かつ安定であるように目的の遺伝子の前にある転写および翻訳シグナルを改善することにより克服され得る。
【００３２】
（４ＨＢコポリマー生成）
ＧｅｒｎｇｒｏｓｓおよびＭａｒｔｉｎは、ＰＨＡシンターゼ基質が、補酵素Ａ（ＣｏＡ）部分の存在を必要とすることを報告した（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．およびＭａｒｔｉｎ，Ｄ．Ｐ．（１９５５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６２７９）。従って、４ＨＢの取り込みに必要とされる前駆体は、４ＨＢ−ＣｏＡである。４−ヒドロキシ酪酸含有ＰＨＡ合成の最小必要条件を決定するために、４−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍから精製された４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＷｉｌｌａｄｓｅｎおよびＢｕｃｋｅｌ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９０）７０：１８７−１９２）、およびＰＨＢシンターゼ（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：９３１１により精製された）の混合物を、ＧｅｒｎｇｒｏｓｓおよびＭａｒｔｉｎ（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．およびＭａｒｔｉｎ，Ｄ．Ｐ．（１９５５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６２７９）により記載されたような条件下でインビトロでインキュベートした。反応産物は単離され、そして４−ヒドロキシ酪酸の取り込みが１Ｈ−ＮＭＲにより確認された。
【００３３】
インビトロでの４−ヒドロキシ酪酸含有ＰＨＡ合成の最小必要条件を確立したので、インビボでのこれらのＰＨＡ合成の最小必要条件は、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼまたは同様の活性をコードする遺伝子、および４−ヒドロキシ酪酸を含むことは明らかになる。基質４−ヒドロキシ酪酸は、ＰＨＡ生成微生物に投与され得るか、または適切な基質から操作生合成経路によりインビボで合成され得る。精製４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼのアミノ酸配列は決定された（ＳｃｈｅｒｆおよびＢｕｃｋｅｌ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）５７：２６９９−２７０１）。この精製タンパク質は酵素消化に供され、続いて得られたペプチドのうち３つのアミノ酸配列分析が行われた。これらのペプチドのアミノ酸配列およびインタクトなタンパク質のＮ末端は、その正体および機能が未知であったＯｒｆＺ遺伝子産物と著しい相同性を示し（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄ）、それによりｏｒｆＺを、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉにおける４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子として同定した。この遺伝子を、ｈｂｃＴと新たに命名した。
【００３４】
この遺伝子の、ＰＨＢシンターゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ株への導入が、４−ヒドロキシ酪酸含有ＰＨＡ合成に十分であるという確認は、以下の通りに行われた。Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａに由来するＰＨＢシンターゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ３７９株においてこの遺伝子の染色体組み込みコピーから発現される。ＰＨＡは、ｈｂｃＴをコードするプラスミドの導入および増殖培地中への４−ヒドロキシ酪酸供給の際に細胞内で形成された。ＰＨＢ経路の他の酵素を提供する遺伝子の非存在下で、蓄積ＰＨＡはＰ４ＨＢである。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ７７７株は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａに由来するβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、およびＰＨＢシンターゼをコードする遺伝子を含む。ｈｂｃＴをコードするプラスミドの導入および増殖培地中への４−ヒドロキシ酪酸供給の際に、ＰＨＢ−４ＨＢコポリマーが形成された。
【００３５】
ＰＨＢ−４ＨＢ生成システムのさらなる開発は、４−ヒドロキシ酪酸が外部から供給される代わりに、内因性中間体から合成されるように、トランスジェニック生物の代謝経路を操作することにより達成される。前駆体４ＨＢ−ＣｏＡへの２つの生化学的経路は、４ＨＢ含有ＰＨＡ生成生物において確立され得る。第１の経路はα−ケトグルタル酸から生じ、第２の経路はコハク酸から生じる。両経路の基質はまた、アミノ酸分解により提供され得る。
【００３６】
（α−ケトグルタル酸から４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの経路）
α−ケトグルタル酸から４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換を可能にする経路は、図２に示される。この経路に関与する酵素は、α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、および４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼである。
【００３７】
これらの活性をコードする遺伝子は、複数の供給源から獲得され得る：
グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇｄｈＡ遺伝子：Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｖａｌｌｅら、Ｇｅｎｅ（１９８４）２７：１９３−１９９およびＶａｌｌｅら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２３：１９９−２０９）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１９９：１４１−１４５）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＤｉＲｕｇｇｉｅｒｏら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９５）６１：１５９−１６４；Ｅｇｇｅｎら、Ｇｅｎｅ（１９９３）１３２：１４３−１４８）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｈｉｂａｔａｅ（Ｂｅｎａｃｈｅｎｈｏｕら（１９９４），Ｇｅｎｅ １４０：１７−２４）、Ｒｕｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｄｕｎｃａｎら、Ａｐｐｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）５８：４０３２−４０３７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｍｉｙａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）１１２：５２−５６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ（Ｔｅｌｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）２０６：１５１−１５９）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９５）２８：１７３−１８８）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｂｏｒｍａｎｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）６：３０１−３０８）、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｓｎｅｄｅｃｏｒら（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：６１６２−６１６７）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：１７１−１７８）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ（Ｃｏｃｋら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）１７：１０２３−１４４）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｎａｇａｓｕら、Ｇｅｎｅ（１９８４）３７：２４７−２５３）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（Ｋｉｎｎａｉｒｄら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２５３−２６０）、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ（Ｙｅｅら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：７５３９−７５４４）。
【００３８】
グルタミン酸−コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼをコードするｇａｄＡおよび／またはｇａｄＢ：Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭｅｔｚｅｒおよびＨａｌｐｅｒｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２：３２５０−３２５６、およびＢａｒｔｓｃｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２：７０３５−７０４２）、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＡｎｄｒｅおよびＪａｕｎｉａｕｘ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９９０）１８：３０４９）。
【００３９】
４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼをコードする４ｈｂＤ遺伝子：Ｃ．Ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，８７１−８８０）。
【００４０】
４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子：Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ＷｉｌｌａｄｓｅｎおよびＢｕｃｋｅｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９０）７０：１８７−１９２）または：Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，８７１−８８０）。
【００４１】
哺乳動物または植物起源である、列挙された微生物に加えて、これらの遺伝子の他の供給源：
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ：（Ｓｙｎｔｉｃｈａｋｉら（１９９６）Ｇｅｎｅ １６８：８７−９２）、トウモロコシ（Ｓａｋａｋｉｂａｒａら（１９９５），Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６：７８９−７９７）、ヒト（Ｔｚｉｍａｇｉｏｇｉｓら（１９９３），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．９１：４３３−４３８）、マウス（Ｔｚｉｍａｇｉｏｇｉｓら（１９９１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０８９：２５０−２５３）、Ａｍｕｒｏら（１９９０），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０４９：２１６−２１８）。
【００４２】
α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ：（Ｐａｒｋら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７６３６−７６３９）、Ｋｗｏｎら（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：７２１５−７２１６）、ラット（Ｔｈａｋｕｒら（１９８８），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．１６：２３５−２４３）、ウサギ（Ｋｉｒｂｙら、（１９８５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３０：４８１−４８８）。
【００４３】
グルタミン酸デカルボキシラーゼ：トマト（Ｇａｌｌｅｇｏら（１９９５），Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：１１４３−１１５１）、ヒト（Ｂｕら、（１９９４），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２１：２２２−２２８）、ネコ（Ｃｈｕら、（１９９４），Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１３：２８７−２９５）、植物（Ｂａｕｍら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６１０−１９６１７）。
【００４４】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ発現の調節は、主にＥ．ｃｏｌｉにおいて研究された。対応するｇｄｈＡ遺伝子は、グルコース／アンモニア最小培地において高発現され、そして中程度にカタボライト抑制される。過剰なグルタミン酸は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣによりコードされる）により分解される。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子下流の２つのＲＥＰ配列はｍＲＮＡ安定化に関与する。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、グルコースによる同様の調節を示す。Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓおよびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの両方に由来するグルタミン酸デヒドロゲナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される。なぜならそれらが、ｇｄｈＡ変異を相補するからである。
【００４５】
ｇａｂ遺伝子クラスターは、グルコースおよびアンモニアによるカタボライト抑制のために、低構成性レベルでしか発現されない。わずかな窒素源または炭素源としてのコハク酸が供給される場合、このオペロンは抑制解除される。従って、ｇａｂＣによりコードされる特異的リプレッサーに加えて、ｃＡＭＰ／ＣＲＰおよびＮｔｒＣの両方は、このプロモーターを調節する。ｇａｂＴを調節するプロモーターは、ｇａｂＤの上流に位置する。コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ｇａｂＤおよびｓａｄによりコードされる。これらの活性は、Ｐ４ＨＢまたはＰＨＢ−４ＨＢ生成の目的に対して有害であり得るが、それらの発現は、十分なグルコースおよび窒素源の存在により抑制されることが予想される。グルタミン酸デカルボキシラーゼは、腸内細菌科の中で稀な酵素である。これは、ピリドキサールリン酸依存性であり、そして低ｐＨで十分に発現される。
【００４６】
（ＧＡＢＡを介したアルギニン、プトレシン、グルタミン、およびプロリンから４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの経路）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌は、少なくとも４つの異なるアミノ酸（アルギニン、プロリン、グルタミン、およびグルタミン酸）を異化してＧＡＢＡを生成し得、ＧＡＢＡは、上記のように４−ヒドロキシ−ブチリルＣｏＡに変換され得る。異化経路は図３に示される。
【００４７】
Ｅ．ｃｏｌｉは、アルギニンを脱炭酸してアグマチンにし得る、ｓｐｅＡおよびａｄｉによりコードされる少なくとも２つの活性を含む。プトレシンおよび尿素は、ｓｐｅＢによりコードされるアグマチンウレオヒドロラーゼの作用によりアグマチンから形成される。プトレシンは、ｐａｔ遺伝子産物であるプトレシンアミノトランスフェラーゼにより触媒される反応において、アミノ基をα−ケトグルタル酸に与えて４−アミノブチルアルデヒドおよびグルタミン酸を形成する。４−アミノブチルアルデヒドは、ｐｒｒによりコードされるアミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによりＧＡＢＡに酸化される。アグマチンウレオヒドロラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、およびアミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼの合成は、カタボライト抑制および窒素利用可能性により二重に制御される。アグマチンウレオヒドロラーゼのカタボライト抑制はｃＡＭＰにより軽減され得るが、プトレシンアミノトランスフェラーゼまたはアミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのカタボライト抑制は、ｃＡＭＰにより軽減され得ない。アグマチンウレオヒドロラーゼ合成は、アルギニンおよびアグマチンにより誘導される。アルギニンデカルボキシラーゼ合成は、カタボライト抑制にも窒素制限による刺激にも感受性でなく、基質誘導にも受けない（Ｓｈａｉｂｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：９３８，１９９５）。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、アルギニン生合成よりもむしろ異化に特殊化したと思われる、第２のアルギニンデカルボキシラーゼがあり、そしてこのタンパク質は、ａｄｉ遺伝子によりコードされる（ＳｔｉｍおよびＢｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：１２２１，１９９３）。これは、酸性ｐＨ、嫌気生活、およびリッチな培地の条件下で誘導される。
【００４８】
プロリンは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｐｕｔＡ遺伝子産物により分解され、この遺伝子産物は、プロリンから、ピロリン５−カルボン酸、次いでグルタミン酸への連続酸化を触媒する。第１工程はＦＡＤ依存性であり、従って、ＰｕｔＡタンパク質は膜結合性である。この同じタンパク質はまた、プロリンの非存在下でｐｕｔオペロンのリプレッサーとして働く。このｐｕｔオペロンは、カタボライト抑制を受ける（ＭｃＦａｌｌおよびＮｅｗｍａｎ、３５８−３７９頁、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６）。
【００４９】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、グルタミンは、ｇｌｔＢおよびｇｌｔＤ遺伝子産物であるグルタミン酸シンターゼによりグルタミン酸に変換される。２分子のグルタミン酸が、グルタミンがα−ケトグルタル酸へアミノ基を与えることにより形成される。Ｅ．ｃｏｌｉグルタミン酸シンターゼ活性は、窒素が制限されている場合、この生物がアンモニア含有最小培地において増殖させられた場合に高く、そしてグルタミン酸またはグルタミン酸生成窒素源の存在下で増殖させられた場合に低い（Ｒｅｉｔｚｅｒ，３９１−４０７頁、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６）。
【００５０】
これらの経路は、生物自身の遺伝子に依存するか、または別の供給源に由来するこのような遺伝子を目的の生物に移入することにより、Ｅ．ｃｏｌｉのような生物におけるポリ（４−ヒドロキシ酪酸）生成のために実現され得る。これらの遺伝子は、以下ような多くの生物から獲得され得る：
例えば、アルギニンデカルボキシラーゼをコードするｓｐｅＡ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＭｏｏｒｅおよびＢｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：４６３１，１９９０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（Ｋａｎｅｋｏら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．３：１０９，１９９６）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｔｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ ３８８：５３９，１９９７）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｗａｔｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１４：１５６９，１９９７）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（Ｎａｍら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：１１５６，１９９７）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）（Ｃｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８６３，１９９６）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｐｅｒｅｚ−Ａｍａｄｏｒら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：９９７，１９９５）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（Ｒａｓｔｏｇｉら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：８２９，１９９３）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）（ＢｅｌｌおよびＭａｌｍｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２４：４３１，１９９０）、アブラナ科の植物（Ｂａｒｂａｒｅａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ、Ａｒａｂｉｓ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ、Ａｅｔｈｉｏｎｅｍａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ、Ｃａｐｓｅｌｌａ ｂｕｒｓａ−ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｒｅｎｏｓａ、Ｓｉｓｙｍｂｒｉｕｍ ａｌｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ ｓａｌｓｕｇｉｎｅａ、Ｐｏｌａｎｉｓｉａ ｄｏｄｅｃａｎｄｒａ、Ｓｔａｎｌｅｙａ ｐｉｎｎａｔａ、Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）（Ｇａｌｌｏｗａｙら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１５，１９９８）、ラット（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４７：１４５８，１９９５）。
【００５１】
生分解性アルギニンデカルボキシラーゼをコードするａｄｉ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳｔｉｍおよびＢｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：１２２１，１９９３）。
【００５２】
アグマチンウレオヒドロラーゼをコードするｓｐｅＢ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳｚｕｍａｎｓｋｉおよびＢｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：５３８，１９９０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ（Ａｉｄｏｏら、Ｇｅｎｅ １４７：４１，１９９４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐｒｅｓｅｃａｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３：３３１３，１９９７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（Ｋａｎｅｋｏら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．３：１０９，１９９６）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：７１３５，１９９７）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ｋｌｅｎｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０：３６４，１９９７）。
【００５３】
プトレシンアミノトランスフェラーゼをコードするｐａｔおよびアミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｐｒｒ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｓｈａｉｂｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：９３８，１９８５）。
【００５４】
グルタミン酸シンターゼをコードするｇｌｔＢＤ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｏｌｉｖｅｒら、Ｇｅｎｅ ６０：１，１９８７）、Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ（Ｄｅｃｋｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：３５３，１９９８）、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ（Ｐｅｌａｎｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３０９９，１９９３）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）（Ｇｒｅｇｅｒｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５：２１５，１９９３）、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｆｉｌｅｔｉｃｉら、Ｙｅａｓｔ １２：１３５９，１９９６；Ｃｏｇｏｎｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：７９２，１９９５）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｂｕｌｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１０５８，１９９６）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：７１３５，１９９７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐｅｔｉｔら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２６１，１９９８）、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ（ＭａｎｄａｌおよびＧｈｏｓｈ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：８０２４，１９９３）。
【００５５】
ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼをコードするｐｕｔＡ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｒｅｄｅｎｂａｃｈら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１：７７，１９９６）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｃｏｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５３７，１９９８）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：４９６，１９９５）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３，１９９７）、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：２０７７，１９９４）、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２７７：２０１，１９９６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｓａｖｏｉｚら、Ｇｅｎｅ ８６：１０７，１９９０）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＣｈｅｎおよびＭａｌｏｙ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３；７８３，１９９１）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ａｌｌｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１６７６，１９９３）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｃｈｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１８７２，１９９６）、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｚｕｒｄｏら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：８５，１９９７）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｋｅｕｎｔｊｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：６４３２，１９９５）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ（Ｓｔｒａｕｂら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：２２１，１９９６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（Ｋａｎｅｋｏら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．３：１０９，１９９６）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．（Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：３０１，１９９６）、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１９：８６８，１９９６）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ（Ｔｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ ３８８：５３９，１９９７）、栽培キノコ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）（Ｓｃｈａａｐら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：５７，１９９７）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（ＤｅｌａｕｎｅｙおよびＶｅｒｍａ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２１：２９９，１９９０）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０１：６９，１９９７）。
【００５６】
アルギニン、プロリン、グルタミン、またはグルタミン酸は、ポリ（４−ヒドロキシ酪酸）生成生物に外部から供給され得るか、または宿主において別の炭素源（好ましくは、安価な炭素源（例えば、グルコース））から合成され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、これらの化合物全てをグルコースから合成するが、増殖に十分な程度しか合成しない。
【００５７】
これらの化合物を過剰生成するＥ．ｃｏｌｉ株が開発された。Ｔｕｊｉｍｏｔｏら（米国特許第５，３７８，６１６号）は、グルタミンを蓄積するＥ．ｃｏｌｉ変異体を記載する。Ｍｏｍｏｓｅら（米国特許第４，４３０，４３０号）は、アルギニン蓄積を導く、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるａｒｇＡ遺伝子過剰発現を記載する。プロリン合成遺伝子を過剰発現する、Ｅ．ｃｏｌｉプロリン耐性変異体はプロリンを蓄積し得る（Ｗａｎｇら、Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：２７，１９９０）。細菌プロリン合成遺伝子を過剰発現するタバコ植物もまた、プロリンを蓄積することが示された（Ｓｏｋｈａｎｓａｎｄｚｈら、Ｇｅｎｅｔｉｋａ ３３：９０６，１９９７）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌は、高培地浸透圧モル濃度に対する応答としてグルタミン酸、ＧＡＢＡ、およびプロリンを蓄積する（ＭｃＬａｇｇａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９１１，１９９４；Ｍｅａｓｕｒｅｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５７：３９８，１９７５；Ｓｃｈｌｅｙｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６０：４２４，１９９３；Ｂｏｔｓｆｏｒｄら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：２５６８，１９９４）。
【００５８】
（コハク酸から４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの経路）
コハク酸から４ＨＢ−ＣｏＡへの変換についての完全な生化学的経路（図４）は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉにおいて特徴付けられている（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２，１２１−１２７；Ｗｏｌｆｆら、１９９３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９，１８７６−１８８２；Ｓｃｈｅｒｆら、１９９４，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６１．２３９−２４５）。最近、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉのスクシニルＣｏＡ：ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｃａｔ１）、コハク酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃＤ）、および４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（４ｈｂＤ）をコードする遺伝子が同定された（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，８７１−８８０）。これらの遺伝子は、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ染色体上の連続したＤＮＡ区間に位置し、そして未知機能の３つの遺伝子（ｏｒｆＺ、ｏｒｆＹ、およびｓｉｇＬ）により隣接される。この遺伝子は、増殖培地中のコハク酸により誘導されるようである。４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、これらの研究において同定されなかった。
【００５９】
（４−ヒドロキシ酪酸合成において作用する酵素をコードする代替遺伝子の同定）
α−ケトグルタル酸またはコハク酸いずれかから４ＨＢへの変換において作用する酵素をコードする代替遺伝子は、相補性研究または発現研究により単離され得る：グルタミン酸−コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ遺伝子は、この遺伝子が、窒素源としてのγ−アミノ酪酸利用についてＥ．ｃｏｌｉ ｇａｂＴ変異を相補する能力により、遺伝子ライブラリーから単離され得る。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の変異は相補され得る。代替的４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現は、Ｅ．ｃｏｌｉが、炭素源として４−ヒドロキシ酪酸を利用するのを可能にする。ＢＬＡＳＴＰプログラムおよびＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いた酵素相同性検索により、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにおける４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼホモログの存在が示唆される。これらのタンパク質は、遺伝子索引（ｉｎｄｅｘ）番号：ｇｉ｜１７８８７９５およびｇｉ｜１７９００１５と同定された。
【００６０】
（組み込みの重要性；ポリマー生成についてのスクリーニング）
株が、接種物計画（ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｔｒａｉｎ）および生成操業の期間の間、バイオポリマーを合成する能力を失わないことは、効率的なＰＨＡ生成に重要である。任意のｐｈｂ遺伝子の欠失が産物欠失をもたらすのに対して、新たなモノマーを提供する任意の遺伝子の欠失は、不均一な産物の形成をもたらす。どちらも望ましくなく、従って、株の安定な増殖が必要とされる。不運なことに、トランスフェラーゼまたはシンターゼをコードする遺伝子の単なる組み込みは、有意なポリマー生成をもたらさない。プロモーター領域改変、または変異誘発、または他の既知の技術、それに続くポリマー生成物についてのスクリーニングにより、酵素発現を増強することが必要である。これらの技術を用いて、実施例に記載された株における遺伝子の組み込みは、１００，０００Ｌ容器中での生成に十分な少なくとも５０世代の間、安定であることが測定された。
【００６１】
これらの組換え体ＰＨＡプロデューサーの増殖および形態は、染色体上のｐｈｂ遺伝子の存在により損われない。選択手順の間、個々の組み込み体は、栄養要求株の単離を回避する最小培地プレート上で選択される。異なるｐｈｂ組み込み体の増殖速度は、ＰＨＢプロデューサーが由来する野生型Ｅ．ｃｏｌｉ株のものと同様であった。ｐｈｂ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ染色体への付加は、これらの株が従来の方法によりなお容易に溶解されるので、その株の下流プロセシングに影響を及ぼさなかった。
【００６２】
本発明は、以下の限定しない実施例を参照してさらに理解される。
【実施例】
【００６３】
（実施例１：ＰＨＢ−４ＨＢ合成の最小必要条件）
ポリ−（Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸）（ＰＨＢ）合成の最小必要条件は、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓに由来する精製ＰＨＡシンターゼ、および基質（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡであることが以前に示された。４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍから単離された酵素４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼにより触媒されるトランスチオエステル化反応を介して、アセチル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシ酪酸からインサイチュで調製され得る。この酵素はまた、遊離酸およびアセチル−ＣｏＡからの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの形成を触媒する。従って、Ｐ（３ＨＢ−コ−４ＨＢ）を形成するための、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのインサイチュ合成および（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡとのその共重合の最小必要条件は、緩衝化水溶液中のＰＨＡシンターゼ、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸、アセチル−ＣｏＡ、および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼを含む。これは、以下のように実証された：リン酸カリウム緩衝液（１ｍｌ、１００ｍＭ、ｐＨ７．５）に、以下を添加した：アセチル−ＣｏＡ（０．５ｍＬ、３０ｍＭ）
４−ヒドロキシ酪酸ナトリウム塩（５０μｌ、２Ｍ）
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸ナトリウム塩（１００μｌ、１Ｍ）
４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（１０ｍｇ、２５単位）ＰＨＡシンターゼ（０．０５ｍｇ）
反応物を室温で一晩放置した。不溶性ＰＨＡ顆粒の形成に注目した。不溶性物質を遠心分離によりペレット化し、そして凍結乾燥した（０．６５ｍｇ）。この物質は、粘着性の粘調度を有した。有機物質をＣＤＣｌ３で抽出し、そして１Ｈ−ＮＭＲにより分析した。ＮＭＲ分析により、約２０％の４−ヒドロキシ酪酸を含む、ポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸−コ−４−ヒドロキシ酪酸）の形成が確認された。ＮＭＲスペクトルは、ポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸−コ−４−ヒドロキシ酪酸）の文献スペクトル（Ｄｏｉ，Ｙ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９８８，２１：２７２２−２７２７）と一致する。
【００６４】
（実施例２：プラスミドによりコードされる経路を用いた、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるポリ（４−ヒドロキシ酪酸）（Ｐ４ＨＢ）合成）
Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来するｈｂｃＴ遺伝子を、標準的な分子生物学的技術を用いてＥ．ｃｏｌｉ中で発現した。この遺伝子は、強力なプロモーターの後ろに、そしてこのプロモーターから発現を駆動する条件下で適切なベクターに配置されている。４ＨＢＣＴを生成する。
【００６５】
Ｅ．ｃｏｌｉ株に、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来する４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、およびＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａに由来するＰＨＢシンターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＦＳ３０を備え付けた。これらの遺伝子は、４−ヒドロキシ酪酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換し、続いて、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをポリ（４−ヒドロキシ酪酸）に重合すると予想される。株を、炭素源として４−ヒドロキシ酪酸単独またはグルコースと組み合せて有する、１０％ＬＢ液体培地５０〜１００ｍｌを含む、２５０ｍｌエーレンマイアーフラスコ中で増殖させた。培養物を、１５０または２００ｒｐｍで振盪しながら３０〜３３℃でインキュベートした。培養物を、インキュベーションの２４時間後に採集し、そしてＰＨＡについて分析した。ｐＦＳ３０を有するＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ１１７７（最小４−ＨＢ培地上での増殖について選択された、ＤＨ５α株の自然変異体）は、その細胞乾燥重量の６７％をＰ４ＨＢホモポリマーとして蓄積する。
【００６６】
【表１】
（実施例３：プラスミドによりコードされるＰＨＡシンターゼを用いた、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるポリ（４−ヒドロキシブチレート）（Ｐ４ＨＢ）合成）
Ｅ．ｃｏｌｉ株に、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来する４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む、プラスミドｐＦＳ１６を備え付けた。この遺伝子は、４−ヒドロキシ酪酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換し、続いて、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを、染色体によりコードされるＰＨＢシンターゼによりＰ４ＨＢに重合すると予想される。株を、炭素源として４−ヒドロキシ酪酸単独またはグルコースと組み合せて有する、１０％ＬＢまたは１００％ＬＢ液体培地５０〜１００ｍｌを含む、２５０ｍｌエーレンマイアーフラスコ中で増殖させた。培養物を、０〜２５０ｒｐｍで振盪しながら３２〜３７℃でインキュベートした。培養物を、インキュベーションの２４時間後に採集し、そしてＰＨＡについて分析した。ｐＦＳ１６を有するＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ７６９は、その細胞乾燥重量の６７％をＰ４ＨＢホモポリマーとして蓄積する。従って、４ＨＢ含有ＰＨＡの形成は、プラスミドによりコードされるＰＨＢシンターゼに依存しない。
【００６７】
【表２】
（実施例４：ｐｈｂ遺伝子を染色体へ組み込むためのプラスミドの構築）
プラスミドｐＭＵＸＣ５ｃａｔは、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のｐｈｂＣ遺伝子をレシピエント株の染色体に組み込むために、この遺伝子を転位因子上に含む（図５）。強力な翻訳配列を、ｐＴｒｃベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中で、Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のｐｈａＣ１をコードする、ＰＨＡシンターゼをコードするｐＫＰＳ４から得た。この構築物において、ｐｈａＣ１の前には強力なリボソーム結合部位：ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴ（−ＡＴＧ）がある。上流の配列を含むｐｈａＣ１遺伝子を、平滑末端を持つＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、ｐＵＣ１８ＳｆｉのＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＭＳＸＣ３を作成した。次に平滑末端のｃａｔ遺伝子カセットを、平滑末端のＳｓｅ８３８７ＩＩ部位にクローニングし、ｐＭＳＸＣ３ｃａｔを得た。この時点で、５’末端の２７塩基対を除く全てのｐｈａＣ１をコードする領域を、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片として除去し、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のｐｈｂＣ遺伝子からの対応する断片と置換した。生じるプラスミドｐＭＳＸＣ５ｃａｔは、Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓのＰＨＡシンターゼ由来の９アミノ末端残基、およびＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来の残りの部分を有する、ハイブリッドＰＨＢシンターゼ酵素をコードする。次にＣ５ｃａｔカセットをＡｖｒＩＩ断片として切除し、ｐＵＴＨｇの対応する部位にクローニングした。これにより、このベクターから水銀抵抗性のマーカーを除去した。生じるプラスミドｐＭＵＸＣ５ｃａｔは、ｐｈｂＣの前にプロモーター配列の無いＣ５ｃａｔミニトランスポゾンを含む。従って、組み込みの際のカセットの発現は、組込み部位に隣接したＤＮＡによって与えられる転写配列に依存する。
【００６８】
ｐＭＳＸＴｐ１ＡＢ５ｋａｎ２をｐＭＳＸＴｐ１ｋａｎから次のように構築した（図６および６Ａ）。まず、ｐＭＳＸＴｐ１ｋａｎをＮｄｅＩで消化し、クレノウ酵素で隙間を埋め、再び連結してＮｄｅＩ部位が欠失したｐＭＳＸＴｐ１ｋａｎ２を得た。この欠失は、クローニング手順の後の段階の間に、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａのｐｈｂＡのすぐ上流にある唯一のＮｄｅＩ部位を生じる。
【００６９】
Ｂ５をｐＺＴ１由来のＮａｒＩ断片としてクローニングし、そしてｐＵＣ１８ＳｆｉのＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングして、ｐＭＳＸＢ５を作成した。Ａ５をＦｓｅＩ／ｂｌｕｎｔ−ＳａｌＩ断片としてＥｃｌＩ３６ＩＩ−ＳａｌＩ部位に挿入して、ｐＭＳＸＡＢ５を生じ、そしてＺ．ｒａｍｉｇｅｒａのＡＢ５遺伝子間領域を再生した。プロモーターのないｃａｔカセットをｐＭＳＸＡＢ５のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入して、ｐＭＳＸＡＢ５ｃａｔを作成した。ｐＭＳＸＡＢ５ｃａｔ由来のＡＢ５断片をＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片としてｐＭＳＸＴｐ１ｋａｎ２のＳａｍＩ部位にクローニングし、ｐＭＳＸＴｐ１ＡＢ５ｋａｎ２を与えた。
【００７０】
ｐｈｂＡＢ５の発現を、これらの遺伝子の上流に強力なプロモーターを導入することによって改善した（図６および６Ａ）。このプロモーターを、上流の活性化配列、−３５プロモーター領域、転写開始部位を有する−１０プロモーター領域、および安定化機能を有する可能性のあるｍＲＮＡ配列を提供するオリゴヌクレオチドのセットを用いて生成した。プラスミドｐＭＳＸＴｐ１ＡＢ５ｋａｎ２をＰｓｔＩ／ＸｂａＩで消化し、ｌａｃプロモーターの−１０領域を含む断片を、オリゴヌクレオチド３Ａ（５’ＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＴＣＧＣＧＣＣＧＴＴ）および３Ｂ（５’ＣＴＡＧＡＡＣＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＴＣＣＣＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡ）をアニーリングした後得られた断片として挿入した。次に、コンセンサスＥ．ｃｏｌｉ ｐｈｏボックスおよび−３５プロモーター領域を含む断片を、オリゴヌクレオチド２Ａ（５’ＴＣＣＣＣＴＧＴＣＡＴＡＡＡＧＴＴＧＴＣＡＣＴＧＣＡ）および２Ｂ（５’ＧＴＧＡＣＡＡＣＴＴＴＡＴＧＡＣＡＧＧＧＧＡＴＧＣＡ）をアニーリングした後得られた断片として、ＰｓｔＩ部位に挿入した。次に、ＡＢ５由来の転写開始部位を含むメッセンジャー安定化配列をオリゴヌクレオチド４Ａ（５’ＣＴＡＧＴＧＣＣＧＧＡＣＣＣＧＧＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡ）および４Ｂ（５’ＴＡＴＧＴＧＣＴＴＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡ）をアニーリングした後得られた断片としてＸｂａＩ−ＮｄｅＩ部位に挿入した。生じるプラスミドがｐＭＳＸｐ１２ＡＢ５ｋａｎ２である。Ｔｐ１２ＡＢ５ｋａｎ２を含むＡｖｒＩＩ断片を、ＡｖｒＩＩで切断したｐＵＴＨｇにクローニングし、ＭＢＸ３７９およびＭＢＸ２４５のゲノムへの組込みに使用した。
【００７１】
次にｐ１２ＡＢ５ｋａｎ発現カセットを２．８ｋｂのＡｖｒＩＩ断片として除去し、ｐＵＴＨｇのＡｖｒＩＩ部位へ連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＣＣ１１８λｐｉｒへ形質転換して、プラスミドｐＭＵＸｐ１２ＡＢ５ｋａｎを得た。次にこのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１λｐｉｒへ形質転換し、そしてｐ１２ＡＢ５ｋａｎ発現カセットをＥ．ｃｏｌｉ株の染色体に接合によって挿入するのに使用した（Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｔｅｒｉｏｌ． １９９０、１７２：６５５７−６５６７）。
【００７２】
（実施例５：ｐｈｂ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ染色体への組込み）
（材料および方法）
Ｅ．ｃｏｌｉ株をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）中で３７℃もしくは３０℃で、または最小Ｅ２培地（Ｌａｇｅｖｅｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８８、５４：２９２４−２９３２）中で増殖させた。ＤＮＡの操作は、Ｑｉａｇｅｎプラスミド調製キットまたはＱｉａｇｅｎ染色体ＤＮＡ調製キットを用いて製造会社の推奨に従って精製した、プラスミドおよび染色体ＤＮＡで行った。ＤＮＡは、制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、製造会社の推奨に従って消化した。ＤＮＡ断片は、Ｑｉａｇｅｎキットを使用して０．７％アガロース−Ｔｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡゲルから単離した。
【００７３】
プラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換またはエレクトロポレーションによって導入した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。プラスミドドナー株およびレシピエント株を交配することによって、ｐｈｂ遺伝子のｐＵＴベクターからの転移を達成した（Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２：６５５７）。使用されたレシピエント株は、ＬＳ５２１８またはＭＢＸ２３のいずれかに由来の、自然のナリジクス酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）またはリファンピシン抵抗性のＥ．ｃｏｌｉ変異体であった。ＭＢＸ２３は、ｒｐｏＳ：：Ｔｎ１０対立遺伝子が１１０６株（Ｅｉｓｅｎｓｔａｒｋ）からのＰ１形質導入によって導入された、ＬＪ１４ ｒｐｏＳ：：Ｔｎ１０である。ｐｈｂ遺伝子が染色体に組み込まれたレシピエントを、ミニトランスポゾン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールによって特定される抗生物質耐性を補充したナリジクス酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）またはリファンピシンプレート上で選択した。オリゴヌクレオチドは、ＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓまたはＧｅｎｅｓｙｓから購入した。ＤＮＡ配列をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ３７３Ａ配列分析装置を使用して、自動配列分析によって決定した。ＤＮＡを、シンターゼ連鎖反応を用いて５０μｌの容量で、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ）のＰＣＲ混合物およびＥｒｉｃｏｍｐＤＮＡ増幅装置を使用して増幅した。
【００７４】
蓄積したＰＨＡをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって次のように決定した。凍結乾燥した細胞重量で約２０ｍｇを、内部標準として添加した２ｍｇ／ｍＬの安息香酸と共に、（容量で）９０％の１−ブタノールおよび１０％の濃塩酸を含む混合物２ｍＬ中で、１１０℃、３時間の抽出およびブタノール分解（ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）に同時に供した。生じた混合物の水溶性の成分は３ｍＬの水で抽出して除去した。有機相（全体の流速が２ｍＬ／分で分離比が１：５０の１μＬ）を、ＦＩＤ検出器を備えるＨＰ ５８９０ ＧＣ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）で、ＳＰＢ−１融合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ、内径０．３２ｍｍ、０．２５μｍの膜、Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、Ｐａ．）を用いて、次のような温度プロファイルで分析した。８０℃で２分間、１分間あたり１０℃づつ２５０℃まで上昇、２５０℃で２分。ポリマー中の４−ヒドロキシ酪酸ユニットの存在を試験するための標準として、γ―ブチロラクトンを使用した。これは、ポリ（４−ヒドロキシ酪酸）のように、ブタノール分解の際にｎ−ブチル４−ヒドロキシ酪酸を生成する。ポリマー中の３−ヒドロキシ酪酸ユニットを試験するために使用した標準は、精製ＰＨＢであった。
【００７５】
１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソ−グアニジン（ＮＴＧ）による突然変異誘発を、Ｍｉｌｌｅｒ（Ａ ｓｈｏｒｔ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）によって述べられたように、９９％を殺菌する１ｍｇ／ｍｌのＮＴＧで９０分間の処理を用いることによって行った。
【００７６】
（結果）Ｃ５ｃａｔを、Ｓ１７−１λｐｉｒ（ｐＭＵＸＣ５ｃａｔ）ドナー株を使用して、ＭＢＸ２３の染色体に接合によって導入した。接合混合物をＬＢ／Ｎ１／Ｃｍプレートにまいて、組込み物（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）を得た。その４０％はアンピシリンに感受性であり、これらの株にプラスミドが存在しないことを示している。５つの組込み物がｐＭＳＸＡＢ５ｃａｔ（Ａｐｒ）によって形質転換され、ＰＨＢシンターゼの生合成活性を調べるために、ＬＢ／Ａｐ／Ｃｍ／２％グルコース中で培養した。ＭＢＸ３２６が最も高いシンターゼ活性を発現し、さらなる研究に使用した。ＰＨＢシンターゼの発現は、ＭＢＸ３２６を１００、２００、５００、および１０００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上で、連続的に画線培養することによって増加した。ＭＢＸ３７９株はＭＢＸ３２６由来であり、１０００μｇ／ｍｌまでクロラムフェニコール耐性を示す。
【００７７】
ｐＭＵＸｐ１２ＡＢ５ｋａｎを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１λｐｉｒをＭＢＸ３７９と交配した。ｐｈｂＡＢ５ｋａｎが染色体に組み込まれた遺伝子導入細胞株を、ＬＢ／Ｎ１／Ｋｍプレート上で選択した。組込み物の中で、ＰＨＢを産生するものをＬＢ／グルコースプレート上で同定し、ＭＢＸ６７７（ＭＢＸ３７９：：ｐ１２ＡＢ５ｋａｎ）をさらなる研究に使用した。２％のグルコースを補充した最少培地中では３８％のＰＨＢが蓄積されたのに対し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ／２％グルコース培地で培養されたこの株のＰＨＢ量は５８％であった。
【００７８】
（実施例６：ＰＨＢ産生を高めるための遺伝子導入Ｅ．ｃｏｌｉ株の突然変異誘発）
ＮＴＧまたはＥＭＳを用いた突然変異誘発を、ＭＢＸ６８０におけるＰＨＢ形成を改善させるために使用した。ＭＢＸ６８０をＥＭＳおよびＮＴＧで処理した後、それぞれＭＢＸ７６９およびＭＢＸ７７７株を選択した。これらの細胞株は１％グルコース、０．５％ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒおよび１ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充したＲ２培地で培養し得る。ＭＢＸ７６９を５０ｍｌのＲ−１０培地／０．５％ＣＳＬ中で２または３％のグルコースと共に、３７℃で２０から２６時間培養した。ＰＨＢは細胞乾燥重量の７１％蓄積した。同様に、ＭＢＸ７６９を５０ｍｌのＬＢ中で０．３７５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．８７５のＫ２ＨＰＯ４、および０．２５の（ＮＨ４）２ＳＯ４、および全体で５０ｇ／Ｌのグルコースと共にまたは無しに、培養した（５つのアリコートをインキュベーションの間に加えた）。６３時間インキュベートした後、ＰＨＢは細胞乾燥重量の９６％まで蓄積した。２％グルコースを補充した最少培地中では５７％のＰＢＨが蓄積したのに対して、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ／２％グルコース培地で増殖させたＭＢＸ７７７株中のＰＨＢ量は６７％であった。
【００７９】
ＭＢＸ３７９由来のＣ５ｃａｔ対立遺伝子を、ＬＳ５２１８、ＬＳ５２１８ｆａｄＡＢ１０１：：Ｔｎ１０およびＬＳ５２１８ｆａｄＲ＋ｚｃｆ１１７：：Ｔｎ１０へＰ１形質導入することによって、染色体ｐｈｂＣ遺伝子を有する改良遺伝子導入Ｅ．ｃｏｌｉ株を得た。生じる株はそれぞれＭＢＸ８１６、ＭＢＸ８１７およびＭＢＸ８２１である。
【００８０】
（実施例７：内因性４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を用いたＥ．ｃｏｌｉでのポリ（４−ヒドロキシ酪酸）（Ｐ４ＨＢ）の合成）
Ｅ．ｃｏｌｉは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする内因性の遺伝子を含む。ＭＢＸ８２１および１２３１株を、単独または炭素供給源としてグルコースと組み合わせた４−ヒドロキシ酪酸と共に、５０から１００ｍｌの１０％ＬＢ液体培地を含む２５０ｍｌのエーレンマイヤーフラスコで増殖させた。ＭＢＸ１２３１は、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジンで処理した後、５００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むプレート上で選択して得られた、ＭＢＸ８２１の変異体である。培養物を３２℃から３３℃で、２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。２４時間インキュベートの後培養物を収集し、ＰＨＡに関して分析した。表ｘはこれらの株がＰ４ＨＢホモポリマーとして細胞乾燥重量の２．５から３．５％を蓄積していることを示している。この株におけるＰ４ＨＢ形成は、ＰＨＢシンターゼをコードするプラスミドまたは異種由来の発現した４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼによらない。これらの株を固形培地上で培養すると、Ｐ４ＨＢ量は１１％程度まで向上する。
【００８１】
【表３】
（実施例８：空気非感受性４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼのスクリーニング方法）
Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼは空気、おそらく酸素によって阻害されるようである。高酸素条件下でＰ４ＨＢを合成するために、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードするｈｂｃＴ遺伝子をプラスミド上に有し、そしてＰＨＡシンターゼ遺伝子を染色体上に有するＥ．ｃｏｌｉ株の変異体を増殖させ、そして細胞群の大多数が灰色のコロニーを形成する場合に、白色のコロニー（ＰＨＡの蓄積を示す）を探索することによって、酸素非感受性変異体をスクリーニングし得る。酸素非感受性細胞株ＭＢＸ２４０［ｐＦＳ１６］、ＭＢＸ３７９［ｐＦＳ１６］およびＭＢＸ８３０［ｐＦＳ１６］をこの方法を用いて同定した。変異体の集団は、インビボでもとの株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたはエチルメタンスルホン酸のような化学的突然変異原、または紫外線照射で処理することにより産生し得る。あるいは、ｈｂｃＴを含むプラスミドに、インビトロでヒドロキシルアミンを用いて突然変異を誘発し得る。次に機能的な４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼを発現している変異体を、固形培地または高度に酸素添加した液体培地中で、４−ヒドロキシ酪酸からのＰ４ＨＢ形成に関してスクリーニングする。
【００８２】
（実施例９：４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ生合成酵素をコードする追加のＥ．ｃｏｌｉ遺伝子のスクリーニング方法）
ＭＢＸ８２１または１２３１中で、４ＨＢを４ＨＢＣｏＡに変換する酵素活性の発現を、突然変異誘発によって増大させ得る。固形培地中で増殖させたＭＢＸ８２１および１２３１中のＰ４ＨＢの出現には約１５０時間かかった。改善されたＰ４ＨＢを蓄積する性質を有する変異体は、これらの細胞株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたはエチルメタンスルホン酸のような化学的突然変異原、または紫外線照射を用いて、無作為に突然変異誘発した後スクリーニングし得る。望ましい変異体は、４−ヒドロキシ酪酸存在下で、インキュベーションして２から５日以内に白色コロニーを形成する。
【００８３】
（実施例１０：４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ生合成酵素をコードする他の遺伝子のスクリーニング方法）
植物系が関与する適用には高ＧＣ含有量のＤＮＡが必要であるので、代わりの４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ生合成遺伝子を同定および単離する必要がある。ｈｂｃＴ遺伝子の低いＧＣ含有量は、他のＡＴリッチなＤＮＡを含む微生物から相同遺伝子を同定および単離するのに有用なプローブとなる。しかし、高ＧＣ含有量のｈｂｃＴ遺伝子は、この方法によっては同定されない。染色体に組み込まれたＰＨＡシンターゼをコードするｐｈｂＣ遺伝子を持つＥ．ｃｏｌｉ細胞株を、そのような遺伝子のスクリーニングに使用し得る。遺伝子を植物に導入する適用のためには、高ＧＣ含有量のＤＮＡを使用することが望ましい（Ｐｅｒｌａｋ Ｆ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：３３２４）。例えばｈｂｃＴ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ３７９で発現された場合、この細胞株は通常の栄養素に加えて４−ヒドロキシ酪酸を含む寒天プレート上でＰ４ＨＢポリマーを産生し得る。Ｐ４ＨＢの形成によってコロニーは簡単に区別できる白色の表現型を持つ。従って、例えば、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａ．ｌａｔｕｓ、Ｐ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉおよび他のＰＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ産生生物の遺伝子ライブラリーを、ＭＢＸ３７９または同様の細胞株に導入し、４ＨＢを含む増殖培地に直接プレートする。白色コロニーを選択し、蓄積したＰＨＡの組成を決定する。遺伝子ライブラリーは、ゲノムＤＮＡを単離し、ＤＮＡ断片の代表的な集団をプラスミドベクターにクローニングすることによって、選択した生物から簡単に構築される。代表的なライブラリーは５，０００から１００，０００個のコロニーを持つ。ライブラリーはｐＬＡＦＲ３のようなベクター中の広い宿主域のライブラリーとして、またはｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２のようなベクター中のＥ．ｃｏｌｉライブラリーとしてのいずれかで作製される。ライブラリーのタイプおよびライブラリーを選択した宿主に導入する方法によって、ゲノムＤＮＡ断片は大きいか（１７−３０ｋｂ）または比較的小さいか（２−６ｋｂ）のいずれかである。ライブラリーを、宿主および使用するベクターに依存して、エレクトロポレーション、形質転換または接合によって、スクリーニング細胞株に導入する。
【００８４】
代わりの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼに加えて、４−ヒドロキシ酪酸を基質として利用し得るアシルＣｏＡシンテターゼがこの方法によって単離される。そのような一般的な活性をもつ酵素をコードする遺伝子の例は、長側鎖脂肪酸の取り込みに関与するｆａｄＤ、アセト酢酸および短側鎖脂肪酸の取り込みに関与するａｔｏＤＡ、芳香族化合物の分解に関与するｃａｔＥ、スクシニルＣｏＡシンテターゼをコードするａｃｅＡＢ、アセチルＣｏＡシンテターゼをコードするａｃｓＡおよびａｃｓＢ、およびそのような遺伝子の相同物である。あるいは、無作為に突然変異誘発したアシルＣｏＡシンテターゼまたはトランスフェラーゼ遺伝子を持つプラスミドを導入することによって、これらの酵素の基質特異性を、４−ヒドロキシ酪酸を含むように拡大し得る。あるいは、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のｈｂｃＴ遺伝子と有意な相同性を持つＥ．ｃｏｌｉ由来のｙｇｆＨ遺伝子を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ活性に関して調査し得る。
【００８５】
（実施例１１：α−ケトグルタル酸からの４ＨＢ−ＣｏＡの内因性合成）
α−ケトグルタル酸は図７に示したように、４ＨＢに変換し得る細胞代謝物である。その経路は、ｇａｂＴ、ｇａｄＡ／ｇａｄＢおよびｇｄｈＡ遺伝子産物によって触媒される回路反応からなる。一旦生成物が４−ＨＢデヒドロゲナーゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼによってさらに４ＨＢ−ＣｏＡに変換され、ＰＨＡシンターゼによってＰＨＡに重合されると、この回路からのコハク酸セミアルデヒドの形成に有利である。
【００８６】
この目的のために、次のプラスミドをｐＭＳＸｃａｔで構築した。
【００８７】
１．ｐＭＳＸ−ＴＤ ｈｂｃＴ−４ｈｂＤ２．ｐＭＳＸ−ＡＢＴ ｇｄｈＡ−ｇａｄＢ−ｇａｂＴ３．ｐＭＴＸ−ＤＢＴＴ ４ｈｂＤ−ｇａｄＢ−ｇａｂＴ−ｈｂｃＴ４．ｐＭＳＸ−ＡＢＴＴＤ ｇｄｈＡ−ｇａｄＡ−ｇａｂＴ−ｈｂｃＴ−４ｈｂＤ。
【００８８】
１．４ｈｂＤをｐＣＫ３から次のプライマーを用いたＰＣＲによって得た：４ＨＢＤ−Ｎ：５’ＣＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＧＧＣ（ＥｃｏＲＩ）
４ＨＢＤ−Ｃ：５’ＴＴＴＣＴＣＴＧＡＧＣＴＣＧＧＧＡＴＡＴＴＴＡＡＴＧＡＴＴＧＴＡＧＧ（ＳａｃＩ）。
【００８９】
ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（ｐＭＢＸ−Ｄ）にクローニングした。ｈｂｃＴをｐＣＫ３由来のＳｓｐＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてクローニングし、ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＭＢＸ−Ｄにクローニングして、ｐＭＢＸ−ＴＤを得た。人工的なｈｂｃＴ−４ｈｂＤオペロンをｐＭＢＸ−ＴＤからＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ断片として切り出し、ｐＵＣ１８ＳｆｉまたはｐＭＳＸ−ＴＰ１のこれらの部位へ連結した（それぞれｐＭＳＸ−ＴＤおよびｐＭＳＸ−ＴＰ１ＴＤ）（図８）。ＴＤまたはＴＰ１−ＴＤ断片をＡｖｒＩＩ断片として切り出し、ＡｖｒＩＩで消化したｐＵＴｋａｎに連結した（ｐＭＵＸ−ＴＤおよびｐＭＵＸ−ＴＰ１−ＴＤ）。このプラスミドはＴＤ／ＴＰ１−ＴＤ構築物をＥ．ｃｏｌｉ染色体に無作為に挿入することを可能にする。組み込まれたＴＤの発現は、内因性のプロモーターによって進められ、一方、組み込まれたＴＰ１−ＴＤの発現は、Ｐ１によって進められる。構築物が組み込まれた組換え体を、４−ヒドロキシ酪酸を唯一の炭素供給源として成育する能力に関して選択した。望ましい挿入物を選択するのに抗生物質耐性マーカーは必要でなかった。
【００９０】
コハク酸セミアルデヒドから４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換を促進する酵素をコードする他の遺伝子は、相補性による通常の手順で単離され得る。４ｈｂＤ相同物の導入後、そのような遺伝子によって野生型Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株は４ＨＢを唯一の炭素供給源として利用する能力を得る。
【００９１】
２．ｇｄｈＡ−ｇａｄＡ−ｇａｂＴからなるオペロンをプラスミドｐＵＣ１８Ｓｆｉ中に作製し、ｐＵＴｋａｎベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉ染色体に挿入した。構築物の受容細胞をＥ２／グリセロール／＿γ−ヒドロキシ酪酸／Ｎ１プレート上で単離した。受容細胞株は（ｇａｂＴ突然変異のために）γ−ヒドロキシ酪酸を窒素供給源として利用できないので、オペロンを発現している細胞株のみがこの培地中で成育する。ｇｄｈＡ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ染色体からＰＣＲおよび次のプライマーを用いて得た：ＧＨ−Ｕｐ：５’ＡＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣ（ＥｃｏＲＩ）
ＧＨ−Ｄｎ：５’ＴＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＣＣＧＴＴＧＧ（ＳａｃＩ）。
ｇａｄＢ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ染色体からＰＣＲおよび次のプライマーを用いて得た：ＧＢ−Ｕｐ：５’ＴＡＡＧＡＧＣＴＣＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＧＣＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＡＧＧ（ＳａｃＩ）
ＧＢ−Ｄｎ：５’ＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＣＡＧＧＴＡＴＧＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＧＧＣ（ＸｍａＩ）。
ｇａｂＴ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ染色体からＰＣＲおよび次のプライマーを用いて得た：ＧＴ−Ｕｐ：５’ＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＡＴＧＣＡＧ（ＢａｍＨＩ）
ＧＴ−Ｄｎ：５’ＧＡＴＴＣＴＡＧＡＴＡＧＧＡＧＣＧＧＣＧＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＧＣＣ（ＸｂａＩ）。
【００９２】
上記のプライマーの設計に使用したＤＮＡ配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ、受け入れ番号：Ｋ０２４９９（ｇｄｈＡ）、Ｍ８４０２５およびＸ７１９１７（ｇａｄＢ）、Ｍ８８３３４（ｇａｂＴ）から得た。
【００９３】
３つのＰＣＲ産物を示された酵素で消化し、続いてｐＵＣ１８Ｓｆｉベクターにクローニングした（ｐＭＳＸ−ＡＢＴ）（図９）。オペロンをＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片として切り出し、ｐＭＳＸＴＰ１にクローニングした（ｐＭＳＸ−ＴＰ１−ＡＢＴ）。ＡＢＴまたはＴＰ１−ＡＢＴ挿入物のいずれかをｐＵＴｋａｎに移動させ、ｇｄｈＡ−ｇａｄＡ−ｇａｂＴオペロンをＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４５のｇａｂＴ変異体の染色体中に挿入するのを可能にした。うまく挿入されたものをＥ２／グリセロール／γ−ヒドロキシ酪酸／Ｎ１プレート上で選択した。
【００９４】
ｇａｂＴの発現はγ−ヒドロキシ酪酸を窒素供給源として利用することを可能にするので、この機能を発現する遺伝子は、γ−ヒドロキシ酪酸が唯一の窒素供給源である最少培地プレート上で簡単に選択できる。オペロンの末端にあるｇａｂＴの発現は、直接的に選択することができない上流遺伝子の転写を必要とする。
【００９５】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼはこの経路で、グルタミン酸を触媒量提供する供給源として機能する。十分なグルタミン酸が存在すれば、追加のＧｄｈＡ活性は不必要であり得る。従って望ましい構築物へのこの遺伝子の組込みは任意である。
【００９６】
３．１および２において述べられたオペロンを次のように組み合わせた。ｐＭＳＸ−ＴＤをＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼ処理し、ＸｈｏＩで消化した；ｐＭＳＸ−ＡＢＴまたはｐＭＳＸ−ＢＴをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウ処理し、ＳａｌＩで消化した；次に、精製したＴＤ断片を、調製したｐＭＳＸ−ＡＢＴおよびｐＭＳＸ−ＢＴプラスミドに連結した（図９）。
【００９７】
（実施例１２：ＧＡＢＡ前駆体からの４ＨＢＣｏＡの内因性合成）
通常の代謝物ＧＡＢＡはグルタミン酸由来であり、通常主要な代謝ではコハク酸セミアルデヒドを経てコハク酸に代謝される。Ｐ４ＨＢ形成の、高レベルの中間体を得るために、ＧＡＢＡへの経路を向上させることが望ましくあり得る。グルタミン酸デヒドロゲナーゼによるα−ケトグルタル酸からグルタミン酸への直接の変換の他に、この変換はまた、例えばグルタミン酸および他のアミノ酸、またはプトレッシンのような基質を用いた多くのアミノ基転移反応の一部である。従って、アルギニン（プトレッシンの前駆体）、グルタミン、またはプロリンを過剰に生成する組換えおよび変異生物は、上記で述べられたようにｇａｂＴ、４ｈｂＤ、およびｈｂｃＴを用いて４ＨＢ−ＣｏＡの方へ向けられ得るグルタミン酸およびＧＡＢＡのレベルを増加させた（図１０）。
【００９８】
（実施例１３：コハク酸からの４ＨＢＣｏＡの内因性合成）
おそらくＳｕｃＤ、４ＨＢＤおよびＣａｔ１の逆転作用が、４ＨＢをＥ．ｃｏｌｉでの主要な代謝物であるコハク酸に変換するため、ｃａｔ１、４ｈｂＤおよびｓｕｃＤが導入されている場合、ＨｂｃＴは４−ヒドロキシ酪酸上でＥ．ｃｏｌｉが成育するのには必要でない（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８、８７１−８８０）。原則として、これらの遺伝子は共にコハク酸から４−ＨＢへの変換を可能にする。そこで、図４に描かれた経路をＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃａｔ１、ｓｕｃＤ、４ｈｂＤ、およびｈｂｃＴ遺伝子から組み立て得る。あるいは、これらの遺伝子を、Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍのような他のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種から単離し得る。Ｅ．ｃｏｌｉは自身のスクシニルＣｏＡ：ＣｏＡトランスフェラーゼを持っているが（ｓｕｃＣＤ；Ｍａｔ−Ｊａｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）２１５：２７６−２８０）、Ｅ．ｃｏｌｉではこの活性は顕著でないので、この遺伝子を他の供給源から導入することが望ましい（ＡｍａｒａｓｉｎｇｈａｍおよびＤａｖｉｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９６５）２４０：３６６４−３６６８）。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子の発現をこの適用のために最適化し得る。
【００９９】
ｈｂｃＴ−ｃａｔ１−ｓｕｃＤ−４ｈｂＤからなるオペロンを、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体に組み込むために構築した。組込みが成功した細胞株は、４ｈｂＤが発現していれば、４ＨＢ上で成育し得る（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８、８７１−８８０）。このオペロンの構築は次のように行った（図１１）：ｏｒｆＹ、ｃａｔ１、ｓｕｃＤ、および４ｈｂＤの５’末端を含むｐＣＫ３由来のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を、ｐＭＳＸｃａｔの対応する部位に連結した（ｐＭＳＸ−Ｙ１Ｄ）。４ｈｂＤ遺伝子を、ｐＭＳＸ−ＤのＰｓｔＩ−ＳａｃＩ断片をＰｓｔＩ−ＳｐｈＩで消化したｐＭＳＸ−Ｙ１Ｄに挿入することにより完成させた（ｐＭＳＸ−Ｙ１ＤＤ）。これを行うために、この連結の断片を両方、ＳｐｈＩおよびＳａｃＩ消化の後、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、さらにＰｓｔＩ消化を始める前に平滑末端を作製した。ｐＭＳＸ−Ｙ１ＤＤをＢａｍＨＩおよびＰａｃＩで消化し、次にクレノウ／Ｔ４ポリメラーゼで断片を平滑末端化し、脱リン酸し、次にＳｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ、クレノウ処理したｈｂｃＴ断片をこのベクターに連結することによって、ｐＭＳＸ−Ｙ１ＤＤのｏｒｆＹを、ｈｂｃＴで置換した（ｐＭＳＸ−Ｔ１ＤＤ）。調節配列、ターミネーターおよびプロモーターを提供する断片を、平滑末端断片としてｐＭＳＸ−Ｔ１ＤＤのＳｍａＩ部位に挿入した。このオペロンの組込みプラスミドを、ｐＭＳＸ−Ｔ１ＤＤの挿入配列をＳｆｉＩ断片としてｐＵＴｋａｎにクローニングすることによって構築した。
【０１００】
（実施例１４：向上した内因性の４ＨＢＣｏＡ合成）
中間体がこれらの新しい経路から出て行くのを防ぐために、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ａｓｐＣ）、およびＮＡＤＰおよびＮＡＤ依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｓａｄおよびｇａｂＤ）を不活性化することが望ましいとされ得る。個々の遺伝子の変異を異なった供給源から得た：ａｓｐＣ１３Ｉ変異を含む細胞株をＥ．ｃｏｌｉ ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ ＣｅｎｔｅｒからＣＧＳＣ５７９９細胞株として得る。ａｓｐＣ遺伝子は２１．１分に位置し、従ってＣＡＧ１２０９４（２２．２５分のｚｃｃ−２８２）またはＣＡＧ１８４７８（２０．００分のｚｂｊ−１２３０）のＴｎ１０（Ｔｃ）マーカー、およびＣＡＧ１２１３０（２１．００分のｚｃｂ−３１１１）のＴｎ１０Ｋｍマーカーと連関する。ｇａｂＤ遺伝子の変異は知られておらず、ＰＣＲにより遺伝子をクローニングし、抗生物質耐性のような遺伝的マーカーを挿入し、ｒｅｃＢＣ細胞株またはｐＭＡＫ７０５のようなこの目的のために構築されたベクターを用いて組み込み、最後に、遺伝子を望ましい宿主に運ぶためにバクテリオファージＰ１形質導入することによって、この活性を欠失させ得る。
【０１０１】
（実施例１５：脂肪種子作物におけるＰＨＡシンターゼおよび４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼの発現）
ＰＨＡシンターゼ導入遺伝子を含むトランスジェニック植物で発現され得る、４−ヒドロキシ酪酸から４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを形成することができる（すなわち、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を持つ）酵素をコードする遺伝子の同定方法を、標準的な手順で開発した。ある場合には、β−ケトチオラーゼおよび／またはアセトアセチルＣｏＡ還元酵素のような他のＰＨＡ生合成遺伝子を関心のある植物作物で発現させることもまた、有用であり得る。ＰＨＡシンターゼ導入遺伝子を脂肪種子作物で発現させる方法は記載されており（米国特許第５，２４５，０２３号および米国特許第５，２５０，４３０号；米国特許第５，５０２，２７３号；米国特許第５，５３４，４３２号；米国特許第５，６０２，３２１号；米国特許第５，６１０，０４１号；米国特許第５，６５０，５５５号；米国特許第５，６６３，０６３号；国際公開第ＷＯ９１００９１７号、国際公開第ＷＯ９２１９７４７号、国際公開第ＷＯ９３０２１８７号、国際公開第ＷＯ９３０２１９４号および国際公開第ＷＯ９４１２０１４号、Ｐｏｉｒｉｅｒら、１９９２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：５２０−５２３、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、１９９６ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ ２６、３８−４４）、これらは全て本明細書中に参考として援用される。この目標を達成するために、ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子、または１つより多くのサブユニットを持つＰＨＡシンターゼの場合は複数の遺伝子を微生物から植物細胞に運び、ＰＨＡシンターゼ酵素の適当な産生レベルを得ることが必要である。それに加えて、さらなるＰＨＡ生合成遺伝子、例えばアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子または、ＰＨＡシンターゼ酵素の基質を合成するのに必要な酵素をコードする他の遺伝子を提供することが必要であり得る。多くの場合、当業者に既知の方法で、異なった植物組織または細胞小器官での発現を調節することが望ましい（ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４；１２９３−１２９９；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（１９９５）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．および“Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（１９９６）、Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ，Ｊ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ． Ｅｎｇｌａｎｄ）。これらは全て本明細書中に参考として援用される。米国特許第５，６１０，０４１号は、核の遺伝子からプラスチドへ発現されたタンパク質を導くために、リーダーペプチドを加えることによる、プラスチドへ発現を記載している。より最近の技術は、外来性の遺伝子を組換えにより直接的にプラスチド染色体に入れる直接挿入を可能にする（Ｓｖａｂら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：８５２６−８５３０；ＭｃＢｒｉｄｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：７３０１−７３０５）。プラスチドＲＮＡおよびタンパク質合成機構の原核生物的性質はまた、例えばＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのｐｈｂＣＡＢオペロンのような、微生物のオペロンの発現を可能にする。この技術は、複数の酵素が関与する経路をコードする一連の遺伝子を、プラスチドゲノムに直接組み込むことを可能にする。ｍＲＮＡの安定性および翻訳に関して、プラスチド遺伝子の５’非翻訳領域の重要性を考慮に入れることもまた、重要である（Ｈａｕｓｅｒら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：１４８６−１４９７）。ある場合には、オペロンによってコードされる導入遺伝子の発現を最大限にするために、５’非翻訳領域を再遺伝子操作すること、二次構造エレメントを除去すること、または高度に発現しているプラスチド遺伝子由来のエレメントを加えることが有用であり得る。
【０１０２】
（発明の効果）
本発明によって、組換えプロセスが提供され、それにより、代替ＰＨＡのモノマー（例えば、４ＨＢ）を合成する新たな株を作り出すために、さらなる遺伝子が、トランスジェニックＰＨＢプロデューサーに導入され得る。
【０１０３】
本発明によってさらに、唯一の構成物またはコモノマーいずれかとして４−ヒドロキシ酪酸を含むＰＨＡを合成するトランスジェニック生物を安定に作る、技術および手順が提供される。
【０１０４】
本発明によってまた、新たな４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子のスクリーニングシステムが提供される。
【０１０５】
本発明によってまた、代替ＰＨＡモノマー内因合成のために、生物学的システムにおいて新たな経路を操作する技術および手順が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ ＯｒｆＺ配列と、Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍに由来する４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ（４ＨＢＣＴ）のＮ末端配列および内部配列とのアラインメントである（配列番号１および２）。同一残基を示し、類似残基は＊で示される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｃ．ｋｌｕｙｅｒｉに由来するｏｒｆＺ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｃ．ｋｌｕｙｅｒｉに由来するｏｒｆＺ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、Ｃ．ｋｌｕｙｅｒｉに由来するｏｒｆＺ遺伝子のアミノ酸配列である。
【図２】図２は、ＧＡＢＡ分路によるα−ケトグルタル酸からの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ内因合成の模式図である。１．α−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ；２．グルタミン酸デカルボキシラーゼ；３．ＧＡＢＡトランスアミナーゼ；４．コハク酸セミアルデヒドレダクターゼ；５．４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ。
【図３】図３は、ＧＡＢＡ前駆体からの４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ内因合成の模式図である。ＧＡＢＡは、アミノ酸（例えば、アルギニン、グルタミン、およびプロリン）分解における中間体である。アルギニン分解の遺伝子は、ｓｐｅＡ、ａｄｉ、ｓｐｅＢ、ｐａｔ、およびｐｒｒによりコードされ、グルタミン分解の遺伝子は、ｇｌｔＢＤおよびｇａｄＢによりコードされ、プロリン分解の遺伝子は、ｐｕｔＡおよびｇａｄＢによりコードされる。ＧＡＢＡは、ｇａｂＴ、４ｈｂＤ、およびｈｂｃＴの遺伝子産物により４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換される。
【図４】図４は、コハク酸からの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの内因合成の模式図である。１．スクシニルＣｏＡ−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２．コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；３．４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ；４．４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ。
【図５】図５は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａに由来するＰＨＢシンターゼ（ｐｈｂＣ）遺伝子の、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他のグラム陰性細菌染色体への組み込みのためのプラスミド構築の模式図である。
【図６】図６は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａに由来する３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（ｐｈｂＡ）およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈｂＢ）遺伝子の、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他のグラム陰性細菌染色体への組み込みのためのプラスミド構築の模式図である。
【図６Ａ】図６Ａ（図６のつづき）は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａに由来する３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（ｐｈｂＡ）およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈｂＢ）遺伝子の、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他のグラム陰性細菌染色体への組み込みのためのプラスミド構築の模式図である。
【図７】図７は、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成のための操作生合成経路に関する代謝表示および遺伝子表示の模式図である。ｇａｂＴ、４ｈｂＤ、およびｈｂｃＴの遺伝子産物はこの経路に必要とされ、ｇａｄＡＢおよびｇｄｈＡは有用であるのに対して、ａｓｐＣ、ｓａｄ、およびｇａｂＤの遺伝子産物は、好ましくは、欠失しているか、または不活性である。
【図８】図８は、プラスミドｐＭＳＸ−ＴＤ、およびｐＭＳＸＴｐ１−ＴＤ（これは、α−ケトグルタル酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素を発現する）構築の模式図である。
【図９】図９は、プラスミドｐＭＳＸ−ＡＢＴ、ｐＭＳＸＴｐ１−ＡＢＴ、およびｐＭＳＸＴｐ１−ＢＴ（これは、α−ケトグルタル酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素を発現する）構築の模式図である。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＭＳＸ−ＡＢＴおよびｐＭＳＸ−ＡＢＴ−ＴＤ（これは、α−ケトグルタル酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素を発現する）構築の模式図である。
【図１１】図１１は、コハク酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素を発現する、プラスミドｐＭＳＸ−Ｔ１ＤＤ構築の模式図である。
【技術分野】
【０００１】
本願は、１９９７年９月１９日に出願された、Ｇｊａｌｔ Ｗ．Ｈｕｉｓｍａｎ、Ｆｒａｎｋ Ａ．Ｓｋｒａｌｙ、Ｄａｖｉｄ Ｐ．Ｍａｒｔｉｎ、およびＯｌｉｖｅｒ Ｐ．Ｐｅｏｐｌｅｓによる、４−ヒドロキシ酸を含むポリヒドロキシアルカノエートポリマー製造のための生物学的システムという名称の、米国特許出願第６０／０５９，３７３号に対して優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキアルカノエート］（ＰＨＡ）は、再生可能資源から生産される、生分解性および生体適合性の熱可塑性物質であり、広範な産業適用および生物医学適用を有する（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６，３８−４４）。近年、単一ポリマーであると考えられたポリ−β−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）が、異なるモノマー組成物および広範な物理的性質を有する、広範なクラスのポリエステルに発展した。現在まで、約１００個の異なるモノマーが、ＰＨＡポリマーに取り込まれた（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，１９９５，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８；２１９−２２８）。ＰＨＡを、それらの側鎖の長さおよびそれらの生合成経路によって２つのグループに大まかに分けることは、有用であった。短い側鎖を有するＰＨＡ、例えば、Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸単位、−ＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ−ここで：ｎは、０または整数であり、そしてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は、飽和および不飽和炭化水素ラジカル；ハロゲン置換およびヒドロキシ置換ラジカル；ヒドロキシラジカル；ハロゲンラジカル；窒素置換ラジカル；酸素置換ラジカル；ならびに水素原子から選択される、のホモポリマーであるポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）は、結晶性の熱可塑性物質であるのに対して、長い側鎖を有するＰＨＡはより弾性がある。前者は、約７０年間知られているのに対して（ＬｅｍｏｉｇｎｅおよびＲｏｕｋｈｅｌｍａｎ，１９２５）、後者の物質は、１９８０年代初期に初めて同定された（ｄｅＳｍｅｔら、１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４；８７０−８７８）。しかし、この指摘の前に、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および、５〜１６個の炭素原子を含む１つ以上の長側鎖ヒドロキシ酸単位両方を含む細菌起源のＰＨＡは同定されている（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ，１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：６９１−６９７；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−５１４；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：７１０−７１６；Ｌｅｅら、１９９５、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：９０１−９０９；Ｋａｔｏら、１９９６，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−３７０；Ａｂｅら、１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１１５−１１９；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９６，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４６：２６１−２６７；米国特許第４，８７６，３３１号）。恐らく、２つの生合成経路の組み合わせが、このヒドロキシ酸モノマーを提供する。これらの後者のコポリマーは、ＰＨＢ−コ−ＨＸと呼ばれる。特定の２成分コポリマーの有用な例は、ＰＨＢ−コ−ヒドロキシヘキサン酸を含む（Ｂｒａｎｄｌら、１９８９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１１：４９−５５；ＡｍｏｓおよびＭｃＩｎｅｒｅｙ，１９９１，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５５：１０３−１０６；Ｓｈｉｏｔａｎｉら、１９９４，米国特許第５，２９２，８６０号）。化学合成法もまた、適用試験のために、この型のラセミＰＨＢコポリマーを調製するために使用されている（ＷＯ ９５／２０６１４、ＷＯ ９５／２０６１５、およびＷＯ ９６／２０６２１）。
【０００３】
非常に多くの微生物が、ＰＨＡポリマーの細胞内保存物を蓄積する能力を有する。ポリヒドロキシアルカノエートは、天然の熱可塑性ポリエステルであるので、それらの適用の大多数は、包装およびコーティング適用に現在使用されている石油化学ポリマーの代用としての適用である。ポリマー産業においてありきたりに行われるような混ぜ合わせおよびブレンドにより得られる性能の拡大に加えて、ＰＨＡポリマーファミリーの広範囲な物理的性質は、対応する広範囲な潜在的な最終用途適用を提供する。ＰＨＡは、ヒドロキシ酸モノマー組成に依存する広範な種々の型において生成され得る（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，１９９５，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９−２２８）。この広範なポリマー組成物は、等しく広範なポリマー物理的性質（４０℃〜１８０℃の融解温度範囲、−３５〜５℃のガラス転移温度、結晶化率を制御する能力と関連する０％〜８０％の結晶度、および５〜５００％の破断伸び（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｒｅａｋ）を含む）を反映する。例えば、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）は、ポリプロピレンの特徴に類似した特徴を有するが、一方、ポリ（３−ヒドロキシオクタン酸（ｏｃｔａｎｏａｔｅ））（（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタン酸および（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサン酸のコポリマー）型は、エラストマーのようにふるまい、そしてより長い側鎖を有するＰＨＡは、ワックスに近い挙動を生じる。ＰＨＡはまた、他のポリマーまたは薬剤により可塑性を持たせられ、そしてそれらとブレンドされ得る。１つの特に有用な形態は、水中のＰＨＡラテックスとしての形態である。
【０００４】
モノマー組成物はまた、有機溶媒中の可溶性に影響を及ぼし、これは、広範な溶媒の選択を可能にする。（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および他のヒドロキシ酸コモノマーのコポリマーは、ＰＨＢホモポリマーの可溶性とは著しく異なる可溶性特徴を有する。
【０００５】
現在まで、ＰＨＡは、限定した商業的利用可能性を経験してきており、コポリマーポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシ吉草酸）（ＰＨＢＶ）だけが有意な量で利用可能である。このコポリマーは、細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（以前は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の発酵により生成されてきた。他のＰＨＡの発酵プロセスは開発されている（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅａｐｌｅｓ，１９９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８−４４）。植物作物もまた、これらのポリマーを生成するために遺伝子操作されている。そしてこれは、植物油と並ぶコスト構造（ｃｏｓｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、および石油に基づくポリマーとの直接的な価格競争力を提供する（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅａｐｌｅｓ，１９９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８−４４）。よりありきたりなポリマー合成アプローチ（対応するラクトンの直接縮合および開環重合を含む）もまた調べられた（ＪｅｓｕｄａｓｏｎおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ，１９９４，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２７：２５９５−２６０２、米国特許第５，２８６，８４２号；米国特許第５，５６３，２３９号；米国特許第５，５１６，８８３号；米国特許第５，４６１，１３９号；カナダ特許出願２，００６，５０８）。
【０００６】
モノマー４−ヒドロキシ酪酸を含むＰＨＡポリマー（ＰＨＢ４ＨＢ、Ｄｏｉ，Ｙ．１９９５，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８，５８５−５９９）、または４−ヒドロキシ吉草酸および４−ヒドロキシヘキサン酸含有ＰＨＡポリエステルの合成は記載されている（Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−５１４およびＶａｌｅｎｔｉｎら、１９９４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：７１０−７１６）。これらのポリエステルは、ＰＨＢＶについて最初に記載された方法と同様の方法を用いて製造され、ここで微生物は、モノマーのＰＨＡポリエステルへの取り込みを促進するために、比較的高価な非炭水化物供給材料を与えられる。例えば、ＰＨＢ４ＨＢ生成は、グルコースおよび４−ヒドロキシ酪酸または４−ヒドロキシ酪酸に変換される基質を、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｋｕｎｉｏｋａ，Ｍ．、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．、およびＤｏｉ，Ｙ．１９８８，Ｐｏｌｙｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９：１７４；Ｄｏｉ，Ｙ．、Ｓｅｇａｗａ，Ａ．、およびＫｕｎｉｏｋａ，Ｍ．１９９０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏ．１２：１０６；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．、Ｄｏｉ，Ｙ．、およびＳｃａｎｄｏｌａ，Ｍ．１９９２，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２５：４２３）、Ａ．ｌａｔｕｓ（Ｈｉｒａｍｉｔｓｕ，Ｍ．、Ｋｏｙａｍａ，Ｎ．、およびＤｏｉ，Ｙ．１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５：４６１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ．、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．およびＤｏｉ，Ｙ．１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４：４４５）、ならびにＣｏｍｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．およびＤｏｉ，Ｙ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１８）に与えることにより達成された。４−ヒドロキシ酪酸に変換される基質は、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，８−オクタンジオール、１，１０−デカンジオール、１，１２−ドデカンジオール、および１，４−ブチロラクトンである。ＰＨＢ４ＨＢコポリマーは、ある範囲のポリマー特性をさらに提供する、ある範囲のモノマー組成物を用いて生成され得る。特に、４ＨＢ量が１０重量％より上に増加すると、融解温度（Ｔｍ）は１３０℃以下に減少し、そして破断伸びは４００％より上に増加する（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．、Ｈｉｒａｍｉｔｓｕ，Ｍ．、およびＤｏｉ，Ｙ．，１９９６，Ｐｏｌｙｍ．Ｉｎｔ．３９：１６９）。
【０００７】
４ＨＢ含有ポリマーの形成はまた、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａまたはＥ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢ−４ＨＢ形成の改善を目的とする研究において、組換え株を用いて研究された。４−ヒドロキシ酪酸を炭素源として使用し得ないＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６変異体が選択された。このような変異体は、コポリマー形成について試験された場合、８４％までの４ＨＢが蓄積ＰＨＡに取り込まれた（Ｋｉｔａｍｕｒａ ＳおよびＹ．Ｄｏｉ，１９９４．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｌａｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ，１２，３７３−３７８頁）。ｐｈｂ遺伝子のさらなるコピーを導入することにより、ＰＨＢ−４ＨＢ蓄積が増強された（Ｌｅｅ，Ｙ．−Ｈ．、Ｐａｒｋ，Ｊ．−Ｓ．、およびＨｕｈ，Ｔ．−Ｌ．１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：７７１−７７４）。
【０００８】
生物学的システムにより４ＨＢ含有ＰＨＡを生成する、より費用効率の高い方法を開発することが望ましい。いくつかの要因；基質費用、発酵時間、および下流プロセシング（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）の効率が、ＰＨＡの経済的な生成に重要である。上記の細菌の一般的な特徴は、それらの増殖速度が遅いこと、多くの場合それらが破砕しにくいこと、そしてそれらの遺伝子工学に対する設備（ａｍｅｎｉｔｙ）が制限されていることである。従って、トランスジェニック生物を用いることによりＰＨＡ生成の経済性を改善するプロセスが開発されてきた。ＰＨＢ４ＨＢ形成は、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来する４−ヒドロキシ酪酸経路を用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて達成された（Ｈｅｉｎ，Ｓ．、Ｓｏｈｌｉｎｇ，Ｂ．、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｇ．、およびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．１９９７．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５３：４１１−４１８）。これらの研究において、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよびＰＨＡシンターゼの両方が、プラスミドによりコードされた。その後の研究により、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来する４−ヒドロキシ酪酸経路は、唯一の炭素源としてグルコースからの細胞乾燥重量の５０％までの、そしてモノマーの２．８％が４ＨＢである、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢ−４ＨＢ形成を支持することが示された。これらの株における４ＨＢモノマーは、ＴＣＡサイクルの中間体であるコハク酸に由来することがもっともらしいようである（Ｖａｌｅｎｔｉｎ，Ｈ．Ｅ．およびＤｅｎｎｉｓ，Ｄ．１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８：３３−３８）。これらの研究は、組換え生成生物としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、およびＰＨＡプロデューサー（例えば、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）に由来するＰＨＡ生合成遺伝子に基づいた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、組換えプロセスを提供することであり、それにより、代替ＰＨＡのモノマー（例えば、４ＨＢ）を合成する新たな株を作り出すために、さらなる遺伝子が、トランスジェニックＰＨＢプロデューサーに導入され得る。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、唯一の構成物またはコモノマーいずれかとして４−ヒドロキシ酪酸を含むＰＨＡを合成するトランスジェニック生物を安定に作る、技術および手順を提供することである。
【００１１】
本発明の目的はまた、新たな４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子のスクリーニングシステムを提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、代替ＰＨＡモノマー内因合成のために、生物学的システムにおいて新たな経路を操作する技術および手順を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される異種酵素をコードする遺伝子をゲノムに安定に取り込んだ、組換え宿主を提供する。
【００１４】
１つの実施形態において、上記宿主は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼの両方をそのゲノムに安定に組み込む。
【００１５】
１つの実施形態において、上記宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００１６】
１つの実施形態において、上記異種酵素がポリヒドロキシアルカノエートシンターゼであり、上記宿主は、４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する内因性酵素を発現する。
【００１７】
１つの実施形態において、上記宿主は、β−ケトチオラーゼおよびアセトアセチルＣｏレダクターゼからなる群より選択される酵素を発現する遺伝子をさらに含む。
【００１８】
別の局面において、本発明は、宿主において４ＨＢを含むポリマーの生成を増強するための方法を提供し、この方法は、以下の工程：ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される異種酵素をコードする遺伝子を、この宿主のゲノムに安定に取り込む工程、を包含する。
【００１９】
１つの実施形態において、上記宿主は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼの両方をそのゲノムに安定に組み込む。
【００２０】
１つの実施形態において、上記方法は、上記異種酵素の発現を増強する工程をさらに包含する。
【００２１】
１つの実施形態において、上記発現は、上記宿主を変異させ、続いて基質として４ＨＢを提供し、そして変異宿主によるポリマー生成についてスクリーニングすることにより増強される。
【００２２】
１つの実施形態において、上記方法は、α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸−コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、および４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素を発現する宿主を提供する工程をさらに包含する。
【００２３】
１つの実施形態において、上記方法は、アルギニン、グルタミン、またはプロリンを分解して、γアミノ酪酸を生成する酵素を発現する宿主を提供する工程をさらに包含する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される異種酵素をコードする遺伝子をゲノムに安定に組み込んだ組換え宿主により生成された、４ＨＢポリマーを提供する。
【００２５】
別の局面において、本発明は、異種種宿主ゲノムへの組み込み後に発現を増強するための、プロモーター制御下の４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする単離遺伝子を含む。
【００２６】
トランスジェニック株を用いる、改善した４ＨＢ含有ＰＨＡ生成プロセスが開発された。必要とされるｐｈｂ遺伝子が染色体に組込まれたトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株が記載される。４ＨＢモノマー合成のために、さらなる遺伝子もまた染色体に組込まれる。後者の遺伝子は、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼを有する広範な生物に由来し、そしてここに記載された操作Ｅ．ｃｏｌｉ株においてこの活性をスクリーニングすることにより同定され得る。さらに、４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性の目的のためにさらに改善され得る、内因性Ｅ．ｃｏｌｉ活性が開示される。新たな経路もまた、４ＨＢ生合成経路の中間体（例えば、α−ケトグルタル酸およびγ−アミノ酪酸）の供給のために開示される。これらの経路の多様性は、安価な炭素源（例えば、糖および脂肪酸）からの４ＨＢ含有ＰＨＡの首尾良い生成に重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−４−ヒドロキシ酪酸）合成の最小の生物学的必要条件が定義された。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａに由来するＰＨＡシンターゼの基質の酵素的合成は、当モル量の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および４−ヒドロキシ酪酸と、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼとのインキュベーションにより達成された。直接酵素的重合と一緒にされたインサイチュでのモノマー−ＣｏＡ合成は、得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲにより決定されるように、ＰＨＢ−４ＨＢコポリマー形成をもたらす。唯一の構成物またはコモノマーいずれかとして４−ヒドロキシ酪酸を含むＰＨＡを合成するトランスジェニック生物を操作する技術および手順が開発された。これらのシステムにおいて、トランスジェニック生物は、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（以前は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、またはＰＨＡを合成し得る他の微生物）、あるいは高等植物または植物構成部分（例えば、油糧穀物（アブラナ属、ヒマワリ、ダイズ、トウモロコシ、ベニバナ、アマ、ヤシもしくはココナツ、またはデンプン蓄積植物（ジャガイモ、タピオカ、キャッサバ））の種子）のいずれかである。４−ヒドロキシ酪酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換し得る酵素をコードする遺伝子の同定のためのスクリーニング手順、および正常代謝産物の流れを、（例えば、コハク酸および／またはグルタミン酸から４−ヒドロキシ酪酸に）向け直すための方法が開発された。グラム陽性絶対嫌気性細菌であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来する４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子をコードする遺伝子が同定され、そしてこれを使用して、４−ヒドロキシ酪酸を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてポリ（４−ヒドロキシ酪酸）蓄積をもたらす４−ヒドロキシル−ＣｏＡに変換するために、この酵素活性をトランスジェニック生物において発現した。トランスジーンから機能的ＰＨＡシンターゼを発現する細菌、ならびにトランスジェニック植物作物においてこれらの遺伝子を発現するための方法が記載される。
【００２８】
新たな４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子についてのスクリーニングシステムもまた記載される。ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子が染色体に組み込まれ、そしてＰＨＡ合成を維持するレベルまで発現された、トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株が開発された。これらのトランスジェニック株を用いて、異なる生物学的供給源に由来するゲノムライブラリーが、代替ＰＨＡ前駆体（例えば、４−ヒドロキシ酪酸）をＰＨＡシンターゼの対応する基質に変換する活性についてスクリーニングされ得る。
【００２９】
代替ＰＨＡモノマー内因合成のために、生物学的システムにおいて新たな経路を操作する技術および手順が提供される。任意のＰＨＡ生成生物（細菌および植物作物を含む）の代謝は、代謝工学によりＰＨＡ合成のための特定の代謝産物を供給するように向け直され得る。このアプローチを有効にするために、共通の代謝中間体のうちの１つから所望のモノマーに導く新たな生化学的経路を開発する必要がある。このような経路は、１つの生物に存在する必要はない。なぜなら、個々の工程が遺伝子工学技術を用いて選択した生成生物において再構成され得るからである。
【００３０】
補充供給原料に由来する代替モノマーの取込みは、特定の欠点を有する。第１に、ファーメンターへの追加供給は、それらが基幹施設を拡大させ、そしてさらなる品質管理を課するので多額の費用がかかる。第２に、モノマー前駆体の追加は、モノマープールおよびＰＨＡ組成物の一定組成を達成するために、きちんと管理される必要がある。Ｐ（４ＨＢ）またはＰＨＢ−コ−４ＨＢ合成のようなＥ．ｃｏｌｉを操作する方法は、唯一の炭素源としての安価な炭水化物供給原料（例えば、グルコース、スクロース、キシロース、およびラクトース）から生じる。λ−ヒドロキシ酪酸分路における酵素活性が高められる一方、この分路から中間体を排出する酵素活性が低減される。代替経路は、コハク酸から４ＨＢを生じる。代謝工学における同様のアプローチにより、現在４−ヒドロキシ酪酸コポリマーを補基質（ｃｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ）から生成し得る生物（例えば、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａ．ｌａｔｕｓ、およびＣｏｍａｍｏｎａｓ）において、ならびに異種ＰＨＡシンターゼ遺伝子（単数または複数）からＰＨＡ合成を発現するトランスジェニック細菌および植物作物システムにおいて、４ＨＢ含有ＰＨＡ生成が適応され得る。
【００３１】
この経路に関与する全ての遺伝子の発現が適切であることは、組換えＥ．ｃｏｌｉ株における効率的なＰＨＡ合成に重要である。このために、目的の遺伝子は、染色体外ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）（これは、本質的に、コピー数効果およびその結果として高発現レベルをもたらす）から発現され得るか、またはより好ましくは、それらは染色体から発現され得る。商品型産物の大規模発酵について、プラスミドに基づくシステムは、プラスミド維持の余分な負担および安定発現問題のために不十分であることが一般的に知られている。これらの欠点は、染色体によりコードされる酵素を使用して、発現が十分かつ安定であるように目的の遺伝子の前にある転写および翻訳シグナルを改善することにより克服され得る。
【００３２】
（４ＨＢコポリマー生成）
ＧｅｒｎｇｒｏｓｓおよびＭａｒｔｉｎは、ＰＨＡシンターゼ基質が、補酵素Ａ（ＣｏＡ）部分の存在を必要とすることを報告した（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．およびＭａｒｔｉｎ，Ｄ．Ｐ．（１９５５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６２７９）。従って、４ＨＢの取り込みに必要とされる前駆体は、４ＨＢ−ＣｏＡである。４−ヒドロキシ酪酸含有ＰＨＡ合成の最小必要条件を決定するために、４−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍから精製された４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＷｉｌｌａｄｓｅｎおよびＢｕｃｋｅｌ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９０）７０：１８７−１９２）、およびＰＨＢシンターゼ（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：９３１１により精製された）の混合物を、ＧｅｒｎｇｒｏｓｓおよびＭａｒｔｉｎ（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．およびＭａｒｔｉｎ，Ｄ．Ｐ．（１９５５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６２７９）により記載されたような条件下でインビトロでインキュベートした。反応産物は単離され、そして４−ヒドロキシ酪酸の取り込みが１Ｈ−ＮＭＲにより確認された。
【００３３】
インビトロでの４−ヒドロキシ酪酸含有ＰＨＡ合成の最小必要条件を確立したので、インビボでのこれらのＰＨＡ合成の最小必要条件は、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼまたは同様の活性をコードする遺伝子、および４−ヒドロキシ酪酸を含むことは明らかになる。基質４−ヒドロキシ酪酸は、ＰＨＡ生成微生物に投与され得るか、または適切な基質から操作生合成経路によりインビボで合成され得る。精製４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼのアミノ酸配列は決定された（ＳｃｈｅｒｆおよびＢｕｃｋｅｌ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）５７：２６９９−２７０１）。この精製タンパク質は酵素消化に供され、続いて得られたペプチドのうち３つのアミノ酸配列分析が行われた。これらのペプチドのアミノ酸配列およびインタクトなタンパク質のＮ末端は、その正体および機能が未知であったＯｒｆＺ遺伝子産物と著しい相同性を示し（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄ）、それによりｏｒｆＺを、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉにおける４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子として同定した。この遺伝子を、ｈｂｃＴと新たに命名した。
【００３４】
この遺伝子の、ＰＨＢシンターゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ株への導入が、４−ヒドロキシ酪酸含有ＰＨＡ合成に十分であるという確認は、以下の通りに行われた。Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａに由来するＰＨＢシンターゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ３７９株においてこの遺伝子の染色体組み込みコピーから発現される。ＰＨＡは、ｈｂｃＴをコードするプラスミドの導入および増殖培地中への４−ヒドロキシ酪酸供給の際に細胞内で形成された。ＰＨＢ経路の他の酵素を提供する遺伝子の非存在下で、蓄積ＰＨＡはＰ４ＨＢである。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ７７７株は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａに由来するβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、およびＰＨＢシンターゼをコードする遺伝子を含む。ｈｂｃＴをコードするプラスミドの導入および増殖培地中への４−ヒドロキシ酪酸供給の際に、ＰＨＢ−４ＨＢコポリマーが形成された。
【００３５】
ＰＨＢ−４ＨＢ生成システムのさらなる開発は、４−ヒドロキシ酪酸が外部から供給される代わりに、内因性中間体から合成されるように、トランスジェニック生物の代謝経路を操作することにより達成される。前駆体４ＨＢ−ＣｏＡへの２つの生化学的経路は、４ＨＢ含有ＰＨＡ生成生物において確立され得る。第１の経路はα−ケトグルタル酸から生じ、第２の経路はコハク酸から生じる。両経路の基質はまた、アミノ酸分解により提供され得る。
【００３６】
（α−ケトグルタル酸から４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの経路）
α−ケトグルタル酸から４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換を可能にする経路は、図２に示される。この経路に関与する酵素は、α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、および４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼである。
【００３７】
これらの活性をコードする遺伝子は、複数の供給源から獲得され得る：
グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇｄｈＡ遺伝子：Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｖａｌｌｅら、Ｇｅｎｅ（１９８４）２７：１９３−１９９およびＶａｌｌｅら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２３：１９９−２０９）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１９９：１４１−１４５）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＤｉＲｕｇｇｉｅｒｏら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９５）６１：１５９−１６４；Ｅｇｇｅｎら、Ｇｅｎｅ（１９９３）１３２：１４３−１４８）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｈｉｂａｔａｅ（Ｂｅｎａｃｈｅｎｈｏｕら（１９９４），Ｇｅｎｅ １４０：１７−２４）、Ｒｕｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｄｕｎｃａｎら、Ａｐｐｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）５８：４０３２−４０３７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｍｉｙａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）１１２：５２−５６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ（Ｔｅｌｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）２０６：１５１−１５９）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９５）２８：１７３−１８８）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｂｏｒｍａｎｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）６：３０１−３０８）、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｓｎｅｄｅｃｏｒら（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：６１６２−６１６７）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：１７１−１７８）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ（Ｃｏｃｋら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）１７：１０２３−１４４）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｎａｇａｓｕら、Ｇｅｎｅ（１９８４）３７：２４７−２５３）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（Ｋｉｎｎａｉｒｄら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２５３−２６０）、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ（Ｙｅｅら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：７５３９−７５４４）。
【００３８】
グルタミン酸−コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼをコードするｇａｄＡおよび／またはｇａｄＢ：Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭｅｔｚｅｒおよびＨａｌｐｅｒｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２：３２５０−３２５６、およびＢａｒｔｓｃｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２：７０３５−７０４２）、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＡｎｄｒｅおよびＪａｕｎｉａｕｘ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９９０）１８：３０４９）。
【００３９】
４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼをコードする４ｈｂＤ遺伝子：Ｃ．Ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，８７１−８８０）。
【００４０】
４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子：Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ＷｉｌｌａｄｓｅｎおよびＢｕｃｋｅｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９０）７０：１８７−１９２）または：Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，８７１−８８０）。
【００４１】
哺乳動物または植物起源である、列挙された微生物に加えて、これらの遺伝子の他の供給源：
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ：（Ｓｙｎｔｉｃｈａｋｉら（１９９６）Ｇｅｎｅ １６８：８７−９２）、トウモロコシ（Ｓａｋａｋｉｂａｒａら（１９９５），Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６：７８９−７９７）、ヒト（Ｔｚｉｍａｇｉｏｇｉｓら（１９９３），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．９１：４３３−４３８）、マウス（Ｔｚｉｍａｇｉｏｇｉｓら（１９９１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０８９：２５０−２５３）、Ａｍｕｒｏら（１９９０），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０４９：２１６−２１８）。
【００４２】
α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ：（Ｐａｒｋら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７６３６−７６３９）、Ｋｗｏｎら（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：７２１５−７２１６）、ラット（Ｔｈａｋｕｒら（１９８８），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．１６：２３５−２４３）、ウサギ（Ｋｉｒｂｙら、（１９８５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３０：４８１−４８８）。
【００４３】
グルタミン酸デカルボキシラーゼ：トマト（Ｇａｌｌｅｇｏら（１９９５），Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：１１４３−１１５１）、ヒト（Ｂｕら、（１９９４），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２１：２２２−２２８）、ネコ（Ｃｈｕら、（１９９４），Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１３：２８７−２９５）、植物（Ｂａｕｍら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６１０−１９６１７）。
【００４４】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ発現の調節は、主にＥ．ｃｏｌｉにおいて研究された。対応するｇｄｈＡ遺伝子は、グルコース／アンモニア最小培地において高発現され、そして中程度にカタボライト抑制される。過剰なグルタミン酸は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣによりコードされる）により分解される。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子下流の２つのＲＥＰ配列はｍＲＮＡ安定化に関与する。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、グルコースによる同様の調節を示す。Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓおよびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの両方に由来するグルタミン酸デヒドロゲナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される。なぜならそれらが、ｇｄｈＡ変異を相補するからである。
【００４５】
ｇａｂ遺伝子クラスターは、グルコースおよびアンモニアによるカタボライト抑制のために、低構成性レベルでしか発現されない。わずかな窒素源または炭素源としてのコハク酸が供給される場合、このオペロンは抑制解除される。従って、ｇａｂＣによりコードされる特異的リプレッサーに加えて、ｃＡＭＰ／ＣＲＰおよびＮｔｒＣの両方は、このプロモーターを調節する。ｇａｂＴを調節するプロモーターは、ｇａｂＤの上流に位置する。コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ｇａｂＤおよびｓａｄによりコードされる。これらの活性は、Ｐ４ＨＢまたはＰＨＢ−４ＨＢ生成の目的に対して有害であり得るが、それらの発現は、十分なグルコースおよび窒素源の存在により抑制されることが予想される。グルタミン酸デカルボキシラーゼは、腸内細菌科の中で稀な酵素である。これは、ピリドキサールリン酸依存性であり、そして低ｐＨで十分に発現される。
【００４６】
（ＧＡＢＡを介したアルギニン、プトレシン、グルタミン、およびプロリンから４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの経路）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌は、少なくとも４つの異なるアミノ酸（アルギニン、プロリン、グルタミン、およびグルタミン酸）を異化してＧＡＢＡを生成し得、ＧＡＢＡは、上記のように４−ヒドロキシ−ブチリルＣｏＡに変換され得る。異化経路は図３に示される。
【００４７】
Ｅ．ｃｏｌｉは、アルギニンを脱炭酸してアグマチンにし得る、ｓｐｅＡおよびａｄｉによりコードされる少なくとも２つの活性を含む。プトレシンおよび尿素は、ｓｐｅＢによりコードされるアグマチンウレオヒドロラーゼの作用によりアグマチンから形成される。プトレシンは、ｐａｔ遺伝子産物であるプトレシンアミノトランスフェラーゼにより触媒される反応において、アミノ基をα−ケトグルタル酸に与えて４−アミノブチルアルデヒドおよびグルタミン酸を形成する。４−アミノブチルアルデヒドは、ｐｒｒによりコードされるアミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによりＧＡＢＡに酸化される。アグマチンウレオヒドロラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、およびアミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼの合成は、カタボライト抑制および窒素利用可能性により二重に制御される。アグマチンウレオヒドロラーゼのカタボライト抑制はｃＡＭＰにより軽減され得るが、プトレシンアミノトランスフェラーゼまたはアミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのカタボライト抑制は、ｃＡＭＰにより軽減され得ない。アグマチンウレオヒドロラーゼ合成は、アルギニンおよびアグマチンにより誘導される。アルギニンデカルボキシラーゼ合成は、カタボライト抑制にも窒素制限による刺激にも感受性でなく、基質誘導にも受けない（Ｓｈａｉｂｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：９３８，１９９５）。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、アルギニン生合成よりもむしろ異化に特殊化したと思われる、第２のアルギニンデカルボキシラーゼがあり、そしてこのタンパク質は、ａｄｉ遺伝子によりコードされる（ＳｔｉｍおよびＢｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：１２２１，１９９３）。これは、酸性ｐＨ、嫌気生活、およびリッチな培地の条件下で誘導される。
【００４８】
プロリンは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｐｕｔＡ遺伝子産物により分解され、この遺伝子産物は、プロリンから、ピロリン５−カルボン酸、次いでグルタミン酸への連続酸化を触媒する。第１工程はＦＡＤ依存性であり、従って、ＰｕｔＡタンパク質は膜結合性である。この同じタンパク質はまた、プロリンの非存在下でｐｕｔオペロンのリプレッサーとして働く。このｐｕｔオペロンは、カタボライト抑制を受ける（ＭｃＦａｌｌおよびＮｅｗｍａｎ、３５８−３７９頁、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６）。
【００４９】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、グルタミンは、ｇｌｔＢおよびｇｌｔＤ遺伝子産物であるグルタミン酸シンターゼによりグルタミン酸に変換される。２分子のグルタミン酸が、グルタミンがα−ケトグルタル酸へアミノ基を与えることにより形成される。Ｅ．ｃｏｌｉグルタミン酸シンターゼ活性は、窒素が制限されている場合、この生物がアンモニア含有最小培地において増殖させられた場合に高く、そしてグルタミン酸またはグルタミン酸生成窒素源の存在下で増殖させられた場合に低い（Ｒｅｉｔｚｅｒ，３９１−４０７頁、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６）。
【００５０】
これらの経路は、生物自身の遺伝子に依存するか、または別の供給源に由来するこのような遺伝子を目的の生物に移入することにより、Ｅ．ｃｏｌｉのような生物におけるポリ（４−ヒドロキシ酪酸）生成のために実現され得る。これらの遺伝子は、以下ような多くの生物から獲得され得る：
例えば、アルギニンデカルボキシラーゼをコードするｓｐｅＡ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＭｏｏｒｅおよびＢｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：４６３１，１９９０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（Ｋａｎｅｋｏら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．３：１０９，１９９６）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｔｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ ３８８：５３９，１９９７）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｗａｔｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１４：１５６９，１９９７）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（Ｎａｍら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：１１５６，１９９７）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）（Ｃｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８６３，１９９６）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｐｅｒｅｚ−Ａｍａｄｏｒら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：９９７，１９９５）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（Ｒａｓｔｏｇｉら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：８２９，１９９３）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）（ＢｅｌｌおよびＭａｌｍｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２４：４３１，１９９０）、アブラナ科の植物（Ｂａｒｂａｒｅａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ、Ａｒａｂｉｓ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ、Ａｅｔｈｉｏｎｅｍａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ、Ｃａｐｓｅｌｌａ ｂｕｒｓａ−ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｒｅｎｏｓａ、Ｓｉｓｙｍｂｒｉｕｍ ａｌｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ ｓａｌｓｕｇｉｎｅａ、Ｐｏｌａｎｉｓｉａ ｄｏｄｅｃａｎｄｒａ、Ｓｔａｎｌｅｙａ ｐｉｎｎａｔａ、Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）（Ｇａｌｌｏｗａｙら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１５，１９９８）、ラット（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４７：１４５８，１９９５）。
【００５１】
生分解性アルギニンデカルボキシラーゼをコードするａｄｉ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳｔｉｍおよびＢｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：１２２１，１９９３）。
【００５２】
アグマチンウレオヒドロラーゼをコードするｓｐｅＢ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳｚｕｍａｎｓｋｉおよびＢｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：５３８，１９９０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ（Ａｉｄｏｏら、Ｇｅｎｅ １４７：４１，１９９４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐｒｅｓｅｃａｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３：３３１３，１９９７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（Ｋａｎｅｋｏら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．３：１０９，１９９６）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：７１３５，１９９７）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ｋｌｅｎｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０：３６４，１９９７）。
【００５３】
プトレシンアミノトランスフェラーゼをコードするｐａｔおよびアミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするｐｒｒ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｓｈａｉｂｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：９３８，１９８５）。
【００５４】
グルタミン酸シンターゼをコードするｇｌｔＢＤ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｏｌｉｖｅｒら、Ｇｅｎｅ ６０：１，１９８７）、Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ（Ｄｅｃｋｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：３５３，１９９８）、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ（Ｐｅｌａｎｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３０９９，１９９３）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）（Ｇｒｅｇｅｒｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５：２１５，１９９３）、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｆｉｌｅｔｉｃｉら、Ｙｅａｓｔ １２：１３５９，１９９６；Ｃｏｇｏｎｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：７９２，１９９５）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｂｕｌｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１０５８，１９９６）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：７１３５，１９９７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐｅｔｉｔら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２６１，１９９８）、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ（ＭａｎｄａｌおよびＧｈｏｓｈ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：８０２４，１９９３）。
【００５５】
ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼをコードするｐｕｔＡ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｒｅｄｅｎｂａｃｈら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１：７７，１９９６）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｃｏｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５３７，１９９８）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：４９６，１９９５）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３，１９９７）、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：２０７７，１９９４）、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２７７：２０１，１９９６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｓａｖｏｉｚら、Ｇｅｎｅ ８６：１０７，１９９０）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＣｈｅｎおよびＭａｌｏｙ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３；７８３，１９９１）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ａｌｌｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１６７６，１９９３）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｃｈｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１８７２，１９９６）、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｚｕｒｄｏら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：８５，１９９７）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｋｅｕｎｔｊｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：６４３２，１９９５）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ（Ｓｔｒａｕｂら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：２２１，１９９６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（Ｋａｎｅｋｏら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．３：１０９，１９９６）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．（Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：３０１，１９９６）、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１９：８６８，１９９６）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ（Ｔｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ ３８８：５３９，１９９７）、栽培キノコ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）（Ｓｃｈａａｐら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：５７，１９９７）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（ＤｅｌａｕｎｅｙおよびＶｅｒｍａ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２１：２９９，１９９０）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０１：６９，１９９７）。
【００５６】
アルギニン、プロリン、グルタミン、またはグルタミン酸は、ポリ（４−ヒドロキシ酪酸）生成生物に外部から供給され得るか、または宿主において別の炭素源（好ましくは、安価な炭素源（例えば、グルコース））から合成され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、これらの化合物全てをグルコースから合成するが、増殖に十分な程度しか合成しない。
【００５７】
これらの化合物を過剰生成するＥ．ｃｏｌｉ株が開発された。Ｔｕｊｉｍｏｔｏら（米国特許第５，３７８，６１６号）は、グルタミンを蓄積するＥ．ｃｏｌｉ変異体を記載する。Ｍｏｍｏｓｅら（米国特許第４，４３０，４３０号）は、アルギニン蓄積を導く、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるａｒｇＡ遺伝子過剰発現を記載する。プロリン合成遺伝子を過剰発現する、Ｅ．ｃｏｌｉプロリン耐性変異体はプロリンを蓄積し得る（Ｗａｎｇら、Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：２７，１９９０）。細菌プロリン合成遺伝子を過剰発現するタバコ植物もまた、プロリンを蓄積することが示された（Ｓｏｋｈａｎｓａｎｄｚｈら、Ｇｅｎｅｔｉｋａ ３３：９０６，１９９７）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌は、高培地浸透圧モル濃度に対する応答としてグルタミン酸、ＧＡＢＡ、およびプロリンを蓄積する（ＭｃＬａｇｇａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９１１，１９９４；Ｍｅａｓｕｒｅｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５７：３９８，１９７５；Ｓｃｈｌｅｙｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６０：４２４，１９９３；Ｂｏｔｓｆｏｒｄら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：２５６８，１９９４）。
【００５８】
（コハク酸から４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの経路）
コハク酸から４ＨＢ−ＣｏＡへの変換についての完全な生化学的経路（図４）は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉにおいて特徴付けられている（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２，１２１−１２７；Ｗｏｌｆｆら、１９９３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９，１８７６−１８８２；Ｓｃｈｅｒｆら、１９９４，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６１．２３９−２４５）。最近、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉのスクシニルＣｏＡ：ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｃａｔ１）、コハク酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃＤ）、および４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（４ｈｂＤ）をコードする遺伝子が同定された（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，８７１−８８０）。これらの遺伝子は、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ染色体上の連続したＤＮＡ区間に位置し、そして未知機能の３つの遺伝子（ｏｒｆＺ、ｏｒｆＹ、およびｓｉｇＬ）により隣接される。この遺伝子は、増殖培地中のコハク酸により誘導されるようである。４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、これらの研究において同定されなかった。
【００５９】
（４−ヒドロキシ酪酸合成において作用する酵素をコードする代替遺伝子の同定）
α−ケトグルタル酸またはコハク酸いずれかから４ＨＢへの変換において作用する酵素をコードする代替遺伝子は、相補性研究または発現研究により単離され得る：グルタミン酸−コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ遺伝子は、この遺伝子が、窒素源としてのγ−アミノ酪酸利用についてＥ．ｃｏｌｉ ｇａｂＴ変異を相補する能力により、遺伝子ライブラリーから単離され得る。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の変異は相補され得る。代替的４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現は、Ｅ．ｃｏｌｉが、炭素源として４−ヒドロキシ酪酸を利用するのを可能にする。ＢＬＡＳＴＰプログラムおよびＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いた酵素相同性検索により、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにおける４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼホモログの存在が示唆される。これらのタンパク質は、遺伝子索引（ｉｎｄｅｘ）番号：ｇｉ｜１７８８７９５およびｇｉ｜１７９００１５と同定された。
【００６０】
（組み込みの重要性；ポリマー生成についてのスクリーニング）
株が、接種物計画（ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｔｒａｉｎ）および生成操業の期間の間、バイオポリマーを合成する能力を失わないことは、効率的なＰＨＡ生成に重要である。任意のｐｈｂ遺伝子の欠失が産物欠失をもたらすのに対して、新たなモノマーを提供する任意の遺伝子の欠失は、不均一な産物の形成をもたらす。どちらも望ましくなく、従って、株の安定な増殖が必要とされる。不運なことに、トランスフェラーゼまたはシンターゼをコードする遺伝子の単なる組み込みは、有意なポリマー生成をもたらさない。プロモーター領域改変、または変異誘発、または他の既知の技術、それに続くポリマー生成物についてのスクリーニングにより、酵素発現を増強することが必要である。これらの技術を用いて、実施例に記載された株における遺伝子の組み込みは、１００，０００Ｌ容器中での生成に十分な少なくとも５０世代の間、安定であることが測定された。
【００６１】
これらの組換え体ＰＨＡプロデューサーの増殖および形態は、染色体上のｐｈｂ遺伝子の存在により損われない。選択手順の間、個々の組み込み体は、栄養要求株の単離を回避する最小培地プレート上で選択される。異なるｐｈｂ組み込み体の増殖速度は、ＰＨＢプロデューサーが由来する野生型Ｅ．ｃｏｌｉ株のものと同様であった。ｐｈｂ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ染色体への付加は、これらの株が従来の方法によりなお容易に溶解されるので、その株の下流プロセシングに影響を及ぼさなかった。
【００６２】
本発明は、以下の限定しない実施例を参照してさらに理解される。
【実施例】
【００６３】
（実施例１：ＰＨＢ−４ＨＢ合成の最小必要条件）
ポリ−（Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸）（ＰＨＢ）合成の最小必要条件は、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓに由来する精製ＰＨＡシンターゼ、および基質（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡであることが以前に示された。４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍから単離された酵素４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼにより触媒されるトランスチオエステル化反応を介して、アセチル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシ酪酸からインサイチュで調製され得る。この酵素はまた、遊離酸およびアセチル−ＣｏＡからの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの形成を触媒する。従って、Ｐ（３ＨＢ−コ−４ＨＢ）を形成するための、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのインサイチュ合成および（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡとのその共重合の最小必要条件は、緩衝化水溶液中のＰＨＡシンターゼ、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸、アセチル−ＣｏＡ、および４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼを含む。これは、以下のように実証された：リン酸カリウム緩衝液（１ｍｌ、１００ｍＭ、ｐＨ７．５）に、以下を添加した：アセチル−ＣｏＡ（０．５ｍＬ、３０ｍＭ）
４−ヒドロキシ酪酸ナトリウム塩（５０μｌ、２Ｍ）
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸ナトリウム塩（１００μｌ、１Ｍ）
４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（１０ｍｇ、２５単位）ＰＨＡシンターゼ（０．０５ｍｇ）
反応物を室温で一晩放置した。不溶性ＰＨＡ顆粒の形成に注目した。不溶性物質を遠心分離によりペレット化し、そして凍結乾燥した（０．６５ｍｇ）。この物質は、粘着性の粘調度を有した。有機物質をＣＤＣｌ３で抽出し、そして１Ｈ−ＮＭＲにより分析した。ＮＭＲ分析により、約２０％の４−ヒドロキシ酪酸を含む、ポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸−コ−４−ヒドロキシ酪酸）の形成が確認された。ＮＭＲスペクトルは、ポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸−コ−４−ヒドロキシ酪酸）の文献スペクトル（Ｄｏｉ，Ｙ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９８８，２１：２７２２−２７２７）と一致する。
【００６４】
（実施例２：プラスミドによりコードされる経路を用いた、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるポリ（４−ヒドロキシ酪酸）（Ｐ４ＨＢ）合成）
Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来するｈｂｃＴ遺伝子を、標準的な分子生物学的技術を用いてＥ．ｃｏｌｉ中で発現した。この遺伝子は、強力なプロモーターの後ろに、そしてこのプロモーターから発現を駆動する条件下で適切なベクターに配置されている。４ＨＢＣＴを生成する。
【００６５】
Ｅ．ｃｏｌｉ株に、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来する４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、およびＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａに由来するＰＨＢシンターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＦＳ３０を備え付けた。これらの遺伝子は、４−ヒドロキシ酪酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換し、続いて、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをポリ（４−ヒドロキシ酪酸）に重合すると予想される。株を、炭素源として４−ヒドロキシ酪酸単独またはグルコースと組み合せて有する、１０％ＬＢ液体培地５０〜１００ｍｌを含む、２５０ｍｌエーレンマイアーフラスコ中で増殖させた。培養物を、１５０または２００ｒｐｍで振盪しながら３０〜３３℃でインキュベートした。培養物を、インキュベーションの２４時間後に採集し、そしてＰＨＡについて分析した。ｐＦＳ３０を有するＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ１１７７（最小４−ＨＢ培地上での増殖について選択された、ＤＨ５α株の自然変異体）は、その細胞乾燥重量の６７％をＰ４ＨＢホモポリマーとして蓄積する。
【００６６】
【表１】
（実施例３：プラスミドによりコードされるＰＨＡシンターゼを用いた、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるポリ（４−ヒドロキシブチレート）（Ｐ４ＨＢ）合成）
Ｅ．ｃｏｌｉ株に、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉに由来する４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む、プラスミドｐＦＳ１６を備え付けた。この遺伝子は、４−ヒドロキシ酪酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換し、続いて、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを、染色体によりコードされるＰＨＢシンターゼによりＰ４ＨＢに重合すると予想される。株を、炭素源として４−ヒドロキシ酪酸単独またはグルコースと組み合せて有する、１０％ＬＢまたは１００％ＬＢ液体培地５０〜１００ｍｌを含む、２５０ｍｌエーレンマイアーフラスコ中で増殖させた。培養物を、０〜２５０ｒｐｍで振盪しながら３２〜３７℃でインキュベートした。培養物を、インキュベーションの２４時間後に採集し、そしてＰＨＡについて分析した。ｐＦＳ１６を有するＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ７６９は、その細胞乾燥重量の６７％をＰ４ＨＢホモポリマーとして蓄積する。従って、４ＨＢ含有ＰＨＡの形成は、プラスミドによりコードされるＰＨＢシンターゼに依存しない。
【００６７】
【表２】
（実施例４：ｐｈｂ遺伝子を染色体へ組み込むためのプラスミドの構築）
プラスミドｐＭＵＸＣ５ｃａｔは、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のｐｈｂＣ遺伝子をレシピエント株の染色体に組み込むために、この遺伝子を転位因子上に含む（図５）。強力な翻訳配列を、ｐＴｒｃベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中で、Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のｐｈａＣ１をコードする、ＰＨＡシンターゼをコードするｐＫＰＳ４から得た。この構築物において、ｐｈａＣ１の前には強力なリボソーム結合部位：ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴ（−ＡＴＧ）がある。上流の配列を含むｐｈａＣ１遺伝子を、平滑末端を持つＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、ｐＵＣ１８ＳｆｉのＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＭＳＸＣ３を作成した。次に平滑末端のｃａｔ遺伝子カセットを、平滑末端のＳｓｅ８３８７ＩＩ部位にクローニングし、ｐＭＳＸＣ３ｃａｔを得た。この時点で、５’末端の２７塩基対を除く全てのｐｈａＣ１をコードする領域を、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片として除去し、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のｐｈｂＣ遺伝子からの対応する断片と置換した。生じるプラスミドｐＭＳＸＣ５ｃａｔは、Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓのＰＨＡシンターゼ由来の９アミノ末端残基、およびＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来の残りの部分を有する、ハイブリッドＰＨＢシンターゼ酵素をコードする。次にＣ５ｃａｔカセットをＡｖｒＩＩ断片として切除し、ｐＵＴＨｇの対応する部位にクローニングした。これにより、このベクターから水銀抵抗性のマーカーを除去した。生じるプラスミドｐＭＵＸＣ５ｃａｔは、ｐｈｂＣの前にプロモーター配列の無いＣ５ｃａｔミニトランスポゾンを含む。従って、組み込みの際のカセットの発現は、組込み部位に隣接したＤＮＡによって与えられる転写配列に依存する。
【００６８】
ｐＭＳＸＴｐ１ＡＢ５ｋａｎ２をｐＭＳＸＴｐ１ｋａｎから次のように構築した（図６および６Ａ）。まず、ｐＭＳＸＴｐ１ｋａｎをＮｄｅＩで消化し、クレノウ酵素で隙間を埋め、再び連結してＮｄｅＩ部位が欠失したｐＭＳＸＴｐ１ｋａｎ２を得た。この欠失は、クローニング手順の後の段階の間に、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａのｐｈｂＡのすぐ上流にある唯一のＮｄｅＩ部位を生じる。
【００６９】
Ｂ５をｐＺＴ１由来のＮａｒＩ断片としてクローニングし、そしてｐＵＣ１８ＳｆｉのＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングして、ｐＭＳＸＢ５を作成した。Ａ５をＦｓｅＩ／ｂｌｕｎｔ−ＳａｌＩ断片としてＥｃｌＩ３６ＩＩ−ＳａｌＩ部位に挿入して、ｐＭＳＸＡＢ５を生じ、そしてＺ．ｒａｍｉｇｅｒａのＡＢ５遺伝子間領域を再生した。プロモーターのないｃａｔカセットをｐＭＳＸＡＢ５のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入して、ｐＭＳＸＡＢ５ｃａｔを作成した。ｐＭＳＸＡＢ５ｃａｔ由来のＡＢ５断片をＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片としてｐＭＳＸＴｐ１ｋａｎ２のＳａｍＩ部位にクローニングし、ｐＭＳＸＴｐ１ＡＢ５ｋａｎ２を与えた。
【００７０】
ｐｈｂＡＢ５の発現を、これらの遺伝子の上流に強力なプロモーターを導入することによって改善した（図６および６Ａ）。このプロモーターを、上流の活性化配列、−３５プロモーター領域、転写開始部位を有する−１０プロモーター領域、および安定化機能を有する可能性のあるｍＲＮＡ配列を提供するオリゴヌクレオチドのセットを用いて生成した。プラスミドｐＭＳＸＴｐ１ＡＢ５ｋａｎ２をＰｓｔＩ／ＸｂａＩで消化し、ｌａｃプロモーターの−１０領域を含む断片を、オリゴヌクレオチド３Ａ（５’ＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＴＣＧＣＧＣＣＧＴＴ）および３Ｂ（５’ＣＴＡＧＡＡＣＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＴＣＣＣＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡ）をアニーリングした後得られた断片として挿入した。次に、コンセンサスＥ．ｃｏｌｉ ｐｈｏボックスおよび−３５プロモーター領域を含む断片を、オリゴヌクレオチド２Ａ（５’ＴＣＣＣＣＴＧＴＣＡＴＡＡＡＧＴＴＧＴＣＡＣＴＧＣＡ）および２Ｂ（５’ＧＴＧＡＣＡＡＣＴＴＴＡＴＧＡＣＡＧＧＧＧＡＴＧＣＡ）をアニーリングした後得られた断片として、ＰｓｔＩ部位に挿入した。次に、ＡＢ５由来の転写開始部位を含むメッセンジャー安定化配列をオリゴヌクレオチド４Ａ（５’ＣＴＡＧＴＧＣＣＧＧＡＣＣＣＧＧＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡ）および４Ｂ（５’ＴＡＴＧＴＧＣＴＴＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡ）をアニーリングした後得られた断片としてＸｂａＩ−ＮｄｅＩ部位に挿入した。生じるプラスミドがｐＭＳＸｐ１２ＡＢ５ｋａｎ２である。Ｔｐ１２ＡＢ５ｋａｎ２を含むＡｖｒＩＩ断片を、ＡｖｒＩＩで切断したｐＵＴＨｇにクローニングし、ＭＢＸ３７９およびＭＢＸ２４５のゲノムへの組込みに使用した。
【００７１】
次にｐ１２ＡＢ５ｋａｎ発現カセットを２．８ｋｂのＡｖｒＩＩ断片として除去し、ｐＵＴＨｇのＡｖｒＩＩ部位へ連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＣＣ１１８λｐｉｒへ形質転換して、プラスミドｐＭＵＸｐ１２ＡＢ５ｋａｎを得た。次にこのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１λｐｉｒへ形質転換し、そしてｐ１２ＡＢ５ｋａｎ発現カセットをＥ．ｃｏｌｉ株の染色体に接合によって挿入するのに使用した（Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｔｅｒｉｏｌ． １９９０、１７２：６５５７−６５６７）。
【００７２】
（実施例５：ｐｈｂ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ染色体への組込み）
（材料および方法）
Ｅ．ｃｏｌｉ株をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）中で３７℃もしくは３０℃で、または最小Ｅ２培地（Ｌａｇｅｖｅｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８８、５４：２９２４−２９３２）中で増殖させた。ＤＮＡの操作は、Ｑｉａｇｅｎプラスミド調製キットまたはＱｉａｇｅｎ染色体ＤＮＡ調製キットを用いて製造会社の推奨に従って精製した、プラスミドおよび染色体ＤＮＡで行った。ＤＮＡは、制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、製造会社の推奨に従って消化した。ＤＮＡ断片は、Ｑｉａｇｅｎキットを使用して０．７％アガロース−Ｔｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡゲルから単離した。
【００７３】
プラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換またはエレクトロポレーションによって導入した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。プラスミドドナー株およびレシピエント株を交配することによって、ｐｈｂ遺伝子のｐＵＴベクターからの転移を達成した（Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２：６５５７）。使用されたレシピエント株は、ＬＳ５２１８またはＭＢＸ２３のいずれかに由来の、自然のナリジクス酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）またはリファンピシン抵抗性のＥ．ｃｏｌｉ変異体であった。ＭＢＸ２３は、ｒｐｏＳ：：Ｔｎ１０対立遺伝子が１１０６株（Ｅｉｓｅｎｓｔａｒｋ）からのＰ１形質導入によって導入された、ＬＪ１４ ｒｐｏＳ：：Ｔｎ１０である。ｐｈｂ遺伝子が染色体に組み込まれたレシピエントを、ミニトランスポゾン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールによって特定される抗生物質耐性を補充したナリジクス酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）またはリファンピシンプレート上で選択した。オリゴヌクレオチドは、ＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓまたはＧｅｎｅｓｙｓから購入した。ＤＮＡ配列をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ３７３Ａ配列分析装置を使用して、自動配列分析によって決定した。ＤＮＡを、シンターゼ連鎖反応を用いて５０μｌの容量で、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ）のＰＣＲ混合物およびＥｒｉｃｏｍｐＤＮＡ増幅装置を使用して増幅した。
【００７４】
蓄積したＰＨＡをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって次のように決定した。凍結乾燥した細胞重量で約２０ｍｇを、内部標準として添加した２ｍｇ／ｍＬの安息香酸と共に、（容量で）９０％の１−ブタノールおよび１０％の濃塩酸を含む混合物２ｍＬ中で、１１０℃、３時間の抽出およびブタノール分解（ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）に同時に供した。生じた混合物の水溶性の成分は３ｍＬの水で抽出して除去した。有機相（全体の流速が２ｍＬ／分で分離比が１：５０の１μＬ）を、ＦＩＤ検出器を備えるＨＰ ５８９０ ＧＣ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）で、ＳＰＢ−１融合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ、内径０．３２ｍｍ、０．２５μｍの膜、Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、Ｐａ．）を用いて、次のような温度プロファイルで分析した。８０℃で２分間、１分間あたり１０℃づつ２５０℃まで上昇、２５０℃で２分。ポリマー中の４−ヒドロキシ酪酸ユニットの存在を試験するための標準として、γ―ブチロラクトンを使用した。これは、ポリ（４−ヒドロキシ酪酸）のように、ブタノール分解の際にｎ−ブチル４−ヒドロキシ酪酸を生成する。ポリマー中の３−ヒドロキシ酪酸ユニットを試験するために使用した標準は、精製ＰＨＢであった。
【００７５】
１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソ−グアニジン（ＮＴＧ）による突然変異誘発を、Ｍｉｌｌｅｒ（Ａ ｓｈｏｒｔ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）によって述べられたように、９９％を殺菌する１ｍｇ／ｍｌのＮＴＧで９０分間の処理を用いることによって行った。
【００７６】
（結果）Ｃ５ｃａｔを、Ｓ１７−１λｐｉｒ（ｐＭＵＸＣ５ｃａｔ）ドナー株を使用して、ＭＢＸ２３の染色体に接合によって導入した。接合混合物をＬＢ／Ｎ１／Ｃｍプレートにまいて、組込み物（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）を得た。その４０％はアンピシリンに感受性であり、これらの株にプラスミドが存在しないことを示している。５つの組込み物がｐＭＳＸＡＢ５ｃａｔ（Ａｐｒ）によって形質転換され、ＰＨＢシンターゼの生合成活性を調べるために、ＬＢ／Ａｐ／Ｃｍ／２％グルコース中で培養した。ＭＢＸ３２６が最も高いシンターゼ活性を発現し、さらなる研究に使用した。ＰＨＢシンターゼの発現は、ＭＢＸ３２６を１００、２００、５００、および１０００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上で、連続的に画線培養することによって増加した。ＭＢＸ３７９株はＭＢＸ３２６由来であり、１０００μｇ／ｍｌまでクロラムフェニコール耐性を示す。
【００７７】
ｐＭＵＸｐ１２ＡＢ５ｋａｎを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１λｐｉｒをＭＢＸ３７９と交配した。ｐｈｂＡＢ５ｋａｎが染色体に組み込まれた遺伝子導入細胞株を、ＬＢ／Ｎ１／Ｋｍプレート上で選択した。組込み物の中で、ＰＨＢを産生するものをＬＢ／グルコースプレート上で同定し、ＭＢＸ６７７（ＭＢＸ３７９：：ｐ１２ＡＢ５ｋａｎ）をさらなる研究に使用した。２％のグルコースを補充した最少培地中では３８％のＰＨＢが蓄積されたのに対し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ／２％グルコース培地で培養されたこの株のＰＨＢ量は５８％であった。
【００７８】
（実施例６：ＰＨＢ産生を高めるための遺伝子導入Ｅ．ｃｏｌｉ株の突然変異誘発）
ＮＴＧまたはＥＭＳを用いた突然変異誘発を、ＭＢＸ６８０におけるＰＨＢ形成を改善させるために使用した。ＭＢＸ６８０をＥＭＳおよびＮＴＧで処理した後、それぞれＭＢＸ７６９およびＭＢＸ７７７株を選択した。これらの細胞株は１％グルコース、０．５％ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒおよび１ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充したＲ２培地で培養し得る。ＭＢＸ７６９を５０ｍｌのＲ−１０培地／０．５％ＣＳＬ中で２または３％のグルコースと共に、３７℃で２０から２６時間培養した。ＰＨＢは細胞乾燥重量の７１％蓄積した。同様に、ＭＢＸ７６９を５０ｍｌのＬＢ中で０．３７５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．８７５のＫ２ＨＰＯ４、および０．２５の（ＮＨ４）２ＳＯ４、および全体で５０ｇ／Ｌのグルコースと共にまたは無しに、培養した（５つのアリコートをインキュベーションの間に加えた）。６３時間インキュベートした後、ＰＨＢは細胞乾燥重量の９６％まで蓄積した。２％グルコースを補充した最少培地中では５７％のＰＢＨが蓄積したのに対して、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ／２％グルコース培地で増殖させたＭＢＸ７７７株中のＰＨＢ量は６７％であった。
【００７９】
ＭＢＸ３７９由来のＣ５ｃａｔ対立遺伝子を、ＬＳ５２１８、ＬＳ５２１８ｆａｄＡＢ１０１：：Ｔｎ１０およびＬＳ５２１８ｆａｄＲ＋ｚｃｆ１１７：：Ｔｎ１０へＰ１形質導入することによって、染色体ｐｈｂＣ遺伝子を有する改良遺伝子導入Ｅ．ｃｏｌｉ株を得た。生じる株はそれぞれＭＢＸ８１６、ＭＢＸ８１７およびＭＢＸ８２１である。
【００８０】
（実施例７：内因性４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を用いたＥ．ｃｏｌｉでのポリ（４−ヒドロキシ酪酸）（Ｐ４ＨＢ）の合成）
Ｅ．ｃｏｌｉは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする内因性の遺伝子を含む。ＭＢＸ８２１および１２３１株を、単独または炭素供給源としてグルコースと組み合わせた４−ヒドロキシ酪酸と共に、５０から１００ｍｌの１０％ＬＢ液体培地を含む２５０ｍｌのエーレンマイヤーフラスコで増殖させた。ＭＢＸ１２３１は、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジンで処理した後、５００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むプレート上で選択して得られた、ＭＢＸ８２１の変異体である。培養物を３２℃から３３℃で、２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。２４時間インキュベートの後培養物を収集し、ＰＨＡに関して分析した。表ｘはこれらの株がＰ４ＨＢホモポリマーとして細胞乾燥重量の２．５から３．５％を蓄積していることを示している。この株におけるＰ４ＨＢ形成は、ＰＨＢシンターゼをコードするプラスミドまたは異種由来の発現した４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼによらない。これらの株を固形培地上で培養すると、Ｐ４ＨＢ量は１１％程度まで向上する。
【００８１】
【表３】
（実施例８：空気非感受性４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼのスクリーニング方法）
Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼは空気、おそらく酸素によって阻害されるようである。高酸素条件下でＰ４ＨＢを合成するために、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードするｈｂｃＴ遺伝子をプラスミド上に有し、そしてＰＨＡシンターゼ遺伝子を染色体上に有するＥ．ｃｏｌｉ株の変異体を増殖させ、そして細胞群の大多数が灰色のコロニーを形成する場合に、白色のコロニー（ＰＨＡの蓄積を示す）を探索することによって、酸素非感受性変異体をスクリーニングし得る。酸素非感受性細胞株ＭＢＸ２４０［ｐＦＳ１６］、ＭＢＸ３７９［ｐＦＳ１６］およびＭＢＸ８３０［ｐＦＳ１６］をこの方法を用いて同定した。変異体の集団は、インビボでもとの株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたはエチルメタンスルホン酸のような化学的突然変異原、または紫外線照射で処理することにより産生し得る。あるいは、ｈｂｃＴを含むプラスミドに、インビトロでヒドロキシルアミンを用いて突然変異を誘発し得る。次に機能的な４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼを発現している変異体を、固形培地または高度に酸素添加した液体培地中で、４−ヒドロキシ酪酸からのＰ４ＨＢ形成に関してスクリーニングする。
【００８２】
（実施例９：４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ生合成酵素をコードする追加のＥ．ｃｏｌｉ遺伝子のスクリーニング方法）
ＭＢＸ８２１または１２３１中で、４ＨＢを４ＨＢＣｏＡに変換する酵素活性の発現を、突然変異誘発によって増大させ得る。固形培地中で増殖させたＭＢＸ８２１および１２３１中のＰ４ＨＢの出現には約１５０時間かかった。改善されたＰ４ＨＢを蓄積する性質を有する変異体は、これらの細胞株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたはエチルメタンスルホン酸のような化学的突然変異原、または紫外線照射を用いて、無作為に突然変異誘発した後スクリーニングし得る。望ましい変異体は、４−ヒドロキシ酪酸存在下で、インキュベーションして２から５日以内に白色コロニーを形成する。
【００８３】
（実施例１０：４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ生合成酵素をコードする他の遺伝子のスクリーニング方法）
植物系が関与する適用には高ＧＣ含有量のＤＮＡが必要であるので、代わりの４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ生合成遺伝子を同定および単離する必要がある。ｈｂｃＴ遺伝子の低いＧＣ含有量は、他のＡＴリッチなＤＮＡを含む微生物から相同遺伝子を同定および単離するのに有用なプローブとなる。しかし、高ＧＣ含有量のｈｂｃＴ遺伝子は、この方法によっては同定されない。染色体に組み込まれたＰＨＡシンターゼをコードするｐｈｂＣ遺伝子を持つＥ．ｃｏｌｉ細胞株を、そのような遺伝子のスクリーニングに使用し得る。遺伝子を植物に導入する適用のためには、高ＧＣ含有量のＤＮＡを使用することが望ましい（Ｐｅｒｌａｋ Ｆ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：３３２４）。例えばｈｂｃＴ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ３７９で発現された場合、この細胞株は通常の栄養素に加えて４−ヒドロキシ酪酸を含む寒天プレート上でＰ４ＨＢポリマーを産生し得る。Ｐ４ＨＢの形成によってコロニーは簡単に区別できる白色の表現型を持つ。従って、例えば、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａ．ｌａｔｕｓ、Ｐ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉおよび他のＰＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ産生生物の遺伝子ライブラリーを、ＭＢＸ３７９または同様の細胞株に導入し、４ＨＢを含む増殖培地に直接プレートする。白色コロニーを選択し、蓄積したＰＨＡの組成を決定する。遺伝子ライブラリーは、ゲノムＤＮＡを単離し、ＤＮＡ断片の代表的な集団をプラスミドベクターにクローニングすることによって、選択した生物から簡単に構築される。代表的なライブラリーは５，０００から１００，０００個のコロニーを持つ。ライブラリーはｐＬＡＦＲ３のようなベクター中の広い宿主域のライブラリーとして、またはｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２のようなベクター中のＥ．ｃｏｌｉライブラリーとしてのいずれかで作製される。ライブラリーのタイプおよびライブラリーを選択した宿主に導入する方法によって、ゲノムＤＮＡ断片は大きいか（１７−３０ｋｂ）または比較的小さいか（２−６ｋｂ）のいずれかである。ライブラリーを、宿主および使用するベクターに依存して、エレクトロポレーション、形質転換または接合によって、スクリーニング細胞株に導入する。
【００８４】
代わりの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼに加えて、４−ヒドロキシ酪酸を基質として利用し得るアシルＣｏＡシンテターゼがこの方法によって単離される。そのような一般的な活性をもつ酵素をコードする遺伝子の例は、長側鎖脂肪酸の取り込みに関与するｆａｄＤ、アセト酢酸および短側鎖脂肪酸の取り込みに関与するａｔｏＤＡ、芳香族化合物の分解に関与するｃａｔＥ、スクシニルＣｏＡシンテターゼをコードするａｃｅＡＢ、アセチルＣｏＡシンテターゼをコードするａｃｓＡおよびａｃｓＢ、およびそのような遺伝子の相同物である。あるいは、無作為に突然変異誘発したアシルＣｏＡシンテターゼまたはトランスフェラーゼ遺伝子を持つプラスミドを導入することによって、これらの酵素の基質特異性を、４−ヒドロキシ酪酸を含むように拡大し得る。あるいは、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のｈｂｃＴ遺伝子と有意な相同性を持つＥ．ｃｏｌｉ由来のｙｇｆＨ遺伝子を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ活性に関して調査し得る。
【００８５】
（実施例１１：α−ケトグルタル酸からの４ＨＢ−ＣｏＡの内因性合成）
α−ケトグルタル酸は図７に示したように、４ＨＢに変換し得る細胞代謝物である。その経路は、ｇａｂＴ、ｇａｄＡ／ｇａｄＢおよびｇｄｈＡ遺伝子産物によって触媒される回路反応からなる。一旦生成物が４−ＨＢデヒドロゲナーゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼによってさらに４ＨＢ−ＣｏＡに変換され、ＰＨＡシンターゼによってＰＨＡに重合されると、この回路からのコハク酸セミアルデヒドの形成に有利である。
【００８６】
この目的のために、次のプラスミドをｐＭＳＸｃａｔで構築した。
【００８７】
１．ｐＭＳＸ−ＴＤ ｈｂｃＴ−４ｈｂＤ２．ｐＭＳＸ−ＡＢＴ ｇｄｈＡ−ｇａｄＢ−ｇａｂＴ３．ｐＭＴＸ−ＤＢＴＴ ４ｈｂＤ−ｇａｄＢ−ｇａｂＴ−ｈｂｃＴ４．ｐＭＳＸ−ＡＢＴＴＤ ｇｄｈＡ−ｇａｄＡ−ｇａｂＴ−ｈｂｃＴ−４ｈｂＤ。
【００８８】
１．４ｈｂＤをｐＣＫ３から次のプライマーを用いたＰＣＲによって得た：４ＨＢＤ−Ｎ：５’ＣＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＧＧＣ（ＥｃｏＲＩ）
４ＨＢＤ−Ｃ：５’ＴＴＴＣＴＣＴＧＡＧＣＴＣＧＧＧＡＴＡＴＴＴＡＡＴＧＡＴＴＧＴＡＧＧ（ＳａｃＩ）。
【００８９】
ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（ｐＭＢＸ−Ｄ）にクローニングした。ｈｂｃＴをｐＣＫ３由来のＳｓｐＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてクローニングし、ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＭＢＸ−Ｄにクローニングして、ｐＭＢＸ−ＴＤを得た。人工的なｈｂｃＴ−４ｈｂＤオペロンをｐＭＢＸ−ＴＤからＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ断片として切り出し、ｐＵＣ１８ＳｆｉまたはｐＭＳＸ−ＴＰ１のこれらの部位へ連結した（それぞれｐＭＳＸ−ＴＤおよびｐＭＳＸ−ＴＰ１ＴＤ）（図８）。ＴＤまたはＴＰ１−ＴＤ断片をＡｖｒＩＩ断片として切り出し、ＡｖｒＩＩで消化したｐＵＴｋａｎに連結した（ｐＭＵＸ−ＴＤおよびｐＭＵＸ−ＴＰ１−ＴＤ）。このプラスミドはＴＤ／ＴＰ１−ＴＤ構築物をＥ．ｃｏｌｉ染色体に無作為に挿入することを可能にする。組み込まれたＴＤの発現は、内因性のプロモーターによって進められ、一方、組み込まれたＴＰ１−ＴＤの発現は、Ｐ１によって進められる。構築物が組み込まれた組換え体を、４−ヒドロキシ酪酸を唯一の炭素供給源として成育する能力に関して選択した。望ましい挿入物を選択するのに抗生物質耐性マーカーは必要でなかった。
【００９０】
コハク酸セミアルデヒドから４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換を促進する酵素をコードする他の遺伝子は、相補性による通常の手順で単離され得る。４ｈｂＤ相同物の導入後、そのような遺伝子によって野生型Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株は４ＨＢを唯一の炭素供給源として利用する能力を得る。
【００９１】
２．ｇｄｈＡ−ｇａｄＡ−ｇａｂＴからなるオペロンをプラスミドｐＵＣ１８Ｓｆｉ中に作製し、ｐＵＴｋａｎベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉ染色体に挿入した。構築物の受容細胞をＥ２／グリセロール／＿γ−ヒドロキシ酪酸／Ｎ１プレート上で単離した。受容細胞株は（ｇａｂＴ突然変異のために）γ−ヒドロキシ酪酸を窒素供給源として利用できないので、オペロンを発現している細胞株のみがこの培地中で成育する。ｇｄｈＡ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ染色体からＰＣＲおよび次のプライマーを用いて得た：ＧＨ−Ｕｐ：５’ＡＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣ（ＥｃｏＲＩ）
ＧＨ−Ｄｎ：５’ＴＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＣＣＧＴＴＧＧ（ＳａｃＩ）。
ｇａｄＢ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ染色体からＰＣＲおよび次のプライマーを用いて得た：ＧＢ−Ｕｐ：５’ＴＡＡＧＡＧＣＴＣＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＧＣＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＡＧＧ（ＳａｃＩ）
ＧＢ−Ｄｎ：５’ＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＣＡＧＧＴＡＴＧＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＧＧＣ（ＸｍａＩ）。
ｇａｂＴ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ染色体からＰＣＲおよび次のプライマーを用いて得た：ＧＴ−Ｕｐ：５’ＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＡＴＧＣＡＧ（ＢａｍＨＩ）
ＧＴ−Ｄｎ：５’ＧＡＴＴＣＴＡＧＡＴＡＧＧＡＧＣＧＧＣＧＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＧＣＣ（ＸｂａＩ）。
【００９２】
上記のプライマーの設計に使用したＤＮＡ配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ、受け入れ番号：Ｋ０２４９９（ｇｄｈＡ）、Ｍ８４０２５およびＸ７１９１７（ｇａｄＢ）、Ｍ８８３３４（ｇａｂＴ）から得た。
【００９３】
３つのＰＣＲ産物を示された酵素で消化し、続いてｐＵＣ１８Ｓｆｉベクターにクローニングした（ｐＭＳＸ−ＡＢＴ）（図９）。オペロンをＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片として切り出し、ｐＭＳＸＴＰ１にクローニングした（ｐＭＳＸ−ＴＰ１−ＡＢＴ）。ＡＢＴまたはＴＰ１−ＡＢＴ挿入物のいずれかをｐＵＴｋａｎに移動させ、ｇｄｈＡ−ｇａｄＡ−ｇａｂＴオペロンをＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４５のｇａｂＴ変異体の染色体中に挿入するのを可能にした。うまく挿入されたものをＥ２／グリセロール／γ−ヒドロキシ酪酸／Ｎ１プレート上で選択した。
【００９４】
ｇａｂＴの発現はγ−ヒドロキシ酪酸を窒素供給源として利用することを可能にするので、この機能を発現する遺伝子は、γ−ヒドロキシ酪酸が唯一の窒素供給源である最少培地プレート上で簡単に選択できる。オペロンの末端にあるｇａｂＴの発現は、直接的に選択することができない上流遺伝子の転写を必要とする。
【００９５】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼはこの経路で、グルタミン酸を触媒量提供する供給源として機能する。十分なグルタミン酸が存在すれば、追加のＧｄｈＡ活性は不必要であり得る。従って望ましい構築物へのこの遺伝子の組込みは任意である。
【００９６】
３．１および２において述べられたオペロンを次のように組み合わせた。ｐＭＳＸ−ＴＤをＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼ処理し、ＸｈｏＩで消化した；ｐＭＳＸ−ＡＢＴまたはｐＭＳＸ−ＢＴをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウ処理し、ＳａｌＩで消化した；次に、精製したＴＤ断片を、調製したｐＭＳＸ−ＡＢＴおよびｐＭＳＸ−ＢＴプラスミドに連結した（図９）。
【００９７】
（実施例１２：ＧＡＢＡ前駆体からの４ＨＢＣｏＡの内因性合成）
通常の代謝物ＧＡＢＡはグルタミン酸由来であり、通常主要な代謝ではコハク酸セミアルデヒドを経てコハク酸に代謝される。Ｐ４ＨＢ形成の、高レベルの中間体を得るために、ＧＡＢＡへの経路を向上させることが望ましくあり得る。グルタミン酸デヒドロゲナーゼによるα−ケトグルタル酸からグルタミン酸への直接の変換の他に、この変換はまた、例えばグルタミン酸および他のアミノ酸、またはプトレッシンのような基質を用いた多くのアミノ基転移反応の一部である。従って、アルギニン（プトレッシンの前駆体）、グルタミン、またはプロリンを過剰に生成する組換えおよび変異生物は、上記で述べられたようにｇａｂＴ、４ｈｂＤ、およびｈｂｃＴを用いて４ＨＢ−ＣｏＡの方へ向けられ得るグルタミン酸およびＧＡＢＡのレベルを増加させた（図１０）。
【００９８】
（実施例１３：コハク酸からの４ＨＢＣｏＡの内因性合成）
おそらくＳｕｃＤ、４ＨＢＤおよびＣａｔ１の逆転作用が、４ＨＢをＥ．ｃｏｌｉでの主要な代謝物であるコハク酸に変換するため、ｃａｔ１、４ｈｂＤおよびｓｕｃＤが導入されている場合、ＨｂｃＴは４−ヒドロキシ酪酸上でＥ．ｃｏｌｉが成育するのには必要でない（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８、８７１−８８０）。原則として、これらの遺伝子は共にコハク酸から４−ＨＢへの変換を可能にする。そこで、図４に描かれた経路をＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃａｔ１、ｓｕｃＤ、４ｈｂＤ、およびｈｂｃＴ遺伝子から組み立て得る。あるいは、これらの遺伝子を、Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍのような他のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種から単離し得る。Ｅ．ｃｏｌｉは自身のスクシニルＣｏＡ：ＣｏＡトランスフェラーゼを持っているが（ｓｕｃＣＤ；Ｍａｔ−Ｊａｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）２１５：２７６−２８０）、Ｅ．ｃｏｌｉではこの活性は顕著でないので、この遺伝子を他の供給源から導入することが望ましい（ＡｍａｒａｓｉｎｇｈａｍおよびＤａｖｉｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９６５）２４０：３６６４−３６６８）。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子の発現をこの適用のために最適化し得る。
【００９９】
ｈｂｃＴ−ｃａｔ１−ｓｕｃＤ−４ｈｂＤからなるオペロンを、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体に組み込むために構築した。組込みが成功した細胞株は、４ｈｂＤが発現していれば、４ＨＢ上で成育し得る（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８、８７１−８８０）。このオペロンの構築は次のように行った（図１１）：ｏｒｆＹ、ｃａｔ１、ｓｕｃＤ、および４ｈｂＤの５’末端を含むｐＣＫ３由来のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を、ｐＭＳＸｃａｔの対応する部位に連結した（ｐＭＳＸ−Ｙ１Ｄ）。４ｈｂＤ遺伝子を、ｐＭＳＸ−ＤのＰｓｔＩ−ＳａｃＩ断片をＰｓｔＩ−ＳｐｈＩで消化したｐＭＳＸ−Ｙ１Ｄに挿入することにより完成させた（ｐＭＳＸ−Ｙ１ＤＤ）。これを行うために、この連結の断片を両方、ＳｐｈＩおよびＳａｃＩ消化の後、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、さらにＰｓｔＩ消化を始める前に平滑末端を作製した。ｐＭＳＸ−Ｙ１ＤＤをＢａｍＨＩおよびＰａｃＩで消化し、次にクレノウ／Ｔ４ポリメラーゼで断片を平滑末端化し、脱リン酸し、次にＳｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ、クレノウ処理したｈｂｃＴ断片をこのベクターに連結することによって、ｐＭＳＸ−Ｙ１ＤＤのｏｒｆＹを、ｈｂｃＴで置換した（ｐＭＳＸ−Ｔ１ＤＤ）。調節配列、ターミネーターおよびプロモーターを提供する断片を、平滑末端断片としてｐＭＳＸ−Ｔ１ＤＤのＳｍａＩ部位に挿入した。このオペロンの組込みプラスミドを、ｐＭＳＸ−Ｔ１ＤＤの挿入配列をＳｆｉＩ断片としてｐＵＴｋａｎにクローニングすることによって構築した。
【０１００】
（実施例１４：向上した内因性の４ＨＢＣｏＡ合成）
中間体がこれらの新しい経路から出て行くのを防ぐために、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ａｓｐＣ）、およびＮＡＤＰおよびＮＡＤ依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｓａｄおよびｇａｂＤ）を不活性化することが望ましいとされ得る。個々の遺伝子の変異を異なった供給源から得た：ａｓｐＣ１３Ｉ変異を含む細胞株をＥ．ｃｏｌｉ ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ ＣｅｎｔｅｒからＣＧＳＣ５７９９細胞株として得る。ａｓｐＣ遺伝子は２１．１分に位置し、従ってＣＡＧ１２０９４（２２．２５分のｚｃｃ−２８２）またはＣＡＧ１８４７８（２０．００分のｚｂｊ−１２３０）のＴｎ１０（Ｔｃ）マーカー、およびＣＡＧ１２１３０（２１．００分のｚｃｂ−３１１１）のＴｎ１０Ｋｍマーカーと連関する。ｇａｂＤ遺伝子の変異は知られておらず、ＰＣＲにより遺伝子をクローニングし、抗生物質耐性のような遺伝的マーカーを挿入し、ｒｅｃＢＣ細胞株またはｐＭＡＫ７０５のようなこの目的のために構築されたベクターを用いて組み込み、最後に、遺伝子を望ましい宿主に運ぶためにバクテリオファージＰ１形質導入することによって、この活性を欠失させ得る。
【０１０１】
（実施例１５：脂肪種子作物におけるＰＨＡシンターゼおよび４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼの発現）
ＰＨＡシンターゼ導入遺伝子を含むトランスジェニック植物で発現され得る、４−ヒドロキシ酪酸から４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを形成することができる（すなわち、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を持つ）酵素をコードする遺伝子の同定方法を、標準的な手順で開発した。ある場合には、β−ケトチオラーゼおよび／またはアセトアセチルＣｏＡ還元酵素のような他のＰＨＡ生合成遺伝子を関心のある植物作物で発現させることもまた、有用であり得る。ＰＨＡシンターゼ導入遺伝子を脂肪種子作物で発現させる方法は記載されており（米国特許第５，２４５，０２３号および米国特許第５，２５０，４３０号；米国特許第５，５０２，２７３号；米国特許第５，５３４，４３２号；米国特許第５，６０２，３２１号；米国特許第５，６１０，０４１号；米国特許第５，６５０，５５５号；米国特許第５，６６３，０６３号；国際公開第ＷＯ９１００９１７号、国際公開第ＷＯ９２１９７４７号、国際公開第ＷＯ９３０２１８７号、国際公開第ＷＯ９３０２１９４号および国際公開第ＷＯ９４１２０１４号、Ｐｏｉｒｉｅｒら、１９９２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：５２０−５２３、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、１９９６ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ ２６、３８−４４）、これらは全て本明細書中に参考として援用される。この目標を達成するために、ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子、または１つより多くのサブユニットを持つＰＨＡシンターゼの場合は複数の遺伝子を微生物から植物細胞に運び、ＰＨＡシンターゼ酵素の適当な産生レベルを得ることが必要である。それに加えて、さらなるＰＨＡ生合成遺伝子、例えばアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子または、ＰＨＡシンターゼ酵素の基質を合成するのに必要な酵素をコードする他の遺伝子を提供することが必要であり得る。多くの場合、当業者に既知の方法で、異なった植物組織または細胞小器官での発現を調節することが望ましい（ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４；１２９３−１２９９；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（１９９５）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．および“Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（１９９６）、Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ，Ｊ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ． Ｅｎｇｌａｎｄ）。これらは全て本明細書中に参考として援用される。米国特許第５，６１０，０４１号は、核の遺伝子からプラスチドへ発現されたタンパク質を導くために、リーダーペプチドを加えることによる、プラスチドへ発現を記載している。より最近の技術は、外来性の遺伝子を組換えにより直接的にプラスチド染色体に入れる直接挿入を可能にする（Ｓｖａｂら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：８５２６−８５３０；ＭｃＢｒｉｄｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：７３０１−７３０５）。プラスチドＲＮＡおよびタンパク質合成機構の原核生物的性質はまた、例えばＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのｐｈｂＣＡＢオペロンのような、微生物のオペロンの発現を可能にする。この技術は、複数の酵素が関与する経路をコードする一連の遺伝子を、プラスチドゲノムに直接組み込むことを可能にする。ｍＲＮＡの安定性および翻訳に関して、プラスチド遺伝子の５’非翻訳領域の重要性を考慮に入れることもまた、重要である（Ｈａｕｓｅｒら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：１４８６−１４９７）。ある場合には、オペロンによってコードされる導入遺伝子の発現を最大限にするために、５’非翻訳領域を再遺伝子操作すること、二次構造エレメントを除去すること、または高度に発現しているプラスチド遺伝子由来のエレメントを加えることが有用であり得る。
【０１０２】
（発明の効果）
本発明によって、組換えプロセスが提供され、それにより、代替ＰＨＡのモノマー（例えば、４ＨＢ）を合成する新たな株を作り出すために、さらなる遺伝子が、トランスジェニックＰＨＢプロデューサーに導入され得る。
【０１０３】
本発明によってさらに、唯一の構成物またはコモノマーいずれかとして４−ヒドロキシ酪酸を含むＰＨＡを合成するトランスジェニック生物を安定に作る、技術および手順が提供される。
【０１０４】
本発明によってまた、新たな４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子のスクリーニングシステムが提供される。
【０１０５】
本発明によってまた、代替ＰＨＡモノマー内因合成のために、生物学的システムにおいて新たな経路を操作する技術および手順が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ ＯｒｆＺ配列と、Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍに由来する４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ（４ＨＢＣＴ）のＮ末端配列および内部配列とのアラインメントである（配列番号１および２）。同一残基を示し、類似残基は＊で示される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｃ．ｋｌｕｙｅｒｉに由来するｏｒｆＺ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｃ．ｋｌｕｙｅｒｉに由来するｏｒｆＺ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、Ｃ．ｋｌｕｙｅｒｉに由来するｏｒｆＺ遺伝子のアミノ酸配列である。
【図２】図２は、ＧＡＢＡ分路によるα−ケトグルタル酸からの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ内因合成の模式図である。１．α−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ；２．グルタミン酸デカルボキシラーゼ；３．ＧＡＢＡトランスアミナーゼ；４．コハク酸セミアルデヒドレダクターゼ；５．４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ。
【図３】図３は、ＧＡＢＡ前駆体からの４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ内因合成の模式図である。ＧＡＢＡは、アミノ酸（例えば、アルギニン、グルタミン、およびプロリン）分解における中間体である。アルギニン分解の遺伝子は、ｓｐｅＡ、ａｄｉ、ｓｐｅＢ、ｐａｔ、およびｐｒｒによりコードされ、グルタミン分解の遺伝子は、ｇｌｔＢＤおよびｇａｄＢによりコードされ、プロリン分解の遺伝子は、ｐｕｔＡおよびｇａｄＢによりコードされる。ＧＡＢＡは、ｇａｂＴ、４ｈｂＤ、およびｈｂｃＴの遺伝子産物により４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換される。
【図４】図４は、コハク酸からの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの内因合成の模式図である。１．スクシニルＣｏＡ−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２．コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；３．４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ；４．４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ。
【図５】図５は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａに由来するＰＨＢシンターゼ（ｐｈｂＣ）遺伝子の、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他のグラム陰性細菌染色体への組み込みのためのプラスミド構築の模式図である。
【図６】図６は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａに由来する３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（ｐｈｂＡ）およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈｂＢ）遺伝子の、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他のグラム陰性細菌染色体への組み込みのためのプラスミド構築の模式図である。
【図６Ａ】図６Ａ（図６のつづき）は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａに由来する３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（ｐｈｂＡ）およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈｂＢ）遺伝子の、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他のグラム陰性細菌染色体への組み込みのためのプラスミド構築の模式図である。
【図７】図７は、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成のための操作生合成経路に関する代謝表示および遺伝子表示の模式図である。ｇａｂＴ、４ｈｂＤ、およびｈｂｃＴの遺伝子産物はこの経路に必要とされ、ｇａｄＡＢおよびｇｄｈＡは有用であるのに対して、ａｓｐＣ、ｓａｄ、およびｇａｂＤの遺伝子産物は、好ましくは、欠失しているか、または不活性である。
【図８】図８は、プラスミドｐＭＳＸ−ＴＤ、およびｐＭＳＸＴｐ１−ＴＤ（これは、α−ケトグルタル酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素を発現する）構築の模式図である。
【図９】図９は、プラスミドｐＭＳＸ−ＡＢＴ、ｐＭＳＸＴｐ１−ＡＢＴ、およびｐＭＳＸＴｐ１−ＢＴ（これは、α−ケトグルタル酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素を発現する）構築の模式図である。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＭＳＸ−ＡＢＴおよびｐＭＳＸ−ＡＢＴ−ＴＤ（これは、α−ケトグルタル酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素を発現する）構築の模式図である。
【図１１】図１１は、コハク酸を４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素を発現する、プラスミドｐＭＳＸ−Ｔ１ＤＤ構築の模式図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主において４ＨＢを含むポリマーの生成を増強するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される異種酵素をコードする遺伝子を、該宿主のゲノムに安定に取り込む工程、ならびに
該異種酵素の発現を増強する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記宿主が、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼの両方をそのゲノムに安定に組み込んだ、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現が、前記宿主を変異させ、続いて基質として４ＨＢを提供し、そして変異宿主によるポリマー生成についてスクリーニングすることにより増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸−コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、および４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素を発現する宿主を提供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アルギニン、グルタミン、またはプロリンを分解して、γアミノ酪酸を生成する酵素を発現する宿主を提供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
宿主において４ＨＢを含むポリマーの生成を増強するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される異種酵素をコードする遺伝子を、該宿主のゲノムに安定に取り込む工程、ならびに
該異種酵素の発現を増強する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記宿主が、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼおよび４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼの両方をそのゲノムに安定に組み込んだ、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現が、前記宿主を変異させ、続いて基質として４ＨＢを提供し、そして変異宿主によるポリマー生成についてスクリーニングすることにより増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸−コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、および４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素を発現する宿主を提供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アルギニン、グルタミン、またはプロリンを分解して、γアミノ酪酸を生成する酵素を発現する宿主を提供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図６Ａ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図６Ａ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−１７１９６０（Ｐ２００９−１７１９６０Ａ）
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２８２２７（Ｐ２００８−３２８２２７）
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【分割の表示】特願２００３−１３２３２５（Ｐ２００３−１３２３２５）の分割
【原出願日】平成１０年９月１８日（１９９８．９．１８）
【出願人】（３９８０５５２３３）メタボリックス，インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【分割の表示】特願２００３−１３２３２５（Ｐ２００３−１３２３２５）の分割
【原出願日】平成１０年９月１８日（１９９８．９．１８）
【出願人】（３９８０５５２３３）メタボリックス，インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
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