ＤＮＡを定量又は検出する方法

【課題】簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法等を提供する。
【解決手段】（１）検体中に含まれるＤＮＡから、目的とする領域の塩基配列を含むＤＮＡを取得する第一工程、（２）第一工程で得られた前記ＤＮＡをメチル化酵素で処理し、メチル化ＤＮＡを取得する第二工程、（３）第二工程で得られた前記メチル化ＤＮＡから、一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する第三工程、（４）第三工程で選択された前記一本鎖メチル化ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、特定オリゴヌクレオチドと、を結合させて、該メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖メチル化ＤＮＡと、該メチル化ＤＮＡ抗体と、該特定オリゴヌクレオチドと、の複合体を形成させて、該複合体を取得する第四工程等を含む検体中に含まれるＤＮＡ中の目的とする領域のメチル化されたＤＮＡの含量を定量または検出する方法等を提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、
（１）目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを検体中から取得する第一工程、
（２）第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する第二工程、
（３）第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する第三工程、
（４）第三工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、該一本鎖メチル化ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域のメチル化された部分と該メチル化ＤＮＡ抗体との結合を阻害せず、且つ、該一本鎖ＤＮＡと相補性により結合し得る塩基配列を有する特定オリゴヌクレオチドと、を混合させて、
該メチル化された目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、該メチル化ＤＮＡ抗体と、該特定オリゴヌクレオチドとの複合体を形成させる第四工程、
（５）第四工程で形成した複合体に含まれる前記メチル化ＤＮＡ抗体をその識別機能により定量又は検出することにより、前記一本鎖メチル化ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する第五工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
第四工程において、二価陽イオンを含有する反応系中で複合体を形成させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二価陽イオンがマグネシウムイオンである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第五工程開始までに、第四工程で形成される複合体に含まれる抗体と支持体とを結合させる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第五工程開始までに、第四工程で形成される複合体に含まれる特定オリゴヌクレオチドと支持体とを結合させる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡメチル化酵素が、シトシンメチル化酵素である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡメチル化酵素が、SssIメチラーゼである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
メチル化ＤＮＡ抗体が、メチルシトシン抗体である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
検体が、下記のいずれかの検体である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液
（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ
（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ
（ｆ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
【請求項１０】
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、下記のいずれかの目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ
（ｂ）予め精製されてなる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
（ｃ）血液中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡ
（ｄ）微生物ゲノム由来の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
（ｅ）ＲＮＡから逆転写酵素によって生成された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
【請求項１１】
第四工程における複合体形成時にカウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下１０００ｍＭ以下である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下２００ｍＭ以下である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
癌患者由来の検体を選抜する方法であり、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法。
【請求項１５】
検体が、哺乳動物由来の血清である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【図１】