ＣａＭＫＩＩ阻害ペプチドおよびこれを含有するＣａＭＫＩＩ阻害剤
【課題】ＡＩＰとは異なる新規なアミノ酸配列を有するＣａＭＫII阻害ペプチドおよびこれを含有するＣａＭＫII阻害剤の提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むペプチドをＣａＭＫ II阻害ペプチドを得た。該アミノ酸配列を有するペプチドは、目的に合わせたさまざまな機能付加等が可能である。また、このＣａＭＫII阻害ペプチドを含有するＣａＭＫII阻害剤は、ＣａＭＫIIの異常な活性化などに起因する疾患の治療に利用することができる。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むペプチドをＣａＭＫ II阻害ペプチドを得た。該アミノ酸配列を有するペプチドは、目的に合わせたさまざまな機能付加等が可能である。また、このＣａＭＫII阻害ペプチドを含有するＣａＭＫII阻害剤は、ＣａＭＫIIの異常な活性化などに起因する疾患の治療に利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃａ２+／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭＫII）の活性を阻害するペプチドおよびこれを含有するＣａＭＫII阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ca2+/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase; ＣａＭＫ）は、Ca2+結合性蛋白質であるカルモデュリンにCa2+が結合したCa2+/カルモデュリンによって活性化されるセリン／スレオニンキナーゼの総称である。CaMKには３種のファミリー（ＣａＭＫＩ, ＣａＭＫＩＩ, ＣａＭＫＩＶ）が存在し、各々が生体内で異なった役割を果たしている。なかでもＣａＭＫIIは脳に豊富に存在し、神経伝達物質の合成や分泌、神経伝達の長期増強の誘導など、高次神経機能の制御に重要な役割を果たすことが知られている。その一方で、ＣａＭＫIIの異常な活性化がパーキンソン病や認知障害、痙攣などの神経疾患の発症と密接に関連していることが示されている。さらに神経疾患に限らず、心不全の誘発、骨粗鬆症の発症、アポトーシスの誘導阻害を介した発癌促進など、ヒトの様々な疾患発症に関与していることが知られている。
【０００３】
そして、ＣａＭＫII阻害剤としては、その制御ドメインに存在している自己リン酸化部位の配列に由来するペプチドＡＩＰ：Autocamtide 2 Related Inhibitory Peptide、配列番号１５：Lys-Lys-Ala-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Val-Asp-Ala-Leu（ＫＫＡＬＲＲＱＥＡＶＤＡＬ）が知られている（非特許文献１）。また、例えば、特許文献１〜３には、ＣａＭＫＩＩ阻害剤として、前記ＡＩＰのアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列からなるペプチドが提案されている。
【０００４】
一方、近年ＣａＭＫIIの構造解析が行われ、その極めてユニークな高次構造が明らかになっている。ＣａＭＫIIはアソシエーションドメインとよばれる領域を中心にして１２分子が円盤状に会合し、この円盤状の核構造の周りに各々のＣａＭＫIIのキナーゼドメイン（触媒ドメイン）がリング状にパッキングされた状態で配置している。Ca2+非存在下ではこの状態で安定に存在しているが、種々の刺激によって細胞内Ca2+濃度が上昇し、Ca2+が結合したカルモデュリンが供給されるとパッキングがほどけ、１２量体の各々のキナーゼが協調的に順次活性化すると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許２９６３９８６号公報
【特許文献２】特表２００１−５０９８０８号公報
【特許文献３】特表２００５−５０４８２９号公報
【特許文献４】ＷＯ２００６／００１５４２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Biochem Biophys Res Commun. 1995 Jul 26;212(3):806-12
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ＡＩＰやその他特許文献１〜３のペプチドの場合、アミノ酸配列における各ポジションの重要性、阻害メカニズムに関する詳細な検討が難しく、生体内動態の制御や膜透過性、安定性の向上など、目的に合わせたさまざまな機能付加、機能改善が困難であるという問題がある。この点を克服することができれば、上記の種々の重要疾患に対する優れた治療薬開発が大きく促進されると期待される。
【０００８】
一方、本発明者らはこれまでに、多価型の相互作用（クラスター効果）に基づく強い結合を阻害するペプチドを同定する新しい方法、多価型ペプチドライブラリー法を確立している（上記特許文献４）。ペプチドライブラリー法は、同定されるペプチド配列の各位置のアミノ酸に関する相対的な重要度が定量化できるという大きな特徴を有する。
【０００９】
そこで、本発明者らは、多価型ペプチドライブラリー法をＣａＭＫIIに対して適用することにより、クラスター化したＣａＭＫIIに対して作用するペプチド配列のスクリーニングが容易になるのではないかとの想定のもと、一連の優れたＣａＭＫII阻害ペプチドの取得を試みた。
【００１０】
本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、ＡＩＰとは異なる新規なアミノ酸配列を有するＣａＭＫII阻害ペプチドおよびこれを含有するＣａＭＫII阻害剤を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドは、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴としている。
【００１２】
本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドでは、前記ペプチドは、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を複数有する多価ペプチドであることが好ましい。
【００１３】
本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドでは、リジンが３つ結合した以下の分子核部、
【００１４】
【化１】
【００１５】
を有し、この分子核部の端部の各々の−ＮＨに、直接またはスペーサーを介して、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドが結合した４価ペプチドであることが好ましい。
【００１６】
本発明のＣａＭＫII阻害剤は、上記のＣａＭＫII阻害ペプチドを含有することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドは、新規なアミノ酸配列を有するペプチドであり、目的に合わせたさまざまな機能付加等が可能になる。また、このＣａＭＫII阻害ペプチドを含有するＣａＭＫII阻害剤は、ＣａＭＫIIの異常な活性化などに起因する疾患の治療に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】多価型ペプチドライブラリーの構造を例示した図である。
【図２】Ｍ１〜Ｍ６のそれぞれの合成ペプチドの阻害効果の結果を示す図である。
【図３】ＰＫＡに対するＭ１〜Ｍ６の合成ペプチドの阻害効果を示す図である。
【図４】ＰＫＣに対するＭ１〜Ｍ６の合成ペプチドの阻害効果を示す図である。
【図５】ＣａＭＫＩＩα-ＫＤのキナーゼ活性に対する４価ペプチドＴ１〜Ｔ６の阻害効果を示す図である。
【図６】ＣａＭＫＩＩα-ＫＤのキナーゼ活性に対する４価ペプチドＴ１〜Ｔ６の阻害効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドは、ＣａＭＫIIに強い結合親和性で結合することで、ＣａＭＫIIの活性を阻害することができる。具体的には、本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドは、以下のアミノ酸配列、
配列番号１：Arg-Arg-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-His-His
（ＲＲＲＬＬＬＬＬＡＲＨＨ）
配列番号２：Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-His-His
（ＲＲＩＬＬＬＬＬＡＲＨＨ）
配列番号３：Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-His
（ＲＲＩＬＬＬＬＬＡＲＬＨ）
配列番号４：Arg-Ile-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-His
(ＲＩＩＬＬＬＬＬＡＬＬＨ)
配列番号５：Arg-Ile-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-His
（ＲＩＩＬＬＬＬＬＡＲＬＨ）
配列番号６：Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-His
（ＲＲＩＬＬＬＬＬＡＬＬＨ）
のいずれかを１以上含む、一価または多価のペプチドである。配列番号１〜６のアミノ酸配列は、後述の実施例に示すスクリーニングによって特定されたものである。
【００２０】
ＣａＭＫII阻害ペプチドは、ＣａＭＫIIとの結合親和性を損なわないものであれば、配列番号１〜６のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に、ペプチドの電荷や親水性等を考慮して、１以上のアミノ酸や修飾基などの修飾分子を適宜付加することができる。例えば、配列番号１〜６のアミノ酸配列のＣ末端には、ペプチドの水溶性を担保するためのアミノ酸として、リジンが３つ連続する配列（ＫＫＫ）を含むペプチドを付加することができる。ＣａＭＫII阻害ペプチドの長さは、アミノ酸の数がおよそ１０〜２０程度の範囲を例示することができる。また、配列番号１〜６のアミノ酸配列のＣ末端には、ＣａＭＫIIの分子構造に対応させ、分子長を調節するための修飾分子を付加することもできる。分子長を調節するための修飾分子としては、例えば、炭素数４〜１０程度の鎖長のものが好ましく、具体的には、amino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]等を例示することができる。
【００２１】
ＣａＭＫII阻害ペプチドが配列番号１〜６のアミノ酸配列を複数含む多価ペプチドを作製する場合、例えば、リジンが複数個結合した分子核部の端部に配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを複数結合させることができる。具体的には、分子核部として、例えば、リジンが３つ結合して形成された以下の構造を例示することができる。
【００２２】
【化２】
【００２３】
この分子核部の、末端の−ＮＨに、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを結合させることで、４価のＣａＭＫII阻害ペプチドを作製することができる。この場合も、配列番号１〜６のアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端にはアミノ酸等の修飾分子を付加することができる。例えば、分子核部と配列番号１〜６のアミノ酸配列のＣ末端との間にamino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]等をスペーサーとして導入することや、リジンが３つ連続する配列（ＫＫＫ）を導入すること等が考慮される。
【００２４】
ＣａＭＫII阻害ペプチドは、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含んでいることによって、ＣａＭＫIIに対して優れた結合親和性を発揮し、ＣａＭＫIIの活性を阻害することができる。特に配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を複数含む多価ペプチドである場合には、ＣａＭＫIIに対して優れた結合親和性を発揮する。また、ＣａＭＫII阻害ペプチドに含まれる配列番号１〜６のアミノ酸配列は、従来の知られているＡＩＰなどとは異なる新規な配列であり、生体内動態の制御や膜透過性、安定性の向上など、目的に合わせたさまざまな機能付加のための検討に用いることができる。
【００２５】
本発明のＣａＭＫII阻害剤は、上記のＣａＭＫII阻害ペプチドを有効成分として含有する。本発明のＣａＭＫII阻害剤は、上記ＣａＭＫII阻害ペプチド以外に、任意の製薬上許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより調製され保存される。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる用量および濃度において患者に非毒性であることを条件として、剤形や投与経路に応じて適宜に選択することができる。例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；およびｍ-クレゾールなど）；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物EDTA等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）またはトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、およびポリエチレングリコール（PEG）等の非イオン性界面活性剤等である。
【００２６】
また、本発明のＣａＭＫII阻害剤は徐放性を有していてもよい。徐放性剤として、例えば、固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス（例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形状）である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸およびγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸等を適宜使用することができる。
【００２７】
このようにして製剤化したＣａＭＫII阻害剤は、例えば、疾患の種類や症状に応じて、経口投与、局所投与、あるいは静脈等を介して全身投与することができる。投与量は、患者の体重、症状等に応じて決定することができる。
【００２８】
本発明のＣａＭＫII阻害剤は、例えば、ＣａＭＫIIの異常な活性化に起因するパーキンソン病や認知障害、痙攣などの神経疾患の治療・予防に利用することができる。また、その他、心不全、骨粗鬆症、アポトーシスの誘導阻害を介した発癌など、ヒトの様々な疾患の治療、発症の抑制に利用することができる。
【実施例】
【００２９】
（１）ＣａＭＫIIの調製
ＣａＭＫIIのアイソザイムのひとつであるＣａＭＫIIαを用い、そのキナーゼドメインを標的とした。ＣａＭＫＩＩαのキナーゼドメイン (ＫＤ)にhis-tagをつけたもの(ＣａＭＫＩＩα-ＫＤ)を調製し、Ni-ビーズ上に固定化した。ＣａＭＫIIの大量調製にはバキュロウイルス発現系を利用し、ビーズ上に固定化されたＣａＭＫＩＩα-ＫＤ は90%以上の純度であることを確認した。
（２）ＣａＭＫIIα に好適化した多価型ペプチドライブラリーのデザイン
図１に、多価型ペプチドライブラリーの構造を示す。この多価型ペプチドライブラリーは、［化１］にも示したように、中央に３つのリジンが結合した分子核部を有し、４つに分岐した構造とされている。そして、この分子核部の端部には、スペーサーとして、図１中「Ｕ」で示されるamino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]が結合している。スペーサー長は、ＣａＭＫIIに好適化するように設計されている。そして、このスペーサーの端部からは、図１中のＸＸＸＸで示されるライブラリー部を含むペプチドが４個結合した、４価のペプチドライブラリーに設計されている。この各々のライブラリー部の末端には、Met-Ala（ＭＡ）が結合している。このＭＡは、スクリーニングに際して導入したものであり、本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドにおいては必ずしも付加する必要はない。なお、ライブラリー部は、便宜的にＸＸＸＸで示しているに過ぎず、そのアミノ酸の数等については以下に詳しく述べる。
ライブラリー部の設計に関して、本発明者らは、１）これまでにＣａＭＫIIαによってリン酸化されることが知られている数多くの基質では、リン酸化されるSer/Thrの位置から-5位のアミノ酸がLeuであることが多く、２）ＡＩＰの配列中におけるこの位置に相当するLeuを別のアミノ酸に置換すると阻害効果が著しく低下する、との知見のから、-5位のLeuが基質との高親和性結合に重要であると推測した。
そこで、多価型ペプチドライブラリーのライブラリー部（図１中で「ＸＸＸＸ」で表示）の配列は、ＸＸＸＬＸＸＸＸＡＸＸＸ（配列番号１３: Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Xaa）と設定した（Ｘ部（Xaa）は、Cys以外の１９種のアミノ酸のミックスチャーからなるdegenerate positionを示す）。配列中、基質のリン酸化位置に相当する0位をAla（Ａ）に固定することでリン酸化を防ぎ、-5位をLeu（Ｌ）に固定することでライブラリー部とＣａＭＫIIα-ＫＤとの結合親和性が高まるように設計した。また、ライブラリー部とスペーサーの間には、Ala-Lys-Lys-Lys（ＡＫＫＫ）を導入した。この３個のLysは、多価型ペプチドライブラリーの水溶性を担保するために導入している。
【００３０】
（３）多価型ペプチドライブラリースクリーニング
スクリーニング方法は、特許文献（ＷＯ2006/001542）に記載の方法に準じる。ＣａＭＫ IIα に好適化した上記の多価型ペプチドライブラリー(240μg)を用い、Ni-ビーズ上に固定化したＣａＭＫＩＩα-ＫＤ（200μg）と４℃で18時間インキュベート（反応溶液の組成；50 mM HEPES-NaOH(pH=7.5), 1 mM EGTA, 20 mM β-glycerophosphate, 0.02% NP-40, 1 mM DTT, 10 μM ATP, final volume 300μl）した。ビーズをPBSならびに0.5%NP-40 PBSで洗浄後、３０％酢酸で溶出し、ＣａＭＫＩＩα-ＫＤに強く結合する画分を調製した。この画分についてアミノ酸シークエンスを行い、各degenerate positionについて、検出される１９種のアミノ酸のモル比を算出した。さらに、オリジナルの多価型ペプチドライブラリー（ライブラリー部として配列番号１３: Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Xaaを有するスクリーニング前の多価型ペプチドライブラリー）についても同様にアミノ酸シークエンスを行い、各degenerate positionでのアミノ酸の検出モル比を算出した。各degenerate positionの各アミノ酸について、それぞれスクリーニングから得られた数値をオリジナルの多価型ペプチドライブラリーから得られた数値で割ることによって、何倍選択性が向上したのかを数値化した。さらに、あるdegenerate positionの１９種類の全てのアミノ酸の数値をたすと１９となるように補正した。このとき各アミノ酸の間で、選択性に差がないと値は１となる。この値が１．３を越えると強い選択性がみられたと判断した。
【００３１】
ＣａＭＫIIα に好適化した多価型ペプチドライブラリーを用いたスクリーニングを２回行い、各Ｘの位置で選択されるアミノ酸を決定した。表１にその結果を示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
その結果、両者で共通して、position -1〜-4でLeuが非常に強く選択されること、position -8でArgが、position +3でHisがそれぞれ選択されることが示された。またposition +1, +2ではArgとLeuの２種のアミノ酸が共通して選択されていた。一方、position -7, -6, +2では両者で選択されるアミノ酸に若干の相違がみられた。
【００３４】
以上の結果から、これらの情報をカバーする配列として、以下の６種類のアミノ酸配列（配列番号１〜６）をＣａＭＫIIα 結合モチーフとして同定した。
【００３５】
配列番号１：Arg-Arg-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-His-His
（ＲＲＲＬＬＬＬＬＡＲＨＨ）
配列番号２：Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-His-His
（ＲＲＩＬＬＬＬＬＡＲＨＨ）
配列番号３：Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-His
（ＲＲＩＬＬＬＬＬＡＲＬＨ）
配列番号４：Arg-Ile-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-His
(ＲＩＩＬＬＬＬＬＡＬＬＨ)
配列番号５：Arg-Ile-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-His
（ＲＩＩＬＬＬＬＬＡＲＬＨ）
配列番号６：Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-His
（ＲＲＩＬＬＬＬＬＡＬＬＨ）
（４）阻害活性測定
スクリーニングの結果得られた上記アミノ酸配列（配列番号１〜６）を基に、上記アミノ酸配列（配列番号１〜６）を含む以下に示すペプチド（配列番号７〜１２）を合成し、ＣａＭＫIIα阻害ペプチドとしての効果を検討した。
【００３６】
配列番号７：
Met-Ala-Arg-Arg-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-His-His-Ala-Lys-Lys-Lys
（ＭＡＲＲＲＬＬＬＬＬＡＲＨＨＡＫＫＫ）
配列番号８：
Met-Ala-Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-His-His-Ala-Lys-Lys-Lys
（ＭＡＲＲＩＬＬＬＬＬＡＲＨＨＡＫＫＫ）
配列番号９：
Met-Ala-Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-His-Ala-Lys-Lys-Lys
（ＭＡＲＲＩＬＬＬＬＬＡＲＬＨＡＫＫＫ）
配列番号１０：
Met-Ala-Arg-Ile-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-His-Ala-Lys-Lys-Lys
(ＭＡＲＩＩＬＬＬＬＬＡＬＬＨＡＫＫＫ)
配列番号１１：
Met-Ala-Arg-Ile-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-His-Ala-Lys-Lys-Lys
（ＭＡＲＩＩＬＬＬＬＬＡＲＬＨＡＫＫＫ）
配列番号１２：
Met-Ala-Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-His-Ala-Lys-Lys-Lys
（ＭＡＲＲＩＬＬＬＬＬＡＬＬＨＡＫＫＫ）
これらの合成ペプチド（配列番号７〜１２）は、上記スクリーニングの結果得られたＣａＭＫIIα 結合モチーフ（配列番号１〜６）のＮ末端にMet−Ala（ＭＡ）を付加し、Ｃ末端に、配列番号１４：Ala-Lys-Lys-Lys（ＡＫＫＫ）を付加している。Ｎ末端のＭＡは、多価型ペプチドライブラリーの構造に対応させて付加しているが省略することが可能である。また、Ｃ末端のＡＫＫＫ（配列番号１４：Ala-Lys-Lys-Lys）は、合成ペプチドの水溶性を担保するために導入している。さらに、ＣａＭＫIIαの分子構造に対応させるため、配列番号７〜１２で示す合成ペプチドのＣ末端にamino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]を付加して分子鎖長を調整したものを使用した。以下、配列番号７の合成ペプチドにamino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]を付加したものをＭ１(monomer 1)と記載し、同様に、配列番号８〜１２の合成ペプチドにamino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]を付加したものを順に、Ｍ２(monomer 1)〜Ｍ６(monomer 6)と記載する。
【００３７】
合成ペプチドＭ１〜Ｍ６と、合成基質ＡＩＰを用いて、ＣａＭＫIIα-ＫＤのキナーゼ活性に対する阻害効果を検討した。また、細胞内に存在する一般的キナーゼであるprotein kinase Ａ(ＰＫＡ)およびprotein kinase Ｃ（ＰＫＣ）の活性に及ぼす影響についても検討した。
【００３８】
ＣａＭＫＩＩα-ＫＤのキナーゼ活性に対するＭ１〜Ｍ６の合成ペプチドの阻害効果の結果を図２に示す。図２から分かるように、Ｍ４については高濃度で阻害活性が減弱するものの、その他の合成ペプチドについてはいずれも強い阻害活性を示すことが示され、その効果はＡＩＰと同程度であった。
【００３９】
一方、ＰＫＡに対するＭ１〜Ｍ６の合成ペプチドの阻害効果を図３に、ＰＫＣに対するＭ１〜Ｍ６の合成ペプチドの阻害効果を図４に示す。図３、図４に示したように、ＰＫＡおよびＰＫＣに対してはいずれのペプチドも全く阻害効果を示さなかった。
【００４０】
以上の通り、多価型スクリーニング法によって、ＡＩＰとは全く異なる新規配列を有し、特異的に ＣａＭＫIIαを強く阻害するＣａＭＫIIα阻害ペプチド、Ｍ１〜Ｍ６を同定することができた。Ｍ１〜Ｍ６が得られたことによって、生体内動態の制御や膜透過性、安定性の向上など、目的に合わせたさまざまな機能付加、機能改善の検討が可能となり、ＣａＭＫIIの異常な活性化に伴う種々の重要疾患に対する優れた治療薬開発が大きく促進される。
（５）多価ＣａＭＫII阻害ペプチドの阻害効果
図１に示した多価型ペプチドライブラリーの４つのライブラリー部（図１中で「ＸＸＸＸ」と表示）に、配列番号１〜６に示したＣａＭＫIIα 結合モチーフのうちのいずれかを導入した４価のペプチドを作製した。この４価ペプチドを配列番号１を含むものから順にＴ１〜Ｔ６と記載する。なお、この４価ペプチド（Ｔ１〜Ｔ６）は、以下に示した分子核部、
【００４１】
【化３】
【００４２】
の端部の各々の−ＮＨに、配列番号７〜１２のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドが結合した４価ペプチドと同様の構造を有している。
【００４３】
そして、４価ペプチドＴ１〜Ｔ６と、合成基質ＡＩＰを用いて、ＣａＭＫIIα-ＫＤのキナーゼ活性に対する阻害効果を検討した。
【００４４】
ＣａＭＫＩＩα-ＫＤのキナーゼ活性に対する４価ペプチドＴ１〜Ｔ６の阻害効果の結果を図５、図６に示す。図５では、横軸が、４価ペプチド（Ｔ１〜Ｔ６）に含まれるＣａＭＫIIα 結合モチーフ（配列番号１〜６）のモル数に換算している。図６では、横軸が４価ペプチド（Ｔ１〜Ｔ６）のモル数を表している。
【００４５】
図５、図６から分かるように、配列番号１〜６に示したＣａＭＫIIα 結合モチーフのうちのいずれかを導入した４価のペプチドは、ＣａＭＫIIαの活性阻害効果があることが確認された。特に、４価ペプチド（Ｔ１〜Ｔ６）に含まれるＣａＭＫIIα 結合モチーフの濃度および４価ペプチド（Ｔ１〜Ｔ６）の濃度が低濃度（例えば、１μＭ〜１０μＭ）の場合、ＡＩＰと同等またはそれ以上の阻害効果が確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃａ２+／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭＫII）の活性を阻害するペプチドおよびこれを含有するＣａＭＫII阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ca2+/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase; ＣａＭＫ）は、Ca2+結合性蛋白質であるカルモデュリンにCa2+が結合したCa2+/カルモデュリンによって活性化されるセリン／スレオニンキナーゼの総称である。CaMKには３種のファミリー（ＣａＭＫＩ, ＣａＭＫＩＩ, ＣａＭＫＩＶ）が存在し、各々が生体内で異なった役割を果たしている。なかでもＣａＭＫIIは脳に豊富に存在し、神経伝達物質の合成や分泌、神経伝達の長期増強の誘導など、高次神経機能の制御に重要な役割を果たすことが知られている。その一方で、ＣａＭＫIIの異常な活性化がパーキンソン病や認知障害、痙攣などの神経疾患の発症と密接に関連していることが示されている。さらに神経疾患に限らず、心不全の誘発、骨粗鬆症の発症、アポトーシスの誘導阻害を介した発癌促進など、ヒトの様々な疾患発症に関与していることが知られている。
【０００３】
そして、ＣａＭＫII阻害剤としては、その制御ドメインに存在している自己リン酸化部位の配列に由来するペプチドＡＩＰ：Autocamtide 2 Related Inhibitory Peptide、配列番号１５：Lys-Lys-Ala-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Val-Asp-Ala-Leu（ＫＫＡＬＲＲＱＥＡＶＤＡＬ）が知られている（非特許文献１）。また、例えば、特許文献１〜３には、ＣａＭＫＩＩ阻害剤として、前記ＡＩＰのアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列からなるペプチドが提案されている。
【０００４】
一方、近年ＣａＭＫIIの構造解析が行われ、その極めてユニークな高次構造が明らかになっている。ＣａＭＫIIはアソシエーションドメインとよばれる領域を中心にして１２分子が円盤状に会合し、この円盤状の核構造の周りに各々のＣａＭＫIIのキナーゼドメイン（触媒ドメイン）がリング状にパッキングされた状態で配置している。Ca2+非存在下ではこの状態で安定に存在しているが、種々の刺激によって細胞内Ca2+濃度が上昇し、Ca2+が結合したカルモデュリンが供給されるとパッキングがほどけ、１２量体の各々のキナーゼが協調的に順次活性化すると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許２９６３９８６号公報
【特許文献２】特表２００１−５０９８０８号公報
【特許文献３】特表２００５−５０４８２９号公報
【特許文献４】ＷＯ２００６／００１５４２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Biochem Biophys Res Commun. 1995 Jul 26;212(3):806-12
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ＡＩＰやその他特許文献１〜３のペプチドの場合、アミノ酸配列における各ポジションの重要性、阻害メカニズムに関する詳細な検討が難しく、生体内動態の制御や膜透過性、安定性の向上など、目的に合わせたさまざまな機能付加、機能改善が困難であるという問題がある。この点を克服することができれば、上記の種々の重要疾患に対する優れた治療薬開発が大きく促進されると期待される。
【０００８】
一方、本発明者らはこれまでに、多価型の相互作用（クラスター効果）に基づく強い結合を阻害するペプチドを同定する新しい方法、多価型ペプチドライブラリー法を確立している（上記特許文献４）。ペプチドライブラリー法は、同定されるペプチド配列の各位置のアミノ酸に関する相対的な重要度が定量化できるという大きな特徴を有する。
【０００９】
そこで、本発明者らは、多価型ペプチドライブラリー法をＣａＭＫIIに対して適用することにより、クラスター化したＣａＭＫIIに対して作用するペプチド配列のスクリーニングが容易になるのではないかとの想定のもと、一連の優れたＣａＭＫII阻害ペプチドの取得を試みた。
【００１０】
本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、ＡＩＰとは異なる新規なアミノ酸配列を有するＣａＭＫII阻害ペプチドおよびこれを含有するＣａＭＫII阻害剤を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドは、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴としている。
【００１２】
本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドでは、前記ペプチドは、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を複数有する多価ペプチドであることが好ましい。
【００１３】
本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドでは、リジンが３つ結合した以下の分子核部、
【００１４】
【化１】
【００１５】
を有し、この分子核部の端部の各々の−ＮＨに、直接またはスペーサーを介して、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドが結合した４価ペプチドであることが好ましい。
【００１６】
本発明のＣａＭＫII阻害剤は、上記のＣａＭＫII阻害ペプチドを含有することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドは、新規なアミノ酸配列を有するペプチドであり、目的に合わせたさまざまな機能付加等が可能になる。また、このＣａＭＫII阻害ペプチドを含有するＣａＭＫII阻害剤は、ＣａＭＫIIの異常な活性化などに起因する疾患の治療に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】多価型ペプチドライブラリーの構造を例示した図である。
【図２】Ｍ１〜Ｍ６のそれぞれの合成ペプチドの阻害効果の結果を示す図である。
【図３】ＰＫＡに対するＭ１〜Ｍ６の合成ペプチドの阻害効果を示す図である。
【図４】ＰＫＣに対するＭ１〜Ｍ６の合成ペプチドの阻害効果を示す図である。
【図５】ＣａＭＫＩＩα-ＫＤのキナーゼ活性に対する４価ペプチドＴ１〜Ｔ６の阻害効果を示す図である。
【図６】ＣａＭＫＩＩα-ＫＤのキナーゼ活性に対する４価ペプチドＴ１〜Ｔ６の阻害効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドは、ＣａＭＫIIに強い結合親和性で結合することで、ＣａＭＫIIの活性を阻害することができる。具体的には、本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドは、以下のアミノ酸配列、
配列番号１：Arg-Arg-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-His-His
（ＲＲＲＬＬＬＬＬＡＲＨＨ）
配列番号２：Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-His-His
（ＲＲＩＬＬＬＬＬＡＲＨＨ）
配列番号３：Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-His
（ＲＲＩＬＬＬＬＬＡＲＬＨ）
配列番号４：Arg-Ile-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-His
(ＲＩＩＬＬＬＬＬＡＬＬＨ)
配列番号５：Arg-Ile-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-His
（ＲＩＩＬＬＬＬＬＡＲＬＨ）
配列番号６：Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-His
（ＲＲＩＬＬＬＬＬＡＬＬＨ）
のいずれかを１以上含む、一価または多価のペプチドである。配列番号１〜６のアミノ酸配列は、後述の実施例に示すスクリーニングによって特定されたものである。
【００２０】
ＣａＭＫII阻害ペプチドは、ＣａＭＫIIとの結合親和性を損なわないものであれば、配列番号１〜６のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に、ペプチドの電荷や親水性等を考慮して、１以上のアミノ酸や修飾基などの修飾分子を適宜付加することができる。例えば、配列番号１〜６のアミノ酸配列のＣ末端には、ペプチドの水溶性を担保するためのアミノ酸として、リジンが３つ連続する配列（ＫＫＫ）を含むペプチドを付加することができる。ＣａＭＫII阻害ペプチドの長さは、アミノ酸の数がおよそ１０〜２０程度の範囲を例示することができる。また、配列番号１〜６のアミノ酸配列のＣ末端には、ＣａＭＫIIの分子構造に対応させ、分子長を調節するための修飾分子を付加することもできる。分子長を調節するための修飾分子としては、例えば、炭素数４〜１０程度の鎖長のものが好ましく、具体的には、amino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]等を例示することができる。
【００２１】
ＣａＭＫII阻害ペプチドが配列番号１〜６のアミノ酸配列を複数含む多価ペプチドを作製する場合、例えば、リジンが複数個結合した分子核部の端部に配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを複数結合させることができる。具体的には、分子核部として、例えば、リジンが３つ結合して形成された以下の構造を例示することができる。
【００２２】
【化２】
【００２３】
この分子核部の、末端の−ＮＨに、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを結合させることで、４価のＣａＭＫII阻害ペプチドを作製することができる。この場合も、配列番号１〜６のアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端にはアミノ酸等の修飾分子を付加することができる。例えば、分子核部と配列番号１〜６のアミノ酸配列のＣ末端との間にamino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]等をスペーサーとして導入することや、リジンが３つ連続する配列（ＫＫＫ）を導入すること等が考慮される。
【００２４】
ＣａＭＫII阻害ペプチドは、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含んでいることによって、ＣａＭＫIIに対して優れた結合親和性を発揮し、ＣａＭＫIIの活性を阻害することができる。特に配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を複数含む多価ペプチドである場合には、ＣａＭＫIIに対して優れた結合親和性を発揮する。また、ＣａＭＫII阻害ペプチドに含まれる配列番号１〜６のアミノ酸配列は、従来の知られているＡＩＰなどとは異なる新規な配列であり、生体内動態の制御や膜透過性、安定性の向上など、目的に合わせたさまざまな機能付加のための検討に用いることができる。
【００２５】
本発明のＣａＭＫII阻害剤は、上記のＣａＭＫII阻害ペプチドを有効成分として含有する。本発明のＣａＭＫII阻害剤は、上記ＣａＭＫII阻害ペプチド以外に、任意の製薬上許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより調製され保存される。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる用量および濃度において患者に非毒性であることを条件として、剤形や投与経路に応じて適宜に選択することができる。例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；およびｍ-クレゾールなど）；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物EDTA等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）またはトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、およびポリエチレングリコール（PEG）等の非イオン性界面活性剤等である。
【００２６】
また、本発明のＣａＭＫII阻害剤は徐放性を有していてもよい。徐放性剤として、例えば、固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス（例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形状）である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸およびγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸等を適宜使用することができる。
【００２７】
このようにして製剤化したＣａＭＫII阻害剤は、例えば、疾患の種類や症状に応じて、経口投与、局所投与、あるいは静脈等を介して全身投与することができる。投与量は、患者の体重、症状等に応じて決定することができる。
【００２８】
本発明のＣａＭＫII阻害剤は、例えば、ＣａＭＫIIの異常な活性化に起因するパーキンソン病や認知障害、痙攣などの神経疾患の治療・予防に利用することができる。また、その他、心不全、骨粗鬆症、アポトーシスの誘導阻害を介した発癌など、ヒトの様々な疾患の治療、発症の抑制に利用することができる。
【実施例】
【００２９】
（１）ＣａＭＫIIの調製
ＣａＭＫIIのアイソザイムのひとつであるＣａＭＫIIαを用い、そのキナーゼドメインを標的とした。ＣａＭＫＩＩαのキナーゼドメイン (ＫＤ)にhis-tagをつけたもの(ＣａＭＫＩＩα-ＫＤ)を調製し、Ni-ビーズ上に固定化した。ＣａＭＫIIの大量調製にはバキュロウイルス発現系を利用し、ビーズ上に固定化されたＣａＭＫＩＩα-ＫＤ は90%以上の純度であることを確認した。
（２）ＣａＭＫIIα に好適化した多価型ペプチドライブラリーのデザイン
図１に、多価型ペプチドライブラリーの構造を示す。この多価型ペプチドライブラリーは、［化１］にも示したように、中央に３つのリジンが結合した分子核部を有し、４つに分岐した構造とされている。そして、この分子核部の端部には、スペーサーとして、図１中「Ｕ」で示されるamino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]が結合している。スペーサー長は、ＣａＭＫIIに好適化するように設計されている。そして、このスペーサーの端部からは、図１中のＸＸＸＸで示されるライブラリー部を含むペプチドが４個結合した、４価のペプチドライブラリーに設計されている。この各々のライブラリー部の末端には、Met-Ala（ＭＡ）が結合している。このＭＡは、スクリーニングに際して導入したものであり、本発明のＣａＭＫII阻害ペプチドにおいては必ずしも付加する必要はない。なお、ライブラリー部は、便宜的にＸＸＸＸで示しているに過ぎず、そのアミノ酸の数等については以下に詳しく述べる。
ライブラリー部の設計に関して、本発明者らは、１）これまでにＣａＭＫIIαによってリン酸化されることが知られている数多くの基質では、リン酸化されるSer/Thrの位置から-5位のアミノ酸がLeuであることが多く、２）ＡＩＰの配列中におけるこの位置に相当するLeuを別のアミノ酸に置換すると阻害効果が著しく低下する、との知見のから、-5位のLeuが基質との高親和性結合に重要であると推測した。
そこで、多価型ペプチドライブラリーのライブラリー部（図１中で「ＸＸＸＸ」で表示）の配列は、ＸＸＸＬＸＸＸＸＡＸＸＸ（配列番号１３: Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Xaa）と設定した（Ｘ部（Xaa）は、Cys以外の１９種のアミノ酸のミックスチャーからなるdegenerate positionを示す）。配列中、基質のリン酸化位置に相当する0位をAla（Ａ）に固定することでリン酸化を防ぎ、-5位をLeu（Ｌ）に固定することでライブラリー部とＣａＭＫIIα-ＫＤとの結合親和性が高まるように設計した。また、ライブラリー部とスペーサーの間には、Ala-Lys-Lys-Lys（ＡＫＫＫ）を導入した。この３個のLysは、多価型ペプチドライブラリーの水溶性を担保するために導入している。
【００３０】
（３）多価型ペプチドライブラリースクリーニング
スクリーニング方法は、特許文献（ＷＯ2006/001542）に記載の方法に準じる。ＣａＭＫ IIα に好適化した上記の多価型ペプチドライブラリー(240μg)を用い、Ni-ビーズ上に固定化したＣａＭＫＩＩα-ＫＤ（200μg）と４℃で18時間インキュベート（反応溶液の組成；50 mM HEPES-NaOH(pH=7.5), 1 mM EGTA, 20 mM β-glycerophosphate, 0.02% NP-40, 1 mM DTT, 10 μM ATP, final volume 300μl）した。ビーズをPBSならびに0.5%NP-40 PBSで洗浄後、３０％酢酸で溶出し、ＣａＭＫＩＩα-ＫＤに強く結合する画分を調製した。この画分についてアミノ酸シークエンスを行い、各degenerate positionについて、検出される１９種のアミノ酸のモル比を算出した。さらに、オリジナルの多価型ペプチドライブラリー（ライブラリー部として配列番号１３: Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Xaaを有するスクリーニング前の多価型ペプチドライブラリー）についても同様にアミノ酸シークエンスを行い、各degenerate positionでのアミノ酸の検出モル比を算出した。各degenerate positionの各アミノ酸について、それぞれスクリーニングから得られた数値をオリジナルの多価型ペプチドライブラリーから得られた数値で割ることによって、何倍選択性が向上したのかを数値化した。さらに、あるdegenerate positionの１９種類の全てのアミノ酸の数値をたすと１９となるように補正した。このとき各アミノ酸の間で、選択性に差がないと値は１となる。この値が１．３を越えると強い選択性がみられたと判断した。
【００３１】
ＣａＭＫIIα に好適化した多価型ペプチドライブラリーを用いたスクリーニングを２回行い、各Ｘの位置で選択されるアミノ酸を決定した。表１にその結果を示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
その結果、両者で共通して、position -1〜-4でLeuが非常に強く選択されること、position -8でArgが、position +3でHisがそれぞれ選択されることが示された。またposition +1, +2ではArgとLeuの２種のアミノ酸が共通して選択されていた。一方、position -7, -6, +2では両者で選択されるアミノ酸に若干の相違がみられた。
【００３４】
以上の結果から、これらの情報をカバーする配列として、以下の６種類のアミノ酸配列（配列番号１〜６）をＣａＭＫIIα 結合モチーフとして同定した。
【００３５】
配列番号１：Arg-Arg-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-His-His
（ＲＲＲＬＬＬＬＬＡＲＨＨ）
配列番号２：Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-His-His
（ＲＲＩＬＬＬＬＬＡＲＨＨ）
配列番号３：Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-His
（ＲＲＩＬＬＬＬＬＡＲＬＨ）
配列番号４：Arg-Ile-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-His
(ＲＩＩＬＬＬＬＬＡＬＬＨ)
配列番号５：Arg-Ile-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-His
（ＲＩＩＬＬＬＬＬＡＲＬＨ）
配列番号６：Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-His
（ＲＲＩＬＬＬＬＬＡＬＬＨ）
（４）阻害活性測定
スクリーニングの結果得られた上記アミノ酸配列（配列番号１〜６）を基に、上記アミノ酸配列（配列番号１〜６）を含む以下に示すペプチド（配列番号７〜１２）を合成し、ＣａＭＫIIα阻害ペプチドとしての効果を検討した。
【００３６】
配列番号７：
Met-Ala-Arg-Arg-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-His-His-Ala-Lys-Lys-Lys
（ＭＡＲＲＲＬＬＬＬＬＡＲＨＨＡＫＫＫ）
配列番号８：
Met-Ala-Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-His-His-Ala-Lys-Lys-Lys
（ＭＡＲＲＩＬＬＬＬＬＡＲＨＨＡＫＫＫ）
配列番号９：
Met-Ala-Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-His-Ala-Lys-Lys-Lys
（ＭＡＲＲＩＬＬＬＬＬＡＲＬＨＡＫＫＫ）
配列番号１０：
Met-Ala-Arg-Ile-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-His-Ala-Lys-Lys-Lys
(ＭＡＲＩＩＬＬＬＬＬＡＬＬＨＡＫＫＫ)
配列番号１１：
Met-Ala-Arg-Ile-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-His-Ala-Lys-Lys-Lys
（ＭＡＲＩＩＬＬＬＬＬＡＲＬＨＡＫＫＫ）
配列番号１２：
Met-Ala-Arg-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-His-Ala-Lys-Lys-Lys
（ＭＡＲＲＩＬＬＬＬＬＡＬＬＨＡＫＫＫ）
これらの合成ペプチド（配列番号７〜１２）は、上記スクリーニングの結果得られたＣａＭＫIIα 結合モチーフ（配列番号１〜６）のＮ末端にMet−Ala（ＭＡ）を付加し、Ｃ末端に、配列番号１４：Ala-Lys-Lys-Lys（ＡＫＫＫ）を付加している。Ｎ末端のＭＡは、多価型ペプチドライブラリーの構造に対応させて付加しているが省略することが可能である。また、Ｃ末端のＡＫＫＫ（配列番号１４：Ala-Lys-Lys-Lys）は、合成ペプチドの水溶性を担保するために導入している。さらに、ＣａＭＫIIαの分子構造に対応させるため、配列番号７〜１２で示す合成ペプチドのＣ末端にamino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]を付加して分子鎖長を調整したものを使用した。以下、配列番号７の合成ペプチドにamino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]を付加したものをＭ１(monomer 1)と記載し、同様に、配列番号８〜１２の合成ペプチドにamino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]を付加したものを順に、Ｍ２(monomer 1)〜Ｍ６(monomer 6)と記載する。
【００３７】
合成ペプチドＭ１〜Ｍ６と、合成基質ＡＩＰを用いて、ＣａＭＫIIα-ＫＤのキナーゼ活性に対する阻害効果を検討した。また、細胞内に存在する一般的キナーゼであるprotein kinase Ａ(ＰＫＡ)およびprotein kinase Ｃ（ＰＫＣ）の活性に及ぼす影響についても検討した。
【００３８】
ＣａＭＫＩＩα-ＫＤのキナーゼ活性に対するＭ１〜Ｍ６の合成ペプチドの阻害効果の結果を図２に示す。図２から分かるように、Ｍ４については高濃度で阻害活性が減弱するものの、その他の合成ペプチドについてはいずれも強い阻害活性を示すことが示され、その効果はＡＩＰと同程度であった。
【００３９】
一方、ＰＫＡに対するＭ１〜Ｍ６の合成ペプチドの阻害効果を図３に、ＰＫＣに対するＭ１〜Ｍ６の合成ペプチドの阻害効果を図４に示す。図３、図４に示したように、ＰＫＡおよびＰＫＣに対してはいずれのペプチドも全く阻害効果を示さなかった。
【００４０】
以上の通り、多価型スクリーニング法によって、ＡＩＰとは全く異なる新規配列を有し、特異的に ＣａＭＫIIαを強く阻害するＣａＭＫIIα阻害ペプチド、Ｍ１〜Ｍ６を同定することができた。Ｍ１〜Ｍ６が得られたことによって、生体内動態の制御や膜透過性、安定性の向上など、目的に合わせたさまざまな機能付加、機能改善の検討が可能となり、ＣａＭＫIIの異常な活性化に伴う種々の重要疾患に対する優れた治療薬開発が大きく促進される。
（５）多価ＣａＭＫII阻害ペプチドの阻害効果
図１に示した多価型ペプチドライブラリーの４つのライブラリー部（図１中で「ＸＸＸＸ」と表示）に、配列番号１〜６に示したＣａＭＫIIα 結合モチーフのうちのいずれかを導入した４価のペプチドを作製した。この４価ペプチドを配列番号１を含むものから順にＴ１〜Ｔ６と記載する。なお、この４価ペプチド（Ｔ１〜Ｔ６）は、以下に示した分子核部、
【００４１】
【化３】
【００４２】
の端部の各々の−ＮＨに、配列番号７〜１２のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドが結合した４価ペプチドと同様の構造を有している。
【００４３】
そして、４価ペプチドＴ１〜Ｔ６と、合成基質ＡＩＰを用いて、ＣａＭＫIIα-ＫＤのキナーゼ活性に対する阻害効果を検討した。
【００４４】
ＣａＭＫＩＩα-ＫＤのキナーゼ活性に対する４価ペプチドＴ１〜Ｔ６の阻害効果の結果を図５、図６に示す。図５では、横軸が、４価ペプチド（Ｔ１〜Ｔ６）に含まれるＣａＭＫIIα 結合モチーフ（配列番号１〜６）のモル数に換算している。図６では、横軸が４価ペプチド（Ｔ１〜Ｔ６）のモル数を表している。
【００４５】
図５、図６から分かるように、配列番号１〜６に示したＣａＭＫIIα 結合モチーフのうちのいずれかを導入した４価のペプチドは、ＣａＭＫIIαの活性阻害効果があることが確認された。特に、４価ペプチド（Ｔ１〜Ｔ６）に含まれるＣａＭＫIIα 結合モチーフの濃度および４価ペプチド（Ｔ１〜Ｔ６）の濃度が低濃度（例えば、１μＭ〜１０μＭ）の場合、ＡＩＰと同等またはそれ以上の阻害効果が確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とするＣａＭＫII阻害ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を複数有する多価ペプチドであることを特徴とする請求項１のＣａＭＫII阻害ペプチド。
【請求項３】
リジンが３つ結合した以下の分子核部、
【化１】
を有し、この分子核部の端部の各々の−ＮＨに、直接またはスペーサーを介して、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドが結合した４価ペプチドであることを特徴とする請求項２のＣａＭＫII阻害ペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかのＣａＭＫII阻害ペプチドを含有することを特徴とするＣａＭＫII阻害剤。
【請求項１】
配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とするＣａＭＫII阻害ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を複数有する多価ペプチドであることを特徴とする請求項１のＣａＭＫII阻害ペプチド。
【請求項３】
リジンが３つ結合した以下の分子核部、
【化１】
を有し、この分子核部の端部の各々の−ＮＨに、直接またはスペーサーを介して、配列番号１〜６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドが結合した４価ペプチドであることを特徴とする請求項２のＣａＭＫII阻害ペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかのＣａＭＫII阻害ペプチドを含有することを特徴とするＣａＭＫII阻害剤。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【公開番号】特開２０１２−１５８５２５（Ｐ２０１２−１５８５２５Ａ）
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７２９５（Ｐ２０１１−１７２９５）
【出願日】平成２３年１月２８日（２０１１．１．２８）
【出願人】（５０３０２７９３１）学校法人同志社 (346)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２８日（２０１１．１．２８）
【出願人】（５０３０２７９３１）学校法人同志社 (346)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
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