Ｄ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼ
ＯＮＣ−Ｔ１８、Ｄ４デサチュラーゼ、Ｄ５エロンガーゼ、これらの単離、特性解析、産成、同定、及び脂肪酸生成への使用に関する方法並びに組成物、並びにこれらの組成物を含む生物、及びこれらを発現する生物を開示する。配列番号２６と、少なくとも７０％、８０％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％の又はこれらを超える同一性を有するＤ４デサチュラーゼを含む組成物を開示する。また、配列番号２６から離脱する任意の変化が保存的変化である組成物も開示する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような（ｎ−３）高度不飽和脂肪酸は、心循環系疾患、慢性炎症及び脳障害に対して好ましい効果を有するという、圧倒的な科学的証拠が存在する。他方、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のような（ｎ−６）脂肪酸は、プロスタグランジン、ロイコトリエン等のようなエイコサノイドステロイドの中間代謝産物として注目されている。
【０００２】
現在、これらの高度不飽和脂肪酸の主な原料は魚類であり、ＥＰＡ及びＤＨＡは、それぞれおよそ２０％及び１０％の量で、種々の（イワシ及びマグロのような）青魚内に存在するとされている。このような脂肪酸プロファイルは、各種魚類において最適な性能のための最適な比が自然選択されることを通して生じると考えられる。しかし、これらの脂質の唯一の原料として魚油を用いることを意図する場合、風味の悪化、利用可能性における制御不能な変動、及び天然魚油の含量のばらつきの問題のような、いくつかの不利点が存在する。加えて、これらの原料から高度に精製された（ｎ−３）又は（ｎ−６）油を得ることを意図する場合、優先的に分離及び精製することは非常に困難である。
【０００３】
真核生物ヤブレツボカビ目（Thraustochytriales eukaryote）、ＯＮＣ−Ｔ１８及び関連生物が、大量のＤＨＡ及びＥＰＡ、並びに他の好ましい脂肪酸を産生できることが既に開示されている。ＯＮＣ−Ｔ１８は、国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００３９７７号並びに米国仮特許出願第６０／７５１４０１号及び同第６０／８２１０８４号に開示されており、これらの少なくともＯＮＣ−Ｔ１８及びその中で産生される脂肪酸に関する情報は、参照することにより全て本明細書に組み込まれる。ＤＨＡ及びＥＰＡ経路を操作することが望ましい。これらの経路に関与するＯＮＣ−Ｔ１８由来の２種の酵素、Ｄ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼの単離及び特徴付けを本明細書に開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＯＮＣ−Ｔ１８、Ｄ４デサチュラーゼ、Ｄ５エロンガーゼ、これらの単離、特性解析、産生、同定、及び脂肪酸産生への使用に関する方法及び組成物、並びにこれらの組成物を含む生物、及びこれらを発現する生物を開示する。
【０００５】
添付図面は、本明細書に組み込まれ、その一部を構成するものであるが、開示する組成物及び方法を例証する記載とともに、いくつかの実施形態を例証する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１はＥＰＡ及びＤＨＡの産生経路を示す。
【図２】図２Ａは単離したＤ４デサチュラーゼの系統樹を示し、図２Ｂは単離したＤ５エロンガーゼの系統樹を示す。
【図３】図３は単離したＤ４デサチュラーゼの遺伝的概要図を示す。
【図４】図４は単離したＤ５エロンガーゼの遺伝的概要図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法を開示並びに説明する前に、それらは、特に定めのない限り特定の合成方法又は特定の組み換えバイオテクノロジー法に、又は特に定めのない限り特定の試薬に限定されるものではなく、したがって、無論それ自体変化してよいことを理解されたい。また、本明細書で用いる用語は、具体的な実施例を説明する目的のためだけのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【０００８】
Ａ．定義
明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈で明示しない限り、複数の対象を含む。したがって、例えば、「医薬用担体（a pharmaceutical carrier）」は、２種又はそれ以上のこのような担体等の混合物を含む。
【０００９】
範囲は、本明細書では、「約」ある特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表すことができる。このような範囲を表すとき、別の実施形態は、その特定の値から、及び／又はその他方の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を用いることにより、近似値として値を表すとき、その特定の値が別の実施形態を成すことを理解されたい。更に、各範囲の端点は他の端点に関連しても、及び他の端点とは独立しても、有効であることも理解されたい。また、本明細書には多くの値が開示され、各値はまたその値自体に加えて「約」その特定の値として開示されることも理解されたい。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。ある値が開示されるとき、当業者は適切に理解するように、その値「以下」、その値「以上」及び値間のあり得る範囲もまた開示されることも理解されたい。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」及び「１０以上」も開示される。また、出願全体にわたって、データは多数の異なる形式で提供され、このデータは端点及び開始点を表し、データ点の任意の組み合わせに及ぶことも理解されたい。例えば、特定のデータ点「１０」及び特定のデータ点１５が開示される場合、１０及び１５超、以上、未満、以下並びに、それに等しい値も、１０と１５との間に加えて開示されると考えられることも理解されたい。また、２つの特定の単位間の各単位も開示されると理解されたい。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３及び１４もまた開示される。
【００１０】
以下の本明細書及び特許請求の範囲では、以下の意味を有するよう定義される多くの用語が参照される。
【００１１】
「随意の」又は「随意に」は、続いて記載される事象又は状況が生じても生じなくてもよく、その記載が、前記事象又は状況が生じる例及び生じない例を含むことを意味する。
【００１２】
「プライマー」は、ある種の酵素的操作を支援でき、前記酵素的操作が生じ得るように標的核酸にハイブリダイズできるプローブのサブセットである。プライマーは、酵素的操作に干渉しない、当該技術分野において利用可能であるヌクレオチド、又はヌクレオチド誘導体若しくは類似体の任意の組み合わせから作製できる。
【００１３】
「プローブ」は、典型的には配列特異的な方式で、例えばハイブリダイゼーションを通して、標的核酸と相互作用することができる分子である。核酸のハイブリダイゼーションについては、当該技術分野においてよく理解されており、本明細書でも論じる。典型的には、プローブは当該技術分野において利用可能であるヌクレオチド、又はヌクレオチド誘導体若しくは類似体の任意の組み合わせから作製できる。
【００１４】
本出願全体を通して、種々の刊行物を参照する。これらの刊行物の開示は、本出願が関連する当該技術分野の状態をより十分に説明するために、その全文を参照することにより本出願に組み込むものとする。開示される参考文献はまた、独立して及び具体的に、その参考文献に依拠する文で論じられる、その参考文献の中に含まれる内容について、参照することにより組み込まれる。
【００１５】
本組成物を調製するために用いるべき構成成分、及び本明細書で開示する方法で用いるべき組成物自体を開示する。これらの及び他の材料は本明細書で開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等を開示するとき、これらの化合物のそれぞれの種々の個々の及び集合的組み合わせ、並びに順序への具体的な参照は明示的に開示されない場合があるが、それぞれは具体的に意図され、本明細書に記載されると理解されたい。例えば、特定のＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼを開示し、論じる場合、そのＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼを含む多くの分子に行い得る多数の改変が論じられ、特にそうではない旨の記述がない限り、Ｄ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼのそれぞれ及び全ての組み合わせ並びに順序、並びに可能な改変が具体的に意図される。したがって、ひとつの分類に属する分子Ａ、Ｂ及びＣという分子、並びに別のひとつの分類に属するＤ、Ｅ及びＦという分子が開示され、分子の組み合わせ例である、Ａ−Ｄが開示される場合、それぞれが独立に引用されない場合でも、それぞれが個々に及び集合的に意図される、すなわち、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ及びＣ−Ｆの組み合わせが開示されるとみなされる。同様にこれらの任意のサブセット又は組み合わせも開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅの部分群が開示されるとみなされる。この概念は、開示する組成物の製造及び使用方法における工程が挙げられるが、これらに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。したがって、実行し得る種々の追加工程が存在する場合、これらの追加工程のそれぞれを、開示した方法の任意の特定の実施形態又は実施形態の組み合わせで実行できることを理解されたい。
【００１６】
Ｂ．組成物
オメガ−３濃縮物（エイコサペンタエン酸ＥＰＡ、２０：５ ｎ−３及びドコサヘキサエン酸ＤＨＡ、２２：６ ｎ−３）の使用は、健康によい食事を増進するための特定の食品の強化において重要性が増している。ヤブレツボカビ目は、そのバイオマスの最大２０％、天然にＤＨＡを産生する海洋原生生物である。これらの生物を発酵させる能力は、これらのオメガ−３油の再生可能な、持続的原料を提供する。脂肪酸代謝経路（図１）の特性解析により、ＥＰＡのドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５ ｎ−３）への伸長に関与するＤ５エロンガーゼ、並びにＤＰＡのＤＨＡへの不飽和化に関与しているＤ４デサチュラーゼの重要性を明らかにする。特定の酵素活性の操作は、市場及び顧客の要求により必要とされる、ＯＮＣ−Ｔ１８株により産生されるＥＰＡ及びＤＨＡの収量に影響を及ぼす可能性がある。
【００１７】
様々なヤブレツボカビ目株（Ｄ４デサチュラーゼについては、Thraustochytrium sp. (CS020087)、Thraustochytrium aureum (AF391546)、Thraustochytrium sp. ATCC 34304 (AF391543)、Thraustochytrium sp. ATCC 21685 (AF489589)及びThraustochytrium sp. FJN-10 (DQ133575)；Ｄ５エロンガーゼについてはThraustochytrium sp. (CS160897) 及びThraustochytrium aureum (CS 160879)）の酵素に由来する遺伝子配列の保存領域から構築した縮重プライマーを用いて、ＯＮＣ−Ｔ１８からＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼを単離した。更にゲノムＤＮＡの遺伝子の一部（それぞれ、９６７ｂｐ及び５９３ｂｐ）をＰＣＲで増幅した。ゲノムウォーキング（APAgene GOLD kit, BIO S&T, Montreal, Quebec）を用いて、既知の配列を広げてオープンリーディングフレーム全体を組み込み、更に広げてプロモータ領域とともに両側の隣接する遺伝子を同定した。次いで、完全な配列用にプライマーを構築して、オープンリーディングフレーム全体（それぞれ１７５８ｂｐ及び１０９９ｂｐ）を組み込んだ完全な遺伝子のＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅ３ベクター（Novagen, San Diego, California）にクローニングし、大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）(Novagen, San Diego, California)に形質転換し、次いで配列を決定した。
【００１８】
得られた遺伝子プラスミドを、UltraClean 6 Minute Mini Plasmid Prep kit (MO BIO Laboratories, Inc., Solana Beach, California)を用いて精製した。遺伝子の挿入断片を、次いで、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いて切り取り、ｐＹＥＳ２酵母発現ベクター（Invitrogen, Carlsbad, California）にクローニングした。ｐＹＤｅｓ（Ｄ４デサチュラーゼ）及びｐＹＥｌｏ（Ｄ５エロンガーゼ）として同定された新たなベクターコンストラクトを、次いでS.c. EasyComp Transformation kit (Invitrogen, Carlsbad, California)を用いて出芽酵母ＩＮＶＳｃ１の、ガラクトースプロモータＧａｌ１の下流に形質転換した。負の対照株は、改変していないｐＹＥＳ２を含むＩＮＶＳｃ１であり、これらは同時に増殖させた。ベクターの選択は、酵母株のウラシル栄養要求性を用いて行い、ウラシルを含まないＳＣ培地を用いた。
【００１９】
Ｄ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼの活性及び特異性を、酵母発現系を用いて決定した。形質転換した酵母を２％のグルコース、１％のTergitol NP-40を含有するＳＣ−Ｕ培地で、４８時間、１５０ＰＲＭ、３０℃にて増殖させた。ＳＣ−Ｕ、２％のガラクトース、１％のラフィノース、１％のTergitol NP-40及び５００μＭの特異的遊離脂肪酸を含有する基質培地を調製した。形質転換した酵母の培養物を、０．５のＯＤ６００で１００ｍＬの基質培地に播種し、培養物を２０℃で５日間インキュベートした。バイオマスを、２０００ＰＲＭで５分間遠心分離することにより回収し、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１度洗浄し、次いで凍結乾燥させた。続いて、脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィーを実施して、脂肪酸不飽和化及び伸長の効率を測定した。基質の変換百分率を、生成物／（基質＋生成物）×１００を算出することにより決定した。
【００２０】
ＢＬＡＳＴｘの結果は、ＯＮＣ−Ｔ１８のＤ４デサチュラーゼは、Thraustochytrium sp. ATCC 21685のＤ４デサチュラーゼと９６％類似していることを示した。図２Ａは、ＯＮＣ−Ｔ１８のＤ４デサチュラーゼ配列と比較したときのＢＬＡＳＴｘサーチの結果を用いたブートストラップ解析（１０００×）である、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて決定した、有根近隣結合系統樹を示す。Ｄ４デサチュラーゼ遺伝子は、５１９アミノ酸タンパク質を転写する、１５６０ｂｐのオープンリーディングフレームを有する。このタンパク質の解析は、３つのヒスチジンボックスモチーフ及び４つの膜貫通領域を有する、シトクロムｂ５ドメインを示し、これらの要素は全てデサチュラーゼの前部に特徴的なものである。この遺伝子に隣接するのは、５つの推定上のＴＡＴＡボックス、複数の反復領域、２つのプロモータ、並びにその上流に同定されたタンパク質キナーゼ及び下流のＡＰ２結合タンパク質である（図３）。
【００２１】
逆に、ＢＬＡＳＴｘサーチで、Ｄ５エロンガーゼタンパク質がThraustochytrium sp.のＦＪＮ−１０多価不飽和脂肪酸エロンガーゼと８９％の同一性を有することが確認された。図２Ｂは、ＯＮＣ−Ｔ１８のＤ５エロンガーゼ配列と比較したときのＢＬＡＳＴｘサーチの結果を用いたブートストラップ解析（１０００×）である、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて決定した、有根近隣結合系統樹を示す。更なる解析により、この２７６アミノ酸タンパク質をコードしている８３１ｂｐの長さのエロンガーゼが、ミトコンドリアに特異的な４つの膜貫通領域及び１つのヒスチジンボックスモチーフを含むことが確認された。このＤ５エロンガーゼ領域の上流構成成分は、ミトコンドリア移入受容体より前に、１つのＴＡＴＡボックス、複数の反復領域、及びプロモータを含み、一方下流では膜占有及び認識ネクサスモチーフの開始が確認された（図４）。
【００２２】
ｎ−３及びｎ−６経路の両方についてのｐＹＤｅｓの特性解析（表１）は、それぞれ、１４％のＤＰＡｎ−３又はドコサテトラエン酸（ＤＴＡ、２２：４ ｎ−６）が、ＤＨＡ又はＤＰＡ ｎ−６に変換されたことを示した。
【００２３】
【表１】
【００２４】
対応するＤ４デサチュラーゼ基質ジホモ−ｇ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ ｎ−６）を供給したとき、変換は検出されなかった。ｐＹＤｅｓ活性を増加させる試みで、クエン酸酸化鉄のような微量金属を培地に添加すると、ＤＰＡからＤＨＡへの変換が増加した（表１）。対照的に、ここでｐＹＥｌｏは、ＥＰＡ又はアラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ ｎ−６）のいずれを供給したときも最小限の変換しか示さない。
【００２５】
高脂肪酸産生株Thraustochytrium sp.ＯＮＣ−Ｔ１８由来のＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼ遺伝子をを、うまく単離及びクローニングし、続いてS. cerevisiaeで発現させた。
【００２６】
更に、Ｄ４デサチュラーゼ酵素は、天然型でも、微量金属の補充を介しても、ＤＰＡ又はＤＴＡをそれぞれの最終産物に変換することが示された。他の脂肪酸の供給試験では、このデサチュラーゼのＤ４に特異的な活性が確認された。エラープローン（error-prone）ＰＣＲのような遺伝子操作技術の使用を通して、この活性は、この株におけるＤＨＡの産生を増加させるために更に強化される。
【００２７】
配列番号２６と、少なくとも７０％、８０％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％の又はこれらを超える同一性を有するＤ４デサチュラーゼを含む組成物を開示する。
【００２８】
また、配列番号２６から離脱する任意の変化が保存的変化である組成物も開示する。
【００２９】
また、前記Ｄ４デサチュラーゼのいずれかをコードする核酸を含む組成物も開示する。
【００３０】
また、ベクターを更に含む組成物も開示する。
【００３１】
また、前記組成物を含む細胞を含む組成物も開示する。
【００３２】
また、前記細胞が真核生物、原核生物、Thraustochytrid、酵母又は大腸菌である組成物も開示する。
【００３３】
また、前記組成物のいずれかを含む非ヒト動物を含む組成物も開示する。
【００３４】
また、前記組成物が、Ｄ４デサチュラーゼの非存在下における組成物よりも多くの多価不飽和脂肪酸を生成する組成物も開示する。
【００３５】
また、前記脂肪酸がＥＰＡ及びＤＨＡである組成物も開示する。
【００３６】
また、前記デサチュラーゼが少なくとも１つのヒスチジンボックスを含む組成物も開示する。
【００３７】
また、前記デサチュラーゼが少なくとも２つのヒスチジンボックスを含む組成物も開示する。
【００３８】
また、前記デサチュラーゼが少なくとも３つのヒスチジンボックスを含む組成物も開示する。
【００３９】
また、前記ヒスチジンボックスが配列ＨＸＸＨＨ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）を含む組成物も開示する。
【００４０】
また、前記ヒスチジンボックスが配列ＱＸＸＨＨを含む組成物も開示する。
【００４１】
また、前記デサチュラーゼがシトクロムｂ５ドメインをも含む組成物も開示する。
【００４２】
また、前記シトクロムｂ５ドメインが５’末端に存在する組成物も開示する。
【００４３】
また、前記デサチュラーゼがデサチュラーゼ基質の存在下にある組成物も開示する。
【００４４】
また、前記基質が少なくとも１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ又は１０００μＭの濃度を有する組成物も開示する。
【００４５】
また、前記基質がドコサペンタエン酸(２２：５ ｎ−３）、ドコサテトラエン酸（２２：４ ｎ−６）、又はジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ ｎ−６）である組成物も開示する。
【００４６】
また、前記デサチュラーゼが、利用可能な基質の少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％を変換する組成物も開示する。
【００４７】
また、前記デサチュラーゼが表１に示す量の基質を変換する組成物も開示する。
【００４８】
また、前記組成物が単離されている組成物も開示する。
【００４９】
また、配列番号１５に対して少なくとも７０％、８０％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、又はこれらを超える同一性を有するＤ５エロンガーゼを含む組成物も開示する。
【００５０】
また、配列番号１５から離脱する任意の変化が保存的変化である組成物も開示する。
【００５１】
また、Ｄ５エロンガーゼのいずれかをコードする核酸を含む組成物も開示する。
【００５２】
また、更にベクターを含む、エロンガーゼ又はデサチュラーゼをコードする組成物も開示する。
【００５３】
また、前記組成物が、Ｄ５エロンガーゼの非存在下における組成物よりも多くの、ＤＨＡ又はＥＰＡのような、多価不飽和脂肪酸を生成する組成物も開示する。
【００５４】
また、前記エロンガーゼがエロンガーゼ基質の存在下にある組成物も開示する。
【００５５】
また、前記基質がエイコサペンタエン酸（２０：５ ｎ−３）又はアラキドン酸（２０：４ ｎ−６）である組成物も開示する。
【００５６】
また、前記エロンガーゼが利用可能な基質の少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％を変換する組成物も開示する。
【００５７】
また、前記組成物が単離されている組成物も開示する。
【００５８】
また、前記開示したデサチュラーゼ組成物のいずれか及び前記開示したエロンガーゼ組成物のいずれかを含む組成物も開示する。
【００５９】
また、１種又はそれ以上の前記組成物のいずれかを用いることを含む、多価不飽和脂肪酸を産生する方法も開示する。
【００６０】
また、産生される脂肪酸がＥＰＡ又はＤＨＡのいずれかである方法も開示する。
【００６１】
また、前記組成物のいずれかを単離することを含む請求項１〜３７に記載の組成物を産生する方法も開示する。
【００６２】
1. 配列類似性
本明細書で論じるように、相同性及び同一性という用語の使用は類似性と同じものを意味することが理解される。したがって、例えば、２つの非天然配列の間で相同性という単語の使用が用いられる場合、それは必ずしも２つの配列の間の進化的関係を示すものではなく、むしろ核酸配列間の類似性又は関連性を指すものであると理解される。２つの進化的に関係のある分子間の相同性を決定するための方法の多くは、進化的に関係するかどうかにかかわらず、配列の類似性を測定する目的のために、任意の２つ若しくはそれ以上の核酸又はタンパク質に対して日常的に適用される。
【００６３】
一般に、本明細書で開示する遺伝子及びタンパク質の、任意の既知の変異体及び誘導体又は生じる可能性のあるものを定義する１つの方法は、特定の既知配列に対する相同性の観点で、変異体及び誘導体を定義することによるものである。本明細書に開示する特定の配列のこの同一性についてはまた、本明細書の他の部分でも論じる。一般に、本明細書に開示する遺伝子及びタンパク質の変異体は、典型的には、規定の配列又はネイティブな配列に対して、少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質、又は遺伝子のような核酸の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最大となるように２つの配列を整列させた後に算出することができる。
【００６４】
相同性を算出する別の方法は、公開されているアルゴリズムにより実施することができる。比較のための最適な配列の整列は、Smith 及び Waterman（Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)）の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman及び Wunsch（J. MoL Biol. 48: 443 (1970)）の相同性整列アルゴリズムにより、Pearson及びLipman（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)）の類似性を探す方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は目視（inspection）により実施できる。
【００６５】
同種の相同性は、例えば、Zuker, M. Science 244:48-52, 1989、Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:7706-7710, 1989、Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989に開示されているアルゴリズムにより、核酸については得ることができ、これらの少なくとも核酸の整列に関する内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。典型的には任意の方法を用いることができ、場合によってはこれらの種々の方法の結果が異なる場合もあるが、当業者は、これらの方法の少なくとも１つで同一性が見出された場合、配列はその提示される同一性を有し、本明細書に開示したものであると言えることが理解される。
【００６６】
例えば、本明細書で使用するとき、別の配列に対して特定の百分率の相同性を有するものとして列挙した配列は、上記算出方法のうちいずれか１つ又はそれ以上により算出したとき、列挙した相同性を有する配列を指す。例えば、他の算出方法のいずれかにより算出したとき、第１の配列が第２の配列に対して８０パーセンの相同性を有しない場合でさえ、Zukerの算出方法を用いて、第１の配列が第２の配列に対して８０パーセンの相同性を有すると算出された場合、第１の配列は、本明細書で定義するとき、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有するとする。別の例として、Smith及びWatermanの算出方法、Needleman 及びWunschの算出方法、Jaegerの算出方法、又は他の算出方法のいずれかにより算出したとき、第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有しない場合でさえ、Zukerの算出方法並びにPearson及びLipmanの算出方法の両方を用いて、第１の配列が第２の配列に対して８０パーセンの相同性を有すると算出された場合、第１の配列は、本明細書で定義するとき、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有するとする。更に別の例として、各算出方法を用いて第１の配列が第２の配列に対して８０％の相同性を有すると算出される場合（実際には、異なる算出方法は、異なる相同性百分率を算出することが多いが）、第１の配列は、本明細書で定義するとき、第２の配列に対して８０％の相同性を有するとする。
【００６７】
２．ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションという用語は、典型的には、プライマー又はプローブと遺伝子のような、少なくとも２つの核酸分子間の配列による相互作用（sequence driven interaction）を意味する。配列による相互作用は、ヌクレオチドに特異的な方式にて、２つのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体又はヌクレオチド誘導体間で生じる相互作用を意味する。例えば、ＧのＣとの相互作用、又はＡのＴとの相互作用は、配列による相互作用である、典型的には、配列による相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面又はフーグスティーン面で生じる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に既知である多数の条件及びパラメータにより影響を受ける。例えば、塩濃度、ｐＨ、及び反応温度は全て、２つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響を及ぼす。
【００６８】
２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのパラメータは、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション及び洗浄工程のいずれか又は両方の温度並びに塩濃度の両方により制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍ（分子の半分が、そのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）を約１２〜２５℃下回る温度における、高イオン強度溶液（６×ＳＳＣ又は６×ＳＳＰＥ）中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、洗浄温度がＴｍを約５〜２０℃下回るように選択された温度及び塩濃度の組み合わせでの洗浄を含み得る。温度及び塩濃度は、フィルタに固定された対照ＤＮＡのサンプルが標識された関心核酸にハイブリダイズし、次いで様々なストリンジェンシー下で洗浄される予備実験で、容易に経験的に決定される。ハイブリダイゼーション温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションではより高い。条件を上記のように、又は当該技術分野において既知であるように用いて、ストリンジェンシーを達成することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Kunkel et al. Methods Enzymol. 1987:154:367, 1987、これらは少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関する内容について、参照することにより本明細書に組み込まれる）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約６８℃（水溶液中）、６×ＳＳＣ又は６×ＳＳＰＥ中であり、続いて約６８℃で洗浄することであり得る。ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェンシーは、必要に応じて、所望の相補性の程度が下がることに応じて、更に、変異性が求められる任意の領域のＧ−Ｃ又はＡ−Ｔの豊富さに応じて、下げることができる。同様に、全て当該技術分野において既知であるように、ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェンシーは、必要に応じて、所望の相同性の程度が上がることに応じて、更に高い相同性が望ましい任意の領域のＧ−Ｃ又はＡ−Ｔの豊富さに応じて、上げることができる。
【００６９】
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、他の核酸に結合した、ある核酸の量（百分率）を調べることである。例えば、いくつか実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の制限核酸が、非制限核酸に結合するときである。典型的には、非制限プライマーは、例えば、１０又は１００又は１０００倍過剰である。この種のアッセイは、制限及び非制限プライマーの両方が、それらのｋｄの例えば１０倍、若しくは１００倍、若しくは１０００倍少ない、又は一方の核酸のみが、１０倍、若しくは１００倍、若しくは１０００倍である、又は、一方若しくは両方の核酸分子がそれらのｋｄを上回る条件下で実施することができる。
【００７０】
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、所望の酵素的操作を促進するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で、酵素的に操作されるプライマーの百分率を調べることである。例えば、いくつか実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％のプライマーが、酵素的操作を促進する条件下で酵素的に操作されるときであり、例えば、酵素的操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％のプライマー分子が伸長するときである。好ましい条件はまた、製造業者により提案されたもの、又は操作を促進する酵素にとって適切であることが当該技術分野において示されているものを含む。
【００７１】
相同性と同時に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションの水準を決定するための、本明細書で開示する種々の方法が存在することが理解される。これらの方法及び条件は、様々な百分率の２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションをもたらすが、特に規定しない限り、任意の方法のパラメータを満たすことで十分である。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが必要である場合、ハイブリダイゼーションがこれらの方法のうち任意の１つにおいて必要なパラメータ内で生じる限り、それは本明細書で開示されると考えられる。
【００７２】
当業者は、組成物又は方法が集合的に又は単独でハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの基準のうち任意の１つを満たす場合、それは本明細書で開示される組成物又は方法であることを理解する。
【００７３】
３．核酸
例えば、単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼ、並びに本明細書に開示する任意の他のタンパク質、並びに種々の機能的核酸をコードする核酸を含む、核酸ベースの本明細書に開示する種々の分子が存在する。開示した核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド置換体で構成されている。これらの及び他の分子の非限定的な例について、本明細書で論じる。例えば、ベクターが細胞内で発現するとき、発現したｍＲＮＡは典型的にはＡ、Ｃ、Ｇ及びＵで構成されることが理解される。同様に、例えばアンチセンス分子が、例えば外因性送達を通して細胞又は細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子は細胞環境内におけるアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチド類似体で構成されることが有利であることが理解される。
【００７４】
ａ）ヌクレオチド及び関連分子
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分及びリン酸部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、リン酸部分及び糖部分を介し、ヌクレオチド間結合を形成して相互に連結できる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）及びチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価リン酸塩である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）又は５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
【００７５】
ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、又はリン酸部分のいずれかに対する、ある種の修飾を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する修飾は、当該技術分野において周知であり、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン及び２−アミノアデニン、並びに糖又はリン酸部分における修飾が挙げられる。
【００７６】
ヌクレオチド置換体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のように、ヌクレオチドと同様の機能特性を有するが、リン酸部分を含まない分子である。ヌクレオチド置換体は、ワトソン−クリック又はフーグスティーン方式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して相互に連結する分子である。ヌクレオチド置換体は、適切な標的核酸と相互作用するとき、二重らせん型構造に適合することができる。
【００７７】
他の種類の分子（コンジュゲート）をヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に連結させて、例えば、細胞取り込みを強化することもできる。コンジュゲートは、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に化学的に連結することができる。このようなコンジュゲートとしては、コレステロール部分のような脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989,86, 6553-6556）。
【００７８】
ワトソン−クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド置換体のワトソン−クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド置換体のワトソン−クリック面としては、プリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド置換体のＣ２、Ｎ１及びＣ６位、並びに、ピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド置換体のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位が挙げられる。
【００７９】
フーグスティーン相互作用は、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のフーグスティーン面で起こる相互作用であり、フーグスティーン面は二本鎖ＤＮＡの主溝に曝される。フーグスティーン面としては、プリンヌクレオチドのＮ７位及びＣ６位の反応基（ＮＨ２又はＯ）が挙げられる。
【００８０】
ｂ）配列
例えば、単離したＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼ、並びにＧｅｎｂａｎｋに開示されている本明細書に開示する任意の他のタンパク質に関連する種々の配列が存在し、これらの配列及び他の配列は、その全体及びその中に含まれる個々の配列が、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８１】
種々の配列が本明細書に提供され、これらの及び他の配列はwww.pubmed.govで、Ｇｅｎｂａｎｋに見出すことができる。当業者は、配列の不一致及び差を解く方法、並びに特定の配列に関連する組成物及び方法を他の関連する配列に適合させる方法を理解する。プライマー及び／又はプローブは、情報が本明細書に開示され、当該技術分野において既知である任意の配列用に設計できる。
【００８２】
ｃ）プライマー及びプローブ
プライマー及びプローブを含む組成物を開示し、そのプライマー及びプローブは本明細書に開示する遺伝子と相互作用することができる。特定の実施形態では、プライマーを用いてＤＮＡ増幅反応を支援することができる。典型的には、プライマーは配列特異的な方式で伸長することができる。配列特異的な方式におけるプライマーの伸長としては、それにプライマーがハイブリダイズする若しくは他の方法で結合する核酸分子の配列及び／又は組成が、プライマーの伸長により生成される産物の組成若しくは配列を方向づける又は影響を及ぼす任意の方法が挙げられる。それ故、配列特異的な方式におけるプライマーの伸長としては、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、又は逆転写が挙げられるが、これらに限定されない。配列特異的な方式でプライマーを増幅する技術及び条件が好ましい。特定の実施形態では、プライマーは、ＰＣＲ又は直接配列決定のようなＤＮＡ増幅反応のために用いられる。特定の実施形態では、プライマーはまた、非酵素的技術を用いて伸長してもよく、この場合例えばプライマーを伸長するために用いられるヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、化学的に反応して配列特異的な方式でプライマーを伸長するよう改変されることが理解される。典型的には、開示するプライマーは、核酸若しくは核酸の領域とハイブリダイズする、又は核酸の相補体若しくは核酸の領域の相補体とハイブリダイズする。
【００８３】
ｄ）機能的核酸
機能的核酸は、標的分子に結合する、又は特定の反応を触媒する等の、特定の機能を有する核酸分子である。機能的核酸分子は、以下のカテゴリーに分けることができるが、これは限定することを意味するものではない。例えば、機能的核酸としては、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重らせん形成分子、及び外部ガイド配列が挙げられる。機能的核酸分子は、標的分子の保有する特定の活性のアフェクタ、阻害剤、修飾因子及び刺激剤として作用できる、又は機能的核酸分子は、任意の他の分子とは関係なく新規の活性を有することもできる。
【００８４】
機能的核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、又は炭水化物鎖のような任意の巨大分子と相互作用できる。したがって、機能的核酸分子は、単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼのｍＲＮＡ、若しくは単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼのゲノムＤＮＡと相互作用できる、又は単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼのポリペプチド若しくは断片と相互作用できる。機能的核酸は、標的分子と機能的核酸分子との間の配列相同性に基づいて、他の核酸と相互作用するよう設計されることが多い。他の状況では、機能的核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、機能的核酸分子と標的分子との間の配列相同性ではなく、特異的認識を起こさせる三次構造の形成に基づく。
【００８５】
アンチセンス分子は、基準（canonical）又は非基準塩基対合のいずれかを介して標的核酸分子と相互作用するよう設計される。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えばＲＮＡｓｅＨ媒介ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解を介して標的分子の破壊を促進するよう設計される。あるいは、アンチセンス分子は、転写又は複製のような、通常標的分子上で起こるプロセシング機能を中断するよう設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計できる。標的分子の最も近づきやすい領域を見出すことにより、アンチセンスの効率を最適化する多くの方法が存在する。代表的な方法は、インビトロ選択実験、並びにＤＭＳ及びＤＥＰＣを用いるＤＮＡ修飾試験である。アンチセンス分子が、１０−６、１０−８、１０−１０、又は１０−１２以下の解離定数（ｋｄ）で標的分子に結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計及び使用を補助する方法並びに技術の代表的な実例は、以下の非限定的な米国特許の一覧中に見出すことができる：米国特許第５，１３５，９１７号、同第５，２９４，５３３号、同第５，６２７，１５８号、同第５，６４１，７５４号、同第５，６９１，３１７号、同第５，７８０，６０７号、同第５，７８６，１３８号、同第５，８４９，９０３号、同第５，８５６，１０３号、同第５，９１９，７７２号、同第５，９５５，５９０号、同第５，９９０，０８８号、同第５，９９４，３２０号、同第５，９９８，６０２号、同第６，００５，０９５号、同第６，００７，９９５号、同第６，０１３，５２２号、同第６，０１７，８９８号、同第６，０１８，０４２号、同第６，０２５，１９８号、同第６，０３３，９１０号、同第６，０４０，２９６号、同第６，０４６，００４号、同第６，０４６，３１９号、及び同第６，０５７，４３７号。
【００８６】
アプタマーは、好ましくは特異的な方法で、標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、ステム−ループ又はＧ−カルテットのような画定された二次及び三次構造に折り畳まれる、１５〜５０塩基の範囲の長さの小核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）及びテオフィリン（theophiline）（米国特許第５，５８０，７３７号）のような小分子、並びに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）及びトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）のような大分子に結合できる。アプタマーは、１０−１２Ｍ未満の標的分子からのｋｄで非常に密接に結合できる。アプタマーは、１０−６、１０−８、１０−１０又は１０−１２未満のｋｄで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高度の特異性で標的分子と結合できる。例えば、標的分子と、分子の単一位置のみが異なる別の分子との間の結合親和性の差が１００００倍超であるアプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号）。アプタマーは、バックグラウンド結合分子のＫｄより少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００又は１００，０００倍低い、標的分子とのｋｄを有することが好ましい。ポリペプチドを比較するとき、例えば、バックグラウンド分子は異なるポリペプチドであることが好ましい。例えば、単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼアプタマーの特異性を決定するとき、バックグラウンドタンパク質は血清アルブミンであり得る。種々の異なる標的分子に結合するためのアプタマーを作製及び使用する方法の代表的な例は、以下の非限定的な米国特許の一覧に見出すことができる：米国特許第５，４７６，７６６号、同第５，５０３，９７８号、同第５，６３１，１４６号、同第５，７３１，４２４号、同第５，７８０，２２８号、同第５，７９２，６１３号、同第５，７９５，７２１号、同第５，８４６，７１３号、同第５，８５８，６６０号、同第５，８６１，２５４号、同第５，８６４，０２６号、同第５，８６９，６４１号、同第５，９５８，６９１号、同第６，００１，９８８号、同第６，０１１，０２０号、同第６，０１３，４４３号、同第６，０２０号、同第１３０号、同第６，０２８号、同第１８６号、同第６，０３０，７７６号、及び同第６，０５１，６９８号。
【００８７】
リボザイムは、分子内又は分子間のいずれかの化学反応を触媒することができる核酸分子である。したがって、リボザイムは、触媒核酸である。リボザイムは分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイム（例えば、以下の米国特許第５，３３４，７１１号、同第５，４３６，３３０号、同第５，６１６，４６６号、同第５，６３３，１３３号、同第５，６４６，０２０号、同第５，６５２，０９４号、同第５，７１２，３８４号、同第５，７７０，７１５号、同第５，８５６，４６３号、同第５，８６１，２８８号、同第５，８９１，６８３号、同第５，８９１，６８４号、同第５，９８５，６２１号、同第５，９８９，９０８号、同第５，９９８，１９３号、同第５，９９８，２０３号、国際公開第９８５８０５８号（Ludwig及びSproat）、同第９８５８０５７号（Ludwig及びSproat）、及び同第９７１８３１２号（Ludwig及びSproat）であるが、これらに限定されない）、ヘアピン型リボザイム（例えば、以下の米国特許第５，６３１，１１５号、同第５，６４６，０３１号、同第５，６８３，９０２号、同第５，７１２，３８４号、同第５，８５６，１８８号、同第５，８６６，７０１号、同第５，８６９，３３９号、及び同第６，０２２，９６２号であるが、これらに限定されない）及びテトラヒメナリボザイム（例えば、以下の米国特許第５，５９５，８７３号及び同第５，６５２，１０７号であるが、これらに限定されない）のような、天然系で見られるリボザイムに基づいた、ヌクレアーゼ又は核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する、多数の異なる種類のリボザイムが存在する。天然系では見られないが、新規の特定の反応を触媒するよう操作されている多数のリボザイムも存在する（例えば、以下の米国特許第５，５８０，９６７号、同第５，６８８，６７０号、同第５，８０７，７１８号、及び同第５，９１０，４０８号であるが、これらに限定されない）。好ましいリボザイムは、ＲＮＡ又はＤＮＡ基質を切断し、より好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、典型的には、その後切断される標的基質の認識及び結合を通して、核酸基質を切断する。この認識は、大部分は基準又は非基準塩基対相互作用に基づくことが多い。この特性により、リボザイムは、核酸を標的特異的に切断するための特に優れた候補となる、なぜなら標的基質の認識は標的基質の配列に基づくためである。種々の異なる反応を触媒するリボザイムの作製及び使用方法の代表的な例は、以下の非限定的な米国特許の一覧に見出すことができる：米国特許第５，６４６，０４２号、同第５，６９３，５３５号、同第５，７３１，２９５号、同第５，８１１，３００号、同第５，８３７，８５５号、同第５，８６９，２５３号、同第５，８７７，０２１号、同第５，８７７，０２２号、同第５，９７２，６９９号、同第５，９７２，７０４号、同第５，９８９，９０６号、及び同第６，０１７，７５６号。
【００８８】
三重鎖形成機能的核酸分子は、二本鎖又は一本鎖核酸のいずれかと相互作用できる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用するとき、三重鎖と呼ばれる構造が形成され、そこにはワトソン−クリック及びフーグスティーン塩基対合の両方に依存して複合体を形成するＤＮＡの３本の鎖が存在する。三重鎖分子が好ましい、なぜなら、三重鎖分子は高い親和性及び特異性で標的領域に結合できるためである。三重鎖形成分子は、１０−６、１０−８、１０−１０又は１０−１２未満のｋｄで標的分子に結合することが好ましい。種々の異なる標的分子に結合する三重鎖形成分子を作製及び使用する方法の代表的な例は、以下の非限定的な米国特許の一覧に見られる：米国特許第５，１７６，９９６号、同第５，６４５，９８５号、同第５，６５０，３１６号、同第５，６８３，８７４号、同第５，６９３，７７３号、同第５，８３４，１８５号、同第５，８６９，２４６号、同第５，８７４，５６６号、及び同第５，９６２，４２６号。
【００８９】
外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する、標的核酸分子に結合する分子であり、この複合体は、標的分子を切断するＲＮａｓｅＰにより認識される。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的とするよう設計することができる。ＲＮＡｓｅＰは、細胞内でのトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを補助する。細菌ＲＮＡｓｅＰは、天然のｔＲＮＡ基質を模倣するために標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体をもたらすＥＧＳを用いることにより、事実上全てのＲＮＡ配列を切断するよう使用することができる（国際公開第９２／０３５６６号（Yale）及びForster and Altman, Science 238:407-409 (1990)）。
【００９０】
同様に、真核生物のＥＧＳ／ＲＮＡｓｅＰ−定方向ＲＮＡ切断を利用して、真核生物細胞内の所望の標的を切断することができる（Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:8006-8010 (1992)；国際公開第９３／２２４３４号（Yale）; 国際公開第９５／２４４８９号（Yale）; Yuan and Altaian, EMBO J 14:159-16* (1995)及びCarrara et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:2627-2631 (1995)）。種々の異なる標的分子の切断を促進するＥＧＳ分子の作製及び使用方法の代表的な例は、以下の非限定的な米国特許の一覧に見られる：米国特許第５，１６８，０５３号、同第５，６２４，８２４号、同第５，６８３，８７３号、同第５，７２８，５２１号、同第５，８６９，２４８号、及び同第５，８７７，１６２号。
【００９１】
４．核酸の送達
外因性ＤＮＡの被験体の細胞への投与及び取り込み（すなわち、遺伝子トランスダクション又はトランスフェクション）を含む上記方法では、開示した核酸は裸のＤＮＡ若しくはＲＮＡの形であってよい、又は核酸は、核酸を細胞に送達するためのベクター内にあってよく、それにより、当業者によく理解されているように、抗体をコードしているＤＮＡ断片はプロモータの転写制御下にある。ベクターは、アデノウイルスベクター（Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Canada）のような、市販調製物であってよい。核酸又はベクターの細胞への送達は、種々の機構を介することができる。１例として、送達は、LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD)、SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Germany)及びTRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI)のような市販のリポソーム調製物、並びに当該技術分野において標準的な手順に従って開発された他のリポソームを用いて、リポソームを介したものであり得る。更に、開示した核酸又はベクターは、エレクトロポレーションによりインビボで送達することもでき、そのための技術はGenetronics, Inc. (San Diego, CA)から入手可能であり、それに加えてSONOPORATION machine (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ)を用いることができる。
【００９２】
１例として、ベクター送達は、組み換えレトロウイルスゲノムをパッケージ化できるレトロウイルスベクター系のような、ウイルス系を介することができる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85:4486, 1988；Miller et al., MoI. Cell. Biol. 6:2895, 1986を参照のこと）。次いで、組み換えレトロウイルスを感染に用いて、それにより、広く中和抗体（又はその活性断片）をコードしている核酸を感染した細胞に送達することができる。改変した核酸を哺乳類細胞に導入する厳密な方法は、無論、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。アデノウイルスベクター（Mitani et al., Hum. Gene Ther. 5:941- 948, 1994）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Goodman et al., Blood 84:1492-1500, 1994）、レンチウイルスベクター（Naidini et al., Science 272:263-267, 1996）、偽型レトロウイルスベクター（Agrawal et al., Exper. Hematol. 24:738-747, 1996）の使用を含む他の技術が、この手順のために広く利用可能である。リポソーム送達並びに受容体介在及び他のエンドサイトーシス機構のような、物理的伝達技術を用いてもよい（例えば、Schwartzenberger et al., Blood 87:472-478, 1996を参照のこと）。この開示する組成物及び方法を、これらの又は他の一般に用いられている遺伝子導入法のいずれかとも併せて用いることができる。
【００９３】
１例として、抗体をコードするＤＮＡがアデノウイルスベクターで被験体の細胞に送達される場合、アデノウイルスのヒトへの投与の用量は、注入１回あたり１０７〜１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲であり得るが、注入１回あたり最大１０１２ｐｆｕにすることができる（Crystal, Hum. Gene Ther. 8:985-1001, 1997；Alvarez and Curiel, Hum. Gene Ther. 8:597-613, 1997）。被験体は１回注入を受けることができる、又は追加の注入が必要な場合、無期限で及び／又は治療の効果が確立されるまで、６ヶ月の間隔で（又は熟練した施術者が決定するとき、他の適切な時間間隔で）繰り返すことができる。
【００９４】
核酸又はベクターの非経口投与は、用いられる場合、一般に、注入を特徴とする。注入物質は、液体溶液又は懸濁液、注入前に溶液を液体に懸濁するために好適な固体形、又はエマルションのいずれかのような従来の形態で調製できる。非経口投与に対する近年改訂されたアプローチは、一定の投与量が維持されるように、徐放又は持続放出系の使用を伴う。好適な処方及び種々の治療用化合物の投与経路についての更なる議論については、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995を参照のこと。
【００９５】
５．発現系
細胞に送達される核酸は、典型的には、発現制御系を含む。例えば、ウイルス及びレトロウイルス系に挿入された遺伝子は、通常、プロモータ及び／又はエンハンサを含んで、所望の遺伝子産物の発現の制御を補助する。プロモータは、一般に、転写開始点に対して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの１つまたは複数の配列である。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の塩基相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメント及び応答エレメントを含み得る。
【００９６】
ａ）ウイルスプロモータ及びエンハンサ
哺乳類宿主細胞でベクターからの転写を制御する好ましいプロモータは、種々の源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスのようなウイルスのゲノム、最も好ましくはサイトメガロウイルス等の種々の原料から、又は異種哺乳類プロモータ、例えばベータアクチンプロモータから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモータは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限断片として便利に得られる（Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)）。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモータは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として便利に得られる（Greenway, PJ. et al., Gene 18: 355-360 (1982)）。無論、宿主細胞又は関連する種のプロモータもまた本明細書で有用である。
【００９７】
エンハンサは、一般に、転写開始点から一定していない距離で機能するＤＮＡの配列を指し、転写単位に対して５’(Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci 78: 993 (1981)) 又は３’(Lusky, M.L., et al., MoI. Cell Bio. 3: 1108 (1983))のいずれかであり得る。更に、エンハンサは、イントロン内（Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983))及びコーディング配列自体内（Osborne, T.F., et al., MoI. Cell Bio. 4: 1293 (1984))にあり得る。それらは、通常１０〜３００ｂｐの長さであり、シスで機能する。エンハンサは、プロモータ付近からの転写を増加させるよう機能する。エンハンサはまた、転写の制御を媒介する応答エレメントを含むことが多い。プロモータもまた、転写の制御を媒介する応答エレメントを含み得る。エンハンサは、遺伝子の発現の制御を決定することが多い。哺乳類遺伝子由来の多くのエンハンサ配列が現在既知であるが（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）、典型的には、普遍的発現のために真核生物ウイルス由来のエンハンサを用いる。好ましい例は、複製起点の後側のＳＶ４０エンハンサ（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサ、複製起点の後側のポリオーマエンハンサ、及びアデノウイルスエンハンサである。
【００９８】
プロモータ及び／又はエンハンサは、光又はそれらの機能を誘発する特異的化学的事象のいずれかにより特異的に活性化され得る。系は、テトラサイクリン及びデキサメタゾンのような試薬により調節できる。また、ガンマ線照射のような照射又はアルキル化化学療法薬に曝露することにより、ウイルスベクターの遺伝子発現を強化する方法も存在する。
【００９９】
特定の実施形態では、プロモータ及び／又はエンハンサ領域は、転写される転写単位の領域の発現を最大化する、恒常的プロモータ及び／又はエンハンサとして作用することができる。特定のコンストラクトでは、特定の時に特定の種類の細胞でしか発現しない場合でさえ、プロモータ及び／又はエンハンサは真核生物細胞の全ての種類で活性である。この種の好ましいプロモータは、ＣＭＶプロモータ（６５０塩基）である。他の好ましいプロモータは、ＳＶ４０プロモータ、サイトメガロウイルス（完全長プロモータ）及びレトロウイルスベクターＬＴＲである。
【０１００】
全ての特定の調節エレメントをクローニングし、メラノーマ細胞のような特定の種類の細胞で選択的に発現する発現ベクターを構築するために用いてよいことが示されている。グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータは、グリア由来の細胞の遺伝子を選択的に発現させるために用いられている。
【０１０１】
真核生物宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト又は有核細胞）で用いられる発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼす可能性のある、転写の終結に必要な配列も含有してよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードしているｍＲＮＡの非翻訳領域でポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた転写終結点も含む。転写単位はまたポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写された単位がｍＲＮＡのようにプロセシング及び輸送される可能性を高めることである。発現コンストラクトにおけるポリアデニル化シグナルの特定及び使用は、十分確立されている。相同なポリアデニル化シグナルを導入遺伝子コンストラクトで用いることが好ましい。特定の転写単位では、ポリアデニル化領域はＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基から成る。転写された単位が、他の標準的な配列を単独で含む、又は上記配列と併せて含み、コンストラクトの発現形又は安定性を向上させることも好ましい。
【０１０２】
ｂ）マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードしている核酸配列を含んでもよい。このマーカー産物を用いて、遺伝子が細胞に送達されているかどうか及び送達された遺伝子が発現しているかどうかを判定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌のｌａｃＺ遺伝子及び緑色蛍光タンパク質である。
【０１０３】
いくつか実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであってよい。哺乳類細胞に好適な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ヒドロマイシン、及びプロマイシンである。このような選択可能なマーカーがうまく哺乳類宿主細胞に移動したとき、形質転換された哺乳類宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合も生存できる。選択レジメンには２つの広く用いられている別個のカテゴリーが存在する。最初のカテゴリーは、細胞の代謝及び補足培地から独立して増殖する能力を欠く突然変異細胞株の使用に基づく。２つの例は、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞及びマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジン又はハイポキサンチンのような栄養素の添加無しでは増殖する能力を欠く。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠いているため、欠失しているヌクレオチドが補足培地に提供されない限り生存できない。培地へ補足に代わるものとしては、インタクトなＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠く細胞に導入し、それによりその増殖要件を変化させることである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子が形質転換されていない個々の細胞は、非補足培地で生存することができない。
【０１０４】
２番目のカテゴリーは、任意の種類の細胞で用いられる選択スキームを指し、突然変異細胞株の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を抑止するための薬物を用いる。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、タンパク質運搬薬物耐性を発現し、選択を生き延びる。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Southern P. and Berg, P.,_J. Molec. Appl. Genet. 1 : 327 (1982)）、ミコフェノール酸（Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980))又はハイグロマイシン（Sugden, B. et al., MoI. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985))を用いる。上記の３つの例は、それぞれ、適切な薬物Ｇ４１８若しくはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）又はハイグロマイシンに対する耐性をもたらすために、真核生物の制御下にある細菌遺伝子を使用する。他には、ネオマイシン類似体Ｇ４１８及びピューロマイシン（puramycin）が挙げられる。
【０１０５】
６．ペプチド
ａ）タンパク質変異体
本明細書で論じるように、既知であり、本明細書で意図される、単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼタンパク質には多数の変異体が存在する。既知の機能的な単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼ株変異体に加えて、開示した方法及び組成物中で機能する単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼタンパク質の誘導体が存在する。タンパク質変異体及び誘導体は、当業者によく理解されており、アミノ酸配列の変更が関与する。例えば、アミノ酸配列の変更は、典型的には、置換、挿入又は欠失変異体の３つの分類のうち１つ又はそれ以上に分類される。挿入には、アミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一若しくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は、通常、例えば、およそ１〜４個の残基の、アミノ又はカルボキシル末端融合より小さな挿入である。実施例で記載するもののような免疫原性融合タンパク質誘導体は、インビトロでの架橋により、又は融合物をコードしているＤＮＡで形質転換された組み換え細胞培養物により、標的配列に免疫原性を与えるのに十分大きなポリペプチドを融合することにより作製される。欠失は、タンパク質配列から１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が除去されることを特徴とする。典型的には、約２〜６個以下の残基が、タンパク質分子内の任意の１部位で欠失する。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードしているＤＮＡにおいてヌクレオチドの部位特異的突然変異を誘発し、それにより変異体をコードしているＤＮＡを生成し、その後組み換え細胞培養物中でＤＮＡを発現させることにより調製される。既知配列を有するＤＮＡの所定の部位で置換突然変異を作製するための技術は周知であり、例えばＭＩ３プライマー突然変異誘発及びＰＣＲ突然変異誘発等である。アミノ酸置換は、典型的には、１つの残基について行われるが、一挙に多くの様々な箇所で起こる場合もある。挿入は通常約１〜１０アミノ酸残基であり、欠失は約１〜３０残基の範囲である。欠失又は挿入は、好ましくは、隣接する対で起こる、すなわち２残基が欠失する又は２残基が挿入される。置換、欠失、挿入又はこれらの任意の組み合わせを組み合わせて、最終コンストラクトに到達する。突然変異は、その配列がリーディングフレームの外に位置してはならず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造を生成できる相補的領域を作製しない。置換変異体は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されたものである。このような置換は、一般に、以下の表２及び表３に従って行われ、保存的置換と称される。
【０１０６】
機能又は免疫学的同一性における大きな変化は、表３のものより保存的ではない置換を選択する、すなわち、（ａ）例えば、シート若しくはらせん形状のような置換の領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の変化若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルクを維持する効果において著しく異なる残基を選択することにより作製される。一般にタンパク質特性に最も大きな変化をもたらすと予測される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリル又はスレオニルを、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル又はアラニルに又は置換する（又は疎水性残基を親水性残基に置換する）、（ｂ）システイン又はプロリンを、任意の他の残基に置換する（又は任意の他の残基をシステイン若しくはプロリンに置換する）、（ｃ）陽電性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、又はヒスチジルを、陰電性残基、例えばグルタミル又はアスパルチルに置換する（又は陰電性残基を陽電性側鎖に置換する）、又は（ｄ）バルク側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンを、側鎖を有しないもの、例えばこの場合グリシンに（又はより）置換する（又は側鎖を有しないものをバルク側鎖を有する残基に置換する）、（ｅ）硫酸化及び／又はグリコシル化の部位の数を増加させることによるものである。
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
例えば、１つのアミノ酸残基を、生物学的に及び／又は化学的に類似の別のアミノ酸残基と置換することは、保存的置換として当該技術分野において既知である。例えば、保存的置換は、ある疎水性残基を別の疎水性残基に、又はある極性残基を別の極性残基に置換することであろう。置換としては、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、ＧＩｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒのような組み合わせが挙げられる。それぞれ明示的に開示されている配列のこのような保存的に置換された変異体は、本明細書に提供されるモザイクポリペプチド内に含まれる。
【０１０９】
置換又は欠失突然変異誘発を使用して、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）又はＯ−グリコシル化（Ｓｅｒ又はＴｈｒ）のための部位を挿入することができる。システイン又は他の不安定な残基の欠失が望ましい場合もある。有望なタンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失又は置換は、例えば、塩基性残基の欠失、又はグルタミニル若しくはヒスチジル残基による置換により達成される。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
特定の翻訳後誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、対応するグルタミル及びアスパリル残基に翻訳後脱アミド化されることが多い。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、及び場合によってはＣ−末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
【０１１２】
本明細書に開示されるタンパク質の変異体及び誘導体を定義する１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性／同一性の観点で、変異体及び誘導体を定義することによるものであることが理解される。例えば、配列番号１５はＤ５エロンガーゼの具体的な配列を記載し、配列番号２６は、Ｄ４デサチュラーゼタンパク質の具体的な配列を記載する。特に、規定の配列に対して少なくとも７０％又は７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％の相同性を有する、本明細書に開示するこれらの及び他のタンパク質の変異体が開示される。当業者は、２つのタンパク質の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最大となるように２つの配列を整列した後に算出できる。配列番号１５及び２６に対して９６％及び８９％を超える同一性を有する配列を具体的に開示する。
【０１１３】
相同性を算出する別の方法は、公開されているアルゴリズムにより実施することができる。比較のための最適な配列の整列は、Smith及び Waterman （Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)）の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman 及びWunsch（J. MoL Biol. 48: 443 (1970)）の相同性配列アルゴリズムにより、Pearson及びLipman（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)）の類似性を探す方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は目視により実施できる。
【０１１４】
同種の相同性は、例えば、Zuker, M. Science 244:48-52, 1989、Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:7706-7710, 1989、Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989に開示されているアルゴリズムにより、核酸について得ることができ、これらは少なくとも核酸の整列に関する内容を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
変異体が保存的突然変異である特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する実施形態のように、保存的突然変異及び相同性の説明は、任意の組み合わせでともに組み合わせ得ることが理解される。
【０１１６】
本明細書で種々のタンパク質及びタンパク質配列について論じるとき、これらのタンパク質配列をコードできる核酸も開示されることが理解される。これは、特定のタンパク質配列に関する全ての縮重配列、すなわち、ある特定のタンパク質配列をコードしている配列を有する全ての核酸、並びに開示するタンパク質配列の変異体及び誘導体をコードしている、縮重核酸を含む全ての核酸を含む。したがって、それぞれの具体的な核酸配列が本明細書に全て書かれていない場合もあるが、それぞれ及び全ての配列は、開示されたタンパク質配列を通して本明細書に事実上開示され、説明されていることが理解される。例えば、配列番号１５に記載されているタンパク質配列をコードできる多くの核酸配列の１つが配列番号１４に記載されている。また、どの具体的なＤＮＡ配列が生物内のどのタンパク質をコードしているかを示すアミノ酸配列は存在しないが、開示するタンパク質の具体的な変異体が本明細書に開示されている場合、それからタンパク質が生じる特定の株においてそのタンパク質をコードしている既知の核酸配列もまた既知であり、本明細書に開示され、説明されることも理解される。
【０１１７】
開示された組成物に組み込むことができる多くのアミノ酸及びペプチド類似体が存在することが理解される。例えば、表２及び表３に示されるアミノ酸とは異なる、多くのＤアミノ酸又は異なる機能的置換を有するアミノ酸が存在する。自然発生ペプチドの逆の立体異性体、並びにペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に選択したアミノ酸をチャージし、例えば終止コドンを利用して類似アミノ酸を部位特異的方法でペプチド鎖に挿入する遺伝的コンストラクトを操作することにより、ポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる（Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991)、Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992)；Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995)、Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989)；Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994)；Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994)、これらは全て、少なくともアミノ酸類似体に関する内容を参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１１８】
ペプチドに類似するが、天然ペプチド結合を介して連結しない分子を生成することができる。例えば、アミノ酸又はアミノ酸類似体に対する結合には、ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−及び−ＣＨＨ２ＳＯ−を挙げることができる（これら及び他のものは、Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)； Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications （一般評論）；Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468； Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979)（−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２−）； Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (−ＣＨ Ｈ２−Ｓ)；Ham J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (−ＣＨ−ＣＨ−、シス及びトランス)；Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (−ＣＯＣＨ２−)；Jennings- White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (−ＣＯＣＨ２−)；Szelke et al. European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982)(−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−)；Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−)；及びHruby Life Sci 31 :189-199 (1982) (−ＣＨ２−Ｓ−)に見られ、これらはそれぞれ参照することにより本明細書に組み込まれる）。特に好ましい非ペプチド結合は、−ＣＨ２ＮＨ−である。ペプチド類似体は、ｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸等のような、結合原子間に１つより多いの原子を有することができると理解される。
【０１１９】
アミノ酸類似体及びペプチド類似体は、より経済的に産生できる、化学的安定性が高い、薬理学的特性（半減期、吸収性、力価、効果等）が強化されている、特異性が改変されている（例えば、生物学的活性が広域性である）、抗原性が低い、及び他の特性のような、強化された又は望ましい特性を有することが多い。
【０１２０】
Ｄ−アミノ酸を用いて、より安定なペプチドを生成することができる、なぜならＤ−アミノ酸はペプチダーゼ等に認識されないためである。同種のＤ−アミノ酸との共通配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸の系統的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を用いて、より安定なペプチドを生成することができる。システイン残基を用いて、２つ又はそれ以上のペプチドをともに環化する又は結合することができる。これは、ペプチドを特定の高次構造にさせるために有用である場合がある（Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992), incorporated herein by reference）。
【０１２１】
７．抗体
（１）抗体全般
用語「抗体」は、本明細書では広い意味で用いられ、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含む。インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、用語「抗体」には、それらが同定、結合、精製され得る、又は変化した活性を有するように、単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼと相互作用する能力について選択される限り、これらの免疫グロブリン分子の断片又はポリマー、及び免疫グロブリン分子若しくはその断片のヒト又はヒト化バージョンを含む。Ｄ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼの開示された領域に結合する抗体も開示される。抗体は、本明細書に記載するインビトロアッセイを用いて、又は類似の方法により所望の活性について試験することができ、その後インビボ治療及び／又は予防活性を、既知の臨床試験法に従って試験する。
【０１２２】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用するとき、実質的に同質な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち集団内の個々の抗体は、抗体分子の小さなサブセットに存在する可能性のある、あり得る自然発生突然変異を除いて同一である。本明細書ではモノクローナル抗体は、具体的には、所望の拮抗活性を呈する限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一である又は同質であるが、鎖の残りは別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一である又は同質である「キメラ」抗体、及びこのような抗体の断片を含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81:6851-6855 (1984)）。
【０１２３】
開示するモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する任意の手順を用いて作製することができる。例えば、開示するモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)に記載のもののような、ハイブリドーマ法を用いて調製できる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物は、典型的には、免疫剤で免役されて、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生する又は産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、例えば本明細書に記載のＨＩＶ Ｅｎｖ−ＣＤ４補助受容体複合体を用いて、インビトロで免役することができる。
【０１２４】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（Cabillyら）に記載されているもののような、組み換えＤＮＡ法により作製することもできる。開示したモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、容易に単離及び配列決定できる。例えば、米国特許第５，８０４，４４０号（Burtonら）及び米国特許第６，０９６，４４１号（Barbas）らに記載されているような、ファージディスプレイ技術を用いて、抗体又は活性抗体断片のライブラリを作製し、スクリーニングすることもできる。
【０１２５】
インビトロ方法もまた一価抗体を調製するのに好適である。抗体の断片、特にＦａｂ断片を生成するための抗体の消化は、当該技術分野において既知である日常的な技術を用いて達成できる。例えば、消化はパパインを用いて実施できる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日公開の国際公開第９４／２９３４８号及び米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、Ｆａｂ断片と呼ばれる、２つの同一の抗原結合断片を生成し、これはそれぞれ１つの抗原結合部位と残りのＦｃ断片を有する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有する断片が得られ、それでもなお抗原を架橋することができる。
【０１２６】
他の配列に結合しようとしまいと、抗体又は抗体断片の活性が、改変されていない抗体又は抗体断片に比べて著しく変化しない又は損なわれないという条件の下で、断片はまた特定の領域又は特定のアミノ酸残基の、挿入、欠失、置換又は他の選択された改変を含むことができる。これらの改変は、ジスルフィド結合できるアミノ酸を除去／付加する、生物寿命を延ばす、分泌特性を変化させる等の、いくつかの追加特性をもたらすことができる。どの場合も、抗体又は抗体断片は、同種抗原への特異的結合のような、生物活性特性を有しなければならない。抗体又は抗体断片の機能的又は活性領域は、タンパク質の特定の領域の突然変異誘発と、それに続く発現及び発現したポリペプチドの試験により同定できる。このような方法は、当業者に容易に明らかであり、抗体又は抗体断片をコードしている核酸の部位特異的突然変異誘発を挙げることができる（Zoller, MJ. Curr. Opin. Biotechnol. 3:348-354, 1992）。
【０１２７】
本明細書で使用するとき、用語「抗体」はまた、ヒト抗体及び／又はヒト化抗体を指すことができる。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、又はウサギに由来するもの）は、自然界でヒトにおいて抗原性を示し、したがって、ヒトに投与されたとき、望ましくない免疫反応を誘発する場合がある。それ故、この方法におけるヒト又はヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫反応を引き起こす可能性を低減するように機能する。
【０１２８】
（２）ヒト抗体
開示するヒト抗体は、任意の技術を用いて調製できる。ヒトモノクローナル抗体を産生する技術の例としては、Cole et al. （Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985)及びBoerner et al. (J Immunol, 147(l):86-95, 1991)に記載のものが挙げられる。ヒト抗体（及びその断片）はまた、ファージディスプレイライブラリを用いて産生することもできる（Hoogenboom et al., J MoI. Biol, 227:381, 1991； Marks et al., J MoI Biol, 222:581, 1991）。
【０１２９】
開示するヒト抗体はまた、遺伝子組み換え動物から得ることもできる。例えば、免疫に反応して、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生できる、遺伝子組み換え、突然変異体マウスが記載されている（例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggermann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993)を参照のこと）。具体的には、これらのキメラ及び生殖細胞突然変異マウスの抗体の重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生を完全に阻害し、ヒト生殖細胞抗体遺伝子アレイをこのような生殖細胞突然変異マウスにうまく転移させると、抗原チャレンジ時にヒト抗体が産生される。所望の活性を有する抗体は、本明細書に記載のようなＥｎｖ−ＣＤ４補助受容体複合体を用いて選択される。
【０１３０】
（３）ヒト化抗体
抗体のヒト化技術は、一般に、組み換えＤＮＡ技術を使用して、抗体分子の１本又はそれ以上のポリペプチド鎖をコードしているＤＮＡ配列を操作することを伴う。したがって、非ヒト抗体（又はその断片）のヒト化型は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれる非ヒト（ドナー）抗体由来の抗原結合部位の一部を含むキメラ抗体、又は抗体鎖（又は、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’若しくは抗原結合部のような、その断片）である。
【０１３１】
ヒト化抗体を生成するために、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対する特定の水準の特異性及び親和性）を有することが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１つ又はそれ以上のＣＤＲの残基を、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基に置換する。場合によっては、対応する非ヒト残基をヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基に置換する。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体でも、移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列でも見られない残基を含有する場合もある。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである源から導入された１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。実際に、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び恐らくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類の抗体の類似部位の残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は、一般に、抗体の定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト抗体の定常領域の少なくとも一部を含む（Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986), Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988), and Presta, Curr. Opin. Struct. Biol, 2:593-596 (1992)）。
【０１３２】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、ヒト化抗体は、げっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによる、Winterとその共同研究者らの方法に従って生成できる（Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）。ヒト化抗体を生成するために用いることができる方法はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（Cabillyら）、同第５，５６５，３３２号（Hoogenboomら）、同第５，７２１，３６７号（Kayら）、同第５，８３７，２４３号（Deoら）、同第５，９３９，５９８号（Kucherlapatiら）、同第６，１３０，３６４号（Jakobovitsら）、及び同第６，１８０，３７７号（Morganら）に記載されている。
【０１３３】
（４）抗体の投与
抗体の投与は、本明細書に記載のように行うことができる。抗体を送達するための核酸アプローチも存在する。抗体及び抗体断片はまた、患者又は被験体自身の細胞が核酸を取り込み、コードされている抗体又は抗体断片を産生及び分泌するように、抗体又は抗体断片をコードする核酸製剤（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）として、患者又は被験体又は細胞に投与することができる。核酸の送達は、例えば本明細書に開示するような任意の手段によることができる。
【０１３４】
８．医薬用担体／医薬品の送達
上記のように、組成物はまた製薬上許容できる担体中でインビボ投与することができる。「製薬上許容できる」とは、生物学的に又は他の点で不所望ではない材料を意味し、すなわち、その材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又は含有されている医薬組成物の他の成分のいずれとも有害な方式で相互作用することなく、核酸又はベクターとともに被験体に投与できる。担体は、当然、当業者に周知であるように、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、かつ被験体のいかなる有害な副作用も最小限に抑えるように選択される。
【０１３５】
組成物は、経口で、非経口で（例えば、静脈内に）、筋肉注射により、腹腔内注射により、経皮的に、体外で、局所鼻腔内投与又は吸入による投与を含む局所的に等で投与してよい。本明細書で使用するとき、「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の一方又は両方を通じて鼻及び鼻道に組成物を送達することを意味し、噴霧機構若しくは液滴機構により、又は核酸若しくはベクターのエーロゾル化を通して送達することを含み得る。吸入による組成物の投与は、噴霧又は液滴機構による送達を介して鼻又は口を通じたものであり得る。また、挿管を介して呼吸器系（例えば、肺）の任意の領域に直接送達することができる。必要とされる組成物の正確な量は、被験体の種、年齢、体重及び全身状態、治療されるアレルギー性疾患の重篤度、用いられる具体的な核酸又はベクター、投与方式等に依存して、被験体により異なる。したがって、全ての組成物の正確な量を規定することは不可能である。しかしながら、適切な量は、本明細書の教示によって、日常的な実験のみを用いて当業者が決定できる。
【０１３６】
組成物の非経口投与は、用いられる場合、一般に、注入を特徴とする。注入物質は、液体溶液又は懸濁液、注入前に液体の懸濁液へ溶解するのに好適な固体形、又はエマルションのような従来の形態で調製できる。非経口投与に対する近年修正されたアプローチは、一定の投与量が維持されるように、徐放又は持続放出系の使用を含む。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
材料は、溶液、懸濁液（例えば、微粒子、リポソーム又は細胞に組み込まれた）であってよい。これらは、抗体、受容体又は受容体リガンドを介して特定の種類の細胞を標的とすることができる。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するために、この技術を使用する例である（Senter, et al., Bioconjugate Chem. , 2:447-451, (1991)；Bagshawe, K.D., 5r. J Cancer, 60:275-281, (1989)；Bagshawe, et al., Br. J Cancer, 58:700-703, (1988)；Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993)；Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992)；Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992)；及びRoffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)）。「ステルス（stealth）」のようなビヒクル及びリポソームにコンジュゲートされた抗体（結腸癌を標的とする脂質媒介薬を含む）、細胞特異的リガンドを介した、受容体が介在するＤＮＡの標的化、リンパ球指向型腫瘍標的化、及びインビボでのマウス神経膠腫細胞の高特異的治療用レトロウイルス標的化。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するために、この技術を使用する例である（Hughes et al., Cancer Research, 49:6214- 6220, (1989)；及びLitzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992))。一般に、受容体は、恒常的又はリガンドに誘発される、エンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体は、クラスリン被覆ピットにおいてクラスタを形成し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受容体が選別される酸性化エンドソームを通過し、次いで細胞表面に再循環する、細胞内に保管される、又はリソソームで分解される。内部移行経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子の排除、ウイルス及び毒素の日和見性侵入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体濃度の調節のような、種々の機能を果たす。多くの受容体は、細胞の種類、受容体の濃度、リガンドの種類、リガンドの価数、及びリガンドの濃度に依存して、１つを超える細胞内経路をたどる。受容体介在エンドサイトーシスの分子及び細胞機構は概説されている（Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)）。
【０１３８】
ａ）製薬上許容できる担体
抗体を含む組成物は、製薬上許容できる担体と組み合わせて治療用に用いることができる。
【０１３９】
好適な担体及びその製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995に記載されている。典型的には、適切な量の製薬上許容できる塩を配合に用いて、配合を等張にする。製薬上許容できる担体の例としては、生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液が挙げることが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８であり、より好ましくは約７〜約７．５である。更に担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような持続放出製剤を含み、このマトリックスは例えばフィルム、リポソーム又は微粒子等の成形品の形態である。特定の担体は、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じてより好ましい場合があることが、当業者には明らかである。
【０１４０】
医薬用担体は、当業者に既知である。これらは最も典型的には、滅菌水、生理食塩水、及び生理学的ｐＨで緩衝化された溶液のような溶液が挙げられる、ヒトに薬物を投与するための標準的な担体である。組成物は、筋肉内に又は皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者により用いられる標準的な手順に従って投与される。
【０１４１】
医薬組成物は、選択した分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、表面活性剤等を含んでもよい。医薬組成物はまた、抗微生物剤、抗炎症性剤、麻酔剤等のような１種又はそれ以上の活性成分を含んでもよい。
【０１４２】
医薬組成物は、局所又は全身治療のいずれが望ましいか、及び治療される領域に応じて、多数の方法で投与することができる。投与は、局所的に（眼科的に、膣内に、直腸内に、鼻腔内にを含む）、経口で、吸入により、又は非経口で、例えば点滴、皮下、腹腔内、若しくは筋肉内注射であり得る。開示した抗体は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、腔内に、又は経皮的に投与することができる。
【０１４３】
非経口投与のための製剤としては、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられ、生理食塩水及び緩衝化培地を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養素補充液、電解質補液（リンガーデキストロースに基づくもののような）等が挙げられる。保存剤、及び、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等のような他の添加剤もまた存在し得る。
【０１４４】
局所投与用製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液剤及び散剤を挙げることができる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤等が必須である又は望ましい場合がある。
【０１４５】
経口投与のための組成物としては、散剤又は顆粒、水又は非水性媒質への懸濁液又は溶液、カプセル、小袋又は錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、又は結合剤が望ましい場合がある。
【０１４６】
いくつかの組成物は、潜在的に、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸のような無機酸、並びに、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸のような有機酸との反応により、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、並びにモノ−、ジ−、トリアルキル及びアリールアミノ並びに置換エタノールアミンのような有機塩基との反応により形成される、製薬上許容できる酸又は塩基付加塩として投与してもよい。
【０１４７】
ｂ）治療的使用
組成物を投与するための有効用量及びスケジュールは、経験的に決定することができ、このような決定をすることは当業者の技能の範囲内である。組成物の投与の用量範囲は、症状障害が効能を受ける所望の効果を生み出すのに十分な程大きい。用量は、不要な交差反応、アナフィラキシー反応等のような有害な副作用を引き起こす程多くてはならない。一般に、用量は、患者の年齢、状態、性別及び疾患の程度、投与経路、又は他の薬物がレジメンに含まれているかどうかにより変化し、当業者が決定することができる。用量は、何らかの使用禁忌がある場合、個々の医師により調節できる。用量は、変化し得、１日又は数日間、毎日１回又はそれ以上の投与回数で投与することができる。医薬品の所与の部類に対する適切な用量に関して、文献中に指針を見出すことができる。例えば、抗体に適切な用量を選択するための指針は、抗体の治療的使用に関する文献、例えばHandbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, NJ. , (1985) ch. 22 and pp. 303-357；Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389に見出すことができる。単独で用いられる抗体の典型的な１日用量は、上述の要因に応じて、体重１ｋｇあたり、１日に約１μｇから最大約１００ｍｇ、又はそれ以上であり得る。
【０１４８】
特定の医薬機能は有しないが、例えば、細胞の染色体内の変化を追跡するため又は診断用ツールの送達のために用いることができる、単離したＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼと相互作用する他の分子は、医薬品について記載したものと同様の方法で送達できる。
【０１４９】
９．チップ及びマイクロアレイ
少なくとも１つのアドレス（address）が、本明細書に開示した核酸配列のいずれかに記載の配列又は配列の一部であるチップを開示する。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書に開示したペプチド配列のいずれかに記載の配列又は配列の一部であるチップも開示する。
【０１５０】
また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書に開示した核酸配列のいずれかに記載の配列又は配列の一部の変異体であるチップを開示する。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書に開示したペプチド配列のいずれかに記載の配列又は配列の一部の変異体であるチップも開示する。
【０１５１】
１０．コンピュータ可読媒体
開示した核酸及びタンパク質は、アミノ酸のヌクレオチドから成る配列として表すことができると理解される。これらの配列を示す種々の方法が存在し、例えば、ヌクレオチドのグアノシンはＧ又はｇにより表すことができる。同様にアミノ酸のバリンは、Ｖａｌ又はＶにより表すことができる。当業者は、存在する種々の方法のいずれかで、任意の核酸又はタンパク質配列を示し、表現する方法を理解し、その方法はそれぞれ本明細書に開示されると考えられる。特に本明細書で意図されるのは、市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク、及びビデオディスクのようなコンピュータ可読媒体、又は他のコンピュータ可読媒体にこれらの配列を表示することである。また、開示する配列の二進コード表示も開示する。当業者は、コンピュータ可読媒体が何であるかを理解する。したがって、核酸又はタンパク質はコンピュータ可読媒体に記録、格納又は保存される。
【０１５２】
配列及び本明細書に記載の配列に関する情報を含むコンピュータ可読媒体を開示する。
【０１５３】
開示した組成物をスクリーニングすることにより同定される組成物／コンビナトリアルケミストリー
ａ）コンビナトリアルケミストリー
開示した組成物を、任意のコンビナトリアル技術の標的として用いて、所望の方法で開示した組成物と相互作用する分子又は巨大分子を同定することができる。本明細書に開示する核酸、ペプチド、及び関連する分子を、コンビナトリアルアプローチの標的として用いることができる。また、例えば配列番号１４、１５、２５若しくは２６又はその一部に開示する組成物をコンビナトリアル又はスクリーニングプロトコルで標的として用いる、コンビナトリアル技術又はスクリーニング技術を通して同定される組成物も開示する。
【０１５４】
コンビナトリアル技術又はスクリーニング方法で開示した組成物を用いるとき、阻害、若しくは刺激のような特定の所望の特性、又は標的分子の機能を有する巨大分子のような分子が同定されると理解される。脂肪酸のような、開示する組成物を用いたときに同定及び単離される分子も開示される。したがって、脂肪酸のような、開示する組成物に関与するコンビナトリアル又はスクリーニングアプローチを用いて生成される生成物も、本明細書に開示されると考えられる。
【０１５５】
例えば、単離したＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼ間の相互作用を阻害する分子を同定するための、開示する方法は、ハイスループット手段を用いて実施できる。例えば、推定上の阻害剤は、相互作用を迅速に同定する、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いて同定できる。この技術の根底にある理論は、２つの分子が空間内で近接しているとき、すなわちバックグラウンドを上回る水準で相互作用しているとき、シグナルが生成される又はシグナルが消滅し得ることである。次いで、例えば推定上の阻害剤に添加することを含む、種々の実験を実施することができる。阻害剤が２つのシグナル伝達分子間の相互作用と競合する場合、シグナルは空間内で互いから除去され、これは用いられるシグナルの種類に応じて、シグナルを減少又は増加させる。このシグナルの減少又は増加は、推定上の阻害剤の存在又は非存在と相関させることができる。任意のシグナル伝達手段を用いることができる。例えば、第１分子と第２分子を推定上の阻害剤下で互いに接触させる工程であって、第１分子又は第２分子が蛍光ドナーを含み、第１分子又は第２分子であって、典型的にはドナーを含まない分子が、蛍光アクセプタを含む工程と；推定上の阻害剤の存在下又は推定上の阻害剤の非存在下で、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を測定する工程であって、推定上の阻害剤の非存在下におけるＦＲＥＴ測定値と比べて、推定上の阻害剤の存在下におけるＦＲＥＴが低いことが、推定上の阻害剤が２つの分子間の結合を阻害したことを示す工程と、を含む、任意の２つの開示した分子間の相互作用の阻害剤を同定する方法を開示する。この種の方法は、同様に細胞系で実施することができる。
【０１５６】
コンビナトリアルケミストリーとしては、典型的には繰り返し作業で、小分子又は別の巨大分子のいずれかに結合できる小分子又は別の巨大分子を単離する全ての方法が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質、オリゴヌクレオチド、及び糖類が巨大分子の例である。例えば、所与の機能を有する、触媒する又はリガンド結合するオリゴヌクレオチド分子は、「インビトロジェネティクス（in vitro genetics）」と呼ばれているものにより、ランダムなオリゴヌクレオチドの複合体混合物から単離することができる（Szostak, TIBS 19:89, 1992）。ランダム及び定義された配列を有する分子の大きなプールを合成し、例えば、１００μｇの１００ヌクレオチドＲＮＡ中の約１０１５の個々の配列のなどの複合体混合物を、ある選択及び濃縮過程に供する。親和性クロマトグラフィー及びカラム上のリガンドに結合した分子のＰＣＲ増幅のサイクルを繰り返すことを通して、Ellington and Szostak (1990)は、１０１０ＲＮＡ分子のうち１分子が小分子染料と結合するような方法で折り畳まれると推定した。このようなリガンド結合挙動を示すＤＮＡ分子も同様に単離されている（Ellington and Szostak, 1992; Bock et al, 1992）。当業者に既知である小有機分子、タンパク質、抗体及び他の巨大分子について、同様の目標を目指す技術が存在する。小有機ライブラリ、オリゴヌクレオチド、又は抗体のいずれかに基づいて、所望の活性についての分子一式をスクリーニングすることは、広くコンビナトリアルケミストリーと呼ばれる。コンビナトリアル技術は、分子間結合相互作用を定義するために、及び巨大分子が核酸であるとき、アプタマーと呼ばれることが多い、特異的結合活性を有する分子を単離するために、特に適している。
【０１５７】
新規活性又は改変された活性のいずれかを有するタンパク質を単離するための、多くの方法が存在する。例えば、ファージディスプレイライブラリを用いて、特定の標的と相互作用する多数のペプチドが単離されている（例えば、米国特許第６，０３１，０７１号；同第５，８２４，５２０号；同第５，５９６，０７９号；及び同第５，５６５，３３２号を参照のこと、これらは少なくともファージディスプレイに関する内容及びコンビナトリアルケミストリーに関する方法について、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１５８】
所与の機能を有するタンパク質を単離する好ましい方法は、Roberts and Szostakにより記載されている(Roberts R. W. and Szostak J.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23)12997-302 (1997))。このコンビナトリアルケミストリー法は、タンパク質の機能的能力と核酸の遺伝的能力を合わせる。ピューロマイシン分子がＲＮＡ分子の３’−末端に共有結合したＲＮＡ分子が生成される。この修飾されたＲＮＡ分子のインビトロ翻訳は、翻訳されるＲＮＡによりコードされている正確なタンパク質をもたらす。加えて、伸長できないペプチジルアクセプタであるピューロマイシンが結合しているために、成長しているペプチド鎖が、ＲＮＡに結合しているピューロマイシンに結合する。したがって、タンパク質分子は、それをコードしている遺伝物質に結合する。ここでは、標準的なインビトロ選択手順を、機能的ペプチドを単離するために用いることができる。一旦ペプチド機能についての選択手順が完了すると、伝統的な核酸操作を実施して、選択された機能的ペプチドをコードする核酸を増幅する。遺伝物質の増幅後、新しいＲＮＡが３’−末端にピューロマイシンを有して転写され、新しいペプチドが翻訳され、別の機能に関する選択がもう一巡実施される。したがって、タンパク質の選択は、核酸選択技術と同様に、繰り返し方式で実施できる。翻訳されるペプチドは、ピューロマイシンに結合したＲＮＡの配列により制御される。この配列は、最適な翻訳（すなわち、終止コドンを有しない等）のために操作されたランダム配列のいずれからでも得ることができ、又は既知のペプチドの改善された又は変更された機能を探すための既知のＲＮＡ分子の縮重配列であってもよい。核酸増幅及びインビトロ翻訳条件は当業者に周知であり、好ましくはRoberts and Szostak (Roberts R. W. and Szostak J.W. Proc. Natl. Acad. ScI USA, 94(23)12997-302 (1997)のように実施される。
【０１５９】
ペプチドを単離するために設計されるコンビナトリアル方法のための、別の好ましい方法は、Cohenらに記載されている(Cohen B.A.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(24):14272-7 (1998))。この方法は、ツーハイブリッド技術を利用し、改変する。酵母ツーハイブリッド系は、タンパク質：タンパク質相互作用の検出及び分析に有用である。最初に出芽酵母において記載された、ツーハイブリッド系は、関心タンパク質に特異的な、新規調節分子を同定するための強力な分子遺伝学的技術である（Fields and Song, Nature 340:245-6 (1989)）。Cohenらは、選択した分子に結合する、合成又は操作されたペプチド配列間の新規相互作用を同定できるよう、この技術を改変した。この種の技術の利点は、選択が細胞内環境で行われることである。この方法は、酸性活性化ドメインに結合したペプチド分子のライブラリを利用する。選択したペプチド、例えば、単離したＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼの一部は、Ｇａｌ４のような転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合する。この種の系でツーハイブリッド技術を実施することにより、単離したＤ４デサチュラーゼ又はＤ５エロンガーゼの一部に結合する分子を同定することができる。
【０１６０】
当業者に周知の手順を用い、種々のコンビナトリアルライブラリと組み合わせることにより、所望の標的に結合又は相互作用する小分子又は巨大分子を単離及び特性解析することができる。これらの化合物の相対結合親和性は比較することができ、当業者に周知の競合的結合試験を用いて最適な化合物が同定される。
【０１６１】
所望の標的に結合する分子を単離するための、コンビナトリアルライブラリ及びスクリーニングコンビナトリアルライブラリを作製する技術は、当業者に周知である。代表的な技術及び方法は、米国特許第５，０８４，８２４号、同第５，２８８，５１４号、同第５，４４９，７５４号、同第５，５０６，３３７号、同第５，５３９，０８３号、同第５，５４５，５６８号、同第５，５５６，７６２号、同第５，５６５，３２４号、同第５，５６５，３３２号、同第５，５７３，９０５号、同第５，６１８，８２５号、同第５，６１９，６８０号、同第５，６２７，２１０号、同第５，６４６，２８５号、同第５，６６３，０４６号、同第５，６７０，３２６号、同第５，６７７，１９５号、同第５，６８３，８９９号、同第５，６８８，６９６号、同第５，６８８，９９７号、同第５，６９８，６８５号、同第５，７１２，１４６号、同第５，７２１，０９９号、同第５，７２３，５９８号、同第５，７４１，７１３号、同第５，７９２，４３１号、同第５，８０７，６８３号、同第５，８０７，７５４号、同第５，８２１，１３０号、同第５，８３１，０１４号、同第５，８３４，１９５号、同第５，８３４，３１８号、同第５，８３４，５８８号、同第５，８４０，５００号、同第５，８４７，１５０号、同第５，８５６，１０７号、同第５，８５６，４９６号、同第５，８５９，１９０号、同第５，８６４，０１０号、同第５，８７４，４４３号、同第５，８７７，２１４号、同第５，８８０，９７２号、同第５，８８６，１２６号、同第５，８８６，１２７号、同第５，８９１，７３７号、同第５，９１６，８９９号、同第５，９１９，９５５号、同第５，９２５，５２７号、同第５，９３９，２６８号、同第５，９４２，３８７号、同第５，９４５，０７０号、同第５，９４８，６９６号、同第５，９５８，７０２号、同第５，９５８，７９２号、同第５，９６２，３３７号、同第５，９６５，７１９号、同第５，９７２，７１９号、同第５，９７６，８９４号、同第５，９８０，７０４号、同第５，９８５，３５６号、同第５，９９９，０８６号、同第６，００１，５７９号、同第６，００４，６１７号、同第６，００８，３２１号、同第６，０１７，７６８号、同第６，０２５，３７１号、同第６，０３０，９１７号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０４５，６７１号、同第６，０４５，７５５号、同第６，０６０，５９６号、及び同第６，０６１，６３６号に見出すことができるが、これらに限定されない。
【０１６２】
コンビナトリアルライブラリは、多数の異なる合成技術を用いて、広く多くの分子から作製することができる。例えば、縮合２，４−ピリミジンジオン(米国特許第６，０２５，３７１号）、ジヒドロベンゾピラン（米国特許第６，０１７，７６８号及び同第５，８２１，１３０号）、アミドアルコール（米国特許第５，９７６，８９４号）、ヒドロキシ−アミノ酸アミド（米国特許第５，９７２，７１９号）炭水化物（米国特許第５，９６５，７１９号）、１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン（米国特許第５，９６２，３３７号）、環式（米国特許第５，９５８，７９２号）、ビアリールアミノ酸アミド（米国特許第５，９４８，６９６号）、チオフェン（米国特許第５，９４２，３８７号）、三環式テトラヒドロキノリン（米国特許第５，９２５，５２７号）、ベンゾフラン（米国特許第５，９１９，９５５号）、イソキノリン（米国特許第５，９１６，８９９号）、ヒダントイン及びチオヒダントイン（米国特許第５，８５９，１９０号）、インドール（米国特許第５，８５６，４９６号）、イミダゾール−ピリド−インドール及びイミダゾール−ピリド−ベンゾチオフェン（米国特許第５，８５６，１０７号）置換２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゾール（米国特許第５，８４７，１５０号）、キノリン（米国特許第５，８４０，５００号）、ＰＮＡ（米国特許第５，８３１，０１４号）、含有タグ（米国特許第５，７２１，０９９号）、ポリケチド（米国特許第５，７１２，１４６号）、モルホリノ−サブユニット（米国特許第５，６９８，６８５号及び同第５，５０６，３３７号）、スルファミド（米国特許第５，６１８，８２５号）、及びベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）を含むライブラリである。
【０１６３】
本明細書で使用するとき、コンビナトリアル法及びライブラリは、伝統的なスクリーニング方法及びライブラリ、並びに繰り返し作業で用いられる方法及びライブラリが含まれた。
【０１６４】
ｂ）コンピュータを利用した薬品設計
開示する組成物は、任意の分子モデリング技術の標的として用いて、開示する組成物の構造を特定する、又は可能性のある分子若しくは小分子のような実際の分子を特定することができ、これらの分子は開示する組成物と所望の方法で相互作用する。本明細書で開示する核酸、ペプチド、及び関連する分子は、任意の分子モデリングプログラム又はアプローチで標的として用いることができる。
【０１６５】
モデリング技術において開示する組成物を用いるとき、阻害若しくは刺激のような特定の所望の特性又は標的分子の機能を有する巨大分子のような分子が同定されると理解される。単離されたＤ４デサチュラーゼ又はＤ５エロンガーゼのような開示する組成物を用いるとき同定及び単離される分子もまた開示される。したがって、単離されたＤ４デサチュラーゼ又はＤ５エロンガーゼのような開示する組成物に関与する分子モデリングアプローチを用いて生成される生成物もまた、本明細書で開示されると考えられる。
【０１６６】
したがって、選択した分子に結合する分子を単離する１つの方法は、合理的設計（rational design）を通じたものである。これは、構造的情報及びコンピュータモデリングを通して達成できる。コンピュータモデリング技術により、選択された分子の三次元原子構造の可視化、および分子と相互作用する新規化合物の合理的設計が可能になる。三次元構造は、典型的には、選択された分子のｘ線結晶学的分析又はＮＭＲイメージングから得られるデータに依存する。その分子力学は、力場のデータを必要とする。コンピュータグラフィックシステムにより、新規化合物がどのように標的分子に結合するかを予測することが可能になり、結合特異性を完全にするために、化合物及び標的分子の構造を実験的に操作することが可能になる。一方又は両方に小さな変化が起こるとき、どの分子−化合物が相互作用するかという予測は、分子力学ソフトウェア及び計算集約的なコンピュータを必要とし、これらは通常分子設計プログラムとユーザとの間のユーザフレンドリな、メニュー方式インタフェース伴う。
【０１６７】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation, Waltham, MA）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギーの最小化及び分子力学機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、及び解析を実行する。ＱＵＡＮＴＡにより、分子相互の挙動の対話的構築、修正、可視化及び分析が可能になる。
【０１６８】
Rotivinen, et al., 1988 Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166； Ripka, New Scientist 54-57 (June 16, 1988)；McKinaly and Rossmann, 1989 Aram. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29, 111-122；Perry and Davies, QSAR: Quantitative Structure- Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989)；Lewis and Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236, 125-140 and 141-162のような多数の記事が、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングについて概説しており、核酸成分のモデル酵素に関しては、Askew, et al., 1989 J. Am. Chem. Soc. I l l, 1082- 1090が概説している。化学物質を選別し、映像的に表現する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc., Pasadena, CA.、Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada、及びHypercube, Inc., Cambridge, Ontarioのような企業から入手可能である。これらは主に特定のタンパク質に特異的な薬物に適用するために設計されているが、それらは、一旦領域が同定されると、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ領域と特異的に相互作用する分子の設計に適合できる。
【０１６９】
結合を変化させることができる化合物の設計及び生成に関して上述したが、基質の結合又は酵素的活性を変化させる化合物について、天然産物又は合成化学物質、及びタンパク質を含む生物学的に活性のある物質を含む、既知の化合物のライブラリをスクリーニングすることもできる。
【０１７０】
１２．キット
本明細書に開示する方法を実行するのに用いることができる試薬を引き出すキットを、本明細書に開示する。キットは、本明細書で論じる、又は開示する方法の実行において必要である若しくは有利である任意の試薬又は試薬の組み合わせを含んでよいことが理解されよう。例えば、キットは、方法の特定の実施形態で論じられる増幅反応を実施するためのプライマー、並びに目的とするプライマーを用いるために必要な緩衝剤及び酵素を含むことができる。
【０１７１】
１３．類似機能を有する組成物
本明細書に開示する組成物は、開示した酵素的機能のような特定の機能を有することが理解される。開示した機能を実施するための特定の構造的要件を本明細書に開示し、開示した構造に関連する同じ機能を実施できる種々の構造が存在すること、及びこれらの構造が最終的に同じ結果、例えば、酵素的機能の刺激又は阻害を達成することが理解される。
【０１７２】
Ｃ．組成物の製造方法
本明細書に開示する組成物及び開示する方法を実施するために必要な組成物は、特に断らない限り、特定の試薬又は化合物について当業者に既知である任意の方法を用いて製造できる。
【０１７３】
１．核酸合成
例えば、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのような核酸は、標準的な化学合成法を用いて製造できる、又は酵素的方法若しくは任意の他の既知の方法を用いて生成できる。このような方法は、標準的な酵素消化に続くヌクレオチド断片の単離（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) Chapters 5, 6を参照のこと）から、例えば、Milligen or Beckman System lPlus DNA synthesizer (for example, Model 8700 automated synthesizer of Milligen-Biosearch, Burlington, MA or ABI Model 380B)を用いるシアノエチルホスホラミダイト法等により純粋に合成する方法にまで及び得る。オリゴヌクレオチドの製造に有用な合成法はまた、Ikuta et ah, Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984)、 (ホスホトリエステル及び亜リン酸トリエステル法）、及びNarang et al., Methods EnzymoL, 65:610-620 (1980)（ホスホトリエステル法）に記載されている。タンパク質核酸分子は、Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994)に記載されているもののような、既知の方法を用いて製造できる。
【０１７４】
２．ペプチド合成
配列番号２３のような、開示するタンパク質を生成する１つの方法は、タンパク質化学技術により２つ若しくはそれ以上のペプチド又はポリペプチドを相互に結合することである。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボノイル）ケミストリー（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）のいずれかを用いて、現在入手可能な実験設備を用いて化学的に合成できる。当業者は、開示するタンパク質に対応するペプチド又はポリペプチドが、例えば、標準的な化学反応により合成できることを容易に理解できる。例えば、ペプチド又はポリペプチドを合成し、その合成樹脂から切断しなくてもよいが、一方ペプチド又はポリペプチドの他の断片を合成し、その後樹脂から切断し、それにより他の断片で機能的に遮断される末端基を露出させることができる。ペプチド縮合反応により、これらの２つの断片は、それぞれカルボキシ末端及びアミノ末端でペプチド結合を介して共有結合して、抗体又はその断片を形成することができる（Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N. Y. (1992)；Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer- Verlag Inc., NY（これらは、少なくともペプチド合成に関する内容が、参照することにより本明細書に組み込まれる））。あるいは、ペプチド又はポリペプチドは、本明細書に記載のようにインビボで独立に合成される。一旦単離されると、これらの独立したペプチド又はポリペプチドは、結合して、同様のペプチド縮合反応を介してペプチド又はその断片を形成することができる。
【０１７５】
例えば、クローニングした又は合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチド断片が結合して、より大きなペプチド断片、ポリペプチド又は全体のタンパク質ドメインを生成することが可能になる（Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)）。あるいは、合成ペプチドのネイティブな化学的ライゲーションを利用して、より短いペプチド断片から合成的に大きなペプチド又はポリペプチドを構築することができる。この方法は、２段階化学反応から成る（Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)）。第１段階は、保護されていない合成ペプチド――チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含有する別の保護されていないペプチドセグメントとの化学選択的反応であり、初期共有生成物としてチオエステル結合中間体が得られる。反応条件を変化させることなく、この中間体は、自然に、急速な分子内反応を受けて、ライゲーション部位でネイティブなペプチド結合を形成する（Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101；Clark-Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994)；Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991)； Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)）。
【０１７６】
あるいは、保護されていないペプチドセグメントは、化学的に結合し、そこで化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間で形成される結合は非天然（非ペプチド）結合である（Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)）。この技術を用いて、タンパク質ドメインの類似体に加えて、大量の完全な生物学的活性を有する比較的純粋なタンパク質が合成されている（de Lisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992)）。
【０１７７】
３．組成物を製造するためのプロセスクレーム
組成物を製造するプロセス、並びに組成物を導く中間体の製造プロセスを開示する。例えば、配列番号１４及び２５の核酸を開示する。合成化学方法及び標準的な分子生物学的方法のような、これらの組成物を製造するために用いることができる種々の方法が存在する。これらの及び他の開示する組成物の製造方法が具体的に開示されることが理解される。
【０１７８】
例えば、配列番号１４及び２５に記載の配列、及び核酸の発現を制御する配列を含む核酸を操作可能な方法で結合させることを含むプロセスにより生成される核酸分子を開示する。
【０１７９】
また、例えば、配列番号１４及び２５に記載の配列に対して８０％の同一性を有する配列を含む核酸分子、及び核酸の発現を制御する配列を含む核酸を操作可能な方法で結合させることを含むプロセスにより生成される核酸分子を開示する。
【０１８０】
例えば、配列番号１４及び２５に記載の配列、及び核酸の発現を制御する配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸分子を、操作可能な方法で結合させることを含むプロセスにより生成される核酸分子を開示する。
【０１８１】
例えば、配列番号１５及び２６に記載のペプチドをコードしている配列、及び核酸分子の発現を制御する配列を含む核酸を操作可能な方法で結合させることを含むプロセスにより生成される核酸分子を開示する。
【０１８２】
例えば、配列番号１５及び２６に記載のペプチドに対して８０％の同一性を有するペプチドをコードしている配列、及び核酸分子の発現を制御する配列を含む核酸を操作可能な方法で結合させることを含むプロセスにより生成される核酸分子を開示する。
【０１８３】
例えば、配列番号１５及び２６に記載のペプチドに対して８０％の同一性を有するペプチドをコードしている配列であって、例えば、配列番号１５及び２６からの任意の変化が保存的変化である配列、及び核酸分子の発現を制御する配列を含む核酸分子を操作可能な方法で結合させることを含むプロセスにより生成される核酸を開示する。
【０１８４】
開示する核酸のいずれかで細胞を形質転換するプロセスにより生成される細胞を開示する。非自然発生的な開示される核酸のいずれかで細胞を形質転換するプロセスにより生成される細胞を開示する。
【０１８５】
開示する核酸のいずれかを発現させるプロセスにより生成される開示する任意のペプチドを開示する。開示する核酸のいずれかを発現させるプロセスにより生成される非自然的に発生する開示するペプチドのいずれかを開示する。非自然的な開示する核酸のいずれかを発現させるプロセスにより生成される開示するペプチドのいずれかを開示する。
【０１８６】
本明細書に開示する核酸分子のいずれかで動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスにより生成される動物を開示する。本明細書に開示される核酸分子のいずれかで動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスにより生成される動物であって、哺乳類である動物を開示する。また、本明細書に開示する核酸分子のいずれかで動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスにより生成される動物であって、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ又は霊長類である動物を開示する。
【０１８７】
また、本明細書に開示する細胞のいずれかを動物に添加するプロセスにより生成される動物を開示する。
【実施例】
【０１８８】
Ｄ．実施例
以下の実施例は、どのように本件で請求する化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法が製造並びに評価されるのかについて、当業者に完全に開示及び説明するために述べるものであり、純粋に例示を目的とし、本開示を限定することを意図するものではない。数（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証するよう努力するが、多少の誤差及び偏差を考慮すべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、温度は℃、かつ周囲温度であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。
【実施例１】
【０１８９】
ThraustochytridのＯＮＣ−Ｔ１８からデサチュラーゼ及びエロンガーゼを単離するための縮重オリゴヌクレオチドの設計
【０１９０】
ThraustochytridのＯＮＣ−Ｔ１８の脂肪酸組成の分析により、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ｎ−６）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）、アドレン酸（adrenic acid）（ＡＤＡ、２２：４ｎ−６）、ω６ドコサペンタエン酸（ω６ＤＰＡ、２２：５ｎ−６）、ω３ドコサペンタエン酸（ω３−ＤＰＡｎ−３）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）のような長鎖ＰＵＦＡがかなりの量存在することが明らかになった。したがって、この生物は、ＡＲＡをＡＤＡに又はＥＰＡをω３−ＤＰＡに変換できる活性Δ５エロンガーゼ、及びＡＤＡをω６−ＤＰＡに又はω３−ＤＰＡをＤＨＡに不飽和化する活性Δ４デサチュラーゼを含むと考えられた（図１）。したがって、目的は、ThraustochytridのＯＮＣ−Ｔ１８からこれらのデサチュラーゼ及びエロンガーゼを単離し、最終的に代替宿主で発現させることにより機能性を確認することを試みることであった。
【０１９１】
機能的デサチュラーゼ酵素をコードしている遺伝子を単離するために、ゲノムＤＮＡを生物から抽出した。ThraustochytridのＯＮＣ−Ｔ１８培養物を、常時攪拌しながら２６℃で１６〜２０時間、培養培地（５ｇ／Ｌ 酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ペプトン、４０ｇ／Ｌ Ｄ（＋）−グルコース、１．２５ｍＬ／Ｌ 微量元素、１．２５ｍＬ／Ｌ ビタミン、４０ｇ／Ｌ 海塩；（微量元素：５ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、３．１５ ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４．３６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、０．６１２５ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０、０．０５９７ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２２ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１８ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１３μｇ／Ｌ Ｈ２ＳｅＯ３、２．７ｍｇ／Ｌ ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、１．８４ ｍｇ／Ｌ Ｎａ３ＶＯ４、１．９４ｍｇ／Ｌ Ｋ２ＣｒＯ４）、（ビタミン：１ｍｇ／Ｌ ビタミンＢ１２、１ｍｇ／Ｌ ビオチン、０．２０ｇ／Ｌ チアミン ＨＣｌ）中で増殖させた。アダプタSorvall #00436を用いてロータＳＴ−Ｈ７５０を備えるSorvall Super T21遠心分離機内で、室温にて５分間、５００ｒｐｍで遠心分離し、８０％の上清を除去し、残りの培地に細胞を再懸濁させ、抽出を続けた。製造業者のプロトコルに従って、Ultraclean Microbial DNA Isolation kit (MO BIO Laboratories, Inc, Solana Beach, California)を用いて、細胞からゲノムＤＮＡを単離した。
【０１９２】
既知のデサチュラーゼで保存されている縮重オリゴヌクレオチド（すなわち、プライマー）を設計するアプローチをとった。これらのプライマーをＰＣＲ反応で用いて、Thraustochytriumから予測されるデサチュラーゼ遺伝子の保存領域を含む断片を同定することができる。Thraustochytrium sp., Thraustochytrium aureum、Thraustochytrium sp. ATCC 34304、 Thraustochytrium sp. ATCC 21685、及びThraustochytrium sp. FJN-IO (それぞれ、ＥＭＢＯ受入番号ＣＳ０２００８７、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ３９１５４６、ＡＦ３９１５４３、ＡＦ４８９５８９、ＤＱ１３３５７５)から５種の配列が入手可能であった。以下のように、Ｋｏｄｏｎプライマーデザイナーソフトウェアを用いて、縮重プライマーを用いた：プライマー４ｄｅｓａｔ３０８（フォワード）（配列番号１）５’−ＧＧＲＡＣＡＧＣＧＡＳＴＴＴＴＡＣＡＧＧＧ−Ｓ’、プライマー４ｄｅｓａｔｌ３６９（リバース）（配列番号２）５’−ＧＴＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＫＡＧ−Ｓ’。
【０１９３】
既知のエロンガーゼに保存されている縮重オリゴヌクレオチド（すなわち、プライマー）を設計するために同じアプローチを用いた。これらのプライマーをＰＣＲ反応で用いて、Thraustochytrium sp.から予測されるエロンガーゼ遺伝子の保存領域を含有する断片を同定できる。Thraustochytrium sp.及びThraustochytrium aureum (それぞれ、ＥＭＢＯ受入番号ＣＳ１６０８９７及びＣＳ１６０８７９）から２種の配列が入手可能であった。以下のように、Ｋｏｄｏｎプライマーデザイナーソフトウェアを用いて、縮重プライマーを用いた：プライマー５ｅｌｏ２０２Ｆ（フォワード）（配列番号３）５’−ＡＡＧＣＣＹＴＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＴＹＣ−３’、プライマー５ｅｌｏ７６８Ｒ（リバース）（配列番号４）５’−ＧＣＡＣＧＡＡＲＡＡＧＴＴＧＣＣＧＡＡＧ−３’。オリゴヌクレオチド配列の縮重コードは、Ｋ＝Ｇ，Ｔ、Ｒ＝Ａ，Ｇ、Ｓ＝Ｇ，Ｃ、Ｙ＝Ｃ，Ｔであった。
【実施例２】
【０１９４】
Thraustochytrium sp. のＯＮＣ−Ｔ１８からのΔ５エロンガーゼヌクレオチド配列の単離
【０１９５】
Δ５エロンガーゼ遺伝子を単離するために、ＰＣＲ増幅を、２００ｎｇ Thraustochytrium sp.のＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡ、１０μＬ ベタイン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ ゼラチン、２００μＭ 各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、１μＭの各プライマー及び０．２ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ(Sigma, Oakville, Ontario)を含有する、５０μＬの体積中で実施した。熱サイクルを、５５．７℃のアニーリング温度で実施し、ＰＣＲ反応物を、０．８％の低融点アガロースゲルで分離し、約６００ｂｐのバンドをゲル精製した。ＰＣＲ産物を、水でアガロースから溶出し、次いでQIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, California)で精製した。これらのＤＮＡ断片を、製造業者の説明書に従って、pT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlueコンピーテントセル(Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンを配列決定した。それにより、既に同定されているΔ５エロンガーゼに対して配列相同性を示す１つのクローンが単離された。このクローンは、以下のように説明される。クローン＃６００−１６（配列番号５）は、これを配列決定し、５９３ｂｐから推定したアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴｘサーチでの最高のスコアとして、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ１Thraustochytrium sp. FJN-IOと９５％の同一性を示した。
【０１９６】
３’−末端を単離するために、Thraustochytrium sp.のＯＮＣ−Ｔ１８から精製したゲノムＤＮＡ、並びにオリゴヌクレオチド３’ＧＳＰａ（配列番号６）（５’−ＣＧＣＴＧＣＧＣＣＣＧＴＡＣＡＴＴＡＣＴＡＣＣＡＴＣＣＡ−Ｓ’）及び３’ＧＳＰｂ（配列番号７）（５’−ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＴＧＡＣ−Ｓ’）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、APAgene GOLD Genome Walking kit (BIO S&T, Montreal, Quebec)を用いて、ゲノムウォーキングを実施した。両方のオリゴヌクレオチドは、推定上のΔ５エロンガーゼの＃６００−１６断片に基づいて設計した。ＰＣＲ断片を、０．８％の低融点アガロースゲルで分離し、約５００〜２０００ｂｐのバンドをゲル精製した。ＰＣＲ産物を、アガロースから水で溶出し、次いでQIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, California)により精製した。これらのＤＮＡ断片を、製造業者の説明書に従ってpT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlueコンピテントセル (Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンを配列決定した。クローン３’Ｃ２−１（配列番号８）は、３５８ｂｐの挿入断片を含んでおり、それは既知のΔ５エロンガーゼとの配列の相同性及び「ＴＧＡ」終止コドンの存在に基づいて、推定上のＤ５エロンガーゼ遺伝子の３’−末端を含むことが確認された。
【０１９７】
５’−末端を単離するために、Thraustochytrium sp.のＯＮＣ−Ｔ１８から精製したゲノムＤＮＡ、並びにオリゴヌクレオチド５’ＧＳＰａ（配列番号９）（５’−ＣＴＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＧＧＧＴＴＧＣＣＡ−Ｓ’）及び５’ＧＳＰｂ（配列番号１０）（５’−ＧＴＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＧＴＡＧＣＣＧＣＣＧＡ−Ｓ’）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、APAgene GOLD Genome Walking kit (BIO S&T, Montreal, Quebec)を用いて、ゲノムウォーキングを実施した。両方のオリゴヌクレオチドは、推定上のＤ５エロンガーゼの＃６００−１６断片に基づいて設計した。ＰＣＲ断片は、０．８％を低融点アガロースゲルで分離し、約５００〜２０００ｂｐのバンドをゲル精製した。ＰＣＲ産物を、アガロースから水で溶出し、次いでQIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, California)により精製した。これらのＤＮＡ断片を、製造業者の説明書に従って、pT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlueコンピテントセル (Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンを配列決定した。新規Δ５エロンガーゼの推定「ＡＴＧ」開始部位を含む５１９ｂｐの挿入断片を含む、クローン５’Ｄ２−１１(配列番号９）が得られた。この断片の推定アミノ酸配列は、既知のΔ５エロンガーゼと整列したとき、８９％の同一性を示した。
【０１９８】
このＤ５エロンガーゼ遺伝子を、テンプレートとしてThraustochytriumのＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡ、及び以下のオリゴヌクレオチドＯＮＣ−Ｔ１８ｅｌｏｌ（フォワード）（配列番号１２）５’−ＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣ−３’、ＯＮＣ−Ｔ１８ｅｌｏ１０９９（リバース）（配列番号１３） ５’−ＧＧＴＣＣＡＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＧＣＧ−３’を用いて、ＰＣＲ増幅によりその全体を単離した。
【０１９９】
ＰＣＲ増幅は、５０μＬの体積：１００ｎｇのThraustochytriumのＯＮＣ−Ｔ１８ゲノムＤＮＡ、２５ｍＭ ＴＡＰＳ−ＨＣｌ（ｐＨ９．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、１．５μＬ ＤＭＳＯ、２００μＭ 各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、０．５μＭ 各プライマー及び１ユニットのPhusion high-fidelity DNA polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland)で実施した。熱サイクル条件は、以下の通りである。テンプレートを最初に９８℃で３０秒間変性し、続いて［９８℃で１０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間］を３０サイクル行い、最後に７２℃で５分間の伸長サイクルを行なった。そのようにして得られたＰＣＲ産物を、製造業者の説明書に従って pT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlue コンピテントセル(Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンの配列を決定した。プラスミドを、UltraClean 6 Minute Mini Plasmid Prep kit (MO BIO Laboratories, Inc, Solana Beach, California)を用いて精製した。それにより得られたプラスミドを、ＢａｍＨＩ／Ｎｏｔｌで消化し、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２(Invitrogen, Carlsbad, California)にクローニングして、クローンｐＹＥｌｏを生成し、次の発現試験のために用いた。
【０２００】
Δ５エロンガーゼ完全長遺伝子挿入断片は１０９９ｂｐ（配列番号１４）の長さであり、最初のＡＴＧから始まる、２７６アミノ酸をコードしている８３１ｂｐのオープンリーディングフレームを含んでいた。完全長遺伝子（配列番号１５）のアミノ酸配列は、Thraustochytrium sp. FJN-IO、Marchantia polymorpha、Physcomitrella patens及びMortierella alpina由来のΔ５エロンガーゼに対して相同な領域を含んでいた。
【実施例３】
【０２０１】
Thraustochytrium ONC-T18からのΔ４デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
【０２０２】
Δ４デサチュラーゼ遺伝子を単離するために、ＰＣＲ増幅を、１００ｎｇ ThraustochytriumのＯＮＣ−Ｔ１８ゲノムＤＮＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、４００μＭ 各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、２μＭの各プライマー及び０．１ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, California)を含有する、５０μｌの体積中で実施した。熱サイクルを、５９．５℃のアニーリング温度で実施し、ＰＣＲ反応物の一部を０．８％の低融点アガロースゲルで分離し、約１１００ｂｐのバンドを、QIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, California)で、残りのＰＣＲ反応から精製した。このＤＮＡ断片を、製造業者の説明書に従って、TOPO TA Cloning kit for Sequencing (Invitrogen, Carlsbad, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをＴＯＰ１０コンピテントセル(Invitrogen, Carlsbad, California)に形質転換し、クローンを配列決定した。それにより、既に同定されているΔ４デサチュラーゼに対して配列の相同性を示す１つのクローンが単離された。このクローンは、以下のように説明される。クローン＃１０−３（配列番号１６）を配列決定し、９６７ｂｐから推定したアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴｘサーチでの最高のスコアとして、デルタ−４脂肪酸デサチュラーゼThraustochytrium sp. ＡＴＣＣ２１６８５と９６％の同一性を示した。
【０２０３】
３’−末端を単離するために、ThraustochytriumのＯＮＣ−Ｔ１８から精製したゲノムＤＮＡ、並びにオリゴヌクレオチド４ｄｅｓａｔ３’ａ（配列番号１７）（５’−ＴＴＡＣＧＣＴＴＣＣＡＡＧＧＡＣＧＣＧＧＴＣ−Ｓ’）及び４ｄｅｓａｔ３’ｂ（配列番号１８）（５’−ＡＴＧＡＡＣＡＡＣＡＣＧＣＧＣＡＡＧＧＡＧＧ−Ｓ’）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、APAgene GOLD Genome Walking kit (BIO S&T, Montreal, Quebec)を用いて、ゲノムウォーキングを実施した。両方のオリゴヌクレオチドは、推定上のΔ４デサチュラーゼの＃１０−３断片に基づいて設計した。ＰＣＲ断片を、０．８％の低融点アガロースゲルで分離し、約５００〜２０００ｂｐのバンドをゲル精製した。ＰＣＲ産物を、アガロースから水で溶出し、次いでQIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, California)により精製した。これらのＤＮＡ断片を、製造業者の説明書に従ってpT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlueコンピテントセル (Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンを配列決定した。クローン３’Ｄ２−９２(配列番号１９）は、７８２ｂｐの挿入断片を含んでおり、それは既知のΔ４デサチュラーゼとの配列の相同性及び「ＴＧＡ」終止コドンの存在に基づいて、推定上のΔ４デサチュラーゼ遺伝子の３’−末端を含むことが確認された。
【０２０４】
５’−末端を単離するために、Thraustochytrium sp.のＯＮＣ−Ｔ１８から精製したゲノムＤＮＡ、並びにオリゴヌクレオチド４ｄｅｓａｔ５’ａ（配列番号２０）（５’−ＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＧＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡＧ−Ｓ’）及び４ｄｅｓａｔ５’ｂ（配列番号２１）（５’−ＣＡＣＡＴＣＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡ−Ｓ’）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、APAgene GOLD Genome Walking kit (BIO S&T, Montreal, Quebec)を用いて、ゲノムウォーキングを実施した。両方のオリゴヌクレオチドは、推定Ｄ４デサチュラーゼの＃１０−３断片に基づいて設計した。ＰＣＲ断片を、０．８％の低融点アガロースゲルで分離し、約５００〜２０００ｂｐのバンドをゲル精製した。ＰＣＲ産物を、アガロースから水で溶出し、次いでQIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, California)により精製した。これらのＤＮＡ断片を、製造業者の説明書に従って、pT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlueコンピテントセル (Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンを配列決定した。このようにして、新規Δ４デサチュラーゼの推定上の「ＡＴＧ」開始部位を含む９４６ｂｐ挿入断片を含む、クローン５’−２１７(配列番号２２）が得られた。この断片の推定アミノ酸配列は、既知のΔ４デサチュラーゼと整列したとき、９６％の同一性を示した。
【０２０５】
このΔ４デサチュラーゼ遺伝子を、テンプレートとしてThraustochytriumＯＮＣ−Ｔ１８ゲノムＤＮＡ、及び以下のオリゴヌクレオチドＯＮＣ−Ｔ１８４ｄｅｓ３８ＯＦ（フォワード）（配列番号２３）５’−ＣＧＡＴＴＧＡＧＡＡＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴ−Ｓ’、ＯＮＣ−Ｔ１４ＤＥＳ１６８７Ｒ（リバース）（配列番号２４）５’−ＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＣＴＧＧＴ−３’を用いて、ＰＣＲ増幅によりその全体を単離した。
【０２０６】
ＰＣＲ増幅は、５０μＬの体積：３００ｎｇのThraustochytrium ＯＮＣ−Ｔ１８ゲノムＤＮＡ、２５ｍＭ ＴＡＰＳ−ＨＣｌ（ｐＨ９．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、１．５μＬ ＤＭＳＯ、２００μＭ 各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、０．５μＭ 各プライマー及び１ユニットのPhusion high-fidelity DNA polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland)を用いて実施した。熱サイクル条件は、以下の通りである。テンプレートを最初に９８℃で３０秒間変性し、続いて［９８℃で１０秒間、６１℃で３０秒間、７２℃で３０秒間］を３０サイクル、最後に７２℃で５分間伸長サイクルを行った。それにより得られたＰＣＲ産物を、製造業者の説明書に従って pT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlueコンピテントセル (Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンの配列を決定した。プラスミドを、UltraClean 6 Minute Mini Plasmid Prep kit (MO BIO Laboratories, Inc, Solana Beach, California)を用いて精製した。それにより得られたプラスミドを、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで消化し、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２(Invitrogen, Carlsbad, California)にクローニングして、クローンｐＹＤｅｓを生成し、次の発現試験のために用いた。
【０２０７】
Δ４デサチュラーゼ完全長遺伝子挿入断片は１７５７ｂｐ（配列番号２５）の長さであり、最初のＡＴＧから始まり、５１９アミノ酸をコードしている１５０９ｂｐのオープンリーディングフレームを含んでいた。完全長遺伝子（配列番号２６）のアミノ酸配列は、Thraustochytrium sp. ATCC21685、Thraustochytrium sp. FJN-IO、及びThraustochytrium aureum由来のΔ４デサチュラーゼに対して相同な領域を含んでいた。それはまた、全ての既知の膜結合デサチュラーゼに見られる３つの保存されている「ヒスチジンボックス」を含んでいた（Okuley, et al. (1994) The Plant Cell 6:147-158）。これらは、アミノ酸１８１〜１８５、２１７〜２２２、及び４５４〜４５８に存在していた。他の膜結合Δ４デサチュラーゼと同様に、ThraustochytriumのＯＮＣ−Ｔ１８Δ４デサチュラーゼの３番目のヒスチジンボックスモチーフ（ＨＸＸＨＨ）は、ＱＸＸＨＨであることが見出された。この配列はまた、５’−末端にシトクロムｂ５ドメインを含んでいた。このシトクロムは、これらの酵素で電子供与体として機能すると考えられる。
【実施例４】
【０２０８】
酵母におけるThraustochytriumＯＮＣ−Ｔ１８Δ４デサチュラーゼ及びΔ５エロンガーゼ遺伝子の発現
【０２０９】
ｐＹＥＳ２（Invitrogen, Carlsbad, California）にクローニングされた完全長Δ４デサチュラーゼから成るクローンｐＹＤｅｓ及び、ｐＹＥＳ２中の完全長Δ５エロンガーゼから成るクローンｐＹＥｌｏを、コンピテント出芽酵母ＩＮＶＳｃ１に形質転換した。酵母の形質転換を、製造業者に特定された条件に従って、S. c. EasyComp Transformation kit (Invitrogen, Carlsbad, California)を用いて実施した。形質転換体を、ウラシルを欠く培地（ＳＣ−Ｕｒａ）上でウラシル栄養要求性について選択した。これらのクローンの特定のデサチュラーゼ活性を検出するために、形質転換体を、以下に列挙する５００μＭの特異的脂肪酸基質の存在下で増殖させた。Ａ）ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）（ドコサヘキサエン酸への変換はΔ４デサチュラーゼ活性を示す）、Ｂ）ドコサテトラエン酸（２２：４ｎ−６）（ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−６）への変換はΔ４デサチュラーゼ活性を示す）、Ｃ）ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ｎ−６）（アラキドン酸（２０：４ｎ−６）への変換はΔ５デサチュラーゼ活性を示す）、Ｄ）エイコサペンタエン酸（２０：５ｎ−３）（ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）への変換はΔ５エロンガーゼ活性を示す）、Ｅ）アラキドン酸（２０：４ｎ−６）（ドコサテトラエン酸（２２：４ｎ−６）への変換はΔ５エロンガーゼ活性を示す）。
【０２１０】
負の対照株は未改変ｐＹＥＳ２ベクターを含むＩＮＶＳｃ１であり、これらを同時に増殖させた。培養物を激しく攪拌し（１５０ｒｐｍ）、５００μＭ（最終濃度）の種々の基質の存在下で２０℃にて９６時間増殖させた。細胞をペレット状にし、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、細胞ペレットを凍結乾燥させた。脂質を、次いで抽出し、ガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ）のために脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に誘導体化した。エステル交換及び抽出を、１００ｍｇの凍結乾燥させた細胞を用いて行い、内部標準としてＣ１９：０を、エステル交換反応混合物（メタノール：塩酸：クロロホルム、１０：１：１）に添加し、混合し、９０℃で２時間加熱し、室温に冷却した。ＦＡＭＥを、１ｍＬの水及び２ｍＬのヘキサン：クロロホルム（４：１）を添加することにより抽出し、有機及び水相を分離させた。有機相を抽出し、０．５ｇの無水硫酸ナトリウムで処理して、微粒子及び残りの水を除去した。有機溶媒をアルゴン流下で蒸発させた。ＦＡＭＥをイソオクタンに再懸濁させ、ＧＣ−ＦＩＤにより分析した。変換率は、生成された生成物を（生成された生成物＋添加した基質）の合計で除し、次いで１００を乗じることにより算出した。表４は、添加した基質の変換率に基づく、単離した遺伝子の酵素活性を表す。
【０２１１】
【表４】
【０２１２】
ThraustochytriumのＯＮＣ−Ｔ１８由来のΔ４デサチュラーゼ遺伝子を含むｐＹＤｅｓクローンは、１４％の２２：５ｎ−３基質を２２：６ｎ−３に、及び１４％の２２：４ｎ−６基質を２２：５ｎ−６に変換した。これは、遺伝子がΔ４デサチュラーゼをコードしていることを確認する。この場合、バックグラウンド（基質の非特異的変換）は存在しなかった。
【実施例５】
【０２１３】
クエン酸酸化鉄によるＯＮＣ−ＴＩ８Δ４デサチュラーゼ活性の操作
【０２１４】
ｐＹＥＳ２（Invitrogen, Carlsbad, California）にクローニングされた、完全長Δ４デサチュラーゼから成る、クローンｐＹＤｅｓを、コンピテント出芽酵母ＩＮＶＳｃ１に形質転換した。負の対照株は未改変ｐＹＥＳ２ベクターを含むＩＮＶＳｃ１であり、これらを同時に増殖させた。培養物を激しく攪拌し（１５０ＲＰＭ）、５００μＭ（最終濃度）のＤＰＡ及び０．０１％クエン酸酸化鉄の存在下で２０℃にて９６時間増殖させた。細胞を前記のように処理して、ＤＰＡのＤＨＡへの変換率を決定した。クエン酸酸化鉄の存在下における変換率は３８．７０％であり、この場合Δ４デサチュラーゼ活性は２．７５倍増加した。
【背景技術】
【０００１】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような（ｎ−３）高度不飽和脂肪酸は、心循環系疾患、慢性炎症及び脳障害に対して好ましい効果を有するという、圧倒的な科学的証拠が存在する。他方、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のような（ｎ−６）脂肪酸は、プロスタグランジン、ロイコトリエン等のようなエイコサノイドステロイドの中間代謝産物として注目されている。
【０００２】
現在、これらの高度不飽和脂肪酸の主な原料は魚類であり、ＥＰＡ及びＤＨＡは、それぞれおよそ２０％及び１０％の量で、種々の（イワシ及びマグロのような）青魚内に存在するとされている。このような脂肪酸プロファイルは、各種魚類において最適な性能のための最適な比が自然選択されることを通して生じると考えられる。しかし、これらの脂質の唯一の原料として魚油を用いることを意図する場合、風味の悪化、利用可能性における制御不能な変動、及び天然魚油の含量のばらつきの問題のような、いくつかの不利点が存在する。加えて、これらの原料から高度に精製された（ｎ−３）又は（ｎ−６）油を得ることを意図する場合、優先的に分離及び精製することは非常に困難である。
【０００３】
真核生物ヤブレツボカビ目（Thraustochytriales eukaryote）、ＯＮＣ−Ｔ１８及び関連生物が、大量のＤＨＡ及びＥＰＡ、並びに他の好ましい脂肪酸を産生できることが既に開示されている。ＯＮＣ−Ｔ１８は、国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００３９７７号並びに米国仮特許出願第６０／７５１４０１号及び同第６０／８２１０８４号に開示されており、これらの少なくともＯＮＣ−Ｔ１８及びその中で産生される脂肪酸に関する情報は、参照することにより全て本明細書に組み込まれる。ＤＨＡ及びＥＰＡ経路を操作することが望ましい。これらの経路に関与するＯＮＣ−Ｔ１８由来の２種の酵素、Ｄ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼの単離及び特徴付けを本明細書に開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＯＮＣ−Ｔ１８、Ｄ４デサチュラーゼ、Ｄ５エロンガーゼ、これらの単離、特性解析、産生、同定、及び脂肪酸産生への使用に関する方法及び組成物、並びにこれらの組成物を含む生物、及びこれらを発現する生物を開示する。
【０００５】
添付図面は、本明細書に組み込まれ、その一部を構成するものであるが、開示する組成物及び方法を例証する記載とともに、いくつかの実施形態を例証する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１はＥＰＡ及びＤＨＡの産生経路を示す。
【図２】図２Ａは単離したＤ４デサチュラーゼの系統樹を示し、図２Ｂは単離したＤ５エロンガーゼの系統樹を示す。
【図３】図３は単離したＤ４デサチュラーゼの遺伝的概要図を示す。
【図４】図４は単離したＤ５エロンガーゼの遺伝的概要図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法を開示並びに説明する前に、それらは、特に定めのない限り特定の合成方法又は特定の組み換えバイオテクノロジー法に、又は特に定めのない限り特定の試薬に限定されるものではなく、したがって、無論それ自体変化してよいことを理解されたい。また、本明細書で用いる用語は、具体的な実施例を説明する目的のためだけのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【０００８】
Ａ．定義
明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈で明示しない限り、複数の対象を含む。したがって、例えば、「医薬用担体（a pharmaceutical carrier）」は、２種又はそれ以上のこのような担体等の混合物を含む。
【０００９】
範囲は、本明細書では、「約」ある特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表すことができる。このような範囲を表すとき、別の実施形態は、その特定の値から、及び／又はその他方の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を用いることにより、近似値として値を表すとき、その特定の値が別の実施形態を成すことを理解されたい。更に、各範囲の端点は他の端点に関連しても、及び他の端点とは独立しても、有効であることも理解されたい。また、本明細書には多くの値が開示され、各値はまたその値自体に加えて「約」その特定の値として開示されることも理解されたい。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。ある値が開示されるとき、当業者は適切に理解するように、その値「以下」、その値「以上」及び値間のあり得る範囲もまた開示されることも理解されたい。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」及び「１０以上」も開示される。また、出願全体にわたって、データは多数の異なる形式で提供され、このデータは端点及び開始点を表し、データ点の任意の組み合わせに及ぶことも理解されたい。例えば、特定のデータ点「１０」及び特定のデータ点１５が開示される場合、１０及び１５超、以上、未満、以下並びに、それに等しい値も、１０と１５との間に加えて開示されると考えられることも理解されたい。また、２つの特定の単位間の各単位も開示されると理解されたい。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３及び１４もまた開示される。
【００１０】
以下の本明細書及び特許請求の範囲では、以下の意味を有するよう定義される多くの用語が参照される。
【００１１】
「随意の」又は「随意に」は、続いて記載される事象又は状況が生じても生じなくてもよく、その記載が、前記事象又は状況が生じる例及び生じない例を含むことを意味する。
【００１２】
「プライマー」は、ある種の酵素的操作を支援でき、前記酵素的操作が生じ得るように標的核酸にハイブリダイズできるプローブのサブセットである。プライマーは、酵素的操作に干渉しない、当該技術分野において利用可能であるヌクレオチド、又はヌクレオチド誘導体若しくは類似体の任意の組み合わせから作製できる。
【００１３】
「プローブ」は、典型的には配列特異的な方式で、例えばハイブリダイゼーションを通して、標的核酸と相互作用することができる分子である。核酸のハイブリダイゼーションについては、当該技術分野においてよく理解されており、本明細書でも論じる。典型的には、プローブは当該技術分野において利用可能であるヌクレオチド、又はヌクレオチド誘導体若しくは類似体の任意の組み合わせから作製できる。
【００１４】
本出願全体を通して、種々の刊行物を参照する。これらの刊行物の開示は、本出願が関連する当該技術分野の状態をより十分に説明するために、その全文を参照することにより本出願に組み込むものとする。開示される参考文献はまた、独立して及び具体的に、その参考文献に依拠する文で論じられる、その参考文献の中に含まれる内容について、参照することにより組み込まれる。
【００１５】
本組成物を調製するために用いるべき構成成分、及び本明細書で開示する方法で用いるべき組成物自体を開示する。これらの及び他の材料は本明細書で開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等を開示するとき、これらの化合物のそれぞれの種々の個々の及び集合的組み合わせ、並びに順序への具体的な参照は明示的に開示されない場合があるが、それぞれは具体的に意図され、本明細書に記載されると理解されたい。例えば、特定のＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼを開示し、論じる場合、そのＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼを含む多くの分子に行い得る多数の改変が論じられ、特にそうではない旨の記述がない限り、Ｄ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼのそれぞれ及び全ての組み合わせ並びに順序、並びに可能な改変が具体的に意図される。したがって、ひとつの分類に属する分子Ａ、Ｂ及びＣという分子、並びに別のひとつの分類に属するＤ、Ｅ及びＦという分子が開示され、分子の組み合わせ例である、Ａ−Ｄが開示される場合、それぞれが独立に引用されない場合でも、それぞれが個々に及び集合的に意図される、すなわち、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ及びＣ−Ｆの組み合わせが開示されるとみなされる。同様にこれらの任意のサブセット又は組み合わせも開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅの部分群が開示されるとみなされる。この概念は、開示する組成物の製造及び使用方法における工程が挙げられるが、これらに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。したがって、実行し得る種々の追加工程が存在する場合、これらの追加工程のそれぞれを、開示した方法の任意の特定の実施形態又は実施形態の組み合わせで実行できることを理解されたい。
【００１６】
Ｂ．組成物
オメガ−３濃縮物（エイコサペンタエン酸ＥＰＡ、２０：５ ｎ−３及びドコサヘキサエン酸ＤＨＡ、２２：６ ｎ−３）の使用は、健康によい食事を増進するための特定の食品の強化において重要性が増している。ヤブレツボカビ目は、そのバイオマスの最大２０％、天然にＤＨＡを産生する海洋原生生物である。これらの生物を発酵させる能力は、これらのオメガ−３油の再生可能な、持続的原料を提供する。脂肪酸代謝経路（図１）の特性解析により、ＥＰＡのドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５ ｎ−３）への伸長に関与するＤ５エロンガーゼ、並びにＤＰＡのＤＨＡへの不飽和化に関与しているＤ４デサチュラーゼの重要性を明らかにする。特定の酵素活性の操作は、市場及び顧客の要求により必要とされる、ＯＮＣ−Ｔ１８株により産生されるＥＰＡ及びＤＨＡの収量に影響を及ぼす可能性がある。
【００１７】
様々なヤブレツボカビ目株（Ｄ４デサチュラーゼについては、Thraustochytrium sp. (CS020087)、Thraustochytrium aureum (AF391546)、Thraustochytrium sp. ATCC 34304 (AF391543)、Thraustochytrium sp. ATCC 21685 (AF489589)及びThraustochytrium sp. FJN-10 (DQ133575)；Ｄ５エロンガーゼについてはThraustochytrium sp. (CS160897) 及びThraustochytrium aureum (CS 160879)）の酵素に由来する遺伝子配列の保存領域から構築した縮重プライマーを用いて、ＯＮＣ−Ｔ１８からＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼを単離した。更にゲノムＤＮＡの遺伝子の一部（それぞれ、９６７ｂｐ及び５９３ｂｐ）をＰＣＲで増幅した。ゲノムウォーキング（APAgene GOLD kit, BIO S&T, Montreal, Quebec）を用いて、既知の配列を広げてオープンリーディングフレーム全体を組み込み、更に広げてプロモータ領域とともに両側の隣接する遺伝子を同定した。次いで、完全な配列用にプライマーを構築して、オープンリーディングフレーム全体（それぞれ１７５８ｂｐ及び１０９９ｂｐ）を組み込んだ完全な遺伝子のＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅ３ベクター（Novagen, San Diego, California）にクローニングし、大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）(Novagen, San Diego, California)に形質転換し、次いで配列を決定した。
【００１８】
得られた遺伝子プラスミドを、UltraClean 6 Minute Mini Plasmid Prep kit (MO BIO Laboratories, Inc., Solana Beach, California)を用いて精製した。遺伝子の挿入断片を、次いで、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いて切り取り、ｐＹＥＳ２酵母発現ベクター（Invitrogen, Carlsbad, California）にクローニングした。ｐＹＤｅｓ（Ｄ４デサチュラーゼ）及びｐＹＥｌｏ（Ｄ５エロンガーゼ）として同定された新たなベクターコンストラクトを、次いでS.c. EasyComp Transformation kit (Invitrogen, Carlsbad, California)を用いて出芽酵母ＩＮＶＳｃ１の、ガラクトースプロモータＧａｌ１の下流に形質転換した。負の対照株は、改変していないｐＹＥＳ２を含むＩＮＶＳｃ１であり、これらは同時に増殖させた。ベクターの選択は、酵母株のウラシル栄養要求性を用いて行い、ウラシルを含まないＳＣ培地を用いた。
【００１９】
Ｄ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼの活性及び特異性を、酵母発現系を用いて決定した。形質転換した酵母を２％のグルコース、１％のTergitol NP-40を含有するＳＣ−Ｕ培地で、４８時間、１５０ＰＲＭ、３０℃にて増殖させた。ＳＣ−Ｕ、２％のガラクトース、１％のラフィノース、１％のTergitol NP-40及び５００μＭの特異的遊離脂肪酸を含有する基質培地を調製した。形質転換した酵母の培養物を、０．５のＯＤ６００で１００ｍＬの基質培地に播種し、培養物を２０℃で５日間インキュベートした。バイオマスを、２０００ＰＲＭで５分間遠心分離することにより回収し、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１度洗浄し、次いで凍結乾燥させた。続いて、脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィーを実施して、脂肪酸不飽和化及び伸長の効率を測定した。基質の変換百分率を、生成物／（基質＋生成物）×１００を算出することにより決定した。
【００２０】
ＢＬＡＳＴｘの結果は、ＯＮＣ−Ｔ１８のＤ４デサチュラーゼは、Thraustochytrium sp. ATCC 21685のＤ４デサチュラーゼと９６％類似していることを示した。図２Ａは、ＯＮＣ−Ｔ１８のＤ４デサチュラーゼ配列と比較したときのＢＬＡＳＴｘサーチの結果を用いたブートストラップ解析（１０００×）である、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて決定した、有根近隣結合系統樹を示す。Ｄ４デサチュラーゼ遺伝子は、５１９アミノ酸タンパク質を転写する、１５６０ｂｐのオープンリーディングフレームを有する。このタンパク質の解析は、３つのヒスチジンボックスモチーフ及び４つの膜貫通領域を有する、シトクロムｂ５ドメインを示し、これらの要素は全てデサチュラーゼの前部に特徴的なものである。この遺伝子に隣接するのは、５つの推定上のＴＡＴＡボックス、複数の反復領域、２つのプロモータ、並びにその上流に同定されたタンパク質キナーゼ及び下流のＡＰ２結合タンパク質である（図３）。
【００２１】
逆に、ＢＬＡＳＴｘサーチで、Ｄ５エロンガーゼタンパク質がThraustochytrium sp.のＦＪＮ−１０多価不飽和脂肪酸エロンガーゼと８９％の同一性を有することが確認された。図２Ｂは、ＯＮＣ−Ｔ１８のＤ５エロンガーゼ配列と比較したときのＢＬＡＳＴｘサーチの結果を用いたブートストラップ解析（１０００×）である、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて決定した、有根近隣結合系統樹を示す。更なる解析により、この２７６アミノ酸タンパク質をコードしている８３１ｂｐの長さのエロンガーゼが、ミトコンドリアに特異的な４つの膜貫通領域及び１つのヒスチジンボックスモチーフを含むことが確認された。このＤ５エロンガーゼ領域の上流構成成分は、ミトコンドリア移入受容体より前に、１つのＴＡＴＡボックス、複数の反復領域、及びプロモータを含み、一方下流では膜占有及び認識ネクサスモチーフの開始が確認された（図４）。
【００２２】
ｎ−３及びｎ−６経路の両方についてのｐＹＤｅｓの特性解析（表１）は、それぞれ、１４％のＤＰＡｎ−３又はドコサテトラエン酸（ＤＴＡ、２２：４ ｎ−６）が、ＤＨＡ又はＤＰＡ ｎ−６に変換されたことを示した。
【００２３】
【表１】
【００２４】
対応するＤ４デサチュラーゼ基質ジホモ−ｇ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ ｎ−６）を供給したとき、変換は検出されなかった。ｐＹＤｅｓ活性を増加させる試みで、クエン酸酸化鉄のような微量金属を培地に添加すると、ＤＰＡからＤＨＡへの変換が増加した（表１）。対照的に、ここでｐＹＥｌｏは、ＥＰＡ又はアラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ ｎ−６）のいずれを供給したときも最小限の変換しか示さない。
【００２５】
高脂肪酸産生株Thraustochytrium sp.ＯＮＣ−Ｔ１８由来のＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼ遺伝子をを、うまく単離及びクローニングし、続いてS. cerevisiaeで発現させた。
【００２６】
更に、Ｄ４デサチュラーゼ酵素は、天然型でも、微量金属の補充を介しても、ＤＰＡ又はＤＴＡをそれぞれの最終産物に変換することが示された。他の脂肪酸の供給試験では、このデサチュラーゼのＤ４に特異的な活性が確認された。エラープローン（error-prone）ＰＣＲのような遺伝子操作技術の使用を通して、この活性は、この株におけるＤＨＡの産生を増加させるために更に強化される。
【００２７】
配列番号２６と、少なくとも７０％、８０％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％の又はこれらを超える同一性を有するＤ４デサチュラーゼを含む組成物を開示する。
【００２８】
また、配列番号２６から離脱する任意の変化が保存的変化である組成物も開示する。
【００２９】
また、前記Ｄ４デサチュラーゼのいずれかをコードする核酸を含む組成物も開示する。
【００３０】
また、ベクターを更に含む組成物も開示する。
【００３１】
また、前記組成物を含む細胞を含む組成物も開示する。
【００３２】
また、前記細胞が真核生物、原核生物、Thraustochytrid、酵母又は大腸菌である組成物も開示する。
【００３３】
また、前記組成物のいずれかを含む非ヒト動物を含む組成物も開示する。
【００３４】
また、前記組成物が、Ｄ４デサチュラーゼの非存在下における組成物よりも多くの多価不飽和脂肪酸を生成する組成物も開示する。
【００３５】
また、前記脂肪酸がＥＰＡ及びＤＨＡである組成物も開示する。
【００３６】
また、前記デサチュラーゼが少なくとも１つのヒスチジンボックスを含む組成物も開示する。
【００３７】
また、前記デサチュラーゼが少なくとも２つのヒスチジンボックスを含む組成物も開示する。
【００３８】
また、前記デサチュラーゼが少なくとも３つのヒスチジンボックスを含む組成物も開示する。
【００３９】
また、前記ヒスチジンボックスが配列ＨＸＸＨＨ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）を含む組成物も開示する。
【００４０】
また、前記ヒスチジンボックスが配列ＱＸＸＨＨを含む組成物も開示する。
【００４１】
また、前記デサチュラーゼがシトクロムｂ５ドメインをも含む組成物も開示する。
【００４２】
また、前記シトクロムｂ５ドメインが５’末端に存在する組成物も開示する。
【００４３】
また、前記デサチュラーゼがデサチュラーゼ基質の存在下にある組成物も開示する。
【００４４】
また、前記基質が少なくとも１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ又は１０００μＭの濃度を有する組成物も開示する。
【００４５】
また、前記基質がドコサペンタエン酸(２２：５ ｎ−３）、ドコサテトラエン酸（２２：４ ｎ−６）、又はジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ ｎ−６）である組成物も開示する。
【００４６】
また、前記デサチュラーゼが、利用可能な基質の少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％を変換する組成物も開示する。
【００４７】
また、前記デサチュラーゼが表１に示す量の基質を変換する組成物も開示する。
【００４８】
また、前記組成物が単離されている組成物も開示する。
【００４９】
また、配列番号１５に対して少なくとも７０％、８０％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、又はこれらを超える同一性を有するＤ５エロンガーゼを含む組成物も開示する。
【００５０】
また、配列番号１５から離脱する任意の変化が保存的変化である組成物も開示する。
【００５１】
また、Ｄ５エロンガーゼのいずれかをコードする核酸を含む組成物も開示する。
【００５２】
また、更にベクターを含む、エロンガーゼ又はデサチュラーゼをコードする組成物も開示する。
【００５３】
また、前記組成物が、Ｄ５エロンガーゼの非存在下における組成物よりも多くの、ＤＨＡ又はＥＰＡのような、多価不飽和脂肪酸を生成する組成物も開示する。
【００５４】
また、前記エロンガーゼがエロンガーゼ基質の存在下にある組成物も開示する。
【００５５】
また、前記基質がエイコサペンタエン酸（２０：５ ｎ−３）又はアラキドン酸（２０：４ ｎ−６）である組成物も開示する。
【００５６】
また、前記エロンガーゼが利用可能な基質の少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％を変換する組成物も開示する。
【００５７】
また、前記組成物が単離されている組成物も開示する。
【００５８】
また、前記開示したデサチュラーゼ組成物のいずれか及び前記開示したエロンガーゼ組成物のいずれかを含む組成物も開示する。
【００５９】
また、１種又はそれ以上の前記組成物のいずれかを用いることを含む、多価不飽和脂肪酸を産生する方法も開示する。
【００６０】
また、産生される脂肪酸がＥＰＡ又はＤＨＡのいずれかである方法も開示する。
【００６１】
また、前記組成物のいずれかを単離することを含む請求項１〜３７に記載の組成物を産生する方法も開示する。
【００６２】
1. 配列類似性
本明細書で論じるように、相同性及び同一性という用語の使用は類似性と同じものを意味することが理解される。したがって、例えば、２つの非天然配列の間で相同性という単語の使用が用いられる場合、それは必ずしも２つの配列の間の進化的関係を示すものではなく、むしろ核酸配列間の類似性又は関連性を指すものであると理解される。２つの進化的に関係のある分子間の相同性を決定するための方法の多くは、進化的に関係するかどうかにかかわらず、配列の類似性を測定する目的のために、任意の２つ若しくはそれ以上の核酸又はタンパク質に対して日常的に適用される。
【００６３】
一般に、本明細書で開示する遺伝子及びタンパク質の、任意の既知の変異体及び誘導体又は生じる可能性のあるものを定義する１つの方法は、特定の既知配列に対する相同性の観点で、変異体及び誘導体を定義することによるものである。本明細書に開示する特定の配列のこの同一性についてはまた、本明細書の他の部分でも論じる。一般に、本明細書に開示する遺伝子及びタンパク質の変異体は、典型的には、規定の配列又はネイティブな配列に対して、少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質、又は遺伝子のような核酸の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最大となるように２つの配列を整列させた後に算出することができる。
【００６４】
相同性を算出する別の方法は、公開されているアルゴリズムにより実施することができる。比較のための最適な配列の整列は、Smith 及び Waterman（Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)）の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman及び Wunsch（J. MoL Biol. 48: 443 (1970)）の相同性整列アルゴリズムにより、Pearson及びLipman（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)）の類似性を探す方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は目視（inspection）により実施できる。
【００６５】
同種の相同性は、例えば、Zuker, M. Science 244:48-52, 1989、Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:7706-7710, 1989、Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989に開示されているアルゴリズムにより、核酸については得ることができ、これらの少なくとも核酸の整列に関する内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。典型的には任意の方法を用いることができ、場合によってはこれらの種々の方法の結果が異なる場合もあるが、当業者は、これらの方法の少なくとも１つで同一性が見出された場合、配列はその提示される同一性を有し、本明細書に開示したものであると言えることが理解される。
【００６６】
例えば、本明細書で使用するとき、別の配列に対して特定の百分率の相同性を有するものとして列挙した配列は、上記算出方法のうちいずれか１つ又はそれ以上により算出したとき、列挙した相同性を有する配列を指す。例えば、他の算出方法のいずれかにより算出したとき、第１の配列が第２の配列に対して８０パーセンの相同性を有しない場合でさえ、Zukerの算出方法を用いて、第１の配列が第２の配列に対して８０パーセンの相同性を有すると算出された場合、第１の配列は、本明細書で定義するとき、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有するとする。別の例として、Smith及びWatermanの算出方法、Needleman 及びWunschの算出方法、Jaegerの算出方法、又は他の算出方法のいずれかにより算出したとき、第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有しない場合でさえ、Zukerの算出方法並びにPearson及びLipmanの算出方法の両方を用いて、第１の配列が第２の配列に対して８０パーセンの相同性を有すると算出された場合、第１の配列は、本明細書で定義するとき、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有するとする。更に別の例として、各算出方法を用いて第１の配列が第２の配列に対して８０％の相同性を有すると算出される場合（実際には、異なる算出方法は、異なる相同性百分率を算出することが多いが）、第１の配列は、本明細書で定義するとき、第２の配列に対して８０％の相同性を有するとする。
【００６７】
２．ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションという用語は、典型的には、プライマー又はプローブと遺伝子のような、少なくとも２つの核酸分子間の配列による相互作用（sequence driven interaction）を意味する。配列による相互作用は、ヌクレオチドに特異的な方式にて、２つのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体又はヌクレオチド誘導体間で生じる相互作用を意味する。例えば、ＧのＣとの相互作用、又はＡのＴとの相互作用は、配列による相互作用である、典型的には、配列による相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面又はフーグスティーン面で生じる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に既知である多数の条件及びパラメータにより影響を受ける。例えば、塩濃度、ｐＨ、及び反応温度は全て、２つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響を及ぼす。
【００６８】
２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのパラメータは、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション及び洗浄工程のいずれか又は両方の温度並びに塩濃度の両方により制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍ（分子の半分が、そのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）を約１２〜２５℃下回る温度における、高イオン強度溶液（６×ＳＳＣ又は６×ＳＳＰＥ）中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、洗浄温度がＴｍを約５〜２０℃下回るように選択された温度及び塩濃度の組み合わせでの洗浄を含み得る。温度及び塩濃度は、フィルタに固定された対照ＤＮＡのサンプルが標識された関心核酸にハイブリダイズし、次いで様々なストリンジェンシー下で洗浄される予備実験で、容易に経験的に決定される。ハイブリダイゼーション温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションではより高い。条件を上記のように、又は当該技術分野において既知であるように用いて、ストリンジェンシーを達成することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Kunkel et al. Methods Enzymol. 1987:154:367, 1987、これらは少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関する内容について、参照することにより本明細書に組み込まれる）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約６８℃（水溶液中）、６×ＳＳＣ又は６×ＳＳＰＥ中であり、続いて約６８℃で洗浄することであり得る。ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェンシーは、必要に応じて、所望の相補性の程度が下がることに応じて、更に、変異性が求められる任意の領域のＧ−Ｃ又はＡ−Ｔの豊富さに応じて、下げることができる。同様に、全て当該技術分野において既知であるように、ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェンシーは、必要に応じて、所望の相同性の程度が上がることに応じて、更に高い相同性が望ましい任意の領域のＧ−Ｃ又はＡ−Ｔの豊富さに応じて、上げることができる。
【００６９】
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、他の核酸に結合した、ある核酸の量（百分率）を調べることである。例えば、いくつか実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の制限核酸が、非制限核酸に結合するときである。典型的には、非制限プライマーは、例えば、１０又は１００又は１０００倍過剰である。この種のアッセイは、制限及び非制限プライマーの両方が、それらのｋｄの例えば１０倍、若しくは１００倍、若しくは１０００倍少ない、又は一方の核酸のみが、１０倍、若しくは１００倍、若しくは１０００倍である、又は、一方若しくは両方の核酸分子がそれらのｋｄを上回る条件下で実施することができる。
【００７０】
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、所望の酵素的操作を促進するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で、酵素的に操作されるプライマーの百分率を調べることである。例えば、いくつか実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％のプライマーが、酵素的操作を促進する条件下で酵素的に操作されるときであり、例えば、酵素的操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％のプライマー分子が伸長するときである。好ましい条件はまた、製造業者により提案されたもの、又は操作を促進する酵素にとって適切であることが当該技術分野において示されているものを含む。
【００７１】
相同性と同時に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションの水準を決定するための、本明細書で開示する種々の方法が存在することが理解される。これらの方法及び条件は、様々な百分率の２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションをもたらすが、特に規定しない限り、任意の方法のパラメータを満たすことで十分である。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが必要である場合、ハイブリダイゼーションがこれらの方法のうち任意の１つにおいて必要なパラメータ内で生じる限り、それは本明細書で開示されると考えられる。
【００７２】
当業者は、組成物又は方法が集合的に又は単独でハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの基準のうち任意の１つを満たす場合、それは本明細書で開示される組成物又は方法であることを理解する。
【００７３】
３．核酸
例えば、単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼ、並びに本明細書に開示する任意の他のタンパク質、並びに種々の機能的核酸をコードする核酸を含む、核酸ベースの本明細書に開示する種々の分子が存在する。開示した核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド置換体で構成されている。これらの及び他の分子の非限定的な例について、本明細書で論じる。例えば、ベクターが細胞内で発現するとき、発現したｍＲＮＡは典型的にはＡ、Ｃ、Ｇ及びＵで構成されることが理解される。同様に、例えばアンチセンス分子が、例えば外因性送達を通して細胞又は細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子は細胞環境内におけるアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチド類似体で構成されることが有利であることが理解される。
【００７４】
ａ）ヌクレオチド及び関連分子
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分及びリン酸部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、リン酸部分及び糖部分を介し、ヌクレオチド間結合を形成して相互に連結できる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）及びチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価リン酸塩である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）又は５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
【００７５】
ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、又はリン酸部分のいずれかに対する、ある種の修飾を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する修飾は、当該技術分野において周知であり、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン及び２−アミノアデニン、並びに糖又はリン酸部分における修飾が挙げられる。
【００７６】
ヌクレオチド置換体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のように、ヌクレオチドと同様の機能特性を有するが、リン酸部分を含まない分子である。ヌクレオチド置換体は、ワトソン−クリック又はフーグスティーン方式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して相互に連結する分子である。ヌクレオチド置換体は、適切な標的核酸と相互作用するとき、二重らせん型構造に適合することができる。
【００７７】
他の種類の分子（コンジュゲート）をヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に連結させて、例えば、細胞取り込みを強化することもできる。コンジュゲートは、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に化学的に連結することができる。このようなコンジュゲートとしては、コレステロール部分のような脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989,86, 6553-6556）。
【００７８】
ワトソン−クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド置換体のワトソン−クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド置換体のワトソン−クリック面としては、プリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド置換体のＣ２、Ｎ１及びＣ６位、並びに、ピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド置換体のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位が挙げられる。
【００７９】
フーグスティーン相互作用は、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のフーグスティーン面で起こる相互作用であり、フーグスティーン面は二本鎖ＤＮＡの主溝に曝される。フーグスティーン面としては、プリンヌクレオチドのＮ７位及びＣ６位の反応基（ＮＨ２又はＯ）が挙げられる。
【００８０】
ｂ）配列
例えば、単離したＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼ、並びにＧｅｎｂａｎｋに開示されている本明細書に開示する任意の他のタンパク質に関連する種々の配列が存在し、これらの配列及び他の配列は、その全体及びその中に含まれる個々の配列が、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８１】
種々の配列が本明細書に提供され、これらの及び他の配列はwww.pubmed.govで、Ｇｅｎｂａｎｋに見出すことができる。当業者は、配列の不一致及び差を解く方法、並びに特定の配列に関連する組成物及び方法を他の関連する配列に適合させる方法を理解する。プライマー及び／又はプローブは、情報が本明細書に開示され、当該技術分野において既知である任意の配列用に設計できる。
【００８２】
ｃ）プライマー及びプローブ
プライマー及びプローブを含む組成物を開示し、そのプライマー及びプローブは本明細書に開示する遺伝子と相互作用することができる。特定の実施形態では、プライマーを用いてＤＮＡ増幅反応を支援することができる。典型的には、プライマーは配列特異的な方式で伸長することができる。配列特異的な方式におけるプライマーの伸長としては、それにプライマーがハイブリダイズする若しくは他の方法で結合する核酸分子の配列及び／又は組成が、プライマーの伸長により生成される産物の組成若しくは配列を方向づける又は影響を及ぼす任意の方法が挙げられる。それ故、配列特異的な方式におけるプライマーの伸長としては、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、又は逆転写が挙げられるが、これらに限定されない。配列特異的な方式でプライマーを増幅する技術及び条件が好ましい。特定の実施形態では、プライマーは、ＰＣＲ又は直接配列決定のようなＤＮＡ増幅反応のために用いられる。特定の実施形態では、プライマーはまた、非酵素的技術を用いて伸長してもよく、この場合例えばプライマーを伸長するために用いられるヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、化学的に反応して配列特異的な方式でプライマーを伸長するよう改変されることが理解される。典型的には、開示するプライマーは、核酸若しくは核酸の領域とハイブリダイズする、又は核酸の相補体若しくは核酸の領域の相補体とハイブリダイズする。
【００８３】
ｄ）機能的核酸
機能的核酸は、標的分子に結合する、又は特定の反応を触媒する等の、特定の機能を有する核酸分子である。機能的核酸分子は、以下のカテゴリーに分けることができるが、これは限定することを意味するものではない。例えば、機能的核酸としては、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重らせん形成分子、及び外部ガイド配列が挙げられる。機能的核酸分子は、標的分子の保有する特定の活性のアフェクタ、阻害剤、修飾因子及び刺激剤として作用できる、又は機能的核酸分子は、任意の他の分子とは関係なく新規の活性を有することもできる。
【００８４】
機能的核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、又は炭水化物鎖のような任意の巨大分子と相互作用できる。したがって、機能的核酸分子は、単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼのｍＲＮＡ、若しくは単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼのゲノムＤＮＡと相互作用できる、又は単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼのポリペプチド若しくは断片と相互作用できる。機能的核酸は、標的分子と機能的核酸分子との間の配列相同性に基づいて、他の核酸と相互作用するよう設計されることが多い。他の状況では、機能的核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、機能的核酸分子と標的分子との間の配列相同性ではなく、特異的認識を起こさせる三次構造の形成に基づく。
【００８５】
アンチセンス分子は、基準（canonical）又は非基準塩基対合のいずれかを介して標的核酸分子と相互作用するよう設計される。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えばＲＮＡｓｅＨ媒介ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解を介して標的分子の破壊を促進するよう設計される。あるいは、アンチセンス分子は、転写又は複製のような、通常標的分子上で起こるプロセシング機能を中断するよう設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計できる。標的分子の最も近づきやすい領域を見出すことにより、アンチセンスの効率を最適化する多くの方法が存在する。代表的な方法は、インビトロ選択実験、並びにＤＭＳ及びＤＥＰＣを用いるＤＮＡ修飾試験である。アンチセンス分子が、１０−６、１０−８、１０−１０、又は１０−１２以下の解離定数（ｋｄ）で標的分子に結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計及び使用を補助する方法並びに技術の代表的な実例は、以下の非限定的な米国特許の一覧中に見出すことができる：米国特許第５，１３５，９１７号、同第５，２９４，５３３号、同第５，６２７，１５８号、同第５，６４１，７５４号、同第５，６９１，３１７号、同第５，７８０，６０７号、同第５，７８６，１３８号、同第５，８４９，９０３号、同第５，８５６，１０３号、同第５，９１９，７７２号、同第５，９５５，５９０号、同第５，９９０，０８８号、同第５，９９４，３２０号、同第５，９９８，６０２号、同第６，００５，０９５号、同第６，００７，９９５号、同第６，０１３，５２２号、同第６，０１７，８９８号、同第６，０１８，０４２号、同第６，０２５，１９８号、同第６，０３３，９１０号、同第６，０４０，２９６号、同第６，０４６，００４号、同第６，０４６，３１９号、及び同第６，０５７，４３７号。
【００８６】
アプタマーは、好ましくは特異的な方法で、標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、ステム−ループ又はＧ−カルテットのような画定された二次及び三次構造に折り畳まれる、１５〜５０塩基の範囲の長さの小核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）及びテオフィリン（theophiline）（米国特許第５，５８０，７３７号）のような小分子、並びに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）及びトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）のような大分子に結合できる。アプタマーは、１０−１２Ｍ未満の標的分子からのｋｄで非常に密接に結合できる。アプタマーは、１０−６、１０−８、１０−１０又は１０−１２未満のｋｄで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高度の特異性で標的分子と結合できる。例えば、標的分子と、分子の単一位置のみが異なる別の分子との間の結合親和性の差が１００００倍超であるアプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号）。アプタマーは、バックグラウンド結合分子のＫｄより少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００又は１００，０００倍低い、標的分子とのｋｄを有することが好ましい。ポリペプチドを比較するとき、例えば、バックグラウンド分子は異なるポリペプチドであることが好ましい。例えば、単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼアプタマーの特異性を決定するとき、バックグラウンドタンパク質は血清アルブミンであり得る。種々の異なる標的分子に結合するためのアプタマーを作製及び使用する方法の代表的な例は、以下の非限定的な米国特許の一覧に見出すことができる：米国特許第５，４７６，７６６号、同第５，５０３，９７８号、同第５，６３１，１４６号、同第５，７３１，４２４号、同第５，７８０，２２８号、同第５，７９２，６１３号、同第５，７９５，７２１号、同第５，８４６，７１３号、同第５，８５８，６６０号、同第５，８６１，２５４号、同第５，８６４，０２６号、同第５，８６９，６４１号、同第５，９５８，６９１号、同第６，００１，９８８号、同第６，０１１，０２０号、同第６，０１３，４４３号、同第６，０２０号、同第１３０号、同第６，０２８号、同第１８６号、同第６，０３０，７７６号、及び同第６，０５１，６９８号。
【００８７】
リボザイムは、分子内又は分子間のいずれかの化学反応を触媒することができる核酸分子である。したがって、リボザイムは、触媒核酸である。リボザイムは分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイム（例えば、以下の米国特許第５，３３４，７１１号、同第５，４３６，３３０号、同第５，６１６，４６６号、同第５，６３３，１３３号、同第５，６４６，０２０号、同第５，６５２，０９４号、同第５，７１２，３８４号、同第５，７７０，７１５号、同第５，８５６，４６３号、同第５，８６１，２８８号、同第５，８９１，６８３号、同第５，８９１，６８４号、同第５，９８５，６２１号、同第５，９８９，９０８号、同第５，９９８，１９３号、同第５，９９８，２０３号、国際公開第９８５８０５８号（Ludwig及びSproat）、同第９８５８０５７号（Ludwig及びSproat）、及び同第９７１８３１２号（Ludwig及びSproat）であるが、これらに限定されない）、ヘアピン型リボザイム（例えば、以下の米国特許第５，６３１，１１５号、同第５，６４６，０３１号、同第５，６８３，９０２号、同第５，７１２，３８４号、同第５，８５６，１８８号、同第５，８６６，７０１号、同第５，８６９，３３９号、及び同第６，０２２，９６２号であるが、これらに限定されない）及びテトラヒメナリボザイム（例えば、以下の米国特許第５，５９５，８７３号及び同第５，６５２，１０７号であるが、これらに限定されない）のような、天然系で見られるリボザイムに基づいた、ヌクレアーゼ又は核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する、多数の異なる種類のリボザイムが存在する。天然系では見られないが、新規の特定の反応を触媒するよう操作されている多数のリボザイムも存在する（例えば、以下の米国特許第５，５８０，９６７号、同第５，６８８，６７０号、同第５，８０７，７１８号、及び同第５，９１０，４０８号であるが、これらに限定されない）。好ましいリボザイムは、ＲＮＡ又はＤＮＡ基質を切断し、より好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、典型的には、その後切断される標的基質の認識及び結合を通して、核酸基質を切断する。この認識は、大部分は基準又は非基準塩基対相互作用に基づくことが多い。この特性により、リボザイムは、核酸を標的特異的に切断するための特に優れた候補となる、なぜなら標的基質の認識は標的基質の配列に基づくためである。種々の異なる反応を触媒するリボザイムの作製及び使用方法の代表的な例は、以下の非限定的な米国特許の一覧に見出すことができる：米国特許第５，６４６，０４２号、同第５，６９３，５３５号、同第５，７３１，２９５号、同第５，８１１，３００号、同第５，８３７，８５５号、同第５，８６９，２５３号、同第５，８７７，０２１号、同第５，８７７，０２２号、同第５，９７２，６９９号、同第５，９７２，７０４号、同第５，９８９，９０６号、及び同第６，０１７，７５６号。
【００８８】
三重鎖形成機能的核酸分子は、二本鎖又は一本鎖核酸のいずれかと相互作用できる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用するとき、三重鎖と呼ばれる構造が形成され、そこにはワトソン−クリック及びフーグスティーン塩基対合の両方に依存して複合体を形成するＤＮＡの３本の鎖が存在する。三重鎖分子が好ましい、なぜなら、三重鎖分子は高い親和性及び特異性で標的領域に結合できるためである。三重鎖形成分子は、１０−６、１０−８、１０−１０又は１０−１２未満のｋｄで標的分子に結合することが好ましい。種々の異なる標的分子に結合する三重鎖形成分子を作製及び使用する方法の代表的な例は、以下の非限定的な米国特許の一覧に見られる：米国特許第５，１７６，９９６号、同第５，６４５，９８５号、同第５，６５０，３１６号、同第５，６８３，８７４号、同第５，６９３，７７３号、同第５，８３４，１８５号、同第５，８６９，２４６号、同第５，８７４，５６６号、及び同第５，９６２，４２６号。
【００８９】
外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する、標的核酸分子に結合する分子であり、この複合体は、標的分子を切断するＲＮａｓｅＰにより認識される。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的とするよう設計することができる。ＲＮＡｓｅＰは、細胞内でのトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを補助する。細菌ＲＮＡｓｅＰは、天然のｔＲＮＡ基質を模倣するために標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体をもたらすＥＧＳを用いることにより、事実上全てのＲＮＡ配列を切断するよう使用することができる（国際公開第９２／０３５６６号（Yale）及びForster and Altman, Science 238:407-409 (1990)）。
【００９０】
同様に、真核生物のＥＧＳ／ＲＮＡｓｅＰ−定方向ＲＮＡ切断を利用して、真核生物細胞内の所望の標的を切断することができる（Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:8006-8010 (1992)；国際公開第９３／２２４３４号（Yale）; 国際公開第９５／２４４８９号（Yale）; Yuan and Altaian, EMBO J 14:159-16* (1995)及びCarrara et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:2627-2631 (1995)）。種々の異なる標的分子の切断を促進するＥＧＳ分子の作製及び使用方法の代表的な例は、以下の非限定的な米国特許の一覧に見られる：米国特許第５，１６８，０５３号、同第５，６２４，８２４号、同第５，６８３，８７３号、同第５，７２８，５２１号、同第５，８６９，２４８号、及び同第５，８７７，１６２号。
【００９１】
４．核酸の送達
外因性ＤＮＡの被験体の細胞への投与及び取り込み（すなわち、遺伝子トランスダクション又はトランスフェクション）を含む上記方法では、開示した核酸は裸のＤＮＡ若しくはＲＮＡの形であってよい、又は核酸は、核酸を細胞に送達するためのベクター内にあってよく、それにより、当業者によく理解されているように、抗体をコードしているＤＮＡ断片はプロモータの転写制御下にある。ベクターは、アデノウイルスベクター（Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Canada）のような、市販調製物であってよい。核酸又はベクターの細胞への送達は、種々の機構を介することができる。１例として、送達は、LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD)、SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Germany)及びTRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI)のような市販のリポソーム調製物、並びに当該技術分野において標準的な手順に従って開発された他のリポソームを用いて、リポソームを介したものであり得る。更に、開示した核酸又はベクターは、エレクトロポレーションによりインビボで送達することもでき、そのための技術はGenetronics, Inc. (San Diego, CA)から入手可能であり、それに加えてSONOPORATION machine (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ)を用いることができる。
【００９２】
１例として、ベクター送達は、組み換えレトロウイルスゲノムをパッケージ化できるレトロウイルスベクター系のような、ウイルス系を介することができる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85:4486, 1988；Miller et al., MoI. Cell. Biol. 6:2895, 1986を参照のこと）。次いで、組み換えレトロウイルスを感染に用いて、それにより、広く中和抗体（又はその活性断片）をコードしている核酸を感染した細胞に送達することができる。改変した核酸を哺乳類細胞に導入する厳密な方法は、無論、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。アデノウイルスベクター（Mitani et al., Hum. Gene Ther. 5:941- 948, 1994）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Goodman et al., Blood 84:1492-1500, 1994）、レンチウイルスベクター（Naidini et al., Science 272:263-267, 1996）、偽型レトロウイルスベクター（Agrawal et al., Exper. Hematol. 24:738-747, 1996）の使用を含む他の技術が、この手順のために広く利用可能である。リポソーム送達並びに受容体介在及び他のエンドサイトーシス機構のような、物理的伝達技術を用いてもよい（例えば、Schwartzenberger et al., Blood 87:472-478, 1996を参照のこと）。この開示する組成物及び方法を、これらの又は他の一般に用いられている遺伝子導入法のいずれかとも併せて用いることができる。
【００９３】
１例として、抗体をコードするＤＮＡがアデノウイルスベクターで被験体の細胞に送達される場合、アデノウイルスのヒトへの投与の用量は、注入１回あたり１０７〜１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲であり得るが、注入１回あたり最大１０１２ｐｆｕにすることができる（Crystal, Hum. Gene Ther. 8:985-1001, 1997；Alvarez and Curiel, Hum. Gene Ther. 8:597-613, 1997）。被験体は１回注入を受けることができる、又は追加の注入が必要な場合、無期限で及び／又は治療の効果が確立されるまで、６ヶ月の間隔で（又は熟練した施術者が決定するとき、他の適切な時間間隔で）繰り返すことができる。
【００９４】
核酸又はベクターの非経口投与は、用いられる場合、一般に、注入を特徴とする。注入物質は、液体溶液又は懸濁液、注入前に溶液を液体に懸濁するために好適な固体形、又はエマルションのいずれかのような従来の形態で調製できる。非経口投与に対する近年改訂されたアプローチは、一定の投与量が維持されるように、徐放又は持続放出系の使用を伴う。好適な処方及び種々の治療用化合物の投与経路についての更なる議論については、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995を参照のこと。
【００９５】
５．発現系
細胞に送達される核酸は、典型的には、発現制御系を含む。例えば、ウイルス及びレトロウイルス系に挿入された遺伝子は、通常、プロモータ及び／又はエンハンサを含んで、所望の遺伝子産物の発現の制御を補助する。プロモータは、一般に、転写開始点に対して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの１つまたは複数の配列である。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の塩基相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメント及び応答エレメントを含み得る。
【００９６】
ａ）ウイルスプロモータ及びエンハンサ
哺乳類宿主細胞でベクターからの転写を制御する好ましいプロモータは、種々の源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスのようなウイルスのゲノム、最も好ましくはサイトメガロウイルス等の種々の原料から、又は異種哺乳類プロモータ、例えばベータアクチンプロモータから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモータは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限断片として便利に得られる（Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)）。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモータは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として便利に得られる（Greenway, PJ. et al., Gene 18: 355-360 (1982)）。無論、宿主細胞又は関連する種のプロモータもまた本明細書で有用である。
【００９７】
エンハンサは、一般に、転写開始点から一定していない距離で機能するＤＮＡの配列を指し、転写単位に対して５’(Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci 78: 993 (1981)) 又は３’(Lusky, M.L., et al., MoI. Cell Bio. 3: 1108 (1983))のいずれかであり得る。更に、エンハンサは、イントロン内（Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983))及びコーディング配列自体内（Osborne, T.F., et al., MoI. Cell Bio. 4: 1293 (1984))にあり得る。それらは、通常１０〜３００ｂｐの長さであり、シスで機能する。エンハンサは、プロモータ付近からの転写を増加させるよう機能する。エンハンサはまた、転写の制御を媒介する応答エレメントを含むことが多い。プロモータもまた、転写の制御を媒介する応答エレメントを含み得る。エンハンサは、遺伝子の発現の制御を決定することが多い。哺乳類遺伝子由来の多くのエンハンサ配列が現在既知であるが（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）、典型的には、普遍的発現のために真核生物ウイルス由来のエンハンサを用いる。好ましい例は、複製起点の後側のＳＶ４０エンハンサ（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサ、複製起点の後側のポリオーマエンハンサ、及びアデノウイルスエンハンサである。
【００９８】
プロモータ及び／又はエンハンサは、光又はそれらの機能を誘発する特異的化学的事象のいずれかにより特異的に活性化され得る。系は、テトラサイクリン及びデキサメタゾンのような試薬により調節できる。また、ガンマ線照射のような照射又はアルキル化化学療法薬に曝露することにより、ウイルスベクターの遺伝子発現を強化する方法も存在する。
【００９９】
特定の実施形態では、プロモータ及び／又はエンハンサ領域は、転写される転写単位の領域の発現を最大化する、恒常的プロモータ及び／又はエンハンサとして作用することができる。特定のコンストラクトでは、特定の時に特定の種類の細胞でしか発現しない場合でさえ、プロモータ及び／又はエンハンサは真核生物細胞の全ての種類で活性である。この種の好ましいプロモータは、ＣＭＶプロモータ（６５０塩基）である。他の好ましいプロモータは、ＳＶ４０プロモータ、サイトメガロウイルス（完全長プロモータ）及びレトロウイルスベクターＬＴＲである。
【０１００】
全ての特定の調節エレメントをクローニングし、メラノーマ細胞のような特定の種類の細胞で選択的に発現する発現ベクターを構築するために用いてよいことが示されている。グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータは、グリア由来の細胞の遺伝子を選択的に発現させるために用いられている。
【０１０１】
真核生物宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト又は有核細胞）で用いられる発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼす可能性のある、転写の終結に必要な配列も含有してよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードしているｍＲＮＡの非翻訳領域でポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた転写終結点も含む。転写単位はまたポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写された単位がｍＲＮＡのようにプロセシング及び輸送される可能性を高めることである。発現コンストラクトにおけるポリアデニル化シグナルの特定及び使用は、十分確立されている。相同なポリアデニル化シグナルを導入遺伝子コンストラクトで用いることが好ましい。特定の転写単位では、ポリアデニル化領域はＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基から成る。転写された単位が、他の標準的な配列を単独で含む、又は上記配列と併せて含み、コンストラクトの発現形又は安定性を向上させることも好ましい。
【０１０２】
ｂ）マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードしている核酸配列を含んでもよい。このマーカー産物を用いて、遺伝子が細胞に送達されているかどうか及び送達された遺伝子が発現しているかどうかを判定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌のｌａｃＺ遺伝子及び緑色蛍光タンパク質である。
【０１０３】
いくつか実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであってよい。哺乳類細胞に好適な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ヒドロマイシン、及びプロマイシンである。このような選択可能なマーカーがうまく哺乳類宿主細胞に移動したとき、形質転換された哺乳類宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合も生存できる。選択レジメンには２つの広く用いられている別個のカテゴリーが存在する。最初のカテゴリーは、細胞の代謝及び補足培地から独立して増殖する能力を欠く突然変異細胞株の使用に基づく。２つの例は、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞及びマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジン又はハイポキサンチンのような栄養素の添加無しでは増殖する能力を欠く。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠いているため、欠失しているヌクレオチドが補足培地に提供されない限り生存できない。培地へ補足に代わるものとしては、インタクトなＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠く細胞に導入し、それによりその増殖要件を変化させることである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子が形質転換されていない個々の細胞は、非補足培地で生存することができない。
【０１０４】
２番目のカテゴリーは、任意の種類の細胞で用いられる選択スキームを指し、突然変異細胞株の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を抑止するための薬物を用いる。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、タンパク質運搬薬物耐性を発現し、選択を生き延びる。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Southern P. and Berg, P.,_J. Molec. Appl. Genet. 1 : 327 (1982)）、ミコフェノール酸（Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980))又はハイグロマイシン（Sugden, B. et al., MoI. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985))を用いる。上記の３つの例は、それぞれ、適切な薬物Ｇ４１８若しくはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）又はハイグロマイシンに対する耐性をもたらすために、真核生物の制御下にある細菌遺伝子を使用する。他には、ネオマイシン類似体Ｇ４１８及びピューロマイシン（puramycin）が挙げられる。
【０１０５】
６．ペプチド
ａ）タンパク質変異体
本明細書で論じるように、既知であり、本明細書で意図される、単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼタンパク質には多数の変異体が存在する。既知の機能的な単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼ株変異体に加えて、開示した方法及び組成物中で機能する単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼタンパク質の誘導体が存在する。タンパク質変異体及び誘導体は、当業者によく理解されており、アミノ酸配列の変更が関与する。例えば、アミノ酸配列の変更は、典型的には、置換、挿入又は欠失変異体の３つの分類のうち１つ又はそれ以上に分類される。挿入には、アミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一若しくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は、通常、例えば、およそ１〜４個の残基の、アミノ又はカルボキシル末端融合より小さな挿入である。実施例で記載するもののような免疫原性融合タンパク質誘導体は、インビトロでの架橋により、又は融合物をコードしているＤＮＡで形質転換された組み換え細胞培養物により、標的配列に免疫原性を与えるのに十分大きなポリペプチドを融合することにより作製される。欠失は、タンパク質配列から１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が除去されることを特徴とする。典型的には、約２〜６個以下の残基が、タンパク質分子内の任意の１部位で欠失する。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードしているＤＮＡにおいてヌクレオチドの部位特異的突然変異を誘発し、それにより変異体をコードしているＤＮＡを生成し、その後組み換え細胞培養物中でＤＮＡを発現させることにより調製される。既知配列を有するＤＮＡの所定の部位で置換突然変異を作製するための技術は周知であり、例えばＭＩ３プライマー突然変異誘発及びＰＣＲ突然変異誘発等である。アミノ酸置換は、典型的には、１つの残基について行われるが、一挙に多くの様々な箇所で起こる場合もある。挿入は通常約１〜１０アミノ酸残基であり、欠失は約１〜３０残基の範囲である。欠失又は挿入は、好ましくは、隣接する対で起こる、すなわち２残基が欠失する又は２残基が挿入される。置換、欠失、挿入又はこれらの任意の組み合わせを組み合わせて、最終コンストラクトに到達する。突然変異は、その配列がリーディングフレームの外に位置してはならず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造を生成できる相補的領域を作製しない。置換変異体は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されたものである。このような置換は、一般に、以下の表２及び表３に従って行われ、保存的置換と称される。
【０１０６】
機能又は免疫学的同一性における大きな変化は、表３のものより保存的ではない置換を選択する、すなわち、（ａ）例えば、シート若しくはらせん形状のような置換の領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の変化若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルクを維持する効果において著しく異なる残基を選択することにより作製される。一般にタンパク質特性に最も大きな変化をもたらすと予測される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリル又はスレオニルを、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル又はアラニルに又は置換する（又は疎水性残基を親水性残基に置換する）、（ｂ）システイン又はプロリンを、任意の他の残基に置換する（又は任意の他の残基をシステイン若しくはプロリンに置換する）、（ｃ）陽電性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、又はヒスチジルを、陰電性残基、例えばグルタミル又はアスパルチルに置換する（又は陰電性残基を陽電性側鎖に置換する）、又は（ｄ）バルク側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンを、側鎖を有しないもの、例えばこの場合グリシンに（又はより）置換する（又は側鎖を有しないものをバルク側鎖を有する残基に置換する）、（ｅ）硫酸化及び／又はグリコシル化の部位の数を増加させることによるものである。
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
例えば、１つのアミノ酸残基を、生物学的に及び／又は化学的に類似の別のアミノ酸残基と置換することは、保存的置換として当該技術分野において既知である。例えば、保存的置換は、ある疎水性残基を別の疎水性残基に、又はある極性残基を別の極性残基に置換することであろう。置換としては、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、ＧＩｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒのような組み合わせが挙げられる。それぞれ明示的に開示されている配列のこのような保存的に置換された変異体は、本明細書に提供されるモザイクポリペプチド内に含まれる。
【０１０９】
置換又は欠失突然変異誘発を使用して、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）又はＯ−グリコシル化（Ｓｅｒ又はＴｈｒ）のための部位を挿入することができる。システイン又は他の不安定な残基の欠失が望ましい場合もある。有望なタンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失又は置換は、例えば、塩基性残基の欠失、又はグルタミニル若しくはヒスチジル残基による置換により達成される。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
特定の翻訳後誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、対応するグルタミル及びアスパリル残基に翻訳後脱アミド化されることが多い。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、及び場合によってはＣ−末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
【０１１２】
本明細書に開示されるタンパク質の変異体及び誘導体を定義する１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性／同一性の観点で、変異体及び誘導体を定義することによるものであることが理解される。例えば、配列番号１５はＤ５エロンガーゼの具体的な配列を記載し、配列番号２６は、Ｄ４デサチュラーゼタンパク質の具体的な配列を記載する。特に、規定の配列に対して少なくとも７０％又は７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％の相同性を有する、本明細書に開示するこれらの及び他のタンパク質の変異体が開示される。当業者は、２つのタンパク質の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最大となるように２つの配列を整列した後に算出できる。配列番号１５及び２６に対して９６％及び８９％を超える同一性を有する配列を具体的に開示する。
【０１１３】
相同性を算出する別の方法は、公開されているアルゴリズムにより実施することができる。比較のための最適な配列の整列は、Smith及び Waterman （Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)）の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman 及びWunsch（J. MoL Biol. 48: 443 (1970)）の相同性配列アルゴリズムにより、Pearson及びLipman（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)）の類似性を探す方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は目視により実施できる。
【０１１４】
同種の相同性は、例えば、Zuker, M. Science 244:48-52, 1989、Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:7706-7710, 1989、Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989に開示されているアルゴリズムにより、核酸について得ることができ、これらは少なくとも核酸の整列に関する内容を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
変異体が保存的突然変異である特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する実施形態のように、保存的突然変異及び相同性の説明は、任意の組み合わせでともに組み合わせ得ることが理解される。
【０１１６】
本明細書で種々のタンパク質及びタンパク質配列について論じるとき、これらのタンパク質配列をコードできる核酸も開示されることが理解される。これは、特定のタンパク質配列に関する全ての縮重配列、すなわち、ある特定のタンパク質配列をコードしている配列を有する全ての核酸、並びに開示するタンパク質配列の変異体及び誘導体をコードしている、縮重核酸を含む全ての核酸を含む。したがって、それぞれの具体的な核酸配列が本明細書に全て書かれていない場合もあるが、それぞれ及び全ての配列は、開示されたタンパク質配列を通して本明細書に事実上開示され、説明されていることが理解される。例えば、配列番号１５に記載されているタンパク質配列をコードできる多くの核酸配列の１つが配列番号１４に記載されている。また、どの具体的なＤＮＡ配列が生物内のどのタンパク質をコードしているかを示すアミノ酸配列は存在しないが、開示するタンパク質の具体的な変異体が本明細書に開示されている場合、それからタンパク質が生じる特定の株においてそのタンパク質をコードしている既知の核酸配列もまた既知であり、本明細書に開示され、説明されることも理解される。
【０１１７】
開示された組成物に組み込むことができる多くのアミノ酸及びペプチド類似体が存在することが理解される。例えば、表２及び表３に示されるアミノ酸とは異なる、多くのＤアミノ酸又は異なる機能的置換を有するアミノ酸が存在する。自然発生ペプチドの逆の立体異性体、並びにペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に選択したアミノ酸をチャージし、例えば終止コドンを利用して類似アミノ酸を部位特異的方法でペプチド鎖に挿入する遺伝的コンストラクトを操作することにより、ポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる（Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991)、Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992)；Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995)、Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989)；Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994)；Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994)、これらは全て、少なくともアミノ酸類似体に関する内容を参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１１８】
ペプチドに類似するが、天然ペプチド結合を介して連結しない分子を生成することができる。例えば、アミノ酸又はアミノ酸類似体に対する結合には、ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−及び−ＣＨＨ２ＳＯ−を挙げることができる（これら及び他のものは、Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)； Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications （一般評論）；Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468； Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979)（−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２−）； Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (−ＣＨ Ｈ２−Ｓ)；Ham J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (−ＣＨ−ＣＨ−、シス及びトランス)；Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (−ＣＯＣＨ２−)；Jennings- White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (−ＣＯＣＨ２−)；Szelke et al. European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982)(−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−)；Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−)；及びHruby Life Sci 31 :189-199 (1982) (−ＣＨ２−Ｓ−)に見られ、これらはそれぞれ参照することにより本明細書に組み込まれる）。特に好ましい非ペプチド結合は、−ＣＨ２ＮＨ−である。ペプチド類似体は、ｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸等のような、結合原子間に１つより多いの原子を有することができると理解される。
【０１１９】
アミノ酸類似体及びペプチド類似体は、より経済的に産生できる、化学的安定性が高い、薬理学的特性（半減期、吸収性、力価、効果等）が強化されている、特異性が改変されている（例えば、生物学的活性が広域性である）、抗原性が低い、及び他の特性のような、強化された又は望ましい特性を有することが多い。
【０１２０】
Ｄ−アミノ酸を用いて、より安定なペプチドを生成することができる、なぜならＤ−アミノ酸はペプチダーゼ等に認識されないためである。同種のＤ−アミノ酸との共通配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸の系統的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を用いて、より安定なペプチドを生成することができる。システイン残基を用いて、２つ又はそれ以上のペプチドをともに環化する又は結合することができる。これは、ペプチドを特定の高次構造にさせるために有用である場合がある（Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992), incorporated herein by reference）。
【０１２１】
７．抗体
（１）抗体全般
用語「抗体」は、本明細書では広い意味で用いられ、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含む。インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、用語「抗体」には、それらが同定、結合、精製され得る、又は変化した活性を有するように、単離されたＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼと相互作用する能力について選択される限り、これらの免疫グロブリン分子の断片又はポリマー、及び免疫グロブリン分子若しくはその断片のヒト又はヒト化バージョンを含む。Ｄ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼの開示された領域に結合する抗体も開示される。抗体は、本明細書に記載するインビトロアッセイを用いて、又は類似の方法により所望の活性について試験することができ、その後インビボ治療及び／又は予防活性を、既知の臨床試験法に従って試験する。
【０１２２】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用するとき、実質的に同質な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち集団内の個々の抗体は、抗体分子の小さなサブセットに存在する可能性のある、あり得る自然発生突然変異を除いて同一である。本明細書ではモノクローナル抗体は、具体的には、所望の拮抗活性を呈する限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一である又は同質であるが、鎖の残りは別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一である又は同質である「キメラ」抗体、及びこのような抗体の断片を含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81:6851-6855 (1984)）。
【０１２３】
開示するモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する任意の手順を用いて作製することができる。例えば、開示するモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)に記載のもののような、ハイブリドーマ法を用いて調製できる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物は、典型的には、免疫剤で免役されて、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生する又は産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、例えば本明細書に記載のＨＩＶ Ｅｎｖ−ＣＤ４補助受容体複合体を用いて、インビトロで免役することができる。
【０１２４】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（Cabillyら）に記載されているもののような、組み換えＤＮＡ法により作製することもできる。開示したモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、容易に単離及び配列決定できる。例えば、米国特許第５，８０４，４４０号（Burtonら）及び米国特許第６，０９６，４４１号（Barbas）らに記載されているような、ファージディスプレイ技術を用いて、抗体又は活性抗体断片のライブラリを作製し、スクリーニングすることもできる。
【０１２５】
インビトロ方法もまた一価抗体を調製するのに好適である。抗体の断片、特にＦａｂ断片を生成するための抗体の消化は、当該技術分野において既知である日常的な技術を用いて達成できる。例えば、消化はパパインを用いて実施できる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日公開の国際公開第９４／２９３４８号及び米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、Ｆａｂ断片と呼ばれる、２つの同一の抗原結合断片を生成し、これはそれぞれ１つの抗原結合部位と残りのＦｃ断片を有する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有する断片が得られ、それでもなお抗原を架橋することができる。
【０１２６】
他の配列に結合しようとしまいと、抗体又は抗体断片の活性が、改変されていない抗体又は抗体断片に比べて著しく変化しない又は損なわれないという条件の下で、断片はまた特定の領域又は特定のアミノ酸残基の、挿入、欠失、置換又は他の選択された改変を含むことができる。これらの改変は、ジスルフィド結合できるアミノ酸を除去／付加する、生物寿命を延ばす、分泌特性を変化させる等の、いくつかの追加特性をもたらすことができる。どの場合も、抗体又は抗体断片は、同種抗原への特異的結合のような、生物活性特性を有しなければならない。抗体又は抗体断片の機能的又は活性領域は、タンパク質の特定の領域の突然変異誘発と、それに続く発現及び発現したポリペプチドの試験により同定できる。このような方法は、当業者に容易に明らかであり、抗体又は抗体断片をコードしている核酸の部位特異的突然変異誘発を挙げることができる（Zoller, MJ. Curr. Opin. Biotechnol. 3:348-354, 1992）。
【０１２７】
本明細書で使用するとき、用語「抗体」はまた、ヒト抗体及び／又はヒト化抗体を指すことができる。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、又はウサギに由来するもの）は、自然界でヒトにおいて抗原性を示し、したがって、ヒトに投与されたとき、望ましくない免疫反応を誘発する場合がある。それ故、この方法におけるヒト又はヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫反応を引き起こす可能性を低減するように機能する。
【０１２８】
（２）ヒト抗体
開示するヒト抗体は、任意の技術を用いて調製できる。ヒトモノクローナル抗体を産生する技術の例としては、Cole et al. （Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985)及びBoerner et al. (J Immunol, 147(l):86-95, 1991)に記載のものが挙げられる。ヒト抗体（及びその断片）はまた、ファージディスプレイライブラリを用いて産生することもできる（Hoogenboom et al., J MoI. Biol, 227:381, 1991； Marks et al., J MoI Biol, 222:581, 1991）。
【０１２９】
開示するヒト抗体はまた、遺伝子組み換え動物から得ることもできる。例えば、免疫に反応して、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生できる、遺伝子組み換え、突然変異体マウスが記載されている（例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggermann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993)を参照のこと）。具体的には、これらのキメラ及び生殖細胞突然変異マウスの抗体の重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生を完全に阻害し、ヒト生殖細胞抗体遺伝子アレイをこのような生殖細胞突然変異マウスにうまく転移させると、抗原チャレンジ時にヒト抗体が産生される。所望の活性を有する抗体は、本明細書に記載のようなＥｎｖ−ＣＤ４補助受容体複合体を用いて選択される。
【０１３０】
（３）ヒト化抗体
抗体のヒト化技術は、一般に、組み換えＤＮＡ技術を使用して、抗体分子の１本又はそれ以上のポリペプチド鎖をコードしているＤＮＡ配列を操作することを伴う。したがって、非ヒト抗体（又はその断片）のヒト化型は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれる非ヒト（ドナー）抗体由来の抗原結合部位の一部を含むキメラ抗体、又は抗体鎖（又は、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’若しくは抗原結合部のような、その断片）である。
【０１３１】
ヒト化抗体を生成するために、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対する特定の水準の特異性及び親和性）を有することが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１つ又はそれ以上のＣＤＲの残基を、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基に置換する。場合によっては、対応する非ヒト残基をヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基に置換する。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体でも、移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列でも見られない残基を含有する場合もある。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである源から導入された１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。実際に、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び恐らくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類の抗体の類似部位の残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は、一般に、抗体の定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト抗体の定常領域の少なくとも一部を含む（Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986), Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988), and Presta, Curr. Opin. Struct. Biol, 2:593-596 (1992)）。
【０１３２】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、ヒト化抗体は、げっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによる、Winterとその共同研究者らの方法に従って生成できる（Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）。ヒト化抗体を生成するために用いることができる方法はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（Cabillyら）、同第５，５６５，３３２号（Hoogenboomら）、同第５，７２１，３６７号（Kayら）、同第５，８３７，２４３号（Deoら）、同第５，９３９，５９８号（Kucherlapatiら）、同第６，１３０，３６４号（Jakobovitsら）、及び同第６，１８０，３７７号（Morganら）に記載されている。
【０１３３】
（４）抗体の投与
抗体の投与は、本明細書に記載のように行うことができる。抗体を送達するための核酸アプローチも存在する。抗体及び抗体断片はまた、患者又は被験体自身の細胞が核酸を取り込み、コードされている抗体又は抗体断片を産生及び分泌するように、抗体又は抗体断片をコードする核酸製剤（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）として、患者又は被験体又は細胞に投与することができる。核酸の送達は、例えば本明細書に開示するような任意の手段によることができる。
【０１３４】
８．医薬用担体／医薬品の送達
上記のように、組成物はまた製薬上許容できる担体中でインビボ投与することができる。「製薬上許容できる」とは、生物学的に又は他の点で不所望ではない材料を意味し、すなわち、その材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又は含有されている医薬組成物の他の成分のいずれとも有害な方式で相互作用することなく、核酸又はベクターとともに被験体に投与できる。担体は、当然、当業者に周知であるように、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、かつ被験体のいかなる有害な副作用も最小限に抑えるように選択される。
【０１３５】
組成物は、経口で、非経口で（例えば、静脈内に）、筋肉注射により、腹腔内注射により、経皮的に、体外で、局所鼻腔内投与又は吸入による投与を含む局所的に等で投与してよい。本明細書で使用するとき、「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の一方又は両方を通じて鼻及び鼻道に組成物を送達することを意味し、噴霧機構若しくは液滴機構により、又は核酸若しくはベクターのエーロゾル化を通して送達することを含み得る。吸入による組成物の投与は、噴霧又は液滴機構による送達を介して鼻又は口を通じたものであり得る。また、挿管を介して呼吸器系（例えば、肺）の任意の領域に直接送達することができる。必要とされる組成物の正確な量は、被験体の種、年齢、体重及び全身状態、治療されるアレルギー性疾患の重篤度、用いられる具体的な核酸又はベクター、投与方式等に依存して、被験体により異なる。したがって、全ての組成物の正確な量を規定することは不可能である。しかしながら、適切な量は、本明細書の教示によって、日常的な実験のみを用いて当業者が決定できる。
【０１３６】
組成物の非経口投与は、用いられる場合、一般に、注入を特徴とする。注入物質は、液体溶液又は懸濁液、注入前に液体の懸濁液へ溶解するのに好適な固体形、又はエマルションのような従来の形態で調製できる。非経口投与に対する近年修正されたアプローチは、一定の投与量が維持されるように、徐放又は持続放出系の使用を含む。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
材料は、溶液、懸濁液（例えば、微粒子、リポソーム又は細胞に組み込まれた）であってよい。これらは、抗体、受容体又は受容体リガンドを介して特定の種類の細胞を標的とすることができる。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するために、この技術を使用する例である（Senter, et al., Bioconjugate Chem. , 2:447-451, (1991)；Bagshawe, K.D., 5r. J Cancer, 60:275-281, (1989)；Bagshawe, et al., Br. J Cancer, 58:700-703, (1988)；Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993)；Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992)；Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992)；及びRoffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)）。「ステルス（stealth）」のようなビヒクル及びリポソームにコンジュゲートされた抗体（結腸癌を標的とする脂質媒介薬を含む）、細胞特異的リガンドを介した、受容体が介在するＤＮＡの標的化、リンパ球指向型腫瘍標的化、及びインビボでのマウス神経膠腫細胞の高特異的治療用レトロウイルス標的化。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するために、この技術を使用する例である（Hughes et al., Cancer Research, 49:6214- 6220, (1989)；及びLitzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992))。一般に、受容体は、恒常的又はリガンドに誘発される、エンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体は、クラスリン被覆ピットにおいてクラスタを形成し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受容体が選別される酸性化エンドソームを通過し、次いで細胞表面に再循環する、細胞内に保管される、又はリソソームで分解される。内部移行経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子の排除、ウイルス及び毒素の日和見性侵入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体濃度の調節のような、種々の機能を果たす。多くの受容体は、細胞の種類、受容体の濃度、リガンドの種類、リガンドの価数、及びリガンドの濃度に依存して、１つを超える細胞内経路をたどる。受容体介在エンドサイトーシスの分子及び細胞機構は概説されている（Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)）。
【０１３８】
ａ）製薬上許容できる担体
抗体を含む組成物は、製薬上許容できる担体と組み合わせて治療用に用いることができる。
【０１３９】
好適な担体及びその製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995に記載されている。典型的には、適切な量の製薬上許容できる塩を配合に用いて、配合を等張にする。製薬上許容できる担体の例としては、生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液が挙げることが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８であり、より好ましくは約７〜約７．５である。更に担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような持続放出製剤を含み、このマトリックスは例えばフィルム、リポソーム又は微粒子等の成形品の形態である。特定の担体は、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じてより好ましい場合があることが、当業者には明らかである。
【０１４０】
医薬用担体は、当業者に既知である。これらは最も典型的には、滅菌水、生理食塩水、及び生理学的ｐＨで緩衝化された溶液のような溶液が挙げられる、ヒトに薬物を投与するための標準的な担体である。組成物は、筋肉内に又は皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者により用いられる標準的な手順に従って投与される。
【０１４１】
医薬組成物は、選択した分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、表面活性剤等を含んでもよい。医薬組成物はまた、抗微生物剤、抗炎症性剤、麻酔剤等のような１種又はそれ以上の活性成分を含んでもよい。
【０１４２】
医薬組成物は、局所又は全身治療のいずれが望ましいか、及び治療される領域に応じて、多数の方法で投与することができる。投与は、局所的に（眼科的に、膣内に、直腸内に、鼻腔内にを含む）、経口で、吸入により、又は非経口で、例えば点滴、皮下、腹腔内、若しくは筋肉内注射であり得る。開示した抗体は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、腔内に、又は経皮的に投与することができる。
【０１４３】
非経口投与のための製剤としては、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられ、生理食塩水及び緩衝化培地を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養素補充液、電解質補液（リンガーデキストロースに基づくもののような）等が挙げられる。保存剤、及び、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等のような他の添加剤もまた存在し得る。
【０１４４】
局所投与用製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液剤及び散剤を挙げることができる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤等が必須である又は望ましい場合がある。
【０１４５】
経口投与のための組成物としては、散剤又は顆粒、水又は非水性媒質への懸濁液又は溶液、カプセル、小袋又は錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、又は結合剤が望ましい場合がある。
【０１４６】
いくつかの組成物は、潜在的に、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸のような無機酸、並びに、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸のような有機酸との反応により、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、並びにモノ−、ジ−、トリアルキル及びアリールアミノ並びに置換エタノールアミンのような有機塩基との反応により形成される、製薬上許容できる酸又は塩基付加塩として投与してもよい。
【０１４７】
ｂ）治療的使用
組成物を投与するための有効用量及びスケジュールは、経験的に決定することができ、このような決定をすることは当業者の技能の範囲内である。組成物の投与の用量範囲は、症状障害が効能を受ける所望の効果を生み出すのに十分な程大きい。用量は、不要な交差反応、アナフィラキシー反応等のような有害な副作用を引き起こす程多くてはならない。一般に、用量は、患者の年齢、状態、性別及び疾患の程度、投与経路、又は他の薬物がレジメンに含まれているかどうかにより変化し、当業者が決定することができる。用量は、何らかの使用禁忌がある場合、個々の医師により調節できる。用量は、変化し得、１日又は数日間、毎日１回又はそれ以上の投与回数で投与することができる。医薬品の所与の部類に対する適切な用量に関して、文献中に指針を見出すことができる。例えば、抗体に適切な用量を選択するための指針は、抗体の治療的使用に関する文献、例えばHandbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, NJ. , (1985) ch. 22 and pp. 303-357；Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389に見出すことができる。単独で用いられる抗体の典型的な１日用量は、上述の要因に応じて、体重１ｋｇあたり、１日に約１μｇから最大約１００ｍｇ、又はそれ以上であり得る。
【０１４８】
特定の医薬機能は有しないが、例えば、細胞の染色体内の変化を追跡するため又は診断用ツールの送達のために用いることができる、単離したＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼと相互作用する他の分子は、医薬品について記載したものと同様の方法で送達できる。
【０１４９】
９．チップ及びマイクロアレイ
少なくとも１つのアドレス（address）が、本明細書に開示した核酸配列のいずれかに記載の配列又は配列の一部であるチップを開示する。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書に開示したペプチド配列のいずれかに記載の配列又は配列の一部であるチップも開示する。
【０１５０】
また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書に開示した核酸配列のいずれかに記載の配列又は配列の一部の変異体であるチップを開示する。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書に開示したペプチド配列のいずれかに記載の配列又は配列の一部の変異体であるチップも開示する。
【０１５１】
１０．コンピュータ可読媒体
開示した核酸及びタンパク質は、アミノ酸のヌクレオチドから成る配列として表すことができると理解される。これらの配列を示す種々の方法が存在し、例えば、ヌクレオチドのグアノシンはＧ又はｇにより表すことができる。同様にアミノ酸のバリンは、Ｖａｌ又はＶにより表すことができる。当業者は、存在する種々の方法のいずれかで、任意の核酸又はタンパク質配列を示し、表現する方法を理解し、その方法はそれぞれ本明細書に開示されると考えられる。特に本明細書で意図されるのは、市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク、及びビデオディスクのようなコンピュータ可読媒体、又は他のコンピュータ可読媒体にこれらの配列を表示することである。また、開示する配列の二進コード表示も開示する。当業者は、コンピュータ可読媒体が何であるかを理解する。したがって、核酸又はタンパク質はコンピュータ可読媒体に記録、格納又は保存される。
【０１５２】
配列及び本明細書に記載の配列に関する情報を含むコンピュータ可読媒体を開示する。
【０１５３】
開示した組成物をスクリーニングすることにより同定される組成物／コンビナトリアルケミストリー
ａ）コンビナトリアルケミストリー
開示した組成物を、任意のコンビナトリアル技術の標的として用いて、所望の方法で開示した組成物と相互作用する分子又は巨大分子を同定することができる。本明細書に開示する核酸、ペプチド、及び関連する分子を、コンビナトリアルアプローチの標的として用いることができる。また、例えば配列番号１４、１５、２５若しくは２６又はその一部に開示する組成物をコンビナトリアル又はスクリーニングプロトコルで標的として用いる、コンビナトリアル技術又はスクリーニング技術を通して同定される組成物も開示する。
【０１５４】
コンビナトリアル技術又はスクリーニング方法で開示した組成物を用いるとき、阻害、若しくは刺激のような特定の所望の特性、又は標的分子の機能を有する巨大分子のような分子が同定されると理解される。脂肪酸のような、開示する組成物を用いたときに同定及び単離される分子も開示される。したがって、脂肪酸のような、開示する組成物に関与するコンビナトリアル又はスクリーニングアプローチを用いて生成される生成物も、本明細書に開示されると考えられる。
【０１５５】
例えば、単離したＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼ間の相互作用を阻害する分子を同定するための、開示する方法は、ハイスループット手段を用いて実施できる。例えば、推定上の阻害剤は、相互作用を迅速に同定する、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いて同定できる。この技術の根底にある理論は、２つの分子が空間内で近接しているとき、すなわちバックグラウンドを上回る水準で相互作用しているとき、シグナルが生成される又はシグナルが消滅し得ることである。次いで、例えば推定上の阻害剤に添加することを含む、種々の実験を実施することができる。阻害剤が２つのシグナル伝達分子間の相互作用と競合する場合、シグナルは空間内で互いから除去され、これは用いられるシグナルの種類に応じて、シグナルを減少又は増加させる。このシグナルの減少又は増加は、推定上の阻害剤の存在又は非存在と相関させることができる。任意のシグナル伝達手段を用いることができる。例えば、第１分子と第２分子を推定上の阻害剤下で互いに接触させる工程であって、第１分子又は第２分子が蛍光ドナーを含み、第１分子又は第２分子であって、典型的にはドナーを含まない分子が、蛍光アクセプタを含む工程と；推定上の阻害剤の存在下又は推定上の阻害剤の非存在下で、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を測定する工程であって、推定上の阻害剤の非存在下におけるＦＲＥＴ測定値と比べて、推定上の阻害剤の存在下におけるＦＲＥＴが低いことが、推定上の阻害剤が２つの分子間の結合を阻害したことを示す工程と、を含む、任意の２つの開示した分子間の相互作用の阻害剤を同定する方法を開示する。この種の方法は、同様に細胞系で実施することができる。
【０１５６】
コンビナトリアルケミストリーとしては、典型的には繰り返し作業で、小分子又は別の巨大分子のいずれかに結合できる小分子又は別の巨大分子を単離する全ての方法が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質、オリゴヌクレオチド、及び糖類が巨大分子の例である。例えば、所与の機能を有する、触媒する又はリガンド結合するオリゴヌクレオチド分子は、「インビトロジェネティクス（in vitro genetics）」と呼ばれているものにより、ランダムなオリゴヌクレオチドの複合体混合物から単離することができる（Szostak, TIBS 19:89, 1992）。ランダム及び定義された配列を有する分子の大きなプールを合成し、例えば、１００μｇの１００ヌクレオチドＲＮＡ中の約１０１５の個々の配列のなどの複合体混合物を、ある選択及び濃縮過程に供する。親和性クロマトグラフィー及びカラム上のリガンドに結合した分子のＰＣＲ増幅のサイクルを繰り返すことを通して、Ellington and Szostak (1990)は、１０１０ＲＮＡ分子のうち１分子が小分子染料と結合するような方法で折り畳まれると推定した。このようなリガンド結合挙動を示すＤＮＡ分子も同様に単離されている（Ellington and Szostak, 1992; Bock et al, 1992）。当業者に既知である小有機分子、タンパク質、抗体及び他の巨大分子について、同様の目標を目指す技術が存在する。小有機ライブラリ、オリゴヌクレオチド、又は抗体のいずれかに基づいて、所望の活性についての分子一式をスクリーニングすることは、広くコンビナトリアルケミストリーと呼ばれる。コンビナトリアル技術は、分子間結合相互作用を定義するために、及び巨大分子が核酸であるとき、アプタマーと呼ばれることが多い、特異的結合活性を有する分子を単離するために、特に適している。
【０１５７】
新規活性又は改変された活性のいずれかを有するタンパク質を単離するための、多くの方法が存在する。例えば、ファージディスプレイライブラリを用いて、特定の標的と相互作用する多数のペプチドが単離されている（例えば、米国特許第６，０３１，０７１号；同第５，８２４，５２０号；同第５，５９６，０７９号；及び同第５，５６５，３３２号を参照のこと、これらは少なくともファージディスプレイに関する内容及びコンビナトリアルケミストリーに関する方法について、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１５８】
所与の機能を有するタンパク質を単離する好ましい方法は、Roberts and Szostakにより記載されている(Roberts R. W. and Szostak J.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23)12997-302 (1997))。このコンビナトリアルケミストリー法は、タンパク質の機能的能力と核酸の遺伝的能力を合わせる。ピューロマイシン分子がＲＮＡ分子の３’−末端に共有結合したＲＮＡ分子が生成される。この修飾されたＲＮＡ分子のインビトロ翻訳は、翻訳されるＲＮＡによりコードされている正確なタンパク質をもたらす。加えて、伸長できないペプチジルアクセプタであるピューロマイシンが結合しているために、成長しているペプチド鎖が、ＲＮＡに結合しているピューロマイシンに結合する。したがって、タンパク質分子は、それをコードしている遺伝物質に結合する。ここでは、標準的なインビトロ選択手順を、機能的ペプチドを単離するために用いることができる。一旦ペプチド機能についての選択手順が完了すると、伝統的な核酸操作を実施して、選択された機能的ペプチドをコードする核酸を増幅する。遺伝物質の増幅後、新しいＲＮＡが３’−末端にピューロマイシンを有して転写され、新しいペプチドが翻訳され、別の機能に関する選択がもう一巡実施される。したがって、タンパク質の選択は、核酸選択技術と同様に、繰り返し方式で実施できる。翻訳されるペプチドは、ピューロマイシンに結合したＲＮＡの配列により制御される。この配列は、最適な翻訳（すなわち、終止コドンを有しない等）のために操作されたランダム配列のいずれからでも得ることができ、又は既知のペプチドの改善された又は変更された機能を探すための既知のＲＮＡ分子の縮重配列であってもよい。核酸増幅及びインビトロ翻訳条件は当業者に周知であり、好ましくはRoberts and Szostak (Roberts R. W. and Szostak J.W. Proc. Natl. Acad. ScI USA, 94(23)12997-302 (1997)のように実施される。
【０１５９】
ペプチドを単離するために設計されるコンビナトリアル方法のための、別の好ましい方法は、Cohenらに記載されている(Cohen B.A.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(24):14272-7 (1998))。この方法は、ツーハイブリッド技術を利用し、改変する。酵母ツーハイブリッド系は、タンパク質：タンパク質相互作用の検出及び分析に有用である。最初に出芽酵母において記載された、ツーハイブリッド系は、関心タンパク質に特異的な、新規調節分子を同定するための強力な分子遺伝学的技術である（Fields and Song, Nature 340:245-6 (1989)）。Cohenらは、選択した分子に結合する、合成又は操作されたペプチド配列間の新規相互作用を同定できるよう、この技術を改変した。この種の技術の利点は、選択が細胞内環境で行われることである。この方法は、酸性活性化ドメインに結合したペプチド分子のライブラリを利用する。選択したペプチド、例えば、単離したＤ４デサチュラーゼ及びＤ５エロンガーゼの一部は、Ｇａｌ４のような転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合する。この種の系でツーハイブリッド技術を実施することにより、単離したＤ４デサチュラーゼ又はＤ５エロンガーゼの一部に結合する分子を同定することができる。
【０１６０】
当業者に周知の手順を用い、種々のコンビナトリアルライブラリと組み合わせることにより、所望の標的に結合又は相互作用する小分子又は巨大分子を単離及び特性解析することができる。これらの化合物の相対結合親和性は比較することができ、当業者に周知の競合的結合試験を用いて最適な化合物が同定される。
【０１６１】
所望の標的に結合する分子を単離するための、コンビナトリアルライブラリ及びスクリーニングコンビナトリアルライブラリを作製する技術は、当業者に周知である。代表的な技術及び方法は、米国特許第５，０８４，８２４号、同第５，２８８，５１４号、同第５，４４９，７５４号、同第５，５０６，３３７号、同第５，５３９，０８３号、同第５，５４５，５６８号、同第５，５５６，７６２号、同第５，５６５，３２４号、同第５，５６５，３３２号、同第５，５７３，９０５号、同第５，６１８，８２５号、同第５，６１９，６８０号、同第５，６２７，２１０号、同第５，６４６，２８５号、同第５，６６３，０４６号、同第５，６７０，３２６号、同第５，６７７，１９５号、同第５，６８３，８９９号、同第５，６８８，６９６号、同第５，６８８，９９７号、同第５，６９８，６８５号、同第５，７１２，１４６号、同第５，７２１，０９９号、同第５，７２３，５９８号、同第５，７４１，７１３号、同第５，７９２，４３１号、同第５，８０７，６８３号、同第５，８０７，７５４号、同第５，８２１，１３０号、同第５，８３１，０１４号、同第５，８３４，１９５号、同第５，８３４，３１８号、同第５，８３４，５８８号、同第５，８４０，５００号、同第５，８４７，１５０号、同第５，８５６，１０７号、同第５，８５６，４９６号、同第５，８５９，１９０号、同第５，８６４，０１０号、同第５，８７４，４４３号、同第５，８７７，２１４号、同第５，８８０，９７２号、同第５，８８６，１２６号、同第５，８８６，１２７号、同第５，８９１，７３７号、同第５，９１６，８９９号、同第５，９１９，９５５号、同第５，９２５，５２７号、同第５，９３９，２６８号、同第５，９４２，３８７号、同第５，９４５，０７０号、同第５，９４８，６９６号、同第５，９５８，７０２号、同第５，９５８，７９２号、同第５，９６２，３３７号、同第５，９６５，７１９号、同第５，９７２，７１９号、同第５，９７６，８９４号、同第５，９８０，７０４号、同第５，９８５，３５６号、同第５，９９９，０８６号、同第６，００１，５７９号、同第６，００４，６１７号、同第６，００８，３２１号、同第６，０１７，７６８号、同第６，０２５，３７１号、同第６，０３０，９１７号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０４５，６７１号、同第６，０４５，７５５号、同第６，０６０，５９６号、及び同第６，０６１，６３６号に見出すことができるが、これらに限定されない。
【０１６２】
コンビナトリアルライブラリは、多数の異なる合成技術を用いて、広く多くの分子から作製することができる。例えば、縮合２，４−ピリミジンジオン(米国特許第６，０２５，３７１号）、ジヒドロベンゾピラン（米国特許第６，０１７，７６８号及び同第５，８２１，１３０号）、アミドアルコール（米国特許第５，９７６，８９４号）、ヒドロキシ−アミノ酸アミド（米国特許第５，９７２，７１９号）炭水化物（米国特許第５，９６５，７１９号）、１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン（米国特許第５，９６２，３３７号）、環式（米国特許第５，９５８，７９２号）、ビアリールアミノ酸アミド（米国特許第５，９４８，６９６号）、チオフェン（米国特許第５，９４２，３８７号）、三環式テトラヒドロキノリン（米国特許第５，９２５，５２７号）、ベンゾフラン（米国特許第５，９１９，９５５号）、イソキノリン（米国特許第５，９１６，８９９号）、ヒダントイン及びチオヒダントイン（米国特許第５，８５９，１９０号）、インドール（米国特許第５，８５６，４９６号）、イミダゾール−ピリド−インドール及びイミダゾール−ピリド−ベンゾチオフェン（米国特許第５，８５６，１０７号）置換２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゾール（米国特許第５，８４７，１５０号）、キノリン（米国特許第５，８４０，５００号）、ＰＮＡ（米国特許第５，８３１，０１４号）、含有タグ（米国特許第５，７２１，０９９号）、ポリケチド（米国特許第５，７１２，１４６号）、モルホリノ−サブユニット（米国特許第５，６９８，６８５号及び同第５，５０６，３３７号）、スルファミド（米国特許第５，６１８，８２５号）、及びベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）を含むライブラリである。
【０１６３】
本明細書で使用するとき、コンビナトリアル法及びライブラリは、伝統的なスクリーニング方法及びライブラリ、並びに繰り返し作業で用いられる方法及びライブラリが含まれた。
【０１６４】
ｂ）コンピュータを利用した薬品設計
開示する組成物は、任意の分子モデリング技術の標的として用いて、開示する組成物の構造を特定する、又は可能性のある分子若しくは小分子のような実際の分子を特定することができ、これらの分子は開示する組成物と所望の方法で相互作用する。本明細書で開示する核酸、ペプチド、及び関連する分子は、任意の分子モデリングプログラム又はアプローチで標的として用いることができる。
【０１６５】
モデリング技術において開示する組成物を用いるとき、阻害若しくは刺激のような特定の所望の特性又は標的分子の機能を有する巨大分子のような分子が同定されると理解される。単離されたＤ４デサチュラーゼ又はＤ５エロンガーゼのような開示する組成物を用いるとき同定及び単離される分子もまた開示される。したがって、単離されたＤ４デサチュラーゼ又はＤ５エロンガーゼのような開示する組成物に関与する分子モデリングアプローチを用いて生成される生成物もまた、本明細書で開示されると考えられる。
【０１６６】
したがって、選択した分子に結合する分子を単離する１つの方法は、合理的設計（rational design）を通じたものである。これは、構造的情報及びコンピュータモデリングを通して達成できる。コンピュータモデリング技術により、選択された分子の三次元原子構造の可視化、および分子と相互作用する新規化合物の合理的設計が可能になる。三次元構造は、典型的には、選択された分子のｘ線結晶学的分析又はＮＭＲイメージングから得られるデータに依存する。その分子力学は、力場のデータを必要とする。コンピュータグラフィックシステムにより、新規化合物がどのように標的分子に結合するかを予測することが可能になり、結合特異性を完全にするために、化合物及び標的分子の構造を実験的に操作することが可能になる。一方又は両方に小さな変化が起こるとき、どの分子−化合物が相互作用するかという予測は、分子力学ソフトウェア及び計算集約的なコンピュータを必要とし、これらは通常分子設計プログラムとユーザとの間のユーザフレンドリな、メニュー方式インタフェース伴う。
【０１６７】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation, Waltham, MA）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギーの最小化及び分子力学機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、及び解析を実行する。ＱＵＡＮＴＡにより、分子相互の挙動の対話的構築、修正、可視化及び分析が可能になる。
【０１６８】
Rotivinen, et al., 1988 Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166； Ripka, New Scientist 54-57 (June 16, 1988)；McKinaly and Rossmann, 1989 Aram. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29, 111-122；Perry and Davies, QSAR: Quantitative Structure- Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989)；Lewis and Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236, 125-140 and 141-162のような多数の記事が、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングについて概説しており、核酸成分のモデル酵素に関しては、Askew, et al., 1989 J. Am. Chem. Soc. I l l, 1082- 1090が概説している。化学物質を選別し、映像的に表現する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc., Pasadena, CA.、Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada、及びHypercube, Inc., Cambridge, Ontarioのような企業から入手可能である。これらは主に特定のタンパク質に特異的な薬物に適用するために設計されているが、それらは、一旦領域が同定されると、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ領域と特異的に相互作用する分子の設計に適合できる。
【０１６９】
結合を変化させることができる化合物の設計及び生成に関して上述したが、基質の結合又は酵素的活性を変化させる化合物について、天然産物又は合成化学物質、及びタンパク質を含む生物学的に活性のある物質を含む、既知の化合物のライブラリをスクリーニングすることもできる。
【０１７０】
１２．キット
本明細書に開示する方法を実行するのに用いることができる試薬を引き出すキットを、本明細書に開示する。キットは、本明細書で論じる、又は開示する方法の実行において必要である若しくは有利である任意の試薬又は試薬の組み合わせを含んでよいことが理解されよう。例えば、キットは、方法の特定の実施形態で論じられる増幅反応を実施するためのプライマー、並びに目的とするプライマーを用いるために必要な緩衝剤及び酵素を含むことができる。
【０１７１】
１３．類似機能を有する組成物
本明細書に開示する組成物は、開示した酵素的機能のような特定の機能を有することが理解される。開示した機能を実施するための特定の構造的要件を本明細書に開示し、開示した構造に関連する同じ機能を実施できる種々の構造が存在すること、及びこれらの構造が最終的に同じ結果、例えば、酵素的機能の刺激又は阻害を達成することが理解される。
【０１７２】
Ｃ．組成物の製造方法
本明細書に開示する組成物及び開示する方法を実施するために必要な組成物は、特に断らない限り、特定の試薬又は化合物について当業者に既知である任意の方法を用いて製造できる。
【０１７３】
１．核酸合成
例えば、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのような核酸は、標準的な化学合成法を用いて製造できる、又は酵素的方法若しくは任意の他の既知の方法を用いて生成できる。このような方法は、標準的な酵素消化に続くヌクレオチド断片の単離（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) Chapters 5, 6を参照のこと）から、例えば、Milligen or Beckman System lPlus DNA synthesizer (for example, Model 8700 automated synthesizer of Milligen-Biosearch, Burlington, MA or ABI Model 380B)を用いるシアノエチルホスホラミダイト法等により純粋に合成する方法にまで及び得る。オリゴヌクレオチドの製造に有用な合成法はまた、Ikuta et ah, Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984)、 (ホスホトリエステル及び亜リン酸トリエステル法）、及びNarang et al., Methods EnzymoL, 65:610-620 (1980)（ホスホトリエステル法）に記載されている。タンパク質核酸分子は、Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994)に記載されているもののような、既知の方法を用いて製造できる。
【０１７４】
２．ペプチド合成
配列番号２３のような、開示するタンパク質を生成する１つの方法は、タンパク質化学技術により２つ若しくはそれ以上のペプチド又はポリペプチドを相互に結合することである。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボノイル）ケミストリー（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）のいずれかを用いて、現在入手可能な実験設備を用いて化学的に合成できる。当業者は、開示するタンパク質に対応するペプチド又はポリペプチドが、例えば、標準的な化学反応により合成できることを容易に理解できる。例えば、ペプチド又はポリペプチドを合成し、その合成樹脂から切断しなくてもよいが、一方ペプチド又はポリペプチドの他の断片を合成し、その後樹脂から切断し、それにより他の断片で機能的に遮断される末端基を露出させることができる。ペプチド縮合反応により、これらの２つの断片は、それぞれカルボキシ末端及びアミノ末端でペプチド結合を介して共有結合して、抗体又はその断片を形成することができる（Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N. Y. (1992)；Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer- Verlag Inc., NY（これらは、少なくともペプチド合成に関する内容が、参照することにより本明細書に組み込まれる））。あるいは、ペプチド又はポリペプチドは、本明細書に記載のようにインビボで独立に合成される。一旦単離されると、これらの独立したペプチド又はポリペプチドは、結合して、同様のペプチド縮合反応を介してペプチド又はその断片を形成することができる。
【０１７５】
例えば、クローニングした又は合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチド断片が結合して、より大きなペプチド断片、ポリペプチド又は全体のタンパク質ドメインを生成することが可能になる（Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)）。あるいは、合成ペプチドのネイティブな化学的ライゲーションを利用して、より短いペプチド断片から合成的に大きなペプチド又はポリペプチドを構築することができる。この方法は、２段階化学反応から成る（Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)）。第１段階は、保護されていない合成ペプチド――チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含有する別の保護されていないペプチドセグメントとの化学選択的反応であり、初期共有生成物としてチオエステル結合中間体が得られる。反応条件を変化させることなく、この中間体は、自然に、急速な分子内反応を受けて、ライゲーション部位でネイティブなペプチド結合を形成する（Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101；Clark-Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994)；Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991)； Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)）。
【０１７６】
あるいは、保護されていないペプチドセグメントは、化学的に結合し、そこで化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間で形成される結合は非天然（非ペプチド）結合である（Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)）。この技術を用いて、タンパク質ドメインの類似体に加えて、大量の完全な生物学的活性を有する比較的純粋なタンパク質が合成されている（de Lisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992)）。
【０１７７】
３．組成物を製造するためのプロセスクレーム
組成物を製造するプロセス、並びに組成物を導く中間体の製造プロセスを開示する。例えば、配列番号１４及び２５の核酸を開示する。合成化学方法及び標準的な分子生物学的方法のような、これらの組成物を製造するために用いることができる種々の方法が存在する。これらの及び他の開示する組成物の製造方法が具体的に開示されることが理解される。
【０１７８】
例えば、配列番号１４及び２５に記載の配列、及び核酸の発現を制御する配列を含む核酸を操作可能な方法で結合させることを含むプロセスにより生成される核酸分子を開示する。
【０１７９】
また、例えば、配列番号１４及び２５に記載の配列に対して８０％の同一性を有する配列を含む核酸分子、及び核酸の発現を制御する配列を含む核酸を操作可能な方法で結合させることを含むプロセスにより生成される核酸分子を開示する。
【０１８０】
例えば、配列番号１４及び２５に記載の配列、及び核酸の発現を制御する配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸分子を、操作可能な方法で結合させることを含むプロセスにより生成される核酸分子を開示する。
【０１８１】
例えば、配列番号１５及び２６に記載のペプチドをコードしている配列、及び核酸分子の発現を制御する配列を含む核酸を操作可能な方法で結合させることを含むプロセスにより生成される核酸分子を開示する。
【０１８２】
例えば、配列番号１５及び２６に記載のペプチドに対して８０％の同一性を有するペプチドをコードしている配列、及び核酸分子の発現を制御する配列を含む核酸を操作可能な方法で結合させることを含むプロセスにより生成される核酸分子を開示する。
【０１８３】
例えば、配列番号１５及び２６に記載のペプチドに対して８０％の同一性を有するペプチドをコードしている配列であって、例えば、配列番号１５及び２６からの任意の変化が保存的変化である配列、及び核酸分子の発現を制御する配列を含む核酸分子を操作可能な方法で結合させることを含むプロセスにより生成される核酸を開示する。
【０１８４】
開示する核酸のいずれかで細胞を形質転換するプロセスにより生成される細胞を開示する。非自然発生的な開示される核酸のいずれかで細胞を形質転換するプロセスにより生成される細胞を開示する。
【０１８５】
開示する核酸のいずれかを発現させるプロセスにより生成される開示する任意のペプチドを開示する。開示する核酸のいずれかを発現させるプロセスにより生成される非自然的に発生する開示するペプチドのいずれかを開示する。非自然的な開示する核酸のいずれかを発現させるプロセスにより生成される開示するペプチドのいずれかを開示する。
【０１８６】
本明細書に開示する核酸分子のいずれかで動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスにより生成される動物を開示する。本明細書に開示される核酸分子のいずれかで動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスにより生成される動物であって、哺乳類である動物を開示する。また、本明細書に開示する核酸分子のいずれかで動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスにより生成される動物であって、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ又は霊長類である動物を開示する。
【０１８７】
また、本明細書に開示する細胞のいずれかを動物に添加するプロセスにより生成される動物を開示する。
【実施例】
【０１８８】
Ｄ．実施例
以下の実施例は、どのように本件で請求する化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法が製造並びに評価されるのかについて、当業者に完全に開示及び説明するために述べるものであり、純粋に例示を目的とし、本開示を限定することを意図するものではない。数（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証するよう努力するが、多少の誤差及び偏差を考慮すべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、温度は℃、かつ周囲温度であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。
【実施例１】
【０１８９】
ThraustochytridのＯＮＣ−Ｔ１８からデサチュラーゼ及びエロンガーゼを単離するための縮重オリゴヌクレオチドの設計
【０１９０】
ThraustochytridのＯＮＣ−Ｔ１８の脂肪酸組成の分析により、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ｎ−６）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）、アドレン酸（adrenic acid）（ＡＤＡ、２２：４ｎ−６）、ω６ドコサペンタエン酸（ω６ＤＰＡ、２２：５ｎ−６）、ω３ドコサペンタエン酸（ω３−ＤＰＡｎ−３）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）のような長鎖ＰＵＦＡがかなりの量存在することが明らかになった。したがって、この生物は、ＡＲＡをＡＤＡに又はＥＰＡをω３−ＤＰＡに変換できる活性Δ５エロンガーゼ、及びＡＤＡをω６−ＤＰＡに又はω３−ＤＰＡをＤＨＡに不飽和化する活性Δ４デサチュラーゼを含むと考えられた（図１）。したがって、目的は、ThraustochytridのＯＮＣ−Ｔ１８からこれらのデサチュラーゼ及びエロンガーゼを単離し、最終的に代替宿主で発現させることにより機能性を確認することを試みることであった。
【０１９１】
機能的デサチュラーゼ酵素をコードしている遺伝子を単離するために、ゲノムＤＮＡを生物から抽出した。ThraustochytridのＯＮＣ−Ｔ１８培養物を、常時攪拌しながら２６℃で１６〜２０時間、培養培地（５ｇ／Ｌ 酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ペプトン、４０ｇ／Ｌ Ｄ（＋）−グルコース、１．２５ｍＬ／Ｌ 微量元素、１．２５ｍＬ／Ｌ ビタミン、４０ｇ／Ｌ 海塩；（微量元素：５ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、３．１５ ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４．３６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、０．６１２５ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０、０．０５９７ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２２ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１８ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１３μｇ／Ｌ Ｈ２ＳｅＯ３、２．７ｍｇ／Ｌ ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、１．８４ ｍｇ／Ｌ Ｎａ３ＶＯ４、１．９４ｍｇ／Ｌ Ｋ２ＣｒＯ４）、（ビタミン：１ｍｇ／Ｌ ビタミンＢ１２、１ｍｇ／Ｌ ビオチン、０．２０ｇ／Ｌ チアミン ＨＣｌ）中で増殖させた。アダプタSorvall #00436を用いてロータＳＴ−Ｈ７５０を備えるSorvall Super T21遠心分離機内で、室温にて５分間、５００ｒｐｍで遠心分離し、８０％の上清を除去し、残りの培地に細胞を再懸濁させ、抽出を続けた。製造業者のプロトコルに従って、Ultraclean Microbial DNA Isolation kit (MO BIO Laboratories, Inc, Solana Beach, California)を用いて、細胞からゲノムＤＮＡを単離した。
【０１９２】
既知のデサチュラーゼで保存されている縮重オリゴヌクレオチド（すなわち、プライマー）を設計するアプローチをとった。これらのプライマーをＰＣＲ反応で用いて、Thraustochytriumから予測されるデサチュラーゼ遺伝子の保存領域を含む断片を同定することができる。Thraustochytrium sp., Thraustochytrium aureum、Thraustochytrium sp. ATCC 34304、 Thraustochytrium sp. ATCC 21685、及びThraustochytrium sp. FJN-IO (それぞれ、ＥＭＢＯ受入番号ＣＳ０２００８７、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ３９１５４６、ＡＦ３９１５４３、ＡＦ４８９５８９、ＤＱ１３３５７５)から５種の配列が入手可能であった。以下のように、Ｋｏｄｏｎプライマーデザイナーソフトウェアを用いて、縮重プライマーを用いた：プライマー４ｄｅｓａｔ３０８（フォワード）（配列番号１）５’−ＧＧＲＡＣＡＧＣＧＡＳＴＴＴＴＡＣＡＧＧＧ−Ｓ’、プライマー４ｄｅｓａｔｌ３６９（リバース）（配列番号２）５’−ＧＴＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＫＡＧ−Ｓ’。
【０１９３】
既知のエロンガーゼに保存されている縮重オリゴヌクレオチド（すなわち、プライマー）を設計するために同じアプローチを用いた。これらのプライマーをＰＣＲ反応で用いて、Thraustochytrium sp.から予測されるエロンガーゼ遺伝子の保存領域を含有する断片を同定できる。Thraustochytrium sp.及びThraustochytrium aureum (それぞれ、ＥＭＢＯ受入番号ＣＳ１６０８９７及びＣＳ１６０８７９）から２種の配列が入手可能であった。以下のように、Ｋｏｄｏｎプライマーデザイナーソフトウェアを用いて、縮重プライマーを用いた：プライマー５ｅｌｏ２０２Ｆ（フォワード）（配列番号３）５’−ＡＡＧＣＣＹＴＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＴＹＣ−３’、プライマー５ｅｌｏ７６８Ｒ（リバース）（配列番号４）５’−ＧＣＡＣＧＡＡＲＡＡＧＴＴＧＣＣＧＡＡＧ−３’。オリゴヌクレオチド配列の縮重コードは、Ｋ＝Ｇ，Ｔ、Ｒ＝Ａ，Ｇ、Ｓ＝Ｇ，Ｃ、Ｙ＝Ｃ，Ｔであった。
【実施例２】
【０１９４】
Thraustochytrium sp. のＯＮＣ−Ｔ１８からのΔ５エロンガーゼヌクレオチド配列の単離
【０１９５】
Δ５エロンガーゼ遺伝子を単離するために、ＰＣＲ増幅を、２００ｎｇ Thraustochytrium sp.のＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡ、１０μＬ ベタイン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ ゼラチン、２００μＭ 各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、１μＭの各プライマー及び０．２ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ(Sigma, Oakville, Ontario)を含有する、５０μＬの体積中で実施した。熱サイクルを、５５．７℃のアニーリング温度で実施し、ＰＣＲ反応物を、０．８％の低融点アガロースゲルで分離し、約６００ｂｐのバンドをゲル精製した。ＰＣＲ産物を、水でアガロースから溶出し、次いでQIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, California)で精製した。これらのＤＮＡ断片を、製造業者の説明書に従って、pT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlueコンピーテントセル(Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンを配列決定した。それにより、既に同定されているΔ５エロンガーゼに対して配列相同性を示す１つのクローンが単離された。このクローンは、以下のように説明される。クローン＃６００−１６（配列番号５）は、これを配列決定し、５９３ｂｐから推定したアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴｘサーチでの最高のスコアとして、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ１Thraustochytrium sp. FJN-IOと９５％の同一性を示した。
【０１９６】
３’−末端を単離するために、Thraustochytrium sp.のＯＮＣ−Ｔ１８から精製したゲノムＤＮＡ、並びにオリゴヌクレオチド３’ＧＳＰａ（配列番号６）（５’−ＣＧＣＴＧＣＧＣＣＣＧＴＡＣＡＴＴＡＣＴＡＣＣＡＴＣＣＡ−Ｓ’）及び３’ＧＳＰｂ（配列番号７）（５’−ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＴＧＡＣ−Ｓ’）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、APAgene GOLD Genome Walking kit (BIO S&T, Montreal, Quebec)を用いて、ゲノムウォーキングを実施した。両方のオリゴヌクレオチドは、推定上のΔ５エロンガーゼの＃６００−１６断片に基づいて設計した。ＰＣＲ断片を、０．８％の低融点アガロースゲルで分離し、約５００〜２０００ｂｐのバンドをゲル精製した。ＰＣＲ産物を、アガロースから水で溶出し、次いでQIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, California)により精製した。これらのＤＮＡ断片を、製造業者の説明書に従ってpT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlueコンピテントセル (Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンを配列決定した。クローン３’Ｃ２−１（配列番号８）は、３５８ｂｐの挿入断片を含んでおり、それは既知のΔ５エロンガーゼとの配列の相同性及び「ＴＧＡ」終止コドンの存在に基づいて、推定上のＤ５エロンガーゼ遺伝子の３’−末端を含むことが確認された。
【０１９７】
５’−末端を単離するために、Thraustochytrium sp.のＯＮＣ−Ｔ１８から精製したゲノムＤＮＡ、並びにオリゴヌクレオチド５’ＧＳＰａ（配列番号９）（５’−ＣＴＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＧＧＧＴＴＧＣＣＡ−Ｓ’）及び５’ＧＳＰｂ（配列番号１０）（５’−ＧＴＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＧＴＡＧＣＣＧＣＣＧＡ−Ｓ’）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、APAgene GOLD Genome Walking kit (BIO S&T, Montreal, Quebec)を用いて、ゲノムウォーキングを実施した。両方のオリゴヌクレオチドは、推定上のＤ５エロンガーゼの＃６００−１６断片に基づいて設計した。ＰＣＲ断片は、０．８％を低融点アガロースゲルで分離し、約５００〜２０００ｂｐのバンドをゲル精製した。ＰＣＲ産物を、アガロースから水で溶出し、次いでQIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, California)により精製した。これらのＤＮＡ断片を、製造業者の説明書に従って、pT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlueコンピテントセル (Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンを配列決定した。新規Δ５エロンガーゼの推定「ＡＴＧ」開始部位を含む５１９ｂｐの挿入断片を含む、クローン５’Ｄ２−１１(配列番号９）が得られた。この断片の推定アミノ酸配列は、既知のΔ５エロンガーゼと整列したとき、８９％の同一性を示した。
【０１９８】
このＤ５エロンガーゼ遺伝子を、テンプレートとしてThraustochytriumのＯＮＣ−Ｔ１８のゲノムＤＮＡ、及び以下のオリゴヌクレオチドＯＮＣ−Ｔ１８ｅｌｏｌ（フォワード）（配列番号１２）５’−ＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣ−３’、ＯＮＣ−Ｔ１８ｅｌｏ１０９９（リバース）（配列番号１３） ５’−ＧＧＴＣＣＡＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＧＣＧ−３’を用いて、ＰＣＲ増幅によりその全体を単離した。
【０１９９】
ＰＣＲ増幅は、５０μＬの体積：１００ｎｇのThraustochytriumのＯＮＣ−Ｔ１８ゲノムＤＮＡ、２５ｍＭ ＴＡＰＳ−ＨＣｌ（ｐＨ９．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、１．５μＬ ＤＭＳＯ、２００μＭ 各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、０．５μＭ 各プライマー及び１ユニットのPhusion high-fidelity DNA polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland)で実施した。熱サイクル条件は、以下の通りである。テンプレートを最初に９８℃で３０秒間変性し、続いて［９８℃で１０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間］を３０サイクル行い、最後に７２℃で５分間の伸長サイクルを行なった。そのようにして得られたＰＣＲ産物を、製造業者の説明書に従って pT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlue コンピテントセル(Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンの配列を決定した。プラスミドを、UltraClean 6 Minute Mini Plasmid Prep kit (MO BIO Laboratories, Inc, Solana Beach, California)を用いて精製した。それにより得られたプラスミドを、ＢａｍＨＩ／Ｎｏｔｌで消化し、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２(Invitrogen, Carlsbad, California)にクローニングして、クローンｐＹＥｌｏを生成し、次の発現試験のために用いた。
【０２００】
Δ５エロンガーゼ完全長遺伝子挿入断片は１０９９ｂｐ（配列番号１４）の長さであり、最初のＡＴＧから始まる、２７６アミノ酸をコードしている８３１ｂｐのオープンリーディングフレームを含んでいた。完全長遺伝子（配列番号１５）のアミノ酸配列は、Thraustochytrium sp. FJN-IO、Marchantia polymorpha、Physcomitrella patens及びMortierella alpina由来のΔ５エロンガーゼに対して相同な領域を含んでいた。
【実施例３】
【０２０１】
Thraustochytrium ONC-T18からのΔ４デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
【０２０２】
Δ４デサチュラーゼ遺伝子を単離するために、ＰＣＲ増幅を、１００ｎｇ ThraustochytriumのＯＮＣ−Ｔ１８ゲノムＤＮＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、４００μＭ 各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、２μＭの各プライマー及び０．１ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, California)を含有する、５０μｌの体積中で実施した。熱サイクルを、５９．５℃のアニーリング温度で実施し、ＰＣＲ反応物の一部を０．８％の低融点アガロースゲルで分離し、約１１００ｂｐのバンドを、QIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, California)で、残りのＰＣＲ反応から精製した。このＤＮＡ断片を、製造業者の説明書に従って、TOPO TA Cloning kit for Sequencing (Invitrogen, Carlsbad, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをＴＯＰ１０コンピテントセル(Invitrogen, Carlsbad, California)に形質転換し、クローンを配列決定した。それにより、既に同定されているΔ４デサチュラーゼに対して配列の相同性を示す１つのクローンが単離された。このクローンは、以下のように説明される。クローン＃１０−３（配列番号１６）を配列決定し、９６７ｂｐから推定したアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴｘサーチでの最高のスコアとして、デルタ−４脂肪酸デサチュラーゼThraustochytrium sp. ＡＴＣＣ２１６８５と９６％の同一性を示した。
【０２０３】
３’−末端を単離するために、ThraustochytriumのＯＮＣ−Ｔ１８から精製したゲノムＤＮＡ、並びにオリゴヌクレオチド４ｄｅｓａｔ３’ａ（配列番号１７）（５’−ＴＴＡＣＧＣＴＴＣＣＡＡＧＧＡＣＧＣＧＧＴＣ−Ｓ’）及び４ｄｅｓａｔ３’ｂ（配列番号１８）（５’−ＡＴＧＡＡＣＡＡＣＡＣＧＣＧＣＡＡＧＧＡＧＧ−Ｓ’）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、APAgene GOLD Genome Walking kit (BIO S&T, Montreal, Quebec)を用いて、ゲノムウォーキングを実施した。両方のオリゴヌクレオチドは、推定上のΔ４デサチュラーゼの＃１０−３断片に基づいて設計した。ＰＣＲ断片を、０．８％の低融点アガロースゲルで分離し、約５００〜２０００ｂｐのバンドをゲル精製した。ＰＣＲ産物を、アガロースから水で溶出し、次いでQIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, California)により精製した。これらのＤＮＡ断片を、製造業者の説明書に従ってpT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlueコンピテントセル (Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンを配列決定した。クローン３’Ｄ２−９２(配列番号１９）は、７８２ｂｐの挿入断片を含んでおり、それは既知のΔ４デサチュラーゼとの配列の相同性及び「ＴＧＡ」終止コドンの存在に基づいて、推定上のΔ４デサチュラーゼ遺伝子の３’−末端を含むことが確認された。
【０２０４】
５’−末端を単離するために、Thraustochytrium sp.のＯＮＣ−Ｔ１８から精製したゲノムＤＮＡ、並びにオリゴヌクレオチド４ｄｅｓａｔ５’ａ（配列番号２０）（５’−ＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＧＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡＧ−Ｓ’）及び４ｄｅｓａｔ５’ｂ（配列番号２１）（５’−ＣＡＣＡＴＣＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡ−Ｓ’）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、APAgene GOLD Genome Walking kit (BIO S&T, Montreal, Quebec)を用いて、ゲノムウォーキングを実施した。両方のオリゴヌクレオチドは、推定Ｄ４デサチュラーゼの＃１０−３断片に基づいて設計した。ＰＣＲ断片を、０．８％の低融点アガロースゲルで分離し、約５００〜２０００ｂｐのバンドをゲル精製した。ＰＣＲ産物を、アガロースから水で溶出し、次いでQIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, California)により精製した。これらのＤＮＡ断片を、製造業者の説明書に従って、pT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlueコンピテントセル (Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンを配列決定した。このようにして、新規Δ４デサチュラーゼの推定上の「ＡＴＧ」開始部位を含む９４６ｂｐ挿入断片を含む、クローン５’−２１７(配列番号２２）が得られた。この断片の推定アミノ酸配列は、既知のΔ４デサチュラーゼと整列したとき、９６％の同一性を示した。
【０２０５】
このΔ４デサチュラーゼ遺伝子を、テンプレートとしてThraustochytriumＯＮＣ−Ｔ１８ゲノムＤＮＡ、及び以下のオリゴヌクレオチドＯＮＣ−Ｔ１８４ｄｅｓ３８ＯＦ（フォワード）（配列番号２３）５’−ＣＧＡＴＴＧＡＧＡＡＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴ−Ｓ’、ＯＮＣ−Ｔ１４ＤＥＳ１６８７Ｒ（リバース）（配列番号２４）５’−ＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＣＴＧＧＴ−３’を用いて、ＰＣＲ増幅によりその全体を単離した。
【０２０６】
ＰＣＲ増幅は、５０μＬの体積：３００ｎｇのThraustochytrium ＯＮＣ−Ｔ１８ゲノムＤＮＡ、２５ｍＭ ＴＡＰＳ−ＨＣｌ（ｐＨ９．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、１．５μＬ ＤＭＳＯ、２００μＭ 各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、０．５μＭ 各プライマー及び１ユニットのPhusion high-fidelity DNA polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland)を用いて実施した。熱サイクル条件は、以下の通りである。テンプレートを最初に９８℃で３０秒間変性し、続いて［９８℃で１０秒間、６１℃で３０秒間、７２℃で３０秒間］を３０サイクル、最後に７２℃で５分間伸長サイクルを行った。それにより得られたＰＣＲ産物を、製造業者の説明書に従って pT7Blue-3 Perfectly Blunt Cloning kit (Novagen, San Diego, California)にクローニングした。組み換えプラスミドをNovaBlueコンピテントセル (Novagen, San Diego, California)に形質転換し、クローンの配列を決定した。プラスミドを、UltraClean 6 Minute Mini Plasmid Prep kit (MO BIO Laboratories, Inc, Solana Beach, California)を用いて精製した。それにより得られたプラスミドを、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで消化し、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２(Invitrogen, Carlsbad, California)にクローニングして、クローンｐＹＤｅｓを生成し、次の発現試験のために用いた。
【０２０７】
Δ４デサチュラーゼ完全長遺伝子挿入断片は１７５７ｂｐ（配列番号２５）の長さであり、最初のＡＴＧから始まり、５１９アミノ酸をコードしている１５０９ｂｐのオープンリーディングフレームを含んでいた。完全長遺伝子（配列番号２６）のアミノ酸配列は、Thraustochytrium sp. ATCC21685、Thraustochytrium sp. FJN-IO、及びThraustochytrium aureum由来のΔ４デサチュラーゼに対して相同な領域を含んでいた。それはまた、全ての既知の膜結合デサチュラーゼに見られる３つの保存されている「ヒスチジンボックス」を含んでいた（Okuley, et al. (1994) The Plant Cell 6:147-158）。これらは、アミノ酸１８１〜１８５、２１７〜２２２、及び４５４〜４５８に存在していた。他の膜結合Δ４デサチュラーゼと同様に、ThraustochytriumのＯＮＣ−Ｔ１８Δ４デサチュラーゼの３番目のヒスチジンボックスモチーフ（ＨＸＸＨＨ）は、ＱＸＸＨＨであることが見出された。この配列はまた、５’−末端にシトクロムｂ５ドメインを含んでいた。このシトクロムは、これらの酵素で電子供与体として機能すると考えられる。
【実施例４】
【０２０８】
酵母におけるThraustochytriumＯＮＣ−Ｔ１８Δ４デサチュラーゼ及びΔ５エロンガーゼ遺伝子の発現
【０２０９】
ｐＹＥＳ２（Invitrogen, Carlsbad, California）にクローニングされた完全長Δ４デサチュラーゼから成るクローンｐＹＤｅｓ及び、ｐＹＥＳ２中の完全長Δ５エロンガーゼから成るクローンｐＹＥｌｏを、コンピテント出芽酵母ＩＮＶＳｃ１に形質転換した。酵母の形質転換を、製造業者に特定された条件に従って、S. c. EasyComp Transformation kit (Invitrogen, Carlsbad, California)を用いて実施した。形質転換体を、ウラシルを欠く培地（ＳＣ−Ｕｒａ）上でウラシル栄養要求性について選択した。これらのクローンの特定のデサチュラーゼ活性を検出するために、形質転換体を、以下に列挙する５００μＭの特異的脂肪酸基質の存在下で増殖させた。Ａ）ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）（ドコサヘキサエン酸への変換はΔ４デサチュラーゼ活性を示す）、Ｂ）ドコサテトラエン酸（２２：４ｎ−６）（ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−６）への変換はΔ４デサチュラーゼ活性を示す）、Ｃ）ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ｎ−６）（アラキドン酸（２０：４ｎ−６）への変換はΔ５デサチュラーゼ活性を示す）、Ｄ）エイコサペンタエン酸（２０：５ｎ−３）（ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）への変換はΔ５エロンガーゼ活性を示す）、Ｅ）アラキドン酸（２０：４ｎ−６）（ドコサテトラエン酸（２２：４ｎ−６）への変換はΔ５エロンガーゼ活性を示す）。
【０２１０】
負の対照株は未改変ｐＹＥＳ２ベクターを含むＩＮＶＳｃ１であり、これらを同時に増殖させた。培養物を激しく攪拌し（１５０ｒｐｍ）、５００μＭ（最終濃度）の種々の基質の存在下で２０℃にて９６時間増殖させた。細胞をペレット状にし、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、細胞ペレットを凍結乾燥させた。脂質を、次いで抽出し、ガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ）のために脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に誘導体化した。エステル交換及び抽出を、１００ｍｇの凍結乾燥させた細胞を用いて行い、内部標準としてＣ１９：０を、エステル交換反応混合物（メタノール：塩酸：クロロホルム、１０：１：１）に添加し、混合し、９０℃で２時間加熱し、室温に冷却した。ＦＡＭＥを、１ｍＬの水及び２ｍＬのヘキサン：クロロホルム（４：１）を添加することにより抽出し、有機及び水相を分離させた。有機相を抽出し、０．５ｇの無水硫酸ナトリウムで処理して、微粒子及び残りの水を除去した。有機溶媒をアルゴン流下で蒸発させた。ＦＡＭＥをイソオクタンに再懸濁させ、ＧＣ−ＦＩＤにより分析した。変換率は、生成された生成物を（生成された生成物＋添加した基質）の合計で除し、次いで１００を乗じることにより算出した。表４は、添加した基質の変換率に基づく、単離した遺伝子の酵素活性を表す。
【０２１１】
【表４】
【０２１２】
ThraustochytriumのＯＮＣ−Ｔ１８由来のΔ４デサチュラーゼ遺伝子を含むｐＹＤｅｓクローンは、１４％の２２：５ｎ−３基質を２２：６ｎ−３に、及び１４％の２２：４ｎ−６基質を２２：５ｎ−６に変換した。これは、遺伝子がΔ４デサチュラーゼをコードしていることを確認する。この場合、バックグラウンド（基質の非特異的変換）は存在しなかった。
【実施例５】
【０２１３】
クエン酸酸化鉄によるＯＮＣ−ＴＩ８Δ４デサチュラーゼ活性の操作
【０２１４】
ｐＹＥＳ２（Invitrogen, Carlsbad, California）にクローニングされた、完全長Δ４デサチュラーゼから成る、クローンｐＹＤｅｓを、コンピテント出芽酵母ＩＮＶＳｃ１に形質転換した。負の対照株は未改変ｐＹＥＳ２ベクターを含むＩＮＶＳｃ１であり、これらを同時に増殖させた。培養物を激しく攪拌し（１５０ＲＰＭ）、５００μＭ（最終濃度）のＤＰＡ及び０．０１％クエン酸酸化鉄の存在下で２０℃にて９６時間増殖させた。細胞を前記のように処理して、ＤＰＡのＤＨＡへの変換率を決定した。クエン酸酸化鉄の存在下における変換率は３８．７０％であり、この場合Δ４デサチュラーゼ活性は２．７５倍増加した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ４デサチュラーゼが、配列番号２６に対して、少なくとも７０％、８０％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％又はそれを超える同一性を有する、Ｄ４デサチュラーゼを含む組成物。
【請求項２】
配列番号２６から離脱するいかなる変化も保存的変化である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＤ４デサチュラーゼをコードしている核酸を含む組成物。
【請求項４】
ベクターを更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞を含む組成物。
【請求項６】
前記細胞が、真核生物、原核生物、Thraustochytrid、酵母又は大腸菌である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む、非ヒト動物を含む組成物。
【請求項８】
前記組成物が、前記Ｄ４デサチュラーゼの非存在下における組成物よりも多くの多価不飽和脂肪酸を生成する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記脂肪酸がＥＰＡ又はＤＨＡである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記デサチュラーゼが少なくとも１つのヒスチジンボックスを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記デサチュラーゼが少なくとも２つのヒスチジンボックスを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記デサチュラーゼが少なくとも３つのヒスチジンボックスを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ヒスチジンボックスが配列ＨＸＸＨＨ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ヒスチジンボックスが配列ＱＸＸＨＨを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記デサチュラーゼがまたシトクロムｂ５ドメインを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記シトクロムｂ５ドメインが５’−末端に存在する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記デサチュラーゼがデサチュラーゼ基質の存在下にある、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記基質が、少なくとも１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ又は１０００μＭの濃度を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記基質が、ドコサペンタエン酸（２２：５ ｎ−３）、ドコサテトラエン酸（２２：４ ｎ−６）、又はジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ ｎ−６）である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記デサチュラーゼが、利用可能な基質の少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％を変換する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記デサチュラーゼが表１に示す量の基質を変換する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物が単離されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｄ５エロンガーゼが、配列番号１５に対して、少なくとも７０％、８０％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％又はそれを超える同一性を有する、Ｄ５エロンガーゼを含む組成物。
【請求項２４】
配列番号１５から離脱するいかなる変化も保存的変化である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項２３又は２４に記載の前記Ｄ５エロンガーゼをコードしている核酸を含む組成物。
【請求項２６】
ベクターを更に含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞を含む組成物。
【請求項２８】
前記細胞が、真核生物、原核生物、Thraustochytrid、酵母又は大腸菌である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の組成物を含む、非ヒト動物を含む組成物。
【請求項３０】
前記組成物が、Ｄ５エロンガーゼの非存在下における組成物よりも多くの多価不飽和脂肪酸を産生する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記脂肪酸がＥＰＡ又はＤＨＡである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記エロンガーゼがエロンガーゼ基質の存在下にある、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記基質が、少なくとも１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ又は１０００μＭの濃度を有する、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記基質が、エイコサペンタエン酸（２０：５ ｎ−３）又はアラキドン酸（２０：４ ｎ−６）である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記エロンガーゼが、利用可能な基質の少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％を変換する、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物が単離されている、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物を含み、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載の組成物を含む組成物。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物のうち１つ又はそれ以上を用いることを含む、多価不飽和脂肪酸を生成する方法。
【請求項３９】
前記生成される脂肪酸がＥＰＡ又はＤＨＡである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物を単離することを含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物を生成する方法。
【請求項１】
Ｄ４デサチュラーゼが、配列番号２６に対して、少なくとも７０％、８０％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％又はそれを超える同一性を有する、Ｄ４デサチュラーゼを含む組成物。
【請求項２】
配列番号２６から離脱するいかなる変化も保存的変化である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＤ４デサチュラーゼをコードしている核酸を含む組成物。
【請求項４】
ベクターを更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞を含む組成物。
【請求項６】
前記細胞が、真核生物、原核生物、Thraustochytrid、酵母又は大腸菌である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む、非ヒト動物を含む組成物。
【請求項８】
前記組成物が、前記Ｄ４デサチュラーゼの非存在下における組成物よりも多くの多価不飽和脂肪酸を生成する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記脂肪酸がＥＰＡ又はＤＨＡである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記デサチュラーゼが少なくとも１つのヒスチジンボックスを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記デサチュラーゼが少なくとも２つのヒスチジンボックスを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記デサチュラーゼが少なくとも３つのヒスチジンボックスを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ヒスチジンボックスが配列ＨＸＸＨＨ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ヒスチジンボックスが配列ＱＸＸＨＨを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記デサチュラーゼがまたシトクロムｂ５ドメインを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記シトクロムｂ５ドメインが５’−末端に存在する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記デサチュラーゼがデサチュラーゼ基質の存在下にある、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記基質が、少なくとも１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ又は１０００μＭの濃度を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記基質が、ドコサペンタエン酸（２２：５ ｎ−３）、ドコサテトラエン酸（２２：４ ｎ−６）、又はジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ ｎ−６）である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記デサチュラーゼが、利用可能な基質の少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％を変換する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記デサチュラーゼが表１に示す量の基質を変換する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物が単離されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｄ５エロンガーゼが、配列番号１５に対して、少なくとも７０％、８０％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％又はそれを超える同一性を有する、Ｄ５エロンガーゼを含む組成物。
【請求項２４】
配列番号１５から離脱するいかなる変化も保存的変化である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項２３又は２４に記載の前記Ｄ５エロンガーゼをコードしている核酸を含む組成物。
【請求項２６】
ベクターを更に含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞を含む組成物。
【請求項２８】
前記細胞が、真核生物、原核生物、Thraustochytrid、酵母又は大腸菌である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の組成物を含む、非ヒト動物を含む組成物。
【請求項３０】
前記組成物が、Ｄ５エロンガーゼの非存在下における組成物よりも多くの多価不飽和脂肪酸を産生する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記脂肪酸がＥＰＡ又はＤＨＡである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記エロンガーゼがエロンガーゼ基質の存在下にある、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記基質が、少なくとも１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ又は１０００μＭの濃度を有する、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記基質が、エイコサペンタエン酸（２０：５ ｎ−３）又はアラキドン酸（２０：４ ｎ−６）である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記エロンガーゼが、利用可能な基質の少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％を変換する、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物が単離されている、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物を含み、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載の組成物を含む組成物。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物のうち１つ又はそれ以上を用いることを含む、多価不飽和脂肪酸を生成する方法。
【請求項３９】
前記生成される脂肪酸がＥＰＡ又はＤＨＡである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物を単離することを含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物を生成する方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５３３００３（Ｐ２０１０−５３３００３Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１６６０３（Ｐ２０１０−５１６６０３）
【出願日】平成１９年１０月３１日（２００７．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００４５５３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１０８２５
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５０５１１３７９１）オーシャン ニュートリッション カナダ リミテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月３１日（２００７．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００４５５３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１０８２５
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５０５１１３７９１）オーシャン ニュートリッション カナダ リミテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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