４６種類の粘膜型ヒトパピローマウイルスを検出しタイプを特定するためのプローブセット
私達は４６種類の粘膜型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を検出しタイプを特定するためのプローブセットを開発した。これらのプローブは、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーの２つの保存領域の間に配置される可変領域を認識する。この出願では、ＮＭＬルミネックス遺伝子型決定法と称する、２段階ＰＣＲ増幅及びルミネックスｘＭＡＰ技術に基づくマルチプレックスアッセイを用いた。４６種類のプローブは、それぞれ、４６種類のＨＰＶタイプのいずれかに由来するＤＮＡに特異的にハイブリダイズするように設計されている。各プローブのハイブリダイゼーションは各タイプに特異的であり、タイプ間でクロスハイブリダイゼーションを起こすことはなく、そして、臨床サンプルに含まれるＨＰＶＤＮＡの遺伝子型決定のためにＰＣＲ産物を検出するのに充分な反応性を有する。また、直接シークエンス法等と、本ＮＭＬルミネックス遺伝子型決定法と、を比較検証した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（先願の情報）
本出願は、２０１０年１月１９日に出願した米国仮特許出願第６１／２９６，２４５号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の遺伝子型を特定するめの試薬及び方法に関する。とりわけ、本発明は、ＰＣＲ増幅及びマイクロビーズを使用した検出を行うことにより、多重分析を行い、感染したＨＰＶのタイプを特定するために臨床サンプルを試験する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトパピローマウイルスは、皮膚及び粘膜の角化上皮の至るところに感染する。これまでのところ、約１２０種類のＨＰＶが明らかになっており、これらは各種類ごとに有病率及び疫学的・臨床的症状が異なる（ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。とりわけ、粘膜型のものは、生殖器、肛門、及び中咽頭の粘膜の角化上皮に感染する（Ｍｕｎｏｚ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｍｕｎｏｚ ａｎｄ Ｂｏｓｃｈ， １９９７； Ｖａｎ Ｒａｎｓｅｔ ｅｔ ａｌ， １９９２； Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｄ’Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。粘膜型のＨＰＶは、最も一般的には、性的接触により伝染し、性交が盛んな人々がとても高い確立で感染する。女性が生涯においてＨＰＶに感染する確立は８０％と推定される（Ｂｅｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。また、世界各地における活動性感染の有病率は１．４％〜２５％程度であり、様々である。
【０００４】
感染のうちの圧倒的多数は無害であり自己限定的であるが、一部の"高リスク"型ＨＰＶに感染した場合、持続感染を招く可能性があり、これはひいては悪性に転換し、浸潤癌に進行するおそれがある（Ｍｕｎｏｚ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。子宮頸癌は、最も一般的なＨＰＶ関連悪性腫瘍であり、今日では、ＨＰＶが実質上全ての子宮頸癌の必要原因となっていることが明らかである（Ｂｏｓｃｈ ａｎｄ Ｍｕｎｏｚ， ２００２； ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ， ２００２， Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｍｕｎｏｚ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ， ２００７）。また、肛門管（Ｍｅｌｂｙｅ ａｎｄ Ｓｐｒｏｇｅｌ， １９９１； Ｐａｌｅｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９１）、陰門（Ｂｕｓｃｅｍａ ｅｔ ａｌ．， １９８８）、陰茎（Ｇｒｅｇｏｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｉｗａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、中咽頭の粘膜、その他の頭頸部組織（Ｄ’Ｓｏｕｚａ， ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｇｉｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｓｙｒｊａｎｅｎ， ２００５）にも、ＨＰＶ関連悪性腫瘍が見つかることがある。
【０００５】
ＨＰＶ感染は、実質上全ての子宮頸癌の進行の必要原因となっている。そのため、パパニコロー法（パップ・テスト）を用いた昔ながらの細胞学的スクリーニングと平行して、あるいはその代用として、高リスク型ＨＰＶの検出が、子宮頸癌のスクリーニング方法として行われるようになってきている。当該スクリーニング方法を導入することにより、子宮頸癌スクリーニングプログラムの検出感度が向上し、性能価格比も向上する（Ｃｕｚｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２００８； Ｃｕｚｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｒｏｎｃｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｍａｙｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｃｕｚｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。
【０００６】
近年、２種類の型特異性のＨＰＶワクチン（１６型、１８型、６型及び１１型に有効なＭｅｒｃｋ−Ｆｒｏｓｓｔ社のガーダシル；１６型及び１８型に有効なＧｌａｘｏ−Ｓｍｉｔｈ−Ｋｌｉｎｅ社のサーバリックス）が開発されている。臨床試験によると、これらのワクチンは、ＨＰＶの持続感染を防止し、また、悪性転換を招き得る頸部上皮の異形成変化を防止するのに、極めて有効である（Ｋｏｕｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｖｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。しかしながら、これらのワクチンは型特異性のものであるため、地域の人々の間でどのようなタイプのＨＰＶが分布しているかを知っておくことが重要である。また、ワクチンの有効性や、ワクチンではカバー出来ないタイプのＨＰＶの発生頻度の予想外の変化を、モニタリングするための監視システムを適所に設けることが重要である。
【０００７】
それ故に、ＨＰＶの型特異的なテストが、現在行われているような研究目的の疫学調査での使用だけに限らず、日常的に広く受け入れられて使用されようになることが予想される。
【０００８】
現在のところ、ＨＰＶのタイプを特定するためには、様々なＰＣＲ法による増幅が必要であり、また、ＰＣＲ法に続いて、特定の配列を検出しなければならない。特定の配列を検出するのは、ＰＣＲ産物を直接配列決定したり、ＲＦＬＰ法（多くの方法が文献に開示されている。例えば、Ｌｕｎｇｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｍｅｎｚｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８； Ｎｏｂｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００８； Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６）を用いたり、特定のプローブを使用してサザンブロッティングやドットブロッティングを行ったり（例えば、Ｇｒｅｇｏｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、ｒｅｖｅｒｓｅ−ｌｉｎｅハイブリダイゼーション（Ｇｒａｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｋｌｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９； ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｍｅｌｃｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ， １９９９）を利用したり、ＤＮＡマイクロアレイ法（Ｍｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ａｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ， ２００６； Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｈａｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｈｗａｎｇ ｅｔａ ｌａ．， ２００３； Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｎｕｏｖｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８）を用いたり、その他の方法（例えば、Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８； Ｄｅｌｌ’Ａｔｔｉ， ２００７； Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００３；Ｇｈａｒｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ， ２００３； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ， ２００３）を用いたりすることにより、行うことができる。とりわけ、ｒｅｖｅｒｓｅ−ｌｉｎｅブロット法は有効な方法であり、疫学調査に広く用いられている。ＩｎｎｏＬｉＰＡ（ｖａｎ Ｈａｍｏｎｔ， ２００６）及びロシュ社のリニアアレイ（Ｃｏｕｔｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６）は、２つの主要な業務用の遺伝子型決定方法であり、いずれもリバースハイブリダイゼーション技術を基礎とするものである。ロシュ社のリニアアレイ遺伝子型決定キットは、ＦＤＡの認可を得ているものであり、業務用の遺伝子型決定手法に主として用いられているものである。しかしながら、これらの手法は、処理量が多い場合の試験に適しておらず、また、結果を判定する際にバンドの明暗度を視覚により評価するので、評価に際し主観に頼ることとなる。
【０００９】
ルミネックス社（米国テキサス州オースティン）により開発されたｘＭＡＰ技術は、１００種類の異なる「色」に着色されたマイクロビーズを利用するものである。この「色」は、マイクロビーズにカップリングされる２種類のスペクトル的に異なる蛍光色素の配合を調整することにより、１００通りに染色されるのである。異なる色は、フローサイトメーターにより認識することができ、異なる種類のマイクロビーズの数を数えることができ、特異的な結合リガンドの存否を分析することができる。この技術は、血清学、遺伝子型決定、及びその他の解析的な適用における様々な多重アッセイの基礎となっている。ルミネックス社のウェブサイトには、ルミネックス技術の説明が掲載されており、また、文献リストが掲載されている。
【００１０】
各タイプのマイクロビーズはそれぞれ特異的なリガンドに結合することが可能である。特異的なリガンドとは、例えばこの研究においては、各タイプのＨＰＶに特異的なＤＮＡプローブである。そして、これらのマイクロビーズはマルチプレックスアッセイを形成するために混合される。ＨＰＶサンプルに由来するＰＣＲ産物はビオチンでラベルされ、ＨＰＶのＤＮＡが対応するプローブとハイブリダイズするように、プローブを保持しているビーズと混合された。それからフローサイトメーターによりマイクロビーズの異なる"色"が識別され、どのタイプがＨＰＶのＤＮＡに由来する蛍光を保持しているかが決定される。フローサイトメーターを作動させるコンピュータソフトウェアによりどのビーズが蛍光を発しているかが示され、それにより試料中に存在するＨＰＶのタイプが特定される。この方法の利点は、一分析当たりの費用が安い点、高処理能力のアッセイを自動化できる可能性、及び、アッセイの必要性に応じてあるいは新しいタイプの発見に応じてマイクロビーズのタイプを追加し又は除去することが可能なことによる柔軟性にある。いくつかのマイクロビーズを基礎としたＨＰＶ遺伝子型決定のためのマルチプレックスアッセイが刊行物により公知となっている。Ｗａｌｌａｃｅら（２００５年）による方法は、４５種類の粘膜ＨＰＶのためのプローブを用いた多重マイクロビーズアッセイである。しかしながら、形式的確認はわずかのタイプについてしか行われず、２０種類のみが臨床サンプルから検出されたものであり、遺伝子型決定の結果についての独立した検証は行われないのである。Ｏｈら（２００７年）により公表されている方法は、１５種類のＨＰＶを検出するものであり、１３２個の臨床サンプルに対して検証が行われている。ＤＮＡマイクロアレイ遺伝子型決定法と対比した５６サンプルも開示されている。Ｓｃｈｍｉｔｔら（２００６年）による方法は、ＨＰＶプラスミド及び臨床サンプルと注意深く比較検証され、２２種類の最も一般的な粘膜型ＨＰＶを網羅する。Ｊｉａｎｇら（２００６年）による方法は、２６種類の粘膜型ＨＰＶの特異的なプローブを開示している。検証は、プローブと相補的な合成オリゴヌクレオチド及び限られた数の臨床サンプルを用いることにより、行われた。Ｑｉａｇｅｎ（独国ヒルデン）によって開発された商業的な方法は、専売のプライマーセットを使用し、続いてルミネックスシステムを用いた検出を行うものであり、１８種類の高リスク型ＨＰＶのタイプを特定することができる。このルミネックスキアゲン試験と、リバースラインブロットハイブリダイゼーションと、を比較した研究が少なくとも１つ公表されている（Ｓｅｍｅら， ２００９年）。
【００１１】
ここに、私達は、新しいＨＰＶ型特異性のプローブのデザインを報告し、また、１回の反応で４６種類の異なる粘膜型タイプを検出することができるマイクロビーズを用いたマルチプレックスアッセイを開発したことを報告する。このユニークなプローブセットには、従来からある方法と比べて、二つの新しいアイデアが導入されている。第一に、変異型や近縁種にあるタイプを判別可能とするべく特異性をより高めるために、従来よりも長いプローブ（３０ｍｅｒｓ）を用いた。第二に、エキソヌクレアーゼを用いてＰＣＲ産物を選択的に分解することにより、一本鎖ＤＮＡ産物を生産することとした。こうすることにより、ノイズに対するシグナルの比率が大きくなり、洗浄の過程が不要となった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、複数種類のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の遺伝子型を高精度に特定するめの試薬及び方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
私達は、４６種類のＤＮＡプローブのセットを提示し、また、ルミネックスｘＭＡＰ技術を用いて４６種類の粘膜型ＨＰＶを検出するためのＰＣＲ増幅法を提示する。この技術には、適切なマイクロビーズの混合物を用いる。各マイクロビーズは、それぞれ特異的なＨＰＶプローブとカップリングされている。これを用いることにより、１つの反応チューブの中で４６種類全てを同時に検出することができるのである。
【００１４】
私達のデータによれば、全てのプローブが、相互にクロスハイブリダイゼーションを生じることがなく、反応性及び特異性が良好であり、４６種類のＨＰＶタイプの検出に適していることがわかる。この結論は、４６タイプからの基準ＤＮＡの使用により支持され、また、ＨＰＶタイプの特定のためのスタンダードな方法である直接シークエンス法を用いた広範囲にわたる検証により支持される。
【００１５】
このルミネックス法により、少なくとも３２種類のＨＰＶタイプから増幅したＤＮＡを、同時にかつ正確に検出することができる。
【００１６】
主要な商業用のＨＰＶタイプ特定方法であるロッシュリニアアレイと比較することにより、ＮＭＬルミネックスアッセイが３種類以下のＨＰＶタイプを含む臨床サンプルにおけるＨＰＶタイプの特定に適していることがわかる。しかしながら、このＰＣＲ増幅方法は、４種類以上のＨＰＶタイプに感染しているサンプルからのＤＮＡを増幅する場合には効率が悪くなる。この問題は、ＰＣＲ増幅法に起因する問題であり、プローブセットやルミネックス検出システムに起因する問題ではない。複数感染をしている場合に増幅の効率が悪くなることは、ＨＰＶ５２型、５３型、６１型、７３型、８４型、及び８９型においては顕著な問題となるが、疫学及び臨床業務において最も重要となる主要な発癌性のＨＰＶタイプの検出に際してはさして問題とはならない。
【００１７】
４種類以上のＨＰＶタイプに感染しているサンプルを除くと、ＮＭＬルミネックスによる検出結果とロッシュリニアアレイによる検出結果とは一致する。そのため、複数感染をしている頻度の高い母集団（例えばエイズウイルス感染者や、男性と性交する男性や、売春婦）に対してＮＭＬルミネックス法を用いた場合、特定のタイプについての有病率を過小評価することにつながる。一方、４種類以上のタイプへの感染の有病率がごくわずかである女性の一般集団にＮＭＬルミネックス法を用いた場合、ほとんどのタイプについての有病率の正確な結果を得ることができる。
【００１８】
ＮＭＬルミネックスＨＰＶ遺伝子型決定法は、ほとんど全ての性器ＨＰＶタイプの検出をすることができるという利点を有し、また、２段階ＰＣＲ法のおかげで非常に反応性が高いという利点を有する。ルミネックスｘＭＡＰ技術により、サンプルを迅速に無干渉で読みとり、結果からの客観的な計算的解釈を得ることが可能となる。私達の当該方法には洗浄の過程がなく、また、目視する過程もないので、自動化を行いやすい。
【００１９】
本発明の第一の態様によれば、サンプル中におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプへの感染を検出しタイプを特定するための方法であって、以下の過程を全て含む方法が提供される。
ａ）少なくとも１種類のＨＰＶタイプを含むことが疑われるサンプルを準備する過程。
ｂ）前記サンプルに、ＨＰＶのＬ１領域を増幅するのに適切なプライマーを添加する過程。
ｃ）前記サンプルをＤＮＡ増幅に適切な条件下でインキュベートする過程。
ｄ）配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する少なくとも一つのプローブを添加する過程。前記プローブはハイブリダイゼーション条件下でそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみ結合し、各前記少なくとも一つのプローブはさらに特有のタグを備える。
ｅ）前記プローブ及び前記サンプルをハイブリダイゼーションに最適な条件下でインキュベートする過程。
ｆ）少なくとも一つの前記タグ付きプローブのハイブリダイゼーションを検出する過程。
【００２０】
本発明の第二の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００２１】
本発明の第三の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１、２、４又は５のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００２２】
本発明の第五の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号４、５及び１７のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００２３】
本発明の第六の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号４、５、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２２、２３、２４、２７及び２９のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００２４】
本発明の第七の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号６、４、５、７、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３７、４０及び４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００２５】
本発明の第八の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１、２、９、１３、１４、１５、１６、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４３、４４及び４５のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＨＰＶ６型及びＨＰＶ１６型の２０ｍｅｒのプローブを用いた予備ハイブリダイゼーションテスト。ＨＰＶ６型及び１６型の２０ｍｅｒのプローブ（表１を参照）とカップリングした２種類のマイクロビーズの混合物は、指示体積のＰＣＲ反応とハイブリダイズされ（パネルＡ及びパネルＢ）、あるいはＨＰＶ１６型のプローブと厳密に相補的な２０ｍｅｒのプローブとハイブリダイズされ（パネルＣ）、あるいは関係のないＰＣＲ産物（β−グロブリンＤＮＡ）とハイブリダイズされた。
【図２】この書類においては、４６種類のＨＰＶタイプにおけるプローブの配置について考察している。ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーの間に配置されるＬ１領域の配列が示してある。プライマーの配置はボックスで取り囲むことにより示してあり、プローブの配列は太字で下線付きで示してある。
【図３】ルミネックスビーズへのハイブリダイゼーションにおける、２段階ＰＣＲ産物のＴ７エキソヌクレアーゼによる分解の効果。上述したように、ＨＰＶ１６型のＤＮＡはＭＹ０９／Ｍｙ１１及びＧＰ５＋／ＧＰ６＋を用いた２段階ＰＣＲにより増幅され、その産物は所定時間の間Ｔ７エキソヌクレアーゼにより分解された。分解された後、ＰＣＲ産物はＨＰＶ１６型のプローブを保持したルミネックスビーズにハイブリダイズされ、上述のように検出された。ＧＰ６＋プライマーは、ルミネックス技術による検出を可能とするために、５´ビオチン部分を含んでおり、また、５´末端から最初の４つのヌクレオチドには、この一本鎖をＴ７エキソヌクレアーゼの作用から保護するために、ホスホロチオエート結合が導入されている。黒い棒グラフ及び白い棒グラフはそれぞれ、陰性試料、及び、ＨＰＶ１６型のプローブと相補的なビオチニル化したオリゴヌクレオチドを含む試料の、蛍光シグナルを示している。
【図４】表４のデータを図示したもの。プローブが右軸に、ＨＰＶＤＮＡが左軸に示してある。垂直方向の軸は、特異的なＨＰＶプローブをカップリングしている各マイクロビーズの蛍光強度を示している。対角線上の棒グラフは、所望の対応するプローブとのＨＰＶＤＮＡタイプのハイブリダイゼーションを示している。
【図５】複数のＨＰＶタイプの同時検出。本文に示されるように、複数のＨＰＶタイプのＤＮＡを含む試料が準備され、記載されているように、ＮＭＬルミネックス法により検出された。各試料に含まれるタイプの数は最も左の欄に示してある。左から２番目の欄には、混合物に追加されたＨＰＶタイプを示してある。"＋"の印は、結果が陽性であったことを示す（５０ＦＵを超えている場合）。アスタリスクは、結果が偽陽性あるいは偽陰性であったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
別段の定義をしてない限り、ここで使用されている全ての技術的・科学的用語は、本発明の属する技術の属する分野における通常の知識を有する者が一般的に理解するのと同様の意味を有するものと解するものとする。本発明の実施及びテストに際しては、ここで説明されている方法及び材料を、これらと同様の又は均等なものと置き換えて用いることができるが、以降においては特に好適な方法及び材料のみについて説明する。以下で言及する全ての文献は、参照することにより本願明細書の一部とみなされる。
【００２８】
４６種類の性器ＨＰＶそれぞれの特定配列に基づいて、配列ＩＤ番号１〜４６から成るＤＮＡプローブが作成された。すなわち、６型（配列ＩＤ番号１）、１１型（配列ＩＤ番号２）、１３型（配列ＩＤ番号３）、１６型（配列ＩＤ番号４）、１８型（配列ＩＤ番号５）、２６型（配列ＩＤ番号６）、３０型（配列ＩＤ番号７）、３１型（配列ＩＤ番号８）、３２型（配列ＩＤ番号９）、３３型（配列ＩＤ番号１０）、３５型（配列ＩＤ番号１１）、３９型（配列ＩＤ番号１２）、４０型（配列ＩＤ番号１３）、４２型（配列ＩＤ番号１４）、４３型（配列ＩＤ番号１５）、４４型（配列ＩＤ番号１６）、４５型（配列ＩＤ番号１７）、５１型（配列ＩＤ番号１８）、５２型（配列ＩＤ番号１９）、５３（配列ＩＤ番号２０）、５４型（配列ＩＤ番号２１）、５６型（配列ＩＤ番号２２）、５８型（配列ＩＤ番号２３）、５９型（配列ＩＤ番号２４）、６１型（配列ＩＤ番号２５）、６２型（配列ＩＤ番号２６）、６６型（配列ＩＤ番号２７）、６７型（配列ＩＤ番号２８）、６８型（配列ＩＤ番号２９）、６９型（配列ＩＤ番号３０）、７０型（配列ＩＤ番号３１）、７１型（配列ＩＤ番号３２）、７２型（配列ＩＤ番号３３）、７３型（配列ＩＤ番号３４）、７４型（配列ＩＤ番号３５）、８１型（配列ＩＤ番号３６）、８２型（配列ＩＤ番号３７）、８３型（配列ＩＤ番号３８）、８４型（配列ＩＤ番号３９）、８５型（配列ＩＤ番号４０）、８６型（配列ＩＤ番号４１）、８７型（配列ＩＤ番号４２）、８９型（配列ＩＤ番号４３）、９０型（配列ＩＤ番号４４）、９１型（配列ＩＤ番号４５）、及び９７型（配列ＩＤ番号４６）である。それぞれのプローブを反応性が高く特異的なものとするために、これらのプローブは以下に示すとおり多重アッセイにより試験された。試験において、目的とするＨＰＶタイプにハイブリダイズしないものや、他のタイプにクロスハイブリダイズしてしまうものは、再設計された。時には何度も再設計を繰り返した。最終的に、全てのプローブがそれぞれ固有のＨＰＶタイプＤＮＡにハイブリダイズするものとなった。したがって、各プローブはそれぞれ、単一の特異的なＨＰＶ遺伝子又はＨＰＶタイプに特異的に結合する。表２には、プローブのデザインの履歴が示してある。
【００２９】
多重アッセイにおいては、製造業者の使用説明書に従い、各プローブはそれぞれ４６種類の蛍光マイクロビーズのいずれかに結合された。各マイクロビーズは、赤色及び赤外蛍光色素を独自の異なる配合で組み合わせて染色したものである。ルミネックス社により製造されるマイクロビーズは、２種類の蛍光色素の組み合わせにより１００種類の異なる色に色分けされたものであり、赤色レーザーを用いたフローサイトメーターにより色を認識するとともに数を数えることができる。また、フローサイトメーターは、緑色レーザーを用いることにより、ビーズセットのいずれかに結合したレポーター染料を検出することもできる。本実施形態では、４６セットのビーズが選択され、各セットがそれぞれ３０ｍｅｒの特有のオリゴヌクレオチドプローブにカップリングされた。各オリゴヌクレオチドプローブは、４６種類の性器ＨＰＶのＤＮＡのうちのいずれかに特異的かつ良好にハイブリダイズするように設計され、後述するように増幅された。マルチプレックス反応が進行するように、４６セットのビーズが混合された。こうすることにより、４６種類のＨＰＶのＤＮＡの結合を検出することができるのである。
【００３０】
プローブは、ＰＣＲ増幅プライマーＧＰ５＋／ＧＰ６＋の間に含まれる領域を増幅するように設計された。この領域は、１６型ＨＰＶにおいては１４１ｂｐの長さである（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１２５６７３，６６２４〜６７６４番のヌクレオチド）。しかし、この長さは、ＨＰＶの種類によって若干異なる。ＧＰ５＋／ＧＰ６＋は、ほとんどの種類のＨＰＶからそのＤＮＡを増幅することのできる一般的なプライマーである。また、公知となっているプライマーセットＭＹ０９／ＭＹ１１及びプライマーセットＰＧＭＹも、ほとんどの種類の性器ＨＰＶにおいてその遺伝子を増幅することのできる一般的なプライマーである。これらのプライマーセットの領域は、ＧＰ＋／ＧＰ６＋の領域の外側に位置しているので、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーと共に用いることにより２段階ＰＣＲ増幅反応に使用することができる。こうすることにより、とりわけ複数種類が同一のサンプルの中に存在するような場合には、ＨＰＶタイプの検出感度及び範囲を向上させることができる。
【００３１】
これらのプライマーを用いることにより、臨床サンプルから得られたＨＰＶのＤＮＡが増幅された。そして、これをＴ７エキソヌクレアーゼで処理することにより、マイクロビーズにカップリングしたプローブの配列と相補的なビオチン標識一本鎖ＤＮＡが得られた。そして、一本鎖となったＨＰＶのＤＮＡは、標識が付けられたマイクロビーズとともに、インキュベートされた。インキュベートすることにより、ＨＰＶのＤＮＡを、マイクロビーズ上の対応するプローブに、結合させることができた。そして、フルオロフォアフィコエリスリンを結合させたストレプトアビジンが添加された。ストレプトアビジンは、ビオチンに強く結合し、ＨＰＶのＤＮＡに結合したマイクロビーズにフィコエリスリン蛍光を付与する。そして、サンプルはフローサイトメリーにより分析された。フローサイトメリーにより、結合した各マイクロビーズのタイプごとの数を分析するとともに、それらのフィコエリスリン蛍光強度を分析することができる。特定のビーズにおいてフィコエリスリン蛍光強度が高いということは、その特定の種類のＨＰＶのＤＮＡが存在することを指し示す。
【００３２】
４６種類のＨＰＶを検出するための多重アッセイに加えて、ワクチンに含まれているタイプのＨＰＶ（ＨＰＶ６型（配列ＩＤ番号１）、１１型（配列ＩＤ番号２）、１６型（配列ＩＤ番号４）、及び１８型（配列ＩＤ番号５））に限定してテストを行うために、マイクロビーズを上記とは異なる組み合わせで混合するものとしてもよい。あるいは、最も有害なタイプのＨＰＶ（ＨＰＶ１６型（配列ＩＤ番号４）、１８型（配列ＩＤ番号５）、及び４５型（配列ＩＤ番号１７））についてテストするために、あるいは最も一般的なタイプのＨＰＶ（ＨＰＶ１６型（配列ＩＤ番号４）、１８型（配列ＩＤ番号５）、３１型（配列ＩＤ番号８）、３３型（配列ＩＤ番号１０）、３５型（配列ＩＤ番号１１）、３９型（配列ＩＤ番号１２）、４５型（配列ＩＤ番号１７）、５１型（配列ＩＤ番号１８）、５２型（配列ＩＤ番号１９）、５６型（配列ＩＤ番号２２）、５８型（配列ＩＤ番号２３）、５９型（配列ＩＤ番号２４）、６６型（配列ＩＤ番号２７）、及び６８型（配列ＩＤ番号２９））について、あるいは全ての発癌性のタイプのＨＰＶ（ＨＰＶ２６型（配列ＩＤ番号６）、１６型（配列ＩＤ番号４）、１８型（配列ＩＤ番号５）、３０型（配列ＩＤ番号７）、３１型（配列ＩＤ番号８）、３３型（配列ＩＤ番号１０）、３５型（配列ＩＤ番号１１）、３９型（配列ＩＤ番号１２）、４５型（配列ＩＤ番号１７）、５１型（配列ＩＤ番号１８）、５２型（配列ＩＤ番号１９）、５３型（配列ＩＤ番号２０）、５６型（配列ＩＤ番号２２）、５８型（配列ＩＤ番号２３）、５９型（配列ＩＤ番号２４）、６６型（配列ＩＤ番号２７）、６７型（配列ＩＤ番号２８）、６８型（配列ＩＤ番号２９）、６９型（配列ＩＤ番号３０）、７０型（配列ＩＤ番号３１）、７３型（配列ＩＤ番号３４）、８２型（配列ＩＤ番号３７）、８５型（配列ＩＤ番号４０）、及び９７型（配列ＩＤ番号４６））についてテストするために、あるいは非発癌性（低リスク）のタイプ（６型（配列ＩＤ番号１）、１１型（配列ＩＤ番号２）、３２型（配列ＩＤ番号９）、４０型（配列ＩＤ番号１３）、４２型（配列ＩＤ番号１４）、４３型（配列ＩＤ番号１５）、４４型（配列ＩＤ番号１６）、５４型（配列ＩＤ番号２１）、６１型（配列ＩＤ番号２５）、６２型（配列ＩＤ番号２６）、６６型（配列ＩＤ番号２７）、６７型（配列ＩＤ番号２８）、６８型（配列ＩＤ番号２９）、６９型（配列ＩＤ番号３０）、７０型（配列ＩＤ番号３１）、７２型（配列ＩＤ番号３３）、７４型（配列ＩＤ番号３５）、８１型（配列ＩＤ番号３６）、８３型（配列ＩＤ番号３８）、８４型（配列ＩＤ番号３９）、８６型（配列ＩＤ番号４１）、８７型（配列ＩＤ番号４２）、８９型（配列ＩＤ番号４３）、９０型（配列ＩＤ番号４４）、及び９１型（配列ＩＤ番号４５））のみについてテストするために、マイクロビーズを上記とは異なる組み合わせで混合するものとしてもよい。
【００３３】
本発明の第一実施形態に基づいて、多様なＨＰＶのウイルス株の遺伝子型決定を行うためのＤＮＡ増幅技術と合わせて用いることのできる一連のＤＮＡプローブが提供される。
【００３４】
本発明の第二実施形態では、多数のＨＰＶのウイルス株を同時に検出するための多重形式アッセイに用いることのできる一連のＤＮＡプローブが提供される。
【００３５】
本発明の第三の実施形態では、当該ＤＮＡプローブは他の検出システムにも用いることができる。他の検出システムには、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リバースラインブロットハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、及び当業者にとって明らかな他の同様のシステムが含まれる。
【００３６】
本発明の一つの態様によれば、サンプル中におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプへの感染を検出しタイプを特定するための方法であって、以下の過程を全て含む方法が提供される。
ａ）少なくとも１種類のＨＰＶタイプを含むことが疑われるサンプルを準備する過程；
ｂ）前記サンプルに、ＨＰＶのＬ１領域を増幅するのに適切なプライマーを添加する過程；
ｃ）前記サンプルをＤＮＡ増幅に適切な条件下でインキュベートする過程；
ｄ）配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する少なくとも一つのプローブを添加する過程であって、前記プローブはハイブリダイゼーション条件下でそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみ結合し、各前記少なくとも一つのプローブはさらに特有のタグを備える、過程；
ｅ）前記プローブ及び前記サンプルをハイブリダイゼーションに最適な条件下でインキュベートする過程；
ｆ）少なくとも一つの前記タグ付きプローブのハイブリダイゼーションを検出する過程。
【００３７】
ここで説明されているように、サンプルには１種類よりも多いＨＰＶタイプが含まれていてもよい。また、"少なくとも一つのプローブ"は、プローブセットを含むものであってもよく、又は当該プローブセットから成るものであってもよい。当該プローブセットのそれぞれのプローブは、配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有し、また、それぞれのプローブを特異的に特定するための特有のタグ又は識別タグを有する。例えば、配列ＩＤ番号１に記載のヌクレオチド配列を有する全てのプローブは、配列ＩＤ番号２に記載のヌクレオチド配列を有する全てのプローブが有しているのと同じタグを有するものであってもよい。
【００３８】
ここで説明されているように、ハイブリダイゼーションの条件は十分に厳しいものであるので、プローブは目的のＤＮＡにのみ結合する。例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれよりも多い数の連続したヌクレオチドが正確に一致するときに限り２本の鎖がハイブリダイゼーションを起こす程度に、ハイブリダイゼーションの条件を十分に厳しいものとすることができる。
【００３９】
配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、特有のタグと、から成る複数のプローブは、与えられたサンプル中におけるとりわけＨＰＶタイプを特定するためにマルチプレックスアッセイにおいて一緒に用いることができ、あるいはそれらのセットのうちのいくつか（サブコンビネーション）を一緒に用いることができる。このことは当業者によって高く評価されるであろう。特に、各プローブはそれに関連する特有のタグを有しているので、サンプル中のＤＮＡ分子がそれぞれのプローブにハイブリダイゼーションした場合、そのサンプル中に対応するＨＰＶタイプが存在することが示唆される。以降に説明するように、このプローブセットはそれぞれのプローブがクロスハイブリダイズしない点で特徴的である。
【００４０】
いくつかの実施形態においては、少なくとも一つのプローブは、プローブの混合物と言うことができ、前記混合物の各典型的なプローブは、配列ＩＤ番号１、２、４若しくは５に記載の、又は配列ＩＤ番号４、５若しくは１７に記載の、又は配列ＩＤ番号４、５、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２２、２３、２４、２７若しくは２９に記載の、又は配列ＩＤ番号６、４、５、７、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３７、４０若しくは４６に記載の、又は配列ＩＤ番号１、２、９、１３、１４、１５、１６、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４３、４４若しくは４５に記載のヌクレオチド配列を有する。
【００４１】
前記特有のタグは二つの蛍光染料の組み合わせである。
【００４２】
ここに説明するように、前記特有のタグは異なる比率の赤色及び赤外蛍光色素の組み合わせである。
【００４３】
本発明の他の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００４４】
本発明の他の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１、２、４又は５のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。配列ＩＤ番号３及び６〜４６のいずれか一つに記載の配列を有するプローブ、並びにこれらのプローブのいくつかの組み合わせを、このプローブセットにさらに追加してもよい。このことは、当業者によって高く評価されるであろう。
【００４５】
本発明の他の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号４、５及び１７のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００４６】
本発明の他の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号４、５、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２２、２３、２４、２７及び２９のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００４７】
本発明の他の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号６、４、５、７、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３７、４０及び４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００４８】
本発明の他の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１、２、９、１３、１４、１５、１６、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４３、４４及び４５のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００４９】
［オリゴヌクレオチド］
オリゴヌクレオチドは、Ｎａｔｉｏｎａｌ・Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ・ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤＮＡコアセクションで合成された。プローブの５´末端のＣ１２をアミノリンカーで修飾し、これがルミネックス社のマイクロビーズのカルボキシル基にカップリングするようにした。ＨＰＶのＤＮＡをＰＣＲ増幅するために用いるプライマーであるＭＹ０９、ＭＹ１１、ＧＰ５＋及び修飾ＧＰ６＋プライマーは、インビトロジェン社（カナダ，オンタリオ州バーリントン）より購入した。
【００５０】
［ＰＣＲ増幅］
プラスミド又は臨床検査サンプルから採取したＨＰＶのＤＮＡは、１段階目はＭＹ０９／ＭＹ１１プライマーを用いて（Ｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９）、２段階目はＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーを用いて（Ｒｏｄａ Ｈｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、２段階ＰＣＲ増幅反応により増幅された。複数のＨＰＶタイプを含む臨床サンプルにおいてＤＮＡの増幅を最適に行うためには、１段階目においてＰＧＭＹプライマーが用いられた（Ｇｒａｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ， ２０００）。ＧＰ６＋プライマーは以下の修飾を含むものであった。：ｉ）ＰＣＲ産物（以下参照）の検出に際し、ストレプトアビジン−ＰＥのリガンドとして用いるために、５´末端にビオチン標識を付した。；ｉｉ）バクテリオファージＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ（以下を参照するとともに、結果のセクションを参照されたい）の作用に対して耐性を付与するために、５´末端から数えて最初の４つのヌクレオチドにはホスホロチオエート結合を導入した。ＰＣＲ増幅は、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰ（インビトロジェン社，カタログ番号＃１０２９７−０１８）、０．２ｍＭずつの各プライマー、及び１．２５Ｕのアンプリタック・ゴールド・ポリメラーゼ（アプライド・バイオシステム社，カタログ番号＃４３１１８１６）を含有する１×ＰＣＲバッファー（インビトロジェン社，カタログ番号＃１０３４２−０２０）の中で行われた。ＭＹ０９／ＭＹ１１プライマーを用いた、２段階ＰＣＲ増幅反応のうちの１段階目は、９４℃で５分間の最初の変性ステップにより開始され、続いて、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で６０秒間のエロンゲーションで構成されるサイクルを３０サイクル行った。最後に、７２℃で７分間のエクステンションがなされた。ＰＧＭＹプライマーを用いた増幅は、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ、及び１８種類のプライマーそれぞれ０．６μＭずつ含むＰＧＭＹミクスチャー（Ｇｒａｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００）の存在下で、４０サイクル（９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間のエロンゲーション）行われた。この反応溶液のうちの１〜５μＬ（通常は２μＬ）が、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーを用いた２段階目の増幅反応に用いられた。２段階目の増幅反応は、次の条件下で行った。：９４℃で５分間の最初の変性を行った後、続いて、９４℃で３０秒、４０℃で２０秒、７２℃で３０秒から成るサイクルを３０サイクル行う。最後に、７２℃で７分間のエクステンションがなされる。ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーを用いた１段階ＰＣＲ増幅反応を行う場合には、次の条件下で行った。：９４℃で５分間の最初の変性を行った後、続いて、９４℃で３０秒、４０℃で２０秒、７２℃で３０秒から成るサイクルを３０サイクル行う。最後に、７２℃で７分間のエクステンションがなされる。
【００５１】
［Ｔ７エキソヌクレアーゼによるＰＣＲ産物の分解］
ＰＣＲを行った後、ビオチニル化したストランドと相補的なＧＰ５＋ストランドは、５´→３´エキソヌクレアーゼであるＴ７遺伝子エキソヌクレアーゼにより分解された。もう一方の方のストランドは、５´末端に４つのホスホロチオエート結合を有することにより、Ｔ７エキソヌクレアーゼの作用から保護された（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ， １９９４）。Ｔ７エキソヌクレアーゼ（ニュー・ニュー・イングランド・バイオラボ社，カタログ番号＃Ｍ０２６３Ｌ）がＰＣＲ産物に最終濃度が０．４Ｕ／μｌとなるように添加されることにより、相補鎖が分解されて、ビオチン標識した１本鎖ＤＮＡが生成された。この１本鎖ＤＮＡは、ルミネックス社のビーズにカップリングされたプローブと相補的な配列を有する。この分解反応は、最終濃度が０．５ＭとなるようにＥＤＴＡを１２．５μｌ添加することにより、停止された。
【００５２】
［マイクロビーズの調整］
赤色及び赤外蛍光色素を異なる比率で配合して分類したマイクロビーズのセットは、ルミネックス社より購入した（米国テキサス州オースティン，カタログ番号＃Ｌ１００−ＣＸＸＸ−０１）。これらのマイクロビーズは、製造業者の使用説明書に従い、適宜変更を加えて、ＨＰＶのタイプ特異的なプローブにカップリングされた。当該ＨＰＶのタイプ特異的なプローブは、５´側がアミノ修飾されており、マイクロビーズの表面に結合されているカルボキシル基と反応して結合できるようになっている。簡単に説明すると、マイクロビーズストック（ルミネックス社）は、しっかりとボルテックスされた後、それぞれのマイクロビーズのセットから、５．０×１０６個のビーズを含むアリコットが採取されて、それぞれ独立した１．５ｍｌ容量の微量遠心管チューブの中に入れられた。そして、超音波ウォーターバス（ブランソン社）の中で再懸濁され、１４０００×ｇで２分間遠心処理された。そして、上清が除去されて、そのマイクロビーズはｐＨ４．５で０．１Ｍ ２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）（シグマ社，カタログ番号＃Ｍ−２９３３）５０μｌに再懸濁された。そして、異なるセットのマイクロビーズにそれぞれ適切なタイプの１ｍＭアミノ置換オリゴヌクレオチド溶液が１μｌずつ添加され、それぞれのチューブに１０ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（フィッシャー社，カタログ番号＃２２９８０）の溶液が２．５μＬずつ添加された。それぞれのチューブはボルテックスされ、室温、暗所で３０分間インキュベートされた後、それぞれのチューブに１０ｍｇ／ｍｌ ＥＤＣが２．５μＬずつ添加された。その後、暗所で３０分間インキュベートされた。この２回目のインキュベートの期間が終了した後、０．０２％ツイン（登録商標）２０（シグマ社，カタログ番号＃Ｐ−９４１６）が１ｍｌずつ添加され、それぞれのチューブが１４，０００×ｇで２分間遠心処理された。上清が除去されて、マイクロビーズのペレットに０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）が１ｍｌ添加された。各チューブはボルテックスされた後、１４，０００×ｇで２分間遠心処理された。上清が除去されて、ペレットが１００μｌのＴＥに再懸濁された。プローブにカップリングしたマイクロビーズは、暗所、４℃で最大で６ヶ月保存された。
【００５３】
［ルミネックスアッセイ］
ルミネックスアッセイにおいては、通常は各セットが１５マイクロビーズ／μｌずつ採取され、混合液において混合された。エキソヌクレアーゼで分解した後のＰＣＲ産物は、９６ウェルＰＣＲマイクロプレート（フィッシャー社，カタログ番号＃ＣＳ００６５０９）の各ウェルの中に全体積が１７μｌとなるように採取され、９６ウェルシーリングカバー（フィッシャー社，カタログ番号＃ＣＳ００６５５５）によりシールされた。マイクロプレートは、ＤＮＡを変性させるために、９５℃で１０分間インキュベートされ、そして、マイクロビーズ混合液３３μＬが添加された。これらのサンプルは、ハイブリダイゼーション温度で１０分間インキュベートされ、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（インビトロジェン社，カタログ番号＃Ｓ−８６６）の溶液０．０４ｍｇ／μｌが２５μｌ添加された後、１×テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）（シグマ社，カタログ番号＃Ｔ−３４１１）がサンプルに添加され、その後さらに６０℃で５分間インキュベートされた。サンプルは、ルミネックスＩＳソフトウェアを用いたルミネックスリキッドチップ２００フローサイトメーターによって分析された。分析は、最大で５０μＬのサンプルを６０℃で、最小でも各タイプにつき１００個のマイクロビーズを数えることにより行われた。下流ゲートは８，３００に、上流ゲートは１６，５００に、それぞれ設定された。
【００５４】
［実施例１：プローブの設計と選択］
プローブは、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマー（Ｒｏｄａ Ｈｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）の間に配置されるＬ１遺伝子の領域を標的として作成された。この領域は、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーが結合する２つの保存領域で挟まれた領域であり、比較的配列があまり保存されていない領域である。この領域の長さはタイプごとに若干異なり、例えばＨＰＶ１６型では１４１ｂｐの長さであり、Ｆｌｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１２５６７３）により公知とされている配列の６６２４〜６７６４番のヌクレオチドに対応している。
【００５５】
ＤＮＡ配列を検出するためにルミネックスＸｍａｐ技術を使用することについて説明している先行文献においては、典型的には２０ｎｔの長さのプローブを使用することが示されている。したがって、私達はまず始めに、ＡｒｒａｙＤｅｓｉｇｎｅｒコンピュータソフトウェア（Ｐｒｅｍｉｅｒ ＢｉｏＳｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）（表１）を使用して２０ｎｔの長さのプローブを設計した。しかしながら、プローブと、ＨＰＶ６型及び１６型由来のＤＮＡと、を用いて予備試験を行ったところ、これらのプローブは私達が行った条件下においてはＨＰＶのＤＮＡを検出するのに使えるほど良好なものではなかった。図１に示すように、ＨＰＶ６型及びＨＰＶ１６型のクローンから増幅されたＤＮＡは、対応する２０ｍｅｒのプローブが結合されているマイクロビーズにハイブリダイズしなかった（パネルＡ及びＢ）。ＨＰＶ１６型のプローブと厳密に相補的なビオチニル化オリゴヌクレオチドは、ＨＰＶ１６型のマイクロビーズを大量に蛍光発光させたが、それだけではなく、ＨＰＶ６型のマイクロビーズの蛍光も非特異的に増加させた（パネルＣ）。
【００５６】
そこで、元のプローブの左端または右端に１０ｎｔを追加することにより、３０ｍｅｒｓのプローブが再設計された。プローブをより長く設計することにより、特異性が高くなり、近縁関係にあるＨＰＶタイプや変異型を判別できる可能性が高まる。近縁関係にあるＨＰＶタイプとは、例えばＨＰＶ１６型とＨＰＶ３１型とである。最初に作成したプローブセットあるいは３０ｍｅｒｓのプローブの中には、交差反応しやすかったり（低い特異性）、目的とする標的物に良好に結合しなかったり（低い反応性）、あるいはその両方が原因で、最適なプローブとは言えないものが、数多く含まれていた。不適切なプローブについては、典型的には、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋断片の可変領域に沿って１０ヌクレオチド右へあるいは左へ位置をずらすことにより、再設計した。このプロセスは、全てのプローブが目的とする標的物に対して特異的かつ良好な反応性で結合するようになるまで、繰り返された。プローブの効率性や特異性を予想しようという試みや、ヘヤピン構造を有するプローブや他の交差反応配列をもつプローブを予想により排除しようという試みは、失敗に終わった。これは、プローブが予期せぬ振る舞いをすることが頻繁にあったためである。
【００５７】
表２に、プローブの開発の履歴が示してある。一方で、この方法において最終的に使用されたプローブのセットが表３に示してある。図２は、この方法でカバーされる４６種類のＨＰＶの整列配列の中でプローブが占める位置を示す図である。
【００５８】
［実施例２：エキソヌクレアーゼの効果］
単に二本鎖のＰＣＲ産物を変性させて、マイクロビーズに結合しているプローブにハイブリダイズさせた場合、ビオチン標識一本鎖オリゴヌクレオチドをマイクロビーズにハイブリダイズさせた場合と比べて、検出される蛍光シグナルが小さくなった（図３）。私達は、マイクロビーズに物理的に結合された短い（３０ｎｔ）プローブにＧＰ６＋ストランドがハイブリダイズすることよりも、ＰＣＲ産物の長いストランドが再ハイブリダイズすることのほうが、熱力学的に起こりやすいのだろうと考えた。それ故に、私達は、先に公知とされている方法に従って（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ， ｅｔ ａｌ．， １９９４）、バクテリオファージＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼを用いて、ＰＣＲ産物のうちの標識がされていない方のストランドを除去することとした。Ｔ７エキソヌクレアーゼは５´→３´プロセッシブ酵素であり、二本鎖ＤＮＡ分子の一方のストランドを迅速に分解する（Ｋｅｒｒ ａｎｄ Ｓａｄｏｗｓｋｉ， １９７２）。ビオチン標識を含むＧＰ６＋ストランドを保護しつつ、ＧＰ５＋ストランドのみを選択的に分解するために、当該分子の５´末端の４つのヌクレオチドのデオキシリボーゼ部分の間に通常のホスホジエステル結合に代えてホスホロチオエート結合を導入するように修飾がなされた。このような化学的修飾を施すことにより、修飾された末端からはＤＮＡ分子の分解を始めることがもはや出来なくなり、Ｔ７エキソヌクレアーゼの作用を阻害することができることが知られている（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。
【００５９】
最適な分解条件は、４０ユニットのＴ７エキソヌクレアーゼを１００μｌのＰＣＲ産物に加えて様々な時間設定でインキュベートしてみて、ルミネックスシステムでそれぞれの蛍光強度を測ることにより、決定した。これらの実験により、図３に示した１つの例のように、反応性のテストとしては４０分間のインキュベートが最適であり、蛍光シグナルが２倍に増加されることがわかった。
【００６０】
［実施例３：ＨＰＶのタイプの特定］
それぞれのタイプについての特異性及び反応性は、公知の起源のＨＰＶから、又は、可能であれば全てのＨＰＶゲノムを含むクローンから、又は、臨床サンプルより若しくは刊行物により公知となっている遺伝子配列（完全なリストは、材料と方法を参照）を用いて合成されたサンプルよりＰＣＲによって増幅された遺伝子のＭＹ領域のクローンから、ＰＣＲ産物を添加することによって、決定された。全てのクローンは、直接シークエンス法により、そして刊行物により公知となっているＨＰＶの配列と比較することにより、確かめられた。
【００６１】
上述したＰＣＲ増幅法、エキソヌクレアーゼ分解、及びマイクロビーズのハイブリダイゼーションを用いることにより、それぞれのタイプのＨＰＶの増幅したＤＮＡは、４６種類の特異的なＨＰＶプローブとそれぞれ結合している４６種類のマイクロビーズの混合液にハイブリダイズされた。ハイブリダイズさせた後、マイクロビーズの混合液はルミネックスリキッドチップ２００フローサイトメーターによって分析された。宿主細胞のＤＮＡのみを含むネガティブコントロールが４連、サンプルと平行して分析された。コントロールにおけるそれぞれのビーズのバックグラウンド蛍光の平均が、サンプルのそれぞれのビーズの蛍光から差し引かれた。ビーズのタイプごとにバックグラウンド蛍光が異なってくると考えられるので、このようなタイプのバックグラウンドの補正が必要なのである。このような補正を行うことにより、他のルミネックスの手順（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｓｅｍｅ ｅｔ ａｌ．， ２００９）において用いられているような、ビーズを洗浄する過程を省くことができるのである。補正を行った後の蛍光シグナルが１００ＦＵよりも大きかった場合、陽性であるものと判断した。
【００６２】
完全な結果が表４に示してある。それぞれの欄には、一番左の欄に記載のタイプのＨＰＶのＤＮＡの存在下において、各ＨＰＶタイプのプローブと結合している各マイクロビーズと関連する蛍光強度が示してある。図４には、同じ結果が図式的に示してある。４６種類全てのプローブがそれぞれ、対応するＨＰＶＤＮＡと強くハイブリダイズしており、異なるタイプのＨＰＶＤＮＡとは強くハイブリダイズしていないことがわかる。表４及び図４に示す特定の項目において、ＨＰＶ８９のマイクロビーズはＨＰＶ４４のＤＮＡが存在する場合でも１００ＦＵの閾値を超える蛍光の検出を示し（５１３ＦＵ）、同じくＨＰＶ７２のマイクロビーズはＨＰＶ８１のＤＮＡが存在する場合でも蛍光の検出を示し（１１８ＦＵ）、同じくＨＰＶ４４のマイクロビーズはＨＰＶ８６のＤＮＡが存在する場合でも蛍光の検出を示す（３９１ＦＵ）点は、特筆すべき点である。この異常な蛍光の検出は、他の試験によっては再現不能であったので、これは秩序だった交差反応を原因とするものではなく、無作為の変動を原因とするものであると解釈されるべきである。これは、１９８０回の測定に対して３回、つまり０．１５％の偽陽性率に相当する。偽陽性の検出を避けるために、臨床サンプルは二連で試験が行われ、当該二連の結果が一致しない場合には再測定が行われた。
【００６３】
それから私達は、同一のサンプルの中に複数のタイプの感染が混在している場合に、これらをルミネックスの手法で検出できるかどうかについてテストした。具体的には、異なるＨＰＶタイプから採取したＤＮＡをそれぞれ増幅し、これらを混合して単一のルミネックス検出反応液の中に入れることにより、テストした。臨床サンプルの状況をシミュレーションするために、タイプごとのＤＮＡの量は一定量に保持された。つまり、存在するタイプの数に関わらず、異なるＤＮＡの混合物はＰＣＲ反応の最大能力で増幅された。その結果を図５に示してある。その結果によれば、クロスハイブリダイゼーションを最小限に抑えつつも、少なくとも３０種類の異なるタイプを同時に検出できることがわかる。しかしながら、いくつかの偽陰性及び偽陽性は存在する。偽陰性は、おそらく、多くのタイプが混在する場合には各ＨＰＶタイプごとの蛍光発光が低下し、それ故にいくつかのマイクロビーズは陽性の判断の閾値としての５０ＦＵを下回ることとなることに起因すると考えられる。ＨＰＶ７２の偽陽性は、このマイクロビーズのバックグラウンド蛍光発光の変動によるものである。
【００６４】
［実施例４：臨床サンプルを用いた検証−直接シークエンシング］
ＮＭＬルミネックス遺伝子型決定手法によって得られた結果と、増幅した産物を直接シークエンシングした結果と、を比較することにより、臨床サンプルに対する検証が行われた。直接シークエンシングによれば、あらゆるタイプのＨＰＶを誤判別することなく特定することができるため、これはＮＭＬルミネックスアッセイのプローブの特異性を追加的に試験することにもなる。
【００６５】
上述のように、７７５個のサンプルについて２段階ＰＣＲにより遺伝子が増幅され、その産物はＮＭＬルミネックス法によりタイプ分けされた。同じサンプルについて、２段階ＰＣＲにより個別に増幅し、アガロースゲル上を泳動させることにより、ＨＰＶＤＮＡの存在を確認した。陽性だったサンプルは、シークエンシングのためＮＭＬＤＮＡコア施設に送付された。そして、増幅産物の両方のストランドをシークエンスするために、ＧＰ５＋プライマーとＧＰ６＋プライマーとが用いられた。結集された配列は、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０）を用いることにより、ＧｅｎＢａｎｋの配列と比較された。タイプが同一であると認められるためには、少なくとも６０ヌクレオチドの長さを有し、かつ、その遺伝子断片におけるヌクレオチドの同一性が９０％よりも大きいことが必要であるものとした。
【００６６】
表５に示された結果によれば、前記２つの方法は、ＨＰＶの検出に関して、タイプの如何に関わらず、９７．７％一致した。代表的な方法とされている直接シークエンス法に対する、ＮＭＬルミネックス法の反応性及び特異性は、それぞれ９８．８％（９７．１−９９．６， ９５％Ｃｌ）及び９６．４％（９６．４−９３．８％， ９５％Ｃｌ）であった。
【００６７】
ＨＰＶタイプの確実な特定ということを考慮に入れると、直接シークエンス法では３４個の陽性のサンプルの配列を決定することができなかったが、そのうちの３２個についてはＮＭＬルミネックス法によりタイプを特定できた。４２９個のサンプルのうち１３個についてのＨＰＶタイプの検出に関しては、両方の方法で陽性という結果は得られなかった（３．３％）。ＮＭＬルミネックス法により全部で７９３のＨＰＶタイプが検出できたのに対し、直接シークエンス法によって検出できたのは全部で５７７である。この不一致は、同一のサンプル内に多数のＨＰＶタイプが存在する場合、直接シークエンス法によってはタイプを検出できないことに起因するものである。
【００６８】
前記２つの方法により検出したＨＰＶタイプの分析結果が表６に示してある。
【００６９】
直接シークエンス法に対する検証からは、ＮＭＬルミネックスアッセイで追加のタイプが検出されたことが、当該アッセイが複数種にわたる感染をより高感度で検出できることに起因するのか、あるいは特異性が低いことに起因するのか、はっきりさせることができない。
【００７０】
［実施例５：臨床サンプルを用いた検証−ロッシュリニアアッセイとの比較］
そこで私達は、ロッシュ社のリニアアレイＨＰＶ遺伝子型決定方法を判断基準に用いて、ＮＭＬルミネックスアッセイの性能を比較した。当該リニアアレイキットによれば３７種類の異なる遺伝子型を検出することができ、このリニアアレイキットにおけるＰＧＭＹプライマーに基づいた増幅システムは、とりわけ複数種類の遺伝子を増幅するのに効果的である。リニアアレイはＦＤＡの認可を得ているものであり、ＨＰＶ疫学の文献で用いられる標準的な方法の一つである。
【００７１】
この比較のために、私達は、８８０セットのサンプルを用いて、製造業者の使用説明書に従って国立微生物学研究所においてロッシュリニアアレイキットを用いてＨＰＶの分析を行うとともに、これと並行してＮＭＬルミネックス遺伝子型決定方法を用いて分析を行った。
【００７２】
リニアアレイのＨＰＶ５２型のプローブは、ＨＰＶ３３型、３５型及び５８型と交差反応を起こす。そのため、上述したように（Ｃｏｕｔｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７）ＨＰＶ５２型に特異的なリアルタイムＰＣＲにより全てのリニアアレイのＨＰＶ５２型の結果を確認した。リニアアレイにはＨＰＶ５５型に指定されたプローブが含まれているが、最新のＨＰＶの分類（ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ， ２００４）によれば、ＨＰＶ５５型はＨＰＶ４４型の変異型と考えられており、ＨＰＶ５５型は削除されている。そのため、私達はこの研究においてはＨＰＶ４４型の指定を使用した。ロッシュリニアアレイのプローブＩＳ３９とＣＰ６１０８はそれぞれ、最近になってＨＰＶ８２型及びＨＰＶ８９型に指定されることとなったタイプを認識する。この研究では、最近の指定が使用された。
【００７３】
表７は、いずれかのＨＰＶタイプに対して陽性のサンプルを検出するに際し、ＮＭＬルミネックスを用いた場合と、ロッシュリニアアレイを用いた場合と、の比較である。不一致の結果は全体で７％であり、不一致のサンプルのうちの５．２％はＮＭＬルミネックスでは陽性と判定されたのにも関わらずリニアアレイでは陽性とは判定されなかった。これは、ＮＭＬルミネックス法で２段階ＰＣＲを使用したことにより、より大きな反応性を有するものになったことに起因し、また、リニアアレイのプローブセットには存在しないＨＰＶタイプを検出したことに起因する。
【００７４】
表８は、全てのＨＰＶタイプ及び複数感染に対して陽性のサンプルを検出するに際し、ＮＭＬルミネックス法を用いた場合と、ロッシュリニアアレイを用いた場合と、の比較である。ロッシュリニアアレイでは、相当により多くのタイプのＨＰＶ（９１７に対し１１１１）を検出することができた。これは、ロッシュリニアアレイが、複数種類に感染しているサンプルに対してより高精度に検出できる能力を有するからである。上述したように（図５参照）、ルミネックス検出システムは少なくとも３２種類の異なるタイプを同時に検出できるのであるから、複数種類に感染しているサンプルに対しての検出感度がロッシュリニアアレイよりも低かったのは、ルミネックス検出システムの問題ではない。しかし、複数のタイプの混合物が存在する場合に効率が低くなる、ＰＣＲ増幅ステップの短所である。表９には個々のタイプの比較結果を示してある。ロッシュリニアアレイでは検出できなかったタイプは別として（ＨＰＶ１３型、３２型、７４型、８５型、８６型、８７型、９０型、及び９１型）、ＨＰＶ５２型、５３型、６１型、７３型、８４型、及び８９型の検出に関しては統計的にロッシュリニアアレイの方が顕著に反応性が高かった（Ｘ２テスト）。一方で、ＨＰＶ６７型の検出に関しては、ＮＭＬルミネックスの方が反応性が高かった。
【００７５】
表１０には、ロッシュリニアアレイの結果４種類以上のタイプに多重感染していることが判明したサンプルを除外した場合の、結果を示してある。この表より、検出されたタイプの総数を見ても（それぞれ、５３５及び５３４）、タイプごとの分析結果を見ても、ＮＭＬルミネックスで得られた結果とロッシュリニアアレイにより得られた結果とがより合致することがわかる。ロッシュリニアアレイでは検出できなかったタイプが存在するほか、５２型（リニアアレイの方が高感度で検出）及び６７型（ＮＭルミネックスの方が高感度で検出）で得られた結果のみが大きく異なっていた。
【００７６】
上に本発明の好適な実施形態を示したが、その中には様々な変更を加えることができると認識されかつ理解されるであろう。そして、添付の特許請求の範囲は、本発明の精神及び範囲内における全てのこのような変更を包含することを意図するものである。
【００７７】
（参考文献）
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Ｂｕｓｃｅｍａ， Ｊ．， Ｚ． Ｎａｇｈａｓｈｆａｒ， Ｅ． Ｓａｗａｄａ， Ｒ． Ｄａｎｉｅｌ， Ｊ． Ｄ． Ｗｏｏｄｒｕｆｆ， ａｎｄ Ｋ． Ｓｈａｈ． １９８８． Ｔｈｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６ ｉｎ ｖｕｌｖａｒ ｎｅｏｐｌａｓｉａ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． ７１：６０１−６０６．
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Ｃｈｏｉ， Ｂ． Ｓ．， Ｏ． Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｐａｒｋ， Ｋ． Ｓ． Ｋｉｍ， Ｊ． Ｋ． Ｊｅｏｎｇ， ａｎｄ Ｊ． Ｓ． Ｌｅｅ． ２００３． Ｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ＨＰＶ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｉｎ Ｋｏｒｅａｎ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｓｅｘ ｗｏｒｋｅｒｓ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４４０−４４５．
Ｃｌｉｆｆｏｒｄ， Ｇ． Ｍ．， Ｓ． Ｇａｌｌｕｓ， Ｒ． Ｈｅｒｒｅｒｏ， Ｎ． Ｍｕｎｏｚ， Ｐ． Ｊ． Ｓｎｉｊｄｅｒｓ， Ｓ． Ｖａｃｃａｒｅｌｌａ， Ｐ． Ｔ． Ａｎｈ， Ｃ． Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏ， Ｎ． Ｔ． Ｈｉｅｕ， Ｅ． Ｍａｔｏｓ， Ｍ． Ｍｏｌａｎｏ， Ｒ． Ｒａｊｋｕｍａｒ， Ｇ． Ｒｏｎｃｏ， Ｓ． ｄｅ Ｓａｎｊｏｓｅ， Ｈ． Ｒ． Ｓｈｉｎ， Ｓ． Ｓｕｋｖｉｒａｃｈ， Ｊ． Ｏ． Ｔｈｏｍａｓ， Ｓ． Ｔｕｎｓａｋｕｌ， Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ， ａｎｄ Ｓ． Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ． ２００５． Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ｉｎ ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｎｏｒｍａｌ ｗｏｍｅｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＨＰＶ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｓｕｒｖｅｙｓ： ａ ｐｏｏｌｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｌａｎｃｅｔ ３６６：９９１−９９８．
Ｃｏｕｔｌｅｅ， Ｆ．， Ｄ． Ｒｏｕｌｅａｕ， Ｇ． Ｇｈａｔｔａｓ， Ｃ． Ｈａｎｋｉｎｓ， Ｓ． Ｖｅｚｉｎａ， Ｐ． Ｃｏｔｅ， Ｊ． Ｍａｃｌｅｏｄ， Ａ． ｄｅ Ｐｏｋｏｍａｎｄｙ， Ｄ． Ｍｏｎｅｙ， Ｓ． Ｗａｌｍｓｌｅｙ， Ｈ． Ｖｏｙｅｒ， Ｐ． Ｂｒａｓｓａｒｄ， ａｎｄ Ｅ． Ｆｒａｎｃｏ． ２００７． Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ｔｙｐｅ ５２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｏｒ ＨＰＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ａｒｒａｙ ＨＰＶ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｓｔ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４５：３８２１−３８２３．
Ｃｏｕｔｌｅｅ， Ｆ．， Ｄ． Ｒｏｕｌｅａｕ， Ｐ． Ｐｅｔｉｇｎａｔ， Ｇ． Ｇｈａｔｔａｓ， Ｊ． Ｒ． Ｋｏｒｎｅｇａｙ， Ｐ． Ｓｃｈｌａｇ， Ｓ． Ｂｏｙｌｅ， Ｃ． Ｈａｎｋｉｎｓ， Ｓ． Ｖｅｚｉｎａ， Ｐ． Ｃｏｔｅ， Ｊ． Ｍａｃｌｅｏｄ， Ｈ． Ｖｏｙｅｒ， Ｐ． Ｆｏｒｅｓｔ， Ｓ． Ｗａｌｍｓｌｅｙ， ａｎｄ Ｅ． Ｆｒａｎｃｏ． ２００６． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ＤＮＡ ｉｎ ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ＰＧＭＹ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｉｎｅａｒ ａｒｒａｙ ＨＰＶ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｓｔ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４４：１９９８−２００６．
Ｃｕｚｉｃｋ， Ｊ．， Ａ． Ｓｚａｒｅｗｓｋｉ， Ｈ． Ｃｕｂｉｅ， Ｇ． Ｈｕｌｍａｎ， Ｈ． Ｋｉｔｃｈｅｎｅｒ， Ｄ． Ｌｕｅｓｌｅｙ， Ｅ． ＭｃＧｏｏｇａｎ， Ｕ． Ｍｅｎｏｎ， Ｇ． Ｔｅｒｒｙ， Ｒ． Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｃ． Ｂｒｏｏｋｓ， Ｍ． Ｄｅｓａｉ， Ｃ． Ｇｉｅ， Ｌ． Ｈｏ， Ｉ． Ｊａｃｏｂｓ， Ｃ． Ｐｉｃｋｌｅｓ， ａｎｄ Ｐ． Ｓａｓｉｅｎｉ． ２００３． Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｗｏｍｅｎ ｗｈｏ ｔｅｓｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ： ｔｈｅ ＨＡＲＴ ｓｔｕｄｙ． Ｌａｎｃｅｔ ３６２：１８７１−１８７６．
Ｃｕｚｉｃｋ， Ｊ．， Ｍ． Ａｒｂｙｎ， Ｒ． Ｓａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ， Ｖ． Ｔｓｕ， Ｇ． Ｒｏｎｃｏ， Ｍ． Ｈ． Ｍａｙｒａｎｄ， Ｊ． Ｄｉｌｌｎｅｒ， ａｎｄ Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ． ２００８． Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｎｏｖｅｌ ｏｐｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２６ Ｓｕｐｐｌ １０：Ｋ２９−Ｋ４１．
Ｃｕｚｉｃｋ， Ｊ．， Ｍ． Ｈ． Ｍａｙｒａｎｄ， Ｇ． Ｒｏｎｃｏ， Ｐ． Ｓｎｉｊｄｅｒｓ， ａｎｄ Ｊ． Ｗａｒｄｌｅ． ２００６． Ｃｈａｐｔｅｒ １０： Ｎｅｗ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２４ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ３−９０−Ｓ３／９７．
Ｄａｖｉｅｓ， Ｐ．， Ｍ． Ａｒｂｙｎ， Ｊ． Ｄｉｌｌｎｅｒ， Ｈ． Ｃ． Ｋｉｔｃｈｅｎｅｒ， Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ， Ｇ． Ｒｏｎｃｏ， ａｎｄ Ｍ． Ｈａｋａｍａ． ２００６． Ａ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １１８：７９１−７９６．
ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ， Ｅ． Ｍ．， Ｃ． Ｆａｕｑｕｅｔ， Ｔ． Ｒ． Ｂｒｏｋｅｒ， Ｈ． Ｕ． Ｂｅｒｎａｒｄ， ａｎｄ Ｈ． ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ． ２００４． Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２４：１７−２７．
Ｄｅｌｌ’Ａｔｔｉ， Ｄ．， Ｍ． Ｚａｖａｇｌｉａ， Ｓ． Ｔｏｍｂｅｌｌｉ， Ｇ． Ｂｅｒｔａｃｃａ， Ａ． Ｏ． Ｃａｖａｚｚａｎａ， Ｇ． Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ， Ｍ． Ｍｉｎｕｎｎｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｍａｓｃｉｎｉ． ２００７． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｉｇｈ ｒｉｓｋ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ． ３８３：１４０−１４６．
Ｄ’Ｓｏｕｚａ， Ｇ．， Ａ． Ｒ． Ｋｒｅｉｍｅｒ， Ｒ． Ｖｉｓｃｉｄｉ， Ｍ． Ｐａｗｌｉｔａ， Ｃ． Ｆａｋｈｒｙ， Ｗ． Ｍ． Ｋｏｃｈ， Ｗ． Ｈ． Ｗｅｓｔｒａ， ａｎｄ Ｍ． Ｌ． Ｇｉｌｌｉｓｏｎ． ２００７． Ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３５６：１９４４−１９５６．
Ｆｌｏｒｅｓ， Ｅ． Ｒ．， Ｂ． Ｌ． Ａｌｌｅｎ−Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｄ． Ｌｅｅ， Ｃ． Ａ． Ｓａｔｔｌｅｒ， ａｎｄ Ｐ． Ｆ． Ｌａｍｂｅｒｔ． １９９９． Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６ （ＨＰＶ−１６） ｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅ ｉｎ ａｎ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６２：３４４−３５４．
Ｇａｏ， Ｙ． Ｅ．， Ｊ． Ｚｈａｎｇ， Ｊ． Ｗｕ， Ｚ． Ｃ． Ｃｈｅｎ， ａｎｄ Ｘ． Ｊ． Ｙａｎ． ２００３． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｈｕａ Ｘｕｅ． Ｙｕ Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｗｕ Ｌｉ Ｘｕｅ． Ｂａｏ． （Ｓｈａｎｇｈａｉ）． ３５：１０２９−１０３４．
Ｇｈａｒｉｚａｄｅｈ， Ｂ．， Ｍ． Ｏｇｇｉｏｎｎｉ， Ｂ． Ｚｈｅｎｇ， Ｅ． Ａｋｏｍ， Ｎ． Ｐｏｕｒｍａｎｄ， Ａ． Ａｈｍａｄｉａｎ， Ｋ． Ｌ． Ｗａｌｌｉｎ， ａｎｄ Ｐ． Ｎｙｒｅｎ． ２００５． Ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ： ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｒｅｌｉａｂｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｄｉａｇｎ． ７：１９８−２０５．
Ｇｉｌｌｉｓｏｎ， Ｍ． Ｌ．， Ｗ． Ｍ． Ｋｏｃｈ， Ｒ． Ｂ． Ｃａｐｏｎｅ， Ｍ． Ｓｐａｆｆｏｒｄ， Ｗ． Ｈ． Ｗｅｓｔｒａ， Ｌ． Ｗｕ， Ｍ． Ｌ． Ｚａｈｕｒａｋ， Ｒ． Ｗ． Ｄａｎｉｅｌ， Ｍ． Ｖｉｇｌｉｏｎｅ， Ｄ． Ｅ． Ｓｙｍｅｒ， Ｋ． Ｖ． Ｓｈａｈ， ａｎｄ Ｄ． Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ． ２０００． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｃａｕｓａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒｓ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９２：７０９−７２０．
Ｇｒａｖｉｔｔ， Ｐ． Ｅ．， Ｃ． Ｌ． Ｐｅｙｔｏｎ， Ｒ． Ｊ． Ａｐｐｌｅ， ａｎｄ Ｃ． Ｍ． Ｗｈｅｅｌｅｒ． １９９８． Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ２７ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｌ１ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ｒｅｖｅｒｓｅ ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３６：３０２０−３０２７．
Ｇｒａｖｉｔｔ， Ｐ． Ｅ．， Ｃ． Ｌ． Ｐｅｙｔｏｎ， Ｔ． Ｑ． Ａｌｅｓｓｉ， Ｃ． Ｍ． Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｆ． Ｃｏｕｔｌｅｅ， Ａ． Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ， Ｍ． Ｈ． Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ， Ｄ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ， ａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ａｐｐｌｅ． ２０００． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３８：３５７−３６１．
Ｇｒｅｇｏｉｒｅ， Ｌ．， Ａ． Ｌ． Ｃｕｂｉｌｌａ， Ｖ． Ｅ． Ｒｅｕｔｅｒ， Ｇ． Ｐ． Ｈａａｓ， ａｎｄ Ｗ． Ｄ． Ｌａｎｃａｓｔｅｒ． １９９５． Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｐｅｎｉｌｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８７：１７０５−１７０９．
Ｇｒｅｇｏｉｒｅ， Ｌ．， Ｍ． Ａｒｅｌｌａ， Ｊ． Ｃａｍｐｉｏｎｅ−Ｐｉｃｃａｒｄｏ， ａｎｄ Ｗ． Ｄ． Ｌａｎｃａｓｔｅｒ． １９８９． Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２７：２６６０−２６６５．
Ｈａｎ， Ｊ．， Ｄ． Ｃ． Ｓｗａｎ， Ｓ． Ｊ． Ｓｍｉｔｈ， Ｓ． Ｈ． Ｌｕｍ， Ｓ． Ｅ． Ｓｅｆｅｒｓ， Ｅ． Ｒ． Ｕｎｇｅｒ， ａｎｄ Ｙ． Ｗ． Ｔａｎｇ． ２００６． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ２５ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ｗｉｔｈ Ｔｅｍｐｌｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４４：４１５７−４１６２．
Ｈａｒｐｅｒ， Ｄ． Ｍ．， Ｅ． Ｌ． Ｆｒａｎｃｏ， Ｃ． Ｍ． Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ａ． Ｂ． Ｍｏｓｃｉｃｋｉ， Ｂ． Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｉ， Ｃ． Ｍ． Ｒｏｔｅｌｉ−Ｍａｒｔｉｎｓ， Ｄ． Ｊｅｎｋｉｎｓ， Ａ． Ｓｃｈｕｉｎｄ， Ｓ． Ａ． Ｃｏｓｔａ Ｃｌｅｍｅｎｓ， ａｎｄ Ｇ． Ｄｕｂｉｎ． ２００６． Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｕｐ ｔｏ ４．５ ｙｅａｒｓ ｏｆ ａ ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｌ１ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ １６ ａｎｄ １８： ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ ｆｒｏｍ ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ ３６７：１２４７−１２５５．
Ｈａｒｐｅｒ， Ｄ． Ｍ．， Ｅ． Ｌ． Ｆｒａｎｃｏ， Ｃ． Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｄ． Ｇ． Ｆｅｒｒｉｓ， Ｄ． Ｊｅｎｋｉｎｓ， Ａ． Ｓｃｈｕｉｎｄ， Ｔ． Ｚａｈａｆ， Ｂ． Ｉｎｎｉｓ， Ｐ． Ｎａｕｄ， Ｎ． Ｓ． Ｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ， Ｃ． Ｍ． Ｒｏｔｅｌｉ−Ｍａｒｔｉｎｓ， Ｊ． Ｔｅｉｘｅｉｒａ， Ｍ． Ｍ． Ｂｌａｔｔｅｒ， Ａ． Ｐ． Ｋｏｒｎ， Ｗ． Ｑｕｉｎｔ， ａｎｄ Ｇ． Ｄｕｂｉｎ． ２００４． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｌ１ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ １６ ａｎｄ １８ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｗｏｍｅｎ： ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ ３６４：１７５７−１７６５．
Ｈｕａｎｇ， Ｈ． Ｊ．， Ｓ． Ｌ． Ｈｕａｎｇ， Ｃ． Ｙ． Ｌｉｎ， Ｒ． Ｗ． Ｌｉｎ， Ｆ． Ｙ． Ｃｈａｏ， Ｍ． Ｙ． Ｃｈｅｎ， Ｔ． Ｃ． Ｃｈａｎｇ， Ｓ． Ｈｓｕｅｈ， Ｋ． Ｈ． Ｈｓｕ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｌａｉ． ２００４． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅｃｈｉｐ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｐｌｕｓ ｒａｄｉｃａｌ ｓｕｒｇｅｒｙ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ． １４：６３９−６４９．
Ｈｗａｎｇ， Ｔ． Ｓ．， Ｊ． Ｋ． Ｊｅｏｎｇ， Ｍ． Ｐａｒｋ， Ｈ． Ｓ． Ｈａｎ， Ｈ． Ｋ． Ｃｈｏｉ， ａｎｄ Ｔ． Ｓ． Ｐａｒｋ． ２００３． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＨＰＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｂｙ ＨＰＶ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． ９０：５１−５６．
Ｉｗａｓａｗａ， Ａ．， Ｙ． Ｋｕｍａｍｏｔｏ， ａｎｄ Ｋ． Ｆｕｊｉｎａｇａ． １９９３． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｐｅｎｉｌｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｕｒｏｌ． １４９：５９−６３．
Ｊｉａｎｇ， Ｈ． Ｌ．， Ｈ． Ｈ． Ｚｈｕ， Ｌ． Ｆ． Ｚｈｏｕ， Ｆ． Ｃｈｅｎ， ａｎｄ Ｚ． Ｃｈｅｎ． ２００６． Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｂｙ Ｌ１ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰ ｓｙｓｔｅｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５５：７１５−７２０．
Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ Ａ， Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ Ｐ， ａｎｄ Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ Ｕ． １９９９． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ｄｏｔ−ｂｌｏｔ．， ｐ． １７１−１９３． Ｉｎ Ｐｅｅｌｉｎｇ ＲＷ ａｎｄ Ｓｐａｒｌｉｎｇ ＰＦ （ｅｄｓ．）， Ｓｅｘｕａｌｌｙ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ．
Ｋｅｒｒ， Ｃ． ａｎｄ Ｐ． Ｄ． Ｓａｄｏｗｓｋｉ． １９７２． Ｇｅｎｅ ６ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７． ＩＩ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４７：３１１−３１８．
Ｋｉｍ， Ｊ． Ｊ．， Ｔ． Ｃ． Ｗｒｉｇｈｔ， ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｇｏｌｄｉｅ． ２００５． Ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ， Ｆｒａｎｃｅ， ａｎｄ Ｉｔａｌｙ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９７：８８８−８９５．
Ｋｌｅｔｅｒ， Ｂ．， Ｌ． Ｊ． ｖａｎ Ｄｏｏｒｎ， Ｊ． ｔｅｒ Ｓｃｈｅｇｇｅｔ， Ｌ． Ｓｃｈｒａｕｗｅｎ， Ｋ． ｖａｎ Ｋｒｉｍｐｅｎ， Ｍ． Ｂｕｒｇｅｒ， Ｂ． ｔｅｒ Ｈａｒｍｓｅｌ， ａｎｄ Ｗ． Ｑｕｉｎｔ． １９９８． Ｎｏｖｅｌ ｓｈｏｒｔ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５３：１７３１−１７３９．
Ｋｏｕｔｓｋｙ， Ｌ． Ａ．， Ｋ． Ａ． Ａｕｌｔ， Ｃ． Ｍ． Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｄ． Ｒ． Ｂｒｏｗｎ， Ｅ． Ｂａｒｒ， Ｆ． Ｂ． Ａｌｖａｒｅｚ， Ｌ． Ｍ． Ｃｈｉａｃｃｈｉｅｒｉｎｉ， ａｎｄ Ｋ． Ｕ． Ｊａｎｓｅｎ． ２００２． Ａ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４７：１６４５−１６５１．
Ｌｅｅ， Ｇ． Ｙ．， Ｓ． Ｍ． Ｋｉｍ， Ｓ． Ｙ． Ｒｉｍ， Ｈ． Ｓ． Ｃｈｏｉ， Ｃ． Ｓ． Ｐａｒｋ， ａｎｄ Ｊ． Ｈ． Ｎａｍ． ２００５． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ＨＰＶ ＤＮＡ ｃｈｉｐ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｌｅｓｉｏｎｓ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ． １５：８１−８７．
Ｌｉｕ， Ｃ． Ｈ．， Ｗ． Ｌ． Ｍａ， Ｒ． Ｓｈｉ， Ｙ． Ｆ． Ｐｅｎｇ， Ｑ． Ｏｕｙａｎｇ， ａｎｄ Ｗ． Ｌ． Ｚｈｅｎｇ． ２００３． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ． Ｄｉ Ｙｉ． Ｊｕｎ． Ｙｉ． Ｄａ． Ｘｕｅ． Ｘｕｅ． Ｂａｏ． ２３：２１３−２１５．
Ｌｕｎｇｕ， Ｏ．， Ｔ． Ｃ． Ｗｒｉｇｈｔ， Ｊｒ．， ａｎｄ Ｓ． Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ． １９９２． Ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｌ１ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＲＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１４５−１５２．
Ｍａｎｏｓ ＭＭ， Ｔｉｎｇ Ｙ， Ｗｒｉｇｈｔ ＤＫ， Ｌｅｗｉｓ ＡＪ， Ｂｒｏｋｅｒ ＴＲ， ａｎｄ Ｗｏｌｉｎｓｋｙ ＳＭ． １９８９． ＵＳｅ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｉｔａｌ ＨＰＶ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ７：２０９−２１４．
Ｍａｙｒａｎｄ， Ｍ． Ｈ．， Ｅ． Ｄｕａｒｔｅ−Ｆｒａｎｃｏ， Ｉ． Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ， Ｓ． Ｄ． Ｗａｌｔｅｒ， Ｊ． Ｈａｎｌｅｙ， Ａ． Ｆｅｒｅｎｃｚｙ， Ｓ． Ｒａｔｎａｍ， Ｆ． Ｃｏｕｔｌｅｅ， ａｎｄ Ｅ． Ｌ． Ｆｒａｎｃｏ． ２００７． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｖｅｒｓｕｓ Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３５７：１５７９−１５８８．
Ｍｅｌｂｙｅ， Ｍ．， Ｃ． Ｒａｂｋｉｎ， Ｍ． Ｆｒｉｓｃｈ， ａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ｂｉｇｇａｒ． １９９４． Ｃｈａｎｇｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ａｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ， １９４０−１９８９． Ａｍ． Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． １３９：７７２−７８０．
Ｍｅｌｃｈｅｒｓ， Ｗ． Ｊ．， Ｊ． Ｍ． Ｂａｋｋｅｒｓ， Ｊ． Ｗａｎｇ， Ｐ． Ｃ． ｄｅ Ｗｉｌｄｅ， Ｈ． Ｂｏｏｎｓｔｒａ， Ｗ． Ｇ． Ｑｕｉｎｔ， ａｎｄ Ａ． Ｇ． Ｈａｎｓｅｌａａｒ． １９９９． Ｓｈｏｒｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｌｉｎｅ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ． Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５５：１４７３−１４７８．
Ｍｅｎｚｏ， Ｓ．， Ａ． Ｃｉａｖａｔｔｉｎｉ， Ｐ． Ｂａｇｎａｒｅｌｌｉ， Ｋ． Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ， Ｓ． Ｓｉｓｔｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｃｌｅｍｅｎｔｉ． ２００８． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｕｎｄｅｒｄｉａｇｎｏｓｅｄ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ． ＢＭＣ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ８：１１２．
Ｍｉｎ， Ｗ．， Ｍ． Ｗｅｎ−Ｌｉ， Ｚ． Ｂａｏ， Ｌ． Ｌｉｎｇ， Ｓ． Ｚｈａｏ−Ｈｕｉ， ａｎｄ Ｚ． Ｗｅｎ−Ｌｉｎｇ． ２００６． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｗｉｔｈ ＲＤ−ＰＣＲ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ． Ｃｕｒｒ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５２：２０４−２０９．
Ｍｏｒｋ， Ｊ．， Ａ． Ｋ． Ｌｉｅ， Ｅ． Ｇｌａｔｔｒｅ， Ｇ． Ｈａｌｌｍａｎｓ， Ｅ． Ｊｅｌｌｕｍ， Ｐ． Ｋｏｓｋｅｌａ， Ｂ． Ｍｏｌｌｅｒ， Ｅ． Ｐｕｋｋａｌａ， Ｊ． Ｔ． Ｓｃｈｉｌｌｅｒ， Ｌ． Ｙｏｕｎｇｍａｎ， Ｍ． Ｌｅｈｔｉｎｅｎ， ａｎｄ Ｊ． Ｄｉｌｌｎｅｒ． ２００１． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｓｑｕａｍｏｕｓ−ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４４：１１２５−１１３１．
Ｍｕｎｏｚ， Ｎ． ａｎｄ Ｆ． Ｘ． Ｂｏｓｃｈ． １９９７． Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ： ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｓａｌｕｄ Ｐｕｂｌｉｃａ Ｍｅｘ． ３９：２７４−２８２．
Ｍｕｎｏｚ， Ｎ．， Ｆ． Ｘ． Ｂｏｓｃｈ， Ｓ． ｄｅ Ｓａｎｊｏｓｅ， Ｒ． Ｈｅｒｒｅｒｏ， Ｘ． Ｃａｓｔｅｌｌｓａｇｕｅ， Ｋ． Ｖ． Ｓｈａｈ， Ｐ． Ｊ． Ｓｎｉｊｄｅｒｓ， ａｎｄ Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ． ２００３． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４８：５１８−５２７．
Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ， Ｔ． Ｔ．， Ｒ． Ｂ． Ｒｅｎｄｌｅ， Ｍ． Ｌ． Ｋｏｔｅｗｉｃｚ， ａｎｄ Ｙ． Ｈ． Ｒｏｇｅｒｓ． １９９４． Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． ３：２８５−２９１．
Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ， Ｍ．， Ｔ． Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｓ． Ｔｏｎｅ， Ｔ． Ｍｕｒａｉ， Ｔ． Ｏｈｋａｗａｒａ， Ｔ． Ｍａｔｓｕｎａｍｉ， Ｍ． Ｋｏｉｚｕｍｉ， Ｙ． Ｔａｋａｇｉ， Ｊ． Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｎ． Ｋｏｎｄｏ， Ｊ． Ｎｉｓｈｉｈｉｒａ， Ｔ． Ｈｏｒｉｋａｗａ， ａｎｄ Ｔ． Ｙｏｓｈｉｋｉ． ２００８． Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４６：１１６１−１１６８．
Ｎｏｂｒｅ， Ｒ． Ｊ．， Ｌ． Ｐ． ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ， ａｎｄ Ｔ． Ｃ． Ｍａｒｔｉｎｓ． ２００８． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｔｙｐｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｖｉｒｏｌ． ４２：１３−２１．
Ｎｕｏｖｏ， Ｇ． Ｊ．， Ｄ． Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ， Ｗ． Ｗ． Ｊｕｎｇ， Ｉ． Ｋ． Ｈａｎ， Ｔ． Ｕｍ， Ｄ． Ｆ． Ｇｒａｂａｒｚ， Ｄ． Ｊ． Ｌｅｅ， ａｎｄ Ｒ． Ｔ． ＭｃＣａｂｅ． ２００８． Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｐ ｓｍｅａｒ， ｃｅｒｖｉｃａｌ ｂｉｏｐｓｙ， ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ ｗｉｔｈ ａｎ ＨＰＶ ｔｙｐｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｉａｇｎ． Ｍｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ． １７：１０７−１１１．
Ｏｈ， Ｔ． Ｊ．， Ｃ． Ｊ． Ｋｉｍ， Ｓ． Ｋ． Ｗｏｏ， Ｔ． Ｓ． Ｋｉｍ， Ｄ． Ｊ． Ｊｅｏｎｇ， Ｍ． Ｓ． Ｋｉｍ， Ｓ． Ｌｅｅ， Ｈ． Ｓ． Ｃｈｏ， ａｎｄ Ｓ． Ａｎ． ２００４． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４２ ：３２７２−３２８０．
Ｐａｌｅｆｓｋｙ， Ｊ． Ｍ． １９９１． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ３：８８１−８８５．
Ｒｏｄａ Ｈｕｓｍａｎ， Ａ． Ｍ．， Ｊ． Ｍ． Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ， Ａ． Ｊ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｕｌｅ， Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ， ａｎｄ Ｐ． Ｊ． Ｓｎｉｊｄｅｒｓ． １９９５． Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ＧＰ５ ａｎｄ ＧＰ６ ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅｉｒ ３’ ｅｎｄｓ ｗｉｔｈ ａｄｊａｃｅｎｔ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：１０５７−１０６２
Ｒｏｎｃｏ， Ｇ．， Ｐ． Ｇｉｏｒｇｉ−Ｒｏｓｓｉ， Ｆ． Ｃａｒｏｚｚｉ， Ｐ． Ｐ． Ｄａｌｌａ， Ａ． Ｄｅｌ Ｍｉｓｔｒｏ， Ｌ． Ｄｅ Ｍａｒｃｏ， Ｍ． Ｄｅ Ｌｉｌｌｏ， Ｃ． Ｎａｌｄｏｎｉ， Ｐ． Ｐｉｅｒｏｔｔｉ， Ｒ． Ｒｉｚｚｏｌｏ， Ｎ． Ｓｅｇｎａｎ， Ｐ． Ｓｃｈｉｎｃａｇｌｉａ， Ｍ． Ｚｏｒｚｉ， Ｍ． Ｃｏｎｆｏｒｔｉｎｉ， ａｎｄ Ｊ． Ｃｕｚｉｃｋ． ２００６． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ−ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｗｏｍｅｎ ｙｏｕｎｇｅｒ ｔｈａｎ ３５ ｙｅａｒｓ： ｒｅｓｕｌｔｓ ａｔ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ． ７：５４７−５５５．
Ｓａｎｔｉａｇｏ， Ｅ．， Ｌ． Ｃａｍａｃｈｏ， Ｍ． Ｌ． Ｊｕｎｑｕｅｒａ， ａｎｄ Ｆ． Ｖａｚｑｕｅｚ． ２００６． Ｆｕｌｌ ＨＰＶ ｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３７：３８−４６．
Ｓｅｍｅ， Ｋ．， Ｓ． Ｚ． Ｌｅｐｅｊ， Ｍ． Ｍ． Ｌｕｎａｒ， Ｊ． Ｉｓｃｉｃ−Ｂｅｓ， Ａ． Ｐｌａｎｉｎｉｃ， Ｂ． Ｊ． Ｋｏｃｊａｎ， Ａ． Ｖｉｎｃｅ， ａｎｄ Ｍ． Ｐｏｌｊａｋ． ２００９． Ｄｉｇｅｎｅ ＨＰＶ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ＲＨ Ｔｅｓｔ ＲＵＯ： ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＩＮＮＯ−ＬｉＰＡ ＨＰＶ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｅｘｔｒａ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ １８ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ａｎｄ ｐｒｏｂａｂｌｅ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｖｉｒｏｌ． ４６：１７６−１７９．
Ｓｍｉｔｈ， Ｊ． Ｓ．， Ｌ． Ｌｉｎｄｓａｙ， Ｂ． Ｈｏｏｔｓ， Ｊ． Ｋｅｙｓ， Ｓ． Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ， Ｒ． Ｗｉｎｅｒ， ａｎｄ Ｇ． Ｍ． Ｃｌｉｆｆｏｒｄ． ２００７． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ： ａ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｐｄａｔｅ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １２１：６２１−６３２．
Ｓｙｒｊａｎｅｎ， Ｓ． ２００５． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ５９−Ｓ６６．
ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｕｌｅ， Ａ． Ｊ．， Ｒ． Ｐｏｌ， Ｎ． Ｆｒａｎｓｅｎ−Ｄａａｌｍｅｉｊｅｒ， Ｌ． Ｍ． Ｓｃｈｏｕｌｓ， Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ， ａｎｄ Ｐ． Ｊ． Ｓｎｉｊｄｅｒｓ． ２００２． ＧＰ５＋／６＋ ＰＣＲ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４０：７７９−７８７．
ｖａｎ Ｈａｍｏｎｔ， Ｄ．， Ｍ． Ａ． ｖａｎ Ｈａｍ， Ｊ． Ｍ． Ｂａｋｋｅｒｓ， Ｌ． Ｆ． Ｍａｓｓｕｇｅｒ， ａｎｄ Ｗ． Ｊ． Ｍｅｌｃｈｅｒｓ． ２００６． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＳＰＦ１０−ＩＮＮＯ ＬｉＰＡ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｃｈｅ ｌｉｎｅａｒ ａｒｒａｙ ＨＰＶ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｓｔ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４４：３１２２−３１２９．
Ｖａｎ Ｒａｎｓｔ， Ｍ．， Ｊ． Ｂ． Ｋａｐｌａｎ， ａｎｄ Ｒ． Ｄ． Ｂｕｒｋ． １９９２． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７３ ：２６５３−２６６０．
Ｖｉｌｌａ， Ｌ． Ｌ．， Ｒ． Ｌ． Ｃｏｓｔａ， Ｃ． Ａ． Ｐｅｔｔａ， Ｒ． Ｐ． Ａｎｄｒａｄｅ， Ｋ． Ａ． Ａｕｌｔ， Ａ． Ｒ． Ｇｉｕｌｉａｎｏ， Ｃ． Ｍ． Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｌ． Ａ． Ｋｏｕｔｓｋｙ， Ｃ． Ｍａｌｍ， Ｍ． Ｌｅｈｔｉｎｅｎ， Ｆ． Ｅ． Ｓｋｊｅｌｄｅｓｔａｄ， Ｓ． Ｅ． Ｏｌｓｓｏｎ， Ｍ． Ｓｔｅｉｎｗａｌｌ， Ｄ． Ｒ． Ｂｒｏｗｎ， Ｒ． Ｊ． Ｋｕｒｍａｎ， Ｂ． Ｍ． Ｒｏｎｎｅｔｔ， Ｍ． Ｈ． Ｓｔｏｌｅｒ， Ａ． Ｆｅｒｅｎｃｚｙ， Ｄ． Ｍ． Ｈａｒｐｅｒ， Ｇ． Ｍ． Ｔａｍｍｓ， Ｊ． Ｙｕ， Ｌ． Ｌｕｐｉｎａｃｃｉ， Ｒ． Ｒａｉｌｋａｒ， Ｆ． Ｊ． Ｔａｄｄｅｏ， Ｋ． Ｕ． Ｊａｎｓｅｎ， Ｍ． Ｔ． Ｅｓｓｅｒ， Ｈ． Ｌ． Ｓｉｎｇｓ， Ａ． Ｊ． Ｓａａｈ， ａｎｄ Ｅ． Ｂａｒｒ． ２００５． Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ｔｙｐｅｓ ６， １１， １６， ａｎｄ １８） Ｌ１ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｗｏｍｅｎ： ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ． ６：２７１−２７８．
Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ， Ｊ． Ｍ．， Ｍ． Ｖ． Ｊａｃｏｂｓ， Ｍ． Ｍ． Ｍａｎｏｓ， Ｆ． Ｘ． Ｂｏｓｃｈ， Ｊ． Ａ． Ｋｕｍｍｅｒ， Ｋ． Ｖ． Ｓｈａｈ， Ｐ． Ｊ． Ｓｎｉｊｄｅｒｓ， Ｊ． Ｐｅｔｏ， Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ， ａｎｄ Ｎ． Ｍｕｎｏｚ． １９９９． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １８９：１２−１９．
Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， Ｘ． Ｙａｎ， Ｊ． Ｓｕｎ， Ｚ． Ｃｈｅｎ， Ｙ． Ｇａｏ， Ｙ． Ｂａｉ， ａｎｄ Ｚ． Ｌｉｕ． ２００３． Ａ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ． Ｊ． （Ｅｎｇｌ． ）． １１６：１１３７−１１４０．
ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ， Ｈ． ２００２． Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ： ｆｒｏｍ ｂａｓｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ２：３４２−３５０
【００７８】
【表１】
【００７９】
【表２】
【００８０】
【表３】
【００８１】
【表４】
【００８２】
【表５】
【００８３】
【表６】
【００８４】
【表７】
【００８５】
【表８】
【００８６】
【表９】
【００８７】
【表１０】
【００８８】
【表１１】
【００８９】
【表１２】
【００９０】
【表１３】
【００９１】
【表１４】
【００９２】
【表１５】
【００９３】
【表１６】
【００９４】
【表１７】
【技術分野】
【０００１】
（先願の情報）
本出願は、２０１０年１月１９日に出願した米国仮特許出願第６１／２９６，２４５号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の遺伝子型を特定するめの試薬及び方法に関する。とりわけ、本発明は、ＰＣＲ増幅及びマイクロビーズを使用した検出を行うことにより、多重分析を行い、感染したＨＰＶのタイプを特定するために臨床サンプルを試験する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトパピローマウイルスは、皮膚及び粘膜の角化上皮の至るところに感染する。これまでのところ、約１２０種類のＨＰＶが明らかになっており、これらは各種類ごとに有病率及び疫学的・臨床的症状が異なる（ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。とりわけ、粘膜型のものは、生殖器、肛門、及び中咽頭の粘膜の角化上皮に感染する（Ｍｕｎｏｚ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｍｕｎｏｚ ａｎｄ Ｂｏｓｃｈ， １９９７； Ｖａｎ Ｒａｎｓｅｔ ｅｔ ａｌ， １９９２； Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｄ’Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。粘膜型のＨＰＶは、最も一般的には、性的接触により伝染し、性交が盛んな人々がとても高い確立で感染する。女性が生涯においてＨＰＶに感染する確立は８０％と推定される（Ｂｅｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。また、世界各地における活動性感染の有病率は１．４％〜２５％程度であり、様々である。
【０００４】
感染のうちの圧倒的多数は無害であり自己限定的であるが、一部の"高リスク"型ＨＰＶに感染した場合、持続感染を招く可能性があり、これはひいては悪性に転換し、浸潤癌に進行するおそれがある（Ｍｕｎｏｚ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。子宮頸癌は、最も一般的なＨＰＶ関連悪性腫瘍であり、今日では、ＨＰＶが実質上全ての子宮頸癌の必要原因となっていることが明らかである（Ｂｏｓｃｈ ａｎｄ Ｍｕｎｏｚ， ２００２； ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ， ２００２， Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｍｕｎｏｚ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ， ２００７）。また、肛門管（Ｍｅｌｂｙｅ ａｎｄ Ｓｐｒｏｇｅｌ， １９９１； Ｐａｌｅｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９１）、陰門（Ｂｕｓｃｅｍａ ｅｔ ａｌ．， １９８８）、陰茎（Ｇｒｅｇｏｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｉｗａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、中咽頭の粘膜、その他の頭頸部組織（Ｄ’Ｓｏｕｚａ， ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｇｉｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｓｙｒｊａｎｅｎ， ２００５）にも、ＨＰＶ関連悪性腫瘍が見つかることがある。
【０００５】
ＨＰＶ感染は、実質上全ての子宮頸癌の進行の必要原因となっている。そのため、パパニコロー法（パップ・テスト）を用いた昔ながらの細胞学的スクリーニングと平行して、あるいはその代用として、高リスク型ＨＰＶの検出が、子宮頸癌のスクリーニング方法として行われるようになってきている。当該スクリーニング方法を導入することにより、子宮頸癌スクリーニングプログラムの検出感度が向上し、性能価格比も向上する（Ｃｕｚｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２００８； Ｃｕｚｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｒｏｎｃｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｍａｙｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｃｕｚｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。
【０００６】
近年、２種類の型特異性のＨＰＶワクチン（１６型、１８型、６型及び１１型に有効なＭｅｒｃｋ−Ｆｒｏｓｓｔ社のガーダシル；１６型及び１８型に有効なＧｌａｘｏ−Ｓｍｉｔｈ−Ｋｌｉｎｅ社のサーバリックス）が開発されている。臨床試験によると、これらのワクチンは、ＨＰＶの持続感染を防止し、また、悪性転換を招き得る頸部上皮の異形成変化を防止するのに、極めて有効である（Ｋｏｕｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｖｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。しかしながら、これらのワクチンは型特異性のものであるため、地域の人々の間でどのようなタイプのＨＰＶが分布しているかを知っておくことが重要である。また、ワクチンの有効性や、ワクチンではカバー出来ないタイプのＨＰＶの発生頻度の予想外の変化を、モニタリングするための監視システムを適所に設けることが重要である。
【０００７】
それ故に、ＨＰＶの型特異的なテストが、現在行われているような研究目的の疫学調査での使用だけに限らず、日常的に広く受け入れられて使用されようになることが予想される。
【０００８】
現在のところ、ＨＰＶのタイプを特定するためには、様々なＰＣＲ法による増幅が必要であり、また、ＰＣＲ法に続いて、特定の配列を検出しなければならない。特定の配列を検出するのは、ＰＣＲ産物を直接配列決定したり、ＲＦＬＰ法（多くの方法が文献に開示されている。例えば、Ｌｕｎｇｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｍｅｎｚｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８； Ｎｏｂｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００８； Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６）を用いたり、特定のプローブを使用してサザンブロッティングやドットブロッティングを行ったり（例えば、Ｇｒｅｇｏｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、ｒｅｖｅｒｓｅ−ｌｉｎｅハイブリダイゼーション（Ｇｒａｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｋｌｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９； ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｍｅｌｃｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ， １９９９）を利用したり、ＤＮＡマイクロアレイ法（Ｍｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ａｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ， ２００６； Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｈａｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｈｗａｎｇ ｅｔａ ｌａ．， ２００３； Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｎｕｏｖｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８）を用いたり、その他の方法（例えば、Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８； Ｄｅｌｌ’Ａｔｔｉ， ２００７； Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００３；Ｇｈａｒｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ， ２００３； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ， ２００３）を用いたりすることにより、行うことができる。とりわけ、ｒｅｖｅｒｓｅ−ｌｉｎｅブロット法は有効な方法であり、疫学調査に広く用いられている。ＩｎｎｏＬｉＰＡ（ｖａｎ Ｈａｍｏｎｔ， ２００６）及びロシュ社のリニアアレイ（Ｃｏｕｔｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６）は、２つの主要な業務用の遺伝子型決定方法であり、いずれもリバースハイブリダイゼーション技術を基礎とするものである。ロシュ社のリニアアレイ遺伝子型決定キットは、ＦＤＡの認可を得ているものであり、業務用の遺伝子型決定手法に主として用いられているものである。しかしながら、これらの手法は、処理量が多い場合の試験に適しておらず、また、結果を判定する際にバンドの明暗度を視覚により評価するので、評価に際し主観に頼ることとなる。
【０００９】
ルミネックス社（米国テキサス州オースティン）により開発されたｘＭＡＰ技術は、１００種類の異なる「色」に着色されたマイクロビーズを利用するものである。この「色」は、マイクロビーズにカップリングされる２種類のスペクトル的に異なる蛍光色素の配合を調整することにより、１００通りに染色されるのである。異なる色は、フローサイトメーターにより認識することができ、異なる種類のマイクロビーズの数を数えることができ、特異的な結合リガンドの存否を分析することができる。この技術は、血清学、遺伝子型決定、及びその他の解析的な適用における様々な多重アッセイの基礎となっている。ルミネックス社のウェブサイトには、ルミネックス技術の説明が掲載されており、また、文献リストが掲載されている。
【００１０】
各タイプのマイクロビーズはそれぞれ特異的なリガンドに結合することが可能である。特異的なリガンドとは、例えばこの研究においては、各タイプのＨＰＶに特異的なＤＮＡプローブである。そして、これらのマイクロビーズはマルチプレックスアッセイを形成するために混合される。ＨＰＶサンプルに由来するＰＣＲ産物はビオチンでラベルされ、ＨＰＶのＤＮＡが対応するプローブとハイブリダイズするように、プローブを保持しているビーズと混合された。それからフローサイトメーターによりマイクロビーズの異なる"色"が識別され、どのタイプがＨＰＶのＤＮＡに由来する蛍光を保持しているかが決定される。フローサイトメーターを作動させるコンピュータソフトウェアによりどのビーズが蛍光を発しているかが示され、それにより試料中に存在するＨＰＶのタイプが特定される。この方法の利点は、一分析当たりの費用が安い点、高処理能力のアッセイを自動化できる可能性、及び、アッセイの必要性に応じてあるいは新しいタイプの発見に応じてマイクロビーズのタイプを追加し又は除去することが可能なことによる柔軟性にある。いくつかのマイクロビーズを基礎としたＨＰＶ遺伝子型決定のためのマルチプレックスアッセイが刊行物により公知となっている。Ｗａｌｌａｃｅら（２００５年）による方法は、４５種類の粘膜ＨＰＶのためのプローブを用いた多重マイクロビーズアッセイである。しかしながら、形式的確認はわずかのタイプについてしか行われず、２０種類のみが臨床サンプルから検出されたものであり、遺伝子型決定の結果についての独立した検証は行われないのである。Ｏｈら（２００７年）により公表されている方法は、１５種類のＨＰＶを検出するものであり、１３２個の臨床サンプルに対して検証が行われている。ＤＮＡマイクロアレイ遺伝子型決定法と対比した５６サンプルも開示されている。Ｓｃｈｍｉｔｔら（２００６年）による方法は、ＨＰＶプラスミド及び臨床サンプルと注意深く比較検証され、２２種類の最も一般的な粘膜型ＨＰＶを網羅する。Ｊｉａｎｇら（２００６年）による方法は、２６種類の粘膜型ＨＰＶの特異的なプローブを開示している。検証は、プローブと相補的な合成オリゴヌクレオチド及び限られた数の臨床サンプルを用いることにより、行われた。Ｑｉａｇｅｎ（独国ヒルデン）によって開発された商業的な方法は、専売のプライマーセットを使用し、続いてルミネックスシステムを用いた検出を行うものであり、１８種類の高リスク型ＨＰＶのタイプを特定することができる。このルミネックスキアゲン試験と、リバースラインブロットハイブリダイゼーションと、を比較した研究が少なくとも１つ公表されている（Ｓｅｍｅら， ２００９年）。
【００１１】
ここに、私達は、新しいＨＰＶ型特異性のプローブのデザインを報告し、また、１回の反応で４６種類の異なる粘膜型タイプを検出することができるマイクロビーズを用いたマルチプレックスアッセイを開発したことを報告する。このユニークなプローブセットには、従来からある方法と比べて、二つの新しいアイデアが導入されている。第一に、変異型や近縁種にあるタイプを判別可能とするべく特異性をより高めるために、従来よりも長いプローブ（３０ｍｅｒｓ）を用いた。第二に、エキソヌクレアーゼを用いてＰＣＲ産物を選択的に分解することにより、一本鎖ＤＮＡ産物を生産することとした。こうすることにより、ノイズに対するシグナルの比率が大きくなり、洗浄の過程が不要となった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、複数種類のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の遺伝子型を高精度に特定するめの試薬及び方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
私達は、４６種類のＤＮＡプローブのセットを提示し、また、ルミネックスｘＭＡＰ技術を用いて４６種類の粘膜型ＨＰＶを検出するためのＰＣＲ増幅法を提示する。この技術には、適切なマイクロビーズの混合物を用いる。各マイクロビーズは、それぞれ特異的なＨＰＶプローブとカップリングされている。これを用いることにより、１つの反応チューブの中で４６種類全てを同時に検出することができるのである。
【００１４】
私達のデータによれば、全てのプローブが、相互にクロスハイブリダイゼーションを生じることがなく、反応性及び特異性が良好であり、４６種類のＨＰＶタイプの検出に適していることがわかる。この結論は、４６タイプからの基準ＤＮＡの使用により支持され、また、ＨＰＶタイプの特定のためのスタンダードな方法である直接シークエンス法を用いた広範囲にわたる検証により支持される。
【００１５】
このルミネックス法により、少なくとも３２種類のＨＰＶタイプから増幅したＤＮＡを、同時にかつ正確に検出することができる。
【００１６】
主要な商業用のＨＰＶタイプ特定方法であるロッシュリニアアレイと比較することにより、ＮＭＬルミネックスアッセイが３種類以下のＨＰＶタイプを含む臨床サンプルにおけるＨＰＶタイプの特定に適していることがわかる。しかしながら、このＰＣＲ増幅方法は、４種類以上のＨＰＶタイプに感染しているサンプルからのＤＮＡを増幅する場合には効率が悪くなる。この問題は、ＰＣＲ増幅法に起因する問題であり、プローブセットやルミネックス検出システムに起因する問題ではない。複数感染をしている場合に増幅の効率が悪くなることは、ＨＰＶ５２型、５３型、６１型、７３型、８４型、及び８９型においては顕著な問題となるが、疫学及び臨床業務において最も重要となる主要な発癌性のＨＰＶタイプの検出に際してはさして問題とはならない。
【００１７】
４種類以上のＨＰＶタイプに感染しているサンプルを除くと、ＮＭＬルミネックスによる検出結果とロッシュリニアアレイによる検出結果とは一致する。そのため、複数感染をしている頻度の高い母集団（例えばエイズウイルス感染者や、男性と性交する男性や、売春婦）に対してＮＭＬルミネックス法を用いた場合、特定のタイプについての有病率を過小評価することにつながる。一方、４種類以上のタイプへの感染の有病率がごくわずかである女性の一般集団にＮＭＬルミネックス法を用いた場合、ほとんどのタイプについての有病率の正確な結果を得ることができる。
【００１８】
ＮＭＬルミネックスＨＰＶ遺伝子型決定法は、ほとんど全ての性器ＨＰＶタイプの検出をすることができるという利点を有し、また、２段階ＰＣＲ法のおかげで非常に反応性が高いという利点を有する。ルミネックスｘＭＡＰ技術により、サンプルを迅速に無干渉で読みとり、結果からの客観的な計算的解釈を得ることが可能となる。私達の当該方法には洗浄の過程がなく、また、目視する過程もないので、自動化を行いやすい。
【００１９】
本発明の第一の態様によれば、サンプル中におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプへの感染を検出しタイプを特定するための方法であって、以下の過程を全て含む方法が提供される。
ａ）少なくとも１種類のＨＰＶタイプを含むことが疑われるサンプルを準備する過程。
ｂ）前記サンプルに、ＨＰＶのＬ１領域を増幅するのに適切なプライマーを添加する過程。
ｃ）前記サンプルをＤＮＡ増幅に適切な条件下でインキュベートする過程。
ｄ）配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する少なくとも一つのプローブを添加する過程。前記プローブはハイブリダイゼーション条件下でそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみ結合し、各前記少なくとも一つのプローブはさらに特有のタグを備える。
ｅ）前記プローブ及び前記サンプルをハイブリダイゼーションに最適な条件下でインキュベートする過程。
ｆ）少なくとも一つの前記タグ付きプローブのハイブリダイゼーションを検出する過程。
【００２０】
本発明の第二の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００２１】
本発明の第三の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１、２、４又は５のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００２２】
本発明の第五の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号４、５及び１７のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００２３】
本発明の第六の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号４、５、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２２、２３、２４、２７及び２９のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００２４】
本発明の第七の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号６、４、５、７、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３７、４０及び４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００２５】
本発明の第八の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１、２、９、１３、１４、１５、１６、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４３、４４及び４５のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＨＰＶ６型及びＨＰＶ１６型の２０ｍｅｒのプローブを用いた予備ハイブリダイゼーションテスト。ＨＰＶ６型及び１６型の２０ｍｅｒのプローブ（表１を参照）とカップリングした２種類のマイクロビーズの混合物は、指示体積のＰＣＲ反応とハイブリダイズされ（パネルＡ及びパネルＢ）、あるいはＨＰＶ１６型のプローブと厳密に相補的な２０ｍｅｒのプローブとハイブリダイズされ（パネルＣ）、あるいは関係のないＰＣＲ産物（β−グロブリンＤＮＡ）とハイブリダイズされた。
【図２】この書類においては、４６種類のＨＰＶタイプにおけるプローブの配置について考察している。ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーの間に配置されるＬ１領域の配列が示してある。プライマーの配置はボックスで取り囲むことにより示してあり、プローブの配列は太字で下線付きで示してある。
【図３】ルミネックスビーズへのハイブリダイゼーションにおける、２段階ＰＣＲ産物のＴ７エキソヌクレアーゼによる分解の効果。上述したように、ＨＰＶ１６型のＤＮＡはＭＹ０９／Ｍｙ１１及びＧＰ５＋／ＧＰ６＋を用いた２段階ＰＣＲにより増幅され、その産物は所定時間の間Ｔ７エキソヌクレアーゼにより分解された。分解された後、ＰＣＲ産物はＨＰＶ１６型のプローブを保持したルミネックスビーズにハイブリダイズされ、上述のように検出された。ＧＰ６＋プライマーは、ルミネックス技術による検出を可能とするために、５´ビオチン部分を含んでおり、また、５´末端から最初の４つのヌクレオチドには、この一本鎖をＴ７エキソヌクレアーゼの作用から保護するために、ホスホロチオエート結合が導入されている。黒い棒グラフ及び白い棒グラフはそれぞれ、陰性試料、及び、ＨＰＶ１６型のプローブと相補的なビオチニル化したオリゴヌクレオチドを含む試料の、蛍光シグナルを示している。
【図４】表４のデータを図示したもの。プローブが右軸に、ＨＰＶＤＮＡが左軸に示してある。垂直方向の軸は、特異的なＨＰＶプローブをカップリングしている各マイクロビーズの蛍光強度を示している。対角線上の棒グラフは、所望の対応するプローブとのＨＰＶＤＮＡタイプのハイブリダイゼーションを示している。
【図５】複数のＨＰＶタイプの同時検出。本文に示されるように、複数のＨＰＶタイプのＤＮＡを含む試料が準備され、記載されているように、ＮＭＬルミネックス法により検出された。各試料に含まれるタイプの数は最も左の欄に示してある。左から２番目の欄には、混合物に追加されたＨＰＶタイプを示してある。"＋"の印は、結果が陽性であったことを示す（５０ＦＵを超えている場合）。アスタリスクは、結果が偽陽性あるいは偽陰性であったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
別段の定義をしてない限り、ここで使用されている全ての技術的・科学的用語は、本発明の属する技術の属する分野における通常の知識を有する者が一般的に理解するのと同様の意味を有するものと解するものとする。本発明の実施及びテストに際しては、ここで説明されている方法及び材料を、これらと同様の又は均等なものと置き換えて用いることができるが、以降においては特に好適な方法及び材料のみについて説明する。以下で言及する全ての文献は、参照することにより本願明細書の一部とみなされる。
【００２８】
４６種類の性器ＨＰＶそれぞれの特定配列に基づいて、配列ＩＤ番号１〜４６から成るＤＮＡプローブが作成された。すなわち、６型（配列ＩＤ番号１）、１１型（配列ＩＤ番号２）、１３型（配列ＩＤ番号３）、１６型（配列ＩＤ番号４）、１８型（配列ＩＤ番号５）、２６型（配列ＩＤ番号６）、３０型（配列ＩＤ番号７）、３１型（配列ＩＤ番号８）、３２型（配列ＩＤ番号９）、３３型（配列ＩＤ番号１０）、３５型（配列ＩＤ番号１１）、３９型（配列ＩＤ番号１２）、４０型（配列ＩＤ番号１３）、４２型（配列ＩＤ番号１４）、４３型（配列ＩＤ番号１５）、４４型（配列ＩＤ番号１６）、４５型（配列ＩＤ番号１７）、５１型（配列ＩＤ番号１８）、５２型（配列ＩＤ番号１９）、５３（配列ＩＤ番号２０）、５４型（配列ＩＤ番号２１）、５６型（配列ＩＤ番号２２）、５８型（配列ＩＤ番号２３）、５９型（配列ＩＤ番号２４）、６１型（配列ＩＤ番号２５）、６２型（配列ＩＤ番号２６）、６６型（配列ＩＤ番号２７）、６７型（配列ＩＤ番号２８）、６８型（配列ＩＤ番号２９）、６９型（配列ＩＤ番号３０）、７０型（配列ＩＤ番号３１）、７１型（配列ＩＤ番号３２）、７２型（配列ＩＤ番号３３）、７３型（配列ＩＤ番号３４）、７４型（配列ＩＤ番号３５）、８１型（配列ＩＤ番号３６）、８２型（配列ＩＤ番号３７）、８３型（配列ＩＤ番号３８）、８４型（配列ＩＤ番号３９）、８５型（配列ＩＤ番号４０）、８６型（配列ＩＤ番号４１）、８７型（配列ＩＤ番号４２）、８９型（配列ＩＤ番号４３）、９０型（配列ＩＤ番号４４）、９１型（配列ＩＤ番号４５）、及び９７型（配列ＩＤ番号４６）である。それぞれのプローブを反応性が高く特異的なものとするために、これらのプローブは以下に示すとおり多重アッセイにより試験された。試験において、目的とするＨＰＶタイプにハイブリダイズしないものや、他のタイプにクロスハイブリダイズしてしまうものは、再設計された。時には何度も再設計を繰り返した。最終的に、全てのプローブがそれぞれ固有のＨＰＶタイプＤＮＡにハイブリダイズするものとなった。したがって、各プローブはそれぞれ、単一の特異的なＨＰＶ遺伝子又はＨＰＶタイプに特異的に結合する。表２には、プローブのデザインの履歴が示してある。
【００２９】
多重アッセイにおいては、製造業者の使用説明書に従い、各プローブはそれぞれ４６種類の蛍光マイクロビーズのいずれかに結合された。各マイクロビーズは、赤色及び赤外蛍光色素を独自の異なる配合で組み合わせて染色したものである。ルミネックス社により製造されるマイクロビーズは、２種類の蛍光色素の組み合わせにより１００種類の異なる色に色分けされたものであり、赤色レーザーを用いたフローサイトメーターにより色を認識するとともに数を数えることができる。また、フローサイトメーターは、緑色レーザーを用いることにより、ビーズセットのいずれかに結合したレポーター染料を検出することもできる。本実施形態では、４６セットのビーズが選択され、各セットがそれぞれ３０ｍｅｒの特有のオリゴヌクレオチドプローブにカップリングされた。各オリゴヌクレオチドプローブは、４６種類の性器ＨＰＶのＤＮＡのうちのいずれかに特異的かつ良好にハイブリダイズするように設計され、後述するように増幅された。マルチプレックス反応が進行するように、４６セットのビーズが混合された。こうすることにより、４６種類のＨＰＶのＤＮＡの結合を検出することができるのである。
【００３０】
プローブは、ＰＣＲ増幅プライマーＧＰ５＋／ＧＰ６＋の間に含まれる領域を増幅するように設計された。この領域は、１６型ＨＰＶにおいては１４１ｂｐの長さである（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１２５６７３，６６２４〜６７６４番のヌクレオチド）。しかし、この長さは、ＨＰＶの種類によって若干異なる。ＧＰ５＋／ＧＰ６＋は、ほとんどの種類のＨＰＶからそのＤＮＡを増幅することのできる一般的なプライマーである。また、公知となっているプライマーセットＭＹ０９／ＭＹ１１及びプライマーセットＰＧＭＹも、ほとんどの種類の性器ＨＰＶにおいてその遺伝子を増幅することのできる一般的なプライマーである。これらのプライマーセットの領域は、ＧＰ＋／ＧＰ６＋の領域の外側に位置しているので、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーと共に用いることにより２段階ＰＣＲ増幅反応に使用することができる。こうすることにより、とりわけ複数種類が同一のサンプルの中に存在するような場合には、ＨＰＶタイプの検出感度及び範囲を向上させることができる。
【００３１】
これらのプライマーを用いることにより、臨床サンプルから得られたＨＰＶのＤＮＡが増幅された。そして、これをＴ７エキソヌクレアーゼで処理することにより、マイクロビーズにカップリングしたプローブの配列と相補的なビオチン標識一本鎖ＤＮＡが得られた。そして、一本鎖となったＨＰＶのＤＮＡは、標識が付けられたマイクロビーズとともに、インキュベートされた。インキュベートすることにより、ＨＰＶのＤＮＡを、マイクロビーズ上の対応するプローブに、結合させることができた。そして、フルオロフォアフィコエリスリンを結合させたストレプトアビジンが添加された。ストレプトアビジンは、ビオチンに強く結合し、ＨＰＶのＤＮＡに結合したマイクロビーズにフィコエリスリン蛍光を付与する。そして、サンプルはフローサイトメリーにより分析された。フローサイトメリーにより、結合した各マイクロビーズのタイプごとの数を分析するとともに、それらのフィコエリスリン蛍光強度を分析することができる。特定のビーズにおいてフィコエリスリン蛍光強度が高いということは、その特定の種類のＨＰＶのＤＮＡが存在することを指し示す。
【００３２】
４６種類のＨＰＶを検出するための多重アッセイに加えて、ワクチンに含まれているタイプのＨＰＶ（ＨＰＶ６型（配列ＩＤ番号１）、１１型（配列ＩＤ番号２）、１６型（配列ＩＤ番号４）、及び１８型（配列ＩＤ番号５））に限定してテストを行うために、マイクロビーズを上記とは異なる組み合わせで混合するものとしてもよい。あるいは、最も有害なタイプのＨＰＶ（ＨＰＶ１６型（配列ＩＤ番号４）、１８型（配列ＩＤ番号５）、及び４５型（配列ＩＤ番号１７））についてテストするために、あるいは最も一般的なタイプのＨＰＶ（ＨＰＶ１６型（配列ＩＤ番号４）、１８型（配列ＩＤ番号５）、３１型（配列ＩＤ番号８）、３３型（配列ＩＤ番号１０）、３５型（配列ＩＤ番号１１）、３９型（配列ＩＤ番号１２）、４５型（配列ＩＤ番号１７）、５１型（配列ＩＤ番号１８）、５２型（配列ＩＤ番号１９）、５６型（配列ＩＤ番号２２）、５８型（配列ＩＤ番号２３）、５９型（配列ＩＤ番号２４）、６６型（配列ＩＤ番号２７）、及び６８型（配列ＩＤ番号２９））について、あるいは全ての発癌性のタイプのＨＰＶ（ＨＰＶ２６型（配列ＩＤ番号６）、１６型（配列ＩＤ番号４）、１８型（配列ＩＤ番号５）、３０型（配列ＩＤ番号７）、３１型（配列ＩＤ番号８）、３３型（配列ＩＤ番号１０）、３５型（配列ＩＤ番号１１）、３９型（配列ＩＤ番号１２）、４５型（配列ＩＤ番号１７）、５１型（配列ＩＤ番号１８）、５２型（配列ＩＤ番号１９）、５３型（配列ＩＤ番号２０）、５６型（配列ＩＤ番号２２）、５８型（配列ＩＤ番号２３）、５９型（配列ＩＤ番号２４）、６６型（配列ＩＤ番号２７）、６７型（配列ＩＤ番号２８）、６８型（配列ＩＤ番号２９）、６９型（配列ＩＤ番号３０）、７０型（配列ＩＤ番号３１）、７３型（配列ＩＤ番号３４）、８２型（配列ＩＤ番号３７）、８５型（配列ＩＤ番号４０）、及び９７型（配列ＩＤ番号４６））についてテストするために、あるいは非発癌性（低リスク）のタイプ（６型（配列ＩＤ番号１）、１１型（配列ＩＤ番号２）、３２型（配列ＩＤ番号９）、４０型（配列ＩＤ番号１３）、４２型（配列ＩＤ番号１４）、４３型（配列ＩＤ番号１５）、４４型（配列ＩＤ番号１６）、５４型（配列ＩＤ番号２１）、６１型（配列ＩＤ番号２５）、６２型（配列ＩＤ番号２６）、６６型（配列ＩＤ番号２７）、６７型（配列ＩＤ番号２８）、６８型（配列ＩＤ番号２９）、６９型（配列ＩＤ番号３０）、７０型（配列ＩＤ番号３１）、７２型（配列ＩＤ番号３３）、７４型（配列ＩＤ番号３５）、８１型（配列ＩＤ番号３６）、８３型（配列ＩＤ番号３８）、８４型（配列ＩＤ番号３９）、８６型（配列ＩＤ番号４１）、８７型（配列ＩＤ番号４２）、８９型（配列ＩＤ番号４３）、９０型（配列ＩＤ番号４４）、及び９１型（配列ＩＤ番号４５））のみについてテストするために、マイクロビーズを上記とは異なる組み合わせで混合するものとしてもよい。
【００３３】
本発明の第一実施形態に基づいて、多様なＨＰＶのウイルス株の遺伝子型決定を行うためのＤＮＡ増幅技術と合わせて用いることのできる一連のＤＮＡプローブが提供される。
【００３４】
本発明の第二実施形態では、多数のＨＰＶのウイルス株を同時に検出するための多重形式アッセイに用いることのできる一連のＤＮＡプローブが提供される。
【００３５】
本発明の第三の実施形態では、当該ＤＮＡプローブは他の検出システムにも用いることができる。他の検出システムには、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リバースラインブロットハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、及び当業者にとって明らかな他の同様のシステムが含まれる。
【００３６】
本発明の一つの態様によれば、サンプル中におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプへの感染を検出しタイプを特定するための方法であって、以下の過程を全て含む方法が提供される。
ａ）少なくとも１種類のＨＰＶタイプを含むことが疑われるサンプルを準備する過程；
ｂ）前記サンプルに、ＨＰＶのＬ１領域を増幅するのに適切なプライマーを添加する過程；
ｃ）前記サンプルをＤＮＡ増幅に適切な条件下でインキュベートする過程；
ｄ）配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する少なくとも一つのプローブを添加する過程であって、前記プローブはハイブリダイゼーション条件下でそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみ結合し、各前記少なくとも一つのプローブはさらに特有のタグを備える、過程；
ｅ）前記プローブ及び前記サンプルをハイブリダイゼーションに最適な条件下でインキュベートする過程；
ｆ）少なくとも一つの前記タグ付きプローブのハイブリダイゼーションを検出する過程。
【００３７】
ここで説明されているように、サンプルには１種類よりも多いＨＰＶタイプが含まれていてもよい。また、"少なくとも一つのプローブ"は、プローブセットを含むものであってもよく、又は当該プローブセットから成るものであってもよい。当該プローブセットのそれぞれのプローブは、配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有し、また、それぞれのプローブを特異的に特定するための特有のタグ又は識別タグを有する。例えば、配列ＩＤ番号１に記載のヌクレオチド配列を有する全てのプローブは、配列ＩＤ番号２に記載のヌクレオチド配列を有する全てのプローブが有しているのと同じタグを有するものであってもよい。
【００３８】
ここで説明されているように、ハイブリダイゼーションの条件は十分に厳しいものであるので、プローブは目的のＤＮＡにのみ結合する。例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれよりも多い数の連続したヌクレオチドが正確に一致するときに限り２本の鎖がハイブリダイゼーションを起こす程度に、ハイブリダイゼーションの条件を十分に厳しいものとすることができる。
【００３９】
配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、特有のタグと、から成る複数のプローブは、与えられたサンプル中におけるとりわけＨＰＶタイプを特定するためにマルチプレックスアッセイにおいて一緒に用いることができ、あるいはそれらのセットのうちのいくつか（サブコンビネーション）を一緒に用いることができる。このことは当業者によって高く評価されるであろう。特に、各プローブはそれに関連する特有のタグを有しているので、サンプル中のＤＮＡ分子がそれぞれのプローブにハイブリダイゼーションした場合、そのサンプル中に対応するＨＰＶタイプが存在することが示唆される。以降に説明するように、このプローブセットはそれぞれのプローブがクロスハイブリダイズしない点で特徴的である。
【００４０】
いくつかの実施形態においては、少なくとも一つのプローブは、プローブの混合物と言うことができ、前記混合物の各典型的なプローブは、配列ＩＤ番号１、２、４若しくは５に記載の、又は配列ＩＤ番号４、５若しくは１７に記載の、又は配列ＩＤ番号４、５、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２２、２３、２４、２７若しくは２９に記載の、又は配列ＩＤ番号６、４、５、７、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３７、４０若しくは４６に記載の、又は配列ＩＤ番号１、２、９、１３、１４、１５、１６、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４３、４４若しくは４５に記載のヌクレオチド配列を有する。
【００４１】
前記特有のタグは二つの蛍光染料の組み合わせである。
【００４２】
ここに説明するように、前記特有のタグは異なる比率の赤色及び赤外蛍光色素の組み合わせである。
【００４３】
本発明の他の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００４４】
本発明の他の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１、２、４又は５のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。配列ＩＤ番号３及び６〜４６のいずれか一つに記載の配列を有するプローブ、並びにこれらのプローブのいくつかの組み合わせを、このプローブセットにさらに追加してもよい。このことは、当業者によって高く評価されるであろう。
【００４５】
本発明の他の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号４、５及び１７のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００４６】
本発明の他の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号４、５、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２２、２３、２４、２７及び２９のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００４７】
本発明の他の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号６、４、５、７、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３７、４０及び４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００４８】
本発明の他の態様によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１、２、９、１３、１４、１５、１６、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４３、４４及び４５のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセットが提供される。
【００４９】
［オリゴヌクレオチド］
オリゴヌクレオチドは、Ｎａｔｉｏｎａｌ・Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ・ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤＮＡコアセクションで合成された。プローブの５´末端のＣ１２をアミノリンカーで修飾し、これがルミネックス社のマイクロビーズのカルボキシル基にカップリングするようにした。ＨＰＶのＤＮＡをＰＣＲ増幅するために用いるプライマーであるＭＹ０９、ＭＹ１１、ＧＰ５＋及び修飾ＧＰ６＋プライマーは、インビトロジェン社（カナダ，オンタリオ州バーリントン）より購入した。
【００５０】
［ＰＣＲ増幅］
プラスミド又は臨床検査サンプルから採取したＨＰＶのＤＮＡは、１段階目はＭＹ０９／ＭＹ１１プライマーを用いて（Ｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９）、２段階目はＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーを用いて（Ｒｏｄａ Ｈｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、２段階ＰＣＲ増幅反応により増幅された。複数のＨＰＶタイプを含む臨床サンプルにおいてＤＮＡの増幅を最適に行うためには、１段階目においてＰＧＭＹプライマーが用いられた（Ｇｒａｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ， ２０００）。ＧＰ６＋プライマーは以下の修飾を含むものであった。：ｉ）ＰＣＲ産物（以下参照）の検出に際し、ストレプトアビジン−ＰＥのリガンドとして用いるために、５´末端にビオチン標識を付した。；ｉｉ）バクテリオファージＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ（以下を参照するとともに、結果のセクションを参照されたい）の作用に対して耐性を付与するために、５´末端から数えて最初の４つのヌクレオチドにはホスホロチオエート結合を導入した。ＰＣＲ増幅は、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰ（インビトロジェン社，カタログ番号＃１０２９７−０１８）、０．２ｍＭずつの各プライマー、及び１．２５Ｕのアンプリタック・ゴールド・ポリメラーゼ（アプライド・バイオシステム社，カタログ番号＃４３１１８１６）を含有する１×ＰＣＲバッファー（インビトロジェン社，カタログ番号＃１０３４２−０２０）の中で行われた。ＭＹ０９／ＭＹ１１プライマーを用いた、２段階ＰＣＲ増幅反応のうちの１段階目は、９４℃で５分間の最初の変性ステップにより開始され、続いて、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で６０秒間のエロンゲーションで構成されるサイクルを３０サイクル行った。最後に、７２℃で７分間のエクステンションがなされた。ＰＧＭＹプライマーを用いた増幅は、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ、及び１８種類のプライマーそれぞれ０．６μＭずつ含むＰＧＭＹミクスチャー（Ｇｒａｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００）の存在下で、４０サイクル（９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間のエロンゲーション）行われた。この反応溶液のうちの１〜５μＬ（通常は２μＬ）が、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーを用いた２段階目の増幅反応に用いられた。２段階目の増幅反応は、次の条件下で行った。：９４℃で５分間の最初の変性を行った後、続いて、９４℃で３０秒、４０℃で２０秒、７２℃で３０秒から成るサイクルを３０サイクル行う。最後に、７２℃で７分間のエクステンションがなされる。ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーを用いた１段階ＰＣＲ増幅反応を行う場合には、次の条件下で行った。：９４℃で５分間の最初の変性を行った後、続いて、９４℃で３０秒、４０℃で２０秒、７２℃で３０秒から成るサイクルを３０サイクル行う。最後に、７２℃で７分間のエクステンションがなされる。
【００５１】
［Ｔ７エキソヌクレアーゼによるＰＣＲ産物の分解］
ＰＣＲを行った後、ビオチニル化したストランドと相補的なＧＰ５＋ストランドは、５´→３´エキソヌクレアーゼであるＴ７遺伝子エキソヌクレアーゼにより分解された。もう一方の方のストランドは、５´末端に４つのホスホロチオエート結合を有することにより、Ｔ７エキソヌクレアーゼの作用から保護された（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ， １９９４）。Ｔ７エキソヌクレアーゼ（ニュー・ニュー・イングランド・バイオラボ社，カタログ番号＃Ｍ０２６３Ｌ）がＰＣＲ産物に最終濃度が０．４Ｕ／μｌとなるように添加されることにより、相補鎖が分解されて、ビオチン標識した１本鎖ＤＮＡが生成された。この１本鎖ＤＮＡは、ルミネックス社のビーズにカップリングされたプローブと相補的な配列を有する。この分解反応は、最終濃度が０．５ＭとなるようにＥＤＴＡを１２．５μｌ添加することにより、停止された。
【００５２】
［マイクロビーズの調整］
赤色及び赤外蛍光色素を異なる比率で配合して分類したマイクロビーズのセットは、ルミネックス社より購入した（米国テキサス州オースティン，カタログ番号＃Ｌ１００−ＣＸＸＸ−０１）。これらのマイクロビーズは、製造業者の使用説明書に従い、適宜変更を加えて、ＨＰＶのタイプ特異的なプローブにカップリングされた。当該ＨＰＶのタイプ特異的なプローブは、５´側がアミノ修飾されており、マイクロビーズの表面に結合されているカルボキシル基と反応して結合できるようになっている。簡単に説明すると、マイクロビーズストック（ルミネックス社）は、しっかりとボルテックスされた後、それぞれのマイクロビーズのセットから、５．０×１０６個のビーズを含むアリコットが採取されて、それぞれ独立した１．５ｍｌ容量の微量遠心管チューブの中に入れられた。そして、超音波ウォーターバス（ブランソン社）の中で再懸濁され、１４０００×ｇで２分間遠心処理された。そして、上清が除去されて、そのマイクロビーズはｐＨ４．５で０．１Ｍ ２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）（シグマ社，カタログ番号＃Ｍ−２９３３）５０μｌに再懸濁された。そして、異なるセットのマイクロビーズにそれぞれ適切なタイプの１ｍＭアミノ置換オリゴヌクレオチド溶液が１μｌずつ添加され、それぞれのチューブに１０ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（フィッシャー社，カタログ番号＃２２９８０）の溶液が２．５μＬずつ添加された。それぞれのチューブはボルテックスされ、室温、暗所で３０分間インキュベートされた後、それぞれのチューブに１０ｍｇ／ｍｌ ＥＤＣが２．５μＬずつ添加された。その後、暗所で３０分間インキュベートされた。この２回目のインキュベートの期間が終了した後、０．０２％ツイン（登録商標）２０（シグマ社，カタログ番号＃Ｐ−９４１６）が１ｍｌずつ添加され、それぞれのチューブが１４，０００×ｇで２分間遠心処理された。上清が除去されて、マイクロビーズのペレットに０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）が１ｍｌ添加された。各チューブはボルテックスされた後、１４，０００×ｇで２分間遠心処理された。上清が除去されて、ペレットが１００μｌのＴＥに再懸濁された。プローブにカップリングしたマイクロビーズは、暗所、４℃で最大で６ヶ月保存された。
【００５３】
［ルミネックスアッセイ］
ルミネックスアッセイにおいては、通常は各セットが１５マイクロビーズ／μｌずつ採取され、混合液において混合された。エキソヌクレアーゼで分解した後のＰＣＲ産物は、９６ウェルＰＣＲマイクロプレート（フィッシャー社，カタログ番号＃ＣＳ００６５０９）の各ウェルの中に全体積が１７μｌとなるように採取され、９６ウェルシーリングカバー（フィッシャー社，カタログ番号＃ＣＳ００６５５５）によりシールされた。マイクロプレートは、ＤＮＡを変性させるために、９５℃で１０分間インキュベートされ、そして、マイクロビーズ混合液３３μＬが添加された。これらのサンプルは、ハイブリダイゼーション温度で１０分間インキュベートされ、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（インビトロジェン社，カタログ番号＃Ｓ−８６６）の溶液０．０４ｍｇ／μｌが２５μｌ添加された後、１×テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）（シグマ社，カタログ番号＃Ｔ−３４１１）がサンプルに添加され、その後さらに６０℃で５分間インキュベートされた。サンプルは、ルミネックスＩＳソフトウェアを用いたルミネックスリキッドチップ２００フローサイトメーターによって分析された。分析は、最大で５０μＬのサンプルを６０℃で、最小でも各タイプにつき１００個のマイクロビーズを数えることにより行われた。下流ゲートは８，３００に、上流ゲートは１６，５００に、それぞれ設定された。
【００５４】
［実施例１：プローブの設計と選択］
プローブは、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマー（Ｒｏｄａ Ｈｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）の間に配置されるＬ１遺伝子の領域を標的として作成された。この領域は、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーが結合する２つの保存領域で挟まれた領域であり、比較的配列があまり保存されていない領域である。この領域の長さはタイプごとに若干異なり、例えばＨＰＶ１６型では１４１ｂｐの長さであり、Ｆｌｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１２５６７３）により公知とされている配列の６６２４〜６７６４番のヌクレオチドに対応している。
【００５５】
ＤＮＡ配列を検出するためにルミネックスＸｍａｐ技術を使用することについて説明している先行文献においては、典型的には２０ｎｔの長さのプローブを使用することが示されている。したがって、私達はまず始めに、ＡｒｒａｙＤｅｓｉｇｎｅｒコンピュータソフトウェア（Ｐｒｅｍｉｅｒ ＢｉｏＳｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）（表１）を使用して２０ｎｔの長さのプローブを設計した。しかしながら、プローブと、ＨＰＶ６型及び１６型由来のＤＮＡと、を用いて予備試験を行ったところ、これらのプローブは私達が行った条件下においてはＨＰＶのＤＮＡを検出するのに使えるほど良好なものではなかった。図１に示すように、ＨＰＶ６型及びＨＰＶ１６型のクローンから増幅されたＤＮＡは、対応する２０ｍｅｒのプローブが結合されているマイクロビーズにハイブリダイズしなかった（パネルＡ及びＢ）。ＨＰＶ１６型のプローブと厳密に相補的なビオチニル化オリゴヌクレオチドは、ＨＰＶ１６型のマイクロビーズを大量に蛍光発光させたが、それだけではなく、ＨＰＶ６型のマイクロビーズの蛍光も非特異的に増加させた（パネルＣ）。
【００５６】
そこで、元のプローブの左端または右端に１０ｎｔを追加することにより、３０ｍｅｒｓのプローブが再設計された。プローブをより長く設計することにより、特異性が高くなり、近縁関係にあるＨＰＶタイプや変異型を判別できる可能性が高まる。近縁関係にあるＨＰＶタイプとは、例えばＨＰＶ１６型とＨＰＶ３１型とである。最初に作成したプローブセットあるいは３０ｍｅｒｓのプローブの中には、交差反応しやすかったり（低い特異性）、目的とする標的物に良好に結合しなかったり（低い反応性）、あるいはその両方が原因で、最適なプローブとは言えないものが、数多く含まれていた。不適切なプローブについては、典型的には、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋断片の可変領域に沿って１０ヌクレオチド右へあるいは左へ位置をずらすことにより、再設計した。このプロセスは、全てのプローブが目的とする標的物に対して特異的かつ良好な反応性で結合するようになるまで、繰り返された。プローブの効率性や特異性を予想しようという試みや、ヘヤピン構造を有するプローブや他の交差反応配列をもつプローブを予想により排除しようという試みは、失敗に終わった。これは、プローブが予期せぬ振る舞いをすることが頻繁にあったためである。
【００５７】
表２に、プローブの開発の履歴が示してある。一方で、この方法において最終的に使用されたプローブのセットが表３に示してある。図２は、この方法でカバーされる４６種類のＨＰＶの整列配列の中でプローブが占める位置を示す図である。
【００５８】
［実施例２：エキソヌクレアーゼの効果］
単に二本鎖のＰＣＲ産物を変性させて、マイクロビーズに結合しているプローブにハイブリダイズさせた場合、ビオチン標識一本鎖オリゴヌクレオチドをマイクロビーズにハイブリダイズさせた場合と比べて、検出される蛍光シグナルが小さくなった（図３）。私達は、マイクロビーズに物理的に結合された短い（３０ｎｔ）プローブにＧＰ６＋ストランドがハイブリダイズすることよりも、ＰＣＲ産物の長いストランドが再ハイブリダイズすることのほうが、熱力学的に起こりやすいのだろうと考えた。それ故に、私達は、先に公知とされている方法に従って（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ， ｅｔ ａｌ．， １９９４）、バクテリオファージＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼを用いて、ＰＣＲ産物のうちの標識がされていない方のストランドを除去することとした。Ｔ７エキソヌクレアーゼは５´→３´プロセッシブ酵素であり、二本鎖ＤＮＡ分子の一方のストランドを迅速に分解する（Ｋｅｒｒ ａｎｄ Ｓａｄｏｗｓｋｉ， １９７２）。ビオチン標識を含むＧＰ６＋ストランドを保護しつつ、ＧＰ５＋ストランドのみを選択的に分解するために、当該分子の５´末端の４つのヌクレオチドのデオキシリボーゼ部分の間に通常のホスホジエステル結合に代えてホスホロチオエート結合を導入するように修飾がなされた。このような化学的修飾を施すことにより、修飾された末端からはＤＮＡ分子の分解を始めることがもはや出来なくなり、Ｔ７エキソヌクレアーゼの作用を阻害することができることが知られている（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。
【００５９】
最適な分解条件は、４０ユニットのＴ７エキソヌクレアーゼを１００μｌのＰＣＲ産物に加えて様々な時間設定でインキュベートしてみて、ルミネックスシステムでそれぞれの蛍光強度を測ることにより、決定した。これらの実験により、図３に示した１つの例のように、反応性のテストとしては４０分間のインキュベートが最適であり、蛍光シグナルが２倍に増加されることがわかった。
【００６０】
［実施例３：ＨＰＶのタイプの特定］
それぞれのタイプについての特異性及び反応性は、公知の起源のＨＰＶから、又は、可能であれば全てのＨＰＶゲノムを含むクローンから、又は、臨床サンプルより若しくは刊行物により公知となっている遺伝子配列（完全なリストは、材料と方法を参照）を用いて合成されたサンプルよりＰＣＲによって増幅された遺伝子のＭＹ領域のクローンから、ＰＣＲ産物を添加することによって、決定された。全てのクローンは、直接シークエンス法により、そして刊行物により公知となっているＨＰＶの配列と比較することにより、確かめられた。
【００６１】
上述したＰＣＲ増幅法、エキソヌクレアーゼ分解、及びマイクロビーズのハイブリダイゼーションを用いることにより、それぞれのタイプのＨＰＶの増幅したＤＮＡは、４６種類の特異的なＨＰＶプローブとそれぞれ結合している４６種類のマイクロビーズの混合液にハイブリダイズされた。ハイブリダイズさせた後、マイクロビーズの混合液はルミネックスリキッドチップ２００フローサイトメーターによって分析された。宿主細胞のＤＮＡのみを含むネガティブコントロールが４連、サンプルと平行して分析された。コントロールにおけるそれぞれのビーズのバックグラウンド蛍光の平均が、サンプルのそれぞれのビーズの蛍光から差し引かれた。ビーズのタイプごとにバックグラウンド蛍光が異なってくると考えられるので、このようなタイプのバックグラウンドの補正が必要なのである。このような補正を行うことにより、他のルミネックスの手順（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｓｅｍｅ ｅｔ ａｌ．， ２００９）において用いられているような、ビーズを洗浄する過程を省くことができるのである。補正を行った後の蛍光シグナルが１００ＦＵよりも大きかった場合、陽性であるものと判断した。
【００６２】
完全な結果が表４に示してある。それぞれの欄には、一番左の欄に記載のタイプのＨＰＶのＤＮＡの存在下において、各ＨＰＶタイプのプローブと結合している各マイクロビーズと関連する蛍光強度が示してある。図４には、同じ結果が図式的に示してある。４６種類全てのプローブがそれぞれ、対応するＨＰＶＤＮＡと強くハイブリダイズしており、異なるタイプのＨＰＶＤＮＡとは強くハイブリダイズしていないことがわかる。表４及び図４に示す特定の項目において、ＨＰＶ８９のマイクロビーズはＨＰＶ４４のＤＮＡが存在する場合でも１００ＦＵの閾値を超える蛍光の検出を示し（５１３ＦＵ）、同じくＨＰＶ７２のマイクロビーズはＨＰＶ８１のＤＮＡが存在する場合でも蛍光の検出を示し（１１８ＦＵ）、同じくＨＰＶ４４のマイクロビーズはＨＰＶ８６のＤＮＡが存在する場合でも蛍光の検出を示す（３９１ＦＵ）点は、特筆すべき点である。この異常な蛍光の検出は、他の試験によっては再現不能であったので、これは秩序だった交差反応を原因とするものではなく、無作為の変動を原因とするものであると解釈されるべきである。これは、１９８０回の測定に対して３回、つまり０．１５％の偽陽性率に相当する。偽陽性の検出を避けるために、臨床サンプルは二連で試験が行われ、当該二連の結果が一致しない場合には再測定が行われた。
【００６３】
それから私達は、同一のサンプルの中に複数のタイプの感染が混在している場合に、これらをルミネックスの手法で検出できるかどうかについてテストした。具体的には、異なるＨＰＶタイプから採取したＤＮＡをそれぞれ増幅し、これらを混合して単一のルミネックス検出反応液の中に入れることにより、テストした。臨床サンプルの状況をシミュレーションするために、タイプごとのＤＮＡの量は一定量に保持された。つまり、存在するタイプの数に関わらず、異なるＤＮＡの混合物はＰＣＲ反応の最大能力で増幅された。その結果を図５に示してある。その結果によれば、クロスハイブリダイゼーションを最小限に抑えつつも、少なくとも３０種類の異なるタイプを同時に検出できることがわかる。しかしながら、いくつかの偽陰性及び偽陽性は存在する。偽陰性は、おそらく、多くのタイプが混在する場合には各ＨＰＶタイプごとの蛍光発光が低下し、それ故にいくつかのマイクロビーズは陽性の判断の閾値としての５０ＦＵを下回ることとなることに起因すると考えられる。ＨＰＶ７２の偽陽性は、このマイクロビーズのバックグラウンド蛍光発光の変動によるものである。
【００６４】
［実施例４：臨床サンプルを用いた検証−直接シークエンシング］
ＮＭＬルミネックス遺伝子型決定手法によって得られた結果と、増幅した産物を直接シークエンシングした結果と、を比較することにより、臨床サンプルに対する検証が行われた。直接シークエンシングによれば、あらゆるタイプのＨＰＶを誤判別することなく特定することができるため、これはＮＭＬルミネックスアッセイのプローブの特異性を追加的に試験することにもなる。
【００６５】
上述のように、７７５個のサンプルについて２段階ＰＣＲにより遺伝子が増幅され、その産物はＮＭＬルミネックス法によりタイプ分けされた。同じサンプルについて、２段階ＰＣＲにより個別に増幅し、アガロースゲル上を泳動させることにより、ＨＰＶＤＮＡの存在を確認した。陽性だったサンプルは、シークエンシングのためＮＭＬＤＮＡコア施設に送付された。そして、増幅産物の両方のストランドをシークエンスするために、ＧＰ５＋プライマーとＧＰ６＋プライマーとが用いられた。結集された配列は、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０）を用いることにより、ＧｅｎＢａｎｋの配列と比較された。タイプが同一であると認められるためには、少なくとも６０ヌクレオチドの長さを有し、かつ、その遺伝子断片におけるヌクレオチドの同一性が９０％よりも大きいことが必要であるものとした。
【００６６】
表５に示された結果によれば、前記２つの方法は、ＨＰＶの検出に関して、タイプの如何に関わらず、９７．７％一致した。代表的な方法とされている直接シークエンス法に対する、ＮＭＬルミネックス法の反応性及び特異性は、それぞれ９８．８％（９７．１−９９．６， ９５％Ｃｌ）及び９６．４％（９６．４−９３．８％， ９５％Ｃｌ）であった。
【００６７】
ＨＰＶタイプの確実な特定ということを考慮に入れると、直接シークエンス法では３４個の陽性のサンプルの配列を決定することができなかったが、そのうちの３２個についてはＮＭＬルミネックス法によりタイプを特定できた。４２９個のサンプルのうち１３個についてのＨＰＶタイプの検出に関しては、両方の方法で陽性という結果は得られなかった（３．３％）。ＮＭＬルミネックス法により全部で７９３のＨＰＶタイプが検出できたのに対し、直接シークエンス法によって検出できたのは全部で５７７である。この不一致は、同一のサンプル内に多数のＨＰＶタイプが存在する場合、直接シークエンス法によってはタイプを検出できないことに起因するものである。
【００６８】
前記２つの方法により検出したＨＰＶタイプの分析結果が表６に示してある。
【００６９】
直接シークエンス法に対する検証からは、ＮＭＬルミネックスアッセイで追加のタイプが検出されたことが、当該アッセイが複数種にわたる感染をより高感度で検出できることに起因するのか、あるいは特異性が低いことに起因するのか、はっきりさせることができない。
【００７０】
［実施例５：臨床サンプルを用いた検証−ロッシュリニアアッセイとの比較］
そこで私達は、ロッシュ社のリニアアレイＨＰＶ遺伝子型決定方法を判断基準に用いて、ＮＭＬルミネックスアッセイの性能を比較した。当該リニアアレイキットによれば３７種類の異なる遺伝子型を検出することができ、このリニアアレイキットにおけるＰＧＭＹプライマーに基づいた増幅システムは、とりわけ複数種類の遺伝子を増幅するのに効果的である。リニアアレイはＦＤＡの認可を得ているものであり、ＨＰＶ疫学の文献で用いられる標準的な方法の一つである。
【００７１】
この比較のために、私達は、８８０セットのサンプルを用いて、製造業者の使用説明書に従って国立微生物学研究所においてロッシュリニアアレイキットを用いてＨＰＶの分析を行うとともに、これと並行してＮＭＬルミネックス遺伝子型決定方法を用いて分析を行った。
【００７２】
リニアアレイのＨＰＶ５２型のプローブは、ＨＰＶ３３型、３５型及び５８型と交差反応を起こす。そのため、上述したように（Ｃｏｕｔｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７）ＨＰＶ５２型に特異的なリアルタイムＰＣＲにより全てのリニアアレイのＨＰＶ５２型の結果を確認した。リニアアレイにはＨＰＶ５５型に指定されたプローブが含まれているが、最新のＨＰＶの分類（ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ， ２００４）によれば、ＨＰＶ５５型はＨＰＶ４４型の変異型と考えられており、ＨＰＶ５５型は削除されている。そのため、私達はこの研究においてはＨＰＶ４４型の指定を使用した。ロッシュリニアアレイのプローブＩＳ３９とＣＰ６１０８はそれぞれ、最近になってＨＰＶ８２型及びＨＰＶ８９型に指定されることとなったタイプを認識する。この研究では、最近の指定が使用された。
【００７３】
表７は、いずれかのＨＰＶタイプに対して陽性のサンプルを検出するに際し、ＮＭＬルミネックスを用いた場合と、ロッシュリニアアレイを用いた場合と、の比較である。不一致の結果は全体で７％であり、不一致のサンプルのうちの５．２％はＮＭＬルミネックスでは陽性と判定されたのにも関わらずリニアアレイでは陽性とは判定されなかった。これは、ＮＭＬルミネックス法で２段階ＰＣＲを使用したことにより、より大きな反応性を有するものになったことに起因し、また、リニアアレイのプローブセットには存在しないＨＰＶタイプを検出したことに起因する。
【００７４】
表８は、全てのＨＰＶタイプ及び複数感染に対して陽性のサンプルを検出するに際し、ＮＭＬルミネックス法を用いた場合と、ロッシュリニアアレイを用いた場合と、の比較である。ロッシュリニアアレイでは、相当により多くのタイプのＨＰＶ（９１７に対し１１１１）を検出することができた。これは、ロッシュリニアアレイが、複数種類に感染しているサンプルに対してより高精度に検出できる能力を有するからである。上述したように（図５参照）、ルミネックス検出システムは少なくとも３２種類の異なるタイプを同時に検出できるのであるから、複数種類に感染しているサンプルに対しての検出感度がロッシュリニアアレイよりも低かったのは、ルミネックス検出システムの問題ではない。しかし、複数のタイプの混合物が存在する場合に効率が低くなる、ＰＣＲ増幅ステップの短所である。表９には個々のタイプの比較結果を示してある。ロッシュリニアアレイでは検出できなかったタイプは別として（ＨＰＶ１３型、３２型、７４型、８５型、８６型、８７型、９０型、及び９１型）、ＨＰＶ５２型、５３型、６１型、７３型、８４型、及び８９型の検出に関しては統計的にロッシュリニアアレイの方が顕著に反応性が高かった（Ｘ２テスト）。一方で、ＨＰＶ６７型の検出に関しては、ＮＭＬルミネックスの方が反応性が高かった。
【００７５】
表１０には、ロッシュリニアアレイの結果４種類以上のタイプに多重感染していることが判明したサンプルを除外した場合の、結果を示してある。この表より、検出されたタイプの総数を見ても（それぞれ、５３５及び５３４）、タイプごとの分析結果を見ても、ＮＭＬルミネックスで得られた結果とロッシュリニアアレイにより得られた結果とがより合致することがわかる。ロッシュリニアアレイでは検出できなかったタイプが存在するほか、５２型（リニアアレイの方が高感度で検出）及び６７型（ＮＭルミネックスの方が高感度で検出）で得られた結果のみが大きく異なっていた。
【００７６】
上に本発明の好適な実施形態を示したが、その中には様々な変更を加えることができると認識されかつ理解されるであろう。そして、添付の特許請求の範囲は、本発明の精神及び範囲内における全てのこのような変更を包含することを意図するものである。
【００７７】
（参考文献）
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Ｃｈｏｉ， Ｂ． Ｓ．， Ｏ． Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｐａｒｋ， Ｋ． Ｓ． Ｋｉｍ， Ｊ． Ｋ． Ｊｅｏｎｇ， ａｎｄ Ｊ． Ｓ． Ｌｅｅ． ２００３． Ｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ＨＰＶ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｉｎ Ｋｏｒｅａｎ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｓｅｘ ｗｏｒｋｅｒｓ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４４０−４４５．
Ｃｌｉｆｆｏｒｄ， Ｇ． Ｍ．， Ｓ． Ｇａｌｌｕｓ， Ｒ． Ｈｅｒｒｅｒｏ， Ｎ． Ｍｕｎｏｚ， Ｐ． Ｊ． Ｓｎｉｊｄｅｒｓ， Ｓ． Ｖａｃｃａｒｅｌｌａ， Ｐ． Ｔ． Ａｎｈ， Ｃ． Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏ， Ｎ． Ｔ． Ｈｉｅｕ， Ｅ． Ｍａｔｏｓ， Ｍ． Ｍｏｌａｎｏ， Ｒ． Ｒａｊｋｕｍａｒ， Ｇ． Ｒｏｎｃｏ， Ｓ． ｄｅ Ｓａｎｊｏｓｅ， Ｈ． Ｒ． Ｓｈｉｎ， Ｓ． Ｓｕｋｖｉｒａｃｈ， Ｊ． Ｏ． Ｔｈｏｍａｓ， Ｓ． Ｔｕｎｓａｋｕｌ， Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ， ａｎｄ Ｓ． Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ． ２００５． Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ｉｎ ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｎｏｒｍａｌ ｗｏｍｅｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＨＰＶ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｓｕｒｖｅｙｓ： ａ ｐｏｏｌｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｌａｎｃｅｔ ３６６：９９１−９９８．
Ｃｏｕｔｌｅｅ， Ｆ．， Ｄ． Ｒｏｕｌｅａｕ， Ｇ． Ｇｈａｔｔａｓ， Ｃ． Ｈａｎｋｉｎｓ， Ｓ． Ｖｅｚｉｎａ， Ｐ． Ｃｏｔｅ， Ｊ． Ｍａｃｌｅｏｄ， Ａ． ｄｅ Ｐｏｋｏｍａｎｄｙ， Ｄ． Ｍｏｎｅｙ， Ｓ． Ｗａｌｍｓｌｅｙ， Ｈ． Ｖｏｙｅｒ， Ｐ． Ｂｒａｓｓａｒｄ， ａｎｄ Ｅ． Ｆｒａｎｃｏ． ２００７． Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ｔｙｐｅ ５２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｏｒ ＨＰＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ａｒｒａｙ ＨＰＶ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｓｔ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４５：３８２１−３８２３．
Ｃｏｕｔｌｅｅ， Ｆ．， Ｄ． Ｒｏｕｌｅａｕ， Ｐ． Ｐｅｔｉｇｎａｔ， Ｇ． Ｇｈａｔｔａｓ， Ｊ． Ｒ． Ｋｏｒｎｅｇａｙ， Ｐ． Ｓｃｈｌａｇ， Ｓ． Ｂｏｙｌｅ， Ｃ． Ｈａｎｋｉｎｓ， Ｓ． Ｖｅｚｉｎａ， Ｐ． Ｃｏｔｅ， Ｊ． Ｍａｃｌｅｏｄ， Ｈ． Ｖｏｙｅｒ， Ｐ． Ｆｏｒｅｓｔ， Ｓ． Ｗａｌｍｓｌｅｙ， ａｎｄ Ｅ． Ｆｒａｎｃｏ． ２００６． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ＤＮＡ ｉｎ ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ＰＧＭＹ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｉｎｅａｒ ａｒｒａｙ ＨＰＶ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｓｔ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４４：１９９８−２００６．
Ｃｕｚｉｃｋ， Ｊ．， Ａ． Ｓｚａｒｅｗｓｋｉ， Ｈ． Ｃｕｂｉｅ， Ｇ． Ｈｕｌｍａｎ， Ｈ． Ｋｉｔｃｈｅｎｅｒ， Ｄ． Ｌｕｅｓｌｅｙ， Ｅ． ＭｃＧｏｏｇａｎ， Ｕ． Ｍｅｎｏｎ， Ｇ． Ｔｅｒｒｙ， Ｒ． Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｃ． Ｂｒｏｏｋｓ， Ｍ． Ｄｅｓａｉ， Ｃ． Ｇｉｅ， Ｌ． Ｈｏ， Ｉ． Ｊａｃｏｂｓ， Ｃ． Ｐｉｃｋｌｅｓ， ａｎｄ Ｐ． Ｓａｓｉｅｎｉ． ２００３． Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｗｏｍｅｎ ｗｈｏ ｔｅｓｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ： ｔｈｅ ＨＡＲＴ ｓｔｕｄｙ． Ｌａｎｃｅｔ ３６２：１８７１−１８７６．
Ｃｕｚｉｃｋ， Ｊ．， Ｍ． Ａｒｂｙｎ， Ｒ． Ｓａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ， Ｖ． Ｔｓｕ， Ｇ． Ｒｏｎｃｏ， Ｍ． Ｈ． Ｍａｙｒａｎｄ， Ｊ． Ｄｉｌｌｎｅｒ， ａｎｄ Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ． ２００８． Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｎｏｖｅｌ ｏｐｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２６ Ｓｕｐｐｌ １０：Ｋ２９−Ｋ４１．
Ｃｕｚｉｃｋ， Ｊ．， Ｍ． Ｈ． Ｍａｙｒａｎｄ， Ｇ． Ｒｏｎｃｏ， Ｐ． Ｓｎｉｊｄｅｒｓ， ａｎｄ Ｊ． Ｗａｒｄｌｅ． ２００６． Ｃｈａｐｔｅｒ １０： Ｎｅｗ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２４ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ３−９０−Ｓ３／９７．
Ｄａｖｉｅｓ， Ｐ．， Ｍ． Ａｒｂｙｎ， Ｊ． Ｄｉｌｌｎｅｒ， Ｈ． Ｃ． Ｋｉｔｃｈｅｎｅｒ， Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ， Ｇ． Ｒｏｎｃｏ， ａｎｄ Ｍ． Ｈａｋａｍａ． ２００６． Ａ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １１８：７９１−７９６．
ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ， Ｅ． Ｍ．， Ｃ． Ｆａｕｑｕｅｔ， Ｔ． Ｒ． Ｂｒｏｋｅｒ， Ｈ． Ｕ． Ｂｅｒｎａｒｄ， ａｎｄ Ｈ． ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ． ２００４． Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２４：１７−２７．
Ｄｅｌｌ’Ａｔｔｉ， Ｄ．， Ｍ． Ｚａｖａｇｌｉａ， Ｓ． Ｔｏｍｂｅｌｌｉ， Ｇ． Ｂｅｒｔａｃｃａ， Ａ． Ｏ． Ｃａｖａｚｚａｎａ， Ｇ． Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ， Ｍ． Ｍｉｎｕｎｎｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｍａｓｃｉｎｉ． ２００７． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｉｇｈ ｒｉｓｋ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ． ３８３：１４０−１４６．
Ｄ’Ｓｏｕｚａ， Ｇ．， Ａ． Ｒ． Ｋｒｅｉｍｅｒ， Ｒ． Ｖｉｓｃｉｄｉ， Ｍ． Ｐａｗｌｉｔａ， Ｃ． Ｆａｋｈｒｙ， Ｗ． Ｍ． Ｋｏｃｈ， Ｗ． Ｈ． Ｗｅｓｔｒａ， ａｎｄ Ｍ． Ｌ． Ｇｉｌｌｉｓｏｎ． ２００７． Ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３５６：１９４４−１９５６．
Ｆｌｏｒｅｓ， Ｅ． Ｒ．， Ｂ． Ｌ． Ａｌｌｅｎ−Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｄ． Ｌｅｅ， Ｃ． Ａ． Ｓａｔｔｌｅｒ， ａｎｄ Ｐ． Ｆ． Ｌａｍｂｅｒｔ． １９９９． Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６ （ＨＰＶ−１６） ｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅ ｉｎ ａｎ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６２：３４４−３５４．
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Ｇｉｌｌｉｓｏｎ， Ｍ． Ｌ．， Ｗ． Ｍ． Ｋｏｃｈ， Ｒ． Ｂ． Ｃａｐｏｎｅ， Ｍ． Ｓｐａｆｆｏｒｄ， Ｗ． Ｈ． Ｗｅｓｔｒａ， Ｌ． Ｗｕ， Ｍ． Ｌ． Ｚａｈｕｒａｋ， Ｒ． Ｗ． Ｄａｎｉｅｌ， Ｍ． Ｖｉｇｌｉｏｎｅ， Ｄ． Ｅ． Ｓｙｍｅｒ， Ｋ． Ｖ． Ｓｈａｈ， ａｎｄ Ｄ． Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ． ２０００． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｃａｕｓａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒｓ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９２：７０９−７２０．
Ｇｒａｖｉｔｔ， Ｐ． Ｅ．， Ｃ． Ｌ． Ｐｅｙｔｏｎ， Ｒ． Ｊ． Ａｐｐｌｅ， ａｎｄ Ｃ． Ｍ． Ｗｈｅｅｌｅｒ． １９９８． Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ２７ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｌ１ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ｒｅｖｅｒｓｅ ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３６：３０２０−３０２７．
Ｇｒａｖｉｔｔ， Ｐ． Ｅ．， Ｃ． Ｌ． Ｐｅｙｔｏｎ， Ｔ． Ｑ． Ａｌｅｓｓｉ， Ｃ． Ｍ． Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｆ． Ｃｏｕｔｌｅｅ， Ａ． Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ， Ｍ． Ｈ． Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ， Ｄ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ， ａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ａｐｐｌｅ． ２０００． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３８：３５７−３６１．
Ｇｒｅｇｏｉｒｅ， Ｌ．， Ａ． Ｌ． Ｃｕｂｉｌｌａ， Ｖ． Ｅ． Ｒｅｕｔｅｒ， Ｇ． Ｐ． Ｈａａｓ， ａｎｄ Ｗ． Ｄ． Ｌａｎｃａｓｔｅｒ． １９９５． Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｐｅｎｉｌｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８７：１７０５−１７０９．
Ｇｒｅｇｏｉｒｅ， Ｌ．， Ｍ． Ａｒｅｌｌａ， Ｊ． Ｃａｍｐｉｏｎｅ−Ｐｉｃｃａｒｄｏ， ａｎｄ Ｗ． Ｄ． Ｌａｎｃａｓｔｅｒ． １９８９． Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２７：２６６０−２６６５．
Ｈａｎ， Ｊ．， Ｄ． Ｃ． Ｓｗａｎ， Ｓ． Ｊ． Ｓｍｉｔｈ， Ｓ． Ｈ． Ｌｕｍ， Ｓ． Ｅ． Ｓｅｆｅｒｓ， Ｅ． Ｒ． Ｕｎｇｅｒ， ａｎｄ Ｙ． Ｗ． Ｔａｎｇ． ２００６． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ２５ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ｗｉｔｈ Ｔｅｍｐｌｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４４：４１５７−４１６２．
Ｈａｒｐｅｒ， Ｄ． Ｍ．， Ｅ． Ｌ． Ｆｒａｎｃｏ， Ｃ． Ｍ． Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ａ． Ｂ． Ｍｏｓｃｉｃｋｉ， Ｂ． Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｉ， Ｃ． Ｍ． Ｒｏｔｅｌｉ−Ｍａｒｔｉｎｓ， Ｄ． Ｊｅｎｋｉｎｓ， Ａ． Ｓｃｈｕｉｎｄ， Ｓ． Ａ． Ｃｏｓｔａ Ｃｌｅｍｅｎｓ， ａｎｄ Ｇ． Ｄｕｂｉｎ． ２００６． Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｕｐ ｔｏ ４．５ ｙｅａｒｓ ｏｆ ａ ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｌ１ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ １６ ａｎｄ １８： ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ ｆｒｏｍ ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ ３６７：１２４７−１２５５．
Ｈａｒｐｅｒ， Ｄ． Ｍ．， Ｅ． Ｌ． Ｆｒａｎｃｏ， Ｃ． Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｄ． Ｇ． Ｆｅｒｒｉｓ， Ｄ． Ｊｅｎｋｉｎｓ， Ａ． Ｓｃｈｕｉｎｄ， Ｔ． Ｚａｈａｆ， Ｂ． Ｉｎｎｉｓ， Ｐ． Ｎａｕｄ， Ｎ． Ｓ． Ｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ， Ｃ． Ｍ． Ｒｏｔｅｌｉ−Ｍａｒｔｉｎｓ， Ｊ． Ｔｅｉｘｅｉｒａ， Ｍ． Ｍ． Ｂｌａｔｔｅｒ， Ａ． Ｐ． Ｋｏｒｎ， Ｗ． Ｑｕｉｎｔ， ａｎｄ Ｇ． Ｄｕｂｉｎ． ２００４． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｌ１ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ １６ ａｎｄ １８ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｗｏｍｅｎ： ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ ３６４：１７５７−１７６５．
Ｈｕａｎｇ， Ｈ． Ｊ．， Ｓ． Ｌ． Ｈｕａｎｇ， Ｃ． Ｙ． Ｌｉｎ， Ｒ． Ｗ． Ｌｉｎ， Ｆ． Ｙ． Ｃｈａｏ， Ｍ． Ｙ． Ｃｈｅｎ， Ｔ． Ｃ． Ｃｈａｎｇ， Ｓ． Ｈｓｕｅｈ， Ｋ． Ｈ． Ｈｓｕ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｌａｉ． ２００４． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅｃｈｉｐ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｐｌｕｓ ｒａｄｉｃａｌ ｓｕｒｇｅｒｙ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ． １４：６３９−６４９．
Ｈｗａｎｇ， Ｔ． Ｓ．， Ｊ． Ｋ． Ｊｅｏｎｇ， Ｍ． Ｐａｒｋ， Ｈ． Ｓ． Ｈａｎ， Ｈ． Ｋ． Ｃｈｏｉ， ａｎｄ Ｔ． Ｓ． Ｐａｒｋ． ２００３． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＨＰＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｂｙ ＨＰＶ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． ９０：５１−５６．
Ｉｗａｓａｗａ， Ａ．， Ｙ． Ｋｕｍａｍｏｔｏ， ａｎｄ Ｋ． Ｆｕｊｉｎａｇａ． １９９３． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｐｅｎｉｌｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｕｒｏｌ． １４９：５９−６３．
Ｊｉａｎｇ， Ｈ． Ｌ．， Ｈ． Ｈ． Ｚｈｕ， Ｌ． Ｆ． Ｚｈｏｕ， Ｆ． Ｃｈｅｎ， ａｎｄ Ｚ． Ｃｈｅｎ． ２００６． Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｂｙ Ｌ１ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰ ｓｙｓｔｅｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５５：７１５−７２０．
Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ Ａ， Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ Ｐ， ａｎｄ Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ Ｕ． １９９９． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ｄｏｔ−ｂｌｏｔ．， ｐ． １７１−１９３． Ｉｎ Ｐｅｅｌｉｎｇ ＲＷ ａｎｄ Ｓｐａｒｌｉｎｇ ＰＦ （ｅｄｓ．）， Ｓｅｘｕａｌｌｙ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ．
Ｋｅｒｒ， Ｃ． ａｎｄ Ｐ． Ｄ． Ｓａｄｏｗｓｋｉ． １９７２． Ｇｅｎｅ ６ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７． ＩＩ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４７：３１１−３１８．
Ｋｉｍ， Ｊ． Ｊ．， Ｔ． Ｃ． Ｗｒｉｇｈｔ， ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｇｏｌｄｉｅ． ２００５． Ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ， Ｆｒａｎｃｅ， ａｎｄ Ｉｔａｌｙ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９７：８８８−８９５．
Ｋｌｅｔｅｒ， Ｂ．， Ｌ． Ｊ． ｖａｎ Ｄｏｏｒｎ， Ｊ． ｔｅｒ Ｓｃｈｅｇｇｅｔ， Ｌ． Ｓｃｈｒａｕｗｅｎ， Ｋ． ｖａｎ Ｋｒｉｍｐｅｎ， Ｍ． Ｂｕｒｇｅｒ， Ｂ． ｔｅｒ Ｈａｒｍｓｅｌ， ａｎｄ Ｗ． Ｑｕｉｎｔ． １９９８． Ｎｏｖｅｌ ｓｈｏｒｔ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５３：１７３１−１７３９．
Ｋｏｕｔｓｋｙ， Ｌ． Ａ．， Ｋ． Ａ． Ａｕｌｔ， Ｃ． Ｍ． Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｄ． Ｒ． Ｂｒｏｗｎ， Ｅ． Ｂａｒｒ， Ｆ． Ｂ． Ａｌｖａｒｅｚ， Ｌ． Ｍ． Ｃｈｉａｃｃｈｉｅｒｉｎｉ， ａｎｄ Ｋ． Ｕ． Ｊａｎｓｅｎ． ２００２． Ａ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４７：１６４５−１６５１．
Ｌｅｅ， Ｇ． Ｙ．， Ｓ． Ｍ． Ｋｉｍ， Ｓ． Ｙ． Ｒｉｍ， Ｈ． Ｓ． Ｃｈｏｉ， Ｃ． Ｓ． Ｐａｒｋ， ａｎｄ Ｊ． Ｈ． Ｎａｍ． ２００５． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ＨＰＶ ＤＮＡ ｃｈｉｐ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｌｅｓｉｏｎｓ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ． １５：８１−８７．
Ｌｉｕ， Ｃ． Ｈ．， Ｗ． Ｌ． Ｍａ， Ｒ． Ｓｈｉ， Ｙ． Ｆ． Ｐｅｎｇ， Ｑ． Ｏｕｙａｎｇ， ａｎｄ Ｗ． Ｌ． Ｚｈｅｎｇ． ２００３． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ． Ｄｉ Ｙｉ． Ｊｕｎ． Ｙｉ． Ｄａ． Ｘｕｅ． Ｘｕｅ． Ｂａｏ． ２３：２１３−２１５．
Ｌｕｎｇｕ， Ｏ．， Ｔ． Ｃ． Ｗｒｉｇｈｔ， Ｊｒ．， ａｎｄ Ｓ． Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ． １９９２． Ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｌ１ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＲＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１４５−１５２．
Ｍａｎｏｓ ＭＭ， Ｔｉｎｇ Ｙ， Ｗｒｉｇｈｔ ＤＫ， Ｌｅｗｉｓ ＡＪ， Ｂｒｏｋｅｒ ＴＲ， ａｎｄ Ｗｏｌｉｎｓｋｙ ＳＭ． １９８９． ＵＳｅ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｉｔａｌ ＨＰＶ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ７：２０９−２１４．
Ｍａｙｒａｎｄ， Ｍ． Ｈ．， Ｅ． Ｄｕａｒｔｅ−Ｆｒａｎｃｏ， Ｉ． Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ， Ｓ． Ｄ． Ｗａｌｔｅｒ， Ｊ． Ｈａｎｌｅｙ， Ａ． Ｆｅｒｅｎｃｚｙ， Ｓ． Ｒａｔｎａｍ， Ｆ． Ｃｏｕｔｌｅｅ， ａｎｄ Ｅ． Ｌ． Ｆｒａｎｃｏ． ２００７． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｖｅｒｓｕｓ Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３５７：１５７９−１５８８．
Ｍｅｌｂｙｅ， Ｍ．， Ｃ． Ｒａｂｋｉｎ， Ｍ． Ｆｒｉｓｃｈ， ａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ｂｉｇｇａｒ． １９９４． Ｃｈａｎｇｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ａｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ， １９４０−１９８９． Ａｍ． Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． １３９：７７２−７８０．
Ｍｅｌｃｈｅｒｓ， Ｗ． Ｊ．， Ｊ． Ｍ． Ｂａｋｋｅｒｓ， Ｊ． Ｗａｎｇ， Ｐ． Ｃ． ｄｅ Ｗｉｌｄｅ， Ｈ． Ｂｏｏｎｓｔｒａ， Ｗ． Ｇ． Ｑｕｉｎｔ， ａｎｄ Ａ． Ｇ． Ｈａｎｓｅｌａａｒ． １９９９． Ｓｈｏｒｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｌｉｎｅ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ． Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５５：１４７３−１４７８．
Ｍｅｎｚｏ， Ｓ．， Ａ． Ｃｉａｖａｔｔｉｎｉ， Ｐ． Ｂａｇｎａｒｅｌｌｉ， Ｋ． Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ， Ｓ． Ｓｉｓｔｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｃｌｅｍｅｎｔｉ． ２００８． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｕｎｄｅｒｄｉａｇｎｏｓｅｄ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ． ＢＭＣ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ８：１１２．
Ｍｉｎ， Ｗ．， Ｍ． Ｗｅｎ−Ｌｉ， Ｚ． Ｂａｏ， Ｌ． Ｌｉｎｇ， Ｓ． Ｚｈａｏ−Ｈｕｉ， ａｎｄ Ｚ． Ｗｅｎ−Ｌｉｎｇ． ２００６． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｗｉｔｈ ＲＤ−ＰＣＲ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ． Ｃｕｒｒ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５２：２０４−２０９．
Ｍｏｒｋ， Ｊ．， Ａ． Ｋ． Ｌｉｅ， Ｅ． Ｇｌａｔｔｒｅ， Ｇ． Ｈａｌｌｍａｎｓ， Ｅ． Ｊｅｌｌｕｍ， Ｐ． Ｋｏｓｋｅｌａ， Ｂ． Ｍｏｌｌｅｒ， Ｅ． Ｐｕｋｋａｌａ， Ｊ． Ｔ． Ｓｃｈｉｌｌｅｒ， Ｌ． Ｙｏｕｎｇｍａｎ， Ｍ． Ｌｅｈｔｉｎｅｎ， ａｎｄ Ｊ． Ｄｉｌｌｎｅｒ． ２００１． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｓｑｕａｍｏｕｓ−ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４４：１１２５−１１３１．
Ｍｕｎｏｚ， Ｎ． ａｎｄ Ｆ． Ｘ． Ｂｏｓｃｈ． １９９７． Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ： ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｓａｌｕｄ Ｐｕｂｌｉｃａ Ｍｅｘ． ３９：２７４−２８２．
Ｍｕｎｏｚ， Ｎ．， Ｆ． Ｘ． Ｂｏｓｃｈ， Ｓ． ｄｅ Ｓａｎｊｏｓｅ， Ｒ． Ｈｅｒｒｅｒｏ， Ｘ． Ｃａｓｔｅｌｌｓａｇｕｅ， Ｋ． Ｖ． Ｓｈａｈ， Ｐ． Ｊ． Ｓｎｉｊｄｅｒｓ， ａｎｄ Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ． ２００３． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４８：５１８−５２７．
Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ， Ｔ． Ｔ．， Ｒ． Ｂ． Ｒｅｎｄｌｅ， Ｍ． Ｌ． Ｋｏｔｅｗｉｃｚ， ａｎｄ Ｙ． Ｈ． Ｒｏｇｅｒｓ． １９９４． Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． ３：２８５−２９１．
Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ， Ｍ．， Ｔ． Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｓ． Ｔｏｎｅ， Ｔ． Ｍｕｒａｉ， Ｔ． Ｏｈｋａｗａｒａ， Ｔ． Ｍａｔｓｕｎａｍｉ， Ｍ． Ｋｏｉｚｕｍｉ， Ｙ． Ｔａｋａｇｉ， Ｊ． Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｎ． Ｋｏｎｄｏ， Ｊ． Ｎｉｓｈｉｈｉｒａ， Ｔ． Ｈｏｒｉｋａｗａ， ａｎｄ Ｔ． Ｙｏｓｈｉｋｉ． ２００８． Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４６：１１６１−１１６８．
Ｎｏｂｒｅ， Ｒ． Ｊ．， Ｌ． Ｐ． ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ， ａｎｄ Ｔ． Ｃ． Ｍａｒｔｉｎｓ． ２００８． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｔｙｐｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｖｉｒｏｌ． ４２：１３−２１．
Ｎｕｏｖｏ， Ｇ． Ｊ．， Ｄ． Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ， Ｗ． Ｗ． Ｊｕｎｇ， Ｉ． Ｋ． Ｈａｎ， Ｔ． Ｕｍ， Ｄ． Ｆ． Ｇｒａｂａｒｚ， Ｄ． Ｊ． Ｌｅｅ， ａｎｄ Ｒ． Ｔ． ＭｃＣａｂｅ． ２００８． Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｐ ｓｍｅａｒ， ｃｅｒｖｉｃａｌ ｂｉｏｐｓｙ， ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ ｗｉｔｈ ａｎ ＨＰＶ ｔｙｐｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｉａｇｎ． Ｍｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ． １７：１０７−１１１．
Ｏｈ， Ｔ． Ｊ．， Ｃ． Ｊ． Ｋｉｍ， Ｓ． Ｋ． Ｗｏｏ， Ｔ． Ｓ． Ｋｉｍ， Ｄ． Ｊ． Ｊｅｏｎｇ， Ｍ． Ｓ． Ｋｉｍ， Ｓ． Ｌｅｅ， Ｈ． Ｓ． Ｃｈｏ， ａｎｄ Ｓ． Ａｎ． ２００４． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４２ ：３２７２−３２８０．
Ｐａｌｅｆｓｋｙ， Ｊ． Ｍ． １９９１． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ３：８８１−８８５．
Ｒｏｄａ Ｈｕｓｍａｎ， Ａ． Ｍ．， Ｊ． Ｍ． Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ， Ａ． Ｊ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｕｌｅ， Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ， ａｎｄ Ｐ． Ｊ． Ｓｎｉｊｄｅｒｓ． １９９５． Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ＧＰ５ ａｎｄ ＧＰ６ ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅｉｒ ３’ ｅｎｄｓ ｗｉｔｈ ａｄｊａｃｅｎｔ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：１０５７−１０６２
Ｒｏｎｃｏ， Ｇ．， Ｐ． Ｇｉｏｒｇｉ−Ｒｏｓｓｉ， Ｆ． Ｃａｒｏｚｚｉ， Ｐ． Ｐ． Ｄａｌｌａ， Ａ． Ｄｅｌ Ｍｉｓｔｒｏ， Ｌ． Ｄｅ Ｍａｒｃｏ， Ｍ． Ｄｅ Ｌｉｌｌｏ， Ｃ． Ｎａｌｄｏｎｉ， Ｐ． Ｐｉｅｒｏｔｔｉ， Ｒ． Ｒｉｚｚｏｌｏ， Ｎ． Ｓｅｇｎａｎ， Ｐ． Ｓｃｈｉｎｃａｇｌｉａ， Ｍ． Ｚｏｒｚｉ， Ｍ． Ｃｏｎｆｏｒｔｉｎｉ， ａｎｄ Ｊ． Ｃｕｚｉｃｋ． ２００６． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ−ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｗｏｍｅｎ ｙｏｕｎｇｅｒ ｔｈａｎ ３５ ｙｅａｒｓ： ｒｅｓｕｌｔｓ ａｔ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ． ７：５４７−５５５．
Ｓａｎｔｉａｇｏ， Ｅ．， Ｌ． Ｃａｍａｃｈｏ， Ｍ． Ｌ． Ｊｕｎｑｕｅｒａ， ａｎｄ Ｆ． Ｖａｚｑｕｅｚ． ２００６． Ｆｕｌｌ ＨＰＶ ｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３７：３８−４６．
Ｓｅｍｅ， Ｋ．， Ｓ． Ｚ． Ｌｅｐｅｊ， Ｍ． Ｍ． Ｌｕｎａｒ， Ｊ． Ｉｓｃｉｃ−Ｂｅｓ， Ａ． Ｐｌａｎｉｎｉｃ， Ｂ． Ｊ． Ｋｏｃｊａｎ， Ａ． Ｖｉｎｃｅ， ａｎｄ Ｍ． Ｐｏｌｊａｋ． ２００９． Ｄｉｇｅｎｅ ＨＰＶ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ＲＨ Ｔｅｓｔ ＲＵＯ： ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＩＮＮＯ−ＬｉＰＡ ＨＰＶ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｅｘｔｒａ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ １８ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ａｎｄ ｐｒｏｂａｂｌｅ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｖｉｒｏｌ． ４６：１７６−１７９．
Ｓｍｉｔｈ， Ｊ． Ｓ．， Ｌ． Ｌｉｎｄｓａｙ， Ｂ． Ｈｏｏｔｓ， Ｊ． Ｋｅｙｓ， Ｓ． Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ， Ｒ． Ｗｉｎｅｒ， ａｎｄ Ｇ． Ｍ． Ｃｌｉｆｆｏｒｄ． ２００７． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ： ａ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｐｄａｔｅ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １２１：６２１−６３２．
Ｓｙｒｊａｎｅｎ， Ｓ． ２００５． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ５９−Ｓ６６．
ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｕｌｅ， Ａ． Ｊ．， Ｒ． Ｐｏｌ， Ｎ． Ｆｒａｎｓｅｎ−Ｄａａｌｍｅｉｊｅｒ， Ｌ． Ｍ． Ｓｃｈｏｕｌｓ， Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ， ａｎｄ Ｐ． Ｊ． Ｓｎｉｊｄｅｒｓ． ２００２． ＧＰ５＋／６＋ ＰＣＲ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４０：７７９−７８７．
ｖａｎ Ｈａｍｏｎｔ， Ｄ．， Ｍ． Ａ． ｖａｎ Ｈａｍ， Ｊ． Ｍ． Ｂａｋｋｅｒｓ， Ｌ． Ｆ． Ｍａｓｓｕｇｅｒ， ａｎｄ Ｗ． Ｊ． Ｍｅｌｃｈｅｒｓ． ２００６． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＳＰＦ１０−ＩＮＮＯ ＬｉＰＡ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｃｈｅ ｌｉｎｅａｒ ａｒｒａｙ ＨＰＶ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｓｔ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４４：３１２２−３１２９．
Ｖａｎ Ｒａｎｓｔ， Ｍ．， Ｊ． Ｂ． Ｋａｐｌａｎ， ａｎｄ Ｒ． Ｄ． Ｂｕｒｋ． １９９２． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７３ ：２６５３−２６６０．
Ｖｉｌｌａ， Ｌ． Ｌ．， Ｒ． Ｌ． Ｃｏｓｔａ， Ｃ． Ａ． Ｐｅｔｔａ， Ｒ． Ｐ． Ａｎｄｒａｄｅ， Ｋ． Ａ． Ａｕｌｔ， Ａ． Ｒ． Ｇｉｕｌｉａｎｏ， Ｃ． Ｍ． Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｌ． Ａ． Ｋｏｕｔｓｋｙ， Ｃ． Ｍａｌｍ， Ｍ． Ｌｅｈｔｉｎｅｎ， Ｆ． Ｅ． Ｓｋｊｅｌｄｅｓｔａｄ， Ｓ． Ｅ． Ｏｌｓｓｏｎ， Ｍ． Ｓｔｅｉｎｗａｌｌ， Ｄ． Ｒ． Ｂｒｏｗｎ， Ｒ． Ｊ． Ｋｕｒｍａｎ， Ｂ． Ｍ． Ｒｏｎｎｅｔｔ， Ｍ． Ｈ． Ｓｔｏｌｅｒ， Ａ． Ｆｅｒｅｎｃｚｙ， Ｄ． Ｍ． Ｈａｒｐｅｒ， Ｇ． Ｍ． Ｔａｍｍｓ， Ｊ． Ｙｕ， Ｌ． Ｌｕｐｉｎａｃｃｉ， Ｒ． Ｒａｉｌｋａｒ， Ｆ． Ｊ． Ｔａｄｄｅｏ， Ｋ． Ｕ． Ｊａｎｓｅｎ， Ｍ． Ｔ． Ｅｓｓｅｒ， Ｈ． Ｌ． Ｓｉｎｇｓ， Ａ． Ｊ． Ｓａａｈ， ａｎｄ Ｅ． Ｂａｒｒ． ２００５． Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ｔｙｐｅｓ ６， １１， １６， ａｎｄ １８） Ｌ１ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｗｏｍｅｎ： ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ． ６：２７１−２７８．
Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ， Ｊ． Ｍ．， Ｍ． Ｖ． Ｊａｃｏｂｓ， Ｍ． Ｍ． Ｍａｎｏｓ， Ｆ． Ｘ． Ｂｏｓｃｈ， Ｊ． Ａ． Ｋｕｍｍｅｒ， Ｋ． Ｖ． Ｓｈａｈ， Ｐ． Ｊ． Ｓｎｉｊｄｅｒｓ， Ｊ． Ｐｅｔｏ， Ｃ． Ｊ． Ｍｅｉｊｅｒ， ａｎｄ Ｎ． Ｍｕｎｏｚ． １９９９． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １８９：１２−１９．
Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， Ｘ． Ｙａｎ， Ｊ． Ｓｕｎ， Ｚ． Ｃｈｅｎ， Ｙ． Ｇａｏ， Ｙ． Ｂａｉ， ａｎｄ Ｚ． Ｌｉｕ． ２００３． Ａ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ． Ｊ． （Ｅｎｇｌ． ）． １１６：１１３７−１１４０．
ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ， Ｈ． ２００２． Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ： ｆｒｏｍ ｂａｓｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ２：３４２−３５０
【００７８】
【表１】
【００７９】
【表２】
【００８０】
【表３】
【００８１】
【表４】
【００８２】
【表５】
【００８３】
【表６】
【００８４】
【表７】
【００８５】
【表８】
【００８６】
【表９】
【００８７】
【表１０】
【００８８】
【表１１】
【００８９】
【表１２】
【００９０】
【表１３】
【００９１】
【表１４】
【００９２】
【表１５】
【００９３】
【表１６】
【００９４】
【表１７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプへの感染を検出しタイプを特定するための方法であって、以下の過程を全て含む方法：
ａ）少なくとも１種類のＨＰＶタイプを含むことが疑われるサンプルを準備する過程；
ｂ）前記サンプルに、ＨＰＶのＬ１領域を増幅するのに適切なプライマーを添加する過程；
ｃ）前記サンプルをＤＮＡ増幅に適切な条件下でインキュベートする過程；
ｄ）配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する少なくとも一つのプローブを添加する過程であって、前記プローブはハイブリダイゼーション条件下でそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみ結合し、各前記少なくとも一つのプローブはさらに特有のタグを備える、過程；
ｅ）前記プローブ及び前記サンプルをハイブリダイゼーションに最適な条件下でインキュベートする過程；
ｆ）少なくとも一つの前記タグ付きプローブのハイブリダイゼーションを検出する過程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも一つのプローブはプローブの混合物から成り、前記混合物の各典型的なプローブは配列ＩＤ番号１、２、４又は５に記載のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも一つのプローブはプローブの混合物から成り、前記混合物の各典型的なプローブは配列ＩＤ番号４、５又は１７に記載のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも一つのプローブはプローブの混合物から成り、前記混合物の各典型的なプローブは配列ＩＤ番号４、５、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２２、２３、２４、２７又は２９に記載のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも一つのプローブはプローブの混合物から成り、前記混合物の各典型的なプローブは配列ＩＤ番号６、４、５、７、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３７、４０又は４６に記載のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも一つのプローブはプローブの混合物から成り、前記混合物の各典型的なプローブは配列ＩＤ番号１、２、９、１３、１４、１５、１６、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４３、４４又は４５に記載のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記特有のタグは二つの蛍光染料の組み合わせである、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記特有のタグは異なる比率の赤色及び赤外蛍光色素の組み合わせである、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記プライマーはＧＰ５＋／ＧＰ６＋から成る、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記プライマーはＧＰ５＋／ＧＰ６＋及びＭＹ０９／ＭＹ０９／ＭＹ１１から成る、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、少なくとも一つの前記プライマーはエキソヌクレアーゼに対して耐性を有する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、（ｄ）の過程の前にエキソヌクレアーゼが添加される、方法。
【請求項１３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセット。
【請求項１４】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１、２、４又は５のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセット。
【請求項１５】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号４、５及び１７のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセット。
【請求項１６】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号４、５、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２２、２３、２４、２７及び２９のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセット。
【請求項１７】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号６、４、５、７、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３７、４０及び４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセット。
【請求項１８】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１、２、９、１３、１４、１５、１６、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４３、４４及び４５のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセット。
【請求項１】
サンプル中におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプへの感染を検出しタイプを特定するための方法であって、以下の過程を全て含む方法：
ａ）少なくとも１種類のＨＰＶタイプを含むことが疑われるサンプルを準備する過程；
ｂ）前記サンプルに、ＨＰＶのＬ１領域を増幅するのに適切なプライマーを添加する過程；
ｃ）前記サンプルをＤＮＡ増幅に適切な条件下でインキュベートする過程；
ｄ）配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する少なくとも一つのプローブを添加する過程であって、前記プローブはハイブリダイゼーション条件下でそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみ結合し、各前記少なくとも一つのプローブはさらに特有のタグを備える、過程；
ｅ）前記プローブ及び前記サンプルをハイブリダイゼーションに最適な条件下でインキュベートする過程；
ｆ）少なくとも一つの前記タグ付きプローブのハイブリダイゼーションを検出する過程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも一つのプローブはプローブの混合物から成り、前記混合物の各典型的なプローブは配列ＩＤ番号１、２、４又は５に記載のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも一つのプローブはプローブの混合物から成り、前記混合物の各典型的なプローブは配列ＩＤ番号４、５又は１７に記載のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも一つのプローブはプローブの混合物から成り、前記混合物の各典型的なプローブは配列ＩＤ番号４、５、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２２、２３、２４、２７又は２９に記載のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも一つのプローブはプローブの混合物から成り、前記混合物の各典型的なプローブは配列ＩＤ番号６、４、５、７、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３７、４０又は４６に記載のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも一つのプローブはプローブの混合物から成り、前記混合物の各典型的なプローブは配列ＩＤ番号１、２、９、１３、１４、１５、１６、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４３、４４又は４５に記載のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記特有のタグは二つの蛍光染料の組み合わせである、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記特有のタグは異なる比率の赤色及び赤外蛍光色素の組み合わせである、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記プライマーはＧＰ５＋／ＧＰ６＋から成る、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記プライマーはＧＰ５＋／ＧＰ６＋及びＭＹ０９／ＭＹ０９／ＭＹ１１から成る、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、少なくとも一つの前記プライマーはエキソヌクレアーゼに対して耐性を有する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、（ｄ）の過程の前にエキソヌクレアーゼが添加される、方法。
【請求項１３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１〜４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセット。
【請求項１４】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１、２、４又は５のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセット。
【請求項１５】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号４、５及び１７のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセット。
【請求項１６】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号４、５、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２２、２３、２４、２７及び２９のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセット。
【請求項１７】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号６、４、５、７、８、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３７、４０及び４６のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセット。
【請求項１８】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプを検出しタイプを特定するためのプローブセットであって、前記セットの各前記プローブはハイブリダイゼーション条件下においてそれぞれ一つの種類のＨＰＶタイプにのみハイブリダイズし、前記セットの各前記プローブは、特有のタグと、配列ＩＤ番号１、２、９、１３、１４、１５、１６、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４３、４４及び４５のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と、により構成される、プローブセット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５１６９９３（Ｐ２０１３−５１６９９３Ａ）
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４９２１９（Ｐ２０１２−５４９２１９）
【出願日】平成２３年１月１９日（２０１１．１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／０５００２６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８８５７３
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５１１０３３８１８）
【氏名又は名称原語表記】ＨＥＲ ＭＡＪＥＳＴＹ ＴＨＥ ＱＵＥＥＮ ＩＮ ＲＩＧＨＴ ＯＦ ＣＡＮＡＤＡ ａｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ＴＨＥ ＭＩＮＩＳＴＥＲ ＯＦ ＨＥＡＬＴＨ
【住所又は居所原語表記】１０１５， ｒｕｅ Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ， ｐｉｅｃｅ Ｔ２４２０， Ｗｉｎｎｉｐｅｇ， Ｍａｎｉｔｏｂａ Ｒ３Ｅ ３Ｐ６ Ｃａｎａｄａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１９日（２０１１．１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／０５００２６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８８５７３
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５１１０３３８１８）
【氏名又は名称原語表記】ＨＥＲ ＭＡＪＥＳＴＹ ＴＨＥ ＱＵＥＥＮ ＩＮ ＲＩＧＨＴ ＯＦ ＣＡＮＡＤＡ ａｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ＴＨＥ ＭＩＮＩＳＴＥＲ ＯＦ ＨＥＡＬＴＨ
【住所又は居所原語表記】１０１５， ｒｕｅ Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ， ｐｉｅｃｅ Ｔ２４２０， Ｗｉｎｎｉｐｅｇ， Ｍａｎｉｔｏｂａ Ｒ３Ｅ ３Ｐ６ Ｃａｎａｄａ
【Ｆターム（参考）】
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