本出願は、ＣＮＳにおけるイズロン酸 ２−スルファターゼ欠乏症を患っている対象を治療するための方法および組成物を提供する。該方法は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する抗体およびイズロン酸 ２−スルファターゼを含む二機能性の融合抗体の全身投与を含む。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２００９年１０月９日に出願された米国仮出願第６１／２５０，３７８号、および２００９年１０月２９日に出願された米国仮出願第６１／２５６，０４９号の利益を主張するものであって、両出願はそれらの全体において参照することによって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩ型は、ハンター症候群としても知られており、ムコ多糖を分解する機能を果たす酵素イズロン酸 ２−スルファターゼ（ＩＤＳ）の欠損に起因する遺伝性代謝疾患である。不十分なレベルのＩＤＳは、例えば、心臓、肝臓、および中枢神経系（ＣＮＳ）において、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の病理学的蓄積を引き起こす。神経変性および精神遅滞を含む症状が小児期に現れる；さらに、脳内の臓器障害に起因して、早期死亡が起こりえる。典型的には、治療は組換えＩＤＳによる静脈内酵素補充療法を含む。しかしながら、全身投与された組換えＩＤＳは血液脳関門（ＢＢＢ）を通過せず、それゆえＣＮＳにおける疾患の作用に対してほとんど影響がない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の概略
本明細書は、イズロン酸 ２−スルファターゼ（「ＩＤＳ」）欠乏症を患っている対象を治療するための方法および組成物を記載している。本明細書で提供する組成物は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる構造（例えば、抗体、免疫グロブリン）と融合したＩＤＳポリペプチドを含む融合抗体を含む。いくつかの実施態様では、ＢＢＢを通過することができる構造は、内在性ＢＢＢ受容体上でＢＢＢを通過する。いくつかの実施態様では、内在性ＢＢＢ受容体はインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびＩＧＦ受容体である。いくつかの実施態様では、内在性ＢＢＢ受容体はインスリン受容体である。いくつかの実施態様では、該方法は、二機能性のヒトインスリン受容体抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ）−ＩＤＳ融合抗体の治療的有効量を全身投与することによって、ＣＮＳへのＩＤＳの送達を可能にする。いくつかの実施態様では、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体はインスリン受容体の細胞外ドメインに結合し、血液脳関門（「ＢＢＢ」）を越えてＣＮＳ内へ輸送され、一方で、イズロン酸 ２−スルファターゼ活性を保持している。いくつかの実施態様では、ＨＩＲ ＡｂはＢＢＢ上の内在性インスリン受容体に結合し、分子的トロイの木馬として作用し、ＩＤＳを脳内へ運ぶ。全身投与のためのＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体の治療的に有効な全身投与量（systemic dose）は、本明細書に記載されているように、部分的には、末梢血からの融合抗体の特異的ＣＮＳ取り込み特性に基づいている。
【０００４】
いくつかの実施態様では、本発明は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる構造（例えば、免疫グロブリン、抗体）と共有結合しているＩＤＳを含有する組成物であって、該構造およびＩＤＳが、それぞれ独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持している組成物を提供する。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも約１０％を保持している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％を保持している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも３０％を保持している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも４０％を保持している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも５０％を保持している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも６０％を保持している。
【０００５】
いくつかの実施態様では、ＩＤＳを含む融合抗体は、スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）によって翻訳後修飾されている。いくつかの実施態様では、翻訳後修飾はシステインをホルミルグリシンへ変換することを含む。いくつかの実施態様では、融合抗体はホルミルグリシン残基を含む。
【０００６】
１つの態様では、本明細書は、治療を必要とする対象の中枢神経系におけるＩＤＳ欠乏症を治療する方法であって、ＩＤＳ活性を有する融合抗体の治療的有効量を対象に全身投与することを含む方法を提供する。本態様のいくつかの実施態様では：（ｉ）融合抗体は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列、ＩＤＳのアミノ酸配列、および免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）融合抗体は、ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに結合し、かつ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸またはヘパリンのＬ−イズロン酸 ２−硫酸（L-iduronate 2-sulfate）単位の２−硫酸基の加水分解を触媒し；かつ、（ｉｉｉ）ＩＤＳのアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。いくつかの実施態様では、免疫グロブリン重鎖はＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である。いくつかの実施態様では、免疫グロブリン重鎖はκクラスの免疫グロブリン重鎖である。
【０００７】
いくつかの実施態様では、少なくとも約２５０，０００ユニットのＩＤＳ活性が脳に送達されるが、ここで蛍光定量的アッセイを用いると１ユニット＝１ｎｍｏｌ／ｈｒである。いくつかの実施態様では、融合抗体の治療的有効量は、少なくとも約２.５ｘ１０^６ユニットのＩＤＳ活性または少なくとも約５０，０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの実施態様では、融合抗体のＩＤＳ比活性は少なくとも３０，０００ユニット／ｍｇである。いくつかの実施態様では、全身投与は非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、動脈内投与、経皮投与、または呼吸器投与である。いくつかの実施態様では、体重５０ｋｇ当たり標準化された（normalized per 50 kg body weight）、少なくとも約２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１６０，０００、１７０，０００、１８０，０００、１９０，０００、２００，０００、２１０，０００、２２０，０００、２３０，０００、２５０，０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性が脳に送達される。いくつかの実施態様では、体重５０ｋｇ当たり標準化された、少なくとも約２５，０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性が脳に送達される。
【０００８】
いくつかの実施態様では、融合抗体はキメラ抗体である。
【０００９】
いくつかの実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、最大４個の単一アミノ酸変異を有する配列番号１のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、最大６個の単一アミノ酸変異を有する配列番号２のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、または最大３個の単一アミノ酸変異を有する配列番号３のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含み、ここで単一アミノ酸変異は置換、欠失、または挿入である。
【００１０】
他の実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、最大３個の単一アミノ酸変異を有する配列番号１のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、最大６個の単一アミノ酸変異を有する配列番号２のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、および最大３個の単一アミノ酸変異を有する配列番号３のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む。
【００１１】
他の実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、または配列番号３のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む。
【００１２】
さらなる実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む。
【００１３】
いくつかの実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、最大３個の単一アミノ酸変異を有する配列番号４のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、最大５個の単一アミノ酸変異を有する配列番号５のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、または最大５個の単一アミノ酸変異を有する配列番号６のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含み、ここで単一アミノ酸変異は置換、欠失、または挿入である。
【００１４】
他の実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、最大３個の単一アミノ酸変異を有する配列番号４のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、最大５個の単一アミノ酸変異を有する配列番号５のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、および最大５個の単一アミノ酸変異を有する配列番号６のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む。
【００１５】
他の実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、または配列番号６のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む。
【００１６】
さらなる実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む。
【００１７】
いくつかの実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含み；かつ、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む。
【００１８】
いくつかの実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は配列番号７と少なくとも９０％同一であり、かつ、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８と少なくとも９０％同一である。
【００１９】
いくつかの実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は配列番号７を含み、かつ、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８を含む。
【００２０】
さらなる実施態様では、ＩＤＳは配列番号９と少なくとも９０％（例えば、９５％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００２１】
他の実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７と少なくとも９０％同一であり；免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８と少なくとも９０％同一であり；かつ、ＩＤＳのアミノ酸配列は配列番号９と少なくとも９５％同一であるか、または配列番号９を含む。
【００２２】
さらに他の実施態様では、融合抗体の免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列は配列番号８を含み、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８を含み、かつ、ＩＤＳのアミノ酸配列は配列番号９を含む。
【００２３】
いくつかの態様では、本明細書は、融合抗体の治療的有効量および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
いくつかの態様では、本明細書は、融合抗体をコードしている単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは配列番号１４の核酸配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施態様では、本明細書は、融合抗体をコードしている単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施態様では、ベクターは配列番号１４の核酸配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施態様では、本明細書は、融合抗体をコードしている単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様では、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）である。
【００２７】
さらなる態様では、本明細書は、治療を必要とする対象の中枢神経系におけるＩＤＳ欠乏症を治療する方法であって、ＩＤＳ活性を有する融合抗体の治療的有効量を対象に全身投与することを含む方法であって、（ｉ）融合抗体が：（ａ）配列番号１０と少なくとも９５％同一の融合タンパク質、および（ｂ）免疫グロブリン軽鎖を含み；かつ、（ｉｉ）融合抗体がヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに結合し、かつ、デルマタンまたはヘパラン硫酸における結合の加水分解を触媒する、方法を提供する。
【００２８】
さらに別の態様では、本明細書は、治療を必要とする対象の中枢神経系におけるＩＤＳ欠乏症を治療する方法であって、ＩＤＳ活性を有する融合抗体の治療的有効量を対象に全身投与することを含む方法であって、
（ｉ）融合抗体が免疫グロブリン重鎖およびＩＤＳのアミノ酸配列を含有する融合タンパク質を含むか、または免疫グロブリン軽鎖およびＩＤＳのアミノ酸配列を含有する融合タンパク質を含み；融合抗体がヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに結合し；かつ、融合抗体がデルマタンまたはヘパラン硫酸における結合の加水分解を触媒し；かつ、（ｉｉ）ＩＤＳのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している、方法を提供する。
【００２９】
参照による援用
本明細書中で言及されている全ての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が参照することによって援用されることを具体的かつ個々に示されている場合と同一の範囲まで、参照することによって本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲にて詳細に説明されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用されている実例となる実施態様を説明する下記の詳細な記載、および下記の通り説明される添付の図面を参照することにより得られるであろう：
【００３１】
【図１】ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに対する代表的なヒトインスリン受容体抗体に由来する、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列可変領域。下線を引いた配列は、それぞれシグナルペプチド、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。ヒトＩｇＧ１から採取した重鎖定常領域は、イタリック体で示している。
【００３２】
【図２】ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに対する代表的なヒトインスリン受容体抗体に由来する、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列可変領域。下線を引いた配列は、それぞれシグナルペプチド、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。ヒトκ軽鎖に由来する定常領域は、イタリック体で示している。
【００３３】
【図３】ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに対する代表的なヒトインスリン受容体抗体の重鎖および軽鎖に由来する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を示す表。
【００３４】
【図４】最初の２５個のアミノ酸のシグナルペプチドを含まないヒトイズロン酸 ２−スルファターゼ（ＩＤＳ）（成熟ＩＤＳ）のアミノ酸配列（ジェンバンクＮＰ_０００１９３）。
【００３５】
【図５】代表的なヒトインスリン受容体抗体重鎖と成熟ヒトＩＤＳの融合のアミノ酸配列。下線を引いた配列は、順にＩｇＧシグナルペプチド、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、および重鎖のカルボキシ末端とＩＤＳのアミノ末端を結合するペプチドリンカーである。イタリック体の配列は、ヒトＩｇＧ１から採取した重鎖定常領域に相当する。太字の配列は、ヒトＩＤＳに相当する。
【００３６】
【図６】代表的なＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体は、成熟ＩＤＳのアミノ末端とＨＩＲ Ａｂの重鎖のＣＨ３領域のカルボキシル末端の融合によって形成される。
【００３７】
【図７】融合抗体が分子的トロイの木馬（ＴＨ）として作用する、ヒトインスリン受容体（ＩＲ）の細胞外ドメインに対する抗体、およびリソソーム酵素（Ｅ）であるＩＤＳを含む、「分子的トロイの木馬」戦略の模式図。
【００３８】
【図８】（Ａ）ヒト肝臓ｃＤＮＡ、およびＩＤＳ特異的プライマー（表２）によるＰＣＲによって作製された、ヒトＩＤＳ ｃＤＮＡのアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色（レーン１）。レーン２および３：ＰｈｉＸ１７４ ＨａｅＩＩＩ消化ＤＮＡスタンダード、およびλＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡスタンダード。（Ｂ）ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の重鎖はｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳプラスミドによって発現され、ここで該プラスミドはｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＨＣプラスミドのＨｐａＩ部位にＩＤＳ ｃＤＮＡをサブクローニングすることによって作製される。
【００３９】
【図９】分子量標準（ＳＴＤ）、精製ＨＩＲＭＡｂ、および精製ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【００４０】
【図１０】抗ヒト（ｈ）ＩｇＧ一次抗体（Ａ）または抗ヒトＩＤＳ一次抗血清（Ｂ）でのウエスタンブロット。ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の免疫反応性をキメラＨＩＲＭＡｂおよび組換えヒトＩＤＳと比較している。ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質およびＨＩＲＭＡｂは、いずれも抗ｈＩｇＧウエスタン上に同一の軽鎖を有している。ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合重鎖は抗ｈＩｇＧおよび抗ヒトＩＤＳ抗体の両方と反応するが、一方、ＨＩＲＭＡｂ重鎖は抗ｈＩｇＧ抗体のみと反応する。ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合重鎖のサイズ１３０ｋＤａは、ＨＩＲＭＡｂの重鎖のサイズよりも約８０ｋＤａ大きいが、これは８０ｋＤａのＩＤＳと５０ｋＤａのＨＩＲＭＡｂ重鎖の融合によるものである。
【００４１】
【図１１】キメラＨＩＲＭＡｂまたはＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質とＨＩＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の結合は、飽和性（saturable）である。ＨＩＲ ＥＣＤへのＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ結合のＥＤ_５０は、キメラＨＩＲＭＡｂの結合のＥＤ_５０に匹敵する。
【００４２】
【図１２】（Ａ）ＩＤＳ酵素活性の２ステップ酵素蛍光定量的アッセイの基質（４−ＭＵＳ）、中間体（ＭＵＢＩ）、および生成物（４−ＭＵ）。（Ｂ）蛍光定量的ユニット（ＦＵ）は精製ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の質量に比例し、融合タンパク質の平均酵素比活性は５１±７ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｕｇタンパク質であるが、これは５１ユニット／ｕｇタンパク質、または５１，０００ユニット／ｍｇタンパク質に等しい。
【００４３】
【図１３】ハンター症候群の線維芽細胞（Hunter fibroblasts）において、細胞内ＩＤＳ酵素活性は、培地の（medium）ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の濃度に比例して増加する。データは平均値±標準誤差（ｎ＝３ディッシュ／ポイント）である。水平バーは健常なヒト線維芽細胞におけるＩＤＳ酵素活性である（平均値±標準偏差）。
【００４４】
【図１４】培地中の０.３ｕｇ／ｍＬのＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の１回処理による、ハンター症候群の線維芽細胞（Hunter fibroblasts）におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）蓄積の好転。健常なヒト線維芽細胞における^３５Ｓ取り込みと比較して、ＧＡＧ蓄積の８４％減少が見られる（ｐ＜０.０００５）。データは平均値±標準誤差である（ｎ＝４ディッシュ／ポイント）。
【００４５】
【図１５】重鎖（ＨＣ）融合遺伝子、軽鎖（ＬＣ）遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、およびｎｅｏ遺伝子をコードしている４つに分離したタンデム発現カセットをコードしている、遺伝子組換えタンデムベクター（ＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ）。
【００４６】
【図１６】代表的なＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合抗体の免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）領域のヌクレオチド配列。
【００４７】
【図１７】代表的なＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合抗体の免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）領域のヌクレオチド配列。
【００４８】
【図１８】代表的なＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合抗体のＤＨＦＲ領域のヌクレオチド配列。
【００４９】
【図１９】代表的なＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合抗体の免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）領域のアミノ酸配列。
【００５０】
【図２０】代表的なＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合抗体のＤＨＦＲ領域のアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
発明の詳細な記載
イントロダクション
血液脳関門（ＢＢＢ）は、全身投与されたＩＤＳ（例えば、組換えＩＤＳ）の中枢神経系への送達に対する深刻な障害である。本開示は、治療的に有意なレベルのＩＤＳ活性を、ＢＢＢを越えてＣＮＳに送達するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施態様では、ＩＤＳはＢＢＢを通過することができるように修飾されている。いくつかの実施態様では、全身投与された修飾ＩＤＳのＣＮＳ内への取り込みの量および速度が提供される。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは修飾後またはＢＢＢ通過後に特定の活性を保持している。本開示は、とりわけ、以下を提供する：（１）ＢＢＢを通過することができる免疫グロブリン（重鎖または軽鎖）に（介在配列を介して、または介さずに）融合したＩＤＳを含むＩＤＳ融合抗体、ならびに関連する方法および組成物；（２）ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに対する免疫グロブリン（重鎖または軽鎖）に（介在配列を介して、または介さずに）融合したＩＤＳを含むヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）抗体（Ａｂ）−ＩＤＳ融合抗体、ならびに関連する方法および組成物；（３）ＩＤＳ欠乏症を治療する方法；ならびに（４）治療的に有効な融合抗体の全身投与量（systemic doses）を、ＣＮＳにおけるそれらの取り込みおよびそれらの比活性の特徴付けに基づいて確立する方法。いくつかの実施態様では、本発明は、ＩＤＳ活性を有し、かつ、受容体媒介ＢＢＢ輸送系（例えば、ヒトインスリン受容体の細胞外ドメイン）に選択的に結合する二機能性のＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）の治療的有効量を、治療を必要とする対象に全身投与することによって中枢神経系におけるＩＤＳ欠乏症を治療する組成物および方法を提供する。
【００５２】
いくつかの定義
本明細書で用いられている「治療」または「治療すること」は、治療効果および／または予防効果を達成することを含む。治療効果は、治療されている基礎的な障害または状態の根絶または改善を意味する。例えば、ハンター症候群を患っている個体において、治療効果は障害の進行の部分的もしくは完全な停止、または障害の部分的もしくは完全な好転を含む。また、治療効果は、基礎的な状態と関連する生理的または心理的症状の１つ以上の根絶または改善と共に達成されるため、患者が依然として該状態を患っている可能性があるという事実にもかかわらず、患者に改善が観察される。治療の予防効果は、状態の予防、状態の進行の遅延（例えば、リソソーム蓄積症の進行の遅延）、または状態の発生の可能性の減少を含む。本明細書で用いられている「治療すること」または「治療」は、予防を含む。
【００５３】
本明細書で用いられている用語「有効量」は、全身投与された場合に、ＣＮＳにおいて有利な、または所望の結果、例えば有利な、もしくは所望の臨床結果、もしくは認知、記憶、気分の上昇、または他の所望のＣＮＳ結果を達成するために十分な量であってよい。有効量は、予防効果を生じる量でもあり、例えば、病理学的状態または望ましくない状態の出現を遅延、減少、または除去する量である。該状態は、限定されるものではないが、精神遅滞、難聴、および神経変性を含む。有効量は１つ以上の投与にて投与されてよい。治療に関して、本発明の組成物の「有効量」は、障害、例えば神経障害の進行を緩和、改善、安定化、逆転または遅延させるために十分な量である。「有効量」は、単独で、または疾患もしくは障害を治療するために用いられる１つ以上の薬剤と併用して用いられる本発明の組成物のいずれかの量であってよい。本発明の意味の範囲内にある治療薬の「有効量」は、患者の主治医または獣医師によって決定される。該量は当業者によって容易に特定され、本発明に従って投与された場合に治療効果を示すであろう。治療的有効量がどの程度の量になるかに影響する因子は、投与されるＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）のＩＤＳ比活性、その吸収特性（例えば、その脳内への取り込み速度）、障害の開始からの経過時間、ならびに治療されている個体の年齢、身体的状態、他の疾患状態の存在、および栄養状態を含む。さらに、患者が摂取している可能性がある他の薬物は、投与される治療薬の治療的有効量の決定に影響するであろう。
【００５４】
本明細書で用いられている「対象」または「個体」は動物、例えば哺乳類である。いくつかの実施態様では、「対象」または「個体」はヒトである。いくつかの実施態様では、対象はムコ多糖症ＩＩ型（「ハンター症候群」）を患っている。
【００５５】
いくつかの実施態様では、ＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体）を含む薬理組成物は、「末梢投与される（administered peripherally）」か、または「末梢投与される（peripherally administered）」。本明細書で用いられているこれらの用語は、ＣＮＳへの直接投与ではない、すなわち、薬剤を血液脳関門の非脳側と接触させる、個体への薬剤、例えば治療薬のいずれかの投与形態を指す。本明細書で用いられている「末梢投与」は、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、吸入による投与、経頬投与、鼻腔内投与、直腸投与、経口投与、非経口投与、舌下投与、または経鼻投与を含む。
【００５６】
本明細書の「医薬的に許容される担体」または「医薬的に許容される賦形剤」は、それ自体、組成物を摂取している個体に有害な抗体の産生を誘発しないいずれかの担体を指す。該担体は当業者に周知である。医薬的に許容される担体／賦形剤の徹底的な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, AR, ed., 20th edition, 2000: Williams and Wilkins PA, USA.に見ることができる。代表的な医薬的に許容される担体は塩、例えば鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩等；ならびに有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、および安息香酸塩等を含んでよい。例えば、本発明の組成物は液体形態にて提供されてよく、０.０１〜１％のポリソルベート−８０等の界面活性剤、または炭水化物添加剤、例えばマンニトール、ソルビトール、もしくはトレハロースを含む、または含まない、様々なｐＨ（５〜８）の生理食塩水ベースの水溶液に製剤化されてよい。通常用いられる緩衝液は、ヒスチジン緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液を含む。
【００５７】
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入に用いられる方法にかかわらず、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ接合、または組換え宿主細胞を作製するための当該技術分野で周知の他の方法が用いられたか否かにかかわらず、外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外因性ポリヌクレオチドは組み込まれていない（nonintegrated）ベクター、例えばプラスミドとして維持されてよく、あるいは宿主ゲノムに組み込まれていてよい。
【００５８】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指す用語として本明細書で互換的に用いられている。すなわち、ポリペプチドに向けられた記載はペプチドの記載およびタンパク質の記載に同様に適用され、逆もまた同様である。該用語は、天然のアミノ酸ポリマー、および１つ以上のアミノ酸残基が非天然のアミノ酸、例えばアミノ酸類似体であるアミノ酸ポリマーに適用する。本明細書で用いられている該用語は、アミノ酸残基が共有結合性のペプチド結合によって結合している、全長タンパク質（すなわち、抗原）を含むいずれかの長さのアミノ酸鎖を包含する。
【００５９】
用語「アミノ酸」は、天然および非天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣薬を指す。天然にコードされているアミノ酸は、２０種の通常のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）、ピロリジン（pyrolysine）およびセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同一の基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、およびメチオニンメチルスルホニウム等を指す。該類似体は修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同一の基本的な化学構造を保持している。
【００６０】
アミノ酸は、それらの通常知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）によって推奨されている１文字記号のいずれかによって本明細書で言及されるであろう。同様に、ヌクレオチドは、それらの通常許容されている１文字コードによって言及されるであろう。
【００６１】
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、および１本鎖または２本鎖形態のいずれかであるそのポリマーを指す。特に限定しない限り、該用語は基準核酸と類似の結合特性を有し、かつ、天然ヌクレオチドと類似の様式で代謝される天然ヌクレオチドの周知の類似体を含有する核酸を包含する。特に限定しない限り、該用語はＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術で用いられるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、およびホスホロアミデート等）を含むオリゴヌクレオチド類似体も指す。特に示さない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列のみならず、その保存的に修飾された変異体（限定されるものではないが、縮重コドン置換を含む）および相補的配列も黙示的に包含する。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成されうる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびCassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【００６２】
用語「単離された」および「精製された」は、その自然環境から実質的または本質的に除去され、または濃縮された物質を指す。例えば、単離された核酸は、通常はそれに隣接している核酸またはサンプル中の他の核酸もしくは成分（タンパク質、脂質等）から分離されたものであってよい。別の例では、その自然環境から実質的に除去され、または濃縮されている場合、ポリペプチドは精製されている。核酸およびタンパク質の精製および単離のための方法は、当該技術分野で周知である。
【００６３】
血液脳関門
いくつかの実施態様では、本発明は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができるＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）を利用する組成物および方法を提供する。該組成物および該方法は、ＩＤＳを末梢血から血液脳関門を越えてＣＮＳ内へ輸送するのに有用である。本明細書で用いられている「血液脳関門」は、末梢循環と脳および脊髄の間の関門を指し、脳毛細血管内皮血漿膜内の密着結合によって形成され、脳内への分子の輸送を制限する非常に密着した関門を作り出す；ＢＢＢは非常に密着しているため、分子量６０Ｄａの尿素のような小分子でさえ制限することができる。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門、および網膜内の血液網膜関門は、中枢神経系（ＣＮＳ）内にある近接した毛細血管関門であり、まとめて血液脳関門またはＢＢＢとして言及される。
【００６４】
ＢＢＢは、脳およびＣＮＳのための新たな神経治療、診断法、および研究道具の開発を制限するものである。ほとんどの治療用の巨大分子（large molecule therapeutics）、例えば組換えタンパク質、アンチセンス薬、遺伝子医薬、精製抗体、またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ベースの薬物等は、薬理学的に有意な量にてＢＢＢを通過しない。一般的に小分子薬物はＢＢＢを通過することができると想定されているが、実際には、ＢＢＢを越えた輸送が不十分であるために、全小分子薬物の＜２％のみが脳内で活性を有する。薬理学的に有意な量にてＢＢＢを通過するために、分子は脂溶性かつ分子量４００ダルトン（Ｄａ）未満でなければならないが、小分子の大部分はこれらの二重の分子特性を有さない。それゆえ、ほとんどの潜在的な治療用、診断用、または研究用分子は、薬理学的活性量にてＢＢＢを通過しない。ＢＢＢをバイパスするために、侵襲性の経頭蓋薬物送達戦略、例えば脳室内（ＩＣＶ）注入、脳内（ＩＣ）投与、および対流増強拡散（convection enhanced diffusion）（ＣＥＤ）等が用いられる。脳への経頭蓋薬物送達は高価で、侵襲性で、かつ、大部分は無効である。ＩＣＶ経路はＩＤＳを脳の上衣表面にのみ送達し、脳実質内へは送達しないが、これはＩＣＶ経路によって与えられた薬物に典型的である。ＩＤＳ等の酵素のＩＣ投与は、脳内でのタンパク質拡散の非常に低い効率のために、局所送達のみを提供する。ＣＥＤは脳の白質路を通る優先的な流体の流れをもたらし、脱髄およびアストログリオーシスを引き起こす。
【００６５】
本明細書に記載されている方法は、ＢＢＢをバイパスするためのこれらの高度に侵襲性かつ一般的に不十分な方法の代替手段を提供し、本明細書に記載されているＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）組成物の全身投与後に、機能性ＩＤＳが末梢血からＢＢＢを通過してＣＮＳ内へ至ることを可能にする。本明細書に記載されている方法は、ＢＢＢ上のインスリン受容体（例えば、ヒトインスリン受容体）または他の受容体の発現を利用し、所望の二機能性のＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）を末梢血からＣＮＳ内へ往復させる（shuttle）。
【００６６】
内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系
ＢＢＢは、いくつかの巨大分子の血液から脳への輸送を可能にする特異的受容体を有することが示されている；これらの輸送体は、本発明の組成物のための輸送体として適している。本発明に有用な内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系は、インスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子１および２（ＩＧＦ１およびＩＧＦ２）、レプチン、ならびにリポタンパク質を輸送するものを含む。いくつかの実施態様では、本発明は、内在性インスリンＢＢＢ受容体媒介輸送系、例えば、ヒト内在性インスリンＢＢＢ受容体媒介輸送系を経由してＢＢＢを通過することができる構造（例えば、免疫グロブリン、抗体）を利用する。いくつかの実施態様では、ＢＢＢを通過することができる構造（例えば、免疫グロブリン、抗体）は、以下の１つ以上のための受容体に結合することによってＢＢＢを通過する：インスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子１および２（ＩＧＦ１およびＩＧＦ２）、レプチン、ならびに／またはリポタンパク質。
【００６７】
ＢＢＢは、いくつかの巨大分子の血液から脳への輸送を可能にする、インスリン受容体を含む特異的受容体を有することが示されている。特に、インスリン受容体は、本明細書に記載されているＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）のための輸送体として適している。本明細書に記載されているＨＩＲ−ＩＤＳ融合抗体は、ヒトインスリン受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する。
【００６８】
インスリン受容体およびそれらの細胞外インスリン結合ドメイン（ＥＣＤ）は、当該技術分野で、構造的および機能的に、広範囲に特徴付けられている。例えば、Yip et al (2003), J Biol. Chem, 278(30):27329-27332；およびWhittaker et al. (2005), J Biol Chem, 280(22):20932-20936を参照のこと。ヒトインスリン受容体のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ジェンバンク受入番号ＮＭ＿０００２０８で見ることができる。
【００６９】
ＢＢＢ受容体媒介輸送系に結合する構造
ＣＮＳに薬物を送達するための１つの非侵襲的アプローチは、興味のある薬剤を構造、例えばＢＢＢ上の受容体と結合する分子と付着することである。次いで、該構造はＢＢＢを越えて薬剤を輸送するためのベクターとして機能する。該構造は、本明細書で「分子的トロイの木馬（ＭＴＨ）」として言及されている。必ずしもというわけではないが、典型的には、ＭＴＨは内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系でＢＢＢを横切る、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に結合することができる外因性ペプチドまたはペプチド模倣部分（例えば、ＭＡｂ）である。特定の実施態様では、ＭＴＨは輸送系の受容体、例えばインスリン受容体に対する抗体であってよい。いくつかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。いくつかの実施態様では、ＭＡｂはキメラＭＡｂである。それゆえ、Ａｂｓは通常、脳から排除されるという事実にもかかわらず、それらはＢＢＢ上の受容体に対する特異性を有する場合、脳実質内へ分子を送達するための有効なビヒクルとなりうる。
【００７０】
いくつかの実施態様では、該方法は、ＢＢＢ受容体媒介輸送系に結合することができる抗体と融合したＩＤＳを含む融合抗体を用いることによって、ＢＢＢを越えてＩＤＳを輸送する方法を含む。いくつかの実施態様では、該方法は、ＢＢＢ受容体媒介輸送系（例えば、以下の１つ以上のための受容体：インスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子１および２（ＩＧＦ１およびＩＧＦ２）、レプチン、ならびに／またはリポタンパク質）に選択的に結合することができる抗体と融合したＩＤＳを含む融合抗体を用いることによって、ＢＢＢを越えてＩＤＳを輸送する方法を含む。
【００７１】
いくつかの実施態様では、該方法は、インスリン受容体のＥＣＤに選択的に結合することができる抗体と融合したＩＤＳを含む融合抗体を用いることによって、ＢＢＢを越えてＩＤＳを輸送する方法を含む。ＢＢＢ上に発現されるインスリン受容体は、それによってＢＢＢを越えてＩＤＳを輸送するためのベクターとして機能しうる。特定のＥＣＤ特異的抗体は内在性リガンドを模倣し得、それによって特異的受容体系上の輸送を経由して血漿膜関門を横切る。該インスリン受容体抗体は、図７に模式的に描写しているように、分子的「トロイの木馬」または「ＴＨ」として作用する。通常は、ＩＤＳ単独では血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しない。しかしながら、ＩＤＳとＴＨの融合後、該酵素は脳内の両方の膜で発現されているＩＲ上の輸送によって、ＢＢＢおよび脳細胞膜を通過することができる。
【００７２】
それゆえ、抗体および他の巨大分子が通常は脳から排除されるという事実にもかかわらず、それらはＢＢＢ上に発現される受容体、例えばインスリン受容体の細胞外ドメインに対する特異性を有する場合、脳実質内への分子の送達のための有効なビヒクルとなりうる。特定の実施態様では、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体はヒトＢＢＢ ＨＩＲ上の細胞外表面エピトープと結合し、この結合は、ヒトＢＢＢインスリン受容体によって媒介される輸送反応を経由して融合抗体がＢＢＢを横切ることを可能にする。
【００７３】
用語「抗体」は、天然の、または部分的もしくは完全に合成によって作製された免疫グロブリンを記載するものである。該用語は、抗原結合ドメインまたはこれと相同の結合ドメインを有するいずれかのポリペプチドまたはタンパク質も含む。ＣＤＲ移植抗体もこの用語に含まれる（contemplated）。
【００７４】
「天然抗体」および「天然免疫グロブリン」は通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は典型的には１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合しているが、一方、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動する。各重鎖および軽鎖も、規則的に間隔が空いた鎖内ジスルフィド架橋を有している。各重鎖はその一端に可変ドメイン（「ＶＨ」）を有し、次いで多数の定常ドメイン（「ＣＨ」）を有する。各軽鎖はその一端に可変ドメイン（「ＶＬ」）を有し、他端に定常ドメイン（「ＣＬ」）を有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメインの間のインターフェースを形成すると考えられている。
【００７５】
用語「可変ドメイン」は、ファミリーメンバーの間で（すなわち、異なるアイソフォームの間、または異なる種において）配列が広範囲に異なるタンパク質ドメインを指す。抗体に関して、用語「可変ドメイン」は、その特定の抗原についての各特定の抗体の結合および特異性に用いられる抗体の可変ドメインを指す。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布されているのではない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方における超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」と呼ばれる。未修飾の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲｓ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、大部分はβ−シート立体配置の形をとり、３つの超可変領域によって結合しているが、該領域はβ−シート構造を結合するループを形成し、場合によってはβ−シート構造の一部を形成している。各鎖の超可変領域がＦＲｓによってごく接近して結びついており、他の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669を参照のこと）。定常ドメインは抗原に対する抗体の結合に直接的に関与していないが、様々な効果または機能、例えば抗体依存性細胞毒性における抗体の関与等を示す。
【００７６】
用語「超可変領域」は、本明細書で用いられる場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、相補的様式にて抗原に直接的に結合し、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として知られている３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲｓ」に由来するアミノ酸残基を含む。
【００７７】
軽鎖可変ドメインにおいて、ＣＤＲｓは典型的にはおよそ残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）および８９〜９７（ＣＤＲＬ３）に相当し、重鎖可変ドメインにおいて、ＣＤＲｓは典型的にはおよそ残基３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）および９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）に相当し；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）、ならびに／または「超可変ループ」由来の残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおいて、残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、重鎖可変ドメインにおいて、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 917 (1987)）に相当する。
【００７８】
本明細書で用いられている「可変フレームワーク領域」または「ＶＦＲ」は、抗原結合ポケットもしくは溝の一部を形成し、および／または抗原と接触しうるフレームワーク残基を指す。いくつかの実施態様では、フレームワーク残基は、抗原結合ポケットまたは溝の一部であるループを形成する。ループ内のアミノ酸残基は、抗原と接触してもしなくてもよい。１つの実施態様では、ＶＦＲのループアミノ酸は、抗体、抗体重鎖または抗体軽鎖の三次元構造を検査することによって決定される。三次元構造は、溶媒接触可能なアミノ酸位置のために分析されうるが、これは該位置がループを形成し、および／または抗体可変ドメインにおいて抗原接触を提供する可能性があるからである。一部の溶媒接触可能な位置はアミノ酸配列多様性を許容しうるが、他の位置（例えば構造的位置）は多様化の程度がより低い。抗体可変ドメインの三次元構造は、結晶構造またはタンパク質モデリングに由来しうる。いくつかの実施態様では、ＶＦＲは重鎖可変ドメインのアミノ酸位置７１〜７８に相当するアミノ酸位置を含み、本質的に該位置からなり、または該位置からなるが、これはKabat et al., 1991に従って定義された位置である。いくつかの実施態様では、ＶＦＲはＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３の間に位置するフレームワーク領域３の一部を形成する。ＶＦＲは標的抗原と接触するために良い位置にあるループを形成し得、または抗原結合ポケットの一部を形成しうる。
【００７９】
免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、異なるクラスに分類されうる。５つの主要な免疫グロブリンのクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに相当する重鎖定常ドメイン（Ｆｃ）は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００８０】
いずれかの脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパまたは（「κ」）およびラムダまたは（「λ」）と呼ばれる２つの明確に異なる型の１つに分類することができる。
【００８１】
抗体または融合抗体に関して、本明細書に記載されている用語「選択的に結合する」、「選択的に結合すること」、「特異的に結合する」、または「特異的に結合すること」は、抗体または融合抗体がその標的抗原に解離定数（Ｋｄ）約１０^−６Ｍ以下、すなわち１０^−７、１０^−８、１０^−９、１０^−１０、１０^−１１、または１０^−１２Ｍで結合することを指す。
【００８２】
本明細書で用いられている用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上の断片も意味すると理解されるであろう（一般的には、Holliger et al., Nature Biotech. 23 (9) 1126-1129 (2005)を参照のこと）。該抗体の非限定的例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544 546）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、すなわちＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423 426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883;およびOsbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:778を参照のこと）を形成している単一タンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって連結することができる。該単鎖抗体は、用語「抗体」に包含されることも意図されている。特異的ｓｃＦｖのいずれかのＶＨおよびＶＬ配列は、完全ＩｇＧ分子または他のアイソタイプをコードしている発現ベクターを作製するために、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列に結合されてよい。ＶＨおよびＶＬは、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかを用いた免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖまたは他の断片の作製にも用いられうる。他の形態の単鎖抗体、例えば二重特異性抗体も包含される。
【００８３】
「Ｆ（ａｂ’）２」および「Ｆａｂ’」部分は、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）をプロテアーゼ、例えばペプシンおよびパパイン等で処理することによって作製することができ、２つのＨ鎖のそれぞれのヒンジ領域の間に存在しているジスルフィド結合の近くで免疫グロブリンを消化することによって産生される抗体断片を含む。例えば、パパインは、２つのＨ鎖のそれぞれのヒンジ領域の間に存在しているジスルフィド結合の上流でＩｇＧを切断し、ＶＬ（Ｌ鎖可変領域）およびＣＬ（Ｌ鎖定常領域）で構成されるＬ鎖、ならびにＶＨ（Ｈ鎖可変領域）およびＣＨγ１（Ｈ鎖の定常領域のγ１領域）で構成されるＨ鎖断片がそれらのＣ末端領域でジスルフィド結合を通じて結合している２つの相同抗体断片を産生する。これら２つの相同抗体断片のそれぞれは、Ｆａｂ’と呼ばれている。ペプシンも、２つのＨ鎖のそれぞれのヒンジ領域の間に存在しているジスルフィド結合の下流でＩｇＧを切断し、２つの上記Ｆａｂ’がヒンジ領域で結合した断片よりもわずかに大きな抗体断片を産生する。この抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれている。
【００８４】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端で数残基が付加されている点がＦａｂ断片と異なっている。本明細書で、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有しているＦａｂ’を指す。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初は、その間にヒンジシステインを有しているＦａｂ’断片のペアとして作製された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００８５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合性会合の１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この立体配置によって、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。合計で、６つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも低親和性ではあるが、抗原を認識および結合する能力を有する。
【００８６】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ、ＶＬ、またはＶＨおよびＶＬドメインの両方を含み、両ドメインが単一ポリペプチド鎖に存在している。いくつかの実施態様では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの総説については、例えばPluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269 315 (1994)を参照のこと。
【００８７】
「キメラ」抗体は、異なる哺乳類の組み合わせに由来する抗体を含む。哺乳類は、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、またはヒトであってよい。異なる哺乳類の組み合わせは、ヒトおよびマウス由来の断片の組み合わせを含む。
【００８８】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体はモノクローナル抗体（ＭＡｂ）であり、典型的にはマウスモノクローナル抗体のヒト化によって得られるキメラヒト−マウス抗体である。該抗体は、例えば抗原投与に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「設計され」た遺伝子導入マウスから得られる。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の要素は、内在性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含有する胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に導入される。遺伝子導入マウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、該マウスはヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生するために用いることができる。
【００８９】
ヒトに使用するために、キメラ抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ、ＢＢＢを通過することができる他の抗体）はヒトに投与された場合に有意な免疫原性を有さないように十分なヒト配列を含有することが好ましく、例えば、約８０％ヒトおよび約２０％マウス、約８５％ヒトおよび約１５％マウス、約９０％ヒトおよび約１０％マウス、約９５％ヒトおよび５％マウス、または約９５％を越えるヒトおよび約５％未満のマウスであることが好ましい。抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ、ＢＢＢを通過することができる他の抗体）のより高度にヒト化した形態も設計することができ、ヒト化抗体（例えばＨＩＲ Ａｂ）はマウスＨＩＲ Ａｂに匹敵する活性を有し、本発明の実施態様に用いることができる。例えば、２００２年１１月２７日に出願された米国特許出願公開第２００４０１０１９０４号、および２００５年２月１７日に出願された米国特許出願公開第２００５０１４２１４１号を参照のこと。本発明に用いるための十分なヒト配列を有するヒトＢＢＢインスリン受容体に対するヒト化抗体は、例えば、Boado et al. (2007), Biotechnol Bioeng, 96(2):381-391に記載されている。
【００９０】
代表的な実施態様では、ＨＩＲ抗体またはそれに由来するＨＩＲ−ＩＤＳ融合抗体は、図３に記載されているＨＣ ＣＤＲｓ（配列番号１〜３）の少なくとも１つまたはその変異体の配列に相当するＣＤＲｓを含む免疫グロブリン重鎖を含有する。例えば、最大１、２、３、４、５、もしくは６個の単一アミノ酸変異を有する配列番号１のアミノ酸配列に相当するＨＣ ＣＤＲ１、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の単一アミノ酸変異を有する配列番号２のアミノ酸配列に相当するＨＣ ＣＤＲ２、または最大１、もしくは２個の単一アミノ酸変異を有する配列番号３のアミノ酸配列に相当するＨＣ ＣＤＲ３であり、ここで単一アミノ酸変異は置換、欠失、または挿入である。
【００９１】
他の実施態様では、ＨＩＲ ＡｂｓまたはＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合Ａｂｓは、配列番号７（図１に示している）と少なくとも５０％同一の（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または最大１００％のいずれかのパーセント同一の）アミノ酸配列の免疫グロブリンＨＣを含有する。
【００９２】
いくつかの実施態様では、ＨＩＲ ＡｂｓまたはＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合Ａｂｓは、図３に記載されているＬＣ ＣＤＲｓ（配列番号４〜６）の少なくとも１つまたはその変異体の配列に相当するＣＤＲｓを含む免疫グロブリン軽鎖を含む。例えば、最大１、２、３、４、もしくは５個の単一アミノ酸変異を有する配列番号４のアミノ酸配列に相当するＬＣ ＣＤＲ１、最大１、２、３、もしくは４個の単一アミノ酸変異を有する配列番号５のアミノ酸配列に相当するＬＣ ＣＤＲ２、または最大１、２、３、４、もしくは５個の単一アミノ酸変異を有する配列番号６のアミノ酸配列に相当するＬＣ ＣＤＲ３である。
【００９３】
他の実施態様では、ＨＩＲ ＡｂｓまたはＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合Ａｂｓは、配列番号８（図２に示している）と少なくとも５０％同一の（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または最大１００％のいずれかのパーセント同一の）アミノ酸配列の免疫グロブリンＬＣを含有する。
【００９４】
さらに他の実施態様では、ＨＩＲ ＡｂｓまたはＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合Ａｂｓは、上記ＨＩＲ重鎖およびＨＩＲ軽鎖のいずれかに相当する重鎖および軽鎖の両方を含有する。
【００９５】
本発明に用いられるＨＩＲ抗体は、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。抗体がグリコシル化されている場合、抗体の機能に有意に影響しないいずれかのグリコシル化パターンが用いられてよい。グリコシル化は抗体が産生された細胞に典型的なパターンで起こり得、細胞型によって異なりうる。例えば、マウス骨髄腫細胞によって産生されたモノクローナル抗体のグリコシル化パターンは、トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されたモノクローナル抗体のグリコシル化パターンと異なりうる。いくつかの実施態様では、抗体は、トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されたパターンでグリコシル化されている。
【００９６】
当業者であれば、現在の技術は膨大な数の候補抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ、ＢＢＢを通過することができる他の抗体）の配列変異体を（例えば、インビトロで）作製することができ、標的抗原、例えばヒトインスリン受容体のＥＣＤまたはその単離されたエピトープに結合することについてスクリーニングすることを可能にすることを理解できるであろう。抗体配列変異体の超ハイスループットスクリーニングの一例については、例えばFukuda et al. (2006) "In vitro evolution of single-chain antibodies using mRNA display," Nuc. Acid Res., 34(19)（オンラインで発表）を参照のこと。Chen et al. (1999), "In vitro scanning saturation mutagenesis of all the specificity determining residues in an antibody binding site," Prot Eng, 12(4): 349-356も参照のこと。インスリン受容体ＥＣＤは、例えばColoma et al. (2000) Pharm Res, 17:266-274に記載されているようにして精製することができ、ＨＩＲ Ａｂｓおよび既知ＨＩＲ ＡｂｓのＨＩＲ Ａｂ配列変異体についてスクリーニングするために用いられる。
【００９７】
従って、いくつかの実施態様では、所望のレベルのヒト配列を有する遺伝的に設計されたＨＩＲ Ａｂは、ＩＤＳと融合しており、二機能性の分子である組換え融合抗体となっている。ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体は、末梢投与後：（ｉ）ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに結合し；（ｉｉ）デルマタンおよび／またはヘパラン硫酸の結合の加水分解を触媒し；かつ、（ｉｉｉ）ＢＢＢ ＨＩＲ上の輸送を経由してＢＢＢを通過することができ、かつ、脳内に入った時点でＩＤＳ活性を保持している。
【００９８】
イズロン酸 ２−スルファターゼ（ＩＤＳ）
組換えＩＤＳ（例えば、エラプラーゼ（Elaprase（登録商標）））の全身投与（例えば、静脈内注射による）は、ハンター症候群を患っている患者のＣＮＳにおけるＩＤＳ欠乏症を救出できない。ＩＤＳはＢＢＢを通過しないため、ＢＢＢを越えた酵素の輸送の不足は、末梢投与後、ＣＮＳにおける有意な治療効果を発揮する妨げとなる。しかしながら、本発明のいくつかの実施態様では、ＩＤＳがＢＢＢを通過することができる抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ）と融合した場合、ＩＤＳは、非侵襲性の末梢投与経路、例えば静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、もしくは経口投与、または他の本明細書に記載されている経路での投与後、血液からＣＮＳに入ることができる。ＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）の投与は、末梢血から脳内へのＩＤＳ活性の送達を可能にする。本明細書に記載されているのは、ＣＮＳにおけるＩＤＳ欠乏症を治療するための治療的に有効なＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）の全身投与量（systemic dose）の決定である。本明細書に記載されているように、ＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）の適切な全身投与量（systemic doses）は、ＨＩＲ Ａｂ−酵素融合抗体のＣＮＳ取り込み特性および酵素活性の定量的決定に基づいて確立される。
デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリンは可変的に硫酸化されたグリコサミノグリカンであり、二糖単位の反復によって作製される長鎖の非分岐鎖多糖である。Ｌ−イズロネート（またはＬ−イズロン酸）は、デルマタン硫酸およびヘパリンの主成分である。それはヘパラン硫酸にも存在している。本明細書で用いられているＩＤＳ（例えば、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０００１９３で登録されているヒトＩＤＳ配列）は、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリンのＬ−イズロン酸 ２−硫酸（L-iduronate 2-sulfate）単位の２−硫酸基の加水分解または除去を触媒することができるいずれかの天然または人工の酵素を指す。
【００９９】
ＩＤＳは、ＩＤＳ酵素活性の発現に特異的翻訳後修飾を必要とする、スルファターゼファミリーのメンバーである。ＩＤＳ酵素の活性は、スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）（ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）とも呼ばれる）によってＣｙｓ−５９がホルミルグリシン残基へ変換された後に活性化される。いくつかの実施態様では、ＩＤＳを含む融合抗体は、スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）によって翻訳後修飾されている。いくつかの実施態様では、翻訳後修飾はシステインをホルミルグリシンへ変換することを含む。いくつかの実施態様では、融合抗体はホルミルグリシン残基を含むＩＤＳを含む。
【０１００】
いくつかの実施態様では、対象組成物（または方法）は、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０００１９３で登録されている５５０個のアミノ酸のタンパク質であるヒトＩＤＳのアミノ酸配列、または２５個のアミノ酸のシグナルペプチドを欠き、配列番号９（図４）に相当するその５２５個のアミノ酸サブ配列と、少なくとも５０％同一の（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または最大１００％のいずれかのパーセント同一の）アミノ酸配列を有するＩＤＳを含む。ヒトＩＤＳの構造機能相関は、例えばSukegawa-Hayasaka et al. (2006), "Effect of Hunter disease (mucopolysaccharidosis type II) mutations on molecular phenotypes of iduronate-2-sulfatase: enzymatic activity, protein processing and structural analysis," J. Inherit. Metab. Dis., 29: 755-761に記載されているように、十分に確立されている。特に、ＩＤＳの機能に重大な意味を持つ残基は、例えばＡｒｇ４８、Ａｌａ８５、Ｐｒｏ８６、Ｓｅｒ３３３、Ｔｒｐ３３７、Ｓｅｒ３４９、Ａｒｇ４６８、およびＧｌｎ５３１を含む。
【０１０１】
いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、配列番号９（図４に示している）と少なくとも５０％同一の（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または最大１００％のいずれかのパーセント同一の）アミノ酸配列を有する。配列番号９等の標準的なＩＤＳ配列の配列変異体は、例えば全配列または特定のドメインに相当する特定のサブ配列のランダム変異誘発によって作製することができる。あるいは、上記のようなＩＤＳ機能に重大な意味を持つことが知られている残基に対する変異を回避しながら、部位特異的変異誘発が反復的に行われてよい。さらに、ＩＤＳ配列の多重変異体の作製において、完全にランダムな変異誘発によって作製されるであろう非機能性の配列変異体の数を大きく減少させるために、変異許容予測プログラムを用いることができる。タンパク質配列におけるアミノ酸置換のタンパク質機能に対する効果を予測するための様々なプログラム（例えば、ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ、ＰＡＮＴＨＥＲ ＰＳＥＣ、ＰＭＵＴ、およびＴｏｐｏＳＮＰ）は、例えばHenikoff et al. (2006), "Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on Protein Function," Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 7:61-80に記載されている。例えば、当該技術分野で周知の４−メチルウンベリフェリル −Ｌ−イズロニド−２−サルフェート（４−ＭＵＳ）蛍光定量的ＩＤＳアッセイによって、ＩＤＳ活性／ＩＤＳ活性の保持についてＩＤＳ配列変異体をスクリーニングすることができる。例えば、Voznyi et al. (2001), J. Inherit. Metab. Dis.24: 675-680を参照のこと。ＩＤＳ活性の１ユニットは、１ｎｍｏｌe基質／時間の加水分解として定義される。従って、当業者であれば、非常に多数の操作可能なＩＤＳ配列変異体は、上述したように、当該技術分野でありふれた方法により、ＩＤＳ配列変異体の非常に多様な「ライブラリー」を作製およびスクリーニングすることによって得ることができることを理解できるであろう。
【０１０２】
配列相同性パーセントは、通常の方法によって決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照のこと。簡潔に述べると、２つのアミノ酸配列を並べて、ギャップオープニングペナルティー（gap opening penalty）を１０で用い、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）を１で用い、かつ、Henikoff and Henikoff（前記）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを用いてアライメントスコアを最適化する。次いで、相同性パーセントは：（［完全な一致の全数］／［より長い配列の長さ＋２つの配列を並べるためにより長い配列に導入されたギャップの数］）（１００）として計算される。
【０１０３】
当業者であれば、２つのアミノ酸配列を並べるために多くの確立されたアルゴリズムが入手可能であることを理解しているであろう。ピアソン（Pearson）とリップマン（Lipman）の「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書で開示されているアミノ酸配列と別のペプチドのアミノ酸配列によって共有されている相同性のレベルを調べるために適切なタンパク質アライメント法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)に記載されている。簡潔に述べると、ＦＡＳＴＡは、最初に、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮することなく、最も高密度の相同性（ｋｔｕｐ変数が１の場合）または相同性のペア（ｋｔｕｐ＝２の場合）のいずれかを有する、問い合わせ配列（例えば、配列番号９または配列番号１６）とテスト配列によって共有されている領域を同定することによって配列類似性を特徴付ける。次いで、アミノ酸置換マトリックスを用いて、全ての対になったアミノ酸の類似性を比較することによって、最も高密度の相同性を有する１０個の領域をリスコアし（rescored）、該領域の末端を「切り取り（trimmed）」、最も高いスコアに寄与している残基のみを含むようにする。「カットオフ」値（配列の長さおよびｋｔｕｐ値に基づいて所定の式によって計算される）を越えるスコアを有するいくつかの領域がある場合は、切り取られた（trimmed）最初の領域を調べて、該領域を連結してギャップを含む近似のアライメントを形成することができるかどうかを決定する。最終的に、ニードルマン（Needleman）−ブンシュ（Wunsch）−セラーズ（Sellers）アルゴリズム（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)）の修正を用いて、２つのアミノ酸配列の最も高スコアの領域を並べ、アミノ酸挿入および欠失を考慮する。ＦＡＳＴＡ分析についての説明に役立つパラメーターは：ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティー（gap opening penalty）＝１０、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）＝１、および置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)のＡｐｐｅｎｄｉｘ２に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を修正することによって、ＦＡＳＴＡプログラムにこれらのパラメーターを導入することができる。
【０１０４】
本発明は、本明細書で開示されているアミノ酸配列と比較して保存的アミノ酸変化を有するタンパク質も含む。例えば、通常のアミノ酸の中で、「保存的アミノ酸置換」は、下記の群のそれぞれの範囲内のアミノ酸の中での置換によって説明される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（３）セリンおよびスレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（６）リジン、アルギニンおよびヒスチジン。ＢＬＯＳＵＭ６２表はタンパク質配列セグメントの約２，０００個の局所的多重アライメントに由来するアミノ酸置換マトリックスであり、５００群を超える関連タンパク質の高度に保存された領域を表している（Henikoff and Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)）。従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本発明のアミノ酸配列に導入されてよい保存的アミノ酸置換を規定するために用いることができる。（上記のような）化学的性質のみに基づいてアミノ酸置換を設計することが可能であるが、用語「保存的アミノ酸置換」は、好ましくは−１を越えるＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換を指す。例えば、０、１、２、または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって置換が特徴付けられている場合、アミノ酸置換は保存的である。このシステムに従うと、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられ、一方、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる。
【０１０５】
配列が本発明の組成物および方法において機能を有する十分な生物学的タンパク質活性を保持している限り、アミノ酸配列は付加的な残基、例えば付加的なＮ末端またはＣ末端アミノ酸を含んでよく、本明細書で開示されている配列の１つに依然として本質的に記載されていることも理解されるであろう。
【０１０６】
組成物
本発明の組成物は：ＢＢＢを越えてＩＤＳを輸送する、ＩＤＳの治療的有効用量を送達する、および／またはＢＢＢを越えて輸送された時点、もしくは標的抗体と融合した時点でＩＤＳの活性を保持するのに有用であることを含む複数の理由で有用である。本発明の組成物は、融合抗体の中でＩＤＳおよび／またはそれが結合している構造（例えば、免疫グロブリン、抗体）が、独立体（separate entity）としてのその活性と比較してある程度の活性をそれぞれ保持している点においても有用である。
【０１０７】
いくつかの実施態様では、本発明は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる構造（例えば、免疫グロブリン、抗体）と共有結合しているＩＤＳを含有する組成物であって、ＩＤＳが独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持している組成物を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる構造（例えば、免疫グロブリン、抗体）と共有結合しているＩＤＳを含有する組成物であって、構造が独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持している組成物を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる構造（例えば、免疫グロブリン、抗体）と共有結合しているＩＤＳを含有する組成物であって、構造およびＩＤＳがそれぞれ独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持している組成物を提供する。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも約１０％を保持している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％を保持している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも３０％を保持している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも４０％を保持している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも５０％を保持している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも６０％を保持している。
【０１０８】
本発明は、ヒトＢＢＢインスリン受容体に対するキメラＭＡｂと共有結合しているＩＤＳを含有する組成物も提供する。本発明は、本発明の１つ以上の組成物および医薬的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物も提供する。
【０１０９】
いくつかの実施態様では、対象組成物は、ＩＤＳ融合抗体であって、末梢血からＢＢＢを越えたその取り込みの結果として、全身投与されたＩＤＳ融合抗体の少なくとも約０.３％（すなわち、約０.３２％）、０.４％、０.４８％、０.６％、０.７４％、０.８％、０.９％、１.０５、１.１、１.２、１.３％、１.５％、２％、２.５％、５％、または約０.３％〜約１２％のいずれかの％）が脳に送達されうるＩＤＳ融合抗体を含む。いくつかの実施態様では、組成物は、ＩＤＳ融合抗体であって、全身投与されたＩＤＳ融合抗体の用量の少なくとも０.５％（すなわち、約０.３２％、０.４％、０.４８％、０.６％、０.７４％、０.８％、０.９％、１.０５、１.１、１.２、１.３％、１.５％、２％、２.５％、５％、または約０.３％〜約１２％のいずれかの％）が、全身投与後２時間以内、すなわち、１.８、１.７、１.５、１.４、１.３、１.２、１.１、０.９、０.８、０.６、０.５または約０.５〜約２時間の間のいずれかの時間で脳に送達されるＩＤＳ融合抗体を含む。
【０１１０】
いくつかの実施態様では、本発明のＩＤＳ融合抗体はＢＢＢを通過することができ、それによって対象の脳内に少なくとも０.１２５ユニットのＩＤＳ活性／ｍｇタンパク質、例えば対象の脳内に０.１４、０.１５、０.１６、０.１７、０.１８、０.１９、０.２、０.２１、０.２２、０.２３、０.２４、０.２５、０.３、０.４、０.５、０.７５、１.０、１.５、２、または０.１２５〜２.５の間のいずれかのユニットのＩＤＳ活性／ｍｇタンパク質を提供する。いくつかの実施態様では、対象の脳に送達されるＩＤＳ活性の全ユニット数は、少なくとも１２，５００ユニット、例えば少なくとも２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１６０，０００、１７０，０００、１８０，０００、１９０，０００、２００，０００、２１０，０００、２２０，０００、２３０，０００、２５０，０００または約１２，５００〜２５０，０００ユニットのＩＤＳ活性の間のいずれかの全ＩＤＳユニット数である。いくつかの実施態様では、対象の脳に送達されるＩＤＳ活性の全ユニット数は、少なくとも１０，０００ユニット、例えば、少なくとも１０，０００、１２，５００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１６０，０００、１７０，０００、１８０，０００、１９０，０００、２００，０００、２１０，０００、２２０，０００、２３０，０００、２５０，０００、３００，０００、５０００，０００または約１０，０００〜５００，０００ユニットのＩＤＳ活性の間のいずれかの全ＩＤＳユニット数である。いくつかの実施態様では、体重５０ｋｇ当たり標準化された、少なくとも約２５，０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性が脳に送達される。いくつかの実施態様では、体重５０ｋｇ当たり標準化された、少なくとも約１０，０００、１５，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１６０，０００、１７０，０００、１８０，０００、１９０，０００、２００，０００、２１０，０００、２２０，０００、２３０，０００、２５０，０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性が脳に送達される。いくつかの実施態様では、体重５０ｋｇ当たり標準化された、少なくとも約２５，０００ ０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性が脳に送達される。いくつかの実施態様では、治療的に有効な全身投与量（systemic dose）は、少なくとも５ｘ１０^５、１ｘ１０^６、２ｘ１０^６、３ｘ１０^６、４、１０^６、５ｘ１０^６、６ｘ１０^６、７ｘ１０^６、８ｘ１０^６、９ｘ１０^６、１ｘ１０^７、１.１ｘ１０^７、１.２ｘ１０^７、１.５ｘ１０^７、１.６ｘ１０^７、１.７ｘ１０^７、１.８ｘ１０^７、１.９ｘ１０^７、２ｘ１０^７、２.１ｘ１０^７、３ｘ１０^７、または約５ｘ１０^５〜３ｘ１０^７ユニットのＩＤＳ活性の間のいずれかの全身投与量（systemic dose）を含む。他の実施態様では、治療的に有効な全身投与量（systemic dose）は、少なくとも約２０，０００ユニット、または少なくとも約１０，０００ユニットのＩＤＳ活性／ｋｇ体重、少なくとも約１０，０００、１５，０００、２０，０００、２２，０００、２４，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、２００，０００、もしくは５００，０００ユニット／ｋｇ体重である。
【０１１１】
当業者であれば、ＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）の治療的に有効な全身投与量（systemic dose）の全量（mass amount）は、部分的には、そのＩＤＳ比活性に依存するであろうことを理解できるであろう。いくつかの実施態様では、ＩＤＳ融合抗体のＩＤＳ比活性は、少なくとも１０，０００Ｕ／ｍｇタンパク質、少なくとも約１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、３２，０００、３４，０００、３５，０００、３６，０００、３７，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、または約１０，０００ユニット／ｍｇ〜約５０，０００ユニット／ｍｇの間のいずれかの比活性値である。
【０１１２】
いくつかの実施態様では、ＢＢＢを通過することができる構造は、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系、例えばインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、ＬＤＬ受容体、またはＩＧＦ受容体を利用する系を利用する。いくつかの実施態様では、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系は、インスリンＢＢＢ受容体媒介輸送系であろう。いくつかの実施態様では、ＢＢＢを通過することができる構造は抗体、例えばモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、例えばキメラＭＡｂである。抗体は、ヒトへの投与に適した十分なヒト配列を有するキメラ抗体であってよい。上記融合タンパク質の実施態様では、血液脳関門を通過することができる構造は、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送体、例えばインスリン輸送体、トランスフェリン輸送体、レプチン輸送体、ＬＤＬ輸送体、およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される輸送体上でＢＢＢを通過する。いくつかの実施態様では、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送体は、インスリン輸送体およびトランスフェリン輸送体からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送体はインスリン輸送体、例えばヒトインスリン輸送体である。ＢＢＢを通過することができる構造は抗体であってよく、例えばＭＡｂ、例えばキメラＭＡｂであってよい。抗体は、本明細書に記載されているような内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送体に対する抗体であってよい。
【０１１３】
抗体は、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい；いくつかの実施態様では、抗体は、例えば、そのＣＨＯ細胞内での合成によって生じたグリコシル化パターンにてグリコシル化されている。構造が抗体である実施態様では、ＩＤＳ融合抗体が血液脳関門を通過し、および／またはＩＤＳがＣＮＳにおいてその活性の治療的に有用な部分を保持できる限り、抗体とＩＤＳの間の共有結合は、抗体のいずれかの適切な部分とＩＤＳの間の結合であってよい。特定の実施態様では、共有結合は、抗体の１つ以上の軽鎖とＩＤＳの間にある。ＩＤＳは、そのカルボキシまたはアミノ末端が、抗体の軽鎖（ＬＣ）または重鎖（ＨＣ）のカルボキシまたはアミノ末端と共有結合していてよい。いずれかの適切な結合が用いられてよく、例えば、軽鎖のカルボキシ末端とペプチドのアミノ末端、重鎖のカルボキシ末端とペプチドのアミノ末端、軽鎖のアミノ末端とペプチドのアミノ末端、重鎖のアミノ末端とペプチドのアミノ末端、軽鎖のカルボキシ末端とペプチドのカルボキシ末端、重鎖のカルボキシ末端とペプチドのカルボキシ末端、軽鎖のアミノ末端とペプチドのカルボキシ末端、または重鎖のアミノ末端とペプチドのカルボキシ末端の結合が用いられてよい。いくつかの実施態様では、結合はＨＣのカルボキシ末端とペプチドのアミノ末端に由来する。末端アミノ酸の間の結合は必要ではなく、本発明の要求を満たすいずれかの結合が用いられてよく；ペプチドの非末端アミノ酸の間の該結合は当業者によって容易に達成されることが理解されるであろう。
【０１１４】
いくつかの実施態様では、２分子以上のＩＤＳがＢＢＢを通過する構造に付着している。いくつかの実施態様では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超えるＩＤＳ分子（またはその断片）が、血液脳関門を通過することができる構造に付着していてよい。
【０１１５】
本明細書に記載されている二機能性のＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）は、それらの独立した構成タンパク質の活性、例えばＩＲ ＥＣＤへのＨＩＲ Ａｂの結合、およびＩＤＳの酵素活性を高比率で保持していてよい。本明細書に記載されているタンパク質のいずれかをコードしているｃＤＮＡｓおよび発現ベクターの構築、ならびにそれらの発現および精製は、十分に当業者の技術の範囲内であり、例えば本明細書で実施例１〜３に詳細に記載されており、Boado et al (2007), Biotechnol Bioeng 96:381-391、米国特許出願第１１／０６１，９５６号、および米国特許出願第１１／２４５，７１０号に記載されている。
【０１１６】
本明細書に記載されているのは、ＩＤＳと融合したＢＢＢを通過することができる本明細書に記載されている標的抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ）を含有する二機能性のＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）であって、血液脳関門を通過することができる標的抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ）およびＩＤＳがそれぞれ、独立体（separate entities）としてのそれらの活性と比較して、それらの活性の少なくとも平均約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持している融合抗体である。いくつかの実施態様では、本発明はＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体であって、ＨＩＲ ＡｂおよびＩＤＳがそれぞれ、独立体（separate entities）としてのそれらの活性と比較して、それらの活性の少なくとも平均約５０％を保持している融合抗体を提供する。いくつかの実施態様では、本発明はＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体であって、ＨＩＲ ＡｂおよびＩＤＳがそれぞれ、独立体（separate entities）としてのそれらの活性と比較して、それらの活性の少なくとも平均約６０％を保持している融合抗体を提供する。いくつかの実施態様では、本発明はＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体であって、ＨＩＲ ＡｂおよびＩＤＳがそれぞれ、独立体（separate entities）としてのそれらの活性と比較して、それらの活性の少なくとも平均約７０％を保持している融合抗体を提供する。いくつかの実施態様では、本発明はＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体であって、ＨＩＲ ＡｂおよびＩＤＳがそれぞれ、独立体（separate entities）としてのそれらの活性と比較して、それらの活性の少なくとも平均約８０％を保持している融合抗体を提供する。いくつかの実施態様では、本発明はＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体であって、ＨＩＲ ＡｂおよびＩＤＳがそれぞれ、独立体（separate entities）としてのそれらの活性と比較して、それらの活性の少なくとも平均約９０％を保持している融合抗体を提供する。いくつかの実施態様では、ＨＩＲ Ａｂは、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持しており、ＩＤＳは独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持している。従って、本明細書に記載されているのは、ＢＢＢを通過することができる二機能性のＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）を含有する組成物であって、構成抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ）およびＩＤＳがそれぞれ、独立のタンパク質としてのそれらの活性と比較して、融合抗体の一部として、それらの活性、例えばそれぞれＨＩＲ結合およびＩＤＳ活性の少なくとも平均約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持している組成物である。ＨＩＲ Ａｂ ＩＤＳ融合抗体は、本明細書に記載されているＨＩＲ抗体のいずれかおよびＩＤＳｓを含む融合タンパク質を指す。
【０１１７】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されているＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）は、抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ）のカルボキシ末端とＩＤＳのアミノ末端の間（または、抗体のアミノ末端とＩＤＳのカルボキシ末端の間）に共有結合を含み、ＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）が受容体媒介ＢＢＢ輸送系に（例えば、ＩＲのＥＣＤに）結合し、血液脳関門を通過する。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは、その活性の治療的に有用な部分を保持している。本明細書に記載されているＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）を含む本発明のいくつかの実施態様では、抗体とＩＤＳの間の共有結合は標的抗体（例えば、ＨＩＲ抗体）のカルボキシまたはアミノ末端とＩＤＳのアミノまたはカルボキシ末端の結合であってよく、結合はＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体がＩＲのＥＣＤに結合して血液脳関門を通過することを可能にし、ＩＤＳがその活性の治療的に有用な部分を保持することを可能にする。特定の実施態様では、共有結合は抗体のＨＣとＩＤＳの間、または抗体のＬＣとＩＤＳの間にある。いずれかの適切な結合が用いられてよく、例えば、軽鎖のカルボキシ末端とＩＤＳのアミノ末端、重鎖のカルボキシ末端とＩＤＳのアミノ末端、軽鎖のアミノ末端とＩＤＳのアミノ末端、重鎖のアミノ末端とＩＤＳのアミノ末端、軽鎖のカルボキシ末端とＩＤＳのカルボキシ末端、重鎖のカルボキシ末端とＩＤＳのカルボキシ末端、軽鎖のアミノ末端とＩＤＳのカルボキシ末端、または重鎖のアミノ末端とＩＤＳのカルボキシ末端の結合が用いられてよい。いくつかの実施態様では、結合はＨＣのカルボキシ末端とＩＤＳのアミノ末端に由来する。
【０１１８】
ＩＤＳは、リンカーを通じて標的抗体（例えば、ＭＡｂ、ＨＩＲ−ＭＡｂ）と融合または共有結合していてよい。末端アミノ酸の間の結合は、融合アミノ酸配列の一部を形成する介在性ペプチドリンカー配列によって達成されうる。ペプチド配列リンカーは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超えるアミノ酸長であってよい。いくつかの好ましい実施態様を含むいくつかの実施態様では、、ペプチドリンカーは２０未満、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１のアミノ酸長である。いくつかの好ましい実施態様を含むいくつかの実施態様では、ペプチドリンカーは少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のアミノ酸長である。いくつかの実施態様では、ＩＤＳは標的抗体に直接結合し、それゆえアミノ酸長は０である。いくつかの実施態様では、ＩＤＳと標的抗体を結合するリンカーはない。いくつかの実施態様では、ＩＤＳのアミノ末端は標的抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）のカルボキシル末端と直接融合し、それゆえＩＤＳと標的抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）を結合するリンカーはない。いくつかの実施態様では、ＩＤＳのカルボキシ末端は標的抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）のアミノ末端と直接融合し、それゆえＩＤＳと標的抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）を結合するリンカーはない。いくつかの実施態様では、ＩＤＳのアミノ末端は、標的抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）のＨＣのカルボキシル末端と直接融合している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳのアミノ末端は、リンカー（例えば、本明細書に記載されているいずれかのリンカー）を通じて、標的抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）のカルボキシル末端と融合している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳのカルボキシ末端は、リンカー（例えば、本明細書に記載されているいずれかのリンカー）を通じて、標的抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）のアミノ末端と融合している。いくつかの実施態様では、ＩＤＳのアミノ末端は、リンカー（例えば、本明細書に記載されている）いずれかのリンカーを通じて、ＨＩＲのＨＣのカルボキシル末端と融合している。
【０１１９】
いくつかの実施態様では、リンカーはグリシン、セリン、および／またはアラニン残基をいずれかの組み合わせまたは順序で含む。いくつかの場合には、リンカーにおけるグリシン、セリン、およびアラニン残基を合わせたパーセンテージは、リンカー内の全残基数の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％である。いくつかの好ましい実施態様では、リンカーにおけるグリシン、セリン、およびアラニン残基を合わせたパーセンテージは、リンカー内の全残基数の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％である。いくつかの実施態様では、リンカー用に、いずれかの数のアミノ酸（天然または合成アミノ酸を含む）の組み合わせ用いることができる。いくつかの実施態様では、２つのアミノ酸のリンカーが用いられる。いくつかの実施態様では、リンカーは配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒを有する。いくつかの実施態様では、２つのアミノ酸のリンカーは、グリシン、セリン、および／またはアラニン残基をいずれかの組み合わせまたは順序で含む（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ａｌａ、またはＡｌａ−Ｓｅｒリンカー）。いくつかの実施態様では、２つのアミノ酸のリンカーは、１つのグリシン、セリン、および／またはアラニン残基と別のアミノ酸からなる（例えば、Ｓｅｒ−Ｘ、ここでＸはいずれかの周知のアミノ酸）。さらに他の実施態様では、２つのアミノ酸のリンカーは、ｇｌｙ、ｓｅｒ、またはａｌａを除くいずれか２つのアミノ酸からなる（例えば、Ｘ−Ｘ）。
【０１２０】
本明細書に記載されているように、いくつかの実施態様では、本開示に用いるためのリンカーは、２を超えるアミノ酸長を有する。本明細書でさらに記載されているように、該リンカーはグリシン、セリン、および／またはアラニン残基をいずれかの組み合わせまたは順序で含んでもよい。いくつかの実施態様では、リンカーは１つのグリシン、セリン、および／またはアラニン残基と他のアミノ酸からなる（例えば、Ｓｅｒ−ｎＸ、ここでＸはいずれかの周知のアミノ酸、ｎはアミノ酸の数）。さらに他の実施態様では、リンカーはいずれか２つのアミノ酸からなる（例えば、Ｘ−Ｘ）。いくつかの実施態様では、該いずれか２つのアミノ酸はいずれかの組み合わせまたは順序のＧｌｙ、Ｓｅｒ、またはＡｌａであって、可変数のアミノ酸がその間に介在している。１つの実施態様の１つの例では、リンカーは少なくとも１つのＧｌｙからなる。１つの実施態様の１つの例では、リンカーは少なくとも１つのＳｅｒからなる。１つの実施態様の１つの例では、リンカーは少なくとも１つのＡｌａからなる。いくつかの実施態様では、リンカーは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＧｌｙ、Ｓｅｒ、および／またはＡｌａ残基からなる。好ましい実施態様では、リンカーはＧｌｙおよびＳｅｒを反復配列で、かつ、いずれかの組み合わせまたは数で含み、例えば（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３、または他のバリエーションである。
【０１２１】
本発明に用いるためのリンカーは、当該技術分野で周知のいずれかの方法を用いることによって設計されてよい。例えば、融合タンパク質の設計において、最適なアミノ酸リンカーを決定するための複数の公的に入手可能なプログラムがある。タンパク質の配列および所望のリンカーの長さのユーザーによる入力に基づいて、最適なリンカーのアミノ酸配列を自動的に作製する公的に入手可能なコンピュータープログラム（例えばＬＩＮＫＥＲプログラム）が、本発明の方法および組成物に用いられてよい。しばしば、タンパク質設計に用いるのに最適なタンパク質リンカーを予測するために、該プログラムはタンパク質サブドメインを結合する天然リンカーの観察される傾向を用いることができる。いくつかの場合には、該プログラムは、最適なリンカーを予測する他の方法を用いる。本発明のためのリンカーを予測するのに適したいくつかのプログラムの例は、当該技術分野で記載されており、例えば、Xue et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32, W562-W565（機能性の融合タンパク質を構築するためのリンカー配列の設計を支援するためのＬＩＮＫＥＲプログラムへのインターネットリンクを提供しているウェブサーバー版）；George and Heringa, (2003), Protein Engineering, 15(11):871-879（リンカー（linker）プログラムへのインターネットリンクを提供し、タンパク質リンカーの合理的設計を記載している）；Argos, (1990), J. Mol. Biol. 211:943-958; Arai et al. (2001) Protein Engineering, 14(8):529-532; Crasto and Feng, (2000) Protein Engineering 13(5):309-312を参照することができる。
【０１２２】
ペプチドリンカー配列はプロテアーゼ切断部位を含んでよいが、しかしながらこれはＩＤＳの活性に必要というわけではない；実際、本発明のこれらの実施態様の利点は、本明細書に記載されている二機能性のＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）が、切断されることなく、輸送およびＢＢＢを越えた時点での活性の両方について、部分的または完全に活性である点にある。図５は、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体のアミノ酸配列の代表的な実施態様（配列番号１０）を示しており、ＨＣがそのカルボキシ末端を通じて２つのアミノ酸「ｓｅｒ−ｓｅｒ」リンカーを経由してＩＤＳのアミノ末端と融合している。いくつかの実施態様では、図４に示しているように、融合ＩＤＳ配列はその２５個のアミノ酸のシグナルペプチドを欠いている。
【０１２３】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されているＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）はＨＣとＬＣの両方を含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載されているＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）は、一価の抗体である。他の実施態様では、本明細書の実施例セクションに記載されているように、本明細書に記載されているＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）は、二価の抗体である。
【０１２４】
ＩＤＳ融合抗体の一部として用いられる標的抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ）は、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい；いくつかの実施態様では、抗体は、例えばＣＨＯ細胞内でのその合成によって生じたグリコシル化パターンにてグリコシル化されている。
【０１２５】
本明細書で用いられている「活性」は、生理的活性（例えば、ＢＢＢを通過する能力および／または治療活性）、結合親和性（受容体媒介ＢＢＢ輸送系に対する標的抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）の結合親和性を含む）、またはＩＤＳの酵素活性を含む。
【０１２６】
ＢＢＢを越えたＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）の輸送は、標準的な方法によって、標的抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ）単独のＢＢＢを越えた輸送と比較することができる。例えば、モデル動物、例えば哺乳類、例えば霊長類によるＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体の薬物動態および脳取り込みが用いられてよい。同様に、ＩＤＳの機能を単独の場合とＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体の一部としての場合で比較するために、ＩＤＳ活性を決定するための標準的なモデルも用いられてよい。例えば、ＩＤＳ対ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体の酵素活性を立証する実施例３を参照のこと。ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体対ＨＩＲ Ａｂ単独について、ＩＲ ＥＣＤに対する結合親和性を比較することができる。例えば、本願明細書の実施例３を参照のこと。
【０１２７】
本明細書は、本明細書に記載されている１つ以上のＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）および医薬的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物も含む。医薬的に許容される担体／賦形剤の徹底的な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, AR, ed., 20th edition, 2000: Williams and Wilkins PA, USAに見ることができる。本発明の医薬組成物は、いずれかの末梢経路、例えば静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内注射；経口、直腸、経頬、経肺、経皮、鼻腔内、または他の適切な末梢投与経路を経由した投与に適した組成物を含む。
【０１２８】
本発明の組成物は特に注射に適しており、例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、または腹腔内投与用の医薬組成物として適している。本発明の水性組成物は、医薬的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散されていてよい本発明の組成物の有効量を含む。語句「医薬的または薬理学的に許容される」は、動物、例えば適切にはヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性の、または他の有害な反応を生じない分子実体（molecular entities）および組成物を指す。本明細書で用いられている「医薬的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに等張剤および吸収遅延剤等を含む。医薬活性物質のための該媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。いずれかの通常の媒体または薬剤が有効成分と適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が期待される。補助的な有効成分も組成物に組み込まれてよい。
【０１２９】
注射用組成物のための代表的な医薬的に許容される担体は、塩、例えば鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩等；ならびに有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、および安息香酸塩等を含んでよい。例えば、本発明の組成物は液体形態にて提供されてよく、様々なｐＨ（５〜８）で、０.０１〜１％のポリソルベート−８０等の界面活性剤、またはマンニトール、ソルビトール、もしくはトレハロース等の炭水化物添加剤を含むまたは含まない生理食塩水ベースの水溶液に製剤化されてよい。通常用いられる緩衝液は、ヒスチジン緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液を含む。通常の保存および使用条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有してよい。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール；フェノール、ソルビン酸、およびチメロサール等によってもたらされうる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム、およびゼラチンの組成物における使用によってもたらされうる。
【０１３０】
ヒト投与のために、製剤はＦＤＡおよび他の規制当局基準によって要求される無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度基準を満たす。活性化合物は、一般的に、非経口投与用に製剤化され、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、または腹腔内経路を経由する注射用に製剤化されるであろう。活性成分（component）または成分（ingredient）を含有する水性組成物の製造は、本開示を考慮すれば当業者は知ることができるであろう。典型的には、該組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとして注射用に製造することができる；注射前の液体の添加の際の溶液または懸濁液の製造における使用に適した固体形態も製造されてよい；製剤は乳化されていてもよい。
【０１３１】
無菌注射用溶液は、活性化合物を、必要であれば上で列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒に必要量にて組み込み、次いで無菌濾過することによって製造される。一般的に、分散液は、様々な無菌化有効成分を、基礎となる分散媒および上で列挙したものから選択される必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって製造される。無菌注射用溶液の製造のための無菌粉末の場合、製造方法は、その前もって無菌濾過した溶液から、有効成分に加えていずれかの付加的な所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥技術を含む。
【０１３２】
製剤化すると、溶液は、投薬製剤（dosage formulation）に適合する様式および本明細書に記載されている判断基準に基づく治療的に有効な量にて全身投与されるであろう。製剤は様々な剤形、例えば上記注射用溶液の形態で容易に投与されるが、薬物放出カプセル剤等も利用されてよい。
【０１３３】
投与される医薬組成物の適切な量、治療の数、および単位用量は、本明細書に記載されているＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ）のＣＮＳ取り込み特性に従って、ならびに治療される対象、対象の状態および所望の効果に従って変動するであろう。投与に関与する人は、いずれの場合も、個々の対象に適切な用量を決定するであろう。
【０１３４】
化合物は非経口投与、例えば静脈内または筋肉内注射用に製剤化される場合に加えて、本発明の他の代替投与方法も用いられてよく、例えば、限定されるものではないが、皮内投与（米国特許第５，９９７，５０１号；第５，８４８，９９１号；および第５，５２７，２８８号を参照のこと）、経肺投与（米国特許第６，３６１，７６０号；第６，０６０，０６９号；および第６，０４１，７７５号を参照のこと）、頬側投与（米国特許第６，３７５，９７５号；および第６，２８４，２６２号を参照のこと）、経皮投与（米国特許第６，３４８，２１０号；および第６，３２２，８０８号を参照のこと）ならびに経粘膜投与（米国特許第５，６５６，２８４号を参照のこと）が用いられてよい。該投与方法は当該技術分野で周知である。例えば点鼻液もしくは鼻腔用スプレー、エアロゾルまたは吸入剤による本発明の鼻腔内投与も用いられてよい。点鼻液は、通常、液滴またはスプレーにて鼻腔に投与されるように設計された水溶液である。点鼻液は多くの点で鼻汁に類似するように製造される。それゆえ、水性点鼻液は通常、等張性で、わずかに緩衝化され、ｐＨ５.５〜６.５を維持している。さらに、必要であれば、点眼薬に用いられるものと類似の抗菌性防腐剤および適切な薬物安定剤が製剤に含まれてよい。様々な市販の点鼻剤が知られており、例えば抗生物質および抗ヒスタミン剤を含み、喘息予防に用いられている。
【０１３５】
他の投与様式に適したさらなる製剤は、坐剤およびペッサリーを含む。直腸ペッサリーまたは坐剤も用いられてよい。坐剤は様々な重量および形状の固体剤形であり、通常、直腸または尿道への挿入によって投薬される。挿入後、坐剤は軟化し、融解し、または腔液（cavity fluids）に溶解する。坐剤のための伝統的な結合剤および担体は、一般的に、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含む；該坐剤は、有効成分をいずれかの適切な範囲、例えば０.５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成されてよい。
【０１３６】
経口製剤は、通常利用される賦形剤、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウム等を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤、または粉末の形態をとる。特定の定義された実施態様では、経口医薬組成物は不活性希釈剤もしくは同化可能な食用担体を含み、ハードもしくはソフトシェルゼラチンカプセルに封入されてよく、錠剤に圧縮されてよく、または食事の食物と共に直接組み込まれてよい。治療的経口投与のために、活性化合物は賦形剤と共に組み込まれてよく、摂取可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、およびウエハー等の形態で用いられてよい。該組成物および製剤は、少なくとも０.１％の活性化合物を含有してよい。組成物および製剤のパーセンテージはもちろん変化してよく、好都合には、単位の重量の約２〜約７５％、または約２５〜６０％であってよい。そのような治療的に有用な該組成物中の活性化合物の量によって、適切な投薬量が得られるであろう。
【０１３７】
錠剤、トローチ剤、丸剤、およびカプセル剤等は、下記も含有してよい：結合剤、例えばトラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチン；賦形剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、およびアルギン酸等；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム；ならびに甘味剤、例えばスクロース、ラクトースまたはサッカリンが添加されてよく、または香味剤、例えばペパーミント、ウィンターグリーンの油、またはサクランボ香味料が添加されてよい。投薬単位形態がカプセル剤である場合、それは上記形態の物質に加えて、液体担体を含有してよい。様々な他の物質がコーティングとして存在してよく、あるいは投薬単位の物理的形態を修正するために存在してよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック（shellac）、糖またはその両方でコーティングされていてよい。エリキシル剤のシロップは、活性化合物を、スクロースを甘味剤として、メチレンおよびプロピルパラベンを防腐剤として含有してよく、色素および香味料、例えばサクランボまたはオレンジ香料を含有してよい。いくつかの実施態様では、経口医薬組成物は、胃の環境から有効成分を保護するために腸溶コーティングされていてよい；腸溶コーティングの方法および製剤は、当該技術分野で周知である。
【０１３８】
方法
本明細書に記載されているのは、本明細書に記載されているようなＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体の治療的有効量を全身投与することによって、ＢＢＢを越えてＣＮＳにＩＤＳの有効用量を送達する方法である。本明細書に記載されているように、ＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）の送達のための適切な全身投与量（systemic doses）は、そのＣＮＳ取り込み特性およびＩＤＳ比活性に基づく。ＩＤＳ欠乏症を患っている対象へのＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）の全身投与は、ＣＮＳへのＩＤＳの非侵襲的送達に対する有効なアプローチである。
【０１３９】
治療的に有効な全身投与量（systemic dose）であるＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）の量は、本明細書に記載されているように、部分的には、投与されるＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）のＣＮＳ取り込み特性、例えばＣＮＳに取り込まれる全身投与された用量のパーセンテージに依存する。
【０１４０】
いくつかの実施態様では、０.３％（すなわち、約０.３２％）、０.４％、０.４８％、０.６％、０.７４％、０.８％、０.９％、１.０５、１.１、１.２、１.３％、１.５％、２％、２.５％、５％、または約０.３％〜約１２％のいずれかの％）の全身投与されたＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）が、末梢血からＢＢＢを越えたその取り込みの結果として脳に送達される。いくつかの実施態様では、少なくとも０.５％（すなわち、約０.３２％、０.４％、０.４８％、０.６％、０.７４％、０.８％、０.９％、１.０５、１.１、１.２、１.３％、１.５％、２％、２.５％、５％、または約０.３％〜約１２％のいずれかの％）の全身投与されたＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）の用量が、全身投与後２時間以内、すなわち、１.８、１.７、１.５、１.４、１.３、１.２、１.１、０.９、０.８、０.６、０.５または約０.５〜約２時間の間のいずれかの時間で脳に送達される。
【０１４１】
従って、いくつかの実施態様では、本発明はＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）の治療的有効量を全身投与する方法を提供し、それによってＢＢＢを通過するＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）の量が対象の脳内に少なくとも０.１２５ユニットのＩＤＳ活性／ｍｇタンパク質、例えば、対象の脳内に０.１４、０.１５、０.１６、０.１７、０.１８、０.１９、０.２、０.２１、０.２２、０.２３、０.２４、０.２５、０.３、０.４、０.５、０.７５、１.０、１.５、２、または０.１２５〜２.５の間のいずれかのユニットのＩＤＳ活性／ｍｇタンパク質を提供する方法を提供する。
【０１４２】
いくつかの実施態様では、対象の脳に送達されるＩＤＳ活性の全ユニット数は、少なくとも１２，５００ユニット、例えば、少なくとも１２，５００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１６０，０００、１７０，０００、１８０，０００、１９０，０００、２００，０００、２１０，０００、２２０，０００、２３０，０００、２５０，０００または約１２，５００〜２５０，０００ユニットのＩＤＳ活性の間のいずれかの全ＩＤＳユニット数である。
【０１４３】
いくつかの実施態様では、治療的に有効な全身投与量（systemic dose）は、少なくとも５ｘ１０^５、１ｘ１０^６、２ｘ１０^６、３ｘ１０^６、４、１０^６、５ｘ１０^６、６ｘ１０^６、７ｘ１０^６、８ｘ１０^６、９ｘ１０^６、１ｘ１０^７、１.１ｘ１０^７、１.２ｘ１０^７、１.５ｘ１０^７、１.６ｘ１０^７、１.７ｘ１０^７、１.８ｘ１０^７、１.９ｘ１０^７、２ｘ１０^７、２.１ｘ１０^７、３ｘ１０^７、または約５ｘ１０^５〜３ｘ１０^７ユニットのＩＤＳ活性の間のいずれかの全身投与量（systemic dose）を含む。
【０１４４】
他の実施態様では、治療的に有効な全身投与量（systemic dose）は、少なくとも約２０，０００ユニットのＩＤＳ活性／ｋｇ体重、少なくとも約２２，０００、２４，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、２００，０００または約２０，０００〜２００，０００ユニットのＩＤＳ活性／ｋｇ体重の間のいずれかのＩＤＳユニット数である。いくつかの実施態様では、体重５０ｋｇ当たり標準化された、少なくとも約１０，０００、１５，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１６０，０００、１７０，０００、１８０，０００、１９０，０００、２００，０００、２１０，０００、２２０，０００、２３０，０００、２５０，０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性が脳に送達される。いくつかの実施態様では、体重５０ｋｇ当たり標準化された、少なくとも約２５，０００ ０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性が脳に送達される。
【０１４５】
当業者であれば、ＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）の治療的に有効な全身投与量（systemic dose）の全量（mass amount）は、部分的には、そのＩＤＳ比活性に依存するであろうことを理解できるであろう。いくつかの実施態様では、ＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）のＩＤＳ比活性は、少なくとも１０，０００Ｕ／ｍｇタンパク質、少なくとも約１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、３２，０００、３４，０００、３５，０００、３６，０００、３７，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、または約１０，０００ユニット／ｍｇ〜約５０，０００ユニット／ｍｇの間のいずれかの比活性値である。
【０１４６】
それゆえ、ＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）の比活性および治療される対象の体重を十分に考慮すると、ＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）の全身投与量（systemic dose）は、少なくとも２ｍｇ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、１００、または約２ｍｇ〜約１００ｍｇの間のいずれかの値のＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）であってよい。
【０１４７】
本明細書で用いられている用語「全身投与」または「末梢投与」は、ＣＮＳ内への直接投与ではないいずれかの投与方法、すなわち、身体的貫通またはＢＢＢの破壊を含まないいずれかの投与方法を含む。「全身投与」は、限定されるものではないが、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経頬投与、経皮投与、直腸投与、経肺（transalveolar）投与（吸入）、または経口投与を含む。本明細書に記載されているように、いずれかの適切なＩＤＳ融合抗体（例えば、ＨＩＲ ＭＡｂ）が用いられてよい。
【０１４８】
本明細書で言及されているＩＤＳ欠乏症は、ハンター症候群、ハンター病、およびムコ多糖症ＩＩ型として知られている１つ以上の状態を含む。ＩＤＳ欠乏症は、体内（心臓、肝臓、脳等）に起こるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の蓄積によって特徴付けられる。
【０１４９】
本発明の組成物、例えばＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体は、併用療法の一部として投与されてよい。該併用療法は、ＩＤＳ欠乏症を患っている患者に典型的に見られる症状の治療または軽減のための別の治療と組み合わせた本発明の組成物の投与を含む。本発明の組成物が別のＣＮＳ障害の方法または組成物と組み合わせて用いられる場合、本発明の組成物と付加的な方法または組成物のいずれかの組み合わせが用いられてよい。それゆえ、例えば、本発明の組成物が別のＣＮＳ障害治療薬と組み合わせて用いられる場合、その２つは、同時に、連続的に、重複する持続期間、類似した、同一の、または異なる頻度等で投与されてよい。いくつかの場合には、本発明の組成物を１つ以上の他のＣＮＳ障害治療薬と組み合わせて含有する組成物が用いられるであろう。
【０１５０】
いくつかの実施態様では、組成物、例えばＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体は、別の薬物と、同一の製剤内または別々の組成物として患者に同時投与される。例えば、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体は、同様にヒト血液脳関門を越えてＩＤＳ以外の組換えタンパク質を送達するように設計された別の融合タンパク質と共に製剤化されてよい。さらに、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体は、他の巨大分子または小分子と組み合わせて製剤化されてよい。
【表１】

【表２】

【０１５１】
実施例
下記の特定の実施例は、単に説明の目的で提供されていると解釈されるべきであり、いかなる場合であっても決して本開示の残りの部分を限定するものではない。これ以上詳述しなくても、当業者であれば、本明細書の記載に基づいて、本発明をその最大限の範囲まで利用することができると考えられる。本明細書で引用されている全ての出版物は、それらの全体において参照することによって本明細書に援用される。参照がＵＲＬなどの識別名またはアドレスでなされている場合、該識別名は変化してよく、インターネット上の特定の情報は現れたり消えたりしうるが、インターネットを検索することによって等価な情報を見ることができると理解されるべきである。それに対する参照は、該情報が入手可能であり、公に普及していることを証明するものである。
【０１５２】
実施例１．ＨＩＲ Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質の発現および機能分析
スライ症候群とも呼ばれるＭＰＳ−ＶＩＩで変異しているリソソーム酵素は、 −グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）である。ＭＰＳ−ＶＩＩは、脳内のグリコサミノグリカンの蓄積をもたらす。ＧＵＳＢ酵素はＢＢＢを通過しないため、ＭＰＳ−ＶＩＩの酵素補充療法（ＥＲＴ）は、脳の治療に有効ではないようである。ＢＢＢを通過するヒトＧＵＳＢを再設計する試みにおいて、ＨＩＲ Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質プロジェクトを開始した。
【０１５３】
２２個のアミノ酸のシグナルペプチドおよび１８個のアミノ酸のカルボキシル末端プロペプチドを含む、ヒトＧＵＳＢタンパク質（ＮＰ＿０００１７２）のアミノ酸Ｍｅｔ_１−Ｔｈｒ_６５１に相当するヒトＧＵＳＢ ｃＤＮＡを、逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびカスタムオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）によってクローン化した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で分離し、ヒトＧＵＳＢ ｃＤＮＡに相当する〜２.０ｋｂの予想される主要な単一バンドを単離した。クローン化されたヒトＧＵＳＢを真核生物発現プラスミドに挿入し、このＧＵＳＢ発現プラスミドをｐＣＤ−ＧＵＳＢと命名した。プラスミドの全発現カセットを双方向ＤＮＡシークエンシングによって確認した。６ウェルフォーマット中、ＣＯＳ細胞をｐＣＤ−ＧＳＵＢでトランスフェクションすると、条件培地中、７日で高ＧＵＳＢ酵素活性をもたらし（表１、実験Ａ）、これにより機能性のヒトＧＵＳＢ ｃＤＮＡが成功裏に設計されたことが立証された。ＧＵＳＢ酵素活性を、市販の４−メチルウンベリフェリル β−Ｌ−グルクロニド（ＭＵＧｌｃＵ）を用いた蛍光定量的アッセイで決定した。この基質をＧＵＳＢによって４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）に加水分解し、発光波長４５０ｎｍおよび励起波長３６５ｎｍを用いた蛍光光度計で４−ＭＵを蛍光定量的に検出する。既知量の４−ＭＵで検量線を作成した。アッセイは３７℃で６０分間インキュベーション、ｐＨ＝４.８で行い、グリシン−炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝１０.５）の添加によって終結させた。
【０１５４】
ＨＩＲ Ａｂの重鎖（ＨＣ）のカルボキシル末端が、２２個のアミノ酸のＧＵＳＢシグナルペプチドを除き、１８個のアミノ酸のカルボキシル末端ＧＵＳＢプロペプチドを含まないヒトＧＵＳＢのアミノ末端と融合している融合タンパク質を発現する、新たなｐＣＤ−ＨＣ−ＧＵＳＢプラスミド発現プラスミドを設計した。ＧＵＳＢ ｃＤＮＡを、ｐＣＤ−ＧＵＳＢをテンプレートとして用いたＰＣＲによってクローン化した。フォワードＰＣＲプライマーに「ＣＡ」ヌクレオチドを導入することによりオープンリーディングフレームを維持し、ＨＩＲ Ａｂ ＨＣのＣＨ３領域のカルボキシル末端と、酵素の２２個のアミノ酸のシグナルペプチドを含まないＧＵＳＢのアミノ末端の間にＳｅｒ−Ｓｅｒリンカーを導入した。ＧＵＳＢリバースＰＣＲプライマーは、成熟ヒトＧＵＳＢタンパク質の末端Ｔｈｒの直後にストップコドン「ＴＧＡ」を導入する。ｐＣＤ−ＨＣ−ＧＵＳＢの発現カセットのＤＮＡシークエンシングは、７１４ｎｔのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、９ｎｔのコザック部位（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）、３，２２８ｎｔのＨＣ−ＧＵＳＢ融合タンパク質オープンリーディングフレーム、および３７０ｎｔのウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）転写終結配列を含む４，３２１ヌクレオチド（ｎｔ）を包含した。プラスミドは、１９個のアミノ酸のＩｇＧシグナルペプチド、４４３個のアミノ酸のＨＩＲＭＡｂ ＨＣ、２個のアミノ酸のリンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、および酵素シグナルペプチドおよびカルボキシル末端プロペプチドを除く６１１個のアミノ酸のヒトＧＵＳＢで構成される、１，０７５個のアミノ酸タンパク質をコードしていた。ＧＵＳＢ配列は、ヒトＧＵＳＢ（ＮＰ＿０００１７２）のＬｅｕ^２３−Ｔｈｒ^６３３と１００％同一であった。グリコシル化を除く重鎖融合タンパク質の予測される分子量は１１９，３０６Ｄａであり、予測される等電点（ｐＩ）は７.８３である。
【０１５５】
ＣＯＳ細胞を６ウェルクラスターディッシュに蒔き、ｐＣＤ−ＬＣおよびｐＣＤ−ＨＣ−ＧＵＳＢで二重トランスフェクトしたが、ここでｐＣＤ−ＬＣはキメラＨＩＲ Ａｂの軽鎖（ＬＣ）をコードしている発現プラスミドである。トランスフェクションはリポフェクタミン２０００を用いて行い、１：２.５のｕｇ ＤＮＡ：ｕＬ リポフェクタミン２０００の比率とし、無血清条件培地を３日および７日で収集した。しかしながら、ｐＣＤ−ＨＣ−ＧＵＳＢおよびｐＣＤ−ＬＣ発現プラスミドによるＣＯＳ細胞の二重トランスフェクション後、ＧＵＳＢ酵素活性の特異的増加はなかった（表１、実験Ｂ）。しかしながら、培地のＩｇＧは、ヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡによって決定すると、わずか２３±２ｎｇ／ｍＬであったため、培地中の低ＧＵＳＢ活性はＨＩＲＭＡｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質の低分泌に起因しうるものであった。それゆえ、ＣＯＳ細胞トランスフェクションを１０ｘＴ５００プレートまで拡大し、ＨＩＲＭＡｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質をタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＩｇＧウエスタンブロッティングは、融合タンパク質重鎖のサイズの予想された増加を示した。しかしながら、ＨＩＲＭＡｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は低く、６.１±０.１ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｕｇタンパク質であった。対照的に、ヒト組換えＧＵＳＢの比活性は２，０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｕｇタンパク質である［Sands et al (1994) Enzyme replacement therapy for murine mucopolysaccharidosis type VII. J Clin Invest 93, 2324-2331］。これらの結果により、ＨＩＲ Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は、ＧＵＳＢとＨＩＲ ＡｂのＨＣのカルボキシル末端の融合後、＞９５％失われたことが立証された。ＨＩＲ Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質とＨＩＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の結合親和性を、ＥＬＩＳＡで調べた。ＨＩＲ ＥＣＤで永続的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を無血清培地（ＳＦＭ）中で培養し、ＨＩＲ ＥＣＤをコムギ胚芽凝集素アフィニティーカラムで精製した。ＨＩＲ ＥＣＤを９６ウェルディッシュに蒔き、ＨＩＲ Ａｂ、およびＨＩＲ Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質とＨＩＲ ＥＣＤの結合を、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体で検出し、次いでアビジンおよびビオチン化ペルオキシダーゼで検出した。最大結合の５０％を与えるタンパク質の濃度、ＥＤ_５０を、非線形回帰分析で決定した。ＨＩＲ受容体アッセイは、６１１個のアミノ酸のＧＵＳＢとＨＩＲＭＡｂ重鎖のカルボキシル末端の融合後、ＨＩＲの親和性に減少がないことを示した。ＨＩＲ ＡｂとＨＩＲ ＥＣＤの結合のＥＤ５０は０.７７±０.１０ｎＭであり、ＨＩＲ Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質の結合のＥＤ５０は０.８１±０.０４ｎＭであった。
【０１５６】
要約すれば、ＧＵＳＢとＨＩＲ Ａｂ ＨＣのカルボキシル末端の融合は、融合タンパク質とＨＩＲの結合親和性を減少させなかった。しかしながら、融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は、＞９５％減少した。
【０１５７】
ＨＩＲ ＡｂとＧＵＳＢの融合タンパク質を成功裏に産生する試みにおいて、ＧＵＳＢシグナルペプチドを含む成熟ヒトＧＵＳＢのカルボキシル末端をＨＩＲ ＡｂのＨＣのアミノ末端と融合させる新たなアプローチを行った。この融合タンパク質をＧＵＳＢ−ＨＩＲ Ａｂと命名した。第一のステップは、この新たな融合タンパク質をコードしている新たな発現プラスミドを設計することである；このプラスミドをｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＨＣと命名した。ｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＨＣプラスミドは、その１９個のアミノ酸のシグナルペプチドを含まないＨＩＲＭＡｂの重鎖（ＨＣ）のアミノ末端が、２２個のアミノ酸のＧＵＳＢシグナルペプチドを含むが、１８個のアミノ酸のカルボキシル末端ＧＵＳＢプロペプチドを含まないヒトＧＵＳＢのカルボキシル末端と融合した融合タンパク質を発現する。ｐＣＤ−ＧＵＳＢベクターは、２２個のアミノ酸のＧＵＳＢシグナルペプチドを含有するが、ＧＵＳＢカルボキシル末端の１８個のアミノ酸のプロペプチドを欠いているＧＵＳＢタンパク質を発現するＧＵＳＢ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用いられる。ｐＣＤ−ＧＵＳＢにおけるＧＵＳＢの１８個のアミノ酸のカルボキシル末端プロペプチドは、部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）によって除去した。その後（The latter）、ＧＵＳＢのＴｈｒ^６３３残基の３’−隣接領域にＡｆｅＩ部位を作製し、ｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＡｆｅＩと命名した。次いで、カルボキシル末端プロペプチドを、ＡｆｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＧＵＳＢの３’−非コード領域に位置する）で除去した。１９個のアミノ酸のＩｇＧシグナルペプチドを含まずＨＩＲＭＡｂ ＨＣストップコドンを含むＨＩＲＭＡｂ ＨＣオープンリーディングフレームは、ＨＩＲＭＡｂ ＨＣ ｃＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲによって作製した。ＰＣＲによって作製されたＨＩＲＭＡｂ ＨＣ ｃＤＮＡをｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＡｆｅＩのＡｆｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＨＣを作製した。ＧＵＳＢのカルボキシル末端とＨＩＲＭＡｂ ＨＣのアミノ末端の間のＳｅｒ−Ｓｅｒリンカーを、ＡｆｅＩ部位内に、ＨＩＲＭＡｂ ＨＣ ｃＤＮＡのクローニングに用いられるＰＣＲプライマーによって導入した。ｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＨＣ発現カセットのＤＮＡシークエンシングは、プラスミドが、２２個のアミノ酸のＧＵＳＢシグナルペプチド、６１１個のアミノ酸のＧＵＳＢ、２個のアミノ酸のリンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、および４４３個のアミノ酸のＨＩＲＭＡｂ ＨＣで構成される１，０７８個のアミノ酸のタンパク質を発現することを示した。ＧＵＳＢ配列は、ヒトＧＵＳＢ（ＮＰ＿０００１７２）のＭｅｔ^１−Ｔｈｒ^６３３と１００％同一であった。
【０１５８】
６ウェルフォーマット中、ＣＯＳ細胞をｐＣＤ−ＬＣおよびｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＨＣ発現プラスミドで二重トランスフェクションすると、ｐＣＤ−ＬＣおよびｐＣＤ−ＨＣ−ＧＵＳＢプラスミドでの二重トランスフェクションと比較して、条件培地中、７日でより高いＧＵＳＢ酵素活性をもたらした（表１、実験Ｃ）。しかしながら、ＥＬＩＳＡによって決定した７日目の条件培地中の培地のヒトＩｇＧ濃度がわずか１３±２ｎｇ／ｍＬであったため、ＧＵＳＢ−ＨＩＲＭＡｂ融合タンパク質もＣＯＳ細胞によって分泌されにくいものであった。ＣＯＳ細胞トランスフェクションを１０ｘＴ５００プレートまで拡大し、ＧＵＳＢ−ＨＩＲＭＡｂ融合タンパク質をタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、融合タンパク質重鎖のサイズの予想された増加を示した。精製ＧＵＳＢ−ＨＩＲＭＡｂ融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は高く、２２６±８ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｕｇタンパク質であったが、これはＨＩＲＭＡｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質の特異的ＧＵＳＢ酵素活性よりも３７倍高い。しかしながら、ＨＩＲ受容体アッセイによると、ＧＵＳＢとＨＩＲＭＡｂ重鎖のアミノ末端の融合後、ＨＩＲに対する親和性が著しく減少し、受容体結合親和性の９５％減少をもたらすことが示された。ＨＩＲ ＡｂとＨＩＲ ＥＣＤの結合のＥＤ５０は０.２５±０.０３ｎＭであり、ＨＩＲ Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質の結合のＥＤ５０は４.８±０.４ｎＭであった。
【０１５９】
要約すれば、ＧＵＳＢとＨＩＲ Ａｂ ＨＣのアミノ末端の融合は融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性の保持をもたらしたが、ＧＵＳＢ−ＨＩＲ Ａｂ融合タンパク質とＨＩＲの結合の９５％減少を引き起こした。対照的に、ＧＵＳＢとＨＩＲ Ａｂ ＨＣのカルボキシル末端の融合は、ＨＩＲ Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質とＨＩＲの結合親和性の減少をもたらさなかった。しかしながら、この融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は＞９５％減少した。
【０１６０】
実施例２．ヒトＨＩＲ Ａｂ重鎖−ＩＤＳ融合タンパク質発現ベクターの構築
ハンター症候群とも呼ばれるＭＰＳ−ＩＩで変異しているリソソーム酵素は、イズロン酸 ２−スルファターゼ（ＩＤＳ）である。ＭＰＳ−ＩＩは、脳内のグリコサミノグリカンの蓄積をもたらす。ＩＤＳ酵素がＢＢＢを通過しないため、ＭＰＳ−ＩＩの酵素補充療法は脳の治療に有効ではないようである。ＢＢＢを通過し、かつ酵素活性を示すことができる二機能性の分子を開発するために、ＩＤＳをＨＩＲ Ａｂと融合させた。
【０１６１】
ＨＩＲ Ａｂと融合した時にＩＤＳの酵素活性が保持されているかどうかは不明であった。これは、ＩＤＳが小胞体内で翻訳後修飾を起こすが、ＩＤＳがＨＩＲ Ａｂと融合した場合にそのプロセスが損なわれるかどうかが分からなかったからである。ＩＤＳはスルファターゼファミリーのメンバーであり、該酵素の活性は、小胞体内でスルファターゼ修飾因子によってＣｙｓ−５９がホルミルグリシン残基に変換された後に活性化される［Zito et al, Sulphatase activities are regulated by the interaction of sulphatase-modifying factor 1 with SUMF2. EMBO Rep 6 (2005) 655-660］。内部システインのホルミルグリシン残基へのこの変換がなければ、該酵素は活性を有さない。例えば融合タンパク質とＨＩＲの高結合親和性を保持する試みにおいて、ＩＤＳがＨＩＲ ＡｂのＨＣのカルボキシル末端と融合した場合、ＩｇＧ重鎖は宿主細胞内での翻訳後、３次元構造にフォールドし、次いで融合タンパク質のＩＤＳ部分がフォールディングするであろう。ＨＩＲ Ａｂ ＨＣ−ＩＤＳ融合タンパク質のＩＤＳ部分が、小胞体内のＩＤＳ修飾因子によって認識および活性化されるであろう３次元構造にフォールドし、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質内で完全なＩＤＳ酵素活性の発現がもたらされるかどうかについては不明であった。
【０１６２】
２５個のアミノ酸のシグナルペプチドを含まないＳｅｒ^２６−Ｐｒｏ^５５０をコードしているヒトＩＤＳ ｃＤＮＡ（ジェンバンクＮＰ＿０００１９３）は、ヒト肝臓ポリＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）で開始した逆転写およびＰＣＲによって作製した。ヒト肝臓ｃＤＮＡは、スーパースクリプト・ファースト−ストランド（SuperScript first-strand）合成キット（インビトロジェン社、サンディエゴ、カリフォルニア州）およびオリゴデオキシチミジンプライミングを用いて製造した。ＩＤＳ ｃＤＮＡは、２μｌ肝臓ｃＤＮＡ逆転写反応、０.２μＭ ＩＤＳフォワードおよびリバースＯＤＮプライマー（表２）、０.２ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸ならびに２.５Ｕ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を５０μｌ Ｐｆｕ緩衝液（ストラタジーン社）中で用いてクローン化した。増幅はマスターサイクラー（Mastercycler）温度サイクラー（エッペンドルフ社、ハンブルグ、ドイツ）中で行い、最初の変性ステップを９５℃で２分間、次いで３０サイクルの変性を９５℃で３０秒間、アニーリングを５５℃で３０秒間、および増幅を７２℃で１分間行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で分離し、ヒトＩＤＳ ｃＤＮＡに相当する〜１.６ｋｂの予想される主要な単一バンドを単離した（図８Ａ）。図８Ｂに概略を示しているように、クローン化されたヒトＩＤＳをｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ ＨＣ真核生物発現プラスミドのＨｐａＩ部位に挿入し、この発現プラスミドをｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳと命名した；ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＨＣ発現プラスミドはキメラＨＩＲＭＡｂの重鎖（ＨＣ）をコードしている。プラスミドの全発現カセットを双方向ＤＮＡシークエンシングによって確認した。ＩＤＳフォワードＰＣＲプライマー（配列番号１１）は、成熟ＩＤＳタンパク質の最初の７個のアミノ酸をコードしている２３塩基であった。このプライマーに「ＣＣ」ヌクレオチドを導入することによりオープンリーディングフレームを維持し、ＨＩＲＭＡｂ ＨＣのＣＨ３領域のカルボキシル末端と、酵素の２５個のアミノ酸のシグナルペプチドを含まないＩＤＳのアミノ末端の間にＳｅｒ−Ｓｅｒリンカーを導入する。ＩＤＳリバースＰＣＲプライマー（配列番号１２）は、成熟ヒトＩＤＳタンパク質の末端Ｐｒｏの直後にストップコドン、「ＴＧＡ」を含むＩＤＳ ｃＤＮＡの末端と相補的な２７塩基であった。ＩＤＳモノマーと各ＨＣのカルボキシル末端の融合は、図６に描写している。プラスミドの全発現カセットは、両鎖をシークエンシングすることによって確認した。
【０１６３】
ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳプラスミドの発現カセットのＤＮＡシークエンシングは、７１４ｎｔのサイトメガロウイルスプロモーター、９ｎｔの全コザック部位（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）、２，９７０ｎｔのＨＩＲＭＡｂ ＨＣ−ＩＤＳ融合タンパク質オープンリーディングフレーム、および３７０ｎｔのウシ成長ホルモンポリＡ配列を含む、４，０６３ヌクレオチド（ｎｔ）を包含していた。プラスミドは、１９個のアミノ酸のＩｇＧシグナルペプチド、４４３個のアミノ酸のＨＩＲＭＡｂ ＨＣ、２個のアミノ酸のリンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、および酵素シグナルペプチドを含まない５２５個のアミノ酸のヒトＩＤＳで構成される、９８９個のアミノ酸のタンパク質（配列番号１０）をコードしていた。グリコシル化を除く重鎖融合タンパク質の予測される分子量は１０８，０２９Ｄａであり、予測される等電点（ｐＩ）は６.０３である。
【０１６４】
実施例３．ＣＯＳ細胞内のＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の発現分析
ＣＯＳ細胞を６ウェルクラスターディッシュに蒔き、ｐＣＤ−ＨＣ−ＩＤＳ、およびｐＣＤ−ＬＣで二重にトランスフェクトしたが、ここでｐＣＤ−ＬＣは、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質にも用いられるキメラＨＩＲＭＡｂの軽鎖（ＬＣ）をコードしている発現プラスミドである。融合タンパク質の発現を、ヒトＩｇＧに特異的なＥＬＩＳＡでスクリーニングした。より大量の融合タンパク質の産生のために、ＣＯＳ細胞を１０ｘＴ５００フラスコ中でトランスフェクトした。３日目および７日目の培地をプールし、２Ｌの無血清条件培地を接線流濾過（ミリポア社）で４００ｍＬまで濃縮し、次いでタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【０１６５】
ＣＯＳ細胞によって産生されたタンパク質Ａ精製融合タンパク質の純度を、５％β−メルカプトエタノールを含む１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳＰＡＧＥ）で評価すると、精製ＨＩＲ Ａｂに匹敵する均一性を有していることが示された（図９）。免疫活性を、ヒトＩＤＳに対するヤギ抗体、またはヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖に対する一次ヤギ抗血清で検査した。
【０１６６】
精製ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質のウエスタンブロッティング上で、抗ヒトＩｇＧ抗体を融合タンパク質の１３５ｋＤａのＨＣ、およびキメラＨＩＲ Ａｂの５０ｋＤａのＨＣと反応させたが、サイズの差である８５ｋＤａは、ＩＤＳの融合に起因するものである（図１０Ａ）。抗ヒトＩｇＧ抗体は、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質またはＨＩＲ Ａｂの軽鎖と等しく反応するが、これは両タンパク質が同一の軽鎖で構成されているからである。抗ＩＤＳ抗体は１３５ｋＤａの融合タンパク質のＨＣと反応するが、キメラＨＩＲ ＡｂのＨＣとは反応しない（図１０Ｂ）。
【０１６７】
実施例４．ＨＩＲ結合およびＩＤＳ活性の分析
ＨＩＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する融合タンパク質の親和性は、ＥＬＩＳＡで決定した。前にColoma et al. (2000) Pharm Res, 17:266-274に記載されているように、ＨＩＲ ＥＣＤで永続的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を無血清培地（ＳＦＭ）中で培養し、ＨＩＲ ＥＣＤをコムギ胚芽凝集素アフィニティーカラムで精製した。ＨＩＲ ＥＣＤをＮｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｂ ９６ウェルディッシュに蒔き、ＨＩＲ Ａｂ、またはＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質と、ＨＩＲ ＥＣＤの結合を、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体で検出し、次いでアビジンおよびビオチン化ペルオキシダーゼ（ベクターラボラトリーズ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）で検出した。最大結合の５０％を与えるＨＩＲ ＡｂまたはＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の濃度を、非線形回帰分析で決定した。図１１に示しているように、キメラＨＩＲ ＡｂまたはＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質はＨＩＲ ＥＣＤに対して同程度の結合を示し、ＥＤ５０はそれぞれ０.３２±０.０５ｎＭおよび０.４０±０.０５ｎＭであった。
【０１６８】
ＩＤＳ酵素活性は、モサーダム・サブストレイツ（Moscerdam Substrates）社（ロッテルダム、オランダ）から購入した４−メチルウンベリフェリル ａ−Ｌ−イズロニド−２−サルフェート（４−ＭＵＳ）を用いた蛍光定量的アッセイで決定した。この基質は、ＩＤＳによって４−メチルウンベリフェリル ａ−Ｌ−イズロニド（ＭＵＢＩ）に加水分解され、ＭＵＢＩはイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ、アルデュラザイム、ジェンザイム社、ボストン、マサチューセッツ州）によって４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）に加水分解され、これはファーランド（Farrand）フィルター蛍光光度計で発光波長４５０ｎｍおよび励起波長３６５ｎｍを用いて蛍光定量的に検出される。既知量の４−ＭＵ（シグマ−アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）で検量線を作成した。アッセイは、マキルベン（McIlvaine's）緩衝液中、３７℃、ｐＨ＝４.５で４時間インキュベーションし、次いで１２ｕｇのＩＤＵＡを添加し、さらに３７℃で２４インキュベーションすることによって行った。０.２ｍＬの０.５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ＝１０.３）の添加によってインキュベーションを終結させた。１ユニット＝１ｎｍｏｌ／ｈｒである。２ステップ酵素蛍光定量的アッセイの概略を図１２Ａに示している。蛍光定量的ユニットは、精製ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の質量に比例し、融合タンパク質の酵素活性は５１±７ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｕｇタンパク質であったが（図１２Ｂ）、これはヒト組換えイズルスルファーゼについて報告されているＩＤＳ酵素活性に匹敵するものである（G. Zareba, Idursulfase in Hunter syndrome treatment. Drugs Today (Barc) 43 (2007) 759-767）。
【０１６９】
実施例５．ＭＰＳ ＩＩ型線維芽細胞におけるＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質取り込みおよび生物学的活性
ＭＰＳ ＩＩ型ハンター症候群の線維芽細胞（Hunter fibroblasts）（ＧＭ０００２９８）および健常なヒト線維芽細胞（ＧＭ０００４９７）は、コーリエル医学研究所（Coriell Institute for Medical Research）（カムデン、ニュージャージー州）から得、６ウェルクラスターディッシュ内で高密集度になるまで（to confluency）培養した。培地を吸引し、ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、血清を含まない１ｍＬのダルベッコ変法イーグル培地で、一定濃度範囲のＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質と共に、３７℃で２時間インキュベートした。培地を吸引し、ＰＢＳでウェルを広範囲に洗浄し（１ｍＬ／ウェル、５回洗浄）、単層を０.３ｍＬ／ウェルの溶解緩衝液（５ｍＭギ酸ナトリウム、０.２％トリトンＸ−１００、ｐＨ＝４.０）中で抽出し、次いで４回の凍結／融解サイクルを行い、４℃で１０分間微量遠心した。ＩＤＳ酵素活性およびビシンコニン酸タンパク質（ＢＣＡ）アッセイのために、上清を除去した。融合タンパク質の取り込みは、ＩＤＳ酵素活性／ｍｇ細胞タンパク質のｎｍｏｌ／ｈｒとして表した。
【０１７０】
ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質は、ＭＰＳ ＩＩ型線維芽細胞によって取り込まれた（図１３）。未処理のこれらの細胞における基礎ＩＤＳ活性は非常に低く、＜１０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ_ｐである。細胞内ＩＤＳ酵素活性は、培地のＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳの濃度に比例して増加する（図１３）。健常なヒト線維芽細胞における正常なＩＤＳ酵素活性は、図１３に水平バーで示している。
【０１７１】
細胞のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）蓄積に対するＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の効果を、^３５Ｓ取り込みアッセイで評価した。ＭＰＳ ＩＩ型または健常なヒト線維芽細胞を２５０，０００細胞／ウェルで６ウェルクラスターディッシュに蒔き、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で４日間培養した。培地を捨て、ウェルをＰＢＳで洗浄し、１０％透析ウシ胎児血清を含む１ｍＬ／ウェルの低サルフェート（low sulfate）Ｆ１２培地を添加すると共に、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質（０.３ｕｇ／ｍＬ）、および１０ｕＣｉ／ｍＬの^３５Ｓ−硫酸ナトリウム（パーキンエルマー社、ボストン、マサチューセッツ州）を添加した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、培地を吸引し、ウェルを冷ＰＢＳで洗浄し（１ｍＬ、５回洗浄）、細胞を０.４ｍＬ／ウェルの１Ｎ ＮａＯＨで溶解した。溶解物を６０℃で６０分間加熱してタンパク質を可溶化し、ＢＣＡタンパク質アッセイ用に一定分量を除去し、パーキンエルマーＴｒｉ−Ｃａｒｂ２１００液体シンチレーションカウンターでサンプルの放射能をカウントした。データは、^３５Ｓカウント毎分（ＣＰＭ）／ｕｇタンパク質として表した。ＧＡＧ蓄積のパーセント標準化は［（Ａ−Ｂ／（Ａ−Ｃ）］ｘ１００から計算したが、ここでＡ＝未処理のハンター症候群の線維芽細胞（Hunter fibroblasts）に取り込まれた^３５Ｓ放射能、Ｂ＝ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質で処理されたハンター症候群の線維芽細胞（Hunter fibroblasts）に取り込まれた^３５Ｓ放射能、Ｃ＝健常なヒト線維芽細胞に取り込まれた^３５Ｓ放射能である。
【０１７２】
培地中の０.３ｕｇ／ｍＬのＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質で処理した、または未処理のハンター症候群の線維芽細胞（Hunter fibroblasts）、および健常なヒト線維芽細胞を、細胞内ＧＡＧｓに取り込まれる^３５Ｓ−硫酸ナトリウムの存在下で２４時間インキュベートした。ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質による処理は、健常な線維芽細胞と比較して、ハンター症候群の線維芽細胞（Hunter fibroblasts）におけるＧＡＧ蓄積を８４％減少させた（ｐ＜０.０００５）（図１４）。ハンター症候群の線維芽細胞（Hunter fibroblasts）におけるＧＡＧ蓄積の予防（図１４）は、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合抗体が、ＧＡＧが蓄積する細胞のリソソーム区画に向けられていることを示すものである。
【０１７３】
実施例６．宿主細胞の永続的トランスフェクションのための発現ベクター
ＨＩＲＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質は２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）で構成されるヘテロ四量体タンパク質であり（図６）、別々のＨＣおよびＬＣタンパク質は別々のＨＣおよびＬＣ遺伝子から産生される。それゆえ、永続的にトランスフェクトされた宿主細胞による全融合タンパク質の高産生を保証するために、ＨＣおよびＬＣの両方について宿主細胞内で同様に高い発現を達成することが必要である。さらに、宿主細胞は、導入遺伝子の挿入部位周辺の宿主ゲノムの選択的増幅を可能にするマーカー遺伝子で、永続的にトランスフェクトされていなければならない。例えば、宿主細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）等の薬物に持続的に曝露すると、標的酵素、すなわちジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を高発現しているクローンを選択することができるであろう。ＨＣ融合遺伝子、ＬＣ遺伝子、およびＤＨＦＲ遺伝子の同様に高い発現を保証するために、これら３つの遺伝子をコードしている発現カセットを全て、図１５に概略を示しているタンデムベクターと呼ばれる一本鎖のＤＮＡ上に配置した。ＨＣ融合遺伝子およびＬＣ遺伝子は、５’側にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来プロモーターが隣接し、５’側にウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子由来のポリＡ＋配列が隣接している。ＤＨＦＲ遺伝子は５’側にＳＶ４０プロモーターが隣接し、３’側に肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）ゲノム由来のポリＡ配列が隣接していた。ＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳは、ｎｅｏ、すなわちネオマイシン耐性遺伝子をコードしている発現カセットも含み、Ｇ４１８による選別を可能にした（図１５）。
【０１７４】
ＴＶの設計を（ａ）アガロースゲル電気泳動、（ｂ）ＣＯＳ細胞内のＩｇＧ発現、および（ｃ）双方向ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１７５】
ＬＣ、ＨＣ融合タンパク質、およびＤＨＦＲのオープンリーディングフレームをコードしているヌクレオチド（ｎｔ）配列は、それぞれ配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５に示している（それぞれ図１６、１７、および１８）。タンデムベクター上のＨＣ融合遺伝子、ＬＣ遺伝子、およびＤＨＦＲ遺伝子によってコードされているアミノ酸（ＡＡ）配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号１６、および配列番号１７に示している（それぞれ図５、１９、および２０）。
【０１７６】
実施例７．ＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳによるチャイニーズハムスター卵巣細胞の永続的トランスフェクション
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、１ｘＨＴサプリメント（ヒポキサンチンおよびチミジン）を含有する無血清ＨｙＱ ＳＦＭ４ＣＨＯユーティリティ培地（ハイクローン社）中で培養した。ＣＨＯ細胞（５ｘ１０^６個の生細胞）を、５μｇのＰｖｕＩで直線状にした（linearized）ＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳプラスミドＤＮＡと共にエレクトロポレーションした。次いで、細胞−ＤＮＡ懸濁液を氷上で１０分間インキュベートした。ＣＨＯ細胞についてのバイオラド・プリセットプロトコール（BioRad pre-set protocol）、すなわち、１５ｍｓｅｃおよび１６０ボルトのパルスを有する方形波で細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を氷上で１０分間インキュベートした。細胞懸濁液を５０ｍＬ培地に移し、１２５μｌ／ウェルで４ｘ９６ウェルプレートに蒔いた（１０，０００細胞／ウェル）。計１０回のエレクトロポレーションおよび４，０００ウェルを１回の研究で行った。
【０１７７】
エレクトロポレーション（ＥＰ）後、ＣＨＯ細胞を３７℃で８％ＣＯ２のインキュベーター内に置いた。ＴＶ内のｎｅｏ遺伝子の存在のために、トランスフェクトされた細胞株は最初にＧ４１８で選別した。ＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳはＤＨＦＲ遺伝子も含有するため（図１５）、トランスフェクトされた細胞は２０ｎＭメトトレキセート（ＭＴＸ）およびＨＴ欠損培地によっても選別することができた。ＥＰ後約２１日で目に見えるコロニーが検出された時点で、ＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧ検査用に条件培地をサンプリングした。ＥＬＩＳＡで高ヒトＩｇＧシグナルを示すウェルを、９６ウェルプレートから１ｍＬのＨｙＱ ＳＦＭ４ＣＨＯ−ユーティリティを含む２４ウェルプレートへ移した。２４ウェルプレートを３７℃で８％ＣＯ２のインキュベーターに戻した。翌週、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを２４ウェルプレート内のクローンに対して行った。これを、６ウェルプレートからＴ７５フラスコ、ならびに最終的にはオービタルシェーカー上の６０ｍＬおよび１２５ｍＬの正方形のプラスチックビンまで繰り返した。この段階で、最終ＭＴＸ濃度は８０ｎＭであり、培地中のＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の尺度である培地のＩｇＧ濃度は細胞密度１０^６／ｍＬで＞１０ｍｇ／Ｌであった。
【０１７８】
希釈クローニング（ＤＣ）用に選択されたクローンを、インキュベーター内のオービタルシェーカーから除去し、無菌フードに移した。５％透析ウシ胎児血清（ｄ−ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＦ−１２Ｋ培地で細胞を５００ｍＬまで希釈し、最終希釈度を８細胞／ｍＬとし、４０ｘ９６ウェルプレート内の４，０００ウェルに１細胞／ウェル（ＣＰＷ）の細胞密度で蒔くことができるようにする。無菌フード内で細胞懸濁液を調製した時点で、８チャネルピペッターまたは高精度ピペッターシステムを用いて１２５ｕＬ分量を９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。プレートを３７℃で８％ＣＯ２のインキュベーターに戻した。１細胞／ウェルまで希釈した細胞は、血清なしでは生存できない。６日目または７日目に、ＤＣプレートをインキュベーターから除去し、無菌フードに移し、そこで５％透析ウシ胎児血清（ｄ−ＦＢＳ）を含む１２５μｌのＦ−１２Ｋ培地を各ウェルに添加した。この時点で、この選択培地は、５％ｄ−ＦＢＳ、３０ｎＭ ＭＴＸおよび０.２５ｍｇ／ｍＬジェネテシンを含有していた。最初の１ＣＰＷプレーティングから２１日目、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ用に、ロボット装置を用いて４，０００ウェルのそれぞれから一定分量を除去した。ＤＣプレートをインキュベーターから除去し、無菌フードに移し、そこで９６ウェルプレートの１ウェル当たり１００μｌの培地を除去し、８チャネルピペッターまたは高精度ピペッターシステムを用いて新たな無菌サンプル９６ウェルプレートに移した。
【０１７９】
最初の１ＣＰＷプレーティングから２０日目、４０ｘ９６ウェルイムノアッセイプレートに、１００ｕＬの１μｇ／ｍＬの一次抗体溶液、マウス抗ヒトＩｇＧの０.１Ｍ ＮａＨＣＯ３溶液を蒔いた。プレートを４℃の冷蔵庫内で一晩インキュベートする。翌日、ＥＬＩＳＡプレートを１ｘＴＢＳＴで５回洗浄し、１００ｕＬの１ｕｇ／ｍＬの二次抗体溶液およびブロッキング緩衝液を添加した。プレートを１ｘＴＢＳＴで５回洗浄する。１００ｕＬの１ｍｇ／ｍＬの４−ニトロフェニルホスフェート ジ（２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール）塩の０.１Ｍグリシン緩衝液中溶液を、９６ウェルイムノアッセイプレートに添加する。マイクロプレートリーダーでプレートを読んだ。アッセイにより、４，０００ウェル／実験についてのＩｇＧ出力データが得られた。最も生産性の高い２４〜４８ウェルをさらなる増殖用に選択した。
【０１８０】
１ＣＰＷ ＤＣに由来する最も生産性の高い２４ウェルプレートを無菌フードに移し、６ウェルディッシュ、Ｔ７５フラスコ、およびオービタルシェーカー上の１２５ｍＬの正方形のプラスチックビンを通じて徐々にサブクローンした。このプロセスの間、細胞の遠心分離の最終段階で血清をゼロまで減少させ、ＳＦＭへ再懸濁した。
【０１８１】
上記手順を、２回目の希釈クローニングで、０.５細胞／ウェル（ＣＰＷ）で繰り返した。この段階で、およそ４０％のウェルが何らかの細胞増殖を示し、増殖を示している全てのウェルはヒトＩｇＧの分泌も示した。これらの結果により、これらの手順でウェル当たり平均１細胞のみが蒔かれ、ＣＨＯ細胞株が単一細胞から生ずることが確認された。
【０１８２】
ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質は、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞によって、細胞密度１〜２百万細胞／ｍＬで、培地濃度１０〜２０ｍｇ／Ｌで多量に培地に分泌された。ＣＨＯ由来ＨＩＲＭＡｂをタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩｇＧまたはＩＤＳウエスタンブロッティング上の融合タンパク質の遊走パターンは、一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞によって産生されたＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質について図９および１０に示しているものと同一であった。ＣＨＯ由来融合タンパク質は、サイズ排除ＨＰＬＣ上で、凝集することなく単一ピークとして遊走した。ＣＨＯ由来融合タンパク質は、ＨＩＲに対する高結合親和性を保持していた。図１１の研究で行われた方法と同一の方法を用いると、ＣＨＯ由来融合タンパク質はＨＩＲに対する高結合親和性を有することを示し、ＥＣ５０は０.３６±０.０４ｎＭであったが、これは融合ＩＤＳを有さないＨＩＲ ＡｂについてのＥＣ５０、０.４１±０.０９ｎＭと有意な違いはなかった。ＣＨＯ由来ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質は、ＩＤＳとＨＩＲ Ａｂの融合にもかかわらず、高ＩＤＳ酵素活性を保持していた。図１２に記載されているＩＤＳ酵素アッセイを用いると、ＣＨＯ由来ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質のＩＤＳ酵素比活性は１１５±７ｎｍｏｌ／ｕｇタンパク質／時間であるが、これはＣＯＳ由来融合タンパク質のＩＤＳ比活性よりもさらに高い（図１２Ｂ）。
【０１８３】
ＩＤＳはＩＤＳ酵素活性の発現に特異的翻訳後修飾を必要とするスルファターゼファミリーのメンバーであるため、ＣＨＯ由来ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の高ＩＤＳ酵素活性は驚くべきものである。ＩＤＳ酵素の活性は、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）とも呼ばれるスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）によるＣｙｓ−５９のホルミルグリシン残基への変換後に活性化される。安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞によって産生されたＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳ融合タンパク質におけるＩＤＳ酵素活性の保持は、ＨＩＲＭＡｂ重鎖と融合しているにもかかわらず、ＩＤＳ酵素が宿主細胞内で活性化されていることを示すものである。
【０１８４】
実施例８．融合タンパク質からのＩＤＳプロペプチドの除去
２５個のアミノ酸のシグナルペプチドに続くＩＤＳの最初の８個のアミノ酸はプロペプチドを構成しているが（Flomen et al, Determination of the organization of coding sequences within the iduronate sulphate sulphatase (IDS) gene, Hum. Mol. Genet. 2, 5-10, 1993）、これはエンドプロテアーゼによって切断されうる。該切断はＨＩＲ ＡｂからのＩＤＳの分離をもたらしうるが、この場合、ＩＤＳはＨＩＲ Ａｂトロイの木馬によってＢＢＢを越えて輸送され得ない。この場合、ＩＤＳ ｃＤＮＡは、表２に記載されている新たなフォワードＯＤＮ（配列番号１９）を用いたＰＣＲによって再増幅されうる。表２に記載されているＩＤＳ ＦＷＤ２ ＯＤＮおよびＩＤＳ ＲＥＶ ＯＤＮによるＰＣＲは、２５個のアミノ酸のシグナルペプチド、Ｍｅｔ−１〜Ｇｌｙ−２５を含まず、８個のアミノ酸のプロペプチド、Ｓｅｒ−２６〜Ｔｈｒ−３３を含まず、Ｔｈｒ−３４で始まり、Ｐｒｏ−５５０で終わるヒトＩＤＳ配列（ＮＰ＿０００１９３）であるＩＤＳ酵素をコードするＩＤＳ ｃＤＮＡを増幅するであろう。ＩＤＳ ＦＷＤ２ ＯＤＮは５’末端に「ＣＣ」を有し、それによりＨＩＲ ＡｂのＨＣのＣＨ３領域のカルボキシル末端を含むオープンリーディングフレームを維持し、ＨＩＲ Ａｂ ＨＣのカルボキシル末端とＩＤＳのアミノ末端の間にＳｅｒ−Ｓｅｒリンカーを配置する。
【０１８５】
実施例９．ＩＤＳと標的抗体を結合するアミノ酸リンカー
成熟ヒトＩＤＳは、ＨＩＲ ＡｂのＨＣのカルボキシル末端と、２個のアミノ酸のリンカー、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（図５で下線を引いている）で融合している。多数のリンカーのバリエーションがＳｅｒ−Ｓｅｒリンカーの代わりに用いられる。２個のアミノ酸のリンカーは保持されてよいが、アミノ酸配列は代替のアミノ酸、例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、もしくはＡｌａ−Ｓｅｒ、または２０個の天然アミノ酸の多数の組み合わせに変化してよい。または、リンカーは１個のアミノ酸、または０個のアミノ酸に減少している。０個のアミノ酸のリンカーの場合、ＩＤＳのアミノ末端はＨＩＲ ＡｂのＨＣのカルボキシル末端と直接融合している。あるいは、リンカーの長さは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個のアミノ酸まで伸長してよい。融合タンパク質の設計における最適なアミノ酸リンカーを決定するための複数の公に入手可能なプログラムがあるため、該リンカーは当該技術分野で周知である。頻繁に用いられるリンカーは、反復配列におけるＧｌｙおよびＳｅｒの様々な組み合わせ、例えば（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３、または他のバリエーションを含む。
【０１８６】
実施例１０．（理論的実施例）ヒト脳へのＩＤＳの受容体媒介送達
ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩ型（ＭＰＳ−ＩＩ）、またはハンター症候群は、リソソーム酵素、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードしている遺伝子の欠損に起因するリソソーム蓄積症である。ＭＰＳ−ＩＩは酵素補充療法（ＥＲＴ）において組換えヒトＩＤＳで治療される［Muenzer, et al, A phase II/III clinical study of enzyme replacement therapy with idurosulfase in mucopolysaccharidosis II (Hunter syndrome). Genet. Med. 8 (2006) 465-473］。しかしながら、ＭＰＳ−ＩＩの多くの症例は中枢神経系に影響する［Al Sawaf, et al, Neurological findings in Hunter disease: pathology and possible therapeutic effects reviewed. J Inherit Metab Dis 31 (2008) 473-480］。ＩＤＳはＢＢＢを通過しないためＥＲＴは脳に有効ではなく、脳に影響するＭＰＳ−ＩＩ症例において、ＥＲＴの使用は任意であると考えられている［Wraith, et al, Mucopolysaccharidosis type II (Hunter syndrome): a clinical review and recommendations for treatment in the era of enzyme replacement therapy. Eur J Pediatr 167 (2008) 267-77］。ＭＰＳ−ＩＩを患う対象の脳を治療することは現在不可能であり、ＭＰＳ−ＩＩと関連する容赦ない神経機能の低下および死を防ぐための新たな治療が必要とされている。
【０１８７】
ＨＩＲ Ａｂ等のＢＢＢの分子的トロイの木馬との融合タンパク質（図６）としての酵素の再設計後、ＩＤＳはヒトＢＢＢを通過する。アカゲザルにおけるＨＩＲ Ａｂの脳取り込みは、脳１００グラム当たり注入量（ＩＤ）の約１％である［Boado et al. (2007), Biotechnol Bioeng, 96(2):381-391.］。アカゲザル脳のサイズはおよそ１００グラムである；それゆえ、注入量の約１％が霊長類脳に分布している。ハンター症候群において静脈内の組換えＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ用量を約１.０ｍｇ／ｋｇで与える場合、５０ｋｇの患者であれば５０ｍｇの融合タンパク質が注入されるであろうが、これは５ｘ１０^７ｎｇの融合タンパク質に等しい。脳による融合タンパク質の取り込みは、ＩＤ／グラムの％として表され、ヒトでは、霊長類と比較して、体重に比例して減少していると予想される。それゆえ、ヒト脳における融合タンパク質の予想される脳取り込みは、ヒト脳当たり注入量の約１％、または１０００ｇのヒト脳当たりＩＤの約１％である。１グラムの脳は、約１００ｍｇの脳タンパク質を含有する。融合タンパク質の脳取り込みは、約１０^−２／ヒト脳、約１０^−５／グラム脳、または約１０^−７／ｍｇ脳タンパク質である。それゆえ、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の脳濃度は、約［（１０^−７／ｍｇタンパク質）ｘ（５ｘ１０^７ｎｇの注入された融合タンパク質）］または約５ｎｇ融合タンパク質／ｍｇ脳タンパク質である。ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質についてＩＤＳ酵素比活性が１１５ユニット／ｕｇ融合タンパク質である場合（図１２Ｂ）、すなわち０.１２ユニット／ｎｇの融合タンパク質である場合、脳内のＩＤＳ活性は約０.６ユニット／ｍｇ脳タンパク質であり、ここで１ユニット＝１ｎｍｏｌ／ｈｒである。ヒト脳当たり１０^５ｍｇタンパク質を与えると、ヒト脳に送達されるＩＤＳ活性は約６０，０００ユニットであると予想される。脳内の正常なＩＤＳ酵素活性は約２.５ユニット／ｍｇタンパク質である（Tomatsu et al, Murine model of MPS IVA with missense mutation at the active site cysteine conserved among sulfatase proteins. Molec. Genet. Metab. 91, 251-258, 2007）。
【０１８８】
それゆえ、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の投与は、１ｍｇ／ｋｇの用量で、かつ体重５０ｋｇで、正常な脳ＩＤＳ酵素活性の２０％補充（replacement）を生じると予想される。リソソーム蓄積症における治療効果は、正常な組織酵素活性の＜５％の補充（replacement）で達成される［Muenzer and Fisher, Advances in the treatment of mucopolysaccharidosis type I. N Engl J Med 350 (2004) 1932-1934］。ヒト脳におけるＩＤＳ酵素活性のより高度の補充（replacement）は、ＨＩＲ Ａｂ−ＩＤＳ融合タンパク質の投薬量を増加させることによって可能になるであろう。
【０１８９】
本発明の好ましい実施態様は本明細書に示され、記載されているが、一方、該実施態様はほんの一例として提供されていることは当業者には明らかなことであろう。ここで、本発明から逸脱することなく、多数のバリエーション、変化、および置換が当業者になされるであろう。本発明を実施するにあたり、本明細書に記載されている本発明の実施態様の様々な代替物が利用されてよいと理解されるべきである。下記の請求項は本発明の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内にある方法および構造ならびにそれらの均等物がそれに包含されることが意図されている。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする対象の中枢神経系におけるイズロン酸−２−スルファターゼ欠乏症を治療する方法であって、イズロン酸−２−スルファターゼ活性を有する融合抗体の治療的有効量を対象に全身投与することを含む方法であって、融合抗体が、
（ａ）免疫グロブリン重鎖およびイズロン酸−２−スルファターゼのアミノ酸配列を含む融合タンパク質であって、イズロン酸−２−スルファターゼのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合している融合タンパク質；ならびに
（ｂ）免疫グロブリン軽鎖；
を含み、融合抗体が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、かつ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸またはヘパリンのＬ−イズロン酸 ２−硫酸単位の２−硫酸基の加水分解を触媒する、方法。
【請求項２】
融合抗体がスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）によって翻訳後修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
融合抗体がホルミルグリシンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＩＤＳが、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％を保持している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＩＤＳおよび免疫グロブリンが、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％をそれぞれ保持している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
体重５０ｋｇ当たり標準化された、少なくとも約２５，０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性が脳に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
治療的有効量が少なくとも約２５０，０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性または少なくとも約２５，０００ユニット／Ｋｇ体重を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
融合抗体のイズロン酸−２−スルファターゼ比活性が少なくとも１０，０００ユニット／ｍｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
免疫グロブリン重鎖がκクラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、または配列番号３のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
免疫グロブリン軽鎖がＩｇＧの免疫グロブリン軽鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
免疫グロブリン軽鎖がκクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、または配列番号６のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に結合することによってＢＢＢを通過する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を通ってＢＢＢを通過する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
融合抗体がインスリン受容体に結合することによってＢＢＢを通過する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
治療を必要とする対象の中枢神経系におけるイズロン酸−２−スルファターゼ欠乏症を治療する方法であって、イズロン酸−２−スルファターゼ活性を有する融合抗体の治療的有効量を対象に全身投与することを含む方法であって、融合抗体が、
（ａ）配列番号１０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および
（ｂ）免疫グロブリン軽鎖；
を含み、融合抗体が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、かつ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸またはヘパリンのＬ−イズロン酸 ２−硫酸単位の２−硫酸基の加水分解を触媒する、方法。
【請求項１９】
融合抗体がスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）によって翻訳後修飾されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
融合抗体がホルミルグリシンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
体重５０ｋｇ当たり標準化された、少なくとも約２５，０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性が脳に送達される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
治療的有効量が少なくとも約２５０，０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性または少なくとも約２５，０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性／Ｋｇ体重を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
融合抗体のイズロン酸−２−スルファターゼ比活性が少なくとも約１０，０００ユニット／ｍｇである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ＩＤＳが、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％を保持している、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＤＳおよび免疫グロブリンが、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％をそれぞれ保持している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
全身投与が非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、動脈内投与、経皮投与、または呼吸器投与である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
免疫グロブリン軽鎖がＩｇＧの免疫グロブリン軽鎖である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
免疫グロブリン軽鎖がκクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、または配列番号６のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に結合することによってＢＢＢを通過する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を通ってＢＢＢを通過する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
融合抗体がインスリン受容体に結合することによってＢＢＢを通過する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
治療を必要とする対象の中枢神経系におけるイズロン酸−２−スルファターゼ欠乏症を治療する方法であって、イズロン酸−２−スルファターゼ活性を有する融合抗体の治療的有効量を対象に全身投与することを含む方法であって、融合抗体が、
（ａ）免疫グロブリン軽鎖およびイズロン酸−２−スルファターゼのアミノ酸配列を含む融合タンパク質であって、イズロン酸−２−スルファターゼのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している融合タンパク質；または
（ｂ）免疫グロブリン重鎖；
を含み、融合抗体が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、かつ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸またはヘパリンのＬ−イズロン酸 ２−硫酸単位の２−硫酸基の加水分解を触媒する、方法。
【請求項３４】
融合抗体がスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）によって翻訳後修飾されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
翻訳後修飾がシステインをホルミルグリシンへ変換することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
体重５０ｋｇ当たり標準化された、少なくとも約２５，０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性が脳に送達される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
治療的有効量が少なくとも約２５０，０００ユニットのα−Ｌ−イズロニダーゼ活性または少なくとも約２５，０００ユニットのイズロン酸−２−スルファターゼ活性／Ｋｇ体重を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
融合抗体のイズロン酸−２−スルファターゼ比活性が約１０，０００ユニット／ｍｇである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
ＩＤＳが、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％を保持している、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
ＩＤＳおよび免疫グロブリンが、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％をそれぞれ保持している、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
免疫グロブリン重鎖がκクラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、または配列番号３のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
免疫グロブリン軽鎖がＩｇＧの免疫グロブリン軽鎖である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
免疫グロブリン軽鎖がκクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４６】
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、または配列番号６のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４７】
融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に結合することによってＢＢＢを通過する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を通ってＢＢＢを通過する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
融合抗体がインスリン受容体に結合することによってＢＢＢを通過する、請求項３３に記載の方法。
【請求項５０】
（ａ）免疫グロブリン重鎖およびイズロン酸−２−スルファターゼのアミノ酸配列を含む融合タンパク質であって、イズロン酸−２−スルファターゼのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合している融合タンパク質；ならびに
（ｂ）免疫グロブリン軽鎖；
を含む融合抗体であって、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、かつ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸またはヘパリンのＬ−イズロン酸 ２−硫酸単位の２−硫酸基の加水分解を触媒する、融合抗体。
【請求項５１】
融合抗体がスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）によって翻訳後修飾されている、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項５２】
融合抗体がホルミルグリシンを含む、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項５３】
融合タンパク質が、イズロン酸−２−スルファターゼのアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間のリンカーをさらに含む、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項５４】
融合抗体のイズロン酸−２−スルファターゼ比活性が少なくとも約１０，０００ユニット／ｍｇである、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項５５】
ＩＤＳが、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％を保持している、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項５６】
ＩＤＳおよび免疫グロブリンが、独立体（separate entity）としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％をそれぞれ保持している、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項５７】
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項５８】
免疫グロブリン重鎖がκクラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項５９】
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、または配列番号３のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項６０】
免疫グロブリン軽鎖がＩｇＧの免疫グロブリン軽鎖である、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項６１】
免疫グロブリン軽鎖がκクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項６２】
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ２、または配列番号６のアミノ酸配列に相当するＣＤＲ３を含む、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項６３】
融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に結合することによってＢＢＢを通過する、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項６４】
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を通ってＢＢＢを通過する、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項６５】
融合抗体がインスリン受容体に結合することによってＢＢＢを通過する、請求項５０に記載の融合抗体。
【請求項６６】
請求項５０に記載の融合抗体の治療的有効量および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６７】
請求項５０に記載の融合抗体をコードしている単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６８】
単離されたポリヌクレオチドが配列番号１４の核酸配列を含む、請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６９】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７０】
配列番号１４の核酸配列を含む請求項６７に記載のベクター。
【請求項７１】
請求項６９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７２】
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項７１に記載の宿主細胞。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【公表番号】特表２０１３−５０７１３１（Ｐ２０１３−５０７１３１Ａ）
【公表日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３３３７５（Ｐ２０１２−５３３３７５）
【出願日】平成２２年１０月８日（２０１０．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５２１１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４４５４２
【国際公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【出願人】（５０８１０５７５１）アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＡＲＭＡＧＥＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，　ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】