本開示は、ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドの組換え生成を増加させる化合物およびその方法、ならびに該組換え化合物を利用する方法に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣＡＳＢ７４３９構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類のＡｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅ相同遺伝子は、ショウジョウバエＡｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅ複合体の保存された哺乳類同族である。該Ａｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅ相同遺伝子は、発達に不可欠な系列特異的転写因子として機能する基本的なヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨまたはＨＬＨ）遺伝子ファミリーのメンバーである。この遺伝子ファミリーの一マウスメンバーであるＭＡＳＨ２は、胎盤の発達に不可欠であるが、胚本体の発達にとっては重要でない。ＭＡＳＨ２遺伝子のヒト相同分子種であるＨＡＳＨ２は、Ａｌｄｅｒｓらによって１９９７年に（著者らによって「ＡＳＣ１２」と命名された）クローン化された。Ａｌｄｅｒｓら（１９９７） Ｈｕｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． ６：８５９−８６７。
【０００３】
国際公開第ＷＯ０１／６２７７８号に記述されるように、ＨＡＳＨ２転写物（該国際公開でＣＡＳＢ７４３９と名付けられた）は、隣接する正常な結腸および試験された他の正常組織と比較すると、結腸直腸腫瘍において過剰発現することを複数の発現研究が明らかにした。この遺伝子は、Ｉ〜ＩＶ期の腺癌の患者において過剰発現する。したがって、たとえば抗原特異的癌免疫療法（ＡＳＣＩ）として組換えＣＡＳＢ７４３９を用いることによって、患者の癌を寛解させるための免疫療法アプローチにおいて有用な癌抗原として、このタンパク質を考慮することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／６２７７８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｌｄｅｒｓら（１９９７） Ｈｕｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． ６：８５９−８６７。
【発明の概要】
【０００６】
ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドの組換え生成を増加させる化合物および方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド、ならびにかかる改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドを含むタンパク質構築物が提供される。前述の改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドは、ＣＡＳＢ７４３９の生成の増強のための少なくとも１つの改変を含む。出願人らは、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドと、本明細書に記述する改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドなどを含むタンパク質構築物とをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子類も開示する。特定の態様では、出願人らは、それらをコードするアミノ酸（ａａ）配列およびヌクレオチド配列（ＤＮＡ）を有するタンパク質構築物を以下の通り開示する：
・ＬＶＬ０５５［配列番号：１（ａａ）：配列番号：２（ＤＮＡ）］；
・ＬＶＬ１１１［配列番号：３（ａａ）：配列番号：４（ＤＮＡ）｝；
・ＬＶＬ１３７［配列番号：５（ａａ）：配列番号：６（ＤＮＡ）］；
・ＬＶＬ１４１［配列番号：７（ａａ）：配列番号：８（ＤＮＡ）］；
・ＬＶＬ１４４［配列番号：９（ａａ）：配列番号：１０（ＤＮＡ）］；および
・ＬＶＬ１６８［配列番号：１１（ａａ）：配列番号：１２（ＤＮＡ）｝。
【０００７】
本明細書に記述するタンパク質構築物の生成のための核酸分子類を活用する方法およびプロセスも開示される。
【０００８】
出願人らは、免疫原性組成物も開示する。これらの組成物は、本明細書に記述する改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたは構築物のうちの１つまたは複数と、医薬的に許容される担体または賦形剤とを含み、該担体または賦形剤は、任意に緩衝剤を含み得る。
【０００９】
一部の実施形態では、結腸直腸癌を治療するための薬物の調製において、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたは本明細書に記述するタンパク質構築物（またはそれらをコードする核酸分子）の使用が開示される。一部の実施形態では、治療、特に結腸直腸癌治療において使用するための本明細書に開示するタンパク質構築物が開示される。一部の実施形態では、結腸直腸癌の患者においてＣＡＳＢ７４３９に対する免疫応答を誘発する方法が開示され、該方法は以下を含む：（ａ）結腸直腸癌の患者を選択すること、および（ｂ）本明細書に記述する改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたは構築物と、医薬的に許容される担体または賦形剤とを含み、該担体または賦形剤が任意に緩衝剤を含み得る、有効量の免疫原性組成物を該患者に投与すること。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドの種々の領域、具体的にはＤＮＡ特異的（ＤＮＡ結合）ドメイン、ｂＨＬＨドメイン、およびプロリンリッチ領域を表す概略図を示す。詳細は実施例２を参照されたい。模式図は、以下の領域についても示している：核標的領域（灰色の矢印）；αヘリックス領域（灰色の円柱）；コイルドコイル領域（黒の円柱）；天然変性領域（黒の矢印）；および低複雑性領域（灰色のボックス）。
【図２】本発明の、完全ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドと並んだＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドの種々のトランケート（黒の矢印）を表す概略図を示す。詳細は実施例４を参照されたい。
【図３】本発明の、プロリンリッチ領域と、特定されかつ予測されるエピトープの近似の位置を示しているＣＡＳＢ７４３９の概略図を示す。種々の実施形態は、プロリンリッチ領域内のアミノ酸を一部または全部を除去することによる改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドを含む。かかる改変型ＣＡＳＢ７４３９は、ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド内にエピトープの大部分を保持している。
【図４】非改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド（配列番号１３）と、ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドへの２つの可能な改変によって生ずるポリペプチド配列との間の配列を示す。すなわち、第１の改変では２１の連続するアミノ酸残基（１３３〜１５３をすべて含んだ）を除去し、第２の改変では２１の連続するアミノ酸残基（１３１〜１５１をすべて含んだ）を除去する。さらに、２１の連続するアミノ酸残基（１３２〜１５２をすべて含んだ）を除去する、ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドへの第３の改変が予測される。本図で示すように、除去された領域内で、もたらされた改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド配列（丸で囲んだ挿入図）は、３通りの改変すべてに対して同じである。これは、配列番号１３の１３１〜１３２および１５２〜１５３の位置でＲＧアミノ酸残基が繰り返されているからである。
【図５】本発明の実施例６のタンパク質構築物間のアミノ酸配列の配列比較を示す。ＣＡＳＢ３７４９＝ＨＡＳＨ２アミノ酸配列（配列番号１３）；ＬＶＬ０８８（配列番号２７）；ＬＶＬ１１１（配列番号３）；ＬＶＬ１３７（配列番号５）；ＬＶＬ１３８（配列番号３３）；ＬＶＬ１６８（配列番号１１）。
【図６】本発明の、ＨＡＳＨ２（ＣＡＳＢ７４３９）アミノ酸配列（配列番号１３）と、以下のタンパク質構築物との間の配列比較を示す：ＬＶＬ１６８（配列番号１１）；ｐＤ１／３（配列番号３９）；およびＬＶＬ１４４（配列番号９）。
【図７】正常（１２）組織および結腸直腸癌（８３）組織におけるＣＡＳＢ７４３９のｍＲＮＡ発現のリアルタイムｑＰＣＲ解析を示す。実施例９を参照されたい。
【図８】種々のヒト結腸直腸癌（ＣＲＣ）試料におけるＣＡＳＢ７４３９のｍＲＮＡと、タンパク質との発現の対応を示す。黒丸は、結腸癌試料におけるＣＡＳＢ７４３９のｍＲＮＡ発現を表すが、○（白丸）は、正常な隣接組織におけるＣＡＳＢ７４３９のｍＲＮＡ発現を表す。免疫蛍光法によって検出されたＣＡＳＢ７４３９タンパク質の対応するレベルを、上記各試料（−発現せず、＋／−非常に低い発現、＋低い発現、＋＋強い発現および＋＋＋非常に強い発現）で示す。ＣＲＣ：原発腫瘍、ＭＥＴＳ：転移、ＮＡＴ：正常な隣接組織。粘液性癌である試料２２４４０および２４７６２を除き、すべての試料は結腸腺癌である。実施例９を参照されたい。
【図９】種々のＣＡＳＢ７４３９構築物による免疫化の後に、脾細胞の再刺激のために用いたＣＡＳＢ７４３９タンパク質配列全体を覆うペプチドのバンクをこの表に記載する。実施例１０を参照されたい。
【図１０】Ｔ細胞免疫原性の検討のために用いたＣＡＳＢ７４３９ペプチドマトリックスを示す。実施例１０を参照されたい。
【図１１Ａ】ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（プール、マトリックスアプローチ）による再刺激に続いて、ＬＶＬ１１１＋ＡＳ０１Ｂによって免疫された近交系マウスの４系統（Ｃ５７ＢＬ６、ＢＡＬＢＣ、ＣＢ６Ｆ１、およびＣ３Ｈ）におけるパーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）ＣＤ４Ｔ細胞として表したＣＤ４応答を示す。実施例１０、近交系マウス多系統の比較実験を参照されたい。
【図１１Ｂ】ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（プール、マトリックスアプローチ）による再刺激に続いて、ＬＶＬ１１１＋ＡＳ０１Ｂによって免疫された近交系マウスの４系統（Ｃ５７ＢＬ６、ＢＡＬＢＣ、ＣＢ６Ｆ１、およびＣ３Ｈ）におけるパーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）ＣＤ４Ｔ細胞として表したＣＤ４応答を示す。実施例１０、近交系マウス多系統の比較実験を参照されたい。
【図１１Ｃ】ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（プール、マトリックスアプローチ）による再刺激に続いて、ＬＶＬ１１１＋ＡＳ０１Ｂによって免疫された近交系マウスの４系統（Ｃ５７ＢＬ６、ＢＡＬＢＣ、ＣＢ６Ｆ１、およびＣ３Ｈ）におけるパーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）ＣＤ４Ｔ細胞として表したＣＤ４応答を示す。実施例１０、近交系マウス多系統の比較実験を参照されたい。
【図１１Ｄ】ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（プール、マトリックスアプローチ）による再刺激に続いて、ＬＶＬ１１１＋ＡＳ０１Ｂによって免疫された近交系マウスの４系統（Ｃ５７ＢＬ６、ＢＡＬＢＣ、ＣＢ６Ｆ１、およびＣ３Ｈ）におけるパーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）ＣＤ４Ｔ細胞として表したＣＤ４応答を示す。実施例１０、近交系マウス多系統の比較実験を参照されたい。
【図１２Ａ】ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（プール、マトリックスアプローチ）による再刺激に続いて、ＬＶＬ１１１＋ＡＳ１５によって免疫された近交系マウスの４系統におけるパーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）ＣＤ４Ｔ細胞として表したＣＤ４応答を示す。実施例１０、近交系マウス多系統の比較実験を参照されたい。
【図１２Ｂ】ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（プール、マトリックスアプローチ）による再刺激に続いて、ＬＶＬ１１１＋ＡＳ１５によって免疫された近交系マウスの４系統におけるパーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）ＣＤ４Ｔ細胞として表したＣＤ４応答を示す。実施例１０、近交系マウス多系統の比較実験を参照されたい。
【図１２Ｃ】ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（プール、マトリックスアプローチ）による再刺激に続いて、ＬＶＬ１１１＋ＡＳ１５によって免疫された近交系マウスの４系統におけるパーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）ＣＤ４Ｔ細胞として表したＣＤ４応答を示す。実施例１０、近交系マウス多系統の比較実験を参照されたい。
【図１２Ｄ】ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（プール、マトリックスアプローチ）による再刺激に続いて、ＬＶＬ１１１＋ＡＳ１５によって免疫された近交系マウスの４系統におけるパーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）ＣＤ４Ｔ細胞として表したＣＤ４応答を示す。実施例１０、近交系マウス多系統の比較実験を参照されたい。
【図１３】前節に記述した近交系マウス４系統におけるＣＤ４免疫原性ＣＡＳＢ７４３９ペプチドの同定を示す。薄い灰色＝０．２〜０．４％ダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）ＣＤ４Ｔ細胞；濃い灰色≧０．５％ダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）ＣＤ４Ｔ細胞。実施例１０、近交系マウス多系統の比較実験を参照されたい。
【図１４】非近交系ＣＤ１マウスにおけるＣＤ４免疫原性ＣＡＳＢ７４３９ペプチドの同定（ＡＳ０１Ｂ、上段パネル；ＡＳ１５、下段パネル）を示す。薄い灰色＝０．２〜０．４％ダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）ＣＤ４Ｔ細胞；濃い灰色≧０．５％ダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）ＣＤ４Ｔ細胞。実施例１０、マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９免疫原性：非近交系マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９Ｔ細胞免疫原性を参照されたい。
【図１５Ａ】ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（免疫優性ペプチドのプール）による再刺激に続いて、ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８、またはＬＶＬ１４４によって免疫されたＣＤ１非近交系マウスそれぞれにおいてパーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）として表したＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞応答を示す。実施例１０、非近交系マウスにおけるＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８、およびＬＶＬ１４４の研究を参照されたい。
【図１５Ｂ】ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（免疫優性ペプチドのプール）による再刺激に続いて、ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８、またはＬＶＬ１４４によって免疫されたＣＤ１非近交系マウスそれぞれにおいてパーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）として表したＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞応答を示す。実施例１０、非近交系マウスにおけるＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８、およびＬＶＬ１４４の研究を参照されたい。
【図１６】ＣＤ４−Ｔ細胞応答（ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（７ペプチド／プール＋ペプチド２４（配列番号７６）からなる７プール）による再刺激に続いて、ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１６８（配列番号１１）またはＬＶＬ１４４（配列番号９）のいずれかによって免疫されたＨＬＡ Ａ２．１／ＤＲ−１トランスジェニックマウスから単離し、プールした末梢血白血球（ＰＢＬ）におけるパーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）として表した）。
【図１７】ＣＤ８−Ｔ細胞応答（ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（７ペプチド＋ペプチド２４（配列番号７６）からなる７プール）による再刺激に続いて、ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１６８（配列番号１１）またはＬＶＬ１４４（配列番号９）のいずれかによって免疫されたＨＬＡ Ａ２．１／ＤＲ−１トランスジェニックマウスから単離し、プールしたＰＢＬにおけるパーセントダブルポジティブ（ＴＦＮ／ＴＮＦ）として表した）。
【図１８】ＣＤ４−Ｔ細胞応答（ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（７ペプチド＋ペプチド２４（配列番号７６）からなる７プール）による再刺激に続いて、ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１６８（配列番号１１）またはＬＶＬ１４４（配列番号９）のいずれかによって免疫されたＨＬＡ Ａ２．１／ＤＲ−１トランスジェニックマウスから単離した脾細胞におけるパーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）として表した）。
【図１９】ＣＤ８−Ｔ細胞応答（ＣＡＳＢ７４３９重複ペプチド（７ペプチド＋ペプチド２４（配列番号７６）からなる７プール）による再刺激に続いて、ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１６８（配列番号１１）またはＬＶＬ１４４（配列番号９）のいずれかによって免疫されたＨＬＡ Ａ２．１／ＤＲ−１トランスジェニックマウスから単離した脾細胞におけるパーセントダブルポジティブ（ＴＦＮ／ＴＮＦ）として表した）。
【図２０Ａ】ＣＢ６Ｆ１近交系マウスにおいてＬＶＬ１１１＋ＡＳ０１ＢまたはＬＶＬ１１１＋ＡＳ１５による免疫化後に誘発されたＣＡＳＢ７４３９特異的抗体応答（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）についての経時的解析を示す。実施例１０、マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９の免疫原性：ＣＡＳＢ７４３９媒介体液性応答を参照されたい。
【図２０Ｂ】ＣＢ６Ｆ１近交系マウスにおいてＬＶＬ１１１＋ＡＳ０１ＢまたはＬＶＬ１１１＋ＡＳ１５による免疫化後に誘発されたＣＡＳＢ７４３９特異的抗体応答（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）についての経時的解析を示す。実施例１０、マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９の免疫原性：ＣＡＳＢ７４３９媒介体液性応答を参照されたい。
【図２０Ｃ】ＣＢ６Ｆ１近交系マウスにおいてＬＶＬ１１１＋ＡＳ０１ＢまたはＬＶＬ１１１＋ＡＳ１５による免疫化後に誘発されたＣＡＳＢ７４３９特異的抗体応答（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）についての経時的解析を示す。実施例１０、マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９の免疫原性：ＣＡＳＢ７４３９媒介体液性応答を参照されたい。
【図２０Ｄ】ＣＢ６Ｆ１近交系マウスにおいてＬＶＬ１１１＋ＡＳ０１ＢまたはＬＶＬ１１１＋ＡＳ１５による免疫化後に誘発されたＣＡＳＢ７４３９特異的抗体応答（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）についての経時的解析を示す。実施例１０、マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９の免疫原性：ＣＡＳＢ７４３９媒介体液性応答を参照されたい。
【図２１Ａ】ＡＳ１５アジュバントとともに製剤化されたＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８、もしくはＬＶＬ１４４による、またはＡＳ１５アジュバント単独による免疫化後の、近交系ＣＢ６Ｆ１マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９特異的体液性応答（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）を示す。実施例１０、マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９の免疫原性：ＣＡＳＢ７４３９媒介体液性応答を参照されたい。
【図２１Ｂ】ＡＳ１５アジュバントとともに製剤化されたＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８、もしくはＬＶＬ１４４による、またはＡＳ１５アジュバント単独による免疫化後の、近交系ＣＢ６Ｆ１マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９特異的体液性応答（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）を示す。実施例１０、マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９の免疫原性：ＣＡＳＢ７４３９媒介体液性応答を参照されたい。
【図２２】ＡＳ１５アジュバントとともに製剤化されたＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８、もしくはＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５アジュバント単独によって免疫されたＣＤ１非近交系マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９特異的体液性応答（ＩｇＧ力価）を示す。実施例１０、ＣＤ１マウスの研究を参照されたい。
【図２３】ＡＳ０１Ｂ（上段）またはＡＳ１５(下段)とともに製剤化されたＬＶＬ１１１によって免疫されたＣＢ６Ｆ１マウスにおけるＴＣ１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４腫瘍移植片を示す。実施例１１、研究＃１．１を参照されたい。上段のパネルでは、グラフ上の曲線の上から下への順に、「緩衝液」、ＬＶＬ１１１（１０μｇ）、ＬＶＬ１１１（１０μｇ）＋ＡＳ０１Ｂ、およびＬＶＬ１１１（１μｇ）＋ＡＳ０１Ｂを示す。下段パネルでは、一番下の曲線は、ＬＶＬ１１１（１０μｇ）＋ＡＳ１５を示す。
【図２４】実施例１１、研究＃１．２からの生存曲線を、上段、中央、および下段のパネルに示す。ＴＦ：無腫瘍。（上段）緩衝生理食塩水、アジュバントを含まないＬＶＬ１１１、またはアジュバント単独（ＡＳ０１もしくはＡＳ１５）によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＳＢ７４３９ ＃１４細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１１１によって免疫された群の最後の生存マウスが最初に死亡し、続いてＡＳ０１Ｂ群の最後の生存マウス、ＡＳ１５群の最後の生存マウス、および緩衝液群の最後の生存マウスが死亡した。(中央)ＡＳ１５単独で、またはＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１１１の表示した用量によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＳＢ７４３９ ＃１４細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＡＳ１５群の最後の生存マウスが最初に死亡した。他の群のうち、３０μｇ群の生存マウスが最も少なく、１μｇ群がそれに続き、次いで最も生存マウスが多かった１０μｇ群が続いた。（下段）ＡＳ０１Ｂ単独で、またはＡＳ０１Ｂとともに製剤化されたＬＶＬ１１１の表示した用量によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＳＢ７４３９ ＃１４細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。このパネルでは、１０μｇ群とＡＳ０１Ｂ群の最後の生存マウスが同じ日に死亡したことを示す。１μｇ群と３０μｇ群は、最終日において、生存率が同じであった。
【図２５】実施例１１、研究＃１．３の生存曲線を示す。ＴＦ：無腫瘍。（上段）ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１４４、もしくはＬＶＬ１６８で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。（下段）ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１４４、もしくはＬＶＬ１６８で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＭＣ３８／ＣＡＢＳ７４３９＃３５細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。
【図２６】実施例１１、研究＃１．４の生存曲線を示す。ＴＦ：無腫瘍。（上段）ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１４４もしくはＬＶＬ１６８で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１４４によって免疫された群は、生存率がわずかに大きかった。（中央）ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１４４もしくはＬＶＬ１６８で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１４４を接種されたマウスは、生存率がわずかに高かった。（下段）ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１４４もしくはＬＶＬ１６８で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＭＣ３８／ＣＡＢＳ７４３９＃３５細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１４４を接種されたマウスで、生存したマウスはいなかった。
【図２７】実施例１１、研究＃２．１の生存曲線を示す。ＴＦ：無腫瘍。（上段）ＡＳ１５とともに製剤化された、６．２５μｇのＬＶＬ１６８、もしくは１０μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１６８を接種されたマウス群は、生存率がわずかに高かった。（上段中央）ＡＳ１５とともに製剤化された、３．１μｇのＬＶＬ１６８、もしくは５μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１４４を接種されたマウス群は、生存率がわずかに高かった。（下段中央）ＡＳ１５とともに製剤化された、１．５５μｇのＬＶＬ１６８、もしくは２．５μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１４４を接種されたマウス群は、最も高い生存率であった。（下段）ＡＳ１５とともに製剤化された、０．７７μｇのＬＶＬ１６８、もしくは１．２５μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１６８を接種されたマウス群は、生存率がわずかに高かった。
【図２８】実施例１１、研究＃２．２の生存曲線を示す。ＴＦ：無腫瘍。（上段）ＡＳ１５とともに製剤化された、６．２５μｇのＬＶＬ１６８、もしくは１０μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。（上段中央）ＡＳ１５とともに製剤化された、３．１μｇのＬＶＬ１６８、もしくは５μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。（下段中央）ＡＳ１５とともに製剤化された、１．５５μｇのＬＶＬ１６８、もしくは２．５μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。（下段）ＡＳ１５とともに製剤化された、０．７７μｇのＬＶＬ１６８、もしくは１．２５μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。
【図２９】実施例１１、研究＃２．３の生存曲線を示す。ＴＦ：無腫瘍。（上段）ＡＳ１５とともに製剤化された、６．２５μｇのＬＶＬ１６８、もしくは１０μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１６８を投与されたマウス群は、生存率が最も高く、ＬＶＬ１４４を投与された群がそれに続いた。ＡＳ１５だけを投与された群には、生存したマウスがいなかった。（中央）ＡＳ１５とともに製剤化された、３．１μｇのＬＶＬ１６８、もしくは５μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１６８を投与されたマウス群は、生存率が最も高く、ＬＶＬ１４４を投与された群がそれに続いた。ＡＳ１５だけを投与された群には、生存したマウスがいなかった。（下段）ＡＳ１５とともに製剤化された、１．５５μｇのＬＶＬ１６８、もしくは２．５μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１６８を投与されたマウス群は、生存率が最も高く、ＬＶＬ１４４を投与された群がそれに続いた。ＡＳ１５だけを投与された群には、生存したマウスがいなかった。対照群として、緩衝生理食塩水またはＡＳ１５単独を用いた。
【図３０】実施例１１、研究＃２．３の生存曲線を示す。ＴＦ：無腫瘍。（上段）ＡＳ１５とともに製剤化された、０．７７μｇのＬＶＬ１６８、もしくは１．２５μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１６８を投与されたマウス群は、生存率が最も高く、ＬＶＬ１４４を投与された群がそれに続いた。ＡＳ１５だけを投与された群には、生存したマウスがいなかった。（中央）ＡＳ１５とともに製剤化された、０．１９μｇのＬＶＬ１６８、もしくは０．３１μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１６８を投与されたマウス群は、生存率が最も高かった。ＬＶＬ１４４を投与された群の最後の生存マウスは、ＡＳ１５群および緩衝液群の最後の生存マウスよりも長生きした。（下段）ＡＳ１５とともに製剤化された、０．０４８μｇのＬＶＬ１６８、もしくは０．０７８μｇのＬＶＬ１４４で、またはＡＳ１５単独によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＢＳ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。ＬＶＬ１６８を投与されたマウス群は、生存率が最も高かった。ＬＶＬ１４４を投与された群の最後の生存マウスは、ＡＳ１５群および緩衝液群の最後の生存マウスよりも長生きした。対照群として、緩衝生理食塩水またはＡＳ１５単独を用いた。
【図３１】ＡＳ１５とともに製剤化された、１μｇのＬＶＬ１６８によって免疫された雄と雌のＣＢ６Ｆ１マウスにおけるＴＣ１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２の腫瘍移植片；ＡＳ１５単独を対照（上段）として用いた。ＡＳ１５とともに製剤化された、１μｇのＬＶＬ１６８で免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＴＣ１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２の腫瘍移植片；ＡＳ１５単独を対照（下段）として用いた。
【図３２】上段パネル：ＡＳ１５とともに製剤化された、１μｇのＬＶＬ１６８によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２細胞を接種された雄または雌のＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。雄および雌のＣＢ６Ｆ１マウスにおいて対照としてＡＳ１５単独を用いた。ＬＶＬ１６８＋ＡＳ１５によって免疫されたＣＢ６Ｆ１マウスのなかで、無腫瘍（ＴＦ）の雄マウスが７匹および雌マウスが３匹いた。ＡＳ１５単独を投与されたマウスにはＴＦがなかった。下段パネル：ＡＳ１５とともに製剤化された、１μｇのＬＶＬ１６８によって免疫され、次いでＴＣ１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２細胞を接種されたＣＢ６Ｆ１マウスの生存曲線を示す。雄および雌のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて対照としてＡＳ１５単独を用いた。ＬＶＬ１６８＋ＡＳ１５によって免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスのなかで、ＴＦ雄マウスが２匹およびＴＦ雌マウスが１匹いた。ＡＳ１５を投与されたマウスのなかで、ＴＦ雄マウスが５匹およびＴＦ雌マウスが１匹いた。
【図３３】ＡＳ１５とともに製剤化された、１μｇのＬＶＬ１６８で、またはＡＳ１５単独によって免疫された雄（黒丸）および雌（灰色の丸）のＣＢ６Ｆ１マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９特異的体系性免疫応答（ＩｇＧ力価）を示す（左側）。ＡＳ１５とともに製剤化された、１μｇのＬＶＬ１６８で、またはＡＳ１５単独によって免疫された雄（黒丸）および雌（灰色の丸）のＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９特異的体系性免疫応答（ＩｇＧ力価）を示す（右側）。
【図３４】ＣＡＳＢ７４３９タンパク質配列全体を覆う４６ペプチドのバンク（図９を参照されたい）を用いる再刺激に続いて、ＡＳ１５とともに製剤化された１μｇのＬＶＬ１６８（配列番号１１）で、またはＡＳ１５単独のいずれかによって免疫されたＣＢ６Ｆ１マウスから単離され、プールされたＰＢＬにおけるＣＤ４Ｔ細胞の応答（パーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）として表した）（上段）。ＣＡＳＢ７４３９タンパク質配列全体を網羅する、ＣＡＳＢ７３４９プールされたペプチド、４６ペプチドのバンク（図９を参照されたい）（下段左側）；ＣＡＳＢ７４３９ペプチド３９（配列番号９１）（下段中央）；またはＲＰＭＩ（下段右側）を用いる再刺激に続いて、ＡＳ１５とともに製剤化された１μｇのＬＶＬ１６８（配列番号１１）で、またはＡＳ１５単独のいずれかによって免疫されたＣ５７／ＢＬ６マウスから単離され、プールされたＰＢＬにおけるＣＤ４−Ｔ細胞の応答（パーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）として表した）。
【図３５】ＣＡＳＢ７４３９タンパク質配列全体を覆う４６ペプチドのバンク（図９を参照されたい）を用いる再刺激に続いて、ＡＳ１５とともに製剤化された１μｇのＬＶＬ１６８（配列番号１１）で、またはＡＳ１５単独のいずれかによって免疫されたＣＢ６Ｆ１マウスから単離され、プールされたＰＢＬにおけるＣＤ８Ｔ細胞の応答（パーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）として表した）（上段）。ＣＡＳＢ７４３９タンパク質配列全体を覆う４６ペプチドのバンク（図９を参照されたい）（下段左側）；ＣＡＳＢ７４３９ペプチド３９（配列番号９１）（下段中央）；またはＲＰＭＩ（下段右側）を用いる再刺激に続いて、ＡＳ１５とともに製剤化された１μｇのＬＶＬ１６８（配列番号１１）で、またはＡＳ１５単独のいずれかによって免疫されたＣ５７／ＢＬ６マウスから単離され、プールされたＰＢＬにおけるＣＤ８−Ｔ細胞の応答（パーセントダブルポジティブ（ＩＦＮγ／ＴＮＦα）として表した）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
商業的に許容される免疫療法への１つのハードルは、商業的に許容される量の組換え癌抗原を生成することである。一般に、およびこれに限定されることなく、組換えポリペプチドの商業的に許容される生成レベルは、Ｃｏｏｍａｓｉｅブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で推定されるように、宿主細胞によって産生される全タンパク質のおよそ５％である。
【００１２】
組換え方法によって生成される場合、ナイーブポリペプチド配列がわずかに少量を産生し得る理由は多数ある。ポリペプチド生成の増加へのアプローチは、宿主発現系またはコドン最適化を変えることを含む。しかしながら、これらの標準的アプローチは、許容されるポリペプチド生成を必ずしももたらさず、かつ一部のポリペプチドの生成は、依然として商業的に禁止されたままである。以下にさらに詳細に記述するように、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドが組換え方法によって許容されるタンパク質レベルを生成するかどうかを出願人らは検討した。
【００１３】
一部の実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドが提供され、ここで該改変は、プロリンリッチ領域全部または一部を除去するように、ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドのＣ末端トランケーションからなる、または該トランケーションを含む。一部の実施形態では、ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド改変は、プロリンリッチ領域全部もしくは一部の除去からなる、または該除去を含む。一部の実施形態では、配列番号１３の少なくともアミノ酸残基１９３を保持するが、プロリンリッチ領域全部または一部が除去される改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドが提供される。
【００１４】
別の実施形態では、本明細書に記述する改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドを含むタンパク質構築物が提供される。一部の実施形態では、かかるタンパク質構築物は、１つまたは複数の異種ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、この異種ポリペプチドは、他の箇所でさらに詳細に記述されているように、融合パートナーである。特に適切な実施形態では、かかるタンパク質構築物は、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドのＮ末端に位置する異種ポリペプチドを含む。さらに特に適切な実施形態では、この異種ポリヘプチドが、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドのＮ末端に位置するインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ（以下にさらに詳細に記述されている）の断片である、タンパク質構築物が提供される。
【００１５】
一部の実施形態では、異種ポリペプチドがポリヒスチジン領域を含むタンパク質構築物が提供される。さらなる実施形態では、ポリヒスチジン配列は、タンパク質構築物のＣ末端部分に位置する。別の実施形態では、ポリヒスチジン配列は、タンパク質構築物のＣ末端に位置する。さらなる実施形態では、ポリヒスチジン配列は、タンパク質構築物のＮ末端部分に位置する。別の実施形態では、ポリヒスチジン配列は、タンパク質構築物のＮ末端に位置する。適切な実施形態では、ポリヒスチジン領域は、１０個以上の連続するヒスチジン残基を含む。特に適切な実施形態では、ポリヒスチジン領域は、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドのＮ末端に位置する１０個以上の連続するヒスチジン残基を含む。一部の実施形態では、複数のポリヒスチジン領域は、本明細書に記述する１つまたは複数の部位に含まれることもある。
【００１６】
一部の実施形態では、異種ポリペプチドが、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドに化学的に結合した担体タンパク質であるタンパク質構築物が提供される。
【００１７】
一部の実施形態では、ポリヒスチジン領域である異種ポリペプチドと、担体タンパク質である異種ポリペプチドとを含むタンパク質構築物が提供される。一部の実施形態では、ポリヒスチジン領域である異種ポリペプチドと、融合パートナーである異種ポリペプチドとを含むタンパク質構築物が提供される。一部の実施形態では、ポリヒスチジン領域である異種ポリペプチドと、融合パートナーである異種ポリペプチドと、担体タンパク質である異種ポリペプチドとを含むタンパク質構築物が提供される。
【００１８】
出願人らは、本明細書の節に記述されているそれぞれの構築物の実施形態も開示し、該構築物ではポリヒスチジン領域などのいずれかの異種ポリペプチドの一部または全部が除去されている。異種ポリペプチドの除去のための組成物および方法は、当技術分野で知られており、エンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼによる消化、化学的改変または異種ポリペプチドと分子の残りの部分との間の結合の切断などを含むがこれらに限定されない。
【００１９】
出願人らは、本明細書で免疫原性組成物も開示する。これらの組成物は、いずれかの改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたは本明細書に記述する改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドを含むタンパク質構築物と、医薬的に許容される担体または賦形剤とを含み、該担体または賦形剤は任意に緩衝剤を含むこともある。特定の態様では、これらの組成物は、アジュバントをさらに含む。特定の態様では、これらの組成物は、少なくともＴｈ１免疫応答を誘発するアジュバントを含む。特定の態様では、本明細書に記述するアジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、およびＣｐＧのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、該組成物は３Ｄ−ＭＰＬを含む。別の実施形態では、該組成物はＣｐＧを含む。一部の実施形態では、該組成物はＱＳ２１を含む。一部の実施形態では、組成物はＱＳ２１およびコレステロールを含む。一部の実施形態では、該組成物はリポソーム製剤中にコレステロール、３Ｄ−ＭＰＬ、およびＱＳ２１を含む。
【００２０】
出願人らは、本明細書に記述する改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドおよび構築物をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子も本明細書で開示する。一部の実施形態では、本明細書に記述する、かかる核酸分子を含むベクターが開示される。一部の実施形態では、該ベクターは原核細胞発現ベクターを含む。一部の実施形態では、該ベクターは真核細胞発現ベクターを含む。一部の実施形態では、タンパク質構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、宿主細胞での発現に最適化されたコドンであった。
【００２１】
出願人らは、（ｉ）本明細書に記述する核酸分子または（ｉｉ）本明細書に記述する核酸分子を有するベクターを含む宿主細胞も開示する。一部の実施形態では、該宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞からなる群から選択される。
【００２２】
一部の実施形態は、（ｉ）本明細書に記述する核酸分子または（ｉｉ）本明細書に記述する核酸分子を有するベクター、および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む免疫原性組成物を提供する。
【００２３】
一部の実施形態では、結腸直腸癌を治療するための薬物の調製において、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたは本明細書に記述するタンパク質構築物（またはそれらをコードする核酸分子）の使用が提供される。一部の実施例では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたは本明細書に記述するタンパク質構築物（またはそれらをコードする核酸分子）を治療、特に結腸直腸癌治療での使用が開示される。一部の実施例では、結腸直腸癌の患者においてＣＡＳＢ７４３９に対する免疫応答を誘発する方法が提供され、該方法は以下を含む：（ｉ）結腸直腸癌の患者を選択すること；および（ｉｉ）改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたは本明細書に記述するタンパク質構築物と、医薬的に許容される担体または賦形剤とを含み、該担体または賦形剤が任意に緩衝剤を含むこともある、有効量の免疫原性組成物をかかる患者に投与すること。本明細書で開示される方法に関する一部の実施形態では、免疫原性組成物はアジュバントをさらに含む。本明細書で開示される方法に関する一部の実施形態では、該アジュバントは少なくともＴＨ１免疫応答を誘発する。本明細書で開示される方法に関する一部の実施形態では、該アジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、およびＣｐＧのうちの少なくとも１つを含む。本明細書で開示される方法に関する一部の実施形態では、該患者はヒト患者である。
【００２４】
タンパク質構築物
ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド
本明細書で名付けられたように、ＣＡＳＢ７４３９は、ＨＡＳＨ２またはＡＳＣＬ２としても知られている。ＨＡＳＨ２は、ヒト由来の１９３アミノ酸残基ポリペプチドである（配列番号１３）。たとえば受入番号ＡＡＢ８６９９３を参照されたい。本明細書では、ＣＡＳＢ７４３９の特徴への言及は、配列番号１３に規定されたポリペプチド配列に関してなされるとする。
【００２５】
プロリンリッチ領域
高プロリン周期性の領域は、１２７〜１５８アミノ酸の領域での配列番号１３に見出される。出願人らは、アミノ酸１３３〜アミノ酸１５３の配列番号１３の領域を「プロリンリッチ」、「ポリプロリン」、「ポリプロリン様」、または「ポリプロ」の領域もしくはドメインを含み、名付けた。したがって、本明細書で用いる場合、「プロリンリッチ」、「ポリプロリン」、「ポリプロリン様」、および「ポリプロ」は、ＣＡＳＢ７４３９のこの領域（またはドメイン）をいう。
【００２６】
改変
本開示は、少なくとも１つの発現増強の改変を含むＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドを含むタンパク質構築物を提供する。一部の実施形態では、ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドの一部が除去される。前述の部分はプロリンリッチ領域の全部または一部を含む。一部の実施形態では、ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドのＣ末端部全体が除去され、配列番号１３のアミノ酸残基１〜１１７を含むトランケート型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドをもたらす。一部の実施形態では、異種ポリペプチドはＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドのＮ末端に位置する。
【００２７】
本明細書で用いる場合、改変型ポリペプチドと関連して「発現増強」または「増強された発現」とは、配列番号１３の非改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチ含む以外は同等（すなわち同じベクター、宿主細胞など）のタンパク質構築物の発現と比べると、前述の改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドを含むタンパク質構築物の発現レベルが上昇するように意図される改変をいう。改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドを含む所定の構築物が、非改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドを含む以外は同等のタンパク質構築物と比べて、発現レベルが上昇したかどうかを測定するために、タンパク質の量を測定するための当技術分野で既知の方法のいずれも容認される。一部の実施形態では、生成はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣｏｏｍａｓｉｅブルー染色法を用いて評価され得る。
【００２８】
プロリンリッチ領域の除去
一部の実施形態では、ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドの改変は、プロリンリッチ領域の一部の除去を含む。一部の実施形態では、ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドの改変は、プロリンリッチ領域全部の除去を含む。一部の実施形態では、ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドの改変は、プロリンリッチ領域の除去に加えて、プロリンリッチ領域の外側のアミノ酸の除去を含む。
【００２９】
一部の実施形態では、改変は配列番号１３のＣ末端部分のトランケーションによって達成される。このように、一部の実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基が、配列番号１３のプロリンリッチ領域のＮ末端に位置する残基に対応するタンパク質構築物が生成される。一部の実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基が、配列番号１３のプロリンリッチ領域内に位置する残基に対応するタンパク質構築物が生成される。一部の実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基は、配列番号１３のアミノ酸残基１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、または１５２に相当する。
【００３０】
一部の実施形態では、改変はプロリンリッチ領域の一部または全部の除去を含む。一部の実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド配列は、２１以上の連続するアミノ酸残基が除去されている配列番号１３に相当する。これらの２１以上の連続する残基は、残基１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、または１５２を含めて、いずれか１つから始まる配列番号１３の連続するアミノ酸配列に相当する。さらなる実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド配列は、２１の連続するアミノ酸残基が除去されており、前述の２１の連続する残基が残基１３１、１３２、および１３３のいずれか１つから始まる、配列番号１３に相当する。
【００３１】
一部の実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド配列は、１つまたは複数の残基１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３が除去されている配列番号１３に相当する。一部の実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド配列は、２つ以上の連続するアミノ酸残基がアミノ酸残基１３３〜１５３を含む領域で除去されている配列番号１３に相当する。
【００３２】
一部の実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド配列は、配列番号１３の１３３〜１５３を含む残基が除去されている配列番号１３に相当する。代表的な非限定的な実施形態は、以下を含む：
・ＬＶＬ０５５、配列番号１（ａａ）；
・ＬＶＬ１１１、配列番号３（ａａ）；
・ＬＶＬ１３７、配列番号５（ａａ）；
・ＬＶＬ１４１、配列番号７（ａａ）；
・ＬＶＬ１４４、配列番号９（ａａ）；および
・ＬＶＬ１６８、配列番号１１（ａａ）。
【００３３】
異種配列
一部の実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドは、異種ポリペプチドと組み合わされる。核酸分子、ポリペプチドまたは別の細胞成分に関して、用語「異種の」とは、本来は通常見出されない所で、細胞成分が生じおよび／または参照分子と異なるソースまたは種から生ずることを示す。本明細書で用いる場合、「異種」分子としては、融合タンパク質、担体タンパク質、および精製タグを含むがこれらに限定されない。
【００３４】
一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド、すなわち担体タンパク質に化学的に結合されることもある。別の実施形態では、異種ポリペプチドおよび改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドは、単一の組換え融合タンパク質として発現されることもある。別の実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドおよび異種ポリペプチドは、単一の組換え融合タンパク質として発現され、かつもう一つの異種ポリペプチドに化学的に結合される。
【００３５】
異種ポリペプチドは、ヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを含むＴヘルパーエピトープを提供することに関与することもある。ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドと、融合タンパク質である異種ポリペプチドとを含むタンパク質構築物の場合、該異種ポリペプチド（融合パートナー）は、かかるエピトープを提供することに関与することもあり、またはナイーブ組換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質構築物（発現エンハンサー）を発現することに関与する。融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強パートナーの両方であり得る。
【００３６】
担体タンパク質
担体タンパク質は、目的のもう一つのポリペプチドに化学的に結合される。担体タンパク質とのポリペプチドの化学的結合は、当技術分野で知られている任意の方法で実行されることができる。このように、直接共有結合の場合、カルボジイミド、グルタルアルデヒドまたはＮ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステルを利用することは可能であり、たとえばＣＤＡＰおよびＳＰＤＰの一般的な市販のヘテロ二機能リンカーを利用する（製造業者の説明書を用いて）。結合反応の後、ポリペプチド−担体タンパク質の抱合体は、透析法、ゲル濾過法、分画方法などよって簡単に単離され、精製されることができる。
【００３７】
一部の実施形態で用いられる担体タンパク質の種類は、当業者にとって容易に分かることであろう。一部の担体タンパク質の機能は、結合したポリペプチドに対する免疫応答を誘発するのを助けるために、サイトカインの助けを提供することである。たとえば、本発明で用いてもよい担体タンパク質の非網羅的リストには、以下が含まれる：キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン、破傷風毒素もしくはジフテリア毒素（ＴＴおよびＤＴ）などの不活化細菌毒素、もしくはそれらの組換え断片（たとえば、ＴＴの断片Ｃのドメイン１、またはＤＴの転移ドメイン）、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）。
【００３８】
融合パートナー
多数の遺伝子融合系が入手可能であるにもかかわらず、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）での組換えタンパク質の発現は、依然として困難なままである。発現させるのが難しいタンパク質の発現を最良に増強する融合パートナーを確立することは、依然として経験に依存する。通常の融合パートナーとしては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ＮＵＳ Ａ、ユビキチン（Ｕｂ）、および低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）タグの各終端が挙げられ、それぞれは文献に記述されている。たとえば、Ｍａｒｂｌｅｓｔｏｎｅ（２００６） Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ． １５：１８２−７；Ｈｕｎｔ（２００５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．＆ Ｐｕｒｉｆ ４０：１−２２；Ｈａｍｍａｒｓｔｏｍら（２００２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １１：３１３−３２１を参照されたい。
【００３９】
免疫原性の融合パートナーとしては、Ｂ型インフルエンザ菌に由来するタンパク質Ｄおよびインフルエンザウイルスに由来する非構造タンパク質であるＮＳ１（赤血球凝集素）が挙げられる。別の免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして知られているタンパク質である。この分子のＣ末端部を用いることもある。ＬＹＴＡは、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（アミダーゼＬＹＴＡ）（ｌｙｔＡ遺伝子によってコードされる。Ｇａｒｃｉａら（１９８６） Ｇｅｎｅ ４３：２６５−２７２）を合成する肺炎連鎖球菌に由来する。残基１７８（たとえば残基１８８〜３０５）から始まるＣ末端側終端で見出されるＬｙｔａの繰返し部分を用いることも可能である。別の適切な融合パートナーは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片である。前述のＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的とする前述のアデニル酸シクラーゼの特性を保持している。国際公開第ＷＯ２００５／０８９７９２号を参照されたい。
【００４０】
本発明の一実施例では、異種ポリペプチドはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（欧州特許第０５９４６１０Ｂ１号）、またはその断片に由来するタンパク質Ｄである。タンパク質Ｄは、インフルエンザ菌由来のＩｇＤ−結合タンパク質である（国際公開第ＷＯ９１／１８９２６号、取得欧州特許第０５９４６１０Ｂ１号）。状況によって、たとえば組換え免疫原発現系では、たとえば、タンパク質Ｄの約１００〜約１１０のＮ末端アミノ酸を含むタンパク質ＤのＮ末端断片を用いることが望ましいこともある（英国特許第９７１７９５３．５号）（ｐＤ１／３、配列番号３９）。
【００４１】
インフルエンザ菌タンパク質Ｄは、１８アミノ酸シグナル配列によって前駆体として合成される（配列番号４１、受入番号ＡＡＡ２４９９８も参照されたい）。アミノ酸シグナル配列が分泌の間にプロセシングされると、前駆体分子内の１９位でシステイン残基がアミノ末端残基になる。
【００４２】
一実施形態では、異種ポリペプチド配列は、プロセシングされたインフルエンザ菌タンパク質Ｄ分子の最初の約３分の１、またはプロセシングされたタンパク質ＤのＮ末端の１００〜１１０アミノ酸を含む。一実施形態では、異種タンパク質は、プロセシングされたタンパク質ＤのＮ末端の１０９アミノ酸に連結したアミノ酸残基Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏを含む。別の実施形態では、異種タンパク質は、プロセシングされたタンパク質Ｄのアミノ酸残基２〜１０９に連結したアミノ酸残基Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏを含む（配列番号３９）。
【００４３】
一実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたはタンパク質構築物は、ＣｙａＡタンパク質またはその断片と化学的に結合している。国際公開第ＷＯ２００５／０５４８５１号を参照されたい。別の実施形態では、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたはタンパク質構築物は、志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的機能的同等物に化学的に連結する。米国特許第６，６１３，８８２号；国際公開第ＷＯ０２／０６０９３７号；国際公開第ＷＯ２００５／１１２９９１号を参照されたい。
【００４４】
ポリヒスチジンタグ、非関連アミノ酸
分泌配列もしくはリーダー配列、プロ配列、ヒスチジンタグなどの精製に役立つ配列、たとえばポリヒスチジン配列(複数のヒスチジン残基で構成される)、または組換え生成の間の安定性のための付加的な配列を含む異種ポリペプチドを含むことは、有利であることが多い。
【００４５】
ヒスチジンタグベクターおよびキット類は、市販されている。たとえば、６個のヒスチジンタグをポリペプチドに加えるためのベクターは、Ｒｏｃｈｅから入手可能である。ヒスチジンタグを付けたポリペプチドを作製して使用するためのキット類は、Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ他から入手可能である。また、ヒスチジンタグの後に、エンドペプチダーゼを用いてポリヒスチジン配列の除去を容易にする適切なアミノ酸配列が続くこともあり得る。エキソペプチダーゼ、たとえばＱｉａｇｅｎ ＴＡＧＺｙｍｅを用いて、付加的な配列なしで、末端のポリヒスチジン配列を除去することができる。
【００４６】
一部の実施形態では、該ポリヒスチジン配列は、タンパク質構築物のＮ末端領域に位置する。さらなる実施形態では、該ポリヒスチジン配列は、タンパク質構築物のＮ終端に位置する。一部の実施形態では、該ポリヒスチジン配列は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またそれ以上の連続したヒスチジンを含む。さらなる実施形態では、該ポリヒスチジン配列は、１０の連続したヒスチジンを含む。
【００４７】
一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、ポリヒスチジン配列と、１つまたは複数の非関連アミノ酸とを含む。「非関連アミノ酸」とは、ポリヒスチジン配列、または融合タンパク質の一部ではなく、かつ当然ながらＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド配列の一部ではない、１つまたは複数のアミノ酸を意味する。たとえば、非関連アミノ酸は、ペプチダーゼ部位を提供するために含まれるものであり、単にクローン化人工産物などの外来性配列であり得る。
【００４８】
ＣＡＳＢ７４３９構築物をコードする核酸分子
この開示の別の実施形態は、本明細書に記述する改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドおよびタンパク質構築物をコードする組換え核酸に関する。特定の実施形態では、組換え核酸は、選択された原核宿主細胞または真核宿主細胞での発現に最適化されたコドンである。複製および発現を促進するために、核酸が原核発現ベクターまたは真核発現ベクターなどのベクターに組み込まれることができる。核酸をコードする組換え改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたはタンパク質構築物を含む宿主細胞も、本開示の特徴である。好ましい宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核（すなわち細菌の）宿主細胞、ならびに真菌（たとえば酵母菌）細胞を含む多数の真核宿主細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞（たとえばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびＶＥＲＯ細胞）が挙げられる。
【００４９】
発現ベクター
複製および発現を促進するために、核酸が原核発現ベクターまたは真核発現ベクターなどのベクターに組み込まれることができる。本明細書に開示する核酸は、種々のベクター（たとえば、細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドと、ファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよびその他多くのウイルスＤＮＡを含む）のいずれか一つに含まれ得るが、通常、ベクターは、ポリペプチド発現産物を産生することに適している発現ベクターである。発現ベクターにおいて、タンパク質構築物をコードする核酸は、通常は、ｍＲＮＡ合成を指示する適切な転写調節配列（プロモーター、および任意に１つまたは複数のエンハンサー）に近接し配向して配置される。すなわち、目的のポリヌクレオチド配列は、適切な転写調節配置に作用可能に連結される。かかるプロモーターの例としては、以下が挙げられる：ＣＭＶの前初期プロモーター、ＬＴＲもしくはＳＶ４０プロモーター、バキュロウイルスの多面体のプロモーター、大腸菌ｌａｃもしくはｔｒｐプロモーター、ファージＴ７およびλＰＬプロモーター、ならびに原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を調節することが知られている他のプロモーター。発現ベクターは、通常は、翻訳開始および転写ターミネーターのリボソーム結合部位も含む。発現ベクターは、発現を増幅するための適切な配列を任意に含む。加えて、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するために、発現ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子、たとえば真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素耐性もしくはネオマイシン耐性、またはたとえば大腸菌におけるテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性を任意に含む。
【００５０】
組換えＣＡＳＢ７４３９核酸の生成を通して当業者を導くのに十分な代表的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， １９９２（およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００３）；およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９９に見出すことができる。
【００５１】
タンパク質構築物をコードする代表的な核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２によって表される。代表的な核酸分子と配列相同性を共有する付加的な配列変異体は、当業者によって生成されることができる。一般的に、核酸変異体は、アミノ酸残基のわずか１％、または２％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％だけ異なるポリペプチドをコードする。すなわち、コードされたポリペプチドは、少なくとも８０％、または８５％、より一般的には少なくとも約９０％あるいはそれ以上、たとえば９５％、９８％、９９％、もしくは９９．５％の配列相同性を共有する。遺伝暗号の重複性のために、タンパク質構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、それ自体より少ない配列相同性を共有することができることを、当業者は直ちに理解するであろう。ある場合には、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたはタンパク質構築物は、本明細書に記載された代表的な構築物のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸改変を有する（たとえば、前述の改変に加えて）。かかる違いは、それぞれ、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の追加、除去または置換であり得る。変異体は、通常は、ヌクレオチド残基のわずかに約１％、または２％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％、または２５％、または３０％だけ異なる。たとえば、核酸をコードする変異体ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたはタンパク質構築物は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２の核酸をコードする代表的なＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたはタンパク質構築物と比較すると、１、または２、または５まで、または約１０まで、または約１５まで、または約５０まで、または約１００までのヌクレオチド差異を含み得る。このように、核酸をコードするＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたはタンパク質構築物と関連してある変異体は、通常は、少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９８％、または９９％、または９９．５％の配列相同性を、ある参照配列、たとえば配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２によって示される参照配列と、または本明細書に開示される核酸をコードする他の代表的なＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド、タンパク質構築物のいずれかと共有する。付加的な変異体は、遺伝的浮動を通して起こり得る、または部位特異的変異誘発もしくはランダム変異誘発を用いて、または２つ以上の既存の変異体の組換えによって人工的に生成され得る。また、かかる付加的な変異体は、本明細書に開示されるＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたはタンパク質構築物と関連して適している。
【００５２】
前述した変異体核酸に加えて、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２によって表される代表的な核酸のうちの１つまたは複数とハイブリッド形成する核酸を用いて、本明細書に開示されるＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドまたはタンパク質構築物をコードすることもできる。本明細書に記述されるパーセント（％）配列相同性の尺度に加えて、２つの核酸間の配列類似性の別の指標は、ハイブリッド形成する能力であることを当業者は認識するであろう。２つの核酸の配列が類似すればするほど、これらの核酸がハイブリッド形成する条件はますますストリンジェントになる。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、配列に依存し、かつ種々の環境パラメータの下で異なる。このように、ストリンジェンシーの特定の程度をもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション方法および組成物の性質と、ハイブリッド形成する核酸配列の長さとに応じて変わる。通常、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特に、Ｎａ^＋および／またはＭｇ^＋＋の濃度）は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するが、洗浄回数もストリンジェンシーに影響する。通常、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔ_m）より約５℃〜２０℃低く選択される。Ｔ_ｍは、標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリット形成する温度（規定のイオン強度およびｐＨの下で）である。核酸ハイブリダイゼーションの条件およびストリンジェンシーの計算については、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ２００１；Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｒｔ Ｉ： Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， ＮＹ， ＮＹ， １９９３；およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９９に見出すことができる。
【００５３】
本開示の目的で、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列との間のミスマッチが２５％未満の場合、ハイブリダイゼーションが起こるだけの条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、より正確な定義のためにストリンジェンシーの特定のレベルに分類されることができる。したがって、本明細書で用いる場合、「中程度のストリンジェンシー」の条件は、その条件下で２５％以上の配列ミスマッチを有する分子がハイブリッド形成しない条件であり；「中間のストリンジェンシー」の条件は、その条件下で１５％を超えるミスマッチを有する分子がハイブリッド形成をしない条件であり；および「高いストリンジェンシー」の条件は、その条件下で１０％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリッド形成しない条件である。「非常に高いストリンジェンシー」の条件は、その条件下で６％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリッド形成しない条件である。対照的に、「低いストリンジェンシーの条件」下でハイブリッド形成する核酸には、非常に少ない配列相同性を有するもの、または核酸のわずかに短い下位配列上で配列相同性を有するものを含む。したがって、本開示によって包含される核酸の種々の変異体は、ストリンジェントな条件下で、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２のうちの少なくとも１つと、実質的にその全長にわたりハイブリッド形成することができると理解される。
【００５４】
タンパク質構築物の生成
本明細書に開示されるタンパク質構築物は、組換えタンパク質の発現および精製のために確立した方法を用いて生成され得る。当業者を導くのに十分な方法は、以下の参考文献に見出すことができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ２００；およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ９９９。付加的かつ特定の詳細を以下に示す。
【００５５】
選択するベクターおよび宿主細胞に応じて、タンパク質構築物をコードする組換え核酸は、種々の周知の方法、たとえば電気穿孔法、リポソームによるトランスフェクション（たとえば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００またはＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）などの市販のリポソーム型トランスフェクション試薬を用いて）、リン酸カルシウム沈殿法、感染法、トランスフェクションなどのいずれかで、宿主細胞に導入され得る。
【００５６】
宿主細胞は、プロモーターを活性化する、形質転換体を選択する、または挿入されたポリヌクレオチド配列を増幅するために必要に応じて改変された従来の栄養を含む培地で培養されることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、通常は、発現のために選択した宿主細胞とともに以前に用いられた条件であり、当業者にとって、およびたとえばＦｒｅｓｈｎｅｙ （１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ− Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋならびにそれに引用された参照文献を含み、本明細書に引用された参照文献で明白であろう。一部の実施形態では、適切な培養温度は、１６℃であり、別の実施形態では３７℃である。本発明の核酸に相当する発現産物は、たとえば植物、酵母菌、真菌、細菌などの非動物細胞でも生成されることができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅに加えて、細胞培養に関する詳細は、Ｐａｙｎｅら（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ （Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ならびにＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（ｅｄｓ） Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ （１９９３） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬに見出すことができる。
【００５７】
宿主細胞
このように、核酸をコードする組換えタンパク質構築物を含む宿主細胞は、本開示の特徴でもある。好ましい宿主細胞としては、大腸菌などの原核（すなわち細菌）宿主細胞、ならびにたとえばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳類細胞（たとえばＣＨＯ細胞）を含む多数の真核宿主細胞が挙げられる。組換えタンパク質構築物核酸は、たとえば、発現ベクターなどのベクターを介して、宿主細胞に導入される（たとえば、形質導入される、形質転換される、またはトランスフェクトされる）。本明細書に記述するベクターは、最も一般的にはプラスミドであるが、かかるベクターは、たとえばウイルス粒子、ファージなどでもあり得る。適切な発現宿主の例としては、以下が挙げられる：細菌細胞、たとえば大腸菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ）およびサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞、たとえばサッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、およびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；昆虫細胞、たとえばショウジョウバエおよびヨウトウガ；哺乳類細胞、たとえば３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３またはＢｏｗｅｓメラノーマ；藻類細胞を含む植物細胞など。
【００５８】
宿主細胞は、挿入された配列の発現を調節する、または発現したタンパク質を所望の様式でプロセシングするその能力のために、任意に選択される。タンパク質のかかる改変は、グリコシル化（ならびに、たとえばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化）が含まれるがこれらに限定されない。たとえば、タンパク質の前躯体型を成熟型に切断する（たとえばフューリンプロテアーゼによって）翻訳後プロセシングは、宿主細胞と関連して任意に行われる。３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＷＩ３８などの異なる宿主細胞は、かかる翻訳後活性のための特定の細胞機構と特性機序があり、かつ導入された異種タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
【００５９】
本明細書に開示する組換えタンパク質構築物の長期の高収率生成のために、安定な発現系が一般的に用いられる。たとえば、タンパク質構築物を安定して発現する核酸分子は、ウイルス由来の複製エレメントまたは内在性発現エレメントおよび選択可能なマーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いることによって宿主細胞に導入される。発現ベクターの導入に続いて、細胞は強化培地で１〜２日の間増殖させてから、選択培地に切り替えて培養される。選択可能なマーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、かつマーカーの存在により、導入した配列をうまく発現する細胞の増殖および回収が可能になる。たとえば、安定して形質転換した細胞の耐性群またはコロニーは、細胞型に適した組織培養技法を用いて増殖され得る。タンパク質構築物をコードする核酸で形質転換した宿主細胞は、細胞培養由来のコード化タンパク質の発現および回収に適した条件下で、任意に培養される。
【００６０】
硫酸アンモニウム沈殿法もしくはエタノール沈殿法、酸抽出法、濾過法、限外濾過法、遠心分離法、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（たとえば、本明細書に記述するタギング系のいずれかを用いる）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびとレクチンクロマトグラフィーを含む当技術分野で周知の多数の方法のうちのいずれかによって、発現したタンパク質構築物は、組換え細胞培養物から回収されて、精製されることができる。タンパク質再折り畳みのステップは、所望通り、成熟タンパク質の立体配置を完了する際に用いられることができる。最終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は最終精製ステップで使用されることができる。本明細書に記述する参考文献に加えて、種々の精製方法が、たとえば、以下に記載されているものを含めて当技術分野で周知である：Ｓａｎｄａｎａ（１９９７） Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．；およびＢｏｌｌａｇら（１９９６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６） Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ＮＪ， Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ（１９９０） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ．Ｋ．；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹ；ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ（１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， ＮＹ；ならびにＷａｌｋｅｒ（１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ＮＪ。
【００６１】
特定の例では、核酸は、原核細胞、たとえば大腸菌細胞での導入および発現に適したベクターを介して細胞に導入される。たとえば、タンパク質構築物をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸は、発現ベクターｐＥＴシリーズ（たとえばｐＥＴ９ｂおよびｐＥＴ２ｄ）などの種々の市販されているまたは専売品ベクターのいずれかに導入されることができる。コード配列の発現は、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導可能であり、高レベルのタンパク質発現をもたらす。ＣＡＳＢ７４３９タンパク質構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、ファージＴ７プロモーターの下で転写される。熱誘導性λｐＬプロモーターを含むｐＵＲＶ２２などの代替ベクターも適している。
【００６２】
発現ベクターは、適切な細菌宿主に（たとえば電気穿孔法によって）導入される。大腸菌の多数の適切な菌株が入手可能であり、当業者は選択することができる（たとえば、ＢＬＲ ＤＥ３、ＢＬ２１ ＤＥ３およびＲｏｓｅｔｔａ ＤＥ３株は、タンパク質構築物をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる組換えベクターの発現に適していることが判明している）。
【００６３】
任意に、タンパク質構築物をコードするポリヌクレオチドは、真核細胞（たとえば昆虫細胞または哺乳類細胞）での導入および発現に適している発現ベクーに組み込まれる。かかる核酸は、選択されたベクター／宿主細胞での発現に最適化されたコドンであることが有利である。選択された細胞は、所望のタンパク質構築物の発現のために、クローン伸長され、かつ特徴づけられることができる。コドン最適化のための技法は、当技術分野で知られている。加えて、他の通常の技術サービスでは、商業分子生物サービスプロバイダーが、コドン最適化を提供する。
【００６４】
原核細胞
細菌系では、多くの発現ベクターが、発現産物を対象とする用途によって選択されることができる。たとえば、大量のポリペプチドまたはその断片が抗体の生成で必要とされるとき、容易に精製される高レベル発現の融合タンパク質を誘導するベクターが有利に使用される。かかるベクターとしては、以下のような多機能大腸菌クローニングベクターおよび発現ベクターが挙げられるがこれらに限定されない。たとえば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、目的のコード配列、たとえば、本明細書に記述する本発明のポリヌクレオチドが、メチオニンおよびそれに続く７個のβ−ガラクトシダーゼ残基から開始するアミノ末端翻訳のための配列を用いて、インフレームのベクターにライゲートされることができ、触媒的に活性なβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を産生する；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５５０３−５５０）；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、アミノ末端メチオニンがヒスチジンタグによってインフレームにライゲートされる；その他。一部の実施形態では、適切なベクターはｐＥＴ１９であり、別の実施形態ではｐＥＴ２４であり；別の実施形態ではｐＥＴ２６である。
【００６５】
真核細胞
同様に、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母菌では、アルファ因子、アルコール酸化酵素およびＰＧＨなどの構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含んでいる多くのベクターが、所望の発現産物の生成のために用いられ得る。概説に関しては、Ｂｅｒｇｅｒ， Ａｕｓｕｂｅｌ，およびたとえばＧｒａｎｔら（１９８７； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４）を参照されたい。哺乳類の宿主細胞では、プラスミド系およびウイルスベース系の両方を含む多くの発現系が、利用されることができる。
【００６６】
免疫原性組成物
医薬的に許容される担体または賦形剤
医薬的に許容される担体および賦形剤は、周知であり、当業者が選択することができる。たとえば、担体または賦形剤は、緩衝剤を有利に含むことができる。任意に、担体または賦形剤は、溶解性および／または安定性を安定させる少なくとも１つの成分も含む。可溶化／安定化剤の例としては、界面活性剤、たとえばラウリルサルコシンおよび／またはＴｗｅｅｎが挙げられる。別の可溶化／安定化剤としては、アルギニン、およびガラス形成ポリオール（たとえばショ糖、トレハロースなど）を含む。多数の医薬的に許容される担体および／または医薬的に許容される賦形剤は、当技術分野で知られており、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｂｙ Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （９７５）に記載されている。
【００６７】
したがって、選択された投与経路で患者に送達する適切な製剤を生成するために、当業者は適切な賦形剤および担体を選択することができる。
【００６８】
適切な賦形剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビトール、トレハロース、Ｎ−ラウロイリルサルコシンナトリウム塩、Ｌ−プロリン、非界面活性剤スルホベタイン、塩酸グアニジン、尿素、トリメチルアミンオキシド、ＫＣｌ、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｚｎ^２＋および他の二価陽イオン関連塩、ジチオスレイトール、ジチオエリトロール、およびβ−メルカプトエタノール。他の賦形剤は界面活性剤であり得る（Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−００、ＮＰ−４０、Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ、オクチルグルコシド、ラウリルマルトシド、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−２、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−６、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、ドデジル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムを含む）。
【００６９】
アジュバント
任意に、免疫原性組成物は、アジュバントも含む。ＣＡＳＢ７４３９に対する免疫応答を誘発する目的で、ヒト患者などの患者への投与に適した免疫原性組成物と関連して、アジュバントを選択して、Ｔｈ１偏向免疫応答を誘発する。アジュバントは通常、免疫原性組成物が投与される患者、または患者の集団におけるＴｈ１偏向免疫応答を増強するように選択される。
【００７０】
Ｔｈ１免疫応答
「Ｔｈ１」型免疫応答は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の誘導によって特徴づけられる。対照的に、「Ｔｈ２」型免疫応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を産生するＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の誘導によって特徴づけられる。
【００７１】
３Ｄ−ＭＰＬを含むがこれに限定されることのないＴＬＲ作用因子
改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドと組み合わせの使用に適したアジュバントは、ＴＬＲ−４−モジュレーターである。一例は、モノホスホリルリピドＡ、またはより詳細には３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）などリピドＡの非毒性誘導体である。３Ｄ−ＭＰＬは、ＭＰＬという名称でＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｓ．Ａ．によって販売されており、文献ではＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬと呼ばれる。たとえば、米国特許第４，４３６，７２７号；第４，８７７，６１１号；第４，８６６，０３４号および第４，９１２，０９４号を参照されたい。３Ｄ−ＭＰＬは主に、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）表現型によってＣＤ４＋Ｔ細胞応答を促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、英国特許出願公開第２２２０２１１Ａ号に開示される方法によって生成されることができる。化学的には、３Ｄ−ＭＰＬは、３−脱アシル化モノホスホリルと、３、４、５または６のアシル化鎖との混合物である。本発明の組成物では、小粒子３Ｄ−ＭＰＬを用いることができる。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍフィルターを通して無菌濾過され得るような粒径である。かかる調製は、国際公開第ＷＯ９４／２１２９２号に記述されている。
【００７２】
別の実施形態では、米国特許第６，００５，０９９号および欧州特許第０７２９４７３Ｂ１号に記述されているように、リポ多糖は、β（１−６）グルコサミン二糖であり得る。当業者は、これらの参照文献の教示に基づいて３Ｄ−ＭＰＬなどの種々のリポ多糖体を容易に生成することができるであろう。上述した免疫賦活薬類（ＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬの構造と類似した構造を有する）に加えて、本明細書のＭＰＬ構造の下位部分であるアシル化単糖およびアシル化二糖の誘導体も、適切なアジュバントである。別の実施形態では、アジュバントはリピドＡの合成誘導体であり、その一部は、ＴＬＲ−４アゴニストと記述され、かつ以下を含むがこれらに限定されない：ＯＭ１７４（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルリン酸二水素、（国際公開第ＷＯ９５／１４０３６号）；ＯＭ２９４ ＤＰ（３Ｓ、９Ｒ）−３−［（Ｒ）ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１，１０−ビス（ジヒドロゲノホスフェート）（国際公開第ＷＯ９９／６４３０１号および第ＷＯ００／０４６２号）；およびＯＭ１９７ ＭＰ−Ａｃ ＤＰ（３Ｓ−，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１−ジヒドロゲノホスフェート１０−（６−アミノヘキサン酸）（国際公開第ＷＯ０１／４６１２７号）。
【００７３】
用いることができる別のＴＬＲ−４リガンドは、たとえば国際公開第９８／５０３９９号または米国特許第６，３０３，３４７号に開示されているアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）（ＡＧＰのプロセスおよび調製も開示されている）、適切にはＲＣ５２７もしくはＲＣ５２９、または米国特許第６，７６４，８４０号に開示されているＡＧＰの医薬的に許容される塩である。一部のＡＧＰはＴＬＲ−４アゴニストであり、一部のＡＧＰはＴＬＲ−４アンタゴニストである。両方とも、アジュバントとして有用であると思われる。
【００７４】
ＴＬＲ−４を介してシグナリング応答を引き起こすことができる（Ｓａｂｒｏｅら， ＪＩ ２００３ ｐ１６３０−５）他の適切なＴＬＲ−４リガンドは、たとえばグラム陰性細菌由来のリポ多糖およびその誘導体、またはその断片、特にＬＰＳの非毒性誘導体（３Ｄ−ＭＰＬなど）である。他の適切なＴＬＲアゴニストは以下の通りである：熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）１０、６０、６５、７０、７５または９０；サーファクタントタンパク質Ａ、ヒアルロン酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノゲンペプチド、ｂ−デフェンシン−２およびムラミールジペプチド（ＭＤＰ）。一実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＨＳＰ６０、７０または９０である。他の適切なＴＬＲ−４リガンドは、国際公開第ＷＯ２００３／０１１２２３号および第ＷＯ２００３／０９９１９５号に開示されており、たとえば、国際公開第ＷＯ２００３／０１１２２３号の４〜５ページ、または国際公開第ＷＯ２００３／０９９１９５号の３〜４ページに開示されている化合物Ｉ、化合物ＩＩ、および化合物ＩＩＩ、ならびに特に、ＥＲ８０３０２２、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５７、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０およびＥＲ８０４７６４として国際公開第ＷＯ２００３／０１１２２３号に開示されている化合物類である。たとえば、１つの適切なＴＬＲ−４リガンドは、ＥＲ８０４０５７である。
【００７５】
サポニンアジュバント
ＣＡＳＢ７４３９とともに免疫原性組成物で用いられる、たとえば、そのままでまたは３Ｄ−ＭＰＬもしくは本明細書に記述する別のアジュバントとの組み合わせでの他のアジュバントは、ＱＳ２１などのサポニンである。
【００７６】
サポニンは、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ， ＭおよびＷａｇｎｅｒ Ｈ．（１９９６． Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ． Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ ２ ｐｐ ３６３−３８６）に教示されている。サポニンは、植物界および海洋動物界に広く分布されているステロイドまたはトリテルペングリコシドである。サポニンは、振盪によって泡立つコロイド溶液を水中で形成すること、およびコレステロールを沈殿させることが知られている。サポニンが細胞膜付近にあると、細胞膜が破裂する原因になるに細孔様構造を細胞膜に形成する。赤血球の溶血は、この現象の一例である。これはすべてのサポニンではないが、特定のサポニンの特性である。
【００７７】
サポニン、特に免疫学的活性のサポニン画分は、全身投与用ワクチンのアジュバントとして知られている。個々のサポニン類のアジュバントおよび溶血作用は、当技術分野で広範に研究されている（Ｌａｃａｉｌｌｅ−ＤｕｂｏｉｓおよびＷａｇｎｅｒ（上記を参照））。たとえば、Ｑｕｉｌ Ａ（南米の樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来する）、およびその画分は、米国特許第５，０５７，５４０号および「ワクチンのアジュバントとしてのサポニン」（'Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ'）， Ｋｅｎｓｉｌ， Ｃ． Ｒ．， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ， １９９６， １２（１−２）：１−５５；および欧州特許第０３６２２７９Ｂ１号に記述されている。Ｑｕｉｌ Ａの画分を含む、免疫刺激複合体（Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ（ＩＳＣＯＭＳ））と名付けられた微粒子構造は、溶血性であり、かつワクチンの製造で用いられている（Ｍｏｒｅｉｎ， Ｂ．，欧州特許第０１０９９４２Ｂ１号；国際公開第ＷＯ９６／１１７１１号；第ＷＯ９６／３３７３９号）。溶血性サポニンであるＱＳ２１およびＱＳ１７（ＱｕｉｌＡのＨＰＬＣ精製画分）は、強力な全身性アジュバントとして記載されており、それの製造方法は米国特許第５，０５７，５４０号および欧州特許第０３６２２７９Ｂ１号に開示されている。全身用ワクチン接種の研究で用いられてきた他のサポニンには、他の植物種、たとえばカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）およびサポナリア（Ｓａｐｏｎａｒｉａ）に由来するものを含む（Ｂｏｍｆｏｒｄら， Ｖａｃｃｉｎｅ， １０（９）：５７２−５７７， １９９２）。
【００７８】
ＱＳ２１およびコレステロールを含むこの製剤は、抗原とともに製剤化されると、Ｔｈ１刺激アジュバントとして良好であることが示されている。したがって、たとえば、ＣＡＳＢ７４３９は、ＱＳ２１とコレステロールとの組み合わせを含むアジュバントとともに免疫原性組成物で有利に使用されることができる。
【００７９】
免疫賦活性オリゴ核酸
ＣＡＳＢ７４３９との組み合わせで用いる１つの適切なアジュバントは、ＴＬＲ−９を介してシグナリング応答を起こすことができるバクテリアＤＮＡのＴＬＲアゴニスト、すなわちＴＬＲ−９アゴニストであり、より具体的には、ＣｐＧモチーフとして知られている特定の配列構成において、非メチル化ＣｐＧヌクレオチドを含むＤＮＡである。ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドは、主にＴｈ１応答を誘導する。かかるオリゴヌクレオチドは周知であり、かつたとえば、国際公開第ＷＯ９６／０２５５５号、国際公開第ＷＯ９９／３３４８８号、ならびに米国特許第６，００８，２００号および第５，８５６，４６２号に記述されている。適切には、ＣｐＧヌクレオチドは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。本発明の免疫原性組成物で用いる適切なオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含むＣｐＧ、少なくとも３個、適切には少なくとも６個以上のヌクレオチドによって分離された２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを任意に含むＣｐＧである。ＣｐＧモチーフは、その後にグアニンヌクレオチドが続くシトシンヌクレオチドである。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、通常はデオキシヌクレオチドである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間は、ホスホロジチオアート結合、または適切にはホスホロチオアート結合ではあるが、ホスホロジエステル結合および他のヌクレオチド間結合も本発明の範囲内である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間結合と混合される。ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオアートを生成する方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、第５，２７８，３０２号および国際公開第ＷＯ９５／２６２０４号に記述されている。
【００８０】
代替実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナリング応答を引き起こすことができるＴＬＲアゴニストが用いられる。一実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナリング応答を引き起こすことができるＴＬＲアゴニストは、ＨＳＰ９０である。たとえば本明細書に述べたような異なるアジュバントの組み合わせを、ＣＡＳＢ７４３９を含む組成物で用いることもできる。たとえば、すでに記述したようにＱＳ２１は３Ｄ−ＭＰＬとともに製剤化されることができる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの割合は、通常、ほぼ１：１０から１０：１の程度、たとえば１：５から５：１であり、実質的に１：１が多い。通常、この割合は、３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１が２．５：１から１：１の範囲である。別のアジュバントの組み合わせは、リポソーム製剤で、またＣｐＧとの組み合わせにおける３Ｄ−ＭＰＬ＋ＱＳ２１である。
【００８１】
結腸直腸癌の患者
本明細書に記述する方法への関与のための結腸直腸癌の患者の選択は、臨床診断、分子診断、またはその組み合わせによって行うことができる。一部の実施形態では、患者はそれらの癌細胞がＣＡＳＢ７４３９（ＨＡＳＨ２）を発現するかどうかを決定するために試験される。結腸直腸癌を診断する臨床方法は、当技術分野で知られている。癌細胞または癌組織がＣＡＳＢ７４３９（ＨＡＳＨ２）を発現するかどうかを決定するための分子技術および分子法は、国際公開第ＷＯ０１／６２７７８号に開示されている。
【実施例】
【００８２】
実験的な実施例
実施例１
ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドを含むタンパク質構築物をコードする２種類の核酸分子をｐＥＴ１９ｂベクターで作製した。Ｈｉｓ−タグをＣＡＳＢ７４３９配列のＮ末端側終端に並置した。これらのクローンをそれぞれ、ＬＶＬ００７［配列番号１５（ａａ）；配列番号１６（ＤＮＡ）］およびＬＶＬ０１０［配列番号１７（ａａ）；配列番号１８（ＤＮＡ）］と名付けた。予想外の変異がＬＶＬ００７クローンに起こり、プロリンのロイシンへのアミノ置換が１つ生じた（配列番号１３に関してアミノ酸残基１７で）ことが観察された。核酸分子は、３種類の異なる宿主細胞型、すなわち、大腸菌株ＢＬＲ ＤＥ３、ＢＬ２１ ＤＥ３、およびＲｏｓｅｔｔａ ＤＥ３を用いて利用された。誘導は、誘導ごとに２段階の温度（１６℃または３７℃）で、かつ１ｍＭのＩＰＴＧを用いて実行した。プロトコールの詳細については、後述の材料および方法の節を参照されたい。
【００８３】
誘導ごとにタンパク質を収集して、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色法を用いてＷｅｓｔｅｒｎブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。これらの実験では、タンパク質の検出は、Ｗｅｓｔｅｒブロットにおいてのみ明らかであった。
【００８４】
実施例２
ＣＡＳＢ７４３９遺伝子のバイオインフォマティック解析を実行し、以下の構造的特徴を明らかにした：
・配列番号１４のヌクレオチド２と２７との間に位置するヘアピンＲＮＡ構造要素
・該ヌクレオチド配列の６２％ＧＣ含有率
・アルギニンコドン（２６／１９３アミノ酸がコードされた）における豊富なヌクレオチド配列
・高レベルの塩基性アミノ酸残基を有するアミノ酸配列
・高い等電点（１１．１８）を有するアミノ酸配列
・アミノ酸配列（配列番号１３の残基７〜２７）内の低複雑性領域
・アミノ酸配列（配列番号１３の残基５６〜１０８）内のヘリックス・ループ・ヘリックスドメイン（ＨＬＨ）（ＩＰＲ００００１４）
・アミノ酸配列（配列番号１３の残基１１８〜１６４）内の天然変性の第１の領域
・アミノ酸配列（配列番号１３の残基１１８〜１６４）内の天然変性の第２の領域。
【００８５】
出願人らは、アミノ酸１２７〜１５８の高プロリン周期性を有する領域も同定した。出願人らは、配列番号１３（ａａ）のアミノ酸１３３〜１５３を含むアミノ酸からの領域をプロリンリッチ領域と名付けた。本実施例で記述した一部の他の特徴とともに、プロリンリッチ領域を、本明細書の他の箇所で記述した領域とともに、図１に模式的方法で表す。
【００８６】
実施例３
非改変型ＣＡＳＢ７４３９ＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号１４）を、商用ＤＮＡ合成サービスプロバイダーであるＧｅｎｅａｒｔ によって最適化し（固有識別番号０６０６５９７）、クローン化した。Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ， ＢｉｏＰａｒｋ， Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒ． １１Ｄ−９３０５３ Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ。ＣＡＳＢ７４３９ヌクレオチド配列は、ＰＣＲ増幅法によってクローンから得て、それを用いて２つの構築物を作製した。第１の構築物において、ＬＶＬ０１６［配列番号２９（ａａ）、配列番号３０（ＤＮＡ）］であるＣＡＳＢ７４３９の配列を、ＣＡＳＢ７４３９配列のＮ末端側終端でｐＤ１／３タンパク質（インフルエンザ菌由来）との融合でｐＥＴ２１ｂ（＋）ベクターに挿入した。第２の構築物において、ＬＶＬ１８［配列番号３１（ａａ）；配列番号３２（ＤＮＡ）］を、ｐＥＴ２１ｂ（＋）ベクター（いかなるタンパク質Ｄ成分も含まない）に挿入した。これらの構築物を、１６℃および３７℃で、１ｍＭのＩＰＴＧを用いてＢＬＲ ＤＥ３大腸菌での生成について評価した。生成は、主に１６℃で生成された非可溶性タンパク質としてＷｅｓｔｅｒｎブロットによって検出可能であった。
【００８７】
以下の４つのＣＡＳＢ７４８９ドメインを選択して、タンパク質の生成を改善するために、さらなる検討を行った：核標的ドメイン、プロリンリッチ領域、ＤＮＡ結合ドメイン、およびＨＬＨドメイン。
【００８８】
実施例４
ＣＡＳＢ７４３９の核標的ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ｂＨＬＨドメイン、およびプロリンリッチ領域を選択して、ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む構築物からのタンパク質の生成を検討した。ＣＡＳＢ７４３９ヌクレオチド配列の異なるセクションを、本明細書に記述するコドン最適化ＧｅｎｅａｒｔクローンからＰＣＲ増殖し、次いでｐＥＴ１９ｂ（＋）ベクターに挿入し、異なるＣＡＳＢ７４３９配列（何らかの方法でトランケートした配列、または完全な配列）を有する５つの構築物；ＣＡＳＢ７４３９配列のＮ末端にポリヒスチジン尾部を有する各構築物をもたらした。図２を参照されたい。
【００８９】
図２に示したそれらの構築物は、３７℃および１６℃で、１ｍＭのＩＰＴＧを用いてＢＬＲ ＤＥ３大腸菌におけるタンパク質の発現を評価した。図２に表したように、これらの構築物は、完全長のＣＡＳＢ７４３９［ＬＶＬ０６０、配列番号１９（ａａ）、配列番号２０（ＤＮＡ）］；核標的ドメインを除去するためにトランケートしたＣＡＳＢ７４３９［Ｃｏｎｓｔ−１、配列番号２１（ａａ）、配列番号２２（ＤＮＡ）］；プロリンリッチ領域を除去するためにトランケートしたＣＡＳＢ７４３９［ＬＶＬ０５５、配列番号１（ａａ）、配列番号２（ＤＮＡ）］；ＤＮＡ結合ドメインを除去するためにトランケートしたＣＡＳＢ７４３９［ＬＶＬ０５６、配列番号２３（ａａ）、配列番号２４（ＤＮＡ）］；基本的なヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）ドメインを除去するためにトランケートしたＣＡＳＢ７４３９［ＬＶＬ０５７、配列番号２５（ａａ）、配列番号２６（ＤＮＡ）］を含んだ。実験誤差のため、Ｃｏｎｓｔ−１は終止コドンが欠けており、結果として一部のベクターヌクレオチド配列の翻訳がもたらされた（ＬＥＤ．．．から始まる、Ｃ末端領域でさらに２１アミノ酸が生じた）。１６℃でのインキュベーションに続いてＬＶＬ０５５の生成（トランケートしたＣ末端）がＣｏｏｍａｓｓｉｅ−ブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、はっきりと検出できた。
【００９０】
実施例５
実施例４に記述した結果に基づいて、（ｉ）プロリンリッチ領域を除去し、一方（ｉｉ）該ポリペプチドのＣ末端部分の他の領域を保持するよう、新規構築物をデザインした。図３および４の説明を参照されたい。これらの図では、（ｉ）該ポリペプチド内で同定されたまたは予測される種々のエピトープと、（ｉｉ）プロリンリッチ領域の除去のための代替アプローチとを説明している。
【００９１】
次いで、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドをコードするコドンを最適化した合成核酸遺伝子配列を、Ｇｅｎｅａｒｔから注文し（固有認識番号０７０６８４０）、２つの異なるベクター内で消化させて、同時に挿入して、以下の構築物を作製した：
（ｉ）プロリンリッチ領域を除去し、ｐＥＴ２６ｂ（＋）ベクター内のＣ末端でポリヒスチジン尾部と融合させた、２１アミノ酸を有するＣＡＳＢ７４３９遺伝子を含むＬＶＬ０８８（配列番号２７（ａａ）、配列番頭２８（ＤＮＡ））および
（ｉｉ）２１アミノ酸プロリンリッチ領域を除去し、かつｐＥＴ１９ｂ（＋）ベクター内にＮ末端およびＣ末端の両方にポリヒスチジン尾部を有するＣＡＳＢ７４３９遺伝子を含むＬＶＬ１１１（配列番号３（ａａ）、配列番号４（ＤＮＡ））。
【００９２】
ＬＶＬ１１１構築物（配列番号３を参照されたい）を、ＬＶＬ０５５で用いたのと同じ戦略に従って、すなわち、１０個のヒスチジンとそれに続くエンテロキナーゼ部位とで構成されるポリヒスチジン尾部を含むｐＥＴ１９（＋）ベクターを用いてクローン化した。
【００９３】
これにより、Ｎ末端に２３アミノ酸融合パートナー（配列番号４２）を得た。
【００９４】
他の構築物は、実施例３に記述したコドンを最適化した合成遺伝子（固有識別番号０６０６５９７）を用いて作製し、以下を含む：
・ＬＶＬ０９０（（Ｎ末端から）ｐＥＴ２１ベクター中にタンパク質Ｄ、完全長の最適化ＣＡＳＢ７４３９、および６−Ｈｉｓを含むタンパク質構築物）（配列番号４３（ａａ）；配列番号４４（ＤＮＡ））
・ＬＶＬ１１２（（Ｎ末端から）ｐＳＵＭＯベクター中にＳＵＭＯタンパク質、完全長の最適化ＣＡＳＢ７４３９を含むタンパク質構築物）（配列番号４５（ａａ）；配列番号４６（ＤＮＡ））
・ＬＶＬ１１３（（Ｎ末端から）ｐＳＵＭＯベクター中にＳＵＭＯタンパク質、ｐＤ１／３タンパク質、完全長の最適化ＣＡＳＢ７４３９を含むタンパク質構築物）（配列番号４７（ａａ）；配列番号４８（ＤＮＡ））
・ＬＶＬ１１４（（Ｎ末端から）ｐＳＵＭＯベクター中にＳＵＭＯタンパク質、アミノ酸１１７でトランケートしたＣＡＳＢ７４３９を含むタンパク質構築物）（配列番号４９（ａａ）；配列番号５０（ＤＮＡ））
・ＬＶＬ１１５（（Ｎ末端から）ｐＳＵＭＯベクター中にＳＵＭＯタンパク質、プロリンリッチ領域を除去した改変型ＣＡＳＢ７４３９を含むタンパク質構築物）（配列番号５１（ａａ）；配列番号５２（ＤＮＡ））。
【００９５】
生成において何ら改善は観察されなかったが、繰返しを１回のみ行った（データ図示せず）。
【００９６】
ＬＶＬ０８８の生成は、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて３７℃および１６℃で一晩誘発させた後に解析した。電気泳動で解析した際に、ＬＶＬ０８８生成は、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットでのみ可視化できた。８００ｍＬ培養フラスコ４本からの１精製ロットで、０．４ｍｇのタンパク質を得た。他方、ＬＶＬ１１１は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−ブルー染色法に従って容易に検出可能であった。組換えタンパク質ＬＶＬ１１１を８ロット以上生成して精製した。ＬＶＬ１１１のいくつかのロット（各ロットは、８００ｍＬ培養フラスコ４本から）は、３．３ｍｇ／ロット〜１０ｍｇ／ロットの範囲で精製タンパク質を生成すると推定された。したがって、ＬＶＬ０８８の生成は、ＬＶＬ１１１で見られた生成よりも下回った。精製タンパク質は、いくつかの抗ＣＡＳＢ７４３９モノクローナル抗体を用いてその反応性も試験し、すべてのケースにおいて陽性反応性が得られた。
【００９７】
実施例６
ＬＶＬ１１１構築物からのＣ末端ポリヒスチジン尾部の除去を検討した。Ｃ末端ポリヒスチジンをコードする部分を含まないポリプロ（−）ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドをコードする核酸分子を、ＬＶＬ１１１構築物からＰＣＲで増幅し、次いでｐＥＴ１９ｂベクターにクローン化した。この構築物をＬＶＬ１３７と名付けた。ＬＶＬ１３７構築物は本質的に、Ｃ末端ポリヒスチジン尾部をコードするヌクレオチド配列を含まないＬＶＬ１１１であった。配列番号５（ａａ）；配列番号５（ＤＮＡ）。Ｃ末端ポリヒスチジン尾部の除去は、生成レベルへの影響を明らかに及ぼさなかった。Ｃｏｏｍａｓｉｅで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで解析すると、ＬＶＬ１３７はＬＶＬ１１１と同じレベルのタンパク質を生成した。
【００９８】
次いで、ポリプロ（−）ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドをコードする核酸分子を、Ｇｅｎｅａｒｔ（０７０６８４０）合成ＣＡＳＢ７４３９配列からＰＣＲで増幅して、Ｎ末端で６ポリヒスチジンタグを有するｐＥＴ２６ベクターにクローン化した。配列番号３３（ａａ）；配列番号３４（ＤＮＡ）。この構築物は、タンパク質生成レベルで著しい減少を示し、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットによる検出が困難であった。
【００９９】
ポリプロ（−）ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドのＮ末端で６ポリヒスチジンタグをコードする核酸分子を、ｐＥＴ２４カナマイシン耐性ベクター中で作製した。新規リンカーのデザインを使用して、ＣＡＳＢ７４３９遺伝子のポリヒスチジンタグ配列と５’末端との間に生成されたヘアピン構造を除去した。具体的には、該タンパク質構築物の最初の８個のアミノ酸残基のためのコドンを、以下のヌクレオチド配列に変えた：５'ＡＴＧ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＧＡＣ ３'（配列番号３５）。（最初のコドンは、５'ＡＴＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＴ ３'（配列番号３６）であった。）この構築物をＬＶＬ１６０と名付けた。配列番号３７（ａａ）：配列番号３８（ＤＮＡ）。ゲルおよびＷｅｓｔｅｒｎブロット解析では、タンパク質生成は、ＬＶＬ１３８で得たのと同じ程度弱く現れた。
【０１００】
ポリプロ（−）ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドのＮ末端で１０ポリヒスチジンタグを有するタンパク質構築物をコードする核酸分子を、ｐＥＴ２４カナマイシン耐性ベクター中で作製した。この構築物をＬＶＬ１６８と特定した。配列番号１１（ａａ）；配列番号１２（ＤＮＡ）。この生成レベルは、ＬＶＬ１１１で観察されたレベルに匹敵した。本実施例で述べた構築物のいくつかの配列比較を図５に示す。
【０１０１】
本実施例および実施例１に述べた構築物の結果を以下の表１に要約する。
【表１】

【０１０２】
表１．実施例１、３、および６に記述した構築物の発現レベル。
【０１０３】
全細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに掛けると、「ゲル−／ブロット＋」生成をもたらす構築物は通常、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットによってのみ見える。全細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに掛けると、「ゲル＋＋＋／ブロット＋＋＋」生成をもたらす構築物は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色によって明瞭に見える。
【０１０４】
６Ｈｉｓ：ヒスチジンタグ＝６ヒスチジン残基
長いＨｉｓ＝２３ａａ（ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＳＳＧＨＩＤＤＤＤＫＨ）（配列番号４２）
Ｄｅｌ−ポリ−プロ−ドメイン：プロリンリッチ領域の除去による改変型ＣＡＳＢ７４３９
ＯＰＴ：最適化コドン
Ｈｉｓｍｏｄｉｆ：コドン選択のために改変されたヒスチジンタグ（本明細書の実施例６を参照されたい）
１／３ｐＤ：本明細書に記述するタンパク質Ｄ構築物
１０Ｈｉｓ：１０個のヒスチジン残基をもつヒスチジンタグ。
【０１０５】
実施例７
別のＣＡＳＢ７４３９構築物を、インフルエンザ菌に由来するタンパク質Ｄの断片との融合で作製した。配列番号３９（ａａ）（（配列番号４０（ＤＮＡ））に示すように、アミノ酸Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏを、プロセシングしたタンパク質Ｄの１０８Ｎ末端アミノ酸（プロセシングしたタンパク質Ｄのアミノ酸残基１〜１０９）に融合した。配列番号３９を本明細書では１／３ｐＤまたは１／３タンパク質Ｄと呼ぶ。ＬＶＬ１４１を得るために、Ｇｅｎｅａｒｔから入手した合成ＣＡＳＢ７４３９ヌクレオチド配列（０７０６８４０）（プロリンリッチ領域除去型）を、１／３３ｐＤを含むカナマイシン耐性プラスミドであるｐＥＴ２６−１／３ｐＤ中でサブクローン化した。ＬＶＬ１４１の配列を、配列番号７（ａａ）および配列番号８（ＤＮＡ）に記載する。生成は、ＬＶＬ１１１に匹敵した。
【０１０６】
次いで、このクローンをＰＣＲによって変異させて、１／３ｐＤと、ＣＡＳＢ７４３９成分との間の４アミノ酸リンカー（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ）を除去した。結果として得た構築物の配列をＬＶＬ１４４と名付け、配列番号９（ａａ）および配列番号１０（ＤＮＡ）に記載する。生成はＬＶＬ１１１に匹敵した。図６は、ＣＡＳＢ７４３９（配列番号１３）；ＬＶＬ１６８（配列番号１２）；ｐＤ１／３（配列番号３９）；およびＬＶＬ１４４（配列番号）の配列比較を示す。
【０１０７】
実施例８
ＬＶＬ１６８の可溶化試験
概して、ＣＡＳＢ７４３９を含む精製タンパク質構築物を６Ｍグアニジン緩衝液に可溶化して、８Ｍ尿素緩衝液に移し、次いで４Ｍ尿素、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＴＣＥＰ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０中で保存する。少容量で行った予備段階の結果は、ＬＶＬ１６８も、尿素、またはＥＤＴＡもしくはＴＣＥＰなどのいかなる還元剤も含まないリン酸緩衝液中で、かつＮａＣｌの有無に係らず、可溶化され得ることを示唆した。これらの緩衝液での透析の後、沈殿物は、何ら観察されなかった。可溶化アッセイを行い、表２に記載した１６の緩衝液中のＬＶＬ１６８タンパク質を特徴づけた。８Ｍ尿素緩衝液、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．０中の１００μリットルの精製ＬＶＬ１６８タンパク質試料を、該緩衝液で２回すすいで事前に調整し、ミニ透析ユニット、１００００ＭＷＣＯ（Ｂｉｏｌｙｎｘ）に入れた。表２に記載した１６種の緩衝液、それぞれ１００ｍＬ中、４℃で攪拌した状態で、一晩透析を行った。次いで、ユニットから試料を収集して、三角フラスコにいれて、２０，０００ｇで５分間遠心させた。遠心後、可溶性タンパク質は懸濁液中に残ったが、非可溶性タンパク質は沈殿して、ペレット状になった。ＬＶＬ１６８タンパク質が溶解した緩衝液を表２に記載する。
【０１０８】
ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥで上清を試験し、次いで残っている可溶性タンパク質の濃度を製造業者の説明書を用いて、ＲＣ ＤＣ法で測定した。Ｌｏｗｒｙ変法のＲＣ ＤＣ法を実行するキットは、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１０００ Ａｌｆｒｅｄ Ｎｏｂｅｌ Ｄｒｉｖｅ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ ９４５４７）から入手可能である。試料は、安定性試験のために４℃で保持した。
【０１０９】
ＬＶＬ１６８の安定性試験
可溶化アッセイに由来するＬＶＬ１６８タンパク質を４℃で７日間保持した。２、３、５、６、９〜１６の試料をそれぞれ２０μリットル、別のチューブに移し、４℃、３７℃または室温でさらに２日間、それらの安定性に対する試験を行った。試料を２０，０００ｇで5分間遠心させた。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、最初の精製タンパク質と比較することによって、タンパク質の分解、凝集または損失についてプロファイルを解析した。該タンパク質は、試験した大部分の緩衝液中で安定だった。
【表２】

【０１１０】
表２．ＬＶＬ１６８に関する溶解性および安定性の試験
便宜上、本明細書に記述する構築物およびそれらの関連生成の概要を表３に示す。
【表３】

【０１１１】
表３． 表１．の省略形を参照されたい。以下のさらなる省略形を表３．で使用する：
ｔｒｕｎｃ：トランケート型
ｃｏｎｓｔ：構築物
ｍｕｔ：ｐＤ１／３と改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドとの間の非関連アミノ酸を除去するために変異させた配列
リンカー：分子の２つの部分の間の非関連アミノ酸
ＤＮＡ結合：ＤＮＡ結合ドメイン
ｂＨＬＨ単独：基本的なヘリックス・ループ・ヘリックスドメイン。
【０１１２】
材料および方法
発現−小規模誘導：
大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株を、本明細書に記述する構築物で形質転換し、適切な抗生物質（４０μｇ／ｍＬのカナマイシンまたは１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン）を含むＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）寒天プレート上に播いて、３７℃で一晩インキュベートした。結果として得た菌叢を用いて、適切な抗生物質（４０μｇ／ｍＬのカナマイシンまたは１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン）を含む２０ｍＬのＬＢ代替タンパク質源（ＡＰＳ）培地に播種して、０．５〜１．０のＯＤ６００に達するまで３７℃でインキュベートした。
【０１１３】
１６℃または３７℃のいずれかで、１ｍＭのＩＰＴＧを加えることによって誘発させた。１６℃で誘発するために、増殖培養物を氷上で１時間冷却させてから、組換えタンパク質の発現を誘発した。次いで該培養物を１６℃での増殖に戻し、これらの条件下で１６時間維持した。３７℃で誘導するために、増殖培養物にＩＰＴＧを加えることによって組換えタンパク質の発現を直ちに誘導させた。３７℃で３時間、誘導を維持した。誘導の前後に、１ｍＬの小アリコートを採取した。
【０１１４】
次いで、アリコートを遠心し（４℃、２０００×ｇで１０分間）、細菌ペレットを解析まで−２０℃で保持した。製造業者の提案に従ってＢｕｇＢｕｓｔｅｒタンパク質の抽出の後に、解析を行った。Ｎｏｖａｇｅｎが製造したＢｕｇＢｕｓｔｅｒは、ＶＷＲから市販されている。発現レベルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＣｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色法およびＷｅｓｔｅｒｎブロットによって測定した。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ抽出に由来するペレット中のタンパク質または上清中のタンパク質の検出後に、溶解性を評価した。
【０１１５】
発現−大規模誘導：
大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株を、本明細書に記述する構築物で形質転換し、適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレート上に播種して、３７℃で一晩インキュベートした。結果として得た菌叢を用いて、適切な抗生物質（４０μｇ／ｍＬのカナマイシンまたは１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン）を含む所望数の８００ｍＬフラスコのＬＢ ＡＰＳ培地に播種して、０．５〜１．０のＯＤ_６００に達するまで３７℃でインキュベートした。次いで、８００ｍＬの増殖培養物を含有する２．５Ｌフラスコを、氷上で１時間冷却させてから、１ｍＭのＩＰＴＧを加えて組換えタンパク質の発現を誘導した。１６℃で誘導するために、増殖培養物を氷上で１時間冷却させてから、誘導した。次いで該培養物を１６℃での増殖に戻し、これらの条件下で１６時間維持した。
【０１１６】
培養物を遠心し（４℃、６０００×ｇで１５分間）、細菌ペレットを精製プロセスまで−８０℃で保持した。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ誘導の前後に１ｍＬの小アリコートを採取して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎブロットによって解析してから、精製した。
【０１１７】
精製
細菌ペレットを、溶解緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＴＣＥＰを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０））およびプロテアーゼ阻害剤の混合物（コンプリートＥＤＴＡフリー）中で再懸濁させた。Ｖｉｂｒａ ｃｅｌｌ超音波プロセッサ上で１３ｍｍプローブを用いる超音波処理によって、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３（Ａｖｅｓｔｉｎ）またはＣｏｎｓｔａｎｔ Ｃｅｌｌ破壊装置（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）によってのいずれかで、細菌を溶解させた。可溶性（上清）および不溶性（ペレット）の成分を、４℃で、２００００ｇで２０分間遠心させて分離した。ＣＡＳＢ７４３９組換えタンパク質は、ペレット中にあることが予想されるので、上清は処分した。
【０１１８】
通常、不溶性成分（ペレット）は、６ＭグアニジンＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＴＣＥＰを含有する５０ｍＭビシン緩衝液、ｐＨ８．０中で再可溶化させ、次いで（２００００×ｇで２０分間）遠心させた。以前の緩衝液中ですでに前平衡させたが、ＴＣＥＰ濃度を１ｍＭまで下げて、５ｍＬ Ｈｉｓ Ｔｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を充填した。充填した後、該カラムを同じ緩衝液で１回洗浄した。６Ｍ ＧｎＨＣｌカオトロープ剤を８Ｍ尿素（８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ８．０）と置換した。８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰおよび２５０ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて溶出を行った。溶出画分からの試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、次いで目的のタンパク質を含有する画分をプールした。必要に応じて遠心分離機上で濃縮して、精製の第２の段階で用いた。
【０１１９】
純度の必要に応じて、８Ｍ 尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭＴＣＥＰでＳＥＣ（分子ふるいクロマトグラフィー）（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１または２段階を行ってから、脱塩の最後の段階を行った。脱塩は、４Ｍ尿素、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＴＣＥＰを含有する最終２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で前平衡させたＧ２５脱塩カラム上で行った。
【０１２０】
タンパク質試料を、チューブに１ｍＬに等分して、−８０℃で保管した。
【０１２１】
タンパク質分析−濃度決定
タンパク質濃度は、ＲＣ ＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄによるＬｏｗｒｙ変法）を用いて決定した。古典的なＬｏｗｒｙまたはＢＣＡアッセイで用いる最終緩衝液の一部の成分が不適合（高含量の尿酸および還元剤）であるために、このアッセイを用いた。既知量の最終タンパク質調製も、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットによって解析し、および凝集または分解、大腸菌タンパク質およびＬＰＳ混入レベルを評価するために、ＬＡＬ含有を解析した。
【０１２２】
実施例９
正常組織および結腸直腸癌（ＣＲＣ）組織におけるＣＡＳＢ７４３９発現の検証
出願人らは、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した８３のＣＲＣ試料および１２の正常な結腸試料でＣＡＳＢ７４３９ ｍＲＮＡ発現のリアルタイムｑＰＣＲ解析を行った。ＣＡＳＢ７４３９ ｍＲＮＡは、正常組織と比較して試験したＣＲＣ試料の６３％で、正常結腸と比較するとＣＲＣにおいて少なくとも１０倍過剰に発現した（平均ＣＡＳＢ７４３９／β−アクチン発現比として報告されたデータ）(図７）。加えて、出願人らは、ウサギ抗ＣＡＳＢ７４３９モノクローナル抗体（４０−１２）（本明細書の他の箇所で記述した抗体）を用いて、ヒトＣＲＣ組織で免疫蛍光法（ＩＦ）によってＣＡＳＢ７４３９タンパク質を検出したが、ＣＡＳＢ７４３９タンパク質は、正常な隣接組織切片では検出されなかった。
【０１２３】
ＣＡＳＢ７４３９に関するさらなる発現データを、標準技法を用いるＧｅｎｅＬｏｇｉｃ（Ｇｅｎｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）解析によって作製した。ＣＡＳＢ７４３９ ｍＲＮＡは、該疾患のすべてのステージからのＣＲＣ試料において高度に発現することがわかった（データ図示せず）。出願人らは、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した８３のＣＲＣ試料および１２の正常な結腸試料でＣＡＳＢ７４３９ ｍＲＮＡ発現のリアルタイムｑＰＣＲ解析を行った。ＣＡＳＢ７４３９ ｍＲＮＡは、正常組織と比較して試験したＣＲＣ試料の６３％で、正常な結腸と比較するとＣＲＣにおいて少なくとも１０倍過剰に発現した（平均ＣＡＳＢ７４３９／β−アクチン発現比として報告されたデータ）(図７）。
【０１２４】
独立した文献では、結腸陰窩の底で非常に低いレベルでのｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＩＳＨ）によるＣＡＳＢ７４３９、すなわちＨＡＳＨ−２、ｍＲＮＡの検出が報告されているが、胎盤以外の他の正常組織での検出は報告されていない。Ｊｕｂｂら（２００６） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２５：３４４５−３４５７。結腸直腸癌（ＣＲＣ）組織では、ＣＡＳＢ７４３９ ｍＲＮＡは、試験したヒト組織の７０％で１５倍過剰発現することを示している。
【０１２５】
ＣＲＣ組織および隣接の正常結腸組織におけるＣＡＳＢ７４３９タンパク質発現
正常組織およびＣＲＣ組織でのＣＡＳＢ７４３９タンパク質発現を免疫蛍光法によって解析するために、特異的ウサギ抗ＣＡＳＢ７４３９モノクローナル抗体（４０−１２）を開発した。出願人らは、ＣＡＳＢ７４３９に対して産生されたウサギハイブリドーマを商用プロバイダーのＥｐｉｔｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．から入手して、スクリーニングを行った。該ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体をまず、組換えタンパク質ＬＶＬ１１１（配列番号３）を用いてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。該モノクローナル抗体の特異性は、ＬＶＬ１１１と、ＣＡＳＢ７４３９を発現するよう操作された組換え細胞系から得た細胞可溶化物とを用いてＷｅｓｔｅｒｎブロットによって検証した（以下のＴＣ１／ＣＡＳＢ７４３９を参照されたい）。ＴＣ１／ＣＡＳＢ７４３９腫瘍（マウス内で増殖）、ＳＷ−６２０細胞とＳＷ−４８０細胞（ＣＡＳＢ７４３９陽性ヒト結腸直腸癌細胞系）、およびＨＣＴ−１１６細胞（ＣＡＳＢ７４３９陰性ヒト結腸直腸癌細胞系）でのＣＡＳＢ７４３９タンパク質発現を、モノクローナル抗体を用いる免疫蛍光法によって評価した。該モノクローナル抗体４０−１２を、ＣＡＳＢ７４３９タンパク質発現検証のために選択した。
【０１２６】
出願人らは、ＮＤＲＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ， ８ Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｅｒ， ８ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， １６２８ ＪＦＫ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ １９１０３）から、１７名の種々の個人に由来するＣＲＣ組織および正常な隣接組織の両方のＯＣＴ包埋凍結組織試料を入手した。これらの個人のうちの５名については、転移性組織も入手した。出願人らは、１７の原発腫瘍、１７の正常な隣接組織、および５の転移性組織をスクリーニングした。分析した１７の原発性ＣＲＣ腫瘍のうちの１３は、ＣＡＳＢ７４３９タンパク質発現が陽性であった（７６．５％）。これらのＣＡＳＢ７４３９陽性試料のすべては、腺癌であった。正常な隣接組織のいずれも、検出可能な濃度のＣＡＳＢ７４３９タンパク質を発現しなかった。５の転移性組織のうちの３は、ＣＡＳＢ７４３９タンパク質発現が陽性だった（６０％）。
【０１２７】
通常の手法を用いて癌組織および正常な隣接結腸組織の両方で行ったリアルタイムｑＰＣＲ解析によって１６のＣＲＣ組織で、ＣＡＳＢ７４３９タンパク質とｍＲＮＡ発現との相関を研究した。Ｋｉ６７染色を増殖マーカーとして使用した。ＣＡＳＢ７４３９タンパク質とｍＲＮＡ発現との相関を図８に示す。免疫蛍光法によってＣＡＳＢ７４３９タンパク質を示した組織試料も、最高のＣＡＳＢ７４３９ ｍＲＮＡレベルを示した。
【０１２８】
実施例１０
マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９の免疫原性：近交系マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９Ｔ細胞の免疫原性
マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９のＴ細胞免疫原性を調べるために、通常の合成方法によってペプチドのバンクを作製し、ＣＡＳＢ７４３９タンパク質の全配列を網羅した（図９）。各ペプチドは１５長であり、１１のアミノ酸が次のペプチドと重複した。免疫優性領域を検討するために、いずれの２つのプールのペプチドも共通ペプチドが１つだけになるように、１４プールのペプチドをマトリックスによって配置した（図１０）。
【０１２９】
マウスにおけるＴ細胞免疫原性の研究のために、１群あたり１５匹までの近交系マウスおよび１０匹までの非近交系マウスに、ＧＳＫ専売品のアジュバントであるＡＳ０１ＢまたはＡＳ１５とともに製剤化された種々の組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質を種々の用量（０〜３０μｇ）で、２週間ごとに筋肉内免疫を４回投与した。一旦抗原とともに製剤化されると、ＡＳ０１Ｂは、リポソーム中ＭＰＬ（１００μｇ／ｍＬ）およびＱＳ２１（１００μｇ／ｍＬ）で構成される。一旦抗原とともに製剤化されると、ＡＳ１５は、リポソーム中ＭＰＬ（１００μｇ／ｍＬ）、ＱＳ２１（１００μｇ／ｍＬ）およびＣｐＧ７９０９（８４０μｇ／ｍＬ）で構成される。各免疫化は、２５μＬの２×濃縮アジュバントと混合した２５μＬの組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質を含有した。したがって、ＡＳ０１Ｂ群の各マウスには、５μｇのＭＰＬおよび５μｇのＱＳ２１を投与した。ＡＳ１５群の各マウスには、５μｇのＭＰＬ、５μｇのＱＳ２１、および５μｇのＣｐＧ７９０９を投与した。最後の免疫化の後、脾臓またはＰＢＬをマウスから採取した。近交系マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９免疫原性分析の場合、脾臓またはＰＢＬを個々に分析するか、またはプールした。ＣＤ１非近交系マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９免疫原性分析の場合、各脾臓を個々に処理した。
【０１３０】
ＰＢＬまたは単離した脾細胞を１ｍＬあたり１０×１０^６細胞の最終濃度で、以下の添加剤を含んだＲＰＭＩ１６４０培地中で再懸濁させた：ペニシリン−ストレプトマイシン（１×）、非必須アミノ酸（１×）、２−メルカプトエタノール（５５ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）。ＣＡＳＢ７４３９配列からのペプチド（ＲＰＭＩ１６４０＋添加剤＋５％熱失活ＦＢＳ中１μｇ／ｍＬ／ペプチドの最終濃度で用いた）で細胞を刺激した。ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＦＮγおよびＴＮＦαに対する細胞内染色（ＩＣＳ）を、従来からの方法で行った。刺激の後、細胞をブレフェルジンＡで処理し、次いで固定した。ＣＤ４およびＣＤ８の表面染色は、ＣＤ４およびＣＤ８に特異的なモノクローナル抗体を用いて行った。次いで、細胞を透過処置して、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＦＮγおよびＴＮＦαのタンパク質に対して産生された特異的モノクローナル抗体を用いて染色した。細胞は、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩを用いるフローサイトメトリーによって分析した。データは、ＩＦＮγ＋およびＴＮＦα＋ＣＤ４−Ｔ細胞またはＣＤ８−Ｔ細胞のダブルポジティブパーセンテージで表す。
【０１３１】
近交系マウス多系統のＴ細胞免疫原性の比較実験
出願人らは、ＡＳ０１ＢまたはＡＳ１５のいずれかと製剤化したＣＡＳＢ７４３９タンパク質の免疫原性を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ， ＱＣ， Ｃａｎａｄａから購入したＣ５７Ｂｌ／６、Ｂａｌｂ／Ｃ、ＣＢ６Ｆ１（Ｃ５７Ｂｌ／６をＢａｌｂ／Ｃマウスと交雑させた第一世代の子孫）およびＣ３Ｈ近交系マウスで比較した。１群あたり５匹のマウスに、ＡＳ０１ＢまたはＡＳ１５のいずれかと製剤化した組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質（ＬＶＬ１１１）１０μｇによって免疫した。脾臓を採取してプールした（１プールは１群あたり５脾臓からなる）。各系統のＬＶＬ１１１へのＣＤ４−Ｔ細胞応答（ダブルポジティブＩＦＮγ＋およびＴＮＦα＋）を、ＡＳ０１Ｂ製剤に関しては図１１に、ＡＳ１５製剤に関しては図１２に示す。４系統の近交系マウスのいずれにおいても、ＣＤ８−Ｔ細胞（ダブルポジティブＩＦＮγ＋およびＴＮＦα＋）応答は観察されなかった。
【０１３２】
ＣＡＳＢ７４３９＋ＡＳ１５によって免疫された近交系マウスで特定されたＣＡＳＢ７４３９免疫優位性ペプチドを、図１３に示す。免疫優性ペプチドおよび配列番号１３のそれに相当する領域を有する系統は、以下のとおりである。
【０１３３】
・Ｃ５７Ｂｌ／６：ペプチド３９（配列番号９１）（配列番号１３のａａ１５３〜１６７）
・Ｂａｌｂ／ｃ：ペプチド２４（配列番号１３のａａ９３〜１０７）
・ＣＢ６Ｆ１：ペプチド７〜８（配列番号１３のａａ２５〜４３）および２３〜２４（配列番号１３のａａ８９〜１０７）
・Ｃ３Ｈ：ペプチド９〜１１（配列番号１３のａａ３３〜５６）、１６〜１９（配列番号１３のａａ６１〜８７）および４１〜４３（配列番号１３のａａ１６１〜１８３）。
【０１３４】
ＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８およびＬＶＬ１４４についての近交系マウスＴ細胞免疫原性研究
ＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８、およびＬＶＬ１４４の免疫原性を近交系マウスＣＢ６Ｆ１マウスで研究した。本実験では、１群あたり５匹のマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ， ＱＣ， Ｃａｎａｄａ）に、ＡＳ１５とともに製剤化された組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質（ＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８およびＬＶＬ１４４）を２週間ごとに４回免疫した。各免疫化は、本明細書の他の箇所で記述したように２５μＬの２×濃縮アジュバントと混合した２５μＬの組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質を含有した。ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞応答（ダブルポジティブＩＦＮγおよびＴＮＦα）を、個々の近交系ＣＢ６Ｆ１マウスにおいて、ＣＡＳＢ７４３９ペプチドマトリックスで脾細胞を再刺激してから、細胞内染色およびフローサイトメトリー分析で測定した。（データ図示せず）３つの構築物すべてによる免疫化は、ＣＤ６Ｆ１近交系マウスにおいて同じ免疫原性領域（配列番号１３のａａ２５〜４３および配列番号１３のａａ８９〜１０７）に対してＣＤ４Ｔ細胞免疫応答を誘発した。
【０１３５】
マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９の免疫原性：非近交系マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９Ｔ細胞免疫原性
ＣＤ１非近交系マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ， ＱＣ， Ｃａｎａｄａ）に、ＡＳ０１ＢまたはＡＳ１５のいずれかと製剤化した組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質（ＬＶＬ１１１）を２週間ごとに４回免疫した。各免疫化は、本明細書の他の箇所で記述したように２５μＬの２×濃縮アジュバントと混合した２５μＬの組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質を含有した。ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞応答（ダブルポジティブＩＦＮγおよびＴＮＦα）を、個々のＣＤ１マウスにおいて、ＣＡＳＢ７４３９ペプチドマトリックスで脾細胞を再刺激してから、細胞内染色およびフローサイトメトリー分析で測定した。
【０１３６】
ＣＡＳＢ７４３９＋ＡＳ０１ＢまたはＣＡＳＢ７４３９＋ＡＳ１５のいずれかによって免疫された非近交系マウスにおいて特定したＣＡＳＢ７４３９ＣＤ４免疫原性ペプチドの表を、図１４の上段および下段のそれぞれに示す。ＣＤ１非近交系マウスにおいて特定したＣＤ４Ｔ細胞の免疫原性領域は、以下のＣＡＳＢ７４３９の領域を網羅する（配列番号１３のアミノ酸位置に関して表した）：ペプチド８〜１０（配列番号１３のａａ２９〜５１）、ペプチド１６〜１８（配列番号１３のａａ６１〜８３）およびペプチド２４〜２６（配列番号１３のａａ９３〜１１５）。ＣＤ１非近交系マウスにおいて特定したＣＤ８Ｔ細胞の免疫原性領域は、以下のＣＡＳＢ７４３９の領域を網羅する：ペプチド１６〜１８（配列番号１３のａａ６１〜８３）、ペプチド２４〜２６（配列番号１３のａａ９３〜１１５）およびペプチド３２（配列番号１３のａａ１２５〜１３９）。（データ図示せず。）。
【０１３７】
ＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８およびＬＶＬ１４４についての非近交系マウスＴ細胞免疫原性研究
ＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８およびＬＶＬ１４４によって誘発されたＣＡＳＢ７４３９＋ＡＳ１５媒介によるＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞応答を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ， ＱＣ， Ｃａｎａｄａから購入した非近交系ＣＤ１マウスそれぞれで試験した。１群あたり５匹のマウスに、ＡＳ１５とともに製剤化された、１０μｇのＣＡＳＢ７４３９組換えタンパク質（ＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８およびＬＶＬ１４４）から構成される筋肉内免疫を２週間ごとに４回投与した。各免疫化は、本明細書の他の箇所で記述したように２５μＬの２×濃縮アジュバントと混合した２５μＬの組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質を含有した。対照群の５匹のマウスに緩衝生理食塩水によって免疫した。
【０１３８】
４回目の免疫化から２週間後、マウスを安楽死させた。ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞応答（ダブルポジティブＩＦＮγおよびＴＮＦα）を、４プールのペプチド（プール１：ペプチド８−９−１０、プール２：ペプチド１６−１７−１８、プール３：ペプチド２４−２５−２６およびプール４：ペプチド３０−３２−３２）で脾細胞を再刺激してから、細胞内染色およびフローサイトメトリー分析で測定した。データを図１５に示す。配列番号１３の同じＣＤ４Ｔ細胞免疫原性領域、特に、ペプチド１６〜１８（配列番号１３のａａ６１〜８３）およびペプチド２４〜２６（配列番号１３のａａ９３〜１１５）は、ＡＳ１５とともに製剤化された３つのＣＡＳＢ７４３９構築物のそれぞれでの免疫化後に活性化された。
【０１３９】
ＬＶＬ１４４およびＬＶＬ１６８についてのＨＬＡ Ａ２．１／ＤＲ１−トランスジェニックマウスのＴ細胞免疫原性研究
２つの構築物（ＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４）によって誘発されたＣＡＳＢ７４３９＋ＡＳ１５媒介によるＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞応答を、Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅから購入したＨＬＡ Ａ２．１／ＤＲ１−トランスジェニックマウスをプール（３匹のマウスからなる３フール）して試験した。１群あたり９匹のマウスに、ＡＳ１５とともに製剤化された６．２５μｇのＬＶＬ１６８または１０μｇのＬＶＬ１４４から構成される筋肉免疫を２週間ごとに４回投与した。各免疫化は、本明細書の他の箇所で記述したように２５μＬの２×濃縮アジュバントと混合した２５μＬの組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質を含有した。対照群の２匹のマウスに、アジュバント単独によって免疫した。
【０１４０】
４回目の免疫化から２週間後、マウスを安楽死させた。ＣＡＳＢ７４３９全配列を網羅する７プールのペプチドでＰＢＬおよび脾細胞を再刺激した後、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞応答（ＩＦＮγおよびＴＮＦαのダブルポジティブ）を細胞内染色およびフローサイトメトリー分析によって測定した［プール１：ペプチド１〜７（配列番号５３〜５９）、プール２：ペプチド８〜１４（配列番号６０〜６６）、プール３：ペプチド１５〜２１（配列番号６７〜７３）、プール４：ペプチド２２〜２８（配列番号７４〜８０）、プール５：ペプチド２９〜３５（配列番号８１〜８７）、プール６：ペプチド３６〜４２（配列番号８８〜９４）、およびプール７：ペプチド４３〜４６（配列番号９５〜９８）］。さらに、ヒトＨＬＡ ＤＲ免疫優性ペプチド２４（配列番号７６）を個々に試験した。図１６〜１９に示した結果は、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞免疫優性領域（ペプチド２２〜２８＋ペプチド２４）が、ＡＳ１５ともに製剤化した２つのＣＡＳＢ７４３９構築物のそれぞれによって免疫した後に活性化されることを示している。したがって、ペプチド２４もヒトＨＬＡ Ａ２．１免疫優性ペプチドである。これらの結果は、同じＣＡＳＢ７４３９ペプチドを用いて、ＡＳ１５とともに製剤化したＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４のいずれかによって免疫した１群あたり５匹のそれぞれから採取した脾細胞を再刺激した第２の実験でも確認された。（データ図示せず。）。
【０１４１】
マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９の免疫原性：ＣＢ６Ｆ１マウスのＣＡＳＢ７４３９媒介体液性応答の研究
ＡＳ０１ＢまたはＡＳ１５のいずれかと製剤化して、ヒト用量の１／１０で用いた１０μｇのＣＡＳＢ７４３９（ＬＶＬ１１１）に対するＣＡＳＢ７４３９媒介体液性応答を、近交系ＣＢ６Ｆ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ， ＱＣ， Ｃａｎａｄａ）で評価した。１群あたり１９匹のマウスに２週間ごとに筋肉内免疫を４回投与した。各免疫化は、２５μＬのアジュバント（２×濃縮）と混合した２５μＬの組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質を含有した。各免疫化の直前および４回目の免疫化から２週間後にマウスから採血した。別の実験では、ＬＶＬ１１１，ＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４に対するＣＡＳＢ７４３９媒介体液性応答を、近交系ＣＢ６Ｆ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ， ＱＣ， Ｃａｎａｄａ）で評価した。１群あたり５０匹のマウスに、ＡＳ１５とともに製剤化したＣＡＳＢ７４３９組換えタンパク質（ＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４）を１０μｇ、または対照群としてＡＳ１５単独を２週間ごとに４回筋肉内免疫を投与した。各免疫化は、本明細書の他の箇所で記述したように２５μＬの２×濃縮アジュバントと混合した２５μＬの組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質を含有した。４回目の免疫化から２週間後、マウスから採血した。
【０１４２】
標準方法に従って、抗ＣＡＳＢ７４３９ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの血清抗体価をＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に言うと、ＣＡＳＢ７４３９組換えタンパク質を９６ウェルプレート中でリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）でコートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）中１％ウシ血清アルブミンを用いてブロックした後、免疫されたマウスからの血清を該プレート中で、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、特異的ヤギ抗ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ標識マウス抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＡＬ， ＵＳＡ）を、３７℃で１時間付加した。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ基質試薬（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， ＯＮ， Ｃａｎａｄａ）を１５分間付加した。１Ｍ硫酸を加えることによって比色反応を停止させた。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）用いて４５０ｎｍでＯＤを測定した。特異的総ＩｇＧ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａの捕捉抗体および内部ＣＡＳＢ７４３９陽性マウス血清を用いて、抗体価を標準曲線で決定した。
【０１４３】
図２０は、ＡＳ０１ＢまたはＡＳ１５のいずれかと製剤化されたＣＡＳＢ７４３９（ＬＶＬ１１１）によって免疫されたマウスの血清中のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの抗体価の経時的解析を表す。該データは、ＡＳ１５がより高いＴｈ１を誘発することを示す（ＡＳ０１Ｂと比較すると、４回目の免疫化の後、１ｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の割合がおよそ１０倍高い（ＩｇＧ２ａは１型免疫応答の代替マーカーである））。図２１に示すように、ＡＳ１５とともに製剤化されたＣＡＳＢ７４３９タンパク質は、どの構築物（ＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４）を用いても、近交系ＣＢ６Ｆ１マウスにおいて極めて強いＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体応答を誘発する。
【０１４４】
マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９の免疫原性：ＣＤ１マウスのＣＡＳＢ７４３９媒介体液性応答の研究
ＣＡＳＢ７４３９免疫化（ＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６９またはＬＶＬ１４４）後のＣＡＳＢ８４３９媒介体液性応答を非近交系ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ， ＱＣ， Ｃａｎａｄａ）で評価した。１群あたり１０匹のマウスに、ＡＳ１５とともに製剤化されたＣＡＳＢ７４３９組換えタンパク質（ＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４）を１０μｇ（または対照群としてＡＳ１５単独で）２週間ごとに４回筋肉内免疫を投与した。各免疫化は、本明細書の他の箇所で記述したように２５μＬの２×濃縮アジュバントと混合した２５μＬの組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質を含有した。
【０１４５】
４回目の免疫化から２週間後、マウスから採血して、抗ＣＡＳＢ７４３９総ＩｇＧ血清抗体価をすでに記述したようにＥＬＩＳＡによって測定した。種々のＣＡＳＢ７４３９構築物（ＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４）によって免疫されたＣＤ１マウスは、極めて強いＣＡＳＢ７４３９特異的体液性免疫応答を発現する（図２２）。ＣＤ非近交系マウスにおいてそれぞれＬＶＬ１６８およびＬＶＬ１１１と比較すると、ＬＶＬ１４４が８〜１０倍高い抗ＣＡＳＢ７４３９総ＩｇＧ力価を誘発したことをデータは示している。
【０１４６】
実施例１１
マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９ ＡＳＣＩの抗腫瘍効力：マウス腫瘍モデルの開発
ＴＣ−１マウス腫瘍細胞またはＭＣ３８マウス結腸直腸癌細胞を用いてＣＡＳＢ７４３９タンパク質を発現するマウス腫瘍モデルを開発して、マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９媒介ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍予防を研究した。TＣ−１腫瘍細胞は、Ｔ．Ｃ． Ｗｕ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ）によって、快く提供されたものであった。該腫瘍細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの初代肺細胞から、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７の遺伝子の連続的トランスファー、ならびに以前に記述されたように（Ｌｉｎら（１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｊａｎ １；５６（１）：２１−６）ｒａｓ癌遺伝子の活性化によって作製した。マウス結腸直腸腺癌細胞系であるＭＣ３８細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から購入した。
【０１４７】
製造業者の提案に従って、非リポソーム型トランスフェクタント試薬Ｆｕｇｅｎｅ−６（Ｒｏｃｈｅ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， ＯＮ， Ｃａｎａｄａ）を用いて、これらの細胞にＣＡＳＢ７４３９をコードする構築物を安定的にトランスフェクトした。簡単に言うと、ＣＡＳＢ７４３９タンパク質の全配列をコードし、かつゼオシン耐性遺伝子を含んでいるプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏｃｉｎｅ）をＦｕｇｅｎｅ−６と混合して、無血清培地中で一晩、ＴＣ−１またはＭＣ３８の腫瘍細胞の上に付加した。トランスフェクションの後、培地＋１０％熱失活ＦＢＳ中で２４時間、細胞を回復させた。次いで、細胞を収集して、限界希釈法のために、９６ウェルプレート（１ウェルあたり５０μＬの細胞懸濁液）に分配した。細胞播種の後、該培地を、１００μｇ／ｍＬのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＯＮ， Ｃａｎａｄａ）を含有する培地＋１０％熱不活性ＦＢＳと取り替えた。選択の後、各クローンを収集して、２４ウェルプレート中で増殖させて凍結させた。ＴＣ１／ＣＡＳＢ７４３９細胞およびＭＣ３８／ＣＡＳＢ７４３９細胞におけるＣＡＳＢ７４３９ ｍＲＮＡの発現を、ＣＡＳＢ７４３９−特異的ＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブを用いて、リアルタイムｑＰＣＲで検証した。リアルタイムｑＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎ７９００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いてＴａｑＭａｎ反応キットで行った。ＣＡＳＢ７４３９タンパク質発現を、特異的抗ＣＡＳＢ７４３９モノクローナル抗体（４０−１２）を用いて、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットおよび免疫蛍光法によって評価した。
【０１４８】
ＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４細胞集団は、完全なクローンではなく、むしろ少なくとも２つのサブクローンから構成される。したがって、完全なクローンＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９細胞集団、すなわちＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２細胞を作製するために、別の限界希釈ステップを行った。
【０１４９】
マウスにおける腫瘍投与のためのＴＣ−１またはＭＣ３８の最適用量を決定するために、細胞（１マウスあたり１×１０^５〜２×１０^６細胞）の種々の用量をＣＢ６Ｆ１近交系マウスに注射した。最適用量は、ＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４およびＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２投与に対しては１マウスあたり２．５×１０^５細胞であると決定し、１マウスあたり１×１０^５細胞はＭＣ３８／ＣＡＳＢ７４３９＃３５による誘発に最適であることが分かった。
【０１５０】
マウスにおける抗腫瘍有効性：免疫および投与実験
一連の４つの研究（１．１〜１．４）をデザインし、ＣＡＳＢ７４３９媒介ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍予防を評価した。概して、これらの４つの研究のそれぞれにおいて、本研究のために選択し、本明細書の他の箇所で記述したように、最終濃度のＡＳ０１ＢまたはＡＳ１５のいずれかと製剤化された特異的組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質の種々の用量（０、１，１０または３０μｇ）で、緩衝生理食塩水とともに、単独のＣＡＳＢ７４３９タンパク質とともに、または単独のアジュバントとともに、ＣＢ６Ｆ１マウス群に２週間ごとに筋肉内免疫を４回投与した。４回目の免疫化から２週間後、ＣＢ６Ｆ１マウスに、２５０，０００のＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４細胞、１００，０００のＭＣ３８／ＣＡＳＢ７４３９＃３５細胞または２５０，０００のＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２腫瘍細胞を皮下注射で投与した。投与後、マウスごとに腫瘍の大きさを週に３回測定した。プロトコールに従って、２００ｍｍ^２を超える大きさの腫瘍を有するマウスを安楽死させた。次いで生存曲線をプロットした。
【０１５１】
さらに４つの研究（２．１〜２．４）を行って、組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質の０、１、１０または３０μｇ以外の用量を検討した。研究２．４では、雄および雌のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＡＳＢ７４３９の免疫原性と腫瘍予防の相互関係を評価し、並行してＣＢ６Ｆ１マウスも評価した。
【０１５２】
研究１．１〜２．４について、以下にさらに詳細に説明する。
【０１５３】
研究＃１．１
出願人らは、ＣＢ６Ｆ１マウスにおいてＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４投与に対して、ＡＳ０１ＢまたはＡＳ１５のいずれかと製剤化されたＬＶＬ１１１（１または１０μｇ）による免疫化によって与えられる腫瘍予防を検討した。本明細書の他の箇所で記述したように、最終濃度のＡＳ０１ＢまたはＡＳ１５のいずれかと製剤化された組換えＣＡＳＢ７４３９タンパク質（ＬＶＬ１１１）によって、１群あたり１０匹のマウスに２週間ごとに４回筋肉内免疫した。緩衝生理食塩水またはＣＡＳＢ７４３９タンパク質単独のいずれかによって免疫された２つの対照群も、試験した。４回目の免疫化から２週間後、各マウスに、２５０，０００のＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４細胞を皮下に投与した。
【０１５４】
４２日間、腫瘍増殖をフォローしたが、４２日目に安楽死させたマウスがあまりにも少なかったので、生存曲線をプロットしなかった。しかしながら、腫瘍増殖曲線は群ごとにプロットした。図２３の上段および下段のパネルは、それぞれＡＳ０１ＢおよびＡＳ１５の製剤で得られた腫瘍増殖曲線を示す。（注：ＡＳ１５は、この図では「ＡＳ０１５」として誤認されている。）ＡＳ０１ＢまたはＡＳ１５のいずれかと製剤化されたＣＡＳＢ７４３９タンパク質を投与されたＣＢ６Ｆ１マウスにおいて、ＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４腫瘍増殖が遅くなることを腫瘍増殖曲線は示している。
【０１５５】
研究＃１．２
ＬＶＬ１１１の異なる投与量（１、１０および３０μｇ）または対照を投与された１４匹のマウスからなる群本明細書の他の箇所で記述したように、最終濃度のＡＳ０１ＢまたはＡＳ１５のいずれかと製剤化されたＬＶＬ１１１の異なる用量で、２週間ごとに４回、マウスに筋肉内免疫した。４つの対照群も、ＡＳ０１Ｂのみ、ＡＳ１５のみ、緩衝生理食塩水のみ、または３０μｇのＬＶＬ１１１のみによって免疫した。４回目の免疫化から２週間後、各マウスに、２５０，０００のＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４細胞を皮下に投与した。投与後、マウスごとに腫瘍の大きさを週に３回測定した。プロトコールに従って、２００ｍｍ^２を超える大きさの腫瘍を有するマウスを安楽死させた。生存曲線を作成した。
【０１５６】
ＡＳ０１Ｂとともに製剤化されたＬＶＬ１１１で免疫化されたマウスよりも、ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１１１で免疫化されマウスは、ＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４腫瘍投与から良好に保護されたことを結果は示している。ＣＢ６Ｆ１マウスでの最良の結果は、ＡＳ１５とともに製剤化された１０μｇのＬＶＬ１１１で得られた。図２４を参照されたい。
【０１５７】
研究＃１．３
１群あたり３８匹のＣＢ６Ｆ１マウスに、本明細書の他の箇所で記述したように、最終濃度のＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４を１０μｇ用量で、２週間ごとに４回、筋肉内免疫した。ＡＳ１５単独で免疫された対照群も、試験した。
【０１５８】
４回目の免疫化から２週間後、２８匹のマウスに、２５０，０００のＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４細胞を皮下に投与し、および残り１０匹のマウスに、１００，０００のＭＣ３８／ＣＡＳＢ７４３９＃３５細胞を皮下に投与した。投与後、マウスごとに腫瘍の大きさを週に３回測定した。プロトコールに従って、２００ｍｍ^２を超える大きさの腫瘍を有するマウスを安楽死させた。ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１１１、ＬＶＬ１６８およびＬＶＬ１４４はすべて、ＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４またはＭＣ３８／ＣＡＳＢ７４３９＃３５の投与に対して保護的であることを結果は示している。図２５を参照されたい。
【０１５９】
研究＃１．４
１群あたり６６匹のＣＢ６Ｆ１マウスに、本明細書の他の箇所で記述したように、最終濃度のＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４を１０μｇ用量で、２週間ごとに４回、筋肉内免疫した。ＡＳ１５単独によって免疫された対照群も、試験した。
【０１６０】
４回目の免疫化から２週間後、１群あたり２２匹のマウスに、２５０，０００のＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４細胞（非クローン集団）、２５０，０００のＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２（クローン集団）のいずれか、または１００，０００のＭＣ３８／ＣＡＳＢ７４３９＃３５細胞を皮下に投与した。投与後、マウスごとに腫瘍の大きさを週に３回測定した。プロトコールに従って、２００ｍｍ^２を超える大きさの腫瘍を有するマウスを安楽死させた。この特定の研究で、対照マウスが先に死ぬこと、および識別できる保護効果がないことによって明らかなように、ＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２の投与は、ＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃の１４よりもより攻撃的であると思える。図２６を参照されたい。次の実験は、本明細書の他の箇所で記述したように、より攻撃的なＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２を用いて行った。
【０１６１】
研究＃２．１
１群あたり１５匹のＣＢ６Ｆ１マウスに、本明細書の他の箇所で記述したように、最終濃度のＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４のいずれかを種々の等モルの用量によって４回筋肉内免疫した。ＬＶＬ１６８の場合、以下の抗原用量を用いた：１マウスあたり０．７７、１．５、３．１および６．２５μｇ。ＬＶＬ１４４の場合、以下の抗原用量を用いた：１マウスあたり１．２５、２．５、５および１０μｇ。ＡＳ１５単独によって免疫された対照群も、試験した。４回目の免疫化から２週間後、すべてのマウスに、２５０，０００のＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２（クローン集団）細胞を皮下に投与した。投与後、マウスごとに腫瘍の大きさを週に３回測定した。２８９ｍｍ^２（１７ｍｍ×１７ｍｍ）を超える大きさの腫瘍を有するマウスを安楽死させた。各群に関する生存曲線を作成した。図２７を参照されたい。該図は、ＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２腫瘍投与後、ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１６８およびＬＶＬ１４４の等モル用量で得られた生存曲線を表す。ＴＦは、無腫瘍マウスを表す。ＡＳ１５対照群と比較すると、ＬＶＬ１４４およびＬＶＬ１６８の等モル用量の４セットは、ＣＢ６Ｆ１マウスにおいて腫瘍増殖を同様に阻害するように思われる。
【０１６２】
研究＃２．２
１群あたり１５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、本明細書の他の箇所で記述したように、最終濃度のＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４のいずれかを種々の等モルの用量によって４回筋肉内免疫した。ＬＶＬ１６８の場合、以下の抗原用量を用いた：１マウスあたり０．７７、１．５、３．１および６．２５μｇ。ＬＶＬ１４４の場合、以下の抗原用量を用いた：１マウスあたり１．２５、２．５、５および１０μｇ。対照群として、マウスにＡＳ１５単独または緩衝剤によって免疫した。４回目の免疫化から２週間後、すべてのマウスに、２５０，０００のＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２（クローン集団）細胞を投与した。投与後、マウスごとに腫瘍の大きさを週に３回測定した。２８９ｍｍ^２（１７ｍｍ×１７ｍｍ）を超える大きさの腫瘍を有するマウスを安楽死させた。各群に関する生存曲線を作成した。図２８を参照されたい。該図は、ＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２腫瘍投与後、ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１６８およびＬＶＬ１４４の異なる等モル用量で得られた生存曲線を表す。ＴＦは、無腫瘍マウスを表す。ＣＢ６Ｆ１マウスで行った研究と対照的に、本研究では、免疫した群、ＡＳ１５群または緩衝群のＣ５６Ｂ１／６マウスの生存間に統計的に有意差は、見られなかった。
【０１６３】
研究＃２．３
１群あたり１５匹のＣＢ６Ｆ１マウスに、本明細書の他の箇所で記述したように、最終濃度のＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４を種々の等モルの用量によって４回筋肉内免疫した。ＬＶＬ１６８の場合、以下の抗原用量を用いた：１マウスあたり０．０４、０．１９、０．７７、１．５、３．１および６．２５μｇ。ＬＶＬ１４４の場合、以下の抗原用量を用いた：１マウスあたり０．０７８、０．３１、１．２５、２．５、５および１０μｇ。ＡＳ１５単独によって免疫された対照群も、試験した。ナイーブマウスも、第２の対照群として用いた。４回目の免疫化から２週間後、すべてのマウスに、２５０，０００のＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２（クローン集団）細胞を皮下に投与した。投与後、マウスごとに腫瘍の大きさを週に３回測定した。２８９ｍｍ^２（１７ｍｍ×１７ｍｍ）を超える大きさの腫瘍を有するマウスを安楽死させた。各群に関する生存曲線を作成した。図２９および３０を参照されたい。これらの図は、ＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２腫瘍投与後、ＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１６８およびＬＶＬ１４４の異なる等モル用量で得られた生存曲線を表す。ＴＦは、無腫瘍マウスを表す。
【０１６４】
試験した２つの等モル最低用量は、腫瘍増殖を有意に阻害するように見えなかった。４つの最高用量で、ＬＶＬ１４４＋ＡＳ１５と比較すると、ＬＶＬ１６８＋ＡＳ１５によって免疫されたマウスにより多くの腫瘍予防が観察された。
【０１６５】
研究＃２．４
研究＃２．２で観察されたように、ＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２腫瘍投与に対して、ＡＳ１５とともに製剤化されたＣＡＳＢ７４３９によって免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスで観察された予防不足をさらに検討した。１群あたり１５匹のＣＢ６Ｆ１またはＣ５７ＢＬ／６のマウスに、本明細書の他の箇所で記述したように、最終濃度のＡＳ１５とともに製剤化されたＬＶＬ１６８を１μｇの用量で４回筋肉内免疫した。ＬＶＬ１６８＋ＡＳ１５を１μｇ用量によって免疫されたマウスの雄群および雌群を別々に調べた。ＡＳ１５単独によって免疫された別々の対照雄群および対照雌群も試験した。
【０１６６】
実施例１０に記述したように、４回目の免疫化から７日後に部分採血を得て、抗ＣＡＳＢ７４３９総ＩｇＧ血清抗体価をＥＬＩＳＡによって測定した。ＬＶＬ１６８＋ＡＳ１５によって免疫された雄および雌のＣＢ６Ｆ１マウスにおいて、同様のＣＡＳＢ７４３９特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答（約１×１０^６ｎｇ／ｍＬ総ＩｇＧ）を得た。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは抗体応答が検出されなかった。図３３を参照されたい。
【０１６７】
４回目の免疫化から１４日後に、部分採血を得た。実施例１０に記述したように、ＣＡＳＢ７４３９全配列を網羅するプールのペプチドで、ＣＢ６Ｆ１またはＣ５７ＢＬ／６のマウス（１群あたり３マウスからなる５プール）由来のＰＢＬを再刺激した後、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞応答（ＩＦＮγおよびＴＮＦαのダブルポジティブ）を細胞内染色およびフローサイトメトリー分析によって測定した。さらに、ペプチド３９（配列番号９１）を、Ｃ５７ＢＬ／６由来のＰＢＬで試験した。ＬＶＬ１６８＋ＡＳ１５によって免疫した雄および雌のＣＢ６Ｆ１マウスにおいて、同様のＣＡＳＢ７４３９特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答（約０．１％頻度）を得た；ＣＡＳＢ７４３８特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答（０．０５％頻度）を雄マウスでのみ得た。図３４および３５（上段のパネル）を参照されたい。ＣＡＳＢ７４３９全配列またはＣＡＳＢ７４３９ペプチド３９（配列番号９１）（配列番号１３のａａ１５３〜１６７）を網羅するプールのペプチドでＰＢＬを再刺激した後、ＣＡＳＢ７４３９特異的ＣＤ４またはＣＤ８のＴ細胞応答を、１μｇのＬＶＬ１６８＋ＡＳ１５によって免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスで検出した。図３４および３５（下段のパネル）を参照されたい。ここで留意すべきは、ＣＡＳＢ７４３９ペプチト３９（配列番号９１）は、１０μｇのＬＶＬ１６８＋ＡＳ１５によって４回免疫されたＣ５７ＢＬ／６の脾細胞においてＣＤ４Ｔ細胞免疫原性が低いペプチドとして以前に特定されていたので、本発明で非依存的に利用したことである。実施例１０の図１３を参照されたい。
【０１６８】
４回目の免疫化から２週間後、すべてのマウスに、２５０，０００のＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２細胞を皮下に投与した。投与後、マウスごとに腫瘍の大きさを週に３回測定した。２８９ｍｍ^２（１７ｍｍ×１７ｍｍ）を超える大きさの腫瘍を有するマウスを安楽死させた。各群に関する腫瘍増殖曲線および生存曲線を作成した。図３１および３２は、ＴＣ−１／ＣＡＳＢ７４３９＃１４−２腫瘍投与後、ＡＳ１５ととも製剤化された１μｇのＬＶＬ１６８またはＬＶＬ１４４によって免疫された雄もしくは雌のＣＢ６Ｆ１マウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウスで得られた腫瘍増殖曲線および生存曲線をそれぞれ表す。結果が示していることは、ＣＡＳＢ７４３９＋ＡＳ１５は、雌ＣＢ６Ｆ１と比べて、雄ＣＢ６Ｆ１マウスにおいて緩慢な腫瘍増殖と良好な生存とをもたらす傾向があるが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは腫瘍予防への効果がないことである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでのＣＡＳＢ７４３９腫瘍予防の不足は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける検出可能なＣＡＳＢ７４３９特異的ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞の非存在、ならびに検出可能なＣＡＳＢ７４３９特異的抗体応答の非存在に対応する。これが示すことは、使用した実験条件下で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスがＣＡＳＢ７４３９による免疫原性および腫瘍予防を調べるには理想的なマウスモデルでないことを示している。一方では、ＣＢ６Ｆ１マウスにおいて観察されたＣＡＳＢ７４３９腫瘍予防は、ＣＡＳＢ７４３９特異的ＣＤ４Ｔ細胞［免疫原性ペプチド７〜８（配列番号１３のａａ２５〜４３）および２３〜２４（配列番号１３のａａ８９〜１０７）、図１３、実施例１０を参照されたい］およびＣＡＳＢ７４３９特異的ＣＤ８Ｔ細胞、ならびにＣＡＳＢ７４３９特異的抗体応答の有意な存在に対応することである。
【０１６９】
配列：
配列番号１
ＬＶＬ０５５ タンパク質
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALA
【０１７０】
配列番号２
ＬＶＬ０５５ ＤＮＡ
atgggccatcatcatcatcatcatcatcatcatcacagcagcggccatatcgacgacgacgacaagcatatggatggtggcaccctgccgcgtagcgctccgccggcaccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggcctaa
【０１７１】
配列番号３
ＬＶＬ１１１ タンパク質
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGYHHHHHH
【０１７２】
配列番号４
ＬＶＬ１１１ ＤＮＡ
atgggccatcatcatcatcatcatcatcatcatcacagcagcggccatatcgacgacgacgacaagcatatggatggtggcaccctgccgcgtagcgcaccgccggctccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcgccgcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgagcccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctatcatcatcatcaccatcattaa
【０１７３】
配列番号５
ＬＶＬ１３７ タンパク質
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
【０１７４】
配列番号６
ＬＶＬ１３７ ＤＮＡ
atgggccatcatcatcatcatcatcatcatcatcacagcagcggccatatcgacgacgacgacaagcatatggatggtggcaccctgccgcgtagcgcaccgccggctccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcgccgcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgagcccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctattaa
【０１７５】
配列番号７
ＬＶＬ１４１ タンパク質
MDPSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLVVIHDHFLDGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETAAAHMDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGYHHHHHH
【０１７６】
配列番号８
ＬＶＬ１４１ ＤＮＡ
atggatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacccaaatgaaatcagacaaaatcattattgctcaccgtggtgctagcggttatttaccagagcatacgttagaatctaaagcacttgcgtttgcacaacaggctgattatttagagcaagatttagcaatgactaaggatggtcgtttagtggttattcacgatcactttttagatggcttgactgatgttgcgaaaaaattcccacatcgtcatcgtaaagatggccgttactatgtcatcgactttaccttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaaccgcggccgcacatatggatggtggcaccctgccgcgtagcgcaccgccggctccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcgccgcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgagcccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctatcatcatcatcaccatcattaa
【０１７７】
配列番号９
ＬＶＬ１４４ タンパク質
MDPSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLVVIHDHFLDGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGYHHHHHH
【０１７８】
配列番号１０
ＬＶＬ１４４ ＤＮＡ
atggatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacccaaatgaaatcagacaaaatcattattgctcaccgtggtgctagcggttatttaccagagcatacgttagaatctaaagcacttgcgtttgcacaacaggctgattatttagagcaagatttagcaatgactaaggatggtcgtttagtggttattcacgatcactttttagatggcttgactgatgttgcgaaaaaattcccacatcgtcatcgtaaagatggccgttactatgtcatcgactttaccttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaaccgatggtggcaccctgccgcgtagcgcaccgccggctccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcgccgcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgagcccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctatcatcatcatcaccatcattaa
【０１７９】
配列番号１１
ＬＶＬ１６８ タンパク質
MHHHHHHHHHHDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
【０１８０】
配列番号１２
ＬＶＬ１６８ ＤＮＡ
atgcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatgacggtggcaccctgccgcgtagcgcaccgccggctccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcgccgcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgagcccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctattaa
【０１８１】
配列番号１３
受入番号ＡＡＢ８６９９３、ＨＡＳＨ２ タンパク質
MDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
【０１８２】
配列番号１４
ＨＡＳＨ２ ＤＮＡ
atggacggcggcacactgcccaggtccgcgccccctgcgccccccgtccctgtcggctgcgctgcccggcggagacccgcgtccccggaactgttgcgctgcagccggcggcggcgaccggccaccgcagagaccggaggcggcgcagcggccgtagcgcggcgcaatgagcgcgagcgcaaccgcgtgaagctggtgaacttgggcttccaggcgctgcggcagcacgtgccgcacggcggcgccagcaagaagctgagcaaggtggagacgctgcgctcagccgtggagtacatccgcgcgctgcagcgcctgctggccgagcacgacgccgtgcgcaacgcgctggcgggagggctgaggccgcaggccgtgcggccgtctgcgccccgcgggccgccagggaccaccccggtcgccgcctcgccctcccgcgcttcttcgtccccgggccgcgggggcagctcggagcccggctccccgcgttccgcctactcgtcggacgacagcggctgcgaaggcgcgctgagtcctgcggagcgcgagctactcgacttctccagctggttagggggctactga
【０１８３】
配列番号１５
ＬＶＬ００７ タンパク質
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMDGGTLPRSAPPAPPVLVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
【０１８４】
配列番号１６
ＬＶＬ００７ ＤＮＡ
atgggccatcatcatcatcatcatcatcatcatcacagcagcggccatatcgacgacgacgacaagcatatggacggcggcacactgcccaggtccgcgccccctgcgccccccgtccttgtcggctgcgctgcccggcggagacccgcgtccccggaactgttgcgctgcagccggcggcggcgaccggccaccgcagagaccggaggcggcgcagcggccgtagcgcggcgcaatgagcgcgagcgcaaccgcgtgaagctggtgaacttgggcttccaggcgctgcggcagcacgtgccgcacggcggcgccagcaagaagctgagcaaggtggagacgctgcgctcagccgtggagtacatccgcgcgctgcagcgcctgctggccgagcacgacgccgtgcgcaacgcgctggcgggagggctgaggccgcaggccgtgcggccgtctgcgccccgcgggccgccagggaccaccccggtcgccgcctcgccctcccgcgcttcttcgtccccgggccgcgggggcagctcggagcccggctccccgcgttccgcctactcgtcggacgacagcggctgcgaaggcgcgctgagtcctgcggagcgcgagctactcgacttctccagctggttagggggctactga
【０１８５】
配列番号１７
ＬＶＬ０１０ タンパク質
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
【０１８６】
配列番号１８
ＬＶＬ０１０ ＤＮＡ
atgggccatcatcatcatcatcatcatcatcatcacagcagcggccatatcgacgacgacgacaagcatatggacggcggcacactgcccaggtccgcgccccctgcgccccccgtccctgtcggctgcgctgcccggcggagacccgcgtccccggaactgttgcgctgcagccggcggcggcgaccggccaccgcagagaccggaggcggcgcagcggccgtagcgcggcgcaatgagcgcgagcgcaaccgcgtgaagctggtgaacttgggcttccaggcgctgcggcagcacgtgccgcacggcggcgccagcaagaagctgagcaaggtggagacgctgcgctcagccgtggagtacatccgcgcgctgcagcgcctgctggccgagcacgacgccgtgcgcaacgcgctggcgggagggctgaggccgcaggccgtgcggccgtctgcgccccgcgggccgccagggaccaccccggtcgccgcctcgccctcccgcgcttcttcgtccccgggccgcgggggcagctcggagcccggctccccgcgttccgcctactcgtcggacgacagcggctgcgaaggcgcgctgagtcctgcggagcgcgagctactcgacttctccagctggttagggggctactga
【０１８７】
配列番号１９
ＬＶＬ０６０ タンパク質
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
【０１８８】
配列番号２０
ＬＶＬ０６０ ＤＮＡ
atgggccatcatcatcatcatcatcatcatcatcacagcagcggccatatcgacgacgacgacaagcatatggatggtggcaccctgccgcgtagcgctccgccggcaccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcaccgcgtggtccgccgggtacgacgccggttgcagcgagcccgagccgtgcgagcagctctccgggtcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgtctccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctattaa
【０１８９】
配列番号２１
Ｃｏｎｓｔ−１ タンパク質
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGYLEDPAANKARKEAELAAATAEQ
【０１９０】
配列番号２２
Ｃｏｎｓｔ−１ＤＮＡ
atgggccatcatcatcatcatcatcatcatcatcacagcagcggccatatcgacgacgacgacaagcatatggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcaccgcgtggtccgccgggtacgacgccggttgcagcgagcccgagccgtgcgagcagctctccgggtcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgtctccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctatctcgaggatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataa
【０１９１】
配列番号２３
ＬＶＬ０５６
タンパク質
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
【０１９２】
配列番号２４
ＬＶＬ０５６ ＤＮＡ
atgggccatcatcatcatcatcatcatcatcatcacagcagcggccatatcgacgacgacgacaagcatatgaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcaccgcgtggtccgccgggtacgacgccggttgcagcgagcccgagccgtgcgagcagctctccgggtcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgtctccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctattaa
【０１９３】
配列番号２５
ＬＶＬ０５７ タンパク質
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALA
【０１９４】
配列番号２６
ＬＶＬ０５７ ＤＮＡ
atgggccatcatcatcatcatcatcatcatcatcacagcagcggccatatcgacgacgacgacaagcatatggcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggcctaa
【０１９５】
配列番号２７
ＬＶＬ０８８ タンパク質
MDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGYHHHHHH
【０１９６】
配列番号２８
ＬＶＬ０８８ ＤＮＡ
atggatggtggcaccctgccgcgtagcgcaccgccggctccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcgccgcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgagcccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctatcatcatcatcaccatcattaa
【０１９７】
配列番号２９
ＬＶＬ０１６ タンパク質
MDPSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLVVIHDHFLDGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETAAAMDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGYLEHHHHHH
【０１９８】
配列番号３０
ＬＶＬ０１６ ＤＮＡ
atggatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacccaaatgaaatcagacaaaatcattattgctcaccgtggtgctagcggttatttaccagagcatacgttagaatctaaagcacttgcgtttgcacaacaggctgattatttagagcaagatttagcaatgactaaggatggtcgtttagtggttattcacgatcactttttagatggcttgactgatgttgcgaaaaaattcccacatcgtcatcgtaaagatggccgttactatgtcatcgactttaccttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaaccgcggccgcaatggatggtggcaccctgccgcgtagcgctccgccggcaccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcaccgcgtggtccgccgggtacgacgccggttgcagcgagcccgagccgtgcgagcagctctccgggtcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgtctccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctatctcgagcaccaccaccaccaccactga
【０１９９】
配列番号３１
ＬＶＬ０１８ タンパク質
MDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGYLEHHHHHH
【０２００】
配列番号３２
ＬＶＬ０１８ ＤＮＡ
atggatggtggcaccctgccgcgtagcgctccgccggcaccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcaccgcgtggtccgccgggtacgacgccggttgcagcgagcccgagccgtgcgagcagctctccgggtcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgtctccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctatctcgagcaccaccaccaccaccactga
【０２０１】
配列番号３３
ＬＶＬ１３８ タンパク質
MHHHHHHDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
【０２０２】
配列番号３４
ＬＶＬ１３８ ＤＮＡ
atgcaccatcaccatcaccatgatggtggcaccctgccgcgtagcgcaccgccggctccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcgccgcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgagcccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctattaa
【０２０３】
配列番号３５
改変型リンカー ＤＮＡ
atgcatcatcatcatcatcatgac
【０２０４】
配列番号３６
非改変型リンカー ＤＮＡ
atgcaccatcaccatcaccatgat
【０２０５】
配列番号３７
ＬＶＬ１６０ タンパク質
MHHHHHHDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
【０２０６】
配列番号３８
ＬＶＬ１６０ ＤＮＡ
atgcatcatcatcatcatcatgacggtggcaccctgccgcgtagcgcaccgccggctccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcgccgcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgagcccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctattaa
【０２０７】
配列番号３９
１／３ｐＤ タンパク質
MDPSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLVVIHDHFLDGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFET
【０２０８】
配列番号４０
１／３ｐＤ ＤＮＡ
atggatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacccaaatgaaatcagacaaaatcattattgctcaccgtggtgctagcggttatttaccagagcatacgttagaatctaaagcacttgcgtttgcacaacaggctgattatttagagcaagatttagcaatgactaaggatggtcgtttagtggttattcacgatcactttttagatggcttgactgatgttgcgaaaaaattcccacatcgtcatcgtaaagatggccgttactatgtcatcgactttaccttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaacc
【０２０９】
配列番号４１
インフルエンザ菌 タンパク質Ｄ
MKLKTLALSLLAAGVLAGCSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLVVIHDHFLDGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETKDGKQAQVYPNRFPLWKSHFRIHTFEDEIEFIQGLEKSTGKKVGIYPEIKAPWFHHQNGKDIAAETLKVLKKYGYDKKTDMVYLQTFDFNELKRIKTELLPQMGMDLKLVQLIAYTDWKETQEKDPKGYWVNYNYDWMFKPGAMAEVVKYADGVGPGWYMLVNKEESKPDNIVYTPLVKELAQYNVEVHPYTVRKDALPEFFTDVNQMYDALLNKSGATGVFTDFPDTGVEFLKGIK
【０２１０】
配列番号４２
長いポリヒスチジンタグ
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKH
【０２１１】
配列番号４３
ＬＶＬ０９０ タンパク質
MDPSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLVVIHDHFLDGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETKDGKQAQVYPNRFPLWKSHFRIHTFEDEIEFIQGLEKSTGKKVGIYPEIKAPWFHHQNGKDIAAETLKVLKKYGYDKKTDMVYLQTFDFNELKRIKTELLPQMGMDLKLVQLIAYTDWKETQEKDPKGYWVNYNYDWMFKPGAMAEVVKYADGVGPGWYMLVNKEESKPDNIVYTPLVKELAQYNVEVHPYTVRKDALPAFFTDVNQMYDVLLNKSGATGVFTDFPDTGVEFLKGIKAAAMDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGYLEHHHHHH
【０２１２】
配列番号４４
ＬＶＬ０９０ ＤＮＡ
atggatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacccaaatgaaatcagacaaaatcattattgctcaccgtggtgctagcggttatttaccagagcatacgttagagtctaaagcacttgcgtttgcacaacaggctgattatttagagcaagatttagcaatgactaaggatggtcgtttagtggttattcacgatcactttttagatggcttgactgatgttgcgaaaaaattcccacatcgtcaccgtaaagatggtcgttactatgtcatcgactttaccttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaaccaaagatggcaaacaagcgcaagtttatcctaatcgtttcccactttggaaatcacattttagaattcatacctttgaagatgaaattgaatttatccaaggcttagaaaaatccactggcaaaaaagtagggatttatccagaaatcaaagcaccttggttccaccatcaaaatggtaaagatattgctgctgaaacgctcaaagtgttaaaaaaatatggctatgataagaaaaccgatatggtttacttacaaactttcgattttaatgaattaaaacgtatcaaaacggaattacttccacaaatgggaatggatttgaaattagttcaattaattgcttatacagattggaaagaaacacaagaaaaagacccaaagggttattgggtaaactataattacgattggatgtttaaacctggtgcaatggcagaagtggttaaatatgccgatggtgttggcccaggttggtatatgttagttaataaagaagaatccaaacctgataatattgtgtacactccgttggtaaaagaacttgcacaatataatgtggaagtgcatccttacaccgtgcgtaaagatgcactacccgcgtttttcacagacgtaaatcaaatgtatgatgtcttattgaataaatcaggggcaacaggtgtatttactgatttcccagatactggcgtggaattcttaaaaggaataaaagcggccgcaatggatggtggcaccctgccgcgtagcgctccgccggcaccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcaccgcgtggtccgccgggtacgacgccggttgcagcgagcccgagccgtgcgagcagctctccgggtcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgtctccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctatctcgagcaccaccaccaccaccac
【０２１３】
列番号４５
ＬＶＬ１１２ タンパク質
MGHHHHHHGSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
【０２１４】
配列番号４６
ＬＶＬ１１２ ＤＮＡ
atgggtcatcaccatcatcatcacgggtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcaggcccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcaccgcgaacagattggaggtgatggtggcaccctgccgcgtagcgctccgccggcaccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcaccgcgtggtccgccgggtacgacgccggttgcagcgagcccgagccgtgcgagcagctctccgggtcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgtctccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctat
【０２１５】
配列番号４７
ＬＶＬ１１３ タンパク質
MGHHHHHHGSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGDPSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLVVIHDHFLDGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETAAAMDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
【０２１６】
配列番号４８
ＬＶＬ１１３
ＤＮＡ
atgggtcatcaccatcatcatcacgggtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcaggcccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcaccgcgaacagattggaggtgatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacccaaatgaaatcagacaaaatcattattgctcaccgtggtgctagcggttatttaccagagcatacgttagaatctaaagcacttgcgtttgcacaacaggctgattatttagagcaagatttagcaatgactaaggatggtcgtttagtggttattcacgatcactttttagatggcttgactgatgttgcgaaaaaattcccacatcgtcatcgtaaagatggccgttactatgtcatcgactttaccttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaaccgcggccgcaatggatggtggcaccctgccgcgtagcgctccgccggcaccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcaccgcgtggtccgccgggtacgacgccggttgcagcgagcccgagccgtgcgagcagctctccgggtcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgtctccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctat
【０２１７】
配列番号４９
ＬＶＬ１１４ タンパク質
MGHHHHHHGSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALA
【０２１８】
配列番号５０
ＬＶＬ１１４ ＤＮＡ
atgggtcatcaccatcatcatcacgggtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcaggcccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcaccgcgaacagattggaggtgatggtggcaccctgccgcgtagcgctccgccggcaccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggcc
【０２１９】
配列番号５１
ＬＶＬ１１５ タンパク質
MGHHHHHHGSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
【０２２０】
配列番号５２
ＬＶＬ１１５ ＤＮＡ
atgggtcatcaccatcatcatcacgggtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcaggcccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcaccgcgaacagattggaggtgatggtggcaccctgccgcgtagcgcaccgccggctccgccggttccggttggttgtgcggcgcgtcgtcgtccggcgagcccggaactgctgcgttgcagccgtcgtcgccgtccggccaccgcggaaaccggtggtggtgcggcagcggttgcgcgtcgtaacgaacgtgaacgtaaccgtgtgaaactggtgaacctgggctttcaggcgctgcgtcagcatgtgccgcatggcggtgcgagcaaaaaactgagcaaagtggaaaccctgcgtagcgcggtggaatatattcgtgcgctgcaacgtctgctggccgaacatgatgcggtgcgtaacgcgctggccggtggtctgcgtccgcaggcggttcgtccgagcgcgccgcgtggtggtagcagcgaaccgggtagcccgcgtagcgcctatagcagcgatgatagcggctgcgaaggtgccctgagcccggcggaacgtgaactgctggattttagcagctggctgggcggctat
【０２２１】
配列番号５３
ペプチド１
MDGGTLPRSAPPAPP
【０２２２】
配列番号５４
ペプチド２
TLPRSAPPAPPVPVG
【０２２３】
配列番号５５
ペプチド３
SAPPAPPVPVGCAAR
【０２２４】
配列番号５６
ペプチド４
APPVPVGCAARRRPA
【０２２５】
配列番号５７
ペプチド５
PVGCAARRRPASPEL
【０２２６】
配列番号５８
ペプチド６
AARRRPASPELLRCS
【０２２７】
配列番号５９
ペプチド７
RPASPELLRCSRRRR
【０２２８】
配列番号６０
ペプチド８
PELLRCSRRRRPATA
【０２２９】
配列番号６１
ペプチド９
RCSRRRRPATAETGG
【０２３０】
配列番号６２
ペプチド１０
RRRPATAETGGGAAA
【０２３１】
配列番号６３
ペプチド１１
ATAETGGGAAAVARR
【０２３２】
配列番号６４
ペプチド１２
TGGGAAAVARRNERE
【０２３３】
配列番号６５
ペプチド１３
AAAVARRNERERNRV
【０２３４】
配列番号６６
ペプチド１４
ARRNERERNRVKLVN
【０２３５】
配列番号６７
ペプチド１５
ERERNRVKLVNLGFQ
【０２３６】
配列番号６８
ペプチド１６
NRVKLVNLGFQALRQ
【０２３７】
配列番号６９ペプチド１７
LVNLGFQALRQHVPH
【０２３８】
配列番号７０
ペプチド１８
GFQALRQHVPHGGAS
【０２３９】
配列番号７１
ペプチド１９
LRQHVPHGGASKKLS
【０２４０】
配列番号７２
ペプチド２０
VPHGGASKKLSKVET
【０２４１】
配列番号７３
ペプチド２１
GASKKLSKVETLRSA
【０２４２】
配列番号７４
ペプチド２２
KLSKVETLRSAVEYI
【０２４３】
配列番号７５
ペプチド２３
VETLRSAVEYIRALQ
【０２４４】
配列番号７６
ペプチド２４
RSAVEYIRALQRLLA
【０２４５】
配列番号７７
ペプチド２５
EYIRALQRLLAEHDA
【０２４６】
配列番号７８
ペプチド２６
ALQRLLAEHDAVRNA
【０２４７】
配列番号７９
ペプチド２７
LAEHDAVRNALAGG
【０２４８】
配列番号８０
ペプチド２８
HDAVRNALAGGLRPQ
【０２４９】
配列番号８１
ペプチド２９
RNALAGGLRPQAVRP
【０２５０】
配列番号８２
ペプチド３０
AGGLRPQAVRPSAPR
【０２５１】
配列番号８３
ペプチド３１
RPQAVRPSAPRGPPG
【０２５２】
配列番号８４
ペプチド３２
VRPSAPRGPPGTTPV
【０２５３】
配列番号８５
ペプチド３３
APRGPPGTTPVAASP
【０２５４】
配列番号８６
ペプチド３４
PPGTTPVAASPSRAS
【０２５５】
配列番号８７
ペプチド３５
TPVAASPSRASSSPG
【０２５６】
配列番号８８
ペプチド３６
ASPSRASSSPGRGGS
【０２５７】
配列番号８９
ペプチド３７
RASSSPGRGGSSEPG
【０２５８】
配列番号９０
ペプチド３８
SPGRGGSSEPGSPRS
【０２５９】
配列番号９１
ペプチド３９
GGSSEPGSPRSAYSS
【０２６０】
配列番号９２
ペプチド４０
EPGSPRSAYSSDDSG
【０２６１】
配列番号９３
ペプチド４１
PRSAYSSDDSGCEGA
【０２６２】
配列番号９４
ペプチド４２
YSSDDSGCEGALSPA
【０２６３】
配列番号９５
ペプチド４３
DSGCEGALSPAEREL
【０２６４】
配列番号９６
ペプチド４４
EGALSPAERELLDFS
【０２６５】
配列番号９７
ペプチド４５
SPAERELLDFSSWLG
【０２６６】
配列番号９８
ペプチド４６
AERELLDFSSWLGGY

【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドであって、少なくとも１つの発現増強改変を含み、前記発現増強改変が少なくとも配列番号１３のプロリンリッチ領域の一部分またはすべての除去を含む、改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチド。
【請求項２】
タンパク質構築物であって、請求項１に記載の改変型ＣＡＳＢ７４３９ポリペプチドを含み、かつ１つまたは複数の異種ポリペプチドをさらに含む、タンパク質構築物。
【請求項３】
（ａ）ＬＶＬ０５５（配列番号１）；
（ｂ）ＬＶＬ１１１（配列番号３）；
（ｃ）ＬＶＬ１３７（配列番号５）；
（ｄ）ＬＶＬ１４１（配列番号７）；
（ｅ）ＬＶＬ１４４（配列番号９）；および
（ｆ）ＬＶＬ１６８（配列番号１１）
から選択される構築物を含む、請求項３に記載のタンパク質構築物。
【請求項４】
免疫原性組成物であって、請求項１から３のいずれか１項に記載のタンパク質構築物と、医薬的に許容される担体または賦形剤とを含み、前記担体または賦形剤が任意に緩衝剤を含み得る、免疫原性組成物。
【請求項５】
アジュバントをさらに含む、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記アジュバントが少なくともＴｈ１免疫応答を誘発する、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記アジュバントが、ＴＬＲ−４アゴニスト、免疫学的に活性なサポニン画分、ＴＬＲ−９アゴニストのうちの少なくとも１つを含む、請求項４、５または６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記ＴＬＲ−４アゴニストが３Ｄ−ＭＰＬである、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記ＴＬＲ−９アゴニストがＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項７または８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記免疫学的に活性なサポニン画分がＱＳ２１である、請求項７、８または９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
３Ｄ−ＭＰＬを含む、請求項７から１０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
ＣｐＧを含む、請求項７から１１のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
ＱＳ２１を含む、請求項７から１２のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
コレステロールをさらに含む、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
核酸分子であって、請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質構築物をコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１６】
ヒトまたは非ヒト動物においてＣＡＳＢ７４３９に対する免疫応答を誘発する方法であって、アジュバントと、
（ａ）配列番号９に記載のポリペプチド配列、および
（ｂ）配列番号１１に記載のポリペプチド配列
からなる群から選択されるポリペプチド配列を含有するタンパク質とを含む有効量の組成物を前記ヒトまたは非ヒト動物に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
ヒトまたは非ヒト動物を治療する方法であって、
（ａ）ＣＡＳＢ７４３９を発現する癌性細胞を有するヒトまたは非ヒト動物を選択するステップと、
（ｂ）アジュバントと、
（ｉ）配列番号９に記載のタンパク質構築物、および
（ｉｉ）配列番号１１に記載のタンパク質構築物
からなる群から選択されるポリペプチドを含有するタンパク質とを含む有効量の組成物を前記ヒトまたは非ヒト動物に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項１８】
ヒトまたは非ヒト動物においてＣＡＳＢ７４３９に対する免疫応答を誘発する方法で使用するための請求項７から１４に記載の免疫原性組成物であって、前記方法が前記免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、免疫原性組成物。
【請求項１９】
（ａ）配列番号９に記載のタンパク質構築物、および
（ｂ）配列番号１１に記載のタンパク質構築物
からなる群から選択されるポリペプチドを含有するタンパク質を含む、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
ヒトまたは非ヒト動物においてＣＡＳＢ７４３９に対する免疫応答を誘発する方法で使用するための薬物の製造における、請求項７から１４に記載の免疫原性組成物の使用であって、前記誘発方法が前記免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、免疫原性組成物の使用。
【請求項２１】
前記免疫原性組成物が、
（ｉ）配列番号９に記載のタンパク質構築物、および
（ｉｉ）配列番号１１に記載のタンパク質構築物
からなる群から選択されるポリペプチドを含有するタンパク質を含む、請求項２０に記載の使用。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１１Ｃ】

【図１１Ｄ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１２Ｄ】

【図１３】

【図１４】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２０Ｃ】

【図２０Ｄ】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【公表番号】特表２０１２−５２８１０６（Ｐ２０１２−５２８１０６Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１２３４０（Ｐ２０１２−５１２３４０）
【出願日】平成２２年５月２５日（２０１０．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５７１４１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３６４４３
【国際公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン　バイオロジカルズ　ソシエテ　アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】