Ｂ−Ｒａｆキナーゼ阻害剤に対する感受性についての診断試験
【課題】B-Rafキナーゼ阻害剤を用いた治療の候補者である患者の検出のための方法の提供。
【解決手段】BRAFにおけるV600E突然変異の有無をオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブを含んで成るアッセイにおいて患者由来の核酸を評価することで実施される。オリゴヌクレオチドは、任意の好適な方法、通常、化学的合成によって調製することができる。検出し、それによりB-Raf阻害剤に対する癌の感度を決定する方法。
【解決手段】BRAFにおけるV600E突然変異の有無をオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブを含んで成るアッセイにおいて患者由来の核酸を評価することで実施される。オリゴヌクレオチドは、任意の好適な方法、通常、化学的合成によって調製することができる。検出し、それによりB-Raf阻害剤に対する癌の感度を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
BRAF遺伝子は、セリン／スレオニンキナーゼであるB-Rafをコードしており、これは共役して活性化したRASから下流のMAPKキナーゼへとシグナル伝達する(Wellbrock et al., Cancer Res. 64: 2338-2342, 2004)。B-Rafにおける発癌誘発の突然変異は、キナーゼ機能の獲得をもたらして、典型的な増殖因子の不在下でRaf-MEK-ERK経路を恒常的に活性化する。この恒常的活性化は、転移性黒色腫の予後不良に関係している (Houben et al., 2004, 上掲)。BRAFの突然変異の活性化は種々の悪性腫瘍で報告されている。例えば、BRAFの突然変異は、70%ものヒト黒色腫の症例で見られる。エクソン１５のコドン６００における１７９９位のヌクレオチドの一塩基突然変異（T>A）がバリンからグルタミン酸への置換（V600E）をもたらし、これはB-Rafに突然変異を有する８５％超の黒色腫で存在している (Davies et al., Nature 417: 949-954, 2002; Garnett and Marais, Cancer Cell 6: 313-319, 2004; Gray-Schopfer et al., Cancer Metastasis Rev. 24:165-183, 2005; Houben et al., 2004)。頻度は多くないが、V600Eは１７９９−１８００位のヌクレオチドでの二塩基突然変異TG>AAから生じる (Houben et al., J Carcinog. 3:6, 2004)。
【背景技術】
【０００２】
多くのキナーゼ阻害剤、例えばB-Rafを阻害するものが知られている。そのような阻害剤には、PLX4032があり、これはB-Raf V600Eキナーゼ活性を選択的に阻害する。本発明は、B-Rafキナーゼ阻害剤、例えばPLX4032を用いた治療のためにV600Eポジティブな患者を同定して選択する方法を提供する。
【０００３】
本発明の簡単な概要
本発明は、B-Rafキナーゼ阻害剤を用いた治療の候補者である患者の検出のための方法及び組成物を提供する。従って、一つの観点において、本発明は、B-Raf阻害剤に対する癌細胞の感受性を決定する方法であって：(i) 癌患者由来の癌細胞から核酸試料を準備し、(ii) 前記核酸試料中の標的ポリヌクレオチド配列を、当該標的ポリヌクレオチド配列を増幅するプライマー対を用いて増幅し、ここで、当該標的ポリヌクレオチド配列は、BRAFにV600E突然変異部位を含んで成り、そして増幅は、配列番号１に記載の配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成り、且つBRAFのV600E突然変異部位にある突然変異配列の存在を検出する標識オリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施される；そして(iii) BRAFにおけるV600E突然変異の有無を検出し；それによりB-Raf阻害剤に対する癌の感受性を決定すること、を含んで成る方法、を提供する。態様によっては、前記プローブは配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する。前記増幅は、V600E突然変異部位での野生型配列の存在を検出する第二プローブの存在下実施することができる。態様によっては、前記第二プローブは、配列番号２の少なくとも１５個のヌクレオチドを含んで成る。態様によっては、前記プローブは、蛍光標識で標識することができる。前記プローブは更に、一方が蛍光色素であり、他方がクエンチング部分であるという２つの標識を用いて標識することもできる。
【０００４】
態様によっては、増幅反応で使用するプライマー対の両プライマーは、BRAFのエキソン１５とハイブリダイズする。態様によって、増幅反応で使用するプライマー対のプライマーの一方が、配列番号３に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチド配列を含んで成り、例えば、プライマー対の一方のプライマーが配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有することがある。追加の態様において、プライマー対の一方のプライマーが、配列番号４に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る。例えば、プライマーは、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有することがある。追加の態様において、増幅反応で使用するプライマー対は、配列番号３及び配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有するプライマーを含んで成る。
【０００５】
態様によっては、前記反応を増幅させる段階は、RP-PCRを含んで成る。
【０００６】
本方法は、B-Rafのアミノ酸位６００に突然変異、例えばV600E突然変異を有する癌を検出するのに利用することができる。態様によって、癌は黒色腫である。他の態様において、癌は結腸癌又は甲状腺癌である。態様によっては、突然変異を検出するために本発明の方法で使用する核酸試料は、皮膚生検由来のものでもよい。他の態様において、前記試料は結腸生検由来のものである。当該試料は、パラフィン包埋組織由来であることもある。本発明の方法は、患者がB-Raf阻害剤、例えば突然変異特異的B-Raf阻害剤、例えばPLX4032に感受性があるという診断を記録することを更に含んで成ることもある。
【０００７】
態様によって、本方法は、B-Raf阻害剤を患者に投与することを更に含んで成る。B-Raf阻害剤は、突然変異特異的B-Raf阻害剤、例えばPLX4032であってもよい。
【０００８】
別の観点において、本発明は、PLX4032治療候補者を同定する方法であって：被験者由来の試料を準備し；そして当該試料からBRAF V600E突然変異を含んで成る生体分子を検出し、それにより、PLX4032治療候補者を同定すること、を含んで成る方法、を提供する。態様によっては、前記生体分子は核酸である。他の態様において、当該生体分子はポリペプチドである。当該ポリペプチドは、例えば患者由来の癌細胞を含んで成る試料から得ることができる。態様によっては、前記ポリペプチドは、イムノアッセイを用いて検出してもよい。本方法はまた、PLX4032を被験者に投与することを含んで成る。
【０００９】
別の観点において、本発明は、B-Raf阻害剤を用いた治療の候補者である患者を検出するためのキットであって、BRAFのV600E突然変異を検出し、そして配列番号１に記載の配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る、第一対立遺伝子特異的プローブを含んで成る、キット、を提供するものである。態様によっては、プローブは配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する。本発明のキットは、第二対立遺伝子特異的プローブであって、野生型BRAF配列を検出し、そして配列番号２に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチド配列を含んで成るプローブを更に含んで成ることもある。態様によっては、第二プローブは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する。
【００１０】
追加の態様において、本発明のキットは、V600E突然変異部位を含んで成るBRAFの標的領域を増幅するプライマー対を更に含んで成る。例えば、当該プライマー対は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成るプライマーを含んで成ることがある。ある観点において、当該プライマーは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有する。他の態様において、前記プライマー対は、配列番号３及び配列番号４に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成るプライマーを含んで成ることがある。態様によっては、前記プライマー対は、配列番号３及び配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有するプライマーを含んで成る。
【００１１】
従って、態様によっては、本発明のキットは：配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するプローブ；配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するプローブ；配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；及び配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー、を含んで成ることがある。
【００１２】
本発明の詳細な説明
定義
本願の文脈において、「V600E」とはB-Rafのアミノ酸位６００にあるバリンの代わりにグルタミンの置換をもたらすBRAFにおける突然変異（ヌクレオチド位１７９９のT>A）を意味する。「V600E」はまた、従来の付番方式のもとでは「V599E」（１７９６T>A）としても知られている(Kumar et al., Clin. Cancer Res. 9:3362-3368, 2003).。
【００１３】
本発明では、「B-Rafキナーゼ阻害剤」はB-Rafキナーゼ活性を阻害するものである。このような阻害剤は、他のキナーゼ、例えば他のrafキナーゼの活性も阻害することがある。
【００１４】
「突然変異特異的B-Rafキナーゼ阻害剤」とは、本明細書で使用する場合、突然変異B-Raf、例えば、野生型B-Rafと比較してアミノ酸位６００がバリン残基である突然変異、例えばV600Eを有するB-Rafについて選択性を有するB-Raf阻害剤を意味する。そのような阻害剤は、野生型と比較して、少なくとも２倍、より頻繁には少なくとも３倍、あるいはそれ以上、強力な突然変異B-Raf、例えばV600E突然変異を有するB-Rafの阻害剤である。例えば、態様によっては、「突然変異特異的B-Raf阻害剤」は、V600E B-Rafの場合、キナーゼ阻害活性に対し約30nMのIC50を有することがあり（生化学的アッセイ）、一方、野生型の場合、相当のIC50は約100nMである。その効力は、細胞アッセイ、例えば増殖阻害を測定する細胞アッセイについてのIC50の観点でも比較することができる。本発明における「突然変異特異的B-Raf阻害剤」とは、B-Raf以外のキナーゼ、例えば他のrafキナーゼも阻害することがある。
【００１５】
用語「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な塩基対合に起因する２つの単一の標準的な核酸による二本鎖構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖間又はわずかなミスマッチ領域を含む核酸鎖間で起こる。本明細書で使用する場合、用語「実質的に相補的」とは、わずかなミスマッチ領域を除き相補的であることを意味する。典型的に、ハイブリダイズ領域にわたるミスマッチなヌクレオチドの総数は約１５ヌクレオチドの長さの配列につきヌクレオチド最大３個である。完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズする条件は、「ストリンジェントな」又は「配列特異的な」ハイブリダイゼーション条件と称される。実質的に相補的な核酸の安定二本鎖は、ストリンジェントに満たない条件下で達成することができる。核酸技術についての当業者は、多くの変動要因、例えばオリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対の濃度、イオン強度、及びミスマッチ塩基対の発生を実験的に考慮して二本鎖の安定性を決定することができる。例えば、二本鎖の安定性を算出するためのコンピューターソフトウェアは、National Biosciences, Inc. (Plymouth, Minn.)から市販されている、例えばOLIGO version 5、又は DNA Software (Ann Arbor, Michigan)から市販されている、Visual OMP 6がある。
【００１６】
オリゴヌクレオチドが完全に相補的な標的配列にのみハイブリダイズする、ストリンジェントな配列特異的ハイブリダイゼーション条件は当業界で周知である（例えば、核酸配列中の多型の検出についての項に供されている一般的な文献を参照のこと）。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境によって異なる。通常、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びpHにおける特定の配列についての熱融解温度（Tm）が約５℃未満になるよう選択される。このTmは、（規定のイオン強度及びpHのもと）塩基対の５０％が解離している温度である。ハイブリダイズ条件のストリンジェンシーを低下させることで、配列のミスマッチが許容されるようになる。許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件を適当に調節することで制御される。
【００１７】
用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち、４つの異なるヌクレオシド三リン酸及び重合剤（すなわちDNAポリメラーゼ又は逆転写酵素）／適当なバッファーの存在下で且つ適当な温度で、DNA合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、好ましくは一本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、標的配列と完全又は実質的に相補的な「ハイブリダイズ領域」、好ましくは約１５〜約３５個の長さのヌクレオチドを含む。プライマーオリゴヌクレオチドは、完全にハイブリダイズ領域から成るか、あるいは、増幅産物の検出、固定、又は操作を可能にするものの、DNA合成の開始剤としての役割を果たすプライマーの能力を変更しない、追加の特徴を含むことができる。例えば、核酸配列の尾部は、捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするプライマーの５’末端に含めることができる。
【００１８】
「対立遺伝子特異的」プライマーとは、本明細書で使用する場合、プライマーの３’末端、通常３’ヌクレオチドが注目の部位、例えば、BRAFのコドン６００内の第二番目の位置であるヌクレオチド１７９９と整列するように標的配列とハイブリダイズし、そしてその注目の位置にある野生型対立遺伝子又は突然変異の対立遺伝子のいずれかと完全に相補的であるようなプライマーである。本明細書で使用する場合、当該プライマーは、３’末端、例えば３’ヌクレオチド又は最後から２番目のヌクレオチドで完全に相補的な対立遺伝子に対し「特異的」である。通常、プライマー伸長は、ミスマッチがプライマーの３’末端に存在する場合に阻害される。対立遺伝子特異的プライマーは、完全に相補的な対立遺伝子とハイブリダイズする場合、より効率的に伸長可能である。同プライマーがその他の対立遺伝子とハイブリダイズする場合にさほど容易に伸長できないのは、ハイブリダイゼーション二本鎖における、プライマーの３’末端にある、例えば３’ヌクレオチド又は最後から２番目のヌクレオチドのミスマッチが原因である。従って、対立遺伝子特異的プライマーの使用は、伸長産物の形成の差異に基づき、対立遺伝子の識別をもたらす。
【００１９】
用語「プローブ」は、標的核酸と適当な条件下で選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。
【００２０】
「対立遺伝子特異的」プローブは、標的配列と完全に又は実質的に相補的な「ハイブリダイズ領域」を含み、これは注目の部位、例えば、BRAFのコドン６００内のヌクレオチド１７９９と完全に相補的である。従って、例えばV600E対立遺伝子特異的プローブは、V600E突然変異配列を選択的に検出し、一方、野生型BRAF対立遺伝子特異的プローブは選択的に野生型配列を検出する。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で当該プローブを用いて実施されるハイブリダイゼーションアッセイは、注目の部位を含んで成る特異的な標的配列の選択的な検出を可能にする。プローブハイブリダイゼーション領域は、好ましくは約１０〜約３５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約１５〜約３５ヌクレオチドの長さである。ハイブリダイゼーションの安定性に影響を及ぼす修飾塩基又は塩基類似体の使用であって、当業界で周知なものは、匹敵する安定性を有するより短い又はより長いプローブの使用を可能にし得る。プローブオリゴヌクレオチドは、完全にハイブリダイズ領域から成るか、あるいは、増幅産物の検出又は固定を可能にするものの、ハイブリダイゼーション領域のハイブリダイゼーション特性を大きく変更しない、追加の特徴を含むことができる。
【００２１】
用語「標的配列」又は「標的領域」は、解析すべき核酸領域を意味し、注目の多型部位を含んで成る。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、プライマー、プローブ及びオリゴヌクレオチドのフラグメントを意味する。これらの用語は長さを限定するものではなく、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−D-リボース含む）、ポリリボヌクレオチド（D-リボース含む）、及びそれ以外の任意なプリン又はピリミジン塩基、あるいは修飾プリン又はピリミジン塩基のN-グリコシドの直鎖重合体に対する総称である。これらの用語には、二本鎖及び一本鎖DNA、並びに二本鎖及び一本鎖RNAが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマー及び／又はプローブとして使用してもよい。
【００２３】
核酸、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、あるいは、制限しないが、ホスホトリエステル結合、ホスホラミダート(phosphoramidate)結合、シロキサン結合、カーボネート結合、カルボキシメチルエステル結合、アセトアミダート結合、カルバミン酸、チオエーテル結合、架橋ホスホラミダート結合、架橋メチレン・ホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、架橋ホスホロチオエート結合、又はスルホン結合を含む修飾された結合、及びそのような結合の組み合わせを含んで成ることができる。
【００２４】
核酸、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、5つの生物学的に生じた塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）、及び／又はその5つの生物学的に生じた塩基以外の塩基を含んで成ることができる。これらの塩基は、例えば、ハイブリダイゼーションを安定させるか又は不安定にするために；プローブ分解を促進するか又は抑制するために；あるいは検出可能部分又はクエンチャー部分の付着点としてといった多数の目的を果たすことができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、限定しないが、N6-メチル-アデニン、N6-tert-ブチル-ベンジル-アデニン、イミダゾール、置換イミダゾール、5-フルオロウラシル、5-ブロムウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルケオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5’-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、2,6-ジアミノプリン、及び5-プロピニル・ピリミジンを含む修飾された、非標準的な、又は誘導体化された塩基部分を1つ以上含むことができる。修飾された、非標準的な、又は誘導体化された塩基部分のその他の例が、米国特許番号第6,001,611号、同第5,955,589号、同第5,844,106号、同第5,789,562号、同第5,750,343号、同第5,728,525号、及び同第5,679,785号において見られる。
【００２５】
更に、核酸、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、限定しないが、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む修飾された糖部分を1つ以上含んで成ることができる。
【００２６】
緒言
本発明は、癌患者、例えば黒色腫の癌患者、結腸癌患者、甲状腺癌患者、及び低悪性度の重度の卵巣癌を有する患者であって、B-Raf阻害剤、例えば選択的突然変異B-Raf阻害剤、例えばPLX4032による治療の候補者である患者を選択するのに使用するためのV600E診断アッセイを提供する。従って、本診断試験は、PLX4032による治療に応答する可能性に従うことで患者を分類するのに使用することができる。
【００２７】
典型的に、V600E突然変異（V599E(1796T>A)としても知られている）は、エキソン１５のコドン６００におけるヌクレオチド位１７９９にある一塩基突然変異（T＞A）の存在を決定することを含んで成る方法を用いて検出される。この突然変異はまた、ヌクレオチド位１７９９−１８００にある二塩基突然変異TG>AAからも生じる。当該二塩基突然変異は、１７９９位を評価することによっても検出することができる。態様によっては、核酸は１８００位の置換の存在によっても評価することができる。
【００２８】
他の突然変異もコドン６００で起こることがある。これらには、V600K、V600D、及びV600Rも含まれる。態様によっては、V600E突然変異を検出するプローブは、他のコドン６００突然変異、例えばV600D、V600K及び／又はV600Rをも検出することができる。態様によっては、プローブはコドン６０１にある突然変異をも検出しうる。
【００２９】
V600E突然変異の存在は、典型的には、核酸、例えばゲノムDNA又はmRNAを、１７９９位置の塩基置換の存在について評価することで決定される。広範なアッセイが利用可能である。態様によって、このアッセイは５’ヌクレアーゼアッセイである。
【００３０】
V600Eは、例えばイムノアッセイを用いて、突然変異V600E B-Rafを検出することで検出することもできる。
【００３１】
V600Eの存在は、患者がB-Raf阻害剤、例えば突然変異特異的B-Raf阻害剤の治療候補者であることを示唆するものである。従って、本発明はまた、V600Eを有することが決定されている患者がRaf阻害剤、例えば選択的突然変異B-Raf阻害剤、例えばPLX4032で治療される方法も含んで成る。
【００３２】
生体試料
V600E突然変異は、様々な種類の癌、例えば黒色腫、結腸直腸癌；甲状腺癌、例えば甲状腺乳頭癌；及び卵巣癌、例えば低悪性度の重度の癌で検出することができる。態様によっては、V600E突然変異は、肺癌、神経膠腫、前立腺癌、肺癌、肉腫、肝臓癌、下垂体癌、並びに大腸、胆道、眼、膵臓、胃、中枢神経系、造血組織及びリンパ系組織で生じる癌において検出される。
【００３３】
V600E突然変異は、患者由来の生体試料で検出される。生体試料は、典型的に癌細胞を含んで成る。例えば、当該試料は、腫瘍生検、例えば悪性メラニン細胞の新生物、結腸直腸腫瘍、又は甲状腺腫瘍の生検；あるいは、転位部位由来の組織試料に由来するものであることもある。他の態様において、生体試料は血液又は別の体液であって、癌細胞を含むものであってもよい。他の態様において、生体試料は、循環している（無細胞）核酸を含んで成ることもある。
【００３４】
突然変異は、生体試料から得られる核酸において検出される。突然変異の存在について評価される核酸は、RNA又はDNAであってもよい。態様によっては、突然変異はゲノムDNAで検出される。
【００３５】
生体試料は、当業界における数々の方法のいずれかを用いて得ることができる。更に、生体試料は、固定剤、例えばホルムアルデヒドで処理し、パラフィン包埋し、そして使用のために切片にすることができる。あるいは、新鮮な又は凍結した組織を利用することもできる。他の態様において、細針吸引を使用してもよい。
【００３６】
核酸配列中のV600Eの検出
V600E突然変異の存在について核酸を評価するための検出技術は、分子遺伝学の分野で周知の手順を伴う。更に、この方法の多くが核酸の増幅を伴う。かかる手順を実施するための十分な指針が当業界で提供されている。文献の例として、例えばPCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplication (H. A. Erlich編, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Aplications (Innisら編, Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, 1994-1999, 2004年4月の補遺版を含む; Sambrook及び& Russel, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3版, 2001)がある。
【００３７】
本方法は典型的にはPCRの工程を採用するが、他の増幅プロトコールを使用してもよい。好適な増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（例えばWu及びWallace, Genomics 4:560-560, 1988）；鎖置換アッセイ（例えばWalkerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992; 米国特許第 5,455,166号明細書）；及び米国特許第 5,437,990号明細書, 同 5,409,818号明細書及び同 5,399,491号明細書に記載の方法を含む、様々な転写ベースの増幅系；転写増幅系(TAS)（Kwohら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989）及び自律配列複製(3SR) (Guatelliら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878, 1990; WO 92/08800号)を含む。あるいは、プローブを検出可能なレベルまで増幅する方法は、Qβ-レプリカーゼ増幅(Kramer及びlizardi, Nature 339: 401-402, 1989; Lomeliら, Clin. Chem. 35: 1826-1831, 1989)等を使用することができる。公知の増幅反応の概説は、例えばAnderson及びMeyersのCurrent Opinion in Biotechnology 4: 41-47, 1993に提供されている。
【００３８】
典型的には、V600Eの検出は、オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブを含んで成るアッセイにおいて患者由来の核酸を評価することで実施される。オリゴヌクレオチドは、任意の好適な方法、通常、化学的合成によって調製することができる。オリゴヌクレオチドは、市販の試薬及び機器を用いて合成することができる。あるいは、商業上の供給先から購入することもできる。オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業界で周知である（例えば、Narangら, Meth. Enzymol. 68: 90-99, 1979; Brownら, Meth. Enzymol. 68: 109-151, 1979; Beaucageら, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981; 及び米国特許第 4,458,066号明細書の固体支持体法）。更に、上記合成方法の修飾も、合成されたオリゴヌクレオチドに関して酵素作用の影響を与えるために好適に使用することができる。例えば、修飾ホスホジエステル結合（例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート又はボラノホスフェート）又はリン酸誘導体以外の結合のオリゴヌクレオチドへの取り込みは、特定の部位での開裂を避けるために使用することができる。更に、新規核酸鎖の合成の鋳型でもある核酸にハイブリダイズする場合に、2’-アミノ修飾糖を使用すると、オリゴヌクレオチドの消化の間に置換される傾向がある。
【００３９】
核酸レベルでV600E突然変異を検出する多くのアッセイが複数の一般的なプロトコールのいずれか：対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション、プライマー伸張、対立遺伝子特異的ライゲーション、塩基配列決定又は電気泳動的分離技術、例えば一本鎖高次構造多型(SSCP)及びヘテロ二本鎖解析を必要とする。アッセイの例として、５’ヌクレアーゼアッセイ、鋳型-指向型色素-ターミネーターの取り込み、分子ビーコン対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイ、一塩基伸長アッセイ及びリアルタイムのピロリン酸塩配列決定を用いた突然変異解析を含む。増幅配列の解析は、マイクロチップ、蛍光偏光アッセイ及びマトリックス支援レーザ脱離イオン化(MALDI )質量分析等の様々な技術を用いて実施することができる。更に使用できる２つの方法として、Flapヌクレアーゼによる浸潤的開裂及びパドロックプローブを用いる方法をベースとしたアッセイである。
【００４０】
V600E対立遺伝子の有無の決定は、解析されるべき患者由来の癌細胞を含んで成る生体試料から得られる核酸試料を解析することで通常実施される。しばしば、当該核酸試料はゲノムDNAを含んで成る。ゲノムDNAは、典型的には腫瘍試料から得られるが、他の細胞又は組織、例えば転移性の部位又は血液から得てもよい。
【００４１】
解析される核酸試料はRNAであってもよい。例えば、生体試料由来のmRNAを解析してV600E突然変異の有無を決定することができる。当該核酸試料は、標的核酸が発現している細胞、例えば転位部位由来の原発腫瘍又は組織から得られる。かかる解析は、最初に、例えばウイルス逆転写酵素を用いて標的RNAを逆転写させ、次いで得られたcDNAを増幅し；又は米国特許第 5,310,652号明細書；同 5,322,770号明細書；同 5,561,058号明細書；同 5,641,864号明細書；及び同 5,693,517号明細書に記載の複合型の高温逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いて実施することができる。
【００４２】
ヌクレオチド置換を検出するための核酸試料の解析にしばしば使用される方法論を簡単に説明する。しかしながら、当業界で知られているあらゆる方法を本発明において使用してヌクレオチド置換を検出することができる。
【００４３】
対立遺伝子特異的プローブ
対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、突然変異配列の一方に特異的なオリゴヌクレオチドを、核酸試料を増幅することで得られた増幅産物とハイブリダイズさせることにより、少なくとも１つの塩基が異なっている２つのDNA分子間での識別に依拠している。対立遺伝子特異的アッセイは、２つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、例えば、一方の変異体と、他方の変異体に対し、別個にハイブリダイズする、最初の変異体用の対立遺伝子特異的プローブ及び第二の変異体用の対立遺伝子特異的プローブを含んで成ることがある。対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、典型的には、短いオリゴヌクレオチド、例えば１５−３５個の長さのヌクレオチドを利用する。かかるプローブを設計するための原理及びガイダンスは当業界で入手可能なものであり、例えば、本明細書で引用する文献に記載されている。ハイブリダイゼーション条件は、十分にストリンジェントであるべきであり、これは、対立遺伝子間でハイブリダイゼーション強度に有意な違いがあること、好ましくは本質的に二種類の応答に有意な違いがあって、プローブが当該対立遺伝子の一方にのみハイブリダイズする条件のことである。プローブによっては、標的DNAの１セグメントとハイブリダイズし、その結果、注目の部位、すなわちBRAFのエキソン１５のコドン６００におけるヌクレオチド位１７９９が、前記プローブの中心部（例えば、１５塩基のオリゴヌクレオチドではその第７位；１６塩基のオリゴヌクレオチドではその第８又は９位）とアラインするが、このデザインは必須ではない。
【００４４】
対立遺伝子の量及び／又は存在は、試料とハイブリダイズする対立遺伝子特異的プローブの量を測定することで決定される。典型的に、オリゴヌクレオチドは、標識、例えば蛍光標識で標識される。例えば、V600Eヌクレオチド置換に特異的な対立遺伝子特異的プローブは、対立遺伝子との優先的なハイブリダイゼーションをもたらすハイブリダイゼーション条件下で、生体試料から得られた核酸とハイブリダイズする。蛍光強度は、特異的なオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたか否かを決定するために測定される。
【００４５】
１つの態様において、V600Eの位置に存在しているヌクレオチドは、V600E突然変異部位を含んで成るBRAFの突然変異（又は野生型）配列と完全に相補的なオリゴヌクレオチドプローブとの特異的なハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーションによって同定される。プローブがハイブリダイズする配列及び配列特異的なハイブリダイゼーション条件は、突然変異部位の１つのミスマッチがハイブリダイゼーション二本鎖を十分に不安定化させて、その結果、それが効果的に形成されないように選択される。従って、配列特異的なハイブリダイゼーション条件下では、安定な二本鎖は、前記プローブと完全に相補的な対立遺伝子配列との間でのみ形成する。従って、約１０〜約３５個の長さのオリゴヌクレオチドであって、突然変異部位を包含する領域内の対立遺伝子配列と完全に相補的なものは、本発明の範囲内である。
【００４６】
別の態様において、突然変異部位に存在しているヌクレオチドは、当該突然変異部位を包含している領域内の突然変異又は野生型の対立遺伝子と実質的に相補的であるか、当該突然変異部位で対立遺伝子と完全に相補的であるオリゴヌクレオチドとの十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションによって同定される。突然変異していない部位で生じるミスマッチにより、両対立遺伝子とのミスマッチが存在しており、標的対立遺伝子配列により形成された二本鎖と対応する標的でない対立遺伝子配列により形成された二本鎖とのミスマッチの数の違いは、標的対立遺伝子配列と完全に相補的な配列が使用される場合と同じである。この態様において、ハイブリダイゼーション条件は、標的配列との安定な二本鎖を形成させるよう十分に緩められ、同時に、標的以外の配列との安定な二本鎖の形成を除外するよう十分なストリンジェンシーが維持される。このような十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、プローブと標的対立遺伝子との間でのみ安定な二本鎖が形成する。従って、突然変異部位を包含する領域内の対立遺伝子配列と実質的に相補的であり、且つ突然変異部位の対立遺伝子配列と完全に相補的な約１０〜約３５の長さのオリゴヌクレオチド、好ましくは約１５〜約３５の長さのオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内である。
【００４７】
完全というより実質的に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ハイブリダイゼーション条件の最適化が制限されるアッセイフォーマットにおいて望ましいことがある。例えば、多数の標的が固定されたプローブアッセイフォーマットにおいては、各標的のプローブは、１つの固体の支持体上に固定される。ハイブリダイゼーションは、この固体の支持体と標的ＤＮＡを含む溶液とを接触させることで同時に実施される。全てのハイブリダイゼーションが同一の条件下で実施される場合、当該ハイブリダイゼーションは、各プローブについて別個に最適化することはできない。アッセイフォーマットがハイブリダイゼーション条件の調節を妨げる場合、プローブ内へのミスマッチの導入を利用して二本鎖の安定性を調節することができる。二本鎖の安定性に対する特定の導入済みミスマッチの効果は周知であり、そして二本鎖の安定性は、上述のとおり、ルーチンに推定し、且つ実験的に決定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件は、プローブの実際のサイズ及び配列に依存しており、これは、本明細書で提供され、そして当業界で周知のガイダンスを実験的に用いて選択することができる。オリゴヌクレオチドプローブを使用して配列内の一塩基対の違いを決定することは、Conner et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282、並びに米国特許第5,468,613及び5,604,099に記載されている。
【００４８】
完全にマッチしたハイブリダイゼーション二本鎖と一塩基がミスマッチしているハイブリダイゼーション二本鎖との間の安定性の比例した変化は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの長さに依存する。より短いプローブ配列で形成された二本鎖は、ミスマッチの存在により比例的により不安定化される。実際に、約１５個〜約３５個の長さのオリゴヌクレオチドは、配列特異的な検出にとって好ましい。更に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの末端は、熱エネルギーに起因する連続的な無作為の分離及び再アニーリングを受けるため、いずれかの末端でのミスマッチは、内部で生じるミスマッチよりもハイブリダイゼーション二本鎖を不安定化させる。好ましくは、標的配列内の一塩基対の変化を識別するために、プローブ配列は、突然変異部位が当該プローブの内部領域に生じるように標的配列とハイブリダイズするものが選択される。
【００４９】
BRAFとハイブリダイズするプローブ配列を選択するための上記基準は、プローブのハイブリダイズ領域、すなわち、標的配列とのハイブリダイゼーションに関与するプローブの部分にも適用される。プローブは、プローブのハイブリダイゼーション特性を大きく変化させることなく、追加の核酸配列、例えば、プローブを固定するのに使用されるポリＴテールと結合することがある。当業者は、本発明の方法に使用する場合、標的配列と相補的でない、すなわち、ハイブリダイゼーションに関与しない追加の核酸と結合したプローブが、未結合のプローブと本質的に同等であることを理解するであろう。
【００５０】
５’−ヌクレアーゼアッセイ
態様によっては、核酸試料は、米国特許第 5,210,015号明細書；同 5,487,972号明細書；及び同 5,804,375号明細書；及びHolland ら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280「TaqMan（登録商標）」又は「５’−ヌクレアーゼアッセイ」を用いて、V600E突然変異の存在についてアッセイされる。TaqMan（登録商標）アッセイでは、増幅された領域内でハイブリダイズする標識済みの検出プローブが増幅反応中存在している。プローブは、当該プローブがDNA合成のためのプライマーとして働かないように修飾される。増幅は、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて実施される。増幅の各合成ステップでは、伸張されるプライマーから下流の標的核酸にハイブリダイズする任意のプローブは、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。従って、新しい標的鎖の合成はプローブの分解をもたらし、この分解産物の蓄積は、標的配列の合成の指標となる。
【００５１】
本アッセイで利用するハイブリダイゼーションプローブは、V600E突然変異部位にあるBRAFの突然変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子とを識別する対立遺伝子特異的プローブであってもよい。あるいは、当該方法は、対立遺伝子特異的プライマー及び増幅産物に結合する標識プローブを用いて実施することができる。
【００５２】
分解産物を検出するための好適な任意の方法を、5’ヌクレアーゼアッセイで使用することができる。検出プローブは、一般的には、2種の蛍光色素で標識化され、そのうちの一つは他の色素の蛍光をクエンチングすることができる。色素は当該プローブに結合され、好ましくは一つが5’末端に、他方が内側部位に結合される。その結果、当該プローブはハイブリダイズしていない状態にある場合、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブの開裂が当該2種の色素間で起こるようにクエンチングが生じる。増幅は、色素間でのブローブの開裂を招くと共に、これに伴うクエンチングの排除及び最初にクエンチングした色素から観察される蛍光の増大をもたらす。分解産物の蓄積は、反応中の蛍光の増加量を測定することによって追跡できる。米国特許第 5,491,063号明細書及び同 5,571,673号明細書は、増幅と同時に生じるプローブの分解の代替的検出方法を説明している。
【００５３】
１つの態様において、BRAFにおけるV600E突然変異の存在について患者の試料を評価するための５’ヌクレアーゼアッセイは、以下のプライマー、又は当該配列と実質的に同一の配列を用いて実施することができる：
TTS068-BRAF_F1: 5' CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE 3' (E= t-ブチルベンジルdA) (配列番号25)
RL_BRAF_R5: 5' TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3' (配列番号4).
【００５４】
プライマー配列と実質的に同一の配列には、その同一の相補的な配列とハイブリダイズするものが含まれる。従って、態様によっては、本発明で使用するためのプライマー配列は、TTS068-BRAF_F1又はRL_BRAF_R5のうちの少なくとも１５個、場合によっては１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６個連続するヌクレオチドを含んで成る。態様によっては、プライマーはTTS068-BRAF_F1のうちの少なくとも２７、２８、２９、又は３０個連続するヌクレオチドを有している。他の態様において、本発明において使用するためのプライマーは、TTS068-BRAF_F1又はRL_BRAF_R5に対し少なくとも８０％の同一性、態様によっては少なくとも８５％の同一性、そして他の態様においては少なくとも９０％以上の同一性を有している。態様によって、フォワードプライマーはTTS068-BRAF_F1であり、リバースプライマーは、Ｘ染色体の偽遺伝子の識別を可能にするプライマーであって、RL_BRAF_R5と重複していないか、あるいはRL_BRAF_R5との重複が１０塩基対未満であるプライマーである。態様によって、リバースプライマーは、RL_BRAF_R5の結合部位の下流の２０又はそれ以下のヌクレオチドを含む部位と結合することができる。例えば、以下の配列のリバースプライマーを利用することもできる：
5' A AAT AGC CTC AAT TCT TAC CAT CCA CAA AA 3' (配列番号12)
5' TAG CCT CAA TTC TTA CCA TCC ACA AAA 3' (配列番号13)
5' TAG CCT CAA TTC TTA CCA TCC ACA AAE 3' (配列番号14)
5' AGG GCC AAA AAT TTA ATC AGT GGA AAA A 3' (配列番号15)
5' CAG TGG AAA AAT AGC CTC AAT TCT TAC CA 3' (配列番号16)
【００５５】
態様によっては、フォワードプライマーは、BRAF-F1の上流にある２０又はそれ以下のヌクレオチドを含む部位と結合することができる。態様によって、フォワードプライマーは、
5' TTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATE 3' (配列番号17);又は
5' ATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAE 3' (配列番号18)
であってもよい。
【００５６】
V600E突然変異は、RNAが起点の鋳型である場合にも検出することができる。そのようなアッセイには、リバースプライマー、例えば、
5' ATG ACT TCT GGT GCC ATC CAC AA 3' (配列番号19)
を含んで成るプライマーを含んで成ることもできる。
【００５７】
他の利用可能なリバースプライマーとして：
5' AAA AAT AGC CTC AAT TCT TAC CAT CCA CAA AA 3' (配列番号20);
5' GCC ATC CAC AAA ATG GAT CCA GAC A 3' (配列番号21);又は
5' CAA AAT GGA TCC AGA CAA CTG TTC AAA 3' (配列番号22)
がある。
【００５８】
本発明の一態様において、５’ヌクレアーゼアッセイは、以下の対立遺伝子特異的プローブの一方又は両方を用いて実施され、これは、突然変異(TTS155-BRAF_MU)又は野生型(TTS148-BRAF_WTs)配列のいずれかを検出する:
TTS155-BRAF_MU 5' QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3' (配列番号23)
TTS148-BRAF_WT 5' QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3' (配列番号24)
(E = HEXレポーター色素, F= FAMレポーター色素, I =デオキシイノシン, Q = BHQ2クエンチャー色素, P= 3’-リン酸)。当該色素(F又はE)は、dIとdA(TTS155-BRAF_MU)又はdGとdA (TTS148-BRAF_WT)のいずれかの間に挿入される。
【００５９】
当業界で理解されているように、TTS155-BRAF_MU又はTTS148-BRAF_WTプローブは、例えば特定の蛍光色素、クエンチャー、及び／又は色素の位置が変更されて、上述のものと異なっていることがある。
【００６０】
態様によっては、V600E、例えばTTS155-BRAF_MUを検出するプローブは、V600D (1799_1800TG>AT)及びV600K (1798_1799GT>AA)も検出する。態様によっては、V600E突然変異を検出するプローブは、K601E (1801A>G)及びV600R (1798_1799GT>AG)も検出する。
【００６１】
態様によっては、プローブ配列と実質的に同一の配列を使用することもできる。プローブと実質的に同一の配列には、そのプローブと同一の相補配列とハイブリダイズするものも含まれる。従って、態様によっては、本発明に使用するためのプローブ配列は、TTS155-BRAF_MU又はTTS148-BRAF_WTの少なくとも15個の連続するヌクレオチド、場合によっては、少なくとも16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 又は30個の連続するヌクレオチドを含んで成る。態様によっては、プライマーはTTS155-BRAF_MU又はTTS148-BRAF_WTの少なくとも27, 28, 29, 又は30個の連続するヌクレオチドを有する。他の態様において、本発明で使用するためのプライマーは、TTS155-BRAF_MU又はTTS148-BRAF_WTに対し少なくとも８５％の同一性、そして他の態様においては少なくとも９０％以上の同一性を有している。
【００６２】
BRAFにおけるV600E突然変異を検出するための５’ヌクレアーゼアッセイは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する任意のポリメラーゼを利用することができる。従って、態様によっては、５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、熱安定性及び熱活性を有する核酸ポリメラーゼである。かかる熱安定性ポリメラーゼには、限定しないが、真正細菌属であるサーマス(Thermus)、サーマトガ(Thermatoga)、及びサーモシフォ(Thermosipho)の様々な種に由来する天然及び組換え型のポリメラーゼ、並びにそれらのキメラ型を含む。例えば、本発明の方法で使用することのできるサーマス種のポリメラーゼには、サーマス・アクアチカス(Thermus aquaticus) (Taq) DNAポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus) (Tth) DNAポリメラーゼ、サーマス種sps17 (sps17)、及びサーマス種Z05（例えば、米国特許第5,405,774号；第5,352,600号；第5,079,352号；第4,889,818号；第5,466,591号；第5,618,711号；第5,674,738号及び第5,795,762号に記載のもの)が含まれる。本発明の方法で使用することのできるサーマトガポリメラーゼには、例えば、サーマトガ・マリチマ(Thermatoga maritima)DNAポリメラーゼ及びサーマトガ・ネアポリタナ(Thermatoga neapolitana)DNAポリメラーゼがあり、一方、使用することのできるサーモシフォポリメラーゼの例には、サーモシフォ・アフリカヌス(Thermosipho africanus)DNAポリメラーゼがある。サーマトガ・マリチマ(Thermatoga maritima)及びサーモシフォ・アフリカヌス(Thermosipho africanus)DNAポリメラーゼの配列は、国際特許公報WO 92/06200で公開されている。サーマトガ・ネアポリタナ(Thermatoga neapolitana)の配列は、国際特許公報WO 97/09451で見られる。
【００６３】
５’ヌクレアーゼアッセイにおいて、増幅検出は通常増幅と並行して行われる（すなわち、「リアルタイム」）。態様によって、態様によっては、増幅の検出は定量的であり、且つ、増幅の検出はリアルタイムである。態様によっては、増幅の検出は定性的である（例えば、標的核酸の存在又は不在の終点検出）。態様によっては、増幅の検出は増幅の後である。態様によっては、増幅の検出は定性的であり、且つ、増幅の検出は増幅の後である。
【００６４】
プローブは、任意の数の標識で検出することができるが、通常、これは蛍光標識である。態様によっては、フルオロフォア部分は、フルオレセイン・ファミリーの色素、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの色素、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの色素、クマリン・ファミリーの色素、ローダミン・ファミリーの色素、シアニン・ファミリーの色素、オキサジン・ファミリーの色素、チアジン・ファミリーの色素、スクアライン・ファミリーの色素、キレート化ランタニド・ファミリーの色素、アゾ・ファミリーの色素、トリフェニルメタン・ファミリーの色素、及びBODIPY（登録商標）・ファミリーの色素から成る群から選択される。
【００６５】
本アッセイは、しばしば、蛍光標識及びクエンチャー部分で標識されたプローブを含んで成る。態様によっては、クエンチャー部分は、フルオレセイン・ファミリーの色素、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの色素、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの色素、クマリン・ファミリーの色素、ローダミン・ファミリーの色素、シアニン・ファミリーの色素、オキサジン・ファミリーの色素、チアジン・ファミリーの色素、スクアライン・ファミリーの色素、キレート化ランタニド・ファミリーの色素、BODIPY（登録商標）・ファミリーの色素、アゾ・ファミリーの色素、トリフェニルメタン・ファミリーの色素、低蛍光クエンチャー部分（すなわち、「ジムドナー(dim donor)」）、及び非蛍光クエンチャー部分（例えば、Black Hole Quenchers（登録商標）（BHQ）を含めた、いわゆる「ダーク・クエンチャー」）から成る群から選択される。
【００６６】
1つの態様において、フルオロフォア部分はフルオレセイン・ファミリーの色素であり、且つ、クエンチャー部分がシアニン・ファミリーの色素である。1つの態様において、フルオロフォア部分はフルオレセイン・ファミリーの色素であり、且つ、クエンチャー部分はヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの色素である。1つの態様において、フルオロフォア部分はヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの色素であり、且つ、クエンチャー部分はシアニン・ファミリーの色素である。1つの態様において、クエンチャーはダーク・クエンチャー、例えばBHQ-1、BHQ-2、又はBHQ-3（Biosearch Technologies, Novato, CA）である。1つの態様において、フルオロフォア部分は、フルオレセイン・ファミリーの色素又はシアニン・ファミリーの色素であり、且つ、クエンチャー部分はダーク・クエンチャーである。
【００６７】
固定化担体
態様によっては、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、固定された標的又は固定されたプローブを用いたアッセイフォーマットにおいて実施される。そのようなフォーマットは、当業界で知られており、例えば、ドット−ブロットフォーマット及びリバースドットブロットアッセイフォーマットがあり、これらは米国特許第5,310,893号；第5,451,512号；第5,468,613号；及び第5,604,099号に記載されている。
【００６８】
対立遺伝子特異的プライマー
V600E突然変異の有無は、対立遺伝子特異的増幅又はプライマー伸長法を用いて検出することができる。これらの反応は、プライマーの３’末端、例えば３’ヌクレオチド又は３’ヌクレオチドの最後から２番目のヌクレオチドにあるミスマッチを介して突然変異（又は野生型）部位を特異的に標的にするよう設計されたプライマーの使用を通常伴う。ミスマッチの存在は、ポリメラーゼがエラー修正活性を欠いている場合、当該ポリメラーゼがプライマーを伸長する能力を発揮させる。例えば、対立遺伝子特異的増幅又は伸長をベースとした方法を用いてV600E突然変異配列を検出するために、BRAFのコドン６００におけるヌクレオチド位１７９９にある突然変異Ａ対立遺伝子と相補的なプライマーは、３’末端ヌクレオチドがこの突然変異の位置でハイブリダイズするよう設計されている。突然変異対立遺伝子の存在は、プライマーの伸長を開始する能力によって決定することができる。３’末端がミスマッチしている場合、伸長は阻害される。従って、例えば、プライマーが３’末端の突然変異対立遺伝子のヌクレオチドとミスマッチしている場合、プライマーは効果的に伸長する。増幅は、１７９９位にあるBRAF野生型配列由来の特異的な対立遺伝子特異的プライマーを用いて実施することもできる。
【００６９】
典型的に、プライマーは増幅反応において第二のプライマーと一緒に使用される。第二のプライマーは、突然変異の位置と無関係の部位でハイブリダイズする。増幅は、２つのプライマーから出発して、検出可能な産物をもたらし、これは特定の対立遺伝子型が存在していることを表す。対立遺伝子特異的な増幅又は伸長をベースとした方法は、例えば、WO 93/22456; 米国特許第5,137,806号；第5,595,890号；第5,639,611号；及び米国特許第4,851,331号に記載されている。
【００７０】
対立遺伝子特異的増幅をベースとした遺伝子型決定を用いた、対立遺伝子の同定は、増幅した標的配列の有無の検出のみを必要とする。増幅された標的配列の検出方法は当業界で周知である。例えば、記載されているゲル電気泳動及びプローブハイブリダイゼーションアッセイは、核酸の存在を検出するために頻繁に使用される。
【００７１】
別のプローブ無しの方法において、増幅した核酸は、反応混合物における二本鎖DNAの合計量の増大をモニタリングすることで検出され、これらは、例えば、米国特許第5,994,056号；及び欧州特許公報第487,218号及び第512,334号に記載されている。二本鎖の標的DNAの検出は、二本鎖DNAと結合した場合に種々のDNA結合色素、例えばSYBRグリーンが示す蛍光の増大に依拠している。
【００７２】
当業者が認識しているように、対立遺伝子特異的な増幅方法は、多数の対立遺伝子特異的プライマーを利用して特定の対立遺伝子をターゲティングする反応で実施することができる。そのような多数の応用のためのプライマーは、通常区別可能な標識で標識されるか、あるいは対立遺伝子から生成した増幅産物がサイズで区別されるよう選択される。従って、例えば、一試料中の野生型及び突然変異V600E対立遺伝子の両方が、一回の増幅反応を用い、増幅産物のゲル解析によって同定することができる。
【００７３】
対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、ハイブリダイゼーション領域中の対立遺伝子の一方と完全に相補的であってもよく、あるいは３’末端のオリゴヌクレオチド以外の位置に幾つかのミスマッチを有することがある。例えば、最後から２番目の３’ヌクレオチドは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドにおいてミスマッチしていることがある。他の態様において、ミスマッチは、両対立遺伝子配列の（非突然変異）部位で起こることがある。
【００７４】
別のV600E BRAF核酸突然変異の検出法
V600E突然変異の存在（不在）は、直接的な配列決定によっても検出することができる。方法として、ジデオキシ配列決定をベースとした方法及び、オリゴヌクレオチドの伸長産物のピロシーケンス (Pyrosequencing)（登録商標）のような方法がある。かかる方法は、しばしば、PCRのような増幅技術を利用する。配列決定のための他の類似の方法は、完全PCRの使用を必要としないが、典型的には、研究目的のヌクレオチドと相補的な１つの蛍光標識されたジデオキシリボ核酸分子（ddNTP）によるプライマーの伸長のみを典型的に使用する。多型部位にあるヌクレオチドは、一塩基伸長しているプライマーの検出を介して同定することができ、これは蛍光標識されている（例えば、Kobayashi et al, Mol. Cell. Probes, 9:175-182, 1995）。
【００７５】
増幅反応を用いて生成した増幅産物は、変性グラジエントゲル電気泳動を利用することで解析することもできる。異なる対立遺伝子は、異なる配列に依存した融解特性及び溶液中でのDNAの電気泳動をベースとして同定することができる（例えば、Erlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, W. H. Freeman and Co, New York, 1992, Chapter 7を参照のこと）。
【００７６】
他の態様において、標的配列の対立遺伝子は、一本鎖DNA高次構造多型解析を用いて区別することができ、これは、一本鎖PCR産物の電気泳動における変化によって塩基の違いを同定するものであり、例えば、Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989)で説明されている。増幅PCR産物は、上述のとおり生成することができ、そして加熱するか他の方法で変性され、一本鎖増幅産物を形成する。一本鎖核酸は、リフォールディングするか、あるいは塩基配列に部分的に依存する二次構造を形成することがある。一本鎖の増幅産物の電気泳動の異なる移動度は、標的領域の対立遺伝子間の配列の違いと関連付けることができる。
【００７７】
BRAFにおけるV600E突然変異の存在を検出するのに使用する方法は、典型的に、上述したような標識されたオリゴヌクレオチド、例えば蛍光標識で標識されたものを利用する。オリゴヌクレオチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的な手段によって検出可能な標識を取り込むことで標識することができる。有用な標識には、蛍光色素、放射性標識、例えば32P、 高電子密度試薬、酵素、例えばペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ、ビオチン、又はハプテン及び抗血清、あるいはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質及びハプテンがある。標識技術は当業界で周知である（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 上掲; Sambrook & Russell, 上掲を参照のこと）。
【００７８】
タンパク質変異体の検出
B-Raf中のV600E突然変異は、野生型と突然変異のB-Rafを識別する方法によって検出することができる。しばしば、これらの方法は突然変異B-Rafと特異的な抗体を利用する。
【００７９】
利用可能な技術の概略は、Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)及びHarlow & Lane, Using Antibodies (1999)で見られる。対立遺伝子変異体と特異的に反応するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は当業界で周知である（例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, 上掲; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986);及びKohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)を参照のこと)。このような技術には、ファージ又は類似のベクターの組換え抗体ライブラリーからの抗体の選択による抗体調製、並びに、ウサギ又はマウスを免疫化することによるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製が含まれる（例えば、Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)を参照のこと）。
【００８０】
突然変異B-Rafは、種々のイムノアッセイ法によって検出することができる。免疫学的な手順及びイムノアッセイの手順の概説については、Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 7th ed. 1991)を参照のこと。更に、本発明のイムノアッセイは、複数の構成のいずれかで実施することができ、これらはEnzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980); and Harlow & Lane, 上掲で広範に概説されている。一般的なイムノアッセイの概説については、Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, eds., 7th ed. 1991)も参照のこと。
【００８１】
一般に使用されているアッセイには、非競合的なアッセイ、例えばサンドイッチアッセイ及び競合アッセイがある。典型的に、ELISAアッセイのようなアッセイを使用することができる。ポリペプチド変異体の量は、定量アッセイを実施することで検出することができる。
【００８２】
他の検出技術、例えばMALDIは、B-Raf中のV600Eの存在を直接検出するのに使用することもできる。
【００８３】
解析用の試料は、患者由来の癌細胞、例えば腫瘍組織から得られる。
【００８４】
治療
突然変異の検出法には、ユーザーに対し、B-Raf V600E突然変異の有無に基づき、それぞれ患者がB-Raf阻害剤、例えば突然変異特異的B-Raf阻害剤、例えばPLX4032で治療されるべきか否かを知らせるデータ解析ソフトの使用も含まれる。
【００８５】
アミノ酸位６００における突然変異の存在について陽性であると決定されている患者は、B-Rafキナーゼ阻害剤、例えば突然変異特異的B-Rafキナーゼ阻害剤、例えばPLX4032による治療候補者である。種々のB-Rafキナーゼ阻害剤、例えば突然変異特異的B-Rafキナーゼ阻害剤は、WO 2007/002325及びWO 2007/002433で説明されている。PLX4032は、WO 2007/002433及びWO 2007/002325では「P-0956」と称されている。
【００８６】
B-Rafキナーゼ阻害剤、例えば突然変異特異的B-Rafキナーゼ阻害剤の投与の指針は、例えばWO/2007/002325、及びWO/2007/002433で見ることができる。適当な剤形は、一部、用途又は投与経路、例えば経口、経皮、経粘膜、吸入又は注射（非経口）に依存している。かかる剤形は、化合物が標的細胞に到達するのを可能にするものであるべきである。他の要因も当業界では周知であり、例えば毒性及び、化合物又は組成物がその効果を発揮するのを遅らせる剤形である。このような技術及び製剤は、通常、The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia, PA, 2005で見ることができる。
【００８７】
医薬組成物は担体又は賦形剤を含むことができる。当該担体又は賦形剤は、化合物の投与を容易にするよう選択することができる。担体の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、例えばラクトース、グルコース、又はサッカロース、あるいはデンプンの複数のタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール及び生理学的に許容される溶媒、がある。生理学的に許容される溶媒の例として、注射用滅菌水（WFI）、生理食塩水、及びデキストロースがある。
【００８８】
前記化合物は、異なる経路、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経口、経粘膜、直腸、又は吸入によって投与することができる。態様によって、特異的なB-Rafキナーゼ阻害剤は経口投与される。経口投与の場合、例えば、化合物は、常用の経口剤形、例えばカプセル、錠剤、及び液体調製物、例えばシロップ、エリキシル、及び濃縮ドロップに製剤化することができる。
【００８９】
吸入の場合、B-Raf阻害剤は乾燥粉末又は適当な溶液、懸濁液、あるいはエアロゾルとして製剤化してもよい。粉末及び溶液は、当業界で知られている適当な添加物を用いて製剤化してもよい。例えば、粉末は、適当な粉末の基剤、例えばラクトース又はデンプンを含んでもよく、そして溶液は、ポリエチレングリコール、滅菌水、エタノール、塩化ナトリウム及び他の添加物、例えば酸、アルカリ及び緩衝液の塩を含んで成ることもある。かかる溶液又は懸濁液は、スプレー、ポンプ、噴霧器、又はネブライザー等を介する吸入によって投与してもよい。
【００９０】
あるいは、B-Raf阻害剤は、注射することができ（非経口投与）、例えば筋肉内、静脈内、腹腔内、及び／又は皮下投与してもよい。注射の場合、前記阻害剤は、滅菌水溶液、。好ましくは生理学的に許容される緩衝液又は溶液、生理食塩水、ハンクス液、又はリンガー液中で調製される。更に、前記化合物は、固形として製剤化し、使用直前に再溶解又は懸濁してもよい。凍結乾燥型も製造することができる。
【００９１】
投与は、経粘膜、局所、又は皮下からの手段によってもよい。経粘膜、局所、又は皮下からの投与の場合、障壁に対して浸透されるのに適した浸透剤が製剤中で使用される。かかる浸透剤は当業界で一般的に知られており、例えば、経粘膜の場合、胆汁塩及びフシジン酸誘導体がある。更に、界面活性剤を使用して浸透を容易にしてもよい。経粘膜投与は、例えば、スプレー式点鼻薬又は座薬（肛門又は膣用）を介してもよい。本発明の局所用組成物は、当業界で知られている適切な担体を選択することで、好ましくは油、クリーム、ローション、軟膏等として製剤化される。適当な担体には、植物油又は鉱油、白色ワセリン（白色軟パラフィン）、分枝鎖脂肪又は油、動物性脂肪及び高分子量アルコールがある。好ましい担体は、活性成分が可溶性のものである。乳化剤、安定化剤、保湿剤及び抗酸化剤も、色又は芳香をつける物質同様、所望により含めることができる。局所適用のためのクリームは、鉱油、自己乳化蜜蝋及び水の混合物であって、少量の溶媒（例えば、油）に溶解した活性成分が混合されている混合物から製剤化することができる。更に、経皮手段による投与は、活性成分及び当業界で知られている任意の１又は複数の担体若しくは希釈剤を含浸させた経皮パッチ又は包帯、例えばバンデージを含んで成ることもある。経皮送達系で投与されるために、剤形の投与は、当然のことながら、用法を通じて断続的というよりも連続して行われる。
【００９２】
投与されるべき種々の化合物の量は、化合物のIC50、化合物の生物学的半減期、被験者の年齢、サイズ、及び体重等の要因、並びに被験者に関する種々の他のパラメーターを考慮して、標準的な手順によって決定することができる。このような因子の重要性は当業者に周知である。通常、用量は治療される被験者1kg当たり0.01〜50mg、好ましくは0.1〜20mgである。複数回投与を使用してもよい。
【００９３】
B-Raf阻害剤は、他の抗癌療法と一緒に使用することができる。
【００９４】
キット
本発明は、本方法を実施するのに有用な成分を含んで成るキットを提供する。態様によっては、当該キットは、前記突然変異又はV600E対立遺伝子に特異的な１又は複数のオリゴヌクレオチドプローブを含んで成ることがある。かかるキットは、V600E突然変異部位を包含するBRAFの遺伝子座の領域を増幅する増幅プライマーを含むことができる。従って、態様によっては、キットは、プライマーセットとして
TTS068-BRAF_F1: 5' CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE 3' (E= t-ブチルベンジルdA) (配列番号25)及び
RL_BRAF_R5: 5' TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3' (配列番号4)を含んで成り、これらは、BRAFの標的領域を増幅する。前記キットは、プローブ、例えば対立遺伝子特異的プローブを更に含んで成ることもできる。本発明のキットで使用することのできる対立遺伝子特異的プローブの例として：
TTS155-BRAF_MU 5' QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3' (配列番号23)
TTS148-BRAF_WT 5' QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3' (配列番号24)
がある。
【００９５】
キットは、言及したオリゴヌクレオチドと実質的に同一のプライマー及び／又はプローブも含んで成る。態様によっては、本発明に使用するためのキットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び／又は配列番号４の核酸配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る１又は複数のオリゴヌクレオチドを含んで成る。
【００９６】
前記キットの他の任意の成分として、ヌクレオチド置換の存在を決定するための追加の試薬がある。例えば、キットは、増幅反応のためのポリメラーゼ、基質としてのヌクレオシド三リン酸及び適切な緩衝液、並びに本発明の方法を実施するための説明書を含むこともできる。キットの他の構成要素には、DNA抽出試薬及びプロトコール及び二価イオンの補因子を含めることもできる。当該緩衝液は、例えばUNGを含むことができる。態様によっては、緩衝液はアプタマーを含むことができる。
【００９７】
キットは更に、コントロール、例えばV600E DNAコントロールを含んでもよい。
【００９８】
実施例
B-Raf V600E突然変異の検出
本実施例は、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された（FFPE）癌の腫瘍組織から抽出したゲノムDNAのV600E（BRAFヌクレオチド１７９９T>A）突然変異の測定のためのリアルタイムPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）ベースの診断試験を示すものである。本実施例において、FFPE組織から抽出したゲノムDNAは、TaqMan PCR解析によって試験した。PCR反応のために、Master MixをTaqMan RNA Reaction Mix, Primer-Probe Mix及び酢酸マグネシウム(Mg(OAc)2)補因子を混合することで調製した。増幅は、125 ngのゲノムDNAを用いて実施した。増幅産物は、COBAS TaqMan 48アナライザーを用いて検出した。
【００９９】
B-Raf V600E部位 (BRAF 1799 T>A)をエキソン15に含むゲノム領域を増幅して、１１６塩基対の二本鎖DNA（アンプリコン）を生成させた。増幅反応は、５５サイクルで実施した。増幅及び検出系は、増幅の各サイクルで生成したPCR産物の量を、標的特異的プローブの開裂から生じる蛍光シグナルを測定することで、リアルタイムに測定した。標的特異的B-Raf野生型（WT;V600）及びB-Raf V600E突然変異プローブは、異なるレポーター色素でそれぞれ標識した。各増幅サイクルの間にこれらのレポーター色素によって放出された蛍光の波長特異的測定により、一個の反応チューブ中でのB-Raf WT及びV600Eの同定が可能となった。一旦各レポーター色素からの蛍光シグナルが既定の閾値に達してから、多重反応におけるWT及びV600Eの両方の突然変異対立遺伝子について、サイクル閾値（Ct）を算出した。
【０１００】
BRAFプライマーは、１１５塩基対（ｂｐ）のBRAFのエキソン１５領域を増幅するよう設計した。Human Genome March 2006 Assembly上のUCSCゲノムブラウザーのBLATツール(http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start)を用いたところ、BRAFのエキソン15は、恐らく偽遺伝子であるX染色体(chrX) の配列chrX:74721094-74721213と９３．４％のホモロジーを有していた。BRAFのイントロン１５の一部を含むリバースプライマーを使用して、意図したBRAF配列を特異的に増幅させた。図１に示すように、リバースプライマーはX染色体配列とわずかに５５．６％のホモロジー（２７ヌクレオチド中１５個）を有していた。BRAFプライマー−プローブミックス中のプローブは、このリバースプライマーの伸長から生じる増幅鎖と相補的であり、これは更に、試験結果がBRAF配列と特異的であることを保証するものである。
【０１０１】
プライマーは、ABI 394 DNA合成装置(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)上で、標準的なデオキシヌクレオチドホスホラミダイト、アクチベーターとしてのジシアノイミダゾール (DCI) 及び常用の３’→５’の方向での固相の制御多孔ガラス(CPG)支持体上での標準的な合成サイクル（若干修正済み）を用い、合成した。５’-t-ブチルベンジルdAは、修飾ヌクレオシドとして取り込み、CPG ( Roche Applied Sciences, Penzberg, Germany)の一部は当該DNA合成のための固体の支持体として使用した。最後の塩基の付加後、５’−ジメトキシトリチル(DMT)保護基は前記合成装置上で除去され、そしてオリゴヌクレオチドは、水酸化アンモニウムを用い、５５℃で１６時間脱保護された。粗製オリゴヌクレオチドを蒸発させて、アンモニアを除去し、そしてMono-Q HR 16/10強塩基陰イオン交換高圧液体クロマトグラフィー (HPLC)カラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を用い、直線勾配の塩化ナトリウムにより、高pHで精製した。画分はPA100 (Dionex Inc., Sunnyvale, CA)イオン交換カラムを用いて解析し、そして９０％超という最小の純度基準を用いてプールした。プールされた画分は、脱塩後、10 mM Tris, pH 8.0中で調製した。以下のプライマーをPCR反応のために合成した：
TTS068-BRAF_F1: 5' CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE 3' (E= t-ブチルベンジルdA) (配列番号25)及び
RL_BRAF_R5: 5' TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3' (配列番号4)。
【０１０２】
TaqManプローブをABI 394 DNA合成装置(Applied Biosystems Inc.)上でウルトラマイルドデオキシヌクレオチドホスホラミダイト (Pierce Biotechnology, Milwaukee, WI)、アクチベーターとしてのDCI及び常用の３’→５’の方向でのCPG支持体上での標準的な合成サイクル（若干修正済み）を用い、合成した。蛍光標識であるcx-FAM (6-カルボキシフルオレセイン, Biogenex Inc.)又はcx-HEX (6-カルボキシフルオレセイン(Biogenex Inc., San Ramon, CA)、及びブラックホールクエンチャー (BHQ-2) (Biosearch Inc., Novato, CA)を、ホスホラミダイト試薬及び１０分のカップリングサイクルを用いて取り込んだ。３’−リン酸を、３’−伸長ブロッカーCPG (Clontech Inc., Mountain View, CA)によって取り込んだ。合成後、DMT保護基は前記合成装置上で除去され、そしてオリゴヌクレオチドは、水酸化アンモニウムを用い、周囲温度で１６時間かけて脱保護された。粗製オリゴヌクレオチドはMono-Q HR 16/10強塩基陰イオン交換HPLCカラム(Amersham Biosciences)を用い、直線勾配の塩化ナトリウムにより精製した。画分は、DNAPac PA100 (Dionex Inc., Sunnyvale, CA)イオン交換カラムを用いて解析し、そして９０％超という最小の純度基準を用いてプールした。プールした画分は脱塩し、そして80 mMトリシン, pH 8.2、240 mM酢酸カリウム、0.1 mM EDTA、及び0.09%アジ化ナトリウムを含んで成るプローブ保存緩衝液中で調製した。Taqman（登録商標）プローブは以下のとおりである：
V600E (TTS155-BRAF_MU): 5' QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3' (配列番号23)
野生型(TTS148-BRAF_WT): 5' QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3' (配列番号24)
(E = HEX レポーター色素, F= FAM レポーター色素, I =デオキシイノシン, Q = BHQ2クエンチャー色素, P= 3’-リン酸)。
【０１０３】
増幅反応には、AmpErase (ウラシル-N-グリコシラーゼ, UNG)及びデオキシウリジン三リン酸 (dUTP)を含ませた。AmpEraseは、デオキシウリジンを含むがチミジンを含まないDNA鎖の破壊を認識して触媒する。デオキシウリジンは、天然のDNAではないが、PCR反応混合物試薬中のdNTPのうちの１つとしてチミジン三リン酸の代わりに、デオキシウリジン三リン酸の使用によって常にアンプリコン中に存在している。反応混合物中でのUNGの取り込みは、アンプリコンの持ち越しによって生じた混入を最小化する。AmpEraseは標的アンプリコンを分解せず、あったとしてもプローブ、及び試験キットを分解しない。
【０１０４】
PCR産物の検出
本実験で利用するBRAFプライマー−プローブの混合物は、B-Raf WT又はV600Eをコードするヌクレオチド配列に特異的な二重標識された蛍光標識をそれぞれ含んでおり、これらは増幅プロセスの間、蛍光シグナルの放出を通じて特異的なPCR産物のリアルタイムな検出を可能にする。B-Raf WT及びV600Eプローブは、異なる蛍光レポーター色素及び同一のクエンチャー色素で標識されている。プローブが無傷の場合、レポーター色素の蛍光は、クエンチャー色素により、フォスター型のエネルギー変換に起因して抑制される。PCRの間、各プローブは、配列依存的に、その標的配列とハイブリダイズし、そしてZ05 DNAポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性によって開裂し、そして２つの色素を分離する。一旦レポーター及びクエンチャー色素が分離すると、レポーター色素由来の蛍光は検出可能になる。PCRサイクル毎にアンプリコンがより生成されるにつれ、レポーター色素由来の蓄積したシグナルは効果的に増大する。B-Raf WT及びV600E配列は、各サイクルの間各プローブをその相当の特異的な発光波長範囲で測定することで独立してモニタリングした。
【０１０５】
各ゲノムDNA試料は、50μLのワーキングマスターミックスを含んで成る100 μLの反応液中で増幅され、これは、一試料当たり、17μLのプライマー−プローブミックス及び13μLの25 mM Mg(OAc)2補因子を20μLのTaqMan RNA反応混合物に添加することで調製した。ゲノムDNA試料(125ng)を50μLの量のワーキングマスターミックスに添加した。各試料は、２つ一組で増幅した。増幅反応は、表１に示す条件下で実施した。各ランには、V600E用のポジティブコントロール反応、そして野生型用のポジティブコントロール反応、並びにネガティブコントロール反応を含めた。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
データ解析
B-Raf V600E（チャンネル１）及びWT（チャンネル２）のCt値は、COBAS TaqMan 48 Analyzerワークステーション上のAmpliLink 3.1ソフトウェアによって算出した。ネガティブ及びポジティブコントロール反応由来のCt値を用いて、ランが有効か否かを決定した。
表２は、各コントロール反応についての許容されるCt値を列挙している。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
*−１のCt値は、有意な増幅が検出されなかったことを示唆している。有効なランの場合、各試料のCt値は、分析性能の研究によって規定された各チャンネルについての許容される範囲に対して評価した。表３は、Ct値の各ペアがどのようにB-Raf V600E突然変異状態の判定に翻訳されたかについての一例を提供するものである。
【０１１０】
【表３】
* −１のCt値は、有意な増幅が検出されなかったことを示唆している。
キーポイント: E = HEXレポーター色素、F= FAMレポーター色素、I =デオキシイノシン、Q = BHQ2クエンチャー色素、P= 3’-リン酸
【０１１１】
以下の試料を評価した。TaqMan（登録商標）PCRの結果は、配列決定によって評価した。
【０１１２】
【表４】
【０１１３】
DNAは、３０個のFFPEの黒色腫試料から抽出した（表４）。その結果、試料には腫瘍細胞及び正常細胞の両方に由来するDNAの混合物が含まれていた。TaqMan（登録商標）アッセイ由来の突然変異検出の結果を、ピロシーケンス及びGS20シーケンスと比較して表５に示す。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】
試料M3及びRM1は、２回目の抽出後でもピロシーケンスについて増幅することができず、両試料は、TaqMan（登録商標）及びGS20法によりV600Eネガティブ（WT）であると判定された。４つの試料は、ピロシーケンスの判定について人為的な解釈を必要とした。RM17の場合、ピロシーケンスの判定はV600Eネガティブであったが、TaqMan（登録商標）及びGS20の結果は、試料がV600Eポジティブであったことを示した；残りの３つのケースでは、これらの３つの方法が一致した結果を示した。ピロシーケンスによってV600Eネガティブと判定された３つの追加試料（RM3、RM6、RM8）は、TaqMan（登録商標）及びGS20法の両方によってはV600Eポジティブと判定された。これらの結果は、ピロシーケンスによる突然変異検出について、RM3、RM6、RM8及びRM17から突然変異含有DNAの生成が不十分であったことと一致している。試料RM8は、4300 GS20の配列決定の読み取り（各方向につき〜２０００）の４％においてV600Eポジティブであり、これはV600Eポジティブの全試料の中で観察された最低のパーセンテージの突然変異BRAFであった。
【０１１６】
ピロシーケンスと比較した場合GS20シーケンスの感度がより高いため、GS20法は、TaqMan（登録商標）テストの参照方法として使用された。COBAS TaqMan（登録商標）B-Raf V600EテストとGS20シーケンスとの間での一致のレベルは、V600Eポジティブについては１２／１２、すなわち１００％であり、そしてV600Eネガティブ（WT）試料については１８／１８、すなわち１００％であった。
【０１１７】
代表的な配列：
配列番号1 BRAF_MU (I =デオキシイノシン P= 3’-リン酸)
5' CTACAIAIAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3'
配列番号2 BRAF_WT (I =デオキシイノシン P= 3’-リン酸)
5' ACAITGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3'
配列番号3 BRAF_F1:
5' CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT 3'
配列番号4 BRAF_R5:
5' TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3'
【０１１８】
本発明は、明確な理解のために説明及び例によってやや詳細に説明してきたが、本発明の教示に照らすと、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく若干の変更及び修飾が行われうることは当業者にとっては自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、B-Raf V600Eアンプリコン（配列番号５）とX染色体の相当の領域（配列番号６）とのアラインメントを示す。B-Raf V600Eプライマー部位は矢印で示されている。前記アンプリコンは、エキソン１５（太字）及びイントロン（小文字）の一部を含んでいる。縦棒は、BRAFとX染色体配列との間で同一の位置を表している。コドン６００は四角で囲まれている；GTGはバリン（V）に相当する。プローブ結合領域は、陰影を付けることで強調されている；突然変異（MU）プローブは野生型（WT）よりも２ヌクレオチド長く（強調部分の5'-CT）、そして両プローブは、本明細書に示す配列の相補体と結合する。
【図２】図２は、コドン６００（矢印）の周囲のB-Rafエキソン１５（配列番号７）と、A-Raf（配列番号８）及びC-Raf（配列番号９）の相同領域とのアラインメントを示す。星印はB-Raf配列と比較した場合のアミノ酸の差異を表す（例えば、Mercer & Pritchard, Biochim Biophys Acta 1653:25-40, 2003）。
【図３】図３は、B-Raf V600Eアンプリコン（配列番号５）とARAF（A-Rafをコード）（配列番号１１）及びRAF1（C-Rafをコード）（配列番号１０）遺伝子由来の対応する配列とのアラインメントを示す。小文字のヌクレオチドがBRAF配列と異なる。
【技術分野】
【０００１】
BRAF遺伝子は、セリン／スレオニンキナーゼであるB-Rafをコードしており、これは共役して活性化したRASから下流のMAPKキナーゼへとシグナル伝達する(Wellbrock et al., Cancer Res. 64: 2338-2342, 2004)。B-Rafにおける発癌誘発の突然変異は、キナーゼ機能の獲得をもたらして、典型的な増殖因子の不在下でRaf-MEK-ERK経路を恒常的に活性化する。この恒常的活性化は、転移性黒色腫の予後不良に関係している (Houben et al., 2004, 上掲)。BRAFの突然変異の活性化は種々の悪性腫瘍で報告されている。例えば、BRAFの突然変異は、70%ものヒト黒色腫の症例で見られる。エクソン１５のコドン６００における１７９９位のヌクレオチドの一塩基突然変異（T>A）がバリンからグルタミン酸への置換（V600E）をもたらし、これはB-Rafに突然変異を有する８５％超の黒色腫で存在している (Davies et al., Nature 417: 949-954, 2002; Garnett and Marais, Cancer Cell 6: 313-319, 2004; Gray-Schopfer et al., Cancer Metastasis Rev. 24:165-183, 2005; Houben et al., 2004)。頻度は多くないが、V600Eは１７９９−１８００位のヌクレオチドでの二塩基突然変異TG>AAから生じる (Houben et al., J Carcinog. 3:6, 2004)。
【背景技術】
【０００２】
多くのキナーゼ阻害剤、例えばB-Rafを阻害するものが知られている。そのような阻害剤には、PLX4032があり、これはB-Raf V600Eキナーゼ活性を選択的に阻害する。本発明は、B-Rafキナーゼ阻害剤、例えばPLX4032を用いた治療のためにV600Eポジティブな患者を同定して選択する方法を提供する。
【０００３】
本発明の簡単な概要
本発明は、B-Rafキナーゼ阻害剤を用いた治療の候補者である患者の検出のための方法及び組成物を提供する。従って、一つの観点において、本発明は、B-Raf阻害剤に対する癌細胞の感受性を決定する方法であって：(i) 癌患者由来の癌細胞から核酸試料を準備し、(ii) 前記核酸試料中の標的ポリヌクレオチド配列を、当該標的ポリヌクレオチド配列を増幅するプライマー対を用いて増幅し、ここで、当該標的ポリヌクレオチド配列は、BRAFにV600E突然変異部位を含んで成り、そして増幅は、配列番号１に記載の配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成り、且つBRAFのV600E突然変異部位にある突然変異配列の存在を検出する標識オリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施される；そして(iii) BRAFにおけるV600E突然変異の有無を検出し；それによりB-Raf阻害剤に対する癌の感受性を決定すること、を含んで成る方法、を提供する。態様によっては、前記プローブは配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する。前記増幅は、V600E突然変異部位での野生型配列の存在を検出する第二プローブの存在下実施することができる。態様によっては、前記第二プローブは、配列番号２の少なくとも１５個のヌクレオチドを含んで成る。態様によっては、前記プローブは、蛍光標識で標識することができる。前記プローブは更に、一方が蛍光色素であり、他方がクエンチング部分であるという２つの標識を用いて標識することもできる。
【０００４】
態様によっては、増幅反応で使用するプライマー対の両プライマーは、BRAFのエキソン１５とハイブリダイズする。態様によって、増幅反応で使用するプライマー対のプライマーの一方が、配列番号３に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチド配列を含んで成り、例えば、プライマー対の一方のプライマーが配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有することがある。追加の態様において、プライマー対の一方のプライマーが、配列番号４に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る。例えば、プライマーは、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有することがある。追加の態様において、増幅反応で使用するプライマー対は、配列番号３及び配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有するプライマーを含んで成る。
【０００５】
態様によっては、前記反応を増幅させる段階は、RP-PCRを含んで成る。
【０００６】
本方法は、B-Rafのアミノ酸位６００に突然変異、例えばV600E突然変異を有する癌を検出するのに利用することができる。態様によって、癌は黒色腫である。他の態様において、癌は結腸癌又は甲状腺癌である。態様によっては、突然変異を検出するために本発明の方法で使用する核酸試料は、皮膚生検由来のものでもよい。他の態様において、前記試料は結腸生検由来のものである。当該試料は、パラフィン包埋組織由来であることもある。本発明の方法は、患者がB-Raf阻害剤、例えば突然変異特異的B-Raf阻害剤、例えばPLX4032に感受性があるという診断を記録することを更に含んで成ることもある。
【０００７】
態様によって、本方法は、B-Raf阻害剤を患者に投与することを更に含んで成る。B-Raf阻害剤は、突然変異特異的B-Raf阻害剤、例えばPLX4032であってもよい。
【０００８】
別の観点において、本発明は、PLX4032治療候補者を同定する方法であって：被験者由来の試料を準備し；そして当該試料からBRAF V600E突然変異を含んで成る生体分子を検出し、それにより、PLX4032治療候補者を同定すること、を含んで成る方法、を提供する。態様によっては、前記生体分子は核酸である。他の態様において、当該生体分子はポリペプチドである。当該ポリペプチドは、例えば患者由来の癌細胞を含んで成る試料から得ることができる。態様によっては、前記ポリペプチドは、イムノアッセイを用いて検出してもよい。本方法はまた、PLX4032を被験者に投与することを含んで成る。
【０００９】
別の観点において、本発明は、B-Raf阻害剤を用いた治療の候補者である患者を検出するためのキットであって、BRAFのV600E突然変異を検出し、そして配列番号１に記載の配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る、第一対立遺伝子特異的プローブを含んで成る、キット、を提供するものである。態様によっては、プローブは配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する。本発明のキットは、第二対立遺伝子特異的プローブであって、野生型BRAF配列を検出し、そして配列番号２に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチド配列を含んで成るプローブを更に含んで成ることもある。態様によっては、第二プローブは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する。
【００１０】
追加の態様において、本発明のキットは、V600E突然変異部位を含んで成るBRAFの標的領域を増幅するプライマー対を更に含んで成る。例えば、当該プライマー対は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成るプライマーを含んで成ることがある。ある観点において、当該プライマーは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有する。他の態様において、前記プライマー対は、配列番号３及び配列番号４に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成るプライマーを含んで成ることがある。態様によっては、前記プライマー対は、配列番号３及び配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有するプライマーを含んで成る。
【００１１】
従って、態様によっては、本発明のキットは：配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するプローブ；配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するプローブ；配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；及び配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー、を含んで成ることがある。
【００１２】
本発明の詳細な説明
定義
本願の文脈において、「V600E」とはB-Rafのアミノ酸位６００にあるバリンの代わりにグルタミンの置換をもたらすBRAFにおける突然変異（ヌクレオチド位１７９９のT>A）を意味する。「V600E」はまた、従来の付番方式のもとでは「V599E」（１７９６T>A）としても知られている(Kumar et al., Clin. Cancer Res. 9:3362-3368, 2003).。
【００１３】
本発明では、「B-Rafキナーゼ阻害剤」はB-Rafキナーゼ活性を阻害するものである。このような阻害剤は、他のキナーゼ、例えば他のrafキナーゼの活性も阻害することがある。
【００１４】
「突然変異特異的B-Rafキナーゼ阻害剤」とは、本明細書で使用する場合、突然変異B-Raf、例えば、野生型B-Rafと比較してアミノ酸位６００がバリン残基である突然変異、例えばV600Eを有するB-Rafについて選択性を有するB-Raf阻害剤を意味する。そのような阻害剤は、野生型と比較して、少なくとも２倍、より頻繁には少なくとも３倍、あるいはそれ以上、強力な突然変異B-Raf、例えばV600E突然変異を有するB-Rafの阻害剤である。例えば、態様によっては、「突然変異特異的B-Raf阻害剤」は、V600E B-Rafの場合、キナーゼ阻害活性に対し約30nMのIC50を有することがあり（生化学的アッセイ）、一方、野生型の場合、相当のIC50は約100nMである。その効力は、細胞アッセイ、例えば増殖阻害を測定する細胞アッセイについてのIC50の観点でも比較することができる。本発明における「突然変異特異的B-Raf阻害剤」とは、B-Raf以外のキナーゼ、例えば他のrafキナーゼも阻害することがある。
【００１５】
用語「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な塩基対合に起因する２つの単一の標準的な核酸による二本鎖構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖間又はわずかなミスマッチ領域を含む核酸鎖間で起こる。本明細書で使用する場合、用語「実質的に相補的」とは、わずかなミスマッチ領域を除き相補的であることを意味する。典型的に、ハイブリダイズ領域にわたるミスマッチなヌクレオチドの総数は約１５ヌクレオチドの長さの配列につきヌクレオチド最大３個である。完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズする条件は、「ストリンジェントな」又は「配列特異的な」ハイブリダイゼーション条件と称される。実質的に相補的な核酸の安定二本鎖は、ストリンジェントに満たない条件下で達成することができる。核酸技術についての当業者は、多くの変動要因、例えばオリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対の濃度、イオン強度、及びミスマッチ塩基対の発生を実験的に考慮して二本鎖の安定性を決定することができる。例えば、二本鎖の安定性を算出するためのコンピューターソフトウェアは、National Biosciences, Inc. (Plymouth, Minn.)から市販されている、例えばOLIGO version 5、又は DNA Software (Ann Arbor, Michigan)から市販されている、Visual OMP 6がある。
【００１６】
オリゴヌクレオチドが完全に相補的な標的配列にのみハイブリダイズする、ストリンジェントな配列特異的ハイブリダイゼーション条件は当業界で周知である（例えば、核酸配列中の多型の検出についての項に供されている一般的な文献を参照のこと）。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境によって異なる。通常、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びpHにおける特定の配列についての熱融解温度（Tm）が約５℃未満になるよう選択される。このTmは、（規定のイオン強度及びpHのもと）塩基対の５０％が解離している温度である。ハイブリダイズ条件のストリンジェンシーを低下させることで、配列のミスマッチが許容されるようになる。許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件を適当に調節することで制御される。
【００１７】
用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち、４つの異なるヌクレオシド三リン酸及び重合剤（すなわちDNAポリメラーゼ又は逆転写酵素）／適当なバッファーの存在下で且つ適当な温度で、DNA合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、好ましくは一本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、標的配列と完全又は実質的に相補的な「ハイブリダイズ領域」、好ましくは約１５〜約３５個の長さのヌクレオチドを含む。プライマーオリゴヌクレオチドは、完全にハイブリダイズ領域から成るか、あるいは、増幅産物の検出、固定、又は操作を可能にするものの、DNA合成の開始剤としての役割を果たすプライマーの能力を変更しない、追加の特徴を含むことができる。例えば、核酸配列の尾部は、捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするプライマーの５’末端に含めることができる。
【００１８】
「対立遺伝子特異的」プライマーとは、本明細書で使用する場合、プライマーの３’末端、通常３’ヌクレオチドが注目の部位、例えば、BRAFのコドン６００内の第二番目の位置であるヌクレオチド１７９９と整列するように標的配列とハイブリダイズし、そしてその注目の位置にある野生型対立遺伝子又は突然変異の対立遺伝子のいずれかと完全に相補的であるようなプライマーである。本明細書で使用する場合、当該プライマーは、３’末端、例えば３’ヌクレオチド又は最後から２番目のヌクレオチドで完全に相補的な対立遺伝子に対し「特異的」である。通常、プライマー伸長は、ミスマッチがプライマーの３’末端に存在する場合に阻害される。対立遺伝子特異的プライマーは、完全に相補的な対立遺伝子とハイブリダイズする場合、より効率的に伸長可能である。同プライマーがその他の対立遺伝子とハイブリダイズする場合にさほど容易に伸長できないのは、ハイブリダイゼーション二本鎖における、プライマーの３’末端にある、例えば３’ヌクレオチド又は最後から２番目のヌクレオチドのミスマッチが原因である。従って、対立遺伝子特異的プライマーの使用は、伸長産物の形成の差異に基づき、対立遺伝子の識別をもたらす。
【００１９】
用語「プローブ」は、標的核酸と適当な条件下で選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。
【００２０】
「対立遺伝子特異的」プローブは、標的配列と完全に又は実質的に相補的な「ハイブリダイズ領域」を含み、これは注目の部位、例えば、BRAFのコドン６００内のヌクレオチド１７９９と完全に相補的である。従って、例えばV600E対立遺伝子特異的プローブは、V600E突然変異配列を選択的に検出し、一方、野生型BRAF対立遺伝子特異的プローブは選択的に野生型配列を検出する。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で当該プローブを用いて実施されるハイブリダイゼーションアッセイは、注目の部位を含んで成る特異的な標的配列の選択的な検出を可能にする。プローブハイブリダイゼーション領域は、好ましくは約１０〜約３５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約１５〜約３５ヌクレオチドの長さである。ハイブリダイゼーションの安定性に影響を及ぼす修飾塩基又は塩基類似体の使用であって、当業界で周知なものは、匹敵する安定性を有するより短い又はより長いプローブの使用を可能にし得る。プローブオリゴヌクレオチドは、完全にハイブリダイズ領域から成るか、あるいは、増幅産物の検出又は固定を可能にするものの、ハイブリダイゼーション領域のハイブリダイゼーション特性を大きく変更しない、追加の特徴を含むことができる。
【００２１】
用語「標的配列」又は「標的領域」は、解析すべき核酸領域を意味し、注目の多型部位を含んで成る。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、プライマー、プローブ及びオリゴヌクレオチドのフラグメントを意味する。これらの用語は長さを限定するものではなく、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−D-リボース含む）、ポリリボヌクレオチド（D-リボース含む）、及びそれ以外の任意なプリン又はピリミジン塩基、あるいは修飾プリン又はピリミジン塩基のN-グリコシドの直鎖重合体に対する総称である。これらの用語には、二本鎖及び一本鎖DNA、並びに二本鎖及び一本鎖RNAが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマー及び／又はプローブとして使用してもよい。
【００２３】
核酸、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、あるいは、制限しないが、ホスホトリエステル結合、ホスホラミダート(phosphoramidate)結合、シロキサン結合、カーボネート結合、カルボキシメチルエステル結合、アセトアミダート結合、カルバミン酸、チオエーテル結合、架橋ホスホラミダート結合、架橋メチレン・ホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、架橋ホスホロチオエート結合、又はスルホン結合を含む修飾された結合、及びそのような結合の組み合わせを含んで成ることができる。
【００２４】
核酸、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、5つの生物学的に生じた塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）、及び／又はその5つの生物学的に生じた塩基以外の塩基を含んで成ることができる。これらの塩基は、例えば、ハイブリダイゼーションを安定させるか又は不安定にするために；プローブ分解を促進するか又は抑制するために；あるいは検出可能部分又はクエンチャー部分の付着点としてといった多数の目的を果たすことができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、限定しないが、N6-メチル-アデニン、N6-tert-ブチル-ベンジル-アデニン、イミダゾール、置換イミダゾール、5-フルオロウラシル、5-ブロムウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルケオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5’-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、2,6-ジアミノプリン、及び5-プロピニル・ピリミジンを含む修飾された、非標準的な、又は誘導体化された塩基部分を1つ以上含むことができる。修飾された、非標準的な、又は誘導体化された塩基部分のその他の例が、米国特許番号第6,001,611号、同第5,955,589号、同第5,844,106号、同第5,789,562号、同第5,750,343号、同第5,728,525号、及び同第5,679,785号において見られる。
【００２５】
更に、核酸、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、限定しないが、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む修飾された糖部分を1つ以上含んで成ることができる。
【００２６】
緒言
本発明は、癌患者、例えば黒色腫の癌患者、結腸癌患者、甲状腺癌患者、及び低悪性度の重度の卵巣癌を有する患者であって、B-Raf阻害剤、例えば選択的突然変異B-Raf阻害剤、例えばPLX4032による治療の候補者である患者を選択するのに使用するためのV600E診断アッセイを提供する。従って、本診断試験は、PLX4032による治療に応答する可能性に従うことで患者を分類するのに使用することができる。
【００２７】
典型的に、V600E突然変異（V599E(1796T>A)としても知られている）は、エキソン１５のコドン６００におけるヌクレオチド位１７９９にある一塩基突然変異（T＞A）の存在を決定することを含んで成る方法を用いて検出される。この突然変異はまた、ヌクレオチド位１７９９−１８００にある二塩基突然変異TG>AAからも生じる。当該二塩基突然変異は、１７９９位を評価することによっても検出することができる。態様によっては、核酸は１８００位の置換の存在によっても評価することができる。
【００２８】
他の突然変異もコドン６００で起こることがある。これらには、V600K、V600D、及びV600Rも含まれる。態様によっては、V600E突然変異を検出するプローブは、他のコドン６００突然変異、例えばV600D、V600K及び／又はV600Rをも検出することができる。態様によっては、プローブはコドン６０１にある突然変異をも検出しうる。
【００２９】
V600E突然変異の存在は、典型的には、核酸、例えばゲノムDNA又はmRNAを、１７９９位置の塩基置換の存在について評価することで決定される。広範なアッセイが利用可能である。態様によって、このアッセイは５’ヌクレアーゼアッセイである。
【００３０】
V600Eは、例えばイムノアッセイを用いて、突然変異V600E B-Rafを検出することで検出することもできる。
【００３１】
V600Eの存在は、患者がB-Raf阻害剤、例えば突然変異特異的B-Raf阻害剤の治療候補者であることを示唆するものである。従って、本発明はまた、V600Eを有することが決定されている患者がRaf阻害剤、例えば選択的突然変異B-Raf阻害剤、例えばPLX4032で治療される方法も含んで成る。
【００３２】
生体試料
V600E突然変異は、様々な種類の癌、例えば黒色腫、結腸直腸癌；甲状腺癌、例えば甲状腺乳頭癌；及び卵巣癌、例えば低悪性度の重度の癌で検出することができる。態様によっては、V600E突然変異は、肺癌、神経膠腫、前立腺癌、肺癌、肉腫、肝臓癌、下垂体癌、並びに大腸、胆道、眼、膵臓、胃、中枢神経系、造血組織及びリンパ系組織で生じる癌において検出される。
【００３３】
V600E突然変異は、患者由来の生体試料で検出される。生体試料は、典型的に癌細胞を含んで成る。例えば、当該試料は、腫瘍生検、例えば悪性メラニン細胞の新生物、結腸直腸腫瘍、又は甲状腺腫瘍の生検；あるいは、転位部位由来の組織試料に由来するものであることもある。他の態様において、生体試料は血液又は別の体液であって、癌細胞を含むものであってもよい。他の態様において、生体試料は、循環している（無細胞）核酸を含んで成ることもある。
【００３４】
突然変異は、生体試料から得られる核酸において検出される。突然変異の存在について評価される核酸は、RNA又はDNAであってもよい。態様によっては、突然変異はゲノムDNAで検出される。
【００３５】
生体試料は、当業界における数々の方法のいずれかを用いて得ることができる。更に、生体試料は、固定剤、例えばホルムアルデヒドで処理し、パラフィン包埋し、そして使用のために切片にすることができる。あるいは、新鮮な又は凍結した組織を利用することもできる。他の態様において、細針吸引を使用してもよい。
【００３６】
核酸配列中のV600Eの検出
V600E突然変異の存在について核酸を評価するための検出技術は、分子遺伝学の分野で周知の手順を伴う。更に、この方法の多くが核酸の増幅を伴う。かかる手順を実施するための十分な指針が当業界で提供されている。文献の例として、例えばPCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplication (H. A. Erlich編, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Aplications (Innisら編, Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, 1994-1999, 2004年4月の補遺版を含む; Sambrook及び& Russel, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3版, 2001)がある。
【００３７】
本方法は典型的にはPCRの工程を採用するが、他の増幅プロトコールを使用してもよい。好適な増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（例えばWu及びWallace, Genomics 4:560-560, 1988）；鎖置換アッセイ（例えばWalkerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992; 米国特許第 5,455,166号明細書）；及び米国特許第 5,437,990号明細書, 同 5,409,818号明細書及び同 5,399,491号明細書に記載の方法を含む、様々な転写ベースの増幅系；転写増幅系(TAS)（Kwohら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989）及び自律配列複製(3SR) (Guatelliら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878, 1990; WO 92/08800号)を含む。あるいは、プローブを検出可能なレベルまで増幅する方法は、Qβ-レプリカーゼ増幅(Kramer及びlizardi, Nature 339: 401-402, 1989; Lomeliら, Clin. Chem. 35: 1826-1831, 1989)等を使用することができる。公知の増幅反応の概説は、例えばAnderson及びMeyersのCurrent Opinion in Biotechnology 4: 41-47, 1993に提供されている。
【００３８】
典型的には、V600Eの検出は、オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブを含んで成るアッセイにおいて患者由来の核酸を評価することで実施される。オリゴヌクレオチドは、任意の好適な方法、通常、化学的合成によって調製することができる。オリゴヌクレオチドは、市販の試薬及び機器を用いて合成することができる。あるいは、商業上の供給先から購入することもできる。オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業界で周知である（例えば、Narangら, Meth. Enzymol. 68: 90-99, 1979; Brownら, Meth. Enzymol. 68: 109-151, 1979; Beaucageら, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981; 及び米国特許第 4,458,066号明細書の固体支持体法）。更に、上記合成方法の修飾も、合成されたオリゴヌクレオチドに関して酵素作用の影響を与えるために好適に使用することができる。例えば、修飾ホスホジエステル結合（例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート又はボラノホスフェート）又はリン酸誘導体以外の結合のオリゴヌクレオチドへの取り込みは、特定の部位での開裂を避けるために使用することができる。更に、新規核酸鎖の合成の鋳型でもある核酸にハイブリダイズする場合に、2’-アミノ修飾糖を使用すると、オリゴヌクレオチドの消化の間に置換される傾向がある。
【００３９】
核酸レベルでV600E突然変異を検出する多くのアッセイが複数の一般的なプロトコールのいずれか：対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション、プライマー伸張、対立遺伝子特異的ライゲーション、塩基配列決定又は電気泳動的分離技術、例えば一本鎖高次構造多型(SSCP)及びヘテロ二本鎖解析を必要とする。アッセイの例として、５’ヌクレアーゼアッセイ、鋳型-指向型色素-ターミネーターの取り込み、分子ビーコン対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイ、一塩基伸長アッセイ及びリアルタイムのピロリン酸塩配列決定を用いた突然変異解析を含む。増幅配列の解析は、マイクロチップ、蛍光偏光アッセイ及びマトリックス支援レーザ脱離イオン化(MALDI )質量分析等の様々な技術を用いて実施することができる。更に使用できる２つの方法として、Flapヌクレアーゼによる浸潤的開裂及びパドロックプローブを用いる方法をベースとしたアッセイである。
【００４０】
V600E対立遺伝子の有無の決定は、解析されるべき患者由来の癌細胞を含んで成る生体試料から得られる核酸試料を解析することで通常実施される。しばしば、当該核酸試料はゲノムDNAを含んで成る。ゲノムDNAは、典型的には腫瘍試料から得られるが、他の細胞又は組織、例えば転移性の部位又は血液から得てもよい。
【００４１】
解析される核酸試料はRNAであってもよい。例えば、生体試料由来のmRNAを解析してV600E突然変異の有無を決定することができる。当該核酸試料は、標的核酸が発現している細胞、例えば転位部位由来の原発腫瘍又は組織から得られる。かかる解析は、最初に、例えばウイルス逆転写酵素を用いて標的RNAを逆転写させ、次いで得られたcDNAを増幅し；又は米国特許第 5,310,652号明細書；同 5,322,770号明細書；同 5,561,058号明細書；同 5,641,864号明細書；及び同 5,693,517号明細書に記載の複合型の高温逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いて実施することができる。
【００４２】
ヌクレオチド置換を検出するための核酸試料の解析にしばしば使用される方法論を簡単に説明する。しかしながら、当業界で知られているあらゆる方法を本発明において使用してヌクレオチド置換を検出することができる。
【００４３】
対立遺伝子特異的プローブ
対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、突然変異配列の一方に特異的なオリゴヌクレオチドを、核酸試料を増幅することで得られた増幅産物とハイブリダイズさせることにより、少なくとも１つの塩基が異なっている２つのDNA分子間での識別に依拠している。対立遺伝子特異的アッセイは、２つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、例えば、一方の変異体と、他方の変異体に対し、別個にハイブリダイズする、最初の変異体用の対立遺伝子特異的プローブ及び第二の変異体用の対立遺伝子特異的プローブを含んで成ることがある。対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、典型的には、短いオリゴヌクレオチド、例えば１５−３５個の長さのヌクレオチドを利用する。かかるプローブを設計するための原理及びガイダンスは当業界で入手可能なものであり、例えば、本明細書で引用する文献に記載されている。ハイブリダイゼーション条件は、十分にストリンジェントであるべきであり、これは、対立遺伝子間でハイブリダイゼーション強度に有意な違いがあること、好ましくは本質的に二種類の応答に有意な違いがあって、プローブが当該対立遺伝子の一方にのみハイブリダイズする条件のことである。プローブによっては、標的DNAの１セグメントとハイブリダイズし、その結果、注目の部位、すなわちBRAFのエキソン１５のコドン６００におけるヌクレオチド位１７９９が、前記プローブの中心部（例えば、１５塩基のオリゴヌクレオチドではその第７位；１６塩基のオリゴヌクレオチドではその第８又は９位）とアラインするが、このデザインは必須ではない。
【００４４】
対立遺伝子の量及び／又は存在は、試料とハイブリダイズする対立遺伝子特異的プローブの量を測定することで決定される。典型的に、オリゴヌクレオチドは、標識、例えば蛍光標識で標識される。例えば、V600Eヌクレオチド置換に特異的な対立遺伝子特異的プローブは、対立遺伝子との優先的なハイブリダイゼーションをもたらすハイブリダイゼーション条件下で、生体試料から得られた核酸とハイブリダイズする。蛍光強度は、特異的なオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたか否かを決定するために測定される。
【００４５】
１つの態様において、V600Eの位置に存在しているヌクレオチドは、V600E突然変異部位を含んで成るBRAFの突然変異（又は野生型）配列と完全に相補的なオリゴヌクレオチドプローブとの特異的なハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーションによって同定される。プローブがハイブリダイズする配列及び配列特異的なハイブリダイゼーション条件は、突然変異部位の１つのミスマッチがハイブリダイゼーション二本鎖を十分に不安定化させて、その結果、それが効果的に形成されないように選択される。従って、配列特異的なハイブリダイゼーション条件下では、安定な二本鎖は、前記プローブと完全に相補的な対立遺伝子配列との間でのみ形成する。従って、約１０〜約３５個の長さのオリゴヌクレオチドであって、突然変異部位を包含する領域内の対立遺伝子配列と完全に相補的なものは、本発明の範囲内である。
【００４６】
別の態様において、突然変異部位に存在しているヌクレオチドは、当該突然変異部位を包含している領域内の突然変異又は野生型の対立遺伝子と実質的に相補的であるか、当該突然変異部位で対立遺伝子と完全に相補的であるオリゴヌクレオチドとの十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションによって同定される。突然変異していない部位で生じるミスマッチにより、両対立遺伝子とのミスマッチが存在しており、標的対立遺伝子配列により形成された二本鎖と対応する標的でない対立遺伝子配列により形成された二本鎖とのミスマッチの数の違いは、標的対立遺伝子配列と完全に相補的な配列が使用される場合と同じである。この態様において、ハイブリダイゼーション条件は、標的配列との安定な二本鎖を形成させるよう十分に緩められ、同時に、標的以外の配列との安定な二本鎖の形成を除外するよう十分なストリンジェンシーが維持される。このような十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、プローブと標的対立遺伝子との間でのみ安定な二本鎖が形成する。従って、突然変異部位を包含する領域内の対立遺伝子配列と実質的に相補的であり、且つ突然変異部位の対立遺伝子配列と完全に相補的な約１０〜約３５の長さのオリゴヌクレオチド、好ましくは約１５〜約３５の長さのオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内である。
【００４７】
完全というより実質的に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ハイブリダイゼーション条件の最適化が制限されるアッセイフォーマットにおいて望ましいことがある。例えば、多数の標的が固定されたプローブアッセイフォーマットにおいては、各標的のプローブは、１つの固体の支持体上に固定される。ハイブリダイゼーションは、この固体の支持体と標的ＤＮＡを含む溶液とを接触させることで同時に実施される。全てのハイブリダイゼーションが同一の条件下で実施される場合、当該ハイブリダイゼーションは、各プローブについて別個に最適化することはできない。アッセイフォーマットがハイブリダイゼーション条件の調節を妨げる場合、プローブ内へのミスマッチの導入を利用して二本鎖の安定性を調節することができる。二本鎖の安定性に対する特定の導入済みミスマッチの効果は周知であり、そして二本鎖の安定性は、上述のとおり、ルーチンに推定し、且つ実験的に決定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件は、プローブの実際のサイズ及び配列に依存しており、これは、本明細書で提供され、そして当業界で周知のガイダンスを実験的に用いて選択することができる。オリゴヌクレオチドプローブを使用して配列内の一塩基対の違いを決定することは、Conner et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282、並びに米国特許第5,468,613及び5,604,099に記載されている。
【００４８】
完全にマッチしたハイブリダイゼーション二本鎖と一塩基がミスマッチしているハイブリダイゼーション二本鎖との間の安定性の比例した変化は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの長さに依存する。より短いプローブ配列で形成された二本鎖は、ミスマッチの存在により比例的により不安定化される。実際に、約１５個〜約３５個の長さのオリゴヌクレオチドは、配列特異的な検出にとって好ましい。更に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの末端は、熱エネルギーに起因する連続的な無作為の分離及び再アニーリングを受けるため、いずれかの末端でのミスマッチは、内部で生じるミスマッチよりもハイブリダイゼーション二本鎖を不安定化させる。好ましくは、標的配列内の一塩基対の変化を識別するために、プローブ配列は、突然変異部位が当該プローブの内部領域に生じるように標的配列とハイブリダイズするものが選択される。
【００４９】
BRAFとハイブリダイズするプローブ配列を選択するための上記基準は、プローブのハイブリダイズ領域、すなわち、標的配列とのハイブリダイゼーションに関与するプローブの部分にも適用される。プローブは、プローブのハイブリダイゼーション特性を大きく変化させることなく、追加の核酸配列、例えば、プローブを固定するのに使用されるポリＴテールと結合することがある。当業者は、本発明の方法に使用する場合、標的配列と相補的でない、すなわち、ハイブリダイゼーションに関与しない追加の核酸と結合したプローブが、未結合のプローブと本質的に同等であることを理解するであろう。
【００５０】
５’−ヌクレアーゼアッセイ
態様によっては、核酸試料は、米国特許第 5,210,015号明細書；同 5,487,972号明細書；及び同 5,804,375号明細書；及びHolland ら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280「TaqMan（登録商標）」又は「５’−ヌクレアーゼアッセイ」を用いて、V600E突然変異の存在についてアッセイされる。TaqMan（登録商標）アッセイでは、増幅された領域内でハイブリダイズする標識済みの検出プローブが増幅反応中存在している。プローブは、当該プローブがDNA合成のためのプライマーとして働かないように修飾される。増幅は、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて実施される。増幅の各合成ステップでは、伸張されるプライマーから下流の標的核酸にハイブリダイズする任意のプローブは、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。従って、新しい標的鎖の合成はプローブの分解をもたらし、この分解産物の蓄積は、標的配列の合成の指標となる。
【００５１】
本アッセイで利用するハイブリダイゼーションプローブは、V600E突然変異部位にあるBRAFの突然変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子とを識別する対立遺伝子特異的プローブであってもよい。あるいは、当該方法は、対立遺伝子特異的プライマー及び増幅産物に結合する標識プローブを用いて実施することができる。
【００５２】
分解産物を検出するための好適な任意の方法を、5’ヌクレアーゼアッセイで使用することができる。検出プローブは、一般的には、2種の蛍光色素で標識化され、そのうちの一つは他の色素の蛍光をクエンチングすることができる。色素は当該プローブに結合され、好ましくは一つが5’末端に、他方が内側部位に結合される。その結果、当該プローブはハイブリダイズしていない状態にある場合、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブの開裂が当該2種の色素間で起こるようにクエンチングが生じる。増幅は、色素間でのブローブの開裂を招くと共に、これに伴うクエンチングの排除及び最初にクエンチングした色素から観察される蛍光の増大をもたらす。分解産物の蓄積は、反応中の蛍光の増加量を測定することによって追跡できる。米国特許第 5,491,063号明細書及び同 5,571,673号明細書は、増幅と同時に生じるプローブの分解の代替的検出方法を説明している。
【００５３】
１つの態様において、BRAFにおけるV600E突然変異の存在について患者の試料を評価するための５’ヌクレアーゼアッセイは、以下のプライマー、又は当該配列と実質的に同一の配列を用いて実施することができる：
TTS068-BRAF_F1: 5' CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE 3' (E= t-ブチルベンジルdA) (配列番号25)
RL_BRAF_R5: 5' TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3' (配列番号4).
【００５４】
プライマー配列と実質的に同一の配列には、その同一の相補的な配列とハイブリダイズするものが含まれる。従って、態様によっては、本発明で使用するためのプライマー配列は、TTS068-BRAF_F1又はRL_BRAF_R5のうちの少なくとも１５個、場合によっては１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６個連続するヌクレオチドを含んで成る。態様によっては、プライマーはTTS068-BRAF_F1のうちの少なくとも２７、２８、２９、又は３０個連続するヌクレオチドを有している。他の態様において、本発明において使用するためのプライマーは、TTS068-BRAF_F1又はRL_BRAF_R5に対し少なくとも８０％の同一性、態様によっては少なくとも８５％の同一性、そして他の態様においては少なくとも９０％以上の同一性を有している。態様によって、フォワードプライマーはTTS068-BRAF_F1であり、リバースプライマーは、Ｘ染色体の偽遺伝子の識別を可能にするプライマーであって、RL_BRAF_R5と重複していないか、あるいはRL_BRAF_R5との重複が１０塩基対未満であるプライマーである。態様によって、リバースプライマーは、RL_BRAF_R5の結合部位の下流の２０又はそれ以下のヌクレオチドを含む部位と結合することができる。例えば、以下の配列のリバースプライマーを利用することもできる：
5' A AAT AGC CTC AAT TCT TAC CAT CCA CAA AA 3' (配列番号12)
5' TAG CCT CAA TTC TTA CCA TCC ACA AAA 3' (配列番号13)
5' TAG CCT CAA TTC TTA CCA TCC ACA AAE 3' (配列番号14)
5' AGG GCC AAA AAT TTA ATC AGT GGA AAA A 3' (配列番号15)
5' CAG TGG AAA AAT AGC CTC AAT TCT TAC CA 3' (配列番号16)
【００５５】
態様によっては、フォワードプライマーは、BRAF-F1の上流にある２０又はそれ以下のヌクレオチドを含む部位と結合することができる。態様によって、フォワードプライマーは、
5' TTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATE 3' (配列番号17);又は
5' ATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAE 3' (配列番号18)
であってもよい。
【００５６】
V600E突然変異は、RNAが起点の鋳型である場合にも検出することができる。そのようなアッセイには、リバースプライマー、例えば、
5' ATG ACT TCT GGT GCC ATC CAC AA 3' (配列番号19)
を含んで成るプライマーを含んで成ることもできる。
【００５７】
他の利用可能なリバースプライマーとして：
5' AAA AAT AGC CTC AAT TCT TAC CAT CCA CAA AA 3' (配列番号20);
5' GCC ATC CAC AAA ATG GAT CCA GAC A 3' (配列番号21);又は
5' CAA AAT GGA TCC AGA CAA CTG TTC AAA 3' (配列番号22)
がある。
【００５８】
本発明の一態様において、５’ヌクレアーゼアッセイは、以下の対立遺伝子特異的プローブの一方又は両方を用いて実施され、これは、突然変異(TTS155-BRAF_MU)又は野生型(TTS148-BRAF_WTs)配列のいずれかを検出する:
TTS155-BRAF_MU 5' QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3' (配列番号23)
TTS148-BRAF_WT 5' QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3' (配列番号24)
(E = HEXレポーター色素, F= FAMレポーター色素, I =デオキシイノシン, Q = BHQ2クエンチャー色素, P= 3’-リン酸)。当該色素(F又はE)は、dIとdA(TTS155-BRAF_MU)又はdGとdA (TTS148-BRAF_WT)のいずれかの間に挿入される。
【００５９】
当業界で理解されているように、TTS155-BRAF_MU又はTTS148-BRAF_WTプローブは、例えば特定の蛍光色素、クエンチャー、及び／又は色素の位置が変更されて、上述のものと異なっていることがある。
【００６０】
態様によっては、V600E、例えばTTS155-BRAF_MUを検出するプローブは、V600D (1799_1800TG>AT)及びV600K (1798_1799GT>AA)も検出する。態様によっては、V600E突然変異を検出するプローブは、K601E (1801A>G)及びV600R (1798_1799GT>AG)も検出する。
【００６１】
態様によっては、プローブ配列と実質的に同一の配列を使用することもできる。プローブと実質的に同一の配列には、そのプローブと同一の相補配列とハイブリダイズするものも含まれる。従って、態様によっては、本発明に使用するためのプローブ配列は、TTS155-BRAF_MU又はTTS148-BRAF_WTの少なくとも15個の連続するヌクレオチド、場合によっては、少なくとも16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 又は30個の連続するヌクレオチドを含んで成る。態様によっては、プライマーはTTS155-BRAF_MU又はTTS148-BRAF_WTの少なくとも27, 28, 29, 又は30個の連続するヌクレオチドを有する。他の態様において、本発明で使用するためのプライマーは、TTS155-BRAF_MU又はTTS148-BRAF_WTに対し少なくとも８５％の同一性、そして他の態様においては少なくとも９０％以上の同一性を有している。
【００６２】
BRAFにおけるV600E突然変異を検出するための５’ヌクレアーゼアッセイは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する任意のポリメラーゼを利用することができる。従って、態様によっては、５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、熱安定性及び熱活性を有する核酸ポリメラーゼである。かかる熱安定性ポリメラーゼには、限定しないが、真正細菌属であるサーマス(Thermus)、サーマトガ(Thermatoga)、及びサーモシフォ(Thermosipho)の様々な種に由来する天然及び組換え型のポリメラーゼ、並びにそれらのキメラ型を含む。例えば、本発明の方法で使用することのできるサーマス種のポリメラーゼには、サーマス・アクアチカス(Thermus aquaticus) (Taq) DNAポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus) (Tth) DNAポリメラーゼ、サーマス種sps17 (sps17)、及びサーマス種Z05（例えば、米国特許第5,405,774号；第5,352,600号；第5,079,352号；第4,889,818号；第5,466,591号；第5,618,711号；第5,674,738号及び第5,795,762号に記載のもの)が含まれる。本発明の方法で使用することのできるサーマトガポリメラーゼには、例えば、サーマトガ・マリチマ(Thermatoga maritima)DNAポリメラーゼ及びサーマトガ・ネアポリタナ(Thermatoga neapolitana)DNAポリメラーゼがあり、一方、使用することのできるサーモシフォポリメラーゼの例には、サーモシフォ・アフリカヌス(Thermosipho africanus)DNAポリメラーゼがある。サーマトガ・マリチマ(Thermatoga maritima)及びサーモシフォ・アフリカヌス(Thermosipho africanus)DNAポリメラーゼの配列は、国際特許公報WO 92/06200で公開されている。サーマトガ・ネアポリタナ(Thermatoga neapolitana)の配列は、国際特許公報WO 97/09451で見られる。
【００６３】
５’ヌクレアーゼアッセイにおいて、増幅検出は通常増幅と並行して行われる（すなわち、「リアルタイム」）。態様によって、態様によっては、増幅の検出は定量的であり、且つ、増幅の検出はリアルタイムである。態様によっては、増幅の検出は定性的である（例えば、標的核酸の存在又は不在の終点検出）。態様によっては、増幅の検出は増幅の後である。態様によっては、増幅の検出は定性的であり、且つ、増幅の検出は増幅の後である。
【００６４】
プローブは、任意の数の標識で検出することができるが、通常、これは蛍光標識である。態様によっては、フルオロフォア部分は、フルオレセイン・ファミリーの色素、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの色素、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの色素、クマリン・ファミリーの色素、ローダミン・ファミリーの色素、シアニン・ファミリーの色素、オキサジン・ファミリーの色素、チアジン・ファミリーの色素、スクアライン・ファミリーの色素、キレート化ランタニド・ファミリーの色素、アゾ・ファミリーの色素、トリフェニルメタン・ファミリーの色素、及びBODIPY（登録商標）・ファミリーの色素から成る群から選択される。
【００６５】
本アッセイは、しばしば、蛍光標識及びクエンチャー部分で標識されたプローブを含んで成る。態様によっては、クエンチャー部分は、フルオレセイン・ファミリーの色素、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの色素、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの色素、クマリン・ファミリーの色素、ローダミン・ファミリーの色素、シアニン・ファミリーの色素、オキサジン・ファミリーの色素、チアジン・ファミリーの色素、スクアライン・ファミリーの色素、キレート化ランタニド・ファミリーの色素、BODIPY（登録商標）・ファミリーの色素、アゾ・ファミリーの色素、トリフェニルメタン・ファミリーの色素、低蛍光クエンチャー部分（すなわち、「ジムドナー(dim donor)」）、及び非蛍光クエンチャー部分（例えば、Black Hole Quenchers（登録商標）（BHQ）を含めた、いわゆる「ダーク・クエンチャー」）から成る群から選択される。
【００６６】
1つの態様において、フルオロフォア部分はフルオレセイン・ファミリーの色素であり、且つ、クエンチャー部分がシアニン・ファミリーの色素である。1つの態様において、フルオロフォア部分はフルオレセイン・ファミリーの色素であり、且つ、クエンチャー部分はヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの色素である。1つの態様において、フルオロフォア部分はヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの色素であり、且つ、クエンチャー部分はシアニン・ファミリーの色素である。1つの態様において、クエンチャーはダーク・クエンチャー、例えばBHQ-1、BHQ-2、又はBHQ-3（Biosearch Technologies, Novato, CA）である。1つの態様において、フルオロフォア部分は、フルオレセイン・ファミリーの色素又はシアニン・ファミリーの色素であり、且つ、クエンチャー部分はダーク・クエンチャーである。
【００６７】
固定化担体
態様によっては、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、固定された標的又は固定されたプローブを用いたアッセイフォーマットにおいて実施される。そのようなフォーマットは、当業界で知られており、例えば、ドット−ブロットフォーマット及びリバースドットブロットアッセイフォーマットがあり、これらは米国特許第5,310,893号；第5,451,512号；第5,468,613号；及び第5,604,099号に記載されている。
【００６８】
対立遺伝子特異的プライマー
V600E突然変異の有無は、対立遺伝子特異的増幅又はプライマー伸長法を用いて検出することができる。これらの反応は、プライマーの３’末端、例えば３’ヌクレオチド又は３’ヌクレオチドの最後から２番目のヌクレオチドにあるミスマッチを介して突然変異（又は野生型）部位を特異的に標的にするよう設計されたプライマーの使用を通常伴う。ミスマッチの存在は、ポリメラーゼがエラー修正活性を欠いている場合、当該ポリメラーゼがプライマーを伸長する能力を発揮させる。例えば、対立遺伝子特異的増幅又は伸長をベースとした方法を用いてV600E突然変異配列を検出するために、BRAFのコドン６００におけるヌクレオチド位１７９９にある突然変異Ａ対立遺伝子と相補的なプライマーは、３’末端ヌクレオチドがこの突然変異の位置でハイブリダイズするよう設計されている。突然変異対立遺伝子の存在は、プライマーの伸長を開始する能力によって決定することができる。３’末端がミスマッチしている場合、伸長は阻害される。従って、例えば、プライマーが３’末端の突然変異対立遺伝子のヌクレオチドとミスマッチしている場合、プライマーは効果的に伸長する。増幅は、１７９９位にあるBRAF野生型配列由来の特異的な対立遺伝子特異的プライマーを用いて実施することもできる。
【００６９】
典型的に、プライマーは増幅反応において第二のプライマーと一緒に使用される。第二のプライマーは、突然変異の位置と無関係の部位でハイブリダイズする。増幅は、２つのプライマーから出発して、検出可能な産物をもたらし、これは特定の対立遺伝子型が存在していることを表す。対立遺伝子特異的な増幅又は伸長をベースとした方法は、例えば、WO 93/22456; 米国特許第5,137,806号；第5,595,890号；第5,639,611号；及び米国特許第4,851,331号に記載されている。
【００７０】
対立遺伝子特異的増幅をベースとした遺伝子型決定を用いた、対立遺伝子の同定は、増幅した標的配列の有無の検出のみを必要とする。増幅された標的配列の検出方法は当業界で周知である。例えば、記載されているゲル電気泳動及びプローブハイブリダイゼーションアッセイは、核酸の存在を検出するために頻繁に使用される。
【００７１】
別のプローブ無しの方法において、増幅した核酸は、反応混合物における二本鎖DNAの合計量の増大をモニタリングすることで検出され、これらは、例えば、米国特許第5,994,056号；及び欧州特許公報第487,218号及び第512,334号に記載されている。二本鎖の標的DNAの検出は、二本鎖DNAと結合した場合に種々のDNA結合色素、例えばSYBRグリーンが示す蛍光の増大に依拠している。
【００７２】
当業者が認識しているように、対立遺伝子特異的な増幅方法は、多数の対立遺伝子特異的プライマーを利用して特定の対立遺伝子をターゲティングする反応で実施することができる。そのような多数の応用のためのプライマーは、通常区別可能な標識で標識されるか、あるいは対立遺伝子から生成した増幅産物がサイズで区別されるよう選択される。従って、例えば、一試料中の野生型及び突然変異V600E対立遺伝子の両方が、一回の増幅反応を用い、増幅産物のゲル解析によって同定することができる。
【００７３】
対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、ハイブリダイゼーション領域中の対立遺伝子の一方と完全に相補的であってもよく、あるいは３’末端のオリゴヌクレオチド以外の位置に幾つかのミスマッチを有することがある。例えば、最後から２番目の３’ヌクレオチドは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドにおいてミスマッチしていることがある。他の態様において、ミスマッチは、両対立遺伝子配列の（非突然変異）部位で起こることがある。
【００７４】
別のV600E BRAF核酸突然変異の検出法
V600E突然変異の存在（不在）は、直接的な配列決定によっても検出することができる。方法として、ジデオキシ配列決定をベースとした方法及び、オリゴヌクレオチドの伸長産物のピロシーケンス (Pyrosequencing)（登録商標）のような方法がある。かかる方法は、しばしば、PCRのような増幅技術を利用する。配列決定のための他の類似の方法は、完全PCRの使用を必要としないが、典型的には、研究目的のヌクレオチドと相補的な１つの蛍光標識されたジデオキシリボ核酸分子（ddNTP）によるプライマーの伸長のみを典型的に使用する。多型部位にあるヌクレオチドは、一塩基伸長しているプライマーの検出を介して同定することができ、これは蛍光標識されている（例えば、Kobayashi et al, Mol. Cell. Probes, 9:175-182, 1995）。
【００７５】
増幅反応を用いて生成した増幅産物は、変性グラジエントゲル電気泳動を利用することで解析することもできる。異なる対立遺伝子は、異なる配列に依存した融解特性及び溶液中でのDNAの電気泳動をベースとして同定することができる（例えば、Erlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, W. H. Freeman and Co, New York, 1992, Chapter 7を参照のこと）。
【００７６】
他の態様において、標的配列の対立遺伝子は、一本鎖DNA高次構造多型解析を用いて区別することができ、これは、一本鎖PCR産物の電気泳動における変化によって塩基の違いを同定するものであり、例えば、Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989)で説明されている。増幅PCR産物は、上述のとおり生成することができ、そして加熱するか他の方法で変性され、一本鎖増幅産物を形成する。一本鎖核酸は、リフォールディングするか、あるいは塩基配列に部分的に依存する二次構造を形成することがある。一本鎖の増幅産物の電気泳動の異なる移動度は、標的領域の対立遺伝子間の配列の違いと関連付けることができる。
【００７７】
BRAFにおけるV600E突然変異の存在を検出するのに使用する方法は、典型的に、上述したような標識されたオリゴヌクレオチド、例えば蛍光標識で標識されたものを利用する。オリゴヌクレオチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的な手段によって検出可能な標識を取り込むことで標識することができる。有用な標識には、蛍光色素、放射性標識、例えば32P、 高電子密度試薬、酵素、例えばペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ、ビオチン、又はハプテン及び抗血清、あるいはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質及びハプテンがある。標識技術は当業界で周知である（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 上掲; Sambrook & Russell, 上掲を参照のこと）。
【００７８】
タンパク質変異体の検出
B-Raf中のV600E突然変異は、野生型と突然変異のB-Rafを識別する方法によって検出することができる。しばしば、これらの方法は突然変異B-Rafと特異的な抗体を利用する。
【００７９】
利用可能な技術の概略は、Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)及びHarlow & Lane, Using Antibodies (1999)で見られる。対立遺伝子変異体と特異的に反応するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は当業界で周知である（例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, 上掲; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986);及びKohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)を参照のこと)。このような技術には、ファージ又は類似のベクターの組換え抗体ライブラリーからの抗体の選択による抗体調製、並びに、ウサギ又はマウスを免疫化することによるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製が含まれる（例えば、Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)を参照のこと）。
【００８０】
突然変異B-Rafは、種々のイムノアッセイ法によって検出することができる。免疫学的な手順及びイムノアッセイの手順の概説については、Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 7th ed. 1991)を参照のこと。更に、本発明のイムノアッセイは、複数の構成のいずれかで実施することができ、これらはEnzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980); and Harlow & Lane, 上掲で広範に概説されている。一般的なイムノアッセイの概説については、Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, eds., 7th ed. 1991)も参照のこと。
【００８１】
一般に使用されているアッセイには、非競合的なアッセイ、例えばサンドイッチアッセイ及び競合アッセイがある。典型的に、ELISAアッセイのようなアッセイを使用することができる。ポリペプチド変異体の量は、定量アッセイを実施することで検出することができる。
【００８２】
他の検出技術、例えばMALDIは、B-Raf中のV600Eの存在を直接検出するのに使用することもできる。
【００８３】
解析用の試料は、患者由来の癌細胞、例えば腫瘍組織から得られる。
【００８４】
治療
突然変異の検出法には、ユーザーに対し、B-Raf V600E突然変異の有無に基づき、それぞれ患者がB-Raf阻害剤、例えば突然変異特異的B-Raf阻害剤、例えばPLX4032で治療されるべきか否かを知らせるデータ解析ソフトの使用も含まれる。
【００８５】
アミノ酸位６００における突然変異の存在について陽性であると決定されている患者は、B-Rafキナーゼ阻害剤、例えば突然変異特異的B-Rafキナーゼ阻害剤、例えばPLX4032による治療候補者である。種々のB-Rafキナーゼ阻害剤、例えば突然変異特異的B-Rafキナーゼ阻害剤は、WO 2007/002325及びWO 2007/002433で説明されている。PLX4032は、WO 2007/002433及びWO 2007/002325では「P-0956」と称されている。
【００８６】
B-Rafキナーゼ阻害剤、例えば突然変異特異的B-Rafキナーゼ阻害剤の投与の指針は、例えばWO/2007/002325、及びWO/2007/002433で見ることができる。適当な剤形は、一部、用途又は投与経路、例えば経口、経皮、経粘膜、吸入又は注射（非経口）に依存している。かかる剤形は、化合物が標的細胞に到達するのを可能にするものであるべきである。他の要因も当業界では周知であり、例えば毒性及び、化合物又は組成物がその効果を発揮するのを遅らせる剤形である。このような技術及び製剤は、通常、The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia, PA, 2005で見ることができる。
【００８７】
医薬組成物は担体又は賦形剤を含むことができる。当該担体又は賦形剤は、化合物の投与を容易にするよう選択することができる。担体の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、例えばラクトース、グルコース、又はサッカロース、あるいはデンプンの複数のタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール及び生理学的に許容される溶媒、がある。生理学的に許容される溶媒の例として、注射用滅菌水（WFI）、生理食塩水、及びデキストロースがある。
【００８８】
前記化合物は、異なる経路、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経口、経粘膜、直腸、又は吸入によって投与することができる。態様によって、特異的なB-Rafキナーゼ阻害剤は経口投与される。経口投与の場合、例えば、化合物は、常用の経口剤形、例えばカプセル、錠剤、及び液体調製物、例えばシロップ、エリキシル、及び濃縮ドロップに製剤化することができる。
【００８９】
吸入の場合、B-Raf阻害剤は乾燥粉末又は適当な溶液、懸濁液、あるいはエアロゾルとして製剤化してもよい。粉末及び溶液は、当業界で知られている適当な添加物を用いて製剤化してもよい。例えば、粉末は、適当な粉末の基剤、例えばラクトース又はデンプンを含んでもよく、そして溶液は、ポリエチレングリコール、滅菌水、エタノール、塩化ナトリウム及び他の添加物、例えば酸、アルカリ及び緩衝液の塩を含んで成ることもある。かかる溶液又は懸濁液は、スプレー、ポンプ、噴霧器、又はネブライザー等を介する吸入によって投与してもよい。
【００９０】
あるいは、B-Raf阻害剤は、注射することができ（非経口投与）、例えば筋肉内、静脈内、腹腔内、及び／又は皮下投与してもよい。注射の場合、前記阻害剤は、滅菌水溶液、。好ましくは生理学的に許容される緩衝液又は溶液、生理食塩水、ハンクス液、又はリンガー液中で調製される。更に、前記化合物は、固形として製剤化し、使用直前に再溶解又は懸濁してもよい。凍結乾燥型も製造することができる。
【００９１】
投与は、経粘膜、局所、又は皮下からの手段によってもよい。経粘膜、局所、又は皮下からの投与の場合、障壁に対して浸透されるのに適した浸透剤が製剤中で使用される。かかる浸透剤は当業界で一般的に知られており、例えば、経粘膜の場合、胆汁塩及びフシジン酸誘導体がある。更に、界面活性剤を使用して浸透を容易にしてもよい。経粘膜投与は、例えば、スプレー式点鼻薬又は座薬（肛門又は膣用）を介してもよい。本発明の局所用組成物は、当業界で知られている適切な担体を選択することで、好ましくは油、クリーム、ローション、軟膏等として製剤化される。適当な担体には、植物油又は鉱油、白色ワセリン（白色軟パラフィン）、分枝鎖脂肪又は油、動物性脂肪及び高分子量アルコールがある。好ましい担体は、活性成分が可溶性のものである。乳化剤、安定化剤、保湿剤及び抗酸化剤も、色又は芳香をつける物質同様、所望により含めることができる。局所適用のためのクリームは、鉱油、自己乳化蜜蝋及び水の混合物であって、少量の溶媒（例えば、油）に溶解した活性成分が混合されている混合物から製剤化することができる。更に、経皮手段による投与は、活性成分及び当業界で知られている任意の１又は複数の担体若しくは希釈剤を含浸させた経皮パッチ又は包帯、例えばバンデージを含んで成ることもある。経皮送達系で投与されるために、剤形の投与は、当然のことながら、用法を通じて断続的というよりも連続して行われる。
【００９２】
投与されるべき種々の化合物の量は、化合物のIC50、化合物の生物学的半減期、被験者の年齢、サイズ、及び体重等の要因、並びに被験者に関する種々の他のパラメーターを考慮して、標準的な手順によって決定することができる。このような因子の重要性は当業者に周知である。通常、用量は治療される被験者1kg当たり0.01〜50mg、好ましくは0.1〜20mgである。複数回投与を使用してもよい。
【００９３】
B-Raf阻害剤は、他の抗癌療法と一緒に使用することができる。
【００９４】
キット
本発明は、本方法を実施するのに有用な成分を含んで成るキットを提供する。態様によっては、当該キットは、前記突然変異又はV600E対立遺伝子に特異的な１又は複数のオリゴヌクレオチドプローブを含んで成ることがある。かかるキットは、V600E突然変異部位を包含するBRAFの遺伝子座の領域を増幅する増幅プライマーを含むことができる。従って、態様によっては、キットは、プライマーセットとして
TTS068-BRAF_F1: 5' CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE 3' (E= t-ブチルベンジルdA) (配列番号25)及び
RL_BRAF_R5: 5' TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3' (配列番号4)を含んで成り、これらは、BRAFの標的領域を増幅する。前記キットは、プローブ、例えば対立遺伝子特異的プローブを更に含んで成ることもできる。本発明のキットで使用することのできる対立遺伝子特異的プローブの例として：
TTS155-BRAF_MU 5' QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3' (配列番号23)
TTS148-BRAF_WT 5' QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3' (配列番号24)
がある。
【００９５】
キットは、言及したオリゴヌクレオチドと実質的に同一のプライマー及び／又はプローブも含んで成る。態様によっては、本発明に使用するためのキットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び／又は配列番号４の核酸配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る１又は複数のオリゴヌクレオチドを含んで成る。
【００９６】
前記キットの他の任意の成分として、ヌクレオチド置換の存在を決定するための追加の試薬がある。例えば、キットは、増幅反応のためのポリメラーゼ、基質としてのヌクレオシド三リン酸及び適切な緩衝液、並びに本発明の方法を実施するための説明書を含むこともできる。キットの他の構成要素には、DNA抽出試薬及びプロトコール及び二価イオンの補因子を含めることもできる。当該緩衝液は、例えばUNGを含むことができる。態様によっては、緩衝液はアプタマーを含むことができる。
【００９７】
キットは更に、コントロール、例えばV600E DNAコントロールを含んでもよい。
【００９８】
実施例
B-Raf V600E突然変異の検出
本実施例は、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された（FFPE）癌の腫瘍組織から抽出したゲノムDNAのV600E（BRAFヌクレオチド１７９９T>A）突然変異の測定のためのリアルタイムPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）ベースの診断試験を示すものである。本実施例において、FFPE組織から抽出したゲノムDNAは、TaqMan PCR解析によって試験した。PCR反応のために、Master MixをTaqMan RNA Reaction Mix, Primer-Probe Mix及び酢酸マグネシウム(Mg(OAc)2)補因子を混合することで調製した。増幅は、125 ngのゲノムDNAを用いて実施した。増幅産物は、COBAS TaqMan 48アナライザーを用いて検出した。
【００９９】
B-Raf V600E部位 (BRAF 1799 T>A)をエキソン15に含むゲノム領域を増幅して、１１６塩基対の二本鎖DNA（アンプリコン）を生成させた。増幅反応は、５５サイクルで実施した。増幅及び検出系は、増幅の各サイクルで生成したPCR産物の量を、標的特異的プローブの開裂から生じる蛍光シグナルを測定することで、リアルタイムに測定した。標的特異的B-Raf野生型（WT;V600）及びB-Raf V600E突然変異プローブは、異なるレポーター色素でそれぞれ標識した。各増幅サイクルの間にこれらのレポーター色素によって放出された蛍光の波長特異的測定により、一個の反応チューブ中でのB-Raf WT及びV600Eの同定が可能となった。一旦各レポーター色素からの蛍光シグナルが既定の閾値に達してから、多重反応におけるWT及びV600Eの両方の突然変異対立遺伝子について、サイクル閾値（Ct）を算出した。
【０１００】
BRAFプライマーは、１１５塩基対（ｂｐ）のBRAFのエキソン１５領域を増幅するよう設計した。Human Genome March 2006 Assembly上のUCSCゲノムブラウザーのBLATツール(http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start)を用いたところ、BRAFのエキソン15は、恐らく偽遺伝子であるX染色体(chrX) の配列chrX:74721094-74721213と９３．４％のホモロジーを有していた。BRAFのイントロン１５の一部を含むリバースプライマーを使用して、意図したBRAF配列を特異的に増幅させた。図１に示すように、リバースプライマーはX染色体配列とわずかに５５．６％のホモロジー（２７ヌクレオチド中１５個）を有していた。BRAFプライマー−プローブミックス中のプローブは、このリバースプライマーの伸長から生じる増幅鎖と相補的であり、これは更に、試験結果がBRAF配列と特異的であることを保証するものである。
【０１０１】
プライマーは、ABI 394 DNA合成装置(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)上で、標準的なデオキシヌクレオチドホスホラミダイト、アクチベーターとしてのジシアノイミダゾール (DCI) 及び常用の３’→５’の方向での固相の制御多孔ガラス(CPG)支持体上での標準的な合成サイクル（若干修正済み）を用い、合成した。５’-t-ブチルベンジルdAは、修飾ヌクレオシドとして取り込み、CPG ( Roche Applied Sciences, Penzberg, Germany)の一部は当該DNA合成のための固体の支持体として使用した。最後の塩基の付加後、５’−ジメトキシトリチル(DMT)保護基は前記合成装置上で除去され、そしてオリゴヌクレオチドは、水酸化アンモニウムを用い、５５℃で１６時間脱保護された。粗製オリゴヌクレオチドを蒸発させて、アンモニアを除去し、そしてMono-Q HR 16/10強塩基陰イオン交換高圧液体クロマトグラフィー (HPLC)カラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を用い、直線勾配の塩化ナトリウムにより、高pHで精製した。画分はPA100 (Dionex Inc., Sunnyvale, CA)イオン交換カラムを用いて解析し、そして９０％超という最小の純度基準を用いてプールした。プールされた画分は、脱塩後、10 mM Tris, pH 8.0中で調製した。以下のプライマーをPCR反応のために合成した：
TTS068-BRAF_F1: 5' CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE 3' (E= t-ブチルベンジルdA) (配列番号25)及び
RL_BRAF_R5: 5' TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3' (配列番号4)。
【０１０２】
TaqManプローブをABI 394 DNA合成装置(Applied Biosystems Inc.)上でウルトラマイルドデオキシヌクレオチドホスホラミダイト (Pierce Biotechnology, Milwaukee, WI)、アクチベーターとしてのDCI及び常用の３’→５’の方向でのCPG支持体上での標準的な合成サイクル（若干修正済み）を用い、合成した。蛍光標識であるcx-FAM (6-カルボキシフルオレセイン, Biogenex Inc.)又はcx-HEX (6-カルボキシフルオレセイン(Biogenex Inc., San Ramon, CA)、及びブラックホールクエンチャー (BHQ-2) (Biosearch Inc., Novato, CA)を、ホスホラミダイト試薬及び１０分のカップリングサイクルを用いて取り込んだ。３’−リン酸を、３’−伸長ブロッカーCPG (Clontech Inc., Mountain View, CA)によって取り込んだ。合成後、DMT保護基は前記合成装置上で除去され、そしてオリゴヌクレオチドは、水酸化アンモニウムを用い、周囲温度で１６時間かけて脱保護された。粗製オリゴヌクレオチドはMono-Q HR 16/10強塩基陰イオン交換HPLCカラム(Amersham Biosciences)を用い、直線勾配の塩化ナトリウムにより精製した。画分は、DNAPac PA100 (Dionex Inc., Sunnyvale, CA)イオン交換カラムを用いて解析し、そして９０％超という最小の純度基準を用いてプールした。プールした画分は脱塩し、そして80 mMトリシン, pH 8.2、240 mM酢酸カリウム、0.1 mM EDTA、及び0.09%アジ化ナトリウムを含んで成るプローブ保存緩衝液中で調製した。Taqman（登録商標）プローブは以下のとおりである：
V600E (TTS155-BRAF_MU): 5' QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3' (配列番号23)
野生型(TTS148-BRAF_WT): 5' QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3' (配列番号24)
(E = HEX レポーター色素, F= FAM レポーター色素, I =デオキシイノシン, Q = BHQ2クエンチャー色素, P= 3’-リン酸)。
【０１０３】
増幅反応には、AmpErase (ウラシル-N-グリコシラーゼ, UNG)及びデオキシウリジン三リン酸 (dUTP)を含ませた。AmpEraseは、デオキシウリジンを含むがチミジンを含まないDNA鎖の破壊を認識して触媒する。デオキシウリジンは、天然のDNAではないが、PCR反応混合物試薬中のdNTPのうちの１つとしてチミジン三リン酸の代わりに、デオキシウリジン三リン酸の使用によって常にアンプリコン中に存在している。反応混合物中でのUNGの取り込みは、アンプリコンの持ち越しによって生じた混入を最小化する。AmpEraseは標的アンプリコンを分解せず、あったとしてもプローブ、及び試験キットを分解しない。
【０１０４】
PCR産物の検出
本実験で利用するBRAFプライマー−プローブの混合物は、B-Raf WT又はV600Eをコードするヌクレオチド配列に特異的な二重標識された蛍光標識をそれぞれ含んでおり、これらは増幅プロセスの間、蛍光シグナルの放出を通じて特異的なPCR産物のリアルタイムな検出を可能にする。B-Raf WT及びV600Eプローブは、異なる蛍光レポーター色素及び同一のクエンチャー色素で標識されている。プローブが無傷の場合、レポーター色素の蛍光は、クエンチャー色素により、フォスター型のエネルギー変換に起因して抑制される。PCRの間、各プローブは、配列依存的に、その標的配列とハイブリダイズし、そしてZ05 DNAポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性によって開裂し、そして２つの色素を分離する。一旦レポーター及びクエンチャー色素が分離すると、レポーター色素由来の蛍光は検出可能になる。PCRサイクル毎にアンプリコンがより生成されるにつれ、レポーター色素由来の蓄積したシグナルは効果的に増大する。B-Raf WT及びV600E配列は、各サイクルの間各プローブをその相当の特異的な発光波長範囲で測定することで独立してモニタリングした。
【０１０５】
各ゲノムDNA試料は、50μLのワーキングマスターミックスを含んで成る100 μLの反応液中で増幅され、これは、一試料当たり、17μLのプライマー−プローブミックス及び13μLの25 mM Mg(OAc)2補因子を20μLのTaqMan RNA反応混合物に添加することで調製した。ゲノムDNA試料(125ng)を50μLの量のワーキングマスターミックスに添加した。各試料は、２つ一組で増幅した。増幅反応は、表１に示す条件下で実施した。各ランには、V600E用のポジティブコントロール反応、そして野生型用のポジティブコントロール反応、並びにネガティブコントロール反応を含めた。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
データ解析
B-Raf V600E（チャンネル１）及びWT（チャンネル２）のCt値は、COBAS TaqMan 48 Analyzerワークステーション上のAmpliLink 3.1ソフトウェアによって算出した。ネガティブ及びポジティブコントロール反応由来のCt値を用いて、ランが有効か否かを決定した。
表２は、各コントロール反応についての許容されるCt値を列挙している。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
*−１のCt値は、有意な増幅が検出されなかったことを示唆している。有効なランの場合、各試料のCt値は、分析性能の研究によって規定された各チャンネルについての許容される範囲に対して評価した。表３は、Ct値の各ペアがどのようにB-Raf V600E突然変異状態の判定に翻訳されたかについての一例を提供するものである。
【０１１０】
【表３】
* −１のCt値は、有意な増幅が検出されなかったことを示唆している。
キーポイント: E = HEXレポーター色素、F= FAMレポーター色素、I =デオキシイノシン、Q = BHQ2クエンチャー色素、P= 3’-リン酸
【０１１１】
以下の試料を評価した。TaqMan（登録商標）PCRの結果は、配列決定によって評価した。
【０１１２】
【表４】
【０１１３】
DNAは、３０個のFFPEの黒色腫試料から抽出した（表４）。その結果、試料には腫瘍細胞及び正常細胞の両方に由来するDNAの混合物が含まれていた。TaqMan（登録商標）アッセイ由来の突然変異検出の結果を、ピロシーケンス及びGS20シーケンスと比較して表５に示す。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】
試料M3及びRM1は、２回目の抽出後でもピロシーケンスについて増幅することができず、両試料は、TaqMan（登録商標）及びGS20法によりV600Eネガティブ（WT）であると判定された。４つの試料は、ピロシーケンスの判定について人為的な解釈を必要とした。RM17の場合、ピロシーケンスの判定はV600Eネガティブであったが、TaqMan（登録商標）及びGS20の結果は、試料がV600Eポジティブであったことを示した；残りの３つのケースでは、これらの３つの方法が一致した結果を示した。ピロシーケンスによってV600Eネガティブと判定された３つの追加試料（RM3、RM6、RM8）は、TaqMan（登録商標）及びGS20法の両方によってはV600Eポジティブと判定された。これらの結果は、ピロシーケンスによる突然変異検出について、RM3、RM6、RM8及びRM17から突然変異含有DNAの生成が不十分であったことと一致している。試料RM8は、4300 GS20の配列決定の読み取り（各方向につき〜２０００）の４％においてV600Eポジティブであり、これはV600Eポジティブの全試料の中で観察された最低のパーセンテージの突然変異BRAFであった。
【０１１６】
ピロシーケンスと比較した場合GS20シーケンスの感度がより高いため、GS20法は、TaqMan（登録商標）テストの参照方法として使用された。COBAS TaqMan（登録商標）B-Raf V600EテストとGS20シーケンスとの間での一致のレベルは、V600Eポジティブについては１２／１２、すなわち１００％であり、そしてV600Eネガティブ（WT）試料については１８／１８、すなわち１００％であった。
【０１１７】
代表的な配列：
配列番号1 BRAF_MU (I =デオキシイノシン P= 3’-リン酸)
5' CTACAIAIAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3'
配列番号2 BRAF_WT (I =デオキシイノシン P= 3’-リン酸)
5' ACAITGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3'
配列番号3 BRAF_F1:
5' CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT 3'
配列番号4 BRAF_R5:
5' TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3'
【０１１８】
本発明は、明確な理解のために説明及び例によってやや詳細に説明してきたが、本発明の教示に照らすと、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく若干の変更及び修飾が行われうることは当業者にとっては自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、B-Raf V600Eアンプリコン（配列番号５）とX染色体の相当の領域（配列番号６）とのアラインメントを示す。B-Raf V600Eプライマー部位は矢印で示されている。前記アンプリコンは、エキソン１５（太字）及びイントロン（小文字）の一部を含んでいる。縦棒は、BRAFとX染色体配列との間で同一の位置を表している。コドン６００は四角で囲まれている；GTGはバリン（V）に相当する。プローブ結合領域は、陰影を付けることで強調されている；突然変異（MU）プローブは野生型（WT）よりも２ヌクレオチド長く（強調部分の5'-CT）、そして両プローブは、本明細書に示す配列の相補体と結合する。
【図２】図２は、コドン６００（矢印）の周囲のB-Rafエキソン１５（配列番号７）と、A-Raf（配列番号８）及びC-Raf（配列番号９）の相同領域とのアラインメントを示す。星印はB-Raf配列と比較した場合のアミノ酸の差異を表す（例えば、Mercer & Pritchard, Biochim Biophys Acta 1653:25-40, 2003）。
【図３】図３は、B-Raf V600Eアンプリコン（配列番号５）とARAF（A-Rafをコード）（配列番号１１）及びRAF1（C-Rafをコード）（配列番号１０）遺伝子由来の対応する配列とのアラインメントを示す。小文字のヌクレオチドがBRAF配列と異なる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
B-Rafキナーゼ阻害剤に対する癌細胞の感度を決定する方法であって：
−癌を有する患者から癌細胞由来の核酸試料を準備すること；
−当該核酸試料中の標的ポリヌクレオチド配列を、当該標的ポリヌクレオチド配列を増幅するプライマー対を用いて増幅すること、ここで、当該標的ポリヌクレオチド配列は、BRAF中にV600E突然変異部位を含んで成り、そして増幅は、配列番号１に記載されている配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを有する標識オリゴヌクレオチドプローブの存在下実施され、BRAF中のV600E突然変異部位で、突然変異した配列の存在を検出する；及び
−BRAFにおけるV600E突然変異の有無を検出すること；それによりB-Raf阻害剤に対する癌の感度を決定すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
増幅が、V600E突然変異部位における野生型配列の存在を検出する第二プローブの存在下実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二プローブが、配列番号２に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマー対のプライマーの一方が、配列番号３に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマー対のプライマーの一方が、配列番号４に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記反応を増幅する工程がRP−PCRを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
B-Rafキナーゼ阻害剤が突然変異特異的B-Rafキナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
B-Rafキナーゼ阻害剤がPLX4032である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
B-Raf阻害剤を用いた治療の候補者である患者を検出するためのキットであって、BRAF中のV600E突然変異を検出し、そして配列番号１に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る、第一対立遺伝子特異的プローブを含んで成る、キット。
【請求項１０】
野生型BRAF配列を検出し、そして配列番号２に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチド配列を含んで成る第二対立遺伝子特異的プローブを更に含んで成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
V600E突然変異部位を含んで成るBRAFの標的領域を増幅するプライマー対を更に含んで成る、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
前記プライマー対が、配列番号３に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成るプライマーを含んで成る、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記プライマー対が、配列番号３及び配列番号４に記載の配列を有するプライマーを含んで成る、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
前記第一プローブが、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有しており、そして前記キットが、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する第二プローブを更に含んで成り、そしてプライマー対が、配列番号３及び配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有するプライマーを含んで成る、請求項９に記載のキット。
【請求項１】
B-Rafキナーゼ阻害剤に対する癌細胞の感度を決定する方法であって：
−癌を有する患者から癌細胞由来の核酸試料を準備すること；
−当該核酸試料中の標的ポリヌクレオチド配列を、当該標的ポリヌクレオチド配列を増幅するプライマー対を用いて増幅すること、ここで、当該標的ポリヌクレオチド配列は、BRAF中にV600E突然変異部位を含んで成り、そして増幅は、配列番号１に記載されている配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを有する標識オリゴヌクレオチドプローブの存在下実施され、BRAF中のV600E突然変異部位で、突然変異した配列の存在を検出する；及び
−BRAFにおけるV600E突然変異の有無を検出すること；それによりB-Raf阻害剤に対する癌の感度を決定すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
増幅が、V600E突然変異部位における野生型配列の存在を検出する第二プローブの存在下実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二プローブが、配列番号２に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマー対のプライマーの一方が、配列番号３に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマー対のプライマーの一方が、配列番号４に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記反応を増幅する工程がRP−PCRを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
B-Rafキナーゼ阻害剤が突然変異特異的B-Rafキナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
B-Rafキナーゼ阻害剤がPLX4032である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
B-Raf阻害剤を用いた治療の候補者である患者を検出するためのキットであって、BRAF中のV600E突然変異を検出し、そして配列番号１に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成る、第一対立遺伝子特異的プローブを含んで成る、キット。
【請求項１０】
野生型BRAF配列を検出し、そして配列番号２に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチド配列を含んで成る第二対立遺伝子特異的プローブを更に含んで成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
V600E突然変異部位を含んで成るBRAFの標的領域を増幅するプライマー対を更に含んで成る、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
前記プライマー対が、配列番号３に記載のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１５個連続のヌクレオチドを含んで成るプライマーを含んで成る、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記プライマー対が、配列番号３及び配列番号４に記載の配列を有するプライマーを含んで成る、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
前記第一プローブが、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有しており、そして前記キットが、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する第二プローブを更に含んで成り、そしてプライマー対が、配列番号３及び配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有するプライマーを含んで成る、請求項９に記載のキット。
【図２】
【図３】
【図１】
【図３】
【図１】
【公開番号】特開２００９−７７７１２（Ｐ２００９−７７７１２Ａ）
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−２２９３９６（Ｐ２００８−２２９３９６）
【出願日】平成２０年９月８日（２００８．９．８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２２９３９６（Ｐ２００８−２２９３９６）
【出願日】平成２０年９月８日（２００８．９．８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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