本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の結合効力を修正する、乳癌および卵巣癌関連遺伝子内の突然変異（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ））を同定するための方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの結合効力を増加または減少させることによって、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現を減少させるＳＮＰを同定する。ｍｉＲＮＡ結合部位内にＳＮＰを導入することによるＢＲＣＡ１に結合するｍｉＲＮＡの改変は、ＢＲＣＡ１発現を調節するかまたは減少させ、最終的には、乳癌細胞または卵巣癌細胞の制御されない細胞増殖をもたらす。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００９年６月２５日に出願された仮出願ＵＳＳＮ６１／２２０，３４２号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）に関する。
【０００２】
政府の援助
本発明は、共にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金第ＣＡ１２４４８４号および第ＣＡ１３１３０１−０１Ａ１号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
一般的に、本発明は、癌および分子生物学の分野に関する。本発明は、癌を発症するリスクの増加を予測するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
癌検出の分野における進歩があるにもかかわらず、当技術分野では、臨床応用に容易に使用することができる様々な癌のための新規な遺伝子マーカーを同定する必要がある。これまで、癌を発症するリスクを予測するのに使用可能な選択肢は、比較的少ない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の方法は、ｍｉＲＮＡの標的への結合能力を修正する可能性のある乳癌遺伝子および卵巣癌遺伝子における多型を同定するだけでなく、標的遺伝子調節に対するこれらのＳＮＰの影響ならびに乳癌および卵巣癌のリスクを評価するための手段を提供する。これらの方法は、従来は認識されていなかった、乳癌および卵巣癌のリスクが増加している患者を同定するために使用される。本発明の方法を使用して、ＢＲＣＡ１遺伝子もしくはそのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物周辺の領域内またはこれらを含む領域内で生じるＳＮＰを同定することおよび特性評価することに特に関連する。
【０００６】
本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の結合能力を修正する可能性のある乳癌および卵巣癌関連遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）における一塩基多型（ＳＮＰ）を同定するための方法を提供する。好ましい実施形態では、乳癌および卵巣癌関連遺伝子は、ＢＲＣＡ１遺伝子それ自体、ゲノム内の周辺領域、ＢＲＣＡ１調節エレメントおよび／またはそれらのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物を含むＢＲＣＡ１である。ＨａｐＭａｐ（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＨａｐＭａｐ Ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｎａｔｕｒｅ，２００３．４２６，７８９−９６）、ｄｂＳＮＰ（Ｓｈｅｒｒｙ，Ｓ．Ｔら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９９９．９，６７７−９）および（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇで利用可能な）Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｄａｔａｂａｓｅなどの当該技術分野において承認されているいくつかのデータベースが目的のＳＮＰをコンピュータで同定するのに使用されるほか、ＰｉｃＴａｒ（Ｌａｎｄｉ，Ｄ．ら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００７））、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（Ｌｅｗｉｓ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ ２００５．１２０，１５−２０）、ｍｉＲａｎｄａ（Ｊｏｈｎ，Ｂ．ら、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ２００４．２，ｅ３６３）、ｍｉＲＮＡ．ｏｒｇ（Ｂｅｔｅｌ，Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００８．３６，Ｄ１４９−５３）およびＭｉｃｒｏＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（Ｒｕｓｉｎｏｖ，Ｖ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００５．３３，Ｗ６９６−７００）などの特殊アルゴリズムもｍｉＲＮＡ結合部位を同定するのに使用されるが、これらに限定されない。
【０００７】
本発明は、ｍｉＲＮＡ相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）部位における配列変異を評価するための、乳房腫瘍および卵巣腫瘍、隣接正常組織（使用可能な場合）ならびに正常組織試料を同定するための方法もまた提供する。この方法の好ましい実施形態では、ＢＲＣＡ１遺伝子またはそのｍＲＮＡ転写産物は、ｍｉＲＮＡ相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）部位を含む。本発明のある実施形態では、変異が生殖系列ＳＮＰである場合、隣接する正常組織は確認するのに使用される。あるいはまたはさらに、生殖系列ではない３’ＵＴＲ変異もまた、臨床的重要性について分析される。
【０００８】
また、本発明は、インビトロにおける標的遺伝子調節に対する同定されたＳＮＰの影響を評価する方法を提供する。この方法の好ましい形態では、同定されたＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子内またはそのｍＲＮＡ転写産物内に含まれる。この方法の別の好ましい形態では、同定されたＳＮＰは、ＢＲＣＡ１ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内に含まれる。本発明のある形態では、発現レベルを測定するための細胞培養系およびルシフェラーゼアッセイ（Ｃｈｉｎ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８．６８，８５３５−４０；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ２００５．１２０，６３５−４７）を使用して、ＳＮＰが評価される。野生型３’ＵＴＲを作製するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、細胞株からヒトゲノムＤＮＡを増幅するのに使用される。変異体配列を構築するために、部位特異的突然変異誘発法が使用される（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ２００５．１２０，６３５−４７）。次いで、これらの構築物は、ルシフェラーゼレポーターにクローニングされる。最後に、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｃｈｉｎ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８．６８，８５３５−４０）を使用して、レポーター発現が定量される。
【０００９】
本発明は、乳癌または卵巣癌を発症するリスクを評価する方法をさらに提供する。この方法の一形態では、目的のＳＮＰの保有率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）は、世界集団（ｗｏｒｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）における予測保有率に関して、試料癌集団内で比較される。この方法の好ましい実施形態では、目的のＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子内またはそのｍＲＮＡ転写産物内に含まれる。新規のＳＮＰに関して、世界集団と比較する前に、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が対立遺伝子の識別のために行われ得る。本明細書において提供される方法の他の実施形態では、一般集団およびＳＮＰを保有しない個体に関して、乳癌および／または卵巣癌を発症するＳＮＰに関連したリスクの増加を決定するために、目的のＳＮＰは、乳癌症例対照および卵巣癌症例対照と比較される。
【００１０】
具体的には、本発明は、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を含む単離および精製されたＢＲＣＡ１ハプロタイプであって、ＳＮＰの存在が被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクを増加させる、ＢＲＣＡ１ハプロタイプを提供する。本発明のハプロタイプは、単離および精製されたゲノム配列またはｃＤＮＡ配列である。また、ハプロタイプは、単離、精製、そして場合により増幅された配列である。ハプロタイプ配列が単離されるゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列は、体液および組織などの生物試料から得られる。最も一般的には、ハプロタイプが由来するＤＮＡ配列は、例えば、正常な被験体もしくは試験被験体から収集した血液試料または腫瘍試料から単離される。このハプロタイプの一形態では、ＳＮＰのそれぞれは、１つ以上のｍｉＲＮＡの活性を変化させる。このハプロタイプの別の形態では、ＳＮＰのそれぞれは、１つ以上のｍｉＲＮＡの活性を増加または減少させる。ある形態では、ＳＮＰは、１つ以上のｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合部位への結合効力を増加または減少させる。ｍｉＲＮＡ結合効力の変化は、ＢＲＣＡ１の発現を増加または減少させ、好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合効力の変化は、ＢＲＣＡ１発現を減少させる。ＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子の非コード領域またはコード領域、周辺遺伝子、およびＢＲＣＡ１発現を調節、変化、増加もしくは減少させるゲノムの遺伝子間配列または遺伝子内配列に位置してもよい。ＢＲＣＡ１遺伝子の非コード領域およびコード領域に位置するＳＮＰは、ｍｉＲＮＡ結合部位に位置し、その結果として、１つ以上のｍｉＲＮＡの活性を阻害する。このハプロタイプのある実施形態では、ＳＮＰは、ｒｓ９９１１６３０、ｒｓ１２５１６、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ３０９２９９５、ｒｓ１０６０９１５、ｒｓ７９９９１２、ｒｓ９９０８８０５およびｒｓ１７５９９９４８からなる群から選択される。好ましい実施形態では、ＳＮＰは、ｒｓ１２５１６、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ３０９２９９５、ｒｓ１０６０９１５およびｒｓ７９９９１２からなる群から選択される。最も選択的な実施形態では、ハプロタイプは、ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１０６０９１５を含む。あるいは、ＳＮＰは、ｒｓ８１７６３１８であるかまたはｒｓ１０６０９１５である。
【００１１】
本明細書において記載されるハプロタイプは、被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクを増加させる。乳癌および卵巣癌のすべてのサブタイプが本発明によって包含されるが、通常検討される乳癌の具体的なサブタイプは、トリプルネガティブ（ＴＮ）（ＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２ネガティブ）、エストロゲン受容体ポジティブ（ＥＲ＋）、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体ポジティブ（ＥＲ＋／ＰＲ＋）ならびにヒト上皮成長因子受容体２ポジティブ（ＨＥＲ２＋）である。好ましい実施形態では、本明細書において記載される珍しいハプロタイプは、最も高い頻度でＴＮ乳癌と関連する。学説に縛られることなく、本明細書において列挙されるホルモン受容体特異的乳癌サブタイプの中で、乳癌は、最も低い頻度で散発性の原因に関連し、したがって、遺伝性である可能性が最も高い。ＴＮ乳癌もまた、特にアフリカ系アメリカ人被験体においてｒｓ８１７６３１８ ＳＮＰおよび／またはｒｓ１０６０９１５を含むハプロタイプに確実に関連する。
【００１２】
本発明は、すべての開示されるハプロタイプを包含する。好ましいハプロタイプとしては、本明細書において記載される「珍しい」ハプロタイプが挙げられる：ＧＧＡＣＧＣＴＡ（配列番号６）、ＧＧＣＣＧＣＴＡ（配列番号９）、ＧＧＣＣＧＣＴＧ（配列番号１０）、ＧＧＡＣＧＣＴＧ（配列番号２１）またはＧＡＡＣＧＴＴＧ（配列番号２６）。
【００１３】
本発明は、乳癌または卵巣癌を発症するリスクの増加を示すＢＲＣＡ１多型シグネチャーであって、以下の一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１０６０９１５の存在または非存在の決定を含み、これらのＳＮＰの存在が乳癌または卵巣癌を発症するリスクの増加を示す、シグネチャーをさらに提供する。ある実施形態では、シグネチャーは、ｒｓ１２５１６、ｒｓ３０９２９９５およびｒｓ７９９９１２からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰの存在または非存在の決定をさらに含む。あるいはまたはさらに、シグネチャーは、ｒｓ９９１１６３０、ｒｓ９９０８８０５およびｒｓ１７５９９９４８からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰの存在または非存在の決定を含む。このシグネチャーの一形態では、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ１０６０９１５、ｒｓ１２５１６、ｒｓ３０９２９９５、ｒｓ７９９９１２、ｒｓ９９１１６３０、ｒｓ９９０８８０５またはｒｓ１７５９９９４８は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合効力を変化させる。あるいは、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ１０６０９１５、ｒｓ１２５１６、ｒｓ３０９２９９５、ｒｓ７９９９１２、ｒｓ９９１１６３０、ｒｓ９９０８８０５およびｒｓ１７５９９９４８は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合効力を増加または減少させる。少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、例えば、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／において公的に利用可能な）ｍｉＲＢａｓｅによって提供されるあらゆるヒトｍｉＲＮＡである。ある実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｍｉＲ−１１８０である。好ましくは、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−７である。
【００１４】
他の実施形態では、このシグネチャーは、１つ以上のマイクロＲＮＡの結合効力を減少させるＢＲＣＡ１遺伝子における少なくとも１つのＳＮＰの存在または非存在の同定をさらに含む。少なくとも１つのＳＮＰは、コード領域内または非コード領域内に生じてもよい。例示的な非コード領域としては、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、イントロン、遺伝子間領域、シス調節エレメント、プロモーターエレメント、エンハンサーエレメントまたは５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。限定されないコード領域の例は、エクソンである。
【００１５】
本明細書において記載されるシグネチャーは、被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクを決定する。乳癌および卵巣癌のすべてのサブタイプが本発明によって包含されるが、通常企図される乳癌の具体的なサブタイプは、トリプルネガティブ（ＴＮ）（ＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２ネガティブ）、エストロゲン受容体ポジティブ（ＥＲ＋）、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体ポジティブ（ＥＲ＋／ＰＲ＋）ならびにヒト上皮成長因子受容体２ポジティブ（ＨＥＲ２＋）である。好ましい実施形態では、本明細書において記載されるシグネチャーは、特にアフリカ系アメリカ人被験体におけるＴＮ乳癌を発症するリスクを決定するのに使用される。
【００１６】
本発明は、（ａ）試験被験体から試料を得る工程；（ｂ）対照試料を得る工程；（ｃ）試験試料由来のＤＮＡ配列内の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位におけるＳＮＰの存在または非存在を決定する工程；および（ｄ）ＳＮＰを含む少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位への少なくとも１つのｍｉＲＮＡの結合効力を、対照試料由来の対応するＤＮＡ配列における同じｍｉＲＮＡ結合部位への該ｍｉＲＮＡの結合効力と比較して、評価する工程を含む、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現を減少させ、かつ被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクを増加させるＳＮＰを同定する方法であって、対照試料と試験試料との間の、対応する結合部位への少なくとも１つのｍｉＲＮＡの結合効力における統計的に有意な変化の存在が、ＳＮＰの存在または非存在がｍｉＲＮＡ介在性の防御を阻害するかまたはｍｉＲＮＡ介在性のＢＲＣＡ１遺伝子発現の抑制を増大させることを示し、それによって、被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクもまた増加させるＳＮＰを同定する、方法をさらに提供する。対照試料と試験試料との間の、対応する結合部位への少なくとも１つのｍｉＲＮＡの結合効力における統計的に有意な増加または減少の存在は、ＳＮＰの存在または非存在がｍｉＲＮＡ介在性の防御を阻害するかまたはＢＲＣＡ１遺伝子発現の抑制を増大させることを示す。この方法のある実施形態では、試験被験体は、乳癌または卵巣癌と診断されている。対照的に、対照試料は、いかなる癌も有するとは診断されていない被験体から得られる。また、対照試料は、データベースまたは臨床研究から検索される対照値ともなり得る。試験試料または対照試料由来のＤＮＡ配列における結合部位へのｍｉＲＮＡの結合効力は、インビボ、インビトロまたはエクスビボで評価される。
【００１７】
本発明は、（ａ）試験被験体から試料を得る工程；（ｂ）試験試料由来のＤＮＡ配列中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位におけるＳＮＰの存在または非存在を決定する工程；および（ｃ）１つ以上の世界集団におけるＳＮＰの予測保有率に関して、乳癌集団または卵巣癌集団内のＳＮＰの保有率を評価する工程を含む、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現を減少させ、かつ被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクを増加させるＳＮＰを同定する方法であって、１つ以上の世界集団と比較した腫瘍試料中のＳＮＰの存在または非存在における統計的に有意な増加が、ＳＮＰが乳癌または卵巣癌を発症するリスクの増加に陽性に関連することを示し、ＢＲＣＡ１の発現を減少させる少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位内のＳＮＰの存在または非存在が、ＳＮＰの存在または非存在がｍｉＲＮＡ介在性の防御を阻害するかまたはｍｉＲＮＡ介在性のＢＲＣＡ１遺伝子発現の抑制を増大させることを示し、それによって、被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクもまた増加させるＳＮＰを同定する、方法を提供する。この方法のある実施形態では、試験被験体は、乳癌または卵巣癌と診断されている。対照的に、対照試料は、いかなる癌も有するとは診断されていない被験体から得られる。また、対照試料は、データベースまたは臨床研究から検索される対照値ともなり得る。世界集団は、地理的集団（ヨーロッパ人もしくはアフリカ系アメリカ人）または民族的集団（アシュケナージ系ユダヤ人）であり、身体的理由または文化的理由に関する構成員は、類似の遺伝的背景を共有することが予想される。
【００１８】
ＳＮＰを同定する方法に関して、ｍｉＲＮＡ結合部位は、実験的に決定され、データベースで同定され、またはアルゴリズムを使用して予測される。また、ＳＮＰの存在または非存在は、実験的に決定され、データベースで同定され、またはアルゴリズムを使用して予測される。
【００１９】
また、本発明は、（ａ）試験被験体からＤＮＡ試料を得る工程；および（ｂ）試料由来の少なくとも１つのＤＮＡ配列において、ｒｓ１２５１６、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ３０９２９９５およびｒｓ７９９９１２からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰの存在を決定する工程を含む、乳癌または卵巣癌を発症するリスクを有する被験体を同定する方法であって、少なくとも１つのＤＮＡ配列における少なくとも１つのＳＮＰの存在が、被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクを、正常な被験体と比較して１０倍増加させる、方法を提供する。好ましい実施形態では、方法は、ｒｓ１０６０９１５の存在を決定する工程をさらに含み、少なくとも１つのＤＮＡ配列におけるｒｓ１０６０９１５ならびにｒｓ１２５１６、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ３０９２９９５およびｒｓ７９９９１２からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰの合わせた存在が、被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクを、正常な被験体と比較して１００倍増加させる。正常な被験体は、ｒｓ１２５１６、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ３０９２９９５、ｒｓ７９９９１２またはｒｓ１０６０９１５を有する一般的な対立遺伝子を保有しない被験体である。
【００２０】
本発明は、（ａ）試験被験体からＤＮＡ試料を得る工程；および（ｂ）試料由来の少なくとも１つのＤＮＡ配列において、ｒｓ８１７６３１８またはｒｓ１０６０９１５の存在を決定する工程を含む、トリプルネガティブ（ＴＮ）乳癌を発症するリスクを有する被験体を同定する方法であって、少なくとも１つのＤＮＡ配列におけるｒｓ８１７６３１８またはｒｓ１０６０９１５の存在が、被験体のＴＮ乳癌を発症するリスクを、正常な被験体と比較して増加させる、方法もまた提供する。好ましい実施形態では、この方法は、ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１０６０９１５の存在を決定する工程を含み、少なくとも１つのＤＮＡ配列におけるｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１０６０９１５の合わせた存在が、被験体のＴＮ乳癌を発症するリスクをさらに増加させる。正常な被験体は、ｒｓ８１７６３１８またはｒｓ１０６０９１５を保有しない被験体である。試験被験体は、好ましくは、アフリカ系アメリカ人である。
【００２１】
本明細書におけるハプロタイプ、シグネチャーおよび方法によって記載されるように、乳癌は、散発性または遺伝性である。また、卵巣癌は、散発性または遺伝性である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ｍｉＲＮＡの生合成の略図である。
【図２−１】図２は、ＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲの注釈である。
【図２−２】図２は、ＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲの注釈である。
【図３−１】図３は、癌集団におけるＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲの図式的な比較である。図は、１２４ 個の癌ＤＮＡ試料および１４個のエール大学対照ＤＮＡ試料に由来するＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲ全体の増幅の配列決定結果に基づく。
【図３−２】図３は、癌集団におけるＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲの図式的な比較である。図は、１２４ 個の癌ＤＮＡ試料および１４個のエール大学対照ＤＮＡ試料に由来するＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲ全体の増幅の配列決定結果に基づく。
【図４Ａ】図４は、２，４７２人の個体を含む４６個の世界集団由来の３個のＳＮＰ部位で遺伝子型決定しているＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲの説明である。
【図４Ｂ】図４は、２，４７２人の個体を含む４６個の世界集団由来の３個のＳＮＰ部位で遺伝子型決定しているＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲの説明である。
【図５】図５は、７個の癌集団および１個のエール大学対照集団由来の３個のＳＮＰ部位で遺伝子型決定しているＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲのグラフ表示であり、３８４人の個体が、これらの８個の集団に含まれる。
【図６】図６は、系統を推測するとともに、ゲノムのＢＲＣＡ１領域のハプロタイプ解析を遂行するのに使用した８個のＳＮＰの説明である。ＢＲＣＡ１遺伝子内で見られたＳＮＰとしては、ｒｓ１２５１６、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ３０９２９９５、ｒｓ１０６０９１５およびｒｓ７９９９１２が挙げられる。ＢＲＣＡ１周辺のＳＮＰとしては、ｒｓ９９１６３０、ｒｓ９９０８８０５およびｒｓ１７５９９９４８が挙げられる。
【図７】図７は、ＢＲＣＡ１ハプロタイプの進化案の説明である。１０個の最も一般的なハプロタイプがここに示されている。各ハプロタイプは、祖先ハプロタイプ（ＧＧＣＣＡＣＴＡ、配列番号８）への変異の蓄積によって説明することができる。直接的に認められたハプロタイプの大部分は、順序付けることができ、１個の派生ヌクレオチド変化によって相違している。枠で囲まれた２個のハプロタイプのうちどちらが、採用されたＳＮＰを有する系統において最初に生じたかということに関しては未解決であった。ＡＧＣＣＡＴＴＡ（配列番号２）ハプロタイプは、現在のところ、世界中で最も一般的に認められるハプロタイプである。「あらゆる所に存在している」と表示された２個のハプロタイプは、世界のすべての地域に存在している（ＧＡＡＣＡＧＡＴＡ（配列番号１７）およびＧＡＡＣＧＣＴＣ（配列番号１８））。組換えハプロタイプ（ＡＧＣＣ−ＧＣＴＧ、配列番号１９）は、（南アメリカ、中央アメリカおよび北アメリカの地域を示す）新世界においてのみ見られる。
【図８】図８は、世界中の４６個の集団（２，４７２人の個体）からのＢＲＣＡ１地域ハプロタイプデータの説明である。
【図９】図９は、７個の癌集団および１個のエール大学対照群（３８４人の個体）に関する、ＢＲＣＡ１地域ハプロタイプデータの説明である。集団サイズ：対照：２９人、乳房／卵巣：１７、子宮：５５、卵巣：７７、ＥＲ／ＰＲ＋：４４、ＨＥＲ２＋：４７、ＭＰ：３９、ＴＮ：７６。
【図１０】図１０は、ＢＲＣＡ１の民族性内訳の説明である。
【図１１】図１１は、コード領域突然変異状態によるＢＲＣＡ１ハプロタイプデータの説明である。ハプロタイプによって、１１０人の患者をＢＲＣＡ１検査および分析した。
【図１２】図１２は、民族性データによって分けた、ＴＮおよびエール大学対照を有するＢＲＣＡ１地域ハプロタイプ頻度を示す略図である。
【図１３】図１３は、民族性および年齢によって分けた、ＴＮ乳癌群におけるＢＲＣＡ１地域ハプロタイプ頻度を示す略図である。
【図１４】図１４は、選択した各集団における遺伝子型決定した各ＳＮＰ（ｒｓ１２５１６対立遺伝子Ａ、ｒｓ８１７６３１８対立遺伝子Ａおよびｒｓ３０９２９９５対立遺伝子Ｇ）での派生対立遺伝子に関する、対立遺伝子頻度を示すグラフである。３８８人の個体（ヨーロッパ系アメリカ人およびアフリカ系アメリカ人対照）ならびに乳癌集団（左から右に示されるＴＮ、ＨＥＲ２＋およびＥＲ＋／ＰＲ＋）において、ＳＮＰを調査した。
【図１５】図１５は、診断年齢ごとの、乳癌患者の間の珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプ頻度を示すグラフである。珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプ頻度に関して、診断年齢が知られているすべての乳癌患者を評価した。診断時に、乳癌患者を、５２歳以下または５２歳超のいずれかにグループ分けした。乳癌患者では一般的だが、対照の間では珍しい５個のハプロタイプが示されている。
【図１６Ａ】図１６Ａは、乳癌患者の間の珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプ頻度を示すグラフである。乳癌患者では一般的だが、大域的対照集団の間ではめったに見られないハプロタイプに関して、乳癌患者を評価した。５個の珍しいハプロタイプ頻度は、Ｙ軸に沿って示されている。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、民族性ごとの、乳癌の間のＢＲＣＡ１ハプロタイプ頻度を示す図式的なダイアグラムである。ハプロタイプ頻度に関して、ヨーロッパ系およびアフリカ系アメリカ人乳癌患者を評価した。ヨーロッパ系アメリカ人およびアフリカ系アメリカ人を対照として追加した。９個の一般的なハプロタイプが示されている。乳癌患者では一般的だが、対照の間ではめったにない５個のさらなるハプロタイプが示されている（これらの珍しいハプロタイプは、番号付けされ、アスタリスクで印を付けられ、そして枠で囲まれている）。ゼロではない評価の残りのハプロタイプ頻度は、残りのクラスに合算されている。３個の３’ＵＴＲ多型は、（１位の部位を左端のヌクレオチドとし、８位の部位を右端のヌクレオチドとする場合、８個のヌクレオチド部位の２位の部位、３位の部位および４位の部位にある）太字フォントで示されており、３’ＵＴＲ内の派生対立遺伝子は、下線が引かれている。
【図１７】図１７Ａは、サブタイプごとの、乳癌患者の間の珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプ頻度を示すグラフである。サブタイプごとに、乳癌患者をグループ分けし、そして、乳癌患者では一般的だが、大域的対照集団の間ではめったに見られないハプロタイプに関して、評価した。５個の珍しいハプロタイプ頻度は、Ｙ軸に沿って示されている。図１７Ｂは、乳癌サブタイプおよび民族性ごとの、珍しいハプロタイプ頻度を示すグラフである。乳房腫瘍サブタイプごとに、ヨーロッパ系およびアフリカ系アメリカ人乳癌患者をさらにグループ分けし、そして、珍しいハプロタイプ頻度に関して、評価した。ヨーロッパ系アメリカ人およびアフリカ系アメリカ人を対照として追加した。乳癌患者では一般的だが、対照の間では珍しい５個のハプロタイプが示されている。
【図１８】図１８ＡおよびＢは、野生型（ＷＴ、ｒｓ１０６０９１５Ｇ）、またはルシフェラーゼレポーターに融合した突然変異ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡ（ｒｅ１０６０９１５Ａ変異型対立遺伝子を含むＢＲＣＡ１遺伝子）エレメントのいずれかで、ＴＮ乳癌細胞（示されるＭＤＡ ＭＢ２３１細胞）をトランスフェクションした後の、ルシフェラーゼレポーター構築物の転写抑制を示す一組のグラフである。ＷＴまたは変異型ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡエレメントのいずれかを含むルシフェラーゼレポーター（２５ｎｇ）を、細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクト細胞を溶解し、デュアルルシフェラーゼ活性に関して、アッセイした。祖先対立遺伝子（Ｇ）に対して、変異型対立遺伝子（Ａ）を正規化した。スチューデントの両側ｔ検定によって、統計的有意性を決定した。結果は、すべての細胞株（試験した９個の細胞株）にわたって、ＷＴと変異型ＢＲＣＡ１エレメントとの間で、ルシフェラーゼ活性の１．８５倍の変化を示した。したがって、ｒｓ１０６０９１５Ａは、ＢＲＣＡ１遺伝子内の調節エレメントである。ｒｓ１０６０９１５が存在すると、ｍｉＲＮＡは効果的に（十分にまたは強固に）結合し得ないか、または異なるｍｉＲＮＡがＢＲＣＡ１に結合し、翻訳の調節変化が可能になる。
【図１９】図１９は、ＢＲＣＡ１遺伝子内のｒｓ１０６０９１５周辺の部位を標的とするｍｉＲＮＡの略図である。４個の候補ｍｉＲＮＡは、ｒｓ１０６０９１５の祖先対立遺伝子または変異型対立遺伝子のいずれかに結合するが、代替ＳＮＰ対立遺伝子には結合しないと予測される。多くの他のものは、あまり強くない相互作用または変化で結合すると予測される。ＢＲＣＡ１ ｒｓ１０６０９１５、６１位から９４位の部位５’−ＡＡＣＡＧＣＵＡＣＣＣＵＵＣＣＡＵＣＡＵＡＡＧＵＧＡＣＵＣＵＵＣＵＧ−３’（配列番号２８）。Ｈｓａ−ｍｉＲ−７、５’−ＵＧＧＡＡＧＡＣＵＡＧＵＧＡＵＵＵＵＧＵＵＧＵ−３’（配列番号２９）。ＢＲＣＡ１ ｒｓ１０６０９１５、７９位から１０５位の部位５’−ＡＵＡＡＧＵＧＡＣＵＣＣＵＣＵＧＣＣＣＵＵＧＡＧＧＡＣ−３’（配列番号３０）。Ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５Ｐ、５’−ＣＵＵＵＵＵＧＣＧＧＵＣＵＧＧＧＣＵＵＧＣ−３’（配列番号３１）。ＢＲＣＡ１ ｒｓ１０６０９１５、４５位から９３位の部位５’−ＵＧＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＵＵＣＵＡＡＣＡＧＣＵＡＣＣＣＵＵＣＣＡＵＣＡＵＡＡＧＵＧＡＣＵＣＵＵＣＵ−３’（配列番号３２）。Ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、５’−ＵＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＧＵＵＣＣＵＧＡ−３’（配列番号３３）。ＢＲＣＡ１ ｒｓ１０６０９１５、４４位から９６位の部位５’−ＡＵＧＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＵＵＣＵＡＡＣＡＧＣＵＡＣＣＣＵＵＣＣＡＵＣＡＵＡＡＧＵＧＡＣＵＣＵＵＣＵ−３’（配列番号３４）。Ｈｓａ−ｍｉＲ−２９８、５’−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＧＡＧＧＵＵＣＵＣＣＣＡ−３’（配列番号３５）。
【図２０】図２０Ａは、珍しいハプロタイプを持たない癌患者と比較した、珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプ腫瘍における著しく高いレベルのｍｉＲ−７発現を示すグラフである（ｐ＝０．０４）。ｍｉＲ−７発現は、乳癌サブタイプよりむしろハプロタイプと相互に関連していると考えられる。図２０Ｂは、ＴＮ乳癌患者における、ｍｉＲＮＡの機能としてのｍｉＲＮＡ発現頻度を示すグラフである。ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２８およびｍｉＲ−３４２は、ＢＲＣＡ１腫瘍において高発現している。例えば、ｍｉＲ−７は、ＴＮ乳癌腫瘍において高発現している。他の乳癌サブタイプは試験しなかったが、珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプが存在する他のサブタイプもまた、高いレベルのｍｉＲ−７発現を示すであろうと考えられる。
【図２１】図２１は、野生型（ＷＴ）ＢＲＣＡ１（ＡＡ）およびｒｓ１０６０９１５ ＳＮＰを含むＢＲＣＡ１（ＧＧ）に対する、ｍｉＲ−７の結合効力を示すグラフである。ｍｉＲ−７結合は、ｒｓ１０６０９１５ ＳＮＰの存在により変化する。祖先配列または変異型配列（ｒｓ１０６０９１５ ＳＮＰを含むＢＲＣＡ１）でトランスフェクトしたＨＣＣ１９３７＋／＋細胞：（０．５ｎＭ）。スクランブル対照ではなくｍｉＲ−７が、ＷＴ ＢＲＣＡ１配列に結合している、すなわち、ｍｉＲ−７は、ＢＲＣＡ発現を特異的に変化させている。注目すべきは、このモデルでは、発現が変化すると、ルシフェラーゼ発現が増大することが明らかにされているということである。ｍｉＲ−７もスクランブル対照も、変異型ＢＲＣＡ１の発現を変化させていないが、このことは予測していた；変異型対立遺伝子内には予測結合部位が存在しないからである（変異型対立遺伝子は、ｍｉＲ−７結合部位を破壊するが、ｍｉＲ−７結合部位は、そうでなければＷＴ ＢＲＣＡ１に存在し、おそらくＢＲＣＡ１を保護し、より高いレベルのｍＲＮＡまたはタンパク質をもたらす）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
現在、乳癌は、最も多く診断される癌であり、女性における癌による死亡の主な原因のひとつである。臨床的分類および分子的分類は、乳癌をサブグループにうまく分類しており、予後的に重要であるカテゴリーにおいて固有の遺伝子発現を示している。カテゴリーの中で、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはプロゲステロン受容体（ＰＲ）ポジティブ、ＨＥＲ２受容体遺伝子増幅腫瘍およびトリプルネガティブ（［ＴＮ］ＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２腫瘍）が、これらの研究から生じている。ＥＲ／ＰＲ＋腫瘍およびＨＥＲ２＋腫瘍はともに最も一般的（８０％）であり、基底様腫瘍またはＴＮ腫瘍は、乳癌の約１５〜２０％の割合を占めている（Ｉｒｖｉｎ ＷＪ，Ｊｒ．およびＣａｒｅｙ ＬＡ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００８；４４（１８）：２７９９−８０５）。ＴＮ表現型は、積極的に解明されているが不明なところが多い癌のサブクラスを表し、これは、若い女性の間およびアフリカ系アメリカ人女性で最も一般的である。
【００２４】
ＢＲＣＡ１コード配列変異は、乳癌に関する周知のリスクファクターであるが、しかしながら、これらの変異は、すべての乳癌症例の５％未満の割合を毎年占めている。全体として、ＢＲＣＡ１変異の結果として生じる乳房腫瘍は、ＴＮ（５７％）（Ａｔｃｈｌｅｙ ＤＰら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００８；２６（２６）：４２８２−８）またはＥＲ＋乳癌（３４％）（ＴｕｎｇＮら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；１２（１）：Ｒ１２．）が最も多く、ＨＥＲ２＋乳癌（約３％）（Ｌａｋｈａｎｉ ＳＲら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００２；２０（９）：２３１０−８．）はほとんどない。ＢＲＣＡ１変異は極めてまれであるため、ＴＮ腫瘍は、ＢＲＣＡ１の低発現によってしばしば特徴付けられる（Ｔｕｒｎｅｒ Ｎ，Ｔｕｔｔ Ａ，Ａｓｈｗｏｒｔｈ Ａ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ ２００４；４（１０）：８１４−９）。ＢＲＣＡ１変異は、ＴＮ腫瘍の約１０〜２０％の割合を占めるのみである（Ｙｏｕｎｇ ＳＲら、ＢＭＣ ｃａｎｃｅｒ ２００９；９：８６；Ｍａｌｏｎｅ ＫＥら、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００６；６６（１６）：８２９７−３０８；Ｎａｎｄａ Ｒら、ＪＡＭＡ ２００５；２９４（１５）：１９２５−３３）。これらの結果は、個体を乳癌にかかりやすくするＢＲＣＡ１誤発現に関連するさらなる遺伝因子が存在する可能性があることを示唆している。
【００２５】
ハプロタイプは、いくつかのＳＮＰのパターンであり、これは、ＤＮＡの遺伝子内またはセグメント内で互いに連鎖不均衡（ＬＤ）にあり、したがって、一つの単位として遺伝で受け継がれる。ハプロタイプは、集団内のすべての測定および不測定対立遺伝子に関するマーカーとして働くので、目的の領域のハプロタイプ研究により、原因ＳＮＰの調査を絞り込むことができる。ＢＲＣＡ１ハプロタイプと乳癌との関連性の過去の研究は、矛盾する結果をもたらしてきた。Ｃｏｘらは、４個の標識ＳＮＰによって予測される５個の一般的なハプロタイプ（５％以上）を同定した。これらのＳＮＰの検査によって、ハプロタイプの１つが、看護師健康調査において白人女性における散発性乳癌の２０％のリスクの増加（オッズ比１．１８、９５％信頼区間１．０２〜１．３７）を予測したことが示された（Ｃｏｘ ＤＧら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；７（２）：Ｒ１７１−５）。このハプロタイプ、家族歴陽性および乳癌リスクの間で、相互作用が有意に（ｐ＝０．０５）認められた（Ｃｏｘ ＤＧら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；７（２）：Ｒ１７１−５）。一方、Ｆｒｅｅｄｍａｎらは、多民族的コホート研究から、コホートおいてＢＲＣＡ１遺伝子座にわたる一般的な変異を検査した。このグループは、ＢＲＣＡ１における一般的な変異が、散発性乳癌リスクに実質的に影響を与えることを示すことができなかった（Ｆｒｅｅｄｍａｎ ＭＬら、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００５；６５（１６）：７５１６−２２）。これらのハプロタイプ研究は、ＢＲＣＡ１のコード領域およびイントロン領域におけるＳＮＰを有する変異に主に焦点を合わせていた（Ｄｕｎｎｉｎｇ ＡＭら、Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９７；６（２）：２８５−９；Ｂａｕ ＤＴら、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４；６４（１４）：５０１３−９）。
【００２６】
ｍｉＲＮＡは、進化的に保存され、ほぼすべての癌で異常に発現している２２個のヌクレオチド非コードＲＮＡのクラスであり、それらは、癌抑制遺伝子または腫瘍抑制因子の新規なクラスとして機能する。 ｍｉＲＮＡが３’ＵＴＲにおいてメッセンジャー（ｍＲＮＡ）に結合する能力は、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質発現を調節するために重要であり、結合は、一塩基多型の影響を受け得る。最近のデータは、癌遺伝子の３’ＵＴＲにおける変異体が、癌リスクの強力な遺伝子マーカーであることを示している（Ｃｈｉｎ ＬＪら、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８；６８（２０）：８５３５−４０；Ｌａｎｄｉ Ｄら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２００８；２９（３）：５７９−８４；Ｐｏｎｇｓａｖｅｅ Ｍら、Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ２００９；１３（３）：３０７−１７）。
【００２７】
最近、ＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲは、このようなｍｉＲＮＡ結合部位ＳＮＰに関して研究されており、ｒｓ１２５１６およびｒｓ８１７６３１８を有する派生（および低頻度）対立遺伝子は、タイ人女性において、家族性乳癌および家族性卵巣癌と明らかな関連性を示した。研究によって、両方のＳＮＰ部位における派生対立遺伝子Ａに関するホモ接合性が、影響を受けないタイ人において見られる頻度の３倍で、癌患者に存在することが明らかになり、重要な癌関連性をもたらした（ｐ＝０．００７）。機能分析によって、同じ染色体上に、すなわちシスに存在する場合に、両部位を有する派生対立遺伝子のＢＲＣＡ１機能の活性が減少することが示され、最も大きな減少がｒｓ８１７６３１８を有する派生対立遺伝子で見られることを示された（Ｐｏｎｇｓａｖｅｅ Ｍら、Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ２００９；１３（３）：３０７−１７）。本研究は、３’ＵＴＲ変異体が既知のＢＲＣＡ１変異に関連しなかったことを明らかにした。さらに、１９９８年における研究は、ＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲにおける３番目のＳＮＰ、すなわちｒｓ３０９２９９５を有する対立遺伝子が、アフリカ系アメリカ人女性において乳癌のリスクの増加に関連することを報告した。より珍しい派生Ｇ対立遺伝子は、アフリカ系アメリカ人対照よりもアフリカ系アメリカ人乳癌症例においてより多いことが明らかになった。アフリカ系アメリカ人女性の間の乳癌およびＧ対立遺伝子に関する年齢調整ＯＲは、３．５（９５％ＣＩ、１．２−１０）であった（Ｎｅｗｍａｎ Ｂら、ＪＡＭＡ １９９８；２７９（１２）：９１５−２１）。
【００２８】
本発明は、機能的３’ＵＴＲ変異体を含むハプロタイプ研究が、乳癌リスクに関連するＢＲＣＡ１ハプロタイプをよりうまく同定するはずであるという理解に一部基づく。さらに、ＢＲＣＡ１機能不全は乳癌サブタイプによって異なるので、乳癌サブタイプによって、これらのハプロタイプを評価した。その結果、乳癌患者において、３’ＵＴＲ ＳＮＰを同定したところ、これらの１個は個々に重要であった。続いて、ハプロタイプと乳癌の関連性を決定するために、これらの変異体およびＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲ周辺の５個のＳＮＰを用いて、ハプロタイプ解析を実施した。本研究によって、乳癌患者では通常共有するが非癌集団ではほとんど共有しない５個のハプロタイプを、さらに同定した。これらの珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプは、乳癌リスクに関連するＢＲＣＡ１機能不全の新規な遺伝子マーカーを表す。
【００２９】
癌は、制御されない細胞増殖および損傷細胞の生存によって起こる多面的な疾患であり、これにより腫瘍形成が生じる。細胞分裂、細胞分化および細胞死が一生を通じて必ず適切に起こるようにするためのいくつかの安全装置を、細胞は発達させている。多くの調節因子は、細胞増殖および細胞分化を導く遺伝子をオンまたはオフにする（Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ，Ａ．＆Ｓｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２００６，６：２５９−６９）。これらの腫瘍抑制遺伝子および癌遺伝子への損傷は、癌で選択される。ほとんどの腫瘍抑制遺伝子および癌遺伝子は、最初に転写され、次いでタンパク質に翻訳されて、それらの影響を発現する。最近のデータは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と称されるタンパク質非コードＲＮＡ低分子もまた腫瘍抑制因子または癌遺伝子のいずれかとして機能し得ることを示している（Ｍｅｄｉｎａ，Ｐ．Ｐ．およびＳｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ２００８．７，２４８５−９２）。ヒトの疾患の中で、ｍｉＲＮＡが、癌において異常に発現または変異していることが示されており、このことは、それらが、より正確にはオンコｍｉｒ（ｏｎｃｏｍｉｒ）と称される癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の新規なクラスとしての役割を果たすことを示唆している（Ｉｏｒｉｏ，Ｍ．Ｖら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５．６５，７０６５−７０）。
【００３０】
ｍｉＲＮＡは、進化的に保存された、短い、タンパク質非コード一本鎖ＲＮＡであり、これは、転写後遺伝子調節因子の新規クラスの代表的なものである。研究によって、腫瘍組織と正常組織との間で、異なるｍｉＲＮＡ発現プロファイルが示され（Ｍｅｄｉｎａ，Ｐ．Ｐ．およびＳｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ２００８．７，２４８５−９２）、ｍｉＲＮＡは、研究された実質的にすべての癌サブタイプにおいて異常なレベルである（Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ，Ａ．＆Ｓｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００６．６，２５９−６９）。ｍｉＲＮＡは、それらの標的遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合し、それぞれ何百もの異なる標的転写産物を調節するが、このことは、ｍｉＲＮＡがヒトゲノムにおけるタンパク質コード遺伝子の３０％を上方制御し得ることを示唆している（Ｃｈｅｎ，Ｋら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２００８．２９，１３０６−１１）。したがって、機能不全なｍｉＲＮＡの効果は多面的である可能性があり、それらの異常発現は、細胞恒常性の平衡を潜在的に失わせて、癌などの疾患の一因となる可能性がある。
【００３１】
ｍｉＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への結合能力は、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質発現を調節するのに重要である。しかしながら、ｍｉＲＮＡ標的部位に内在し、存在する結合部位を消去するかまたは誤った結合部位を作り出し得る一塩基多型（ＳＮＰ）によって、この結合は影響を受け得る（Ｃｈｅｎ，Ｋ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２００８．２９，１３０６−１１）。癌などの疾患におけるｍｉＲＮＡ標的部位ＳＮＰの役割は、まさに定義され始めたばかりである。
【００３２】
ｍｉＲＮＡ
ｍｉＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子のｍＲＮＡと対合することによって転写後遺伝子調節において機能する約２２ヌクレオチド長のタンパク質非コードＲＮＡ低分子の広いクラスである。最近、生存経路において重要であることが知られているタンパク質をｍｉＲＮＡが調節するという証拠によって、ｍｉＲＮＡがヒト癌遺伝子座で役割を果たすことが示された（Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ，Ａ．＆Ｓｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００６，６：２５９−６９；Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．Ｃｅｌｌ ２００１，１０７：８２３−６；Ｓｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．およびＷｅｉｄｈａａｓ，Ｊ．Ｂ．Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ ２００６，２：７３−８２）。ｍｉＲＮＡは多くの下流の標的を制御するので、それらは、癌の処置に関する新規な標的として作用し得る。
【００３３】
ｍｉＲＮＡの基本的な合成および成熟は、図１において描かれ得る（Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ，Ａ．およびＳｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００６．６，２５９−６９）。つまり、ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって核においてｍｉＲＮＡ遺伝子から転写されて、長い一次ＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）転写物を形成し、これらは、キャップ化およびポリアデニル化される（Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ，Ａ．およびＳｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００６．６，２５９−６９；Ｌｅｅ，Ｙ．ら、Ｅｍｂｏ Ｊ ２００２．２１，４６６３−７０）。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、数キロ塩基長であり得、リボヌクレアーゼＩＩＩ（ＲＮＡａｓｅＩＩＩ）酵素ドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）およびその補因子、すなわちパーシャ（Ｐａｓｈａ）によって核においてプロセシングされて、約７０ヌクレオチドのステムループ構造を有するｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を放出する。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、エクスポーチン５によってＲａｎ‐グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）依存的に核から細胞質に搬出され、そこで、次いでそれらは、ダイサー、すなわちリボヌクレアーゼＩＩＩ（ＲＮＡａｓｅＩＩＩ）酵素によってプロセシングされる。これは、約２２塩基ヌクレオチドの二本鎖ｍｉＲＮＡ：ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）に組み込まれるｍｉＲＮＡ二本鎖の放出を引き起こす。この時点で、複合体は今やその標的遺伝子を調節することができる。
【００３４】
図１は、ｍｉＲＮＡとその標的との間の相補性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ）の程度に依存する２つの方法のうち１つによって、遺伝子発現の調節がどのように起こり得るかを示す。不完全な相補性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ）を有するｍＲＮＡ標的に結合するｍｉＲＮＡは、タンパク質翻訳のレベルで標的遺伝子発現を阻害する。一般的に、このメカニズムを使用するｍｉＲＮＡのための相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）部位は、標的ｍＲＮＡ遺伝子の３’ＵＴＲにおいて発見される。完全な相補性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ）を有するｍＲＮＡ標的に結合するｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの切断を誘導する。このメカニズムを使用するｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ標的のコード配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において一般的に見られるｍｉＲＮＡ相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）部位に結合する。
【００３５】
哺乳動物では、ｍｉＲＮＡは、研究された実質的にすべての癌サブタイプにおいて異常なレベルで見られる遺伝子調節因子である。標的遺伝子に結合する適切なｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質発現を調節するのに重要である。しかしながら、ｍｉＲＮＡ結合部位に内在し、存在する結合部位をなくすかまたは非正統的な結合部位を作り出し得る多型によって、良好な結合は影響を受け得る。したがって、ｍｉＲＮＡ結合部位における多型は、遺伝子およびタンパク質発現への広範囲に及ぶ影響を有し、癌などのヒト疾患のリスクに影響を与え得る遺伝的変異性の別の原因を示し得る。疾患におけるｍｉＲＮＡ結合部位ＳＮＰの役割は、まさに定義され始めたばかりであり、ｍｉＲＮＡの結合能力を修正し、それによって、標的遺伝子調節ならびに乳癌および／または卵巣癌のリスクに影響を与える乳癌遺伝子におけるＳＮＰの同定は、乳癌および／または卵巣癌リスクの増加を有する患者を認識するための新規な方法を同定するのに役立つ可能性がある。
【００３６】
ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡおよび標的遺伝子の非コード領域だけでなく、タンパク質コード領域も標的とする。ｍｉＲＮＡのメカニズム：標的認識は、非コード領域とコード領域との間で異なる可能性がある。ｍｉＲＮＡがタンパク質コード領域内の結合部位を認識する場合、ｍｉＲＮＡ結合の転写サイレンシング効果は、非コード領域におけるｍｉＲＮＡ認識およびｍｉＲＮＡ結合の結果と比較して、減少する可能性がある。また、タンパク質コード領域内に位置するｍｉＲＮＡ結合部位シード領域は、非コード領域に位置する結合部位のシード領域よりも多数のｍｉＲＮＡに結合したヌクレオチドを必要とする可能性がある。ＳＮＰは、コード領域内に位置するｍｉＲＮＡ結合部位においても生じ、その結果として、１つ以上のｍｉＲＮＡの標的遺伝子の発現を調節する能力に影響を与える可能性がある。
【００３７】
コード領域において生じ、ｍｉＲＮＡの活性に影響を与えるＳＮＰは、標的タンパク質の発現に対して、定量的にまたは定性的に類似する効果を有する可能性があると考えられる。あるいは、コード領域において生じ、ｍｉＲＮＡの活性に影響を与えるＳＮＰは、標的タンパク質の発現に対して、定量的にまたは定性的に異なる効果を有する可能性がある。非コード領域およびコード領域においてＳＮＰが同時に存在する場合に、これら両方のＳＮＰは、１つ以上のｍｉＲＮＡが（これらの個々のＳＮＰが相乗的に作用する）それらの各結合部位に結合する結合能力に影響を与えて、標的転写産物または標的タンパク質の発現に影響を与えるとさらに考えられる。
【００３８】
ｍｉＲＮＡ活性は、細胞周期によってさらに影響を受ける。細胞周期停止中、あるｍｉＲＮＡは、翻訳を活性化するかまたは標的ｍＲＮＡの上方制御を誘導することを示している（Ｖａｓｕｄｅｖａｎ Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７．３１８（５８５８）：１９３１−４）。したがって、ｍｉＲＮＡの活性は、細胞周期の、例えば成長（Ｇ_１およびＧ_２）期中および合成（Ｓ_１）期中の転写抑制と、細胞周期停止（Ｇ_０）中の転写活性化との間で揺れる可能性がある。学説に縛られることなく、癌細胞は、不適切な時期にまたは不適切な頻度で細胞周期に入り細胞周期を終える。また、癌細胞は、ＢＲＣＡ１などのＤＮＡ修復タンパク質の機能的または適切なレベルの安全装置を有さずに、細胞周期をしばしば終える。非癌性の正常細胞は、ＢＲＣＡ１に結合したｍｉＲＮＡが腫瘍抑制タンパク質の発現を上方制御するＧ_０期の状態である可能性があるが、癌細胞は、ｍｉＲＮＡがタンパク質発現を転写段階で抑制する成長期の状態にあることが最も多い。本発明は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの活性または結合に影響を与える非コード領域および／またはコード領域におけるＳＮＰの存在が、例えばＢＲＣＡ１の上方制御を阻害する可能性があり、これが、正常細胞が細胞周期に入るのを誘導し、該細胞周期中で、さらなるｍｉＲＮＡがＢＲＣＡ１および／または他の腫瘍抑制遺伝子の発現をさらに抑制する可能性があると考える。
【００３９】
一塩基多型（ＳＮＰ）
一塩基多型（ＳＮＰ）は、ＤＮＡ配列変異であり、これは、ゲノム（または他の共有配列）中の一塩基が、種の構成員の間で（または個体における一組の染色体の間で）異なる場合に生じる。ＳＮＰは、遺伝子のコード配列内、遺伝子の非コード領域内または遺伝子の間の遺伝子間領域に含まれてもよい。遺伝子コードの縮重性のために、コード配列内のＳＮＰは、産生されるタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変化させないだろう。同じポリペプチド配列をコードする新しいＤＮＡ配列をもたらすＳＮＰ変異は、シノニマス（ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ）と名付けられる（サイレント変異とも称される。）。反対に、異なるポリペプチド配列をコードする新しいＤＮＡ配列をもたらすＳＮＰ変異は、非シノニマス（ｎｏｎ−ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ）と名付けられる。タンパク質コード領域に存在しないＳＮＰは、それでもやはり、遺伝子スプライシング、転写因子結合または非コードＲＮＡの配列に影響を与える可能性がある。
【００４０】
本発明の方法に関して、非コードＲＮＡ領域は、ｍｉＲＮＡ分子に相補的であり他の調節因子との相互作用に必要とされる調節配列を含むので、それらの領域内に生じるＳＮＰは特に重要である。ゲノム配列内に生じるＳＮＰは、分解または翻訳サイレンシングのためのｍｉＲＮＡ分子によって標的とされるｍＲＮＡ転写産物に転写される。ゲノム配列または遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に生じるＳＮＰは、本発明の方法に特に重要である。
【００４１】
ＢＲＣＡ１
ＢＲＣＡ１（若年性乳癌１（ＢＲｅａｓｔ ＣＡｎｃｅｒ １，ｅａｒｌｙ ｏｎｓｅｔ））は、ヒト腫瘍抑制遺伝子である。ＢＲＣＡ１は、乳癌に最もよく関連するが、ＢＲＣＡ１遺伝子は、体のあらゆる細胞において存在している。腫瘍抑制遺伝子として、ＢＲＣＡ１は、細胞増殖をネガティブに調節し、損傷ＤＮＡを修復することによってまたはＤＮＡがあまりにも損傷しているために修復できない細胞に関する細胞の自滅プログラムを開始することによって、変異が導入されることを防ぐ。
【００４２】
ＢＲＣＡ１のような腫瘍抑制遺伝子が変異または誤調節され、次いでその機能が阻害される場合、細胞は、不完全に複製されたＤＮＡで増殖が進む可能性がある。また、細胞は、あまりにも頻繁に細胞周期に入る可能性がある。このような状況において、腫瘍は形成する。良性腫瘍とは対照的な癌性腫瘍は、隣接組織の制御されない増殖、浸潤および破壊、ならびにリンパ液または血液を介した体内の他の部位への転移を示す。
【００４３】
具体的には、相同的組換え、すなわち、相同的で無傷のヌクレオチド配列が、２本の類似または同一ＤＮＡ鎖（例えば、姉妹染色分体、相同染色体または（細胞周期の段階に依存する）鋳型である同じ染色体に由来する配列）の間で交換される過程によって、ＢＲＣＡ１は、ＤＮＡにおける二本鎖の損傷を修復する。しかしながら、ＢＲＣＡ１タンパク質は、単独で機能しない。ＢＲＣＡ１は、他の腫瘍抑制タンパク質、ＤＮＡ損傷センサーおよびシグナル伝達物質と結合して、ＢＲＣＡ１結合ゲノムサーベイランス（ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）複合体（ＢＡＳＣ）として知られる大きな多サブユニットタンパク質複合体を形成する。
【００４４】
ＢＲＣＡ１タンパク質は複合体を形成して、細胞機能を実行することができるという事実にもかかわらず、ＢＲＣＡ１遺伝子における変異は、細胞修復プログラムおよび細胞増殖プログラムの規制を撤廃するのに十分である。重要なことに、本発明は、一塩基多型（ＳＮＰ）、ハプロタイプ、１つ以上のｍｉＲＮＡがＢＲＣＡ１遺伝子のコード領域もしくは非コード領域に結合する機能を抑制または阻害するＳＮＰを同定するための方法、および、本明細書において記載される少なくとも１つの多型を検出することによって癌を発症するリスクの増加を予測するための方法を提供する。
【００４５】
本発明は、ＢＲＣＡ１内のＳＮＰを同定または特性評価するための方法を提供する。学説に縛られることなく、本明細書において開示されるＳＮＰ、および本明細書において開示される方法を使用して同定されたＳＮＰは、ｍｉＲＮＡ結合部位内で生じるか、またはそうでなければｍｉＲＮＡ活性に影響を与え、１つ以上のｍｉＲＮＡとＢＲＣＡ１との間の「より強固な」ｍｉＲＮＡ相互作用もしくは結合を引き起こすか、または「より弱い」ｍｉＲＮＡ相互作用もしくはこれらの相互作用の喪失を引き起こす場合もあると考えられる。３’ＵＴＲにおけるこれらのｍｉＲＮＡの結合効力または結合活性の増加は、ＢＲＣＡ１の転写の減少をもたらし、全体的には、細胞におけるＢＲＣＡ１タンパク質のより低いレベルをもたらす。エクソン内で結合を失う可能性もまた、ＢＲＣＡ１のより低いレベルをもたらす可能性がある。したがって、本明細書において同定されるＳＮＰは、ＢＲＣＡ１腫瘍抑制遺伝子を抑制し、細胞修復メカニズムおよび細胞増殖メカニズムがＢＲＣＡ１による監視なしで進行することを可能にする。上記のように、制御されない細胞増殖は、癌を発症するリスクの増加をもたらす。
【００４６】
典型的なＢＲＣＡ１遺伝子およびＢＲＣＡ１転写産物は、以下に提供される。（ＮＣＢＩアクセッション番号によって提供される）すべてのＧｅｎＢａｎｋの記録は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４７】
転写産物変異体１であるヒトＢＲＣＡ１は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７２９４および配列番号１１の核酸配列によってコードされる。
【００４８】
【化１−１】

【００４９】
【化１−２】

【００５０】
【化１−３】

転写産物変異体２であるヒトＢＲＣＡ１は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７３００および配列番号１２の核酸配列によってコードされる。
【００５１】
【化２−１】

【００５２】
【化２−２】

【００５３】
【化２−３】

転写産物変異体３であるヒトＢＲＣＡ１は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７２９７および配列番号１３の核酸配列によってコードされる。
【００５４】
【化３−１】

【００５５】
【化３−２】

【００５６】
【化３−３】

転写産物変異体４であるヒトＢＲＣＡ１は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７２９８および配列番号１４の核酸配列によってコードされる。
【００５７】
【化４−１】

【００５８】
【化４−２】

転写産物変異体５であるヒトＢＲＣＡ１は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７２９９および配列番号１５の核酸配列によってコードされる。
【００５９】
【化５−１】

【００６０】
【化５−２】

転写産物変異体６であるヒトＢＲＣＡ１は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＲ＿０２７６７６および配列番号１６の核酸配列によってコードされる。
【００６１】
【化６−１】

【００６２】
【化６−２】

【００６３】
【化６−３】

ＢＲＣＡ１：ｍｉＲＮＡ相互作用
著しく過剰発現したｍｉＲＮＡは、腫瘍抑制遺伝子をネガティブに調節することによって腫瘍成長を促進する癌遺伝子として示唆されている。腫瘍抑制遺伝子として、ＢＲＣＡ１の機能の１つは、１つ以上のｍｉＲＮＡの発現を抑制している可能性がある。例えば、ｍｉＲ−７は、ＢＲＣＡ１によって抑制され、ＢＲＣＡ１が欠損した細胞において過剰発現している（表１）。図２０は、乳癌において、具体的にはトリプルネガティブ（ＴＮ）サブタイプ内でｍｉＲ−７が高発現していることをさらに明示している。本明細書において提供される研究は、ＴＮ乳癌を発症する患者が、ｒｓ１０６０９１５ ＳＮＰを含む珍しいハプロタイプをしばしば保有することを明示している。したがって、このＳＮＰの存在は、ｍｉＲ−７がＢＲＣＡ１に結合することを妨げる（図２１）。
【００６４】
ｍｉＲ−７は、乳癌から守ってくれる可能性がある。ｍｉＲＮＡが遺伝子発現を抑制するという概念に対して、メカニズムは直観的に反しているようだが、ｍｉＲ−７結合部位が無傷でありｍｉＲ−７がＢＲＣＡ１に結合する場合に、ＢＲＣＡ１の発現はより高くなり、したがって、ＢＲＣＡ１を含む細胞は、より機能的なタンパク質を含む。エクソン内におけるｍｉＲＮＡ結合は、このような効果を有すると報告されている。ｒｓ１０６０９１５ ＳＮＰがＢＲＣＡ１において存在する場合、ｍｉＲ−７は結合することを阻害され、ＢＲＣＡ１の発現レベルは下がり、そしてその結果として、細胞が有する機能的なタンパク質は少ない。したがって、発現のｒｓ１０６０９１５調節エレメントは、ＢＲＣＡ１遺伝子内に含まれる（図１８ＡからＢ）。
【００６５】
利用可能または機能的なＢＲＣＡ１タンパク質が少なければ、ＤＮＡ合成エラーおよび制御されない増殖から細胞を保護するＤＮＡ修復経路が害される。したがって、癌を発症するリスクが増加する。
【００６６】
【表１】

ｍｉＲ−７は、ＢＲＣＡ１によって抑制されている。
野生型ＢＲＣＡ１または対照ベクターのいずれかでＨＣＣ１９３７細胞をトランスフェクションした後、細胞ｍＲＮＡの発現レベルを分析した。
ＢＲＣＡ１を欠損している細胞において、リストに記載されたｍｉＲＮＡのすべてをより高いレベルで発現させた。
【００６７】
単離された核酸分子
本発明は、１つ以上のＳＮＰを含む単離された核酸分子を提供する。本明細書において開示される１つ以上のＳＮＰを含む単離された核酸分子は、本文を通して相互変換可能に、「ＳＮＰ含有核酸分子」と称してもよい。単離された核酸分子は、場合により全長改変タンパク質またはその断片をコードし得る。本発明の単離された核酸分子はまた、（「ＳＮＰ検出試薬」と題された以下の節により詳細に記載される）プローブおよびプライマーを含み、これらは、開示されたＳＮＰ、および単離された全長遺伝子、転写産物、ｃＤＮＡ分子、ならびにそれらの断片をアッセイするために使用され得、これらは、コードされたタンパク質を発現させる目的で使用され得る。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「単離された核酸分子」は、一般的に、本発明のＳＮＰを含む核酸分子、またはこのような分子（例えば、相補的配列を有する核酸）にハイブリダイズする核酸分子を含み、そして、核酸分子の天然供給源に存在するほとんどの他の核酸から分離される。さらに、「単離された」核酸分子（例えば、本発明のＳＮＰを含むｃＤＮＡ分子）は、他の細胞物質、または組換え技術によって産生される場合、培養培地、または化学合成される場合、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を、実質的に含み得ない。核酸分子は、他のコード配列または調節配列に融合され得、それでもなお、「単離された」と考えられ得る。非ヒトトランスジェニック動物に存在する核酸分子は、動物には、天然には存在しないが、これも「単離された」と考えられる。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、「単離された」と考えられる。「単離された」ＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞内で維持される組換えＤＮＡ分子、および溶液中の（部分的に、または実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子はとしては、本発明の単離されたＳＮＰ含有ＤＮＡ分子のインビボＲＮＡ転写産物またはインビトロＲＮＡ転写産物が挙げられる。本発明に従う単離された核酸分子としては、さらに、合成により生成されたこのような分子が挙げられる。
【００６９】
一般的に、単離されたＳＮＰ含有核酸分子は、本発明によって開示される１つ以上のＳＮＰ位置を含み、それらのＳＮＰ位置の両側の隣接ヌクレオチド配列を有する。隣接配列は、上記ＳＮＰ部位と天然で結合しているヌクレオチド残基および／または非相同ヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、上記隣接配列は、特に上記ＳＮＰ含有核酸分子が、タンパク質またはタンパク質断片を産生するために使用される場合、ＳＮＰ位置の両側の約５００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約８ヌクレオチドまたは約４ヌクレオチド（もしくはこれらの間の任意の他の長さ）、あるいは全長遺伝子、全タンパク質コード配列もしくは非コード配列（または、エクソン、イントロンまたは５’もしくは３’非翻訳領域のようなその任意の一部分）までである。
【００７０】
全長遺伝子および全タンパク質コード配列について、ＳＮＰ隣接配列は、例えば、ＳＮＰの両側の約５ＫＢ、約４ＫＢ、約３ＫＢ、約２ＫＢまたは約１ＫＢまでである。さらに、この場合には、単離された核酸分子は、エクソンの配列を含む（タンパク質をコードするエクソン配列および／または非コードエクソン配列を含む）が、イントロンの配列および非翻訳調節配列も含み得る。したがって、任意のタンパク質コード配列は、隣接しているか、またはイントロンによって分離され得る。重要な点は、核酸が、遠く離れかつ重要ではない隣接配列から単離され、そして適切な長さであり、その結果、特定の処置または組換えタンパク質の発現、ＳＮＰ位置をアッセイするためのプローブおよびプライマーの調製、およびＳＮＰ含有核酸配列特異的な他の用途のような本明細書において所望される用途に供され得る。
【００７１】
単離されたＳＮＰ含有核酸分子は、例えば、ゲノムＤＮＡから単離された遺伝子（例えば、クローニングまたはＰＣＲ増幅による）、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ転写分子のような全長遺伝子または転写産物を含み得る。さらに、本明細書において開示される１つ以上のＳＮＰを含むこのような全長遺伝子および転写産物の断片もまた、本発明に包含される。
【００７２】
したがって、本発明はまた、核酸配列およびその相補体の断片も含む。断片は典型的に、少なくとも約８以上のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０以上のヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約１６以上のヌクレオチチドの隣接したヌクレオチド配列を含む。さらに、断片は、少なくとも約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２１ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、または約５００ヌクレオチド（またはこれらの間のあらゆる他の数）の長さを含み得る。断片の長さは、意図される用途に基づく。このような断片は、ポリヌクレオチドプローブの合成用のヌクレオチド配列（例えば、限定されないが、配列番号１１から１６）を使用して単離され得る。次いで、例えば、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー、またはｍＲＮＡをスクリーニングするのに標識されたプローブを使用して、目的の領域に対応する核酸を単離し得る。さらに、プライマーが、１つ以上のＳＮＰ部位をアッセイする目的で、または遺伝子の特定領域をクローニングするために、増幅反応において使用され得る。
【００７３】
本発明の単離された核酸分子はさらに、核酸サンプル中の目的のポリヌクレオチドのコピー数を増加するために使用される種々の核酸増幅方法のうちの１つの産物である、ＳＮＰ含有ポリヌクレオチドをさらに含む。このような増幅方法は、当該分野において周知であり、そしてこれらとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号；および米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，１９９２）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ およびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０，１９８９；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７，１９８８）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（米国特許第５，２７０，１８４号；および米国特許第５，４２２，２５２号）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）（米国特許出願第５，３９９，４９１号）、連鎖直線増幅（ｌｉｎｋｅｄ ｌｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＬＡ）（米国特許第６，０２７，９２３号）など、ならびに等温増幅方法、例えば、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）ならびに自己維持配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４，１９９０）が挙げられるがこれらに限定されない。このような方法論に基づいて、当業者は、本明細書において開示されるＳＮＰの５’側および３’側の任意の適切な領域にプライマーを容易に設計し得る。このようなプライマーは、その配列中に目的のＳＮＰを含む限り任意の長さのＤＮＡを増幅するために使用され得る。
【００７４】
本明細書において使用される場合、本発明の「増幅された核酸分子」は、ＳＮＰ含有核酸分子であり、その量は、試験サンプル中のその開始量と比較した場合、インビトロで実施された任意の核酸増幅方法によって少なくとも２倍に増加している。他の好ましい実施形態では、増幅された核酸分子は、試験サンプル中のその開始量と比較した場合、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、１，０００倍、またはさらに１０，０００倍の増加の結果である。典型的なＰＣＲ増幅において、目的のポリヌクレオチドは、増幅していないゲノムＤＮＡの少なくとも５０，０００倍の量を上回ってしばしば増幅されるが、アッセイのために必要とされる増幅の正確な量は、その後使用される検出方法の感度に依存する。
【００７５】
一般的に、増幅されたポリヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチドの長さである。より典型的には、増幅されたポリヌクレオチドは、少なくとも約１６ヌクレオチドの長さである。本発明の好ましい実施形態では、増幅されたポリヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチドの長さである。本発明のより好ましい実施形態では、増幅されたポリヌクレオチドは、少なくとも約２１ヌクレオチド，約２２ヌクレオチド，約２３ヌクレオチド，約２４ヌクレオチド，約２５ヌクレオチド，約３０ヌクレオチド，３５ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、または約６０ヌクレオチドの長さである。本発明のさらに別の好ましい実施形態では、増幅されたポリヌクレオチドは、少なくとも約１００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチドまたは約３００ヌクレオチドの長さである。本発明の増幅されたポリヌクレオチドの全長は、目的のＳＮＰが存在するエクソン、イントロン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたは遺伝子全体程度の長さであり得るが、増幅産物は、典型的には約１，０００ヌクレオチド以下の長さである（しかし、特定の増幅方法は、１０００ヌクレオチドの長さよりも長い増幅産物を生じ得る）。より好ましくは、増幅されたポリヌクレオチドは、約６００ヌクレオチド以下の長さである。増幅されたポリヌクレオチドの長さに関わらず、目的のＳＮＰは、その配列に沿って至る所に位置し得ることが理解される。
【００７６】
このような産物は、その５’末端もしくは３’末端またはその両方に付加的な配列を有し得る。別の実施形態では、増幅産物は、約１０１ヌクレオチドの長さであり、そして本明細書において開示されるＳＮＰを含む。好ましくは、そのＳＮＰは、増幅産物の中央に位置する（例えば、２０１ヌクレオチドの長さである増幅産物において１０１位、または１０１ヌクレオチドの長さである増幅産物において５１位）か、または増幅産物の中央から１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、もしくは２０ヌクレオチド以内に位置する（しかし、上に示したように、目的のＳＮＰは、増幅産物の長さに沿って至る所に位置し得る）。
【００７７】
本発明は、本明細書において開示される１つ以上のＳＮＰ、その相補体およびそのＳＮＰ含有断片を含む、１つ以上のポリヌクレオチド配列を含むか、このポリヌクレオチドからなるか、またはこのポリヌクレオチドから本質的に構成される単離された核酸分子を提供する。
【００７８】
ヌクレオチド配列がこの核酸分子の全長ヌクレオチド配列である場合、核酸分子は、そのヌクレオチド配列からなる。
【００７９】
核酸分子は、そのヌクレオチド配列が、最終の核酸分子において少数の付加的なヌクレオチド残基しか伴わずに存在する場合、そのようなヌクレオチド配列から本質的になる。
【００８０】
ヌクレオチド配列がその核酸分子の最終のヌクレオチド配列の少なくとも一部である場合、核酸分子は、そのヌクレオチド配列を含む。このような様式において、その核酸分子は、ヌクレオチド配列のみであっても、付加的なヌクレオチド残基（例えば、天然にそれに関係する残基）を有しても、異種ヌクレオチド配列を有してもよい。このような核酸分子は、１個から少数の付加的なヌクレオチドを有しても、さらに多くの付加的なヌクレオチドを含んでもよい。種々の型のこれら核酸分子がどのようにして容易に作製され得、そして単離され得るのかの簡単な説明を、以下に提供する。そしてこのような技術は、当業者にとって周知である（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。
【００８１】
単離された核酸分子としては、ペプチドのみをコードする配列を有する核酸分子、成熟ペプチドをコードする配列およびさらなるコード配列（例えば、リーダー配列または分泌配列（例えば、プレ−プロタンパク質配列またはプロタンパク質配列））を有する核酸分子、付加的なコード配列を有する成熟ペプチドをコードする配列または付加的なコード配列を有さない成熟ペプチドをコードする配列に加えて、付加的な非コード配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセッシング（スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合、および／または、ｍＲＮＡの安定性において一定の役割を果たす、転写されるが翻訳されない配列のような、例えば、イントロンおよび非コード５’配列および非コード３’配列）、が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、核酸分子は、例えば、精製を容易にするペプチドをコードする異種マーカー配列へ融合され得る。
【００８２】
単離された核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態、またはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ形態であり得、例えば、分子クローニングによって得られ得るかまたは化学合成技術による産生またはその組み合わせにより産生され得る（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。さらに、単離された核酸分子（特にプローブおよびプライマーのようなＳＮＰ検出試薬）はまた、部分的または全体的に、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のような１つ以上の型の核酸アナログ形態（米国特許第５，５３９，０８２号；米国特許第５，５２７，６７５号；米国特許第５，６２３，０４９号；米国特許第５，７１４，３３１号）であり得る。核酸、特にＤＮＡは、二本鎖であってもまたは一本鎖であってもよい。一本鎖核酸は、コード鎖（センス鎖）または相補的非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。ＤＮＡセグメント、ＲＮＡセグメント、またはＰＮＡセグメントは、例えば、ヒトゲノムの断片（ＤＮＡまたはＲＮＡの場合）、または単一のヌクレオチド、短いオリゴヌクレオチドリンカーから、あるいは一連のオリゴヌクレオチドから構築され、合成核酸分子を提供し得る。核酸分子は、参考として本明細書において提供される配列を使用して容易に合成され得、オリゴヌクレオチドおよびＰＮＡオリゴマーの合成技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｃｏｒｅｙ，“Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｃｏｐｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７ Ｊｕｎｅ；１５（６）：２２４−９，およびＨｙｒｕｐら、“Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１９９６ Ｊａｎｕａｒｙ；４（１）：５−２３参照）。さらに、大規模な自動化オリゴヌクレオチド／ＰＮＡ合成（アレイまたはビーズ表面または他の固体支持体上での合成を含む）が、市販の核酸合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）３９００ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＤＮＡ ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒまたはＥｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）、および本明細書において提供される配列情報を使用して容易に達成され得る。
【００８３】
本発明は、当該分野で公知の改変されたヌクレオチド、合成ヌクレオチド、もしくは天然に生じないヌクレオチド、または改変された構造エレメント、合成の構造エレメント、もしくは天然に生じない構造エレメント、または他の代替的な／改変された核酸化学を含む、核酸アナログを含む。このような核酸アナログは、例えば、配列番号２１、２６および２７において同定される１つ以上のＳＮＰを検出するための検出試薬（例えば、プライマー／プローブ）として有用である。さらに、これらアナログを含むキット／システム（例えば、ビーズ、アレイなど）もまた、本発明に含まれる。例えば、具体的には、本発明の多型配列に基づくＰＮＡオリゴマーが企図される。ＰＮＡオリゴマーは、ＤＮＡのアナログであり、そのリン酸骨格は、ペプチド様骨格で置換されている（Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：１０８１−１０８２（１９９４），Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：７９３−７９６（１９９６），Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３（９）：１２６９−１２７２（２００１），ＷＯ９６／０４０００）。ＰＮＡは、従来のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログよりも、高い親和性および特異性で、相補的なＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズする。このＰＮＡの特性は、従来のオリゴヌクレオチドおよびペプチドを用いては達成し得ない新規な分子生物学および生化学の用途を可能とする。
【００８４】
核酸の結合特性および／または安定性を改善する核酸改変のさらなる例は、イノシンのような塩基アナログ、インターカレーター（米国特許第４，８３５，２６３号）および副溝の結合体（米国特許第５，８０１，１１５号）の使用を含む。したがって、核酸分子、ＳＮＰ含有核酸分子、ＳＮＰ検出試薬（例えば、プローブおよびプライマー）、オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドに対する本明細書における言及は、ＰＮＡオリゴマーおよび他の核酸アナログを含む。当該分野で公知の核酸アナログおよび選択的核酸化学／改変核酸化学の他の例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（２００２）に記載される。
【００８５】
さらに、天然に存在する対立遺伝子変異型（ならびにオルソログおよびパラログ）ならびに変異誘発技術によって産生される合成変異体のような、核酸分子の変異体（例えば、限定されないが、配列番号１１から１６として同定されたもの）は、当該分野において周知の方法を使用して同定および／または産生され得る。さらにこのような変異体は、配列番号１１から１６として開示される核酸配列（またはその断片）と少なくとも、７０％から８０％、８０％から８５％、８５％から９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を共有し、かつ新規ＳＮＰ対立遺伝子を含む、ヌクレオチド配列を含み得る。したがって、本発明は、配列番号１１から１６の配列と比較した場合ある程度の配列変異を有するが、新規ＳＮＰ対立遺伝子を含む、単離された核酸分子を具体的に企図する。
【００８６】
２つの配列間の配列の比較および同一性のパーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ギャップウェート（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）１６、１４、１２、１０、８、６または４、長さウェート（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５または６）を使用して、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））を用いて決定され、これは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムへ組み込まれている。
【００８７】
さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびにギャップウェート（４０、５０、６０、７０、または８０）および長さウェート（１、２、３、４、５、または６）を使用してＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））を用いて決定される。別の実施形態では、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の間の同一性のパーセントは、ＰＡＭ１２０ウェート残基表、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へ組み込まれているＥ．ＭｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））を使用して決定される。
【００８８】
本発明のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、さらに「照会配列」として使用され、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、配列データベースに対して検索を実施し得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施し得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２）を用いて実施し、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることが可能である。ＢＬＡＳＴのタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて実施し、本発明のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることが可能である。比較目的のためにギャップを入れたアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７））に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用した場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが、使用され得る。ＢＬＡＳＴに加えて、当該分野で使用される他の検索プログラムおよび配列比較プログラムの例としては、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，３６５−３８９（１９９４））およびＫＥＲＲ（Ｄｕｆｒｅｓｎｅら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；２０（１２）：１２６９−７１）が挙げられるが、これらに限定されない。生命情報科学技術に関するさらなる情報については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．参照。
【００８９】
ＳＮＰ検出試薬
本発明の具体的な形態では、本明細書において開示される配列は、ＳＮＰ検出試薬の設計のために使用され得る。好ましい実施形態では、配列番号１１から１６の配列が、ＳＮＰ検出試薬の設計のために使用される。本明細書において使用される場合、「ＳＮＰ検出試薬」は、本明細書において開示される特定の標的ＳＮＰ位置を特異的に検出し、好ましくは、標的ＳＮＰ位置の特定のヌクレオチド（対立遺伝子）に対して特異的である（すなわち、検出試薬は、好ましくは、標的ＳＮＰ位置にある異なる選択的ヌクレオチドを区別し得、これによって標的ＳＮＰ位置に存在するヌクレオチドの正体を決定することを可能とする）。典型的に、このような検出試薬は、標的ＳＮＰ含有核酸分子に対して配列特異的な様式の相補的な塩基対合によってハイブリダイズし、試験サンプル中において当該分野で公知の形態のような他の核酸配列から標的変異体の配列を区別する。好ましい実施形態では、このようなプローブは、同一の標的ＳＮＰ位置において異なるヌクレオチドを有する他の核酸から標的ＳＮＰ位置で特定のヌクレオチド（対立遺伝子）を有する核酸を区別し得る。さらに、検出試薬は、ＳＮＰ位置に対して５’側および／または３’側にある特定の領域、特に３’ＵＴＲに対応する領域にハイブリダイズし得る。検出試薬の別の例は、標的ポリヌクレオチドの相補鎖に沿うヌクレオチドの伸長の開始点として作用するプライマーである。本明細書において提供されるＳＮＰ配列の情報はまた、本発明の任意のＳＮＰを（例えば、ＰＣＲを使用して）増幅するためのプライマー（例えば、対立遺伝子特異的プライマー）を設計するためにも有用である。
【００９０】
本発明の好ましい一実施形態では、ＳＮＰ検出試薬は、単離もしくは合成されたＤＮＡまたはＲＮＡのポリヌクレオチドプローブ、またはプライマー、またはＰＮＡオリゴマー、またはＤＮＡ、ＲＮＡおよび／もしくはＰＮＡの組み合わせであり、ＬＣＳ内に位置するＳＮＰを含む標的核酸分子のセグメントに対してハイブリダイズする。ポリヌクレオチドの形態の検出試薬は場合により、改変塩基アナログ、インターカレート剤、または副溝の結合体を含み得る。プローブのような複数の検出試薬は、ＳＮＰ検出キットを形成するために、例えば、固体支持体（例えば、アレイもしくはビーズ）に付着させられるか、または溶液中にて供給され得る（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎアッセイ、もしくはプライマー伸長反応のような酵素反応のためのプローブ／プライマーセット）。
【００９１】
プローブまたはプライマーは、典型的には、精製されたオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーである。このようなオリゴヌクレオチドは、典型的に、ストリンジェントな条件下で、標的核酸分子における少なくとも約８個、約１０個、約１２個、約１６個、約１８個、約２０個、約２１個、約２２個、約２５個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約１００個（またはこれらの間のあらゆる他の数）のまたはこれ以上の連続するヌクレオチドに対してハイブリダイズする、相補的なヌクレオチド配列の領域を含む。特定のアッセイに依存して、その連続するヌクレオチドは、標的ＳＮＰ位置を含み得るか、あるいは所望されるアッセイを実施するためにＳＮＰ位置に十分に近い、５’側および／または３’側の特定の領域であり得るかのいずれかである。
【００９２】
このようなプライマーおよびプローブが、本発明のＳＮＰの遺伝子型決定のための試薬として直接的に有用であり、任意のキット／システム形態へ組込まれ得ることは、当業者に明らかになるであろう。
【００９３】
標的ＳＮＰ含有配列に特異的なプローブまたはプライマーを作製するために、目的のＳＮＰ周辺の遺伝子配列／転写産物配列および／またはコンテキスト配列が典型的には、そのヌクレオチド配列の５’末端または３’末端において開始する、コンピュータアルゴリズムを使用して調べられる。次いで典型的なアルゴリズムは、その遺伝子配列／ＳＮＰコンテキスト配列に特有である、規定された長さのオリゴマーを同定し、このオリゴマーは、ハイブリダイゼーションのために適切な範囲内のＧＣ含量を有し、ハイブリダイゼーションを妨げ得る推定二次構造を有さず、そして／または所望される他の特性を保有するか、あるいは、所望されない他の特質を欠く。
【００９４】
本発明のプライマーまたはプローブは、典型的には、少なくとも約８ヌクレオチドの長さである。本発明の一実施形態では、プライマーまたはプローブは、少なくとも約１０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態では、プライマーまたはプローブは、少なくとも約１２ヌクレオチドの長さである。より好ましい実施形態では、プライマーまたはプローブは、少なくとも約１６ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２１ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２３ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、または少なくとも約２５ヌクレオチドの長さである。プローブの最大長は、そのプローブが使用されるアッセイの型に依存して、検出される標的配列と同じ程度までの長さであり得るが、典型的には、約５０ヌクレオチド未満、約６０ヌクレオチド未満、約６５ヌクレオチド未満、または約７０ヌクレオチド未満の長さである。プライマーの場合には、その最大長は、典型的には、約３０ヌクレオチド未満の長さである。本発明の具体的な好ましい実施形態では、プライマーまたはプローブは、約１８ヌクレオチドから約２８ヌクレオチドの長さの範囲内にある。しかし、他の実施形態（例えば、核酸アレイ、およびプローブが基材に付着する他の実施形態）において、上記プローブは、より長い（例えば、３０から７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド以上の長さ）ものであり得る（以下の「ＳＮＰ検出キットおよびシステム」と題する節参照）。
【００９５】
ＳＮＰを解析するために、選択的ＳＮＰ対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを使用することが、適切であり得る。標的配列における単一ヌクレオチド変化を検出するそのようなオリゴヌクレオチドは、「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」、「対立遺伝子特異的プローブ」または「対立遺伝子特異的プライマー」のような用語によって呼ばれ得る。多型を解析するための対立遺伝子特異的プローブの設計および使用は、例えば、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄ．Ｃｏｔｔｏｎら、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３２４，１６３−１６６（１９８６）；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ，ＥＰ２３５，７２６；およびＳａｉｋｉ，ＷＯ８９／１１５４８に記載される。
【００９６】
各々の対立遺伝子特異的プライマーまたは対立遺伝子特異的プローブの設計は、変数（例えば、標的核酸分子中のＳＮＰ位置に隣接するヌクレオチド配列の正確な組成、ならびにそのプライマーまたはプローブの長さ）に依存するが、プライマーおよびプローブの使用における別の要因は、そのプローブまたはプライマーと、標的配列との間のハイブリダイゼーションが実施される条件のストリンジェンシーである。より高いストリンジェンシー条件は、より低いイオン強度および／またはより高い反応温度の緩衝液を利用し、そして安定な二重鎖を形成するためには、プローブ／プライマーと標的配列との間のより完全な一致を必要とする傾向がある。しかし、そのストリンジェンシーが高すぎる場合、ハイブリダイゼーションは、全く生じない場合がある。対照的に、より低いストリンジェンシー条件は、より高いイオン強度および／またはより低い反応温度の緩衝液を利用し、そしてプローブ／プライマーと標的配列との間のよりミスマッチした塩基による安定な二重鎖の形成を可能にする。例としてであって限定としてではないが、対立遺伝子特異的プローブを使用する高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件についての例示的な条件は、以下の通りである：５倍標準的生理食塩水リン酸ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）、０．５％ＮａＤｏｄＳＯ．ｓｕｂ．４（ＳＤＳ）を含む溶液を用いる５５℃でのプレハイブリダイゼーション；同じ溶液中にある標的核酸分子とともに同じ温度でプローブをインキュベートすること、その後、２倍ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液を用いて５５℃または室温で洗浄すること。
【００９７】
中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が、例えば、約５０ｍＭ ＫＣｌを含む溶液を用いて、約４６℃にて、対立遺伝子特異的プライマー伸長反応のために使用され得る。あるいは、上記反応は、高温（例えば、６０℃）にて実行され得る。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）反応（この反応において、２つのプローブが標的配列と完全に相補的な場合に、これら２つのプローブが連結される）のために適切な中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約１００ｍＭ ＫＣｌの溶液を、温度４６℃にて利用し得る。
【００９８】
ハイブリダイゼーションベースのアッセイにおいて、ある個体由来の標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、別の個体由来の対応するセグメントには、その２つの個体由来の個々のＤＮＡセグメントにおける異なる多型形態（例えば、選択的ＳＮＰ対立遺伝子／ヌクレオチド）の存在に起因してハイブリダイズしない、対立遺伝子特異的プローブが、設計され得る。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度における検出可能な有意な差異が存在し、好ましくは、本質的には二元の応答が存在し、それによって、プローブが対立遺伝子のうちの一方のみにハイブリダイズするかまたは一方の対立遺伝子に対して有意により強くハイブリダイズするのに充分に、ストリンジェントであるべきである。プローブは、ＳＮＰ部位を含む標的配列にハイブリダイズしてそのＳＮＰ部位がそのプローブの配列に沿ったどこかに整列するように設計され得るが、そのプローブは、好ましくは、標的配列のセグメントにハイブリダイズして、そのＳＮＰ部位が、そのプローブの中心位置（例えば、そのプローブのいずれかの末端から少なくとも３ヌクレオチド離れているそのプローブ内の位置）と整列するように設計される。このプローブ設計は、一般的には、異なる対立遺伝子形態間でのハイブリダイゼーションにおける良好な識別を達成する。
【００９９】
別の実施形態では、プローブまたはプライマーは、標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズして、そのＳＮＰがそのプローブまたはプライマーの最も５’側の末端または最も３’側の末端のいずれかと整列するように、設計され得る。オリゴヌクレオチド連結アッセイ（米国特許第４，９８８，６１７号）における使用のために特に適切な具体的な好ましい実施形態では、上記プローブの最も３’側のヌクレオチドは、その標的配列中のＳＮＰ位置と整列する。
【０１００】
オリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーは、当該分野で周知の方法によって調製され得る。化学合成方法としては、Ｎａｒａｎｇら、１９７９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：９０により記載されるホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら、１９７９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：１０９により記載されるホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９により記載されるジエチルホスホアミデート法；および米国特許第４，４５８，０６６号に記載される固体支持体法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
対立遺伝子特異的プローブは、しばしば、対の状態で（または、より一般的ではないが、３個または４個の組の状態で（例えば、ＳＮＰ位置がそれぞれ３個または４個の対立遺伝子を有することが公知である場合、あるいは、標的ＳＮＰ対立遺伝子の核酸分子の両方の鎖をアッセイするために））使用され、そのような対は、そのＳＮＰ位置で対立遺伝子変異型を示す１ヌクレオチドミスマッチ以外は同一であり得る。
一般的に、１つの対のうちの一方のメンバーは、より一般的なＳＮＰ対立遺伝子（すなわち、標的集団中においてより頻繁である対立遺伝子）を有する標的配列参照形態と完全に一致し、その対のうちのもう一方のメンバーは、より一般的ではないＳＮＰ対立遺伝子（すなわち、その標的集団において稀な対立遺伝子）を有する標的配列形態と完全に一致する。アレイの場合には、複数のプローブ対が、複数の異なる多型を同時に解析するために同じ支持体上に固定され得る。
【０１０２】
ある型のＰＣＲベースのアッセイにおいて、対立遺伝子特異的プライマーは、ＳＮＰ位置と重複し、そのプライマーが完全相補性を示す対立遺伝子形態の増幅のみをプライミングする、標的核酸分子上の領域にハイブリダイズする（Ｇｉｂｂｓ，１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７ ２４２７−２４４８）。典型的には、それらのプライマーの最も３’側のヌクレオチドは、その標的核酸分子のＳＮＰ位置と整列し、かつそのＳＮＰ位置と相補的である。このプライマーは、遠位部位にてハイブリダイズする第２のプライマーと整列の結合に使用される。増幅は、これらの２つのプライマーから進行し、どの対立遺伝子形態が試験サンプル中に存在するかを示す検出可能な産物を生じる。コントロールが、通常、第２のプライマー対を用いて実施される。この第２のプライマー対のうちの一方は、その多型部位で一塩基ミスマッチを示し、この第２のプライマー対のうちのもう一方は、遠位部位に対して完全相補性を示す。この一塩基ミスマッチは、増幅を防止するかまたは増幅効率を実質的に減少させ、その結果、検出可能な産物が形成されないか、または検出可能な産物がより低量もしくはより低速度で形成される。上記の方法は、一般的には、そのミスマッチがそのオリゴヌクレオチドの最も３’側の位置にある（すなわち、そのオリゴヌクレオチドの最も３’側の位置が、標的ＳＮＰ位置と整列する）場合に、最も効率的に作用する。なぜなら、この位置は、上記プライマーからの伸長に対して最も不安定であるからである（例えば、ＷＯ９３／２２４５６参照）。このＰＣＲベースのアッセイは、下記のＴａｑＭａｎアッセイの一部として利用され得る。
【０１０３】
本発明の具体的実施形態では、本発明のプライマーは、標的ＳＮＰを含む核酸分子のセグメントに対して実質的に相補的な配列を含み、但し、そのプライマーは、そのプライマーの最も３’側の末端にある３つのヌクレオチド位置のうちの１つにおいてミスマッチヌクレオチドを有し、その結果、そのミスマッチヌクレオチドは、そのＳＮＰ部位において特定の対立遺伝子と塩基対形成しない。好ましい実施形態では、上記プライマー中のミスマッチヌクレオチドは、そのプライマーの最も３’側の位置にある最後のヌクレオチドから２番目にある。より好ましい実施形態では、上記プライマー中のミスマッチヌクレオチドは、そのプライマーの最も３’側の位置にある最後のヌクレオチドである。
【０１０４】
本発明の別の実施形態では、本発明のＳＮＰ検出試薬は、検出可能なシグナルを発する蛍光発生レポーター色素で標識される。好ましいレポーター色素は、蛍光色素であるが、検出試薬（例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマー）に結合され得る任意のレポーター色素が、本発明における使用のために適切である。そのような色素としては、アクリジン、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ、カスケードブルー、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ダブシル、エダンス、エオシン、エリスロシン、フルオレセイン、６−Ｆａｍ、Ｔｅｔ、Ｊｏｅ、Ｈｅｘ、オレゴングリーン、ローダミン、Ｒｈｏｄｏｌ Ｇｒｅｅｎ、Ｔａｍｒａ、Ｒｏｘ、およびテキサスレッドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
本発明のなお別の実施形態では、その検出試薬は、特に、その試薬が自己クエンチングプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ）（米国特許第５，２１０，０１５号および米国特許第５，５３８，８４８号）または分子ビーコンプローブ（米国特許第５，１１８，８０１号および米国特許第５，３１２，７２８号）または他のステムレスプローブもしくは直鎖状ビーコンプローブ（Ｌｉｖａｋら、１９９５，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌ．４：３５７−３６２；Ｔｙａｇｉら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８；Ｎａｚａｒｅｎｋｏら、１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５１６−２５２１；米国特許第５，８６６，３３６号および米国特許第６，１１７，６３５号）として使用される場合に、クエンチャー色素（例えば、Ｔａｍｒａ）でさらに標識され得る。
【０１０６】
本発明の検出試薬はまた、他の標識（ストレプトアビジン結合のためのビオチン、抗体結合のためのハプテン、および別の相補的オリゴヌクレオチド（例えば、ジップコードの対）に結合するためのオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。
【０１０７】
本発明はまた、本明細書において同定されたＳＮＰヌクレオチドを含まない（またはそのＳＮＰヌクレオチドと相補的である）が、本明細書において開示される１つ以上のＳＮＰをアッセイするために使用される、試薬も企図する。例えば、本明細書において提供される標的ＳＮＰ位置に隣接はするが直接的にはハイブリダイズしないプライマーが、それらのプライマーが、その標的ＳＮＰ位置と近接する（すなわち、その標的ＳＮＰ部位から１ヌクレオチド以上の範囲内にある）領域にハイブリダイズするプライマー伸長反応において、有用である。そのプライマー伸長反応の間に、プライマーは、典型的には、特定のヌクレオチド（対立遺伝子）が標的ＳＮＰ部位に存在する場合にはその標的ＳＮＰ部位を過ぎては伸長できず、そのプライマー伸長産物は、どのＳＮＰ対立遺伝子がその標的ＳＮＰ部位に存在するかを決定するために容易に検出され得る。例えば、特定のｄｄＮＴＰが、一旦ｄｄＮＴＰが上記伸長産物（その最も３’側の末端にｄｄＮＴＰを含み、そのｄｄＮＴＰが本明細書において開示されるＳＮＰに対応する、プライマー伸長産物は、本発明により包含される組成物である）に組み込まれるとプライマー伸長を終結させるために、上記プライマー伸長反応において使用される。したがって、ＳＮＰ部位に近接する領域中の核酸分子に結合する試薬は、結合した配列はそのＳＮＰ部位自体を必ずしも含まないけれども、これもまた本発明によって包含される。
【０１０８】
ＳＮＰ検出キットおよびＳＮＰ検出システム
当業者は、本明細書において開示されるＳＮＰおよび関連する配列情報に基づいて、検出試薬が、本発明の任意のＳＮＰを個別にかまたは組み合わせてアッセイするために開発および使用され得、そのような検出試薬は、当該分野で周知である確立されたキット形態またはシステム形態のうちの１つに容易に組み込まれ得ることを、認識するであろう。用語「キット」および「システム」とは、本明細書においてＳＮＰ検出試薬の文脈で使用される場合、複数のＳＮＰ検出試薬の組み合わせ、または１つ以上の他の型のエレメントまたは構成要素（例えば、他の型の生化学試薬、容器、パッケージ（例えば、市販用に意図されるパッケージング）、ＳＮＰ検出試薬が結合している基材、電子ハードウェア構成要素など）と組み合わせた１種以上のＳＮＰ検出試薬のようなものを指す。したがって、本発明は、ＳＮＰ検出キットおよびＳＮＰ検出システム（パッケージされたプローブとプライマーとの組（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ／プライマーの組）、核酸分子のアレイ／マイクロアレイ、および本発明の１種以上のＳＮＰを検出するための１種以上のプローブ、プライマー、または他の検出試薬を含むビーズが挙げられるが、これらに限定されない）をさらに提供する。上記キット／システムは、種々の電子ハードウェア構成要素を場合により含み得る。例えば、種々の製造業者により提供されるアレイ（「ＤＮＡチップ」）および微小流体システム（「ラボ・オン・ア・チップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」システム）は、典型的には、ハードウェア構成要素を含む。上記キット／システム（例えば、プローブ／プライマーの組）は、電子ハードウェア構成要素を含まないかもしれないが、例えば、１つ以上の容器中にパッケージングされた１種以上のＳＮＰ検出試薬を（場合により、他の生化学試薬とともに）含み得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ＳＮＰ検出キットは、典型的には、１種以上の検出試薬と、アッセイまたは反応（例えば、ＳＮＰ含有核酸分子の増幅および／または検出）を実行するための必要な他の構成要素（例えば、緩衝液、酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼもしくはリガーゼ）、鎖伸長ヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオチド三リン酸）、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応の場合には鎖終結ヌクレオチド、ポジティブコントロール配列、ネガティブコントロール配列など）を含む。キットは、標的核酸の量を決定するための手段、およびその量を標準物と比較するための手段をさらに含み得る。キットは、そのキットを使用して目的のＳＮＰ含有核酸分子を検出するための指示書を含み得る。本発明の一実施形態では、１種以上のアッセイを実行して本明細書において開示される１種以上のＳＮＰを検出するための必要試薬を含むキットが、提供される。本発明の好ましい実施形態では、ＳＮＰ検出キット／システムは、核酸アレイの形態、または区画分けされたキット（微小流体システム／ラボ・オン・ア・チップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）システムを含む）の形態である。
【０１１０】
ＳＮＰ検出キット／システムは、例えば、各標的ＳＮＰ位置またはその付近にある核酸分子にハイブリダイズする１つ以上のプローブまたはプローブ対を含み得る。複数の対立遺伝子特異的プローブ対が、多数のＳＮＰを同時にアッセイするためにこのキット／システム中に含まれ得る。上記多数のＳＮＰのうちの少なくとも１つは、本発明のＳＮＰである。いくつかのキット／システムにおいて、上記対立遺伝子特異的プローブは、基材（例えば、アレイまたはビーズ）に固定される。
【０１１１】
用語「アレイ」、「マイクロアレイ」、および「ＤＮＡチップ」とは、基材（例えば、ガラス、プラスチック、紙、ナイロン、または他の型の膜、フィルター、チップ、もしくは他の適切な固体支持体）に付着された、別個のポリヌクレオチド群を指すために本明細書において互換可能に使用される。上記ポリヌクレオチドは、上記基材上で直接合成され得るか、または上記基材とは別個に合成された後で上記基材に付着され得る。一実施形態では、上記マイクロアレイは、米国特許第５，８３７，８３２号、Ｃｈｅｅら、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１１９９５（Ｃｈｅｅら），Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊら、（１９９６；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５−１６８０）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．ら、（１９９６；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０６１４−１０６１９（これらすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法にしたがって、調製されそして使用される。他の実施形態では、このようなアレイは、Ｂｒｏｗｎら、米国特許第５，８０７，５２２号により記載される方法により生成される。
【０１１２】
核酸アレイは、以下の参考文献中に概説されている：Ｚａｍｍａｔｔｅｏら、“Ｎｅｗ ｃｈｉｐｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．２００２；８：８５−１０１；Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら、“Ａｃｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；１２（４）：１８１−９２；Ｈｅｌｌｅｒ，“ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｄｅｖｉｃｅｓ，ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ．２００２；４：１２９−５３．Ｅｐｕｂ ２００２ Ｍａｒ．２２；Ｋｏｌｃｈｉｎｓｋｙら、“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳＮＰｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｇｅｌ−ｂａｓｅｄ ｃｈｉｐｓ”，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２００２ Ａｐｒｉｌ；１９（４）：３４３−６０；およびＭｃＧａｌｌら、“Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｅｎｅｃｈｉｐ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅ ａｒｒａｙｓ”，Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；７７：２１−４２。
【０１１３】
多数のプローブ（例えば、対立遺伝子特異的プローブ）が、アレイにおいて実施され得、各プローブまたはプローブ対は、異なるＳＮＰ位置にハイブリダイズし得る。ポリヌクレオチドプローブの場合、これらのプローブは、光指向性化学プロセスを使用して、基材上の指定領域で合成され得る（かまたは、別個に合成され得、その後、指定領域に付着され得る）。各ＤＮＡチップは、格子様パターンで整列され（例えば、１０セント銀貨の大きさまで）小型化された、例えば、数千から数億個の個々の合成ポリヌクレオチドプローブを含み得る。好ましくは、プローブは、順序立ったアドレス指定可能なアレイ状に固体支持体に付着される。
【０１１４】
マイクロアレイは、固体支持体に付着した多数の独特の一本鎖ポリヌクレオチド（通常は、合成アンチセンスポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡ断片のいずれか）から構成され得る。典型的なポリヌクレオチドは、好ましくは、約６ヌクレオチドから６０ヌクレオチド、より好ましくは約１５ヌクレオチドから３０ヌクレオチド、最も好ましくは約１８ヌクレオチドから２５ヌクレオチドの長さである。特定の型のマイクロアレイまたは他の検出キット／システムについて、ほんの約７ヌクレオチドから２０ヌクレオチドの長さであるオリゴヌクレオチドを使用することが、好ましくあり得る。他の型のアレイ（例えば、化学発光検出技術と組み合わせて使用されるアレイ）において、好ましいプローブの長さは、例えば、約１５ヌクレオチドから８０ヌクレオチドの長さ、好ましくは約５０ヌクレオチドから７０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約５５ヌクレオチドから６５ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約６０ヌクレオチドの長さであり得る。このマイクロアレイまたは検出キットは、遺伝子／転写産物または標的ＳＮＰ部位の既知の５’配列または３’配列を網羅するポリヌクレオチド；遺伝子／転写産物の全長配列を網羅する連続するポリヌクレオチド；または標的遺伝子／転写産物配列の長さに沿った特定の領域（特に、１つ以上のＳＮＰに対応する領域）から選択される独特のポリヌクレオチドを含み得る。上記マイクロアレイまたは検出キットにおいて使用されるポリヌクレオチドは、目的のＳＮＰに対して特異的（例えば、標的ＳＮＰ部位の特定のＳＮＰ対立遺伝子に対して特異的、または複数の異なるＳＮＰ部位にある特定のＳＮＰ対立遺伝子に対して特異的）であり得るか、あるいは目的の多型遺伝子／転写産物に対して特異的であり得る。
【０１１５】
ポリヌクレオチドアレイに基づくハイブリダイゼーションアッセイは、完全に一致する標的配列変異体およびミスマッチ標的配列変異体に対する、上記プローブのハイブリダイゼーション安定性の差異に依存する。ＳＮＰ遺伝子型決定のために、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用されるストリンジェンシー条件は、１ＳＮＰ位置程度にしか互いと異ならない核酸分子が区別され得るのに充分に高いことが、一般的には好ましい（例えば、典型的ＳＮＰハイブリダイゼーションアッセイが、１つの特定のヌクレオチドがＳＮＰ位置に存在する場合にかぎりハイブリダイゼーションが生じるが、代替的ヌクレオチドがそのＳＮＰ位置に存在する場合にはハイブリダイゼーションは生じないように、設計される）。そのような高いストリンジェンシーの条件は、例えば、ＳＮＰ検出のために対立遺伝子特異的プローブの核酸アレイを使用する場合に、好ましくあり得る。そのような高いストリンジェンシーの条件は、先の節において記載されており、当業者にとって周知であり、そして例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６において見出され得る。
【０１１６】
他の実施形態では、上記アレイは、化学発光検出技術と組み合わせて使用される。以下の特許および特許出願（これらはすべて、本明細書により参考として援用される）は、化学発光検出に関するさらなる情報を提供する：米国特許出願１０／６２０３３２および同１０／６２０３３３は、マイクロアレイ検出のための化学発光アプローチを記載し、米国特許第６１２４４７８号、米国特許第６１０７０２４号、米国特許第５９９４０７３号、米国特許第５９８１７６８号、米国特許第５８７１９３８号、米国特許第５８４３６８１号、米国特許第５８００９９９号、および米国特許第５７７３６２８号は、化学発光検出を実施するためのジオキセタンの方法および組成物を記載し；公開された米国出願ＵＳ２００２／０１１０８２８は、マイクロアレイコントロールのための方法および組成物を開示する。
【０１１７】
本発明の一実施形態では、核酸アレイは、約１５ヌクレオチドから２５ヌクレオチドの長さのプローブのアレイを含み得る。さらなる実施形態では、核酸アレイは、多数のプローブを含み得、ここで、少なくとも１つのプローブは、ＳＮＰを検出可能であり、かつ／または少なくとも１つのプローブは、配列表に開示される配列、それらに相補的な配列、および、少なくとも約８個連続するヌクレオチド、好ましくは、１０個、１２個、１５個、１６個、１８個、２０個、より好ましくは２２個、２５個、３０個、４０個、４７個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、８０個、９０個、１００個またはそれ以上の連続するヌクレオチド（またはこれらの間のあらゆる他の数）を含み、かつ新規なＳＮＰ対立遺伝子を含むそれらの断片からなる群より選択される配列のうちの１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、上記ＳＮＰ部位に対して相補的なヌクレオチドは、上記プローブの中心から５ヌクレオチド内、４ヌクレオチド内、３ヌクレオチド内、２ヌクレオチド内、または１ヌクレオチド内、より好ましくは上記プローブの中心にある。
【０１１８】
ポリヌクレオチドプローブは、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら）（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、化学カップリング手順およびインクジェット適用装置を使用することによって、基材表面上で合成され得る。別の形態では、ドット（またはスロット）ブロットと類似する「格子状」アレイが、真空系、熱的結合手順、ＵＶ結合手順、機械的結合手順、または化学結合手順を使用して、基材表面にｃＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドを整列させて結合するために使用され得る。アレイ（例えば、上記のアレイ）は、手によってか、あるいは利用可能なデバイス（スロットブロット装置またはドットブロット装置）、材料（適切な任意の固体支持体）、および機器（ロボット機器を含む）を使用することによって、生成され得、そして８個、２４個、９６個、３８４個、１５３６個、６１４４個以上のポリヌクレオチド、または市販の機器の効率的な使用のために適する他の任意の数のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１１９】
そのようなアレイまたは他のキット／システムを使用して、本発明は、試験サンプル中にある本明細書において開示されるＳＮＰを同定するための方法を提供する。そのような方法は、典型的には、試験核酸サンプルを、本発明の少なくとも１つのＳＮＰ位置に対応する１つ以上のプローブを含むアレイとともにインキュベートする工程、ならびに上記試験サンプル由来の核酸と上記プローブのうちの１つ以上との結合についてアッセイする工程を包含する。ＳＮＰ検出試薬（またはそのような１種以上のＳＮＰ検出試薬を使用する、キット／システム）を、インキュベーション条件は、上記アッセイにおいて使用される形式、使用される検出方法、ならびに上記アッセイにおいて使用される検出試薬の型および性質に依存する。当業者は、市販のハイブリダイゼーション形式、増幅形式、およびアレイアッセイ形式のうちのいずれか１つが、本明細書において開示されるＳＮＰを検出するために容易に適合され得ることを、認識する。
【０１２０】
本発明のＳＮＰ検出キット／システムは、ＳＮＰ含有核酸分子の後の増幅および／または検出のために、試験サンプルから核酸を調製するために使用される構成要素を含み得る。そのようなサンプル調製構成要素は、任意の体液（例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、粘液質、胃液、精液、涙、汗など）、皮膚、毛髪、細胞（特に、有核細胞）、生検、口腔スワブまたは組織標本からの、核酸抽出物（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む）、タンパク質抽出物もしくは膜抽出物を生成するために使用され得る。上記の方法において使用される試験サンプルは、上記アッセイ形式、上記検出方法の性質、およびアッセイされるべき試験サンプルとして使用される具体的な組織、細胞、または抽出物に基づいて、変化するであろう。核酸抽出物、タンパク質抽出物、および細胞抽出物を調製する方法は、当該分野で周知であり、利用されるシステムと適合するサンプルを得るために容易に適合され得る。試験サンプルから核酸を抽出するための自動サンプル調製システムは、市販されており、その例は、ＱｉａｇｅｎのＢｉｏＲｏｂｏｔ ９６００、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＲＩＳＭ ６７００、およびＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳｙｓｔｅｍｓのＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍである。
【０１２１】
本発明により企図される別の形態のキットは、区画分けされたキットである。区画分けされたキットは、試薬が別個の容器中に含まれる任意のキットを包含する。そのような容器としては、例えば、小さいガラス容器、プラスチック容器、プラスチック片、ガラス片、または紙片、またはアレイ形成材料（例えば、シリカ）が挙げられる。そのような容器によって、試験サンプルおよび試薬が相互混入しないようにある区画から別の区画へと試薬を効率的に移動することが可能であるか、またはある区画からそのキット中に含まれない別の容器に移動することが可能であり、各容器の薬剤または溶液は、ある区画から別の区画または別の容器へと、定量的様式で添加され得る。そのような容器としては、例えば、試験サンプルを受容する１つ以上の容器、本発明の１つ以上のＳＮＰを検出するための少なくとも１つのプローブまたは他のＳＮＰ検出試薬を含む１つ以上の容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液など）を含む１つ以上の容器、および結合したプローブまたは他のＳＮＰ検出試薬の存在を明らかにするために使用される試薬を含む１つ以上の容器が、挙げられ得る。上記キットは、例えば、核酸増幅反応または他の酵素反応（例えば、プライマー伸長反応）、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、電気泳動（好ましくは、キャピラリー電気泳動）、質量分析法、および／またはレーザー誘導蛍光検出のための、区画および／もしくは試薬を場合によりさらに含み得る。上記キットはまた、そのキットを使用するための指示書を備え得る。例示的な区画分けされたキットとしては、当該分野で公知の微小流体デバイス（例えば、Ｗｅｉｇｌら、“Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００３ Ｆｅｂ．２４；５５（３）：３４９−７７参照）が挙げられる。そのような微小流体デバイスにおいて、上記容器は、例えば、微小流体「容器」、微小流体「チャンバ」、または微小流体「チャネル」と呼ばれ得る。
【０１２２】
マイクロ流体デバイスは、「ラボ・オン・ア・チップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」システムとも称され得、生物医学的なマイクロ電気機械システム（ｂｉｏＭＥＭ）または多構成要素一体型システムは、ＳＮＰを解析するための本発明の典型的なキット／システムである。このようなシステムは、単一の機能性デバイスにおいてプローブ／標的ハイブリダイゼーション、核酸増幅、およびキャピラリー電気泳動法の反応のような過程を縮小化および分画化する。このようなマイクロ流体デバイスは典型的に、システムの少なくとも１つの形態において検出試薬を利用し、そしてこのような検出試薬は使用され、本発明の１つ以上のＳＮＰを検出し得る。マイクロ流体システムの１つの例は、米国特許第５，５８９，１３６号に開示され、この開示はチップにおいてＰＣＲ増幅の統合およびキャピラリー電気泳動が記載される。典型的なマイクロ流体システムは、マイクロチップ上に含まれるガラス、シリコン、石英、またはプラスチックのウエハ上に設計されるマイクロチャネルのパターンを含む。サンプルの移動は、電気、電気浸透性、または流体静力学の力によって制御され得、この力は、機能的顕微鏡バルブおよび可動部分を伴わないポンプを作成するためにマイクロチップの異なる範囲にわたって適用される。電圧の変化は、マイクロ機械加工されたチャネル間の交点で液体の流動を制御する方法およびマイクロチップの異なるセクションにわたりポンプ注入するための液体流量を変化させるための方法として使用され得る。例えば、米国特許第６，１５３，０７３号（Ｄｕｂｒｏｗら）および米国特許第６，１５６，１８１号（Ｐａｒｃｅら）参照。
【０１２３】
ＳＮＰを遺伝子型決定するために、典型的なマイクロ流動システムは、例えば、核酸増幅、プライマー伸長、キャピラリー電気泳動、およびレーザー光誘導蛍光検出のような検出方法を統合し得る。このような例示的なシステムを使用するための例示的なプロセスの最初の工程において、核酸サンプルは、好ましくはＰＣＲによって増幅される。次いで、増幅産物は、ｄｄＮＴＰ（各ｄｄＮＴＰに対して特異的な蛍光）および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する自動プライマー伸長反応に供され標的ＳＮＰのちょうど上流にハイブリダイズするプライマー伸長反応を実施する。３’末端において伸長が一旦完了すると、このプライマーは、キャピラリー電気泳動によって組込まれていない蛍光ｄｄＮＴＰから分離される。キャピラリー電気泳動に使用される分離培地は、例えば、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールまたはデキストランであり得る。単一のヌクレオチドプライマーの伸長産物中に組込まれたｄｄＮＴＰは、レーザー光誘導蛍光検出によって同定される。このような例示的なマイクロチップが、使用され例えば、少なくとも９６サンプルから３８４サンプル、またはそれ以上が同時に処理され得る。
核酸分子の使用
本発明の核酸分子は、特に障害を発症するリスクの評価において種々の用途を有する。典型的な障害としては、炎症性、変性、代謝、増殖性、循環、認知、生殖および行動の障害が挙げられるが、これに限定されない。本発明の好ましい実施形態では、障害は癌である。例えば、核酸分子は、ハイブリダイゼーションプローブとして、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、転写産物、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、増幅されたＤＮＡまたは他の核酸分子においてＳＮＰを遺伝子型決定するために、ならびに全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために有用である。
【０１２４】
プローブは、ＬＣＳ含有核酸分子の全長に沿って任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る。好ましくは、プローブは、配列特異的な様式でＳＮＰ含有標的配列にハイブリダイズし、その結果、標的配列を、どのヌクレオチドがＳＮＰ部位に存在するかによってのみ、標的配列と異なる他のヌクレオチド配列とを識別する。このようなプローブは、試験サンプル中のＳＮＰ含有核酸の存在を検出するために、またはどのヌクレオチド（対立遺伝子）が、特定のＳＮＰ部位に存在するかを決定する（すなわち、ＳＮＰ部位を遺伝子型決定する）ために特に有用である。
【０１２５】
核酸のハイブリダイゼーションプローブは、核酸発現の存在、レベル、形態、および／または分布を決定するために使用され得る。レベルが決定される核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。したがって、本明細書において記載されるＳＮＰに特異的なプローブが、使用され所定の細胞、組織、または生物において存在、発現および／または遺伝子のコピー数を調べ得る。これらの用途は、正常なレベルに対する遺伝子発現の増加または減少に関連する障害の診断に関連する。ｍＲＮＡ検出のためのインビトロ技術としては、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンブロットハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。
【０１２６】
したがって、本発明の核酸分子は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され本明細書において開示されるＳＮＰを検出し得、それによって多型を有する個体が、障害を発症するリスクを有するか否かを決定し得る。疾患の表現型に関連するＳＮＰの検出は、活性な疾患および／または疾患に対する遺伝的な素因についての予測ツールを提供する。
【０１２７】
本発明の核酸分子はまた、本明細書において記載されるＳＮＰ含有核酸分子に由来する発現されたｍＲＮＡ分子の全体または一部分に対応するリボザイムを設計するのにも有用である。
【０１２８】
本発明の核酸分子はまた、核酸分子および改変ペプチドの全体または一部分を発現するトランスジェニック動物を構築するためにも有用である。本明細書において開示されるＳＮＰを含む核酸分子を有する組換え細胞およびトランスジェニック動物の産生は、例えば、処置化合物および投薬レジメンの効果的な臨床設計を可能とする。
【０１２９】
ＳＮＰ遺伝子決定方法
どの特定のヌクレオチド（すなわち対立遺伝子）が、１つ以上のＳＮＰ位置の各々に存在するかを決定するプロセスは、ＳＮＰ遺伝子型決定と称される。本発明は、種々の障害についてのスクリーニングまたはその素因の決定、または処置形態に対する応答性の決定、または予後診断、またはゲノムマッピングまたはＳＮＰ関連性解析などの用途のための、ＳＮＰ遺伝子型決定の方法を提供する。
【０１３０】
核酸サンプルは、当該分野において周知の方法によって遺伝子型決定され、どの対立遺伝子が、目的の任意の所定遺伝子領域（例えば、ＳＮＰ位置）に存在するかを決定し得る。隣接する配列が、オリゴヌクレオチドプローブのようなＳＮＰ検出試薬を設計するために使用され得、このプローブは場合によりキットの形式で与えられ得る。例示的なＳＮＰ遺伝子型決定方法は、Ｃｈｅｎら、“Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ｃｏｓｔ ａｎｄ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ”，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｊ．２００３；３（２）：７７−９６；Ｋｗｏｋら、“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ”，Ｃｕｒｒ Ｉｓｓｕｅｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３ Ａｐｒｉｌ；５（２）：４３−６０；Ｓｈｉ，“Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ”，Ａｍ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００２；２（３）：１９７−２０５；およびＫｗｏｋ，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ”，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２００１；２：２３５−５８に記載される。ハイスループットのＳＮＰ遺伝子型決定についての例示的技術は、Ｍａｒｎｅｌｌｏｓ，“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＳＮＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ”，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．２００３ Ｍａｙ；６（３）：３１７−２１に記載される。一般的なＳＮＰ遺伝子型決定方法としては、ＴａｑＭａｎアッセイ、分子ビーコンアッセイ、核酸アレイ、対立遺伝子特異的なプライマー伸長、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、配列されたプライマー伸長、均質なプライマーの伸長アッセイ、質量分析法による検出を伴うプライマー伸長、高熱配列決定（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、遺伝子アレイで選別される複合プライマーの伸長、周期的ローリングサークルを伴うライゲーション、均質なライゲーション、ＯＬＡ（米国特許第４，９８８，１６７号）、遺伝子アレイで選別される複合ライゲーション反応、制限断片長の多型、一塩基の伸長タグアッセイおよびインベーダーアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。このような方法は、例えば、発光または化学発光の検出、蛍光検出、時間分解型蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー伝達、蛍光偏光、質量分析、および電気検出のような検出メカニズムと組み合わせて用いられ得る。
【０１３１】
多型を検出するための種々の方法としては、切断因子からの保護がＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖においてミスマッチの塩基を検出するために使用される方法（Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２（１９８５）；Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ ８５：４３９７（１９８８）；およびＳａｌｅｅｂａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５（１９９２））、変異体および野生型の核酸分子の電気泳動の移動度の比較（Ｏｒｉｔａら、ＰＮＡＳ ８６：２７６６（１９８９）；Ｃｏｔｔｏｎら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４（１９９３）；およびＨａｙａｓｈｉら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９（１９９２））ならびに変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおいて多型断片または野生型断片の移動をアッセイすること（Ｍｙｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５（１９８５））が挙げられるが、これらに限定されない。特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮａｓｅ保護およびＳ１保護のような、ヌクレアーゼ保護アッセイまたは化学切断法によっても評価され得る。
【０１３２】
好ましい実施形態では、ＳＮＰ遺伝子型決定は、５’ヌクレアーゼアッセイとしても公知であるＴａｑＭａｎアッセイを用いて実施される（米国特許第５，２１０，０１５号および米国特許第５，５３８，８４８号）。ＴａｑＭａｎアッセイは、ＰＣＲの間に特定の増幅産物の蓄積を検出する。ＴａｑＭａｎアッセイは、蛍光レポーター色素およびクエンチャー色素を用いて標識されたオリゴヌクレオチドプローブを利用する。レポーター色素は、適切な波長での放射線照射によって励起され、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）と呼ばれるプロセスを介して同一のプローブ中のクエンチャー色素へエネルギーを伝達する。このプローブへ取り付けられた場合、励起されたレポーター色素は、シグナルを放射しない。インタクトなプローブにおけるクエンチャー色素とレポーター色素との近さは、レポーターについての減少した蛍光を維持する。レポーター色素およびクエンチャー色素は、それぞれ最も５’側の末端および最も３’側の末端に有っても、その逆であってもよい。あるいは、レポーター色素は、最も５’側の末端または最も３’側の末端にあり得、一方で、クエンチャー色素は、内部のヌクレオチドに結合される（またはこの逆もあり得る）。さらに別の実施形態では、レポーターおよびクエンチャーの両方が、互いに間隔を空けて内部のヌクレオチドへ結合され得、その結果レポーターの蛍光は、減少される。
【０１３３】
ＰＣＲの間、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がプローブを切断し、それによってレポーター色素とクエンチャー色素とを分離し、そして結果として、レポーターの蛍光の上昇を生じる。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の上昇をモニタリングすることにより直接検出される。ＤＮＡポリメラーゼは、プローブがＰＣＲの間に増幅される標的ＳＮＰ含有鋳型にハイブリダイズする場合にのみ、レポーター色素とクエンチャー色素との間のプローブを切断し、かつプローブは、特定のＳＮＰ対立遺伝子が存在する場合にのみ、標的ＳＮＰ部位にハイブリダイズするように設計されている。
【０１３４】
好ましいＴａｑＭａｎプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブの配列は、本明細書において提供されるＳＮＰおよび関連する核酸配列情報を用いて、容易に決定され得る。Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）のようなコンピュータプログラムの多くは、最適なプライマー／プローブのセットを迅速に得るために使用され得る。本発明のＳＮＰを検出するためのこのようなプライマーおよびプローブが、癌などの種々の障害のための予測アッセイにおいて有用であり、かつキット形式に容易に組み込まれることが、当業者に明らかとなるであろう。本発明はまた、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ（米国特許第５，１１８，８０１号および米国特許第５，３１２，７２８号）ならびに他の改変形式（米国特許第５，８６６，３３６号および米国特許第６，１１７，６３５号）の使用のような、当該分野において周知のＴａｑｍａｎアッセイの改変を含む。
【０１３５】
多型の同一性はまた、限定されるわけではないが、リボプローブ（Ｗｉｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：７５７５，１９８５；Ｍｅｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２，１９８５）およびヌクレオチド誤対合を認識するタンパク質、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｕｔＳタンパク質（Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２５：２２９−２５３，１９９１）を用いたリボヌクレアーゼ保護方法を含む誤対合検出技術を用いても決定され得る。別法として、変異型対立遺伝子は、１本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）解析（Ｏｒｉｔａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５：８７４−８７９，１９８９；Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら、ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｒ．Ｅｌｌｅｓ，ｅｄ．，ｐｐ．３２１−３４０，１９９６）または変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｗａｒｔｅｌｌら、Ｎｕｃｉ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：２６９９−２７０６，１９９０；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２３２−２３６，１９８９）により同定され得る。
【０１３６】
ポリメラーゼ介在プライマー伸長法もまた、多型の同定に使用され得る。幾つかの上記方法は、特許および科学文献に記載されており、「遺伝ビット解析」方法（国際公開第９２／１５７１２号）およびリガーゼ／ポリメラーゼ介在遺伝ビット解析（米国特許第５，６７９，５２４号）を含む。関連方法は、ＷＯ９１／０２０８７，ＷＯ９０／０９４５５，ＷＯ９５／１７６７６，米国特許第５，３０２，５０９号および米国特許第５，９４５，２８３号に開示されている。多型を含む伸長プライマーは、米国特許第５，６０５，７９８号に記載された質量分析法により検出され得る。別のプライマー伸長方法は、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Ｒｕａｎｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：８３９２，１９８９；Ｒｕａｎｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，６８７７−６８８２，１９９１；ＷＯ９３／２２４５６；Ｔｕｒｋｉら、Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１６３５−１６４１，１９９５）である。さらに、多数の多型部位は、Ｗａｌｌａｃｅら、（ＷＯ８９／１０４１４）に記載された対立遺伝子特異的プライマーのセットを用いて多数の核酸領域を同時に増幅することにより調査され得る。
【０１３７】
本発明のＳＮＰの遺伝型を決定するための別の好ましい方法は、ＯＬＡにおける２つのオリゴヌクレオチドプローブの使用である（例えば、米国特許第４，９８８，６１７号参照）。この方法において、１つのプローブは、その最も３’末端にＳＮＰ部位が整列した、標的核酸のセグメントにハイブリダイズする。第２のプローブは、標的核酸分子の第１のプローブのすぐ３’に隣接するセグメントにハイブリダイズする。２つの並列したプローブは、標的核酸分子にハイブリダイズし、そして、もし第１のプローブの最も３’のヌクレオチドとＳＮＰ部位との間に完全な相補性があれば、リガーゼのような結合剤の存在下で連結される。ミスマッチがある場合、連結は起こらない。反応後、連結されたプローブは、標的核酸分子から分離され、そしてＳＮＰの存在の指標として検出される。
【０１３８】
以下の特許、特許出願、および公開されている国際特許出願は、すべて、本明細書で参考により援用され、種々の形式のＯＬＡを実施するための技術に関するさらなる情報を提供する：米国特許第６，０２７，８８９号、米国特許第６，２６８，１４８号、米国特許第５４９４８１０号、米国特許第５８３０７１１号、および米国特許第６０５４５６４号は、ＳＮＰ検出を実施するためのＯＬＡストラテジーを記載する；ＷＯ９７／３１２５６およびＷＯ００／５６９２７は、ユニバーサルアレイを用いたＳＮＰ検出を実施するためのＯＬＡストラテジーを記載し、ここで、ジップコード配列は、ハイブリダイゼーションプローブの１つに導入され得、かつ結果として生じた産物（もしくは増幅産物）は、ユニバーサルジップコードアレイにハイブリダイズし得る；米国特許出願ＵＳ０１／１７３２９（および０９／５８４，９０５）は、ＯＬＡ（もしくはＬＤＲ）、続いてＰＣＲを記載し、ここで、ジップコードはＯＬＡプローブに組み込まれ、かつ増幅されたＰＣＲ産物は、電気泳動もしくはユニバーサルジップコードアレイ読み出し装置により決定される；米国特許出願６０／４２７，８１８、同６０／４４５，６３６および同６０／４４５，４９４は、ＳＮＰｌｅｘ法およびＯＬＡに続くＰＣＲを用いた多重ＳＮＰ検出のためのソフトウェアを記載し、ここで、ジップコードは、ＯＬＡプローブに組み込まれ、かつ増幅されたＰＣＲ産物は、ジップシュート（ｚｉｐｃｈｕｔｅ）試薬とハイブリダイズし、かつＳＮＰの同定は、ジップシュートの電気泳動読み出し装置により決定される。いくつかの実施形態では、ＯＬＡは、ＰＣＲ（もしくは別の核酸増幅方法）の前に実施される。他の実施形態では、ＰＣＲ（もしくは他の核酸増幅方法）は、ＯＬＡの前に実施される。
【０１３９】
ＳＮＰを遺伝子型決定するための別の方法は、質量分析に基づく。質量分析は、ＤＮＡの４種のヌクレオチドの各々の固有の質量を利用する。ＳＮＰは、代替的なＳＮＰ対立遺伝子を有する核酸の質量の差異を測定することにより、質量分析によって明白に遺伝子型決定され得る。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ）質量分析技術が、ＳＮＰのような分子質量のきわめて正確な決定のために好ましい。ＳＮＰ解析に対する数多くのアプローチが、質量分析に基づいて開発されている。好ましい質量分析に基づくＳＮＰを遺伝子型決定する方法は、プライマー伸長アッセイを含み、これも、従来のゲルに基づく形式およびマイクロアレイのような他の適用と組み合わせて利用され得る。
【０１４０】
典型的に、プライマー伸長アッセイは、標的ＳＮＰ部位から（５’）上流の鋳型ＰＣＲアプリコンに対する、プライマーの設計およびアニールを含む。ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）および／もしくはデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物を、鋳型（例えば、ＰＣＲなどにより典型的に増幅されている、ＳＮＰ含有核酸分子）、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物に添加する。プライマーの伸長は、混合物中のｄｄＮＴＰのうちの１つに対して相補的なヌクレオチドが生じる鋳型中の最初の部位で、終結する。プライマーは、ＳＮＰ部位に直接隣接する（すなわち、プライマーの３’末端のヌクレオチドは、標的ＳＮＰ部位の隣のヌクレオチドにハイブリダイズする）か、もしくはＳＮＰ部位から２つ以上のヌクレオチド離れているかのどちらかであり得る。プライマーが、標的ＳＮＰ部位から数ヌクレオチド離れている場合、唯一の制限は、プライマーの３’末端とＳＮＰ部位との間の鋳型配列が、検出されるべきものと同じ型のヌクレオチドを含まないこと、またはこのことが、伸長プライマーの未完成な終結を引き起こすことである。あるいは、すべての４種のｄｄＮＴＰのみが、ｄＮＴＰなしで反応混合物に添加される場合、プライマーは常に、標的ＳＮＰ位置に対応するただ１つのヌクレオチドにより伸長される。この場合、プライマーは、ＳＮＰ位置より１つ上流のヌクレオチドに結合するために設計される（すなわち、プライマーの３’末端のヌクレオチドは、標的ＳＮＰ部位の５’側で標的ＳＮＰ部位に直接隣接するヌクレオチドにハイブリダイズする）。ただ１つのヌクレオチドによる伸長は、伸長されるプライマーの全体の質量を最小にし、それにより、代替的なＳＮＰヌクレオチドの間の質量の差異の分解能を上昇させるので、ただ１つのヌクレオチドによる伸長が好ましい。さらに、非改変ｄｄＮＴＰの代わりに、プライマー伸長反応には、質量標識されたｄｄＮＴＰが用いられ得る。このことは、これらのｄｄＮＴＰにより伸長されたプライマーの間の質量の差異を上昇させ、それにより、上昇する感度および精度を提供し、そして特に、ヘテロ接合の塩基位置を決定するために有用である。質量標識はまた、集中的なサンプル調製手順の必要性を軽減し、そして質量分析の必要とされる分解能を低下させる。
【０１４１】
伸長されたプライマーは、次に精製され得、そして、標的ＳＮＰ部位に存在しているヌクレオチドの同一性を決定するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析され得る。分析の１つの方法において、プライマー伸長反応からの生成物は、マトリックスを形成する光吸収結晶と組み合わせられる。次に、このマトリックスは、核酸分子をイオン化し、そして気体相に脱着するために、レーザーのようなエネルギー源により打ち付けられる。次に、イオン化された分子は、飛行管内に放射され、そして加速されて検出器に向かってこの管を下る。レーザーパルスのようなイオン化現象と分子が検出器と衝突する間の時間は、その分子の飛行時間である。飛行時間は、イオン化された分子の電荷に対する質量比（ｍ／ｚ）と正確に相関する。より小さいｍ／ｚを有するイオンは、より大きいｍ／ｚを有するイオンよりも早くこの管を下って進行し、そしてそのため、このより軽いイオンは、より重いイオンの前に検出器に到達する。したがって、飛行時間は、対応する、かつ非常に正確なｍ／ｚに変換される。この様式で、ＳＮＰは、一塩基部分に異なるヌクレオチドを有する核酸分子において固有の、質量のわずかな差異、および対応する飛行時間の差異に基づいて同定され得る。ＳＮＰ遺伝子型決定のための、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析と関連するプライマー伸長反応アッセイの使用に関するさらなる情報については、例えば、Ｗｉｓｅら、“Ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００３；１７（１１）：１１９５−２０２参照。
【０１４２】
以下の参考は、ＳＮＰ遺伝子型決定のための質量分析に基づく方法を記載する、さらなる情報を提供する：Ｂｏｃｋｅｒ，“ＳＮＰ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｂａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００３ Ｊｕｌｙ；１９ Ｓｕｐｐｌ １：１４４−１５３；Ｓｔｏｒｍら、“ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｂａｓｅｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３；２１２：２４１−６２；Ｊｕｒｉｎｋｅら、“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ＭａｓｓＡＲＲＡＹ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ”，Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；７７：５７−７４；およびＪｕｒｉｎｋｅら、“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＤＮＡ ＭａｓｓＡｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００２；１８７：１７９−９２。
【０１４３】
ＳＮＰはまた、直接のＤＮＡ配列決定によっても評価され得る。種々の自動化配列決定手順が利用され得（（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）、これらとしては、質量分析による配列決定が挙げられる（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２（１９９６）；およびＧｒｉｆｆｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９（１９９３）参照）。本発明の核酸配列は、当業者がこのような自動化配列決定手順のための配列決定プライマーを容易に設計することを可能にする。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７，３１００，３７００，３７３０，ａｎｄ ３７３０．ｔｉｍｅｓ．１ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）のような商業的な機器が、自動化配列決定のために、当該分野において一般的に使用される。
【０１４４】
本発明のＳＮＰの遺伝子型を決定するために使用され得る他の方法としては、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）および変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５（１９８５））。ＳＳＣＰは、Ｏｒｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．に記載のように、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動移動度の変化により、塩基の差異を識別する。一本鎖ＰＣＲ産物は、二本鎖ＰＣＲ産物を加熱するか、もしくはそれ以外で変性させることにより生成され得る。一本鎖核酸は、塩基配列に部分的に依存する二次構造を、再び折りたたむか、もしくは形成し得る。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動移動度は、ＳＮＰ位置の塩基配列の差異に関連する。ＤＧＧＥは、多型ＤＮＡに固有の異なる配列依存的安定性および融解特性、ならびに変性勾配ゲルにおける電気泳動移動度パターンの対応する差異に基づいて、ＳＮＰ対立遺伝子を識別する（Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，Ｃｈａｐｔｅｒ ７）。
【０１４５】
配列特異的リボザイム（米国特許第５，４９８，５３１号）がまた、リボザイム切断部位の発生もしくは消失に基づいてＳＮＰを評価するために、使用され得る。完全にマッチする配列は、ヌクレアーゼ切断消化アッセイによるか、もしくは融解温度の差異により、ミスマッチ配列と区別され得る。ＳＮＰが制限酵素切断部位に影響する場合、ＳＮＰは、制限酵素消化パターンの変化、およびゲル電気泳動により決定される核酸断片の長さの対応する変化により確認され得る。
【０１４６】
ＳＮＰ遺伝子型決定は、例えば、ヒト被験体から生体試料（例えば、組織、細胞、流体、分泌物などのサンプル）を収集する工程、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは両方）を単離する工程、標的核酸領域のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、標的ＳＮＰを含む単離された核酸の領域に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーに、核酸を接触させる工程、そして、目的のＳＮＰ位置に存在するヌクレオチドを決定する工程、または、いくつかのアッセイにおいては、増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程（アッセイは、特定のＳＮＰ対立遺伝子が存在するか、もしくは存在しない場合にのみ、ハイブリダイゼーションおよび／もしくは増幅が生じるように設計され得る）を包含し得る。いくつかのアッセイにおいて、増幅産物の大きさは、検出され、そしてコントロールサンプルの長さと比較される；例えば、欠損および挿入は、正常な遺伝子型と比較した増幅産物の大きさの変化により検出され得る。
【０１４７】
ＳＮＰ遺伝子型決定は、以下に記載のような数多くの実用的な適用のために有用である。このような適用の例としては、ＳＮＰ−疾患関連性解析、疾患素因スクリーニング、疾患診断、疾患予後判断、疾患経過モニタリング、個体の遺伝子型に基づく治療ストラテジーの決定（薬理ゲノミクス）、疾患もしくは薬物に対する応答の見込みに関連したＳＮＰ遺伝子型に基づく治療剤の開発、処置レジメンについての臨床試験のための患者母集団の層化、ならびに個体が治療剤により有害な副作用を経験する可能性の予測が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
疾患スクリーニングアッセイ
遺伝子型と疾患に関連する表現型との間の関連性／相関に関する情報は、いくつかの方法で活用され得る。例えば、１つ以上のＳＮＰと、処置が利用可能な疾患に対する素因との間に高度に統計的に有意な関連性がある場合は、個体におけるこのような遺伝子型パターンの検出は、処置の即時実行、または、少なくとも、個体の定期的なモニタリングの制度を正当化し得る。ＳＮＰとヒトの疾患との間の、弱いが、なお統計学的に有意な関連の場合、即時の治療的介入またはモニタリングは、感受性対立遺伝子またはＳＮＰを検出した後に正当化されないこともある。それにもかかわらず、被験体は、単純なライフスタイルの変化（例えば、食事、運動、禁煙、モニタリング／調査の強化）を始めることを動機付けされ得、このライフスタイルの変化は、個体がほとんど、または全く費用をかけずに達成され得るが、個体が感受性対立遺伝子を有することによってリスクが増加し得る、病態を発症するリスクを減少するという、強力な利点を与え得る。
【０１４９】
一形態では、本発明は、細胞増殖性障害（例えば、癌）などの疾患を発症するリスク、感受性または確率を増加させるＳＮＰを同定する方法を提供する。さらなる形態では、本発明は、疾患を発症するリスクを有する被験体を同定する、予後疾患を決定する、または疾患の発病を予測するための方法を提供する。例えば、被験体の細胞増殖性疾患を発症するリスク、疾患を持つ個体の予後、または細胞増殖性疾患の発病の予測は、ＢＲＣＡ１の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）における突然変異を検出することによって決定される。突然変異の同定は、細胞増殖性障害を発症するリスクの増加、予後不良、または細胞増殖性障害を発症する初期段階を示す。
【０１５０】
突然変異は、例えば、欠失、挿入、逆位、置換、フレームシフトまたは組換えである。突然変異は、ｍｉＲＮＡの結合効力を調節する（例えば、増加または減少させる）。「結合効力」は、ｍｉＲＮＡが標的遺伝子または転写産物に結合する能力を意味し、したがって、それぞれ標的遺伝子もしくは転写産物の転写または翻訳を鎮め、減少させ、抑制し、阻害し、または妨げる。結合効力は、ｍｉＲＮＡがタンパク質産生を阻害するか、またはレポータータンパク質産生を阻害する能力によって決定される。あるいはまたはさらに、結合効力は、結合エネルギーとして定義され、最小自由エネルギー（ｍｆｅ）（キロカロリー／モル）で測定される。
【０１５１】
本発明の文脈における「リスク」は、特定の期間にわたってある事象が起こるであろうという確率に関し、被験体の「絶対」リスクまたは「相対」リスクを意味し得る。絶対リスクは、関連時間集団に関する実際の測定後観測結果を参照して、または、関連時間期間の間追跡調査された統計的に有効な歴史的集団から作成される指標値を参照して、測定され得る。相対リスクは、低リスク集団の絶対リスクまたは平均集団リスクのいずれかと比較した、被験体の絶対リスクの比を指すが、これは、臨床的リスクファクターをどのように評価するかによって変化し得る。オッズ比（所定の検査結果に関する、否定的な事象に対する肯定的な事象の割合）もまた、無変換（ｎｏ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）に通常使用される（オッズ比は、式ｐ／（１−ｐ）にしたがう（式中、ｐは事象の確率であり、（１−ｐ）は）事象が起こらない確率である）。
【０１５２】
本発明の文脈における「リスク評価」または「リスクの評価」は、事象もしくは疾患状態が起こり得る確率、オッズまたは可能性（事象もしくはある疾患状態から別のものへの変換が起こる割合、すなわち、原発腫瘍から転移性腫瘍へ、もしくは転移を発症するリスクがあるものへ、または第一の転移性の事象のリスクから第ニの転移性の事象へ、またはある種の原発腫瘍を発症するリスクから１つ以上の異なる種類の原発腫瘍を発症することへ）の予測を行うことを包含する。リスク評価はまた、過去に測定した集団を参照して、絶対期間または相対期間で、将来の臨床パラメーター、従来の臨床リスクファクター値または他の癌の指標を予測することを含み得る。
【０１５３】
「リスクの増加」は、ＢＲＣＡ１内にＳＮＰを保有する個体が、ＳＮＰを保有しない個体と比較して、少なくとも１つの様々な障害（例えば、癌）を発症するであろう確率の増加を表すことを意味する。ある実施形態では、ＳＮＰ保有者は、ＳＮＰを保有しない個体よりも、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍以上少なくとも１つの種類の癌を発症する可能性がある。また、１つの癌を発症したＢＲＣＡ１内ＳＮＰの保有者は、第二の癌を発症する可能性が高い。ある実施形態では、非保有者が少なくとも１つの第二の癌を発症する平均年齢の１、２、５、７、１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７または３０年前に、ＢＲＣＡ１ ＳＮＰは、少なくとも１つの第二の癌を発症する。
【０１５４】
細胞増殖性障害としては、細胞分裂が制御されていない様々な病状が挙げられる。例示的な細胞増殖性障害としては、新生物、良性腫瘍、悪性腫瘍、前癌期病状、インサイチュー腫瘍、被包性腫瘍、転移性腫瘍、液性腫瘍、固形腫瘍、免疫学的腫瘍、血液系腫瘍、癌、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫および急速に分裂する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用される用語「急速に分裂する細胞」は、同じ組織内の隣接細胞もしくは近隣細胞の間で予想もしくは観察されるものを超えるまたは上回る速度で分裂するあらゆる細胞として定義される。癌としては、乳癌および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
被験体は、好ましくは、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、特定の疾患の動物モデルを表す被験体として有利に使用され得る。被験体は、男性または女性であり得る。被験体は、疾患を有すると過去に診断または同定され、場合によっては、疾患に関する治療的介入を既に受けたか、または現に受けている者であり得る。または、被験体は、疾患を有すると過去に診断されなかった者でもあり得る。例えば、被験体は、疾患に関する１つ以上のリスクファクターを示す者であり得る。
【０１５６】
生体試料は、核酸を含むあらゆる組織または体液であり得る。様々な実施形態は、パラフィン包埋組織、凍結組織、外科的細針吸引、皮膚の細胞、筋肉、肺、頭部および首、食道、腎臓、膵臓、口、咽喉、咽頭（ｐｈａｒｙｎｘ）、喉頭（ｌａｒｙｎｘ）、食道、顔面、脳、前立腺、乳房、子宮内膜、小腸、血液細胞、肝臓、精巣、卵巣、子宮、頸部、大腸、胃、脾臓、リンパ節または骨髄を含む。他の実施形態は、体液試料、例えば、気管支ブラシ、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｒａｖａｇｅ）、末梢血リンパ球、リンパ液、腹水、漿液、胸水、唾液、脳脊髄液、涙液、食道洗浄液、ならびに排泄物または尿試料（例えば、膀胱洗浄液および尿）を含む。
【０１５７】
連鎖不平衡（ＬＤ）とは、所定の集団における各対立遺伝子の存在の別個の頻度から予測されるものよりも多い頻度での、２つ以上の異なるＳＮＰ部位における対立遺伝子の同時遺伝（例えば、選択的なヌクレオチド）をいう。独立して遺伝される２つの対立遺伝子の同時遺伝の予測される頻度は、第１の対立遺伝子の頻度に第２の対立遺伝子の頻度を乗じたものである。予測された頻度で同時に生じる対立遺伝子は、「連鎖平衡」であると言われる。対照的に、ＬＤは、２つ以上の異なるＳＮＰ部位における対立遺伝子の間の任意の非ランダムな遺伝的関連をいい、この遺伝的関連は一般的に、染色体に沿う２つの遺伝子座の物理的な近接性に起因する。ＬＤは、２つ以上のＳＮＰ部位が、所定の染色体上で互いに密接に物理的に近接している場合に生じ得、したがって、これらのＳＮＰ部位における対立遺伝子は、１つのＳＮＰ部位における特定のヌクレオチド（対立遺伝子）が、近くに位置する異なるＳＮＰ部位における特定のヌクレオチド（対立遺伝子）と非ランダムな関連を示す結果のために、複数の世代について分離されていないままである傾向がある。したがって、ＳＮＰ部位の１つを遺伝子型決定することにより、ＬＤであるもう一方のＳＮＰを遺伝子型決定したものとほとんど同じ情報が生じる。
【０１５８】
遺伝的障害（例えば、予後またはリスク）目的のために個体をスクリーニングすることに関して、特定のＳＮＰ部位が障害をスクリーニングするのに有用であることが分かった場合、当業者であれば、このＳＮＰ部位を有するＬＤ内に存在する他のＳＮＰ部位もまた、病状をスクリーニングするのに有用であることを認識するであろう。種々の程度のＬＤが、いくつかのＳＮＰが他よりもより密接に関連している（すなわち、より強いＬＤである）という結果を有する２つ以上のＳＮＰの間で遭遇され得る。さらに、染色体に沿ってＬＤが延びる物理的な距離は、ゲノムの異なる領域間で異なり、したがって、ＬＤが生じるために必要とされる２つ以上のＳＮＰ部位の間の物理的分離の程度は、ゲノムの異なる領域の間で異なり得る。
【０１５９】
スクリーニング適用に関して、実際に疾患を生じる（原因となる）多型ではないが、このような原因となる多型とＬＤである多型（例えば、ＳＮＰおよび／またはハプロタイプ）がまた、有用である。このような場合、原因となる多型とＬＤである多型の遺伝子型は、原因となる多型の遺伝子型の予測となり、したがって、原因となるＳＮＰにより影響を受ける表現型（例えば、疾患）の予測となる。したがって、原因となる多型とＬＤである多型マーカーは、マーカーとして有用であり、そして、実際の原因となる多型が未知である場合、特に有用である。
【０１６０】
ヒトのゲノムにおける連鎖不平衡は、以下で総説されている：Ｗａｌｌら、“Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｂｌｏｃｋｓ ａｎｄ ｌｉｎｋａｇｅ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ”，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２００３ Ａｕｇｕｓｔ；４（８）：５８７−９７；Ｇａｍｅｒら、“Ｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ：ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｉｎｋａｇｅ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｄｉａｌｌｅｌｉｃ ｌｏｃｉ”，Ｇｅｎｅｔ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２００３ Ｊａｎｕａｒｙ；２４（１）：５７−６７；Ａｒｄｌｉｅら、“Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｉｎｋａｇｅ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ”，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ａｐｒｉｌ；３（４）：２９９−３０９（ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２００２ Ｊｕｌｙ；３（７）：５６６）；およびＲｅｍｍら、“Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｎｋａｇｅ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２２ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ”；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；６（１）：２４−３０。
【０１６１】
疾患の表現型（例えば、癌）を有する特定のＳＮＰおよび／またはＳＮＰハプロタイプの寄与または関連は、本発明のＳＮＰを使用して、その遺伝子型を有さない個体と比較して、特定の遺伝子型の結果として検出可能な形質（例えば、癌）を発現する個体、または、その後に、検出可能な形質を発現するリスクを増加もしくは減少してその遺伝子型を配置する個体を同定し得る、優れた試験を開発し得る。本明細書において記載されるように、スクリーニングは、単一のＳＮＰまたは一群のＳＮＰに基づき得る。素因／リスクのスクリーニングの精度を高めるために、本発明のＳＮＰの解析は、疾患の他の多型もしくは他の危険因子（例えば、疾患の症状、病理学的特徴、家族歴、食事、環境因子またはライフスタイル因子）の解析と組み合わせられ得る。
【０１６２】
本発明のスクリーニング技術は、種々の方法論（例えば、ハプロタイプ決定のための個体の染色体の解析を可能にする方法、家族研究、単一精子ＤＮＡ解析または体細胞ハイブリッドが挙げられる）を採用して、検出可能な形質を発症するリスクの増加もしくは減少に関連するＳＮＰもしくはＳＮＰパターンを試験被験体が有するかどうか、または、個体が特定の多型／変異の結果として検出可能な形質を罹患するかどうかを決定し得る。本発明の診断を用いて解析された形質は、アルツハイマー病に関連する病理および傷害において通常観察される、任意の検出可能な形質であり得る。
【実施例】
【０１６３】
実施例１：ｍｉＲＮＡの結合効力を潜在的に修正し得る乳癌および卵巣癌関連遺伝子におけるＳＮＰの同定
臨床的分類および分子的分類は、乳癌を、生物学的な重要性を有するサブグループにうまく分類している。サブグループのカテゴリーは、１）ＥＲ＋および／またはＰＲ＋腫瘍、２）ＨＥＲ２＋腫瘍、ならびに３）トリプルネガティブ（ＴＮ）腫瘍である（Ｐｅｒｏｕ，Ｃ．Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ ２０００．４０６，７４７−５２）。ＥＲ＋および／またはＰＲ＋腫瘍ならびにＨＥＲ２＋腫瘍はともに、最も一般的（７５％）であり、トリプルネガティブ腫瘍は、乳癌の約２５％の割合を占めている。残念ながら、トリプルネガティブ表現型は、積極的に解明されているが不明なところが多い乳癌のサブクラスの代表的なものであり、これは、若いアフリカ系アメリカ人女性で最も蔓延している（４０未満）。このサブクラスは、５年生存率が他のサブタイプよりも悪い（７２％対８５％）。
【０１６４】
本研究のためにエール大学から提供された３５５人の癌症例および２９人の対照個体の原発腫瘍から、ＤＮＡを採取した。これらのＤＮＡ試料の中で、２０６個が乳房由来である。加えて、乳癌および卵巣癌を有する患者から、７７個の卵巣癌ＤＮＡ試料、５５個の子宮癌ＤＮＡ試料、１７個のＤＮＡ試料を採取した。また、ニューヘーブン、コネティカット州の症例対照群を代表する２９個の非癌性ＤＮＡ試料も採取した。本研究に参加しているこれらの患者各人に関して、重要な医療情報（例えば、臨床情報および病理情報、家族歴、民族性ならびに生存率）は知られている。本研究に使用した試料のライブラリーは、培養され続けている。
【０１６５】
ＢＲＣＡ１遺伝子は、乳癌および卵巣癌のリスクの増加に関連しており、本研究の中心となっている。（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕで公的に利用可能な）カリフォルニア大学サンタクルーズ校のゲノムブラウザにしたがって、ＢＲＣＡ１の３’ＵＴＲを選択した。３’ＵＴＲは、各遺伝子の停止コドンから最後のエクソンの末端までの配列として定義される。それぞれ（例えば、ＰｉｃＴａｒ，ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ，ｍｉＲａｎｄａ，ｍｉＲＮＡ．ｏｒｇおよびＭｉｃｒｏＩｎｓｐｅｃｔｏｒ）の初期設定パラメーターを使用した特殊アルゴリズムの方法によって、ＢＲＣＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ内の推定ｍｉＲＮＡ結合部位を同定した。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰで公的に利用可能な）ｄｂＳＮＰおよび（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで公的に利用可能な）Ｅｎｓｅｍｂｌ ｄａｔａｂａｓｅを検索することによって、ｍｉＲＮＡ結合部位に存在するＳＮＰを同定した。
【０１６６】
ＤＮＡ癌試料および細胞株から、ＢＲＣＡ１の３’ＵＴＲのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ突然変異頻度を最小化するために、Ｕｌｔｒａ ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＫＯＤ ｈｏｔ ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＥＭＤ）を使用した。使用した熱サイクルプログラムは、９５℃２分で１サイクル、９５℃２０秒、６４℃１０秒および７２℃４０秒で４０サイクルを含んでいた。次いで、配列決定するために、エール大学のケック生命工学資源研究室（ｈｔｔｐ：／／ｋｅｃｋ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／）に、ＰＣＲ単位複製配列を送った。新規ＳＮＰおよび既知ＳＮＰの両方の存在に関して、配列をスクリーニングした。同定したすべてのＳＮＰを記録した。
【０１６７】
ＢＲＣＡ１に関する十分な配列決定結果を得るとすぐに、時間効率のより良い方法のハイスループット遺伝子型決定法を使用した。したがって、適切な多型専用に設計されたＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を採用した。１個が各対立遺伝子に対するものである２個のＴａｑＭａｎ蛍光標識プローブを使用して、遺伝子型決定を実施した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ配列検出システムおよびＳＤＳ ２．２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、分析を実施した。以下の熱サイクルプログラム：９５℃１０分で１サイクル、９３℃１５秒および６０℃１分で５０サイクルを使用して、癌試料上およびＤＮＡ試料の世界ライブラリー上で、ＴａｑＭａｎ反応を行った。ＢＲＣＡ１用プローブのアッセイＩＤは、以下の通りである。
【０１６８】
ＢＲＣＡ１：
Ｃ＿３１７８６６５＿１０（ｒｓ９９１１６３０）、
Ｃ＿２９３５６＿１０（ｒｓ１２５１６）、
Ｃ＿３１７８６８８＿１０（ｒｓ８１７６３１８）、
特注のＲＳ３０９２９９５−０００１（ｒｓ３０９２９９５）、
Ｃ＿３１７８６７６＿１０＿ｒｓ１０６０９１５）、
Ｃ＿２６１５１８０＿１０（ｒｓ７９９９１２）、
Ｃ＿３１７８６９２＿１０（ｒｓ９９０８８０５）、
およびＣ＿９２７０４５４＿１０（ｒｓ１７５９９９４８）（図６、表２）。
【０１６９】
研究参加者のＤＮＡ試料を保存するために、ＴａｑＭａｎ ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。前増幅（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の手順はゲノム全体を増幅しないが、その代わり、本発明者らは、目的のプローブのすべてからなる「アッセイプール」を作る。したがって、５個の異なる染色体および７個の異なる遺伝子から、１８個のプローブをプールした。１００個超の試料をうまく前増幅した。この方法は、すべての関連プローブを一緒にプールし、目的のゲノム領域を増幅する手段を提供する。基本的なプロトコールは、極めて低いＤＮＡ濃度で前増幅ＰＣＲを行うためのものである（結果は、わずか１．５μｇの０．５ｎｇ／μｌＤＮＡから信頼性の高い結果を収集できることを示している）。次いで、前増幅産物を１：４０に希釈する。そうすると、試料は、ＴａｑＭａｎ遺伝子型決定（上記の手順）に使用できる状態になる。
【０１７０】
【表２】

太字の多型は、被験体の乳癌を発症するリスクを予測するのに必要な最適なＳＮＰのセットを含む。
Ｔａｑｍａｎ ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイを使用して、２個の遺伝子および約２６７ｋｂに及ぶ８個のＳＮＰを研究した。
【０１７１】
【表３】

＊数字は、８個の異なるＳＮＰに関して遺伝子型決定した患者の数を表す。
ＢＲＣＡ１では、次いで、配列決定したすべての患者を遺伝子型決定もした。
いくつかのサブタイプ、特にＭＰに関して直接的に配列決定できる多数の試料は、多くのまたはすべてのＦＦＰＥ試料だからとは限られない。
【０１７２】
実施例２：乳房腫瘍および卵巣腫瘍に由来する組織試料、隣接正常組織試料ならびに正常組織試料を使用した、ＢＲＣＡ１内のｍｉＲＮＡ相補的部位における配列変異の評価
ＢＲＣＡ１は、１３８１個のヌクレオチドの高度に保存された３’ＵＴＲを有する。３’ＵＴＲは、１６個の既知ＳＮＰを有する。これらのＳＮＰの中の９個は、予測ｍｉＲＮＡ結合部位に位置し、これらの９個の中の４個は、予測シード領域結合部位に位置する。しかしながら、これまでは、これらの１６個のＳＮＰの中で、３個のＳＮＰ（ｒｓ３０９２９９５、ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１２５１６）だけが、配列決定されたＤＮＡ試料において発見されている。加えて、予測ｍｉＲＮＡ結合部位に存在する１個の新規ＳＮＰ（ＳＮＰ１）が同定されている。注目すべきことに、このＳＮＰだけが、１人の患者において、腫瘍組織および隣接正常組織の両方で発見されている。結果は再現性がある（図２および３）。配列決定によって同定されており、予測ｍｉＲＮＡ結合部位を有する４個のＳＮＰの中で、これらの２個（ｒｓ３０９２９９５およびｒｓ１２５１６）が、予測ｍｉＲＮＡ結合部位のシード領域に位置する（図３）。本発明者らが同定したＳＮＰのいずれも、高度に保存された予測ｍｉＲＮＡ結合部位に位置しない。
【０１７３】
より具体的には、ｒｓ３０９２９９５は、あまり保存されていない２個の以下のｍｉＲＮＡ：ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂおよびｈａｓ−ｍｉＲ−６３５が結合すると予測される部位に位置する。ｒｓ３０９２９９５は、ｈａｓ−ｍｉＲ６３５のシード領域に位置すると予測される。ｒｓ８１７６３１８は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７５８が結合すると予測される部位に位置する。ＳＮＰ１は、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５４およびｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐの両方が結合すると予測される部位に位置する。最後に、ｒｓ１２５１６は、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−４１２が結合すると予測される部位に位置する。ｒｓ１２５１６は、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３７の予測シード領域に収まる（図３）。
【０１７４】
研究癌集団においてＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲをマッピングするとすぐに、癌ＤＮＡ試料を遺伝子型決定するよりハイスループットな方法を使用した。これを達成するために、本発明者らの癌集団を配列決定する間中、３個の主要な位置するＳＮＰ専用に設計されたＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。１個が各対立遺伝子に対するものである２個のＴａｑＭａｎ蛍光標識プローブを使用して、遺伝子型決定を実施した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ配列検出システムおよびＳＤＳ ２．２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、分析を実施した。本発明者らの癌試料および世界ＤＮＡ試料上で、ＴａｑＭａｎ反応を実行した。
【０１７５】
実施例３：地域集団対世界集団におけるＢＲＣＡ１ ＳＮＰの保有率
図４は、２，４７２人の個体を含む４６個の世界集団の世界ライブラリーに由来するＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲに関する遺伝子型決定結果を示している。図４に示されるように、ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１２５１６は、一般集団において、ほとんどの場合、一緒に遺伝で受け継がれている。アフリカの民族性を除いて、それらは、それぞれ集団の３１．６％および３１．７％において見られる。加えて、ｒｓ３０９２９９５は、世界の大部分を通じて極めて珍しい。アフリカの民族性を除いて、ｒｓ３０９２９９５は、平均すると集団において見られない。しかしながら、これらの２つの興味深い傾向は、アフリカの集団には当てはまらない。アフリカの集団（グラフの左端のビアカピグミーからエチオピア系ユダヤ人まで、１０個ある）内では、ｒｓ３０９２９９５は、集団の１０．２％において見られ、ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１２５１６は、一緒に遺伝で受け継がれている可能性は低い。ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１２５１６が一緒に遺伝で受け継がれていない場合、ｒｓ１２５１６は、ｒｓ８１７６３１８よりも常に高い保有率にあるようである（それぞれ２７．８％および１６．３％）。
【０１７６】
同時に、ＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲにおける３個の同じＳＮＰに関して、７個の癌集団およびエール大学対照の１個の集団から、３８４人の個体を分析した（図５）。興味深いことに、世界集団において認められた傾向（図４）は、研究癌集団を反映していない。しかしながら、類似点がいくつかある。例えば、ｒｓ３０９２９９５は、研究癌集団およびエール大学対照群の１．６％の割合で見られる。また、エール大学対照群内では、ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１２５１６は、非アフリカの世界集団と同じ傾向を示している。すなわち、非アフリカの世界集団内では、これらの２個のＳＮＰは、集団の約３１％に存在しており、本発明者らのエール大学集団内では、それらは、集団の約２８％に存在しており、通常一緒に遺伝で受け継がれている。しかしながら、ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１２５１６が一緒に遺伝で受け継がれる可能性が低い様々な癌集団において認められる著しい違いがある。この傾向は、アフリカの集団において見られるものと類似する。しかしながら、この傾向をさらにより興味深くするものは、アフリカの集団内では、ＳＮＰ ｒｓ１２５１６が、集団においてｒｓ８１７６３１８よりも高い頻度にあることである（それぞれ２７．８％および１６．３％）。しかし、研究癌集団では、ｒｓ８１７６３１８は、本発明者らの（ＨＥＲ２＋を除く）乳癌集団においてｒｓ１２５１６よりも高い頻度にある（それぞれ２６．９％および２１．３％）。
【０１７７】
過去の結果に対応して、より参考になるＳＮＰを用いて、１７番染色体のこの領域を満たした。本発明者らの動機は２つ、すなわち、領域の系統進化を解決すること、およびハプロタイプ解析を行うことであった。これを達成するために、ＢＲＣＡ１を包含する５個のさらなる参考ＳＮＰを加えた（図６）。ＢＲＣＡ１は逆鎖上に存在するので、これらのＳＮＰは、染色体の下端から上（３’から５’）に順序付けられる。これらの８個のＳＮＰは、２個の遺伝子（ＢＲＣＡ１およびＮＢＲ１）にまたがり、約２６７ｋｂに及ぶ。この大きな染色体領域によって、ハプロタイプ解析のために認められる強い連鎖不均衡にもかかわらず、本発明者らは、遺伝的変異性を観察することができる（Ｇｕ，Ｓ．，Ｐａｋｓｔｉｓ，Ａ．Ｊ．およびＫｉｄｄ，Ｋ．Ｋ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００５．２１，３９３８−９）。ハプロタイプ解析は、目的の遺伝子におけるＳＮＰの影響を解析するための強力な方法である。ハプロタイプ解析を行うことの背後にある理論は、疾患遺伝子がネガティブな選択圧を受けた場合、疾患を保有する染色体における連鎖変異は、集団内でより低頻度にある可能性があるということである。
【０１７８】
ＢＲＣＡ１にまたがるこれらの８個のＳＮＰの進化を決定した（図７）。図６において、各ＳＮＰは、ハプロタイプ位置（１から８）に割り当てられる。これらの位置は、図７において認められる「偽の」ハプロタイプと相互に関連している。例えば、祖先配列は、８文字「ＧＧＣＣＡＣＴＡ（配列番号８）」であり、各文字は、（左から右に）番号付けされた位置と相互に関連している。ＳＮＰの祖先状態を決定するために、本発明者らのヒト試料で使用される同じＴａｑＭａｎアッセイを採用したが、しかしながら、非ヒト霊長類に由来するゲノムＤＮＡを遺伝子型決定するのにこれらのアッセイを使用した。１０個の最も一般的なハプロタイプは、祖先ハプロタイプへの変異の蓄積によって説明することができる。直接的に認められたハプロタイプの大部分は、順序付けることができ、１個の派生ヌクレオチド変化によって相違している。より具体的には、図７において、枠で囲まれた２個のハプロタイプのうちどちらが、採用されたＳＮＰを有する系統において最初に生じたかということに関しては未解決であった。ＡＧＣＣＡＴＴＡ（配列番号２）ハプロタイプは、現在のところ、世界で最も一般的に認められるハプロタイプである。ＧＡＡＣＧＣＴＡ（配列番号３）およびＧＡＡＣＧＣＴＧ（配列番号４）の２個のハプロタイプは、世界のすべての地域に存在している。ＡＧＣＣ−ＧＣＴＧ（配列番号１９）ハプロタイプは、新世界（これは、南アメリカ、中央アメリカおよび北アメリカの地域を示す（集団の詳細に関しては、ＡＬＦＲＥＤ：ｈｔｔｐ：／／ａｌｆｒｅｄ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／参照））においてのみ見られる。
【０１７９】
世界集団および研究癌集団の間で、ハプロタイプ保有率を比較した。この比較よって、２個の群の間で認められたハプロタイプの間でも、乳癌および／または卵巣癌に対するリスクの増加に関連する１つ以上のハプロタイプの間でも、著しい違いが明らかになった。
【０１８０】
２，４７２人の個体を含む４６個の世界集団における８個のＳＮＰ（図８）を遺伝子型決定した。ハプロタイプ進化のデータに基づいて、図８におけるハプロタイプのデータを予測した。より具体的には、認められた祖先ハプロタイプであるＧＧＣＣＡＣＴＡ（配列番号８）は、アフリカの民族性においてのみ見られた。最も一般的なハプロタイプであるＡＧＣＣＡＴＴＡ（配列番号２）は、世界中で高いレベルで見られた。ＧＡＡＣＧＣＴＡ（配列番号３）およびＧＡＡＣＧＣＴＧ（配列番号４）の２個のハプロタイプも同様に、世界中で見られた。（ハプロタイプ進化で予測されたように）組換えハプロタイプであるＡＧＣＣ−ＧＣＴＧ（配列番号１９）は、新世界においてのみ実際に見られた。このグラフは、ＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲを遺伝子型決定する際に見られたパターン（図４）を連想させる。図４を論じた際に言及したように、アフリカの集団は、極めて異なるパターンを示す。この観察結果は、ここでも当てはまる。図８において、最初の１０個の民族性は、アフリカの家系（ビアカピグミーからエチオピア系ユダヤ人まで）からなり、固有のハプロタイプパターンを示している。例えば、以下のハプロタイプ、ＧＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号７）、ＧＡＣＧＡＣＴＡ（配列番号５）、ＧＡＣＣＡＣＴＡ（配列番号２０）およびＡＧＣＣＡＣＴＡ（配列番号１）は、アフリカ人に全く固有である。最後に、配列標識された「残り」は、集団においてまれな頻度で存在する多様なハプロタイプを表す可能性が最も高い。４６個の集団は、サイズがわずか２６人の個体（マサイ族（Ｍａｓｉａ））から２２２人もの個体（ラオス人）まである。各集団は、平均して、示される９６．６人の個体を有する。
【０１８１】
図９は、合計で３８４人の個体となる７個の癌集団および１個のエール大学対照群からの、本発明者らのハプロタイプのデータを示す。重要なことに、一般的な世界ハプロタイプの傾向と図９の比較に関して、多くの同じハプロタイプが認められた。例えば、ＡＧＣＣＡＴＴＡ（配列番号２）ハプロタイプは、今もなお最も一般的に認められるものであった。加えて、ＧＡＡＣＧＣＴＡ（配列番号３）およびＧＡＡＣＧＣＴＧ（配列番号４）の２個のハプロタイプは、世界中で見られ、図９において示されるどの集団でも見られた。図８におけるアフリカの集団の中で一般的であったＧＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号７）ハプロタイプは、図９においてもしばしば認められた。これは、ＧＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号７）ハプロタイプが認められたすべての集団において、アフリカ系アメリカ人がいるからかもしれない。ＧＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号７）ハプロタイプが認められなかった図９における集団だけが、乳房／卵巣集団であり、この群は、白人だけから構成されていた（民族性データに関する図１０参照）。しかしながら、注目すべきことに、乳癌のＴＮサブタイプ内で認められたハプロタイプは、世界集団だけでなく、他の癌集団およびエール大学対照群とも極めて著しく異なっていた（図９）。特に興味深い３個のハプロタイプがある。これらのハプロタイプは、ＧＧＡＣＧＣＴＡ（配列番号６）、ＧＧＣＣＧＣＴＡ（配列番号９）およびＧＧＣＣＧＣＴＧ（配列番号１０）である（図９および表４）。これらの３個の固有ハプロタイプは、ＴＮ癌群において認められたハプロタイプの１２％を構成しており、（おそらく、残りを除く）世界ハプロタイプにおいては表れなかった。ＧＧＣＣＧＣＴＡ（配列番号９）ハプロタイプは、７個の癌群すべてにおいて見られるので、特に興味深い。加えて、ＴＮ乳癌群は、ハプロタイプの約１８％を構成する残りのハプロタイプの最も大きい集団を有する（図９）。残りのハプロタイプに関する基準は、すべてのカテゴリーにわたるすべての試料の１％未満である。ＴＮ内では、残りは、ハプロタイプ「ＧＧＡＣＧＣＴＧ」（配列番号２１）である。このハプロタイプは、ＴＮハプロタイプの４％を構成している。しかしながら、それは、他のカテゴリーにおいてはめったに認められないので、残りとして分類される（それは、卵巣において１回、および子宮癌群において１回認められる。）。表４は、これらの固有で興味深いハプロタイプ内にある影響されたＳＮＰのより厳密な分析を示す。祖先ハプロタイプであるＧＧＣＣＡＣＴＡ（配列番号８）、および最も一般的なハプロタイプであるＡＧＣＣＡＴＴＡ（配列番号２）は、比較する目的で示されている。ＳＮＰ ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ１０６０９１５およびｒｓ１７５９９９４８は、固有ハプロタイプをもたらす典型的な変異部位である。ｒｓ８１７６３１８は、ＢＲＣＡ１の３’ＵＴＲに位置しており、予測ｍｉＲＮＡ結合部位にも位置しているので、重要である。ｒｓ１０６０９１５もまた、ＢＲＣＡ１のコード領域のエクソン１２に位置しているので、重要である。コード領域もまた、ｍｉＲＮＡに関する標的部位である。
【０１８２】
【表４】

下線が引かれたｄｂＳＮＰ＃は、乳癌または卵巣癌を発症するリスクの予測に関する、多型の本質的な部位を表す。
ｒｓ１０６０９１５ ＳＮＰ：変異型対立遺伝子（Ａ）がホモ接合であり、異なる民族群においてこの突然変異の影響を研究する場合、アフリカ系アメリカ人の乳癌対対照の関連性は、統計的に有意である（ｐ＝０．０１）。アフリカ系アメリカ人のトリプルネガティブ（ＴＮ）乳癌対対照へと関連性をさらに詳細化すると、結果はより有意である（ｐ＝０．００５）。
【０１８３】
これらの癌群をさらに分析するために、ＳＮＰデータを他の既知ＴＮ乳癌リスクファクターに関連付けた。図１１は、コード領域突然変異状態ごとのＢＲＣＡ１ハプロタイプデータを表す。本研究において、１１０人の患者をハプロタイプごとにＢＲＣＡ１検査し、分析した。ＢＲＣＡ１突然変異は、ＴＮ乳癌において一般的であるので、ＧＧＣＣＧＣＴＡ（配列番号９）およびＧＧＣＣＧＣＴＧ（配列番号１０）の２個の固有ハプロタイプが、集団の８％を構成するＢＲＣＡ１突然変異保有者の間に見られることが予想された。
ＴＮ乳癌が固有のＳＮＰシグネチャーを有し、アフリカの集団の多様性の結果ではないことを確認するために、図１２および１３を作成した。実際、アフリカ系アメリカ人および白人の民族性によってエール大学対照群およびＴＮ群を比較すると、ＴＮアフリカ系アメリカ人は、対照民族性およびＴＮ白人の両方とも異なっていたことを、図１２は確認している。特に、ＧＧＡＣＧＣＴＡ（配列番号６）およびＧＧＣＣＧＣＴＡ（配列番号９）のハプロタイプは、ＴＮアフリカ系アメリカ人において多く見られる。ＴＮ乳癌は、若いアフリカ系アメリカ人女性（すなわち、４０歳（ｙｏ）未満）の間で最もよく見られ、興味深いので、このことは予想されていた。図１３において、エール大学対照群およびＴＮ乳癌群内で、異なる民族性を年齢ごとにさらに比較した。年齢ごとに比較すると、ＧＧＡＣＧＣＴＡ（配列番号６）ハプロタイプがアフリカ系アメリカ人集団内でのみ見られ、ＧＧＣＣＧＣＴＡ（配列番号９）ハプロタイプが白人に限られていたことは明白である。ＧＧＣＣＧＣＴＡ（配列番号９）ハプロタイプは、若い集団（５１歳以下）において主に見られたが、しかしながら、年長のアフリカ系アメリカ人においても見られた。最後に、ＴＮアフリカ系アメリカ人（ＡＡ）集団内では、祖先ハプロタイプは、より年長のＴＮ ＡＡ群において極めてより多く見られる。より若いＴＮ ＡＡ群においては、ＧＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号７）ハプロタイプは、より多く見られる。これは、系統データに合っている（図７）。
【０１８４】
実施例４：乳癌リスクに関連する珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプ
乳癌を発症するリスクの増加を有する女性を同定する遺伝子マーカーは存在するが、受け継いだリスクの大部分は、分かりにくいままである。多数のＢＲＣＡ１コード配列突然変異が乳癌リスクに関連するが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合を破壊するＢＲＣＡ１多型における突然変異は、機能的であり得、癌リスクの遺伝子マーカーとして作用し得る。したがって、ＢＲＣＡ１の３’ＵＴＲにおけるこのような多型、およびこれらの機能的な多型を含むハプロタイプが、乳癌リスクに関連する可能性があるという仮説を検証した。配列決定および遺伝子型決定を通じて、乳癌集団で多型性であるＢＲＣＡ１において、３個の３’ＵＴＲ変異体を同定したところ、該変異体の１個（ホモ接合性の変異型対立遺伝子Ａであるｒｓ８１７６３１８）は、アフリカ系アメリカ人女性に関して重要な癌関連性を示し、アフリカ系アメリカ人女性に関するトリプルネガティブ乳癌を発症するリスクを特異的に予測する（それぞれｐ＝０．０４およびｐ＝０．０２）。ハプロタイプ解析を通じて、乳癌患者（ｎ＝２２１）が、対照集団では通常見られない（すべての乳癌染色体の９．５０％および対照染色体の０．１１％、ｐ＝０．０００１）これらの３’ＵＴＲ変異体を含む５個の珍しいハプロタイプを持っている、ということが見出された。５個の珍しいハプロタイプの中の３個は、ｒｓ８１７６３１８ ＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲ機能的対立遺伝子を含む。さらに、これらのハプロタイプは、ＢＲＣＡ１突然変異乳癌患者においてめったに見られないので（１／１２９＝０．７８％；１／１２９患者または１／２５８染色体）、ＢＲＣＡ１コード領域突然変異のバイオマーカーではない。これらの珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプは、乳癌リスクの増加の新しい遺伝子マーカーの代表的なものである。
【０１８５】
材料と方法
研究集団
エール大学のヒューマン・インベスティゲーション・コミッティー（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認後、ＨＩＣプロトコール＃０８０５００３７８９に基づいて、エール大学／ニューヘーブン病院（ニューヘーブン、コネティカット州）で処置を受けている乳癌患者由来の試料を、合計２２１人の承諾者から採取したところ、試料は、１８０個の腫瘍ＦＦＰＥおよび４１個の生殖系列ＤＮＡ供給源（それぞれ８１．４％および１８．６％）からなった。２２個の血液および１９個の唾液供給源（それぞれ５３．７％および４６．３％）から、生殖系列ＤＮＡ試料を採取した。年齢、民族性および癌の家族歴などの患者データを収集した。病理学的分類によって、乳癌サブタイプを規定した。エール大学／ニューヘーブン病院から対照を採用し、非黒色腫皮膚癌を除く癌のあらゆる経歴を持たない者を対照に入れた。すべての試料は唾液試料であった。年齢、民族性および家族歴などの情報を記録した。遺伝子型および癌関連性のＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲ分析のために、１９４個の生殖系列ＤＮＡ対照を使用し（９２人のヨーロッパ系アメリカ人および１０２人のアフリカ系アメリカ人）、そして、既知の腫瘍サブタイプおよび民族性を持つ乳癌患者由来の２０５個の腫瘍ＦＦＰＥならびに生殖系列ＤＮＡ試料を使用した。ロッテルダム家族性癌診療所を通じてエラスムス大学医療センターで、１２９人の非血縁ＢＲＣＡ１突然変異保有者を突き止め、後述のように末梢血試料からＤＮＡを単離した。
【０１８６】
世界集団に関して、本発明者らは、エール大学における本発明者らの資源（世界中からの４６個の集団を代表する２，２５０人の非血縁個体）を使用した。この資源は、遺伝学研究（Ｃｈｉｎ ＬＪら、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８；６８（２０）：８５３５−４０；Ｓｐｅｅｄ ＷＣら、Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ ｊｏｕｒｎａｌ ２００９；９（４）：２８３−９０；Ｓｐｅｅｄ ＷＣら、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ｂ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｇｅｎｅｔ ２００８；１４７Ｂ（４）：４６３−６；Ｙａｍｔｉｃｈ Ｊら、ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ２００９；８（５）：５７９−８４．）の中でよく記録されている。本研究で示された４６個の集団は、１０人のアフリカ人（ビアカピグミー（Ｂｉａｋａ Ｐｙｇｍｙ）、ムブティピグミー（Ｍｂｕｔｉ Ｐｙｇｍｉｅｓ）、ヨルバ族、イボ族、ハウサ族、チャガ族、マサイ族、サンダウェ族、アフリカ系アメリカ人およびエチオピア系ユダヤ人）、３人の南西アジア人（イエメン系ユダヤ人、ドルーズ人およびサマリア人）、１０人のヨーロッパ人（アシュケナージ系ユダヤ人、アディゲ人、チュバシュ人、ハンガリー人、アーケインジェル系ロシア人（Ａｒｃｈａｎｇｅｌ Ｒｕｓｓｉａｎ）、ボログダ系ロシア人、フィンランド人、デーン族、アイルランド人およびヨーロッパ系アメリカ人）、２人の北西アジア人（コミジリエーン（Ｋｏｍｉ Ｚｙｒｉａｎｅ）およびハンティ族）、１人の南アジア人（南インドのケララの住民）、１人の北東シベリア人（ヤクート族）、２人の太平洋諸島出身者（ナシオイ系メラネシア人およびミクロネシア人）、９人の東アジア人（ラオス人、カンボジア人、サンフランシスコ出身の中国人、台湾漢民族、客家、韓国人、日本人、アミ族およびアタルヤ族）、４人の北アメリカ人（シャイアン、アリゾナ出身のピマ族、メキシコ出身のピマ族、マヤ人）ならびに４人の南アメリカ人（ケチュア族、ティクナ族、ロンドニア系スルイ族、カリチアーナ族）を含む。それぞれの集団試料に関係するヒト被験体研究を管理する委員会によって承認されたプロトコールの下で、すべての被験体がインフォームドコンセントに同意した。試料の説明および試料のサイズは、Ａｌｌｅｌｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ａｌｆｒｅｄ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ）で集団名を検索することによって、および過去の刊行物（Ｃｈｅｕｎｇ ＫＨら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０００；２８（１）：３６１−３）で見ることができる。樹立および／または生育されたリンパ芽球様細胞株から、ＤＮＡ試料を抽出した。形質転換、細胞培養およびＤＮＡ増幅の方法は、記載されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＭＡ およびＧｕｓｅｌｌａ ＪＦ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ １９８４；２０（１１）：８５６−８）。すべての志願者は明らかに健康であり、そのほかの点では、すべての関連する施設内倫理委員会によって承認された手続きの下で適切なインフォームドコンセントを得た後、成人正常な被験体男性試料または成人正常な被験体女性試料を採取した。
【０１８７】
３’ＵＴＲ配列の進化
ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、凍結されたＦＦＰＥ腫瘍乳房組織からＤＮＡを単離し、そしてＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、血液および唾液からＤＮＡを単離した。ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ならびにこの配列に特異的なＤＮＡプライマー：ＢＲＣＡ１：５’−ＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号２２）および５’−ＧＡＧＡＡＡＧＴＣＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡ−３’（配列番号２３）を使用して、ＢＲＣＡ１の３’ＵＴＲ全体を増幅した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ １６１（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ産物を精製し、ネスト化プライマー：ＢＲＣＡ１：５’−ＣＣＴＡＣＣＴＧＡＴＡＣＣＣＣＡＧＡＴＣ−３’（配列番号２４）および５’−ＧＧＣＣＴＡＡＧＴＣＴＣＡＡＧＡＡＣＡＧＴＣ−３’（配列番号２５）を使用して配列決定した。
【０１８８】
マーカータイピング
ハイスループット遺伝子型決定に関して、各ＳＮＰ位置にある対立遺伝子を同定するために、ＴａｑＭａｎ ５’ヌクレアーゼアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を特別に設計した。非ヒト霊長類−３匹のボノボ（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ）、３匹のチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、３匹のテナガザル（Ｈｙｌｏｂａｔｅｓ）、３匹のゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ）および３匹のオランウータン（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ）に関するゲノムＤＮＡを遺伝子型決定するための同じＴａｑＭａｎアッセイを使用することによって、本発明者らは、採用した８個のＳＮＰの祖先状態を決定した。
【０１８９】
統計
関連性およびフィッシャー直接確率検定のカイ二乗検定を使用して、集団全体の遺伝子型頻度を比較した。関連性のカイ二乗検定を使用して、ハプロタイプデータの有意性を評価した。ｐ＞０．０５の場合、ｐ値は統計的に有意であると考えた。各民族集団内の対照の間で、ハプロタイプ内のすべての部位は、ハーディワインベルグ平衡にしたがっている。本発明者らは、ＰＨＡＳＥ（集団データに基づく、ハプロタイプ再構成および組換え率推定のためのソフトウェア）を使用して、部分母集団の情報なしで、患者および対照個体（３０、３１）のハプロタイプを推測した。ＰＨＡＳＥソフトウェアは、ハプロタイプ配置の確実性の評価を提供する。ＢＲＣＡ１遺伝子の非常に単純なハプロタイプ構造を考慮すると、ＰＨＡＳＥアルゴリズムは極めて正確であった。評価する必要がなかったハプロタイプの中で、ＰＨＡＳＥは、９９％の確実性で本発明者らの集団を評価した。
【０１９０】
結果
ＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲにおけるＳＮＰの同定
多数の既知のＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲ ＳＮＰがある（表５）。乳癌患者において、これらの既知の多型頻度を同定するために、および／または、新規ＳＮＰを同定するために、本発明者らは、３個の既知の乳癌サブタイプを持つ乳癌患者（ＴＮ＝７、ＨＥＲ２＋＝１８およびＥＲ／ＰＲ＋／ＨＥＲ２−＝１４）において、ＢＲＣＡ１の３’ＵＴＲ全体を配列決定した。これらの患者におけるＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲ全体の最初のスクリーニングによって、過去に報告された３個の機能的なＳＮＰ：ｒｓ１２５１６、ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ３０９２９９５だけに存在する変異を同定した（表５）。加えて、本発明者らは、ＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲにおいて、新規ＳＮＰを同定した。ＢＲＣＡ１における新規ＳＮＰは、６８２４Ｇ／Ａまたは５７１１＋１１１３Ｇ／Ａである。これまでに見られなかったＡ対立遺伝子に関して、６１歳のアフリカ系アメリカ人ＨＥＲ２＋患者において、このＳＮＰをヘテロ接合として同定した。集団全体に存在するこれらの変異体の頻度をよりよく評価するために、本発明者らは、４６個の世界的な集団を構成する２，２５０人の非癌性個体において、集団特異的な遺伝子型決定を実施した（図４Ａ）。ｒｓ１２５１６、ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ３０９２９９５の同定した３個のＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲ ＳＮＰは、集団において強い連鎖不均衡にあり、民族性によって異なる。
【０１９１】
【表５】

コード鎖上に存在する既知のＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲ ＳＮＰのリスト。多型の位置は、ｄｂＳＮＰビルド１３０に基づいている。
＊研究した３個のＳＮＰ。
†これらはポリＡの変異体である。本発明者らは、それらをＳＴＲＰまたは短い縦列反復配列の多型として分類した。チンパンジー、オランウータン（ｏｒａｎｇａｔａｎ）およびヒトの参照配列に基づくと、ＳＴＲＰは複合体である：Ａ_{１６−１９}Ｇ_２Ａ_３−４。
【０１９２】
【表６】

３９人の乳癌患者からＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲ全体を配列決定した。認められた遺伝子型は、Ｇ／Ｇ−Ｃ／Ｃ−Ｃ／Ｃ、Ａ／Ｇ−Ａ／Ｃ−Ｃ／Ｃ、Ａ／Ａ−Ａ／Ａ−Ｃ／ＣおよびＧ／Ｇ−Ａ／Ｃ−Ｇ／Ｃであった。位置は、それぞれｒｓ１２５１６、ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ３０９２９９５である。対立遺伝子Ａは、位置ｒｓ１２５１６およびｒｓ８１７６３１８における派生対立遺伝子である。対立遺伝子Ｇは、ｒｓ３０９２９９５における派生対立遺伝子である。
【０１９３】
対照集団における民族性ごとに同定した３’ＵＴＲ ＳＮＰにおいて重要な変異が認められたので、続いて、異なる民族性の乳癌患者におけるこれらのＳＮＰの変異を決定した。１３０人の乳癌ヨーロッパ系アメリカ人患者および３８人の乳癌アフリカ系アメリカ人患者において、これらのＳＮＰを遺伝子型決定したところ、これらの群全体に変異を認められた（図４Ｂ）。これらのＳＮＰと腫瘍リスクとの関連性を決定するために、乳癌患者および民族性対応対照の間で、これらのＳＮＰの頻度を比較した。ｒｓ８１７６３１８においてホモ接合型（Ａ／Ａ）である珍しい変異体が、アフリカ系アメリカ人に関する乳癌と非常に関連する２０７であることを決定した［オッズ比（ＯＲ）、９．４８；９５％信頼区間（ＣＩ）、１．０１−８８．８０；ｐ＝０．０４］。乳癌のヨーロッパ系アメリカ人とｒｓ８１７６３１８ ＳＮＰとの間に、腫瘍関連性は認められなかった（表７）。
【０１９４】
【表７】

無条件ロジスティック回帰モデルにおいて、乳癌（ＢＣ）サブタイプならびに人種［ヨーロッパ系アメリカ人（ＥＡ）およびアフリカ系アメリカ人（ＡＡ）］による、オッズ比（ＯＲ）および９５％信頼区間（ＣＩ）を調整した。太字の値は、統計的な腫瘍関連性を示す。丸括弧内の数字は、各群の患者数を指す（第一列目）。
【０１９５】
ＢＲＣＡ１機能不全は乳癌サブタイプの間で異なるので、次いで、民族性および乳癌サブタイプごとに、３個の３’ＵＴＲ ＳＮＰを評価した（図１４）。ｒｓ８１７６３１８のホモ接合変異型が、アフリカ系アメリカ人女性の間で、ＴＮ乳癌のリスクと非常に関連することを決定した［ＯＲ、１２．１９；９５％ＣＩ、１．２９−１１５．２１、ｐ＝０．０２）。あらゆる他のＳＮＰに関して、または、ＥＲ／ＰＲ＋もしくはＨＥＲ２＋乳癌サブタイプに関して、関連性は認められなかった（表１０）。
【０１９６】
【表１０】

無条件ロジスティック回帰モデルにおいて、乳癌（ＢＣ）サブタイプならびに人種［ヨーロッパ系アメリカ人（ＥＡ）およびアフリカ系アメリカ人（ＡＡ）］による、オッズ比（ＯＲ）および９５％信頼区間（ＣＩ）を調整した。太字の値は、統計的な腫瘍関連性を示す。丸括弧内の数字は、各群の患者数を指す（第一列目）。ここで、ＮＡは、腫瘍サブタイプにおける遺伝型の表示がなかった場合に使用され、これは、群を構成する患者数が少ない結果である可能性が高い。
【０１９７】
ＢＲＣＡ１ハプロタイプ進化および頻度
ＢＲＣＡ１領域をよりよく評価するために、本発明者らは、本発明者らの乳癌患者において本発明者らが同定した３個の３’ＵＴＲ ＳＮＰを囲んでいる過去に報告された５個のさらなるタグ付きＳＮＰ（Ｋｉｄｄ ＪＲら、（ａｂｓｔｒａｃｔ／ｐｒｏｇｒａｍ＃５８）．ｔｈｅ ５３ｒｄ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ４−８ｔｈ，２００３，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ２００３に出席）を加えた。合計８個のＳＮＰは、２６７ ｋｂに及ぶ（表２）。この領域全体は高いＬＤを有し、本発明者らのハプロタイプを構成する８個のＳＮＰすべての間のヘテロ接合性は、一般的に高い（３０から５０％）（ｈｔｔｐ：／／ａｌｆｒｅｄ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ）（Ｃｈｅｕｎｇ ＫＨら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０００；２８（１）：３６１−３；Ｋｉｄｄ ＪＲら、（ａｂｓｔｒａｃｔ／ｐｒｏｇｒａｍ ＃５８）．ｔｈｅ ５３ｒｄ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ４−８ｔｈ，２００３，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ２００３に出席）。
【０１９８】
これらの８個のＳＮＰを使用して、世界ハプロタイプ頻度を作製した（図８）。認められた一般的なハプロタイプのすべては、祖先ハプロタイプへの変異の蓄積によって説明することができる（図７）。直接的に認められたハプロタイプの大部分は、順序付けることができ、１個の派生ヌクレオチド変化によって相違している；ある事例では、２個の変化が必要とされ、別の事例では、組換えが認められる。合計で、これらは３本の枝をつくり、それぞれは、祖先ハプロタイプに由来する単一のヌクレオチド変化に端を発する。注目すべきことに、（３から５個のハプロタイプを持つ）アフリカ以外に対して、（６から９個の示されるハプロタイプを持つ）アフリカにおいて、ハプロタイプ多様性がかなり高いことが見出された。祖先ハプロタイプＧＧＣＣＡＣＴＡ（配列番号８）は、ほとんどアフリカにおいてのみ見られる。世界的に見られる最も一般的なハプロタイプであるＡＧＣＣＡＴＴＡ（配列番号２）は、アフリカ以外のすべての集団において非常に多い。
【０１９９】
乳癌患者におけるＢＲＣＡ１ハプロタイプ
乳癌患者におけるこれらの８個のＳＮＰからなるハプロタイプをさらに研究して、非癌性患者と乳癌患者との間でこれらのＢＲＣＡ１ハプロタイプに違いがあったかどうかを決定した。本発明者らの乳癌集団では極めて豊富だが（４２／４４２すべての評価した乳癌染色体）、世界対照集団では非常に珍しい５個のハプロタイプ（ＧＧＣＣＧＣＴＡ［配列番号９、＃１］、ＧＧＣＣＧＣＴＧ［配列番号１０、＃２］、ＧＧＡＣＧＣＴＡ［配列番号６、＃３］、ＧＧＡＣＧＣＴＧ［配列番号２１、＃４］およびＧＡＡＣＧＴＴＧ［配列番号２６、＃５］）を同定した。４５００個の非癌性染色体の世界試料では、ＧＧＡＣＧＣＴＡ（配列番号６）ハプロタイプ（＃３）が３番染色体上で認められ、ＧＧＡＣＧＣＴＧ（配列番号２１）ハプロタイプ（＃４）が２番染色体上に存在したが、ＧＧＣＣＧＣＴＡ（配列番号９）（＃１）、ＧＧＣＣＧＣＴＧ（配列番号１０）（＃２）およびＧＡＡＣＧＴＴＧ（配列番号２６）（＃５）ハプロタイプは見られなかった（０．１％未満）。これは、非癌性対照におけるこれらのハプロタイプに関する０．１％の全体的な世界頻度対乳癌患者染色体に関する９．５０％の頻度を示している（ｐ＜０．０００１）（図１６Ａ）。２個のハプロタイプ（それぞれ＃３および＃４）は、ＳＮＰ ｒｓ８１７６３１８を有する３’ＵＴＲ内の派生対立遺伝子Ａによって特徴付けられる。３番目の珍しいハプロタイプ（ＧＡＡＣＧＴＴＧ（配列番号２６）、＃５）は、ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１２５１６という２個の３’ＵＴＲ多型を有する派生対立遺伝子（Ａ）を有する。
【０２００】
研究結果によって、これらのハプロタイプが民族性によって異なっていたことが実証されたので、これらの珍しい乳癌ハプロタイプを適切な民族集団とよりよく比較するために、乳癌患者および対応対照を、民族性ごとにさらに評価した。民族性対応対照は、合計１９４人の個体（エール大学対照の白人のアメリカ人およびアフリカ系アメリカ人の集団を含む、１０２人のアフリカ系アメリカ人ならびに９２人のヨーロッパ系アメリカ人）から構成された。白人のアメリカ人乳癌患者の８．８４％およびアフリカ系アメリカ人乳癌患者の１１．８４％が、珍しいハプロタイプを含んでおり、そしてやはり、これらのハプロタイプは、民族性対応対照においてはめったに見られず、ＧＧＡＣＧＣＴＡ（配列番号６）ハプロタイプ（＃３）だけが、１個のヨーロッパ系アメリカ人対照染色体上に見られることが見出された（０．２６％、１／３８８染色体、ｐ＜０．０００１、図１６Ｂ、表８）。
【０２０１】
【表８−１】

【０２０２】
【表８−２】

５個の珍しいハプロタイプを有する、乳癌患者および対照のリスト。発症年齢および民族性は、可能であれば、リストに記載される。ＮＫ＝情報が利用不可であるか不明である。試料は、正常組織および腫瘍の両方に由来する。
【０２０３】
乳癌サブタイプごとの、乳癌患者におけるＢＲＣＡ１ハプロタイプ
既知のＢＲＣＡ１コード配列突然変異は乳癌サブタイプによって異なるので、次いで、珍しいハプロタイプがどのようにして、乳癌サブタイプの間に分布したかを決定した。珍しいハプロタイプは、ＴＮ、ＥＲ／ＰＲ＋とＨＥＲ２＋サブタイプとの間で著しく異なり、ＴＮサブグループは、これらの珍しいハプロタイプを最も高い割合１４．８５％（３０／２０２染色体、他のものと比較してｐ＝０．０１４）で有し、次いで、ＥＲ／ＰＲ＋乳癌サブタイプでは８．０９％（１１／１３６ ＥＲ／ＰＲ＋染色体）であり、ＨＥＲ２＋サブタイプでは最も低い１％（１／１０４）である（図１７Ａ、表９）。ＧＧＡＣＧＣＴＧ（配列番号２１）ハプロタイプ（＃４）だけが、ＴＮ腫瘍と関連しており、他の腫瘍サブタイプと関連していなかった。次いで、民族性および乳房腫瘍サブタイプの両方で、珍しいハプロタイプを評価した（図１７Ｂ）。２個のハプロタイプ（それぞれ＃２および＃５）は、乳癌ヨーロッパ系アメリカ人に固有であった。興味深いことに、ＴＮサブグループが、残りのハプロタイプの最も高い割合を占めている（９．９％）。残りは、研究したすべての集団において１％未満の頻度を有するすべてのハプロタイプの合計として定義される。これらの知見は、乳癌のＴＮサブタイプが、この領域全体を通じて最大量の変動性を有し、珍しいハプロタイプと最も強く関連していることを示している。
【０２０４】
【表９】

ハプロタイプ頻度のばらつきに関して、民族性対応対照と比較して、ヨーロッパ系およびアフリカ系アメリカ人乳癌患者を評価した。９個の一般的なハプロタイプが示されている。乳癌患者では一般的だが、対照の間では珍しい５個のさらなるハプロタイプもまたリストに記載されている。ゼロではない評価の残りのハプロタイプは合算され、残りとしてリストに記載されている。ｐ＜０．０５であれば、値は、有意であると考えられる。＊この表における「残り」のハプロタイプは、具体的に名付けられていないゼロではないハプロタイプの累積評価を表しており、したがって、単一配列を表していないので、配列識別子を割り当てなかった。
【０２０５】
年齢およびＢＲＣＡ突然変異状態ごとのＢＲＣＡ１ハプロタイプ
年齢ごとに珍しいハプロタイプを評価して、より若い（閉経前の）女性が、閉経後の女性と比較して、これらの珍しいハプロタイプのより高い割合を占めるかどうかを決定した。珍しいハプロタイプは、５２歳未満の乳癌患者においてより多く見られる；しかしながら、この傾向は、統計的に有意ではなかった（図１５）。
【０２０６】
珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプが、ＢＲＣＡ１コード配列突然変異と関連しているかどうかもまた決定したが、本研究で検査した患者に関して、ＢＲＣＡ１突然変異状態は不明であった。したがって、１２９人の非血縁の別の集団
本発明者らの珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプの存在に関して、ＢＲＣＡ１コード領域突然変異がヘテロ接合であるヨーロッパ人の乳癌患者を検査した。ＢＲＣＡ１コード配列突然変異の患者１人だけが、珍しいハプロタイプ（０．８％、ＧＡＡＣＧＴＴＧ（配列番号２６）、＃５）を有していた。残りの４個の珍しいハプロタイプは、この患者の集団において見られず、このことは、これらの珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプは、一般的なＢＲＣＡ１コード配列突然変異の代理マーカーではなく、むしろこれらの珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプは、乳癌に関連するＢＲＣＡ１変異に固有の新規バイオマーカーであるということを示唆している。
【０２０７】
考察
本研究によって、２９９人の乳癌患者が、対照集団では通常見られない５個の珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプを持つことが見出された。これらのハプロタイプは、ＢＲＣＡ１ ３’ＵＴＲ ＳＮＰを含んでおり、その中の１個（ｒｓ８１７６３１８）は、アフリカ系アメリカ人の間で重要な癌関連性を示し（ｐ＝０．０４）、そしてさらに、民族性対応対照と比較すると、アフリカ系アメリカ人の間でトリプルネガティブ乳癌に関するリスクファクターである（ｐ＝０．０２）。これらのハプロタイプは、一般的なＢＲＣＡ１コード領域突然変異と関連していない。これらの知見は、珍しいＢＲＣＡ１ハプロタイプが、乳癌を発症するリスクの増加の新しい遺伝子マーカーの代表的なものであるとともに、ＢＲＣＡ１機能に影響を与え、乳癌リスクの増加をもたらす、ＢＲＣＡ１における非コード配列変異の代表的なものでもあることを明示している。
【０２０８】
これまでに、ＢＲＣＡ１領域におけるハプロタイプ解析を実施して、散在性乳癌との関連性を決定する研究があったが、しかしながら、これらの従来の研究者らは、ほとんど成果がなかった（Ｃｏｘ ＤＧら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；７（２）：Ｒ１７１−５；Ｆｒｅｅｄｍａｎ ＭＬら、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００５；６５（１６）：７５１６−２２）。
【０２０９】
本研究は、ハプロタイプ解析の一部として、ＢＲＣＡ１の３’ＵＴＲ非コード調節領域において珍しい機能的な変異体を含む散在性乳癌の、最初のＢＲＣＡ１ハプロタイプ研究である。３’ＵＴＲ内の変異体が遺伝子発現制御を通じて癌に対する感受性を増加させるという仮説は、急速に、証拠によって裏付けることができるようになってきている（Ｃｈｉｎ ＬＪら、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８；６８（２０）：８５３５−４０；Ｌａｎｄｉ Ｄら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２００８；２９（３）：５７９−８４）。珍しいハプロタイプにおいて、乳癌リスクの増加が、ハプロタイプ内の１個の単一変異体であるかまたは対立遺伝子の組み合わせであるかを、本発明者らは決定することができないが、各ハプロタイプを含む機能的な３’ＵＴＲ変異体と他の変異体の組み合わせが、重要なＢＲＣＡ１機能不全を予測するとの仮説が立てられている。
【０２１０】
本発明者らのハプロタイプ解析において、サブタイプごとに散在性乳癌をさらに分析した。ＢＲＣＡ１突然変異の結果として生じる乳癌は、ＴＮ（５７％）（Ａｔｃｈｌｅｙ ＤＰら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００８；２６（２６）：４２８２−８）およびＥＲ＋乳癌（３４％）（Ｔｕｎｇ Ｎら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；１２（１）：Ｒ１２）と最も高い頻度で関連しており、そして、ＨＥＲ２＋乳癌（約 ３％）（Ｌａｋｈａｎｉ ＳＲら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００２；２０（９）：２３１０−８）においてめったに見られないので、珍しいハプロタイプがＴＮおよびＥＲ＋乳癌において主に存在するという本発明者らの知見は、それらが真のＢＲＣＡ１機能不全に関連しているという本発明者らの仮説を、さらに裏付けている。
【０２１１】
これからの研究は、本発明者らのＢＲＣＡ１ハプロタイプ内の個々のＳＮＰのいくつかに焦点を合わせるであろう。ＢＲＣＡ１シノニマスエクソン突然変異であるタグ付きＳＮＰ ｒｓ１０６０９１５が特に興味深く、これは、５個の珍しいハプロタイプのすべてにおいて、派生対立遺伝子Ｇを伴っている。ｒｓ１０６０９１５は、意義不明の変異体（ＶＵＳ）である。乳癌インフォメーションコア（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｏｒｅ）（ＢＩＣ）は、野生型配列との比較に基づき導かれるｍＲＮＡおよびタンパク質レベルに基づいて、このＶＵＳを、中立または臨床上ほとんど重要ではないと分類している（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｎｈｇｒｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｉｃ／）。このＳＮＰは、高リスクの患者集団において通常見られることから、Ｍｙｒｉａｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，は、それを高リスクの女性と関連付け、それを多型性に分類しているが、本研究とは対照的に、彼らは、乳癌または卵巣癌を発症するリスクの増加のバイオマーカーとしての役割を、このＳＮＰに割り当てていない。具体的には、Ｍｙｒｉａｄは、ｒｓ１０６０９１５が、被験体の乳癌のＴＮサブタイプを発症するリスクの重要な予測因子であることを示していない。
【０２１２】
最近、ＢＲＣＡ１における類似のコード配列ＳＮＰが、ｍｉＲＮＡ結合部位に位置しており、腫瘍感受性に影響を与え得ることが示された（Ｎｉｃｏｌｏｓｏ ＭＳら、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ；７０（７）：２７８９−９８）。ｍｉＲＮＡ結合に影響を与えるエクソンＳＮＰと組み合わせた、ｍｉＲＮＡの崩壊をもたらす３’ＵＴＲ ＳＮＰは、珍しいハプロタイプにおいて乳癌リスクの増加をもたらす１個のメカニズムである。
【０２１３】
乳癌のＴＮサブタイプにおける珍しいハプロタイプの豊富さは、とりわけ特筆すべきである。このサブタイプだけが、対照と比較して、本発明者らの珍しいハプロタイプと統計的に関連しているのではなく（ｐ＜０．０００１）、ＴＮ乳癌もまた、本発明者らの珍しいハプロタイプと関連している最も一般的なサブタイプである。ＴＮ腫瘍はエストロゲン刺激（未経産、肥満、ホルモン補充療法）と関連していないので、ＴＮ乳癌に関するリスクファクターは、乳癌の他の形態とは異なっている。ＴＮとエストロゲン刺激の非関連性は、さらなる遺伝子的原因が存在することを強く示唆している。ＴＮ乳癌は最悪の結果を出すので、乳癌のこのサブタイプを発症するリスクを有する者を同定することが、おそらく最も重要である。
【０２１４】
本発明者らの研究の欠点としては、珍しいハプロタイプを持つ患者が少数であることが挙げられ、このことは、未対応の年齢および人種との潜在的に重要な関連性を妨げているかもしれない。加えて、ＢＲＣＡ１コード領域突然変異に関してヘテロ接合であるヨーロッパ人の乳癌患者の集団は、ほとんどが西ヨーロッパの白人であり、混血ヨーロッパ人の家系はおそらくわずかな割合である。民族的に限られた群は、ＢＲＣＡ１突然変異保有者の間の珍しいハプロタイプの知見を限定するかもしれない。しかしながら、珍しいハプロタイプと乳癌の密接な関連性は、これらの知見を、さらにより強く統計的に重要にする。本研究は、これらの珍しいハプロタイプが、乳癌を発症するリスクの増加の遺伝子マーカーとして使用できるという証拠を提供し、そして、より大きなサンプルサイズで結果を有効なものにするとともに、これらのハプロタイプの生物学的機能およびそれらの乳癌リスクの増加のメカニズムをさらに解明するという今後の活動を支援する。
【０２１５】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明に関連して説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例証することを意図しており、制限することを意図していない。他の形態、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内に含まれる。
【０２１６】
本明細書において参照した特許および科学論文は、当業者が利用できる知識を確立している。本明細書において引用されるすべての米国特許および公開されたまたは未公開の米国特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用された公開されたすべての外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用されるアクセッション番号によって示されるＧｅｎｂｅｎｋおよびＮＣＢＩ提出物は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用される他のすべての公表された参考文献、文書、原稿、および科学論文は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１７】
本発明は、その好ましい実施形態を参照して特に示され、記述されてきたが、形態および詳細に様々な変化を行ってもよく、それらも添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱しないことは、当業者によって理解されるであろう。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を含むＢＲＣＡ１ハプロタイプであって、該ＳＮＰの存在が被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクを増加させる、ＢＲＣＡ１ハプロタイプ。
【請求項２】
前記ＳＮＰのそれぞれが、１つ以上のｍｉＲＮＡの活性を変化させる、請求項１記載のハプロタイプ。
【請求項３】
前記ＳＮＰが、ＢＲＣＡ１遺伝子の非コード領域またはコード領域に位置する、請求項１記載のハプロタイプ。
【請求項４】
前記ＳＮＰが、ＢＲＣＡ１遺伝子の非コード領域またはコード領域に位置する、請求項２記載のハプロタイプ。
【請求項５】
前記ＳＮＰが、ｒａ９９１１６３０、ｒｓｌ２５１６、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ３０９２９９５、ｒｓｌ０６０９１５、ｒｓ７９９９１２、ｒｓ９９０８８０５およびｒｓｌ７５９９９４８からなる群から選択される、請求項１または４記載のハプロタイプ。
【請求項６】
前記ＳＮＰが、ｒｓｌ２５１６、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ３０９２９９５、ｒｓｌ０６０９１５およびｒｓ７９９９１２からなる群から選択される、請求項１記載のハプロタイプ。
【請求項７】
前記ＳＮＰが、ｒｓ８１７６３１８またはｒｓｌ０６０９１５である、請求項１記載のハプロタイプ。
【請求項８】
ｒｓ８１７６３１８およびｒｓｌ０６０９１５を含む、請求項１記載のハプロタイプ。
【請求項９】
前記ＳＮＰの存在が、被験体のトリプルネガティブ（ＴＮ）乳癌を発症するリスクを増加させる、請求項１記載のハプロタイプ。
【請求項１０】
ＧＧＡＣＧＣＴＡ（配列番号６）、ＧＧＣＣＧＣＴＡ（配列番号９）、ＧＧＣＣＧＣＴＧ（配列番号１０）、ＧＧＡＣＧＣＴＧ（配列番号２１）またはＧＡＡＣＧＴＴＧ（配列番号２６）のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のハプロタイプ。
【請求項１１】
乳癌または卵巣癌を発症するリスクの増加を示すＢＲＣＡ１多型シグネチャーであって、一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ８１７６３１８およびｒｓｌ０６０９１５の存在または非存在の決定を含み、これらのＳＮＰの存在が乳癌または卵巣癌を発症するリスクの増加を示す、シグネチャー。
【請求項１２】
ｒｓｌ２５１６、ｒｓ３０９２９９５およびｒｓ７９９９１２からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰの存在または非存在の決定をさらに含む、請求項１１記載のシグネチャー。
【請求項１３】
ｒｓ９９１１６３０、ｒｓ９９０８８０５およびｒｓｌ７５９９９４８からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰの存在または非存在の決定をさらに含む、請求項１１または１２記載のシグネチャー。
【請求項１４】
ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１０６０９１５が、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の結合効力を変化させる、請求項１１記載のシグネチャー。
【請求項１５】
ｒｓｌ２５１６、ｒｓ３０９２９９５、ｒｓ７９９９１２、ｒｓ９９１１６３０、ｒｓ９９０８８０５またはｒｓ１７５９９９４８が、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの結合効力を変化させる、請求項１２または１３記載のシグネチャー。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡがｍｉＲ−７である、請求項１１記載のシグネチャー。
【請求項１７】
１つ以上のマイクロＲＮＡの結合効力を変化させるＢＲＣＡ１遺伝子におけるＳＮＰの存在または非存在の同定をさらに含む、請求項１記載のシグネチャー。
【請求項１８】
前記ＳＮＰが、コード領域または非コード領域内に存在する、請求項１７記載のシグネチャー。
【請求項１９】
前記非コード領域が、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、イントロン、遺伝子間領域、シス調節エレメント、プロモーターエレメント、エンハンサーエレメントまたは５’非翻訳領域（ＵＴＲ）である、請求項１８記載のシグネチャー。
【請求項２０】
前記コード領域がエクソンである、請求項１８記載のシグネチャー。
【請求項２１】
前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１１記載のシグネチャー。
【請求項２２】
ＢＲＣＡ１遺伝子の発現を減少させ、かつ被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクを増加させるＳＮＰを同定する方法であって、該方法は：
（ａ）試験被験体から試料を得る工程；
（ｂ）対照試料を得る工程；
（ｃ）該試験試料由来のＤＮＡ配列内の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位におけるＳＮＰの存在または非存在を決定する工程；および
（ｄ）該ＳＮＰを含む該少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位への少なくとも１つのｍｉＲＮＡの結合効力を、該対照試料由来の対応するＤＮＡ配列における同じｍｉＲＮＡ結合部位への該ｍｉＲＮＡの結合効力と比較して、評価する工程
を含み、ここで、
該対照試料と該試験試料との間の、該対応する結合部位への該少なくとも１つのｍｉＲＮＡの結合効力における統計的に有意な変化の存在が、該ＳＮＰの存在または非存在がｍｉＲＮＡ介在性の防御を阻害するかまたはｍｉＲＮＡ介在性のＢＲＣＡ１遺伝子発現の抑制を増大させることを示し、それによって、被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクもまた増加させるＳＮＰを同定する、方法。
【請求項２３】
ＢＲＣＡ１遺伝子の発現を減少させ、かつ被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクを増加させるＳＮＰを同定する方法であって、該方法は：
（ａ）試験被験体から試料を得る工程；
（ｂ）該試験試料由来のＤＮＡ配列中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位におけるＳＮＰの存在または非存在を決定する工程；および
（ｃ）１つ以上の世界集団における該ＳＮＰの予測保有率に関して、乳癌集団または卵巣癌集団内の該ＳＮＰの保有率を評価する工程
を含み、
該１つ以上の世界集団と比較した、腫瘍試料中の該ＳＮＰの存在または非存在における統計的に有意な増加が、該ＳＮＰが乳癌または卵巣癌を発症するリスクの増加に陽性に関連することを示し、ＢＲＣＡ１の発現を減少させる少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位内の該ＳＮＰの存在または非存在が、該ＳＮＰの存在または非存在がｍｉＲＮＡ介在性の防御を阻害するかまたはｍｉＲＮＡ介在性のＢＲＣＡ１遺伝子発現の抑制を増大させることを示し、それによって、被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクもまた増加させるＳＮＰを同定する、方法。
【請求項２４】
前記試験被験体が、乳癌または卵巣癌と診断されている、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
前記対照試料が、いかなる癌も有するとは診断されていない被験体から得られる、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、実験的に決定されるか、データベースで同定されるか、またはアルゴリズムを使用して予測される、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２７】
前記ＳＮＰの存在または非存在が、実験的に決定されるか、データベースで同定されるか、またはアルゴリズムを使用して予測される、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２８】
前記結合効力が、インビトロまたはエクスビボで評価される、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
前記乳癌が、散発性または遺伝性である、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項３０】
前記卵巣癌が、散発性または遺伝性である、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項３１】
乳癌または卵巣癌を発症するリスクを有する被験体を同定する方法であって、該方法は：
（ａ）試験被験体からＤＮＡ試料を得る工程；および
（ｂ）該試料由来の少なくとも１つのＤＮＡ配列において、ｒｓ１２５１６、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ３０９２９９５およびｒｓ７９９９１２からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰの存在を決定する工程
を含み、ここで、
該少なくとも１つのＤＮＡ配列における該少なくとも１つのＳＮＰの存在が、該被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクを、正常な被験体と比較して１０倍増加させる、方法。
【請求項３２】
ｒｓ１０６０９１５の存在を決定する工程をさらに含み、前記少なくとも１つのＤＮＡ配列におけるｒｓ１０６０９１５ならびにｒｓｌ２５１６、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ３０９２９９５およびｒｓ７９９９１２からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰの合わせた存在が、前記被験体の乳癌または卵巣癌を発症するリスクを、正常な被験体と比較して１００倍増加させる、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
正常な被験体が、ｒｓｌ２５１６、ｒｓ８１７６３１８、ｒｓ３０９２９９５、ｒｓ７９９９１２またはｒｓｌ０６０９１５を保有しない被験体である、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記乳癌が、散発性または遺伝性である、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
前記卵巣癌が、散発性または遺伝性である、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
トリプルネガティブ（ＴＮ）乳癌を発症するリスクを有する被験体を同定する方法であって、該方法は：
（ａ）試験被験体からＤＮＡ試料を得る工程；および
（ｂ）該試料由来の少なくとも１つのＤＮＡ配列において、ｒｓ８１７６３１８またはｒｓ１０６０９１５の存在を決定する工程
を含み、ここで、
該少なくとも１つのＤＮＡ配列におけるｒｓ８１７６３１８またはｒｓ１０６０９１５の存在が、該被験体のＴＮ乳癌を発症するリスクを、正常な被験体と比較して増加させる、方法。
【請求項３７】
ｒｓ８１７６３１８およびｒｓ１０６０９１５の存在を決定する工程を含み、前記少なくとも１つのＤＮＡ配列におけるｒｓ１０６０９１５およびｒｓ８１７６３１８の合わせた存在が、前記被験体のＴＮ乳癌を発症するリスクをさらに増加させる、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記乳癌が、散発性または遺伝性である、請求項３６または３７記載の方法。
【請求項３９】
前記卵巣癌が、散発性または遺伝性である、請求項３６または３７記載の方法。
【請求項４０】
前記試験被験体がアフリカ系アメリカ人である、請求項３６または３７記載の方法。

【図１】

【図４Ｂ】

【図５】

【図６】

【図７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２−１】

【図２−２】

【図３−１】

【図３−２】

【図４Ａ】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７】

【公表番号】特表２０１２−５３１２１０（Ｐ２０１２−５３１２１０Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１７８０３（Ｐ２０１２−５１７８０３）
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４０１０５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１５１８４１
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５９３１５２７２０）
【氏名又は名称原語表記】Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【Ｆターム（参考）】