ＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制するための方法および組成物
【課題】ＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制することが可能なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の提供。
【解決手段】ＣＤ１４受容体を発現する細胞のＣＤ１４媒介活性化を抑制する方法であって、有効量の抗体またはその生物学的に活性な断片と該細胞とを接触させることを含み、該抗体が、細胞表面のＣＤ１４に結合し、リガンドによるＣＤ１４媒介活性化を抑制するものであり、該リガンドは該抗体の存在下では該細胞のＣＤ１４に結合し、該抗体の不在下では細胞活性化を刺激するものであり、該リガンドの少なくとも５０％は該抗体の存在下で細胞表面ＣＤ１４に結合する。
【解決手段】ＣＤ１４受容体を発現する細胞のＣＤ１４媒介活性化を抑制する方法であって、有効量の抗体またはその生物学的に活性な断片と該細胞とを接触させることを含み、該抗体が、細胞表面のＣＤ１４に結合し、リガンドによるＣＤ１４媒介活性化を抑制するものであり、該リガンドは該抗体の存在下では該細胞のＣＤ１４に結合し、該抗体の不在下では細胞活性化を刺激するものであり、該リガンドの少なくとも５０％は該抗体の存在下で細胞表面ＣＤ１４に結合する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の属する技術分野
本発明はＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制するための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明はＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制する部位でＣＤ１４単球抗原に結合する分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の説明
細胞の正しい機能は、環境とコミュニケートする細胞の能力に部分的に依存している。外部刺激は膜受容体としばしば相互作用し、次に膜受容体は最終的に転写因子に影響を及ぼす第２のメッッセンジャーを誘導する。次に、転写因子はある遺伝子の発現を活性化または抑制し、所与の細胞におけるタンパク質の特異的パターンをもたらす。
【０００３】
転写因子ＮＦ-κＢ（核因子-κＢ）はこの因子のＤＮＡ結合モチーフに接触して、免疫受容体、サイトカインおよびウイルスタンパク質をコードする一組の遺伝子を調節する種々の刺激によって誘導される。ＮＦ-κＢを活性化できる種々の因子には、リポ多糖（ＬＰＳ）が含まれる。次に、ＬＰＳは敗血性ショック、全身性炎症応答症候群および多臓器不全を含む敗血症症候群の誘発に密接に関連している。
【０００４】
敗血症は毒素によって誘発される病的状態であり、この誘発または累積は最も一般的には感染または外傷によって引き起こされる。敗血症の初期症状は典型的には、悪寒、大量の発汗、不規則に上下する熱、衰弱、等を含み、これらに続いて持続性熱、低血圧が起こり、ショック、好中球減少症、白血球減少症、汎発性血管内凝固症候群、急性呼吸促進症候群および多臓器不全に至る。
【０００５】
リポ多糖、つまり内毒素は、すべてのグラム陰性細菌〔例えば、大腸菌、肺炎桿菌(Klebsiella pneumonia)、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa)]の外膜に見いだされる毒性成分である。ＬＰＳは免疫細胞にとってin vitroにおいてもin vivo においても、強力で多面発現性(pleiotropic)の刺激物質であることが確認されている(Morrison, D.C. &J.L. Ryan, Annu. Rev. Med., 38:417, 1987; Bone, R.C., Ann. Intern. Med., 115:457, 1991)。グラム陰性敗血症を患うヒトにおいて見られる病態生理学的影響のすべては、精製ＬＰＳによって完全に倍増しうるという点で、反論できない証拠がＬＰＳの毒性的役割を支持する。この毒性成分が応答細胞を活性化する作用機構は複雑で、十分理解されていない。グラム陰性菌感染への宿主応答は、エフェクター細胞によるこれらの細菌および／またはＬＰＳの認識に依存しており、血清タンパク質および細胞膜受容体に密接に関連している。細菌およびＬＰＳの一掃は細網内皮細胞によるエンドサイトーシスおよび食作用によって行なわれるが、ＬＰＳによる宿主免疫応答の付随的活性化は活性化マクロファージによるサイトカインの分泌をもたらし、これがグラム陰性菌感染の間に起こる異常に増大された宿主応答の引き金を引きうる。
【０００６】
Tobiasら(J. Exp. Med., 164:777, 1986)によるＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）〔ＬＰＳへの高親和性結合を示す（Ｋｄ＝１０-9Ｍ-1）〕として同定された血清タンパク質の発見は、in vivo でいったん放出されたＬＰＳの運命を明らかにするのに役立った。肝臓で合成され、分子量が約 60 kDのこの新規タンパク質は、ヒトにおいて200 μg/mlのレベルに達する急性期血清タンパク質であることが示された。高親和性ＬＰＳ／ＬＢＰ複合体の形成に続いて、マクロファージによる認識がなされ、次にＴＮＦ-αおよび他のマクロファージ分泌産物の放出が伴う(Schumann, R.R. ら，Science, 249:1429,1990)。ＬＰＢと結合したＬＰＳの効果に関するさらなる研究は、単球およびマクロファージの表面におけるそれの特異的受容体、すなわちＣＤ１４の発見をもたらした(Wright, S.D.ら，Science, 249:1431, 1990)。ＣＤ１４に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いたさらなる分析により、１個の抗ＣＤ１４ｍＡｂ（３Ｃ１０； VanVoorhis, W.C.ら，J. Exp. Med., 158:126, 1983)が結合したドメインはＣＤ１４上のＬＰＳ／ＬＢＰ結合部位の一部であるか、またはそれに極めて接近していたことが示された。モノクローナル抗体３Ｃ１０は、ＬＰＳ／ＬＢＰのＣＤ１４への結合を妨げる能力の性質により、ＬＰＳで刺激した後のヒト全血アッセイにおいてＴＮＦ-α放出を抑制することができた。この発見によって、たとえヒト全血に含まれる他のすべての細胞、タンパク質および因子の存在下であっても、１個のタンパク質決定基（ＣＤ１４上のリガンド結合部位）をブロックすれば、ＬＰＳに応答するＴＮＦ-α（敗血性ショックの重要な媒介物質であることが公知である）および他のマクロファージ分泌産物の放出を抑制するのに十分であることが示唆されている。
【０００７】
敗血症等のＣＤ１４媒介細胞活性化疾患の性質を理解することにおいて進歩があったにもかかわらず、そのような活性化を抑制し、またこれらの疾患を診断するために使用することができる組成物に対するかなりの必要が残っている。本発明はそのような組成物を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Morrison, D.C. &J.L. Ryan, Annu. Rev. Med., 38:417, 1987; Bone, R.C., Ann. Intern. Med., 115:457, 1991
【非特許文献２】J. Exp. Med., 164:777, 1986
【非特許文献３】Schumann, R.R. ら，Science, 249:1429,1990
【非特許文献４】Wright, S.D.ら，Science, 249:1431, 1990
【非特許文献５】VanVoorhis, W.C.ら，J. Exp. Med., 158:126, 1983
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制することが可能なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。これらの細胞系によって産生されたモノクローナル抗体もまた提供される。これらのモノクローナル抗体は、ＣＤ１４に結合して、もし抑制されなければＮＦ-κＢ活性化を誘導しうるリガンドによるＮＦ-κＢ活性化を抑制するのに広く有用である。上記モノクローナル抗体の生物学的に活性な断片が提供される。これらの抗体および断片は、試料中の細胞表面関連および可溶性ＣＤ１４の存在を検出するのに有用である。上記モノクローナル抗体より作成されるキメラおよびＣＤＲグラフト(grafted)抗体もまた提供される。
【００１０】
上記の生物学的組成物を含有する医薬組成物が提供される。これらは、敗血症等のＬＰＳ関連疾患を治療および予防するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はヒト可溶性ＣＤ１４受容体の核酸配列である（配列番号：９）。
【図２】図２は２８Ｃ５ Ｈ鎖の核酸配列およびアミノ酸配列である（それぞれ配列番号：１および２）。
【図３】図３は２８Ｃ５ Ｌ鎖の核酸配列およびアミノ酸配列である（それぞれ配列番号：３および４）。
【図４】図４は１８Ｅ１２ Ｈ鎖の核酸配列およびアミノ酸配列である（それぞれ配列番号：５および６）。
【図５】図５は１８Ｅ１２ Ｌ鎖の核酸配列およびアミノ酸配列である（それぞれ配列番号：７および８）。
【図６Ａ】図６は対照ＴＨＰ−１細胞単独のＦＡＣＳ分析である。
【図６Ｂ】図６は対照ＴＨＰ−１細胞単独のＦＡＣＳ分析である。
【図６Ｃ】図６は対照ＴＨＰ−１細胞単独のＦＡＣＳ分析である。
【図６Ｄ】図６は対照ＴＨＰ−１細胞単独のＦＡＣＳ分析である。
【図７Ａ】図７は対照ＴＨＰ−１細胞およびＦｉＴＣ結合体単独のＦＡＣＳ分析である。
【図７Ｂ】図７は対照ＴＨＰ−１細胞およびＦｉＴＣ結合体単独のＦＡＣＳ分析である。
【図７Ｃ】図７は対照ＴＨＰ−１細胞およびＦｉＴＣ結合体単独のＦＡＣＳ分析である。
【図７Ｄ】図７は対照ＴＨＰ−１細胞およびＦｉＴＣ結合体単独のＦＡＣＳ分析である。
【図８Ａ】図８は陽性対照ＴＨＰ−１およびＭＹ４抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図８Ｂ】図８は陽性対照ＴＨＰ−１およびＭＹ４抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図８Ｃ】図８は陽性対照ＴＨＰ−１およびＭＹ４抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図８Ｄ】図８は陽性対照ＴＨＰ−１およびＭＹ４抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図９Ａ】図９は２８Ｃ５抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図９Ｂ】図９は２８Ｃ５抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図９Ｃ】図９は２８Ｃ５抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図９Ｄ】図９は２８Ｃ５抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図１０Ａ】図１０は１８Ｅ１２抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図１０Ｂ】図１０は１８Ｅ１２抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図１０Ｃ】図１０は１８Ｅ１２抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図１０Ｄ】図１０は１８Ｅ１２抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図１１】図１１はｓＣＤ１４に対する種々のｍＡｂの力価である。
【図１２】図１２は、ｍＡｂ３Ｃ１０と一団の抗ＣＤ１４ｍＡｂとの競合アッセイの結果を示す。
【図１３】図１３は、抗ＣＤ１４ｍＡｂによるＬＰＳ／ＬＢＰのＣＤ１４への結合のブロックを示す。
【図１４】図１４は、ＨＬ−６０細胞におけるサイトカイン放出をブロックする抗ＣＤ１４ｍＡｂの能力の評価結果を示す。
【図１５】図１５は、ＬＰＳの細胞性ＣＤ１４への結合を抑制する抗ＣＤ１４ｍＡｂの効果を示す。
【図１６】図１６は、ＬＰＳ依存性、ＣＤ１４媒介細胞活性化に及ぼす抗ＣＤ１４ｍＡｂの効果を示す。
【図１７Ａ】図１７は、ＬＰＳを用いて抗原投与し、１８Ｅ１２（・）、２８Ｃ５（■）またはＩｇＧ１（×）を用いて処理したサルの平均動脈圧を示す。
【図１７Ｂ】図１７は、ＬＰＳを用いて抗原投与し、１８Ｅ１２（・）、２８Ｃ５（■）またはＩｇＧ１（×）を用いて処理したサルの平均動脈圧を示す。
【図１８Ａ】図１８は、サルにおけるヒトＩＦＮ-γによる処理の前および後のＣＤ１４レベルおよびＬＢＰレベルを示す。
【図１８Ｂ】図１８は、サルにおけるヒトＩＦＮ-γによる処理の前および後のＣＤ１４レベルおよびＬＢＰレベルを示す。
【図１９】図１９は、１８Ｅ１２、２８Ｃ５またはＩｇＧ１を用いて処理したサルにおけるＢＳＡの洗浄液(lavage)／血漿の比を示す。
【図２０】図２０はサルにおける１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１の抗体半減期を示す。
【図２１Ａ】図２１は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２１Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２１Ｂ）におけるＣＤ１４レベルを示す。
【図２１Ｂ】図２１は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２１Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２１Ｂ）におけるＣＤ１４レベルを示す。
【図２２Ａ】図２２は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２２Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２２Ｂ）におけるＬＢＰレベルを示す。
【図２２Ｂ】図２２は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２２Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２２Ｂ）におけるＬＢＰレベルを示す。
【図２３Ａ】図２３は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２３Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２３Ｂ）におけるＡＬＴ／ＧＰＴレベルを示す。
【図２３Ｂ】図２３は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２３Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２３Ｂ）におけるＡＬＴ／ＧＰＴレベルを示す。
【図２４Ａ】図２４は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２４Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２４Ｂ）におけるＥ−セレクチンレベルを示す。
【図２４Ｂ】図２４は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２４Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２４Ｂ）におけるＥ−セレクチンレベルを示す。
【図２５Ａ】図２５は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＴＮＦレベル（図２５Ａ）、および抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつ抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＩＬ−１レベル（図２５Ｂ）を示す。
【図２５Ｂ】図２５は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＴＮＦレベル（図２５Ａ）、および抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつ抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＩＬ−１レベル（図２５Ｂ）を示す。
【図２６Ａ】図２６は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＩＬ−６レベル（図２６Ａ）、および抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつ抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＩＬ−８レベル（図２６Ｂ）を示す。
【図２６Ｂ】図２６は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＩＬ−６レベル（図２６Ａ）、および抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつ抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＩＬ−８レベル（図２６Ｂ）を示す。
【図２７】図２７は、１８Ｅ１２（●）、２８Ｃ５（▲）または２３Ｇ４（■）を用いた処理による、ＬＰＳで刺激したヒト全血におけるＴＮＦ放出の抑制を示す。
【図２８】図２８は、ヒヒ血液におけるＬＰＳ誘導ＴＮＦ分泌に及ぼす抗ＣＤ１４抗体の効果を示す〔２３Ｇ４（●）、２８Ｃ５（▽）および１８Ｅ１２（▼）〕。
【図２９】図２９は、モノクローナル抗体３Ｃ１０、２８Ｃ５、２３Ｇ４および１８Ｅ１２のＬ鎖のアミノ酸配列を示す。
【図３０】図３０は、モノクローナル抗体３Ｃ１０、２８Ｃ５および１８Ｅ１２のＨ鎖のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
ヒト可溶性ＣＤ１４（「ｓＣＤ１４」）の全長ポリペプチドが本開示によって提供される。本明細書で用いる「ＣＤ１４」という用語は、ＬＰＳがＬＰＳ：ＬＢＰ複合体として存在する時のＬＰＳの結合部位であるとして同定された細胞表面受容体を意味する。ＣＤ１４細胞表面受容体は、成熟単球、好中球およびマクロファージの表面に存在するグリセロホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合タンパク質である。天然のＣＤ１４もまた、成熟単球およびマクロファージの表面から可溶性形態で自然に放出される。天然のｓＣＤ１４はＧＰＩアンカーを欠き、血清中に存在する。ｓＣＤ１４の生物学的起源および機能はまだ十分に明らかにされていない(Bazil, Europ. J. Immunol., 16:1583-1589, 1986) 。
【００１３】
本明細書で用いる「可溶性」という用語は、細胞表面に関連しない、と定義される。「可溶性ＣＤ１４」とは、ＬＰＳ：ＬＢＰ複合体および／またはＬＰＳ単独に特異的に結合するものとしてさらに特徴付けられる、非細胞関連ＣＤ１４分子である。「組換えヒトｓＣＤ１４」は、図１に記載の核酸配列（配列番号：９）によってコードされる全長のアミノ酸可溶性ヒトＣＤ１４タンパク質、およびその端を切断されたものの両方を含む。同定する目的のためのみに、上記全長タンパク質を５２３と称し、端部切断タンパク質を８４７と称する。このヒトｓＣＤ１４は免疫原としてポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作成に有用であり、また患者の試料中におけるＬＰＳの存在を検出するためにも有用である。免疫原として使用する場合、５２３は従来のＣＤ１４免疫原よりも有利な点を提供した。例えば、５２３はより多数のＣＤ１４特異的陽性クローンを提供した；５２３は全細胞抽出物中に存在するであろう他の免疫原性タンパク質に対する多数の非特異的応答を排除した；そして、５２３は興味の対象である抗体を得るために必要とされるスクリーニングの回数を減らした。この全長ヒトｓＣＤ１４ポリペプチドは、図１に記載の核酸配列（配列番号：９）を有する。この配列を用いて、当業者は類似の配列を有するポリペプチドを化学合成または遺伝子組換えにより作成することができる。端部切断タンパク質（「８４７」）は、除去された配列のカルボキシル末端由来の８個のアミノ酸を有する。
【００１４】
ｓＣＤ１４の１次アミノ酸配列の小変異は、本明細書に記述されるｓＣＤ１４タンパク質と比較して実質的に等しい機能を有するタンパク質をもたらす可能性がある。このような修飾は、部位特異的突然変異誘発によるもののように精巧であることもあるし、また自然発生的なものでもありうる。これらの修飾によって産生されたすべてのタンパク質は、ＣＤ１４機能が存在するかぎり本発明に含まれる。
【００１５】
ｓＣＤ１４の１次アミノ酸配列の修飾はまた保存性変異を包含する。本明細書に用いられる「保存性変異」という用語は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似したアミノ酸残基による置換を意味する。保存性変異の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニン等の疎水性残基が別の疎水性残基に置換すること、またはアルギニンがリシンに、グルタミン酸がアスラギン酸に、グルタミンがアスパラギンに置換する等の極性残基が別の極性残基に置換することを含む。「保存性変異」という用語は、置換ポリペプチドに対して作成された抗体が非置換ポリペプチドに対しても免疫反応を示すならば、置換アミノ酸を非置換親アミノ酸の代わりに使用することをも含む。
【００１６】
本発明は図１（配列番号：９）に記載の、ヒト可溶性ＣＤ１４ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、図１に記載の核酸分子とは異なるが、発現されるとこの核酸分子と同一の表現型効果または免疫原性効果を奏する核酸分子をも包含する。本発明は、上記の核酸分子と比較したとき、産生されるポリペプチドの表現型を変更しない非コード領域における変化によって特徴付けられる核酸分子を包含する。それゆえ、ｓＣＤ１４の全体または一部をコードする全てのポリヌクレオチドも、ｓＣＤ１４の機能（抗体を誘導する、または抗体と結合するなど）を示すものであれば本発明に含まれると解釈される。そのようなポリヌクレオチドは、天然に存在する、および意図的に操作された（例えば突然変異誘発された）ポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドは上記タンパク質をコードするＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む。
【００１７】
本発明はさらに、本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を包含する。本明細書に使用する「核酸」という用語は、ＲＮＡならびに一本鎖および２本鎖のＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む。
【００１８】
図１に記載の配列および当業者に周知の方法（参照として全体をここに組み入れる Sambrookら，Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989) に例示される)を用いて、ヒトｓＣＤ１４を遺伝子組換えによって作成し、単離することができる。この配列を含有する発現ベクター、およびそのベクターを含有する宿主細胞もまた本発明により提供される。本明細書に使用する「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、プロモーターおよびエンハンサー配列等の発現をもたらすことが可能な他の配列との機能的な共同により、選択された宿主細胞において発現されうる異種の核酸配列をいう。説明の目的のためのみに例を挙げると、これらの発現ベクターは細菌プラスミド、細菌ファージ、動物ウイルス、バキュロウイルスまたはコスミドでありうる。ベクターが細菌プラスミドまたは細菌ファージの場合は、上記のポリペプチドを遺伝子組換えによって産生するために大腸菌等の原核生物宿主細胞が使用できる。真核生物宿主細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)等の哺乳動物細胞またはバキュロウイルス発現のための昆虫細胞でありうるが、これらに限定されない。
【００１９】
ヒトｓＣＤ１４を遺伝子組換えによって産生する方法が本発明により提供される。この方法は、上記の宿主細胞を、ｓＣＤ１４核酸分子が転写され、かつ翻訳されるのに適切な条件下で培養することを要する。発現後、市販のＣＤ１４モノクローナル抗体からなるアフィニティーカラムを使用して、組換えｓＣＤ１４を細胞培養物より単離することができる。
【００２０】
本発明はまた、細胞表面ＣＤ１４受容体および可溶性ＣＤ１４と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、抑制されなければＣＤ１４受容体に結合し、細胞を活性化して、例えばＮＦ-κＢ活性を誘導またはサイトカインを産生および放出することが可能なリガンドによるＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制する。本発明によって提供されるモノクローナル抗体は、リガンドがＣＤ１４に結合してしまった後でも、リガンドによるＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制することができる。これらのモノクローナル抗体はリガンドとＣＤ１４との間に少なくとも約80%のリガンド結合を起こさせ、それでもなおＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制することができるが、これらの抗体はリガンドとＣＤ１４との間に少なくとも約50%のリガンド結合が起こるのを許しうる。
【００２１】
本明細書に使用する「抗体またはポリクローナル抗体」という用語は、抗原を用いた免疫感作に応答して、または組換えクローニング技法により作られるタンパク質を意味する。「モノクローナル抗体」という用語は、細胞の単一クローンより誘導された免疫グロブリンを意味する。そのクローンから誘導されたすべてのモノクローナル抗体は化学的および構造的に同一で、１個の抗原決定基に特異的である。
【００２２】
実験室においてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作成するための方法は、当分野の技術では公知である〔参照としてここに組み入れる Harlow および Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yord (1988)参照〕。本発明のモノクローナル抗体は、可溶性ＣＤ１４の全長ヒト組換えポリペプチドを動物、例えばマウスまたはウサギに導入することにより生物学的に作成できる。その動物における抗体産生細胞を単離し、ハイブリッド細胞またはハイブリドーマを作成するために骨髄腫細胞または異種骨髄腫細胞と融合させる。それゆえ、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞もまた提供される。この方法で産生されるモノクローナル抗体は、１８Ｅ１２、２８Ｃ５、２３Ｇ４、５Ｇ３、４Ｆ２、１３Ａ７、１０Ｂ７および２６Ｆ３と称するモノクローナル抗体を含むが、これらだけに限定されない。ハイブリドーマ細胞系１８Ｅ１２、２８Ｃ５および２３Ｇ４は、特許手続上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約の規定に基づいて American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville,Maryland 20852, U.S.A.に寄託された。１８Ｅ１２および２８Ｃ５は1993年5月27日に寄託され、それぞれATCC受託番号 HB11363およびHB11364を与えられた。２３Ｇ４は1994年5月25日に寄託され、受託番号Xを与えられた。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびその規則（ブダペスト条約）の規定に基づいて行なわれた。これは、寄託日より30年間、生育しうる培養物の維持を保証する。これらの微生物は、当該米国特許の付与、または米国若しくは外国出願の公開のうちどちらか早い方が行なわれたならば、培養物の子孫を公衆に対して永久的および非制限的に入手可能であることを保証し、また米国特許商標庁長官によって35 U.S.C.§122およびそれに準じる長官規則（特に886 OG 638に関連してC.F.R.§1.14を含む) により資格があるとされた者に対する子孫の入手可能性を保証するブダペスト条約の条件に基づいて、ATCCにより入手可能とされるであろう。
【００２３】
本願の譲受人は、もし培養寄託物が適切な条件下で培養されていて死滅、紛失または破壊された場合、通知があり次第、同一培養物の生育可能な標本と迅速に取り換えることに合意した。寄託された菌株の入手可能性は、政府当局によりその特許法に基づいて授与された権利に反してその発明を実施するためのライセンスであると解釈されるべきではない。
【００２４】
ここまで記述してきた明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能とするに十分であると考えられる。本発明は、寄託された細胞系によってその範囲を制限されるものではない。なぜなら、寄託された具体物は本発明の一側面の一つの説明として意図されるもので、機能的に等価な任意の細胞系は本発明の範囲内にあるからである。微生物の寄託は、本明細書に含有される記述が本発明の任意の側面（最も好ましい態様を含む）の実施を可能とするには不十分であるという承認を構成しない。また、微生物の寄託は、請求の範囲をその寄託物が表す特定の例証に制限するものと解釈されるべきではない。
【００２５】
したがって、独自の可溶性ＣＤ１４の全長組換えタンパク質および周知の方法を用いて、当業者は本発明のハイブリドーマ細胞および抗体を作成し、スクリーニングすることができる。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体は、細胞表面ＣＤ１４受容体および可溶性ＣＤ１４と特異的に反応し、ＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制可能であるとして特徴付けることができる。結合特異性の測定方法は下記に要約されている。１つの態様において、本発明のモノクローナル抗体は、抗ＣＤ１４抗体３Ｃ１０(American Type Culture Collection より入手可能)の親和性よりも大きいＣＤ１４に対する結合親和性を有するものとしてさらに特徴付けることができる。そのようなモノクローナル抗体の一つは、２８Ｃ５と称するモノクローナル抗体である。ジヒドロキシビタミンＤ３誘導ＴＨＰＩ細胞への２８Ｃ５結合のスキャッチャード分析は、３ｘ１０-9Ｍ-1という親和性を示した。モノクローナル抗体２８Ｃ５および２３Ｇ４、ならびに類似の特異性および親和性を有する抗体は、活性化を抑制でき、またＮＦ-κＢ活性化を誘導するリガンドとのＣＤ１４の結合を抑制することができる、としてさらに特徴付けることができる。さらに、本発明のすべてのモノクローナル抗体は、ＣＤ１４＋細胞が誘導性リガンドと接触した時に、これらの細胞からのサイトカイン放出を抑制する能力によって特徴付けることができる。本明細書で用いるサイトカインという用語はＴＮＦ-α、ＩＬ-１、ＩＬ-６およびＩＬ-８を含むが、これらだけに限定されない。
【００２７】
別の態様においては、モノクローナル抗体１８Ｅ１２および類似の特異性を有するモノクローナル抗体は、ＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制する能力を有するが、その抑制がなければＣＤ１４媒介細胞活性化を誘導できるリガンドとＣＤ１４との結合を有意に抑制しない（つまり、これらの抗体はＣＤ１４結合を許す）、としてさらに特徴付けることができる。１８Ｅ１２の特異性を有するモノクローナル抗体は、リガンドとＣＤ１４の間で少なくとも約50%から少なくとも約80%の結合が起こることを許す。
【００２８】
ここに記述された好ましいモノクローナル抗体、すなわち１８Ｅ１２および２３Ｇ４は、ヒトＣＤ１４およびヒヒＣＤ１４の両方に結合する。他方、２８Ｃ５はヒヒＣＤ１４とは結合しない。
【００２９】
ＬＢＰは、ＬＰＳのＣＤ１４に対する提示に関与する支配的な血清タンパク質であるが、他の血清タンパク質もまた適切な条件下でＬＰＳに結合し、ＬＰＳ−ＣＤ１４相互作用を促進しうる(Wright, S.D.ら，J. Expt. Med., 176:719-727, 1992)。生理的条件下でＬＢＰまたは他のタンパク質のどちらが優勢かに関わりなく、モノクローナル抗体１８Ｅ１２、２３Ｇ４または２８Ｃ５の効果は同一である。なぜなら、これらの抗体は血漿（または血清）の存在下でＬＰＳのＮＦ-κＢまたはサイトカイン産生に及ぼす効果を妨げるからである。
【００３０】
本発明はまた、上記のポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生物学的に活性な断片を提供する。これらの「抗体断片」は、選択的に抗原または受容体と結合する若干の能力を保持している。このような抗体断片は以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち：
（１）Ｆａｂ：酵素パパインで消化して作成され、無傷のＬ鎖１本および１本のＨ鎖の一部を生じる、抗体分子の一価の抗原結合性断片を含有する断片；
（２）Ｆａｂ’：ペプシンで処理し、次に還元して得られ、無傷のＬ鎖１本およびＨ鎖の一部を生じる、抗体分子の断片；１個の抗体分子につき２個のＦａｂ’断片が得られる；
（３）（Ｆａｂ’）2：酵素ペプシンで処理し、次に還元を行なわないで得られる、抗体の断片；（Ｆａｂ’）2は２つのジスルフィド結合により結合している２個のＦａｂ’断片からなる二量体である；
（４）Ｆｖ：２本の鎖として発現されるＬ鎖の可変部およびＨ鎖の可変部を含有する遺伝子工学的に作成された断片と定義される；および
（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）：適切なポリペプチドリンカーによって結合されたＬ鎖の可変部およびＨ鎖の可変部を遺伝子工学的に融合させた一本鎖分子として含有する、遺伝子工学的に作成された断片と定義される。
【００３１】
これらの断片の作成方法は当分野において公知である。例えば、前出のHarlowおよびLaneを参照されたい。
【００３２】
「生物学的に活性な断片」のさらなる例は、以下に規定する抗体のＣＤＲを特異的に含む抗体断片を含む。これらのＣＤＲ領域は、図２〜５および２９〜３０（配列番号：１〜８および配列番号：２２〜２４）に同定されている。これらの抗体のＣＤＲは、下記のＣＤＲグラフト(grafted) 抗体を作成するのに有用である。「生物学的に活性な断片」のさらなる例は、これもまた図２〜５および２９〜３０（配列番号：１〜８および配列番号：２２〜２４）に同定される抗体のフレームワーク構造領域を特異的に含む断片を含む。抗体のフレームワーク構造領域は、ＣＤＲのＰＣＲ増幅のためのプライマーとして有用である。
【００３３】
遺伝子組換えによって作成され、生化学的に合成され、化学的に合成され、または化学的に修飾されたタンパク質またはポリペプチドであって、対応する天然ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のＣＤ１４細胞表面受容体および可溶性ＣＤ１４に結合する能力、ならびに活性化するリガンドのＣＤ１４＋細胞への結合によるＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制する能力を保持しているものも、本発明に包含される。抗原または受容体と結合する能力は、抗体捕獲アッセイ等の当分野の技術において公知の抗原結合アッセイによって測定される（例えば、前出のHarlowおよびLaneを参照）。
【００３４】
上記の抗体または生物的に活性な抗体断片の任意のものが、ＣＤＲグラフト抗体およびキメラ抗体の作成に使用できる。
【００３５】
「ＣＤＲ」若しくは「相補性決定部位」または「超可変部」は、抗原結合部位の形成に寄与する三次元ループ構造を形成する、抗体のＬ鎖およびＨ鎖上のアミノ酸配列と定義される。
【００３６】
本明細書に使用する「ＣＤＲグラフト」抗体という用語は、Ｌ鎖および／またはＨ鎖可変部の１個またはそれ以上のＣＤＲ配列の少なくとも一部が、所与の抗原または受容体に対して異なる結合特異性を有する抗体由来のＣＤＲ配列の類似部分によって置換されているアミノ酸配列を有する抗体を言う。
【００３７】
本明細書で用いる「Ｌ鎖可変部」および「Ｈ鎖可変部」という用語は、Ｌ鎖およびＨ鎖のそれぞれのＮ末端部に存在する、各抗体ごとに変化した一次アミノ酸配列を有する領域またはドメインを言う。抗体の可変部は、一緒に折りたたまれて抗体の三次元結合部位を形成するＬ鎖およびＨ鎖のアミノ末端ドメインからなる。
【００３８】
類似性ＣＤＲ配列は基質またはレシピエント抗体に「グラフト（接ぎ木）される(grafted)」と言われている。「ドナー」抗体とはＣＤＲ配列を提供する抗体で、置換された配列を受け取る抗体が「基質」抗体である。当業者は、本明細書に提供する教示を当分野で周知の技法（参照のため全体をここに組み入れるBorrebeack, C.A., Antibody Engineering : A PracticalGuide, W.H. Freeman and Company, New York, 1992参照）と組み合わせて使用して、容易にこれらのＣＤＲグラフト抗体を作成することができる。
【００３９】
本発明はさらに、上記の抗体または生物学的に活性な断片のキメラ抗体を提供する。本明細書で用いる「キメラ抗体」という用語は、ある生物種から誘導された抗体の可変部が別の種から誘導された抗体の定常部と組み合わされている抗体を言う。キメラ抗体はＤＮＡ組換え技術によって構築され、例えば Shawら，J. Immun. 138:4534 (1987); Sun, L.K. ら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:214-218(1987)に記述されている。
【００４０】
上記の抗体、モノクローナル抗体、生物学的に活性な断片、キメラ抗体およびＣＤＲグラフト抗体をコードする核酸分子もまた本発明により提供される。「核酸」という用語は、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを含むことが意図される。これらの核酸分子は、ＲＮＡ転写プロモーターに機能しうる形で連結することができる。本発明は上記の核酸分子とは異なるが、同一の表現型効果を生じる核酸分子をも包含する。本発明は、上記の核酸分子と比較したとき、産生されるポリペプチドの表現型を変化させない、非コード領域における変化によって特徴付けられる核酸分子を包含する。本発明はさらに、本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を包含する。本明細書に使用する「核酸」という用語は、１本鎖および２本鎖のＤＮＡおよびｃＤＮＡはもとよりＲＮＡも包含する。
【００４１】
１つの態様において、これらの核酸分子は前記の発現ベクターに挿入される。発現ベクターは適切な宿主細胞に挿入することができる。挿入された核酸配列の転写および翻訳に好ましい条件下で細胞の増殖を誘導すると、組換えタンパク質またはポリペプチドが産生され、次にこれらを単離して、以下に記述する診断または治療に使用することができる。組換えによりポリペプチドおよびタンパク質を産生する方法は広く知られている（前出のSambrookら、および Kreigler, M., Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York, 1990参照。これらはそれぞれ参照のためここに組み入れている）。
【００４２】
医薬組成物もまた本発明により提供される。これらの医薬組成物は、上記のポリペプチド、断片、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体またはＣＤＲグラフト抗体の任意のものを単独で、または相互に組み合わせて含有し、かつ製薬上許容されるキャリヤーを含有する。本明細書に使用される「製薬上許容されるキャリヤー」という用語は、任意の標準的医薬キャリヤーを含む。例えば、リン酸緩衝化生理食塩溶液、水、および油／水または水／油エマルジョン等のエマルジョン類、および種々の湿潤剤等である。これらの医薬組成物は診断または治療上の目的に有用である。
【００４３】
本発明のモノクローナル抗体は、in vitroでの使用に適している。例えば、これらの抗体を液相で、または固相担体に結合して使用するイムノアッセイに適している。さらに、これらのイムノアッセイにおけるモノクローナル抗体は、種々の方法で検出可能に標識することができる。本発明のモノクローナル抗体を使用できるイムノアッセイの種類の例は、直接または間接様式の競合および非競合イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ(RIA)およびサンドイッチ( 免疫測定法)アッセイである。本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原の検出は、前進、逆方向または同時様式で実施されるイムノアッセイ( 生理的試料に関する競合イムノアッセイおよび免疫組織化学的アッセイを含む）を用いて行なうことができる。当業者は過度の実験をすることなく他のイムノアッセイ様式を知るか、または容易に認識することができるであろう。
【００４４】
本発明のモノクローナル抗体は、多数の異なる担体に結合させてＣＤ１４の検出に使用することができる。周知の担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が含まれる。担体の性質は、本発明の目的に応じて可溶性であることも、不溶性であることもある。当業者は、通常の実験によりモノクローナル抗体を結合させるための他の適切な担体を知るか、またはそのような担体を突き止めることができるであろう。
【００４５】
当業者に公知の多数の異なる標識および標識化方法がある。本発明に使用できる標識の種類の例には、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物および生体発光化合物が含まれる。当業者は、通常の実験により本発明のモノクローナル抗体に結合させる他の適切な標識を知るか、またはそのような標識を突き止めることができるであろう。さらに、このような標識を本発明のモノクローナル抗体に結合させることは、当業者に周知の標準的技法を用いて行なうことができる。
【００４６】
さらに、ＬＰＳ／ＬＢＰ複合体の細胞表面ＣＤ１４受容体への結合をブロックするための方法が提供される。この方法は、細胞を上記複合体と結合可能なモノクローナル抗体（例えば、２８Ｃ５若しくは２３Ｇ４の特異性および親和性を有するモノクローナル抗体、またはその生物学的に活性な断片）と接触させることによるものである。また、ＮＦ-κＢ活性化を誘導することが可能なリガンド（ＬＰＳまたはＬＰＳ／ＬＢＰ等）の存在下におけるＣＤ１４受容体を発現する細胞のＮＦ-κＢ活性化を抑制する方法も開示される。この方法は、上記細胞を細胞表面受容体ＣＤ１４および全長ヒト可溶性ＣＤ１４に特異的に結合する能力を有する抗体、またはその生物学的に活性な断片と接触させることを提供する。このような抗体の具体例は、２８Ｃ５、２３Ｇ４および１８Ｅ１２と称する抗体である。
【００４７】
動物およびヒトに使用することができる幾つかの治療方法がここに提供される。１つの治療法は、細胞表面受容体ＣＤ１４および可溶性ＣＤ１４に特異的に結合する能力を有する抗体またはその生物学的に活性な断片を、疾患を有する被験者に有効量投与することによって、ＮＦ-κＢ活性化に関連する疾患（敗血症等）を治療または予防する手段である。上記の方法は、１８Ｅ１２の結合特異性を有するモノクローナル抗体を使用した場合に特に有利である。１８Ｅ１２およびそれに類似の抗体はＬＰＳがＣＤ１４受容体と結合してしまった後でもＮＦ-κＢ活性化を抑制できるので、そのような抗体は後期敗血症(later stage sepsis)の治療に使用することができる。本明細書に使用する後期敗血症という用語は、ＬＰＳがＣＤ１４細胞関連受容体と結合してしまった後の疾患過程を意味する。意味深いことに、１８Ｅ１２および類似の抗体は、抗体が結合した細胞にＬＰＳまたはＬＰＳ／ＬＢＰ複合体の該細胞内への輸送を継続することを許すことができる。この特性は、in vivo系からのＬＰＳまたはＬＰＳ／ＬＢＰ複合体の除去を可能とし、それによってどこか他のin vivo 部位において起こりうるＬＰＳまたはＬＰＳ／ＬＢＰ複合体の病理学的相互作用を抑制するという付加的利益をもたらす。
【００４８】
あるいは、治療が予防的なものであるか、又はＬＰＳ／ＬＢＰがＣＤ１４と結合するのをブロックし、それによってサイトカイン放出および細胞活性化を抑制することが望ましい場合は、モノクローナル抗体２８Ｃ５および２３Ｇ４が本発明の方法に好ましい。
【００４９】
本発明は、敗血症の症状を示しているか、または敗血症を発症する恐れのある被験者に、治療上有効量の、ＣＤ１４に結合して細胞活性化を抑制する本発明のモノクローナル抗体を投与することを含む、敗血症自体または敗血症の１つまたはそれ以上の症状を改善する治療法を提供する。改善されうる症状は、血中ＴＮＦレベルの一過性の上昇に関連する症状、例えば熱、低血圧、好中球減少、白血球減少、血小板減少、汎発性血管内凝固症候群、成人呼吸促進症候群、ショックおよび多臓器不全を含む。このような治療を要する患者には、例えばグラム陰性菌感染、毒物中毒、または肝不全に由来する内毒血症等の毒血症の危険がある患者、またはこれを患っている患者が含まれる。さらに、グラム陽性菌感染、ウイルス感染または真菌感染を有する患者は、敗血症の症状を示すことがあり、ここに記述する治療方法によって利益を受けることができる。本発明の方法からより特別に利益を受けることのできる患者は、大腸菌、インフルエンザ菌Ｂ(Haemophilus influenza B)、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、ブドウ球菌、または肺炎球菌による感染を患っている患者である。敗血症の危険がある患者には、火傷、銃創、腎不全または肝不全を患う患者が含まれる。
【００５０】
本明細書に用いる「治療上有効量」という表現は、用いられるモノクローナル抗体（ＣＤ１４に結合し、サイトカイン放出等のシグナル発信現象をブロックする）の量が、被験者のＬＰＳへの応答を減少させ、敗血症の症状を減少させるのに十分な量であることを言う。したがって「治療上有効」という表現は、例えば、血漿中のＴＮＦレベルにおける臨床的に有意な上昇をさまたげる、そして好ましくは少なくとも５０％減少させる、そしてより好ましくは９０％減少させるのに十分なその抗体の量を含む。本発明のモノクローナル抗体、例えば１８Ｅ１２、２８Ｃ５および２３Ｇ４を投与する際の投与量範囲は、所望の効果を生じるに十分なだけ大きい。一般にこれらの抗体の用量は、患者の年齢、状態、性別、前記の細菌または他の作用物質による感染の程度によって変わり、当業者によって決定されうる。何らかの禁忌の場合、用量は個々の治療医により調節することができる。いずれにせよ、治療の有効性は、患者のＬＰＳおよびＴＮＦレベルをモニターすることにより確認できる。血清ＬＰＳおよびＴＮＦレベルの低下は患者の回復と相互関連しているに相違ない。
【００５１】
さらに、本発明の抗体の治療的投与と実質的に同時にＴＮＦ抑制剤、抗生物質またはその両方を投与することをさらに含む前記の方法によって、敗血症の危険のある、またはその症状を示している患者を治療することができる。例えば、抗ＴＮＦ抗体および／またはＴＮＦ拮抗薬の使用等による、敗血症におけるＴＮＦの役割への直接的または間接的干渉は、敗血症の症状を予防または改善することができる。特に好ましいのは有効成分としての抗ＴＮＦ抗体、例えば Traceyら(Nature, 330:662, 1987) によって記述されているＴＮＦ特異性を有するモノクローナル抗体などの使用である。
【００５２】
末端切断型(truncated) ＬＢＰまたは本発明の抗体を用いた治療に加えて、抗生物質を用いて敗血症の症状を示す患者を治療することができる。典型的抗生物質には、ゲンタマイシン等のアミノグリコシド、またはペニシリン、セファロスポリン等のβ−ラクタムが含まれる。したがって、本発明の好ましい治療法は、殺菌量の抗生物質の投与と実質的に同時に、治療上有効量の本発明の抗体を投与することを含む。
【００５３】
本明細書に使用する「殺菌量(bactricidal amount)」という用語は、治療を受けている患者において細菌を殺す血中濃度を達成するのに十分な量を言う。ヒトに投与しても安全であると一般に承認されている抗生物質の殺菌量は、当分野の技術において周知であり、公知のように特定の抗生物質および治療すべき細菌感染の種類により変わる。
【００５４】
好ましくは、本発明のモノクローナル抗体の投与は、抗生物質投与の約48時間以内に、より好ましくは約2〜8時間以内に、そして最も好ましくはそれと実質的に同時に行なわれる。
【００５５】
本発明の目的のためには、被験者は動物またヒト患者であり、有効量は体重 1 kg あたり 0.25 mg から約 50 mgである。１つの態様において、有効量は体重 1 kg あたり 0.5 mg から約 10mgである。被験者がヒト患者である場合、好ましい量は体重 1 kg あたり約 0.5 mg から約 8 mg である。
【００５６】
当業者に公知のように、上記の諸方法は治療および予防の効果を増強するために組み合わせることが可能である。医薬組成物を投与する手段は当業者には周知であり、これらの手段は静脈内投与、経口投与、腹腔内投与、皮下投与、または吸入療法による投与を含むが、これらだけに限定されない。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例は本発明を説明することを意図するものであって、制限するものではない。
実施例１
可溶性ＣＤ14（ｓＣＤ14）の産生およびモノクローナル抗体の製造
Ａ．ｓＣＤ14のクローニング
ヒトＣＤ14遺伝子の１コピーを入手した。ヒト単球細胞系（ＨＬ−60）（American Type Culture Collection,ATCC No.240）からのこの遺伝子のクローニングについての記述が Blood,73 :284(1989)にあり、ここで参考として引用する。ＣＤ14遺伝子をこの発現ベクターから切除し、哺乳動物の発現ベクターｐＥＥ14（Celtech)中にクローン化した。このベクターは誘導性グルタミンシンテターゼ遺伝子（ＧＳ）を有しており、これを使用してＣＤ14遺伝子を含有する挿入ＤＮＡフラグメントを増幅させた。この遺伝子の完全ＤＮＡ配列をｐＥＥ14中にクローン化した。市販の抗ＣＤ14ｍＡｂｓとの反応性に関するＥＬＩＳＡ検定によって、可溶性ＣＤ14を発現する細胞を同定した。ＦＡＣＳ分析によって検出したところ、523 と同定された１つのクローンが可溶性ＣＤ14と膜結合形態のものとの両方を発現することが証明された。可溶性形態のクローン 523は予測された翻訳タンパク質配列の20番目のアミノ酸残基の位置でＮ−末端プロセシングされていることがわかった。このタンパク質の配列を図１に示す。翻訳されたＣＤ14配列の１〜19アミノ酸残基はシグナル配列であると予測された（Gene Works, Intelligenetics ）。Ｃ−末端配列分析によって、Ｃ−末端は完全なままであることがわかった；ヒト血清から単離した可溶性ＣＤ14において言及されている（Bazil,et al.,Eur.J.Immunol.,16:1583,1986をここに参考として挙げる）のと同様のプロセシングは生起しなかったことになる。腎臓疾患患者の尿から単離した可溶性ＣＤ14は、Ｃ−末端から最大で８番目までのアミノ酸が欠如している（Bazil,Mol.Immunol.,26:657,1989）。クローン 523は、ＣＨＯ細胞中での発現の結果、Ｃ−末端でのプロセシングステップがなかったのかも知れない。
【００５８】
可溶性ＣＤ14の精製は、市販のｍＡｂ63Ｄ3 （American Type Culture Collectionより(ATCC No.HB44)入手可能）のアフィニティカラム上で抗原を精製することによって行なった。
【００５９】
Ｂ．ｓＣＤ14モノクローナル抗体の産生
上記の精製ヒト組換えＣＤ14で免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞系Ｘ63.Ａｇ8.653間での体細胞融合によって、ヒト可溶性ＣＤ14に対するモノクローナル抗体を産生させた。ＥＬＩＳＡ検定においてＣＤ14に対するスクリーニングによって同定したモノクローナル抗体の28Ｃ5 ，18Ｅ12，26Ｆ3 および23Ｇ4 は Ig Ｇ１ｍＡｂである。ＣＤ14+細胞上のフローマイクロフルオロメトリーおよび生合成標識したＣＤ14の免疫沈降によって、天然ＣＤ14への結合を確認した。モノクローナル抗体28Ｃ5 ,23Ｇ4および18Ｅ12は細胞結合および可溶性ＣＤ14を認識する。競合試験により、これらのｍＡｂはＣＤ14の３つの異なるエピトープ（28Ｃ5 および23Ｇ4 では重複）に結合したことが示された。
【００６０】
実施例２
モノクローナル抗体の特性決定
Ａ．抗ＣＤ14モノクローナル抗体を使用したＣＤ14+陽性細胞のＦＡＣＳ分析
ＴＨＰ−１細胞（American Type Culture Collection, ATCC
No. TIB 202 ）をジヒドロキシビタミンＤ３で48時間誘導し、その後細胞をＤＭＥＭ（4.5 g/L グルコース、90％ウシ胎児血清を有し、１％ＢＳＡおよび0.02％アジドを有するＰＢＳを追加した、ダルベッコ改変イーグル培地）で洗浄した。1,000,000 cells/tube（１チューブ当たりの細胞数）を第１の抗体（抗ＣＤ14上清）の１：２の希釈物と４℃で45分間反応させた。細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／アジドで洗浄した。第２の抗体（ヤギ抗マウスIgＧ、ＦＩＴＣ標識(Cappel)）を１：250 の希釈率で添加し、４℃で30分反応させた。細胞を同一の緩衝液で２回洗浄した。ペレットを緩衝液１mlに再懸濁させた。サイトフルオログラフ（Cytofluorograph)（Ortho Instruments)によって蛍光強度を測定した。この結果を図６〜10に示す。
【００６１】
Ｂ．抗ｓＣＤ14モノクローナル抗体の可溶性ＣＤ14に対する結合親和性の測定
可溶性ＣＤ14抗原に対する結合親和性について、すべての抗ＣＤ14ｍＡｂおよび市販の抗ＣＤ14のいくつかを評価した（図11）。抗体３Ｃ10は力価１：２8、28Ｃ５は力価１：２11であった。これは３Ｃ10に比較して28Ｃ５の力価が８倍であることを示す。これらの抗体の比親和性は、標識ヤギ抗マウス複合抗体でプローブ化した等濃度の精製抗体タンパク質で測定した。この方法によってわかった、ｓＣＤ14に対して高親和性のある抗体は、４Ｆ２，５Ｇ３，26Ｆ３，28Ｃ５，23Ｇ４および63Ｄ３である。抗ＣＤ14ｍＡｂの３Ｃ10および18Ｅ12はｓＣＤ14に対し、最低の親和性を示した。抗ＣＤ14の28Ｃ５は、３Ｃ10に比較してずっと高い親和性を有していた。可溶性ＣＤ14をマイクロタイタープレート上に塗布し、抗ＣＤ14ｍＡｂの２μg／mlから２倍ずつの連続希釈物を添加した。ヤギ抗マウスＨＲＰ複合抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した。その後基質を添加して、力価１：２nを記録した。これは、陰性対照のＯＤ490nmの少なくとも３倍を与える抗体の最高希釈率によって表される。
【００６２】
標識３Ｃ10と抗ＣＤ14ｍＡｂの１パネル間の競合試験によって、抗体28Ｃ５および10Ａ１（IgＡｍＭａｂ）のみが塗布マイクロタイタープレート上でｓＣＤ14について３Ｃ10と競合することができることが明らかになった（図12）。さらに競合検定を実施し、18Ｅ12は28Ｃ５、３Ｃ10、または26Ｆ３と競合しないことが確認された。
【００６３】
表１は28Ｃ５、23Ｇ４および18Ｅ12間での同様の競合検定の結果を示す。ＥＬＩＳＡ検定において、固相上にビオチン標識抗ＣＤ14ｍＡｂ（Ａ，Ｃ）とともにこれらの抗体を塗布した。
【００６４】
【表１】
【００６５】
これらの抗ＣＤ14ｍＡｂの、ＬＰＳ／ＬＢＰのｓＣＤ14への結合をブロックする能力は、同様の形式のＥＬＩＳＡを使用して評価した。
【００６６】
ｍＡｂを、ＬＰＳ／ＬＢＰのｓＣＤ14への結合を阻害する能力に関して評価したところ、28Ｃ５が最も効果的であった（図13）。図13は、各種抗ＣＤ14モノクローナル抗体４μg/ml存在下で、固相上に固定化された可溶性ＣＤ14へのＬＰＢ／ビオチニル化ＬＰＳ複合体の結合強度を表す。抗ＣＤ14ｍＡｂ28Ｃ５および３Ｃ10はこの結合作用をブロックする。抗ＣＤ14ｍＡｂは、ＯＤ値の減少で示されるように、このブロッキングにおいてより効果的である。抗ＣＤ14ｍＡｂ18Ｅ12はブロッキング効果を何ら示さない。
【００６７】
ＨＬ-60 細胞中でのＬＰＳ刺激に応答したサイトカインの放出をブロックする能力に関する抗ＣＤ14の評価では、28Ｃ５がＴＮＦ−αの発現をブロックすることが示された (図14) 。ＬＰＳの添加前に全血にex vivo で28Ｃ５、23Ｇ４および18Ｅ12を添加した場合にも、サイトカイン放出の阻害が観察された。驚くべきことに、18Ｅ12は、ＣＤ14へのＬＰＳ／ＬＢＰの結合をブロックしないことがすでに証明されたにもかかわらず、サイトカインの放出を阻害した（図13および27）。ヒヒ全血中におけるＬＰＳ誘導ＴＮＦに対する23Ｇ４、28Ｃ５および18Ｅ12の影響も、ex vivoで試験した。図28の結果は、ＬＰＳ誘導ヒヒ血中でのＴＮＦ分泌の阻害について、23Ｇ４が最も影響力があることを示している。これらの結果は、18Ｅ12が、ＬＰＳ／ＬＢＰ結合を妨げないが、細胞のＬＰＳ刺激に関与するシグナル作用には重要なＣＤ14上の領域に対して特異的であったことを示す。
【００６８】
28Ｃ５および23Ｇ４はＣＤ14へのＬＰＳ：ＬＢＰの結合のブロッキングについては共通の特異性を示すが、ヒヒＣＤ14の認識については共通ではなく（23Ｇ４のみがヒヒを認識する）、28Ｃ５はＬＰＳに応答したヒヒ全血からのＴＮＦαの放出をブロックすることができない（図27）。
【００６９】
抗ＣＤ14ｍＡｂの28Ｃ５、18Ｅ12および23Ｇ４のｓＣＤ14へのＬＰＳ／ＬＢＰ結合をブロックする能力を、表１について述べたのと同様の形式のＥＬＩＳＡを使用して同様に評価した。結果は、やはりｓＣＤ14結合について23Ｇ４と28Ｃ５が競合することを示す（表１参照）。
【００７０】
Ｃ．サイトカイン放出の活性化
ＨＬ-60 細胞（American Type Culture Collectionより入手、ATCC No.CCL-240 ）を濃度1.5×105cells／mlでプレートに塗布した。この細胞を10％ウシ血清、10-7M DHvD3（Biomol Research Laboratories）および50μM インドメタシン（Calbiochem）を含有するＲＰＭＩ1640中で３〜４日間単球系列に誘導した。これらの分化した細胞を10％ヒトＡＢ型血清(Irvine Scientific)存在または不在の50μMインドメタシン含有増殖培地１ml当たり１×106細胞数で再懸濁させ、その後平底クラスター皿に入れた。各種濃度のＬＰＳ（E.coli血清型 01217:B8;Sigma ）を添加し、37℃で４〜５時間インキュベートすることによって、細胞を活性化した。培養皿中の細胞を低速遠心分離（170×g、室温で10分間）によってペレット化し、可溶性サイトカイン値のＥＬＩＳＡ（ヒトＴＮＦα検出用ＥＬＩＳＡキット；Genzyme ）のために増殖培地を除去した。
【００７１】
Ｄ．細胞ＣＤ14へのＬＰＳ結合の抗ＣＤ14モノクローナル抗体による阻害
細胞ＣＤ14とＬＰＳ間の相互作用のメカニズムを特性づけるため、Lee et al.,J.Exp.Med.,175:1697-1705,1992 に記載された、安定的にトランスフェクトされたヒトＣＤ14発現ベクターを含有する70Ｚ/3細胞を調製して、70Ｚ/3-hＣＤ14細胞を形成させた。細胞表面ＣＤ14を発現する安定的にトランスフェクトされた細胞は、前記したＦＩＴＣ複合抗ヒトＣＤ14ＭａｂＭＹ４で染色した細胞上のＦＡＣＳ分析を使用して確認した。ＣＤ14からの膜アンカーが除去され、崩壊促進因子（ＤＡＦ）からの膜アンカーに替わった、70Ｚ/3-hＣＤ14ＤＡＦと称するもの、ヒト組織因子からの膜アンカーに替わった、70Ｚ/3-hＣＤ14ＴＦと称するもの、およびマウスクラス分子、Ｈ２Ｋ2からの膜アンカーに替わった、70Ｚ/3-hＣＤ14ＣＩと称する、ＣＤ14融合タンパク質を発現する別のトランスフェクトされた細胞系をも調製した。
【００７２】
細胞ＣＤ14へのＬＰＳの直接結合についてＦＩＴＣ標識ＬＰＳ（ＦＩＴＣ−ＬＰＳ）を使用して特性決定した。Ｍａｂ10μg／mlを有するかまたは有しない10％ＦＣＳを含有し、37℃で30分前培養した培地に、70Ｚ/3−ＣＤ14細胞を懸濁させた。その後、ＦＩＴＣ−Ｒｅ595-ＬＰＳを１ng／mlとなるように添加し、37℃で15分保持した。その後すぐに等容量の氷冷ＲＰＭＩ1640培地を添加し、混合液をＦＡＣＳ分析まで４℃に保持した。細胞結合蛍光を上記のLee らによる記載にしたがって測定し、トランスフェクトされていない70Ｚ/3細胞を使用して測定した蛍光を差し引くことによって、測定蛍光を補正した。
【００７３】
図15に棒グラフを示すが、この結果は、細胞表面ＣＤ14タンパク質（wtまたは融合タンパク質）を含有するすべてのトランスフェクトされた細胞タイプに関し、抗ＣＤ14モノクローナル抗体ＭａｂＭＹ４（斜線）はＬＰＳの細胞への結合をブロックするが、Ｍａｂ18Ｅ12（白ぬき）はＬＰＳの細胞への結合をブロックしなかったことを示している。Ｍａｂ18Ｅ12存在下でのＦＩＴＣ−ＬＰＳ結合は抗体を使用しないで得られた結果（黒色）と同程度だった。ＭａｂＭＹ４はＣＤ14と免疫反応することが知られている抗体であるが、ここに示されたでデータによって、ＬＰＳのＣＤ14への結合を阻害し、またＬＰＳ依存性のＣＤ14が媒介する細胞の活性化を阻害することが示される。各種トランスフェクトされた細胞系において、ＦＩＴＣ−ＬＰＳ結合の程度の差異はＣＤ14発現の程度の差異を反映する。ｈＣＤ14トランスフェクト細胞は１細胞当たり約10,000のレセプターを含むが、ｈＣＤ14ＤＡＦトランスフェクト細胞は１細胞当たり約50,000のレセプターを含み、ｈＣＤ14ＴＦおよびｈＣＤ14ＣＩトランスフェクト細胞はそれぞれ１細胞当たり約15,000〜20,000のレセプターを含むと概算される。結果は３回の独立した測定の平均＋／−標準偏差として表示している。
【００７４】
Ｅ．抗ＣＤ14モノクローナル抗体を使用した、細胞のＬＰＳ依存性、ＣＤ14媒介活性化の阻害
細胞のＬＰＳによるＣＤ14媒介活性化を阻害する能力に関し、抗ＣＤ14モノクローナル抗体を特性決定した。このため、ＣＤ14トランスフェクト細胞システムを発生させ、ＬＰＳ誘導活性化に応答性があることを証明した。実施例３に記載するように、前記した数種の膜結合形態のＣＤ14を含有する数種のトランスフェクト70Ｚ/3細胞系を調製した。
【００７５】
このトランスフェクト細胞を上記 Leeらによって記載されているようにして培養し、10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；56℃で30分熱不活性化）および図16に”＋”によって示す抗体（ＭＹ４または18Ｅ12）10μg／mlを含有するＲＰＭＩ1640培地中に懸濁し、37℃で30分保持した。その後、図16に”＋”によって示すように、100μM タキソール（taxol ）またはＬＰＳ（1 ng/ml Ｒｅ595 ＬＰＳ）を添加し、37℃で15分保持した。その後、細胞を回収し、Molitor et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:10028-10032(1990)に記載されているように、ＮＦ-κＢの活性化を測定するため、核抽出物を調製した。ＮＦ-κＢの存在を検出するため、４％未変性ポリアクリルアミドゲル上でのゲル遅延検定において、二本鎖形態のＰ32標識ＮＦ-κＢ特異的オリゴヌクレオチド（5'-CAGAGGGGACTTTCCGAGA-3' ）を使用した。
【００７６】
試験の結果を図16に示すが、これによると、ＬＰＳもタキソールもＮＦ-κＢ活性化を誘導することが示される。予測されたように、ＬＰＳはＣＤ14を含まない対照トランスフェクト細胞（70Ｚ/3−ＲＳＶ）において最低のＮＦ-κＢ活性化を誘導し、ＣＤ14を発現する細胞において顕著な活性化を誘導した。このことは、ＬＰＳ誘導ＮＦ-κＢ活性化が細胞表面でＣＤ14によって媒介され、そしてＣＤ14を必要とすることを示している。さらに、これらの結果は、ＭＹ４も18Ｅ12もＬＰＳ誘導ＮＦ-κＢ発現を阻害するが、タキソール誘導ＮＦ-κＢ発現は阻害せず、これらの抗体の阻害効果がＣＤ14に特異的で依存性であることを示している。
【００７７】
ＭａｂＭＹ４および18Ｅ12でのこれらの結果は、細胞の活性化を誘導するためにはＬＰＳのＣＤ14への結合だけでは不十分で、ＬＰＳ−ＣＤ14結合に付随する相互作用が細胞の活性化のために重要であることを示している。この結果はまた、細胞のＣＤ14媒介活性化の阻害は、異なる程度で、まず誘導物質（ＬＰＳ）がＣＤ14に結合するのをブロックし、２番目に誘導物質がＣＤ14に結合した後のステップをブロックすることによって生起するらしいことを示している。またこのデータは、誘導物質がＬＰＳ以外の分子である場合に、第二段階での阻害剤の使用が、ＣＤ14媒介細胞活性化をブロックすることの確証でもある。
【００７８】
Ｆ．ＬＰＳのＣＤ14+細胞による捕捉の阻害
敗血症の進行中、ＬＰＳは細胞表面のＣＤ14に結合し、これらのＣＤ14+細胞によって捕捉されることが知られている（Kitchens,et al.,J.Exp.Med., 176:485-494,1992 ; Pugin et al.,PNAS, 90:2744-2748,1993）。Ｍａｂ28Ｃ５などの、ＬＰＳのＣＤ14への結合をブロックする抗体と、Ｍａｂ18Ｅ12などの、ＣＤ14への結合をブロックしない抗体との間の差異は、ＣＤ14+細胞によるＬＰＳ捕捉の観点によるものである。このため、抗ＣＤ14抗体のＬＰＳ捕捉を阻害する能力の特性決定をした。
【００７９】
この目的のため、各種抗ＣＤ14抗体の存在下におけるトランスフェクト70Ｚ/3-hＣＤ14細胞上へのＦＩＴＣ−ＬＰＳの捕捉を測定した。ＣＤ14+トランスフェクト細胞を37℃に保持した後、抗体を使用しないでＦＩＴＣ−ＬＰＳにさらし、細胞内部のＦＩＴＣ−ＬＰＳから発生する蛍光を検出して、通常条件下ではＬＰＳが細胞に捕捉されることを確認した。Ｍａｂ28Ｃ５の存在下では、ＬＰＳの捕捉は完全に阻害されたが、Ｍａｂ18Ｅ12の存在下では、捕捉は通常条件下で観察された量の約65％に減少しただけであった。これらの結果は、Ｍａｂ18Ｅ12はＬＰＳの捕捉を実質的に妨げないので、ＬＰＳを細胞に入り込ませることが必要な状態でのＣＤ14+細胞の活性化の阻害のために、このＭａｂ18Ｅ12が特に有用であることを示している。続く試験において、Ｍａｂ23Ｇ４の存在下では、Ｍａｂ28Ｃ５で見られたのと同様に、ＬＰＳの捕捉が阻害されることが示された。
【００８０】
ＣＤ14抗原検定（ＥＬＩＳＡ）
塗布：炭酸水素塩緩衝液中１μg/mlに希釈した抗ＣＤ14ｍＡｂ28Ｃ５ 150μl/well。４℃で一晩インキュベートした。
ブロッキング：プレートを４回洗浄した後、ブロッキング緩衝液150μl/wellを添加した。37℃で１時間インキュベートした。
【００８１】
試料：プレートを１回洗浄した後、希釈用緩衝液に希釈した試料125μl/wellを添加した。37℃で１時間インキュベートした。
【００８２】
複合体：プレートを５回洗浄した後、希釈用緩衝液中１μg/mlに希釈したビオチニル化抗ＣＤ14ｍＡｂ18Ｅ12 0.100ml/well を添加した。37℃で１時間インキュベートした。
【００８３】
Ａv-ＨＲＰＯ：プレートを５回洗浄した後、あらかじめ形成させたストレプトアビジン／ビオチン／ペルオキシダーゼ複合体 0.100 ml/wellを添加した。（ストレプトアビジン／ビオチニル化／ＨＲＰＯ調製物（Zymed SABC kit）：洗浄用緩衝液中にストレプトアビジン 2μl/mlとビオチニル化ＨＲＰＯ2μl/mlを混合し、37℃で30分インキュベートした。ウェルに添加する前に希釈用緩衝液で１：２に希釈した。）37℃で30分インキュベートした。
【００８４】
基質：プレートを５回洗浄した後、Sigma ＯＰＤ 0.100ml/well を添加し、プレートを暗所に30分放置し、4N H2SO4 0.050 mlで発色を停止させた。490 nmにおいてプレートを測定した。
【００８５】
ＣＤ14標準：100 ng/ml のクローン523 の２倍連続希釈物
血清の希釈：開始希釈率 １：25−１：50
【００８６】
各種ＥＬＩＳＡ試薬
ブロッキング用緩衝液：ＰＢＳ＋10％w/v 脱脂乾燥乳(Carnation)。
洗浄用緩衝液：ＰＢＳ＋0.05％v/v Tween 20。
希釈用緩衝液：ブロッキング用緩衝液と洗浄用緩衝液をvol/vol 混合し、試料、標識抗体および前形成複合体の希釈に使用した。
【００８７】
実施例３
モノクローナル抗体のクローニング
ここに参考として引用する、Chomczynkski and Sacchi,Anal.Bio., 162:156-159(1987)の方法を使用して、モノクローナル抗体産生細胞系から、メッセンジャーＲＮＡを抽出した。マウス特異的３" 抗体プライマー（ＩgＧ1またはｋ）を使用して逆転写を行い、その結果生成したｃＤＮＡを、ここに参考として引用する、Huse,et al.,Science,246:1274-1281(1989)に記載されたマウス特異的５’抗体プライマーの１パネルを使用して、製造者の指示にしたがって、ＰＣＲ（Supplier）に供した。重鎖および軽鎖ＤＮＡフラグメントをゲル精製し、適当な酵素で消化した。672塩基対の重鎖フラグメントをpBluescript II KS+のSpe1/Xho1 部位にクローン化し、自動 ABI Model 373A DNA シークエンサーを使用し、製造者の指示にしたがって、配列決定した。642 塩基対の軽鎖フラグメントをpBluescript II KS+のSst1/Xba 部位にクローン化し、同様の方法で配列決定した。
【００８８】
配列番号１および２は、28Ｃ５重鎖のヌクレオチドおよびこれから推定されるアミノ酸配列であり、配列番号３および４は、28Ｃ５軽鎖のヌクレオチドおよびこれから推定されるアミノ酸配列である。配列番号５および６は、18Ｅ12重鎖のヌクレオチドおよびこれから推定されるアミノ酸配列であり、配列番号７および８は、18Ｅ12軽鎖のヌクレオチドおよびこれから推定されるアミノ酸配列である（図２〜５）。図30は３Ｃ10、28Ｃ５および18Ｅ12の重鎖の比較を示すものである。配列番号25および26は、23Ｇ４軽鎖のヌクレオチドおよびこれから推定されるアミノ酸配列である（図29参照）。図29はモノクローナル抗体３Ｃ10、28Ｃ５、23Ｇ４および18Ｅ12の軽鎖のアミノ酸配列を示すものである。図30はモノクローナル抗体３Ｃ10、28Ｃ５および18Ｅ12の重鎖のアミノ酸配列を示すものである。
【００８９】
28Ｃ５および23Ｇ４は両者ともにＣＤ14へのＬＰＳ：ＬＢＰ結合をブロックし、ｓＣＤ14結合に関して互いに競合し、そして同濃度でヒト全血中のＴＮＦαの放出を妨害する（図27参照）という、共通の特異性を有するにもかかわらず、その軽鎖は共通するヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有してはいない（表２参照）ことに注目すべきである。
【００９０】
核酸の組換え発現
本発明の核酸の組換え発現を以下の一般的戦略にしたがって実施する。抗体発現ハイブリドーマ細胞からPolyＡ+ ｍＲＮＡを単離する。ｃＤＮＡ合成およびｍＲＮＡのＰＣＲ増幅を、上記の方法によって実施する。得られたｃＤＮＡ配列のデータから、例えば DNAStar（Madison,Wisconsin）から市販されているMAPSEQなどのコンピュータソフトウェアプログラムによって、このＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を推定する。
【００９１】
抗体フラグメントとして構築された発現生成物を、ハプテンもしくは抗原を利用するＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定）、またはアフィニティーカラムなどの当業界で知られた方法によって、結合親和性についてスクリーニングする（例えば、参考としてここに引用する、Skerra and Pluckthun,Science,240:1038-1041,1988,に記載）。
【００９２】
本発明を実施するのに、例えばプラスミド、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスベクター、バキュロウイルスベクターおよび酵母中で使用するベクターなどの数タイプのベクターが入手でき、使用することができる。ベクターがプラスミドの場合は、一般にプロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製起点を含む種々の成分、および当業者に知られた他の必要成分を含む。
【００９３】
原核生物ベクターにおいて最も一般的に使用されるプロモーターは、Lac Ｚプロモーター系、アルカリホスファターゼ phoＡプロモーター、バクテリオファージλＰＬプロモーター（熱感受性プロモーター）、tac プロモーター（lacリプレッサーによって調節された、ハイブリッドtrp-lac プロモーター）、トリプトファンプロモーターおよびバクテリオファージT7プロモーターを含む。
【００９４】
本発明を実施する際に使用したプロモーターは lacＺプロモーターおよび phoＡプロモーターである。 lacＺプロモーターはlac リプレッサータンパク質 lac iで調節し、この lacリプレッサータンパク質レベルを操作することによって、ポリペプチドの転写を調節できるようにする。実例をあげると、 lacＺプロモーターを含有するファージミド（phagemid）を、 lacＺプロモーターのリプレッサーである lac iリプレッサー遺伝子の１コピーを含有する細胞種中で増殖させる。lac i 遺伝子を含有する細胞系の好例として、ＪＭ 101およびＸＬ1-blueが含まれる。変法として、宿主細胞を、リプレッサーlac i と lacＺプロモーターの両方を含有するプラスミドで同時トランスフェクトすることができる。場合によっては、上記の手法の両方を同時に使用し、すなわち、 lacＺプロモーターを含有するファージミド粒子を lac i遺伝子を含有する細胞系中で増殖させ、この細胞系を lacＺおよび lac i遺伝子の両方を含有するプラスミドで同時トランスフェクトする。普通、上記のようなトランスフェクトする宿主にある遺伝子を発現させようとするとき、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）のような誘発物質を添加するが、このステップは省略してもよい。
【００９５】
本発明を実施するのに使用するベクターのもう１つの有用な成分はシグナル配列である。この配列はポリペプチドをコードする遺伝子の５’の直近に典型的に局在し、融合タンパク質のアミノ末端に転写される。しかし、ある場合には、シグナル配列が分泌されるタンパク質をコードする遺伝子の５’以外の位置に局在することが証明されている。この配列はバクテリア細胞の内膜を通って付着するタンパク質を標的とする。シグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列を有するタンパク質をコードするいずれかの遺伝子からの制限エンドヌクレアーゼフラグメントとして得ることができる。好適な原核細胞シグナル配列は、例えばＬａｍＢまたはＯｍｐＦ（ここに参考として引用する、Wong,et al.,Gene,68:193,1983）、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡをコードする遺伝子および他の遺伝子から得ることができる。本発明を実施するのに好ましい原核細胞シグナルは、ここに参考として引用する、Chang,et al.,Gene,55:189,1987 に記載されている、E.coli熱安定性エンテロトキシン II(ＳＴII）シグナル配列である。
【００９６】
本発明を実施するのに使用するベクターの、また別の有用な成分は、表現型選択遺伝子である。典型的な表現型選択遺伝子は宿主細胞に抗生物質耐性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子である。実例をあげると、アンピシリン耐性遺伝子（amp)、およびテトラサイクリン耐性遺伝子（tet）はこの目的のために容易に使用される。
【００９７】
前記の成分および必要なポリペプチドをコードする遺伝子を含む好適なベクターの構築は、標準的な組換えＤＮＡ操作を使用して調製される。組換え方法論に関する参考文献を下に示した。ベクターを形成するために組み合わせられる単離ＤＮＡフラグメントは、切断され、組合せられ、目的とするベクターを産生するように、特定の順番と方向性で連結される。
【００９８】
ＤＮＡは好適な緩衝液中で、適当な制限酵素または酵素群を使用して切断される。一般に、緩衝液約20μl中、プラスミドまたはＤＮＡフラグメント約0.2〜1μgが適当な制限酵素約１〜２単位とともに使用される。好適な緩衝液、ＤＮＡ濃度、ならびにインキュベート時間および温度は、制限酵素の製造業者によって特定されている。一般に、37℃で１または２時間のインキュベート時間で十分であるが、いくつかの酵素はもっと高温を必要とする。インキュベート後、フェノールとクロロホルムの混合物を使用した消化溶液の抽出によって、酵素および他の混入物を除去し、水性画分からエタノールでの沈殿によってＤＮＡを回収する。
【００９９】
ＤＮＡフラグメント同士を連結してある機能を有するベクターを形成させるためには、ＤＮＡフラグメントの末端が互いに適合性でなければならない。場合によっては、この末端がエンドヌクレアーゼ消化後そのまま適合し得ることもあろう。しかし、連結に適合する末端を作るためには、エンドヌクレアーゼ消化によって普通生成する付着末端をまず平滑末端に変換する必要がある。末端を平滑末端にするため、ＤＮＡを好適な緩衝液中で、４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェートの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenowフラグメント（Klenow）10単位で、15℃において少なくとも15分処理する。その後、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって、ＤＮＡを精製する。
【０１００】
ＤＮＡゲル電気泳動を使用して、切断されたＤＮＡフラグメントをサイズ別に分離し、選択する。ＤＮＡはアガロースまたはポリアクリルアミドマトリックス上で電気泳動を行なう。マトリックスの選択は分離すべきＤＮＡフラグメントのサイズによって行なわれるべきものである。電気泳動後、マトリックスから電気溶出によって、あるいは、マトリックスとして低溶融性のアガロースを使用した場合は、アガロースを溶融させ、ＤＮＡを抽出することによって、ＤＮＡを取り出す。
【０１０１】
互いに連結しようとするＤＮＡフラグメント（連結するフラグメントのそれぞれの末端が適合性となるように、あらかじめ適当な制限酵素で消化する）をおよそ同モル量づつ溶液に入れる。この溶液は他にＡＴＰ、リガーゼ緩衝液およびＤＮＡ 0.5μg当たり約10単位のＴ４ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを含む。ＤＮＡフラグメントをベクター中に連結する場合は、まずベクターを適当な制限エンドヌクレアーゼ（群）で切断することによって、線状化する。この線状化ベクターをその後アルカリホスファターゼまたはコウシ腸ホスファターゼで処理してもよい。このホスファターゼ処理によって、連結段階中のベクターの自己連結が阻止される。
【０１０２】
連結後、外来遺伝子を挿入し終えたベクターを好適なホスト細胞中に形質転換する。好適な原核宿主細胞は E.coli菌株 JM101、E.coli K12菌株 294（ATCC番号 31,446）、E.coli菌株 W3110（ATCC番号 27,325）、E.coli X1776（ATCC番号 31,537）、E.coli XL-1Blue (Stratagene)、およびE.coli Bである；しかし、HB 101、NM 522、NM 538、NM 539などのE.coliおよび原核生物の他の多くの種および属の他の多くの菌株も同様に使用することができる。上記のE.coli株に加えて、Bacillus subtilis などのバチルス、Salmonella typhimuniumまたは Serratia marcesans などの他の腸内細菌および各種Pseudomonas 種のすべてが宿主として使用し得る。
【０１０３】
原核細胞の形質転換は塩化カルシウムまたは当業者によく知られた他の方法を使用して、容易に実施される。これらの細胞を形質転換するために、エレクトロポレーション（ここで参考として引用する、Neumann,et al.,EMBO J.,1:841 1982）もまた使用することができる。形質転換された細胞は抗生物質、普通テトラサイクリン（tet）またはアンピシリン（amp）上で増殖させ、ベクター上に存在するtet および／またはamp耐性遺伝子に起因して、これらへの耐性が与えられたかどうかによって、選択される。
【０１０４】
形質転換された細胞の選択後、これらの細胞を培地中で増殖させ、その後プラスミドＤＮＡ（または外来遺伝子が挿入された他のベクター）を単離する。プラスミドＤＮＡは当業界で知られた方法を使用して単離することができる。この精製プラスミドをその後、制限地図および／またはＤＮＡ配列決定によって分析する。
【０１０５】
上に概説した操作をするため、骨髄腫（P3-653）、ハイブリドーマ（SP2/0）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、ミドリザル腎臓（COS1）およびマウス繊維芽細胞（L492）などの哺乳類細胞系がポリペプチドの発現用の好適な宿主細胞である。これらの”哺乳類”ベクターは１つのプロモーター、１つのエンハンサー、１つのポリアデニル化シグナル、シグナル配列およびジェネティシン（geneticin）（ネオマイシン耐性）、ミコフェノール酸（キサンチングアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ）またはヒスチジノール（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）などの選択性マーカーをコードする遺伝子を含んでもよい。
【０１０６】
哺乳類宿主細胞において使用する好適なプロモーターとして、Ig Kappa、Ig Gamma、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス40（ＳＶ40）初期型、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）およびメタロチオネインが含まれるが、これらに限定されるものではない。好適なエンハンサーとして、Ig Kappa、Ig Heavy、ＣＭＶ初期型およびＳＶ40が含まれるが、これに限定されるものではない。ポリアデニル化用配列には、Ig Kappa、Ig GammaまたはＳＶ40大型Ｔ抗原が含まれる。好適なシグナル配列には、Ig Kappa、Ig Heavyおよびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）が含まれる。
【０１０７】
ベクターがバキュロウイルスの場合は、好適なプロモーターおよびエンハンサーとして、AcＭＮＰＶポリヘドリン、AcＭＮＰＶＥＴＬおよびAcＭＮＰＶ p10配列が含まれるが、これに限定されるわけではない。１つの特に好適なポリアデニル化シグナルはポリヘドリンAcＭＮＰＶである。Ig Kappa、Ig HeavyおよびAcＭＮＰＶは好適なシグナル配列の例である。これらのベクター類は以下の昆虫細胞系、中でもＳＦ９、ＳＦ21およびHigh５において有用である。
【０１０８】
変法として、ポリペプチドを、ＰＳ23-6Ａ、Ｗ301-18Ａ、ＬＬ20、Ｄ234-3 、ＩＮＶＳＣ１、ＩＮＶＳＣ２、ＹＪＪ337 などの酵母菌株内で発現させることができる。gal １およびｐＥＦＴ-1などのプロモーターおよびエンハンサー配列が有用である。Vra-4 もまた好適なエンハンサー配列を提供する。機能的な”複製起点”として有用な配列にはars1および2μ環状プラスミドが含まれる。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
実施例４
in vivo でのＣＤ14抗体処置
ウサギを３日間ＩＦＮ-γ前処置した後ＬＰＳ注射すると、ウサギに敗血症状態が発症する（G.J.Jurkovich,et al.,J.Surg.Res.,51:197-203,1991）。ここに記載されたin vivo 実験と同様の処方にしたがった。ＩＦＮ-γ 5μg／kg（比活性：2.5×108unit／mg；5 μg＝1.25×106unit／mg）を３日間連続して毎日注射し、その後、基準の心臓拍出および全身血圧を確定し、ＬＰＳの８時間の注入（総用量３mg／kgまたは 375μg/kg/時間×８時間）を開始した。３日間ＩＮＦ-γの皮下注射をし、３日目に、ＬＰＳ注入開始の少なくとも１時間前に基準のデータを採った。これらの動物は実験の期間中ケタミン麻酔を続けた。ウサギの実験によると、これらの動物はＬＰＳの注入にともなって眠くなることが示唆された。同じ確定処方をサルの２つのグループにも使用した。動物に、イソタイプが一致する対照モノクローナル抗体（ＭＡｂ）またはＣＤ14ブロッキングＭＡｂのどちらかを、世話をする責任者には処置処方を報せないで、ランダムに割り当てた。ＬＰＳ注入の開始30分前に、5mg/kg/mAbの投与（イソタイプまたはＣＤ14特異性）をボーラス注射によって行なった。
【０１１１】
動物をケタミンで麻酔した後、大腿部動脈および静脈のそれぞれに、動脈および静脈カテーテルを入れた。動脈カテーテルは、心臓拍出の熱による希薄を測定するため、先端部にサーミスターを備えている。このカテーテル上の２番目の管腔部は動脈圧の測定に使用した。静脈カテーテルは、薬品および維持液の注入ならびに心臓拍出の測定の際の冷却注入のために使用した。各心臓拍出測定において、乳酸加リンゲル（3 ml）を使用した。
【０１１２】
血圧および心臓拍出を、基準期間には15分毎、その後の実験中は30分毎記録した。動脈ＰＯ2／ＰＣＯ2、pll およびタンパク質を測定するために、１時間毎に血液（3 ml）を取り出した。この同じ血液試料を全身の白血球細胞数と部分的な数の測定に使用した。ＬＰＳの注入後、これらの動物に乳酸加リンゲル液を補給した。すべての動物に補液として4 ml／kg注入し、心臓拍出を基準値の10％以内に維持するため、必要に応じて注入を増加させた。
【０１１３】
総数６匹の動物のそれぞれをIgＧ１イソタイプ対照または28Ｃ５のいずれかで前処置し、５匹の動物を18Ｅ12で前処置した。抗体の注入30分後、すべての試験動物にＬＰＳを抗原投与した。ＬＰＳ注入の72時間前から、サルにヒト組換えインターフェロンガンマ（125,000 U/kg）を、24時間間隔で３回皮下注射した。麻酔動物中のＭＡＰ値を測定するため、上記のように、大腿部動脈および静脈中に動脈および静脈カテーテルをそれぞれ入れた。
【０１１４】
ＬＰＳを抗原投与したサルの平均動脈圧（ＭＡＰ）
平均動脈圧（ＭＡＰ）の試験結果によると、28Ｃ５で前処置したものは、対照グループに共通する、特に２時間後における血圧の有意な低下が回避されたことがわかる（図17）。しかし、18Ｅ12で前処置した動物は２時間目の血圧の低下を示すが、28Ｃ５前処置動物で測定されたパーセンテージまで回復することができた。18Ｅ12の機能は、シグナル効果だけが妨害され、28Ｃ５および23Ｇ４の重要な特徴である、ＬＰＳの結合の阻害は妨害しない点で、28Ｃ５とは異なっている。機能におけるこの差異はＭＡＰ応答において見られた差異を反映すると考えられる。18Ｅ12による保護は、後のＬＰＳ誘導効果にも及ぶと考えられる。この18Ｅ12によるプロフィールは、ＬＰＳに対する生理学的応答現象（低血圧化）においても、この抗ＣＤ14ｍＡｂがイソタイプ対照処置動物において見られた有害な影響を防止することができることを示している。
【０１１５】
ＣＤ14濃度に対するＩＦＮの影響
動物に対する24時間間隔で３日間のインターフェロン−ガンマによる前処置は、ＣＤ14の濃度に対し、比較的小さい影響しか与えなかった（図18）。しかし、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）の循環量が、グラム陰性敗血症において見られる値まで有意に増加した（ＬＢＰは２つの非競合モノクローナル抗体を試料を捕捉し、プローブするのに使用したＥＬＩＳＡによって測定した）。インターフェロン−ガンマは、これらの動物において生理学的および／または生化学的変化を何らもたらさないはずのＬＰＳの投与量に対し、その動物に鋭敏な応答性を誘導し、感受性にするものと推測される。
【０１１６】
ＢＳＡの洗浄液／血漿比
ＢＳＡの洗浄液／血漿比は肺損傷の１指標であり、肺組織を透過したＢＳＡ（実験の終了時の１時間前に注射）量の目安でもある。肺は内毒素血症に影響を受ける主要な器官の１つである。ＢＳＡ値はＢＳＡ特異性モノクローナル抗体を使用したイムノアッセイによって測定した。ＢＳＡモノクローナル抗体は容易に入手できる。この場合は、28Ｃ５で前処置した動物は、対照処置動物において明らかだった肺損傷から有意に保護された（図19）。18Ｅ12処置動物はＬＰＳの影響から完全には保護されなかったが、グループとしては、対照動物よりはよかった。
【０１１７】
抗体半減期
抗体の半減期、すなわち、抗体の可溶性の循環型ＣＤ14ならびに単球および好中球上の膜結合ＣＤ14への結合による消失についての疑問が生じる。ヒト抗原を認識しないイソタイプ対照抗体と比較したところ、３つのグループすべてについて、消失速度論は等しかった（図20）。
【０１１８】
抗体処置したサルのＣＤ14値
２つの非競合モノクローナル抗体を試料の捕捉し、プローブするのに使用するＥＬＩＳＡによって、ＣＤ14を測定した。抗体のみで処置（ＬＰＳ処理はしない）したサルのＣＤ14値は、対照処置動物に比較して、28Ｃ５において有意に高かった（図21）。in vitroでの研究において、ＣＤ14産生細胞を抗ＣＤ14ｍＡｂ28Ｃ５にさらすと、ｓＣＤ14値が高くなることが明らかになってはいるが、上記の上昇の理由はわからない；多分、抗体がＧＰＩ連結タンパク質の脱離機構を強化するのであろう。18Ｅ12処置動物では36時間後に増加し、60時間目から減少し始めることが示された。抗体処置動物にＬＰＳを抗原投与したとき、28Ｃ５グループにおいて、抗体のみの動物での値以上にＣＤ14値がさらに上昇はしないので、これは明らかに抗体誘導効果であることを示めしている。
【０１１９】
ＬＢＰ値
上記のように、インターフェロン−ガンマ処置後、ＬＢＰ値が上昇する。抗ＣＤ14処置、ＬＰＳ処置動物において、対照に比較して検出ＬＢＰ値がわずかに低下する（図22）。これはＬＰＳの結合または転移のための標的が得られない場合に複合体が消失することを示すものと考えられるが、理由はわからない。
【０１２０】
ＡＬＴ／ＧＰＴ値
酵素トランスアミナーゼ、ＡＬＴ／ＧＰＴ（同種の酵素と考えられるもの）は肝機能の指標であるので、これを測定して壊死の形跡を調べた。敗血症ショックの患者においては、肝不全の開始はＭＳＯＦシンドロームの中の初期症状である。損傷の程度に応じ、ヒトにおける最大値は4000Ｕ／mlにまで達し得る。Sigma Diagnostics の試験キットの製造業者の指示にしたがって、ＡＬＴ／ＧＰＴ値を測定した。
【０１２１】
ここで記録された値はどれもヒトの極限状態で得られる範囲にはないが、実験中24時間にわたって、対照グループにおいて酵素値の上昇傾向がある。抗体のみで処置したサルにおけるＡＬＴ／ＧＰＴの正常値は平均で18Ｕ／ml（Ｔ＝０）〜52.2Ｕ／ml（Ｔ＝24）の範囲であり、試験中使用した麻酔（ケタミン）に起因したＴ＝24における上昇があった。２つの抗ＣＤ14処置グループは同様の経過をたどった；平均で16.5Ｕ／ml（Ｔ＝０）〜64.6Ｕ／ml（Ｔ＝24）。対照グループの平均は22.8Ｕ／ml（Ｔ＝０）〜98Ｕ／ml（Ｔ＝24）だった。24時間の経過では、対照グループの動物中での上昇が続くかどうかを決めることができないと思われる（図23）。
【０１２２】
可溶性Ｅセレクチン値
ＣＤ14レセプターのブロッキングが内皮細胞からの可溶性Ｅセレクチンの放出を阻止するかどうかを決定するため、Parameter ＥＬＩＳＡキット（British Biotechnology Products,Ltd. ）によって、可溶性Ｅセレクチン値を測定した。内皮細胞表面でのＥセレクチンの発現はこれらの細胞の活性化の指標であり、ＴＮＦ、ＩＬ-1またはＬＰＳ刺激の結果生じる。可溶性Ｅセレクチン値は、24時間後、すべてのグループにおいて同レベルまで上昇した（図24）。
【０１２３】
ＩＬ-1、ＩＬ-6、ＩＬ-8およびＴＮＦ値
全グループの動物において、QuantikineTMキット(R&DSystems）を使用して製造業者の仕様書にしたがって、ＬＰＳ抗原投与に応答したサイトカインを評価した。検定は固相ＥＬＩＳＡ形式でのイムノアッセイである。ＴＮＦα検定はBiokine （登録商標）酵素イムノアッセイキット（Ｔ細胞診断用）で、製造業者の仕様書にしたがって実施した。ＴＮＦαおよびＩＬ-1βはＬＰＳ刺激の結果として誘導される炎症性応答の重要な媒介体であることが知られている。抗ＣＤ14処置グループにおいては、対照処置グループに対し、ＴＮＦαおよびＩＬ-1β応答が減少し、18Ｅ12がこれらの炎症性サイトカインの発現の最低値を示した。また、抗ＣＤ14グループの両方において、ＴＮＦ応答のピークが１時間遅くなった。この知見の意味は今のところわからない（図25）。
【０１２４】
ヒト敗血症におけるＩＬ-1、ＩＬ-6およびＩＬ-8のピークはＴＮＦより遅れることが知られており、これはＩＬ-1、ＩＬ-6およびＩＬ-8の放出がＴＮＦの産生に大きく依存するという知見に一致する。グラム陰性敗血症と診断されたヒトにおける死亡率に関連するとされてきたサイトカインの１つはＩＬ-6値の上昇である。ＩＬ-6は組織損傷に対する宿主の各種の面での防御を調整する。この場合のモデルにおいては、ＬＰＳへの応答において、28Ｃ５が最低のＩＬ-6値を示した。18Ｅ12で前処置された動物も、対照グループよりも低い値を有していたが、28Ｃ５ほど低くはなかった。ＩＬ-8応答は抗ＣＤ14グループの中ではそれほど低くはなかったが、わずかに低下した（図26）。ヒヒモデルにおけるＩＬ-8値はＴＮＦ値に関連性があることが示された；ＴＮＦが減少した結果、ＩＬ-8が減少した。ＩＬ-8は化学誘引物質および顆粒球活性化作用を有する。抗ＣＤ14処置グループにおいて見られたような、天然のＩＬ-8応答をなるべく保存することが、これらのＬＰＳへの宿主の応答の重要な媒介体を完全なままに保つことになるようである。
【０１２５】
配列の要約
配列番号１：28Ｃ５重鎖の核酸および推定アミノ酸配列
配列番号２：28Ｃ５重鎖の推定アミノ酸配列
配列番号３：28Ｃ５軽鎖の核酸および推定アミノ酸配列
配列番号４：28Ｃ５軽鎖の推定アミノ酸配列
配列番号５：18Ｅ12重鎖の核酸および推定アミノ酸配列
配列番号６：18Ｅ12重鎖の推定アミノ酸配列
配列番号７：18Ｅ12軽鎖の核酸および推定アミノ酸配列
配列番号８：18Ｅ12軽鎖の推定アミノ酸配列
配列番号９：ヒト可溶性ＣＤ14レセプターをコードする核酸配列
配列番号10：３Ｃ10重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号11：３Ｃ10重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号12：３Ｃ10重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号13：28Ｃ５重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号14：28Ｃ５重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号15：28Ｃ５重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号16：３Ｃ10軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号17：３Ｃ10軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号18：３Ｃ10軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号19：28Ｃ５軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号20：28Ｃ５軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号21：28Ｃ５軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号22：23Ｇ４軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号23：23Ｇ４軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号24：23Ｇ４軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号25：23Ｇ４軽鎖のアミノ酸配列
【技術分野】
【０００１】
１．発明の属する技術分野
本発明はＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制するための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明はＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制する部位でＣＤ１４単球抗原に結合する分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の説明
細胞の正しい機能は、環境とコミュニケートする細胞の能力に部分的に依存している。外部刺激は膜受容体としばしば相互作用し、次に膜受容体は最終的に転写因子に影響を及ぼす第２のメッッセンジャーを誘導する。次に、転写因子はある遺伝子の発現を活性化または抑制し、所与の細胞におけるタンパク質の特異的パターンをもたらす。
【０００３】
転写因子ＮＦ-κＢ（核因子-κＢ）はこの因子のＤＮＡ結合モチーフに接触して、免疫受容体、サイトカインおよびウイルスタンパク質をコードする一組の遺伝子を調節する種々の刺激によって誘導される。ＮＦ-κＢを活性化できる種々の因子には、リポ多糖（ＬＰＳ）が含まれる。次に、ＬＰＳは敗血性ショック、全身性炎症応答症候群および多臓器不全を含む敗血症症候群の誘発に密接に関連している。
【０００４】
敗血症は毒素によって誘発される病的状態であり、この誘発または累積は最も一般的には感染または外傷によって引き起こされる。敗血症の初期症状は典型的には、悪寒、大量の発汗、不規則に上下する熱、衰弱、等を含み、これらに続いて持続性熱、低血圧が起こり、ショック、好中球減少症、白血球減少症、汎発性血管内凝固症候群、急性呼吸促進症候群および多臓器不全に至る。
【０００５】
リポ多糖、つまり内毒素は、すべてのグラム陰性細菌〔例えば、大腸菌、肺炎桿菌(Klebsiella pneumonia)、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa)]の外膜に見いだされる毒性成分である。ＬＰＳは免疫細胞にとってin vitroにおいてもin vivo においても、強力で多面発現性(pleiotropic)の刺激物質であることが確認されている(Morrison, D.C. &J.L. Ryan, Annu. Rev. Med., 38:417, 1987; Bone, R.C., Ann. Intern. Med., 115:457, 1991)。グラム陰性敗血症を患うヒトにおいて見られる病態生理学的影響のすべては、精製ＬＰＳによって完全に倍増しうるという点で、反論できない証拠がＬＰＳの毒性的役割を支持する。この毒性成分が応答細胞を活性化する作用機構は複雑で、十分理解されていない。グラム陰性菌感染への宿主応答は、エフェクター細胞によるこれらの細菌および／またはＬＰＳの認識に依存しており、血清タンパク質および細胞膜受容体に密接に関連している。細菌およびＬＰＳの一掃は細網内皮細胞によるエンドサイトーシスおよび食作用によって行なわれるが、ＬＰＳによる宿主免疫応答の付随的活性化は活性化マクロファージによるサイトカインの分泌をもたらし、これがグラム陰性菌感染の間に起こる異常に増大された宿主応答の引き金を引きうる。
【０００６】
Tobiasら(J. Exp. Med., 164:777, 1986)によるＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）〔ＬＰＳへの高親和性結合を示す（Ｋｄ＝１０-9Ｍ-1）〕として同定された血清タンパク質の発見は、in vivo でいったん放出されたＬＰＳの運命を明らかにするのに役立った。肝臓で合成され、分子量が約 60 kDのこの新規タンパク質は、ヒトにおいて200 μg/mlのレベルに達する急性期血清タンパク質であることが示された。高親和性ＬＰＳ／ＬＢＰ複合体の形成に続いて、マクロファージによる認識がなされ、次にＴＮＦ-αおよび他のマクロファージ分泌産物の放出が伴う(Schumann, R.R. ら，Science, 249:1429,1990)。ＬＰＢと結合したＬＰＳの効果に関するさらなる研究は、単球およびマクロファージの表面におけるそれの特異的受容体、すなわちＣＤ１４の発見をもたらした(Wright, S.D.ら，Science, 249:1431, 1990)。ＣＤ１４に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いたさらなる分析により、１個の抗ＣＤ１４ｍＡｂ（３Ｃ１０； VanVoorhis, W.C.ら，J. Exp. Med., 158:126, 1983)が結合したドメインはＣＤ１４上のＬＰＳ／ＬＢＰ結合部位の一部であるか、またはそれに極めて接近していたことが示された。モノクローナル抗体３Ｃ１０は、ＬＰＳ／ＬＢＰのＣＤ１４への結合を妨げる能力の性質により、ＬＰＳで刺激した後のヒト全血アッセイにおいてＴＮＦ-α放出を抑制することができた。この発見によって、たとえヒト全血に含まれる他のすべての細胞、タンパク質および因子の存在下であっても、１個のタンパク質決定基（ＣＤ１４上のリガンド結合部位）をブロックすれば、ＬＰＳに応答するＴＮＦ-α（敗血性ショックの重要な媒介物質であることが公知である）および他のマクロファージ分泌産物の放出を抑制するのに十分であることが示唆されている。
【０００７】
敗血症等のＣＤ１４媒介細胞活性化疾患の性質を理解することにおいて進歩があったにもかかわらず、そのような活性化を抑制し、またこれらの疾患を診断するために使用することができる組成物に対するかなりの必要が残っている。本発明はそのような組成物を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Morrison, D.C. &J.L. Ryan, Annu. Rev. Med., 38:417, 1987; Bone, R.C., Ann. Intern. Med., 115:457, 1991
【非特許文献２】J. Exp. Med., 164:777, 1986
【非特許文献３】Schumann, R.R. ら，Science, 249:1429,1990
【非特許文献４】Wright, S.D.ら，Science, 249:1431, 1990
【非特許文献５】VanVoorhis, W.C.ら，J. Exp. Med., 158:126, 1983
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制することが可能なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。これらの細胞系によって産生されたモノクローナル抗体もまた提供される。これらのモノクローナル抗体は、ＣＤ１４に結合して、もし抑制されなければＮＦ-κＢ活性化を誘導しうるリガンドによるＮＦ-κＢ活性化を抑制するのに広く有用である。上記モノクローナル抗体の生物学的に活性な断片が提供される。これらの抗体および断片は、試料中の細胞表面関連および可溶性ＣＤ１４の存在を検出するのに有用である。上記モノクローナル抗体より作成されるキメラおよびＣＤＲグラフト(grafted)抗体もまた提供される。
【００１０】
上記の生物学的組成物を含有する医薬組成物が提供される。これらは、敗血症等のＬＰＳ関連疾患を治療および予防するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はヒト可溶性ＣＤ１４受容体の核酸配列である（配列番号：９）。
【図２】図２は２８Ｃ５ Ｈ鎖の核酸配列およびアミノ酸配列である（それぞれ配列番号：１および２）。
【図３】図３は２８Ｃ５ Ｌ鎖の核酸配列およびアミノ酸配列である（それぞれ配列番号：３および４）。
【図４】図４は１８Ｅ１２ Ｈ鎖の核酸配列およびアミノ酸配列である（それぞれ配列番号：５および６）。
【図５】図５は１８Ｅ１２ Ｌ鎖の核酸配列およびアミノ酸配列である（それぞれ配列番号：７および８）。
【図６Ａ】図６は対照ＴＨＰ−１細胞単独のＦＡＣＳ分析である。
【図６Ｂ】図６は対照ＴＨＰ−１細胞単独のＦＡＣＳ分析である。
【図６Ｃ】図６は対照ＴＨＰ−１細胞単独のＦＡＣＳ分析である。
【図６Ｄ】図６は対照ＴＨＰ−１細胞単独のＦＡＣＳ分析である。
【図７Ａ】図７は対照ＴＨＰ−１細胞およびＦｉＴＣ結合体単独のＦＡＣＳ分析である。
【図７Ｂ】図７は対照ＴＨＰ−１細胞およびＦｉＴＣ結合体単独のＦＡＣＳ分析である。
【図７Ｃ】図７は対照ＴＨＰ−１細胞およびＦｉＴＣ結合体単独のＦＡＣＳ分析である。
【図７Ｄ】図７は対照ＴＨＰ−１細胞およびＦｉＴＣ結合体単独のＦＡＣＳ分析である。
【図８Ａ】図８は陽性対照ＴＨＰ−１およびＭＹ４抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図８Ｂ】図８は陽性対照ＴＨＰ−１およびＭＹ４抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図８Ｃ】図８は陽性対照ＴＨＰ−１およびＭＹ４抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図８Ｄ】図８は陽性対照ＴＨＰ−１およびＭＹ４抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図９Ａ】図９は２８Ｃ５抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図９Ｂ】図９は２８Ｃ５抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図９Ｃ】図９は２８Ｃ５抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図９Ｄ】図９は２８Ｃ５抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図１０Ａ】図１０は１８Ｅ１２抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図１０Ｂ】図１０は１８Ｅ１２抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図１０Ｃ】図１０は１８Ｅ１２抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図１０Ｄ】図１０は１８Ｅ１２抗体のＦＡＣＳ分析である。
【図１１】図１１はｓＣＤ１４に対する種々のｍＡｂの力価である。
【図１２】図１２は、ｍＡｂ３Ｃ１０と一団の抗ＣＤ１４ｍＡｂとの競合アッセイの結果を示す。
【図１３】図１３は、抗ＣＤ１４ｍＡｂによるＬＰＳ／ＬＢＰのＣＤ１４への結合のブロックを示す。
【図１４】図１４は、ＨＬ−６０細胞におけるサイトカイン放出をブロックする抗ＣＤ１４ｍＡｂの能力の評価結果を示す。
【図１５】図１５は、ＬＰＳの細胞性ＣＤ１４への結合を抑制する抗ＣＤ１４ｍＡｂの効果を示す。
【図１６】図１６は、ＬＰＳ依存性、ＣＤ１４媒介細胞活性化に及ぼす抗ＣＤ１４ｍＡｂの効果を示す。
【図１７Ａ】図１７は、ＬＰＳを用いて抗原投与し、１８Ｅ１２（・）、２８Ｃ５（■）またはＩｇＧ１（×）を用いて処理したサルの平均動脈圧を示す。
【図１７Ｂ】図１７は、ＬＰＳを用いて抗原投与し、１８Ｅ１２（・）、２８Ｃ５（■）またはＩｇＧ１（×）を用いて処理したサルの平均動脈圧を示す。
【図１８Ａ】図１８は、サルにおけるヒトＩＦＮ-γによる処理の前および後のＣＤ１４レベルおよびＬＢＰレベルを示す。
【図１８Ｂ】図１８は、サルにおけるヒトＩＦＮ-γによる処理の前および後のＣＤ１４レベルおよびＬＢＰレベルを示す。
【図１９】図１９は、１８Ｅ１２、２８Ｃ５またはＩｇＧ１を用いて処理したサルにおけるＢＳＡの洗浄液(lavage)／血漿の比を示す。
【図２０】図２０はサルにおける１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１の抗体半減期を示す。
【図２１Ａ】図２１は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２１Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２１Ｂ）におけるＣＤ１４レベルを示す。
【図２１Ｂ】図２１は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２１Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２１Ｂ）におけるＣＤ１４レベルを示す。
【図２２Ａ】図２２は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２２Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２２Ｂ）におけるＬＢＰレベルを示す。
【図２２Ｂ】図２２は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２２Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２２Ｂ）におけるＬＢＰレベルを示す。
【図２３Ａ】図２３は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２３Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２３Ｂ）におけるＡＬＴ／ＧＰＴレベルを示す。
【図２３Ｂ】図２３は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２３Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２３Ｂ）におけるＡＬＴ／ＧＰＴレベルを示す。
【図２４Ａ】図２４は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２４Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２４Ｂ）におけるＥ−セレクチンレベルを示す。
【図２４Ｂ】図２４は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）単独で処理したサル（図２４Ａ）、または抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサル（図２４Ｂ）におけるＥ−セレクチンレベルを示す。
【図２５Ａ】図２５は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＴＮＦレベル（図２５Ａ）、および抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつ抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＩＬ−１レベル（図２５Ｂ）を示す。
【図２５Ｂ】図２５は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＴＮＦレベル（図２５Ａ）、および抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつ抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＩＬ−１レベル（図２５Ｂ）を示す。
【図２６Ａ】図２６は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＩＬ−６レベル（図２６Ａ）、および抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつ抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＩＬ−８レベル（図２６Ｂ）を示す。
【図２６Ｂ】図２６は、抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＩＬ−６レベル（図２６Ａ）、および抗体（１８Ｅ１２、２８Ｃ５およびＩｇＧ１）で処理し、かつ抗体処理の後にＬＰＳを用いて抗原投与したサルにおけるＩＬ−８レベル（図２６Ｂ）を示す。
【図２７】図２７は、１８Ｅ１２（●）、２８Ｃ５（▲）または２３Ｇ４（■）を用いた処理による、ＬＰＳで刺激したヒト全血におけるＴＮＦ放出の抑制を示す。
【図２８】図２８は、ヒヒ血液におけるＬＰＳ誘導ＴＮＦ分泌に及ぼす抗ＣＤ１４抗体の効果を示す〔２３Ｇ４（●）、２８Ｃ５（▽）および１８Ｅ１２（▼）〕。
【図２９】図２９は、モノクローナル抗体３Ｃ１０、２８Ｃ５、２３Ｇ４および１８Ｅ１２のＬ鎖のアミノ酸配列を示す。
【図３０】図３０は、モノクローナル抗体３Ｃ１０、２８Ｃ５および１８Ｅ１２のＨ鎖のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
ヒト可溶性ＣＤ１４（「ｓＣＤ１４」）の全長ポリペプチドが本開示によって提供される。本明細書で用いる「ＣＤ１４」という用語は、ＬＰＳがＬＰＳ：ＬＢＰ複合体として存在する時のＬＰＳの結合部位であるとして同定された細胞表面受容体を意味する。ＣＤ１４細胞表面受容体は、成熟単球、好中球およびマクロファージの表面に存在するグリセロホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合タンパク質である。天然のＣＤ１４もまた、成熟単球およびマクロファージの表面から可溶性形態で自然に放出される。天然のｓＣＤ１４はＧＰＩアンカーを欠き、血清中に存在する。ｓＣＤ１４の生物学的起源および機能はまだ十分に明らかにされていない(Bazil, Europ. J. Immunol., 16:1583-1589, 1986) 。
【００１３】
本明細書で用いる「可溶性」という用語は、細胞表面に関連しない、と定義される。「可溶性ＣＤ１４」とは、ＬＰＳ：ＬＢＰ複合体および／またはＬＰＳ単独に特異的に結合するものとしてさらに特徴付けられる、非細胞関連ＣＤ１４分子である。「組換えヒトｓＣＤ１４」は、図１に記載の核酸配列（配列番号：９）によってコードされる全長のアミノ酸可溶性ヒトＣＤ１４タンパク質、およびその端を切断されたものの両方を含む。同定する目的のためのみに、上記全長タンパク質を５２３と称し、端部切断タンパク質を８４７と称する。このヒトｓＣＤ１４は免疫原としてポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作成に有用であり、また患者の試料中におけるＬＰＳの存在を検出するためにも有用である。免疫原として使用する場合、５２３は従来のＣＤ１４免疫原よりも有利な点を提供した。例えば、５２３はより多数のＣＤ１４特異的陽性クローンを提供した；５２３は全細胞抽出物中に存在するであろう他の免疫原性タンパク質に対する多数の非特異的応答を排除した；そして、５２３は興味の対象である抗体を得るために必要とされるスクリーニングの回数を減らした。この全長ヒトｓＣＤ１４ポリペプチドは、図１に記載の核酸配列（配列番号：９）を有する。この配列を用いて、当業者は類似の配列を有するポリペプチドを化学合成または遺伝子組換えにより作成することができる。端部切断タンパク質（「８４７」）は、除去された配列のカルボキシル末端由来の８個のアミノ酸を有する。
【００１４】
ｓＣＤ１４の１次アミノ酸配列の小変異は、本明細書に記述されるｓＣＤ１４タンパク質と比較して実質的に等しい機能を有するタンパク質をもたらす可能性がある。このような修飾は、部位特異的突然変異誘発によるもののように精巧であることもあるし、また自然発生的なものでもありうる。これらの修飾によって産生されたすべてのタンパク質は、ＣＤ１４機能が存在するかぎり本発明に含まれる。
【００１５】
ｓＣＤ１４の１次アミノ酸配列の修飾はまた保存性変異を包含する。本明細書に用いられる「保存性変異」という用語は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似したアミノ酸残基による置換を意味する。保存性変異の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニン等の疎水性残基が別の疎水性残基に置換すること、またはアルギニンがリシンに、グルタミン酸がアスラギン酸に、グルタミンがアスパラギンに置換する等の極性残基が別の極性残基に置換することを含む。「保存性変異」という用語は、置換ポリペプチドに対して作成された抗体が非置換ポリペプチドに対しても免疫反応を示すならば、置換アミノ酸を非置換親アミノ酸の代わりに使用することをも含む。
【００１６】
本発明は図１（配列番号：９）に記載の、ヒト可溶性ＣＤ１４ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、図１に記載の核酸分子とは異なるが、発現されるとこの核酸分子と同一の表現型効果または免疫原性効果を奏する核酸分子をも包含する。本発明は、上記の核酸分子と比較したとき、産生されるポリペプチドの表現型を変更しない非コード領域における変化によって特徴付けられる核酸分子を包含する。それゆえ、ｓＣＤ１４の全体または一部をコードする全てのポリヌクレオチドも、ｓＣＤ１４の機能（抗体を誘導する、または抗体と結合するなど）を示すものであれば本発明に含まれると解釈される。そのようなポリヌクレオチドは、天然に存在する、および意図的に操作された（例えば突然変異誘発された）ポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドは上記タンパク質をコードするＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む。
【００１７】
本発明はさらに、本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を包含する。本明細書に使用する「核酸」という用語は、ＲＮＡならびに一本鎖および２本鎖のＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む。
【００１８】
図１に記載の配列および当業者に周知の方法（参照として全体をここに組み入れる Sambrookら，Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989) に例示される)を用いて、ヒトｓＣＤ１４を遺伝子組換えによって作成し、単離することができる。この配列を含有する発現ベクター、およびそのベクターを含有する宿主細胞もまた本発明により提供される。本明細書に使用する「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、プロモーターおよびエンハンサー配列等の発現をもたらすことが可能な他の配列との機能的な共同により、選択された宿主細胞において発現されうる異種の核酸配列をいう。説明の目的のためのみに例を挙げると、これらの発現ベクターは細菌プラスミド、細菌ファージ、動物ウイルス、バキュロウイルスまたはコスミドでありうる。ベクターが細菌プラスミドまたは細菌ファージの場合は、上記のポリペプチドを遺伝子組換えによって産生するために大腸菌等の原核生物宿主細胞が使用できる。真核生物宿主細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)等の哺乳動物細胞またはバキュロウイルス発現のための昆虫細胞でありうるが、これらに限定されない。
【００１９】
ヒトｓＣＤ１４を遺伝子組換えによって産生する方法が本発明により提供される。この方法は、上記の宿主細胞を、ｓＣＤ１４核酸分子が転写され、かつ翻訳されるのに適切な条件下で培養することを要する。発現後、市販のＣＤ１４モノクローナル抗体からなるアフィニティーカラムを使用して、組換えｓＣＤ１４を細胞培養物より単離することができる。
【００２０】
本発明はまた、細胞表面ＣＤ１４受容体および可溶性ＣＤ１４と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、抑制されなければＣＤ１４受容体に結合し、細胞を活性化して、例えばＮＦ-κＢ活性を誘導またはサイトカインを産生および放出することが可能なリガンドによるＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制する。本発明によって提供されるモノクローナル抗体は、リガンドがＣＤ１４に結合してしまった後でも、リガンドによるＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制することができる。これらのモノクローナル抗体はリガンドとＣＤ１４との間に少なくとも約80%のリガンド結合を起こさせ、それでもなおＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制することができるが、これらの抗体はリガンドとＣＤ１４との間に少なくとも約50%のリガンド結合が起こるのを許しうる。
【００２１】
本明細書に使用する「抗体またはポリクローナル抗体」という用語は、抗原を用いた免疫感作に応答して、または組換えクローニング技法により作られるタンパク質を意味する。「モノクローナル抗体」という用語は、細胞の単一クローンより誘導された免疫グロブリンを意味する。そのクローンから誘導されたすべてのモノクローナル抗体は化学的および構造的に同一で、１個の抗原決定基に特異的である。
【００２２】
実験室においてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作成するための方法は、当分野の技術では公知である〔参照としてここに組み入れる Harlow および Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yord (1988)参照〕。本発明のモノクローナル抗体は、可溶性ＣＤ１４の全長ヒト組換えポリペプチドを動物、例えばマウスまたはウサギに導入することにより生物学的に作成できる。その動物における抗体産生細胞を単離し、ハイブリッド細胞またはハイブリドーマを作成するために骨髄腫細胞または異種骨髄腫細胞と融合させる。それゆえ、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞もまた提供される。この方法で産生されるモノクローナル抗体は、１８Ｅ１２、２８Ｃ５、２３Ｇ４、５Ｇ３、４Ｆ２、１３Ａ７、１０Ｂ７および２６Ｆ３と称するモノクローナル抗体を含むが、これらだけに限定されない。ハイブリドーマ細胞系１８Ｅ１２、２８Ｃ５および２３Ｇ４は、特許手続上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約の規定に基づいて American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville,Maryland 20852, U.S.A.に寄託された。１８Ｅ１２および２８Ｃ５は1993年5月27日に寄託され、それぞれATCC受託番号 HB11363およびHB11364を与えられた。２３Ｇ４は1994年5月25日に寄託され、受託番号Xを与えられた。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびその規則（ブダペスト条約）の規定に基づいて行なわれた。これは、寄託日より30年間、生育しうる培養物の維持を保証する。これらの微生物は、当該米国特許の付与、または米国若しくは外国出願の公開のうちどちらか早い方が行なわれたならば、培養物の子孫を公衆に対して永久的および非制限的に入手可能であることを保証し、また米国特許商標庁長官によって35 U.S.C.§122およびそれに準じる長官規則（特に886 OG 638に関連してC.F.R.§1.14を含む) により資格があるとされた者に対する子孫の入手可能性を保証するブダペスト条約の条件に基づいて、ATCCにより入手可能とされるであろう。
【００２３】
本願の譲受人は、もし培養寄託物が適切な条件下で培養されていて死滅、紛失または破壊された場合、通知があり次第、同一培養物の生育可能な標本と迅速に取り換えることに合意した。寄託された菌株の入手可能性は、政府当局によりその特許法に基づいて授与された権利に反してその発明を実施するためのライセンスであると解釈されるべきではない。
【００２４】
ここまで記述してきた明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能とするに十分であると考えられる。本発明は、寄託された細胞系によってその範囲を制限されるものではない。なぜなら、寄託された具体物は本発明の一側面の一つの説明として意図されるもので、機能的に等価な任意の細胞系は本発明の範囲内にあるからである。微生物の寄託は、本明細書に含有される記述が本発明の任意の側面（最も好ましい態様を含む）の実施を可能とするには不十分であるという承認を構成しない。また、微生物の寄託は、請求の範囲をその寄託物が表す特定の例証に制限するものと解釈されるべきではない。
【００２５】
したがって、独自の可溶性ＣＤ１４の全長組換えタンパク質および周知の方法を用いて、当業者は本発明のハイブリドーマ細胞および抗体を作成し、スクリーニングすることができる。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体は、細胞表面ＣＤ１４受容体および可溶性ＣＤ１４と特異的に反応し、ＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制可能であるとして特徴付けることができる。結合特異性の測定方法は下記に要約されている。１つの態様において、本発明のモノクローナル抗体は、抗ＣＤ１４抗体３Ｃ１０(American Type Culture Collection より入手可能)の親和性よりも大きいＣＤ１４に対する結合親和性を有するものとしてさらに特徴付けることができる。そのようなモノクローナル抗体の一つは、２８Ｃ５と称するモノクローナル抗体である。ジヒドロキシビタミンＤ３誘導ＴＨＰＩ細胞への２８Ｃ５結合のスキャッチャード分析は、３ｘ１０-9Ｍ-1という親和性を示した。モノクローナル抗体２８Ｃ５および２３Ｇ４、ならびに類似の特異性および親和性を有する抗体は、活性化を抑制でき、またＮＦ-κＢ活性化を誘導するリガンドとのＣＤ１４の結合を抑制することができる、としてさらに特徴付けることができる。さらに、本発明のすべてのモノクローナル抗体は、ＣＤ１４＋細胞が誘導性リガンドと接触した時に、これらの細胞からのサイトカイン放出を抑制する能力によって特徴付けることができる。本明細書で用いるサイトカインという用語はＴＮＦ-α、ＩＬ-１、ＩＬ-６およびＩＬ-８を含むが、これらだけに限定されない。
【００２７】
別の態様においては、モノクローナル抗体１８Ｅ１２および類似の特異性を有するモノクローナル抗体は、ＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制する能力を有するが、その抑制がなければＣＤ１４媒介細胞活性化を誘導できるリガンドとＣＤ１４との結合を有意に抑制しない（つまり、これらの抗体はＣＤ１４結合を許す）、としてさらに特徴付けることができる。１８Ｅ１２の特異性を有するモノクローナル抗体は、リガンドとＣＤ１４の間で少なくとも約50%から少なくとも約80%の結合が起こることを許す。
【００２８】
ここに記述された好ましいモノクローナル抗体、すなわち１８Ｅ１２および２３Ｇ４は、ヒトＣＤ１４およびヒヒＣＤ１４の両方に結合する。他方、２８Ｃ５はヒヒＣＤ１４とは結合しない。
【００２９】
ＬＢＰは、ＬＰＳのＣＤ１４に対する提示に関与する支配的な血清タンパク質であるが、他の血清タンパク質もまた適切な条件下でＬＰＳに結合し、ＬＰＳ−ＣＤ１４相互作用を促進しうる(Wright, S.D.ら，J. Expt. Med., 176:719-727, 1992)。生理的条件下でＬＢＰまたは他のタンパク質のどちらが優勢かに関わりなく、モノクローナル抗体１８Ｅ１２、２３Ｇ４または２８Ｃ５の効果は同一である。なぜなら、これらの抗体は血漿（または血清）の存在下でＬＰＳのＮＦ-κＢまたはサイトカイン産生に及ぼす効果を妨げるからである。
【００３０】
本発明はまた、上記のポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生物学的に活性な断片を提供する。これらの「抗体断片」は、選択的に抗原または受容体と結合する若干の能力を保持している。このような抗体断片は以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち：
（１）Ｆａｂ：酵素パパインで消化して作成され、無傷のＬ鎖１本および１本のＨ鎖の一部を生じる、抗体分子の一価の抗原結合性断片を含有する断片；
（２）Ｆａｂ’：ペプシンで処理し、次に還元して得られ、無傷のＬ鎖１本およびＨ鎖の一部を生じる、抗体分子の断片；１個の抗体分子につき２個のＦａｂ’断片が得られる；
（３）（Ｆａｂ’）2：酵素ペプシンで処理し、次に還元を行なわないで得られる、抗体の断片；（Ｆａｂ’）2は２つのジスルフィド結合により結合している２個のＦａｂ’断片からなる二量体である；
（４）Ｆｖ：２本の鎖として発現されるＬ鎖の可変部およびＨ鎖の可変部を含有する遺伝子工学的に作成された断片と定義される；および
（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）：適切なポリペプチドリンカーによって結合されたＬ鎖の可変部およびＨ鎖の可変部を遺伝子工学的に融合させた一本鎖分子として含有する、遺伝子工学的に作成された断片と定義される。
【００３１】
これらの断片の作成方法は当分野において公知である。例えば、前出のHarlowおよびLaneを参照されたい。
【００３２】
「生物学的に活性な断片」のさらなる例は、以下に規定する抗体のＣＤＲを特異的に含む抗体断片を含む。これらのＣＤＲ領域は、図２〜５および２９〜３０（配列番号：１〜８および配列番号：２２〜２４）に同定されている。これらの抗体のＣＤＲは、下記のＣＤＲグラフト(grafted) 抗体を作成するのに有用である。「生物学的に活性な断片」のさらなる例は、これもまた図２〜５および２９〜３０（配列番号：１〜８および配列番号：２２〜２４）に同定される抗体のフレームワーク構造領域を特異的に含む断片を含む。抗体のフレームワーク構造領域は、ＣＤＲのＰＣＲ増幅のためのプライマーとして有用である。
【００３３】
遺伝子組換えによって作成され、生化学的に合成され、化学的に合成され、または化学的に修飾されたタンパク質またはポリペプチドであって、対応する天然ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のＣＤ１４細胞表面受容体および可溶性ＣＤ１４に結合する能力、ならびに活性化するリガンドのＣＤ１４＋細胞への結合によるＣＤ１４媒介細胞活性化を抑制する能力を保持しているものも、本発明に包含される。抗原または受容体と結合する能力は、抗体捕獲アッセイ等の当分野の技術において公知の抗原結合アッセイによって測定される（例えば、前出のHarlowおよびLaneを参照）。
【００３４】
上記の抗体または生物的に活性な抗体断片の任意のものが、ＣＤＲグラフト抗体およびキメラ抗体の作成に使用できる。
【００３５】
「ＣＤＲ」若しくは「相補性決定部位」または「超可変部」は、抗原結合部位の形成に寄与する三次元ループ構造を形成する、抗体のＬ鎖およびＨ鎖上のアミノ酸配列と定義される。
【００３６】
本明細書に使用する「ＣＤＲグラフト」抗体という用語は、Ｌ鎖および／またはＨ鎖可変部の１個またはそれ以上のＣＤＲ配列の少なくとも一部が、所与の抗原または受容体に対して異なる結合特異性を有する抗体由来のＣＤＲ配列の類似部分によって置換されているアミノ酸配列を有する抗体を言う。
【００３７】
本明細書で用いる「Ｌ鎖可変部」および「Ｈ鎖可変部」という用語は、Ｌ鎖およびＨ鎖のそれぞれのＮ末端部に存在する、各抗体ごとに変化した一次アミノ酸配列を有する領域またはドメインを言う。抗体の可変部は、一緒に折りたたまれて抗体の三次元結合部位を形成するＬ鎖およびＨ鎖のアミノ末端ドメインからなる。
【００３８】
類似性ＣＤＲ配列は基質またはレシピエント抗体に「グラフト（接ぎ木）される(grafted)」と言われている。「ドナー」抗体とはＣＤＲ配列を提供する抗体で、置換された配列を受け取る抗体が「基質」抗体である。当業者は、本明細書に提供する教示を当分野で周知の技法（参照のため全体をここに組み入れるBorrebeack, C.A., Antibody Engineering : A PracticalGuide, W.H. Freeman and Company, New York, 1992参照）と組み合わせて使用して、容易にこれらのＣＤＲグラフト抗体を作成することができる。
【００３９】
本発明はさらに、上記の抗体または生物学的に活性な断片のキメラ抗体を提供する。本明細書で用いる「キメラ抗体」という用語は、ある生物種から誘導された抗体の可変部が別の種から誘導された抗体の定常部と組み合わされている抗体を言う。キメラ抗体はＤＮＡ組換え技術によって構築され、例えば Shawら，J. Immun. 138:4534 (1987); Sun, L.K. ら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:214-218(1987)に記述されている。
【００４０】
上記の抗体、モノクローナル抗体、生物学的に活性な断片、キメラ抗体およびＣＤＲグラフト抗体をコードする核酸分子もまた本発明により提供される。「核酸」という用語は、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを含むことが意図される。これらの核酸分子は、ＲＮＡ転写プロモーターに機能しうる形で連結することができる。本発明は上記の核酸分子とは異なるが、同一の表現型効果を生じる核酸分子をも包含する。本発明は、上記の核酸分子と比較したとき、産生されるポリペプチドの表現型を変化させない、非コード領域における変化によって特徴付けられる核酸分子を包含する。本発明はさらに、本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を包含する。本明細書に使用する「核酸」という用語は、１本鎖および２本鎖のＤＮＡおよびｃＤＮＡはもとよりＲＮＡも包含する。
【００４１】
１つの態様において、これらの核酸分子は前記の発現ベクターに挿入される。発現ベクターは適切な宿主細胞に挿入することができる。挿入された核酸配列の転写および翻訳に好ましい条件下で細胞の増殖を誘導すると、組換えタンパク質またはポリペプチドが産生され、次にこれらを単離して、以下に記述する診断または治療に使用することができる。組換えによりポリペプチドおよびタンパク質を産生する方法は広く知られている（前出のSambrookら、および Kreigler, M., Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York, 1990参照。これらはそれぞれ参照のためここに組み入れている）。
【００４２】
医薬組成物もまた本発明により提供される。これらの医薬組成物は、上記のポリペプチド、断片、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体またはＣＤＲグラフト抗体の任意のものを単独で、または相互に組み合わせて含有し、かつ製薬上許容されるキャリヤーを含有する。本明細書に使用される「製薬上許容されるキャリヤー」という用語は、任意の標準的医薬キャリヤーを含む。例えば、リン酸緩衝化生理食塩溶液、水、および油／水または水／油エマルジョン等のエマルジョン類、および種々の湿潤剤等である。これらの医薬組成物は診断または治療上の目的に有用である。
【００４３】
本発明のモノクローナル抗体は、in vitroでの使用に適している。例えば、これらの抗体を液相で、または固相担体に結合して使用するイムノアッセイに適している。さらに、これらのイムノアッセイにおけるモノクローナル抗体は、種々の方法で検出可能に標識することができる。本発明のモノクローナル抗体を使用できるイムノアッセイの種類の例は、直接または間接様式の競合および非競合イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ(RIA)およびサンドイッチ( 免疫測定法)アッセイである。本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原の検出は、前進、逆方向または同時様式で実施されるイムノアッセイ( 生理的試料に関する競合イムノアッセイおよび免疫組織化学的アッセイを含む）を用いて行なうことができる。当業者は過度の実験をすることなく他のイムノアッセイ様式を知るか、または容易に認識することができるであろう。
【００４４】
本発明のモノクローナル抗体は、多数の異なる担体に結合させてＣＤ１４の検出に使用することができる。周知の担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が含まれる。担体の性質は、本発明の目的に応じて可溶性であることも、不溶性であることもある。当業者は、通常の実験によりモノクローナル抗体を結合させるための他の適切な担体を知るか、またはそのような担体を突き止めることができるであろう。
【００４５】
当業者に公知の多数の異なる標識および標識化方法がある。本発明に使用できる標識の種類の例には、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物および生体発光化合物が含まれる。当業者は、通常の実験により本発明のモノクローナル抗体に結合させる他の適切な標識を知るか、またはそのような標識を突き止めることができるであろう。さらに、このような標識を本発明のモノクローナル抗体に結合させることは、当業者に周知の標準的技法を用いて行なうことができる。
【００４６】
さらに、ＬＰＳ／ＬＢＰ複合体の細胞表面ＣＤ１４受容体への結合をブロックするための方法が提供される。この方法は、細胞を上記複合体と結合可能なモノクローナル抗体（例えば、２８Ｃ５若しくは２３Ｇ４の特異性および親和性を有するモノクローナル抗体、またはその生物学的に活性な断片）と接触させることによるものである。また、ＮＦ-κＢ活性化を誘導することが可能なリガンド（ＬＰＳまたはＬＰＳ／ＬＢＰ等）の存在下におけるＣＤ１４受容体を発現する細胞のＮＦ-κＢ活性化を抑制する方法も開示される。この方法は、上記細胞を細胞表面受容体ＣＤ１４および全長ヒト可溶性ＣＤ１４に特異的に結合する能力を有する抗体、またはその生物学的に活性な断片と接触させることを提供する。このような抗体の具体例は、２８Ｃ５、２３Ｇ４および１８Ｅ１２と称する抗体である。
【００４７】
動物およびヒトに使用することができる幾つかの治療方法がここに提供される。１つの治療法は、細胞表面受容体ＣＤ１４および可溶性ＣＤ１４に特異的に結合する能力を有する抗体またはその生物学的に活性な断片を、疾患を有する被験者に有効量投与することによって、ＮＦ-κＢ活性化に関連する疾患（敗血症等）を治療または予防する手段である。上記の方法は、１８Ｅ１２の結合特異性を有するモノクローナル抗体を使用した場合に特に有利である。１８Ｅ１２およびそれに類似の抗体はＬＰＳがＣＤ１４受容体と結合してしまった後でもＮＦ-κＢ活性化を抑制できるので、そのような抗体は後期敗血症(later stage sepsis)の治療に使用することができる。本明細書に使用する後期敗血症という用語は、ＬＰＳがＣＤ１４細胞関連受容体と結合してしまった後の疾患過程を意味する。意味深いことに、１８Ｅ１２および類似の抗体は、抗体が結合した細胞にＬＰＳまたはＬＰＳ／ＬＢＰ複合体の該細胞内への輸送を継続することを許すことができる。この特性は、in vivo系からのＬＰＳまたはＬＰＳ／ＬＢＰ複合体の除去を可能とし、それによってどこか他のin vivo 部位において起こりうるＬＰＳまたはＬＰＳ／ＬＢＰ複合体の病理学的相互作用を抑制するという付加的利益をもたらす。
【００４８】
あるいは、治療が予防的なものであるか、又はＬＰＳ／ＬＢＰがＣＤ１４と結合するのをブロックし、それによってサイトカイン放出および細胞活性化を抑制することが望ましい場合は、モノクローナル抗体２８Ｃ５および２３Ｇ４が本発明の方法に好ましい。
【００４９】
本発明は、敗血症の症状を示しているか、または敗血症を発症する恐れのある被験者に、治療上有効量の、ＣＤ１４に結合して細胞活性化を抑制する本発明のモノクローナル抗体を投与することを含む、敗血症自体または敗血症の１つまたはそれ以上の症状を改善する治療法を提供する。改善されうる症状は、血中ＴＮＦレベルの一過性の上昇に関連する症状、例えば熱、低血圧、好中球減少、白血球減少、血小板減少、汎発性血管内凝固症候群、成人呼吸促進症候群、ショックおよび多臓器不全を含む。このような治療を要する患者には、例えばグラム陰性菌感染、毒物中毒、または肝不全に由来する内毒血症等の毒血症の危険がある患者、またはこれを患っている患者が含まれる。さらに、グラム陽性菌感染、ウイルス感染または真菌感染を有する患者は、敗血症の症状を示すことがあり、ここに記述する治療方法によって利益を受けることができる。本発明の方法からより特別に利益を受けることのできる患者は、大腸菌、インフルエンザ菌Ｂ(Haemophilus influenza B)、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、ブドウ球菌、または肺炎球菌による感染を患っている患者である。敗血症の危険がある患者には、火傷、銃創、腎不全または肝不全を患う患者が含まれる。
【００５０】
本明細書に用いる「治療上有効量」という表現は、用いられるモノクローナル抗体（ＣＤ１４に結合し、サイトカイン放出等のシグナル発信現象をブロックする）の量が、被験者のＬＰＳへの応答を減少させ、敗血症の症状を減少させるのに十分な量であることを言う。したがって「治療上有効」という表現は、例えば、血漿中のＴＮＦレベルにおける臨床的に有意な上昇をさまたげる、そして好ましくは少なくとも５０％減少させる、そしてより好ましくは９０％減少させるのに十分なその抗体の量を含む。本発明のモノクローナル抗体、例えば１８Ｅ１２、２８Ｃ５および２３Ｇ４を投与する際の投与量範囲は、所望の効果を生じるに十分なだけ大きい。一般にこれらの抗体の用量は、患者の年齢、状態、性別、前記の細菌または他の作用物質による感染の程度によって変わり、当業者によって決定されうる。何らかの禁忌の場合、用量は個々の治療医により調節することができる。いずれにせよ、治療の有効性は、患者のＬＰＳおよびＴＮＦレベルをモニターすることにより確認できる。血清ＬＰＳおよびＴＮＦレベルの低下は患者の回復と相互関連しているに相違ない。
【００５１】
さらに、本発明の抗体の治療的投与と実質的に同時にＴＮＦ抑制剤、抗生物質またはその両方を投与することをさらに含む前記の方法によって、敗血症の危険のある、またはその症状を示している患者を治療することができる。例えば、抗ＴＮＦ抗体および／またはＴＮＦ拮抗薬の使用等による、敗血症におけるＴＮＦの役割への直接的または間接的干渉は、敗血症の症状を予防または改善することができる。特に好ましいのは有効成分としての抗ＴＮＦ抗体、例えば Traceyら(Nature, 330:662, 1987) によって記述されているＴＮＦ特異性を有するモノクローナル抗体などの使用である。
【００５２】
末端切断型(truncated) ＬＢＰまたは本発明の抗体を用いた治療に加えて、抗生物質を用いて敗血症の症状を示す患者を治療することができる。典型的抗生物質には、ゲンタマイシン等のアミノグリコシド、またはペニシリン、セファロスポリン等のβ−ラクタムが含まれる。したがって、本発明の好ましい治療法は、殺菌量の抗生物質の投与と実質的に同時に、治療上有効量の本発明の抗体を投与することを含む。
【００５３】
本明細書に使用する「殺菌量(bactricidal amount)」という用語は、治療を受けている患者において細菌を殺す血中濃度を達成するのに十分な量を言う。ヒトに投与しても安全であると一般に承認されている抗生物質の殺菌量は、当分野の技術において周知であり、公知のように特定の抗生物質および治療すべき細菌感染の種類により変わる。
【００５４】
好ましくは、本発明のモノクローナル抗体の投与は、抗生物質投与の約48時間以内に、より好ましくは約2〜8時間以内に、そして最も好ましくはそれと実質的に同時に行なわれる。
【００５５】
本発明の目的のためには、被験者は動物またヒト患者であり、有効量は体重 1 kg あたり 0.25 mg から約 50 mgである。１つの態様において、有効量は体重 1 kg あたり 0.5 mg から約 10mgである。被験者がヒト患者である場合、好ましい量は体重 1 kg あたり約 0.5 mg から約 8 mg である。
【００５６】
当業者に公知のように、上記の諸方法は治療および予防の効果を増強するために組み合わせることが可能である。医薬組成物を投与する手段は当業者には周知であり、これらの手段は静脈内投与、経口投与、腹腔内投与、皮下投与、または吸入療法による投与を含むが、これらだけに限定されない。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例は本発明を説明することを意図するものであって、制限するものではない。
実施例１
可溶性ＣＤ14（ｓＣＤ14）の産生およびモノクローナル抗体の製造
Ａ．ｓＣＤ14のクローニング
ヒトＣＤ14遺伝子の１コピーを入手した。ヒト単球細胞系（ＨＬ−60）（American Type Culture Collection,ATCC No.240）からのこの遺伝子のクローニングについての記述が Blood,73 :284(1989)にあり、ここで参考として引用する。ＣＤ14遺伝子をこの発現ベクターから切除し、哺乳動物の発現ベクターｐＥＥ14（Celtech)中にクローン化した。このベクターは誘導性グルタミンシンテターゼ遺伝子（ＧＳ）を有しており、これを使用してＣＤ14遺伝子を含有する挿入ＤＮＡフラグメントを増幅させた。この遺伝子の完全ＤＮＡ配列をｐＥＥ14中にクローン化した。市販の抗ＣＤ14ｍＡｂｓとの反応性に関するＥＬＩＳＡ検定によって、可溶性ＣＤ14を発現する細胞を同定した。ＦＡＣＳ分析によって検出したところ、523 と同定された１つのクローンが可溶性ＣＤ14と膜結合形態のものとの両方を発現することが証明された。可溶性形態のクローン 523は予測された翻訳タンパク質配列の20番目のアミノ酸残基の位置でＮ−末端プロセシングされていることがわかった。このタンパク質の配列を図１に示す。翻訳されたＣＤ14配列の１〜19アミノ酸残基はシグナル配列であると予測された（Gene Works, Intelligenetics ）。Ｃ−末端配列分析によって、Ｃ−末端は完全なままであることがわかった；ヒト血清から単離した可溶性ＣＤ14において言及されている（Bazil,et al.,Eur.J.Immunol.,16:1583,1986をここに参考として挙げる）のと同様のプロセシングは生起しなかったことになる。腎臓疾患患者の尿から単離した可溶性ＣＤ14は、Ｃ−末端から最大で８番目までのアミノ酸が欠如している（Bazil,Mol.Immunol.,26:657,1989）。クローン 523は、ＣＨＯ細胞中での発現の結果、Ｃ−末端でのプロセシングステップがなかったのかも知れない。
【００５８】
可溶性ＣＤ14の精製は、市販のｍＡｂ63Ｄ3 （American Type Culture Collectionより(ATCC No.HB44)入手可能）のアフィニティカラム上で抗原を精製することによって行なった。
【００５９】
Ｂ．ｓＣＤ14モノクローナル抗体の産生
上記の精製ヒト組換えＣＤ14で免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞系Ｘ63.Ａｇ8.653間での体細胞融合によって、ヒト可溶性ＣＤ14に対するモノクローナル抗体を産生させた。ＥＬＩＳＡ検定においてＣＤ14に対するスクリーニングによって同定したモノクローナル抗体の28Ｃ5 ，18Ｅ12，26Ｆ3 および23Ｇ4 は Ig Ｇ１ｍＡｂである。ＣＤ14+細胞上のフローマイクロフルオロメトリーおよび生合成標識したＣＤ14の免疫沈降によって、天然ＣＤ14への結合を確認した。モノクローナル抗体28Ｃ5 ,23Ｇ4および18Ｅ12は細胞結合および可溶性ＣＤ14を認識する。競合試験により、これらのｍＡｂはＣＤ14の３つの異なるエピトープ（28Ｃ5 および23Ｇ4 では重複）に結合したことが示された。
【００６０】
実施例２
モノクローナル抗体の特性決定
Ａ．抗ＣＤ14モノクローナル抗体を使用したＣＤ14+陽性細胞のＦＡＣＳ分析
ＴＨＰ−１細胞（American Type Culture Collection, ATCC
No. TIB 202 ）をジヒドロキシビタミンＤ３で48時間誘導し、その後細胞をＤＭＥＭ（4.5 g/L グルコース、90％ウシ胎児血清を有し、１％ＢＳＡおよび0.02％アジドを有するＰＢＳを追加した、ダルベッコ改変イーグル培地）で洗浄した。1,000,000 cells/tube（１チューブ当たりの細胞数）を第１の抗体（抗ＣＤ14上清）の１：２の希釈物と４℃で45分間反応させた。細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／アジドで洗浄した。第２の抗体（ヤギ抗マウスIgＧ、ＦＩＴＣ標識(Cappel)）を１：250 の希釈率で添加し、４℃で30分反応させた。細胞を同一の緩衝液で２回洗浄した。ペレットを緩衝液１mlに再懸濁させた。サイトフルオログラフ（Cytofluorograph)（Ortho Instruments)によって蛍光強度を測定した。この結果を図６〜10に示す。
【００６１】
Ｂ．抗ｓＣＤ14モノクローナル抗体の可溶性ＣＤ14に対する結合親和性の測定
可溶性ＣＤ14抗原に対する結合親和性について、すべての抗ＣＤ14ｍＡｂおよび市販の抗ＣＤ14のいくつかを評価した（図11）。抗体３Ｃ10は力価１：２8、28Ｃ５は力価１：２11であった。これは３Ｃ10に比較して28Ｃ５の力価が８倍であることを示す。これらの抗体の比親和性は、標識ヤギ抗マウス複合抗体でプローブ化した等濃度の精製抗体タンパク質で測定した。この方法によってわかった、ｓＣＤ14に対して高親和性のある抗体は、４Ｆ２，５Ｇ３，26Ｆ３，28Ｃ５，23Ｇ４および63Ｄ３である。抗ＣＤ14ｍＡｂの３Ｃ10および18Ｅ12はｓＣＤ14に対し、最低の親和性を示した。抗ＣＤ14の28Ｃ５は、３Ｃ10に比較してずっと高い親和性を有していた。可溶性ＣＤ14をマイクロタイタープレート上に塗布し、抗ＣＤ14ｍＡｂの２μg／mlから２倍ずつの連続希釈物を添加した。ヤギ抗マウスＨＲＰ複合抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した。その後基質を添加して、力価１：２nを記録した。これは、陰性対照のＯＤ490nmの少なくとも３倍を与える抗体の最高希釈率によって表される。
【００６２】
標識３Ｃ10と抗ＣＤ14ｍＡｂの１パネル間の競合試験によって、抗体28Ｃ５および10Ａ１（IgＡｍＭａｂ）のみが塗布マイクロタイタープレート上でｓＣＤ14について３Ｃ10と競合することができることが明らかになった（図12）。さらに競合検定を実施し、18Ｅ12は28Ｃ５、３Ｃ10、または26Ｆ３と競合しないことが確認された。
【００６３】
表１は28Ｃ５、23Ｇ４および18Ｅ12間での同様の競合検定の結果を示す。ＥＬＩＳＡ検定において、固相上にビオチン標識抗ＣＤ14ｍＡｂ（Ａ，Ｃ）とともにこれらの抗体を塗布した。
【００６４】
【表１】
【００６５】
これらの抗ＣＤ14ｍＡｂの、ＬＰＳ／ＬＢＰのｓＣＤ14への結合をブロックする能力は、同様の形式のＥＬＩＳＡを使用して評価した。
【００６６】
ｍＡｂを、ＬＰＳ／ＬＢＰのｓＣＤ14への結合を阻害する能力に関して評価したところ、28Ｃ５が最も効果的であった（図13）。図13は、各種抗ＣＤ14モノクローナル抗体４μg/ml存在下で、固相上に固定化された可溶性ＣＤ14へのＬＰＢ／ビオチニル化ＬＰＳ複合体の結合強度を表す。抗ＣＤ14ｍＡｂ28Ｃ５および３Ｃ10はこの結合作用をブロックする。抗ＣＤ14ｍＡｂは、ＯＤ値の減少で示されるように、このブロッキングにおいてより効果的である。抗ＣＤ14ｍＡｂ18Ｅ12はブロッキング効果を何ら示さない。
【００６７】
ＨＬ-60 細胞中でのＬＰＳ刺激に応答したサイトカインの放出をブロックする能力に関する抗ＣＤ14の評価では、28Ｃ５がＴＮＦ−αの発現をブロックすることが示された (図14) 。ＬＰＳの添加前に全血にex vivo で28Ｃ５、23Ｇ４および18Ｅ12を添加した場合にも、サイトカイン放出の阻害が観察された。驚くべきことに、18Ｅ12は、ＣＤ14へのＬＰＳ／ＬＢＰの結合をブロックしないことがすでに証明されたにもかかわらず、サイトカインの放出を阻害した（図13および27）。ヒヒ全血中におけるＬＰＳ誘導ＴＮＦに対する23Ｇ４、28Ｃ５および18Ｅ12の影響も、ex vivoで試験した。図28の結果は、ＬＰＳ誘導ヒヒ血中でのＴＮＦ分泌の阻害について、23Ｇ４が最も影響力があることを示している。これらの結果は、18Ｅ12が、ＬＰＳ／ＬＢＰ結合を妨げないが、細胞のＬＰＳ刺激に関与するシグナル作用には重要なＣＤ14上の領域に対して特異的であったことを示す。
【００６８】
28Ｃ５および23Ｇ４はＣＤ14へのＬＰＳ：ＬＢＰの結合のブロッキングについては共通の特異性を示すが、ヒヒＣＤ14の認識については共通ではなく（23Ｇ４のみがヒヒを認識する）、28Ｃ５はＬＰＳに応答したヒヒ全血からのＴＮＦαの放出をブロックすることができない（図27）。
【００６９】
抗ＣＤ14ｍＡｂの28Ｃ５、18Ｅ12および23Ｇ４のｓＣＤ14へのＬＰＳ／ＬＢＰ結合をブロックする能力を、表１について述べたのと同様の形式のＥＬＩＳＡを使用して同様に評価した。結果は、やはりｓＣＤ14結合について23Ｇ４と28Ｃ５が競合することを示す（表１参照）。
【００７０】
Ｃ．サイトカイン放出の活性化
ＨＬ-60 細胞（American Type Culture Collectionより入手、ATCC No.CCL-240 ）を濃度1.5×105cells／mlでプレートに塗布した。この細胞を10％ウシ血清、10-7M DHvD3（Biomol Research Laboratories）および50μM インドメタシン（Calbiochem）を含有するＲＰＭＩ1640中で３〜４日間単球系列に誘導した。これらの分化した細胞を10％ヒトＡＢ型血清(Irvine Scientific)存在または不在の50μMインドメタシン含有増殖培地１ml当たり１×106細胞数で再懸濁させ、その後平底クラスター皿に入れた。各種濃度のＬＰＳ（E.coli血清型 01217:B8;Sigma ）を添加し、37℃で４〜５時間インキュベートすることによって、細胞を活性化した。培養皿中の細胞を低速遠心分離（170×g、室温で10分間）によってペレット化し、可溶性サイトカイン値のＥＬＩＳＡ（ヒトＴＮＦα検出用ＥＬＩＳＡキット；Genzyme ）のために増殖培地を除去した。
【００７１】
Ｄ．細胞ＣＤ14へのＬＰＳ結合の抗ＣＤ14モノクローナル抗体による阻害
細胞ＣＤ14とＬＰＳ間の相互作用のメカニズムを特性づけるため、Lee et al.,J.Exp.Med.,175:1697-1705,1992 に記載された、安定的にトランスフェクトされたヒトＣＤ14発現ベクターを含有する70Ｚ/3細胞を調製して、70Ｚ/3-hＣＤ14細胞を形成させた。細胞表面ＣＤ14を発現する安定的にトランスフェクトされた細胞は、前記したＦＩＴＣ複合抗ヒトＣＤ14ＭａｂＭＹ４で染色した細胞上のＦＡＣＳ分析を使用して確認した。ＣＤ14からの膜アンカーが除去され、崩壊促進因子（ＤＡＦ）からの膜アンカーに替わった、70Ｚ/3-hＣＤ14ＤＡＦと称するもの、ヒト組織因子からの膜アンカーに替わった、70Ｚ/3-hＣＤ14ＴＦと称するもの、およびマウスクラス分子、Ｈ２Ｋ2からの膜アンカーに替わった、70Ｚ/3-hＣＤ14ＣＩと称する、ＣＤ14融合タンパク質を発現する別のトランスフェクトされた細胞系をも調製した。
【００７２】
細胞ＣＤ14へのＬＰＳの直接結合についてＦＩＴＣ標識ＬＰＳ（ＦＩＴＣ−ＬＰＳ）を使用して特性決定した。Ｍａｂ10μg／mlを有するかまたは有しない10％ＦＣＳを含有し、37℃で30分前培養した培地に、70Ｚ/3−ＣＤ14細胞を懸濁させた。その後、ＦＩＴＣ−Ｒｅ595-ＬＰＳを１ng／mlとなるように添加し、37℃で15分保持した。その後すぐに等容量の氷冷ＲＰＭＩ1640培地を添加し、混合液をＦＡＣＳ分析まで４℃に保持した。細胞結合蛍光を上記のLee らによる記載にしたがって測定し、トランスフェクトされていない70Ｚ/3細胞を使用して測定した蛍光を差し引くことによって、測定蛍光を補正した。
【００７３】
図15に棒グラフを示すが、この結果は、細胞表面ＣＤ14タンパク質（wtまたは融合タンパク質）を含有するすべてのトランスフェクトされた細胞タイプに関し、抗ＣＤ14モノクローナル抗体ＭａｂＭＹ４（斜線）はＬＰＳの細胞への結合をブロックするが、Ｍａｂ18Ｅ12（白ぬき）はＬＰＳの細胞への結合をブロックしなかったことを示している。Ｍａｂ18Ｅ12存在下でのＦＩＴＣ−ＬＰＳ結合は抗体を使用しないで得られた結果（黒色）と同程度だった。ＭａｂＭＹ４はＣＤ14と免疫反応することが知られている抗体であるが、ここに示されたでデータによって、ＬＰＳのＣＤ14への結合を阻害し、またＬＰＳ依存性のＣＤ14が媒介する細胞の活性化を阻害することが示される。各種トランスフェクトされた細胞系において、ＦＩＴＣ−ＬＰＳ結合の程度の差異はＣＤ14発現の程度の差異を反映する。ｈＣＤ14トランスフェクト細胞は１細胞当たり約10,000のレセプターを含むが、ｈＣＤ14ＤＡＦトランスフェクト細胞は１細胞当たり約50,000のレセプターを含み、ｈＣＤ14ＴＦおよびｈＣＤ14ＣＩトランスフェクト細胞はそれぞれ１細胞当たり約15,000〜20,000のレセプターを含むと概算される。結果は３回の独立した測定の平均＋／−標準偏差として表示している。
【００７４】
Ｅ．抗ＣＤ14モノクローナル抗体を使用した、細胞のＬＰＳ依存性、ＣＤ14媒介活性化の阻害
細胞のＬＰＳによるＣＤ14媒介活性化を阻害する能力に関し、抗ＣＤ14モノクローナル抗体を特性決定した。このため、ＣＤ14トランスフェクト細胞システムを発生させ、ＬＰＳ誘導活性化に応答性があることを証明した。実施例３に記載するように、前記した数種の膜結合形態のＣＤ14を含有する数種のトランスフェクト70Ｚ/3細胞系を調製した。
【００７５】
このトランスフェクト細胞を上記 Leeらによって記載されているようにして培養し、10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；56℃で30分熱不活性化）および図16に”＋”によって示す抗体（ＭＹ４または18Ｅ12）10μg／mlを含有するＲＰＭＩ1640培地中に懸濁し、37℃で30分保持した。その後、図16に”＋”によって示すように、100μM タキソール（taxol ）またはＬＰＳ（1 ng/ml Ｒｅ595 ＬＰＳ）を添加し、37℃で15分保持した。その後、細胞を回収し、Molitor et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:10028-10032(1990)に記載されているように、ＮＦ-κＢの活性化を測定するため、核抽出物を調製した。ＮＦ-κＢの存在を検出するため、４％未変性ポリアクリルアミドゲル上でのゲル遅延検定において、二本鎖形態のＰ32標識ＮＦ-κＢ特異的オリゴヌクレオチド（5'-CAGAGGGGACTTTCCGAGA-3' ）を使用した。
【００７６】
試験の結果を図16に示すが、これによると、ＬＰＳもタキソールもＮＦ-κＢ活性化を誘導することが示される。予測されたように、ＬＰＳはＣＤ14を含まない対照トランスフェクト細胞（70Ｚ/3−ＲＳＶ）において最低のＮＦ-κＢ活性化を誘導し、ＣＤ14を発現する細胞において顕著な活性化を誘導した。このことは、ＬＰＳ誘導ＮＦ-κＢ活性化が細胞表面でＣＤ14によって媒介され、そしてＣＤ14を必要とすることを示している。さらに、これらの結果は、ＭＹ４も18Ｅ12もＬＰＳ誘導ＮＦ-κＢ発現を阻害するが、タキソール誘導ＮＦ-κＢ発現は阻害せず、これらの抗体の阻害効果がＣＤ14に特異的で依存性であることを示している。
【００７７】
ＭａｂＭＹ４および18Ｅ12でのこれらの結果は、細胞の活性化を誘導するためにはＬＰＳのＣＤ14への結合だけでは不十分で、ＬＰＳ−ＣＤ14結合に付随する相互作用が細胞の活性化のために重要であることを示している。この結果はまた、細胞のＣＤ14媒介活性化の阻害は、異なる程度で、まず誘導物質（ＬＰＳ）がＣＤ14に結合するのをブロックし、２番目に誘導物質がＣＤ14に結合した後のステップをブロックすることによって生起するらしいことを示している。またこのデータは、誘導物質がＬＰＳ以外の分子である場合に、第二段階での阻害剤の使用が、ＣＤ14媒介細胞活性化をブロックすることの確証でもある。
【００７８】
Ｆ．ＬＰＳのＣＤ14+細胞による捕捉の阻害
敗血症の進行中、ＬＰＳは細胞表面のＣＤ14に結合し、これらのＣＤ14+細胞によって捕捉されることが知られている（Kitchens,et al.,J.Exp.Med., 176:485-494,1992 ; Pugin et al.,PNAS, 90:2744-2748,1993）。Ｍａｂ28Ｃ５などの、ＬＰＳのＣＤ14への結合をブロックする抗体と、Ｍａｂ18Ｅ12などの、ＣＤ14への結合をブロックしない抗体との間の差異は、ＣＤ14+細胞によるＬＰＳ捕捉の観点によるものである。このため、抗ＣＤ14抗体のＬＰＳ捕捉を阻害する能力の特性決定をした。
【００７９】
この目的のため、各種抗ＣＤ14抗体の存在下におけるトランスフェクト70Ｚ/3-hＣＤ14細胞上へのＦＩＴＣ−ＬＰＳの捕捉を測定した。ＣＤ14+トランスフェクト細胞を37℃に保持した後、抗体を使用しないでＦＩＴＣ−ＬＰＳにさらし、細胞内部のＦＩＴＣ−ＬＰＳから発生する蛍光を検出して、通常条件下ではＬＰＳが細胞に捕捉されることを確認した。Ｍａｂ28Ｃ５の存在下では、ＬＰＳの捕捉は完全に阻害されたが、Ｍａｂ18Ｅ12の存在下では、捕捉は通常条件下で観察された量の約65％に減少しただけであった。これらの結果は、Ｍａｂ18Ｅ12はＬＰＳの捕捉を実質的に妨げないので、ＬＰＳを細胞に入り込ませることが必要な状態でのＣＤ14+細胞の活性化の阻害のために、このＭａｂ18Ｅ12が特に有用であることを示している。続く試験において、Ｍａｂ23Ｇ４の存在下では、Ｍａｂ28Ｃ５で見られたのと同様に、ＬＰＳの捕捉が阻害されることが示された。
【００８０】
ＣＤ14抗原検定（ＥＬＩＳＡ）
塗布：炭酸水素塩緩衝液中１μg/mlに希釈した抗ＣＤ14ｍＡｂ28Ｃ５ 150μl/well。４℃で一晩インキュベートした。
ブロッキング：プレートを４回洗浄した後、ブロッキング緩衝液150μl/wellを添加した。37℃で１時間インキュベートした。
【００８１】
試料：プレートを１回洗浄した後、希釈用緩衝液に希釈した試料125μl/wellを添加した。37℃で１時間インキュベートした。
【００８２】
複合体：プレートを５回洗浄した後、希釈用緩衝液中１μg/mlに希釈したビオチニル化抗ＣＤ14ｍＡｂ18Ｅ12 0.100ml/well を添加した。37℃で１時間インキュベートした。
【００８３】
Ａv-ＨＲＰＯ：プレートを５回洗浄した後、あらかじめ形成させたストレプトアビジン／ビオチン／ペルオキシダーゼ複合体 0.100 ml/wellを添加した。（ストレプトアビジン／ビオチニル化／ＨＲＰＯ調製物（Zymed SABC kit）：洗浄用緩衝液中にストレプトアビジン 2μl/mlとビオチニル化ＨＲＰＯ2μl/mlを混合し、37℃で30分インキュベートした。ウェルに添加する前に希釈用緩衝液で１：２に希釈した。）37℃で30分インキュベートした。
【００８４】
基質：プレートを５回洗浄した後、Sigma ＯＰＤ 0.100ml/well を添加し、プレートを暗所に30分放置し、4N H2SO4 0.050 mlで発色を停止させた。490 nmにおいてプレートを測定した。
【００８５】
ＣＤ14標準：100 ng/ml のクローン523 の２倍連続希釈物
血清の希釈：開始希釈率 １：25−１：50
【００８６】
各種ＥＬＩＳＡ試薬
ブロッキング用緩衝液：ＰＢＳ＋10％w/v 脱脂乾燥乳(Carnation)。
洗浄用緩衝液：ＰＢＳ＋0.05％v/v Tween 20。
希釈用緩衝液：ブロッキング用緩衝液と洗浄用緩衝液をvol/vol 混合し、試料、標識抗体および前形成複合体の希釈に使用した。
【００８７】
実施例３
モノクローナル抗体のクローニング
ここに参考として引用する、Chomczynkski and Sacchi,Anal.Bio., 162:156-159(1987)の方法を使用して、モノクローナル抗体産生細胞系から、メッセンジャーＲＮＡを抽出した。マウス特異的３" 抗体プライマー（ＩgＧ1またはｋ）を使用して逆転写を行い、その結果生成したｃＤＮＡを、ここに参考として引用する、Huse,et al.,Science,246:1274-1281(1989)に記載されたマウス特異的５’抗体プライマーの１パネルを使用して、製造者の指示にしたがって、ＰＣＲ（Supplier）に供した。重鎖および軽鎖ＤＮＡフラグメントをゲル精製し、適当な酵素で消化した。672塩基対の重鎖フラグメントをpBluescript II KS+のSpe1/Xho1 部位にクローン化し、自動 ABI Model 373A DNA シークエンサーを使用し、製造者の指示にしたがって、配列決定した。642 塩基対の軽鎖フラグメントをpBluescript II KS+のSst1/Xba 部位にクローン化し、同様の方法で配列決定した。
【００８８】
配列番号１および２は、28Ｃ５重鎖のヌクレオチドおよびこれから推定されるアミノ酸配列であり、配列番号３および４は、28Ｃ５軽鎖のヌクレオチドおよびこれから推定されるアミノ酸配列である。配列番号５および６は、18Ｅ12重鎖のヌクレオチドおよびこれから推定されるアミノ酸配列であり、配列番号７および８は、18Ｅ12軽鎖のヌクレオチドおよびこれから推定されるアミノ酸配列である（図２〜５）。図30は３Ｃ10、28Ｃ５および18Ｅ12の重鎖の比較を示すものである。配列番号25および26は、23Ｇ４軽鎖のヌクレオチドおよびこれから推定されるアミノ酸配列である（図29参照）。図29はモノクローナル抗体３Ｃ10、28Ｃ５、23Ｇ４および18Ｅ12の軽鎖のアミノ酸配列を示すものである。図30はモノクローナル抗体３Ｃ10、28Ｃ５および18Ｅ12の重鎖のアミノ酸配列を示すものである。
【００８９】
28Ｃ５および23Ｇ４は両者ともにＣＤ14へのＬＰＳ：ＬＢＰ結合をブロックし、ｓＣＤ14結合に関して互いに競合し、そして同濃度でヒト全血中のＴＮＦαの放出を妨害する（図27参照）という、共通の特異性を有するにもかかわらず、その軽鎖は共通するヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有してはいない（表２参照）ことに注目すべきである。
【００９０】
核酸の組換え発現
本発明の核酸の組換え発現を以下の一般的戦略にしたがって実施する。抗体発現ハイブリドーマ細胞からPolyＡ+ ｍＲＮＡを単離する。ｃＤＮＡ合成およびｍＲＮＡのＰＣＲ増幅を、上記の方法によって実施する。得られたｃＤＮＡ配列のデータから、例えば DNAStar（Madison,Wisconsin）から市販されているMAPSEQなどのコンピュータソフトウェアプログラムによって、このＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を推定する。
【００９１】
抗体フラグメントとして構築された発現生成物を、ハプテンもしくは抗原を利用するＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定）、またはアフィニティーカラムなどの当業界で知られた方法によって、結合親和性についてスクリーニングする（例えば、参考としてここに引用する、Skerra and Pluckthun,Science,240:1038-1041,1988,に記載）。
【００９２】
本発明を実施するのに、例えばプラスミド、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスベクター、バキュロウイルスベクターおよび酵母中で使用するベクターなどの数タイプのベクターが入手でき、使用することができる。ベクターがプラスミドの場合は、一般にプロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製起点を含む種々の成分、および当業者に知られた他の必要成分を含む。
【００９３】
原核生物ベクターにおいて最も一般的に使用されるプロモーターは、Lac Ｚプロモーター系、アルカリホスファターゼ phoＡプロモーター、バクテリオファージλＰＬプロモーター（熱感受性プロモーター）、tac プロモーター（lacリプレッサーによって調節された、ハイブリッドtrp-lac プロモーター）、トリプトファンプロモーターおよびバクテリオファージT7プロモーターを含む。
【００９４】
本発明を実施する際に使用したプロモーターは lacＺプロモーターおよび phoＡプロモーターである。 lacＺプロモーターはlac リプレッサータンパク質 lac iで調節し、この lacリプレッサータンパク質レベルを操作することによって、ポリペプチドの転写を調節できるようにする。実例をあげると、 lacＺプロモーターを含有するファージミド（phagemid）を、 lacＺプロモーターのリプレッサーである lac iリプレッサー遺伝子の１コピーを含有する細胞種中で増殖させる。lac i 遺伝子を含有する細胞系の好例として、ＪＭ 101およびＸＬ1-blueが含まれる。変法として、宿主細胞を、リプレッサーlac i と lacＺプロモーターの両方を含有するプラスミドで同時トランスフェクトすることができる。場合によっては、上記の手法の両方を同時に使用し、すなわち、 lacＺプロモーターを含有するファージミド粒子を lac i遺伝子を含有する細胞系中で増殖させ、この細胞系を lacＺおよび lac i遺伝子の両方を含有するプラスミドで同時トランスフェクトする。普通、上記のようなトランスフェクトする宿主にある遺伝子を発現させようとするとき、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）のような誘発物質を添加するが、このステップは省略してもよい。
【００９５】
本発明を実施するのに使用するベクターのもう１つの有用な成分はシグナル配列である。この配列はポリペプチドをコードする遺伝子の５’の直近に典型的に局在し、融合タンパク質のアミノ末端に転写される。しかし、ある場合には、シグナル配列が分泌されるタンパク質をコードする遺伝子の５’以外の位置に局在することが証明されている。この配列はバクテリア細胞の内膜を通って付着するタンパク質を標的とする。シグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列を有するタンパク質をコードするいずれかの遺伝子からの制限エンドヌクレアーゼフラグメントとして得ることができる。好適な原核細胞シグナル配列は、例えばＬａｍＢまたはＯｍｐＦ（ここに参考として引用する、Wong,et al.,Gene,68:193,1983）、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡをコードする遺伝子および他の遺伝子から得ることができる。本発明を実施するのに好ましい原核細胞シグナルは、ここに参考として引用する、Chang,et al.,Gene,55:189,1987 に記載されている、E.coli熱安定性エンテロトキシン II(ＳＴII）シグナル配列である。
【００９６】
本発明を実施するのに使用するベクターの、また別の有用な成分は、表現型選択遺伝子である。典型的な表現型選択遺伝子は宿主細胞に抗生物質耐性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子である。実例をあげると、アンピシリン耐性遺伝子（amp)、およびテトラサイクリン耐性遺伝子（tet）はこの目的のために容易に使用される。
【００９７】
前記の成分および必要なポリペプチドをコードする遺伝子を含む好適なベクターの構築は、標準的な組換えＤＮＡ操作を使用して調製される。組換え方法論に関する参考文献を下に示した。ベクターを形成するために組み合わせられる単離ＤＮＡフラグメントは、切断され、組合せられ、目的とするベクターを産生するように、特定の順番と方向性で連結される。
【００９８】
ＤＮＡは好適な緩衝液中で、適当な制限酵素または酵素群を使用して切断される。一般に、緩衝液約20μl中、プラスミドまたはＤＮＡフラグメント約0.2〜1μgが適当な制限酵素約１〜２単位とともに使用される。好適な緩衝液、ＤＮＡ濃度、ならびにインキュベート時間および温度は、制限酵素の製造業者によって特定されている。一般に、37℃で１または２時間のインキュベート時間で十分であるが、いくつかの酵素はもっと高温を必要とする。インキュベート後、フェノールとクロロホルムの混合物を使用した消化溶液の抽出によって、酵素および他の混入物を除去し、水性画分からエタノールでの沈殿によってＤＮＡを回収する。
【００９９】
ＤＮＡフラグメント同士を連結してある機能を有するベクターを形成させるためには、ＤＮＡフラグメントの末端が互いに適合性でなければならない。場合によっては、この末端がエンドヌクレアーゼ消化後そのまま適合し得ることもあろう。しかし、連結に適合する末端を作るためには、エンドヌクレアーゼ消化によって普通生成する付着末端をまず平滑末端に変換する必要がある。末端を平滑末端にするため、ＤＮＡを好適な緩衝液中で、４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェートの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenowフラグメント（Klenow）10単位で、15℃において少なくとも15分処理する。その後、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって、ＤＮＡを精製する。
【０１００】
ＤＮＡゲル電気泳動を使用して、切断されたＤＮＡフラグメントをサイズ別に分離し、選択する。ＤＮＡはアガロースまたはポリアクリルアミドマトリックス上で電気泳動を行なう。マトリックスの選択は分離すべきＤＮＡフラグメントのサイズによって行なわれるべきものである。電気泳動後、マトリックスから電気溶出によって、あるいは、マトリックスとして低溶融性のアガロースを使用した場合は、アガロースを溶融させ、ＤＮＡを抽出することによって、ＤＮＡを取り出す。
【０１０１】
互いに連結しようとするＤＮＡフラグメント（連結するフラグメントのそれぞれの末端が適合性となるように、あらかじめ適当な制限酵素で消化する）をおよそ同モル量づつ溶液に入れる。この溶液は他にＡＴＰ、リガーゼ緩衝液およびＤＮＡ 0.5μg当たり約10単位のＴ４ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを含む。ＤＮＡフラグメントをベクター中に連結する場合は、まずベクターを適当な制限エンドヌクレアーゼ（群）で切断することによって、線状化する。この線状化ベクターをその後アルカリホスファターゼまたはコウシ腸ホスファターゼで処理してもよい。このホスファターゼ処理によって、連結段階中のベクターの自己連結が阻止される。
【０１０２】
連結後、外来遺伝子を挿入し終えたベクターを好適なホスト細胞中に形質転換する。好適な原核宿主細胞は E.coli菌株 JM101、E.coli K12菌株 294（ATCC番号 31,446）、E.coli菌株 W3110（ATCC番号 27,325）、E.coli X1776（ATCC番号 31,537）、E.coli XL-1Blue (Stratagene)、およびE.coli Bである；しかし、HB 101、NM 522、NM 538、NM 539などのE.coliおよび原核生物の他の多くの種および属の他の多くの菌株も同様に使用することができる。上記のE.coli株に加えて、Bacillus subtilis などのバチルス、Salmonella typhimuniumまたは Serratia marcesans などの他の腸内細菌および各種Pseudomonas 種のすべてが宿主として使用し得る。
【０１０３】
原核細胞の形質転換は塩化カルシウムまたは当業者によく知られた他の方法を使用して、容易に実施される。これらの細胞を形質転換するために、エレクトロポレーション（ここで参考として引用する、Neumann,et al.,EMBO J.,1:841 1982）もまた使用することができる。形質転換された細胞は抗生物質、普通テトラサイクリン（tet）またはアンピシリン（amp）上で増殖させ、ベクター上に存在するtet および／またはamp耐性遺伝子に起因して、これらへの耐性が与えられたかどうかによって、選択される。
【０１０４】
形質転換された細胞の選択後、これらの細胞を培地中で増殖させ、その後プラスミドＤＮＡ（または外来遺伝子が挿入された他のベクター）を単離する。プラスミドＤＮＡは当業界で知られた方法を使用して単離することができる。この精製プラスミドをその後、制限地図および／またはＤＮＡ配列決定によって分析する。
【０１０５】
上に概説した操作をするため、骨髄腫（P3-653）、ハイブリドーマ（SP2/0）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、ミドリザル腎臓（COS1）およびマウス繊維芽細胞（L492）などの哺乳類細胞系がポリペプチドの発現用の好適な宿主細胞である。これらの”哺乳類”ベクターは１つのプロモーター、１つのエンハンサー、１つのポリアデニル化シグナル、シグナル配列およびジェネティシン（geneticin）（ネオマイシン耐性）、ミコフェノール酸（キサンチングアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ）またはヒスチジノール（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）などの選択性マーカーをコードする遺伝子を含んでもよい。
【０１０６】
哺乳類宿主細胞において使用する好適なプロモーターとして、Ig Kappa、Ig Gamma、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス40（ＳＶ40）初期型、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）およびメタロチオネインが含まれるが、これらに限定されるものではない。好適なエンハンサーとして、Ig Kappa、Ig Heavy、ＣＭＶ初期型およびＳＶ40が含まれるが、これに限定されるものではない。ポリアデニル化用配列には、Ig Kappa、Ig GammaまたはＳＶ40大型Ｔ抗原が含まれる。好適なシグナル配列には、Ig Kappa、Ig Heavyおよびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）が含まれる。
【０１０７】
ベクターがバキュロウイルスの場合は、好適なプロモーターおよびエンハンサーとして、AcＭＮＰＶポリヘドリン、AcＭＮＰＶＥＴＬおよびAcＭＮＰＶ p10配列が含まれるが、これに限定されるわけではない。１つの特に好適なポリアデニル化シグナルはポリヘドリンAcＭＮＰＶである。Ig Kappa、Ig HeavyおよびAcＭＮＰＶは好適なシグナル配列の例である。これらのベクター類は以下の昆虫細胞系、中でもＳＦ９、ＳＦ21およびHigh５において有用である。
【０１０８】
変法として、ポリペプチドを、ＰＳ23-6Ａ、Ｗ301-18Ａ、ＬＬ20、Ｄ234-3 、ＩＮＶＳＣ１、ＩＮＶＳＣ２、ＹＪＪ337 などの酵母菌株内で発現させることができる。gal １およびｐＥＦＴ-1などのプロモーターおよびエンハンサー配列が有用である。Vra-4 もまた好適なエンハンサー配列を提供する。機能的な”複製起点”として有用な配列にはars1および2μ環状プラスミドが含まれる。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
実施例４
in vivo でのＣＤ14抗体処置
ウサギを３日間ＩＦＮ-γ前処置した後ＬＰＳ注射すると、ウサギに敗血症状態が発症する（G.J.Jurkovich,et al.,J.Surg.Res.,51:197-203,1991）。ここに記載されたin vivo 実験と同様の処方にしたがった。ＩＦＮ-γ 5μg／kg（比活性：2.5×108unit／mg；5 μg＝1.25×106unit／mg）を３日間連続して毎日注射し、その後、基準の心臓拍出および全身血圧を確定し、ＬＰＳの８時間の注入（総用量３mg／kgまたは 375μg/kg/時間×８時間）を開始した。３日間ＩＮＦ-γの皮下注射をし、３日目に、ＬＰＳ注入開始の少なくとも１時間前に基準のデータを採った。これらの動物は実験の期間中ケタミン麻酔を続けた。ウサギの実験によると、これらの動物はＬＰＳの注入にともなって眠くなることが示唆された。同じ確定処方をサルの２つのグループにも使用した。動物に、イソタイプが一致する対照モノクローナル抗体（ＭＡｂ）またはＣＤ14ブロッキングＭＡｂのどちらかを、世話をする責任者には処置処方を報せないで、ランダムに割り当てた。ＬＰＳ注入の開始30分前に、5mg/kg/mAbの投与（イソタイプまたはＣＤ14特異性）をボーラス注射によって行なった。
【０１１１】
動物をケタミンで麻酔した後、大腿部動脈および静脈のそれぞれに、動脈および静脈カテーテルを入れた。動脈カテーテルは、心臓拍出の熱による希薄を測定するため、先端部にサーミスターを備えている。このカテーテル上の２番目の管腔部は動脈圧の測定に使用した。静脈カテーテルは、薬品および維持液の注入ならびに心臓拍出の測定の際の冷却注入のために使用した。各心臓拍出測定において、乳酸加リンゲル（3 ml）を使用した。
【０１１２】
血圧および心臓拍出を、基準期間には15分毎、その後の実験中は30分毎記録した。動脈ＰＯ2／ＰＣＯ2、pll およびタンパク質を測定するために、１時間毎に血液（3 ml）を取り出した。この同じ血液試料を全身の白血球細胞数と部分的な数の測定に使用した。ＬＰＳの注入後、これらの動物に乳酸加リンゲル液を補給した。すべての動物に補液として4 ml／kg注入し、心臓拍出を基準値の10％以内に維持するため、必要に応じて注入を増加させた。
【０１１３】
総数６匹の動物のそれぞれをIgＧ１イソタイプ対照または28Ｃ５のいずれかで前処置し、５匹の動物を18Ｅ12で前処置した。抗体の注入30分後、すべての試験動物にＬＰＳを抗原投与した。ＬＰＳ注入の72時間前から、サルにヒト組換えインターフェロンガンマ（125,000 U/kg）を、24時間間隔で３回皮下注射した。麻酔動物中のＭＡＰ値を測定するため、上記のように、大腿部動脈および静脈中に動脈および静脈カテーテルをそれぞれ入れた。
【０１１４】
ＬＰＳを抗原投与したサルの平均動脈圧（ＭＡＰ）
平均動脈圧（ＭＡＰ）の試験結果によると、28Ｃ５で前処置したものは、対照グループに共通する、特に２時間後における血圧の有意な低下が回避されたことがわかる（図17）。しかし、18Ｅ12で前処置した動物は２時間目の血圧の低下を示すが、28Ｃ５前処置動物で測定されたパーセンテージまで回復することができた。18Ｅ12の機能は、シグナル効果だけが妨害され、28Ｃ５および23Ｇ４の重要な特徴である、ＬＰＳの結合の阻害は妨害しない点で、28Ｃ５とは異なっている。機能におけるこの差異はＭＡＰ応答において見られた差異を反映すると考えられる。18Ｅ12による保護は、後のＬＰＳ誘導効果にも及ぶと考えられる。この18Ｅ12によるプロフィールは、ＬＰＳに対する生理学的応答現象（低血圧化）においても、この抗ＣＤ14ｍＡｂがイソタイプ対照処置動物において見られた有害な影響を防止することができることを示している。
【０１１５】
ＣＤ14濃度に対するＩＦＮの影響
動物に対する24時間間隔で３日間のインターフェロン−ガンマによる前処置は、ＣＤ14の濃度に対し、比較的小さい影響しか与えなかった（図18）。しかし、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）の循環量が、グラム陰性敗血症において見られる値まで有意に増加した（ＬＢＰは２つの非競合モノクローナル抗体を試料を捕捉し、プローブするのに使用したＥＬＩＳＡによって測定した）。インターフェロン−ガンマは、これらの動物において生理学的および／または生化学的変化を何らもたらさないはずのＬＰＳの投与量に対し、その動物に鋭敏な応答性を誘導し、感受性にするものと推測される。
【０１１６】
ＢＳＡの洗浄液／血漿比
ＢＳＡの洗浄液／血漿比は肺損傷の１指標であり、肺組織を透過したＢＳＡ（実験の終了時の１時間前に注射）量の目安でもある。肺は内毒素血症に影響を受ける主要な器官の１つである。ＢＳＡ値はＢＳＡ特異性モノクローナル抗体を使用したイムノアッセイによって測定した。ＢＳＡモノクローナル抗体は容易に入手できる。この場合は、28Ｃ５で前処置した動物は、対照処置動物において明らかだった肺損傷から有意に保護された（図19）。18Ｅ12処置動物はＬＰＳの影響から完全には保護されなかったが、グループとしては、対照動物よりはよかった。
【０１１７】
抗体半減期
抗体の半減期、すなわち、抗体の可溶性の循環型ＣＤ14ならびに単球および好中球上の膜結合ＣＤ14への結合による消失についての疑問が生じる。ヒト抗原を認識しないイソタイプ対照抗体と比較したところ、３つのグループすべてについて、消失速度論は等しかった（図20）。
【０１１８】
抗体処置したサルのＣＤ14値
２つの非競合モノクローナル抗体を試料の捕捉し、プローブするのに使用するＥＬＩＳＡによって、ＣＤ14を測定した。抗体のみで処置（ＬＰＳ処理はしない）したサルのＣＤ14値は、対照処置動物に比較して、28Ｃ５において有意に高かった（図21）。in vitroでの研究において、ＣＤ14産生細胞を抗ＣＤ14ｍＡｂ28Ｃ５にさらすと、ｓＣＤ14値が高くなることが明らかになってはいるが、上記の上昇の理由はわからない；多分、抗体がＧＰＩ連結タンパク質の脱離機構を強化するのであろう。18Ｅ12処置動物では36時間後に増加し、60時間目から減少し始めることが示された。抗体処置動物にＬＰＳを抗原投与したとき、28Ｃ５グループにおいて、抗体のみの動物での値以上にＣＤ14値がさらに上昇はしないので、これは明らかに抗体誘導効果であることを示めしている。
【０１１９】
ＬＢＰ値
上記のように、インターフェロン−ガンマ処置後、ＬＢＰ値が上昇する。抗ＣＤ14処置、ＬＰＳ処置動物において、対照に比較して検出ＬＢＰ値がわずかに低下する（図22）。これはＬＰＳの結合または転移のための標的が得られない場合に複合体が消失することを示すものと考えられるが、理由はわからない。
【０１２０】
ＡＬＴ／ＧＰＴ値
酵素トランスアミナーゼ、ＡＬＴ／ＧＰＴ（同種の酵素と考えられるもの）は肝機能の指標であるので、これを測定して壊死の形跡を調べた。敗血症ショックの患者においては、肝不全の開始はＭＳＯＦシンドロームの中の初期症状である。損傷の程度に応じ、ヒトにおける最大値は4000Ｕ／mlにまで達し得る。Sigma Diagnostics の試験キットの製造業者の指示にしたがって、ＡＬＴ／ＧＰＴ値を測定した。
【０１２１】
ここで記録された値はどれもヒトの極限状態で得られる範囲にはないが、実験中24時間にわたって、対照グループにおいて酵素値の上昇傾向がある。抗体のみで処置したサルにおけるＡＬＴ／ＧＰＴの正常値は平均で18Ｕ／ml（Ｔ＝０）〜52.2Ｕ／ml（Ｔ＝24）の範囲であり、試験中使用した麻酔（ケタミン）に起因したＴ＝24における上昇があった。２つの抗ＣＤ14処置グループは同様の経過をたどった；平均で16.5Ｕ／ml（Ｔ＝０）〜64.6Ｕ／ml（Ｔ＝24）。対照グループの平均は22.8Ｕ／ml（Ｔ＝０）〜98Ｕ／ml（Ｔ＝24）だった。24時間の経過では、対照グループの動物中での上昇が続くかどうかを決めることができないと思われる（図23）。
【０１２２】
可溶性Ｅセレクチン値
ＣＤ14レセプターのブロッキングが内皮細胞からの可溶性Ｅセレクチンの放出を阻止するかどうかを決定するため、Parameter ＥＬＩＳＡキット（British Biotechnology Products,Ltd. ）によって、可溶性Ｅセレクチン値を測定した。内皮細胞表面でのＥセレクチンの発現はこれらの細胞の活性化の指標であり、ＴＮＦ、ＩＬ-1またはＬＰＳ刺激の結果生じる。可溶性Ｅセレクチン値は、24時間後、すべてのグループにおいて同レベルまで上昇した（図24）。
【０１２３】
ＩＬ-1、ＩＬ-6、ＩＬ-8およびＴＮＦ値
全グループの動物において、QuantikineTMキット(R&DSystems）を使用して製造業者の仕様書にしたがって、ＬＰＳ抗原投与に応答したサイトカインを評価した。検定は固相ＥＬＩＳＡ形式でのイムノアッセイである。ＴＮＦα検定はBiokine （登録商標）酵素イムノアッセイキット（Ｔ細胞診断用）で、製造業者の仕様書にしたがって実施した。ＴＮＦαおよびＩＬ-1βはＬＰＳ刺激の結果として誘導される炎症性応答の重要な媒介体であることが知られている。抗ＣＤ14処置グループにおいては、対照処置グループに対し、ＴＮＦαおよびＩＬ-1β応答が減少し、18Ｅ12がこれらの炎症性サイトカインの発現の最低値を示した。また、抗ＣＤ14グループの両方において、ＴＮＦ応答のピークが１時間遅くなった。この知見の意味は今のところわからない（図25）。
【０１２４】
ヒト敗血症におけるＩＬ-1、ＩＬ-6およびＩＬ-8のピークはＴＮＦより遅れることが知られており、これはＩＬ-1、ＩＬ-6およびＩＬ-8の放出がＴＮＦの産生に大きく依存するという知見に一致する。グラム陰性敗血症と診断されたヒトにおける死亡率に関連するとされてきたサイトカインの１つはＩＬ-6値の上昇である。ＩＬ-6は組織損傷に対する宿主の各種の面での防御を調整する。この場合のモデルにおいては、ＬＰＳへの応答において、28Ｃ５が最低のＩＬ-6値を示した。18Ｅ12で前処置された動物も、対照グループよりも低い値を有していたが、28Ｃ５ほど低くはなかった。ＩＬ-8応答は抗ＣＤ14グループの中ではそれほど低くはなかったが、わずかに低下した（図26）。ヒヒモデルにおけるＩＬ-8値はＴＮＦ値に関連性があることが示された；ＴＮＦが減少した結果、ＩＬ-8が減少した。ＩＬ-8は化学誘引物質および顆粒球活性化作用を有する。抗ＣＤ14処置グループにおいて見られたような、天然のＩＬ-8応答をなるべく保存することが、これらのＬＰＳへの宿主の応答の重要な媒介体を完全なままに保つことになるようである。
【０１２５】
配列の要約
配列番号１：28Ｃ５重鎖の核酸および推定アミノ酸配列
配列番号２：28Ｃ５重鎖の推定アミノ酸配列
配列番号３：28Ｃ５軽鎖の核酸および推定アミノ酸配列
配列番号４：28Ｃ５軽鎖の推定アミノ酸配列
配列番号５：18Ｅ12重鎖の核酸および推定アミノ酸配列
配列番号６：18Ｅ12重鎖の推定アミノ酸配列
配列番号７：18Ｅ12軽鎖の核酸および推定アミノ酸配列
配列番号８：18Ｅ12軽鎖の推定アミノ酸配列
配列番号９：ヒト可溶性ＣＤ14レセプターをコードする核酸配列
配列番号10：３Ｃ10重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号11：３Ｃ10重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号12：３Ｃ10重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号13：28Ｃ５重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号14：28Ｃ５重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号15：28Ｃ５重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号16：３Ｃ10軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号17：３Ｃ10軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号18：３Ｃ10軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号19：28Ｃ５軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号20：28Ｃ５軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号21：28Ｃ５軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号22：23Ｇ４軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号23：23Ｇ４軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号24：23Ｇ４軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号25：23Ｇ４軽鎖のアミノ酸配列
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表される重鎖と配列番号４で表される軽鎖を含むモノクローナル抗体２８Ｃ５と同じ結合特異性を有するモノクローナル抗体又は生物学的に活性な抗体断片。
【請求項２】
配列番号１３で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で表される重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５で表される重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１９で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０で表される軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号２における１〜１１３残基で表される重鎖可変領域と、配列番号４における１〜１０７残基で表される軽鎖可変領域を含む請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
配列番号２で表される重鎖と配列番号４で表される軽鎖を含む請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
マウス又はヒトの請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又は（Ｆａｂ’）２から選択される請求項１に記載の生物学的に活性な抗体断片。
【請求項７】
請求項１に記載のモノクローナル抗体又は抗体断片をコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１３６４が付されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体２８Ｃ５の可変領域を含むキメラ抗体。
【請求項１１】
配列番号２の１〜１１３残基で表される重鎖可変領域と配列番号４における１〜１０７残基で表される軽鎖可変領域を含む請求項１０に記載のキメラ抗体。
【請求項１２】
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１３６４が付されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体２８Ｃ５のＣＤＲを含むＣＤＲグラフト抗体。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＣＤＲグラフト抗体であって、配列番号１３で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で表される重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５で表される重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１９で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０で表される軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１で表される軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤＲグラフト抗体。
【請求項１】
配列番号２で表される重鎖と配列番号４で表される軽鎖を含むモノクローナル抗体２８Ｃ５と同じ結合特異性を有するモノクローナル抗体又は生物学的に活性な抗体断片。
【請求項２】
配列番号１３で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で表される重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５で表される重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１９で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０で表される軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号２における１〜１１３残基で表される重鎖可変領域と、配列番号４における１〜１０７残基で表される軽鎖可変領域を含む請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
配列番号２で表される重鎖と配列番号４で表される軽鎖を含む請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
マウス又はヒトの請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又は（Ｆａｂ’）２から選択される請求項１に記載の生物学的に活性な抗体断片。
【請求項７】
請求項１に記載のモノクローナル抗体又は抗体断片をコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１３６４が付されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体２８Ｃ５の可変領域を含むキメラ抗体。
【請求項１１】
配列番号２の１〜１１３残基で表される重鎖可変領域と配列番号４における１〜１０７残基で表される軽鎖可変領域を含む請求項１０に記載のキメラ抗体。
【請求項１２】
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１３６４が付されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体２８Ｃ５のＣＤＲを含むＣＤＲグラフト抗体。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＣＤＲグラフト抗体であって、配列番号１３で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で表される重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５で表される重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１９で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０で表される軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１で表される軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤＲグラフト抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【公開番号】特開２００９−２７８９７９（Ｐ２００９−２７８９７９Ａ）
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４６８１９（Ｐ２００９−１４６８１９）
【出願日】平成２１年６月１９日（２００９．６．１９）
【分割の表示】特願２００８−３９１９２（Ｐ２００８−３９１９２）の分割
【原出願日】平成６年５月２７日（１９９４．５．２７）
【出願人】（５０３０７０１８８）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１９日（２００９．６．１９）
【分割の表示】特願２００８−３９１９２（Ｐ２００８−３９１９２）の分割
【原出願日】平成６年５月２７日（１９９４．５．２７）
【出願人】（５０３０７０１８８）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (5)
【Ｆターム（参考）】
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