ＤＮＡ中のシトシンのメチル化法および検出法
ａ）５−メチル化シトシンが未反応にとどまる一方で、非メチル化シトシンがウラシルまたは、シトシンと塩基対の挙動が異なる、その他の塩基に変換されるように、検査すべきＤＮＡと試薬または酵素とを反応させることと、
ｂ）前処理した前記ＤＮＡをポリメラーゼと少なくとも一つのプライマーとで増幅し、その５’末端にリンカーを介してプローブを結合することと（スコーピオン・プライマー）、
ｃ）前記プライマー伸張生成物をマトリックス鎖から分離することと、
ｄ）前記プローブが、分子内的に前記プライマー伸張生成物と混成し、そしてその混成が、ＤＮＡのメチル化状態に依存して起こることと、
ｅ）前記プローブの混成が起こったか否かを検出することと
を特徴とするＤＮＡ中のシトシンのメチル化を検出する方法。
ｂ）前処理した前記ＤＮＡをポリメラーゼと少なくとも一つのプライマーとで増幅し、その５’末端にリンカーを介してプローブを結合することと（スコーピオン・プライマー）、
ｃ）前記プライマー伸張生成物をマトリックス鎖から分離することと、
ｄ）前記プローブが、分子内的に前記プライマー伸張生成物と混成し、そしてその混成が、ＤＮＡのメチル化状態に依存して起こることと、
ｅ）前記プローブの混成が起こったか否かを検出することと
を特徴とするＤＮＡ中のシトシンのメチル化を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡ中の５−メチルシトシンの検出法に関する。５−メチルシトシンは真核細胞のＤＮＡの中で共有結合的に修飾を受ける頻度の最も高い塩基である。この塩基は、とりわけ転写の調節、遺伝すり込みおよび癌の発生において生物学的に重要な役割を演じている（総説：Ｍｉｌｌｅｒら、：Ｆｉｖｅ ｎｏｔ Ｆｏｕｒ：第五番目の塩基の歴史と意義、Ｓ．Ｂｅｃｋおよび Ａ．Ｏｌｅｋ（編），Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ２００３年，３〜２０ページを参照）。それゆえ、５−メチルシトシンを遺伝子情報の要素として確認することは重要な課題である。シトシンおよび５−メチルシトシンは塩基対の形成において同じ挙動を示すためメチル化の検出は当然のこととして困難である。従って混成を基礎にする従来の検出法の多くは、シトシンとメチルシトシンとを識別できない。加えて、ＰＣＲ増幅時にメチル化情報は完全に失われる。
【背景技術】
【０００２】
従来のメチル化分析法は、大きく分けて二種類の異なった原理に基づいている。その一つは、メチル化に対して特異的な制限酵素を使用する方法である。もう一つは、選択的に非メチル化シトシンをウラシルに化学変換する方法である（いわゆる亜硫酸水素塩処理。例えばＤＥ １０１ ５４ ３１７ Ａ１；ＤＥ １００ ２９ ９１５ Ａ１）。そこで、酵素または化学的に処理されたＤＮＡは、多くの場合増幅したのち異なったやり方で分析することが可能である（総説：ＷＯ ０２／０７２８８０ Ｓ．１ ｆｆ）。その場合、メチル化を感度よく定量的に検出できる方法に関心が向けられる。このことは、癌の発生におけるシトシンのメチル化の重要な役割を考えれば、特に診断への応用の面に大きな関心が寄せられる。その場合、体液、例えば血清で異常なメチル化パターンを検出する方法が特に重要な意味を持つ。なぜなら、不安定なＲＮＡと違い、体液中にＤＮＡが見つかることが少なくないからである。それどころか、癌のような破壊的な病理過程においては、血中ＤＮＡ濃度が上昇する。したがって、体液中に存在する腫瘍ＤＮＡのメチル化分析によって癌を診断することが可能であり、そのことについてはすでに数多くの記載がある（例えば、Ｐａｌｍｉｓａｎｏら：Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｂｅｒｒａｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｐｕｔｕｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｎｏｖ １；６０（２１）：５９５４〜８）。そこで問題になるのは、体液中には疾患タイプのメチル化パターン以外に、配列が同じでメチル化パターンが異なるＤＮＡが多量に存在していることである。そのため、診断法は、配列が同じＤＮＡの強いバックグラウンドの中で、メチル化のパターンが異なる少量の、とりわけ、メチル化ＤＮＡを検出する必要がある。
【０００３】
感度の高い現行検出法は、ＰＣＲ増幅を通じて行われる。その場合に使用される方法は、いわゆるメチル化に感応するＰＣＲ法である（「ＭＳＰ」；Ｈｅｒｍａｎら、：Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ：ａ Ｎｏｖｅｌ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６ Ｓｅｐ ３：９３（１８）：９８２１〜６）。この場合、あらかじめメチル化されているか（または逆の手法ではメチル化されていない）、亜硫酸水素塩で処理された配列位置のみに特異的に結合するプライマーが使用される。これに比する感度の高い方法は、いわゆる「ヘビー・メチル」法である。この場合は、メチル化に特異的なブロッカーオリゴマーを使用することで、もともとメチル化されている（またはメチル化されていない）ＤＮＡのみが特異的に増幅される（総説：ＷＯ ０２／０７２８８０）。ＭＳＰ法もヘビー・メチル法も定量可能なリアルタイム改変法として使用できる。そのため、あとで生成物を分析する必要がなく、ＰＣＲ実施中に直接メチル化のステータスが低い位置を検出することができる（「ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ」−ＷＯ ００／７００９０；ＵＳ ６，３３１，３９３）。この場合、実施形態は「Ｔａｑｍａｎ」法である。この方法は蛍光色素−クエンチャー対を有するプローブ分子を使用する。プローブは配列特異的に増幅体（Ａｍｐｌｉｆｉｋａｔｅ）と混成し、次の増幅サイクルの過程でポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって分解する。クエンチャーと色素が分離されると、検出可能な蛍光シグナルが生じる（Ｅａｄｓら：ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ：ａ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｓｓａｙ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０００ Ａｐｒ １５：２８（８）：Ｅ３２参照）。さらに別の実施形態はいわゆるライトサイクラー法である。この方法は２種類の異なったプローブが使用される。プローブは、互いに直接的に近接して増幅体と混成し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を通じて検出可能なシグナルを発生する。
【０００４】
このリアルタイム法のメチル化分析への適用性はもちろん限られる。それは、特に、特異性、選択性および反応速度に関してあてはまる。しかし、シトシンのメチル化の特別な生物学的医学的重要性のため、優れたメチル化分析法の開発に対して強い技術的な需要がある。以下にそのような方法について記述する。本発明においては、プローブとプライマーは互いに結合し、プローブは分子内的に混成して標的配列を形成することができる。本発明による方法は効果的かつ迅速な検出が可能であり、そのため、極めて高感度で極めて特異性の高いメチル化分析を可能にする。
【０００５】
本発明による方法に類似するメチル化分析法はすでに「スコーピオン」の名称で記載されている（例えば、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｆ−ｐｒｏｂｉｎｇ ａｍｐｌｉｃｏｎｓ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９ Ａｕｇ；１７（８）：８０４〜７；Ｔｈｅｌｗｅｌｌら：Ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｔｏ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０００ Ｏｃｔ １；２８（１９）：３７５２〜６１；米国特許第６，３２６，１４５；米国特許第６，３６５，７２９号；米国特許出願第２００３００８７２４０ Ａ１号）。スコーピオン法は異なる実施形態で適用することが可能である。もちろん、全ての方法は、プローブが分子内的に結合する点で共通している。いわゆる「ヘアピンループ」改変法の場合、スコーピオン・プライマーは、５’末端に、特別なヘアピンループ配置で存在する特異的なプローブ配列を有する。プローブ配列の末端には蛍光色素とクエンチャーとが存在し、ヘアピンを形成することで互いに近接する。プローブ配列とプライマー配列は、いわゆるＰＣＲストッパーを有するリンカーを介して結合している。増幅が一巡して、生成した二本鎖が分離すると、プローブは分子内的に同じ分子鎖の伸張したプライマー配列に結合する。この混成によってヘアピンが開くと、蛍光色素とクエンチャーは分離し、その結果、シグナルを検出することができる。ＰＣＲストッパーは、ＰＣＲの中でポリメラーゼが「通読」するのを阻止し、間違った正信号を回避する（参照：Ｔｈｅｌｗｅｌｌら、２０００，特に上記文献の３７５３ページの図１）。
【０００６】
スコーピオン法の別の改変法は、いわゆる「デュプレックス」法である。この場合は、プローブ配列は、ヘアピン構造ではなくて、別のオリゴヌクレオチドとデュプレックスを形成する。すなわち、プローブ配列の５’末端は蛍光色素と結合し、他方もう一つのオリゴヌクレオチドは３’末端にクエンチャーを有する。デュプレックスが形成することで、クエンチャーと色素とは互いに近接する。増幅が一巡して、二本鎖が分離すると、プローブは分子内的に同じ分子鎖の伸張したプライマー配列に結合する。蛍光色素とクエンチャーは分離し、その結果、シグナルを検出することができる（Ｓｏｌｉｎａｓら、：Ｄｕｐｌｅｘ ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ＳＮＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＦＲＥＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００１ Ｏｃｔ １５；２９（２０）：Ｅ９６）。さらに、プローブが２種類の色素を有していて、蛍光共鳴エネルギー移動を介してシグナルが形成されるデュプレックス法の改変法も記載されている（参照：Ｓｏｌｉｎａｓら、２００１，上記文献、特に７ｆページおよび６ページの図５）。上に述べたヘアピン法と比べてデュプレックス法が優れている点は、クエンチャーと色素とが完全に分離して活性化された形をとると、ヘアピン法の場合より強い蛍光シグナルが発生することである。加えて、デュプレックス・スコーピオン・プライマーは、対応するヘアピン・プライマーより合成が簡単で、安価である（参照：Ｓｏｌｉｎａｓら、２００１，上記文献、８ｆページ）。
【０００７】
さらにスコーピオン法の別の改変法は、米国特許第６３２６１４５号および米国特許出願第２００３００８７２４０号に詳しく記載されている。
【０００８】
スコーピオン法は、従来法のリアルタイムＰＣＲ法と比べていくつかの利点を有している。このことは特に反応速度の点であてはまる。スコーピオン・プローブは、分子内的に標的配列と混成すると、一分子反応の速度論に従う。それに対してＴａｑｍａｎ法の場合は、プローブの結合は、二分子反応の速度論に従って起こり、ライトサイクラー法の場合は３分子反応の速度論に従う。さらに、ライトサイクラー法の場合は、シグナルが検出可能になる前に酵素によってプローブが分解される必要がある。それゆえ、例えば迅速分析に必要な高速ＰＣＲサイクルは、ごく限定的にしか使用できないかもしれない。したがって、スコーピオン法は、特に迅速サイクル条件では、従来法であるリアルタイム法より高性能である（Ｔｈｅｌｗｅｌｌら、２０００，上記文献）。スコーピオン法の別の利点は特別な特異性にある。すなわち、プローブ配列を短くすると特異性が高まり、ただ一つの塩基対の欠陥を検出することが可能である。従来法であるリアルタイム法の改変法では対応する特異性の強化は不可能である。この場合、プローブを短くすると非特異的なＰＣＲ生成物と結合する確率が高くなるため、特異性はむしろ低下する（参照：Ｔｈｅｌｗｅｌｌら、２０００，上記文献、３７６０ページ）。
【０００９】
以下では、まずメチル化分析へのスオーピオン法の適用について述べる。シトシンのメチル化は、特に生物学的医学的に重要であることと、公知の方法の欠点とを考慮して、この有益で新しい技術の扉を開くことは重要な技術の進歩をもたらす。メチル化分析へのスコーピオン法の適用は、すでに変異分析から知られているスコーピオン法の利点以外に、別の利点ともつながっている。すなわち、従来のＰＣＲ法では、複数個の位置が同時メチル化されたシトシンを含む配列のみが、高感度で特異的なメチル化分析が可能である。それに対して、本発明のいくつかの実施形態では、同時メチル化された位置はわずかの数しか必要としない。この場合、スコーピオン法は配列依存性であるため、比較し得る既知のＰＣＲ法（「ヘビー・メチル法」、下記参照）よりも適用範囲が広い。２種類のスコーピオン・プライマーを使用すれば別の特別な利点がもたらされる。すなわちメチル化と変異とを同時に検査することができる。加えて、２種類のスコーピオン・プライマーを使用すれば内部定量が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明による方法は、シトシンのメチル化を高感度で検出することが可能である。次に挙げる５つの段階からなる：
１）検査すべきＤＮＡを反応試薬または酵素と反応させると、メチルシトシンは反応しないまま残る。それに対して、非メチル化シトシンはウラシルまたは別の塩基に変換され、それらはシトシンとは塩基対形成における挙動が異なる。
２）あらかじめ処理したＤＮＡを、ポリメラーゼおよび少なくとも一つのプライマーによって増幅し、その５’末端をリンカーを介してプローブと結合させる。
３）プライマー伸張生成物をマトリックス鎖から分離する。
４）プローブを分子内的にプライマー伸張生成物と混成させる。その場合、混成はＤＮＡのメチル化状態に依存して進行する。
５）プローブの混成が起こっていれば検出される。
【００１１】
本発明の方法の第一段階は、検査すべきＤＮＡを反応試薬または酵素と反応させると、５−メチルシトシンは反応しないまま残り、非メチル化シトシンはウラシルまたは別の塩基に変換され、それらはシトシンとは塩基対形成における挙動が異なる。検査すべきＤＮＡは、診断に関する問題か学術的な問題かによって、異なる試料源から採取することができる。診断に関する問題の場合は、好ましくは組織が検査試料として使用されるが、体液、特に血清を使用することもできる。痰、糞便、尿または脳脊髄液からのＤＮＡも使用可能である。ＤＮＡは、好ましくはまず生物試料から分離される。ＤＮＡの抽出は、標準的方法に従い、血液から、例えばＱｉａｇｅｎ ＵｌｔｒａＳｅｎｓ ＤＮＡ抽出キットを使って行われる。次に、分離したＤＮＡは、例えば制限酵素を作用させて断片化することができる。反応条件と問題となる酵素は、当業者にとってよく知られており、例えばメーカーが添付するプロトコルの記載に従うこともできる。次に、ＤＮＡを化学的または酵素的に変換する。化学的変換は、好ましくは亜硫酸水素塩で行われる。亜硫酸水素塩による変換の異なる変形が当業者には知られている（例えば、Ｆｒｏｍｍｅｒら：Ａ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｔｈａｔ ｙｉｅｌｄｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９２ Ｍａｒ １；８９（５）：１５２７〜３１；Ｏｌｅｋ，Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６ Ｄｅｃ １５；２４（２４）５０６４〜６．；ＤＥ １００ ２９ ９１５；ＤＥ １００ ２９ ９１５）。亜硫酸水素塩の反応は、特に好ましくは変性溶媒、例えばジオキサン、およびラジカル捕捉剤の存在下に行われる（参照：ＤＥ １００ ２９ ９１５）。別の好ましい実施形態では、ＤＮＡは、化学的に変換するのではなく、酵素的に変換される。これは、例えばメチル化シチジンより、非メチル化シチジンの方が速く変換されるシチジンデアミナーゼの使用によって考えることができる。相当する酵素は最近同定された（Ｂｒａｎｓｔｅｉｔｔｅｒら：Ａｃｔｉｖａｔｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｄｅａｍｉｎａｔｅｓ ｄｅｏｘｙｃｙｔｒｉｄｉｎｅ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｂｕｔ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ａｐｒ １；１００（７）：４１２０−７）。
【００１２】
本発明による第二段階において、あらかじめ処理したＤＮＡは、ポリメラーゼおよび少なくとも一つのプライマーによって増幅される。この増幅に関しては、例えば等温増幅法など異なる可能性が当業者に知られている。もちろんポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が好ましい。その場合、プライマーの構造によって異なる実施形態が考えられる。言うまでもなく、全ての実施形態はプライマーの少なくとも一つの５’末端が、リンカーを介してプローブと結合していることで共通している。プライマー、リンカーおよびプローブの配列全体はプローブの二次構造に依存しない−以下ではスコーピオン・プライマーと呼ぶ。それに対して、プライマーは、スコーピオン・プライマーのプライマー配列のみを指す。メチル化に特異的な検出を行うには、プローブの配列かプライマーの配列がメチル化に対して特異的でなければならない。例えば、もともとメチル化されているＤＮＡもメチル化されていないＤＮＡも同様に増幅することが可能であり、両者の形はメチル化に特異的なプローブと混成して初めて区別することが可能になる。逆に、一種類のＤＮＡを増幅し、次いでこれを非特異的なプローブで検出することも可能である。高い特異性が要求される場合は、増幅も検出もメチル化特異的に行われる方法が好ましい。
【００１３】
メチル化に特異的な増幅は異なる方法で実現することができる。好ましい実施形態では、ＰＣＲは、あらかじめメチル化して（または逆の手法では：メチル化しないで）変換された配列位置でのみ特異的に結合するプライマーを使用して行われる。この方法は、メチル化感受性ＰＣＲ（ＭＳＰ）の名称で知られている。ここでは、少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを含むプライマーが使用され、好ましくはＣＧ位置を少なくとも３個所有し、そのうちの一つが３’末端に位置するプライマーが使用される。非メチル化配列または非転写鎖の増幅には、それに応じてＴＧジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチドが必要である。ＭＳＰを実施するための正確な技術的指示は当業者に知られている（参照：Ｈｅｒｍａｎら：Ｍｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ：ａ ｎｏｖｅｌ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６ Ｓｅｐ ３；９３（１８）：９８２１〜６；米国特許第５，７８６，１４６号；米国特許第６，０１７，７０４号；米国特許第６，２００，７５６号）。
【００１４】
メチル化に特異的な増幅の好ましい別の実施形態は、「ヘビー・メチル」法である。この場合、一つのＣＧ（またはＴＧまたはＣＡ）−ジヌクレオチドと結合し、それゆえバックグラウンドＤＮＡの増幅を阻止する、少なくとも一つのメチル化に特異的なブロッカーオリゴマーが使用される。実施形態は、ブロッカーの分解または伸張が極力抑えられるよう、ポリメラーゼの選択またはブロッカーオリゴマーの改変を通じて、ブロッカーの分解または伸張が極力抑えられるように構成される。増幅を行うための正確な技術的指示は当業者には知られている（ＷＯ ０２／０７２８８０）。
【００１５】
メチル化に特異的な増幅およびメチル化に非特異的な増幅は、本発明により、異なるリンカーエレメントおよびプローブエレメントと組み合わせることができる。言うまでもなく、全ての実施形態は、プライマーの少なくとも一つの５’末端が、リンカーを介してプローブ配列と結合していることで共通している。リンカーの長さおよび構造に関する指示は、従来技術から得られる。特に、プローブは増幅されないようにしなければならない。これは当業者に知られている様々な形態を通じて実現することができる（欧州特許第０４１６８１７号；米国第５，５２５，４９４号；米国特許出願第２００３００８７２４０号）。好ましい実施形態ではリンカーにプライマーの伸張によって非転写鎖を阻止するＰＣＲブロッカーが含まれる。その場合、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）モノマーが特に好ましい。別法としてリンカーに２−Ｏ−アルキルーＲＮＡを含めることができる。部分的に５’−５’方向に互いに連結しているオリゴヌクレオチドの使用も考えられる（参照：米国特許出願第２００３００８７２４０号）。
【００１６】
さらにスコーピオン・プライマーは、プローブが分子内的にプライマーの伸張生成物に結合できるような構造に作られている。本発明によれば、プローブの混成は本来のＤＮＡのメチル化状態に依存して行われる。このことは、マトリックスＤＮＡの検査すべき位置がもともとメチル化されているか、または同じくメチル化されていないで存在する場合に限り、混成が起こることを意味する。該当するメチル化に特異的な検出は異なるやり方で行うことができる。すでに増幅がメチル化特異的に行われれば、メチル化に非特異的なプローブで十分かもしれない。すなわち、（メチル化特異的に）増幅体が生成した場合に限って、プローブの混成が行われる。言うまでもなく、本発明によればメチル化に特異的なプローブを使用することが好ましい。これはもともとメチル化されているかメチル化されていないＤＮＡとしか結合しない。それに応じて、プローブには少なくとも一個のメチル化に特異的なＣＧ、ＴＧまたはＣＡジヌクレオチドが含まれる。１〜３個の該当するジヌクレオチドが好ましい。プローブ配列の長さは、好ましくは６〜５０個のヌクレオチドであり、特に好ましくは１０〜４０個のヌクレオチドであり、さらに好ましくは１５〜３０個のヌクレオチドである。その場合、プローブは、核酸のアナログ、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）または２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡを含む。プローブの長さおよび構造に関する技術的な指示は米国特許第６，３２６，１４５号および米国特許出願第２００３００８７２４０号に記載されている。
【００１７】
加えて、プローブは少なくとも一つの目印を有しており、もし混成が行われたときはその目印によって検出することができる。これに関しては、様々なシグナルシステムが当業者に知られている。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を通じてシグナルを発生する蛍光色素−クエンチャーの組み合わせ（ペア）や層間挿入色素−色素の組み合わせ（ペア）を使用することができる。さらに、増幅体と固相との結合を可能にするシステムの使用も考えられる。これらの例や、同じくメチル化分析に使用することができ、それゆえ本発明の一部をなす別の例は、米国特許第６，３２６，１４５号および米国特許出願第２００３００８７２４０号（特に［００１８］；［５１］およびそれにつづく段落）に詳細かつ別の補強資料とともに記載されている。
【００１８】
シグナルシステムは好ましくは２成分からなる。これらは、実施形態では両成分が空間的に互いに離れている場合に限ってシグナルを発生するように考案されている。これとは逆に、両成分が互いに近接して存在する場合に限ってシグナルを発生するようにすることも可能である。両実施形態では、両成分は同じ分子によって使用に供されることもできるし、異なる分子によって使用に供することもできる。両成分は、プローブの様々な二次構造を通じて必要な空間構造を維持することができる。そのような例として、ヘアピン、ループ、嚢胞、アーム、エルボおよび幹などの構造をあげることができる。それぞれに応じて考え得る多くの実施形態は従来技術に属する（米国特許第６，３２６，１４５号および米国特許出願第２００３００８７２４０号、特に［５２］およびそれにつづく段落）。これらの実施形態もメチル化分析に使用することができ、それゆえ本発明の一部をなす。
【００１９】
好ましい実施形態では、蛍光色素−クエンチャーの組み合わせ（ペア）が使用される。これに該当する組み合わせ（ペア）は当業者に知られている（例えば、補強資料を含む米国特許出願第２００３００８７２４０号、［００２０］を参照）。特に好ましい変形実施形態では、クエンチャーおよび色素がプローブと結合してヘアピンを形成することで互いに近接して不活性な形で存在する（参照：Ｔｈｅｌｗｅｌｌら ２０００ 前記文献）。使用可能なヘアピン構造に関する正確な技術的指示は従来技術に属する（米国特許第６，３２６，１４５号および米国特許出願第２００３００８７２４０号）。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、スコーピオン・プライマーは二つのシグナル成分を有し、これら二つの成分は、空間的に互いに離れていて不活性な形で存在し、プローブがプライマーの伸張生成物と混成すると、空間的に互いに近接するようになる。特に好ましい変形実施形態では、活性な形のシグナル成分は、蛍光共鳴エネルギー移動を通じてシグナルを発生する。その場合、第一成分はスコーピオン・プライマーの３’領域に、そして第二成分は５’領域に存在する。
【００２１】
特に好ましい別の実施形態では、シグナル成分は、異なる分子と結合して空間的に互いに近接して不活性な形で存在する。この実施形態は、例えば、プローブと不活性な形のデュプレックスを形成するさらなる別のオリゴヌクレオチドを使用することで実現可能である。その場合、プローブはその５’末端に蛍光色素を有するのに対して、上記オリゴヌクレオチドはその３’末端にクエンチャーを有する。オリゴヌクレオチドの代わりに、核酸アナログから選択されるオリゴマー、例えばペプチド−核酸オリゴマーも使用することができる（参照：Ｓｏｌｉｎａｓら、上記文献；米国特許第６，３２６，１４５号；米国特許出願第２００３００８７２４０号）。
【００２２】
特に好ましい別の実施形態では、クエンチャーは、同じように、不活性な形でプローブと特別な空間的構造を形成する、さらなる別のヌクレオチドと結合している。この場合プローブは２種類の色素を有する。プローブと別のオリゴヌクレオチドとが互いに離れるとすぐに、両色素の間で蛍光共鳴エネルギー移動によるシグナルが発生する。オリゴヌクレオチドの代わりに、核酸アナログから選択されるオリゴマー、例えばペプチド−核酸オリゴマーも使用することができる（参照：Ｓｏｌｉｎａｓら、２００１、上記文献、特に７ページ以下と、６ページの図５）。
【００２３】
特に好ましい第五の実施形態は、ライトサイクラー法に似ており、色素標識分子を追加使用する。この実施形態では、さらなる分子とプローブとの間で特別な空間構造を必要としない。シグナルの発生は、ここでも蛍光共鳴エネルギー移動によって行われる。プローブだけでなく、このさらなる分子は、活性な形で増幅体と結合するため、両色素は互いに近接するようになり、その結果、シグナルを発生する。別の分子としては、好ましくは、オリゴヌクレチドか、核酸アナログから選択されるオリゴマーが使用される。オリゴヌクレオチド配列またはオリゴマー配列がメチル化に対して特異的である場合は、すなわち少なくとも一つのＣＧ（またはＴＧまたはＣＡ）−ジヌクレオチドを有する場合は、検出反応の特異性が高まる。配列の長さは、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドである。当業者にとって、さらなる技術的指示は公知のライトサイクラー法から得られる。
【００２４】
ここまで述べてきた全ての実施形態は、通常のプライマーとならんで、スコーピオン・プライマーを使用して行うことができる。しかし本発明によれば、プライマーは、それが前進プライマーであれ逆進（リバース）プライマーであれ、サソリの形で存在することが好ましい。このような組み合わせは多様な利点と結びつけることができる。例えば、特に好ましい第一の実施形態は、メチル化分析の感度を上げることができる。その場合、両スコーピオン・プライマーは、活性な形で同じシグナルを発生する。プローブは、ＤＮＡの異なる共メチル化位置と結合する。両スコーピオン・プライマーのシグナルは重畳してシグナル強度を増す。逆に、特に好ましい第二の実施形態では、検出反応の特異性が高まる。その場合、スコーピオン・プライマーは異なるシグナル成分を有する。ここでもプローブはＤＮＡの異なる共メチル化位置と混成する。しかし両シグナルが同時に現れる場合に限って正シグナルと見なされる。特に好ましい第三の実施形態では、メチル化分析の正確な内部定量化が可能である。その場合、一方のスコーピオン・プライマーはメチル化分析に使用され、他方のスコーピオン・プライマーは全ＤＮＡ量の定量に使用される。このような使用は、例えばメチル化に対して非特異的な増幅が行われ、かつ両スコーピオン・プライマーが異なるシグナル成分を有する場合に可能である。そこで、第一スコーピオン・プライマーのプローブは、上で述べたようにメチル化に特異的な位置と混成し、第二スコーピオン・プライマーのプローブは、非メチル化位置に結合する。したがって、第二スコーピオン・プライマーによって発生するシグナルで、ＤＮＡの全量が定量できるのに対して、第一スコーピオン・プライマーのシグナルは、メチル化（または非メチル化）ＤＮＡの量を示す。両シグナルから、メチル化ＤＮＡの量が正確に決定される。特に好ましい第四の実施形態では、メチル化分析と変異分析または対立遺伝子の識別を同時に行うことができる。それには、第一スコーピオン・プライマーがメチル化分析（上記を参照）に使用され、第二スコーピオン・プライマーが変異分析（または対立遺伝子の識別）に使用される。その場合、両スコーピオン・プライマーは、異なるシグナル成分を有する。第二スコーピオン・プライマーのプローブ配列は、ある決められた変異（またはある決められた対立遺伝子）に対して特異的である。次に、発生したシグナルからメチル化状態と変異の有無が結論される。
【００２５】
すでに上で述べたように、異なるメチル化に特異的な増幅法またはメチル化に非特異的な増幅法と、異なるリンカーおよび各種プローブシステムとを組み合わせることができる。同時に一つまたは二つのスコーピオン・プライマーを使用することができる。これによって、メチル化分析に適し、そしてそれゆえ本発明の範囲内に入るものと見なすことができる、多様な実施形態が生まれる。この方法をいかに実施すべきかは、本願明細書と従来の技術路とを組み合わせることから生まれる。次に、本発明の好ましい反応条件を詳しく記述する。当業者に知られているように、最適反応条件は、実施形態に応じて変形することができる。
【００２６】
本発明による方法にとっては、排他的にスコーピオン・プライマーを使用する必要はない。むしろ、スコーピオン・プライマーは、同じ配列を持つ従来のプライマーと一緒に、わずかな比率で使用するだけで十分である。両プライマー種の間の最適な比率は、特別なアッセイの構成によって変わるが、実験的に容易に決めることができる。好適なシグナルシステム（例えば異なる蛍光色素）を使用する場合、異なったスコーピオン・プライマーを使って複数個の配列を同時に検査することもできる（Ｔｈｅｌｗｅｌｌら ２０００ 上記文献；米国特許出願第２００３００８７２４０号）。スコーピオン・プライマーは、増幅反応実施中の異なる時間に加えることができる。それゆえ、スコーピオン・プライマーは、増幅反応の最後のサイクルに参加していれば十分である。これは、例えば終点分析を実施しなければならないような場合に適合する（参照：Ｓｏｌｉｎａｓら、２００１ 上記文献、６ページ）。もちろんスコーピオン・プライマーは、好ましくは、増幅開始時にはすでに存在している。このことは、特にリアルタイム法が適用される場合にあてはます。増幅は好ましくはＰＣＲを通じて行われる。当業者であれば、いかなる試薬、濃度および温度サイクルを使用すべきか、理解しているであろう。
【００２７】
本発明の方法の第三段階では、プライマー伸張生成物がマトリックス鎖から分離される。プライマー伸張生成物にプローブを結合させるには、この操作は不可欠である。この分離は、好ましくは昇温して行われる。ＰＣＲでは、この昇温操作を通常の温度サイクルの一環として行うことができる。
【００２８】
本発明の方法の第三段階では、プローブをプライマー伸張生成物と混成させる。その場合、混成は、最初のＤＮＡのメチル化状態に依存して行われる。このことは、マトリックスＤＮＡの検査すべき位置が最初からメチル化されているか、またはメチル化されない場合に限って混成が行われることを意味している。もしメチル化に非特異的な増幅を行おうとすれば、プローブの配列によって、メチル化に特異的な混成が確実に行われるようにしなければならない。一般に、（メチル化に特異的な）生成物が形成されたときに限って、メチル化に特異的な増幅と、メチル化に非特異的なプローブの使用で結合が行われる（上記を参照）。全ＤＮＡ量を決定し、メチル化分析とならんで変異分析も行わなければならないような場合は、２種類のスコーピオン・プライマーで反応を行うと、２種類のスコーピオン・プライマーのプローブの混成は、メチル化状態とは無関係に行うことができる（上記を参照）。
【００２９】
本発明の方法の第五段階では、混成が行われたか否かを検出する。その場合、検出は現在の技術水準によるシグナルの発生に依存して行われる。
【００３０】
当業者であれば、本発明による方法の段階２〜５が何回もくり返し可能であることを知っている。このことは特にリアルタイム法の適用に対してあてはまる。
【００３１】
すでにくり返し述べてきたが、本発明による方法は様々な実施形態に適用することができる。以下に、いくつかの好ましい実施形態を詳しく述べる。これらの方法を実施するための正確な技術的指示は、当業者にとって、従来技術と本願明細書との組み合わせから明らかとなろう。それにもかかわらず、本発明の方法は、以下に記載する変形に限定されるものではない。別の場所に開示されたメチル化分析に関するスコーピオン技術の実施形態も適用でき、それゆえ、本発明の一部をなす（特に、Ｔｈｅｌｗｅｌｌら、上記文献；Ｓｏｌｉｎａｓら、上記文献；米国特許第６，３２６，１４５号；米国特許出願第２００３００８７２４０号、特に［５２］以下を参照）。
【００３２】
第一の好ましい実施形態は、以下「メチル−ヘアピン」と名づける。その場合、増幅は、化学的に、または酵素で前処理したＤＮＡのメチル化に非特異的なＰＣＲによって行われる。それに応じて、もともとメチル化ＤＮＡおよびもともとメチル化されていないＤＮＡに同じやり方で結合するプライマーが使用される。それゆえ、このプライマーは、ＣＧジヌクレオチドを含まず、すでに変換前からこの配列に存在する位置に相当するＴＧジヌクレオチドおよびＣＡジヌクレオチドのみを含む。プライマーのペアとして、好ましくは、スコーピオン・プライマーと通常のＰＣＲプライマーとが使用される。スコーピオン・プライマーのリンカーには、プローブの増幅を阻止するため、好ましくはヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）モノマーが含まれる。当業者であれば、リンカーエレメントの設計方法については理解していよう（ＥＰ ０４１６８１７；米国特許第５，５２５，４９４号；米国特許出願第２００３００８７２４０号）。スコーピオン・プライマーのプローブエレメントは、ヘアピン構造を形成する。プローブ配列の長さは、好ましくは６〜５０ヌクレオチド、特に好ましくは１０〜４０ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドである。その場合、プローブは、核酸アナログ、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）または２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡを含むことができる。使用可能なヘアピン構造の長さおよび構造に関する正確な技術的指示は、現在の技術水準に属する（米国特許第６，３２６，１４５号；米国特許出願第２００３００８７２４０号）。プローブ配列はメチル化に対して特異的である。すなわち、プローブ配列は少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを有するか、またはメチル化に特異的なＴＧジヌクレオチドおよびＣＡジヌクレオチドを有する。該当するジヌクレオチドは、好ましくは１〜３個である。プローブは、さらに蛍光色素−クエンチャーのペアを有し、そのペアは、ヘアピンを形成することにより、空間的に互いに直接的に近接して存在する。ＰＣＲの過程でスコーピオン・プライマーを伸張し、つづいて、伸張したプライマーをマトリックス鎖から分離する。次に、スコーピオン・プライマーのプローブを、メチル化状態に依存する形で伸張プライマーに結合させる。色素とクエンチャーとを引き離すと蛍光シグナルが発生する。シグナルの検出は、現在の技術水準により、様々な方法で行うことができる。本発明の方法は、同じ配列の通常のプライマーに加えて、わずかな比率でスコーピオン・プライマーを使用するだけで十分である（上記を参照）。好適なシグナルシステムを使用する場合、異なるスコーピオン・プライマーを使用すれば同時に複数個の配列を同時に検査することが可能である。実施例１にはメチルーヘアピン法が記載されている。実施例２ではメチルライト法とメチル−ヘアピン法とが比較されている。図５は、メチル−ヘアピンの反応の経過を概略的に示したものである。
【００３３】
第二の好ましい実施形態は、以下「ＭＳＰ−メチル−ヘアピン」と呼ぶ。その場合、増幅は、化学的に、または酵素で前処理したＤＮＡのメチル化に特異的なＰＣＲによって行われる。それに応じて、好ましくは、もともとメチル化されたＤＮＡまたはもともとメチル化されていないＤＮＡに結合するプライマーが使用される。したがって、このプライマーは、ＣＧジヌクレオチドまたはメチル化に特異的なＴＧジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチドを含む。好ましくは、プライマーは少なくとも３つの対応するジヌクレオチドを有し、少なくとも１つの３’末端が限定される。プライマーのペアとして、好ましくはスコーピオン・プライマーと通常のＰＣＲプライマーとが使用される。リンカーおよびプローブは、メチル−ヘアピン法の場合と同様に構成される（上記を参照）。その場合、プローブは、好ましくはメチル化に特異的な配列を使用する。すなわち、プローブは少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを有するか、またはメチル化に特異的なＴＧジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチドを有する。該当するジヌクレオチドは、好ましくは１〜３個である。増幅はすでにメチル化に特異的に行われるため、メチル化に非特異的なプローブを使用することもできる。シグナルの発生は、メチル−ヘアピン法の場合と同様、蛍光色素−クエンチャーのペアを通じて行われる（上記を参照）。
【００３４】
第三の好ましい実施例は、以下「ヘビー・メチル−ヘアピン」と呼ぶ。その場合、増幅は、化学的に、または酵素で前処理したＤＮＡのメチル化に特異的なヘビー・メチルＰＣＲによって行われる（上記を参照）。これにはメチル化に非特異的なプライマーが使用される。すなわち、もともとメチル化されたＤＮＡおよびもともとメチル化されていないＤＮＡに同じやり方で結合するプライマーが使用される。それゆえ、このプライマーは、ＣＧジヌクレオチドを含まず、すでに変換前からこの配列に存在する位置に相当するＴＧジヌクレオチドおよびＣＡジヌクレオチドのみを含む。メチル化に特異的な増幅は、少なくとも一つのメチル化に特異的なブロッカー−オリゴマーを使用して確実に行われるようにされる。ブロッカーは、ＣＧジヌクレオチド（またはメチル化に特異的なＴＧジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチド）に結合してバックグラウンドＤＮＡの増幅を阻止する。この実施形態は、ポリメラーゼの選択を通じて、またはブロッカーオリゴマーの修飾を通じて、ブロッカーの分解または伸張を極力抑えるように構成することができる。プライマーのペアとして、好ましくはスコーピオン・プライマーと通常のＰＣＲプライマーとが使用される。リンカーおよびプローブは、メチル−ヘアピン法の場合と同様に構成される（上記を参照）。その場合、プローブは、好ましくはメチル化に特異的な配列を使用する。すなわち、プローブは少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを有するか、またはメチル化に特異的なＴＧジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチドを有する。該当するジヌクレオチドは、好ましくは１〜３個である。特に好ましい実施形態では、ヘビー・メチル−ヘアピンアッセイは、ブロックとシグナル発生とに、メチル化に特異的な同じジヌクレオチドを使用する。これによって、分析に必要なジヌクレオチドの数が少なくなり、その結果、ヘビー・メチル−ヘアピン法は、ヘビー・メチル法より広い適用範囲を持つことができる。さらに、より高い特異性も実現される。増幅は、すでにメチル化特異的に行われるため、メチル化に非特異的なプローブを使用できる。シグナルの発生は、メチル−ヘアピン法の場合と同様、蛍光色素−クエンチャーのペアを通じて行われる（上記を参照）。実施例３でヘビー・メチル−ヘアピン法について説明する。
【００３５】
第四の好ましい実施例は、以下「メチル−デュプレックス」と呼ぶ。この改変法と上記メチル−ヘアピン改変法とでは、プローブエレメントだけが異なる。メチル−デュプレックス法の場合は、色素とクエンチャーは異なる分子に連結されていて、空間的に互いに近接して不活性な形で存在する。これは、例えばプローブと不活性な形でデュプレックスを形成する別のオリゴヌクレオチドの使用によって可能である。オリゴヌクレオチドの代わりに、核酸アナログ、例えばペプチド−核酸−オリゴマーから選択される別のオリゴマーを使用することもできる（参照：Ｓｏｌｉｎａｓら、上記文献；米国特許第６，３２６，１４５号；米国特許出願第２００３００８７２４０号）。図６は、メチル−ヘアピンの反応の経過を概略的に示したものである。
【００３６】
第五の好ましい実施形態は、以下「ＭＳＰ−メチル−デュプレックス」と呼ぶ。この改変法と上記ＭＳＰ−メチル−ヘアピン改変法とでは、プローブエレメントだけが異なる。これも別のオリゴマーとで特殊な空間構造、例えばデュプレックスを形成する（上記参照）。
【００３７】
第六の好ましい実施形態は、以下「ヘビー・メチル−デュプレックス」と呼ぶ。この改変法は、「ヘビー・メチル−ヘアピン」と、別のオリゴマーと一緒に特殊な空間構造、例えばデュプレックスを形成するプローブエレメントとを組み合わせたものに相当する（上記参照）。
【００３８】
第七の特に好ましい実施形態は、定量的「メチル−ヘアピン」アッセイを対象とする。この実施形態は、「メチル−ヘアピン−アッセイ」というべきものであり、第二のスコーピオン・プライマーが使用される。これによれば内部定量が可能となる。第二スコーピオン・プライマーのプローブはメチル化に非特異的であり、メチル化状態には無関係に増幅体に結合する。これによって発生するシグナルを使ってＤＮＡの全量が定量される。他方、第一スコーピオン・プライマーは、メチル化（または非メチル化）ＤＮＡの値を与える。両シグナルからメチル化ＤＮＡの正確な量を決定できる。
【００３９】
本発明の別の局面は、本発明による全ての実施形態を使用することにある。本発明による方法は、疾患に特異的なシトシンの位置を検査する場合、特に、癌またはメチル化状態の変化を伴うその他の疾患の診断または予後の予測に適している。これに該当する症例は、中枢神経系の障害、攻撃的症状または行動傷害；脳障害による臨床的、心理的および社会的結果；精神障害および人格障害；認知症および／またはそれに関連する症状；心臓血管に関する疾患、機能不全および障害；胃腸管の機能不全、障害または疾患；呼吸器系の機能不全、障害または疾患；負傷、炎症、感染、免疫および／または回復；発育過程における逸脱としての身体の機能不全、障害または疾患；皮膚、筋肉、結合組織または骨の機能不全、障害または疾患；内分泌系および代謝系の機能不全、障害または疾患；頭痛または性的機能不全などである。さらに、本発明による方法は、治療薬の副作用の予想、特異的な薬物治療の決定（各個人に合わせた医学）、薬物治療結果の監視にも適する。さらに別の応用は、細胞のタイプまたは組織の識別および細胞分化の検査である。
【００４０】
メチル化分析および、メチル化状態の変化を伴う上記疾患の立証または予後の予測にスコーピオン・プライマーを使用することも本発明の対象である。治療薬の副作用の予想、特異的な薬物治療の決定（各個人に合わせた医学）、薬物治療結果の監視へのスコーピオン・プライマーの使用も本発明のさらに別の対象である。さらに、細胞のタイプまたは組織の識別および細胞分化の検査も本発明の対象である。本明細書で使用される「スコーピオン・プライマー」は、その５’末端でリンカーを介してプローブ配列に結合したプライマーである（上記を参照）。
【００４１】
最後に、少なくとも一つのスコーピオン・プライマーと、ポリメラーゼと、ＰＣＲのために必要な試薬とからなるキットも本発明の対象である。
【実施例】
【００４２】
実施例１：メチル−ヘアピン−リアルタイムＰＣＲアッセイによるｂｒｃａｌ遺伝子のメチル化ＤＮＡの定量
ヒトｂｒｃａｌ遺伝子の亜硫酸水素塩で処理した断片を増幅した（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｌ７８８３３．１，ｎｔ ３５３８〜ｎｔ ３６６６；ＳｅｑＩＤ−７）。マトリックスには末梢血球からのＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および包括的にメチル化したヒトＤＮＡ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用した。両ＤＮＡ種は、亜硫酸水素塩溶液で処理した（Ｏｌｅｋら、１９９６，上記文献）。この処理によって非メチル化シトシンはウラシルに変換されたのに対して、５−メチルシトシンは変化しないで残った。亜硫酸水素塩処理後、ＤＮＡ濃度をＵＶ吸収（２６０ｎｍ）によって決定した。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．１ｎｇの亜硫酸水素塩でそれぞれ処理したメチル化マトリクス−ＤＮＡを使用して、アッセイの能力を調べた。反応は、ライトサイクラー装置を使用し、全体積２０μＬで行った。反応混合物は、１０μＬのマトリックスＤＮＡ（濃度については下記を参照）、２μＬの混成プローブ用ＦａｓｔＳｔａｒｔ−ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ反応混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、０．３０μｍｏｌ／Ｌの前進プライマー（５’−ＧＡＡＧｔＴＧＡｔＡＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴｔＴＴＴＧＡ−３’；ＳｅｑＩＤ−１）、０．１０μｍｏｌ／Ｌの逆進プライマー（５’−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；ＳｅｑＩＤ−２）、０．５μｍｏｌ／Ｌのスコーピオン・プライマー（５’−ＦＡＭ−ＧＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＣＣ−ＭＲ−ＨＥＧ−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；プローブエレメント：ＳｅｑＩＤ−６；プライマーエレメント：ＳｅｑＩＤ−８）および２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2を含む。加熱サイクルは、９５゜Ｃで１０分間保温することから開始し、そのあとは、９５゜Ｃで１０秒間、５６゜Ｃで３０秒間そして７２゜Ｃで１０秒間のサイクルを５５回くり返した。毎サイクル、５６゜Ｃで行うアニーリングの前に、蛍光シグナルを検出した。
【００４３】
ウラシルとチミンは、塩基対の特性が同じであるため、変換されない非メチル化シトシンに対応する位置を小文字の「ｔ」（あるいは相補鎖では小文字の「ａ」）で示した。それに対して、亜硫酸水素塩で処理する前から存在していたチミンに対しては大文字のＡ（あるいは相補鎖では「Ａ」）で示した。この実施例およびそのあとの実施例でプライマー配列の表記に使われている略字の意味は次の通りである：ＦＡＭ＝フルオレッセインでラベル；ｒｅｄ６４０＝ライトサイクラー−フルオレッセインでラベル、チャンネルＦ２；ＭＲ＝メチルレッドでラベル；ＨＥＧ＝ヘキサエチレングリコールのスペーサー；ｐｈｏ＝リン酸塩で修飾；ｆｌｕｏ＝フルオレッセイン。
【００４４】
結果を表１および図１に示す。表１は、ライトサイクラー・ソフトウェアで計算した２回くりかえし閾値の平均値を示す。負の比較対照からは、増幅体は生成しなかった（１０ｎｇの亜硫酸水素塩で処理した非メチル化ＤＮＡ；５０ｎｇのゲノムＤＮＡ；水）。得られたデータから、メチル−ヘアピンアッセイによって、ｂｒｃａｌ遺伝子の亜硫酸水素塩処理したメチル化ＤＮＡを検出できることがわかる。亜硫酸水素塩で処理したメチル化マトリックスＤＮＡの場合、ＰＣＲ法は、少なくとも３桁のオーダーで直線性を示す（図１）。したがって、メチル−ヘアピンアッセイは、リアルタイムＰＣＲプラットフォーム上で、メチル化ＤＮＡを定量することができる。
【００４５】
【表１】
亜硫酸水素塩で処理したマトリックスDNAの量(ng) メチル-ヘアピンの限界サイクル
【００４６】
実施例２：亜硫酸塩処理したメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとからなるＤＮＡ混合物中のｂｒｃａｌ−Ａｍｐｌｉｃｏｎｓのメチル化に特異的な検出に対するメチル−ヘアピンアッセイとメチルライトアッセイとの比較
【００４７】
以下では、リアルタイムＰＣＲ法メチルヘアピンとメチルライトとを比較した。亜硫酸塩処理した、もともとメチル化されていないＤＮＡのバックグラウンド下において、亜硫酸塩処理した、もともとメチル化されていないＤＮＡの量を決定した。
【００４８】
ＰＣＲによる増幅は、ライトサイクラー装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、２０μＬの全体積で行った。ヒトｂｒｃａｌ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｌ７８８３３．１のｎｔ ３５３８〜ｎｔ ３６６６；ＳｅｑＩＤ−７）の亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡ断片を増幅した。メチル−ヘアピン反応混合物は、１０μＬのマトリックスＤＮＡ（濃度については下記を参照）、２μＬの混成プローブ用ＦａｓｔＳｔａｒｔ−ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ反応混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、０．３０μｍｏｌ／Ｌの前進プライマー（５’−ＧＡＡＧｔＴＧＡｔＡＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴｔＴＴＴＧＡ−３’；ＳｅｑＩＤ−１）、０．１０μｍｏｌ／Ｌの逆進プライマー（５’−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；ＳｅｑＩＤ−２）、０．５μｍｏｌ／Ｌのスコーピオン・プライマー（５’−ＦＡＭ−ＧＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＣＣ−ＭＲ−ＨＥＧ−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；プローブエレメント：ＳｅｑＩＤ−６；プライマーエレメント：ＳｅｑＩＤ−８）および２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2を含む。メチルライト反応混合物は、１０μＬのマトリックスＤＮＡ、２μＬの混成プローブ用ＦａｓｔＳｔａｒｔ−ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ反応混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、０．３０μｍｏｌ／Ｌの前進プライマー（５’−ＧＡＡＧｔＴＧＡｔＡＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴｔＴＴＴＧＡ−３’；ＳｅｑＩＤ−１）、０．３０μｍｏｌ／Ｌの逆進プライマー（５’−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；ＳｅｑＩＤ−２）、０．２５μｍｏｌ／Ｌの混成プローブ１（５’−ＧＣＧＧＡＡｔｔＴＧＡＧＡＧＧＣＧＴＡ−ｆｌｕｏ−３’；ＳｅｑＩＤ−３）および混成プローブ２（５’−ｒｅｄ６４０−ＧＣＧＴＴＧＴＧＡＡｔｔｔＴＧＧＧＧＡＧ−ｐｈｏ−３’；ＳｅｑＩＤ−４）を含む。加熱サイクルは、９５゜Ｃで１０分間保温することから開始し、そのあとは、９５゜Ｃで１０秒間、５６゜Ｃで３０秒間そして７２゜Ｃで１０秒間のサイクルを５５回くり返した。毎サイクル、５６゜Ｃで行うアニーリングの前に、蛍光シグナルを検出した。
【００４９】
実施例１に記載の試料と同じ試料からＤＮＡを分離した。いずれの反応でも亜硫酸水素塩で処理した全量２０ｎｇのＤＮＡを使用した。メチル化ＤＮＡの比率は、１００％、５０％および１０％とした。これは各反応当たりの絶対量で２０ｎｇ（１００％）、１０ｎｇ（５０％）および２ｎｇ（１０％）に相当する。両アッセイは、同じライトサイクラー装置で同じＤＮＡ混合物を使い、並行して行った。蛍光シグナルは別々のチャンネルで検出した。メチル−ヘアピンアッセイは、チャンネルＦ１（５２０ｎｍ）でシグナルを発生した。メチルライトアッセイのシグナルは、チャンネルＦ２で検出した（６４０ｎｍ）。
【００５０】
実験データから、両アッセイとも全濃度で、非メチル化ＤＮＡのバックグラウンド下において、メチル化ＤＮＡのシグナルを得ることができることが証明された（図２および３）。亜硫酸水素塩で処理したメチル化ＤＮＡはシグナルを生じなかった。メチル−ヘアピンアッセイは、メチルライトアッセイと比較して強いシグナルを発生し、良い分析結果を与えた。このことは、特に１０％試料で当てはまる。すなわち、メチルライトアッセイのシグナルはバックグラウンドのシグナルに対して１４０％、スコーピオンアッセイのシグナルは１８０％であった。これらの結果から、メチル−ヘアピンアッセイは、１８ｎｇのバックグラウンド下で、少なくとも２ｎｇのメチル化ＤＮＡを検出できることがわかる。すなわち、メチル−ヘアピンアッセイは、メチルライトアッセイより感度が高い。
【００５１】
実施例３：４０００倍の非メチル化ＤＮＡバックグラウンド下における、ｂｒｃａｌ遺伝子のメチル化ＤＮＡの検出にヘビー・メチル−ヘアピンアッセイの使用
【００５２】
本明細書に記載するアッセイは、ヘビー・メチル−ヘアピン技術およびメチル−ヘアピン技術の利点と結び付いている。メチル化特異的ブロッカー（ヘビー・メチル）と、スコーピオン・プライマー（メチルヘアピン）によるメチル化特異的検出と、を使用するとメチル化ＤＮＡを選択的に検出するための新しいリアルタイムＰＣＲ技術（ヘビー・メチル−ヘアピン）が創出される。
【００５３】
ヘビー・メチル−ヘアピンアッセイは、ライトサイクラー装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、２０μＬの全体積で行った。ヒトｂｒｃａｌ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｌ７８８３３．１のｎｔ ３５３８〜ｎｔ ３６６６；ＳｅｑＩＤ−７）の亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡ断片を増幅した。反応混合物は、１０μＬのマトリックスＤＮＡ（濃度については下記を参照）、２μＬの混成プローブ用ＦａｓｔＳｔａｒｔ−ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ反応混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、０．３０μｍｏｌ／Ｌの前進プライマー（５’−ＧＡＡＧｔＴＧＡｔＡＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴｔＴＴＴＧＡ−３’；ＳｅｑＩＤ−１）、０．１０μｍｏｌ／Ｌの逆進プライマー（５’−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；ＳｅｑＩＤ−２）、０．５μｍｏｌ／Ｌのスコーピオン・プライマー（５’−ＦＡＭ−ＧＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＣＣ−ＭＲ−ＨＥＧ−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；プローブエレメント：ＳｅｑＩＤ−６；プライマーエレメント：ＳｅｑＩＤ−８）、４μｍｏｌ／Ｌのブロッカー（５’−ＴＡＡＴＣＣＴＣＡａＣＡＣＴＴＣＣＣＴＣＡＣＡＡＣＣＴ−ｐｈｏ−３’：ＳｅｑＩＤ−５）および２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2を含む。加熱サイクルは、９５゜Ｃで１０分間保温することから開始し、そのあとは、９５゜Ｃで１０秒間、５６゜Ｃで３０秒間そして７２゜Ｃで１０秒間のサイクルを５５回くり返した。毎サイクル、５６゜Ｃで行うアニーリングの前に、蛍光シグナルを検出した。実施例１に記載の試料と同じ試料からＤＮＡ混合物を分離した。亜硫酸水素塩処理した、もともとメチル化されているＤＮＡの量は、各試料、１００ｐｇとした。バックグラウンドの非メチル化ＤＮＡの量は試料ごとに変えた。メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡのとの比、１：１０００および１：４０００は、亜硫酸水素塩処理したあとで所定の比になるように混合して調製した。それぞれに対応して、ＤＮＡの絶対量は、反応に対して１００．１ｎｇ（１：１０００）、または４００．１ｎｇ（１：４０００）であった。正の対照試料として、非メチル化バックグラウンドを含まない１００ｐｇのメチル化ＤＮＡを使用し、負の対照試料として１００ｎｇの非メチル化ＤＮＡを使用した。
【００５４】
結果を図４に示す。ヘビー・メチル−ヘアピンアッセイにより、１：１０００および１：４０００の両感度比で１００ｐｇのメチル化ＤＮＡを検出することができた。１００ｎｇの非メチル化ＤＮＡではシグナルは得られなかった。それに対して、非メチル化ＤＮＡのバックグラウンドを含まない１００ｐｇメチル化ＤＮＡからなる正の対照試料では強いシグナルが発生した。これらのデータから、ヘビー・メチル−ヘアピンアッセイは、４０００倍の非メチル化ＤＮＡのバックグラウンド下でも、メチル化ＤＮＡを高感度で検出できることがわかる。
【００５５】
実施例４（理論的実施例）：スコーピオ・リアルタイム分析（ヘビー・メチル−ヘアピンアッセイ）によるＧＳＴＰｉ遺伝子のメチル化分析
ＧＳＴＰｉ遺伝子の下記断片（亜硫酸水素塩で処理）を増幅する：
ＣＧＧＧＡｔｔＡｔｔｔＴＴＡＴＡＡＧＧｔＴＣＧＧＡＧＧｔＣＧＣＧＡＧＧｔｔＴＴＣＧｔＴＧＧＡＧＴＴＴＣＧｔＣＧｔＣＧｔＡＧＴｔＴＴＣＧｔｔＡｔｔＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９ ｎｔ；１８４５〜ｎｔ１９２４ Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ３２４３８７）。ＰＣＲは上記の反応条件で行った。プライマーには次の配列を使用した：前進プライマー（ＧＧＧＡｔｔＡｔｔｔＴＴＡＴＡＡＧＧＡｔＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、逆進プライマー（ＴＡＣＴＣＡＣＴａａＴａａＣＫＡＡａＡＣＴａＣ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、スコーピオン・プライマー（ＦＡＭ−ｇｇｃａｇｃｃＧｔＴＧＧＡＧｔｔｔＣＧｔＣＧｇｇｃｔｇｃｃ−ＤＤＱ−ＨＥＧ−ＴＡＣＴＣＡＣＴＡＡＴＡＡＣＫＡＡＡＡＣＴＡＣ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２，１３）、４μＭ ブロッキング試料（ＣＴＡＡＴＡＡＣａＡＡＡＡＣＴＡＣａＡＣａＡＣａＡＡＡＣＴＣＣＡＡＣ−ＰＨＯ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）。上記の標準スコーピオプライマーの代わりに次のデュプレックススコーピオプライマーも使用できる：ＦＡＭ−ＧｔＴＧＧＡＧｔｔｔＣＧｔＣＧ−ＨＥＧ−ＴＡＣＴＣＡＣＴＡＡＴＡＡＣＫＡＡＡＡＣＴＡＣ（Ｓｅｑ ＩＤ；ＣＧａＣＧａａａＣＴＣＣＡａＣ−ＤＤＱ；Ｓｅｑ ＩＤ ＮＯ：１５；ＮＯ：１６）。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】メチル−ヘアピンアッセイによる亜硫酸水素塩処理したｂｒｃａｌＤＮＡのリアルタイム増幅（実施例１）：Ｙ軸はサイクルごとに測定される蛍光シグナルを表す（チャンネルＦ１）。Ｘ軸はサイクル回数を示す。負の対照試料はシグナルを発生しなかった：水（星印）、５０ｎｇゲノムＤＮＡ（×）、１０ｎｇ亜硫酸水素処理した非メチル化ＤＮＡ（○）。亜硫酸水素処理したメチル化ＤＮＡは、●（１０ｎｇ）、▲（１ｎｇ）および■（０．１ｎｇ）で示してある。
【図２】混成プローブを使用するメチルライトアッセイによる亜硫酸水素塩処理したｂｒｃａｌＤＮＡのリアルタイム増幅（実施例２）：Ｙ軸はチャンネルＦ２（６４０ｎｍ）における蛍光シグナルを表す。測定はサイクルごとに行った（Ｘ軸）。曲線は、非メチル化ＤＮＡのバックグラウンド下における１００％（●）、５０％（◆）および１０％メチル化ＤＮＡ（▲）を表す。各試料中の２０ｎｇ亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを、全部一斉に検査した。２０ｎｇの非メチル化ＤＮＡはシグナルが決定できなかった（□）。
【図３】混成プローブを使用するメチル・ループアッセイによる亜硫酸水素塩処理したｂｒｃａｌＤＮＡのリアルタイム増幅（実施例２）：Ｙ軸はチャンネルＦ１（５２０ｎｍ）における蛍光シグナルを表す。測定はサイクルごとに行った（Ｘ軸）。曲線は、非メチル化ＤＮＡのバックグラウンド下における１００％（●）、５０％（◆）および１０％メチル化ＤＮＡ（▲）を表す。全部合わせて、各試料当たり２０ｎｇ亜硫酸水素塩ＤＮＡを使用した。２０ｎｇの非メチル化ＤＮＡの場合、シグナルは検出されなかった（□）。
【図４】ヘビー・メチル−ヘアピンアッセイによるｂｒｃａｌ−ＤＮＡの高感度検出（実施例３）：Ｙ軸はチャンネルＦ１（５２０ｎｍ）における蛍光シグナルを表す。測定はサイクルごとに行った（Ｘ軸）。下記量の非メチル化ＤＮＡのバックグラウンド下に、それぞれ１００ｐｇのメチル化ＤＮＡを決定した：バックグラウンドＤＮＡ非存在（●）、１００ｎｇ（▼）、４００ｎｇ（▲）。負の対照試料（１００ｎｇの非メチル化ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡを含まず）ではシグナルは得られなかった（□）。
【図５】メチル−ヘアピン法の経過を概略的に表したものである。スコーピオン・プライマーは左側に存在する。スコーピオン・プライマーの（メチル化に特異的な）プローブエレメントは、ヘアピン状の形で存在する。それは蛍光色素（▲）とクエンチャー（■）とを有し、それらはヘアピン構造を取ることによって空間的に互いに直接的に近接して存在する。ジグザグの線はリンカーエレメント内のＰＣＲストッパーを表す。すでに亜硫酸水素塩処理した検査すべきＤＮＡは二本の棒で表わしてある。ＤＮＡ内のＣＧ位が検査すべき位置である。シトシンがもともとメチル化されている場合だけ、シトシンは、亜硫酸水素塩で処理しても変化を受けないままであった。それに対して、非メチル化シトシンはウラシル（またはチミン）に変換される。スコーピオン・プライマーの（ここではメチル化に対して非特異的な）プライマーエレメントは、熱変性後、一本鎖ＤＮＡに結合することができる。ポリメラーゼによってプライマーの伸張が起こる。さらに熱変性を行うと、プローブは、伸張生成物がＣＧヌクレオチドを含む限り、伸張したプライマーに分子内的に結合する。しかしこれがあてはまるのは、検査すべきＤＮＡがもともとメチル化されて存在した場合に限る。非メチル化シトシンは、プローブに結合しないＴＧジヌクレオチドを生成する（図示されていない）。伸張したプライマー配列にプローブが結合するとヘアピンが解除され、蛍光シグナルが検出できるようになる（図は、Ｔｈｅｌｗｅｌｌら ２０００、上記文献、３７５３ページによって改変）。
【図６】メチル−デュプレックス法の経過を概略的に表したものである。スコーピオン・プライマーは左側に存在する。スコーピオン・プライマーの（メチル化に特異的な）プローブエレメントは、別の追加オリゴヌクレオチドと一緒になって、二本鎖の形で存在する。プローブエレメントは、蛍光色素（▲）を有する。追加オリゴヌクレオチドにクエンチャー（■）が結合する。両成分は、デュプレックスによって、空間的に互いに直接的に近接して存在する。ジグザグの線は、スコーピオン・プライマーのリンカーエレメント内のＰＣＲストッパーを表す。すでに亜硫酸水素塩処理した検査すべきＤＮＡは二本の棒で表わしてある。検査すべき位置はＤＮＡ内のＣＧ位である。シトシンがもともとメチル化されている場合に限って、シトシンは、亜硫酸水素塩で処理しても変化を受けないまま残った。それに対して、非メチル化シトシンはウラシル（またはチミン）に変換される。スコーピオン・プライマーの（ここではメチル化に対して非特異的な）プライマーエレメントは、熱変性後、一本鎖ＤＮＡに結合することができる。ポリメラーゼによってプライマーの伸張が起こる。さらに熱変性を行うと、デュプレックスは、プローブおよび追加オリゴヌクレオチドから分離し、プローブは、伸張生成物がＣＧヌクレオチドを含む限り、伸張したプライマーに分子内的に結合する。しかしこれがあてはまるのは、検査すべきＤＮＡがもともとメチル化されて存在した場合に限る。非メチル化シトシンは、プローブに結合しないＴＧジヌクレオチドを生成する（図示されていない）。伸張したプライマー配列にプローブが結合すると、色素およびクエンチャーが分離され、蛍光シグナルが検出できるようになる（図は、Ｓｏｌｉｎａｓら ２００１、上記文献、ｅ９６ページによって改変）。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡ中の５−メチルシトシンの検出法に関する。５−メチルシトシンは真核細胞のＤＮＡの中で共有結合的に修飾を受ける頻度の最も高い塩基である。この塩基は、とりわけ転写の調節、遺伝すり込みおよび癌の発生において生物学的に重要な役割を演じている（総説：Ｍｉｌｌｅｒら、：Ｆｉｖｅ ｎｏｔ Ｆｏｕｒ：第五番目の塩基の歴史と意義、Ｓ．Ｂｅｃｋおよび Ａ．Ｏｌｅｋ（編），Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ２００３年，３〜２０ページを参照）。それゆえ、５−メチルシトシンを遺伝子情報の要素として確認することは重要な課題である。シトシンおよび５−メチルシトシンは塩基対の形成において同じ挙動を示すためメチル化の検出は当然のこととして困難である。従って混成を基礎にする従来の検出法の多くは、シトシンとメチルシトシンとを識別できない。加えて、ＰＣＲ増幅時にメチル化情報は完全に失われる。
【背景技術】
【０００２】
従来のメチル化分析法は、大きく分けて二種類の異なった原理に基づいている。その一つは、メチル化に対して特異的な制限酵素を使用する方法である。もう一つは、選択的に非メチル化シトシンをウラシルに化学変換する方法である（いわゆる亜硫酸水素塩処理。例えばＤＥ １０１ ５４ ３１７ Ａ１；ＤＥ １００ ２９ ９１５ Ａ１）。そこで、酵素または化学的に処理されたＤＮＡは、多くの場合増幅したのち異なったやり方で分析することが可能である（総説：ＷＯ ０２／０７２８８０ Ｓ．１ ｆｆ）。その場合、メチル化を感度よく定量的に検出できる方法に関心が向けられる。このことは、癌の発生におけるシトシンのメチル化の重要な役割を考えれば、特に診断への応用の面に大きな関心が寄せられる。その場合、体液、例えば血清で異常なメチル化パターンを検出する方法が特に重要な意味を持つ。なぜなら、不安定なＲＮＡと違い、体液中にＤＮＡが見つかることが少なくないからである。それどころか、癌のような破壊的な病理過程においては、血中ＤＮＡ濃度が上昇する。したがって、体液中に存在する腫瘍ＤＮＡのメチル化分析によって癌を診断することが可能であり、そのことについてはすでに数多くの記載がある（例えば、Ｐａｌｍｉｓａｎｏら：Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｂｅｒｒａｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｐｕｔｕｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｎｏｖ １；６０（２１）：５９５４〜８）。そこで問題になるのは、体液中には疾患タイプのメチル化パターン以外に、配列が同じでメチル化パターンが異なるＤＮＡが多量に存在していることである。そのため、診断法は、配列が同じＤＮＡの強いバックグラウンドの中で、メチル化のパターンが異なる少量の、とりわけ、メチル化ＤＮＡを検出する必要がある。
【０００３】
感度の高い現行検出法は、ＰＣＲ増幅を通じて行われる。その場合に使用される方法は、いわゆるメチル化に感応するＰＣＲ法である（「ＭＳＰ」；Ｈｅｒｍａｎら、：Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ：ａ Ｎｏｖｅｌ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６ Ｓｅｐ ３：９３（１８）：９８２１〜６）。この場合、あらかじめメチル化されているか（または逆の手法ではメチル化されていない）、亜硫酸水素塩で処理された配列位置のみに特異的に結合するプライマーが使用される。これに比する感度の高い方法は、いわゆる「ヘビー・メチル」法である。この場合は、メチル化に特異的なブロッカーオリゴマーを使用することで、もともとメチル化されている（またはメチル化されていない）ＤＮＡのみが特異的に増幅される（総説：ＷＯ ０２／０７２８８０）。ＭＳＰ法もヘビー・メチル法も定量可能なリアルタイム改変法として使用できる。そのため、あとで生成物を分析する必要がなく、ＰＣＲ実施中に直接メチル化のステータスが低い位置を検出することができる（「ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ」−ＷＯ ００／７００９０；ＵＳ ６，３３１，３９３）。この場合、実施形態は「Ｔａｑｍａｎ」法である。この方法は蛍光色素−クエンチャー対を有するプローブ分子を使用する。プローブは配列特異的に増幅体（Ａｍｐｌｉｆｉｋａｔｅ）と混成し、次の増幅サイクルの過程でポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって分解する。クエンチャーと色素が分離されると、検出可能な蛍光シグナルが生じる（Ｅａｄｓら：ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ：ａ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｓｓａｙ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０００ Ａｐｒ １５：２８（８）：Ｅ３２参照）。さらに別の実施形態はいわゆるライトサイクラー法である。この方法は２種類の異なったプローブが使用される。プローブは、互いに直接的に近接して増幅体と混成し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を通じて検出可能なシグナルを発生する。
【０００４】
このリアルタイム法のメチル化分析への適用性はもちろん限られる。それは、特に、特異性、選択性および反応速度に関してあてはまる。しかし、シトシンのメチル化の特別な生物学的医学的重要性のため、優れたメチル化分析法の開発に対して強い技術的な需要がある。以下にそのような方法について記述する。本発明においては、プローブとプライマーは互いに結合し、プローブは分子内的に混成して標的配列を形成することができる。本発明による方法は効果的かつ迅速な検出が可能であり、そのため、極めて高感度で極めて特異性の高いメチル化分析を可能にする。
【０００５】
本発明による方法に類似するメチル化分析法はすでに「スコーピオン」の名称で記載されている（例えば、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｆ−ｐｒｏｂｉｎｇ ａｍｐｌｉｃｏｎｓ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９ Ａｕｇ；１７（８）：８０４〜７；Ｔｈｅｌｗｅｌｌら：Ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｔｏ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０００ Ｏｃｔ １；２８（１９）：３７５２〜６１；米国特許第６，３２６，１４５；米国特許第６，３６５，７２９号；米国特許出願第２００３００８７２４０ Ａ１号）。スコーピオン法は異なる実施形態で適用することが可能である。もちろん、全ての方法は、プローブが分子内的に結合する点で共通している。いわゆる「ヘアピンループ」改変法の場合、スコーピオン・プライマーは、５’末端に、特別なヘアピンループ配置で存在する特異的なプローブ配列を有する。プローブ配列の末端には蛍光色素とクエンチャーとが存在し、ヘアピンを形成することで互いに近接する。プローブ配列とプライマー配列は、いわゆるＰＣＲストッパーを有するリンカーを介して結合している。増幅が一巡して、生成した二本鎖が分離すると、プローブは分子内的に同じ分子鎖の伸張したプライマー配列に結合する。この混成によってヘアピンが開くと、蛍光色素とクエンチャーは分離し、その結果、シグナルを検出することができる。ＰＣＲストッパーは、ＰＣＲの中でポリメラーゼが「通読」するのを阻止し、間違った正信号を回避する（参照：Ｔｈｅｌｗｅｌｌら、２０００，特に上記文献の３７５３ページの図１）。
【０００６】
スコーピオン法の別の改変法は、いわゆる「デュプレックス」法である。この場合は、プローブ配列は、ヘアピン構造ではなくて、別のオリゴヌクレオチドとデュプレックスを形成する。すなわち、プローブ配列の５’末端は蛍光色素と結合し、他方もう一つのオリゴヌクレオチドは３’末端にクエンチャーを有する。デュプレックスが形成することで、クエンチャーと色素とは互いに近接する。増幅が一巡して、二本鎖が分離すると、プローブは分子内的に同じ分子鎖の伸張したプライマー配列に結合する。蛍光色素とクエンチャーは分離し、その結果、シグナルを検出することができる（Ｓｏｌｉｎａｓら、：Ｄｕｐｌｅｘ ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ＳＮＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＦＲＥＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００１ Ｏｃｔ １５；２９（２０）：Ｅ９６）。さらに、プローブが２種類の色素を有していて、蛍光共鳴エネルギー移動を介してシグナルが形成されるデュプレックス法の改変法も記載されている（参照：Ｓｏｌｉｎａｓら、２００１，上記文献、特に７ｆページおよび６ページの図５）。上に述べたヘアピン法と比べてデュプレックス法が優れている点は、クエンチャーと色素とが完全に分離して活性化された形をとると、ヘアピン法の場合より強い蛍光シグナルが発生することである。加えて、デュプレックス・スコーピオン・プライマーは、対応するヘアピン・プライマーより合成が簡単で、安価である（参照：Ｓｏｌｉｎａｓら、２００１，上記文献、８ｆページ）。
【０００７】
さらにスコーピオン法の別の改変法は、米国特許第６３２６１４５号および米国特許出願第２００３００８７２４０号に詳しく記載されている。
【０００８】
スコーピオン法は、従来法のリアルタイムＰＣＲ法と比べていくつかの利点を有している。このことは特に反応速度の点であてはまる。スコーピオン・プローブは、分子内的に標的配列と混成すると、一分子反応の速度論に従う。それに対してＴａｑｍａｎ法の場合は、プローブの結合は、二分子反応の速度論に従って起こり、ライトサイクラー法の場合は３分子反応の速度論に従う。さらに、ライトサイクラー法の場合は、シグナルが検出可能になる前に酵素によってプローブが分解される必要がある。それゆえ、例えば迅速分析に必要な高速ＰＣＲサイクルは、ごく限定的にしか使用できないかもしれない。したがって、スコーピオン法は、特に迅速サイクル条件では、従来法であるリアルタイム法より高性能である（Ｔｈｅｌｗｅｌｌら、２０００，上記文献）。スコーピオン法の別の利点は特別な特異性にある。すなわち、プローブ配列を短くすると特異性が高まり、ただ一つの塩基対の欠陥を検出することが可能である。従来法であるリアルタイム法の改変法では対応する特異性の強化は不可能である。この場合、プローブを短くすると非特異的なＰＣＲ生成物と結合する確率が高くなるため、特異性はむしろ低下する（参照：Ｔｈｅｌｗｅｌｌら、２０００，上記文献、３７６０ページ）。
【０００９】
以下では、まずメチル化分析へのスオーピオン法の適用について述べる。シトシンのメチル化は、特に生物学的医学的に重要であることと、公知の方法の欠点とを考慮して、この有益で新しい技術の扉を開くことは重要な技術の進歩をもたらす。メチル化分析へのスコーピオン法の適用は、すでに変異分析から知られているスコーピオン法の利点以外に、別の利点ともつながっている。すなわち、従来のＰＣＲ法では、複数個の位置が同時メチル化されたシトシンを含む配列のみが、高感度で特異的なメチル化分析が可能である。それに対して、本発明のいくつかの実施形態では、同時メチル化された位置はわずかの数しか必要としない。この場合、スコーピオン法は配列依存性であるため、比較し得る既知のＰＣＲ法（「ヘビー・メチル法」、下記参照）よりも適用範囲が広い。２種類のスコーピオン・プライマーを使用すれば別の特別な利点がもたらされる。すなわちメチル化と変異とを同時に検査することができる。加えて、２種類のスコーピオン・プライマーを使用すれば内部定量が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明による方法は、シトシンのメチル化を高感度で検出することが可能である。次に挙げる５つの段階からなる：
１）検査すべきＤＮＡを反応試薬または酵素と反応させると、メチルシトシンは反応しないまま残る。それに対して、非メチル化シトシンはウラシルまたは別の塩基に変換され、それらはシトシンとは塩基対形成における挙動が異なる。
２）あらかじめ処理したＤＮＡを、ポリメラーゼおよび少なくとも一つのプライマーによって増幅し、その５’末端をリンカーを介してプローブと結合させる。
３）プライマー伸張生成物をマトリックス鎖から分離する。
４）プローブを分子内的にプライマー伸張生成物と混成させる。その場合、混成はＤＮＡのメチル化状態に依存して進行する。
５）プローブの混成が起こっていれば検出される。
【００１１】
本発明の方法の第一段階は、検査すべきＤＮＡを反応試薬または酵素と反応させると、５−メチルシトシンは反応しないまま残り、非メチル化シトシンはウラシルまたは別の塩基に変換され、それらはシトシンとは塩基対形成における挙動が異なる。検査すべきＤＮＡは、診断に関する問題か学術的な問題かによって、異なる試料源から採取することができる。診断に関する問題の場合は、好ましくは組織が検査試料として使用されるが、体液、特に血清を使用することもできる。痰、糞便、尿または脳脊髄液からのＤＮＡも使用可能である。ＤＮＡは、好ましくはまず生物試料から分離される。ＤＮＡの抽出は、標準的方法に従い、血液から、例えばＱｉａｇｅｎ ＵｌｔｒａＳｅｎｓ ＤＮＡ抽出キットを使って行われる。次に、分離したＤＮＡは、例えば制限酵素を作用させて断片化することができる。反応条件と問題となる酵素は、当業者にとってよく知られており、例えばメーカーが添付するプロトコルの記載に従うこともできる。次に、ＤＮＡを化学的または酵素的に変換する。化学的変換は、好ましくは亜硫酸水素塩で行われる。亜硫酸水素塩による変換の異なる変形が当業者には知られている（例えば、Ｆｒｏｍｍｅｒら：Ａ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｔｈａｔ ｙｉｅｌｄｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９２ Ｍａｒ １；８９（５）：１５２７〜３１；Ｏｌｅｋ，Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６ Ｄｅｃ １５；２４（２４）５０６４〜６．；ＤＥ １００ ２９ ９１５；ＤＥ １００ ２９ ９１５）。亜硫酸水素塩の反応は、特に好ましくは変性溶媒、例えばジオキサン、およびラジカル捕捉剤の存在下に行われる（参照：ＤＥ １００ ２９ ９１５）。別の好ましい実施形態では、ＤＮＡは、化学的に変換するのではなく、酵素的に変換される。これは、例えばメチル化シチジンより、非メチル化シチジンの方が速く変換されるシチジンデアミナーゼの使用によって考えることができる。相当する酵素は最近同定された（Ｂｒａｎｓｔｅｉｔｔｅｒら：Ａｃｔｉｖａｔｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｄｅａｍｉｎａｔｅｓ ｄｅｏｘｙｃｙｔｒｉｄｉｎｅ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｂｕｔ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ａｐｒ １；１００（７）：４１２０−７）。
【００１２】
本発明による第二段階において、あらかじめ処理したＤＮＡは、ポリメラーゼおよび少なくとも一つのプライマーによって増幅される。この増幅に関しては、例えば等温増幅法など異なる可能性が当業者に知られている。もちろんポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が好ましい。その場合、プライマーの構造によって異なる実施形態が考えられる。言うまでもなく、全ての実施形態はプライマーの少なくとも一つの５’末端が、リンカーを介してプローブと結合していることで共通している。プライマー、リンカーおよびプローブの配列全体はプローブの二次構造に依存しない−以下ではスコーピオン・プライマーと呼ぶ。それに対して、プライマーは、スコーピオン・プライマーのプライマー配列のみを指す。メチル化に特異的な検出を行うには、プローブの配列かプライマーの配列がメチル化に対して特異的でなければならない。例えば、もともとメチル化されているＤＮＡもメチル化されていないＤＮＡも同様に増幅することが可能であり、両者の形はメチル化に特異的なプローブと混成して初めて区別することが可能になる。逆に、一種類のＤＮＡを増幅し、次いでこれを非特異的なプローブで検出することも可能である。高い特異性が要求される場合は、増幅も検出もメチル化特異的に行われる方法が好ましい。
【００１３】
メチル化に特異的な増幅は異なる方法で実現することができる。好ましい実施形態では、ＰＣＲは、あらかじめメチル化して（または逆の手法では：メチル化しないで）変換された配列位置でのみ特異的に結合するプライマーを使用して行われる。この方法は、メチル化感受性ＰＣＲ（ＭＳＰ）の名称で知られている。ここでは、少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを含むプライマーが使用され、好ましくはＣＧ位置を少なくとも３個所有し、そのうちの一つが３’末端に位置するプライマーが使用される。非メチル化配列または非転写鎖の増幅には、それに応じてＴＧジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチドが必要である。ＭＳＰを実施するための正確な技術的指示は当業者に知られている（参照：Ｈｅｒｍａｎら：Ｍｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ：ａ ｎｏｖｅｌ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６ Ｓｅｐ ３；９３（１８）：９８２１〜６；米国特許第５，７８６，１４６号；米国特許第６，０１７，７０４号；米国特許第６，２００，７５６号）。
【００１４】
メチル化に特異的な増幅の好ましい別の実施形態は、「ヘビー・メチル」法である。この場合、一つのＣＧ（またはＴＧまたはＣＡ）−ジヌクレオチドと結合し、それゆえバックグラウンドＤＮＡの増幅を阻止する、少なくとも一つのメチル化に特異的なブロッカーオリゴマーが使用される。実施形態は、ブロッカーの分解または伸張が極力抑えられるよう、ポリメラーゼの選択またはブロッカーオリゴマーの改変を通じて、ブロッカーの分解または伸張が極力抑えられるように構成される。増幅を行うための正確な技術的指示は当業者には知られている（ＷＯ ０２／０７２８８０）。
【００１５】
メチル化に特異的な増幅およびメチル化に非特異的な増幅は、本発明により、異なるリンカーエレメントおよびプローブエレメントと組み合わせることができる。言うまでもなく、全ての実施形態は、プライマーの少なくとも一つの５’末端が、リンカーを介してプローブ配列と結合していることで共通している。リンカーの長さおよび構造に関する指示は、従来技術から得られる。特に、プローブは増幅されないようにしなければならない。これは当業者に知られている様々な形態を通じて実現することができる（欧州特許第０４１６８１７号；米国第５，５２５，４９４号；米国特許出願第２００３００８７２４０号）。好ましい実施形態ではリンカーにプライマーの伸張によって非転写鎖を阻止するＰＣＲブロッカーが含まれる。その場合、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）モノマーが特に好ましい。別法としてリンカーに２−Ｏ−アルキルーＲＮＡを含めることができる。部分的に５’−５’方向に互いに連結しているオリゴヌクレオチドの使用も考えられる（参照：米国特許出願第２００３００８７２４０号）。
【００１６】
さらにスコーピオン・プライマーは、プローブが分子内的にプライマーの伸張生成物に結合できるような構造に作られている。本発明によれば、プローブの混成は本来のＤＮＡのメチル化状態に依存して行われる。このことは、マトリックスＤＮＡの検査すべき位置がもともとメチル化されているか、または同じくメチル化されていないで存在する場合に限り、混成が起こることを意味する。該当するメチル化に特異的な検出は異なるやり方で行うことができる。すでに増幅がメチル化特異的に行われれば、メチル化に非特異的なプローブで十分かもしれない。すなわち、（メチル化特異的に）増幅体が生成した場合に限って、プローブの混成が行われる。言うまでもなく、本発明によればメチル化に特異的なプローブを使用することが好ましい。これはもともとメチル化されているかメチル化されていないＤＮＡとしか結合しない。それに応じて、プローブには少なくとも一個のメチル化に特異的なＣＧ、ＴＧまたはＣＡジヌクレオチドが含まれる。１〜３個の該当するジヌクレオチドが好ましい。プローブ配列の長さは、好ましくは６〜５０個のヌクレオチドであり、特に好ましくは１０〜４０個のヌクレオチドであり、さらに好ましくは１５〜３０個のヌクレオチドである。その場合、プローブは、核酸のアナログ、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）または２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡを含む。プローブの長さおよび構造に関する技術的な指示は米国特許第６，３２６，１４５号および米国特許出願第２００３００８７２４０号に記載されている。
【００１７】
加えて、プローブは少なくとも一つの目印を有しており、もし混成が行われたときはその目印によって検出することができる。これに関しては、様々なシグナルシステムが当業者に知られている。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を通じてシグナルを発生する蛍光色素−クエンチャーの組み合わせ（ペア）や層間挿入色素−色素の組み合わせ（ペア）を使用することができる。さらに、増幅体と固相との結合を可能にするシステムの使用も考えられる。これらの例や、同じくメチル化分析に使用することができ、それゆえ本発明の一部をなす別の例は、米国特許第６，３２６，１４５号および米国特許出願第２００３００８７２４０号（特に［００１８］；［５１］およびそれにつづく段落）に詳細かつ別の補強資料とともに記載されている。
【００１８】
シグナルシステムは好ましくは２成分からなる。これらは、実施形態では両成分が空間的に互いに離れている場合に限ってシグナルを発生するように考案されている。これとは逆に、両成分が互いに近接して存在する場合に限ってシグナルを発生するようにすることも可能である。両実施形態では、両成分は同じ分子によって使用に供されることもできるし、異なる分子によって使用に供することもできる。両成分は、プローブの様々な二次構造を通じて必要な空間構造を維持することができる。そのような例として、ヘアピン、ループ、嚢胞、アーム、エルボおよび幹などの構造をあげることができる。それぞれに応じて考え得る多くの実施形態は従来技術に属する（米国特許第６，３２６，１４５号および米国特許出願第２００３００８７２４０号、特に［５２］およびそれにつづく段落）。これらの実施形態もメチル化分析に使用することができ、それゆえ本発明の一部をなす。
【００１９】
好ましい実施形態では、蛍光色素−クエンチャーの組み合わせ（ペア）が使用される。これに該当する組み合わせ（ペア）は当業者に知られている（例えば、補強資料を含む米国特許出願第２００３００８７２４０号、［００２０］を参照）。特に好ましい変形実施形態では、クエンチャーおよび色素がプローブと結合してヘアピンを形成することで互いに近接して不活性な形で存在する（参照：Ｔｈｅｌｗｅｌｌら ２０００ 前記文献）。使用可能なヘアピン構造に関する正確な技術的指示は従来技術に属する（米国特許第６，３２６，１４５号および米国特許出願第２００３００８７２４０号）。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、スコーピオン・プライマーは二つのシグナル成分を有し、これら二つの成分は、空間的に互いに離れていて不活性な形で存在し、プローブがプライマーの伸張生成物と混成すると、空間的に互いに近接するようになる。特に好ましい変形実施形態では、活性な形のシグナル成分は、蛍光共鳴エネルギー移動を通じてシグナルを発生する。その場合、第一成分はスコーピオン・プライマーの３’領域に、そして第二成分は５’領域に存在する。
【００２１】
特に好ましい別の実施形態では、シグナル成分は、異なる分子と結合して空間的に互いに近接して不活性な形で存在する。この実施形態は、例えば、プローブと不活性な形のデュプレックスを形成するさらなる別のオリゴヌクレオチドを使用することで実現可能である。その場合、プローブはその５’末端に蛍光色素を有するのに対して、上記オリゴヌクレオチドはその３’末端にクエンチャーを有する。オリゴヌクレオチドの代わりに、核酸アナログから選択されるオリゴマー、例えばペプチド−核酸オリゴマーも使用することができる（参照：Ｓｏｌｉｎａｓら、上記文献；米国特許第６，３２６，１４５号；米国特許出願第２００３００８７２４０号）。
【００２２】
特に好ましい別の実施形態では、クエンチャーは、同じように、不活性な形でプローブと特別な空間的構造を形成する、さらなる別のヌクレオチドと結合している。この場合プローブは２種類の色素を有する。プローブと別のオリゴヌクレオチドとが互いに離れるとすぐに、両色素の間で蛍光共鳴エネルギー移動によるシグナルが発生する。オリゴヌクレオチドの代わりに、核酸アナログから選択されるオリゴマー、例えばペプチド−核酸オリゴマーも使用することができる（参照：Ｓｏｌｉｎａｓら、２００１、上記文献、特に７ページ以下と、６ページの図５）。
【００２３】
特に好ましい第五の実施形態は、ライトサイクラー法に似ており、色素標識分子を追加使用する。この実施形態では、さらなる分子とプローブとの間で特別な空間構造を必要としない。シグナルの発生は、ここでも蛍光共鳴エネルギー移動によって行われる。プローブだけでなく、このさらなる分子は、活性な形で増幅体と結合するため、両色素は互いに近接するようになり、その結果、シグナルを発生する。別の分子としては、好ましくは、オリゴヌクレチドか、核酸アナログから選択されるオリゴマーが使用される。オリゴヌクレオチド配列またはオリゴマー配列がメチル化に対して特異的である場合は、すなわち少なくとも一つのＣＧ（またはＴＧまたはＣＡ）−ジヌクレオチドを有する場合は、検出反応の特異性が高まる。配列の長さは、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドである。当業者にとって、さらなる技術的指示は公知のライトサイクラー法から得られる。
【００２４】
ここまで述べてきた全ての実施形態は、通常のプライマーとならんで、スコーピオン・プライマーを使用して行うことができる。しかし本発明によれば、プライマーは、それが前進プライマーであれ逆進（リバース）プライマーであれ、サソリの形で存在することが好ましい。このような組み合わせは多様な利点と結びつけることができる。例えば、特に好ましい第一の実施形態は、メチル化分析の感度を上げることができる。その場合、両スコーピオン・プライマーは、活性な形で同じシグナルを発生する。プローブは、ＤＮＡの異なる共メチル化位置と結合する。両スコーピオン・プライマーのシグナルは重畳してシグナル強度を増す。逆に、特に好ましい第二の実施形態では、検出反応の特異性が高まる。その場合、スコーピオン・プライマーは異なるシグナル成分を有する。ここでもプローブはＤＮＡの異なる共メチル化位置と混成する。しかし両シグナルが同時に現れる場合に限って正シグナルと見なされる。特に好ましい第三の実施形態では、メチル化分析の正確な内部定量化が可能である。その場合、一方のスコーピオン・プライマーはメチル化分析に使用され、他方のスコーピオン・プライマーは全ＤＮＡ量の定量に使用される。このような使用は、例えばメチル化に対して非特異的な増幅が行われ、かつ両スコーピオン・プライマーが異なるシグナル成分を有する場合に可能である。そこで、第一スコーピオン・プライマーのプローブは、上で述べたようにメチル化に特異的な位置と混成し、第二スコーピオン・プライマーのプローブは、非メチル化位置に結合する。したがって、第二スコーピオン・プライマーによって発生するシグナルで、ＤＮＡの全量が定量できるのに対して、第一スコーピオン・プライマーのシグナルは、メチル化（または非メチル化）ＤＮＡの量を示す。両シグナルから、メチル化ＤＮＡの量が正確に決定される。特に好ましい第四の実施形態では、メチル化分析と変異分析または対立遺伝子の識別を同時に行うことができる。それには、第一スコーピオン・プライマーがメチル化分析（上記を参照）に使用され、第二スコーピオン・プライマーが変異分析（または対立遺伝子の識別）に使用される。その場合、両スコーピオン・プライマーは、異なるシグナル成分を有する。第二スコーピオン・プライマーのプローブ配列は、ある決められた変異（またはある決められた対立遺伝子）に対して特異的である。次に、発生したシグナルからメチル化状態と変異の有無が結論される。
【００２５】
すでに上で述べたように、異なるメチル化に特異的な増幅法またはメチル化に非特異的な増幅法と、異なるリンカーおよび各種プローブシステムとを組み合わせることができる。同時に一つまたは二つのスコーピオン・プライマーを使用することができる。これによって、メチル化分析に適し、そしてそれゆえ本発明の範囲内に入るものと見なすことができる、多様な実施形態が生まれる。この方法をいかに実施すべきかは、本願明細書と従来の技術路とを組み合わせることから生まれる。次に、本発明の好ましい反応条件を詳しく記述する。当業者に知られているように、最適反応条件は、実施形態に応じて変形することができる。
【００２６】
本発明による方法にとっては、排他的にスコーピオン・プライマーを使用する必要はない。むしろ、スコーピオン・プライマーは、同じ配列を持つ従来のプライマーと一緒に、わずかな比率で使用するだけで十分である。両プライマー種の間の最適な比率は、特別なアッセイの構成によって変わるが、実験的に容易に決めることができる。好適なシグナルシステム（例えば異なる蛍光色素）を使用する場合、異なったスコーピオン・プライマーを使って複数個の配列を同時に検査することもできる（Ｔｈｅｌｗｅｌｌら ２０００ 上記文献；米国特許出願第２００３００８７２４０号）。スコーピオン・プライマーは、増幅反応実施中の異なる時間に加えることができる。それゆえ、スコーピオン・プライマーは、増幅反応の最後のサイクルに参加していれば十分である。これは、例えば終点分析を実施しなければならないような場合に適合する（参照：Ｓｏｌｉｎａｓら、２００１ 上記文献、６ページ）。もちろんスコーピオン・プライマーは、好ましくは、増幅開始時にはすでに存在している。このことは、特にリアルタイム法が適用される場合にあてはます。増幅は好ましくはＰＣＲを通じて行われる。当業者であれば、いかなる試薬、濃度および温度サイクルを使用すべきか、理解しているであろう。
【００２７】
本発明の方法の第三段階では、プライマー伸張生成物がマトリックス鎖から分離される。プライマー伸張生成物にプローブを結合させるには、この操作は不可欠である。この分離は、好ましくは昇温して行われる。ＰＣＲでは、この昇温操作を通常の温度サイクルの一環として行うことができる。
【００２８】
本発明の方法の第三段階では、プローブをプライマー伸張生成物と混成させる。その場合、混成は、最初のＤＮＡのメチル化状態に依存して行われる。このことは、マトリックスＤＮＡの検査すべき位置が最初からメチル化されているか、またはメチル化されない場合に限って混成が行われることを意味している。もしメチル化に非特異的な増幅を行おうとすれば、プローブの配列によって、メチル化に特異的な混成が確実に行われるようにしなければならない。一般に、（メチル化に特異的な）生成物が形成されたときに限って、メチル化に特異的な増幅と、メチル化に非特異的なプローブの使用で結合が行われる（上記を参照）。全ＤＮＡ量を決定し、メチル化分析とならんで変異分析も行わなければならないような場合は、２種類のスコーピオン・プライマーで反応を行うと、２種類のスコーピオン・プライマーのプローブの混成は、メチル化状態とは無関係に行うことができる（上記を参照）。
【００２９】
本発明の方法の第五段階では、混成が行われたか否かを検出する。その場合、検出は現在の技術水準によるシグナルの発生に依存して行われる。
【００３０】
当業者であれば、本発明による方法の段階２〜５が何回もくり返し可能であることを知っている。このことは特にリアルタイム法の適用に対してあてはまる。
【００３１】
すでにくり返し述べてきたが、本発明による方法は様々な実施形態に適用することができる。以下に、いくつかの好ましい実施形態を詳しく述べる。これらの方法を実施するための正確な技術的指示は、当業者にとって、従来技術と本願明細書との組み合わせから明らかとなろう。それにもかかわらず、本発明の方法は、以下に記載する変形に限定されるものではない。別の場所に開示されたメチル化分析に関するスコーピオン技術の実施形態も適用でき、それゆえ、本発明の一部をなす（特に、Ｔｈｅｌｗｅｌｌら、上記文献；Ｓｏｌｉｎａｓら、上記文献；米国特許第６，３２６，１４５号；米国特許出願第２００３００８７２４０号、特に［５２］以下を参照）。
【００３２】
第一の好ましい実施形態は、以下「メチル−ヘアピン」と名づける。その場合、増幅は、化学的に、または酵素で前処理したＤＮＡのメチル化に非特異的なＰＣＲによって行われる。それに応じて、もともとメチル化ＤＮＡおよびもともとメチル化されていないＤＮＡに同じやり方で結合するプライマーが使用される。それゆえ、このプライマーは、ＣＧジヌクレオチドを含まず、すでに変換前からこの配列に存在する位置に相当するＴＧジヌクレオチドおよびＣＡジヌクレオチドのみを含む。プライマーのペアとして、好ましくは、スコーピオン・プライマーと通常のＰＣＲプライマーとが使用される。スコーピオン・プライマーのリンカーには、プローブの増幅を阻止するため、好ましくはヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）モノマーが含まれる。当業者であれば、リンカーエレメントの設計方法については理解していよう（ＥＰ ０４１６８１７；米国特許第５，５２５，４９４号；米国特許出願第２００３００８７２４０号）。スコーピオン・プライマーのプローブエレメントは、ヘアピン構造を形成する。プローブ配列の長さは、好ましくは６〜５０ヌクレオチド、特に好ましくは１０〜４０ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドである。その場合、プローブは、核酸アナログ、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）または２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡを含むことができる。使用可能なヘアピン構造の長さおよび構造に関する正確な技術的指示は、現在の技術水準に属する（米国特許第６，３２６，１４５号；米国特許出願第２００３００８７２４０号）。プローブ配列はメチル化に対して特異的である。すなわち、プローブ配列は少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを有するか、またはメチル化に特異的なＴＧジヌクレオチドおよびＣＡジヌクレオチドを有する。該当するジヌクレオチドは、好ましくは１〜３個である。プローブは、さらに蛍光色素−クエンチャーのペアを有し、そのペアは、ヘアピンを形成することにより、空間的に互いに直接的に近接して存在する。ＰＣＲの過程でスコーピオン・プライマーを伸張し、つづいて、伸張したプライマーをマトリックス鎖から分離する。次に、スコーピオン・プライマーのプローブを、メチル化状態に依存する形で伸張プライマーに結合させる。色素とクエンチャーとを引き離すと蛍光シグナルが発生する。シグナルの検出は、現在の技術水準により、様々な方法で行うことができる。本発明の方法は、同じ配列の通常のプライマーに加えて、わずかな比率でスコーピオン・プライマーを使用するだけで十分である（上記を参照）。好適なシグナルシステムを使用する場合、異なるスコーピオン・プライマーを使用すれば同時に複数個の配列を同時に検査することが可能である。実施例１にはメチルーヘアピン法が記載されている。実施例２ではメチルライト法とメチル−ヘアピン法とが比較されている。図５は、メチル−ヘアピンの反応の経過を概略的に示したものである。
【００３３】
第二の好ましい実施形態は、以下「ＭＳＰ−メチル−ヘアピン」と呼ぶ。その場合、増幅は、化学的に、または酵素で前処理したＤＮＡのメチル化に特異的なＰＣＲによって行われる。それに応じて、好ましくは、もともとメチル化されたＤＮＡまたはもともとメチル化されていないＤＮＡに結合するプライマーが使用される。したがって、このプライマーは、ＣＧジヌクレオチドまたはメチル化に特異的なＴＧジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチドを含む。好ましくは、プライマーは少なくとも３つの対応するジヌクレオチドを有し、少なくとも１つの３’末端が限定される。プライマーのペアとして、好ましくはスコーピオン・プライマーと通常のＰＣＲプライマーとが使用される。リンカーおよびプローブは、メチル−ヘアピン法の場合と同様に構成される（上記を参照）。その場合、プローブは、好ましくはメチル化に特異的な配列を使用する。すなわち、プローブは少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを有するか、またはメチル化に特異的なＴＧジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチドを有する。該当するジヌクレオチドは、好ましくは１〜３個である。増幅はすでにメチル化に特異的に行われるため、メチル化に非特異的なプローブを使用することもできる。シグナルの発生は、メチル−ヘアピン法の場合と同様、蛍光色素−クエンチャーのペアを通じて行われる（上記を参照）。
【００３４】
第三の好ましい実施例は、以下「ヘビー・メチル−ヘアピン」と呼ぶ。その場合、増幅は、化学的に、または酵素で前処理したＤＮＡのメチル化に特異的なヘビー・メチルＰＣＲによって行われる（上記を参照）。これにはメチル化に非特異的なプライマーが使用される。すなわち、もともとメチル化されたＤＮＡおよびもともとメチル化されていないＤＮＡに同じやり方で結合するプライマーが使用される。それゆえ、このプライマーは、ＣＧジヌクレオチドを含まず、すでに変換前からこの配列に存在する位置に相当するＴＧジヌクレオチドおよびＣＡジヌクレオチドのみを含む。メチル化に特異的な増幅は、少なくとも一つのメチル化に特異的なブロッカー−オリゴマーを使用して確実に行われるようにされる。ブロッカーは、ＣＧジヌクレオチド（またはメチル化に特異的なＴＧジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチド）に結合してバックグラウンドＤＮＡの増幅を阻止する。この実施形態は、ポリメラーゼの選択を通じて、またはブロッカーオリゴマーの修飾を通じて、ブロッカーの分解または伸張を極力抑えるように構成することができる。プライマーのペアとして、好ましくはスコーピオン・プライマーと通常のＰＣＲプライマーとが使用される。リンカーおよびプローブは、メチル−ヘアピン法の場合と同様に構成される（上記を参照）。その場合、プローブは、好ましくはメチル化に特異的な配列を使用する。すなわち、プローブは少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを有するか、またはメチル化に特異的なＴＧジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチドを有する。該当するジヌクレオチドは、好ましくは１〜３個である。特に好ましい実施形態では、ヘビー・メチル−ヘアピンアッセイは、ブロックとシグナル発生とに、メチル化に特異的な同じジヌクレオチドを使用する。これによって、分析に必要なジヌクレオチドの数が少なくなり、その結果、ヘビー・メチル−ヘアピン法は、ヘビー・メチル法より広い適用範囲を持つことができる。さらに、より高い特異性も実現される。増幅は、すでにメチル化特異的に行われるため、メチル化に非特異的なプローブを使用できる。シグナルの発生は、メチル−ヘアピン法の場合と同様、蛍光色素−クエンチャーのペアを通じて行われる（上記を参照）。実施例３でヘビー・メチル−ヘアピン法について説明する。
【００３５】
第四の好ましい実施例は、以下「メチル−デュプレックス」と呼ぶ。この改変法と上記メチル−ヘアピン改変法とでは、プローブエレメントだけが異なる。メチル−デュプレックス法の場合は、色素とクエンチャーは異なる分子に連結されていて、空間的に互いに近接して不活性な形で存在する。これは、例えばプローブと不活性な形でデュプレックスを形成する別のオリゴヌクレオチドの使用によって可能である。オリゴヌクレオチドの代わりに、核酸アナログ、例えばペプチド−核酸−オリゴマーから選択される別のオリゴマーを使用することもできる（参照：Ｓｏｌｉｎａｓら、上記文献；米国特許第６，３２６，１４５号；米国特許出願第２００３００８７２４０号）。図６は、メチル−ヘアピンの反応の経過を概略的に示したものである。
【００３６】
第五の好ましい実施形態は、以下「ＭＳＰ−メチル−デュプレックス」と呼ぶ。この改変法と上記ＭＳＰ−メチル−ヘアピン改変法とでは、プローブエレメントだけが異なる。これも別のオリゴマーとで特殊な空間構造、例えばデュプレックスを形成する（上記参照）。
【００３７】
第六の好ましい実施形態は、以下「ヘビー・メチル−デュプレックス」と呼ぶ。この改変法は、「ヘビー・メチル−ヘアピン」と、別のオリゴマーと一緒に特殊な空間構造、例えばデュプレックスを形成するプローブエレメントとを組み合わせたものに相当する（上記参照）。
【００３８】
第七の特に好ましい実施形態は、定量的「メチル−ヘアピン」アッセイを対象とする。この実施形態は、「メチル−ヘアピン−アッセイ」というべきものであり、第二のスコーピオン・プライマーが使用される。これによれば内部定量が可能となる。第二スコーピオン・プライマーのプローブはメチル化に非特異的であり、メチル化状態には無関係に増幅体に結合する。これによって発生するシグナルを使ってＤＮＡの全量が定量される。他方、第一スコーピオン・プライマーは、メチル化（または非メチル化）ＤＮＡの値を与える。両シグナルからメチル化ＤＮＡの正確な量を決定できる。
【００３９】
本発明の別の局面は、本発明による全ての実施形態を使用することにある。本発明による方法は、疾患に特異的なシトシンの位置を検査する場合、特に、癌またはメチル化状態の変化を伴うその他の疾患の診断または予後の予測に適している。これに該当する症例は、中枢神経系の障害、攻撃的症状または行動傷害；脳障害による臨床的、心理的および社会的結果；精神障害および人格障害；認知症および／またはそれに関連する症状；心臓血管に関する疾患、機能不全および障害；胃腸管の機能不全、障害または疾患；呼吸器系の機能不全、障害または疾患；負傷、炎症、感染、免疫および／または回復；発育過程における逸脱としての身体の機能不全、障害または疾患；皮膚、筋肉、結合組織または骨の機能不全、障害または疾患；内分泌系および代謝系の機能不全、障害または疾患；頭痛または性的機能不全などである。さらに、本発明による方法は、治療薬の副作用の予想、特異的な薬物治療の決定（各個人に合わせた医学）、薬物治療結果の監視にも適する。さらに別の応用は、細胞のタイプまたは組織の識別および細胞分化の検査である。
【００４０】
メチル化分析および、メチル化状態の変化を伴う上記疾患の立証または予後の予測にスコーピオン・プライマーを使用することも本発明の対象である。治療薬の副作用の予想、特異的な薬物治療の決定（各個人に合わせた医学）、薬物治療結果の監視へのスコーピオン・プライマーの使用も本発明のさらに別の対象である。さらに、細胞のタイプまたは組織の識別および細胞分化の検査も本発明の対象である。本明細書で使用される「スコーピオン・プライマー」は、その５’末端でリンカーを介してプローブ配列に結合したプライマーである（上記を参照）。
【００４１】
最後に、少なくとも一つのスコーピオン・プライマーと、ポリメラーゼと、ＰＣＲのために必要な試薬とからなるキットも本発明の対象である。
【実施例】
【００４２】
実施例１：メチル−ヘアピン−リアルタイムＰＣＲアッセイによるｂｒｃａｌ遺伝子のメチル化ＤＮＡの定量
ヒトｂｒｃａｌ遺伝子の亜硫酸水素塩で処理した断片を増幅した（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｌ７８８３３．１，ｎｔ ３５３８〜ｎｔ ３６６６；ＳｅｑＩＤ−７）。マトリックスには末梢血球からのＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および包括的にメチル化したヒトＤＮＡ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用した。両ＤＮＡ種は、亜硫酸水素塩溶液で処理した（Ｏｌｅｋら、１９９６，上記文献）。この処理によって非メチル化シトシンはウラシルに変換されたのに対して、５−メチルシトシンは変化しないで残った。亜硫酸水素塩処理後、ＤＮＡ濃度をＵＶ吸収（２６０ｎｍ）によって決定した。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．１ｎｇの亜硫酸水素塩でそれぞれ処理したメチル化マトリクス−ＤＮＡを使用して、アッセイの能力を調べた。反応は、ライトサイクラー装置を使用し、全体積２０μＬで行った。反応混合物は、１０μＬのマトリックスＤＮＡ（濃度については下記を参照）、２μＬの混成プローブ用ＦａｓｔＳｔａｒｔ−ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ反応混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、０．３０μｍｏｌ／Ｌの前進プライマー（５’−ＧＡＡＧｔＴＧＡｔＡＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴｔＴＴＴＧＡ−３’；ＳｅｑＩＤ−１）、０．１０μｍｏｌ／Ｌの逆進プライマー（５’−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；ＳｅｑＩＤ−２）、０．５μｍｏｌ／Ｌのスコーピオン・プライマー（５’−ＦＡＭ−ＧＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＣＣ−ＭＲ−ＨＥＧ−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；プローブエレメント：ＳｅｑＩＤ−６；プライマーエレメント：ＳｅｑＩＤ−８）および２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2を含む。加熱サイクルは、９５゜Ｃで１０分間保温することから開始し、そのあとは、９５゜Ｃで１０秒間、５６゜Ｃで３０秒間そして７２゜Ｃで１０秒間のサイクルを５５回くり返した。毎サイクル、５６゜Ｃで行うアニーリングの前に、蛍光シグナルを検出した。
【００４３】
ウラシルとチミンは、塩基対の特性が同じであるため、変換されない非メチル化シトシンに対応する位置を小文字の「ｔ」（あるいは相補鎖では小文字の「ａ」）で示した。それに対して、亜硫酸水素塩で処理する前から存在していたチミンに対しては大文字のＡ（あるいは相補鎖では「Ａ」）で示した。この実施例およびそのあとの実施例でプライマー配列の表記に使われている略字の意味は次の通りである：ＦＡＭ＝フルオレッセインでラベル；ｒｅｄ６４０＝ライトサイクラー−フルオレッセインでラベル、チャンネルＦ２；ＭＲ＝メチルレッドでラベル；ＨＥＧ＝ヘキサエチレングリコールのスペーサー；ｐｈｏ＝リン酸塩で修飾；ｆｌｕｏ＝フルオレッセイン。
【００４４】
結果を表１および図１に示す。表１は、ライトサイクラー・ソフトウェアで計算した２回くりかえし閾値の平均値を示す。負の比較対照からは、増幅体は生成しなかった（１０ｎｇの亜硫酸水素塩で処理した非メチル化ＤＮＡ；５０ｎｇのゲノムＤＮＡ；水）。得られたデータから、メチル−ヘアピンアッセイによって、ｂｒｃａｌ遺伝子の亜硫酸水素塩処理したメチル化ＤＮＡを検出できることがわかる。亜硫酸水素塩で処理したメチル化マトリックスＤＮＡの場合、ＰＣＲ法は、少なくとも３桁のオーダーで直線性を示す（図１）。したがって、メチル−ヘアピンアッセイは、リアルタイムＰＣＲプラットフォーム上で、メチル化ＤＮＡを定量することができる。
【００４５】
【表１】
亜硫酸水素塩で処理したマトリックスDNAの量(ng) メチル-ヘアピンの限界サイクル
【００４６】
実施例２：亜硫酸塩処理したメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとからなるＤＮＡ混合物中のｂｒｃａｌ−Ａｍｐｌｉｃｏｎｓのメチル化に特異的な検出に対するメチル−ヘアピンアッセイとメチルライトアッセイとの比較
【００４７】
以下では、リアルタイムＰＣＲ法メチルヘアピンとメチルライトとを比較した。亜硫酸塩処理した、もともとメチル化されていないＤＮＡのバックグラウンド下において、亜硫酸塩処理した、もともとメチル化されていないＤＮＡの量を決定した。
【００４８】
ＰＣＲによる増幅は、ライトサイクラー装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、２０μＬの全体積で行った。ヒトｂｒｃａｌ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｌ７８８３３．１のｎｔ ３５３８〜ｎｔ ３６６６；ＳｅｑＩＤ−７）の亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡ断片を増幅した。メチル−ヘアピン反応混合物は、１０μＬのマトリックスＤＮＡ（濃度については下記を参照）、２μＬの混成プローブ用ＦａｓｔＳｔａｒｔ−ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ反応混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、０．３０μｍｏｌ／Ｌの前進プライマー（５’−ＧＡＡＧｔＴＧＡｔＡＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴｔＴＴＴＧＡ−３’；ＳｅｑＩＤ−１）、０．１０μｍｏｌ／Ｌの逆進プライマー（５’−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；ＳｅｑＩＤ−２）、０．５μｍｏｌ／Ｌのスコーピオン・プライマー（５’−ＦＡＭ−ＧＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＣＣ−ＭＲ−ＨＥＧ−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；プローブエレメント：ＳｅｑＩＤ−６；プライマーエレメント：ＳｅｑＩＤ−８）および２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2を含む。メチルライト反応混合物は、１０μＬのマトリックスＤＮＡ、２μＬの混成プローブ用ＦａｓｔＳｔａｒｔ−ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ反応混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、０．３０μｍｏｌ／Ｌの前進プライマー（５’−ＧＡＡＧｔＴＧＡｔＡＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴｔＴＴＴＧＡ−３’；ＳｅｑＩＤ−１）、０．３０μｍｏｌ／Ｌの逆進プライマー（５’−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；ＳｅｑＩＤ−２）、０．２５μｍｏｌ／Ｌの混成プローブ１（５’−ＧＣＧＧＡＡｔｔＴＧＡＧＡＧＧＣＧＴＡ−ｆｌｕｏ−３’；ＳｅｑＩＤ−３）および混成プローブ２（５’−ｒｅｄ６４０−ＧＣＧＴＴＧＴＧＡＡｔｔｔＴＧＧＧＧＡＧ−ｐｈｏ−３’；ＳｅｑＩＤ−４）を含む。加熱サイクルは、９５゜Ｃで１０分間保温することから開始し、そのあとは、９５゜Ｃで１０秒間、５６゜Ｃで３０秒間そして７２゜Ｃで１０秒間のサイクルを５５回くり返した。毎サイクル、５６゜Ｃで行うアニーリングの前に、蛍光シグナルを検出した。
【００４９】
実施例１に記載の試料と同じ試料からＤＮＡを分離した。いずれの反応でも亜硫酸水素塩で処理した全量２０ｎｇのＤＮＡを使用した。メチル化ＤＮＡの比率は、１００％、５０％および１０％とした。これは各反応当たりの絶対量で２０ｎｇ（１００％）、１０ｎｇ（５０％）および２ｎｇ（１０％）に相当する。両アッセイは、同じライトサイクラー装置で同じＤＮＡ混合物を使い、並行して行った。蛍光シグナルは別々のチャンネルで検出した。メチル−ヘアピンアッセイは、チャンネルＦ１（５２０ｎｍ）でシグナルを発生した。メチルライトアッセイのシグナルは、チャンネルＦ２で検出した（６４０ｎｍ）。
【００５０】
実験データから、両アッセイとも全濃度で、非メチル化ＤＮＡのバックグラウンド下において、メチル化ＤＮＡのシグナルを得ることができることが証明された（図２および３）。亜硫酸水素塩で処理したメチル化ＤＮＡはシグナルを生じなかった。メチル−ヘアピンアッセイは、メチルライトアッセイと比較して強いシグナルを発生し、良い分析結果を与えた。このことは、特に１０％試料で当てはまる。すなわち、メチルライトアッセイのシグナルはバックグラウンドのシグナルに対して１４０％、スコーピオンアッセイのシグナルは１８０％であった。これらの結果から、メチル−ヘアピンアッセイは、１８ｎｇのバックグラウンド下で、少なくとも２ｎｇのメチル化ＤＮＡを検出できることがわかる。すなわち、メチル−ヘアピンアッセイは、メチルライトアッセイより感度が高い。
【００５１】
実施例３：４０００倍の非メチル化ＤＮＡバックグラウンド下における、ｂｒｃａｌ遺伝子のメチル化ＤＮＡの検出にヘビー・メチル−ヘアピンアッセイの使用
【００５２】
本明細書に記載するアッセイは、ヘビー・メチル−ヘアピン技術およびメチル−ヘアピン技術の利点と結び付いている。メチル化特異的ブロッカー（ヘビー・メチル）と、スコーピオン・プライマー（メチルヘアピン）によるメチル化特異的検出と、を使用するとメチル化ＤＮＡを選択的に検出するための新しいリアルタイムＰＣＲ技術（ヘビー・メチル−ヘアピン）が創出される。
【００５３】
ヘビー・メチル−ヘアピンアッセイは、ライトサイクラー装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、２０μＬの全体積で行った。ヒトｂｒｃａｌ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｌ７８８３３．１のｎｔ ３５３８〜ｎｔ ３６６６；ＳｅｑＩＤ−７）の亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡ断片を増幅した。反応混合物は、１０μＬのマトリックスＤＮＡ（濃度については下記を参照）、２μＬの混成プローブ用ＦａｓｔＳｔａｒｔ−ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ反応混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、０．３０μｍｏｌ／Ｌの前進プライマー（５’−ＧＡＡＧｔＴＧＡｔＡＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴｔＴＴＴＧＡ−３’；ＳｅｑＩＤ−１）、０．１０μｍｏｌ／Ｌの逆進プライマー（５’−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；ＳｅｑＩＤ−２）、０．５μｍｏｌ／Ｌのスコーピオン・プライマー（５’−ＦＡＭ−ＧＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＣＣ−ＭＲ−ＨＥＧ−ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴａＡＴＣＣＴＣＡａ−３’；プローブエレメント：ＳｅｑＩＤ−６；プライマーエレメント：ＳｅｑＩＤ−８）、４μｍｏｌ／Ｌのブロッカー（５’−ＴＡＡＴＣＣＴＣＡａＣＡＣＴＴＣＣＣＴＣＡＣＡＡＣＣＴ−ｐｈｏ−３’：ＳｅｑＩＤ−５）および２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2を含む。加熱サイクルは、９５゜Ｃで１０分間保温することから開始し、そのあとは、９５゜Ｃで１０秒間、５６゜Ｃで３０秒間そして７２゜Ｃで１０秒間のサイクルを５５回くり返した。毎サイクル、５６゜Ｃで行うアニーリングの前に、蛍光シグナルを検出した。実施例１に記載の試料と同じ試料からＤＮＡ混合物を分離した。亜硫酸水素塩処理した、もともとメチル化されているＤＮＡの量は、各試料、１００ｐｇとした。バックグラウンドの非メチル化ＤＮＡの量は試料ごとに変えた。メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡのとの比、１：１０００および１：４０００は、亜硫酸水素塩処理したあとで所定の比になるように混合して調製した。それぞれに対応して、ＤＮＡの絶対量は、反応に対して１００．１ｎｇ（１：１０００）、または４００．１ｎｇ（１：４０００）であった。正の対照試料として、非メチル化バックグラウンドを含まない１００ｐｇのメチル化ＤＮＡを使用し、負の対照試料として１００ｎｇの非メチル化ＤＮＡを使用した。
【００５４】
結果を図４に示す。ヘビー・メチル−ヘアピンアッセイにより、１：１０００および１：４０００の両感度比で１００ｐｇのメチル化ＤＮＡを検出することができた。１００ｎｇの非メチル化ＤＮＡではシグナルは得られなかった。それに対して、非メチル化ＤＮＡのバックグラウンドを含まない１００ｐｇメチル化ＤＮＡからなる正の対照試料では強いシグナルが発生した。これらのデータから、ヘビー・メチル−ヘアピンアッセイは、４０００倍の非メチル化ＤＮＡのバックグラウンド下でも、メチル化ＤＮＡを高感度で検出できることがわかる。
【００５５】
実施例４（理論的実施例）：スコーピオ・リアルタイム分析（ヘビー・メチル−ヘアピンアッセイ）によるＧＳＴＰｉ遺伝子のメチル化分析
ＧＳＴＰｉ遺伝子の下記断片（亜硫酸水素塩で処理）を増幅する：
ＣＧＧＧＡｔｔＡｔｔｔＴＴＡＴＡＡＧＧｔＴＣＧＧＡＧＧｔＣＧＣＧＡＧＧｔｔＴＴＣＧｔＴＧＧＡＧＴＴＴＣＧｔＣＧｔＣＧｔＡＧＴｔＴＴＣＧｔｔＡｔｔＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９ ｎｔ；１８４５〜ｎｔ１９２４ Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ３２４３８７）。ＰＣＲは上記の反応条件で行った。プライマーには次の配列を使用した：前進プライマー（ＧＧＧＡｔｔＡｔｔｔＴＴＡＴＡＡＧＧＡｔＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、逆進プライマー（ＴＡＣＴＣＡＣＴａａＴａａＣＫＡＡａＡＣＴａＣ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、スコーピオン・プライマー（ＦＡＭ−ｇｇｃａｇｃｃＧｔＴＧＧＡＧｔｔｔＣＧｔＣＧｇｇｃｔｇｃｃ−ＤＤＱ−ＨＥＧ−ＴＡＣＴＣＡＣＴＡＡＴＡＡＣＫＡＡＡＡＣＴＡＣ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２，１３）、４μＭ ブロッキング試料（ＣＴＡＡＴＡＡＣａＡＡＡＡＣＴＡＣａＡＣａＡＣａＡＡＡＣＴＣＣＡＡＣ−ＰＨＯ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）。上記の標準スコーピオプライマーの代わりに次のデュプレックススコーピオプライマーも使用できる：ＦＡＭ−ＧｔＴＧＧＡＧｔｔｔＣＧｔＣＧ−ＨＥＧ−ＴＡＣＴＣＡＣＴＡＡＴＡＡＣＫＡＡＡＡＣＴＡＣ（Ｓｅｑ ＩＤ；ＣＧａＣＧａａａＣＴＣＣＡａＣ−ＤＤＱ；Ｓｅｑ ＩＤ ＮＯ：１５；ＮＯ：１６）。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】メチル−ヘアピンアッセイによる亜硫酸水素塩処理したｂｒｃａｌＤＮＡのリアルタイム増幅（実施例１）：Ｙ軸はサイクルごとに測定される蛍光シグナルを表す（チャンネルＦ１）。Ｘ軸はサイクル回数を示す。負の対照試料はシグナルを発生しなかった：水（星印）、５０ｎｇゲノムＤＮＡ（×）、１０ｎｇ亜硫酸水素処理した非メチル化ＤＮＡ（○）。亜硫酸水素処理したメチル化ＤＮＡは、●（１０ｎｇ）、▲（１ｎｇ）および■（０．１ｎｇ）で示してある。
【図２】混成プローブを使用するメチルライトアッセイによる亜硫酸水素塩処理したｂｒｃａｌＤＮＡのリアルタイム増幅（実施例２）：Ｙ軸はチャンネルＦ２（６４０ｎｍ）における蛍光シグナルを表す。測定はサイクルごとに行った（Ｘ軸）。曲線は、非メチル化ＤＮＡのバックグラウンド下における１００％（●）、５０％（◆）および１０％メチル化ＤＮＡ（▲）を表す。各試料中の２０ｎｇ亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを、全部一斉に検査した。２０ｎｇの非メチル化ＤＮＡはシグナルが決定できなかった（□）。
【図３】混成プローブを使用するメチル・ループアッセイによる亜硫酸水素塩処理したｂｒｃａｌＤＮＡのリアルタイム増幅（実施例２）：Ｙ軸はチャンネルＦ１（５２０ｎｍ）における蛍光シグナルを表す。測定はサイクルごとに行った（Ｘ軸）。曲線は、非メチル化ＤＮＡのバックグラウンド下における１００％（●）、５０％（◆）および１０％メチル化ＤＮＡ（▲）を表す。全部合わせて、各試料当たり２０ｎｇ亜硫酸水素塩ＤＮＡを使用した。２０ｎｇの非メチル化ＤＮＡの場合、シグナルは検出されなかった（□）。
【図４】ヘビー・メチル−ヘアピンアッセイによるｂｒｃａｌ−ＤＮＡの高感度検出（実施例３）：Ｙ軸はチャンネルＦ１（５２０ｎｍ）における蛍光シグナルを表す。測定はサイクルごとに行った（Ｘ軸）。下記量の非メチル化ＤＮＡのバックグラウンド下に、それぞれ１００ｐｇのメチル化ＤＮＡを決定した：バックグラウンドＤＮＡ非存在（●）、１００ｎｇ（▼）、４００ｎｇ（▲）。負の対照試料（１００ｎｇの非メチル化ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡを含まず）ではシグナルは得られなかった（□）。
【図５】メチル−ヘアピン法の経過を概略的に表したものである。スコーピオン・プライマーは左側に存在する。スコーピオン・プライマーの（メチル化に特異的な）プローブエレメントは、ヘアピン状の形で存在する。それは蛍光色素（▲）とクエンチャー（■）とを有し、それらはヘアピン構造を取ることによって空間的に互いに直接的に近接して存在する。ジグザグの線はリンカーエレメント内のＰＣＲストッパーを表す。すでに亜硫酸水素塩処理した検査すべきＤＮＡは二本の棒で表わしてある。ＤＮＡ内のＣＧ位が検査すべき位置である。シトシンがもともとメチル化されている場合だけ、シトシンは、亜硫酸水素塩で処理しても変化を受けないままであった。それに対して、非メチル化シトシンはウラシル（またはチミン）に変換される。スコーピオン・プライマーの（ここではメチル化に対して非特異的な）プライマーエレメントは、熱変性後、一本鎖ＤＮＡに結合することができる。ポリメラーゼによってプライマーの伸張が起こる。さらに熱変性を行うと、プローブは、伸張生成物がＣＧヌクレオチドを含む限り、伸張したプライマーに分子内的に結合する。しかしこれがあてはまるのは、検査すべきＤＮＡがもともとメチル化されて存在した場合に限る。非メチル化シトシンは、プローブに結合しないＴＧジヌクレオチドを生成する（図示されていない）。伸張したプライマー配列にプローブが結合するとヘアピンが解除され、蛍光シグナルが検出できるようになる（図は、Ｔｈｅｌｗｅｌｌら ２０００、上記文献、３７５３ページによって改変）。
【図６】メチル−デュプレックス法の経過を概略的に表したものである。スコーピオン・プライマーは左側に存在する。スコーピオン・プライマーの（メチル化に特異的な）プローブエレメントは、別の追加オリゴヌクレオチドと一緒になって、二本鎖の形で存在する。プローブエレメントは、蛍光色素（▲）を有する。追加オリゴヌクレオチドにクエンチャー（■）が結合する。両成分は、デュプレックスによって、空間的に互いに直接的に近接して存在する。ジグザグの線は、スコーピオン・プライマーのリンカーエレメント内のＰＣＲストッパーを表す。すでに亜硫酸水素塩処理した検査すべきＤＮＡは二本の棒で表わしてある。検査すべき位置はＤＮＡ内のＣＧ位である。シトシンがもともとメチル化されている場合に限って、シトシンは、亜硫酸水素塩で処理しても変化を受けないまま残った。それに対して、非メチル化シトシンはウラシル（またはチミン）に変換される。スコーピオン・プライマーの（ここではメチル化に対して非特異的な）プライマーエレメントは、熱変性後、一本鎖ＤＮＡに結合することができる。ポリメラーゼによってプライマーの伸張が起こる。さらに熱変性を行うと、デュプレックスは、プローブおよび追加オリゴヌクレオチドから分離し、プローブは、伸張生成物がＣＧヌクレオチドを含む限り、伸張したプライマーに分子内的に結合する。しかしこれがあてはまるのは、検査すべきＤＮＡがもともとメチル化されて存在した場合に限る。非メチル化シトシンは、プローブに結合しないＴＧジヌクレオチドを生成する（図示されていない）。伸張したプライマー配列にプローブが結合すると、色素およびクエンチャーが分離され、蛍光シグナルが検出できるようになる（図は、Ｓｏｌｉｎａｓら ２００１、上記文献、ｅ９６ページによって改変）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）５−メチル化シトシンが未反応にとどまる一方で、非メチル化シトシンがウラシルまたは、シトシンと塩基対の挙動が異なる、その他の塩基に変換されるように、検査すべきＤＮＡと試薬または酵素とを反応させることと、
ｂ）前処理した前記ＤＮＡをポリメラーゼと少なくとも一つのプライマーとで増幅し、その５’末端にリンカーを介してプローブを結合することと（スコーピオン・プライマー）、
ｃ）前記プライマー伸張生成物をマトリックス鎖から分離することと、
ｄ）前記プローブが、分子内的に前記プライマー伸張生成物と混成し、そしてその混成が、ＤＮＡのメチル化状態に依存して起こることと、
ｅ）前記プローブの混成が起こったか否かを検出することと
を特徴とするＤＮＡ中のシトシンのメチル化を検出する方法。
【請求項２】
工程ａ）の反応が亜硫酸水素塩で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）の反応がシチジン脱アミナーゼによって行われ、その際、非メチル化シチジンがメチル化シチジンより速く反応することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）の前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応によって行われることを特徴とする請求項１〜３の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリメラーゼ連鎖反応がＭＳＰ法またはヘビー・メチル法の形で行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブが、２種類のシグナル成分を有しており、そしてそれら２種類のシグナル成分が空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブが、プライマー伸張生成物と混成すると、前記シグナル成分が、互いに遠ざかることを特徴とする請求項１〜５の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項７】
前記両シグナル成分が、クエンチャー蛍光色素の対であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
不活性な形での空間的な隔たりが、前記プローブの二次的構造によって、そして具体的にはヘアピンによって、確保されることを特徴とする請求項６〜７の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項９】
前記スコーピオン・プライマーが、２種類のシグナル成分を有しており、そしてそれら２種類のシグナル成分が空間的に互いに遠ざかっていて不活性な形で存在し、前記プローブが、プライマー伸張生成物と混成すると空間的に互いに近接することを特徴とする請求項１〜５の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記シグナル成分が、活性な形で、蛍光共鳴エネルギー移動によってシグナルを発生することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブと、さらなる別のオリゴヌクレオチドとが、それぞれ少なくとも一つのシグナル成分を有していて、そしてそれらのシグナル成分が空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブがプライマー伸張反応生成物と混成すると、前記シグナル成分が互いに遠ざかることを特徴とする請求項１〜５の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記両シグナル成分が、クエンチャー蛍光色素の対であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
不活性な形での空間的な隔たりが、前記プローブと、前記さらなる別のオリゴヌクレオチドとの間のデュプレックス構造によって確保されることを特徴とする請求項１１〜１２の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブと、前記さらなる別のオリゴヌクレオチドとが、それぞれ少なくとも一つのシグナル成分を有していて、そしてそれらのシグナル成分は空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブがプライマー伸張反応生成物と混成すると、前記シグナル成分が互いに遠ざかることを特徴とする請求項１〜５の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記シグナル成分が、活性な形で、蛍光共鳴エネルギー移動によってシグナルを発生することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記さらなる別のオリゴヌクレオチドが、前記プローブに直接的に近接してプライマー伸張生成物と結合することを特徴とする請求項１４〜１５の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１７】
複数個の配列を同時に増幅することを特徴とする請求項１〜１６の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅が、２種類のスコーピオン・プライマーによって行われることを特徴とする請求項１〜１７の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記スコーピオン・プライマーが、異なるシグナル成分を有することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記スコーピオン・プライマーの一方が、メチル化に対して特異的なプローブを有し、前記スコーピオン・プライマーのもう一方が、メチル化に対して非特異的なプローブを有することを特徴とする請求項１８〜１９の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記スコーピオン・プライマーの一方が、メチル化に対して特異的なプローブを有し、前記スコーピオン・プライマーのもう一方が、変異または対立遺伝子に対して特異的なプローブを有することを特徴とする請求項１〜１９に記載の方法。
【請求項２２】
メチル化に対して非特異的なＰＣＲ増幅が行われ、その際、前記プローブが、クエンチャーと色素分子とを有し、そしてこれらのクエンチャーと色素分子とが、空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブがプライマー伸張生成物と混成すると互いに遠ざかる（「メチル−ヘアピン」）ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＭＳＰ増幅が行われ、その際、前記プローブが、クエンチャーと色素分子とを有し、そしてこれらのクエンチャーと色素分子とが、空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブがプライマー伸張生成物と混成すると互いに遠ざかる（「ＭＳＰ−メチル−ヘアピン」）ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２４】
ヘビー・メチル増幅が行われ、その際、前記プローブが、クエンチャーと色素分子とを有し、そしてこれらのクエンチャーと色素分子とが、空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブが、プライマー伸張生成物と混成すると互いに遠ざかる（「ヘビー・メチル−ヘアピン」）ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２５】
メチル化に対して非特異的な増幅が行われ、その際、前記プローブが色素分子を有し、そしてさらなる別のオリゴヌクレチオドがクエンチャーを有し、そしてこれらの色素分子とクエンチャーが、空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブが、プライマー伸張生成物と混成すると互いに遠ざかる（「メチル−デュプレックス」）ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＳＰ増幅が行われ、その際、前記プローブが色素分子を有し、そしてさらなる別のオリゴヌクレチオドがクエンチャーを有し、そしてこれらの色素分子とクエンチャーが、空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブが、プライマー伸張生成物と混成すると互いに遠ざかる（「ＭＳＰ−メチル−デュプレックス」）ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２７】
ヘビー・メチル増幅が行われ、その際、前記プローブが色素分子を有し、そしてさらなる別のオリゴヌクレチオドがクエンチャーを有し、そしてこれらの色素分子とクエンチャーが、空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブが、プライマー伸張生成物と混成すると互いに遠ざかる（「ヘビー・メチル−デュプレックス」）ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅が、２種類のスコーピオン・プライマーによって行われ、前記スコーピオン・プライマーの一方が、メチル化に対して特異的なプローブを有し、前記スコーピオン・プライマーのもう一方が、メチル化に対して非特異的なプローブを有する（「定量的メチル−ヘアピン」）ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
癌疾患またはシトシンのメチル化状態が関係する疾患の診断または予後の予測のため、薬物の副作用の予想のため、特異的な薬物治療の確定のため、薬物治療の結果の監視のため、細胞のタイプまたは組織を区別するため、または細胞分化を研究するために、請求項１〜２８の少なくとも一項に記載の方法の使用。
【請求項３０】
メチル化分析にスコーピオン・プライマーを使用すること、特に、癌疾患またはシトシンのメチル化状態が関係する疾患の診断または予後の予測のため、薬物の副作用の予想のため、特異的な薬物治療の確定のため、薬物治療の結果の監視のため、細胞のタイプまたは組織を区別するため、または細胞分化を研究するためのスコーピオン・プライマーの使用。
【請求項３１】
少なくとも一つのスコーピオン・プライマー、ポリメラーゼ、およびポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬からなるキット。
【請求項１】
ａ）５−メチル化シトシンが未反応にとどまる一方で、非メチル化シトシンがウラシルまたは、シトシンと塩基対の挙動が異なる、その他の塩基に変換されるように、検査すべきＤＮＡと試薬または酵素とを反応させることと、
ｂ）前処理した前記ＤＮＡをポリメラーゼと少なくとも一つのプライマーとで増幅し、その５’末端にリンカーを介してプローブを結合することと（スコーピオン・プライマー）、
ｃ）前記プライマー伸張生成物をマトリックス鎖から分離することと、
ｄ）前記プローブが、分子内的に前記プライマー伸張生成物と混成し、そしてその混成が、ＤＮＡのメチル化状態に依存して起こることと、
ｅ）前記プローブの混成が起こったか否かを検出することと
を特徴とするＤＮＡ中のシトシンのメチル化を検出する方法。
【請求項２】
工程ａ）の反応が亜硫酸水素塩で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）の反応がシチジン脱アミナーゼによって行われ、その際、非メチル化シチジンがメチル化シチジンより速く反応することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）の前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応によって行われることを特徴とする請求項１〜３の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリメラーゼ連鎖反応がＭＳＰ法またはヘビー・メチル法の形で行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブが、２種類のシグナル成分を有しており、そしてそれら２種類のシグナル成分が空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブが、プライマー伸張生成物と混成すると、前記シグナル成分が、互いに遠ざかることを特徴とする請求項１〜５の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項７】
前記両シグナル成分が、クエンチャー蛍光色素の対であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
不活性な形での空間的な隔たりが、前記プローブの二次的構造によって、そして具体的にはヘアピンによって、確保されることを特徴とする請求項６〜７の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項９】
前記スコーピオン・プライマーが、２種類のシグナル成分を有しており、そしてそれら２種類のシグナル成分が空間的に互いに遠ざかっていて不活性な形で存在し、前記プローブが、プライマー伸張生成物と混成すると空間的に互いに近接することを特徴とする請求項１〜５の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記シグナル成分が、活性な形で、蛍光共鳴エネルギー移動によってシグナルを発生することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブと、さらなる別のオリゴヌクレオチドとが、それぞれ少なくとも一つのシグナル成分を有していて、そしてそれらのシグナル成分が空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブがプライマー伸張反応生成物と混成すると、前記シグナル成分が互いに遠ざかることを特徴とする請求項１〜５の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記両シグナル成分が、クエンチャー蛍光色素の対であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
不活性な形での空間的な隔たりが、前記プローブと、前記さらなる別のオリゴヌクレオチドとの間のデュプレックス構造によって確保されることを特徴とする請求項１１〜１２の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブと、前記さらなる別のオリゴヌクレオチドとが、それぞれ少なくとも一つのシグナル成分を有していて、そしてそれらのシグナル成分は空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブがプライマー伸張反応生成物と混成すると、前記シグナル成分が互いに遠ざかることを特徴とする請求項１〜５の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記シグナル成分が、活性な形で、蛍光共鳴エネルギー移動によってシグナルを発生することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記さらなる別のオリゴヌクレオチドが、前記プローブに直接的に近接してプライマー伸張生成物と結合することを特徴とする請求項１４〜１５の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１７】
複数個の配列を同時に増幅することを特徴とする請求項１〜１６の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅が、２種類のスコーピオン・プライマーによって行われることを特徴とする請求項１〜１７の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記スコーピオン・プライマーが、異なるシグナル成分を有することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記スコーピオン・プライマーの一方が、メチル化に対して特異的なプローブを有し、前記スコーピオン・プライマーのもう一方が、メチル化に対して非特異的なプローブを有することを特徴とする請求項１８〜１９の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記スコーピオン・プライマーの一方が、メチル化に対して特異的なプローブを有し、前記スコーピオン・プライマーのもう一方が、変異または対立遺伝子に対して特異的なプローブを有することを特徴とする請求項１〜１９に記載の方法。
【請求項２２】
メチル化に対して非特異的なＰＣＲ増幅が行われ、その際、前記プローブが、クエンチャーと色素分子とを有し、そしてこれらのクエンチャーと色素分子とが、空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブがプライマー伸張生成物と混成すると互いに遠ざかる（「メチル−ヘアピン」）ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＭＳＰ増幅が行われ、その際、前記プローブが、クエンチャーと色素分子とを有し、そしてこれらのクエンチャーと色素分子とが、空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブがプライマー伸張生成物と混成すると互いに遠ざかる（「ＭＳＰ−メチル−ヘアピン」）ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２４】
ヘビー・メチル増幅が行われ、その際、前記プローブが、クエンチャーと色素分子とを有し、そしてこれらのクエンチャーと色素分子とが、空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブが、プライマー伸張生成物と混成すると互いに遠ざかる（「ヘビー・メチル−ヘアピン」）ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２５】
メチル化に対して非特異的な増幅が行われ、その際、前記プローブが色素分子を有し、そしてさらなる別のオリゴヌクレチオドがクエンチャーを有し、そしてこれらの色素分子とクエンチャーが、空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブが、プライマー伸張生成物と混成すると互いに遠ざかる（「メチル−デュプレックス」）ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＳＰ増幅が行われ、その際、前記プローブが色素分子を有し、そしてさらなる別のオリゴヌクレチオドがクエンチャーを有し、そしてこれらの色素分子とクエンチャーが、空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブが、プライマー伸張生成物と混成すると互いに遠ざかる（「ＭＳＰ−メチル−デュプレックス」）ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２７】
ヘビー・メチル増幅が行われ、その際、前記プローブが色素分子を有し、そしてさらなる別のオリゴヌクレチオドがクエンチャーを有し、そしてこれらの色素分子とクエンチャーが、空間的に互いに近接して不活性な形で存在し、前記プローブが、プライマー伸張生成物と混成すると互いに遠ざかる（「ヘビー・メチル−デュプレックス」）ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅が、２種類のスコーピオン・プライマーによって行われ、前記スコーピオン・プライマーの一方が、メチル化に対して特異的なプローブを有し、前記スコーピオン・プライマーのもう一方が、メチル化に対して非特異的なプローブを有する（「定量的メチル−ヘアピン」）ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
癌疾患またはシトシンのメチル化状態が関係する疾患の診断または予後の予測のため、薬物の副作用の予想のため、特異的な薬物治療の確定のため、薬物治療の結果の監視のため、細胞のタイプまたは組織を区別するため、または細胞分化を研究するために、請求項１〜２８の少なくとも一項に記載の方法の使用。
【請求項３０】
メチル化分析にスコーピオン・プライマーを使用すること、特に、癌疾患またはシトシンのメチル化状態が関係する疾患の診断または予後の予測のため、薬物の副作用の予想のため、特異的な薬物治療の確定のため、薬物治療の結果の監視のため、細胞のタイプまたは組織を区別するため、または細胞分化を研究するためのスコーピオン・プライマーの使用。
【請求項３１】
少なくとも一つのスコーピオン・プライマー、ポリメラーゼ、およびポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬からなるキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５０２１２６（Ｐ２００７−５０２１２６Ａ）
【公表日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２３５１９（Ｐ２００６−５２３５１９）
【出願日】平成１６年８月１３日（２００４．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００４／００１８３７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２４０５６
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【出願人】（５００２４７１０５）エピゲノミクス アーゲー (15)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１３日（２００４．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００４／００１８３７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２４０５６
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【出願人】（５００２４７１０５）エピゲノミクス アーゲー (15)
【Ｆターム（参考）】
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