Ａ型肝炎ウイルス核酸の捕捉、検出および定量のためのオリゴヌクレオチドの同定
【課題】ウイルス血症サンプル中のＡ型肝炎ウイルスを検出するための信頼できる診断試験法を提供する。
【解決手段】Ａ型肝炎ウイルス特異的プライマー、およびＡ型肝炎ウイルスゲノムの保存領域から誘導されるプローブが、開示される。捕捉オリゴヌクレオチド、プライマー、およびプローブを使用する、核酸ベースのアッセイもまた、開示される。長さ６０ヌクレオチド以下の単離されたオリゴヌクレオチドが開示され、この単離されたオリゴヌクレオチドは、（ａ）特定な配列からなる群より選択される配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列2体して９０％配列同一性を有するヌクレオチド配列；または（ｃ）（ａ）の相補体および（ｂ）の相補体；を含む。
【解決手段】Ａ型肝炎ウイルス特異的プライマー、およびＡ型肝炎ウイルスゲノムの保存領域から誘導されるプローブが、開示される。捕捉オリゴヌクレオチド、プライマー、およびプローブを使用する、核酸ベースのアッセイもまた、開示される。長さ６０ヌクレオチド以下の単離されたオリゴヌクレオチドが開示され、この単離されたオリゴヌクレオチドは、（ａ）特定な配列からなる群より選択される配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列2体して９０％配列同一性を有するヌクレオチド配列；または（ｃ）（ａ）の相補体および（ｂ）の相補体；を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、ウイルス診断に関する。具体的には、本発明は、生物学的サンプルにおいてＡ型肝炎感染を正確に診断するためおよびＡ型肝炎を検出するための、核酸ベースアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ａ型肝炎は、発熱、倦怠感、食欲不振、悪心、腹部不快感、および黄疸を引き起こす、腸伝達性疾患である。Ａ型肝炎の病因因子であるＡ型肝炎ウイルスは、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のＨｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ属に分類される、小さく外被のない球状のウイルスである。ＨＡＶゲノムは、一本鎖で線状の７．５ｋｂ ＲＮＡ分子からなり、このＲＮＡ分子は、ウイルス複製に必要な構造タンパク質および酵素活性を生じるようにプロセシングされるポリタンパク質前駆体をコードする（非特許文献１）。ＨＡＶは、細胞培養中でほとんど増殖せず、細胞傷害性ではなく、そして低収量のウイルスを生じる。ビリオンから抽出されたＨＡＶ ＲＮＡは、細胞培養中で感染性である（非特許文献２および非特許文献３）が、そのウイルスゲノムの直接操作は、そのＲＮＡ組成が原因で困難になる。
【０００３】
ＨＡＶは、感染した個体に対する抗体によって認識される主要な抗原性ドメインを含む、４つのキャプシドタンパク質（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）をコードする。このキャプシドタンパク質に加えて、抗原性ドメインは、２Ａのような非構造タンパク質およびウイルスによりコードされるプロテアーゼ中において、報告されている。別の重要なＨＡＶ抗原性ドメインが、キャプシド前駆体Ｐ１と２Ａとの間の連結部において、記載されている。
【０００４】
ＨＡＶは、人−人接触または汚染された食物もしくは汚染された水の摂取のいずれかによって、糞便−口腔経路によって、通常は獲得される。しかし、プールされた血漿生成物によってＨＡＶが伝達する可能性が存在する。脂質エンベロープが存在しないことによって、ＨＡＶは、物理化学的不活化に対して非常に抵抗性であり、このウイルスは、血液生成物の従来の熱処理に耐え得る。従って、ＨＡＶおよびパルボウイルスＢ１９は、プールされた血漿誘導体の投与を介して伝達されてきた。感染した個体におけるＨＡＶ抗原および／またはＨＡＶ抗体を同定するための感度が良い特異的な診断アッセイ、ならびにウイルス血症サンプルを検出してそのサンプルを輸液から排除するための核酸ベースの試験の開発は、重要な公衆衛生上の挑戦を示す。
【０００５】
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎらに対する米国特許第５，２９０，６７７号（特許文献１）は、抗体を使用するＨＡＶウイルス全体の捕捉を記載する。ＲＮＡが、単離され、そしてｃＤＮＡが生成される。その後、そのｃＤＮＡは、ＨＡＶゲノムのＶＰ１キャプシド領域由来のプライマーおよびＶＰ３キャプシド領域由来のプライマーを使用するＰＣＲによって増幅され、その増幅産物が、そのゲノムの同じ領域に由来するプローブを使用して検出される。それらのプライマーおよびプローブの選択は、検出されるべきＨＡＶの遺伝子型に基づく。
血液誘導体および血漿誘導体を介するかまたは個人的密接によるこのウイルスの伝達を防ぐために、ウイルス血症サンプル中のＡ型肝炎ウイルスを検出するための信頼できる診断試験を開発する必要性が、存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，２９０，６７７号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｊａｒｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：２６２７〜２６３２（１９８５）
【非特許文献２】Ｌａｃａｒｎｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：２１６〜２２５（１９８１）
【非特許文献３】Ｓｉｅｇｌら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．５７：３３１〜３４１（１９８１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、感染している可能性がある個体由来の生物学的サンプルにおいてＨＡＶを検出するための、感度の良い信頼できる核酸ベースの診断試験を開発することに基づく。本明細書中に記載される技術は、ＰＣＲ、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、および５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎＴＭ技術）を使用して、ＨＡＶ配列の保存ゲノム領域の増幅用テンプレートとして、抽出したサンプル核酸を利用する。これらの方法は、ウイルス血症サンプルにおけるＨＡＶの検出を可能にする。特定の実施形態において、本発明は、ＨＡＶゲノムの５’ＵＴＲ領域に由来するプライマーおよびプローブを使用する。さらに、これらの方法は、捕捉されたサンプル核酸が同じ容器中で増幅および検出に供され得る、ワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）分析を可能にする。本発明の方法を使用して、感染したサンプルは、輸液から、および血液誘導体調製物から、同定されて排除され得る。
従って、一実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＨＡＶ感染を検出するための方法に関する。この方法は、
（ａ）固体支持体を、上記生物学的サンプルと、高カオトロピック塩濃度下で、または上記固体支持体と標的核酸との間で複合体が形成されるハイブリダイズ条件下で、接触させる工程；
（ｂ）上記サンプルから（ａ）の固体支持体を分離する工程；
（ｃ）標的核酸が存在する場合にその標的核酸を増幅する工程；および
（ｄ）上記増幅された核酸の存在を、上記サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程；
を包含する。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＨＡＶ感染を検出するための方法に関する。この方法は、
（ａ）固体支持体を、上記生物学的サンプルと、高カオトロピック塩濃度下で、または上記固体支持体と標的核酸との間で複合体が形成されるハイブリダイズ条件下で、接触させる工程；
（ｂ）上記サンプルから（ａ）の固体支持体を分離する工程；
（ｃ）ＨＡＶのゲノムの５’ ＵＴＲに由来するプライマー（例えば、配列番号１を含む配列によって示されるプライマー、および配列番号２を含む配列によって示されるプライマー）を使用して、標的核酸鎖を増幅する工程；
を包含する。特定の実施形態において、この方法は、ＨＡＶゲノムの５’ ＵＴＲに由来するプローブ（例えば、配列番号３のプローブ）を使用して、上記増幅された標的オリゴヌクレオチドの存在を、上記サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程をさらに包含する。
【００１０】
さらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＨＡＶ感染を検出するための方法に関し、上記方法は、
ＨＡＶを含むことが疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程；
２種のプライマーを使用して、上記核酸を増幅する工程であって、
（ａ）上記プライマーの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、一方のプライマーは、配列番号１からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつもう一方のプライマーは、配列番号２からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、または
（ｂ）上記プライマーは、（ａ）のヌクレオチド配列と９０％配列同一性を有し、
上記２種のプライマーの各々は、それぞれ、単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程；ならびに
上記増幅された核酸の存在を、上記サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程、
を包含する。
【００１１】
特定の実施形態において、上記核酸は、
（ａ）結合している捕捉核酸を含む固体支持体を、標的核酸鎖が上記捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で生物学的サンプルと接触させる工程；および
（ｂ）上記サンプルから上記固体支持体を分離する工程；
を包含する方法によって、上記生物学的サンプルから単離される。
【００１２】
さらなる実施形態において、上記単離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施される。
【００１３】
さらなる実施形態において、上記捕捉核酸は、１種以上のオリゴヌクレオチドを含み、上記オリゴヌクレオチドの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつ上記オリゴヌクレオチドの各々は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群より選択される配列からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む。
【００１４】
なおさらなる実施形態において、上記捕捉核酸は、長さが約１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドのホモポリマー鎖（例えば、ポリＡ、ポリＴ、ポリＧ、ポリＣおよびポリＵ）をさらに含む。
【００１５】
別の実施形態において、上記増幅する工程は、ＰＣＲ、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）またはＴａｑＭａｎを含む。
【００１６】
さらなる実施形態において、上記方法は、増幅された生成物を検出するために標識プローブオリゴヌクレオチドを使用する工程をさらに包含し、このプローブは、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつ配列番号３を含む少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む。
【００１７】
特定の実施形態において、上記プローブは、検出可能な標識（例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識）を５’末端および３’末端にさらに含む。
【００１８】
なお別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＨＡＶ感染を検出するための方法に関し、この方法は、
（ａ）固体支持体を、１種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸と、この捕捉核酸が上記固体支持体と結合する条件下で接触させる工程であって、上記１種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群より選択される配列を含む、工程；
（ｂ）（ａ）の固体支持体を、生物学的サンプルと、ＨＡＶ由来の標的核酸鎖が存在する場合にはその標的核酸鎖が上記捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で接触する工程；および
（ｃ）上記サンプルから（ｂ）の固体支持体を分離する工程；
（ｄ）配列番号１を含むセンスプライマーと配列番号２を含むアンチセンスプライマーとを使用して上記核酸を増幅する工程であって、上記センスプライマーおよび上記アンチセンスプライマーは、それぞれ、上記単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程；ならびに
（ｅ）上記増幅された核酸の存在を、上記サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程；
を包含する。
【００１９】
上記の方法の特定の実施形態において、上記固体支持体は、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）を含み、上記単離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施される。
【００２０】
さらなる実施形態において、本発明は、図１に示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つからなるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。
【００２１】
さらなる実施形態において、本発明は、長さ６０ヌクレオチド以下の単離されたオリゴヌクレオチドに関し、この単離されたオリゴヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群より選択される配列からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して９０％配列同一性を有するヌクレオチド配列；または
（ｃ）（ａ）の相補体および（ｂ）の相補体；
を含む。
【００２２】
特定の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【００２３】
さらなる実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を５’末端および／または３’末端にさらに含む。特定の実施形態において、上記検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識である。
【００２４】
なおさらなる実施形態において、本発明は、診断試験キットに関し、このキットは、本明細書中に記載される１種以上のプライマーと、この診断試験を実行することについての指示を含む。特定の実施形態において、この試験キットは、検出可能な標識に結合した約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドのＨＡＶ特異的ハイブリダイズ配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブをさらに含む。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＨＡＶを検出するためのキットに関する。このキットは、１種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸（これらの１種以上のオリゴヌクレオチドの各々は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群より選択される配列を含む）；配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマー；ならびに配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブを含む。特定の実施形態において、上記試験キットは、ポリメラーゼ、および上記診断試験を実行するための指示をさらに含む。
【００２６】
さらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＨＡＶ感染を検出するためのキットに関し、このキットは、
１種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸であって、これらのオリゴヌクレオチドの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつこれらのオリゴヌクレオチドの各々は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群より選択される配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、捕捉核酸；
少なくとも２種のプライマーであって、これらのプライマーの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、一方のプライマーは、配列番号１からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、もう一方のプライマーは、配列番号２からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、プライマー；および
ＨＡＶ感染を同定するための指示書
を備える。
【００２７】
特定の実施形態において、上記キットは、長さが約６０ヌクレオチド以下でありかつ配列番号３からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、プローブオリゴヌクレオチドをさらに含む。上記プローブは、検出可能な標識を５’末端および３’末端にさらに含み得る。いくつかの実施形態において、上記検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識である、キット。
【００２８】
特定の実施形態において、上記のキットは、ポリメラーゼおよび緩衝液をさらに含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
長さ６０ヌクレオチド以下の単離されたオリゴヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群より選択される配列からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して９０％配列同一性を有するヌクレオチド配列；または
（ｃ）（ａ）の相補体および（ｂ）の相補体；
を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目２）
項目１に記載のオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群より選択される配列からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列である、オリゴヌクレオチド。
（項目３）
項目１に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目４）
項目１に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号２を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目５）
項目１に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号３を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目６）
項目５に記載のオリゴヌクレオチドであって、検出可能な標識を５’末端および／または３’末端にさらに含む、オリゴヌクレオチド。
（項目７）
項目６に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識である、オリゴヌクレオチド。
（項目８）
Ａ型肝炎ウイルス核酸を増幅するための２種のプライマーの組であって、該プライマーの組は、配列番号１からなるプライマーおよび配列番号２からなるプライマーからなる、組。
（項目９）
生物学的サンプル中のＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）を検出する方法であって、該方法は、
ＨＡＶを含むことが疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程；
該ＨＡＶのゲノムの５’ ＵＴＲに由来する少なくとも２種のプライマーを使用して、該単離された核酸を増幅する工程であって、該プライマーの各々は、長さが１０ヌクレオチド〜６０ヌクレオチドであり、かつ該プライマーの各々は、それぞれ、該単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程；および
該増幅された核酸の存在を、該サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程；
を包含する、方法。
（項目１０）
項目９に記載の方法であって、
（ａ）前記プライマーのうちの一方は、配列番号１からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつもう一方のプライマーは、配列番号２からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、または
（ｂ）前記プライマーは、（ａ）のヌクレオチド配列と９０％配列同一性を有し、そして
前記増幅された核酸の存在を、前記サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する、方法。
（項目１１）
項目９に記載の方法であって、前記核酸は、
（ａ）結合している捕捉核酸を含む固体支持体を、標的核酸鎖が該捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で生物学的サンプルと接触させる工程；および
（ｂ）該サンプルから該固体支持体を分離する工程；
を包含する方法によって、前記生物学的サンプルから単離される、方法。
（項目１２）
項目１１に記載の方法であって、前記固体支持体は、ビーズを含む、方法。
（項目１３）
項目１２に記載の方法であって、前記ビーズは、磁気ビーズである、方法。
（項目１４）
項目１３に記載の方法であって、前記単離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施される、方法。
（項目１５）
項目１１に記載の方法であって、前記捕捉核酸は、１種以上のオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつ該オリゴヌクレオチドの各々は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群より選択される配列からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、方法。
（項目１６）
項目１５に記載の方法であって、前記捕捉核酸は、３’末端または５’末端のいずれかに、長さが約１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドのホモポリマー鎖をさらに含み、該ホモポリマー鎖は、ポリＡ、ポリＴ、ポリＧ、ポリＣおよびポリＵからなる群より選択される、方法。
（項目１７）
項目１６に記載の方法であって、前記ホモポリマー鎖は、ポリＡ鎖である、方法。
（項目１８）
項目９に記載の方法であって、前記増幅する工程は、ＰＣＲ、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）またはＴａｑＭａｎを含む、方法。
（項目１９）
項目１８に記載の方法であって、前記増幅する工程は、ＴＭＡを含む、方法。
（項目２０）
項目１８に記載の方法であって、検出可能な標識を含むプローブオリゴヌクレオチドを、前記増幅された配列を検出するために使用する工程をさらに包含し、ここで、該プローブオリゴヌクレオチドは、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつ該プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号３を含む少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、方法。
（項目２１）
項目２０に記載の方法であって、前記プローブは、検出可能な標識を５’末端および３’末端に含む、方法。
（項目２２）
項目２１に記載の方法であって、前記検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識である、方法。
（項目２３）
生物学的サンプルにおけるＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）感染を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）固体支持体を、１種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸と、該捕捉核酸が該固体支持体と結合する条件下で接触させる工程であって、該１種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群より選択される配列を含む、工程；
（ｂ）（ａ）の固体支持体を、該生物学的サンプルと、ＨＡＶ由来の標的核酸鎖が存在する場合には該標的核酸鎖が該捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で接触させる工程；および
（ｃ）該サンプルから（ｂ）の固体支持体を分離する工程；
（ｄ）配列番号１を含むセンスプライマーと配列番号２を含むアンチセンスプライマーとを使用して該核酸を増幅する工程であって、該センスプライマーおよび該アンチセンスプライマーは、それぞれ、該単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程；ならびに
（ｅ）該増幅された核酸の存在を、該サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程；
を包含する、方法。
（項目２４）
項目２３に記載の方法であって、前記固体支持体は、ビーズを含む、方法。
（項目２５）
項目２４に記載の方法であって、前記ビーズは、磁気ビーズである、方法。
（項目２６）
項目２５に記載の方法であって、前記単離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施される、方法。
（項目２７）
生物学的サンプルにおけるＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）感染を検出するためのキットであって、該キットは、
１種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸であって、該オリゴヌクレオチドの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつ該オリゴヌクレオチドの各々は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群より選択される配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、捕捉核酸；
少なくとも２種のプライマーであって、該プライマーの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、一方のプライマーは、配列番号１からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、もう一方のプライマーは、配列番号２からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、プライマー；および
ＨＡＶ感染を同定するための指示書
を備える、キット。
（項目２８）
項目２７に記載のキットであって、ポリメラーゼと緩衝液とをさらに備える、キット。
（項目２９）
項目２７に記載のキットであって、プローブオリゴヌクレオチドをさらに備え、該プローブオリゴヌクレオチドは、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつ配列番号３を含む少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、キット。
（項目３０）
項目２９に記載のキットであって、前記プローブは、検出可能な標識を５’末端および３’末端にさらに含む、キット。
（項目３１）
項目３０に記載のキットであって、前記検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識である、キット。
【００２９】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかになる。さらに、特定の手順または組成物をより詳細に記載する種々の参考文献が、本明細書中に示される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１Ａ〜図１Ｂ（配列番号１および配列番号２）は、単離されたＨＡＶ核酸の増幅における使用のための例示的プライマーを示す。
【図２】図２（配列番号３）は、ＨＡＶの存在を示す増幅された標的オリゴヌクレオチドの存在を検出する際に使用するためのプローブを示し、Ｘは、６−ＦＡＭ（フルオレセイン）であり、Ｚは、リンカー＋ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）である。
【図３】図３Ａ〜図３Ｆ（配列番号１０〜配列番号１５）は、生物学的サンプルからＨＡＶ核酸を単離するための例示的捕捉オリゴヌクレオチドを示す。
【図４】図４Ａは、ＨＡＶ野生型標的配列（配列番号１６）を示す。図４Ｂ（配列番号１７）は、標的の捕捉および増幅についてのコントロールとして使用するための例示的内部コントロール配列を示す。太字の塩基は、この内部コントロール配列中で置換されている野生型の配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他のように示されない限り、当業者の範囲内にある従来の化学、生化学、組換えＤＮＡ技術およびウイルス学の方法を使用する。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，現行版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかにそうでないように示さない限り、複数の言及物を包含することが、留意されなければならない。従って、例えば、「オリゴヌクレオチド（ａｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」に対する言及は、２つ以上のオリゴヌクレオチドの混合物を包含するなどである。
【００３２】
以下のアミノ酸略語が、文中全体にわたって使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ） アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アルパラギン：Ａｓｎ（Ｎ） アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ） グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ） グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ） イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ） リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ） フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ） セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ） トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ） バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。
【００３３】
（Ｉ．定義）
本発明を記載する際に、以下の用語が使用され、この以下の用語は、下記に示されるように定義されることが意図される。
【００３４】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを指し、そしてこれは、その最小の長さの生成物には限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどが、この定義内に包含される。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方が、この定義により包含される。これらの用語はまた、そのポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を包含する。さらに、本発明のために、「ポリペプチド」は、ネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的には性質が保存的である）を含むタンパク質を、そのタンパク質が望ましい活性を維持する限り、指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介してのように、意図的であってもよいし、または例えば、そのタンパク質を生成する宿主の変異またはＰＣＲ増幅に起因するエラーを介して、偶発的であってもよい。
【００３５】
「単離された」によって、ポリペプチドを指す場合、その示される分子は、その分離が天然で見出される生物全体から分離されて別個であること、または同じ型の他の生物学的高分子が実質的に存在しないことが、意味される。ポリヌクレオチドに関する用語「単離された」とは、天然で通常会合する配列を全体的にかまたは部分的に欠いている核酸分子；または天然で存在する通りに存在するが、会合した異種配列を有する、配列；またはその染色体から解離されている分子である。
【００３６】
指定される配列「に由来する」ポリヌクレオチド、または指定される配列「に特異的である」ポリヌクレオチドとは、指定されるヌクレオチド配列の一領域に対応する（すなわち、同一であるかまたは相補的である）少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、そしてなおより好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの連続配列を含む、ポリヌクレオチド配列を指す。その由来するポリヌクレオチドは、目的とするヌクレオチド配列から必ずしも物理的に誘導されるわけではなく、任意の様式（化学合成、複製、逆転写または転写が挙げられるが、これらに限定されない）で、そのポリヌクレオチドが由来する領域中の塩基配列により提供される情報に基づいて生成され得る。従って、その由来するポリヌクレオチドは、元のポリヌクレオチドのセンス方向またはアンチセンス方向のいずれかを示し得る。
【００３７】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分の間の類似性パーセントを指す。２つの核酸配列または２つのポリペプチド配列は、それらの配列が、その分子の規定された長さにわたって少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５〜９８％の配列類似性を示す場合に、互いに対して「実質的に相同である」。本明細書中で使用される場合、実質的に相同性とは、特定の核酸配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列もまた指す。
【００３８】
一般的に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれ、正確なヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとの一致を指す。同一性パーセントは、それらの２つの配列を整列し、整列した２つの配列間の一致の正確な数を計数し、短い方の配列の長さで除算し、その結果に１００を乗算することによって、２つの分子間の配列情報を直接比較することによって、決定され得る。
【００３９】
容易に利用可能なコンピュータープログラムは、相同性および同一性の分析を補助するために使用され得る。例えば、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣは、ペプチド分析のために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９，１９８１の局所相同性アルゴリズムを適合する。ヌクレオチド配列相同性を決定するためのプログラムが、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）において利用可能であり、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＦＡＳＴＡプログラムおよびＧＡＰプログラムもまた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに依存する。これらのプログラムは、製造業者によって推奨されそして上記で言及されるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅにおいて記載される、デフォルトパラメーターを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の相同性パーセントは、デフォルトスコアリングテーブルおよび６ヌクレオチド位置のギャップペナルティを用いてＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して、決定され得る。
【００４０】
本発明の状況において相同性パーセントを確立する別の方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発されてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により頒布されている、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有するＭＰＳＲＣＨパッケージのプログラムを使用することである。この組のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが、使用され得、デフォルトパラメーターは、スコアリングテーブル（例えば、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップエクステンションペナルティ１、およびギャップ６）について使用される。生じたデータから、「Ｍａｔｃｈ」値が「配列相同性」を反映する。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを計算するための他の適切なプログラムは、当該分野で一般的に公知であり、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを使用して使用され得る：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし：鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０、Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＵＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｕｉｏｎｓ＝５０配列；分別＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴにおいて見出され得る。
【００４１】
あるいは、相同性は、相同領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、そして消化されたフラグメントのサイズ決定によって、決定され得る。実質的に相同である核酸配列は、例えば、その特定の系について規定されたストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において、同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当業者の範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（前出）を参照のこと。
【００４２】
「組換え」とは、核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、その起源または操作によって、天然で会合するポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合していない、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。用語「組換え」とは、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されたポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子は、下記にさらに記載されるように、クローン化され、その後、形質転換生物中で発現される。その宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現して、そのタンパク質を生成する。
【００４３】
「制御エレメント」とは、それが連結しているヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を補助するポリヌクレオチド配列を指す。この用語は、宿主細胞においてコード配列の転写および翻訳を集合的に提供する、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む）、そして適切な場合には、リーダー配列およびエンハンサーを包含する。
【００４４】
「プロモーター」とは、本明細書中で使用される場合、ポリメラーゼに結合可能であり、かつそのプロモーターに作動可能に連結している下流（３’方向の）ヌクレオチド配列の転写を開始可能である、調節領域である。本発明のために、プロモーター配列は、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで目的の配列の転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを包含する。そのプロモーター配列の中には、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼもしくはＤＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。例えば、プロモーターは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）によってその核酸に結合して特定の部位でＲＮＡの転写を開始するためのシグナルとして認識される核酸配列であり得る。結合のために、そのような転写酵素は、一般的には、そのプロモーター配列とその相補体とを含む部分で二本鎖であるＤＮＡを必要とする。そのテンプレート部分（転写されるべき配列）は、二本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写を促進する際にその効率が顕著に変化し得る種々の異なるプロモーター配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合して転写を開始する場合、そのプロモーター配列は、転写される配列の一部ではない。従って、それにより生成されたＲＮＡ転写物は、その配列を含まない。
【００４５】
制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼがそのプロモーター配列に結合して隣接配列を転写する場合に、ヌクレオチド配列の「転写を指向する」。
【００４６】
「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩおよびバクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼである。すべての公知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開始するためには相補的プライマーを必要とする。適切な条件下では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成し得る。
【００４７】
「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「転写酵素」は、（通常は二本鎖である）プロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子または部分的に二本鎖のＤＮＡ分子から、複数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。このＲＮＡ分子（「転写物」）は、そのプロモーターのすぐ下流の特定の位置で始まって、５’→３’方向で合成される。転写酵素の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリラーゼ、ならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６である。
【００４８】
「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」は、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。すべての公知の逆転写酵素はまた、ＤＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを生成する能力も有する。従って、これらは、ＲＮＡ依存性およびＤＮＡ依存性の両方のＤＮＡポリメラーゼである。ＲＮＡテンプレートおよびＤＮＡテンプレートの両方を用いて合成を開始するためには、プライマーが必要とされる。
【００４９】
「ＲＮＡｓｅＨ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解する酵素である。これらの酵素は、エンドヌクレアーゼであっても、エキソヌクレアーゼであってもよい。ほとんどの逆転写酵素は、通常は、そのポリメラーゼ活性に加えて、ＲＮＡｓｅＨ活性を含む。しかし、そのＲＮＡｓｅＨの他の供給源は、ポリメラーゼ活性を付随することなく利用可能である。その分解は、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からのＲＮＡの分離をもたらしうる。あるいは、そのＲＮＡｓｅＨは、そのＲＮＡの一部が融解するように種々の位置でそのＲＮＡを単に切断し得るか、または酵素がそのＲＮＡの一部をほぐすのを許容する。
【００５０】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」とは、任意の長さのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドのポリマー形態を包含するために本明細書中で使用される。この用語は、その分子の一次構造のみを指す。従って、この用語は、三本鎖ＤＮＡ，二本鎖ＤＮＡ、および一本鎖ＤＮＡ、ならびに三本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖ＲＮＡを包含する。この用語はまた、改変体（例えば、メチル化および／またはキャップ化による）、ならびに非改変形態のポリヌクレオチドを包含する。より具体的には、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」とは、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリン塩基もしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドもしくはＣ−グリコシドである他の任意の型のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー（例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））ポリマーおよびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＯｒｅｇｏｎからＮｅｕｇｅｎｅとして市販される）ポリマー、ならびにそのポリマーが塩基対形成および塩基スタッキング（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるような）を可能にする構成で核酸塩基を含む場合に、他の配列特異的核酸ポリマーを包含する。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」の間で意図される長さの区別は存在せず、これらの用語は、互換可能に使用される。これらの用語は、その分子の一次構造のみを指す。従って、これらの用語は、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホロアミデート、２’−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ，二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ならびにＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間のハイブリッドを包含し、そしてまた、既知の型の改変（例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上をアナログで置換すること、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、負荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有する改変、および正荷電結合（例えば、アミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）を有する改変、ペンダント部分（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む））を含む改変、インターカレーター（例えば、空くチジン、ソラレンなど）を含む改変、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変結合（例えば、αアノマー核酸など）を含む改変、ならびに非改変形態のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド）を包含する。特に、ＤＮＡは、デオキシリボ核酸である。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「標的核酸領域」または「標的核酸」とは、増幅されるべき「標的配列」を有する核酸分子を意味する。この標的核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、そしてその標的配列のほかに他の配列（これは、増幅されないかもしれない）を含み得る。用語「標的配列」とは、標的核酸中の増幅されるべき特定のヌクレオチド配列を指す。その標的配列は、プローブが望ましい条件下で安定なハイブリッドを形成する標的分子中に含まれる、プローブハイブリダイズ領域を含み得る。その「標的配列」はまた、そのオリゴヌクレオチドプライマーが複合体形成し、その標的配列をテンプレートとして使用して伸長される、複合体形成配列を含み得る。その標的核酸がもともの一本鎖である場合、用語「標的配列」はまた、その標的核酸中に存在するような「標的配列」と相補的な配列を指す。その「標的核酸」がもともと二本鎖である場合、用語「標的配列」とは、プラス（＋）鎖およびマイナス（−）鎖の両方を指す。
【００５２】
用語「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」とは、本明細書中で使用される場合、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドと重合誘導剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ）の存在下かつ適切な温度、ｐＨ、金属濃度、および塩濃度）に配置された場合に、相補的核酸鎖の合成を開始するように作用するオリゴヌクレオチドを指す。そのプライマーは、好ましくは、最大の増幅効率のためには一本鎖であるが、あるいは、二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、そのプライマーは、まず、伸長産物を調製するために使用される前に、その鎖を分離するように処理される。この変性工程は、代表的には、熱によって行われるが、あるいは、アルカリとその後の中和によって実行され得る。従って、「プライマー」は、テンプレートと相補的であり、そしてそのテンプレートとの水素結合またはハイブリダイゼーションによって複合体形成して、ポリメラーゼによる合成開始のためのプライマー／テンプレート複合体を生じる。この複合体は、その３’末端に結合したテンプレートと相補的な共有結合塩基をＤＮＡ合成プロセスにおいて添加することによって、伸長される。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」とは、上記で定義されるような、ポリヌクレオチドから構成される構造体であって、その構造は、標的核酸分析物中に存在する核酸配列と相補的な核酸配列を含む、構造体を指す。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、および／または合成ヌクレオチドアナログから構成され得る。「オリゴヌクレオチドプローブ」が、５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎＴＭ技術）において使用される場合、そのプローブは、少なくとも１つの蛍光剤と、少なくとも１つの消光剤とを含み、このプローブは、増幅されたあらゆる標的オリゴヌクレオチド配列を検出するために、その反応において使用されるポリメラーゼの５’エンドヌクレアーゼ活性によって消化される。この状況において、このオリゴヌクレオチドプローブは、その５’末端に近接する十分な数のホスホジエステル結合を有し、その結果、使用される５’→３’ヌクレアーゼ活性は、結合したプローブを効率的に分解してその蛍光剤と消光剤とを分離し得る。オリゴヌクレオチドプローブがこのＴＭＡ技術において使用される場合、そのオリゴヌクレオチドプローブは、下記に記載されるように、適切に標識される。
【００５４】
このハイブリダイズ配列は、安定なハイブリッドを提供するために完全な相補性を有する必要はないことが、認識される。多くの状況において、安定なハイブリッドは、塩基の約１０％未満がミスマッチであり、４つ以上のヌクレオチドからなるループを無視する場合に形成される。従って、本明細書中で使用される場合、用語「相補的」とは、アッセイ条件下で、その「相補体」と安定な複合体を形成するオリゴヌクレオチドを、一般的には、約９０％以上の相同性が存在する場合に、指す。
【００５５】
用語「ハイブリダイズする」および「ハイブリダイゼーション」とは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を介して複合体を形成するために十分に相補的であるヌクレオチド配列間での複合体の形成を指す。プライマーが標的（テンプレート）と「ハイブリダイズ」する場合、そのような複合体（またはハイブリッド）は、例えば、ＤＮＡ合成を開始するためにＤＮＡポリメラーゼによって必要とされるプライミング機能を保存するために十分に安定である。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「結合対」とは、互いに特異的に結合する第１分子および第２分子（例えば、核酸二重鎖を形成可能な相補的ポリヌクレオチド対）を指す。サンプル中におけるその結合対の第１メンバーと、その結合対の第２メンバーとの「特異的結合」は、そのサンプル中の他の成分に対するよりも高い親和性および特異性で、その第１メンバーと第２メンバーとが結合すること（またはその逆）によって、示される。その結合対のメンバー間の結合は、代表的には、非共有結合性である。文脈が明らかに他のように示さない限り、用語「親和性分子」および「標的分析物」とは、本明細書中で、それぞれ、結合対の第１メンバーおよび第２メンバーを指すために使用される。
【００５７】
用語「特異的結合分子」および「親和性分子」とは、本明細書中で互換可能に使用され、そしてこれらは、サンプル中に存在する検出可能な物質と、化学的手段または物理的手段を介して選択的に結合する分子を指す。「選択的に結合する」によって、その分子は、目的とする標的に対して優先的に結合するか、または他の分子に対してよりも標的に対して高い親和性で結合することが、意味される。例えば、核酸分子は、実質的に相補的な配列に結合し、関連しない配列には結合しない。
【００５８】
二本鎖核酸分子の「融解温度」または「Ｔｍ」とは、その核酸の螺旋構造の半分が、加熱、または例えば、酸処理もしくはアルカリ処理などによる塩基対間の水素結合の他の解離が原因で失われる温度として、規定される。核酸分子のＴｍは、その長さおよびその塩基組成に依存する。ＧＣ塩基対がリッチな核酸分子は、豊富なＡＴ塩基対を有する核酸分子よりも高いＴｍを有する。核酸の分離した相補鎖は、その温度がそのＴｍよりも下に低下すると、自然に再会合またはアニールして、二重鎖核酸を形成する。最も速い核酸ハイブリダイゼーション速度は、そのＴｍより約２５℃低い温度で生じる。そのＴｍは、以下の関係：Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（ＧＣ）％（Ｍａｒｍｕｒら（１９６２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０９〜１１８）を使用して、推定され得る。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」とは、被験体により生成される抗体を一般的に含め、被験体から単離された組織サンプルまたは流体サンプルを指す。代表的なサンプルとしては、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚分泌物、気道、腸管および泌尿器管、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検、そしてまたインビトロ細胞培養成分のサンプル（培養培地中での細胞増殖ならびに組織増殖から生じる馴化培地（例えば、組換え細胞および細胞成分）が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい生物学的サンプルは、血液、血漿および血清である。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出可能な分子を指し、これには、放射性同位体、蛍光剤、化学発光体、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、またはハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光剤」とは、検出可能な範囲の蛍光を示すことが可能な物質またはその物質の一部を指す。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「固体支持体」とは、固体表面（例えば、磁気ビーズ、ラテックスビーズ、マイクロタイタープレートウェル、ガラスプレート、ナイロン、アガロース、アクリルアミドなど）を指す。
【００６２】
（ＩＩ．発明を実施する形態）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方物にもプロセスパラメーターにも限定されず、従って、当然変化し得ることが、理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記載するためだけのものであり、この用語は、限定することは意図されないこともまた、理解されるべきである。
【００６３】
本明細書中に記載される組成物および方法と類似するかまたは等価である複数の組成および方法が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書中に記載される。
【００６４】
上記のように、本発明は、生物学的サンプルにおいてＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）感染を正確に検出するための新規な診断方法の開発に基づく。その方法は、少量のウイルスを含むサンプルにおけるＨＡＶ標的核酸配列の同定を可能にする感度の高い核酸ベースの検出技術に依存する。具体的には、本発明者は、本明細書中において、ＨＡＶゲノムの５’ ＵＴＲ由来の配列を使用して、生物学的サンプルにおけるＨＡＶの迅速かつ感度の高い検出を提供することを発見した。ＨＡＶゲノムの配列（５’ ＵＴＲを含む）は、複数のＨＡＶ単離株において公知である。例えば、ＮＣＢＩ登録番号Ｋ０２９９０；ＡＢ０２０５６４；ＡＢ０２０５６５；ＡＢ０２０５６６；ＡＢ０２０５６７；ＡＢ０２０５６８；ＡＢ０２０５６９；ＡＦ２６８３９６；Ｍ１６６３２；Ｍ１４７０７；Ｍ２０２７３；ＮＣ００１４８９；Ｘ８３３０２；Ｃｏｈｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５０〜５９を参照のこと。種々のＨＡＶ単離株に由来する配列を比較することによって、本発明とともに使用するためのこれらの５’ ＵＴＲ配列および他の５’ ＵＴＲ配列は、容易に同定され得る。簡便のために、本発明とともに使用するためのこの種々の核酸分子は、ＮＣＢＩ登録番号Ｋ０２９９０に対して番号付けされている。その５’ ＵＴＲ配列は、ＮＣＢＩ登録番号Ｋ０２９９０の１〜７２３位に存在する。
【００６５】
本発明のストラテジーにおいて、その標的核酸は、非相同ＤＮＡ／ＲＮＡから分離される。一局面において、その標的核酸は、固体支持体と複合体を形成することによって、分離される。別の局面において、その標的核酸は、固体支持体上に固定された捕捉オリゴヌクレオチドを使用することによって分離され、その捕捉オリゴヌクレオチドは、検出されるべき生物にとって特異的であり得る。その後、分離された標的核酸は、レポーター基でタグ化されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出され得るか、または増幅され得る。ＨＡＶについて、分離された標的核酸は、好ましくは、非翻訳領域（例えば、５’ ＵＴＲ）中でプライマーを使用して増幅される。この領域由来の代表的なプライマーは、配列番号１および配列番号２の配列（図１）を含むプライマーである。
【００６６】
本発明の一局面において、標的核酸を保有する可能性がある生物学的サンプルは、固体支持体（必要に応じて、捕捉オリゴヌクレオチドを有する）と接触される。その捕捉オリゴヌクレオチドは、その固体支持体と、例えば、その固体支持体に対するプローブ部分の共有結合によって、親和性結合によって、水素結合によって、または非特異的結合によって、結合され得る。
【００６７】
その捕捉オリゴヌクレオチドは、目的の領域からの約５〜約５００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約１００ヌクレオチド、またはより好ましくは約１０〜約６０ヌクレオチド、またはこれらの範囲中の任意の整数個のヌクレオチド（例えば、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド．．．３５ヌクレオチド．．．４０ヌクレオチドなどを含む配列）を含み得る。代表的な捕捉オリゴヌクレオチドは、ＨＡＶ単離株の５’ ＵＴＲ配列（例えば、本明細書中図３Ａ〜３Ｆ（配列番号１０〜１５）に示される配列）から誘導される。
【００６８】
その捕捉オリゴヌクレオチドは、種々の様式で固体支持体に付着され得る。例えば、そのオリゴヌクレオチドは、その固体支持体に捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドを付着することによって、固体支持体に付着され得る。より好ましくは、その捕捉オリゴヌクレオチドは、その固体支持体からプローブを離すように作用するリンカーによって、固体支持体に付着される。そのリンカーは、通常は、長さが少なくとも１０〜５０原子であり、より好ましくは、長さが少なくとも１５〜３０原子である。そのリンカーに必要な長さは、使用される特定の固体支持体に依存する。例えば、６原子リンカーが、高架橋ポリスチレンが固体支持体として使用される場合に、一般的に十分である。
【００６９】
固体支持体に捕捉オリゴヌクレオチドを付着するために使用され得る広範な種類のリンカーが、当該分野で公知である。このリンカーは、固体支持体に付着された捕捉オリゴヌクレオチドに対する標的配列のハイブリダイゼーションを有意には妨げない、任意の化合物から形成され得る。このリンカーは、自動合成によりそのリンカー上に容易に付加され得る、ホモポリマーオリゴヌクレオチドから形成され得る。そのホモポリマー配列は、ウイルス特異的配列に対して５’側または３’側のいずれかであり得る。本発明の一局面において、その捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体への付着を容易にするために、ホモポリマー鎖（例えば、ポリＡ、ポリＴ、ポリＧ、ポリＣ、ポリＵ、ポリｄＡ、ポリｄＴ、ポリｄＧ、ポリｄＣまたはポリｄＵ）に連結され得る。そのホモポリマー鎖は、長さが約１０〜約４０ヌクレオチドであり得、または好ましくは、長さが約１２〜約２５ヌクレオチドであり得、またはこれらの範囲中の任意の整数個のヌクレオチド（例えば、１０ヌクレオチド．．．１２ヌクレオチド．．．１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、または２４ヌクレオチド）であり得る。
【００７０】
代表的なホモポリマー配列としては、ポリＴ配列またはポリＡ配列が挙げられる。あるいは、官能化ポリエチレングリコールのようなポリマーが、リンカーとして使用され得る。そのようなポリマーは、標的オリゴヌクレオチドに対するプローブのハイブリダイゼーションを有意には妨げない。結合の例としては、ポリエチレングリコール結合、カルバメート結合、およびアミド結合が挙げられる。固体支持体と、リンカーと、捕捉オリゴヌクレオチドとの間の結合は、好ましくは、高温度で塩基性条件下で塩基保護基を除去する間には切断されない。
【００７１】
この捕捉オリゴヌクレオチドはまた、その捕捉オリゴヌクレオチドの伸長を妨げるために、３’末端でリン酸化され得る。
【００７２】
この固体支持体は、多くの形態を採り得、この形態としては、例えば、粒子形態に還元されており、この支持体を含むサンプル媒体を篩に通すと回収可能なニトロセルロース；磁場を適用した際にサンプル媒体内をニトロセルロースが移動するのを可能にする、磁気粒子などが含浸されたニトロセルロースまたは物質；濾過され得るかまたは電磁特性を示し得る、ビーズまたは粒子；水性媒体の表面に分配するポリスチレンビーズ；ならびに磁性シリカが挙げられる。捕捉オリゴヌクレオチドの固定のための固体支持体の好ましい型の例としては、制御孔ガラス、ガラスプレート、ポリスチレン、アビジンコートポリスチレンビーズ、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル、および活性化デキストランが挙げられる。
【００７３】
本発明の一局面は、磁気シリカまたは磁気ビーズを含む固体支持体を包含し、必要に応じて、この磁気シリカまたは磁気ビーズは、捕捉オリゴヌクレオチドが磁気支持体粒子に共有結合または結合するのを容易にする一級アミン官能基を含む。あるいは、その磁気シリカまたは磁気ビーズは、それらに固定されたホモポリマー（例えば、ポリＴ配列またはポリＡ配列）を有する。磁気シリカまたは磁気ビーズを備える固体支持体を使用することによって、単離、増幅、および検出をワンポットで行う方法が可能になる。なぜなら、この固体支持体は、磁気手段によって生物学的サンプルから分離され得るからである。
【００７４】
この磁気ビーズまたは磁気粒子は、標準的技術を使用して生成され得るか、または商業的供給源から得られ得る。一般に、この粒子またはビーズは、磁気ビーズから構成され得るが、これらはまた、反応性表面を有して磁場と反応する能力を示す限り、他の磁性金属または金属酸化物（不純形態であっても、合金形態であっても、複合体形態であってもよい）であってもよい。個別にかまたは鉄と組み合わせて使用され得る他の物質としては、コバルト、ニッケル、およびケイ素が挙げられるが、これらに限定されない。本発明における適用のために適切な磁気ビーズとしては、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ，ＩＮによって商標名Ｓｅｒａ−ＭａｇＴＭ磁気オリゴヌクレオチドビーズとして販売されている、ポリｄＴ基含有磁気ビーズが挙げられる。本発明における適用のために適切な磁気シリカとしては、Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによってＭａｇＰｒｅｐＴＭ磁気シリカが挙げられる。
【００７５】
次に、捕捉オリゴヌクレオチドと固体支持体との結合は、その捕捉オリゴヌクレオチドを含む媒体と、その固体支持体とを接触することによって、開始される。一局面において、ポリｄＴ基含有磁気ビーズが、ＨＡＶゲノムの保存一本鎖領域から選択される配列と連続してポリｄＡを含む標的配列と、ハイブリダイズされる。この捕捉オリゴヌクレオチド上のポリｄＡと、固体支持体上のポリｄＴとが、ハイブリダイズし、それにより、この捕捉オリゴヌクレオチドが固体支持体に固定または結合する。別の局面において、この磁気ビーズは、２００２年１０月９日出願の同一人に譲渡された係属中の米国特許出願番号１０／２６７，９２２において開示されるヌクレオチド配列に由来する、約１０〜約７５ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約２５ヌクレオチドのその表面ヌクレオチド配列上に、固定されている。
【００７６】
この固体支持体は、高いカオトロピック塩濃度下またはハイブリダイゼーション条件下で、生物学的サンプルと接触される。この捕捉オリゴヌクレオチドは、生物学的サンプル中に存在する標的鎖とハイブリダイズする。代表的には、標的に対する捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、約１５分間以内に達成され得るが、３〜４８時間かかり得る。
【００７７】
別の局面において、シリカ磁気粒子が、複合体の形成を促進するように設計された条件下で、標的物質を含む媒体に曝露される。この複合体は、より好ましくは、シリカ磁気粒子と、上記媒体と、カオトロピック塩との混合物中で形成される。
【００７８】
カオトロピック塩は、水性溶液中で非常に可溶性であるカオトロピックイオンの塩である。そのような塩によって提供されるカオトロピックイオンは、タンパク質水溶液または核酸水溶液中で十分に高濃度である場合には、タンパク質をアンフォールディングさせるか、核酸の二次構造を失わせるか、または二本鎖核酸の場合には融解させる。カオトロピックイオンは、液体の水中に存在する水素結合ネットワークを破壊することによって、正確にフォールディングまたは構成されたタンパク質および核酸よりも、変性タンパク質および変性核酸を熱力学的に安定にするので、これらの効果を有すると考えられる。代表的なカオトロピックイオンとしては、グアニジニウムイオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、およびトリクロロ酢酸イオンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において好ましいのは、グアニジニウムイオンである。カオトロピック塩としては、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、およびトリクロロ酢酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいのは、上記のグアニジニウム塩であり、特に好ましいのは、チオシアン酸グアニジンである。
【００７９】
本方法の実施において使用するためのカオトロピックイオンの濃度は、好ましくは、約０．１Ｍと７Ｍとの間であり、より好ましくは、約０．５Ｍと５Ｍとの間である。この混合物中のカオトロピックイオンの濃度は、生物学的標的物質を混合物中のシリカ磁気粒子に接着させるに十分に高くなければならないが、標的物質を実質的に変性させたり、分解したり、または混合物から沈殿させたりする程には高くない。タンパク質、および大きな二本鎖核酸分子（例えば、ウイルス核酸）は、０．５Ｍと２Ｍとの間のカオトロピック塩濃度で安定であるが、約２Ｍよりも高いカオトロピック塩濃度で溶液から沈殿することが公知である。
【００８０】
本発明の一局面において、上記のように形成された複合体は、上記の核酸物質のうちの少なくともいくらかが、上記シリカ磁気粒子に接着されて、複合体を形成するまでインキュベートされる。このインキュベーション工程は、少なくとも約０℃、好ましくは少なくとも約４℃、より好ましくは少なくとも約２０℃の温度にて実行され、但し、そのインキュベーション温度は、約７５℃以下である。従って、０℃〜７５℃、好ましくは４℃〜５０℃、最も好ましくは約１５℃〜約３５℃の範囲の温度、またはこれらの範囲内の任意の整数値の温度が、本明細書中での用途を見出す。このインキュベーション工程は、好ましくは、シリカ磁気粒子が上記核酸物質に可逆的に結合する能力を失いはじめる温度よりも低い温度で実行され、室温程度（すなわち、約２５℃）で実行され得る。
【００８１】
その後、固体支持体は、濾過によって、カラムに通すことによって、または磁気的手段によって、生物学的サンプルから分離される。当業者によって認識されるように、分離方法は、選択される固体支持体の型に依存する。標的は、固体支持体上に固定された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするので、その標的鎖は、それによってサンプル中の不純物から分離される。いくつかの場合、外来の核酸、タンパク質、糖質、脂質、細胞破片、および他の不純物が、生物学的サンプル中でこれらが最初に見出されたよりもかなり低い濃度であっても、なおこの支持体に結合し得る。当業者は、いくつかの望ましくない物質が、洗浄媒体でその支持体を洗浄することによって除去され得ることを認識する。生物学的サンプルからその固体支持体を分離すると、好ましくは、サンプル中に存在する非標的核酸のうちの少なくとも約７０％、より好ましくは約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％を除去する。
【００８２】
本発明の方法はまた、捕捉された標的オリゴヌクレオチドを増幅して、増幅された核酸を生成する工程も包含する。標的核酸を増幅する工程は、核酸ポリメラーゼを使用して、複数コピーのその標的オリゴヌクレオチドまたはそのフラグメントを生成する。適切な増幅技術は、当該分野で周知であり、例えば、転写関連増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、レプリカーゼ媒介性増幅、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）である。
【００８３】
本発明のアッセイとともに使用するためのプライマーは、好ましくは、存在が検出されるべき生物にとって独特である。従って、ＨＡＶの検出のために、そのプライマーは、ＨＡＶの非翻訳領域中の保存領域（例えば、図１において示される領域）から誘導される。
【００８４】
このアッセイにおいて使用するためのプライマーおよび捕捉オリゴヌクレオチドは、標準的技術によって容易に合成される。この標準的技術は、例えば、米国特許第４，４５８，０６６号および同第４，４１５，７３２号；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３〜２３１１；およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１３（１ Ａｐｒｉｌ １９８７）に開示されるような、ホスホロアミダイト化学を介する固相合成である。他の化学合成方法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：９０により記載されるホスホトリエステル方法、およびＢｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：１０９により開示されるホスホジエステル方法が挙げられる。ポリ（Ａ）もしくはポリ（Ｃ）または他の非相補的ヌクレオチド伸長物が、これらの同じ方法を使用して、プローブ中に組み込まれ得る。ヘキサエチレンオキシド伸長物が、当該分野で公知の方法によって、プローブに結合され得る。Ｃｌｏａｄら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６３２４〜６３２６；Ｌｅｖｅｎｓｏｎらに対する米国特許第４，９１４，２１０号；Ｄｕｒａｎｄら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６３５３〜６３５９；およびＨｏｒｎら（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４７０５〜４７０８。代表的には、そのプライマー配列は、長さが１０〜７５ヌクレオチド間（例えば、１５〜６０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチドなど）であり、より代表的には、１８〜４０ヌクレオチド長の間であり、言及した範囲の間の任意の長さである。代表的なプローブは、１０〜５０ヌクレオチド長の間（例えば、１５〜４０ヌクレオチド長、１８〜３０ヌクレオチド長など）、および言及した範囲の間の任意の長さの範囲にある。
【００８５】
さらに、このプローブは、検出用標識に結合され得る。標識の付加を可能にする反応性官能基を用いてオリゴヌクレオチドを誘導体化するために、いくつかの手段が公知である。例えば、いくつかのアプローチが、プローブをビオチン化して、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、または電子密度標識をアビジンを介して結合し得るようにするために利用可能である。例えば、Ｂｒｏｋｅｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９７８）５：３６３〜３８４（これは、フェリチン−アビジン−ビオチン標識の使用を開示する）およびＣｈｏｌｌｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８５）１３：１５２９〜１５４１（これは、アミノアルキルホスホルアミドリンカーアームを介してオリゴヌクレオチドの５’末端をビオチン化することを開示する）を参照のこと。いくつかの方法がまた、アミノ反応基（例えば、イソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなど）によって誘導体化された蛍光化合物または他の型の化合物によって容易に標識される、アミノ誘導体化オリゴヌクレオチドを合成するために、利用可能である。例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３１３１〜３１３９、Ｇｉｂｓｏｎら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６４５５〜６４６７およびＭｉｙｏｓｈｉらに対する米国特許第４，６０５，７３５号を参照のこと。チオール特異的標識と反応し得るスルフヒドリル誘導体化オリゴヌクレオチドを合成するための方法もまた、利用可能である。例えば、Ｆｕｎｇらに対する米国特許第４，７５７，１４１号、Ｃｏｎｎｏｌｌｙら（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４８５〜４５０２およびＳｐｏａｔら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４８３７〜４８４８を参照のこと。核酸フラグメントを標識するための方法論の包括的概説が、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１６９：１〜２５において提供される。
【００８６】
例えば、プローブは、そのプローブの非連結末端に蛍光分子を連結することによって、蛍光標識され得る。適切な蛍光標識を選択するための指針は、Ｓｍｉｔｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：２６０〜３０１；Ｋａｒｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：４９５５〜４９６２；Ｈａｕｇｌａｎｄ（１９８９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）において見出され得る。好ましい蛍光標識としては、フルオレセインおよびその誘導体（例えば、米国特許第４，３１８，８４６号およびＬｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ（１９８９）１０：１５１〜１６４に開示される）、ならびに６−ＦＡＭ（フルオレセイン）、ＪＯＥ（２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロフルオレセイン）、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）、ＲＯＸ（ローダミンＸ）、ＨＥＸ−１、ＨＥＸ−２、ＺＯＥ、ＴＥＴ−１またはＮＡＮ−２などが、挙げられる。
【００８７】
さらに、プローブは、下記の技術を使用してアクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識され得る。現在の技術によって、ＡＥ標識をそのプローブ中の任意の位置に配置することが可能である。例えば、Ｎｅｌｓｏｎら（１９９５）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｋｒｉｃｋａ Ｌ．Ｊ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｎｅｌｓｏｎら（１９９４）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＨＰＡ） ｔｏ ＰＣＲ」Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｗｅｅｋｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２９：１４７４〜１４７９；Ｂｅｒｒｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）３４：２０８７〜２０９０を参照のこと。ＡＥ分子は、プローブ内の任意の位置に標識を配置することを可能にする非ヌクレオチドベースのリンカーアーム化学を使用して、プローブに直接結合され得る。例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，１８５，４３９号を参照のこと。
【００８８】
特定の実施形態において、内部コントロール（ＩＣ）または内部標準が、標的の捕捉および増幅についてのコントロールとして役立てるために添加される。好ましくは、このＩＣは、標的配列とは異なり、サンプルから生物特異的なオリゴヌクレオチドを分離するために使用されるプローブ配列とハイブリダイズ可能であり、かつ増幅可能である、配列を含む。この内部コントロールの使用によって、分離プロセス、増幅プロセス、および検出系のコントロールが可能になり、そしてサンプルについてのアッセイ性能および定量をモニタリングすることが可能になる。このＩＣは、適切な任意の点（例えば、溶解緩衝液中）に含まれ得る。一実施形態において、このＩＣは、ＨＡＶヌクレオチド配列の一部を含むＲＮＡと、プローブにハイブリダイズする独特な配列とを含む。従って、特定の実施形態において、このＩＣは、５〜３０塩基（例えば、６塩基．．．９塩基．．．１２塩基．．．１５塩基．．．２０塩基など）またはこれより多くの塩基が他の塩基で置換された改変配列を含む、ＨＡＶゲノムの一部を含む。この置換塩基は、２個または３個連続する配列だけが置換されるように、標的配列の全体の長さにわたって位置し得る。ＨＡＶについての代表的ＩＣは、図４Ｂに示され、これは、ＨＡＶゲノムの５’ ＵＴＲに由来する７２１ｂｐを含む。図４Ｂ中の太字の大文字は、野生型配列中に存在する塩基が置換されている、塩基を示す（図４Ａを参照のこと）。このアッセイは、内部標準に特異的なプローブ（ＩＣプローブ）をさらに含み得る。
【００８９】
このＩＣ配列についての代表的なプローブは、実施例において配列番号１８および配列番号１９として詳説される。このＩＣプローブは、必要に応じて、標的配列についての検出可能な標識とは異なる検出可能な標識に結合され得る。この検出可能な標識が発蛍光団である実施形態において、このＩＣは、分光光度法によって、そして検出限界の研究によって、定量され得る。
【００９０】
代表的には、標的検出を妨げないＩＣのコピー数は、そのＩＣを、標的の固定されたＩＵ／コピー／ＰＦＵを用いて力価測定することによって、好ましくは下端で決定される。標準曲線が、国際的に認可されている標準のサンプルを希釈することによって、作成される。
【００９１】
別の実施形態において、本明細書中に記載される通りに、ＩＣは、当業者に公知の標準的技術に従って、サンプルから単離されたＲＮＡと合わされる。その後、このＲＮＡは、ｃＤＮＡを提供するために逆転写酵素を使用して逆転写される。このｃＤＮＡ配列は、標識プライマーを使用して、必要に応じて（例えば、ＰＣＲによって）増幅され得る。この増幅生成物は、代表的には、電気泳動によって分離され、そして組み込まれた標識の量（増幅生成物の量に比例する）が、決定される。その後、サンプル中のｍＲＮＡの量は、既知の標準物によって生成されたシグナルと比較することによって、計算される。
【００９２】
上記のプライマーおよびプローブは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの技術において使用されて、生物学的サンプル中のＨＡＶ感染が検出され得る。ＰＣＲは、核酸分子または分子混合物中に含まれる望ましい標的核酸配列を増幅するための技術である。ＰＣＲにおいて、一対のプライマーが、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズするように過剰に使用される。これらのプライマーは、標的核酸をテンプレートとして使用して、ポリメラーゼによって各々伸長される。この伸長生成物は、元の標的鎖から解離した後に、標的配列自体になる。その後、新しいプライマーが、ハイブリダイズされ、そしてポリメラーゼによって伸長され、このサイクルが反復されて、標的配列分子の数が幾何学的に増加される。サンプル中の標的核酸配列を増幅するためのＰＣＲ方法は、当該分野で周知であり、そしてそれは、例えば、Ｉｎｎｉｓら編、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ １９９０）；Ｔａｙｌｏｒ（１９９１）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ、ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３；ならびに米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８８９，８１８号を参照のこと。
【００９３】
具体的には、ＰＣＲは、増幅されるべき標的ヌクレオチド配列に隣接する比較的短いオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、これらのプライマーは、それらの３’末端が互いに向かい合い、各プライマーがもう一方に向かって延びるような、方向である。このポリヌクレオチドサンプルは、抽出され、好ましくは熱によって変性され、そしてモル過剰量で存在する第１プライマーおよび第２プライマーとハイブリダイズされる。重合は、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ−ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で、プライマー依存性およびテンプレート依存性のポリヌクレオチド重合剤（例えば、プライマー伸長生成物を生成可能な酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）（種々の供給源（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）から入手可能である）、Ｔｈｅｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓから単離されたＤＮＡポリメラーゼ（「Ｖｅｎｔ」ポリメラーゼ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）））を使用して、触媒される。これによって、元の鎖の新しく合成された相補鎖にその５’末端で共有結合している個々のプライマーを含む、２つの「長い生成物」が生じる。その後、この反応混合物は、例えば、温度を低下させること、変性剤を不活化すること、またはより多くのポリメラーゼを添加することによって、重合条件へと戻され、そして第２サイクルが開始される。この第２サイクルは、この２つの元の鎖、第１サイクルからの２つの長い生成物、元の鎖から複製された２つの新しい長い生成物、およびこの長い生成物から複製された２つの「短い生成物」を提供する。この短い生成物は、各端部にプライマーを伴って標的配列の配列を有する。さらなるサイクル各々において、さらに２つの長い生成物が、生成され、そして長い生成物および短い生成物の数と等しい数の短い生成物が、直前のサイクルの最後に残る。従って、標的配列を含む短い生成物の数は、各サイクルとともに対数的に増加する。好ましくは、ＰＣＲは、市販のサーマルサイクラー（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて実行される。
【００９４】
ＲＮＡは、そのｍＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写し、その後、上記のようにＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施することによって、増幅され得る。あるいは、単一の酵素が、米国特許第５，３２２，７７０号に記載されるように、両方の工程のために使用され得る。ｍＲＮＡはまた、ｃＤＮＡへと逆転写され得、その後、Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９９４）ＰＣＲ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐ．４：８０〜８４によって記載されるように、非対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）が実施され得る。
【００９５】
ＴａｑＭａｎＴＭアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）として公知である蛍光発生５’ヌクレアーゼアッセイは、核酸標的についての強力かつ汎用的なＰＣＲベースの検出系である。従って、本明細書中に記載されるＨＡＶゲノムの領域に由来するプライマーおよびプローブは、生物学的サンプル中の感染の存在を検出するために、ＴａｑＭａｎＴＭ分析において使用され得る。分析は、蛍光シグナルの生成をモニタリングすることによって、サーマルサイクリングと組み合わせて実施される。このアッセイ系は、ゲル電気泳動の必要性を省き、そしてこのアッセイ系は、標的コピー数の決定を可能にする定量的データを生成する能力を有する。
【００９６】
蛍光発生５’ヌクレアーゼアッセイは、例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭＤＮＡポリメラーゼ（これは、内因性５’ヌクレアーゼ活性を有する）を使用して、蛍光レポーター色素と消光剤との両方で標識された内部オリゴヌクレオチドプローブを消化することによって、便利に実施される（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：７２７６〜７２８０；およびＬｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９３）２１：３７６１〜３７６６を参照のこと）。アッセイの結果は、増幅サイクルの間に蛍光プローブが消化された時に生じる蛍光の変化を測定すること、その色素標識と消光剤標識とを分離すること、そして標的核酸の増幅に比例する蛍光シグナルの増加を引き起こすことによって、検出される。
【００９７】
この増幅生成物は、溶液中で、または固体支持体を使用して、検出され得る。この方法において、ＴａｑＭａｎＴＭプローブが、望ましいＰＣＲ生成物内の標的配列にハイブリダイズするように消化される。ＴａｑＭａｎＴＭプローブの５’末端は、蛍光レポーター色素を含む。このプローブの３’末端は、プローブ伸長を防ぐようにブロックされ、そしてこの３’末端は、５’発蛍光団の蛍光を消光する色素を含む。その後の増幅の間に、その５’蛍光標識は、５’エキソヌクレア−ゼ活性を有するポリメラーゼがその反応中に存在する場合に、切り離される。その５’発蛍光団が励起すると、検出され得る蛍光の増加をもたらす。
【００９８】
従って、一局面において、本発明は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと、ＨＡＶ標的配列にハイブリダイズ可能な１種以上のプライマーと、そのプライマーに対して３’側でＨＡＶ標的配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブとを使用して、標的ＨＡＶヌクレオチド配列を増幅するための方法に関する。増幅の間に、そのポリメラーゼは、標的配列にハイブリダイズした場合にオリゴヌクレオチドプローブを消化し、それによって、消光剤分子からレポーター分子を分離する。その増幅が実行された場合、レポーター分子の蛍光がモニターされ、その蛍光は、核酸増幅の発生に対応する。そのレポーター分子は、好ましくは、フルオレセイン色素であり、消光剤分子は、好ましくは、ローダミン色素である。
【００９９】
プライマーおよびプローブの長さは変化し得るが、プローブ配列は、それがプライマー配列よりも高い融解温度を有するように、選択される。好ましくは、そのプローブ配列は、増幅プライマー配列についての融解温度よりも約１０℃高い推定融解温度を有する。従って、プライマー配列は、一般的には、プローブ配列よりも短い。代表的には、プライマー配列は、１０〜７５ヌクレオチド長の間の範囲であり、より代表的には、２０〜４５ヌクレオチド長の範囲内にある。代表的なプローブは、１０〜５０ヌクレオチド長の範囲にあり、より代表的には、１５〜４０ヌクレオチド長の範囲内にある。
【０１００】
ＴａｑＭａｎＴＭアッセイの詳細な説明について、そのアッセイにおいて使用するための試薬および条件は、例えば、Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：７２７６〜７２８０；米国特許第５，５３８，８４８号、同第５，７２３，５９１号、および同第５，８７６，９３０号を参照のこと。
【０１０１】
本明細書中に記載されるＨＡＶ配列はまた、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）アッセイのための基礎として使用され得る。ＴＭＡは、生物学的サンプル中に非常に少量で存在する標的核酸配列を同定する方法を提供する。そのような配列は、直接アッセイ方法を使用して検出することが困難または不可能であり得る。具体的には、ＴＭＡは、等温性の自己触媒核酸標的増幅システムであり、標的配列の数十億個より多くのＲＮＡコピーを提供し得る。このアッセイは、定性的に実施されて、生物学的サンプル中の標的配列の存在または非存在を正確に検出し得る。このアッセイはまた、数桁の濃度範囲にわたって標的配列の量の定量的尺度を提供し得る。ＴＭＡは、反応条件（例えば、温度、イオン強度、およびｐＨ）を反復操作することなく、標的核酸配列の複数コピーを自己触媒合成するための方法を提供する。
【０１０２】
一般的に、ＴＭＡは、以下の工程：（ａ）核酸（ＲＮＡが挙げられる）を、ＨＡＶに感染していると疑われる目的の生物学的サンプルから単離する工程；および（ｂ）反応混合物中に、（ｉ）単離された核酸、（ｉｉ）第１オリゴヌクレオチドプライマーおよび第２オリゴヌクレオチドプライマー（この第１プライマーは、ＲＮＡ標的配列（例えば、＋鎖）の３’末端部分が存在する場合にその３’末端部分と複合体形成するに十分に相補的な複合体形成配列を有する。第２プライマーは、その相補鎖（例えば、−鎖）の標的配列の３’末端部分と複合体形成するに十分に相補的な複合体形成配列を有する。この第１オリゴヌクレオチドは、その複合体形成配列の５’側に、プロモーターを含む配列をさらに含む。）、（ｉｉｉ）逆転写酵素またはＲＮＡおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｖ）ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を選択的に分解する酵素活性（例えば、ＲＮＡｓｅＨ）、ならびに（ｖ）上記プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを合わせる工程、を包含する。
【０１０３】
その反応混合物の成分は、段階的にかまたは一度に、合わされ得る。この反応混合物は、オリゴヌクレオチド／標的配列が形成される条件下（核酸プライム条件および核酸合成条件を含む）（リボヌクレオチド三リン酸およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む）で、標的配列の複数コピーを提供するために十分な時間インキュベートされる。その反応は、反応成分（例えば、成分酵素）の安定性を維持するために適切であり、かつ増幅反応の経過の間に反応条件の改変も操作も必要としない、条件下で有利なことに生じる。従って、その反応は、実質的に等温性でありかつ実質的に一定のイオン強度およびｐＨを含む、条件下で生じ得る。この反応は、簡便には、第１ＤＮＡ伸長反応によって生成されるＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を分離するために変性工程を必要としない。
【０１０４】
適切なＤＮＡポリメラーゼとしては、逆転写酵素（例えば、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素（例えば、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．から入手可能である）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能である）が挙げられる。
【０１０５】
これらのプライマー中に組み込むために適切なプロモーターまたはプロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼにより特異的に認識される核酸配列（天然に存在する配列、合成により生成される配列、または制限酵素消化の生成物のいずれか）であり、このＲＮＡポリメラーゼは、その配列を認識し、その配列に結合し、転写プロセスを開始し、それによってＲＮＡ転写物が生成される。この配列は、必要に応じて、このＲＮＡポリメラーゼの実際の認識部位を越えて伸長するヌクレオチド塩基をさらに含み得、このヌクレオチド塩基は、分解プロセスに対する付加された安定性もしくは感受性を、または増加した転写効率を、付与し得る。有用なプロモーターの例としては、特定のバクテリオファージポリメラーゼによって認識されるプロモーター（例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、もしくはＳＰ６に由来するプロモーター）、またはＥ．ｃｏｌｉ由来のプロモーターが挙げられる。これらのＲＮＡポリメラーゼは、商業的供給源（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ）から容易に入手可能である。
【０１０６】
本明細書中の方法において使用するために適切な逆転写酵素のうちのいくつか（例えば、ＡＭＶ逆転写酵素）は、ＲＮＡｓｅＨ活性を有する。しかし、外因性ＲＮＡｓｅＨ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅＨ）を添加することは、ＡＭＶ逆転写酵素を使用する場合でさえも、好ましくあり得る。ＲＮＡｓｅＨは、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから容易に入手可能である。
【０１０７】
これらの方法によって生成されるＲＮＡ転写物は、上記の機構を介して標的配列のさらなるコピーを生成するためのテンプレートとして作用し得る。この系は、自己触媒性であり、反応条件（例えば、温度、ｐＨ、イオン強度など）を反復して改変する必要も変化する必要もなく、増幅が自己触媒的に生じる。
【０１０８】
検出は、広範な種類の方法（直接配列決定、配列特異的オリゴマーとのハイブリダイゼーション、ゲル電気泳動および質量分析法を含む）を使用して、なされ得る。これらの方法は、不均質形式を使用しても、均質形式を使用してもよく、同位体標識を使用しても、非同位体標識を使用しても、標識を使用しなくてもよい。
【０１０９】
ある好ましい検出方法は、上記の標的配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用することである。このプローブは、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）において使用され得る。この実施形態において、このプローブは、アクリジニウムエステル（ＡＥ）（これは、非常に化学発光性の分子である）で簡便に標識される。例えば、Ｎｅｌｓｏｎら（１９９５）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｋｒｉｃｋａ Ｌ．Ｊ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｎｅｌｓｏｎら（１９９４）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＨＰＡ） ｔｏ ＰＣＲ」Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｗｅｅｋｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２９：１４７４〜１４７９；Ｂｅｒｒｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）３４：２０８７〜２０９０を参照のこと。一つのＡＥ分子が、プローブ内の任意の位置に標識を配置することを可能にする非ヌクレオチドベースリンカーアーム化学を使用して、プローブに直接結合される。例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，１８５，４３９号を参照のこと。化学発光は、アルカリ水素ペルオキシドとの反応によって誘発される。アルカリ水素ペルオキシドは、励起したＮ−メチルアクリドンを生じ、このＮ−メチルアクリドンは、その後、光子を放出して基底状態へと低下する。
【０１１０】
このＡＥ分子が核酸プローブに共有結合された場合、加水分解は、穏やかなアルカリ条件下で迅速である。このＡＥ標識プローブが標的核酸と正確に相補的である場合、ＡＥ加水分解の速度は、非常に低下する。従って、ハイブリダイズしたＡＥ標識プローブおよびハイブリダイズしていないＡＥ標識プローブは、物理的に分離する必要なく、溶液中で直接検出され得る。
【０１１１】
ＨＰＡは、一般的には、以下の工程からなる：（ａ）ＡＥ標識プローブを、約１５〜約３０分間、溶液中で標的核酸とハイブリダイズさせる工程。その後、穏やかなアルカリ溶液を添加し、ハイブリダイズしていないプローブに結合したＡＥを加水分解する。この反応は、約５〜１０分間かかる。残っているハイブリッド結合したＡＥを、存在する標的の量の尺度として検出する。この工程は、約２〜５秒間かかる。好ましくは、差次的加水分解工程を、ハイブリダイゼーション工程と同じ温度（代表的には、５０〜７０℃）で行う。あるいは、第２の差次的加水分解工程を、室温で実施し得る。これによって、上昇したｐＨ（例えば、１０〜１１の範囲内にある）を使用することが可能になる。このｐＨは、ハイブリダイズしたＡＥ標識プローブと、ハイブリダイズしていないＡＥ標識プローブとの間で、より大きな加水分解速度差を生じる。ＨＰＡは、例えば、米国特許第６，００４，７４５号；同第５，９４８，８９９号および同第５，２８３，１７４号に詳細に記載される。
【０１１２】
ＴＭＡは、例えば、米国特許第５，３９９，４９１号に詳細に記載される。代表的なアッセイの一例において、単離された核酸サンプル（ＨＡＶ標的配列を含むと疑われる）が、緩衝剤、塩、マグネシウム、ヌクレオチド三リン酸、プライマー、ジチオスレイトール、およびスペルミジンを含む、緩衝剤濃縮物と混合される。この反応物は、必要に応じて、約１００℃で約２分間インキュベートされて、あらゆる二次構造が変性される。室温まで冷却した後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡｓｅＨが添加され、その混合物は、３７℃で２〜４時間インキュベートされる。その後、その反応は、生成物を変性すること、プローブ溶液を添加すること、６０℃で２０分間インキュベートすること、ハイブリダイズしていないプローブを選択的に加水分解するために溶液を添加すること、この反応物を６０℃で６分間インキュベートすること、そしてルミノメーターにおいて残っている化学発光を測定することによって、アッセイされ得る。
【０１１３】
容易に明らかであるように、本明細書中に記載されるアッセイの設計は、多量の変化を受け、多くの形式が、当該分野で公知である。上記の説明は、単に指針として提供されるに過ぎず、当業者は、当該分野で周知の技術を使用して、記載されているプロトコルを容易に改変し得る。
【０１１４】
上記のアッセイ試薬（プライマー、プローブ、結合したプローブを備える固体支持体、および他の検出試薬）は、上記のアッセイを実行するために、適切な指示書および他の必要試薬とともに、キット中で提供され得る。このキットは、通常は、別の容器中に、プライマーとプローブとの組み合わせ（固体支持体にすでに結合しているか、またはマトリックスにこの組み合わせを結合するための試薬と別個であるかのいずれか）、コントロール処方物（ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール）、標識がシグナルを直接発生しない場合にそのアッセイ形式が同じシグナル発生試薬（例えば、酵素基質）を必要とする場合は、標識試薬を含む。このアッセイを実行するための指示（たとえば、文書、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）が、通常は、このキット中に含まれる。このキットはまた、使用される特定のアッセイに依存して、パッケージされた他の試薬、および物質（すなわち、洗浄緩衝剤など）を含み得る。標準的アッセイ（例えば、上記のアッセイ）は、これらのキットを使用して実行され得る。
【０１１５】
（ＩＩＩ．実験）
下記に、本発明を実行するための具体的な実施形態の例が存在する。これらの実施例は、例示目的のためだけに提供され、本発明の範囲をいかなる様式でも限定することは意図されない。
【０１１６】
使用する数字（例えば、量、温度など）に関して、正確さを保証するために努力はしたが、いくらかの実験誤差および偏差は、当然許容されるべきである。
【０１１７】
以下の実施例において、酵素は、商業的供給源から購入し、製造業者の指示に従って使用した。ニトロセルロースフィルターなどもまた、商業的供給源から購入した。
【０１１８】
ＲＮＡフラグメントおよびＤＮＡフラグメントの単離において、記載される場合以外は、すべてのＲＮＡ操作およびＤＮＡ操作は、標準的手順に従って行った。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）を参照のこと。制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノーフラグメント、および他の生物学的試薬は、商業的供給業者から購入して、製造業者の指示に従って使用し得る。二本鎖核酸フラグメントは、アガロースゲル上で分離した。
【実施例】
【０１１９】
（実施例１）
生物学的サンプルからのＨＡＶ ＲＮＡの抽出）
ＨＡＶ核酸陽性血清を、ＢｉｏＣｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）から購入した。２つのアプローチを使用して、サンプルから核酸を単離した。具体的には、ＲＮＡを、（ａ）シリカに結合することによって、および（ｂ）標的特異的オリゴヌクレオチドにアニールすることによって、抽出した。
【０１２０】
（（ａ）シリカに結合することによる核酸の単離）
ＲＮＡを、Ｂｏｏｍ，Ｒ．ら（１９９０）「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８；４９５〜５０３により記載される方法を使用して、シリカに結合することによって抽出した。高濃度のカオトロピック塩（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート）の存在下で、核酸は、シリカに結合する。サイズ分けした小さな核酸は、酸性ｐＨ条件下、シリカにより効率的に結合する。結合した核酸を、高温にて、低塩、アルカリｐＨ緩衝剤中で、効率的に溶出する。通常のシリカを帯磁シリカで置換すると、核酸単離の洗浄工程および溶出工程が非常に容易になる。磁気ベースを使用して、核酸が結合したシリカ粒子を捕捉するために使用し、それにより、通常のシリカ粒子を沈降するために必要な遠心分離を排除した。
【０１２１】
使用した溶解緩衝剤は、Ｏｒｇａｎｏｎ−Ｔｅｋｎｉｋａ（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）から得た。この溶解緩衝剤は、タンパク質を可溶化してＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅを不活化するために、グアニジニウムイソチオシアネートを含む。界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は、細胞構造および核タンパク質の可溶化および崩壊のプロセスをさらに容易にし、それにより、核酸を放出させる。この溶解試薬を酸性にして、核酸結合を増強した。５０μｌのアルカリ溶出緩衝液を使用して、結合した核酸を溶出させた。予め分注した９．０ｍｌの溶解試薬を使用して、２．０ｍｌのＨＡＶ ＩｇＭ陽性血漿から核酸を抽出した。帯磁シリカ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから得たＭａｇＰｒｅｐ粒子）を使用して、核酸が結合したシリカ粒子を捕捉し、それにより、通常のシリカ粒子を沈降するために必要な遠心分離を排除した。結合した核酸を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ９．０）中に溶出した。核酸単離の後、ＨＡＶの存在を、下記のようにＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲを実施することによって、決定した。
【０１２２】
（（ｂ）標的特異的オリゴヌクレオチドにアニールすることによる核酸の単離）
帯磁シリカを使用すると、洗浄工程および溶出工程の間の迅速かつ容易な取扱いが非常に容易になるが、核酸の単離は、なお労力がかかり、かつ時間がかかる。従って、磁気ビーズを使用して、血漿または血清からの特定の核酸標的の一工程捕捉を、使用した。これを広範な種類のウイルス核酸捕捉試験に適用可能にするために、オリゴｄＴに結合した包括的磁気ビーズを、使用した。約１４ｂｐの長さのオリゴｄＴを備える血清−Ｍａｇ磁気オリゴ（ｄＴ）ビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、３’末端にＨＡＶ特異的配列と連続して（下記に特定される配列の末端にて示される）ポリＡテールを含む捕捉オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用した。
【０１２３】
磁気ビーズを、プライマーを含まない０．４ｍｌのＴＭＡ溶解緩衝液（ＧｅｎＰｒｏｂｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中に懸濁し、捕捉プライマーを、個別にかまたは組み合わせて、試験した。捕捉後、ビーズを、０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、０．５％ ＮＰ−４０という洗浄緩衝液で３回洗浄した。捕捉した核酸を備えるビーズを、１００μｌのＴａｑＭａｎＴＭ一工程ＲＴ−ＰＣＲ試薬中に懸濁し、下記のようなＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲによる検出のために、ＴａｑＭａｎＴＭＲＴ−ＰＣＲマイクロタイタープレートに移した。いくつかのオリゴヌクレオチドの組み合わせが、ＴａｑＭａｎＴＭアッセイによって検出した場合に、ＨＡＶを捕捉する際に効率的であった。
【０１２４】
使用した捕捉オリゴヌクレオチドは、以下の通りであった（配列の終わりに示した番号付けは、ＮＣＢＩ登録番号Ｋ０２９９０に対する、ＨＡＶゲノム内の位置に対応する。捕捉配列は、特定した位置に対して逆相補的な配列である。なぜなら、ＨＡＶは、＋鎖ＲＮＡウイルスであるからである）：
【０１２５】
【化１】
【０１２６】
【化２】
（７３〜９５、＋２２ｂｐポリＡテール、ｐ＝リン酸化）（配列番号９）。
【０１２７】
（実施例２）
（ＴａｑＭａｎＴＭによるＨＡＶ ＲＮＡの検出）
ＴａｑＭａｎＴＭ技術を、捕捉した標的ＲＮＡを増幅するために使用した。このために、増幅オリゴヌクレオチドは、ＨＡＶ特異的プライマーからなった。これらのプライマーは、以下の通りであった：
５’非翻訳領域における増幅プライマーおよび検出プローブ：
【０１２８】
【化３】
ここで、Ｘ＝６−ＦＡＭ（フルオレセイン）であり、Ｚ＝リンカー＋ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）である。
【０１２９】
実施例１からの核酸を希釈して、約１００ＩＵ／２０μｌを得た。ＴａｑＭａｎＴＭ分析用の試薬は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから得た。最終容量５０ｍｌ中のＴａｑＭａｎＴＭ反応混合物は、２５ｍｌのＴａｑＭａｎＴＭＯｎｅ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍｉｘ、各々０．５ｐｍｏｌの増幅プライマー、および０．２ｐｍｏｌのプローブを含んだ。この反応条件は、ＡＢＩ ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ中で、ＲＴ活性について４８℃で３０分間、酵素を活性化するために９６℃で１０分間、その後、９５℃で３０秒間と交互に６０℃で３０秒間を４５サイクルを含んだ。ＰＣＲ増幅センスプライマーＶＨＡＶ１、アンチセンスプライマーＶＨＡＶ２、およびプローブＶＨＡＶ３を、使用した。
【０１３０】
７２１ｎｔの内部コントロール転写物（図４Ｂ（配列番号１７））を調製した。これを捕捉して増幅し得るが、これは、変化したプローブ結合配列を含む。図４Ｂに示される配列中の太字は、標的中の配列（図４Ａ、配列番号１６）を置換するこの内部コントロール中の配列を示す。この内部コントロールについての例示的なプローブ配列は、ｘＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＣＴｚ（配列番号１８）またはｘＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＣＴｚ（配列番号１９）であり、ここで、ｘ＝ＴＥＴであり、ｚ＝リンカー＋ＴＡＭＲＡである。
【０１３１】
（実施例３）
（増幅効率および捕捉オリゴヌクレオチドの組み合わせの試験）
ＨＡＶの５’ ＵＴＲヌクレオチド配列を、ＮＣＢＩ登録番号Ｋ０２９９０の配列に基づいて合成によって構築した。この配列をＭ１３プラスミド中にクローニングして、一本鎖ＮＤＡを得、このＤＮＡを精製した。
【０１３２】
（（ａ）増幅効率）
クローニングして精製した上記のＤＮＡの濃度を、分光光度法によって決定し、１反応当たり１０，０００〜０．５コピーに対応するＤＮＡの希釈物を、ＴａｑＭａｎＴＭアッセイにおいて増幅し、上記の方法、プライマー、およびプローブを使用して検出した。代表的には、＞０．２の閾値にて＜４５サイクルにて認識したサンプルからのシグナルを、陽性であると見なした。表１が、結果を詳説する。
【０１３３】
（表１）
【０１３４】
【表１】
（（ｂ）捕捉オリゴヌクレオチドの組み合わせ）
捕捉／プライマーの組み合わせの効率を、２５コピー／反応のｓｓＤＮＡを使用して試験した。配列番号４、５、６、７、８、および９の配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドの組み合わせが、最も効率的であった。
【０１３５】
従って、新規なＨＡＶ配列およびこれらの配列を使用する検出アッセイを、開示してきた。上記から、本発明の具体的な実施形態が本明細書中で例示目的のために記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが、認識される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、ウイルス診断に関する。具体的には、本発明は、生物学的サンプルにおいてＡ型肝炎感染を正確に診断するためおよびＡ型肝炎を検出するための、核酸ベースアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ａ型肝炎は、発熱、倦怠感、食欲不振、悪心、腹部不快感、および黄疸を引き起こす、腸伝達性疾患である。Ａ型肝炎の病因因子であるＡ型肝炎ウイルスは、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のＨｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ属に分類される、小さく外被のない球状のウイルスである。ＨＡＶゲノムは、一本鎖で線状の７．５ｋｂ ＲＮＡ分子からなり、このＲＮＡ分子は、ウイルス複製に必要な構造タンパク質および酵素活性を生じるようにプロセシングされるポリタンパク質前駆体をコードする（非特許文献１）。ＨＡＶは、細胞培養中でほとんど増殖せず、細胞傷害性ではなく、そして低収量のウイルスを生じる。ビリオンから抽出されたＨＡＶ ＲＮＡは、細胞培養中で感染性である（非特許文献２および非特許文献３）が、そのウイルスゲノムの直接操作は、そのＲＮＡ組成が原因で困難になる。
【０００３】
ＨＡＶは、感染した個体に対する抗体によって認識される主要な抗原性ドメインを含む、４つのキャプシドタンパク質（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）をコードする。このキャプシドタンパク質に加えて、抗原性ドメインは、２Ａのような非構造タンパク質およびウイルスによりコードされるプロテアーゼ中において、報告されている。別の重要なＨＡＶ抗原性ドメインが、キャプシド前駆体Ｐ１と２Ａとの間の連結部において、記載されている。
【０００４】
ＨＡＶは、人−人接触または汚染された食物もしくは汚染された水の摂取のいずれかによって、糞便−口腔経路によって、通常は獲得される。しかし、プールされた血漿生成物によってＨＡＶが伝達する可能性が存在する。脂質エンベロープが存在しないことによって、ＨＡＶは、物理化学的不活化に対して非常に抵抗性であり、このウイルスは、血液生成物の従来の熱処理に耐え得る。従って、ＨＡＶおよびパルボウイルスＢ１９は、プールされた血漿誘導体の投与を介して伝達されてきた。感染した個体におけるＨＡＶ抗原および／またはＨＡＶ抗体を同定するための感度が良い特異的な診断アッセイ、ならびにウイルス血症サンプルを検出してそのサンプルを輸液から排除するための核酸ベースの試験の開発は、重要な公衆衛生上の挑戦を示す。
【０００５】
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎらに対する米国特許第５，２９０，６７７号（特許文献１）は、抗体を使用するＨＡＶウイルス全体の捕捉を記載する。ＲＮＡが、単離され、そしてｃＤＮＡが生成される。その後、そのｃＤＮＡは、ＨＡＶゲノムのＶＰ１キャプシド領域由来のプライマーおよびＶＰ３キャプシド領域由来のプライマーを使用するＰＣＲによって増幅され、その増幅産物が、そのゲノムの同じ領域に由来するプローブを使用して検出される。それらのプライマーおよびプローブの選択は、検出されるべきＨＡＶの遺伝子型に基づく。
血液誘導体および血漿誘導体を介するかまたは個人的密接によるこのウイルスの伝達を防ぐために、ウイルス血症サンプル中のＡ型肝炎ウイルスを検出するための信頼できる診断試験を開発する必要性が、存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，２９０，６７７号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｊａｒｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：２６２７〜２６３２（１９８５）
【非特許文献２】Ｌａｃａｒｎｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：２１６〜２２５（１９８１）
【非特許文献３】Ｓｉｅｇｌら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．５７：３３１〜３４１（１９８１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、感染している可能性がある個体由来の生物学的サンプルにおいてＨＡＶを検出するための、感度の良い信頼できる核酸ベースの診断試験を開発することに基づく。本明細書中に記載される技術は、ＰＣＲ、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、および５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎＴＭ技術）を使用して、ＨＡＶ配列の保存ゲノム領域の増幅用テンプレートとして、抽出したサンプル核酸を利用する。これらの方法は、ウイルス血症サンプルにおけるＨＡＶの検出を可能にする。特定の実施形態において、本発明は、ＨＡＶゲノムの５’ＵＴＲ領域に由来するプライマーおよびプローブを使用する。さらに、これらの方法は、捕捉されたサンプル核酸が同じ容器中で増幅および検出に供され得る、ワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）分析を可能にする。本発明の方法を使用して、感染したサンプルは、輸液から、および血液誘導体調製物から、同定されて排除され得る。
従って、一実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＨＡＶ感染を検出するための方法に関する。この方法は、
（ａ）固体支持体を、上記生物学的サンプルと、高カオトロピック塩濃度下で、または上記固体支持体と標的核酸との間で複合体が形成されるハイブリダイズ条件下で、接触させる工程；
（ｂ）上記サンプルから（ａ）の固体支持体を分離する工程；
（ｃ）標的核酸が存在する場合にその標的核酸を増幅する工程；および
（ｄ）上記増幅された核酸の存在を、上記サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程；
を包含する。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＨＡＶ感染を検出するための方法に関する。この方法は、
（ａ）固体支持体を、上記生物学的サンプルと、高カオトロピック塩濃度下で、または上記固体支持体と標的核酸との間で複合体が形成されるハイブリダイズ条件下で、接触させる工程；
（ｂ）上記サンプルから（ａ）の固体支持体を分離する工程；
（ｃ）ＨＡＶのゲノムの５’ ＵＴＲに由来するプライマー（例えば、配列番号１を含む配列によって示されるプライマー、および配列番号２を含む配列によって示されるプライマー）を使用して、標的核酸鎖を増幅する工程；
を包含する。特定の実施形態において、この方法は、ＨＡＶゲノムの５’ ＵＴＲに由来するプローブ（例えば、配列番号３のプローブ）を使用して、上記増幅された標的オリゴヌクレオチドの存在を、上記サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程をさらに包含する。
【００１０】
さらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＨＡＶ感染を検出するための方法に関し、上記方法は、
ＨＡＶを含むことが疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程；
２種のプライマーを使用して、上記核酸を増幅する工程であって、
（ａ）上記プライマーの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、一方のプライマーは、配列番号１からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつもう一方のプライマーは、配列番号２からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、または
（ｂ）上記プライマーは、（ａ）のヌクレオチド配列と９０％配列同一性を有し、
上記２種のプライマーの各々は、それぞれ、単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程；ならびに
上記増幅された核酸の存在を、上記サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程、
を包含する。
【００１１】
特定の実施形態において、上記核酸は、
（ａ）結合している捕捉核酸を含む固体支持体を、標的核酸鎖が上記捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で生物学的サンプルと接触させる工程；および
（ｂ）上記サンプルから上記固体支持体を分離する工程；
を包含する方法によって、上記生物学的サンプルから単離される。
【００１２】
さらなる実施形態において、上記単離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施される。
【００１３】
さらなる実施形態において、上記捕捉核酸は、１種以上のオリゴヌクレオチドを含み、上記オリゴヌクレオチドの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつ上記オリゴヌクレオチドの各々は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群より選択される配列からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む。
【００１４】
なおさらなる実施形態において、上記捕捉核酸は、長さが約１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドのホモポリマー鎖（例えば、ポリＡ、ポリＴ、ポリＧ、ポリＣおよびポリＵ）をさらに含む。
【００１５】
別の実施形態において、上記増幅する工程は、ＰＣＲ、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）またはＴａｑＭａｎを含む。
【００１６】
さらなる実施形態において、上記方法は、増幅された生成物を検出するために標識プローブオリゴヌクレオチドを使用する工程をさらに包含し、このプローブは、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつ配列番号３を含む少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む。
【００１７】
特定の実施形態において、上記プローブは、検出可能な標識（例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識）を５’末端および３’末端にさらに含む。
【００１８】
なお別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＨＡＶ感染を検出するための方法に関し、この方法は、
（ａ）固体支持体を、１種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸と、この捕捉核酸が上記固体支持体と結合する条件下で接触させる工程であって、上記１種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群より選択される配列を含む、工程；
（ｂ）（ａ）の固体支持体を、生物学的サンプルと、ＨＡＶ由来の標的核酸鎖が存在する場合にはその標的核酸鎖が上記捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で接触する工程；および
（ｃ）上記サンプルから（ｂ）の固体支持体を分離する工程；
（ｄ）配列番号１を含むセンスプライマーと配列番号２を含むアンチセンスプライマーとを使用して上記核酸を増幅する工程であって、上記センスプライマーおよび上記アンチセンスプライマーは、それぞれ、上記単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程；ならびに
（ｅ）上記増幅された核酸の存在を、上記サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程；
を包含する。
【００１９】
上記の方法の特定の実施形態において、上記固体支持体は、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）を含み、上記単離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施される。
【００２０】
さらなる実施形態において、本発明は、図１に示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つからなるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。
【００２１】
さらなる実施形態において、本発明は、長さ６０ヌクレオチド以下の単離されたオリゴヌクレオチドに関し、この単離されたオリゴヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群より選択される配列からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して９０％配列同一性を有するヌクレオチド配列；または
（ｃ）（ａ）の相補体および（ｂ）の相補体；
を含む。
【００２２】
特定の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【００２３】
さらなる実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を５’末端および／または３’末端にさらに含む。特定の実施形態において、上記検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識である。
【００２４】
なおさらなる実施形態において、本発明は、診断試験キットに関し、このキットは、本明細書中に記載される１種以上のプライマーと、この診断試験を実行することについての指示を含む。特定の実施形態において、この試験キットは、検出可能な標識に結合した約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドのＨＡＶ特異的ハイブリダイズ配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブをさらに含む。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＨＡＶを検出するためのキットに関する。このキットは、１種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸（これらの１種以上のオリゴヌクレオチドの各々は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群より選択される配列を含む）；配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマー；ならびに配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブを含む。特定の実施形態において、上記試験キットは、ポリメラーゼ、および上記診断試験を実行するための指示をさらに含む。
【００２６】
さらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＨＡＶ感染を検出するためのキットに関し、このキットは、
１種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸であって、これらのオリゴヌクレオチドの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつこれらのオリゴヌクレオチドの各々は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群より選択される配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、捕捉核酸；
少なくとも２種のプライマーであって、これらのプライマーの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、一方のプライマーは、配列番号１からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、もう一方のプライマーは、配列番号２からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、プライマー；および
ＨＡＶ感染を同定するための指示書
を備える。
【００２７】
特定の実施形態において、上記キットは、長さが約６０ヌクレオチド以下でありかつ配列番号３からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、プローブオリゴヌクレオチドをさらに含む。上記プローブは、検出可能な標識を５’末端および３’末端にさらに含み得る。いくつかの実施形態において、上記検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識である、キット。
【００２８】
特定の実施形態において、上記のキットは、ポリメラーゼおよび緩衝液をさらに含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
長さ６０ヌクレオチド以下の単離されたオリゴヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群より選択される配列からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して９０％配列同一性を有するヌクレオチド配列；または
（ｃ）（ａ）の相補体および（ｂ）の相補体；
を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目２）
項目１に記載のオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群より選択される配列からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列である、オリゴヌクレオチド。
（項目３）
項目１に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目４）
項目１に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号２を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目５）
項目１に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号３を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目６）
項目５に記載のオリゴヌクレオチドであって、検出可能な標識を５’末端および／または３’末端にさらに含む、オリゴヌクレオチド。
（項目７）
項目６に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識である、オリゴヌクレオチド。
（項目８）
Ａ型肝炎ウイルス核酸を増幅するための２種のプライマーの組であって、該プライマーの組は、配列番号１からなるプライマーおよび配列番号２からなるプライマーからなる、組。
（項目９）
生物学的サンプル中のＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）を検出する方法であって、該方法は、
ＨＡＶを含むことが疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程；
該ＨＡＶのゲノムの５’ ＵＴＲに由来する少なくとも２種のプライマーを使用して、該単離された核酸を増幅する工程であって、該プライマーの各々は、長さが１０ヌクレオチド〜６０ヌクレオチドであり、かつ該プライマーの各々は、それぞれ、該単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程；および
該増幅された核酸の存在を、該サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程；
を包含する、方法。
（項目１０）
項目９に記載の方法であって、
（ａ）前記プライマーのうちの一方は、配列番号１からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつもう一方のプライマーは、配列番号２からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、または
（ｂ）前記プライマーは、（ａ）のヌクレオチド配列と９０％配列同一性を有し、そして
前記増幅された核酸の存在を、前記サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する、方法。
（項目１１）
項目９に記載の方法であって、前記核酸は、
（ａ）結合している捕捉核酸を含む固体支持体を、標的核酸鎖が該捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で生物学的サンプルと接触させる工程；および
（ｂ）該サンプルから該固体支持体を分離する工程；
を包含する方法によって、前記生物学的サンプルから単離される、方法。
（項目１２）
項目１１に記載の方法であって、前記固体支持体は、ビーズを含む、方法。
（項目１３）
項目１２に記載の方法であって、前記ビーズは、磁気ビーズである、方法。
（項目１４）
項目１３に記載の方法であって、前記単離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施される、方法。
（項目１５）
項目１１に記載の方法であって、前記捕捉核酸は、１種以上のオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつ該オリゴヌクレオチドの各々は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群より選択される配列からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、方法。
（項目１６）
項目１５に記載の方法であって、前記捕捉核酸は、３’末端または５’末端のいずれかに、長さが約１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドのホモポリマー鎖をさらに含み、該ホモポリマー鎖は、ポリＡ、ポリＴ、ポリＧ、ポリＣおよびポリＵからなる群より選択される、方法。
（項目１７）
項目１６に記載の方法であって、前記ホモポリマー鎖は、ポリＡ鎖である、方法。
（項目１８）
項目９に記載の方法であって、前記増幅する工程は、ＰＣＲ、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）またはＴａｑＭａｎを含む、方法。
（項目１９）
項目１８に記載の方法であって、前記増幅する工程は、ＴＭＡを含む、方法。
（項目２０）
項目１８に記載の方法であって、検出可能な標識を含むプローブオリゴヌクレオチドを、前記増幅された配列を検出するために使用する工程をさらに包含し、ここで、該プローブオリゴヌクレオチドは、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつ該プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号３を含む少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、方法。
（項目２１）
項目２０に記載の方法であって、前記プローブは、検出可能な標識を５’末端および３’末端に含む、方法。
（項目２２）
項目２１に記載の方法であって、前記検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識である、方法。
（項目２３）
生物学的サンプルにおけるＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）感染を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）固体支持体を、１種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸と、該捕捉核酸が該固体支持体と結合する条件下で接触させる工程であって、該１種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群より選択される配列を含む、工程；
（ｂ）（ａ）の固体支持体を、該生物学的サンプルと、ＨＡＶ由来の標的核酸鎖が存在する場合には該標的核酸鎖が該捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で接触させる工程；および
（ｃ）該サンプルから（ｂ）の固体支持体を分離する工程；
（ｄ）配列番号１を含むセンスプライマーと配列番号２を含むアンチセンスプライマーとを使用して該核酸を増幅する工程であって、該センスプライマーおよび該アンチセンスプライマーは、それぞれ、該単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程；ならびに
（ｅ）該増幅された核酸の存在を、該サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程；
を包含する、方法。
（項目２４）
項目２３に記載の方法であって、前記固体支持体は、ビーズを含む、方法。
（項目２５）
項目２４に記載の方法であって、前記ビーズは、磁気ビーズである、方法。
（項目２６）
項目２５に記載の方法であって、前記単離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施される、方法。
（項目２７）
生物学的サンプルにおけるＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）感染を検出するためのキットであって、該キットは、
１種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸であって、該オリゴヌクレオチドの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつ該オリゴヌクレオチドの各々は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群より選択される配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、捕捉核酸；
少なくとも２種のプライマーであって、該プライマーの各々は、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、一方のプライマーは、配列番号１からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、もう一方のプライマーは、配列番号２からの少なくとも１０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、プライマー；および
ＨＡＶ感染を同定するための指示書
を備える、キット。
（項目２８）
項目２７に記載のキットであって、ポリメラーゼと緩衝液とをさらに備える、キット。
（項目２９）
項目２７に記載のキットであって、プローブオリゴヌクレオチドをさらに備え、該プローブオリゴヌクレオチドは、長さが約６０ヌクレオチド以下であり、かつ配列番号３を含む少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、キット。
（項目３０）
項目２９に記載のキットであって、前記プローブは、検出可能な標識を５’末端および３’末端にさらに含む、キット。
（項目３１）
項目３０に記載のキットであって、前記検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識である、キット。
【００２９】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかになる。さらに、特定の手順または組成物をより詳細に記載する種々の参考文献が、本明細書中に示される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１Ａ〜図１Ｂ（配列番号１および配列番号２）は、単離されたＨＡＶ核酸の増幅における使用のための例示的プライマーを示す。
【図２】図２（配列番号３）は、ＨＡＶの存在を示す増幅された標的オリゴヌクレオチドの存在を検出する際に使用するためのプローブを示し、Ｘは、６−ＦＡＭ（フルオレセイン）であり、Ｚは、リンカー＋ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）である。
【図３】図３Ａ〜図３Ｆ（配列番号１０〜配列番号１５）は、生物学的サンプルからＨＡＶ核酸を単離するための例示的捕捉オリゴヌクレオチドを示す。
【図４】図４Ａは、ＨＡＶ野生型標的配列（配列番号１６）を示す。図４Ｂ（配列番号１７）は、標的の捕捉および増幅についてのコントロールとして使用するための例示的内部コントロール配列を示す。太字の塩基は、この内部コントロール配列中で置換されている野生型の配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他のように示されない限り、当業者の範囲内にある従来の化学、生化学、組換えＤＮＡ技術およびウイルス学の方法を使用する。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，現行版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかにそうでないように示さない限り、複数の言及物を包含することが、留意されなければならない。従って、例えば、「オリゴヌクレオチド（ａｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」に対する言及は、２つ以上のオリゴヌクレオチドの混合物を包含するなどである。
【００３２】
以下のアミノ酸略語が、文中全体にわたって使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ） アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アルパラギン：Ａｓｎ（Ｎ） アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ） グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ） グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ） イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ） リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ） フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ） セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ） トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ） バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。
【００３３】
（Ｉ．定義）
本発明を記載する際に、以下の用語が使用され、この以下の用語は、下記に示されるように定義されることが意図される。
【００３４】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを指し、そしてこれは、その最小の長さの生成物には限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどが、この定義内に包含される。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方が、この定義により包含される。これらの用語はまた、そのポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を包含する。さらに、本発明のために、「ポリペプチド」は、ネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的には性質が保存的である）を含むタンパク質を、そのタンパク質が望ましい活性を維持する限り、指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介してのように、意図的であってもよいし、または例えば、そのタンパク質を生成する宿主の変異またはＰＣＲ増幅に起因するエラーを介して、偶発的であってもよい。
【００３５】
「単離された」によって、ポリペプチドを指す場合、その示される分子は、その分離が天然で見出される生物全体から分離されて別個であること、または同じ型の他の生物学的高分子が実質的に存在しないことが、意味される。ポリヌクレオチドに関する用語「単離された」とは、天然で通常会合する配列を全体的にかまたは部分的に欠いている核酸分子；または天然で存在する通りに存在するが、会合した異種配列を有する、配列；またはその染色体から解離されている分子である。
【００３６】
指定される配列「に由来する」ポリヌクレオチド、または指定される配列「に特異的である」ポリヌクレオチドとは、指定されるヌクレオチド配列の一領域に対応する（すなわち、同一であるかまたは相補的である）少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、そしてなおより好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの連続配列を含む、ポリヌクレオチド配列を指す。その由来するポリヌクレオチドは、目的とするヌクレオチド配列から必ずしも物理的に誘導されるわけではなく、任意の様式（化学合成、複製、逆転写または転写が挙げられるが、これらに限定されない）で、そのポリヌクレオチドが由来する領域中の塩基配列により提供される情報に基づいて生成され得る。従って、その由来するポリヌクレオチドは、元のポリヌクレオチドのセンス方向またはアンチセンス方向のいずれかを示し得る。
【００３７】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分の間の類似性パーセントを指す。２つの核酸配列または２つのポリペプチド配列は、それらの配列が、その分子の規定された長さにわたって少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５〜９８％の配列類似性を示す場合に、互いに対して「実質的に相同である」。本明細書中で使用される場合、実質的に相同性とは、特定の核酸配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列もまた指す。
【００３８】
一般的に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれ、正確なヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとの一致を指す。同一性パーセントは、それらの２つの配列を整列し、整列した２つの配列間の一致の正確な数を計数し、短い方の配列の長さで除算し、その結果に１００を乗算することによって、２つの分子間の配列情報を直接比較することによって、決定され得る。
【００３９】
容易に利用可能なコンピュータープログラムは、相同性および同一性の分析を補助するために使用され得る。例えば、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣは、ペプチド分析のために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９，１９８１の局所相同性アルゴリズムを適合する。ヌクレオチド配列相同性を決定するためのプログラムが、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）において利用可能であり、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＦＡＳＴＡプログラムおよびＧＡＰプログラムもまた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに依存する。これらのプログラムは、製造業者によって推奨されそして上記で言及されるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅにおいて記載される、デフォルトパラメーターを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の相同性パーセントは、デフォルトスコアリングテーブルおよび６ヌクレオチド位置のギャップペナルティを用いてＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して、決定され得る。
【００４０】
本発明の状況において相同性パーセントを確立する別の方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発されてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により頒布されている、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有するＭＰＳＲＣＨパッケージのプログラムを使用することである。この組のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが、使用され得、デフォルトパラメーターは、スコアリングテーブル（例えば、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップエクステンションペナルティ１、およびギャップ６）について使用される。生じたデータから、「Ｍａｔｃｈ」値が「配列相同性」を反映する。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを計算するための他の適切なプログラムは、当該分野で一般的に公知であり、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを使用して使用され得る：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし：鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０、Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＵＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｕｉｏｎｓ＝５０配列；分別＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴにおいて見出され得る。
【００４１】
あるいは、相同性は、相同領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、そして消化されたフラグメントのサイズ決定によって、決定され得る。実質的に相同である核酸配列は、例えば、その特定の系について規定されたストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において、同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当業者の範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（前出）を参照のこと。
【００４２】
「組換え」とは、核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、その起源または操作によって、天然で会合するポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合していない、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。用語「組換え」とは、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されたポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子は、下記にさらに記載されるように、クローン化され、その後、形質転換生物中で発現される。その宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現して、そのタンパク質を生成する。
【００４３】
「制御エレメント」とは、それが連結しているヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を補助するポリヌクレオチド配列を指す。この用語は、宿主細胞においてコード配列の転写および翻訳を集合的に提供する、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む）、そして適切な場合には、リーダー配列およびエンハンサーを包含する。
【００４４】
「プロモーター」とは、本明細書中で使用される場合、ポリメラーゼに結合可能であり、かつそのプロモーターに作動可能に連結している下流（３’方向の）ヌクレオチド配列の転写を開始可能である、調節領域である。本発明のために、プロモーター配列は、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで目的の配列の転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを包含する。そのプロモーター配列の中には、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼもしくはＤＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。例えば、プロモーターは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）によってその核酸に結合して特定の部位でＲＮＡの転写を開始するためのシグナルとして認識される核酸配列であり得る。結合のために、そのような転写酵素は、一般的には、そのプロモーター配列とその相補体とを含む部分で二本鎖であるＤＮＡを必要とする。そのテンプレート部分（転写されるべき配列）は、二本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写を促進する際にその効率が顕著に変化し得る種々の異なるプロモーター配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合して転写を開始する場合、そのプロモーター配列は、転写される配列の一部ではない。従って、それにより生成されたＲＮＡ転写物は、その配列を含まない。
【００４５】
制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼがそのプロモーター配列に結合して隣接配列を転写する場合に、ヌクレオチド配列の「転写を指向する」。
【００４６】
「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩおよびバクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼである。すべての公知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開始するためには相補的プライマーを必要とする。適切な条件下では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成し得る。
【００４７】
「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「転写酵素」は、（通常は二本鎖である）プロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子または部分的に二本鎖のＤＮＡ分子から、複数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。このＲＮＡ分子（「転写物」）は、そのプロモーターのすぐ下流の特定の位置で始まって、５’→３’方向で合成される。転写酵素の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリラーゼ、ならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６である。
【００４８】
「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」は、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。すべての公知の逆転写酵素はまた、ＤＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを生成する能力も有する。従って、これらは、ＲＮＡ依存性およびＤＮＡ依存性の両方のＤＮＡポリメラーゼである。ＲＮＡテンプレートおよびＤＮＡテンプレートの両方を用いて合成を開始するためには、プライマーが必要とされる。
【００４９】
「ＲＮＡｓｅＨ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解する酵素である。これらの酵素は、エンドヌクレアーゼであっても、エキソヌクレアーゼであってもよい。ほとんどの逆転写酵素は、通常は、そのポリメラーゼ活性に加えて、ＲＮＡｓｅＨ活性を含む。しかし、そのＲＮＡｓｅＨの他の供給源は、ポリメラーゼ活性を付随することなく利用可能である。その分解は、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からのＲＮＡの分離をもたらしうる。あるいは、そのＲＮＡｓｅＨは、そのＲＮＡの一部が融解するように種々の位置でそのＲＮＡを単に切断し得るか、または酵素がそのＲＮＡの一部をほぐすのを許容する。
【００５０】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」とは、任意の長さのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドのポリマー形態を包含するために本明細書中で使用される。この用語は、その分子の一次構造のみを指す。従って、この用語は、三本鎖ＤＮＡ，二本鎖ＤＮＡ、および一本鎖ＤＮＡ、ならびに三本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖ＲＮＡを包含する。この用語はまた、改変体（例えば、メチル化および／またはキャップ化による）、ならびに非改変形態のポリヌクレオチドを包含する。より具体的には、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」とは、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリン塩基もしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドもしくはＣ−グリコシドである他の任意の型のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー（例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））ポリマーおよびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＯｒｅｇｏｎからＮｅｕｇｅｎｅとして市販される）ポリマー、ならびにそのポリマーが塩基対形成および塩基スタッキング（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるような）を可能にする構成で核酸塩基を含む場合に、他の配列特異的核酸ポリマーを包含する。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」の間で意図される長さの区別は存在せず、これらの用語は、互換可能に使用される。これらの用語は、その分子の一次構造のみを指す。従って、これらの用語は、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホロアミデート、２’−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ，二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ならびにＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間のハイブリッドを包含し、そしてまた、既知の型の改変（例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上をアナログで置換すること、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、負荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有する改変、および正荷電結合（例えば、アミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）を有する改変、ペンダント部分（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む））を含む改変、インターカレーター（例えば、空くチジン、ソラレンなど）を含む改変、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変結合（例えば、αアノマー核酸など）を含む改変、ならびに非改変形態のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド）を包含する。特に、ＤＮＡは、デオキシリボ核酸である。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「標的核酸領域」または「標的核酸」とは、増幅されるべき「標的配列」を有する核酸分子を意味する。この標的核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、そしてその標的配列のほかに他の配列（これは、増幅されないかもしれない）を含み得る。用語「標的配列」とは、標的核酸中の増幅されるべき特定のヌクレオチド配列を指す。その標的配列は、プローブが望ましい条件下で安定なハイブリッドを形成する標的分子中に含まれる、プローブハイブリダイズ領域を含み得る。その「標的配列」はまた、そのオリゴヌクレオチドプライマーが複合体形成し、その標的配列をテンプレートとして使用して伸長される、複合体形成配列を含み得る。その標的核酸がもともの一本鎖である場合、用語「標的配列」はまた、その標的核酸中に存在するような「標的配列」と相補的な配列を指す。その「標的核酸」がもともと二本鎖である場合、用語「標的配列」とは、プラス（＋）鎖およびマイナス（−）鎖の両方を指す。
【００５２】
用語「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」とは、本明細書中で使用される場合、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドと重合誘導剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ）の存在下かつ適切な温度、ｐＨ、金属濃度、および塩濃度）に配置された場合に、相補的核酸鎖の合成を開始するように作用するオリゴヌクレオチドを指す。そのプライマーは、好ましくは、最大の増幅効率のためには一本鎖であるが、あるいは、二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、そのプライマーは、まず、伸長産物を調製するために使用される前に、その鎖を分離するように処理される。この変性工程は、代表的には、熱によって行われるが、あるいは、アルカリとその後の中和によって実行され得る。従って、「プライマー」は、テンプレートと相補的であり、そしてそのテンプレートとの水素結合またはハイブリダイゼーションによって複合体形成して、ポリメラーゼによる合成開始のためのプライマー／テンプレート複合体を生じる。この複合体は、その３’末端に結合したテンプレートと相補的な共有結合塩基をＤＮＡ合成プロセスにおいて添加することによって、伸長される。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」とは、上記で定義されるような、ポリヌクレオチドから構成される構造体であって、その構造は、標的核酸分析物中に存在する核酸配列と相補的な核酸配列を含む、構造体を指す。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、および／または合成ヌクレオチドアナログから構成され得る。「オリゴヌクレオチドプローブ」が、５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎＴＭ技術）において使用される場合、そのプローブは、少なくとも１つの蛍光剤と、少なくとも１つの消光剤とを含み、このプローブは、増幅されたあらゆる標的オリゴヌクレオチド配列を検出するために、その反応において使用されるポリメラーゼの５’エンドヌクレアーゼ活性によって消化される。この状況において、このオリゴヌクレオチドプローブは、その５’末端に近接する十分な数のホスホジエステル結合を有し、その結果、使用される５’→３’ヌクレアーゼ活性は、結合したプローブを効率的に分解してその蛍光剤と消光剤とを分離し得る。オリゴヌクレオチドプローブがこのＴＭＡ技術において使用される場合、そのオリゴヌクレオチドプローブは、下記に記載されるように、適切に標識される。
【００５４】
このハイブリダイズ配列は、安定なハイブリッドを提供するために完全な相補性を有する必要はないことが、認識される。多くの状況において、安定なハイブリッドは、塩基の約１０％未満がミスマッチであり、４つ以上のヌクレオチドからなるループを無視する場合に形成される。従って、本明細書中で使用される場合、用語「相補的」とは、アッセイ条件下で、その「相補体」と安定な複合体を形成するオリゴヌクレオチドを、一般的には、約９０％以上の相同性が存在する場合に、指す。
【００５５】
用語「ハイブリダイズする」および「ハイブリダイゼーション」とは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を介して複合体を形成するために十分に相補的であるヌクレオチド配列間での複合体の形成を指す。プライマーが標的（テンプレート）と「ハイブリダイズ」する場合、そのような複合体（またはハイブリッド）は、例えば、ＤＮＡ合成を開始するためにＤＮＡポリメラーゼによって必要とされるプライミング機能を保存するために十分に安定である。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「結合対」とは、互いに特異的に結合する第１分子および第２分子（例えば、核酸二重鎖を形成可能な相補的ポリヌクレオチド対）を指す。サンプル中におけるその結合対の第１メンバーと、その結合対の第２メンバーとの「特異的結合」は、そのサンプル中の他の成分に対するよりも高い親和性および特異性で、その第１メンバーと第２メンバーとが結合すること（またはその逆）によって、示される。その結合対のメンバー間の結合は、代表的には、非共有結合性である。文脈が明らかに他のように示さない限り、用語「親和性分子」および「標的分析物」とは、本明細書中で、それぞれ、結合対の第１メンバーおよび第２メンバーを指すために使用される。
【００５７】
用語「特異的結合分子」および「親和性分子」とは、本明細書中で互換可能に使用され、そしてこれらは、サンプル中に存在する検出可能な物質と、化学的手段または物理的手段を介して選択的に結合する分子を指す。「選択的に結合する」によって、その分子は、目的とする標的に対して優先的に結合するか、または他の分子に対してよりも標的に対して高い親和性で結合することが、意味される。例えば、核酸分子は、実質的に相補的な配列に結合し、関連しない配列には結合しない。
【００５８】
二本鎖核酸分子の「融解温度」または「Ｔｍ」とは、その核酸の螺旋構造の半分が、加熱、または例えば、酸処理もしくはアルカリ処理などによる塩基対間の水素結合の他の解離が原因で失われる温度として、規定される。核酸分子のＴｍは、その長さおよびその塩基組成に依存する。ＧＣ塩基対がリッチな核酸分子は、豊富なＡＴ塩基対を有する核酸分子よりも高いＴｍを有する。核酸の分離した相補鎖は、その温度がそのＴｍよりも下に低下すると、自然に再会合またはアニールして、二重鎖核酸を形成する。最も速い核酸ハイブリダイゼーション速度は、そのＴｍより約２５℃低い温度で生じる。そのＴｍは、以下の関係：Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（ＧＣ）％（Ｍａｒｍｕｒら（１９６２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０９〜１１８）を使用して、推定され得る。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」とは、被験体により生成される抗体を一般的に含め、被験体から単離された組織サンプルまたは流体サンプルを指す。代表的なサンプルとしては、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚分泌物、気道、腸管および泌尿器管、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検、そしてまたインビトロ細胞培養成分のサンプル（培養培地中での細胞増殖ならびに組織増殖から生じる馴化培地（例えば、組換え細胞および細胞成分）が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい生物学的サンプルは、血液、血漿および血清である。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出可能な分子を指し、これには、放射性同位体、蛍光剤、化学発光体、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、またはハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光剤」とは、検出可能な範囲の蛍光を示すことが可能な物質またはその物質の一部を指す。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「固体支持体」とは、固体表面（例えば、磁気ビーズ、ラテックスビーズ、マイクロタイタープレートウェル、ガラスプレート、ナイロン、アガロース、アクリルアミドなど）を指す。
【００６２】
（ＩＩ．発明を実施する形態）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方物にもプロセスパラメーターにも限定されず、従って、当然変化し得ることが、理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記載するためだけのものであり、この用語は、限定することは意図されないこともまた、理解されるべきである。
【００６３】
本明細書中に記載される組成物および方法と類似するかまたは等価である複数の組成および方法が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書中に記載される。
【００６４】
上記のように、本発明は、生物学的サンプルにおいてＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）感染を正確に検出するための新規な診断方法の開発に基づく。その方法は、少量のウイルスを含むサンプルにおけるＨＡＶ標的核酸配列の同定を可能にする感度の高い核酸ベースの検出技術に依存する。具体的には、本発明者は、本明細書中において、ＨＡＶゲノムの５’ ＵＴＲ由来の配列を使用して、生物学的サンプルにおけるＨＡＶの迅速かつ感度の高い検出を提供することを発見した。ＨＡＶゲノムの配列（５’ ＵＴＲを含む）は、複数のＨＡＶ単離株において公知である。例えば、ＮＣＢＩ登録番号Ｋ０２９９０；ＡＢ０２０５６４；ＡＢ０２０５６５；ＡＢ０２０５６６；ＡＢ０２０５６７；ＡＢ０２０５６８；ＡＢ０２０５６９；ＡＦ２６８３９６；Ｍ１６６３２；Ｍ１４７０７；Ｍ２０２７３；ＮＣ００１４８９；Ｘ８３３０２；Ｃｏｈｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５０〜５９を参照のこと。種々のＨＡＶ単離株に由来する配列を比較することによって、本発明とともに使用するためのこれらの５’ ＵＴＲ配列および他の５’ ＵＴＲ配列は、容易に同定され得る。簡便のために、本発明とともに使用するためのこの種々の核酸分子は、ＮＣＢＩ登録番号Ｋ０２９９０に対して番号付けされている。その５’ ＵＴＲ配列は、ＮＣＢＩ登録番号Ｋ０２９９０の１〜７２３位に存在する。
【００６５】
本発明のストラテジーにおいて、その標的核酸は、非相同ＤＮＡ／ＲＮＡから分離される。一局面において、その標的核酸は、固体支持体と複合体を形成することによって、分離される。別の局面において、その標的核酸は、固体支持体上に固定された捕捉オリゴヌクレオチドを使用することによって分離され、その捕捉オリゴヌクレオチドは、検出されるべき生物にとって特異的であり得る。その後、分離された標的核酸は、レポーター基でタグ化されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出され得るか、または増幅され得る。ＨＡＶについて、分離された標的核酸は、好ましくは、非翻訳領域（例えば、５’ ＵＴＲ）中でプライマーを使用して増幅される。この領域由来の代表的なプライマーは、配列番号１および配列番号２の配列（図１）を含むプライマーである。
【００６６】
本発明の一局面において、標的核酸を保有する可能性がある生物学的サンプルは、固体支持体（必要に応じて、捕捉オリゴヌクレオチドを有する）と接触される。その捕捉オリゴヌクレオチドは、その固体支持体と、例えば、その固体支持体に対するプローブ部分の共有結合によって、親和性結合によって、水素結合によって、または非特異的結合によって、結合され得る。
【００６７】
その捕捉オリゴヌクレオチドは、目的の領域からの約５〜約５００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約１００ヌクレオチド、またはより好ましくは約１０〜約６０ヌクレオチド、またはこれらの範囲中の任意の整数個のヌクレオチド（例えば、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド．．．３５ヌクレオチド．．．４０ヌクレオチドなどを含む配列）を含み得る。代表的な捕捉オリゴヌクレオチドは、ＨＡＶ単離株の５’ ＵＴＲ配列（例えば、本明細書中図３Ａ〜３Ｆ（配列番号１０〜１５）に示される配列）から誘導される。
【００６８】
その捕捉オリゴヌクレオチドは、種々の様式で固体支持体に付着され得る。例えば、そのオリゴヌクレオチドは、その固体支持体に捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドを付着することによって、固体支持体に付着され得る。より好ましくは、その捕捉オリゴヌクレオチドは、その固体支持体からプローブを離すように作用するリンカーによって、固体支持体に付着される。そのリンカーは、通常は、長さが少なくとも１０〜５０原子であり、より好ましくは、長さが少なくとも１５〜３０原子である。そのリンカーに必要な長さは、使用される特定の固体支持体に依存する。例えば、６原子リンカーが、高架橋ポリスチレンが固体支持体として使用される場合に、一般的に十分である。
【００６９】
固体支持体に捕捉オリゴヌクレオチドを付着するために使用され得る広範な種類のリンカーが、当該分野で公知である。このリンカーは、固体支持体に付着された捕捉オリゴヌクレオチドに対する標的配列のハイブリダイゼーションを有意には妨げない、任意の化合物から形成され得る。このリンカーは、自動合成によりそのリンカー上に容易に付加され得る、ホモポリマーオリゴヌクレオチドから形成され得る。そのホモポリマー配列は、ウイルス特異的配列に対して５’側または３’側のいずれかであり得る。本発明の一局面において、その捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体への付着を容易にするために、ホモポリマー鎖（例えば、ポリＡ、ポリＴ、ポリＧ、ポリＣ、ポリＵ、ポリｄＡ、ポリｄＴ、ポリｄＧ、ポリｄＣまたはポリｄＵ）に連結され得る。そのホモポリマー鎖は、長さが約１０〜約４０ヌクレオチドであり得、または好ましくは、長さが約１２〜約２５ヌクレオチドであり得、またはこれらの範囲中の任意の整数個のヌクレオチド（例えば、１０ヌクレオチド．．．１２ヌクレオチド．．．１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、または２４ヌクレオチド）であり得る。
【００７０】
代表的なホモポリマー配列としては、ポリＴ配列またはポリＡ配列が挙げられる。あるいは、官能化ポリエチレングリコールのようなポリマーが、リンカーとして使用され得る。そのようなポリマーは、標的オリゴヌクレオチドに対するプローブのハイブリダイゼーションを有意には妨げない。結合の例としては、ポリエチレングリコール結合、カルバメート結合、およびアミド結合が挙げられる。固体支持体と、リンカーと、捕捉オリゴヌクレオチドとの間の結合は、好ましくは、高温度で塩基性条件下で塩基保護基を除去する間には切断されない。
【００７１】
この捕捉オリゴヌクレオチドはまた、その捕捉オリゴヌクレオチドの伸長を妨げるために、３’末端でリン酸化され得る。
【００７２】
この固体支持体は、多くの形態を採り得、この形態としては、例えば、粒子形態に還元されており、この支持体を含むサンプル媒体を篩に通すと回収可能なニトロセルロース；磁場を適用した際にサンプル媒体内をニトロセルロースが移動するのを可能にする、磁気粒子などが含浸されたニトロセルロースまたは物質；濾過され得るかまたは電磁特性を示し得る、ビーズまたは粒子；水性媒体の表面に分配するポリスチレンビーズ；ならびに磁性シリカが挙げられる。捕捉オリゴヌクレオチドの固定のための固体支持体の好ましい型の例としては、制御孔ガラス、ガラスプレート、ポリスチレン、アビジンコートポリスチレンビーズ、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル、および活性化デキストランが挙げられる。
【００７３】
本発明の一局面は、磁気シリカまたは磁気ビーズを含む固体支持体を包含し、必要に応じて、この磁気シリカまたは磁気ビーズは、捕捉オリゴヌクレオチドが磁気支持体粒子に共有結合または結合するのを容易にする一級アミン官能基を含む。あるいは、その磁気シリカまたは磁気ビーズは、それらに固定されたホモポリマー（例えば、ポリＴ配列またはポリＡ配列）を有する。磁気シリカまたは磁気ビーズを備える固体支持体を使用することによって、単離、増幅、および検出をワンポットで行う方法が可能になる。なぜなら、この固体支持体は、磁気手段によって生物学的サンプルから分離され得るからである。
【００７４】
この磁気ビーズまたは磁気粒子は、標準的技術を使用して生成され得るか、または商業的供給源から得られ得る。一般に、この粒子またはビーズは、磁気ビーズから構成され得るが、これらはまた、反応性表面を有して磁場と反応する能力を示す限り、他の磁性金属または金属酸化物（不純形態であっても、合金形態であっても、複合体形態であってもよい）であってもよい。個別にかまたは鉄と組み合わせて使用され得る他の物質としては、コバルト、ニッケル、およびケイ素が挙げられるが、これらに限定されない。本発明における適用のために適切な磁気ビーズとしては、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ，ＩＮによって商標名Ｓｅｒａ−ＭａｇＴＭ磁気オリゴヌクレオチドビーズとして販売されている、ポリｄＴ基含有磁気ビーズが挙げられる。本発明における適用のために適切な磁気シリカとしては、Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによってＭａｇＰｒｅｐＴＭ磁気シリカが挙げられる。
【００７５】
次に、捕捉オリゴヌクレオチドと固体支持体との結合は、その捕捉オリゴヌクレオチドを含む媒体と、その固体支持体とを接触することによって、開始される。一局面において、ポリｄＴ基含有磁気ビーズが、ＨＡＶゲノムの保存一本鎖領域から選択される配列と連続してポリｄＡを含む標的配列と、ハイブリダイズされる。この捕捉オリゴヌクレオチド上のポリｄＡと、固体支持体上のポリｄＴとが、ハイブリダイズし、それにより、この捕捉オリゴヌクレオチドが固体支持体に固定または結合する。別の局面において、この磁気ビーズは、２００２年１０月９日出願の同一人に譲渡された係属中の米国特許出願番号１０／２６７，９２２において開示されるヌクレオチド配列に由来する、約１０〜約７５ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約２５ヌクレオチドのその表面ヌクレオチド配列上に、固定されている。
【００７６】
この固体支持体は、高いカオトロピック塩濃度下またはハイブリダイゼーション条件下で、生物学的サンプルと接触される。この捕捉オリゴヌクレオチドは、生物学的サンプル中に存在する標的鎖とハイブリダイズする。代表的には、標的に対する捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、約１５分間以内に達成され得るが、３〜４８時間かかり得る。
【００７７】
別の局面において、シリカ磁気粒子が、複合体の形成を促進するように設計された条件下で、標的物質を含む媒体に曝露される。この複合体は、より好ましくは、シリカ磁気粒子と、上記媒体と、カオトロピック塩との混合物中で形成される。
【００７８】
カオトロピック塩は、水性溶液中で非常に可溶性であるカオトロピックイオンの塩である。そのような塩によって提供されるカオトロピックイオンは、タンパク質水溶液または核酸水溶液中で十分に高濃度である場合には、タンパク質をアンフォールディングさせるか、核酸の二次構造を失わせるか、または二本鎖核酸の場合には融解させる。カオトロピックイオンは、液体の水中に存在する水素結合ネットワークを破壊することによって、正確にフォールディングまたは構成されたタンパク質および核酸よりも、変性タンパク質および変性核酸を熱力学的に安定にするので、これらの効果を有すると考えられる。代表的なカオトロピックイオンとしては、グアニジニウムイオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、およびトリクロロ酢酸イオンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において好ましいのは、グアニジニウムイオンである。カオトロピック塩としては、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、およびトリクロロ酢酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいのは、上記のグアニジニウム塩であり、特に好ましいのは、チオシアン酸グアニジンである。
【００７９】
本方法の実施において使用するためのカオトロピックイオンの濃度は、好ましくは、約０．１Ｍと７Ｍとの間であり、より好ましくは、約０．５Ｍと５Ｍとの間である。この混合物中のカオトロピックイオンの濃度は、生物学的標的物質を混合物中のシリカ磁気粒子に接着させるに十分に高くなければならないが、標的物質を実質的に変性させたり、分解したり、または混合物から沈殿させたりする程には高くない。タンパク質、および大きな二本鎖核酸分子（例えば、ウイルス核酸）は、０．５Ｍと２Ｍとの間のカオトロピック塩濃度で安定であるが、約２Ｍよりも高いカオトロピック塩濃度で溶液から沈殿することが公知である。
【００８０】
本発明の一局面において、上記のように形成された複合体は、上記の核酸物質のうちの少なくともいくらかが、上記シリカ磁気粒子に接着されて、複合体を形成するまでインキュベートされる。このインキュベーション工程は、少なくとも約０℃、好ましくは少なくとも約４℃、より好ましくは少なくとも約２０℃の温度にて実行され、但し、そのインキュベーション温度は、約７５℃以下である。従って、０℃〜７５℃、好ましくは４℃〜５０℃、最も好ましくは約１５℃〜約３５℃の範囲の温度、またはこれらの範囲内の任意の整数値の温度が、本明細書中での用途を見出す。このインキュベーション工程は、好ましくは、シリカ磁気粒子が上記核酸物質に可逆的に結合する能力を失いはじめる温度よりも低い温度で実行され、室温程度（すなわち、約２５℃）で実行され得る。
【００８１】
その後、固体支持体は、濾過によって、カラムに通すことによって、または磁気的手段によって、生物学的サンプルから分離される。当業者によって認識されるように、分離方法は、選択される固体支持体の型に依存する。標的は、固体支持体上に固定された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするので、その標的鎖は、それによってサンプル中の不純物から分離される。いくつかの場合、外来の核酸、タンパク質、糖質、脂質、細胞破片、および他の不純物が、生物学的サンプル中でこれらが最初に見出されたよりもかなり低い濃度であっても、なおこの支持体に結合し得る。当業者は、いくつかの望ましくない物質が、洗浄媒体でその支持体を洗浄することによって除去され得ることを認識する。生物学的サンプルからその固体支持体を分離すると、好ましくは、サンプル中に存在する非標的核酸のうちの少なくとも約７０％、より好ましくは約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％を除去する。
【００８２】
本発明の方法はまた、捕捉された標的オリゴヌクレオチドを増幅して、増幅された核酸を生成する工程も包含する。標的核酸を増幅する工程は、核酸ポリメラーゼを使用して、複数コピーのその標的オリゴヌクレオチドまたはそのフラグメントを生成する。適切な増幅技術は、当該分野で周知であり、例えば、転写関連増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、レプリカーゼ媒介性増幅、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）である。
【００８３】
本発明のアッセイとともに使用するためのプライマーは、好ましくは、存在が検出されるべき生物にとって独特である。従って、ＨＡＶの検出のために、そのプライマーは、ＨＡＶの非翻訳領域中の保存領域（例えば、図１において示される領域）から誘導される。
【００８４】
このアッセイにおいて使用するためのプライマーおよび捕捉オリゴヌクレオチドは、標準的技術によって容易に合成される。この標準的技術は、例えば、米国特許第４，４５８，０６６号および同第４，４１５，７３２号；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３〜２３１１；およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１３（１ Ａｐｒｉｌ １９８７）に開示されるような、ホスホロアミダイト化学を介する固相合成である。他の化学合成方法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：９０により記載されるホスホトリエステル方法、およびＢｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：１０９により開示されるホスホジエステル方法が挙げられる。ポリ（Ａ）もしくはポリ（Ｃ）または他の非相補的ヌクレオチド伸長物が、これらの同じ方法を使用して、プローブ中に組み込まれ得る。ヘキサエチレンオキシド伸長物が、当該分野で公知の方法によって、プローブに結合され得る。Ｃｌｏａｄら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６３２４〜６３２６；Ｌｅｖｅｎｓｏｎらに対する米国特許第４，９１４，２１０号；Ｄｕｒａｎｄら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６３５３〜６３５９；およびＨｏｒｎら（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４７０５〜４７０８。代表的には、そのプライマー配列は、長さが１０〜７５ヌクレオチド間（例えば、１５〜６０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチドなど）であり、より代表的には、１８〜４０ヌクレオチド長の間であり、言及した範囲の間の任意の長さである。代表的なプローブは、１０〜５０ヌクレオチド長の間（例えば、１５〜４０ヌクレオチド長、１８〜３０ヌクレオチド長など）、および言及した範囲の間の任意の長さの範囲にある。
【００８５】
さらに、このプローブは、検出用標識に結合され得る。標識の付加を可能にする反応性官能基を用いてオリゴヌクレオチドを誘導体化するために、いくつかの手段が公知である。例えば、いくつかのアプローチが、プローブをビオチン化して、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、または電子密度標識をアビジンを介して結合し得るようにするために利用可能である。例えば、Ｂｒｏｋｅｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９７８）５：３６３〜３８４（これは、フェリチン−アビジン−ビオチン標識の使用を開示する）およびＣｈｏｌｌｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８５）１３：１５２９〜１５４１（これは、アミノアルキルホスホルアミドリンカーアームを介してオリゴヌクレオチドの５’末端をビオチン化することを開示する）を参照のこと。いくつかの方法がまた、アミノ反応基（例えば、イソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなど）によって誘導体化された蛍光化合物または他の型の化合物によって容易に標識される、アミノ誘導体化オリゴヌクレオチドを合成するために、利用可能である。例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３１３１〜３１３９、Ｇｉｂｓｏｎら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６４５５〜６４６７およびＭｉｙｏｓｈｉらに対する米国特許第４，６０５，７３５号を参照のこと。チオール特異的標識と反応し得るスルフヒドリル誘導体化オリゴヌクレオチドを合成するための方法もまた、利用可能である。例えば、Ｆｕｎｇらに対する米国特許第４，７５７，１４１号、Ｃｏｎｎｏｌｌｙら（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４８５〜４５０２およびＳｐｏａｔら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４８３７〜４８４８を参照のこと。核酸フラグメントを標識するための方法論の包括的概説が、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１６９：１〜２５において提供される。
【００８６】
例えば、プローブは、そのプローブの非連結末端に蛍光分子を連結することによって、蛍光標識され得る。適切な蛍光標識を選択するための指針は、Ｓｍｉｔｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：２６０〜３０１；Ｋａｒｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：４９５５〜４９６２；Ｈａｕｇｌａｎｄ（１９８９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）において見出され得る。好ましい蛍光標識としては、フルオレセインおよびその誘導体（例えば、米国特許第４，３１８，８４６号およびＬｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ（１９８９）１０：１５１〜１６４に開示される）、ならびに６−ＦＡＭ（フルオレセイン）、ＪＯＥ（２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロフルオレセイン）、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）、ＲＯＸ（ローダミンＸ）、ＨＥＸ−１、ＨＥＸ−２、ＺＯＥ、ＴＥＴ−１またはＮＡＮ−２などが、挙げられる。
【００８７】
さらに、プローブは、下記の技術を使用してアクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識され得る。現在の技術によって、ＡＥ標識をそのプローブ中の任意の位置に配置することが可能である。例えば、Ｎｅｌｓｏｎら（１９９５）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｋｒｉｃｋａ Ｌ．Ｊ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｎｅｌｓｏｎら（１９９４）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＨＰＡ） ｔｏ ＰＣＲ」Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｗｅｅｋｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２９：１４７４〜１４７９；Ｂｅｒｒｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）３４：２０８７〜２０９０を参照のこと。ＡＥ分子は、プローブ内の任意の位置に標識を配置することを可能にする非ヌクレオチドベースのリンカーアーム化学を使用して、プローブに直接結合され得る。例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，１８５，４３９号を参照のこと。
【００８８】
特定の実施形態において、内部コントロール（ＩＣ）または内部標準が、標的の捕捉および増幅についてのコントロールとして役立てるために添加される。好ましくは、このＩＣは、標的配列とは異なり、サンプルから生物特異的なオリゴヌクレオチドを分離するために使用されるプローブ配列とハイブリダイズ可能であり、かつ増幅可能である、配列を含む。この内部コントロールの使用によって、分離プロセス、増幅プロセス、および検出系のコントロールが可能になり、そしてサンプルについてのアッセイ性能および定量をモニタリングすることが可能になる。このＩＣは、適切な任意の点（例えば、溶解緩衝液中）に含まれ得る。一実施形態において、このＩＣは、ＨＡＶヌクレオチド配列の一部を含むＲＮＡと、プローブにハイブリダイズする独特な配列とを含む。従って、特定の実施形態において、このＩＣは、５〜３０塩基（例えば、６塩基．．．９塩基．．．１２塩基．．．１５塩基．．．２０塩基など）またはこれより多くの塩基が他の塩基で置換された改変配列を含む、ＨＡＶゲノムの一部を含む。この置換塩基は、２個または３個連続する配列だけが置換されるように、標的配列の全体の長さにわたって位置し得る。ＨＡＶについての代表的ＩＣは、図４Ｂに示され、これは、ＨＡＶゲノムの５’ ＵＴＲに由来する７２１ｂｐを含む。図４Ｂ中の太字の大文字は、野生型配列中に存在する塩基が置換されている、塩基を示す（図４Ａを参照のこと）。このアッセイは、内部標準に特異的なプローブ（ＩＣプローブ）をさらに含み得る。
【００８９】
このＩＣ配列についての代表的なプローブは、実施例において配列番号１８および配列番号１９として詳説される。このＩＣプローブは、必要に応じて、標的配列についての検出可能な標識とは異なる検出可能な標識に結合され得る。この検出可能な標識が発蛍光団である実施形態において、このＩＣは、分光光度法によって、そして検出限界の研究によって、定量され得る。
【００９０】
代表的には、標的検出を妨げないＩＣのコピー数は、そのＩＣを、標的の固定されたＩＵ／コピー／ＰＦＵを用いて力価測定することによって、好ましくは下端で決定される。標準曲線が、国際的に認可されている標準のサンプルを希釈することによって、作成される。
【００９１】
別の実施形態において、本明細書中に記載される通りに、ＩＣは、当業者に公知の標準的技術に従って、サンプルから単離されたＲＮＡと合わされる。その後、このＲＮＡは、ｃＤＮＡを提供するために逆転写酵素を使用して逆転写される。このｃＤＮＡ配列は、標識プライマーを使用して、必要に応じて（例えば、ＰＣＲによって）増幅され得る。この増幅生成物は、代表的には、電気泳動によって分離され、そして組み込まれた標識の量（増幅生成物の量に比例する）が、決定される。その後、サンプル中のｍＲＮＡの量は、既知の標準物によって生成されたシグナルと比較することによって、計算される。
【００９２】
上記のプライマーおよびプローブは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの技術において使用されて、生物学的サンプル中のＨＡＶ感染が検出され得る。ＰＣＲは、核酸分子または分子混合物中に含まれる望ましい標的核酸配列を増幅するための技術である。ＰＣＲにおいて、一対のプライマーが、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズするように過剰に使用される。これらのプライマーは、標的核酸をテンプレートとして使用して、ポリメラーゼによって各々伸長される。この伸長生成物は、元の標的鎖から解離した後に、標的配列自体になる。その後、新しいプライマーが、ハイブリダイズされ、そしてポリメラーゼによって伸長され、このサイクルが反復されて、標的配列分子の数が幾何学的に増加される。サンプル中の標的核酸配列を増幅するためのＰＣＲ方法は、当該分野で周知であり、そしてそれは、例えば、Ｉｎｎｉｓら編、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ １９９０）；Ｔａｙｌｏｒ（１９９１）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ、ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３；ならびに米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８８９，８１８号を参照のこと。
【００９３】
具体的には、ＰＣＲは、増幅されるべき標的ヌクレオチド配列に隣接する比較的短いオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、これらのプライマーは、それらの３’末端が互いに向かい合い、各プライマーがもう一方に向かって延びるような、方向である。このポリヌクレオチドサンプルは、抽出され、好ましくは熱によって変性され、そしてモル過剰量で存在する第１プライマーおよび第２プライマーとハイブリダイズされる。重合は、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ−ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で、プライマー依存性およびテンプレート依存性のポリヌクレオチド重合剤（例えば、プライマー伸長生成物を生成可能な酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）（種々の供給源（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）から入手可能である）、Ｔｈｅｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓから単離されたＤＮＡポリメラーゼ（「Ｖｅｎｔ」ポリメラーゼ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）））を使用して、触媒される。これによって、元の鎖の新しく合成された相補鎖にその５’末端で共有結合している個々のプライマーを含む、２つの「長い生成物」が生じる。その後、この反応混合物は、例えば、温度を低下させること、変性剤を不活化すること、またはより多くのポリメラーゼを添加することによって、重合条件へと戻され、そして第２サイクルが開始される。この第２サイクルは、この２つの元の鎖、第１サイクルからの２つの長い生成物、元の鎖から複製された２つの新しい長い生成物、およびこの長い生成物から複製された２つの「短い生成物」を提供する。この短い生成物は、各端部にプライマーを伴って標的配列の配列を有する。さらなるサイクル各々において、さらに２つの長い生成物が、生成され、そして長い生成物および短い生成物の数と等しい数の短い生成物が、直前のサイクルの最後に残る。従って、標的配列を含む短い生成物の数は、各サイクルとともに対数的に増加する。好ましくは、ＰＣＲは、市販のサーマルサイクラー（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて実行される。
【００９４】
ＲＮＡは、そのｍＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写し、その後、上記のようにＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施することによって、増幅され得る。あるいは、単一の酵素が、米国特許第５，３２２，７７０号に記載されるように、両方の工程のために使用され得る。ｍＲＮＡはまた、ｃＤＮＡへと逆転写され得、その後、Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９９４）ＰＣＲ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐ．４：８０〜８４によって記載されるように、非対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）が実施され得る。
【００９５】
ＴａｑＭａｎＴＭアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）として公知である蛍光発生５’ヌクレアーゼアッセイは、核酸標的についての強力かつ汎用的なＰＣＲベースの検出系である。従って、本明細書中に記載されるＨＡＶゲノムの領域に由来するプライマーおよびプローブは、生物学的サンプル中の感染の存在を検出するために、ＴａｑＭａｎＴＭ分析において使用され得る。分析は、蛍光シグナルの生成をモニタリングすることによって、サーマルサイクリングと組み合わせて実施される。このアッセイ系は、ゲル電気泳動の必要性を省き、そしてこのアッセイ系は、標的コピー数の決定を可能にする定量的データを生成する能力を有する。
【００９６】
蛍光発生５’ヌクレアーゼアッセイは、例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭＤＮＡポリメラーゼ（これは、内因性５’ヌクレアーゼ活性を有する）を使用して、蛍光レポーター色素と消光剤との両方で標識された内部オリゴヌクレオチドプローブを消化することによって、便利に実施される（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：７２７６〜７２８０；およびＬｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９３）２１：３７６１〜３７６６を参照のこと）。アッセイの結果は、増幅サイクルの間に蛍光プローブが消化された時に生じる蛍光の変化を測定すること、その色素標識と消光剤標識とを分離すること、そして標的核酸の増幅に比例する蛍光シグナルの増加を引き起こすことによって、検出される。
【００９７】
この増幅生成物は、溶液中で、または固体支持体を使用して、検出され得る。この方法において、ＴａｑＭａｎＴＭプローブが、望ましいＰＣＲ生成物内の標的配列にハイブリダイズするように消化される。ＴａｑＭａｎＴＭプローブの５’末端は、蛍光レポーター色素を含む。このプローブの３’末端は、プローブ伸長を防ぐようにブロックされ、そしてこの３’末端は、５’発蛍光団の蛍光を消光する色素を含む。その後の増幅の間に、その５’蛍光標識は、５’エキソヌクレア−ゼ活性を有するポリメラーゼがその反応中に存在する場合に、切り離される。その５’発蛍光団が励起すると、検出され得る蛍光の増加をもたらす。
【００９８】
従って、一局面において、本発明は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと、ＨＡＶ標的配列にハイブリダイズ可能な１種以上のプライマーと、そのプライマーに対して３’側でＨＡＶ標的配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブとを使用して、標的ＨＡＶヌクレオチド配列を増幅するための方法に関する。増幅の間に、そのポリメラーゼは、標的配列にハイブリダイズした場合にオリゴヌクレオチドプローブを消化し、それによって、消光剤分子からレポーター分子を分離する。その増幅が実行された場合、レポーター分子の蛍光がモニターされ、その蛍光は、核酸増幅の発生に対応する。そのレポーター分子は、好ましくは、フルオレセイン色素であり、消光剤分子は、好ましくは、ローダミン色素である。
【００９９】
プライマーおよびプローブの長さは変化し得るが、プローブ配列は、それがプライマー配列よりも高い融解温度を有するように、選択される。好ましくは、そのプローブ配列は、増幅プライマー配列についての融解温度よりも約１０℃高い推定融解温度を有する。従って、プライマー配列は、一般的には、プローブ配列よりも短い。代表的には、プライマー配列は、１０〜７５ヌクレオチド長の間の範囲であり、より代表的には、２０〜４５ヌクレオチド長の範囲内にある。代表的なプローブは、１０〜５０ヌクレオチド長の範囲にあり、より代表的には、１５〜４０ヌクレオチド長の範囲内にある。
【０１００】
ＴａｑＭａｎＴＭアッセイの詳細な説明について、そのアッセイにおいて使用するための試薬および条件は、例えば、Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：７２７６〜７２８０；米国特許第５，５３８，８４８号、同第５，７２３，５９１号、および同第５，８７６，９３０号を参照のこと。
【０１０１】
本明細書中に記載されるＨＡＶ配列はまた、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）アッセイのための基礎として使用され得る。ＴＭＡは、生物学的サンプル中に非常に少量で存在する標的核酸配列を同定する方法を提供する。そのような配列は、直接アッセイ方法を使用して検出することが困難または不可能であり得る。具体的には、ＴＭＡは、等温性の自己触媒核酸標的増幅システムであり、標的配列の数十億個より多くのＲＮＡコピーを提供し得る。このアッセイは、定性的に実施されて、生物学的サンプル中の標的配列の存在または非存在を正確に検出し得る。このアッセイはまた、数桁の濃度範囲にわたって標的配列の量の定量的尺度を提供し得る。ＴＭＡは、反応条件（例えば、温度、イオン強度、およびｐＨ）を反復操作することなく、標的核酸配列の複数コピーを自己触媒合成するための方法を提供する。
【０１０２】
一般的に、ＴＭＡは、以下の工程：（ａ）核酸（ＲＮＡが挙げられる）を、ＨＡＶに感染していると疑われる目的の生物学的サンプルから単離する工程；および（ｂ）反応混合物中に、（ｉ）単離された核酸、（ｉｉ）第１オリゴヌクレオチドプライマーおよび第２オリゴヌクレオチドプライマー（この第１プライマーは、ＲＮＡ標的配列（例えば、＋鎖）の３’末端部分が存在する場合にその３’末端部分と複合体形成するに十分に相補的な複合体形成配列を有する。第２プライマーは、その相補鎖（例えば、−鎖）の標的配列の３’末端部分と複合体形成するに十分に相補的な複合体形成配列を有する。この第１オリゴヌクレオチドは、その複合体形成配列の５’側に、プロモーターを含む配列をさらに含む。）、（ｉｉｉ）逆転写酵素またはＲＮＡおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｖ）ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を選択的に分解する酵素活性（例えば、ＲＮＡｓｅＨ）、ならびに（ｖ）上記プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを合わせる工程、を包含する。
【０１０３】
その反応混合物の成分は、段階的にかまたは一度に、合わされ得る。この反応混合物は、オリゴヌクレオチド／標的配列が形成される条件下（核酸プライム条件および核酸合成条件を含む）（リボヌクレオチド三リン酸およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む）で、標的配列の複数コピーを提供するために十分な時間インキュベートされる。その反応は、反応成分（例えば、成分酵素）の安定性を維持するために適切であり、かつ増幅反応の経過の間に反応条件の改変も操作も必要としない、条件下で有利なことに生じる。従って、その反応は、実質的に等温性でありかつ実質的に一定のイオン強度およびｐＨを含む、条件下で生じ得る。この反応は、簡便には、第１ＤＮＡ伸長反応によって生成されるＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を分離するために変性工程を必要としない。
【０１０４】
適切なＤＮＡポリメラーゼとしては、逆転写酵素（例えば、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素（例えば、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．から入手可能である）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能である）が挙げられる。
【０１０５】
これらのプライマー中に組み込むために適切なプロモーターまたはプロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼにより特異的に認識される核酸配列（天然に存在する配列、合成により生成される配列、または制限酵素消化の生成物のいずれか）であり、このＲＮＡポリメラーゼは、その配列を認識し、その配列に結合し、転写プロセスを開始し、それによってＲＮＡ転写物が生成される。この配列は、必要に応じて、このＲＮＡポリメラーゼの実際の認識部位を越えて伸長するヌクレオチド塩基をさらに含み得、このヌクレオチド塩基は、分解プロセスに対する付加された安定性もしくは感受性を、または増加した転写効率を、付与し得る。有用なプロモーターの例としては、特定のバクテリオファージポリメラーゼによって認識されるプロモーター（例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、もしくはＳＰ６に由来するプロモーター）、またはＥ．ｃｏｌｉ由来のプロモーターが挙げられる。これらのＲＮＡポリメラーゼは、商業的供給源（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ）から容易に入手可能である。
【０１０６】
本明細書中の方法において使用するために適切な逆転写酵素のうちのいくつか（例えば、ＡＭＶ逆転写酵素）は、ＲＮＡｓｅＨ活性を有する。しかし、外因性ＲＮＡｓｅＨ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅＨ）を添加することは、ＡＭＶ逆転写酵素を使用する場合でさえも、好ましくあり得る。ＲＮＡｓｅＨは、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから容易に入手可能である。
【０１０７】
これらの方法によって生成されるＲＮＡ転写物は、上記の機構を介して標的配列のさらなるコピーを生成するためのテンプレートとして作用し得る。この系は、自己触媒性であり、反応条件（例えば、温度、ｐＨ、イオン強度など）を反復して改変する必要も変化する必要もなく、増幅が自己触媒的に生じる。
【０１０８】
検出は、広範な種類の方法（直接配列決定、配列特異的オリゴマーとのハイブリダイゼーション、ゲル電気泳動および質量分析法を含む）を使用して、なされ得る。これらの方法は、不均質形式を使用しても、均質形式を使用してもよく、同位体標識を使用しても、非同位体標識を使用しても、標識を使用しなくてもよい。
【０１０９】
ある好ましい検出方法は、上記の標的配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用することである。このプローブは、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）において使用され得る。この実施形態において、このプローブは、アクリジニウムエステル（ＡＥ）（これは、非常に化学発光性の分子である）で簡便に標識される。例えば、Ｎｅｌｓｏｎら（１９９５）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｋｒｉｃｋａ Ｌ．Ｊ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｎｅｌｓｏｎら（１９９４）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＨＰＡ） ｔｏ ＰＣＲ」Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｗｅｅｋｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２９：１４７４〜１４７９；Ｂｅｒｒｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）３４：２０８７〜２０９０を参照のこと。一つのＡＥ分子が、プローブ内の任意の位置に標識を配置することを可能にする非ヌクレオチドベースリンカーアーム化学を使用して、プローブに直接結合される。例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，１８５，４３９号を参照のこと。化学発光は、アルカリ水素ペルオキシドとの反応によって誘発される。アルカリ水素ペルオキシドは、励起したＮ−メチルアクリドンを生じ、このＮ−メチルアクリドンは、その後、光子を放出して基底状態へと低下する。
【０１１０】
このＡＥ分子が核酸プローブに共有結合された場合、加水分解は、穏やかなアルカリ条件下で迅速である。このＡＥ標識プローブが標的核酸と正確に相補的である場合、ＡＥ加水分解の速度は、非常に低下する。従って、ハイブリダイズしたＡＥ標識プローブおよびハイブリダイズしていないＡＥ標識プローブは、物理的に分離する必要なく、溶液中で直接検出され得る。
【０１１１】
ＨＰＡは、一般的には、以下の工程からなる：（ａ）ＡＥ標識プローブを、約１５〜約３０分間、溶液中で標的核酸とハイブリダイズさせる工程。その後、穏やかなアルカリ溶液を添加し、ハイブリダイズしていないプローブに結合したＡＥを加水分解する。この反応は、約５〜１０分間かかる。残っているハイブリッド結合したＡＥを、存在する標的の量の尺度として検出する。この工程は、約２〜５秒間かかる。好ましくは、差次的加水分解工程を、ハイブリダイゼーション工程と同じ温度（代表的には、５０〜７０℃）で行う。あるいは、第２の差次的加水分解工程を、室温で実施し得る。これによって、上昇したｐＨ（例えば、１０〜１１の範囲内にある）を使用することが可能になる。このｐＨは、ハイブリダイズしたＡＥ標識プローブと、ハイブリダイズしていないＡＥ標識プローブとの間で、より大きな加水分解速度差を生じる。ＨＰＡは、例えば、米国特許第６，００４，７４５号；同第５，９４８，８９９号および同第５，２８３，１７４号に詳細に記載される。
【０１１２】
ＴＭＡは、例えば、米国特許第５，３９９，４９１号に詳細に記載される。代表的なアッセイの一例において、単離された核酸サンプル（ＨＡＶ標的配列を含むと疑われる）が、緩衝剤、塩、マグネシウム、ヌクレオチド三リン酸、プライマー、ジチオスレイトール、およびスペルミジンを含む、緩衝剤濃縮物と混合される。この反応物は、必要に応じて、約１００℃で約２分間インキュベートされて、あらゆる二次構造が変性される。室温まで冷却した後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡｓｅＨが添加され、その混合物は、３７℃で２〜４時間インキュベートされる。その後、その反応は、生成物を変性すること、プローブ溶液を添加すること、６０℃で２０分間インキュベートすること、ハイブリダイズしていないプローブを選択的に加水分解するために溶液を添加すること、この反応物を６０℃で６分間インキュベートすること、そしてルミノメーターにおいて残っている化学発光を測定することによって、アッセイされ得る。
【０１１３】
容易に明らかであるように、本明細書中に記載されるアッセイの設計は、多量の変化を受け、多くの形式が、当該分野で公知である。上記の説明は、単に指針として提供されるに過ぎず、当業者は、当該分野で周知の技術を使用して、記載されているプロトコルを容易に改変し得る。
【０１１４】
上記のアッセイ試薬（プライマー、プローブ、結合したプローブを備える固体支持体、および他の検出試薬）は、上記のアッセイを実行するために、適切な指示書および他の必要試薬とともに、キット中で提供され得る。このキットは、通常は、別の容器中に、プライマーとプローブとの組み合わせ（固体支持体にすでに結合しているか、またはマトリックスにこの組み合わせを結合するための試薬と別個であるかのいずれか）、コントロール処方物（ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール）、標識がシグナルを直接発生しない場合にそのアッセイ形式が同じシグナル発生試薬（例えば、酵素基質）を必要とする場合は、標識試薬を含む。このアッセイを実行するための指示（たとえば、文書、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）が、通常は、このキット中に含まれる。このキットはまた、使用される特定のアッセイに依存して、パッケージされた他の試薬、および物質（すなわち、洗浄緩衝剤など）を含み得る。標準的アッセイ（例えば、上記のアッセイ）は、これらのキットを使用して実行され得る。
【０１１５】
（ＩＩＩ．実験）
下記に、本発明を実行するための具体的な実施形態の例が存在する。これらの実施例は、例示目的のためだけに提供され、本発明の範囲をいかなる様式でも限定することは意図されない。
【０１１６】
使用する数字（例えば、量、温度など）に関して、正確さを保証するために努力はしたが、いくらかの実験誤差および偏差は、当然許容されるべきである。
【０１１７】
以下の実施例において、酵素は、商業的供給源から購入し、製造業者の指示に従って使用した。ニトロセルロースフィルターなどもまた、商業的供給源から購入した。
【０１１８】
ＲＮＡフラグメントおよびＤＮＡフラグメントの単離において、記載される場合以外は、すべてのＲＮＡ操作およびＤＮＡ操作は、標準的手順に従って行った。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）を参照のこと。制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノーフラグメント、および他の生物学的試薬は、商業的供給業者から購入して、製造業者の指示に従って使用し得る。二本鎖核酸フラグメントは、アガロースゲル上で分離した。
【実施例】
【０１１９】
（実施例１）
生物学的サンプルからのＨＡＶ ＲＮＡの抽出）
ＨＡＶ核酸陽性血清を、ＢｉｏＣｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）から購入した。２つのアプローチを使用して、サンプルから核酸を単離した。具体的には、ＲＮＡを、（ａ）シリカに結合することによって、および（ｂ）標的特異的オリゴヌクレオチドにアニールすることによって、抽出した。
【０１２０】
（（ａ）シリカに結合することによる核酸の単離）
ＲＮＡを、Ｂｏｏｍ，Ｒ．ら（１９９０）「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８；４９５〜５０３により記載される方法を使用して、シリカに結合することによって抽出した。高濃度のカオトロピック塩（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート）の存在下で、核酸は、シリカに結合する。サイズ分けした小さな核酸は、酸性ｐＨ条件下、シリカにより効率的に結合する。結合した核酸を、高温にて、低塩、アルカリｐＨ緩衝剤中で、効率的に溶出する。通常のシリカを帯磁シリカで置換すると、核酸単離の洗浄工程および溶出工程が非常に容易になる。磁気ベースを使用して、核酸が結合したシリカ粒子を捕捉するために使用し、それにより、通常のシリカ粒子を沈降するために必要な遠心分離を排除した。
【０１２１】
使用した溶解緩衝剤は、Ｏｒｇａｎｏｎ−Ｔｅｋｎｉｋａ（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）から得た。この溶解緩衝剤は、タンパク質を可溶化してＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅを不活化するために、グアニジニウムイソチオシアネートを含む。界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は、細胞構造および核タンパク質の可溶化および崩壊のプロセスをさらに容易にし、それにより、核酸を放出させる。この溶解試薬を酸性にして、核酸結合を増強した。５０μｌのアルカリ溶出緩衝液を使用して、結合した核酸を溶出させた。予め分注した９．０ｍｌの溶解試薬を使用して、２．０ｍｌのＨＡＶ ＩｇＭ陽性血漿から核酸を抽出した。帯磁シリカ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから得たＭａｇＰｒｅｐ粒子）を使用して、核酸が結合したシリカ粒子を捕捉し、それにより、通常のシリカ粒子を沈降するために必要な遠心分離を排除した。結合した核酸を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ９．０）中に溶出した。核酸単離の後、ＨＡＶの存在を、下記のようにＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲを実施することによって、決定した。
【０１２２】
（（ｂ）標的特異的オリゴヌクレオチドにアニールすることによる核酸の単離）
帯磁シリカを使用すると、洗浄工程および溶出工程の間の迅速かつ容易な取扱いが非常に容易になるが、核酸の単離は、なお労力がかかり、かつ時間がかかる。従って、磁気ビーズを使用して、血漿または血清からの特定の核酸標的の一工程捕捉を、使用した。これを広範な種類のウイルス核酸捕捉試験に適用可能にするために、オリゴｄＴに結合した包括的磁気ビーズを、使用した。約１４ｂｐの長さのオリゴｄＴを備える血清−Ｍａｇ磁気オリゴ（ｄＴ）ビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、３’末端にＨＡＶ特異的配列と連続して（下記に特定される配列の末端にて示される）ポリＡテールを含む捕捉オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用した。
【０１２３】
磁気ビーズを、プライマーを含まない０．４ｍｌのＴＭＡ溶解緩衝液（ＧｅｎＰｒｏｂｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中に懸濁し、捕捉プライマーを、個別にかまたは組み合わせて、試験した。捕捉後、ビーズを、０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、０．５％ ＮＰ−４０という洗浄緩衝液で３回洗浄した。捕捉した核酸を備えるビーズを、１００μｌのＴａｑＭａｎＴＭ一工程ＲＴ−ＰＣＲ試薬中に懸濁し、下記のようなＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲによる検出のために、ＴａｑＭａｎＴＭＲＴ−ＰＣＲマイクロタイタープレートに移した。いくつかのオリゴヌクレオチドの組み合わせが、ＴａｑＭａｎＴＭアッセイによって検出した場合に、ＨＡＶを捕捉する際に効率的であった。
【０１２４】
使用した捕捉オリゴヌクレオチドは、以下の通りであった（配列の終わりに示した番号付けは、ＮＣＢＩ登録番号Ｋ０２９９０に対する、ＨＡＶゲノム内の位置に対応する。捕捉配列は、特定した位置に対して逆相補的な配列である。なぜなら、ＨＡＶは、＋鎖ＲＮＡウイルスであるからである）：
【０１２５】
【化１】
【０１２６】
【化２】
（７３〜９５、＋２２ｂｐポリＡテール、ｐ＝リン酸化）（配列番号９）。
【０１２７】
（実施例２）
（ＴａｑＭａｎＴＭによるＨＡＶ ＲＮＡの検出）
ＴａｑＭａｎＴＭ技術を、捕捉した標的ＲＮＡを増幅するために使用した。このために、増幅オリゴヌクレオチドは、ＨＡＶ特異的プライマーからなった。これらのプライマーは、以下の通りであった：
５’非翻訳領域における増幅プライマーおよび検出プローブ：
【０１２８】
【化３】
ここで、Ｘ＝６−ＦＡＭ（フルオレセイン）であり、Ｚ＝リンカー＋ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）である。
【０１２９】
実施例１からの核酸を希釈して、約１００ＩＵ／２０μｌを得た。ＴａｑＭａｎＴＭ分析用の試薬は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから得た。最終容量５０ｍｌ中のＴａｑＭａｎＴＭ反応混合物は、２５ｍｌのＴａｑＭａｎＴＭＯｎｅ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍｉｘ、各々０．５ｐｍｏｌの増幅プライマー、および０．２ｐｍｏｌのプローブを含んだ。この反応条件は、ＡＢＩ ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ中で、ＲＴ活性について４８℃で３０分間、酵素を活性化するために９６℃で１０分間、その後、９５℃で３０秒間と交互に６０℃で３０秒間を４５サイクルを含んだ。ＰＣＲ増幅センスプライマーＶＨＡＶ１、アンチセンスプライマーＶＨＡＶ２、およびプローブＶＨＡＶ３を、使用した。
【０１３０】
７２１ｎｔの内部コントロール転写物（図４Ｂ（配列番号１７））を調製した。これを捕捉して増幅し得るが、これは、変化したプローブ結合配列を含む。図４Ｂに示される配列中の太字は、標的中の配列（図４Ａ、配列番号１６）を置換するこの内部コントロール中の配列を示す。この内部コントロールについての例示的なプローブ配列は、ｘＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＣＴｚ（配列番号１８）またはｘＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＣＴｚ（配列番号１９）であり、ここで、ｘ＝ＴＥＴであり、ｚ＝リンカー＋ＴＡＭＲＡである。
【０１３１】
（実施例３）
（増幅効率および捕捉オリゴヌクレオチドの組み合わせの試験）
ＨＡＶの５’ ＵＴＲヌクレオチド配列を、ＮＣＢＩ登録番号Ｋ０２９９０の配列に基づいて合成によって構築した。この配列をＭ１３プラスミド中にクローニングして、一本鎖ＮＤＡを得、このＤＮＡを精製した。
【０１３２】
（（ａ）増幅効率）
クローニングして精製した上記のＤＮＡの濃度を、分光光度法によって決定し、１反応当たり１０，０００〜０．５コピーに対応するＤＮＡの希釈物を、ＴａｑＭａｎＴＭアッセイにおいて増幅し、上記の方法、プライマー、およびプローブを使用して検出した。代表的には、＞０．２の閾値にて＜４５サイクルにて認識したサンプルからのシグナルを、陽性であると見なした。表１が、結果を詳説する。
【０１３３】
（表１）
【０１３４】
【表１】
（（ｂ）捕捉オリゴヌクレオチドの組み合わせ）
捕捉／プライマーの組み合わせの効率を、２５コピー／反応のｓｓＤＮＡを使用して試験した。配列番号４、５、６、７、８、および９の配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドの組み合わせが、最も効率的であった。
【０１３５】
従って、新規なＨＡＶ配列およびこれらの配列を使用する検出アッセイを、開示してきた。上記から、本発明の具体的な実施形態が本明細書中で例示目的のために記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが、認識される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−２９１２００（Ｐ２００９−２９１２００Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７８９１７（Ｐ２００９−１７８９１７）
【出願日】平成２１年７月３１日（２００９．７．３１）
【分割の表示】特願２００４−５１３４５４（Ｐ２００４−５１３４５４）の分割
【原出願日】平成１５年６月１２日（２００３．６．１２）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月３１日（２００９．７．３１）
【分割の表示】特願２００４−５１３４５４（Ｐ２００４−５１３４５４）の分割
【原出願日】平成１５年６月１２日（２００３．６．１２）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
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