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DNAアレイ上でのハイスループットゲノム配列決定
説明

DNAアレイ上でのハイスループットゲノム配列決定

【課題】標的ポリヌクレオチドのアレイから得られうる配列決定情報の量を上昇させるさらなるアプローチを利用可能とすること。また、数十億の分子、例えばマイクロミリより小さいサイズおよび距離の分子を支持することが出来る操作された核酸分子のランダムアレイを調製するための方法および組成物を提供すること。
【解決手段】本発明は、標的ポリヌクレオチド中に散在したアダプターを用いる、標的配列のヌクレオチド配列情報を獲得するための方法および組成物に関する。配列情報は新規なもの、例えば未知核酸の配列決定でもよいし、再配列決定、または遺伝子型同定でもよい。本発明は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの断片中の分散した位置に複数のアダプターを挿入する方法を含む。かかるアダプターは、様々な配列決定化学、例えば、プライマー伸長、プローブライゲーション等によりヌクレオチドを同定する化学を用いて隣接配列を調べるためのプラットフォームとして役立ちうる。本発明には、アダプターにより近接する標的配列の途切れが生じるように既知のアダプター配列を標的配列に挿入するための方法および組成物も含まれる。アダプターの「上流」と「下流」の両方を配列決定することにより、完全な標的配列の同定が達成されうる。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程を含む、標的ポリヌクレオチドの配列情報を決定する方法:
(a) 複数のコンカテマーを提供する工程、ここで、各コンカテマーは以下の工程によって得られるものである:
(i) 該標的ポリヌクレオチドの断片および第一のアダプターを含む第一の環状DNAを形成させる工程、ここで、該第一のアダプターは制限酵素の結合部位を含み、該制限酵素は少なくとも6個のヌクレオチドによって該結合部位から隔てられた切断部位においてDNAを切断するものである;
(ii) 該結合部位に結合する制限エンドヌクレアーゼを用いて標的ポリヌクレオチドの内部にある部位において第一の環状DNAを切断することを含む方法により、直線化されたDNAを形成させる工程;
(iii) 該直線化されたDNAおよび第二のアダプターを含む第二の環状DNAを形成させる工程; および
(iv) 第二の環状DNAを増幅して該コンカテマーを形成させる工程;
(b) 表面に結合した該コンカテマーのアレイを形成させる工程; ならびに
(c) 該アレイ中の複数のコンカテマーにおいて、第二のアダプターの上流および下流両方の標的配列を決定する工程。
【請求項2】
工程(c)が以下の工程を含む、請求項1の方法:
(i) 該アダプター中のプローブハイブリダイゼーション部位にアンカープローブをハイブリダイズさせる工程;
(ii) ハイブリダイズしたアンカープローブに隣接する標的ポリヌクレオチドの標的配列に配列決定プローブをハイブリダイズさせる工程; 次いで
(iii) 配列決定プローブとアンカープローブをライゲーションする工程; および
(iv) 工程(iii)においてライゲーションしたプローブを検出して該標的配列中のヌクレオチドを同定する工程。
【請求項3】
請求項2の工程(i)から(iv)までを繰り返して標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を同定する、請求項2の方法。
【請求項4】
該アダプターの各々におけるハイブリダイゼーション部位にアンカープローブをハイブリダイズさせることを含む、請求項1から3のいずれかの方法。
【請求項5】
標的ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項1から3のいずれかの方法。
【請求項6】
表面が平方ミリメートルあたり100,000より多くのコンカテマーを含み、該コンカテマーが光学的に分解可能なものである、請求項1から3のいずれかの方法。
【請求項7】
コンカテマーが表面上の別々の空間的に離れた領域に結合する、請求項1から3のいずれかの方法。
【請求項8】
各別々の空間的に離れた領域が 1μm2 よりも小さい面積を有するか、またはコンカテマーが別々の空間的に離れた領域に非共有結合する、請求項7の方法。
【請求項9】
実質的に全ての別々の空間的に離れた領域が多くとも1つの結合したコンカテマーを有する、請求項7の方法。
【請求項10】
複数のコンカテマーがあるパターンで表面上にランダムに配置されたアレイを含む、標的ポリヌクレオチドの配列情報を決定するためのキットであって、各コンカテマーが以下の工程によって得られたものである、キット:
(i) 該標的ポリヌクレオチドの断片および第一のアダプターを含む第一の環状DNAを形成させる工程、ここで、第一のアダプターは制限酵素の結合部位を含み、該制限酵素は少なくとも6個のヌクレオチドによって該結合部位から隔てられた切断部位においてDNAを切断するものである;
(ii) 該結合部位に結合する制限エンドヌクレアーゼを用いて標的ポリヌクレオチドの内部にある部位において第一の環状DNAを切断することを含む方法により、直線化されたDNAを形成させる工程;
(iii) 該直線化されたDNAおよび第二のアダプターを含む第二の環状DNAを形成させる工程; および
(iv) 第二の環状DNAを増幅して該コンカテマーを形成させる工程、
ここで、少なくとも1つのアダプターが2つのプローブハイブリダイゼーション部位を含み、1つは 3'末端に隣接または近接し、1つは 5'末端に隣接または近接し、それにより、該アダプターは上流および下流両方の標的配列を決定するために構成されている。
【請求項11】
複数のコンカテマー中の第二のアダプター上のプローブハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズするよう構成されたアンカープローブをさらに含む、請求項10のキット。
【請求項12】
ハイブリダイズしたアンカープローブに隣接する標的配列にハイブリダイズし、その後複数のコンカテマー上の該アンカープローブとライゲーションするよう構成された配列決定プローブをさらに含む、請求項11のキット。

【図1A】
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【図1B】
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【図1C】
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【図1D】
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【図1E】
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【図1F】
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【図1G】
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【図2A】
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【図2B】
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【図2C】
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【図2D】
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【図2E】
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【図2F】
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【図2G】
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【図3A】
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【図3B】
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【図3C】
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【図3D】
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【図3E】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【公開番号】特開2013−27401(P2013−27401A)
【公開日】平成25年2月7日(2013.2.7)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2012−220591(P2012−220591)
【出願日】平成24年10月2日(2012.10.2)
【分割の表示】特願2008−556583(P2008−556583)の分割
【原出願日】平成19年2月26日(2007.2.26)
【出願人】(507411419)カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】CALLIDA GENOMICS, INC.
【Fターム(参考)】