ＤＮＡを用いた目的物の標識及び確認方法
【課題】ＤＮＡを用いた目的物の標識方法及び当該標識物の簡便な確認方法を提供すること。
【解決手段】目的物を標識する方法であって、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡで当該目的物を標識することを特徴とする目的物の標識方法。標識に使用されるＤＮＡが、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物が例示される。本発明により、厳密な温度制御が必要なサーマルサイクラーを必要とせず、恒温槽とハンディトランスイルミネーターがあれば目的物を確認することが可能である。
【解決手段】目的物を標識する方法であって、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡで当該目的物を標識することを特徴とする目的物の標識方法。標識に使用されるＤＮＡが、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物が例示される。本発明により、厳密な温度制御が必要なサーマルサイクラーを必要とせず、恒温槽とハンディトランスイルミネーターがあれば目的物を確認することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡを用いた目的物の標識方法及び当該標識方法により標識された目的物の確認方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高度なコンピューター技術等を用いた種々の模造品や模倣品が市場に流出し、純正品や正統品が被害を受けるケースが増大している。例えば、有名ブランド商品の偽物の販売、有価証券や紙幣の偽造の他、特に最近では商品ラベルの改ざんによる食品の不正流通が問題となっている。このような状況の中で、目的物の確認及び判定方法として開発された技術の１つが、ＤＮＡを用いて認証を行う「ＤＮＡインク」や「ＤＮＡタグ」技術である。
【０００３】
これらは、（１）天然資源、例えば動物、植物、油、鉱物及び水、（２）化学物質、例えば薬剤、溶媒、石油生成物、及び爆薬物、（３）汚染物質を含む商業上の副産物、例えば放射性又はその他の危険な廃棄物、並びに（４）製品、例えば銃、タイプライター、自動車及び自動車部品を含む多数の様々な物質の製造及び流通の追跡調査に用いられている。この際、使用される標識は製品の同一性の確認に役立ち、製造者及び消費者に有用な情報を提供する（例えば、特許文献１、２）。
【０００４】
例えば「ＤＮＡインク」は、特定の塩基配列のＤＮＡを利用して、当該ＤＮＡを含むインク（ＤＮＡインク）を作製し、このＤＮＡインクを商品等への印刷に使用することで真正品の確実な確認・同定を可能とし、もって商品等の偽造や改ざんを防止する技術である（例えば、特許文献３）。
【０００５】
また、合成ＤＮＡ及び当該合成ＤＮＡと異なるＤＮＡの両者を含有する組成物を用いることで、偽造や複製をより困難とするインクや印刷物も検討されている（例えば、特許文献４）。
【０００６】
通常、上記のようなＤＮＡインクやＤＮＡタグで用いられているＤＮＡは単一の二本鎖ＤＮＡである。その確認又は判定方法は、当該ＤＮＡ試料を直接シークエンシングするか、あるいはＰＣＲ法により目的のＤＮＡを増幅後、ハイブリダイゼーションの工程を経る必要がある。しかしながら、これらの方法では、結果がでるまでに長い時間が必要である。また、結果が出る時間を短縮するために、ゲル電気泳動法のみで確認する方法が検討されているが、この場合、精度が極端に悪くなる。このため精度を上げるため、ゲル電気泳動後、目的のＤＮＡを単離し、シークエンシングもしくはＤＮＡチップ等で更に確認を行う方法も検討されているが、高度の技術と専用設備が必要であり、結局、時間もかかるという問題があった。またいずれの場合も、目的物が存在する場所で直ちに判定することができないという問題点もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３０８２９４２号公報
【特許文献２】特許第３０５９１９６号公報
【特許文献３】特開２００３−１５７００４号公報
【特許文献４】特開２００８−１８７９９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、簡便なＤＮＡを用いた目的物の標識方法及び当該標識物の確認方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡであって、当該塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物を用いる目的物の標識方法を見出した。また、前記標識に使用されるＤＮＡとして分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物を用いることにより、後の増幅及び確認（検出）工程において、通常、前記塩基配列を含有しないＤＮＡの存在により、あらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡを鋳型とした増幅産物を検出するための蛍光値が減少すると予測されるが、驚くべきことに、実際には当該蛍光値が向上することを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明の第１の発明は、目的物を標識する方法であって、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡで当該目的物を標識することを特徴とする目的物の標識方法に関する。第１の発明の態様としては、標識に使用されるＤＮＡが、当該ＤＮＡが含有するあらかじめ定められた塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物であってもよい。また、標識に使用されるＤＮＡが、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物であってもよい。
【００１１】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明で標識された目的物を確認する方法であって、標識された目的物に含有されるＤＮＡを当該ＤＮＡに含有されるあらかじめ定められた塩基配列に基づいて検出することを特徴とする目的物の確認方法に関する。第２の発明の態様としては、標識に使用されたＤＮＡを鋳型としてあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ断片を増幅する工程を包含してもよい。また、等温核酸増幅法によりＤＮＡ断片の増幅が実施されてもよい。なお、等温核酸増幅法としてはＩＣＡＮ法が挙げられる。また、当該ＩＣＡＮ法とサイクリングプローブ法を用いることにより、短時間でかつ反応時間を大幅に短縮することが可能である。
【００１２】
本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明のための標識用ＤＮＡ混合物であって、少なくとも１種類の分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、少なくとも１種類の前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物に関する。第３の発明の態様としては、１〜３種類、好ましくは１〜２種類の分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、１〜５種類、好ましくは１〜３種類の前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物である。
【００１３】
本発明は更に、目的物を標識する方法であって、あらかじめ定められた検出用の塩基配列を分子内に複数コピー含有するＤＮＡで当該目的物を標識することを特徴とする目的物の標識方法を提供する。当該ＤＮＡは、あらかじめ定められた検出用の塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物であってもよい。また当該ＤＮＡはあらかじめ定められた検出用の塩基配列を分子内に複数コピー含有するＤＮＡと、あらかじめ定められた検出用の塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物であってもよい。
【００１４】
本発明はまた、前記方法により標識された目的物を確認する方法であって、標識された目的物に含有される検出用の塩基配列を確認することを特徴とする目的物の確認方法が提供される。当該確認方法においては、あらかじめ定められた検出用の塩基配列を鋳型として増幅する工程を包含する方法が挙げられる。またその好ましい態様としては、等温核酸増幅法によりあらかじめ定められた検出用の塩基配列の増幅が実施される。
【００１５】
また本発明の標識方法のためのＤＮＡであって、少なくとも１種類のあらかじめ定められた検出用の塩基配列を分子内に複数コピー含有するＤＮＡと、少なくとも１種類のあらかじめ定められた検出用の塩基配列を含有しないＤＮＡとの標識用ＤＮＡ混合物が提供される。
【００１６】
更に本発明により、あらかじめ定められた検出用の塩基配列を分子内に複数コピー含有するＤＮＡで標識された目的物を提供する。当該ＤＮＡとしては、あらかじめ定められた検出用の塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物であってもよい。また当該ＤＮＡはあらかじめ定められた検出用の塩基配列を分子内に複数コピー含有するＤＮＡと、あらかじめ定められた検出用の塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物であってもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、目的物を標識し、短時間で簡便に当該標識物を確認する事が可能であり、更に真贋判定等が求められる場所において、ＤＮＡに基づく確認や認証を行うことが可能となる。また当該方法は、温度を厳密に制御するためのサーマルサイクラーを必要とせず、恒温槽とハンディトランスイルミネーターがあれば実施可能である。従って、目的物を確認したい場所で実施可能な真贋判定方法としても有用である。すなわち本発明により、品質保証性が確立した被標識目的物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】リアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ増幅・検出曲線を示す。
【図２】リアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ増幅・検出曲線を示す。
【図３】本発明の確認方法における蛍光値の向上を示すグラフである。
【図４】本発明の確認方法の一態様の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書において「分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ」とは、あらかじめ定められた検出用の塩基配列が並列して複数コピー存在するＤＮＡのことを言う。当該コピーは、同一分子内に存在しているＤＮＡが含まれる。特に限定はされないが、例えば、前記の「あらかじめ定められた塩基配列」が複数個、同じ向きで直接並んだもの、交互に対向しているもの、あるいはランダムな向きで並んだものが挙げられる。また、任意の塩基配列を介して同じ向き、交互に対向、あるいはランダムな向きに並んだものも、本明細書でいう「分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ」に包含される。
【００２０】
本明細書において「あらかじめ定められた塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物」とは、あらかじめ定められた検出用の塩基配列が並列、対向又はランダムに複数コピー存在するＤＮＡであって、前記コピー数が異なるＤＮＡが少なくとも２種類含有されるもののことを言う。特に限定はされないが、例えば、「ラダーＤＮＡ（ラダータイプＤＮＡ）」が挙げられる。当該ラダーＤＮＡは、電気泳動等により分析した場合に複数のバンドからなるラダー形態の泳動像を与えるものをいう。更に、電気泳動等により明確なバンドを示さない（スメア状態を呈する）ものも含まれる。
【００２１】
本明細書において「分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物」とは、上記「分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ」あるいは「あらかじめ定められた塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物」に、更にあらかじめ定められた塩基配列を含有しない、すなわち異なる非検出用塩基配列を含有するＤＮＡを添加したもののことを言う。この異なる塩基配列を含有するＤＮＡは特に限定はされないが、例えば、あらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと全く異なる塩基配列を含有するＤＮＡ、又は一部塩基配列が類似するが、あらかじめ定められた塩基配列に基づいて検出や解析することができないＤＮＡが好ましい（本明細書において「ダミーＤＮＡ」という場合がある）。また、当該ＤＮＡは電気泳動において単一バンドで得られるもの、ラダー形態のもの又はスメア状態のもののいずれであってもよく、ウシ胸腺ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡやそれらの分解物のようなものであってもよい。本発明に使用される「分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ」の当該ＤＮＡで標識された物品からの単離を困難もしくは不可能としうるＤＮＡは、本発明においてダミーＤＮＡとして用いることができる。
【００２２】
本明細書において「シングルＤＮＡ（シングルタイプＤＮＡ）」とは、分子内に１コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡであることを言う。
【００２３】
本明細書において「等温核酸増幅法」とは、等温で実施可能な核酸増幅方法である。例えば、鎖置換型増幅（ＳＤＡ；Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法あるいは種々の改良ＳＤＡ法等が挙げられる。これらの等温核酸増幅法又はオリゴヌクレオチド合成法の反応においては、プライマーの伸長や、一本鎖伸長生成物（又は元の標的配列）へのプライマーのアニーリングや、それに続くプライマーの伸長は、一定温度で保温された反応混合物中で同時に起こる。
【００２４】
本明細書において「Ｃｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ」とは、サイクリングプローブ反応（ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｒｏｂｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、例えば米国特許第５，６６０，９８８号公報）とＩＣＡＮ法（例えば、国際公開第００／５６８７７号パンフレット）を組み合わせた検出方法である。
【００２５】
ＩＣＡＮ法とは、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、及びＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドが該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；及び
（ｂ）鋳型となる核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びにエンドヌクレアーゼによる伸長鎖の切断反応が行える一定の温度条件で増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含する核酸の増幅方法である。例えば５５〜７０℃で活性を示すＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨを使用することにより、前記の温度範囲内の等温条件で標的ＤＮＡを増幅することができる。
【００２６】
サイクリングプローブ反応とは、標的ＤＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡとＤＮＡからなるキメラプローブと、ＲＮａｓｅＨとの組み合わせによる検出法である。標的ＤＮＡにハイブリダイズしたキメラプローブのＲＮＡ部分はＲＮａｓｅＨにより切断されることから、このキメラプローブ分解産物が標的ＤＮＡ検出の指標となる。
【００２７】
本発明の標識方法は、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた検出用の塩基配列を含有するＤＮＡ（以下、本発明の標識用ＤＮＡと記載することがある）で目的物を標識する方法を言う。
【００２８】
本発明の標識方法で用いる分子内に複数コピーのあらかじめ定められた検出用の塩基配列を含有するＤＮＡ及び／又は非検出用のダミーＤＮＡは、例えば、核酸増幅用プライマーがアニーリングする部分のみ共通の塩基配列であってもよい。また、一対のプライマー間のアンプリコンサイズと塩基組成比率とが同じであるように設計されたものであってもよい。ダミーＤＮＡを人為的に入れることで、本発明の標識用ＤＮＡを単離し、その塩基配列の情報が抽出されるのを防ぐことが可能である。また、ダミーＤＮＡは検出の対象となるＤＮＡと同量もしくは過剰に添加することが好ましい。更に試料中の本発明の標識用ＤＮＡとダミーＤＮＡは、前記標識用ＤＮＡのあらかじめ定められた塩基配列の全長とダミーＤＮＡの塩基配列の全長がほぼ同じものが好ましい。この場合、本発明の標識用ＤＮＡとダミーＤＮＡの重量比で２倍以上、好ましくは５倍以上、更に好ましくは１０倍以上、更に１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上とすることが可能である。また、モル比の場合でも２倍以上、好ましくは５倍以上、更に好ましくは１０倍以上、更に１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上とすることが可能である。驚くべきことに、本発明者らは、ダミーＤＮＡの添加は本発明の標識用ＤＮＡの単離や特定を困難にすることができるだけでなく、本発明の標識用ＤＮＡの検出感度の向上にも寄与する事を見出した。
【００２９】
本発明の標識用ＤＮＡに含有される「あらかじめ定められた塩基配列」の由来は特に限定はされないが、例えばヒト、動物、植物、微生物などの各生物種のＤＮＡの配列から選択したものが挙げられる。また、あらかじめ定められた暗号化の規則にしたがって人為的に作成した塩基配列、もしくは他の生物種のＤＮＡと相同性（同一性）が低い又は他の生物種にない人為的に作成した塩基配列を使用してもよい。
【００３０】
本発明の標識用ＤＮＡの調製は、増幅領域が連なったラダー形態のＤＮＡを調製可能な種々の方法で実施することができる。例えば、ＲＣＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法等が挙げられる。特に好ましくは、増幅領域が複数個、任意の塩基配列を介していずれも同じ向きに重合した状態となり、電気泳動による増幅産物の解析ではラダー形態のバンドとして確認されるＤＮＡが調製可能な核酸増幅方法が好ましく、ＩＣＡＮ法やＢａｃｉｌｌｕｓ ｃａｒｄｏｔｅｎａｘ由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ）を用いた核酸増幅方法が好適に使用できる。また、適切な塩基配列を設計して人工合成する方法、人工合成したＤＮＡを酵素的に連結する方法等により調製してもよい。更に、核酸分解酵素の作用に耐性を有するようなＤＮＡ（修飾塩基やホスホロチオエート結合を含有するＤＮＡ、末端修飾されたＤＮＡ等）としてもよい。
【００３１】
本発明の標識用ＤＮＡの使用量としては、目的物の標識が行え、確認ができる量であれば特に限定はないが、例えば増幅・検出時間を１０分間とした場合、１００ｐｇ〜１μｇの範囲、好ましくは１ｎｇ〜１００ｎｇの範囲、更に好ましくは２ｎｇ〜２０ｎｇの範囲である。
【００３２】
本発明者らは、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ断片を増幅した場合に、従来の方法、すなわち上記のシングルタイプＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ断片を増幅した場合に比べて、反応初期のＤＮＡ断片の増幅量が顕著に多く、鋳型の有無を短時間で判定できることを見出した。
【００３３】
検出の標的となる核酸（標的核酸）の存在の有無を確認するために、蛍光標識プローブや核酸インターカレーター等でＤＮＡ断片の増幅量をモニターする方法が知られている。当該方法においては、ＤＮＡ断片の増幅に伴って反応液より発せられる蛍光の値が特定の閾値を超えるか否かによって、標的核酸の有無を判定できる。標的核酸を鋳型としたＤＮＡ断片の反応初期の増幅量が多ければ、蛍光値が閾値を超えるまでに要する時間が短縮され、標的核酸の存在の有無を早期に判定することが可能となる。なお、上記の閾値は、通常、陽性検体を陰性検体と区別可能な任意の値が設定されるが、特定のアルゴリズムや計算式に基づいて設定されてもよい。このように、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡを使用する本発明の標識方法は、従来の方法と比較して、当該ＤＮＡの検出を短時間で実施することが可能である。
【００３４】
本発明の標識用ＤＮＡとして使用されるラダーＤＮＡの調製方法は、増幅領域が連なったラダー形態の増幅産物を積極的に生成させることにより実施することができる。このようなラダー形態の増幅産物は増幅領域が複数個、任意の塩基配列を介していずれも同じ向きに重合したものであり、電気泳動による増幅産物の解析ではラダー状のバンドとして確認される。
【００３５】
当該ラダー形態の増幅産物は、国際公開第２００５／０５６７９０号パンフレットに記載のとおり、下記の工程により調製することができる：
（Ａ）下記（ａ）又は（ｂ）から選択される反応混合物を調製する工程、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種類のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、及びＲＮａｓｅＨ、
（ｂ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、及びＲＮａｓｅＨ、ここで、一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーはラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーとして作用し、
ここで、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されており、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に相補的な第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型となる核酸の塩基配列に相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも２種類を含んでおり、
上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域及び／又はその領域より３’側の塩基配列に相補的な配列を有し、鋳型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側の塩基配列、鋳型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な領域の５’末端より更に５’側方向の領域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な配列を５’側に有し、
及び
（Ｂ）鋳型となる核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びにＲＮａｓｅＨによる伸長鎖の切断反応が行える一定の温度条件でラダー形態の増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程。
【００３６】
本方法によるラダー形態の増幅産物の調製は、適切なラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの設計による他、鋳型となる核酸上にある塩基配列を利用して実施することができる。特に限定はされないが例えば、設定しようとする一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある塩基配列が、設定しようとするもう一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある塩基配列と相補的である場合、上記配置でキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、効率よくラダー形態の増幅産物を得ることができる。また、ラダー形成を行うことにより、検出感度及び検出速度が向上する。
【００３７】
上記鋳型となる核酸上の双方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある、相補的な塩基配列は、そのＧＣ含量、その近接する配列、プライマーとの距離、増幅される長さ、反応条件等によって任意に設定することができ、特に限定するものではないが、例えば３塩基以上、好ましくは６塩基以上の相補的な塩基配列から選択することが好ましい。また当該配列は、特に限定するものではないが、例えば上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端を０位とした場合、＋２０〜−１００の領域、好ましくは＋１５〜−８０の領域、更に好ましくは＋１０〜−６０の領域、特に好ましくは＋５〜−４０の領域である。更に鋳型となる核酸上の双方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側、あるいはその上流にある配列の相補性は、当然、上記記載の条件によって任意に設定することができ、特に限定するものではないが、７０％以上の範囲が好適である。
【００３８】
本発明の標識方法は、目的物の真贋を判定するための標識方法として利用することもできる。すなわち、真正品を本発明の方法で標識することにより、真正品と標識されていない偽物とを区別することができる。下記実施例に記載のとおり、ラダーＤＮＡ形態の本発明の標識用ＤＮＡ（標識用ラダーＤＮＡ）及びダミーラダーＤＮＡの組み合わせは、シングルタイプＤＮＡ及びダミーラダーＤＮＡの組み合わせよりも、短時間の増幅・検出に好適である。
【００３９】
また、本発明の標識方法における目的物の標識の形態としては、本発明の標識用ＤＮＡを含むＤＮＡ混合物が付着可能で、かつ前記ＤＮＡ混合物を安定に保持できる担体を使用する方法が例示される。例えば、前記ＤＮＡ混合物を付着させたニトロセルロース、プラス荷電された若しくは荷電されていないナイロン、紙、カード、木材、プラスチック材料、布、金属、ガラス、セラミック、粘土類、ビーズ又はゲル状の有機材料、又は無機材料等の担体を目的物に付加する標識形態であってもよい。本発明の一態様では、前記の担体自体が標識される目的物となりうる。更に上記担体には、ＤＮＡ混合物を分解から保護するよう紫外線吸収剤又は紫外線散乱剤のいずれかを含ませてもよい。前記紫外線吸収剤には、例えばベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤類やベンゾフェノン系紫外線吸収剤類、サリチル酸エステル系紫外線吸収剤類など、市販されているものの中から適宜選択して使用する。また、紫外線散乱剤には例えば微粒子の酸化チタンや酸化亜鉛が使用できる。ＤＮＡ分解酵素に対する阻害剤を含有させることもできる。更に当該担体の表面は、その部分ないし全体を保護層で覆うことができる。保護層には紫外線吸収剤を添加してもよい。当該保護層としては、ラミネートコーティングのようにプラスチック樹脂などが好適に使用でき、熱や酸・アルカリによる分解を妨げ、ＤＮＡ混合物をより確実に保護することができる。また、ＤＮＡ混合物が担体から分離するのを防止できるので、それだけ確実にＤＮＡを回収することができ、検出精度を向上させることができる。
【００４０】
本発明の標識方法では、特に限定はされないが、標識用ＤＮＡは複数種類の混合物であってもよいし、ダミーＤＮＡも複数種類の混合物であってもよい。この場合、複数種類のあらかじめ定められた塩基配列の異なる標識用ＤＮＡに対してそれぞれを検出するプローブを用いることにより、あらかじめ定められた塩基配列の異なる標識用ＤＮＡ間の濃度比率（例えば、標識用ＤＮＡ１と別の標識用ＤＮＡ２の混合物における１と２の濃度比率を蛍光値で判断する）も目的物の確認のための指標とすることができる。
【００４１】
本発明の目的物の確認方法は、本発明の方法で標識した目的物から当該本発明の標識用ＤＮＡ、もしくは当該ＤＮＡを含むＤＮＡ混合物を抽出し、「あらかじめ定められた塩基配列」に基づいて当該ＤＮＡを検出することにより実施される、所望により、検出に先立って本発明の標識用ＤＮＡもしくはその一部の領域を増幅する工程を含んでもよい。好適な態様においては、等温核酸増幅法、例えば国際公開第００／５６８７７号パンフレットに記載されたＩＣＡＮ法によりＤＮＡの増幅が実施される。
【００４２】
例えば、標識された目的物から本発明の標識用ＤＮＡを含む担体を取得する。この担体より適切な溶液、例えば水や緩衝液を用いてＤＮＡの抽出を行う。例えばイオン性又は非イオン性の界面活性剤とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム水塩を含む緩衝液（トリス塩酸緩衝液等）を用いてもよい。また、抽出操作の際には撹拌のような適当な物理的刺激を与えて抽出してもよいし、加熱処理を行ってもよい。その後、必要に応じて、ＤＮＡの精製操作、ＤＮＡ濃縮操作を行ってもよい。ＤＮＡの精製・濃縮には公知の方法を用いる事ができる。
更に、標識された目的物の種類によっては全く抽出操作をせず、取得された前記の担体をそのまま後の検出工程に供してもよい。
【００４３】
必要に応じ、抽出された本発明の標識用ＤＮＡを鋳型として、あらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ断片を増幅する。当該ＤＮＡ断片を増幅する際、本発明においては、ラダー形態で増幅させる方法が好適である。
【００４４】
上記ラダー形態の増幅産物は、増幅領域を複数個含むものであるので、例えば適切なプローブとのハイブリダイゼーションによって多数のプローブとハイブリダイズすることが可能である。当該プローブとしては、前記の「あらかじめ定められた塩基配列」及び／又は上記ラダー形態の増幅産物中の標的核酸配列間に存在する介在配列にハイブリダイズするもののいずれもが好適に使用できる。また、当該プローブとしては、増幅産物とのハイブリダイズの結果、蛍光等のシグナルを示すものが好適に使用できる。このようなプローブは、標識用ＤＮＡを鋳型として増幅した増幅産物が存在した場合に強いシグナルを発生することから、増幅領域を含む核酸の検出を目的とする場合に有用である。また、制限酵素消化等を組み合わせて、ラダー形態の増幅産物より増幅領域、又はその一部をモノマーとして得ることもできる。
【００４５】
好適な態様では、ラダー形態のＤＮＡの増幅と「あらかじめ定められた塩基配列」の検出を同時に実施することができる。例えば、前記のＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ法を利用できる。この場合、（ａ）少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置された少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、標的ＤＮＡ上の特定の塩基を含む領域を増幅できるプライマー、（ｂ）標的ＤＮＡ上の前記特定の塩基を含む領域にハイブリダイズすることができ、かつ標的ＤＮＡとハイブリダイズした場合にＲＮａｓｅＨによる切断を受けるプローブ、（ｃ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｄ）ＲＮａｓｅＨ、を含有する組成物を用いて確認することが可能である。この場合、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｔＤＮＡポリメラーゼが好適である。検出には、サイクリングプローブ法以外の方法、例えばモレキュラービーコン法を用いてもよい。これら増幅・検出の反応条件は使用するプライマーやプローブの鎖長、塩基組成等をもとに適宜設定すればよい。
【００４６】
上記方法においては、国際公開第２００５／０５６７９０号パンフレットに記載されたラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、増幅領域が連なった重合体を生成させることができる。このようなラダー形態の増幅産物は、複数個の増幅領域がラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーと第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流領域に相補的な配列を介して同じ向きに連なったものである。更に本発明の方法においては、鋳型となる核酸上の一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある塩基配列がもう一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある塩基配列と相補的な場合、当該位置にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、標的核酸を感度良く検出することができる。
【００４７】
上記のサイクリングプローブ法やモレキュラービーコン法で用いるプローブは、例えば、蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質の両者で、適当な間隔をとって標識したものがよい。このようなプローブはインタクトな状態ではほとんど蛍光を発することはないが、標的配列へのハイブリダイゼーション又は切断によって蛍光を発するようになる。当該物質の組合わせとしては、６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＤＡＢＣＹＬ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ−４’−ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＲＯＸ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）とＤＡＢＣＹＬ、６−ＦＡＭとＥｃｌｉｐｓｅ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＲＯＸとＥｃｌｉｐｓｅ、ＴＥＴ（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＤＡＢＣＹＬ、ＴＥＴとＥｃｌｉｐｓｅ等が好適に使用できる。このようなプローブを使用することにより、反応中の反応液を直接観察することによって本発明の標識用ＤＮＡの有無を確認することが可能である。当該方法は、特に短時間で標識用ＤＮＡを高感度に検出できるという優れた効果を奏する。このような標識プローブとハンディトランスイルミネーターのような紫外線照射装置を用いることにより、蛍光検出器、写真、あるいは肉眼で検出操作を行うことができる。例えば、恒温槽部分、励起光照射部分、蛍光モニター部分を備えた装置を用いれば、本発明の方法で標識された目的物の確認を現場、すなわち十分な設備を備えた施設以外の場所で、かつ短時間に実施することができる。
【００４８】
ＩＣＡＮ法とサイクリングプローブ法とを組み合わせた本発明の態様では、検出で使用する蛍光標識プローブの濃度は、例えば０．３μＭ〜１μＭの範囲、好ましくは、０．４μＭ〜０．８μＭの範囲である。前記濃度範囲のプローブを用いることにより、増幅・検出時間は、２０分以下、好ましくは１５分以下、特に好ましくは、１０分以下で実施することができる。なお、標識した担体からの標識用ＤＮＡの抽出効率が低い場合は、それに合わせて前記蛍光標識プローブ濃度を調整するのは当然のことである。
【００４９】
本発明の方法において、増幅・検出の際に、本発明の標識用ＤＮＡのみを増幅してもよいし、前記標識用ＤＮＡ及びダミーＤＮＡの両方を増幅してもよい。ダミーＤＮＡとして本発明の標識用ＤＮＡの増幅に使用されるものと同一のプライマー対で増幅されるものを使用してもよい。この場合、蛍光標識プローブは標識用ＤＮＡ中の標的配列にのみ完全にハイブリダイズ及び／又は切断によって蛍光を発することにより、検出が可能であることから、仮にプライマー配列に関する情報が漏洩しても、本発明の標識用ＤＮＡを単離もしくは特定することは困難である。また、増幅・検出後の産物を第３者が入手したとしても、その中の増幅された標識用ＤＮＡは、同様に増幅されたダミーＤＮＡの存在のために特定が困難である。
【００５０】
更に本発明の方法においては、ダミーＤＮＡの存在により、本発明の標識用ＤＮＡの検出強度が向上するという予想外の効果が奏される。言い換えれば、検出反応系内のダミーＤＮＡの存在により、ダミーＤＮＡに由来するバックグラウンド値の上昇ではなく、標識用ＤＮＡを鋳型とした増幅産物を検出するための蛍光値の向上が見られる。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例をもって本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに何ら限定されるものではない。なお、本発明においてＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、特許第２９７８００１号に記載の方法で調製した。また、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｈ（以下、Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ）は、国際公開第０２／２２８３１号パンフレットに記載の方法で調製した。
【００５２】
実施例１
（１）シングルタイプＤＮＡの調製
配列番号１〜４記載の塩基配列を有するプライマー、シロイヌナズナＤＮＡ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標、タカラバイオ社製）及びその添付試薬を用い、添付取扱説明書に従って５０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。当該反応液を９４℃ ２分加熱後、続けて９４℃ ３０秒、５４℃ ３０秒、７２℃ １分を１サイクルとする３０サイクル反応に供した。配列番号１及び２記載の塩基配列を有するプライマーからは、Ａｒａｂ０３ＤＮＡ断片、配列番号３及び４記載の塩基配列を有するプライマーからは、Ａｒａｂ０６（Ｕ）ＤＮＡ断片が増幅される。反応終了後、イソプロパノール沈殿精製を行い、吸光度測定によりＤＮＡ濃度を算出した。以降の実験では、このＤＮＡをシングルタイプＤＮＡとして用いた。
【００５３】
（２）ラダータイプＤＮＡの調製
上記（１）で調製したＡｒａｂ０３ＤＮＡ断片 １０ｐｇを鋳型とし、Ａ３ＩＦ４キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ３ＩＦ４プライマー：配列番号５）及びＡ３ＩＲ４キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ３ＩＲ４プライマー：配列番号６）をそれぞれ２０ｐｍｏｌ、３２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ ＤＭＳＯ、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．６ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、０．０４％ プロピレンジアミン、０．１１％ ＢＳＡ、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ ２２Ｕ、Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ １００Ｕを含む、２５μＬの反応液を調製した。ＩＣＡＮ反応は、６０℃、６０分間の条件で行った。反応終了後、反応液５μＬを２％アガロース電気泳動に供し、増幅産物が約１６０ｂｐを１単位とするラダー形態の増幅産物（ラダーＤＮＡ）になっていることを確認した。
【００５４】
得られたラダーＤＮＡの中から約４８０ｂｐの断片をアガロースゲルから抜き出し、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ社製）のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした。こうして得られたプラスミドをｐＵＡ３３プラスミドと命名した。次に、前記ｐＵＡ３３プラスミド １ｎｇを鋳型とし、前記Ａ３ＩＦ４プライマー及びＡ３ＩＲ４プライマーを用いて、前記のＩＣＡＮ反応条件でラダーＤＮＡ（Ａ３ラダーＤＮＡ）を増幅した。反応終了後、反応液５μｌを２％アガロース電気泳動に供し、増幅産物が約１６０ｂｐを１単位とするラダー形態の増幅産物になっていることを確認した。
【００５５】
次に、上記（１）で調製したＡｒａｂ０６（Ｕ）ＤＮＡ断片 １ｎｇを鋳型とし、Ａ６ＩＦ９キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ６ＩＦ９プライマー：配列番号７）及びＡ６ＩＲ８キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ６ＩＲ８プライマー：配列番号８）をそれぞれ２０ｐｍｏｌ用いて、前記反応条件でラダーＤＮＡを増幅した。反応終了後、増幅産物が約１３０ｂｐを１単位とするラダー形態の増幅産物（ラダーＤＮＡ）になっていることを確認した。
【００５６】
得られたラダーＤＮＡの中から約３９０ｂｐの断片をアガロースゲルから抜き出し、ｐＵＣ１１８ベクターのＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした。こうして得られたプラスミドをｐＵＡ６３プラスミドと命名した。次に前記ｐＵＡ６３プラスミド １ｎｇを鋳型として前記Ａ６ＩＦ９プライマー及びＡ６ＩＲ８プライマーをそれぞれ２０ｐｍｏｌ用いて、前記反応条件でラダーＤＮＡ（Ａ６ラダーＤＮＡ）を増幅した。反応終了後、反応液５μＬを２％アガロース電気泳動に供し、増幅産物が約１３０ｂｐを１単位とするラダー形態の増幅産物になっていることを確認した。
【００５７】
こうして得られたＡ３ラダーＤＮＡ及びＡ６ラダーＤＮＡは、イソプロパノール沈殿で精製後、吸光度測定によりＤＮＡ濃度を算出した。これ以降の実験では、この２種類のＤＮＡをラダータイプＤＮＡとして用いた。
【００５８】
実施例２ 標識用ＤＮＡの選定
（１）シングルタイプＤＮＡとラダータイプＤＮＡの比較
実施例１で調製したシングルタイプＤＮＡ又はラダータイプＤＮＡを鋳型としてＩＣＡＮ法とサイクリングプローブ法とを組み合わせたリアルタイム検出を行った（以下リアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応と記載する）。測定結果から検出時間と増幅曲線の関係について比較を行った。Ａｒａｂ０３ＤＮＡ及びＡ３ラダーＤＮＡ 各１５ｎｇをそれぞれ鋳型として、Ａ３ＩＦ５キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ３ＩＦ５プライマー：配列番号９）及びＡ３ＩＲ３キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ３ＩＲ３プライマー：配列番号１０）を各２０ｐｍｏｌとＡ３プローブ２（配列番号１１）を５ｐｍｏｌ用いて、２５μＬの容量の反応液を調製した。前記Ａ３プローブ２は、Ａｒａｂ０３ＤＮＡ及びＡ３ラダーＤＮＡ中の塩基配列にハイブリダイズするプローブであって、その５’末端側にクエンチャーとなるエクリプス（登録商標、エポック バイオサイエンシズ社製）、その３’末端側にレポーターとなるＲｏｘ（登録商標、アプライド バイオシステムズ社製）を有している。反応液組成は、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、プローブ以外は、実施例１記載と同様とした。
【００５９】
こうして調製した反応液をＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）にセットし、６０℃、６０分間反応させた。その検出結果を図１に示す。すなわち図１は、リアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ法による増幅・検出曲線であり、縦軸は、蛍光値、横軸は時間を示す。この結果より、同じ鋳型量の場合、シングルタイプＤＮＡよりラダータイプＤＮＡの方が短時間で増幅・検出曲線が立ち上がることが明らかとなった。このことから、短時間での検出にはラダータイプＤＮＡが適していることが明らかとなった。
【００６０】
（２）ダミーラダーＤＮＡとの組み合わせの比較
実施例１−（１）で調製したＡｒａｂ０３由来の塩基配列を有するシングルタイプＤＮＡ（Ａｒａｂ０３ＤＮＡ）又は実施例１−（２）で調製したラダータイプＤＮＡ（Ａ３ラダーＤＮＡ）に、ダミーＤＮＡとして実施例１−（２）で調製したＡｒａｂ０６由来の塩基配列を有するラダータイプＤＮＡ（Ａ６ラダーＤＮＡ）を混合したものを鋳型としてリアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応を行い、検出時間と増幅曲線の関係について比較を行った。Ａｒａｂ０３ＤＮＡ及びＡ３ラダーＤＮＡ 各２０ｎｇに対し、１０倍量のＡ６ラダーＤＮＡを混合したものをそれぞれ鋳型として、前記実施例２−（１）の反応条件でリアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応を行った。その検出結果を図２に示す。すなわち図２は、リアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ法による増幅・検出曲線であり、縦軸は、蛍光値、横軸は時間を示す。この結果より、ダミーＤＮＡの添加の有無で増幅曲線はほとんど変わらないことが明らかとなった。すなわち、短時間での検出において、標識用ＤＮＡに対してダミーＤＮＡが多く存在している場合でも、標識用ＤＮＡとしてはシングルタイプＤＮＡよりラダータイプＤＮＡが適していることが確認できた。更に、当該蛍光値から、６分〜１５分の範囲、例えば１０分間の反応時間で十分に検出できることが明らかとなった。
【００６１】
（３）判別用ＤＮＡの蛍光値に対するダミーＤＮＡ（ダミーラダーＤＮＡ）の影響
上記実施例２−（２）の実験結果を踏まえ、標識用ラダーＤＮＡの蛍光値に対するダミーラダーＤＮＡの影響について検討した。すなわち、Ａ３ラダーＤＮＡ ２０ｎｇに対し、１０倍量又は１００倍量のＡ６ラダーＤＮＡを混合したものを鋳型として、前記実施例２−（１）の反応条件でリアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応を行った。なお、増幅・検出時間１０分間と設定した。その結果の蛍光値を表１に示した。
【００６２】
【表１】
【００６３】
表１は、増幅・検出時間が１０分間の場合の蛍光値を示している。この結果から、標識用ラダーＤＮＡに対しダミーラダーＤＮＡの濃度が上がるに従い、バックグラウンド値の上昇ではなく、標識用ラダーＤＮＡに起因する蛍光値の増加が見られた。一方、標識用ラダーＤＮＡとダミーラダーＤＮＡの濃度を上記と同じにしたサンプルについて、実施例２−（１）で使用されたプライマーと同じ塩基配列を有するＤＮＡプライマーを用いたリアルタイム ＰＣＲを行ったところ、ダミーラダーＤＮＡの濃度が上がるに従い、標識用ラダーＤＮＡに起因する蛍光値は下降する傾向であった。
【００６４】
次に、上記Ａ３ラダーＤＮＡ ２ｎｇに対し、等量〜１０００倍量のＡ６ラダーＤＮＡを混合したものを鋳型として、前記実施例２−（１）の反応条件でリアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応を行った。なお、増幅・検出時間は１０分間と設定した。その結果を図３に示す。すなわち図３は、標識用ラダーＤＮＡの蛍光値の向上傾向を示すグラフであり、縦軸は蛍光値、横軸は標識用ラダーＤＮＡに対するダミーラダーＤＮＡの比率を示す。また、図３の縦軸の値は、標識用ラダーＤＮＡの蛍光値から、共存するダミーラダーＤＮＡ自体の蛍光値（バックグラウンドの蛍光値）を差し引いた値で示している。
【００６５】
図３から明らかなように、標識用ラダーＤＮＡと等量のダミーラダーＤＮＡを添加した場合に比べ、１００倍量、５００倍量、１０００倍量添加した場合においても、標識用ラダーＤＮＡに起因する蛍光値の増加が確認できた。すなわち、本発明の方法においては、標識用ラダーＤＮＡに対してダミーラダーＤＮＡの濃度を多くすることにより、バックグラウンド値の上昇ではない標識用ラダーＤＮＡに起因する蛍光値の向上が起きるということに加え、更にダミーラダーＤＮＡの濃度を上げることにより、標識用ＤＮＡの塩基配列解析をより高いレベルで防止できることが確認できた。
【００６６】
実施例３
（１）担体からの抽出操作の省略
目的物を標識した担体から複雑な操作なく短時間でＤＮＡを検出できるかどうかを検討した。まず、モデル実験系として、実施例１−（２）で調製したＡ３ラダーＤＮＡ １００ｎｇをＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ マイクロカード（ワットマン社製）にスポットし、風乾した。その後、前記カードからスポット部分を切り出した後、実施例２−（１）記載と同じ組成のＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応液 １２５μＬで、プローブ濃度が０．２μＭ〜０．８μＭの反応液を調製し、６０℃、１０分間静置した。
【００６７】
ネガティブコントロールとしてＤＮＡをスポットしていないカードを同じ面積分切り出し、同様の反応を行った。反応終了後、各チューブにＵＶを照射したところ、Ａ３ラダーＤＮＡをスポットしたカード断片を含むチューブでは０．４μＭ〜０．８μＭとプローブ濃度が増すに従い、反応チューブ内に肉眼で十分確認できる蛍光が発せられた。これらの蛍光のネガティブコントロールとの差は肉眼で確認することができた。
【００６８】
（２）担体からの抽出操作の省略２
次に、標識用ラダーＤＮＡとして実施例１−（２）で調製したＡ３ラダーＤＮＡ １００ｎｇとダミーラダーＤＮＡとして実施例１−（２）で調製したＡ６ラダーＤＮＡ １μｇの混合液、Ａ３ラダーＤＮＡ １００ｎｇの溶液、及びＡ６ラダーＤＮＡ １μｇの溶液のそれぞれ１μＬをＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ マイクロカード（ワットマン社製）にスポットし、風乾した。その後、スポット部分を切り出し、上記実施例２−（１）に記載の方法でプローブ濃度が０．８μＭのＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応を各２本ずつ行った。また、ネガティブコントロールとしてＤＮＡをスポットしていないカードを同じ面積分切り出し、上記と同様の反応を２本行った。これらの反応チューブをＵＶ照射した結果を図４に示す。すなわち図４は、ハンディトランスイルミネーターを用いてＵＶ照射を行った反応チューブの写真であり、チューブ１、２はネガティブコントロール、チューブ３、４はＡ３ラダーＤＮＡ １００ｎｇのみ、チューブ５、６はＡ３ラダーＤＮＡ １００ｎｇとＡ６ラダーＤＮＡ １μｇの混合液、チューブ７、８はＡ６ラダーＤＮＡ １μｇのみの反応液である。図中、標識用ＤＮＡが標識用ラダーＤＮＡを示し、ダミーＤＮＡがダミーラダーＤＮＡを示す。
【００６９】
図４に示すように、標識用ラダーＤＮＡ及びダミーラダーＤＮＡがない場合及びダミーラダーＤＮＡのみの場合のチューブでは蛍光は見られない。また、標識用ラダーＤＮＡ量が同じであるにも関わらず、標識用ラダーＤＮＡ単独の場合に比べダミーラダーＤＮＡが共存する方が蛍光値が増加していることが確認できた。更に標識用ラダーＤＮＡ単独の反応チューブよりもダミーラダーＤＮＡが共存する反応チューブの方が、反応チューブ内の蛍光がハッキリとしており、肉眼で容易に確認できた。このことから、上記方法で判定を求められる場所で目的物を標識した担体から複雑な操作なしで、少なくとも１０分間で標識用ＤＮＡの検出を肉眼で行える系を構築できた。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、判定が求められる現場において、ＤＮＡをベースとした判定を短時間で実施することができる。また本発明は、プローブハイブリダイゼーションに基づくため、非常に精度の高い判別方法を実施することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
SEQ ID NO:1 ; Primer F to amplify the Arab03 DNA fragment.
SEQ ID NO:2 ; Primer R to amplify the Arab03 DNA fragment.
SEQ ID NO:3 ; Primer F to amplify the Arab06(U) DNA fragment.
SEQ ID NO:4 ; Primer R to amplify the Arab06(U) DNA fragment.
SEQ ID NO:5 ; A3IF4 chimeric primer to amplify the Arab03 DNA fragment using ICAN method. 3 bases of 3' end are RNA.
SEQ ID NO:6 ; A3IR4 chimeric primer to amplify the Arab03 DNA fragment using ICAN method. 3 bases of 3' end are RNA.
SEQ ID NO:7 ; A6IF9 chimeric primer to amplify the Arab06(U) DNA fragment using ICAN method. 3 bases of 3' end are RNA.
SEQ ID NO:8 ; A6IR8 chimeric primer to amplify the Arab06(U) DNA fragment using ICAN method. 3 bases of 3' end are RNA.
SEQ ID NO:9 ; A3IF5 chimeric primer to amplify the Arab03 DNA fragment using ICAN method. 3 bases of 3' end are RNA.
SEQ ID NO:10 ; A3IR3 chimeric primer to amplify the Arab03 DNA fragment using ICAN method. 3 bases of 3' end are RNA.
SEQ ID NO:11 ; A3 probe 2. 9th base is RNA.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡを用いた目的物の標識方法及び当該標識方法により標識された目的物の確認方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高度なコンピューター技術等を用いた種々の模造品や模倣品が市場に流出し、純正品や正統品が被害を受けるケースが増大している。例えば、有名ブランド商品の偽物の販売、有価証券や紙幣の偽造の他、特に最近では商品ラベルの改ざんによる食品の不正流通が問題となっている。このような状況の中で、目的物の確認及び判定方法として開発された技術の１つが、ＤＮＡを用いて認証を行う「ＤＮＡインク」や「ＤＮＡタグ」技術である。
【０００３】
これらは、（１）天然資源、例えば動物、植物、油、鉱物及び水、（２）化学物質、例えば薬剤、溶媒、石油生成物、及び爆薬物、（３）汚染物質を含む商業上の副産物、例えば放射性又はその他の危険な廃棄物、並びに（４）製品、例えば銃、タイプライター、自動車及び自動車部品を含む多数の様々な物質の製造及び流通の追跡調査に用いられている。この際、使用される標識は製品の同一性の確認に役立ち、製造者及び消費者に有用な情報を提供する（例えば、特許文献１、２）。
【０００４】
例えば「ＤＮＡインク」は、特定の塩基配列のＤＮＡを利用して、当該ＤＮＡを含むインク（ＤＮＡインク）を作製し、このＤＮＡインクを商品等への印刷に使用することで真正品の確実な確認・同定を可能とし、もって商品等の偽造や改ざんを防止する技術である（例えば、特許文献３）。
【０００５】
また、合成ＤＮＡ及び当該合成ＤＮＡと異なるＤＮＡの両者を含有する組成物を用いることで、偽造や複製をより困難とするインクや印刷物も検討されている（例えば、特許文献４）。
【０００６】
通常、上記のようなＤＮＡインクやＤＮＡタグで用いられているＤＮＡは単一の二本鎖ＤＮＡである。その確認又は判定方法は、当該ＤＮＡ試料を直接シークエンシングするか、あるいはＰＣＲ法により目的のＤＮＡを増幅後、ハイブリダイゼーションの工程を経る必要がある。しかしながら、これらの方法では、結果がでるまでに長い時間が必要である。また、結果が出る時間を短縮するために、ゲル電気泳動法のみで確認する方法が検討されているが、この場合、精度が極端に悪くなる。このため精度を上げるため、ゲル電気泳動後、目的のＤＮＡを単離し、シークエンシングもしくはＤＮＡチップ等で更に確認を行う方法も検討されているが、高度の技術と専用設備が必要であり、結局、時間もかかるという問題があった。またいずれの場合も、目的物が存在する場所で直ちに判定することができないという問題点もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３０８２９４２号公報
【特許文献２】特許第３０５９１９６号公報
【特許文献３】特開２００３−１５７００４号公報
【特許文献４】特開２００８−１８７９９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、簡便なＤＮＡを用いた目的物の標識方法及び当該標識物の確認方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡであって、当該塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物を用いる目的物の標識方法を見出した。また、前記標識に使用されるＤＮＡとして分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物を用いることにより、後の増幅及び確認（検出）工程において、通常、前記塩基配列を含有しないＤＮＡの存在により、あらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡを鋳型とした増幅産物を検出するための蛍光値が減少すると予測されるが、驚くべきことに、実際には当該蛍光値が向上することを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明の第１の発明は、目的物を標識する方法であって、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡで当該目的物を標識することを特徴とする目的物の標識方法に関する。第１の発明の態様としては、標識に使用されるＤＮＡが、当該ＤＮＡが含有するあらかじめ定められた塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物であってもよい。また、標識に使用されるＤＮＡが、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物であってもよい。
【００１１】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明で標識された目的物を確認する方法であって、標識された目的物に含有されるＤＮＡを当該ＤＮＡに含有されるあらかじめ定められた塩基配列に基づいて検出することを特徴とする目的物の確認方法に関する。第２の発明の態様としては、標識に使用されたＤＮＡを鋳型としてあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ断片を増幅する工程を包含してもよい。また、等温核酸増幅法によりＤＮＡ断片の増幅が実施されてもよい。なお、等温核酸増幅法としてはＩＣＡＮ法が挙げられる。また、当該ＩＣＡＮ法とサイクリングプローブ法を用いることにより、短時間でかつ反応時間を大幅に短縮することが可能である。
【００１２】
本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明のための標識用ＤＮＡ混合物であって、少なくとも１種類の分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、少なくとも１種類の前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物に関する。第３の発明の態様としては、１〜３種類、好ましくは１〜２種類の分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、１〜５種類、好ましくは１〜３種類の前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物である。
【００１３】
本発明は更に、目的物を標識する方法であって、あらかじめ定められた検出用の塩基配列を分子内に複数コピー含有するＤＮＡで当該目的物を標識することを特徴とする目的物の標識方法を提供する。当該ＤＮＡは、あらかじめ定められた検出用の塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物であってもよい。また当該ＤＮＡはあらかじめ定められた検出用の塩基配列を分子内に複数コピー含有するＤＮＡと、あらかじめ定められた検出用の塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物であってもよい。
【００１４】
本発明はまた、前記方法により標識された目的物を確認する方法であって、標識された目的物に含有される検出用の塩基配列を確認することを特徴とする目的物の確認方法が提供される。当該確認方法においては、あらかじめ定められた検出用の塩基配列を鋳型として増幅する工程を包含する方法が挙げられる。またその好ましい態様としては、等温核酸増幅法によりあらかじめ定められた検出用の塩基配列の増幅が実施される。
【００１５】
また本発明の標識方法のためのＤＮＡであって、少なくとも１種類のあらかじめ定められた検出用の塩基配列を分子内に複数コピー含有するＤＮＡと、少なくとも１種類のあらかじめ定められた検出用の塩基配列を含有しないＤＮＡとの標識用ＤＮＡ混合物が提供される。
【００１６】
更に本発明により、あらかじめ定められた検出用の塩基配列を分子内に複数コピー含有するＤＮＡで標識された目的物を提供する。当該ＤＮＡとしては、あらかじめ定められた検出用の塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物であってもよい。また当該ＤＮＡはあらかじめ定められた検出用の塩基配列を分子内に複数コピー含有するＤＮＡと、あらかじめ定められた検出用の塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物であってもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、目的物を標識し、短時間で簡便に当該標識物を確認する事が可能であり、更に真贋判定等が求められる場所において、ＤＮＡに基づく確認や認証を行うことが可能となる。また当該方法は、温度を厳密に制御するためのサーマルサイクラーを必要とせず、恒温槽とハンディトランスイルミネーターがあれば実施可能である。従って、目的物を確認したい場所で実施可能な真贋判定方法としても有用である。すなわち本発明により、品質保証性が確立した被標識目的物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】リアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ増幅・検出曲線を示す。
【図２】リアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ増幅・検出曲線を示す。
【図３】本発明の確認方法における蛍光値の向上を示すグラフである。
【図４】本発明の確認方法の一態様の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書において「分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ」とは、あらかじめ定められた検出用の塩基配列が並列して複数コピー存在するＤＮＡのことを言う。当該コピーは、同一分子内に存在しているＤＮＡが含まれる。特に限定はされないが、例えば、前記の「あらかじめ定められた塩基配列」が複数個、同じ向きで直接並んだもの、交互に対向しているもの、あるいはランダムな向きで並んだものが挙げられる。また、任意の塩基配列を介して同じ向き、交互に対向、あるいはランダムな向きに並んだものも、本明細書でいう「分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ」に包含される。
【００２０】
本明細書において「あらかじめ定められた塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物」とは、あらかじめ定められた検出用の塩基配列が並列、対向又はランダムに複数コピー存在するＤＮＡであって、前記コピー数が異なるＤＮＡが少なくとも２種類含有されるもののことを言う。特に限定はされないが、例えば、「ラダーＤＮＡ（ラダータイプＤＮＡ）」が挙げられる。当該ラダーＤＮＡは、電気泳動等により分析した場合に複数のバンドからなるラダー形態の泳動像を与えるものをいう。更に、電気泳動等により明確なバンドを示さない（スメア状態を呈する）ものも含まれる。
【００２１】
本明細書において「分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物」とは、上記「分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ」あるいは「あらかじめ定められた塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物」に、更にあらかじめ定められた塩基配列を含有しない、すなわち異なる非検出用塩基配列を含有するＤＮＡを添加したもののことを言う。この異なる塩基配列を含有するＤＮＡは特に限定はされないが、例えば、あらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと全く異なる塩基配列を含有するＤＮＡ、又は一部塩基配列が類似するが、あらかじめ定められた塩基配列に基づいて検出や解析することができないＤＮＡが好ましい（本明細書において「ダミーＤＮＡ」という場合がある）。また、当該ＤＮＡは電気泳動において単一バンドで得られるもの、ラダー形態のもの又はスメア状態のもののいずれであってもよく、ウシ胸腺ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡやそれらの分解物のようなものであってもよい。本発明に使用される「分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ」の当該ＤＮＡで標識された物品からの単離を困難もしくは不可能としうるＤＮＡは、本発明においてダミーＤＮＡとして用いることができる。
【００２２】
本明細書において「シングルＤＮＡ（シングルタイプＤＮＡ）」とは、分子内に１コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡであることを言う。
【００２３】
本明細書において「等温核酸増幅法」とは、等温で実施可能な核酸増幅方法である。例えば、鎖置換型増幅（ＳＤＡ；Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法あるいは種々の改良ＳＤＡ法等が挙げられる。これらの等温核酸増幅法又はオリゴヌクレオチド合成法の反応においては、プライマーの伸長や、一本鎖伸長生成物（又は元の標的配列）へのプライマーのアニーリングや、それに続くプライマーの伸長は、一定温度で保温された反応混合物中で同時に起こる。
【００２４】
本明細書において「Ｃｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ」とは、サイクリングプローブ反応（ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｒｏｂｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、例えば米国特許第５，６６０，９８８号公報）とＩＣＡＮ法（例えば、国際公開第００／５６８７７号パンフレット）を組み合わせた検出方法である。
【００２５】
ＩＣＡＮ法とは、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、及びＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドが該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；及び
（ｂ）鋳型となる核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びにエンドヌクレアーゼによる伸長鎖の切断反応が行える一定の温度条件で増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含する核酸の増幅方法である。例えば５５〜７０℃で活性を示すＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨを使用することにより、前記の温度範囲内の等温条件で標的ＤＮＡを増幅することができる。
【００２６】
サイクリングプローブ反応とは、標的ＤＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡとＤＮＡからなるキメラプローブと、ＲＮａｓｅＨとの組み合わせによる検出法である。標的ＤＮＡにハイブリダイズしたキメラプローブのＲＮＡ部分はＲＮａｓｅＨにより切断されることから、このキメラプローブ分解産物が標的ＤＮＡ検出の指標となる。
【００２７】
本発明の標識方法は、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた検出用の塩基配列を含有するＤＮＡ（以下、本発明の標識用ＤＮＡと記載することがある）で目的物を標識する方法を言う。
【００２８】
本発明の標識方法で用いる分子内に複数コピーのあらかじめ定められた検出用の塩基配列を含有するＤＮＡ及び／又は非検出用のダミーＤＮＡは、例えば、核酸増幅用プライマーがアニーリングする部分のみ共通の塩基配列であってもよい。また、一対のプライマー間のアンプリコンサイズと塩基組成比率とが同じであるように設計されたものであってもよい。ダミーＤＮＡを人為的に入れることで、本発明の標識用ＤＮＡを単離し、その塩基配列の情報が抽出されるのを防ぐことが可能である。また、ダミーＤＮＡは検出の対象となるＤＮＡと同量もしくは過剰に添加することが好ましい。更に試料中の本発明の標識用ＤＮＡとダミーＤＮＡは、前記標識用ＤＮＡのあらかじめ定められた塩基配列の全長とダミーＤＮＡの塩基配列の全長がほぼ同じものが好ましい。この場合、本発明の標識用ＤＮＡとダミーＤＮＡの重量比で２倍以上、好ましくは５倍以上、更に好ましくは１０倍以上、更に１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上とすることが可能である。また、モル比の場合でも２倍以上、好ましくは５倍以上、更に好ましくは１０倍以上、更に１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上とすることが可能である。驚くべきことに、本発明者らは、ダミーＤＮＡの添加は本発明の標識用ＤＮＡの単離や特定を困難にすることができるだけでなく、本発明の標識用ＤＮＡの検出感度の向上にも寄与する事を見出した。
【００２９】
本発明の標識用ＤＮＡに含有される「あらかじめ定められた塩基配列」の由来は特に限定はされないが、例えばヒト、動物、植物、微生物などの各生物種のＤＮＡの配列から選択したものが挙げられる。また、あらかじめ定められた暗号化の規則にしたがって人為的に作成した塩基配列、もしくは他の生物種のＤＮＡと相同性（同一性）が低い又は他の生物種にない人為的に作成した塩基配列を使用してもよい。
【００３０】
本発明の標識用ＤＮＡの調製は、増幅領域が連なったラダー形態のＤＮＡを調製可能な種々の方法で実施することができる。例えば、ＲＣＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法等が挙げられる。特に好ましくは、増幅領域が複数個、任意の塩基配列を介していずれも同じ向きに重合した状態となり、電気泳動による増幅産物の解析ではラダー形態のバンドとして確認されるＤＮＡが調製可能な核酸増幅方法が好ましく、ＩＣＡＮ法やＢａｃｉｌｌｕｓ ｃａｒｄｏｔｅｎａｘ由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ）を用いた核酸増幅方法が好適に使用できる。また、適切な塩基配列を設計して人工合成する方法、人工合成したＤＮＡを酵素的に連結する方法等により調製してもよい。更に、核酸分解酵素の作用に耐性を有するようなＤＮＡ（修飾塩基やホスホロチオエート結合を含有するＤＮＡ、末端修飾されたＤＮＡ等）としてもよい。
【００３１】
本発明の標識用ＤＮＡの使用量としては、目的物の標識が行え、確認ができる量であれば特に限定はないが、例えば増幅・検出時間を１０分間とした場合、１００ｐｇ〜１μｇの範囲、好ましくは１ｎｇ〜１００ｎｇの範囲、更に好ましくは２ｎｇ〜２０ｎｇの範囲である。
【００３２】
本発明者らは、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ断片を増幅した場合に、従来の方法、すなわち上記のシングルタイプＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ断片を増幅した場合に比べて、反応初期のＤＮＡ断片の増幅量が顕著に多く、鋳型の有無を短時間で判定できることを見出した。
【００３３】
検出の標的となる核酸（標的核酸）の存在の有無を確認するために、蛍光標識プローブや核酸インターカレーター等でＤＮＡ断片の増幅量をモニターする方法が知られている。当該方法においては、ＤＮＡ断片の増幅に伴って反応液より発せられる蛍光の値が特定の閾値を超えるか否かによって、標的核酸の有無を判定できる。標的核酸を鋳型としたＤＮＡ断片の反応初期の増幅量が多ければ、蛍光値が閾値を超えるまでに要する時間が短縮され、標的核酸の存在の有無を早期に判定することが可能となる。なお、上記の閾値は、通常、陽性検体を陰性検体と区別可能な任意の値が設定されるが、特定のアルゴリズムや計算式に基づいて設定されてもよい。このように、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡを使用する本発明の標識方法は、従来の方法と比較して、当該ＤＮＡの検出を短時間で実施することが可能である。
【００３４】
本発明の標識用ＤＮＡとして使用されるラダーＤＮＡの調製方法は、増幅領域が連なったラダー形態の増幅産物を積極的に生成させることにより実施することができる。このようなラダー形態の増幅産物は増幅領域が複数個、任意の塩基配列を介していずれも同じ向きに重合したものであり、電気泳動による増幅産物の解析ではラダー状のバンドとして確認される。
【００３５】
当該ラダー形態の増幅産物は、国際公開第２００５／０５６７９０号パンフレットに記載のとおり、下記の工程により調製することができる：
（Ａ）下記（ａ）又は（ｂ）から選択される反応混合物を調製する工程、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種類のラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー、及びＲＮａｓｅＨ、
（ｂ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、及びＲＮａｓｅＨ、ここで、一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーはラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーとして作用し、
ここで、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されており、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に相補的な第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型となる核酸の塩基配列に相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも２種類を含んでおり、
上記ラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の当該第一キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な領域及び／又はその領域より３’側の塩基配列に相補的な配列を有し、鋳型となる核酸と相同的な第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側の塩基配列、鋳型となる核酸の当該第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーと相同な領域の５’末端より更に５’側方向の領域に相当する塩基配列あるいはその両方に相補的な配列を５’側に有し、
及び
（Ｂ）鋳型となる核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びにＲＮａｓｅＨによる伸長鎖の切断反応が行える一定の温度条件でラダー形態の増幅産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程。
【００３６】
本方法によるラダー形態の増幅産物の調製は、適切なラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーの設計による他、鋳型となる核酸上にある塩基配列を利用して実施することができる。特に限定はされないが例えば、設定しようとする一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある塩基配列が、設定しようとするもう一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある塩基配列と相補的である場合、上記配置でキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、効率よくラダー形態の増幅産物を得ることができる。また、ラダー形成を行うことにより、検出感度及び検出速度が向上する。
【００３７】
上記鋳型となる核酸上の双方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある、相補的な塩基配列は、そのＧＣ含量、その近接する配列、プライマーとの距離、増幅される長さ、反応条件等によって任意に設定することができ、特に限定するものではないが、例えば３塩基以上、好ましくは６塩基以上の相補的な塩基配列から選択することが好ましい。また当該配列は、特に限定するものではないが、例えば上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端を０位とした場合、＋２０〜−１００の領域、好ましくは＋１５〜−８０の領域、更に好ましくは＋１０〜−６０の領域、特に好ましくは＋５〜−４０の領域である。更に鋳型となる核酸上の双方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側、あるいはその上流にある配列の相補性は、当然、上記記載の条件によって任意に設定することができ、特に限定するものではないが、７０％以上の範囲が好適である。
【００３８】
本発明の標識方法は、目的物の真贋を判定するための標識方法として利用することもできる。すなわち、真正品を本発明の方法で標識することにより、真正品と標識されていない偽物とを区別することができる。下記実施例に記載のとおり、ラダーＤＮＡ形態の本発明の標識用ＤＮＡ（標識用ラダーＤＮＡ）及びダミーラダーＤＮＡの組み合わせは、シングルタイプＤＮＡ及びダミーラダーＤＮＡの組み合わせよりも、短時間の増幅・検出に好適である。
【００３９】
また、本発明の標識方法における目的物の標識の形態としては、本発明の標識用ＤＮＡを含むＤＮＡ混合物が付着可能で、かつ前記ＤＮＡ混合物を安定に保持できる担体を使用する方法が例示される。例えば、前記ＤＮＡ混合物を付着させたニトロセルロース、プラス荷電された若しくは荷電されていないナイロン、紙、カード、木材、プラスチック材料、布、金属、ガラス、セラミック、粘土類、ビーズ又はゲル状の有機材料、又は無機材料等の担体を目的物に付加する標識形態であってもよい。本発明の一態様では、前記の担体自体が標識される目的物となりうる。更に上記担体には、ＤＮＡ混合物を分解から保護するよう紫外線吸収剤又は紫外線散乱剤のいずれかを含ませてもよい。前記紫外線吸収剤には、例えばベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤類やベンゾフェノン系紫外線吸収剤類、サリチル酸エステル系紫外線吸収剤類など、市販されているものの中から適宜選択して使用する。また、紫外線散乱剤には例えば微粒子の酸化チタンや酸化亜鉛が使用できる。ＤＮＡ分解酵素に対する阻害剤を含有させることもできる。更に当該担体の表面は、その部分ないし全体を保護層で覆うことができる。保護層には紫外線吸収剤を添加してもよい。当該保護層としては、ラミネートコーティングのようにプラスチック樹脂などが好適に使用でき、熱や酸・アルカリによる分解を妨げ、ＤＮＡ混合物をより確実に保護することができる。また、ＤＮＡ混合物が担体から分離するのを防止できるので、それだけ確実にＤＮＡを回収することができ、検出精度を向上させることができる。
【００４０】
本発明の標識方法では、特に限定はされないが、標識用ＤＮＡは複数種類の混合物であってもよいし、ダミーＤＮＡも複数種類の混合物であってもよい。この場合、複数種類のあらかじめ定められた塩基配列の異なる標識用ＤＮＡに対してそれぞれを検出するプローブを用いることにより、あらかじめ定められた塩基配列の異なる標識用ＤＮＡ間の濃度比率（例えば、標識用ＤＮＡ１と別の標識用ＤＮＡ２の混合物における１と２の濃度比率を蛍光値で判断する）も目的物の確認のための指標とすることができる。
【００４１】
本発明の目的物の確認方法は、本発明の方法で標識した目的物から当該本発明の標識用ＤＮＡ、もしくは当該ＤＮＡを含むＤＮＡ混合物を抽出し、「あらかじめ定められた塩基配列」に基づいて当該ＤＮＡを検出することにより実施される、所望により、検出に先立って本発明の標識用ＤＮＡもしくはその一部の領域を増幅する工程を含んでもよい。好適な態様においては、等温核酸増幅法、例えば国際公開第００／５６８７７号パンフレットに記載されたＩＣＡＮ法によりＤＮＡの増幅が実施される。
【００４２】
例えば、標識された目的物から本発明の標識用ＤＮＡを含む担体を取得する。この担体より適切な溶液、例えば水や緩衝液を用いてＤＮＡの抽出を行う。例えばイオン性又は非イオン性の界面活性剤とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム水塩を含む緩衝液（トリス塩酸緩衝液等）を用いてもよい。また、抽出操作の際には撹拌のような適当な物理的刺激を与えて抽出してもよいし、加熱処理を行ってもよい。その後、必要に応じて、ＤＮＡの精製操作、ＤＮＡ濃縮操作を行ってもよい。ＤＮＡの精製・濃縮には公知の方法を用いる事ができる。
更に、標識された目的物の種類によっては全く抽出操作をせず、取得された前記の担体をそのまま後の検出工程に供してもよい。
【００４３】
必要に応じ、抽出された本発明の標識用ＤＮＡを鋳型として、あらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ断片を増幅する。当該ＤＮＡ断片を増幅する際、本発明においては、ラダー形態で増幅させる方法が好適である。
【００４４】
上記ラダー形態の増幅産物は、増幅領域を複数個含むものであるので、例えば適切なプローブとのハイブリダイゼーションによって多数のプローブとハイブリダイズすることが可能である。当該プローブとしては、前記の「あらかじめ定められた塩基配列」及び／又は上記ラダー形態の増幅産物中の標的核酸配列間に存在する介在配列にハイブリダイズするもののいずれもが好適に使用できる。また、当該プローブとしては、増幅産物とのハイブリダイズの結果、蛍光等のシグナルを示すものが好適に使用できる。このようなプローブは、標識用ＤＮＡを鋳型として増幅した増幅産物が存在した場合に強いシグナルを発生することから、増幅領域を含む核酸の検出を目的とする場合に有用である。また、制限酵素消化等を組み合わせて、ラダー形態の増幅産物より増幅領域、又はその一部をモノマーとして得ることもできる。
【００４５】
好適な態様では、ラダー形態のＤＮＡの増幅と「あらかじめ定められた塩基配列」の検出を同時に実施することができる。例えば、前記のＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ法を利用できる。この場合、（ａ）少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置された少なくとも２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、標的ＤＮＡ上の特定の塩基を含む領域を増幅できるプライマー、（ｂ）標的ＤＮＡ上の前記特定の塩基を含む領域にハイブリダイズすることができ、かつ標的ＤＮＡとハイブリダイズした場合にＲＮａｓｅＨによる切断を受けるプローブ、（ｃ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｄ）ＲＮａｓｅＨ、を含有する組成物を用いて確認することが可能である。この場合、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｔＤＮＡポリメラーゼが好適である。検出には、サイクリングプローブ法以外の方法、例えばモレキュラービーコン法を用いてもよい。これら増幅・検出の反応条件は使用するプライマーやプローブの鎖長、塩基組成等をもとに適宜設定すればよい。
【００４６】
上記方法においては、国際公開第２００５／０５６７９０号パンフレットに記載されたラダー形成オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、増幅領域が連なった重合体を生成させることができる。このようなラダー形態の増幅産物は、複数個の増幅領域がラダー形成オリゴヌクレオチドプライマーと第二キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流領域に相補的な配列を介して同じ向きに連なったものである。更に本発明の方法においては、鋳型となる核酸上の一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある塩基配列がもう一方のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’側あるいはその上流にある塩基配列と相補的な場合、当該位置にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、標的核酸を感度良く検出することができる。
【００４７】
上記のサイクリングプローブ法やモレキュラービーコン法で用いるプローブは、例えば、蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質の両者で、適当な間隔をとって標識したものがよい。このようなプローブはインタクトな状態ではほとんど蛍光を発することはないが、標的配列へのハイブリダイゼーション又は切断によって蛍光を発するようになる。当該物質の組合わせとしては、６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＤＡＢＣＹＬ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ−４’−ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＲＯＸ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）とＤＡＢＣＹＬ、６−ＦＡＭとＥｃｌｉｐｓｅ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＲＯＸとＥｃｌｉｐｓｅ、ＴＥＴ（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＤＡＢＣＹＬ、ＴＥＴとＥｃｌｉｐｓｅ等が好適に使用できる。このようなプローブを使用することにより、反応中の反応液を直接観察することによって本発明の標識用ＤＮＡの有無を確認することが可能である。当該方法は、特に短時間で標識用ＤＮＡを高感度に検出できるという優れた効果を奏する。このような標識プローブとハンディトランスイルミネーターのような紫外線照射装置を用いることにより、蛍光検出器、写真、あるいは肉眼で検出操作を行うことができる。例えば、恒温槽部分、励起光照射部分、蛍光モニター部分を備えた装置を用いれば、本発明の方法で標識された目的物の確認を現場、すなわち十分な設備を備えた施設以外の場所で、かつ短時間に実施することができる。
【００４８】
ＩＣＡＮ法とサイクリングプローブ法とを組み合わせた本発明の態様では、検出で使用する蛍光標識プローブの濃度は、例えば０．３μＭ〜１μＭの範囲、好ましくは、０．４μＭ〜０．８μＭの範囲である。前記濃度範囲のプローブを用いることにより、増幅・検出時間は、２０分以下、好ましくは１５分以下、特に好ましくは、１０分以下で実施することができる。なお、標識した担体からの標識用ＤＮＡの抽出効率が低い場合は、それに合わせて前記蛍光標識プローブ濃度を調整するのは当然のことである。
【００４９】
本発明の方法において、増幅・検出の際に、本発明の標識用ＤＮＡのみを増幅してもよいし、前記標識用ＤＮＡ及びダミーＤＮＡの両方を増幅してもよい。ダミーＤＮＡとして本発明の標識用ＤＮＡの増幅に使用されるものと同一のプライマー対で増幅されるものを使用してもよい。この場合、蛍光標識プローブは標識用ＤＮＡ中の標的配列にのみ完全にハイブリダイズ及び／又は切断によって蛍光を発することにより、検出が可能であることから、仮にプライマー配列に関する情報が漏洩しても、本発明の標識用ＤＮＡを単離もしくは特定することは困難である。また、増幅・検出後の産物を第３者が入手したとしても、その中の増幅された標識用ＤＮＡは、同様に増幅されたダミーＤＮＡの存在のために特定が困難である。
【００５０】
更に本発明の方法においては、ダミーＤＮＡの存在により、本発明の標識用ＤＮＡの検出強度が向上するという予想外の効果が奏される。言い換えれば、検出反応系内のダミーＤＮＡの存在により、ダミーＤＮＡに由来するバックグラウンド値の上昇ではなく、標識用ＤＮＡを鋳型とした増幅産物を検出するための蛍光値の向上が見られる。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例をもって本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに何ら限定されるものではない。なお、本発明においてＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、特許第２９７８００１号に記載の方法で調製した。また、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｈ（以下、Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ）は、国際公開第０２／２２８３１号パンフレットに記載の方法で調製した。
【００５２】
実施例１
（１）シングルタイプＤＮＡの調製
配列番号１〜４記載の塩基配列を有するプライマー、シロイヌナズナＤＮＡ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標、タカラバイオ社製）及びその添付試薬を用い、添付取扱説明書に従って５０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。当該反応液を９４℃ ２分加熱後、続けて９４℃ ３０秒、５４℃ ３０秒、７２℃ １分を１サイクルとする３０サイクル反応に供した。配列番号１及び２記載の塩基配列を有するプライマーからは、Ａｒａｂ０３ＤＮＡ断片、配列番号３及び４記載の塩基配列を有するプライマーからは、Ａｒａｂ０６（Ｕ）ＤＮＡ断片が増幅される。反応終了後、イソプロパノール沈殿精製を行い、吸光度測定によりＤＮＡ濃度を算出した。以降の実験では、このＤＮＡをシングルタイプＤＮＡとして用いた。
【００５３】
（２）ラダータイプＤＮＡの調製
上記（１）で調製したＡｒａｂ０３ＤＮＡ断片 １０ｐｇを鋳型とし、Ａ３ＩＦ４キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ３ＩＦ４プライマー：配列番号５）及びＡ３ＩＲ４キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ３ＩＲ４プライマー：配列番号６）をそれぞれ２０ｐｍｏｌ、３２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ ＤＭＳＯ、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．６ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、０．０４％ プロピレンジアミン、０．１１％ ＢＳＡ、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ ２２Ｕ、Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ １００Ｕを含む、２５μＬの反応液を調製した。ＩＣＡＮ反応は、６０℃、６０分間の条件で行った。反応終了後、反応液５μＬを２％アガロース電気泳動に供し、増幅産物が約１６０ｂｐを１単位とするラダー形態の増幅産物（ラダーＤＮＡ）になっていることを確認した。
【００５４】
得られたラダーＤＮＡの中から約４８０ｂｐの断片をアガロースゲルから抜き出し、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ社製）のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした。こうして得られたプラスミドをｐＵＡ３３プラスミドと命名した。次に、前記ｐＵＡ３３プラスミド １ｎｇを鋳型とし、前記Ａ３ＩＦ４プライマー及びＡ３ＩＲ４プライマーを用いて、前記のＩＣＡＮ反応条件でラダーＤＮＡ（Ａ３ラダーＤＮＡ）を増幅した。反応終了後、反応液５μｌを２％アガロース電気泳動に供し、増幅産物が約１６０ｂｐを１単位とするラダー形態の増幅産物になっていることを確認した。
【００５５】
次に、上記（１）で調製したＡｒａｂ０６（Ｕ）ＤＮＡ断片 １ｎｇを鋳型とし、Ａ６ＩＦ９キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ６ＩＦ９プライマー：配列番号７）及びＡ６ＩＲ８キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ６ＩＲ８プライマー：配列番号８）をそれぞれ２０ｐｍｏｌ用いて、前記反応条件でラダーＤＮＡを増幅した。反応終了後、増幅産物が約１３０ｂｐを１単位とするラダー形態の増幅産物（ラダーＤＮＡ）になっていることを確認した。
【００５６】
得られたラダーＤＮＡの中から約３９０ｂｐの断片をアガロースゲルから抜き出し、ｐＵＣ１１８ベクターのＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした。こうして得られたプラスミドをｐＵＡ６３プラスミドと命名した。次に前記ｐＵＡ６３プラスミド １ｎｇを鋳型として前記Ａ６ＩＦ９プライマー及びＡ６ＩＲ８プライマーをそれぞれ２０ｐｍｏｌ用いて、前記反応条件でラダーＤＮＡ（Ａ６ラダーＤＮＡ）を増幅した。反応終了後、反応液５μＬを２％アガロース電気泳動に供し、増幅産物が約１３０ｂｐを１単位とするラダー形態の増幅産物になっていることを確認した。
【００５７】
こうして得られたＡ３ラダーＤＮＡ及びＡ６ラダーＤＮＡは、イソプロパノール沈殿で精製後、吸光度測定によりＤＮＡ濃度を算出した。これ以降の実験では、この２種類のＤＮＡをラダータイプＤＮＡとして用いた。
【００５８】
実施例２ 標識用ＤＮＡの選定
（１）シングルタイプＤＮＡとラダータイプＤＮＡの比較
実施例１で調製したシングルタイプＤＮＡ又はラダータイプＤＮＡを鋳型としてＩＣＡＮ法とサイクリングプローブ法とを組み合わせたリアルタイム検出を行った（以下リアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応と記載する）。測定結果から検出時間と増幅曲線の関係について比較を行った。Ａｒａｂ０３ＤＮＡ及びＡ３ラダーＤＮＡ 各１５ｎｇをそれぞれ鋳型として、Ａ３ＩＦ５キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ３ＩＦ５プライマー：配列番号９）及びＡ３ＩＲ３キメラオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ３ＩＲ３プライマー：配列番号１０）を各２０ｐｍｏｌとＡ３プローブ２（配列番号１１）を５ｐｍｏｌ用いて、２５μＬの容量の反応液を調製した。前記Ａ３プローブ２は、Ａｒａｂ０３ＤＮＡ及びＡ３ラダーＤＮＡ中の塩基配列にハイブリダイズするプローブであって、その５’末端側にクエンチャーとなるエクリプス（登録商標、エポック バイオサイエンシズ社製）、その３’末端側にレポーターとなるＲｏｘ（登録商標、アプライド バイオシステムズ社製）を有している。反応液組成は、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、プローブ以外は、実施例１記載と同様とした。
【００５９】
こうして調製した反応液をＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）にセットし、６０℃、６０分間反応させた。その検出結果を図１に示す。すなわち図１は、リアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ法による増幅・検出曲線であり、縦軸は、蛍光値、横軸は時間を示す。この結果より、同じ鋳型量の場合、シングルタイプＤＮＡよりラダータイプＤＮＡの方が短時間で増幅・検出曲線が立ち上がることが明らかとなった。このことから、短時間での検出にはラダータイプＤＮＡが適していることが明らかとなった。
【００６０】
（２）ダミーラダーＤＮＡとの組み合わせの比較
実施例１−（１）で調製したＡｒａｂ０３由来の塩基配列を有するシングルタイプＤＮＡ（Ａｒａｂ０３ＤＮＡ）又は実施例１−（２）で調製したラダータイプＤＮＡ（Ａ３ラダーＤＮＡ）に、ダミーＤＮＡとして実施例１−（２）で調製したＡｒａｂ０６由来の塩基配列を有するラダータイプＤＮＡ（Ａ６ラダーＤＮＡ）を混合したものを鋳型としてリアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応を行い、検出時間と増幅曲線の関係について比較を行った。Ａｒａｂ０３ＤＮＡ及びＡ３ラダーＤＮＡ 各２０ｎｇに対し、１０倍量のＡ６ラダーＤＮＡを混合したものをそれぞれ鋳型として、前記実施例２−（１）の反応条件でリアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応を行った。その検出結果を図２に示す。すなわち図２は、リアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ法による増幅・検出曲線であり、縦軸は、蛍光値、横軸は時間を示す。この結果より、ダミーＤＮＡの添加の有無で増幅曲線はほとんど変わらないことが明らかとなった。すなわち、短時間での検出において、標識用ＤＮＡに対してダミーＤＮＡが多く存在している場合でも、標識用ＤＮＡとしてはシングルタイプＤＮＡよりラダータイプＤＮＡが適していることが確認できた。更に、当該蛍光値から、６分〜１５分の範囲、例えば１０分間の反応時間で十分に検出できることが明らかとなった。
【００６１】
（３）判別用ＤＮＡの蛍光値に対するダミーＤＮＡ（ダミーラダーＤＮＡ）の影響
上記実施例２−（２）の実験結果を踏まえ、標識用ラダーＤＮＡの蛍光値に対するダミーラダーＤＮＡの影響について検討した。すなわち、Ａ３ラダーＤＮＡ ２０ｎｇに対し、１０倍量又は１００倍量のＡ６ラダーＤＮＡを混合したものを鋳型として、前記実施例２−（１）の反応条件でリアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応を行った。なお、増幅・検出時間１０分間と設定した。その結果の蛍光値を表１に示した。
【００６２】
【表１】
【００６３】
表１は、増幅・検出時間が１０分間の場合の蛍光値を示している。この結果から、標識用ラダーＤＮＡに対しダミーラダーＤＮＡの濃度が上がるに従い、バックグラウンド値の上昇ではなく、標識用ラダーＤＮＡに起因する蛍光値の増加が見られた。一方、標識用ラダーＤＮＡとダミーラダーＤＮＡの濃度を上記と同じにしたサンプルについて、実施例２−（１）で使用されたプライマーと同じ塩基配列を有するＤＮＡプライマーを用いたリアルタイム ＰＣＲを行ったところ、ダミーラダーＤＮＡの濃度が上がるに従い、標識用ラダーＤＮＡに起因する蛍光値は下降する傾向であった。
【００６４】
次に、上記Ａ３ラダーＤＮＡ ２ｎｇに対し、等量〜１０００倍量のＡ６ラダーＤＮＡを混合したものを鋳型として、前記実施例２−（１）の反応条件でリアルタイムＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応を行った。なお、増幅・検出時間は１０分間と設定した。その結果を図３に示す。すなわち図３は、標識用ラダーＤＮＡの蛍光値の向上傾向を示すグラフであり、縦軸は蛍光値、横軸は標識用ラダーＤＮＡに対するダミーラダーＤＮＡの比率を示す。また、図３の縦軸の値は、標識用ラダーＤＮＡの蛍光値から、共存するダミーラダーＤＮＡ自体の蛍光値（バックグラウンドの蛍光値）を差し引いた値で示している。
【００６５】
図３から明らかなように、標識用ラダーＤＮＡと等量のダミーラダーＤＮＡを添加した場合に比べ、１００倍量、５００倍量、１０００倍量添加した場合においても、標識用ラダーＤＮＡに起因する蛍光値の増加が確認できた。すなわち、本発明の方法においては、標識用ラダーＤＮＡに対してダミーラダーＤＮＡの濃度を多くすることにより、バックグラウンド値の上昇ではない標識用ラダーＤＮＡに起因する蛍光値の向上が起きるということに加え、更にダミーラダーＤＮＡの濃度を上げることにより、標識用ＤＮＡの塩基配列解析をより高いレベルで防止できることが確認できた。
【００６６】
実施例３
（１）担体からの抽出操作の省略
目的物を標識した担体から複雑な操作なく短時間でＤＮＡを検出できるかどうかを検討した。まず、モデル実験系として、実施例１−（２）で調製したＡ３ラダーＤＮＡ １００ｎｇをＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ マイクロカード（ワットマン社製）にスポットし、風乾した。その後、前記カードからスポット部分を切り出した後、実施例２−（１）記載と同じ組成のＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応液 １２５μＬで、プローブ濃度が０．２μＭ〜０．８μＭの反応液を調製し、６０℃、１０分間静置した。
【００６７】
ネガティブコントロールとしてＤＮＡをスポットしていないカードを同じ面積分切り出し、同様の反応を行った。反応終了後、各チューブにＵＶを照射したところ、Ａ３ラダーＤＮＡをスポットしたカード断片を含むチューブでは０．４μＭ〜０．８μＭとプローブ濃度が増すに従い、反応チューブ内に肉眼で十分確認できる蛍光が発せられた。これらの蛍光のネガティブコントロールとの差は肉眼で確認することができた。
【００６８】
（２）担体からの抽出操作の省略２
次に、標識用ラダーＤＮＡとして実施例１−（２）で調製したＡ３ラダーＤＮＡ １００ｎｇとダミーラダーＤＮＡとして実施例１−（２）で調製したＡ６ラダーＤＮＡ １μｇの混合液、Ａ３ラダーＤＮＡ １００ｎｇの溶液、及びＡ６ラダーＤＮＡ １μｇの溶液のそれぞれ１μＬをＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ マイクロカード（ワットマン社製）にスポットし、風乾した。その後、スポット部分を切り出し、上記実施例２−（１）に記載の方法でプローブ濃度が０．８μＭのＣｙｃｌｅａｖｅ ＩＣＡＮ反応を各２本ずつ行った。また、ネガティブコントロールとしてＤＮＡをスポットしていないカードを同じ面積分切り出し、上記と同様の反応を２本行った。これらの反応チューブをＵＶ照射した結果を図４に示す。すなわち図４は、ハンディトランスイルミネーターを用いてＵＶ照射を行った反応チューブの写真であり、チューブ１、２はネガティブコントロール、チューブ３、４はＡ３ラダーＤＮＡ １００ｎｇのみ、チューブ５、６はＡ３ラダーＤＮＡ １００ｎｇとＡ６ラダーＤＮＡ １μｇの混合液、チューブ７、８はＡ６ラダーＤＮＡ １μｇのみの反応液である。図中、標識用ＤＮＡが標識用ラダーＤＮＡを示し、ダミーＤＮＡがダミーラダーＤＮＡを示す。
【００６９】
図４に示すように、標識用ラダーＤＮＡ及びダミーラダーＤＮＡがない場合及びダミーラダーＤＮＡのみの場合のチューブでは蛍光は見られない。また、標識用ラダーＤＮＡ量が同じであるにも関わらず、標識用ラダーＤＮＡ単独の場合に比べダミーラダーＤＮＡが共存する方が蛍光値が増加していることが確認できた。更に標識用ラダーＤＮＡ単独の反応チューブよりもダミーラダーＤＮＡが共存する反応チューブの方が、反応チューブ内の蛍光がハッキリとしており、肉眼で容易に確認できた。このことから、上記方法で判定を求められる場所で目的物を標識した担体から複雑な操作なしで、少なくとも１０分間で標識用ＤＮＡの検出を肉眼で行える系を構築できた。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、判定が求められる現場において、ＤＮＡをベースとした判定を短時間で実施することができる。また本発明は、プローブハイブリダイゼーションに基づくため、非常に精度の高い判別方法を実施することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
SEQ ID NO:1 ; Primer F to amplify the Arab03 DNA fragment.
SEQ ID NO:2 ; Primer R to amplify the Arab03 DNA fragment.
SEQ ID NO:3 ; Primer F to amplify the Arab06(U) DNA fragment.
SEQ ID NO:4 ; Primer R to amplify the Arab06(U) DNA fragment.
SEQ ID NO:5 ; A3IF4 chimeric primer to amplify the Arab03 DNA fragment using ICAN method. 3 bases of 3' end are RNA.
SEQ ID NO:6 ; A3IR4 chimeric primer to amplify the Arab03 DNA fragment using ICAN method. 3 bases of 3' end are RNA.
SEQ ID NO:7 ; A6IF9 chimeric primer to amplify the Arab06(U) DNA fragment using ICAN method. 3 bases of 3' end are RNA.
SEQ ID NO:8 ; A6IR8 chimeric primer to amplify the Arab06(U) DNA fragment using ICAN method. 3 bases of 3' end are RNA.
SEQ ID NO:9 ; A3IF5 chimeric primer to amplify the Arab03 DNA fragment using ICAN method. 3 bases of 3' end are RNA.
SEQ ID NO:10 ; A3IR3 chimeric primer to amplify the Arab03 DNA fragment using ICAN method. 3 bases of 3' end are RNA.
SEQ ID NO:11 ; A3 probe 2. 9th base is RNA.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物を標識する方法であって、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡで当該目的物を標識することを特徴とする目的物の標識方法。
【請求項２】
分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡが、当該ＤＮＡが含有するあらかじめ定められた塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡが、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物である請求項１記載の方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法で標識された目的物を確認する方法であって、標識された目的物に含有されるＤＮＡを当該ＤＮＡに含有されるあらかじめ定められた塩基配列に基づいて検出することを特徴とする目的物の確認方法。
【請求項５】
標識に使用されたＤＮＡを鋳型として、あらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ断片を増幅する工程を包含する請求項４記載の方法。
【請求項６】
等温核酸増幅法によりＤＮＡ断片の増幅が実施される請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項３記載の標識方法のための標識用ＤＮＡ混合物であって、少なくとも１種類の分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、少なくとも１種類の前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物。
【請求項１】
目的物を標識する方法であって、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡで当該目的物を標識することを特徴とする目的物の標識方法。
【請求項２】
分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡが、当該ＤＮＡが含有するあらかじめ定められた塩基配列のコピー数が異なる複数種のＤＮＡの混合物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡが、分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物である請求項１記載の方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法で標識された目的物を確認する方法であって、標識された目的物に含有されるＤＮＡを当該ＤＮＡに含有されるあらかじめ定められた塩基配列に基づいて検出することを特徴とする目的物の確認方法。
【請求項５】
標識に使用されたＤＮＡを鋳型として、あらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡ断片を増幅する工程を包含する請求項４記載の方法。
【請求項６】
等温核酸増幅法によりＤＮＡ断片の増幅が実施される請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項３記載の標識方法のための標識用ＤＮＡ混合物であって、少なくとも１種類の分子内に複数コピーのあらかじめ定められた塩基配列を含有するＤＮＡと、少なくとも１種類の前記塩基配列を含有しないＤＮＡとの混合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２７３６７５（Ｐ２０１０−２７３６７５Ａ）
【公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０２９８２（Ｐ２０１０−１０２９８２）
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
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