ＥｐｈＡ３に対する抗体
本開示は、疾患を治療するためにヒトに投与した場合に免疫原性が低減されている、EphA3に対する高親和性抗体、およびそのような抗体を使用する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2009年10月14日に出願した米国特許仮出願第61/251,668号の恩典を主張し、この出願は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Eph受容体チロシンキナーゼ(Eph)は、チロシン残基においてタンパク質をリン酸化するキナーゼである受容体チロシンキナーゼ(RTK)の大きな群に属する。Ephおよびそれらの膜結合型エフリンリガンド(エフリン)は、細胞の位置決めおよび組織の組織化を制御する(Poliakov, A., et al., Dev Cell 7:465-80 (2004) (非特許文献1))。他の受容体チロシンキナーゼとは対照的に、Eph受容体の活性化は、リガンド結合および二量体化を必要とするばかりでなく、予め形成されたリガンドオリゴマーを必要とする。したがって、Eph受容体のチロシンリン酸化は、クラスター形成型または膜結合型のエフリンリガンドの提示を必要とする(Davis et al., Science 266:816-819 (1994) (非特許文献2))。機能的でかつ生化学的なEph応答は、より高度なリガンドオリゴマー形成状態で起こる(Stein et al., Genes Dev 12:667-678 (1998) (非特許文献3))。
【０００３】
数あるパターン形成機能の中でも特に、種々のEphおよびエフリンは、血管発生において役割を果たすことが示されている。成体において、ある種のエフリンおよびそれらの受容体が調節解除されて再出現することが、腫瘍の浸潤、転移、および新血管新生に寄与することも認められている。例えば、ドミナントネガティブな可溶性EphA2またはEphA3タンパク質は、インビトロにおいてエフリン誘導性の内皮細胞機能に及ぼす効果、ならびにインビボにおいて腫瘍の血管新生および進行に及ぼす効果を示す(Nakamoto,. et al., Microsc Res Tech 59:58-67 (2002) (非特許文献4)；Brantley-Sieders, et al., Curr Pharm Des 10:3431-42 (2004) (非特許文献5)；Brantley, et al. Oncogene 21 :7011-26 (2002) (非特許文献6)；Cheng, et al. Neoplasia 5:445-56 (2003) (非特許文献7)．Dobrzanski, et al. Cancer Res 64:910-9 (2004) (非特許文献8))。さらに、Ephファミリーメンバーは、多種多様なヒト固形腫瘍に由来する腫瘍細胞で過剰発現することが見出されている(Brantley-Sieders, et al., Curr Pharm Des 10:3431-42 (2004) (非特許文献5)；Marme, D. Ann Hematol 81 Suppl 2:S66 (2002) (非特許文献9)；Booth, C. et al., Nat Med 8:1360-1 (2002) (非特許文献10))。
【０００４】
Epha3はまた、移行期および急性転化期の慢性骨髄性白血病(CML)患者のCD34+細胞で活性化され、過剰発現することも報告されている(Cilloni et al., American Society of Hematology, Abstract 1092, 2008 (非特許文献11) (2008年11月14日にオンラインで利用可能))。Cilloniらは、初代CML細胞またはEphA3をトランスフェクトした正常細胞を特異的モノクローナル抗体と共にインキュベートした場合に、該抗体が初代細胞およびトランスフェクト細胞において増殖の有意な減少を誘導し、コロニーの成長を減少させ、かつ接着特性の変化を誘導することを報告した。該抗体は、正常対照細胞においても、慢性期のCML患者に由来する細胞においても、有意な変化を全く誘導しなかった。
【０００５】
本発明は、新規な抗EphA3抗体の発見に一部基づいている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Poliakov, A., et al., Dev Cell 7:465-80 (2004)
【非特許文献２】Davis et al., Science 266:816-819 (1994)
【非特許文献３】Stein et al., Genes Dev 12:667-678 (1998)
【非特許文献４】Nakamoto,. et al., Microsc Res Tech 59:58-67 (2002)
【非特許文献５】Brantley-Sieders, et al., Curr Pharm Des 10:3431-42 (2004)
【非特許文献６】Brantley, et al. Oncogene 21 :7011-26 (2002)
【非特許文献７】Cheng, et al. Neoplasia 5:445-56 (2003)
【非特許文献８】Dobrzanski, et al. Cancer Res 64:910-9 (2004)
【非特許文献９】Marme, D. Ann Hematol 81 Suppl 2:S66 (2002)
【非特許文献１０】Booth, C. et al., Nat Med 8:1360-1 (2002)
【非特許文献１１】Cilloni et al., American Society of Hematology, Abstract 1092, 2008
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、強力な抗EphA3抗体、および例えばEphA3が関与する疾患を治療するために、そのような抗体を使用する方法に関する。本発明の抗体は、本明細書に記載される特徴を有する。したがって、1つの局面において、本発明の抗体は、アミノ酸配列X1GX2YEX3FDX4を含むCDR3を含むVH領域を含み、ここで、X1はSまたはGであり、X2はYまたはVであり、X3はEまたはDであり、かつX4はS、V、またはIであるが、ただしアミノ酸配列がSGYYEDFDSである場合には、CDR1はSYWINではなく、アミノ酸配列がSGYYEEFDSである場合には、CDR1はTYWISではない。いくつかの態様において、抗体は、アミノ酸配列
を含むCDR3を有する。いくつかの態様において、抗体は、ヒト生殖系列Jセグメントアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性、典型的には少なくとも85％もしくは少なくとも90％の同一性を含むか；または2つ以下の位置でヒト生殖系列Jセグメントと異なるJセグメント；ならびにヒト生殖系列Vセグメントアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性、典型的には少なくとも85％の同一性、および好ましくは90％の同一性、またはそれ以上を含むVセグメントを有する。いくつかの態様において、JセグメントはヒトJH6アミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含み、かつVセグメントはヒトVH1 1-02アミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含む。いくつかの態様において、抗体は、WGQGTTVTVSを含むFR4、またはWGQGTTVTVSと1つ以下のアミノ酸が異なるFR4を有する。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載のVH領域に示されるVH CDR1、またはVH CDR2、またはVH CDR1およびVH CDR2の両方を含む。例えば、本発明の抗体は、アミノ酸配列GYWMN、TYWIS、もしくはSYWINを有するVH CDR1、および/またはアミノ酸配列
を有するCDR2を有し得る。いくつかの態様において、抗体は、VH CDR1 GYWMNおよびCDR2
を有する。いくつかの態様において、抗体は、VH CDR1 TYWISおよびVH CDR2
を有する。いくつかの態様において、本発明の抗体は、図1に示されるV領域の1つに由来するVH CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。いくつかの態様において、抗体は、図1に示されるVセグメント配列のVH Vセグメントアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、VHは、図1に記載されるVH領域の配列を有する。
【０００８】
本発明はまた、配列X1X2YX3X4YPYTを有するCDR3結合特異性決定基を含むVL領域を有する抗体を提供し、ここで、X1はG、V、またはAであり；X2はQ、R、またはGであり；X3はA、S、またはLであり；かつX4はNまたはKである。いくつかの態様において、CDR3は、
を含む。いくつかの態様において、CDR3がVQYANYPYTである場合には、CDR1はRASQEISGYLGでもRASQGIISYLAでもなく、かつ/またはCDR2はAASTLDSでもAASSLQSでもない。いくつかの態様において、VL領域は、ヒト生殖系列Jセグメントアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性、典型的には少なくとも85％もしくは90％の同一性を含むか、またはヒト生殖系列セグメントと2つ以下のアミノ酸が異なるJセグメント；およびヒト生殖系列Vセグメントアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性、典型的には少なくとも90％の同一性、またはそれ以上を含むVセグメントを含む。いくつかの態様において、Jセグメントは、ヒト生殖系列Jκ2アミノ酸配列に由来する配列FGQGKLEIKに対して2つ以下のアミノ酸変化、多くの場合には1つ以下のアミノ酸変化を有し、かつVセグメントは、ヒト生殖系列JκI L15アミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含む。いくつかの態様において、抗体のFR4はアミノ酸配列FGQGKLEIKを有するか、または配列FGQGKLEIKに対して変化した1つ以下のアミノ酸残基を有する。いくつかの態様において、VL領域は、図1に示される配列VL領域のCDR1、またはCDR2、またはCDR1およびCDR2の両方を含む。例えば、CDR1は、配列
を有し得；かつ/またはCDR2は、配列AASSLQS、GASSLQS、AASSLQR、もしくはAASTLDSを有し得る。いくつかの態様において、CDR1は配列RASQGIISYLAを有し、かつCDR2は配列GASSLQSを有する。いくつかの態様において、CDR1は配列QASQDISTYLNを有し、かつCDR2は配列AASSLQRまたはAASSLQSを有する。いくつかの態様において、CDR1は配列RASQSISSYLAを有し、かつCDR2は配列AASSLQRを有する。いくつかの態様において、VL領域は、図1に記載されるVL領域の1つのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。いくつかの態様において、VL領域は、図1に示されるVセグメント配列を有するVセグメントを含む。いくつかの態様において、VL領域は、図1に記載されるVL領域の配列を有する。典型的な態様において、抗体のVH領域は、先行する段落に記載されるVH領域のいずれかを含む。
【０００９】
いくつかの態様において、本発明は、
を含むCDR3を有するVL領域を含む抗体を提供する。いくつかの態様において、抗体は、アミノ酸配列X1GX2YEX3FDX4を含む重鎖CDR3を含み、ここで、X1はSまたはGであり、X2はYまたはVであり、X3はEまたはDであり、かつX4はS、V、またはIである。いくつかの態様において。いくつかの態様において、重鎖CDR3は、アミノ酸配列
を含む。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載される軽鎖CDR1もしくはCDR2、または図1に記載される重鎖CDR1もしくはCDR2を含む。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載される軽鎖CDR1およびCDR2、ならびに/または図1に記載される重鎖CDR1およびCDR2を含む。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載されるVL Vセグメントを含む。
【００１０】
本発明はさらに、配列SGYYE(E/D)FDSを有するCDR3を含むVH領域、および先行する段落に記載されるVL領域CDR3配列を含む抗体を提供するが、ただしVL領域CDR3配列はVQYANYPYTでもVQYMNYPYTでもない。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載される重鎖CDR1もしくはCDR2、または図1に記載される軽鎖CDR1もしくはCDR2を含む。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載される重鎖CDR1およびCDR2、ならびに/または図1に記載される軽鎖CDR1およびCDR2を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、本発明の抗EphA3抗体は、図1に記載されるVH領域の1つに由来するVH CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに図1に記載されるVL領域の1つに由来するVL CDR1、CDR2、およびCDR3を含む。
【００１２】
本発明の抗体は、図1に記載されるVH領域または図1に記載されるVL領域を含み得る。多くの場合には、抗体は、図1に記載されるVH領域および図1に記載されるVL領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、a) SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:20、b) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:11、c) SEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO:12、d) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:19、e) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:21、f) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:22、g) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:23、h) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:11、i) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:12、j) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:21、k) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:22、l) SEQ ID NO:4および SEQ ID N0:11、m) SEQ ID N0:4およびSEQ ID NO:13、n) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:11、o) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:13、p) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:21、q) SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:14、r) SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:15、s) SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:14、t) SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:15、u) SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:14、v) SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:15、w) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:16、x) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:17、y) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:19、z) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:17、aa) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:18、またはbb) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:20を含むVH領域とVL領域の組み合わせを含む。
【００１３】
いくつかの態様において、例えば図1中のVH領域配列より選択されるVH領域配列、および図1中のVL領域配列より選択されるVL領域を有する本発明の抗体は、37℃で実施した表面プラズモン共鳴解析により決定して約10 nMよりも優れた、および多くの場合には約5 nMまたは1 nMよりも優れた一価親和性を有する。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗体は、約10 nM、約5 nM、約2.5 nM、約1 nM、約0.5 nM、約0.25 nM、または約0.1 nM、もしくはそれよりも優れた親和性(表面プラズモン共鳴を用いて測定)を有する。
【００１４】
本明細書に記載される本発明の抗体は、N末端にメチオニンを含むVH領域および/またはVL領域を有し得る。
【００１５】
いくつかの態様において、抗体はIgGである。いくつかの態様において、抗体はIgG1またはIgG3である。いくつかの態様において、抗体はIg2またはIgG4である。
【００１６】
いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO:24に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、および/またはSEQ ID NO:25に記載されるアミノ酸配列を有するκ軽鎖定常領域を含む。
【００１７】
いくつかの態様において、抗体の重鎖定常領域は無フコシル化されている。いくつかの態様において、本発明の抗体を含む抗体調製物は、低フコシル化または無フコシル化されている。
【００１８】
いくつかの態様において、本発明の抗EphA3抗体は、それぞれSEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、またはSEQ ID NO:36およびSEQ ID NO:27を含む重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を有し；かつ抗体は無フコシル化されている。
【００１９】
いくつかの態様において、抗体は(Fab')2である。
【００２０】
いくつかの態様において、抗体はペグ化されている。
【００２１】
いくつかの態様において、抗体はEphA3を活性化する。
【００２２】
いくつかの態様において、抗体は、EphA3への結合に関して例えばエフリンA5のような天然リガンドと競合しない。
【００２３】
別の局面において、本発明は、EphA3依存性疾患を有する患者を治療する方法であって、本明細書に記載される本発明の抗体を治療有効量で該患者に投与する段階を含む方法を提供する。患者は、例えば癌を有し得る。いくつかの態様において、抗体は、EphA3を発現する腫瘍細胞を含む固形腫瘍を有する患者に投与される。他の態様において、抗体は、EphA3を発現する腫瘍細胞を有さない腫瘍を有する患者に投与される。
【００２４】
いくつかの態様において、抗体は、骨髄増殖性疾患を有する患者に投与される。いくつかの態様において、抗体は、急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病を有する患者に投与される、いくつかのいくつかの態様において、抗体はリンパ腫を有する患者に投与される。いくつかの態様において、抗体は、骨髄異形成症候群、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、または特発性骨髄線維症を有する患者に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の抗EphA3抗体の例示的なVH配列およびVL配列を提供する。
【図２】重鎖CDR2/FR3カセット構築の模式図を提供する。
【図３】抗EphA3 IgGを用いた抗原結合ELISAの結果を示す。EphA3-FcをコーティングしたELISAプレートを、キメラIIIA4(丸)、本発明の例示的な改変抗体(四角)、または対照IgG(三角)で処理し、抗ヒトκ鎖HRPコンジュゲートとの結合についてプロービングした。
【図４】EphA3に対する本発明の改変抗体の特異性を示す。様々なEphタンパク質をELISAプレート上にコーティングし、改変抗体で処理し、抗ヒトκ鎖HRPコンジュゲートとの結合についてプロービングした。
【図５】本発明の例示的な改変抗EphA3抗体が、細胞表面に発現されたEphA3に結合する能力を評価する実験における、3つの細胞株のフローサイトメトリー解析のデータを示す。B16細胞、SKmel28細胞、およびLnCAP細胞を2％ BSAおよびラットIgGでブロッキングし、改変抗EphA3 IgG、キメラIIIA4 IgG、またはアイソタイプ対照IgGでプロービングした。Facs Caliberフローサイトメトリー(BD)を用いて、結合した抗体を、抗ヒトIgGフィコエリトリンコンジュゲートにより検出した。死細胞は、ヨウ化プロピジウム染色により排除した。各グラフについて、対照抗体プロファイルはグラフ中の一番左側の曲線である。
【図６】無フコシル化抗EphA3抗体が、フコシル化抗EphA3抗体と比較して、AML細胞に対する増強されたADCC活性を有することを示すデータを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本明細書で使用する「EphA3」は、Eph受容体A3を指す。この受容体は、「ヒト胚キナーゼ」、「hek」、「eph様チロシンキナーゼ1」、「etk1」、または「tyro4」とも称されている。EphA3は、タンパク質-チロシンキナーゼファミリーのエフリン受容体サブファミリーに属する。EPHおよびEPH関連受容体は、発生事象の媒介に関連づけられている。EPHサブファミリーの受容体は、典型的には、単一のキナーゼドメイン、ならびにCysリッチドメインおよび2つのフィブロネクチンIII型反復を含む細胞外領域を有する。エフリン受容体は、それらの細胞外ドメイン配列の類似性、ならびにエフリン-Aおよびエフリン-Bリガンドとの結合に関するそれらの親和性に基づいて、2つの群に分類される。EphA3はエフリン-Aリガンドと結合する。EphA3の核酸配列およびタンパク質配列は公知である。例示的なヒトEphA3アミノ酸配列は、アクセッション番号(EAW68857)の下で入手可能である。
【００２７】
本発明おいて、EphA3の「活性化」は、EphA3のリン酸化を引き起こす。したがって、EphA3を活性化する、すなわちEphA3のリン酸化を引き起こす抗体は、本発明との関連においてアゴニストと見なされる。EphA3は、二量体化によって活性化され得る。そのような活性化は、リン酸化およびアポトーシスをもたらし得るが、必ずしも細胞の円形化をもたらし得るわけではない。例えばEphA3のクラスター化が起こった場合の活性化は、形態変化、典型的には細胞の円形化をさらにもたらし得る。
【００２８】
本発明において、「EphA3抗体」または「抗EphA3抗体」は互換的に用いられ、EphA3に特異的に結合する抗体を指す。いくつかの態様において、抗体はEphA3を二量体化し得る。本用語は、エフリンリガンド(例えば、エフリンA5)結合の存在下においてEphA3に結合する抗体、およびリガンド結合部位に結合し、EphA3に対するリガンド結合と競合する抗体を包含する。
【００２９】
「エフリンリガンドの結合の存在下においてEphA3に結合するEphA3抗体」とは、エフリンA5などのエフリンリガンドのEphA3に対する結合を有意に妨げない抗体を指す。EphA3およびエフリンリガンド、例えばエフリンA5を含む結合反応物中にそのような抗体が存在すると、EphA3に対するエフリンリガンド結合は約30％未満、典型的には20％または10％未満減少する。
【００３０】
「mAb IIIA4」という用語は、EphA3をアフィニティー単離するために、元々LK63ヒト急性プレB白血病細胞に対して産生されたモノクローナル抗体IIIA4を指す(Boyd, et al. J Biol Chem 267:3262-3267, 1992)。mAb IIIA4は、天然EphA3球状エフリン結合ドメインに結合する(例えば、Smith, et al., J. Biol. Chem 279:9522-9531, 2004)。これは、アクセッション番号91061920の下で、欧州動物細胞培養収集機関(European Collection of Animal Cell Cultures)に寄託されている(例えば、欧州特許第EP0590030号を参照されたい)。
【００３１】
本明細書で使用する「活性アイソタイプを有する抗体」とは、免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に結合するヒトFc領域を有する抗体を指す。「活性アイソタイプ」には、IgG1、IgG3、IgM、IgA、およびIgEが含まれる。本用語は、Fcエフェクター機能を調節する変異、またはそのように調節する糖組成および/もしくはグリコシル化レベルに対する変化などの修飾を含むヒトFc領域を有する抗体を包含する。
【００３２】
「Fc領域」とは、第1定常領域免疫グロブリンドメインを除いた抗体の定常領域を指す。したがって、Fcとは、IgA、IgD、およびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにIgEおよびIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのN末端側の可動性ヒンジを指す。IgAおよびIgMの場合、FcはJ鎖を含み得る。IgGの場合、Fcは、免疫グロブリンドメインCγ2およびCγ3、ならびにCγ1とCγとの間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変化し得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は通常、そのカルボキシル末端に残基C226またはP230を含むよう規定され、その際、番号付けはKabatらによるEU指数(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va)に従うことが、当技術分野において理解されている。「Fc領域」という用語は、単離体としてのこの領域を指す場合もあれば、または抗体もしくは抗体断片との関連におけるこの領域を指す場合もある。「Fc領域」は、Fc領域の天然の対立遺伝子変種、およびエフェクター機能を調節する修飾を含む。Fc領域はまた、生物学的機能に変化をもたらさない変種も含む。例えば、生物学的機能を実質的に喪失させることなく、免疫グロブリンのFc領域のN末端またはC末端から1つまたは複数のアミノ酸を欠失させることができる。このような変種は、活性に最小の影響を及ぼすように、当技術分野で公知の一般規則に従って選択することができる(例えば、Bowie, et al., Science 247:306-1310, 1990を参照されたい)。
【００３３】
(KD)と省略される「平衡解離定数」または「親和性」という用語は、会合速度定数(Ka、時間-1 M-1)で除した解離速度定数(kd、時間-1)を指す。平衡解離定数は、当技術分野における任意の公知の方法を用いて測定することができる。本発明の抗体は高親和性抗体である。このような抗体は、37℃で実施した表面プラズモン共鳴解析により決定して約約50 nMよりも優れた(低い)、および多くの場合には約10 nM未満の一価親和性を有する。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗体は、約50 nM未満、典型的には約25 nM未満、またはさらには10 nM未満、例えば約5 nMまたは約1 nMの親和性(表面プラズモン共鳴を用いて測定)を有する。本発明との関連において、親和性は、例えばより低い数値的KDによって明らかなようにより高い親和性を有する場合に、「より優れている」。
【００３４】
タンパク質またはペプチドに言及する場合の、抗体に「特異的に(または選択的に)結合する」または「〜と特異的に(または選択的に)免疫反応性である」という語句は、抗体が関心対象のタンパク質に結合する結合反応を指す。本発明との関連において、抗体は典型的には、他の抗原に対するその親和性よりも少なくとも100倍高い親和性でEphA3に結合する。
【００３５】
本明細書で使用する「抗体」とは、結合タンパク質として機能的に定義され、かつ抗体を産生する動物の免疫グロブリンコード遺伝子のフレームワーク領域に由来すると当業者によって認識されるアミノ酸配列を含むとして構造的に定義されるタンパク質を指す。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなり得る。認識されている免疫グロブリン遺伝子にはκ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、これらはそれぞれ免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを規定する。
【００３６】
典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は2つの同じポリペプチド鎖対からなり、各対は1本の「軽」鎖(約25 kD)および1本の「重」鎖(約50〜70 kD)を有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識を担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。
【００３７】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、結合特異性を保持する抗体断片も含む。例えば、いくつかの十分に特徴づけられた抗体断片が存在する。したがって、例えば、ペプシンはヒンジ領域内のジスルフィド結合のC末端側で抗体を消化して、それ自体ジスルフィド結合によってVH-CH1に結合している軽鎖であるFabの二量体、F(ab)'2を生じる。F(ab)'2を穏和な条件下で還元してヒンジ領域内のジスルフィド結合を切断し、それにより(Fab')2二量体からFab'単量体に変換することができる。Fab'単量体は、本質的にヒンジ領域の部分を伴うFabである(他の抗体断片のより詳細な説明については、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を参照されたい)。無傷の抗体の消化に関して様々な抗体断片が規定されるが、当業者は、化学的にまたは組換えDNA方法論を用いることによりそのような断片を新規に合成できることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用する抗体という用語はまた、全抗体の修飾によって生じるか、または組換えDNA方法論を用いて合成される抗体断片を含む。
【００３８】
抗体には、可変重鎖領域と可変軽鎖領域が共に結合して(直接またはペプチドリンカーを介して)、連続したポリペプチドを形成する一本鎖Fv抗体(sFvまたはscFv)のような一本鎖抗体(単一のポリペプチド鎖として存在する抗体)を含む、VH-VL二量体が含まれる。一本鎖Fv抗体は、直接結合しているか、またはペプチドコードリンカーによって結合しているVHコード配列およびVLコード配列を含む核酸から発現され得る、共有結合したVH-VLである(例えば、Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)。VHとVLは単一ポリペプチド鎖として互いに結合しているが、VHドメインおよびVLドメインは非共有結合によって会合する。あるいは、抗体は別の断片であってもよい。他の断片もまた、例えば組換え技法を用いて、可溶性タンパク質として、またはディスプレイ法から得られる断片として作製することができる。抗体には、二抗体(diantibody)およびミニ抗体も含まれ得る。本発明の抗体には、ラクダ科動物に由来する抗体のような重鎖二量体も含まれる。
【００３９】
本明細書で使用する「V領域」とは、B細胞分化の際の重鎖および軽鎖のV領域遺伝子の再編成の結果としてVセグメントに付加されるセグメントであるCDR3およびフレームワーク4を含めた、フレームワーク1、CDR1、フレームワーク2、CDR2、およびフレームワーク3のセグメントを含む抗体可変領域ドメインを指す。本明細書で使用する「Vセグメント」とは、V遺伝子によってコードされるV領域(重鎖または軽鎖)の領域を指す。重鎖可変領域のVセグメントは、FR1-CDR1-FR2-CDR2およびFR3をコードする。本発明の目的のために、軽鎖可変領域のVセグメントは、FR3を通じてCDR3まで及ぶと定義する。
【００４０】
本明細書で使用する「Jセグメント」という用語は、CDR3およびFR4のC末端部分を含みコードされる可変領域のサブ配列を指す。生殖系列Jセグメントは、免疫グロブリンJ遺伝子セグメントによってコードされる。
【００４１】
本明細書で使用する「相補性決定領域(CDR)」とは、軽鎖および重鎖の可変領域によって確立される4つの「フレームワーク」領域を中断する、各鎖における3つの超可変領域を指す。CDRは主に、抗原のエピトープに対する結合を担う。各鎖のCDRは典型的には、N末端から順に番号付けしてCDR1、CDR2、およびCDR3と称され、典型的には、特定のCDRが位置する鎖によっても特定される。したがって、VH CDR3はそれが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、VL CDR1はそれが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するCDR1である。
【００４２】
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成成分である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域が組み合わさったものであり、三次元空間にCDRを配置し、整列させるように働く。
【００４３】
CDRおよびフレームワーク領域のアミノ酸配列は、例えばKabat、Chothia、国際ImMunoGeneTicsデータベース(IMGT)、およびAbMといった、当技術分野で周知の種々の定義を用いて決定することができる(例えば、Johnson et al.、前記；Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917；Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883；Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817；Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol 1997, 273(4)を参照されたい)。抗原結合部位の定義は、以下の文献にも記載されている：Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000)；およびLefranc,M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan 1;29(1):207-9 (2001)；MacCallum et al, Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996)；およびMartin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989)；Martin, et al, Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991)；Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992)；およびRees et al, In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996)。
【００４４】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続したアミノ酸から、またはタンパク質の三次折りたたみによって隣接した非連続アミノ酸から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは典型的には、変性溶媒に曝露されても保持されるが、三次折りたたみによって形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは典型的には、独特の空間的高次構造中に少なくとも3アミノ酸、およびより一般的には少なくとも5または8〜10アミノ酸を含む。エピトープの空間的高次構造を決定する方法には、例えば、x線結晶解析および2次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)を参照されたい。
【００４５】
本明細書で使用する「キメラ抗体」とは、(a) 定常領域またはその一部が改変、置換、または交換され、その結果として抗原結合部位(可変領域)が、異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能、および/もしくは種の定常領域、または例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物等といったキメラ抗体に新たな特性を付与する完全に異なる分子に結合しているか；または(b) 可変領域またはその一部が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域もしくはその一部で；または別の種由来もしくは別の抗体クラスもしくはサブクラス由来の対応する配列で改変、置換、または交換された免疫グロブリン分子を指す。
【００４６】
本明細書で使用する「ヒト化抗体」とは、ドナー抗体由来のCDRがヒトフレームワーク配列に移植されている免疫グロブリン分子を指す。ヒト化抗体はまた、フレームワーク配列内にドナー起源の残基を含み得る。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含み得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含む場合がある。ヒト化は、「超ヒト化(superhumanizing)」抗体(Tan et al., J. Immunol. 169: 1119, 2002)および「表面再処理(resurfacing)」(例えば、Staelens et al., Mol. Immunol. 43: 1243, 2006；およびRoguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 969, 1994)などの技法を含む、当技術分野で公知の方法(例えば、Jones et al., Nature 321:522-525; 1986；Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988；Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992；米国特許第4,816,567号)を用いて行うことができる。
【００４７】
本発明との関連における「Humaneered(商標)」抗体とは、参照抗体の結合特異性を有する改変ヒト抗体を指す。本発明において使用するための「Humaneered(商標)」抗体は、ドナー免疫グロブリンに由来する最小配列を含む免疫グロブリン分子を有する。典型的には、抗体は、参照抗体の重鎖のCDR3領域による結合特異性決定基(BSD)をコードするDNA配列をヒトVHセグメント配列に結合し、参照抗体由来の軽鎖CDR3 BSDをコードするDNA配列をヒトVLセグメント配列に結合することによって「Humaneered(商標)」する。humaneer化する方法は、米国特許出願公開第20050255552号および米国特許出願公開第20060134098号に提供されている。
【００４８】
本発明との関連において使用する「結合特異性決定基」または「BSD」という用語は、抗体の結合特異性を決定するために必要な、CDR領域内の最小の連続したまたは非連続のアミノ酸配列を指す。本発明において、最小の結合特異性決定基は、抗体の重鎖および軽鎖のCDR3配列の一部または全長内に存在する。
【００４９】
本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト化抗体および「Humaneered(商標)」抗体、ならびに公知の技法を用いて得られるヒトモノクローナル抗体を包含する。
【００５０】
「低フコシル化」抗体調製物とは、オリゴ糖鎖の50％未満がα1,6-フコースを含む抗体調製物を指す。典型的には、「低フコシル化」抗体調製物では、オリゴ糖鎖の約40％未満、約30％未満、約20％未満、約10％未満、または5％未満もしくは1％未満がα1,6-フコースを含む。
【００５１】
「無フコシル化」抗体は、IgG重鎖のCH2ドメインに付着する炭水化物においてα1,6-フコースを欠いている。
【００５２】
核酸の部分に関して使用する場合の「異種の」という用語は、核酸が、天然では相互にこれと同じ関係で通常見出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、このような核酸は典型的には組換えにより作製され、例えば新たな機能的核酸を創出するように配置された無関係の遺伝子に由来する2つまたはそれ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質とは、天然では相互にこれと同じ関係で見出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を指す。
【００５３】
例えば細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して使用する場合の「組換え体」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種核酸もしくは異種タンパク質の導入または天然核酸もしくは天然タンパク質の変更により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば組換え細胞は、天然(非組換え)型の細胞内に見出されない遺伝子を発現するか、または天然遺伝子を発現するが、これが別の方法で異常に発現される、低発現される、もしくは全く発現されない。本明細書における「組換え核酸」という用語は、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いて、一般的に核酸の操作により最初にインビトロで形成された、天然に通常見出されない形態の核酸を意味する。このようにして、異なる配列の機能的な連結が達成される。したがって、通常は結合していないDNA分子を連結することによってインビトロで形成された線状形態の単離核酸または発現ベクターはいずれも、本発明の目的に関して組換え体と見なされる。組換え核酸を作製し、宿主細胞または生物体に再導入すると、これは非組換え的に、すなわちインビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製する；しかしながら、このような核酸は、組換えにより作製されると続いて非組換え的に複製するが、それでもなお本発明の目的に関して組換え体と見なされることが理解される。同様に、「組換えタンパク質」とは、組換え技法を用いて、すなわち上記の組換え核酸の発現を通して作製されたタンパク質である。
【００５４】
本明細書で使用するEphA3依存性疾患とは、EphA3を発現する細胞が、疾患を治療するための治療法の標的である疾患を指す。
【００５５】
「血管原性骨髄前駆細胞」という用語は、骨髄由来の内皮前駆体および/または循環内皮細胞前駆細胞を指す。
【００５６】
本明細書で使用する「癌細胞」または「腫瘍細胞」という用語は、新生物細胞を指す。本用語は、良性および悪性である癌細胞を含む。新生物形質転換は、腫瘍細胞の由来元の細胞型に対する腫瘍細胞の表現型変化を伴う。この変化には、接触阻害の喪失、形態変化、および異常な成長が含まれ得る。(Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd edition, 1994を参照されたい)。
【００５７】
本発明との関連における「癌の成長を阻害すること」とは、成長を遅延させること、および/または癌を有する患者の癌細胞負荷を減少させることを指す。したがって、「癌の成長を阻害すること」は、癌細胞を死滅させること、および癌細胞の成長を遅延または停止させることを含む。
【００５８】
本明細書において使用する「治療薬」とは、疾患に罹患している患者に治療有効量で投与した場合に、疾患および疾患に伴う合併症の症状を治癒するか、または少なくとも部分的に止める薬剤を指す。
【００５９】
2つまたはそれ以上のポリペプチド(または核酸)配列との関連における「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、以下に記載する初期設定パラメータでBLASTもしくはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いて、または手動アライメントおよび目視検査により測定した場合に(例えば、NCBIウェブサイトを参照されたい)、同一であるかまたは特定の割合のアミノ酸残基(またはヌクレオチド)が同一である(すなわち、比較領域または指定領域にわたって最大限の一致を得るために比較およびアライメントした場合の、特定領域にわたる約60％の同一性、好ましくは70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれよりも高い同一性)2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。そのような配列は、その時「実質的に同一である」と称される。「実質的に同一である」配列には、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列、ならびに天然の、例えば多型または対立遺伝子変種、および人為的変種もまた含まれる。以下に記載するように、好ましいアルゴリズムはギャップ等について説明し得る。好ましくは、タンパク質配列同一性は、少なくとも約25アミノ酸長の領域にわたり、またはより好ましくは50〜100アミノ酸長の領域にわたり、またはタンパク質の全長にわたり存在する。
【００６０】
本明細書で使用する「比較領域」は、2つの配列を最適にアライメントした後に、同じ数の連続位置の参照配列に対して1つの配列を比較することができる、典型的には20〜600、一般的には約50〜約200、より一般的には約100〜約150からなる群より選択される数の連続位置のうちの1つのセグメントに対する言及を含む。比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison, WI)により、または手動アライメントおよび目視検査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)を参照されたい)によって行うことができる。
【００６１】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例には、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)、およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されているBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムが含まれる。本発明の核酸およびタンパク質のパーセント配列同一性を決定するには、BLASTおよびBLAST 2.0を本明細書に記載されるパラメータで使用する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、初期設定としてワード長(W) 11、期待値(E) 10、M＝5、N＝-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムでは、初期設定としてワード長3、および期待値(E) 10、およびBLOSUM62スコア行列(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい)アライメント(B) 50、期待値(E) 10、M＝5、N＝-4、ならびに両鎖の比較を使用する。
【００６２】
2つのポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、第1ポリペプチドが、第2ポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば2つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは典型的には第2ポリペプチドと実質的に同一である。
【００６３】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態において見出される通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。純度および均一性は典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を用いて決定する。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。いくつかの態様における「精製された」という用語は、タンパク質が電気泳動ゲルで本質的に1本のバンドを生じることを表す。好ましくは、これは、タンパク質が少なくとも85％純粋、より好ましくは少なくとも95％純粋、および最も好ましくは少なくとも99％純粋であることを意味する。
【００６４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、天然アミノ酸ポリマー、修飾残基を含むもの、および非天然アミノ酸ポリマーばかりでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００６５】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、例えば、α炭素に水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基が結合している、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【００６６】
アミノ酸は、本明細書中では、IUPAC-IUB生化学命名委員会により推奨されている一般に知られている3文字記号または1文字記号により参照され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に是認されている1文字コードにより参照され得る。
【００６７】
「保存的修飾変種」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関する保存的修飾変種とは、同一または本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指すが、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一のまたは関連する配列、例えば天然の連続した配列を指す。遺伝暗号の縮重により、数多くの機能的に同一である核酸が大部分のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが指定されるすべての位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、コドンを記載の対応するコドンの別のものに変更することができる。このような核酸の変化は「サイレント変化」であり、これは保存的修飾変種の1種である。ポリペプチドをコードする本明細書内のすべての核酸配列は、核酸のサイレント変化も表す。当業者は、特定の状況において、核酸内の各コドン(通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUGおよび通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く)を修飾して、機能的に同一である分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、多くの場合には、発現産物に関して記載された配列では、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変化が暗に意味されるが、実際のプローブ配列に関してはそのようなことはない。
【００６８】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コード配列内の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、付加する、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、その変化によって化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる場合に「保存的修飾変種」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。このような保存的修飾変種は、本発明の多型変種、種間相同体、および対立遺伝子に付加されるものであり、これらを排除するものではない。典型的な相互の保存的置換：1) アラニン(A)、グリシン(G)；2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；4) アルギニン(R)、リジン(K)；5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；7) セリン(S)、スレオニン(T)；および8) システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい)。
【００６９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「1つの(a)」、「1つの(and)」、および「その」は、特に文脈によって明白に指示されていない限り、その対象物の複数形も含む。
【００７０】
I. 序論
本発明は、EphA3に高い親和性で結合し、典型的にはEphA3を活性化する抗体に関する。抗体は、ヒト生殖系列VH配列およびVL配列と高度のアミノ酸配列同一性を有する可変領域を含む。好ましい態様において、本発明の抗体のCDRH3はアミノ酸配列X1GX2YE(X3)FDX4を含み、ここで、X1はSまたはGであり、X2はYまたはVであり、X3はEまたはDであり、かつX4はS、V、またはIであるが、ただしアミノ酸配列はSGYYEDFDSではない。いくつかの態様において、本発明の抗体のCDRL3はアミノ酸配列X1X2YX3X4YPYTを含み、ここで、X1はVまたはAであり、X2はQ、R、またはGであり、X3はA、S、またはLであり、かつX4はNまたはKである。
【００７１】
典型的には、CDR3のBSDを除く部分および完全なFR4は、ヒト生殖系列配列からなる。いくつかの態様において、BSDを除くCDR3-FR4配列は、各鎖においてヒト生殖系列配列と2アミノ酸以下だけ異なる。いくつかの態様において、Jセグメントはヒト生殖系列Jセグメントを含む。ヒト生殖系列配列は、例えば公的に利用可能な国際ImMunoGeneTicsデータベース(IMGT)およびV-base(vbase.mrc-cpe.cam.ac.ukでのワールドワイドウェブにおける)を通して決定することができる。
【００７２】
ヒト生殖系列Vセグメントレパートリーは、51個の重鎖V領域、40個のκ軽鎖Vセグメント、および31個のλ軽鎖Vセグメントからなり、合計3,621個の生殖系列V領域対を作出する。加えて、これらのVセグメントの大部分に関して安定な対立遺伝子変種が存在するが、生殖系列レパートリーの構造多様性に対するこれらの変種の寄与は限られている。すべてのヒト生殖系列Vセグメント遺伝子の配列は公知であり、MRC Centre for Protein Engineering、Cambridge, United Kingdomにより提供されるV-baseデータベースにおいてアクセスすることができる(Chothia et al., 1992, J Mol Biol 227:776-798；Tomlinson et al., 1995, EMBO J 14:4628-4638；およびWilliams et al., 1996, J Mol Biol 264:220-232もまた参照されたい)。
【００７３】
本明細書において記載される抗体または抗体断片は、原核生物もしくは真核生物の微生物系において、または哺乳動物細胞などの高等真核生物の細胞内で発現させることができる。
【００７４】
本発明において使用する抗体は、任意の形式であってよい。例えば、いくつかの態様において、抗体は、例えば無傷のIg、Fab、Fab'、F(ab')2のように定常領域、例えばヒト定常領域を含んでよく、または例えばscFvもしくはFvのように無償の免疫グロブリンの断片であってもよい。
【００７５】
II. 重鎖
本発明の抗EphA3抗体の重鎖は、以下のエレメントを含む重鎖V領域を含む：
1) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3を含むヒト重鎖Vセグメント配列
2) アミノ酸配列X1GX2YEX3FDX4を含むCDRH3領域、ここで、X1はSまたはGであり、X2はYまたはVであり、X3はEまたはDであり、かつX4はS、V、またはIであるが、ただしアミノ酸配列はSGYYEDFDSではない；および
3) ヒト生殖系列J遺伝子セグメントによって付与されるFR4。
【００７６】
いくつかの態様において、CDR3は、
を含む。
【００７７】
Vセグメントは典型的には、ヒト生殖系列Vセグメント、例えばヒトVH1サブクラスと少なくとも80％の同一性、または85％、90％、95％、もしくはそれ以上の同一性を有する。したがって、いくつかの態様において、Vセグメントは、生殖系列セグメントVH1 1-02と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％、もしくはそれ以上の同一性を有するヒトVH1 1-02セグメントである。いくつかの態様において、Vセグメントは、VH1 1-02と15残基以下だけ、および好ましくは10残基以下だけ異なる。
【００７８】
いくつかの態様において、本発明の抗体は、生殖系列セグメントVH 1-02と；または図1に示されるVH領域のVセグメントの1つと少なくとも90％の同一性、または少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の同一性を有するVセグメントを含む。
【００７９】
本発明の抗体のFR4配列は、ヒトJH1、JH3、JH4、JH5、もしくはJH6遺伝子生殖系列セグメント、またはヒト生殖系列JHセグメントと比較して高度のアミノ酸配列同一性、例えば少なくとも90％もしくは95％の同一性を有するか、またはヒト生殖系列JHセグメントと比較して3アミノ酸残基以下において、典型的には2アミノ酸残基以下において異なる配列によって提供される。いくつかの態様において、Jセグメントはヒト生殖系列JH6配列に由来し、FR4は配列WGQGTTVTVSSを有する。
【００８０】
いくつかの態様において、VH領域のVセグメントは、図1に示されるCDR1および/またはCDR2を有する。例えば、本発明の抗体は、配列GYWMN、TYWIS、またはSYWINを有するCDR1を有し得る。本発明の抗体は、配列
を有するCDR2を有し得る。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗EphA3抗体は、配列
を有するVH領域CDR3、ならびにCDR1配列GYWMN、TYWIS、またはSYWIN、およびCDR2
を有し得る。
【００８１】
いくつかの態様において、本発明の抗EphA3抗体は、配列SGYYEDFDSを有するVH領域CDR3、ならびに図1に記載されるVH領域のCDR1および/またはCDR2を有し得る。
【００８２】
いくつかの態様において、本発明の抗体のVH領域Vセグメントは、図1に示されるVセグメント配列を有する。
【００８３】
典型的な態様において、本発明の抗体は、図1に記載されるVH領域配列を有する。
【００８４】
III. 軽鎖
本発明の抗EphA3抗体の軽鎖は、以下のエレメントを含む軽鎖V領域を含む：
1) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3を含むヒト軽鎖Vセグメント配列
2) 配列X1X2YX3X4PYTを含む配列CDR3を有するCDRL3領域、ここで、X1はVまたはAであり；X2はQ、R、またはGであり；X3はA、S、またはLであり；かつX4はNまたはKである；および
3) ヒト生殖系列J遺伝子セグメントによって付与されるFR4。
【００８５】
いくつかの態様において、CDR3は配列X1X2YX3X4YPYTを有し、ここで、X1はVであり、X2はQであり、X3はAであり、かつX4はNである。いくつかの態様において、VL CDR3は、
である。
【００８６】
VL領域は、Vλ VセグメントまたはVκ Vセグメントのいずれかを含む。相補的なVH領域と組み合わさって結合を支持するVκ配列の例を、図1に提供する。
【００８７】
Vκセグメントは任意のサブクラスのものであってよく、例えば多くの場合にはVκIサブクラスのものである。いくつかの態様において、セグメントは、ヒト生殖系列VκIと少なくとも80％の配列同一性、例えばヒト生殖系列VκI L15配列と少なくとも80％の同一性を有する。いくつかの態様において、Vκセグメントは、VκI L15と5残基以下だけ異なり得る。他の態様において、本発明の抗体のVL領域Vセグメントは、図1に示されるVL領域のヒトκVセグメント配列と少なくとも85％の同一性、または少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の同一性を有する。
【００８８】
本発明の抗体のVL領域のFR4配列は、ヒト生殖系列Jセグメント、例えばまたはヒト生殖系列Jセグメントと高度のアミノ酸配列同一性を有する配列によって提供される。いくつかの態様において、Jセグメントはヒト生殖系列Jκ2配列であり、抗体のFR4は配列FGQGKLEIKを有する。
【００８９】
いくつかの態様において、VL領域のVセグメントは、図1に示されるCDR1および/またはCDR2を有する。したがって、本発明の抗体は、
のCDR1配列、および/またはCDR2配列
を有し得る。
【００９０】
特定の態様において、本発明の抗EphA3抗体は、図1に記載されるVL領域のVセグメントの1つに示される組み合わせのVL領域CDR1およびCDR2、ならびに
を含むVL領域CDR3配列を有し得る。いくつかの態様において、そのような抗EphA3抗体は、FGQGKLEIKであるVL領域FR4領域を含み得る。したがって、本発明の抗EphA3抗体のVL領域は、例えば、CDR3
；CDR1配列RASQGIISYLA、QASQDISTYLN、RASQEISGYLG、またはRASQSISSYLA；およびCDR2配列
を含み得る。
【００９１】
いくつかの態様において、本発明の抗体のVL領域Vセグメントは、図1に示されるVセグメント配列を有する。
【００９２】
典型的な態様において、本発明の抗体は、図1に記載されるVL領域配列を有する。
【００９３】
いくつかの態様において、本発明の抗体は、SEQ ID NO: l〜10に記載されるVH領域のいずれか1つと共に、SEQ ID NO: 11〜23に記載されるVL領域のいずれか1つを含む。
【００９４】
IV. EphA3抗体の調製
抗体の親和性は、結合活性および親和性を測定するための周知のアッセイ法を用いて評価することができる。そのような技法には、ELISAアッセイ法、および表面プラズモン共鳴法または干渉法を使用する結合測定が含まれる。例えば、ForteBio(Mountain View, CA) Octetバイオサンサーを用いて、バイオレイヤー干渉法により親和性を測定することができる。
【００９５】
本発明の抗体は、典型的には、EphA3への結合に関してmIIIA4と競合する。本明細書に記載される抗体が、EphA3への結合に関してmIIIA4を阻止するかまたはmIIIA4と競合する能力は、該抗体が、EphA3に結合する際にmIIIA4が結合するエピトープと同じエピトープ、または近接した、例えば重複するエピトープに結合することを示す。他の態様において、本明細書に記載される抗体、例えば図1に提供される表に示されるVH領域とVL領域の組み合わせを含む抗体は、別の抗体がEphA3への結合に関して競合するかどうかを評価するための参照抗体として用いることができる。試験抗体は、抗原に対する参照抗体の結合が、該試験抗体の存在下において少なくとも30％、通常は少なくとも約40％、50％、60％、または75％、および多くの場合には少なくとも約90％減少する場合に、参照抗体の結合を競合的に阻害すると見なされる。ELISA法、および免疫ブロットなどの他のアッセイ法を含む多くのアッセイ法を用いて、結合を評価することができる。
【００９６】
典型的な態様において、抗体は活性化抗体である。抗体がEphA3を活性化する活性を保持することを確認するために、抗体を試験することができる。活性は、リン酸化アッセイ法を含むいくつものエンドポイント、またはアポトーシスのような間接的エンドポイントを用いて測定することができる。
【００９７】
ヒト生殖系列配列に近いV領域配列を有する抗体を単離する方法は、以前に記載されている(米国特許出願公開第20050255552号および第20060134098号)。抗体ライブラリーを、哺乳動物細胞、酵母細胞、または原核細胞を含む適切な宿主細胞で発現させることができる。いくつかの細胞系における発現に関しては、細胞外培地への分泌を指示するために、シグナルペプチドをN末端に導入することができる。抗体は、シグナルペプチドと共に、またはシグナルペプチドを伴わずに大腸菌(E. coli)などの細菌細胞から分泌させることができる。大腸菌から抗体断片をシグナルなしで分泌させる方法は、米国特許出願第20070020685号に記載されている。
【００９８】
EphA3結合抗体を作製するには、例えば図1に示される本発明のVH領域の1つを、例えば図1に示される本発明のVL領域の1つと組み合わせ、適切な発現系においていくつかの形式のいずれかで発現させる。したがって、抗体は、原核または真核宿主細胞において、宿主細胞内かまたは分泌によるかのいずれかで、scFv、Fab、Fab'(免疫グロブリンヒンジ配列を含む)、F(ab')2(2つのFab'分子のヒンジ配列間のジスルフィド結合形成によって形成される)、全免疫グロブリン、もしくは切断型免疫グロブリンとして、または融合タンパク質として発現させることができる。例えばシグナルなしの発現系で産生されるポリペプチドのN末端には、メチオニン残基が任意に存在してよい。本明細書に記載されるVH領域はそれぞれ、VL領域の各々と対を形成して、抗EphA3抗体を生じ得る。
【００９９】
抗体は、原核生物発現系および真核生物発現系の両方を含むいくつもの発現系を用いて産生させることができる。いくつかの態様において、発現系は、CHO細胞発現系などの哺乳動物細胞発現である。多くのそのような系は、商業的供給者から広く入手可能である。抗体がVH領域およびVL領域の両方を含む態様において、VH領域およびVL領域は、単一のベクターを用いて、例えばジシストロニック発現単位で、または異なるプロモーターの制御下で発現させてもよい。他の態様において、VH領域およびVL領域は、個別のベクターを用いて発現させてもよい。本明細書において記載されるVH領域またはVL領域は、任意にN末端にメチオニンを含んでよい。
【０１００】
本発明の抗体は、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、またはdABを含むいくつもの形式で産生させることができる。本発明の抗体はまた、ヒト定常領域を含み得る。軽鎖の定常領域は、ヒトのκ定常領域またはλ定常領域であってよい。重鎖定常領域は、多くの場合にはγ鎖定常領域、例えばγ-1、γ-2、γ-3、またはγ-4定常領域である。他の態様において、抗体はIgAまたはIgMであってよい。
【０１０１】
本発明のいくつかの態様では、抗体VL領域、例えば図1に記載されるVL領域をヒトκ定常領域(例えば、SEQ ID NO:25)と組み合わせて、完全な軽鎖を形成させる。
【０１０２】
本発明のいくつかの態様では、VH領域をヒトγ-1定常領域と組み合わせる。任意の適切なγ-1アロタイプを選択することができる。したがって、いくつかの態様において、抗体は、図1に記載されるVH領域配列より選択されるVHを有する、定常領域、例えばSEQ ID NO:24を有するIgGである。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載されるVL領域配列より選択されるVLを有する。特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO:25に記載されるκ定常領域、およびSEQ ID NO:24に記載される重鎖定常領域を有し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、図1に記載される配列からの以下の組み合わせの1つを含む。
【０１０３】
例えば抗体が断片であるいくつかの態様では、インビボにおける半減期の延長を提供するために、抗体を別の分子、例えばポリエチレングリコール(ペグ化)または血清アルブミンに結合することができる。抗体断片のペグ化の例は、Knight et al. Platelets 15:409, 2004(アブシキシマブに関する)；Pedley et al., Br. J. Cancer 70:1126, 1994(抗CEA抗体に関する)；Chapman et al., Nature Biotech. 17:780, 1999；およびHumphreys, et al., Protein Eng. Des. 20: 227,2007において提供される)。
【０１０４】
いくつかの態様において、本発明の抗体はFab'または(Fab')2の形態である。
【０１０５】
全長軽鎖は、VL領域をヒトκ定常領域またはヒトλ定常領域に融合させることによって作製される。いずれの定常領域を任意の軽鎖に対して用いてもよいが、典型的な態様では、κ定常領域はVκ可変領域と組み合わせて用いられ、λ定常領域はVλ可変領域と共に用いられる。
【０１０６】
Fab'の重鎖は、本発明のVH領域の、ヒト重鎖定常領域配列、第1定常(CH1)ドメインおよびヒンジ領域への融合によって作製されたFd'断片である。重鎖定常領域配列は、免疫グロブリンクラスのいずれにも由来し得るが、多くの場合にはIgGに由来し、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4に由来してよい。本発明のFab'抗体はハイブリッド配列であってもよく、例えばヒンジ配列はある免疫グロブリンサブクラスに由来してよく、CH1ドメインは異なるサブクラスに由来してもよい。
【０１０７】
本発明において使用する抗体は多くの形式であってよい。いくつかの態様において、抗体は、Fc領域、例えばヒトFc領域を含み得る。例えば、このような抗体には、EphA3と結合し、かつ活性アイソタイプを有するIgG抗体が含まれる。いくつかの態様において、抗体は、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、または単一ドメイン抗体(「dAb」)などの、抗体の活性断片(例えば、これはEphA3を二量体化し得る)または誘導体であってよい。例えば、いくつかの態様において、抗体はF(ab')2であってよい。本発明において使用することができる抗体の他の例示的な態様には、活性化ナノボディまたは活性化ラクダ科動物抗体が含まれる。このような抗体はさらに、当業者に周知の方法によって組換えにより改変することができる。上記のように、このような抗体は公知の技法を用いて生成することができる。当業者によって理解されるように、抗体が一価であり得る形式、例えばFvまたはFab形式であるいくつかの態様では、該抗体を三価または四価抗体などの多価抗体として使用してもよい。多価抗体を作製する方法は公知である(例えば、King et al., Cancer Res. 54:6176-6185, 1994を参照されたい)。
【０１０８】
多くの態様において、本発明において使用するための抗体は、例えば免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に結合するといったエフェクター機能を有するFc定常領域を有する。例示的な「エフェクター機能」には、C1q結合；補体依存性細胞傷害；Fc受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)；食作用；細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)の下方制御等が含まれる。このようなエフェクター機能は一般に、Fc領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、公知のアッセイ法を用いて評価することができる(例えば、以下に引用する参考文献を参照されたい)。
【０１０９】
活性アイソタイプを有し、マクロファージ、単球、好中球、およびNK細胞などのエフェクター細胞上のFc受容体に結合する抗EphA3抗体は、ADCCによる細胞死を誘導し得る。
【０１１０】
Fc領域は、天然IgG1、またはIgG3、IgM、IgA、およびIgEを含むその他の活性アイソタイプに由来し得る。「活性アイソタイプ」には、Fc領域が、Fc受容体に対する結合を増大させるため、またはさもなくば抗体の効力を向上させるための修飾を含む抗体が含まれる。このようなFc定常領域は、Fc受容体に対する結合を増大させる変異、そのように増大させるグリコシル化レベルに対する変化等のような修飾を含み得る。Fc領域を修飾する多くの方法が当技術分野で公知である。例えば、米国特許出願公開第20060039904号は、1つまたは複数のFcリガンド(例えば、FcγR、C1q)に対する結合親和性の修飾を含む、エフェクター機能が強化されたFc受容体の変種を記載している。さらに、このようなFc変種は、変化した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害(CDC)活性を有する。その他のFc変種には、Ghetie et al., Nat Biotech. 15:637-40, 1997；Duncan et al, Nature 332:563-564, 1988；Lund et al., J. Immunol 147:2657-2662, 1991；Lund et al, Mol Immunol 29:53-59, 1992；Alegre et al, Transplantation 57:1537-1543, 1994；Hutchins et al., Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984, 1995；Jefferis et al, Immunol Lett. 44:111-117, 1995；Lund et al., FASEB J 9:115-119, 1995；Jefferis et al, Immunol Lett 54:101-104, 1996；Lund et al, J Immunol 157:4963-4969, 1996；Armour et al., Eur J Immunol 29:2613-2624, 1999；Idusogie et al, J Immunol 164:4178-4184, 200；Reddy et al, J Immunol 164:1925-1933, 2000；Xu et al., Cell Immunol 200:16-26, 2000；Idusogie et al, J Immunol 166:2571-2575, 2001；Shields et al., J Biol Chem 276:6591-6604, 2001；Jefferis et al, Immunol Lett 82:57-65. 2002；Presta et al., Biochem Soc Trans 30:487-490, 2002；Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005-4010, 2006；米国特許第5,624,821号；第5,885,573号；第5,677,425号；第6,165,745号；第6,277,375号；第5,869,046号；第6,121,022号；第5,624,821号；第5,648,260号；第6,194,551号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,277,375号；第7,335,742号；および第7,317,091号；ならびにPCT公開WO 94/2935；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 02/060919、およびWO 04/029207によって開示されているものが含まれる。
【０１１１】
グリコシル化は、炭水化物(糖質)が酵素的に高分子に結合してグリカンを生じる、翻訳後修飾の1つの形態である。本発明との関連において、炭水化物は典型的には、1つまたは複数のN結合(アスパラギンまたはアルギニン側鎖の窒素を介する)により、抗体Fc領域に付着する；しかしながら、O結合(セリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシリジン、またはヒロドキシプロリン側鎖のヒドロキシ酸素を介する)もまた可能である。一般的に、IgG抗体は、CH2ドメイン内の残基Asn297において保存されたN結合型グリコシル化部位を有し、例えばある種のIgDおよびIgAといったいくつかのクラスおよびサブクラスはまた、多くの場合にヒンジ領域内にO結合型糖質を有する。糖質は典型的には、複合高マンノース型分岐糖である；N結合の場合、アミノ酸側鎖窒素に直接付着する糖質は、典型的にはN-アセチルグルコサミンである。
【０１１２】
いくつかの態様では、Fc領域のグリコシル化を修飾することができる。例えば、修飾は、例えば抗体配列内の1つまたは複数のグリコシル化部位を変更することによる無グリコシル化であってよい。このようなアプローチは、米国特許第5,714,350号および第6,350,861号においてさらに詳述されている。また、フコシル残基の量が減少した低フコシル化Fc変種、またはフコシル残基を欠いている無フコシル化Fc変種、または二分岐GlcNAc構造が増加したFc変種など、グリコシル化の型が変化したFc領域を作製することもできる。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成することができる。ラット骨髄腫細胞ならびに酵母および植物を含む、グリコシル化機構が変化した細胞は当技術分野において記載されており、これを宿主細胞として使用し、そこで本発明の組換え抗体を発現させて、グリコシル化が変化した抗体を産生させることができる。10倍のADCCをもたらす二分岐GlcNacについて記載している、Umana et al, Nat. Biotechnol 17:176-180, 1999。Umanaは、そのような二分岐分子がフコシル化の低下をもたらすことを指摘している。Davies, et al., Biotechnol. Bioeng. 74:288-294, 2001は、抗CD20抗体のADCCの増加をもたらす、酵素β1-4-NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII)(二分岐GlcNac構造を引き起こす)が挿入されたCHO細胞について記載している。米国特許(Umana)第6,602,684号は、二分岐GlcNac糖タンパク質を産生するように改変された細胞について記載している。
【０１１３】
抗体調製物のフコシル化を減少させる方法の例は、Shields et al, J Biol Chem 277:26733-26740, 2002において提供され、これはIgG1を産生させるためのフコシル化が欠損したCHO細胞(Lec13)について記載しており、さらにヒトFcγRIIIAに対するフコース欠損IgG1の結合が50倍まで向上し、ADCCが増加したことを記載している。加えて、Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003は、YB2/0細胞とCHO細胞で産生されたIgGを比較している。YB2/0細胞ではフコシル化が減少し、二分岐GlcNac含量が増加した。Niwa et al., Clinc. Cancer Res. 1-:6248-6255, 2004は、抗CD20抗体をYB2/0細胞で作製された抗体(低フコシル化)と比較し、後者におけるADCCの増強を観察した。無フコシル化抗体を生成する技法の例は、例えば、Kanda et al, Glycobiology 17:104-118, 2006に記載されている。米国特許第6,946,292号(Kanda)は、無フコシル化抗体を産生させるためのフコシルトランスフェラーゼノックアウト細胞について記載している。米国特許第7,214,775号およびWO 00/61739は、抗体の100％が無フコシル化されている抗体調製物について記載している。
【０１１４】
グリコシル化を修飾するための他の技法もまた公知である。例えば、米国特許出願公開第20070248600号；第20070178551号(改変された下等真核細胞(酵母)を使用して「ヒト」グリコシル化構造をもたらすGlycoFi技術方法)；第20080060092号(改変された植物を使用して「ヒト」グリコシル化構造をもたらすBiolex技術方法)；第20060253928号(同様に、「ヒト」抗体を産生させるための植物の改変について記載している)を参照されたい。
【０１１５】
フコースを減少させるためのさらなる技法には、ProBioGen技術(von Horsten et al., Glycobiology, (advance access publication July 23, 2010)；Potelligent(商標)技術(Biowa, Inc. Princeton, N.J.)；およびGlycoMAb(商標)グリコシル化改変技術(GLYCART biotechnology AG、Zurich, Switzerland)が含まれる。
【０１１６】
抗体のN結合型オリゴ糖含量は、当技術分野で公知の方法により解析することができる。以下はそのような方法の一例である：抗体を、酵素N-グリコシダーゼF(Roche；TaKaRa)による消化に供する。放出された炭水化物を、陽イオンモードでマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)によって解析する(Papac et al., Glycobiol. 8: 445-454, 1998)。次に、単糖組成を、改良高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)により特徴づける(Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473, 2003)。
【０１１７】
本発明のいくつかの態様では、例えば抗体が反復投与に適するように、抗体をさらに改変して免疫原性を低減させる。免疫原性が低減された抗体を作製する方法には、ヒト化およびhumaneer化手順、ならびに例えば1つまたは複数のフレームワーク領域において抗体をさら改変して、T細胞エピトープを除去する脱免疫化などの修飾技法が含まれる。
【０１１８】
いくつかの態様では、抗体を、EphA3発現細胞、例えば血管原性骨髄前駆細胞の表面上に存在するEphA3を活性化し得るか、またはADCCによりそのような細胞を死滅させ得る形態で使用する。したがって、いくつかの態様において、抗体は二量体である。他の態様において、抗体は、活性アイソタイプを有する単量体型であってよい。いくつかの態様において、抗体は、EphA3を架橋し得る多価型、例えば三価または四価型である。
【０１１９】
V. EphA3が標的である疾患を治療するための抗EphA3抗体の投与
本発明はまた、EphA3発現細胞を死滅させることが望ましい疾患を有する患者を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、そのような疾患は新生物疾患であってよい。したがって、1つの局面において、本発明は、本発明の抗体を用いて新生物疾患を治療する方法であって、腫瘍の成長を阻害するために、本発明の抗EphA3抗体を患者(腫瘍を有する)に投与する段階を含む方法を提供する。治療することができる腫瘍には、乳房、肺、結腸、胃、肝臓、腎臓、卵巣、食道、および前立腺、ならびにその他の腫瘍が含まれる。したがって、本発明の抗体を用いて治療される固形腫瘍は、乳癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巣癌、外陰部癌、腎癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、絨毛癌、頭頸部癌、上咽頭癌、咽頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、膵癌、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経鞘腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、線維肉腫を含む肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、およびウィルムス腫瘍であってよい。母斑症に付随する異常な血管増殖、および浮腫(脳腫瘍に付随するものなど)もまた、本発明の抗体を用いて治療することができる。
【０１２０】
いくつかの態様では、抗EphA3抗体を、腫瘍細胞の表面上にEphA3を発現する患者に投与する。いくつかの態様では、抗EphA3抗体を、腫瘍内の血管の内皮上にEphA3を発現する患者に投与する。いくつかの態様において、患者は、腫瘍細胞表面および内皮の両方においてEphA3を発現し得る。いくつかの態様において、抗体は、例えばWO/2008/112192に記載される形式である。
【０１２１】
いくつかの態様では、本発明の抗体を用いて非新生物状態を治療する。非新生物状態は、望ましくないまたは異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム性動脈硬化プラーク、心筋梗塞からの浮腫、糖尿病性および他の増殖性網膜症、後水晶体線維増殖症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶反応、網膜/脈絡膜血管新生、隅角の血管新生(ルベオーシス)、眼性血管新生疾患、血管再狭窄、動静脈奇形(AVM)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺過形成(グレーブス病を含む)、角膜および他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性肺滲出、脳浮腫(例えば、急性脳卒中/閉鎖性頭部損傷/外傷に付随)、滑液炎、RAにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、変形性関節症(OA)、難治性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、第3腔の体液疾患(膵炎、区画症候群、熱傷、腸疾患)、子宮筋腫、早産、IBD(クローン病および潰瘍性大腸炎)などの慢性炎症、腎同種移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくないまたは異常な組織塊成長(非癌)、肥満症、脂肪組織量増殖、血友病関節、肥厚性瘢痕、発毛の阻害、オスラー・ウェーバー症候群、化膿肉芽腫 後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心膜液貯留、ならびに胸水からなる群より選択される。
【０１２２】
いくつかの態様では、本発明の抗体を、骨髄増殖性疾患に罹患している患者に投与する。いくつかの態様において、骨髄増殖性疾患は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、真性赤血球増加症(PV)、本態性血小板血症(ET)、または特発性骨髄線維症(IM)である。いくつかの態様では、患者由来の白血病幹細胞がEphA3を発現する慢性骨髄性白血病を有する患者を治療するために、本発明の抗EphA3抗体を1つまたは複数の付加的な治療薬と併用することができる。そのような治療薬には、様々な化学療法薬およびメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))が含まれる。
【０１２３】
抗体は、単独で、または関心対象の疾患を治療するための他の治療法と併用して投与することができる。いくつかの態様では、抗EphA3抗体をBv8アンタゴニスト、例えばBv8抗体アンタゴニストと併用して投与する。Bv8アンタゴニストは公知である(例えば、WO 2009039337、およびその中で引用されているBv8アンタゴニストに関する参考文献を参照されたい)。例えば、Bv8アンタゴニストには、天然配列Bv8ポリペプチドまたは天然配列Bv8受容体(PKR-I/EG-VEGFR1またはPKR-2/EG-VEGFR2)ポリペプチドに特異的に結合する抗体および抗体断片が含まれる。いくつかの態様では、患者をまた、例えば抗VEGF抗体アンタゴニストのようなVEGFアンタゴニストを含む付加的な治療薬、および他の治療薬で治療してもよく、それらの例をさらに以下に記載する。
【０１２４】
いくつかの態様では、抗EphA3抗体を、例えば抗VEGF抗体アンタゴニストのようなVEGFアンタゴニストによる治療を以前に受けたことがある患者に投与する。いくつかの態様において、腫瘍はVEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性であってよい。いくつかの態様では、抗EphA3抗体を、早期腫瘍、例えば病期I、病期II、または病期III腫瘍を有する患者に投与する。
【０１２５】
本明細書で使用する、例えばVEGF抗体アンタゴニストのようなVEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性であると見なされるか、またはVEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性である腫瘍を有する患者とは、治療法には反応するが副作用に苦しむ、耐性を生じる、治療法に反応しない、治療法に満足のいくように反応しない等の患者を指す。したがって、そのような患者またはそのような患者の腫瘍では、腫瘍細胞の数は有意に減少していないかもしくは増加しており、または腫瘍サイズは有意に減少していないかもしくは増加しており、または癌細胞のサイズもしくは数がさらに減少することはない。患者が治療に対して抵抗性であることの判定は、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当技術分野で公知の任意の方法により、インビボまたはインビトロのいずれかで行うことができる。同様に、本発明との関連における、例えばVEGF抗体のようなVEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性である非新生物状態を有する患者とは、VEGFアンタゴニストによる治療に満足のいくように反応しない患者、例えば副作用に苦しむ、耐性を生じる、またはその状態の治療指標の軽減を示さない患者を指す。
【０１２６】
本発明の方法は、疾患の治療に適した投与計画を用いて、抗EphA3抗体を薬学的組成物として治療有効量で患者に投与する段階を含む。様々な薬物送達系において使用するために、組成物を製剤化することができる。適切な製剤化のために、生理的に許容される1つまたは複数の賦形剤または担体を組成物中に含めることもできる。本発明において使用するのに適した製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins, 2005に見出される。
【０１２７】
抗EphA3抗体は、注射用滅菌等張水溶液などの、患者への注射に適した溶液として提供する。抗体を、許容される担体に適切な濃度で溶解または懸濁する。いくつかの態様において、担体は水性であり、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等である。組成物は、pH調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤等のような、おおよその生理的状態に必要とされる補助的な薬学的物質を含み得る。
【０１２８】
本発明の薬学的組成物は、疾患または疾患およびその合併症の症状を治癒するかまたは少なくとも部分的に止めるのに十分な量で、患者、例えば腫瘍または非新生物状態を有する患者に投与する。これを達成するのに適した量を「治療有効量」と定義する。治療有効量は、治療法に対する患者の反応をモニターすることにより決定する。治療有効量を示す典型的な基準には、患者における疾患の症状の改善が含まれる。この使用のために有効な量は、年齢、体重、性別、投与経路等の他の要因を含め、疾患の重症度および患者の健康の全般的状態に依存する。患者により必要とされかつ許容される投与量および頻度に応じて、抗体の単回投与または複数回投与を施行することができる。いずれにせよ、本方法は、患者を効果的に治療するために十分量の抗EphA3抗体を提供する。
【０１２９】
抗体は、これらに限定されないが、静脈内、皮下、筋肉内、または腹腔内経路を含む任意の適切な経路を介した注射または注入によって投与することができる。いくつかの態様において、抗体は吹送によって投与してもよい。例示的な態様において、抗体は、4℃の注射用滅菌等張生理食塩水溶液中に10 mg/mlで保存することができ、患者に投与する前に、注射用0.9％塩化ナトリウム100 mlまたは200 mlのいずれかで希釈する。抗体は、0.2〜10 mg/kgの用量で1時間かけて静脈内注入により投与する。他の態様において、抗体は15分〜2時間かけて静脈内注入により投与する。さらなる他の態様では、投与手順は皮下ボーラス注射による。
【０１３０】
抗体の用量は、患者に効果的な治療を提供するように選択され、0.1 mg未満/kg体重〜約25 mg/kg体重の範囲、または1 mg〜2 g/患者の範囲である。好ましくは、用量は、1〜10 mg/kgまたはおよそ50 mg〜1000 mg/患者の範囲である。用量は、抗体の薬物動態(例えば、循環中の抗体の半減期)および薬力学的反応(例えば、抗体の治療効果の持続)に応じて、1日に1回〜3ヵ月ごとに1回の範囲であり得る適切な頻度で繰り返すことができる。いくつかの態様では、約7日〜約25日のインビボ半減期および抗体の投薬を1週間に1回〜3ヵ月ごとに1回繰り返す。他の態様では、抗体を1ヵ月におよそ1回投与する。
【０１３１】
本発明のVH領域および/またはVL領域はまた、診断の目的で用いることもできる。例えば、VH領域および/またはVL領域を、患者由来の細胞におけるEphA3レベルの検出など、臨床解析のために用いることができる。本発明のVH領域またはVL領域はまた、例えば抗Id抗体を産生させるために用いることもできる。
【実施例】
【０１３２】
方法論
マウスV領域のサブクローニング
マウスモノクローナルmIIIA4由来のV領域DNAは、Dr. Martin Lackmann(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University、Victoria, Australia)により提供された。PCRを用いて、V重鎖領域およびVκ領域のV遺伝子を増幅し、所望のベクターにクローニングするのに適した制限酵素部位を組み込んだ。V領域はFab断片としてクローニングし、大腸菌内で発現させた。このFabをEphA3-Fc抗原結合について試験したが、このFabをこれらの実施例において参照配列FA4と称する。
【０１３３】
抗体精製
Fab断片を大腸菌から分泌により発現させた。細胞を2×YT培地中でOD600が0.6になるまで培養した。IPTGを用いて、発現を33℃で3時間誘導した。構築されたFabをペリプラズム画分から取得し、標準的な方法に従って、連鎖球菌プロテインGを使用するアフィニティークロマトグラフィー(HiTrapプロテインG HPカラム；GE Healthcare)により精製した。FabをpH 2.0緩衝液で溶出し、ただちにこれをpH 7.0に調整して、PBS pH 7.4(PBSはカルシウムおよびマグネシウムを含まない)に対して透析した。
【０１３４】
ELISA
典型的には、抗原50 ngを、4℃で一晩インキュベートすることにより96ウェルマイクロタイタープレートに結合させた。プレートを、5％ミルクのPBS溶液で33℃で1時間ブロッキングした。それぞれHumaneered Fabまたは最適化参照Fab FA106を発現する大腸菌からの誘導培地(50μl)を、各ウェルに添加した。33℃で１時間インキュベートした後、プレートをPBS＋0.1％ Tween 20(PBST)で3回リンスし、抗ヒトκ鎖HRPコンジュゲート(Sigma；PBSTで0.1 ng/mlに希釈) 50μlを各ウェルに添加し、プレートを33℃で40分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回およびPBSで1回洗浄した。基質3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(TMB)(Sigma) 100μlを各ウェルに添加し、プレートを室温で〜5分間インキュベートした。反応を停止させるため、0.2 N H2SO4 100μlを各ウェルに添加した。反応物を分光光度法により450 nmで読み取った。
【０１３５】
Ephファミリーメンバーに対する結合を検出するため、組換えヒトEph細胞外(ec)ドメインをR&D Systems Incから入手した：EphA1-Fc融合タンパク質、EphA2 ecドメイン、EphA5 ecドメイン、EphB4 ecドメイン、およびEphB6-Fc融合タンパク質。ELISAウェルを、Ephタンパク質100 ngで37℃で1時間コーティングした。PBSTで1度洗浄した後、ウェルをPBST中の5％ミルクで37℃で1時間ブロッキングした。ウェルを1度洗浄し、2倍希釈系列の候補humaneered抗体を、コーティングされたEphタンパク質の各セットに添加した。1時間後、ウェルをPBSTで3回洗浄し、抗ヒトκ鎖HRPコンジュゲート(Sigma；PBSTで0.1 ng/mlに希釈) 50μlを各ウェルに添加した。プレートを45分間インキュベートし、PBSTで3回洗浄し、PBSで1回洗浄し、TMB 100μlを各ウェルに添加した。0.2 N H2SO4を添加することにより反応を停止させ、450 nmにおける吸光度により結合を測定した。
【０１３６】
コロニーリフト結合アッセイ(CLBA)
Fab断片のHumaneeredライブラリーのスクリーニングは、抗原コーティングしたニトロセルロースフィルターを用いて、記載されている通りに実施した(米国特許出願公開第20050255552号および第20060134098号)。
【０１３７】
親和性測定
Fab断片の結合動態は、Biosensor Tools Incにおいて表面プラズモン共鳴解析(spr；Biacore T100)を用いて解析した。親和性は、3つの異なるFab濃度で測定された会合定数および解離定数から算出した。
【０１３８】
IgGの構築
ヒトIgG1定常領域および元のマウスIIIA4抗体に由来する可変領域を含むように、キメラIIIA4 IgGを構築した。PCRを用いて、Martin Lackmannによって提供されたマウスIIIA4 DNAから重鎖および軽鎖を増幅し、またクローニング用の制限部位も組み込んだ。重鎖可変領域を、UCOE配列の下流に位置するCMVプロモーターから発現される完全なIgG1重鎖を発現するベクターにクローニングした。このプラスミドは、哺乳動物細胞における選択用のNeo遺伝子、および大腸菌におけるプラスミド産生用のAmp遺伝子を含む。同様に、軽鎖可変領域を、UCOE配列の下流のCMVプロモーターから発現されるヒトκ軽鎖定常領域を発現するベクターにクローニングした。このプラスミドは、哺乳動物細胞におけるハイグロマイシン選択用の遺伝子、および大腸菌における産生用のAmp遺伝子を含む。改変抗体IgG重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターは、可変領域のDNAが上記の大腸菌発現ベクターから得られ、重鎖発現ベクターがネオマイシンの代わりにピューロマイシン耐性遺伝子を含むことを除いて、同様に構築した。Humaneered抗体IgGおよびキメラIIIA4 IgGは、Fugene 6試薬(Promega)を用いて重鎖構築物と軽鎖構築物を同時トランスフェクトすることにより、改良CHO細胞株において発現させた。
【０１３９】
フローサイトメトリー
典型的には、SKmel28、LnCAP、およびB16-F10の細胞3×106個を、3000 rpmで3分間の遠心分離により回収した。培地を除去し、細胞をPBS中の2％ BSAで4℃で30分間ブロッキングした後、10μg/mlラットIgGで4℃で30分間にわたり2回目のブロッキングを行った。細胞をペレット化し、PBS 1.5 mlに再懸濁し、500μlの一定分量に分割した。各分割量を個別に、5μg/mlの対照IgG、humaneered IgG、またはキメラIIIA4 IgGで4℃で45分間プロービングした。試料をPBSで1度洗浄し、抗ヒトIgG-フィコエリトリンコンジュゲートを添加した。45分後、細胞を1度洗浄し、PBSで再懸濁し、FACS Caliberフローサイトメトリーを用いてフローサイトメトリーにより解析した。解析の直前にヨウ化プロピジウムを添加して、死細胞を排除した。
【０１４０】
実施例1. 改変ヒト抗EphA3抗体の同定
マウスおよび参照のV領域アミノ酸配列
マウス(mIIIA4)および参照(FA4)のV領域配列を以下に示す。CDR配列を下線で示す。
mIIIA4およびFA4のVh：
mIIIA4およびFA4のVk：
【０１４１】
Fab FA4は、ヒト定常領域に融合された、mIIIA4由来の無傷のマウスV領域を有し、大腸菌から精製された。抗原に結合するFab断片の希釈ELISAは、抗体濃度に依存する結合曲線を生じた。
【０１４２】
参照Fab(FA4)に加えて、最適化参照Fab(FA106)を構築した。最適化参照Fab FA106では、FA4内のいくつかのフレームワークアミノ酸残基をヒト生殖系列に変更した。最適化参照FabのV領域配列を以下に提供する。ヒト生殖系列に変更した残基を太字フォントで示す。CDR配列を下線で示す。
FA106 Vh：
FA106 Vk：
【０１４３】
ライブラリー構築およびV領域カセット
エピトープに焦点を当てたライブラリーを、BSDおよびヒト生殖細胞系列Jセグメント配列を含む固有のCDR3-FR4領域に連結されたヒトVセグメントライブラリー配列から構築した。「全長」Vh(Vh1およびVh5)ライブラリーおよび「全長」Vk(VkI)ライブラリーを、マウスVセグメントの一部のみが最初にヒト配列のライブラリーで置換された「カセット」ライブラリーを構築するための基礎として使用した。Vh鎖およびVk鎖の両方について、いくつかの種類のカセット「ライブラリー」を構築した。V重鎖およびVκ鎖のためのカセットを、フレームワーク2領域内の重複共通配列を用いてブリッジPCRにより作製した。このようにして、「前端部」ヒトカセットライブラリーをヒトVh1およびVh5サブクラスの両方について構築し、「中央部」ヒトカセットライブラリーをヒトVh1について構築した。「前端部」および「中央部」カセットライブラリーをVkIサブクラスについて構築した。
【０１４４】
加えて、Vh CDR2-FR3からなるカセットライブラリーを構築した。模式図を図2に示す。参照CDR2の最初の4残基(枠で囲んである)は、5' PCRプライマーによってコードされた。また、mIIIA4 CDR2およびヒト生殖系列Vh1-58 CDR2における下線のアミノ酸残基は、フォワードプライマー中の対の組み合わせにおいて変化をもたせた(線の上下のアミノ酸残基によって示す)。3' PCRプライマーは、ヒト生殖系列Vh1 FR3に相補的である。これらのプライマーを用いて増幅を行い、改変されたCDR2ライブラリーに対してHu Vh1 FR3ライブラリー(脾臓mRNAに由来)を付加した。連続したブリッジPCR反応を用いて、「前端部」カセットとCDR3-FR4カセットを付着させて、機能的なV領域を構築した。
【０１４５】
抗原への結合を支持するヒトVhカセットまたはVkカセットを、コロニーリフト結合アッセイにより同定し、ELISAによる親和性に従って順位を決定した。V重鎖のスクリーニングにより、EphA3-Fc組換え融合タンパク質抗原結合を支持する「前端部」、「中央部」、およびCDR2/FR3カセットが同定された。Vκのスクリーニングにより、抗原結合を支持する「前端部」および「中央部」カセットが同定された。各鎖の機能的カセットを組み換えて、抗原と結合する完全に改変された高親和性Fabを構築した。
【０１４６】
高親和性の改変Fabのプールを同定した後、CDR3親和性成熟ライブラリーを構築した。一連の改変Fabクローンの共通CDR3 BSD配列を、縮重PCRプライマーを用いて変異させて、ライブラリーを作製した。これらの変異誘発ライブラリーを、コロニーリフト結合アッセイ法およびELISAアッセイ法を用いてスクリーニングした。選択されたFabを、ELISAによる親和性について順位付けした。FA106 Fabと比較した場合に同様のまたは改善された抗原親和性を支持する変異を同定した。抗原結合を支持するまたは改善する重鎖および軽鎖CDR3変異は、各CDRのBSD領域を規定するのに役立つ。
【０１４７】
参照FabとHumaneered Fabの配列アライメント
マウス参照Fabと2つの改変Fabのアミノ酸配列のアライメントしたVセグメントを、最も近い単一のヒト生殖系列V遺伝子、Vh1-02またはVkI L15と比較した。humaneered Fab Vh領域のFR4はヒト生殖系列JH6に由来し、配列WGQGTTVTVSSを有する。humaneered Fab Vk領域のFR4はヒト生殖系列Jk2に由来し、配列FGQGKLEIKを有する。
【０１４８】
改変FabのVh領域およびVk領域はそれぞれ、ヒト生殖系列アミノ酸配列と高い相同性を有する。例示的な相同性を表1に示す。
【０１４９】
（表１）2つの改変V領域のヒト生殖系列配列との同一性の割合：割合はいずれも、V領域にわたる単一のヒト生殖系列配列との同一性を示し、CDR3 BSD配列は除外する
【０１５０】
実施例2. 改変抗体の結合動態
改変Fabをコロニーリフト結合アッセイから単離し、抗原結合ELISAによって親和性を確認した。抗原結合ELISAにおいて強力な陽性シグナルを有する改変Fabクローンを精製し、最適化参照Fab FA106との動態比較によりさらに特徴づけした。
【０１５１】
2つの改変Fabおよび参照Fab FA106の結合動態を、Biacoreを用いて解析した。3つのFabを出発濃度500 nMから100 nMまで希釈し、0.005％ Tween-20および0.1 mg/ml BSAを含むPBS、pH 7.4を用いて3倍希釈系列でさらに試験した。5つの濃度をそれぞれ、3つの異なる密度表面で3回試験した。アッセイは25℃で行った。各表面からの反応データを、1：1相互作用モデルに適合させた。算出された会合定数および解離定数を表2に示す。改変Fabクローン1および2ならびに参照クローンFA106の動態解析はいずれも、抗原に対する低ナノモルの親和性を示した。
【０１５２】
（表２）25℃で測定したHumaneered Fab結合定数
括弧内の数字は、3つの異なる密度表面からのデータに基づいて最終報告された数字における標準誤差を示す。左欄の「低度」、「中度」、および「高度」という用語は、チップ密度を指す。
【０１５３】
Humaneered Fab1を哺乳動物細胞においてIgGとして発現させ、培養上清から精製した。一価結合親和性を解析するために、パパイン消化によりFab断片を作製した。ヒトおよびマウスEphA3-Fcに対するFabの結合を、ストレプトアビジンチップ上に捕捉されたビオチン化EphA3変種を用いてBiacore 3000で測定した。FabをHBSPランニング緩衝液で、50 nMから0.62 nMまで3倍希釈で希釈した。結果は、空の参照セルおよび複数回のHBSP緩衝液注入で二重にブランク処理した。1：1相互作用を仮定して、Biacoreデータの全体的適合解析を行った。結合動態パラメータを表3に示す。データから、哺乳動物細胞から産生されたHumaneered Fab1が、ヒトEphA3およびマウスEphA3の両方に高い親和性で結合することが示される。
【０１５４】
（表３）匹敵する親和性でヒトEphA3およびマウスEphA3と結合する改変Fab1
固定化されたマウスおよびヒトEphA3-Fc融合タンパク質に対するFab1の結合を、Biacore 3000装置を用いる表面プラズモン共鳴解析および全体的適合解析により解析した。ka＝会合定数；kd＝解離定数；KD＝総親和性。
【０１５５】
結合および特異性
全長抗体(IgG1κ)を構築し、CHO細胞から発現させ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ELISAプレートをEphA3-Fcでコーティングし、cIIIA4 IgG、例示的な改変IgG、および対照IgG1の結合を比較した(図3)。このアッセイにおけるEC50は、元のキメラ抗体よりも改変IgGでおよそ3倍低かった。
【０１５６】
EphA3は、エフリンリガンドと結合するEph受容体ファミリーのメンバーである。このファミリーの最も相同的なメンバーはEphA受容体であり、その細胞外ドメインはEphA3との配列同一性が39％〜62％の間で異なる。
【０１５７】
例示的な改変IgGの特異性を確認するため、3つのEphAタンパク質および2つのより遠縁のEphBタンパク質に対して結合を評価した(図4を参照されたい)。EphA5はEphA3との相同性が61％であり、EphA3と最も相同的なファミリーメンバーの1つである。改変抗体はEphA3と特異的に結合した；EphA1、EphA2、またはEphA5に対して、結合は認められなかった。試験した2つのEphB受容体(EphB4およびEphB6)のいずれに対しても、検出可能な結合は認められなかった。
【０１５８】
例示的な改変抗体を、生細胞の表面上に発現したEphA3に対する結合についても試験した。EphA3を発現することが知られている3つの腫瘍細胞株を使用した:マウス黒色腫(B16)、ヒト黒色腫(SKmel28)、および前立腺癌株(LnCAP)。生細胞を、改変IgG、キメラIIIA4、または対照抗体でプロービングした。結合した抗体を、抗ヒトIgGフィコエリトリンコンジュゲートにより、フローサイトメトリーを用いて検出した(図5)。B16細胞およびSKmel28細胞に対して、改変IgGおよびキメラIIIA4の両方で強力な結合が認められた。両IgGはまた、LnCAPとも結合した。
【０１５９】
実施例3. Fab断片およびF(ab')2断片がアポトーシスを誘導する能力の評価
本発明の例示的な改変IgG1抗体(Ab1)または対照ヒトIgG1抗体のパパイン消化により、Fab断片を作製した。100 mM酢酸ナトリウム pH 5.0中で、抗体1 mgをパパイン(Roche # 10108014001) 0.01 mgと共に37℃で18時間インキュベートした。F(ab')2はペプシン消化により生成された。100 mM酢酸ナトリウム pH 4.0中で、IgG 5 mgを固定化ペプシンアガローススラリー(Pierce # 20343) 250μlと共に37℃で18時間インキュベートした。切断の際には、両消化物をプロテインA樹脂と共に30分間インキュベートして、Fc断片を除去し、上清を回収した。Fab断片およびF(ab')2断片を、50 mMコハク酸Na pH 6.0、145 mM NaCl、および0.05％ Tween 80に対して透析した。
【０１６０】
Ab1のFab断片およびF(ab')2断片が、白血病患者から単離された初代細胞においてアポトーシスを誘導する能力を評価するため、細胞を96ウェル「U」底プレート中の培養液(10％ウシ胎仔血清を添加したRPMI 1640) 0.1 ml中に、2×105個細胞/ウェルで播種した。抗体または抗体断片を最終濃度が10μg/mlとなるように添加し、プレートを組織培養インキュベーター中で37℃および5％二酸化炭素にて24時間インキュベートした。アポトーシス誘導の陽性対照として、別個の細胞試料をカンプトテシン(10μM；Calbiochem)と共にインキュベートした。インキュベーションの終了時に、細胞を回収し、1000 rpmで5分間の遠心分離により洗浄した後、FITC結合アネキシンV(BD Pharmingen) 10μlを含む緩衝液0.1 ml中で氷上で30分間インキュベートした。細胞を遠心分離により1度洗浄し、1：1000希釈したヨウ化プロピジウム(Sigma)を含むフローサイトメトリー緩衝液に再懸濁した。アポトーシスを起こしているアネキシンV染色細胞を、フローサイトメトリーにより同定した。
【０１６１】
（表４）Ab1抗体およびAb1抗体断片によるアポトーシスの誘導
【０１６２】
表4の結果から、例示的な抗体(Ab1) F(ab')2断片が、EphA3を発現する初代白血病細胞においてアポトーシスの直接的誘導を誘導したことが示される。10μg/ml Ab1 F(ab')2を用いて、標的細胞のおよそ20％が24時間以内に殺傷された。対照的に、一価Fab断片は検出可能なレベルのアポトーシスを誘導することができず、これらの細胞において有意なレベルのアポトーシスを誘導するためには、EphA3の二量体化が必要かつ十分であり、アポトーシス誘導にはFcエフェクター機能は必要でないことが示される。
【０１６３】
実施例4. 無フコシル化抗体の評価
抗体1を、異なるCHO細胞株における発現により、2つのグリコシル型で産生させた。1つの形態(フコシル化抗体1)は、α 1,6フコースを含むIgG1κ(f-アロタイプ)治療抗体に典型的なグリコシル化パターンを有する。他方の形態(無フコシル化抗体1と称する)は、α-1,6フコースの付加を妨げるために、α-1,6フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8のホモ接合性欠失を含むCHO細胞株で産生させ、したがって無フコシル化されている。これらの抗体調製物を、NK細胞媒介性抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイにおいて比較した。
【０１６４】
様々な濃度の抗EphA3抗体調製物を、白血病初代標的細胞および正常ヒトPBMCエフェクター細胞(Stanford University Blood Bankによるバフィーコート)と共にインキュベートした。0.0001μg/mL〜10.0μg/mLのフコシル化抗体1および無フコシル化抗体1の両方を、急性骨髄性白血病(AML)患者由来の標的細胞1×104個、および正常PBMCエフェクター細胞1×106個(エフェクター：標的細胞比は100：1)を用いて試験した。37℃、5％ CO2で16時間インキュベートした後、LDH放出を、界面活性剤で溶解した細胞からのLDHと比較して測定して、細胞傷害性の割合を決定した(Promega Cytotox 96キットを使用)。
【０１６５】
無フコシル化抗体1は、フコシル化抗体1と比較して、EphA3陽性標的細胞に対する増加したADCC活性を示す(図6)。
【０１６６】
明確に理解できるように説明および実施例により前述の本発明をある程度詳細に記述してきたが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それらに対していくらかの変更および修正がなされ得ることは、本発明の教示に照らして当業者には容易に明白であろう。
【０１６７】
本明細書において引用した出版物、アクセッション番号、特許、および特許出願はすべて、それぞれが詳細にかつ個別に参照により組み入れられることが示されるがごとく、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６８】
本発明の抗EphA3抗体の例示的なVH領域配列：
【０１６９】
本発明の抗EphA3抗体の例示的なVL領域配列：
【０１７０】
SEQ ID NO:24：例示的な重鎖定常領域
【０１７１】
SEQ ID NO:25：例示的な軽鎖定常領域
【０１７２】
本発明の例示的な抗体(重鎖および軽鎖配列)：
SEQ ID NO:26(重鎖、SEQ ID NO:26/27を含む抗体)
SEQ ID NO:27(軽鎖、SEQ ID NO:26/27を含む抗体)
SEQ ID NO:28(重鎖、SEQ ID NO:28/29を含む抗体)
SEQ ID NO:29(軽鎖、SEQ ID NO:28/29を含む抗体)
SEQ ID NO:30(重鎖、SEQ ID NO:30/31を含む抗体)
SEQ ID NO:31(軽鎖、SEQ ID NO:30/31を含む抗体)
SEQ ID NO:32(重鎖、SEQ ID NO:32/33を含む抗体)
SEQ ID NO:33(軽鎖、SEQ ID NO:32/33を含む抗体)
SEQ ID NO:34(重鎖、SEQ ID NO:34/35を含む抗体)
SEQ ID NO:35(軽鎖、SEQ ID NO:34/35を含む抗体)
SEQ ID NO:36(重鎖、SEQ ID NO:36/37を含む抗体)
SEQ ID NO:37(軽鎖、SEQ ID NO:36/37を含む抗体)
【図１−１】
【図１−２】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2009年10月14日に出願した米国特許仮出願第61/251,668号の恩典を主張し、この出願は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Eph受容体チロシンキナーゼ(Eph)は、チロシン残基においてタンパク質をリン酸化するキナーゼである受容体チロシンキナーゼ(RTK)の大きな群に属する。Ephおよびそれらの膜結合型エフリンリガンド(エフリン)は、細胞の位置決めおよび組織の組織化を制御する(Poliakov, A., et al., Dev Cell 7:465-80 (2004) (非特許文献1))。他の受容体チロシンキナーゼとは対照的に、Eph受容体の活性化は、リガンド結合および二量体化を必要とするばかりでなく、予め形成されたリガンドオリゴマーを必要とする。したがって、Eph受容体のチロシンリン酸化は、クラスター形成型または膜結合型のエフリンリガンドの提示を必要とする(Davis et al., Science 266:816-819 (1994) (非特許文献2))。機能的でかつ生化学的なEph応答は、より高度なリガンドオリゴマー形成状態で起こる(Stein et al., Genes Dev 12:667-678 (1998) (非特許文献3))。
【０００３】
数あるパターン形成機能の中でも特に、種々のEphおよびエフリンは、血管発生において役割を果たすことが示されている。成体において、ある種のエフリンおよびそれらの受容体が調節解除されて再出現することが、腫瘍の浸潤、転移、および新血管新生に寄与することも認められている。例えば、ドミナントネガティブな可溶性EphA2またはEphA3タンパク質は、インビトロにおいてエフリン誘導性の内皮細胞機能に及ぼす効果、ならびにインビボにおいて腫瘍の血管新生および進行に及ぼす効果を示す(Nakamoto,. et al., Microsc Res Tech 59:58-67 (2002) (非特許文献4)；Brantley-Sieders, et al., Curr Pharm Des 10:3431-42 (2004) (非特許文献5)；Brantley, et al. Oncogene 21 :7011-26 (2002) (非特許文献6)；Cheng, et al. Neoplasia 5:445-56 (2003) (非特許文献7)．Dobrzanski, et al. Cancer Res 64:910-9 (2004) (非特許文献8))。さらに、Ephファミリーメンバーは、多種多様なヒト固形腫瘍に由来する腫瘍細胞で過剰発現することが見出されている(Brantley-Sieders, et al., Curr Pharm Des 10:3431-42 (2004) (非特許文献5)；Marme, D. Ann Hematol 81 Suppl 2:S66 (2002) (非特許文献9)；Booth, C. et al., Nat Med 8:1360-1 (2002) (非特許文献10))。
【０００４】
Epha3はまた、移行期および急性転化期の慢性骨髄性白血病(CML)患者のCD34+細胞で活性化され、過剰発現することも報告されている(Cilloni et al., American Society of Hematology, Abstract 1092, 2008 (非特許文献11) (2008年11月14日にオンラインで利用可能))。Cilloniらは、初代CML細胞またはEphA3をトランスフェクトした正常細胞を特異的モノクローナル抗体と共にインキュベートした場合に、該抗体が初代細胞およびトランスフェクト細胞において増殖の有意な減少を誘導し、コロニーの成長を減少させ、かつ接着特性の変化を誘導することを報告した。該抗体は、正常対照細胞においても、慢性期のCML患者に由来する細胞においても、有意な変化を全く誘導しなかった。
【０００５】
本発明は、新規な抗EphA3抗体の発見に一部基づいている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Poliakov, A., et al., Dev Cell 7:465-80 (2004)
【非特許文献２】Davis et al., Science 266:816-819 (1994)
【非特許文献３】Stein et al., Genes Dev 12:667-678 (1998)
【非特許文献４】Nakamoto,. et al., Microsc Res Tech 59:58-67 (2002)
【非特許文献５】Brantley-Sieders, et al., Curr Pharm Des 10:3431-42 (2004)
【非特許文献６】Brantley, et al. Oncogene 21 :7011-26 (2002)
【非特許文献７】Cheng, et al. Neoplasia 5:445-56 (2003)
【非特許文献８】Dobrzanski, et al. Cancer Res 64:910-9 (2004)
【非特許文献９】Marme, D. Ann Hematol 81 Suppl 2:S66 (2002)
【非特許文献１０】Booth, C. et al., Nat Med 8:1360-1 (2002)
【非特許文献１１】Cilloni et al., American Society of Hematology, Abstract 1092, 2008
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、強力な抗EphA3抗体、および例えばEphA3が関与する疾患を治療するために、そのような抗体を使用する方法に関する。本発明の抗体は、本明細書に記載される特徴を有する。したがって、1つの局面において、本発明の抗体は、アミノ酸配列X1GX2YEX3FDX4を含むCDR3を含むVH領域を含み、ここで、X1はSまたはGであり、X2はYまたはVであり、X3はEまたはDであり、かつX4はS、V、またはIであるが、ただしアミノ酸配列がSGYYEDFDSである場合には、CDR1はSYWINではなく、アミノ酸配列がSGYYEEFDSである場合には、CDR1はTYWISではない。いくつかの態様において、抗体は、アミノ酸配列
を含むCDR3を有する。いくつかの態様において、抗体は、ヒト生殖系列Jセグメントアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性、典型的には少なくとも85％もしくは少なくとも90％の同一性を含むか；または2つ以下の位置でヒト生殖系列Jセグメントと異なるJセグメント；ならびにヒト生殖系列Vセグメントアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性、典型的には少なくとも85％の同一性、および好ましくは90％の同一性、またはそれ以上を含むVセグメントを有する。いくつかの態様において、JセグメントはヒトJH6アミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含み、かつVセグメントはヒトVH1 1-02アミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含む。いくつかの態様において、抗体は、WGQGTTVTVSを含むFR4、またはWGQGTTVTVSと1つ以下のアミノ酸が異なるFR4を有する。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載のVH領域に示されるVH CDR1、またはVH CDR2、またはVH CDR1およびVH CDR2の両方を含む。例えば、本発明の抗体は、アミノ酸配列GYWMN、TYWIS、もしくはSYWINを有するVH CDR1、および/またはアミノ酸配列
を有するCDR2を有し得る。いくつかの態様において、抗体は、VH CDR1 GYWMNおよびCDR2
を有する。いくつかの態様において、抗体は、VH CDR1 TYWISおよびVH CDR2
を有する。いくつかの態様において、本発明の抗体は、図1に示されるV領域の1つに由来するVH CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。いくつかの態様において、抗体は、図1に示されるVセグメント配列のVH Vセグメントアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、VHは、図1に記載されるVH領域の配列を有する。
【０００８】
本発明はまた、配列X1X2YX3X4YPYTを有するCDR3結合特異性決定基を含むVL領域を有する抗体を提供し、ここで、X1はG、V、またはAであり；X2はQ、R、またはGであり；X3はA、S、またはLであり；かつX4はNまたはKである。いくつかの態様において、CDR3は、
を含む。いくつかの態様において、CDR3がVQYANYPYTである場合には、CDR1はRASQEISGYLGでもRASQGIISYLAでもなく、かつ/またはCDR2はAASTLDSでもAASSLQSでもない。いくつかの態様において、VL領域は、ヒト生殖系列Jセグメントアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性、典型的には少なくとも85％もしくは90％の同一性を含むか、またはヒト生殖系列セグメントと2つ以下のアミノ酸が異なるJセグメント；およびヒト生殖系列Vセグメントアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性、典型的には少なくとも90％の同一性、またはそれ以上を含むVセグメントを含む。いくつかの態様において、Jセグメントは、ヒト生殖系列Jκ2アミノ酸配列に由来する配列FGQGKLEIKに対して2つ以下のアミノ酸変化、多くの場合には1つ以下のアミノ酸変化を有し、かつVセグメントは、ヒト生殖系列JκI L15アミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含む。いくつかの態様において、抗体のFR4はアミノ酸配列FGQGKLEIKを有するか、または配列FGQGKLEIKに対して変化した1つ以下のアミノ酸残基を有する。いくつかの態様において、VL領域は、図1に示される配列VL領域のCDR1、またはCDR2、またはCDR1およびCDR2の両方を含む。例えば、CDR1は、配列
を有し得；かつ/またはCDR2は、配列AASSLQS、GASSLQS、AASSLQR、もしくはAASTLDSを有し得る。いくつかの態様において、CDR1は配列RASQGIISYLAを有し、かつCDR2は配列GASSLQSを有する。いくつかの態様において、CDR1は配列QASQDISTYLNを有し、かつCDR2は配列AASSLQRまたはAASSLQSを有する。いくつかの態様において、CDR1は配列RASQSISSYLAを有し、かつCDR2は配列AASSLQRを有する。いくつかの態様において、VL領域は、図1に記載されるVL領域の1つのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。いくつかの態様において、VL領域は、図1に示されるVセグメント配列を有するVセグメントを含む。いくつかの態様において、VL領域は、図1に記載されるVL領域の配列を有する。典型的な態様において、抗体のVH領域は、先行する段落に記載されるVH領域のいずれかを含む。
【０００９】
いくつかの態様において、本発明は、
を含むCDR3を有するVL領域を含む抗体を提供する。いくつかの態様において、抗体は、アミノ酸配列X1GX2YEX3FDX4を含む重鎖CDR3を含み、ここで、X1はSまたはGであり、X2はYまたはVであり、X3はEまたはDであり、かつX4はS、V、またはIである。いくつかの態様において。いくつかの態様において、重鎖CDR3は、アミノ酸配列
を含む。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載される軽鎖CDR1もしくはCDR2、または図1に記載される重鎖CDR1もしくはCDR2を含む。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載される軽鎖CDR1およびCDR2、ならびに/または図1に記載される重鎖CDR1およびCDR2を含む。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載されるVL Vセグメントを含む。
【００１０】
本発明はさらに、配列SGYYE(E/D)FDSを有するCDR3を含むVH領域、および先行する段落に記載されるVL領域CDR3配列を含む抗体を提供するが、ただしVL領域CDR3配列はVQYANYPYTでもVQYMNYPYTでもない。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載される重鎖CDR1もしくはCDR2、または図1に記載される軽鎖CDR1もしくはCDR2を含む。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載される重鎖CDR1およびCDR2、ならびに/または図1に記載される軽鎖CDR1およびCDR2を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、本発明の抗EphA3抗体は、図1に記載されるVH領域の1つに由来するVH CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに図1に記載されるVL領域の1つに由来するVL CDR1、CDR2、およびCDR3を含む。
【００１２】
本発明の抗体は、図1に記載されるVH領域または図1に記載されるVL領域を含み得る。多くの場合には、抗体は、図1に記載されるVH領域および図1に記載されるVL領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、a) SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:20、b) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:11、c) SEQ ID NO: 2およびSEQ ID NO:12、d) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:19、e) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:21、f) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:22、g) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:23、h) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:11、i) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:12、j) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:21、k) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:22、l) SEQ ID NO:4および SEQ ID N0:11、m) SEQ ID N0:4およびSEQ ID NO:13、n) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:11、o) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:13、p) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:21、q) SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:14、r) SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:15、s) SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:14、t) SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:15、u) SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:14、v) SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:15、w) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:16、x) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:17、y) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:19、z) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:17、aa) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:18、またはbb) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:20を含むVH領域とVL領域の組み合わせを含む。
【００１３】
いくつかの態様において、例えば図1中のVH領域配列より選択されるVH領域配列、および図1中のVL領域配列より選択されるVL領域を有する本発明の抗体は、37℃で実施した表面プラズモン共鳴解析により決定して約10 nMよりも優れた、および多くの場合には約5 nMまたは1 nMよりも優れた一価親和性を有する。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗体は、約10 nM、約5 nM、約2.5 nM、約1 nM、約0.5 nM、約0.25 nM、または約0.1 nM、もしくはそれよりも優れた親和性(表面プラズモン共鳴を用いて測定)を有する。
【００１４】
本明細書に記載される本発明の抗体は、N末端にメチオニンを含むVH領域および/またはVL領域を有し得る。
【００１５】
いくつかの態様において、抗体はIgGである。いくつかの態様において、抗体はIgG1またはIgG3である。いくつかの態様において、抗体はIg2またはIgG4である。
【００１６】
いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO:24に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、および/またはSEQ ID NO:25に記載されるアミノ酸配列を有するκ軽鎖定常領域を含む。
【００１７】
いくつかの態様において、抗体の重鎖定常領域は無フコシル化されている。いくつかの態様において、本発明の抗体を含む抗体調製物は、低フコシル化または無フコシル化されている。
【００１８】
いくつかの態様において、本発明の抗EphA3抗体は、それぞれSEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、またはSEQ ID NO:36およびSEQ ID NO:27を含む重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を有し；かつ抗体は無フコシル化されている。
【００１９】
いくつかの態様において、抗体は(Fab')2である。
【００２０】
いくつかの態様において、抗体はペグ化されている。
【００２１】
いくつかの態様において、抗体はEphA3を活性化する。
【００２２】
いくつかの態様において、抗体は、EphA3への結合に関して例えばエフリンA5のような天然リガンドと競合しない。
【００２３】
別の局面において、本発明は、EphA3依存性疾患を有する患者を治療する方法であって、本明細書に記載される本発明の抗体を治療有効量で該患者に投与する段階を含む方法を提供する。患者は、例えば癌を有し得る。いくつかの態様において、抗体は、EphA3を発現する腫瘍細胞を含む固形腫瘍を有する患者に投与される。他の態様において、抗体は、EphA3を発現する腫瘍細胞を有さない腫瘍を有する患者に投与される。
【００２４】
いくつかの態様において、抗体は、骨髄増殖性疾患を有する患者に投与される。いくつかの態様において、抗体は、急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病を有する患者に投与される、いくつかのいくつかの態様において、抗体はリンパ腫を有する患者に投与される。いくつかの態様において、抗体は、骨髄異形成症候群、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、または特発性骨髄線維症を有する患者に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の抗EphA3抗体の例示的なVH配列およびVL配列を提供する。
【図２】重鎖CDR2/FR3カセット構築の模式図を提供する。
【図３】抗EphA3 IgGを用いた抗原結合ELISAの結果を示す。EphA3-FcをコーティングしたELISAプレートを、キメラIIIA4(丸)、本発明の例示的な改変抗体(四角)、または対照IgG(三角)で処理し、抗ヒトκ鎖HRPコンジュゲートとの結合についてプロービングした。
【図４】EphA3に対する本発明の改変抗体の特異性を示す。様々なEphタンパク質をELISAプレート上にコーティングし、改変抗体で処理し、抗ヒトκ鎖HRPコンジュゲートとの結合についてプロービングした。
【図５】本発明の例示的な改変抗EphA3抗体が、細胞表面に発現されたEphA3に結合する能力を評価する実験における、3つの細胞株のフローサイトメトリー解析のデータを示す。B16細胞、SKmel28細胞、およびLnCAP細胞を2％ BSAおよびラットIgGでブロッキングし、改変抗EphA3 IgG、キメラIIIA4 IgG、またはアイソタイプ対照IgGでプロービングした。Facs Caliberフローサイトメトリー(BD)を用いて、結合した抗体を、抗ヒトIgGフィコエリトリンコンジュゲートにより検出した。死細胞は、ヨウ化プロピジウム染色により排除した。各グラフについて、対照抗体プロファイルはグラフ中の一番左側の曲線である。
【図６】無フコシル化抗EphA3抗体が、フコシル化抗EphA3抗体と比較して、AML細胞に対する増強されたADCC活性を有することを示すデータを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本明細書で使用する「EphA3」は、Eph受容体A3を指す。この受容体は、「ヒト胚キナーゼ」、「hek」、「eph様チロシンキナーゼ1」、「etk1」、または「tyro4」とも称されている。EphA3は、タンパク質-チロシンキナーゼファミリーのエフリン受容体サブファミリーに属する。EPHおよびEPH関連受容体は、発生事象の媒介に関連づけられている。EPHサブファミリーの受容体は、典型的には、単一のキナーゼドメイン、ならびにCysリッチドメインおよび2つのフィブロネクチンIII型反復を含む細胞外領域を有する。エフリン受容体は、それらの細胞外ドメイン配列の類似性、ならびにエフリン-Aおよびエフリン-Bリガンドとの結合に関するそれらの親和性に基づいて、2つの群に分類される。EphA3はエフリン-Aリガンドと結合する。EphA3の核酸配列およびタンパク質配列は公知である。例示的なヒトEphA3アミノ酸配列は、アクセッション番号(EAW68857)の下で入手可能である。
【００２７】
本発明おいて、EphA3の「活性化」は、EphA3のリン酸化を引き起こす。したがって、EphA3を活性化する、すなわちEphA3のリン酸化を引き起こす抗体は、本発明との関連においてアゴニストと見なされる。EphA3は、二量体化によって活性化され得る。そのような活性化は、リン酸化およびアポトーシスをもたらし得るが、必ずしも細胞の円形化をもたらし得るわけではない。例えばEphA3のクラスター化が起こった場合の活性化は、形態変化、典型的には細胞の円形化をさらにもたらし得る。
【００２８】
本発明において、「EphA3抗体」または「抗EphA3抗体」は互換的に用いられ、EphA3に特異的に結合する抗体を指す。いくつかの態様において、抗体はEphA3を二量体化し得る。本用語は、エフリンリガンド(例えば、エフリンA5)結合の存在下においてEphA3に結合する抗体、およびリガンド結合部位に結合し、EphA3に対するリガンド結合と競合する抗体を包含する。
【００２９】
「エフリンリガンドの結合の存在下においてEphA3に結合するEphA3抗体」とは、エフリンA5などのエフリンリガンドのEphA3に対する結合を有意に妨げない抗体を指す。EphA3およびエフリンリガンド、例えばエフリンA5を含む結合反応物中にそのような抗体が存在すると、EphA3に対するエフリンリガンド結合は約30％未満、典型的には20％または10％未満減少する。
【００３０】
「mAb IIIA4」という用語は、EphA3をアフィニティー単離するために、元々LK63ヒト急性プレB白血病細胞に対して産生されたモノクローナル抗体IIIA4を指す(Boyd, et al. J Biol Chem 267:3262-3267, 1992)。mAb IIIA4は、天然EphA3球状エフリン結合ドメインに結合する(例えば、Smith, et al., J. Biol. Chem 279:9522-9531, 2004)。これは、アクセッション番号91061920の下で、欧州動物細胞培養収集機関(European Collection of Animal Cell Cultures)に寄託されている(例えば、欧州特許第EP0590030号を参照されたい)。
【００３１】
本明細書で使用する「活性アイソタイプを有する抗体」とは、免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に結合するヒトFc領域を有する抗体を指す。「活性アイソタイプ」には、IgG1、IgG3、IgM、IgA、およびIgEが含まれる。本用語は、Fcエフェクター機能を調節する変異、またはそのように調節する糖組成および/もしくはグリコシル化レベルに対する変化などの修飾を含むヒトFc領域を有する抗体を包含する。
【００３２】
「Fc領域」とは、第1定常領域免疫グロブリンドメインを除いた抗体の定常領域を指す。したがって、Fcとは、IgA、IgD、およびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにIgEおよびIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのN末端側の可動性ヒンジを指す。IgAおよびIgMの場合、FcはJ鎖を含み得る。IgGの場合、Fcは、免疫グロブリンドメインCγ2およびCγ3、ならびにCγ1とCγとの間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変化し得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は通常、そのカルボキシル末端に残基C226またはP230を含むよう規定され、その際、番号付けはKabatらによるEU指数(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va)に従うことが、当技術分野において理解されている。「Fc領域」という用語は、単離体としてのこの領域を指す場合もあれば、または抗体もしくは抗体断片との関連におけるこの領域を指す場合もある。「Fc領域」は、Fc領域の天然の対立遺伝子変種、およびエフェクター機能を調節する修飾を含む。Fc領域はまた、生物学的機能に変化をもたらさない変種も含む。例えば、生物学的機能を実質的に喪失させることなく、免疫グロブリンのFc領域のN末端またはC末端から1つまたは複数のアミノ酸を欠失させることができる。このような変種は、活性に最小の影響を及ぼすように、当技術分野で公知の一般規則に従って選択することができる(例えば、Bowie, et al., Science 247:306-1310, 1990を参照されたい)。
【００３３】
(KD)と省略される「平衡解離定数」または「親和性」という用語は、会合速度定数(Ka、時間-1 M-1)で除した解離速度定数(kd、時間-1)を指す。平衡解離定数は、当技術分野における任意の公知の方法を用いて測定することができる。本発明の抗体は高親和性抗体である。このような抗体は、37℃で実施した表面プラズモン共鳴解析により決定して約約50 nMよりも優れた(低い)、および多くの場合には約10 nM未満の一価親和性を有する。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗体は、約50 nM未満、典型的には約25 nM未満、またはさらには10 nM未満、例えば約5 nMまたは約1 nMの親和性(表面プラズモン共鳴を用いて測定)を有する。本発明との関連において、親和性は、例えばより低い数値的KDによって明らかなようにより高い親和性を有する場合に、「より優れている」。
【００３４】
タンパク質またはペプチドに言及する場合の、抗体に「特異的に(または選択的に)結合する」または「〜と特異的に(または選択的に)免疫反応性である」という語句は、抗体が関心対象のタンパク質に結合する結合反応を指す。本発明との関連において、抗体は典型的には、他の抗原に対するその親和性よりも少なくとも100倍高い親和性でEphA3に結合する。
【００３５】
本明細書で使用する「抗体」とは、結合タンパク質として機能的に定義され、かつ抗体を産生する動物の免疫グロブリンコード遺伝子のフレームワーク領域に由来すると当業者によって認識されるアミノ酸配列を含むとして構造的に定義されるタンパク質を指す。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなり得る。認識されている免疫グロブリン遺伝子にはκ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、これらはそれぞれ免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを規定する。
【００３６】
典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は2つの同じポリペプチド鎖対からなり、各対は1本の「軽」鎖(約25 kD)および1本の「重」鎖(約50〜70 kD)を有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識を担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。
【００３７】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、結合特異性を保持する抗体断片も含む。例えば、いくつかの十分に特徴づけられた抗体断片が存在する。したがって、例えば、ペプシンはヒンジ領域内のジスルフィド結合のC末端側で抗体を消化して、それ自体ジスルフィド結合によってVH-CH1に結合している軽鎖であるFabの二量体、F(ab)'2を生じる。F(ab)'2を穏和な条件下で還元してヒンジ領域内のジスルフィド結合を切断し、それにより(Fab')2二量体からFab'単量体に変換することができる。Fab'単量体は、本質的にヒンジ領域の部分を伴うFabである(他の抗体断片のより詳細な説明については、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を参照されたい)。無傷の抗体の消化に関して様々な抗体断片が規定されるが、当業者は、化学的にまたは組換えDNA方法論を用いることによりそのような断片を新規に合成できることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用する抗体という用語はまた、全抗体の修飾によって生じるか、または組換えDNA方法論を用いて合成される抗体断片を含む。
【００３８】
抗体には、可変重鎖領域と可変軽鎖領域が共に結合して(直接またはペプチドリンカーを介して)、連続したポリペプチドを形成する一本鎖Fv抗体(sFvまたはscFv)のような一本鎖抗体(単一のポリペプチド鎖として存在する抗体)を含む、VH-VL二量体が含まれる。一本鎖Fv抗体は、直接結合しているか、またはペプチドコードリンカーによって結合しているVHコード配列およびVLコード配列を含む核酸から発現され得る、共有結合したVH-VLである(例えば、Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)。VHとVLは単一ポリペプチド鎖として互いに結合しているが、VHドメインおよびVLドメインは非共有結合によって会合する。あるいは、抗体は別の断片であってもよい。他の断片もまた、例えば組換え技法を用いて、可溶性タンパク質として、またはディスプレイ法から得られる断片として作製することができる。抗体には、二抗体(diantibody)およびミニ抗体も含まれ得る。本発明の抗体には、ラクダ科動物に由来する抗体のような重鎖二量体も含まれる。
【００３９】
本明細書で使用する「V領域」とは、B細胞分化の際の重鎖および軽鎖のV領域遺伝子の再編成の結果としてVセグメントに付加されるセグメントであるCDR3およびフレームワーク4を含めた、フレームワーク1、CDR1、フレームワーク2、CDR2、およびフレームワーク3のセグメントを含む抗体可変領域ドメインを指す。本明細書で使用する「Vセグメント」とは、V遺伝子によってコードされるV領域(重鎖または軽鎖)の領域を指す。重鎖可変領域のVセグメントは、FR1-CDR1-FR2-CDR2およびFR3をコードする。本発明の目的のために、軽鎖可変領域のVセグメントは、FR3を通じてCDR3まで及ぶと定義する。
【００４０】
本明細書で使用する「Jセグメント」という用語は、CDR3およびFR4のC末端部分を含みコードされる可変領域のサブ配列を指す。生殖系列Jセグメントは、免疫グロブリンJ遺伝子セグメントによってコードされる。
【００４１】
本明細書で使用する「相補性決定領域(CDR)」とは、軽鎖および重鎖の可変領域によって確立される4つの「フレームワーク」領域を中断する、各鎖における3つの超可変領域を指す。CDRは主に、抗原のエピトープに対する結合を担う。各鎖のCDRは典型的には、N末端から順に番号付けしてCDR1、CDR2、およびCDR3と称され、典型的には、特定のCDRが位置する鎖によっても特定される。したがって、VH CDR3はそれが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、VL CDR1はそれが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するCDR1である。
【００４２】
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成成分である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域が組み合わさったものであり、三次元空間にCDRを配置し、整列させるように働く。
【００４３】
CDRおよびフレームワーク領域のアミノ酸配列は、例えばKabat、Chothia、国際ImMunoGeneTicsデータベース(IMGT)、およびAbMといった、当技術分野で周知の種々の定義を用いて決定することができる(例えば、Johnson et al.、前記；Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917；Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883；Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817；Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol 1997, 273(4)を参照されたい)。抗原結合部位の定義は、以下の文献にも記載されている：Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000)；およびLefranc,M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan 1;29(1):207-9 (2001)；MacCallum et al, Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996)；およびMartin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989)；Martin, et al, Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991)；Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992)；およびRees et al, In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996)。
【００４４】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続したアミノ酸から、またはタンパク質の三次折りたたみによって隣接した非連続アミノ酸から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは典型的には、変性溶媒に曝露されても保持されるが、三次折りたたみによって形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは典型的には、独特の空間的高次構造中に少なくとも3アミノ酸、およびより一般的には少なくとも5または8〜10アミノ酸を含む。エピトープの空間的高次構造を決定する方法には、例えば、x線結晶解析および2次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)を参照されたい。
【００４５】
本明細書で使用する「キメラ抗体」とは、(a) 定常領域またはその一部が改変、置換、または交換され、その結果として抗原結合部位(可変領域)が、異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能、および/もしくは種の定常領域、または例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物等といったキメラ抗体に新たな特性を付与する完全に異なる分子に結合しているか；または(b) 可変領域またはその一部が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域もしくはその一部で；または別の種由来もしくは別の抗体クラスもしくはサブクラス由来の対応する配列で改変、置換、または交換された免疫グロブリン分子を指す。
【００４６】
本明細書で使用する「ヒト化抗体」とは、ドナー抗体由来のCDRがヒトフレームワーク配列に移植されている免疫グロブリン分子を指す。ヒト化抗体はまた、フレームワーク配列内にドナー起源の残基を含み得る。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含み得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含む場合がある。ヒト化は、「超ヒト化(superhumanizing)」抗体(Tan et al., J. Immunol. 169: 1119, 2002)および「表面再処理(resurfacing)」(例えば、Staelens et al., Mol. Immunol. 43: 1243, 2006；およびRoguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 969, 1994)などの技法を含む、当技術分野で公知の方法(例えば、Jones et al., Nature 321:522-525; 1986；Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988；Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992；米国特許第4,816,567号)を用いて行うことができる。
【００４７】
本発明との関連における「Humaneered(商標)」抗体とは、参照抗体の結合特異性を有する改変ヒト抗体を指す。本発明において使用するための「Humaneered(商標)」抗体は、ドナー免疫グロブリンに由来する最小配列を含む免疫グロブリン分子を有する。典型的には、抗体は、参照抗体の重鎖のCDR3領域による結合特異性決定基(BSD)をコードするDNA配列をヒトVHセグメント配列に結合し、参照抗体由来の軽鎖CDR3 BSDをコードするDNA配列をヒトVLセグメント配列に結合することによって「Humaneered(商標)」する。humaneer化する方法は、米国特許出願公開第20050255552号および米国特許出願公開第20060134098号に提供されている。
【００４８】
本発明との関連において使用する「結合特異性決定基」または「BSD」という用語は、抗体の結合特異性を決定するために必要な、CDR領域内の最小の連続したまたは非連続のアミノ酸配列を指す。本発明において、最小の結合特異性決定基は、抗体の重鎖および軽鎖のCDR3配列の一部または全長内に存在する。
【００４９】
本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト化抗体および「Humaneered(商標)」抗体、ならびに公知の技法を用いて得られるヒトモノクローナル抗体を包含する。
【００５０】
「低フコシル化」抗体調製物とは、オリゴ糖鎖の50％未満がα1,6-フコースを含む抗体調製物を指す。典型的には、「低フコシル化」抗体調製物では、オリゴ糖鎖の約40％未満、約30％未満、約20％未満、約10％未満、または5％未満もしくは1％未満がα1,6-フコースを含む。
【００５１】
「無フコシル化」抗体は、IgG重鎖のCH2ドメインに付着する炭水化物においてα1,6-フコースを欠いている。
【００５２】
核酸の部分に関して使用する場合の「異種の」という用語は、核酸が、天然では相互にこれと同じ関係で通常見出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、このような核酸は典型的には組換えにより作製され、例えば新たな機能的核酸を創出するように配置された無関係の遺伝子に由来する2つまたはそれ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質とは、天然では相互にこれと同じ関係で見出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を指す。
【００５３】
例えば細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して使用する場合の「組換え体」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種核酸もしくは異種タンパク質の導入または天然核酸もしくは天然タンパク質の変更により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば組換え細胞は、天然(非組換え)型の細胞内に見出されない遺伝子を発現するか、または天然遺伝子を発現するが、これが別の方法で異常に発現される、低発現される、もしくは全く発現されない。本明細書における「組換え核酸」という用語は、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いて、一般的に核酸の操作により最初にインビトロで形成された、天然に通常見出されない形態の核酸を意味する。このようにして、異なる配列の機能的な連結が達成される。したがって、通常は結合していないDNA分子を連結することによってインビトロで形成された線状形態の単離核酸または発現ベクターはいずれも、本発明の目的に関して組換え体と見なされる。組換え核酸を作製し、宿主細胞または生物体に再導入すると、これは非組換え的に、すなわちインビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製する；しかしながら、このような核酸は、組換えにより作製されると続いて非組換え的に複製するが、それでもなお本発明の目的に関して組換え体と見なされることが理解される。同様に、「組換えタンパク質」とは、組換え技法を用いて、すなわち上記の組換え核酸の発現を通して作製されたタンパク質である。
【００５４】
本明細書で使用するEphA3依存性疾患とは、EphA3を発現する細胞が、疾患を治療するための治療法の標的である疾患を指す。
【００５５】
「血管原性骨髄前駆細胞」という用語は、骨髄由来の内皮前駆体および/または循環内皮細胞前駆細胞を指す。
【００５６】
本明細書で使用する「癌細胞」または「腫瘍細胞」という用語は、新生物細胞を指す。本用語は、良性および悪性である癌細胞を含む。新生物形質転換は、腫瘍細胞の由来元の細胞型に対する腫瘍細胞の表現型変化を伴う。この変化には、接触阻害の喪失、形態変化、および異常な成長が含まれ得る。(Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd edition, 1994を参照されたい)。
【００５７】
本発明との関連における「癌の成長を阻害すること」とは、成長を遅延させること、および/または癌を有する患者の癌細胞負荷を減少させることを指す。したがって、「癌の成長を阻害すること」は、癌細胞を死滅させること、および癌細胞の成長を遅延または停止させることを含む。
【００５８】
本明細書において使用する「治療薬」とは、疾患に罹患している患者に治療有効量で投与した場合に、疾患および疾患に伴う合併症の症状を治癒するか、または少なくとも部分的に止める薬剤を指す。
【００５９】
2つまたはそれ以上のポリペプチド(または核酸)配列との関連における「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、以下に記載する初期設定パラメータでBLASTもしくはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いて、または手動アライメントおよび目視検査により測定した場合に(例えば、NCBIウェブサイトを参照されたい)、同一であるかまたは特定の割合のアミノ酸残基(またはヌクレオチド)が同一である(すなわち、比較領域または指定領域にわたって最大限の一致を得るために比較およびアライメントした場合の、特定領域にわたる約60％の同一性、好ましくは70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれよりも高い同一性)2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。そのような配列は、その時「実質的に同一である」と称される。「実質的に同一である」配列には、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列、ならびに天然の、例えば多型または対立遺伝子変種、および人為的変種もまた含まれる。以下に記載するように、好ましいアルゴリズムはギャップ等について説明し得る。好ましくは、タンパク質配列同一性は、少なくとも約25アミノ酸長の領域にわたり、またはより好ましくは50〜100アミノ酸長の領域にわたり、またはタンパク質の全長にわたり存在する。
【００６０】
本明細書で使用する「比較領域」は、2つの配列を最適にアライメントした後に、同じ数の連続位置の参照配列に対して1つの配列を比較することができる、典型的には20〜600、一般的には約50〜約200、より一般的には約100〜約150からなる群より選択される数の連続位置のうちの1つのセグメントに対する言及を含む。比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison, WI)により、または手動アライメントおよび目視検査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)を参照されたい)によって行うことができる。
【００６１】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例には、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)、およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されているBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムが含まれる。本発明の核酸およびタンパク質のパーセント配列同一性を決定するには、BLASTおよびBLAST 2.0を本明細書に記載されるパラメータで使用する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、初期設定としてワード長(W) 11、期待値(E) 10、M＝5、N＝-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムでは、初期設定としてワード長3、および期待値(E) 10、およびBLOSUM62スコア行列(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい)アライメント(B) 50、期待値(E) 10、M＝5、N＝-4、ならびに両鎖の比較を使用する。
【００６２】
2つのポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、第1ポリペプチドが、第2ポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば2つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは典型的には第2ポリペプチドと実質的に同一である。
【００６３】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態において見出される通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。純度および均一性は典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を用いて決定する。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。いくつかの態様における「精製された」という用語は、タンパク質が電気泳動ゲルで本質的に1本のバンドを生じることを表す。好ましくは、これは、タンパク質が少なくとも85％純粋、より好ましくは少なくとも95％純粋、および最も好ましくは少なくとも99％純粋であることを意味する。
【００６４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、天然アミノ酸ポリマー、修飾残基を含むもの、および非天然アミノ酸ポリマーばかりでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００６５】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、例えば、α炭素に水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基が結合している、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【００６６】
アミノ酸は、本明細書中では、IUPAC-IUB生化学命名委員会により推奨されている一般に知られている3文字記号または1文字記号により参照され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に是認されている1文字コードにより参照され得る。
【００６７】
「保存的修飾変種」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関する保存的修飾変種とは、同一または本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指すが、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一のまたは関連する配列、例えば天然の連続した配列を指す。遺伝暗号の縮重により、数多くの機能的に同一である核酸が大部分のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが指定されるすべての位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、コドンを記載の対応するコドンの別のものに変更することができる。このような核酸の変化は「サイレント変化」であり、これは保存的修飾変種の1種である。ポリペプチドをコードする本明細書内のすべての核酸配列は、核酸のサイレント変化も表す。当業者は、特定の状況において、核酸内の各コドン(通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUGおよび通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く)を修飾して、機能的に同一である分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、多くの場合には、発現産物に関して記載された配列では、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変化が暗に意味されるが、実際のプローブ配列に関してはそのようなことはない。
【００６８】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コード配列内の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、付加する、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、その変化によって化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる場合に「保存的修飾変種」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。このような保存的修飾変種は、本発明の多型変種、種間相同体、および対立遺伝子に付加されるものであり、これらを排除するものではない。典型的な相互の保存的置換：1) アラニン(A)、グリシン(G)；2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；4) アルギニン(R)、リジン(K)；5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；7) セリン(S)、スレオニン(T)；および8) システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい)。
【００６９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「1つの(a)」、「1つの(and)」、および「その」は、特に文脈によって明白に指示されていない限り、その対象物の複数形も含む。
【００７０】
I. 序論
本発明は、EphA3に高い親和性で結合し、典型的にはEphA3を活性化する抗体に関する。抗体は、ヒト生殖系列VH配列およびVL配列と高度のアミノ酸配列同一性を有する可変領域を含む。好ましい態様において、本発明の抗体のCDRH3はアミノ酸配列X1GX2YE(X3)FDX4を含み、ここで、X1はSまたはGであり、X2はYまたはVであり、X3はEまたはDであり、かつX4はS、V、またはIであるが、ただしアミノ酸配列はSGYYEDFDSではない。いくつかの態様において、本発明の抗体のCDRL3はアミノ酸配列X1X2YX3X4YPYTを含み、ここで、X1はVまたはAであり、X2はQ、R、またはGであり、X3はA、S、またはLであり、かつX4はNまたはKである。
【００７１】
典型的には、CDR3のBSDを除く部分および完全なFR4は、ヒト生殖系列配列からなる。いくつかの態様において、BSDを除くCDR3-FR4配列は、各鎖においてヒト生殖系列配列と2アミノ酸以下だけ異なる。いくつかの態様において、Jセグメントはヒト生殖系列Jセグメントを含む。ヒト生殖系列配列は、例えば公的に利用可能な国際ImMunoGeneTicsデータベース(IMGT)およびV-base(vbase.mrc-cpe.cam.ac.ukでのワールドワイドウェブにおける)を通して決定することができる。
【００７２】
ヒト生殖系列Vセグメントレパートリーは、51個の重鎖V領域、40個のκ軽鎖Vセグメント、および31個のλ軽鎖Vセグメントからなり、合計3,621個の生殖系列V領域対を作出する。加えて、これらのVセグメントの大部分に関して安定な対立遺伝子変種が存在するが、生殖系列レパートリーの構造多様性に対するこれらの変種の寄与は限られている。すべてのヒト生殖系列Vセグメント遺伝子の配列は公知であり、MRC Centre for Protein Engineering、Cambridge, United Kingdomにより提供されるV-baseデータベースにおいてアクセスすることができる(Chothia et al., 1992, J Mol Biol 227:776-798；Tomlinson et al., 1995, EMBO J 14:4628-4638；およびWilliams et al., 1996, J Mol Biol 264:220-232もまた参照されたい)。
【００７３】
本明細書において記載される抗体または抗体断片は、原核生物もしくは真核生物の微生物系において、または哺乳動物細胞などの高等真核生物の細胞内で発現させることができる。
【００７４】
本発明において使用する抗体は、任意の形式であってよい。例えば、いくつかの態様において、抗体は、例えば無傷のIg、Fab、Fab'、F(ab')2のように定常領域、例えばヒト定常領域を含んでよく、または例えばscFvもしくはFvのように無償の免疫グロブリンの断片であってもよい。
【００７５】
II. 重鎖
本発明の抗EphA3抗体の重鎖は、以下のエレメントを含む重鎖V領域を含む：
1) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3を含むヒト重鎖Vセグメント配列
2) アミノ酸配列X1GX2YEX3FDX4を含むCDRH3領域、ここで、X1はSまたはGであり、X2はYまたはVであり、X3はEまたはDであり、かつX4はS、V、またはIであるが、ただしアミノ酸配列はSGYYEDFDSではない；および
3) ヒト生殖系列J遺伝子セグメントによって付与されるFR4。
【００７６】
いくつかの態様において、CDR3は、
を含む。
【００７７】
Vセグメントは典型的には、ヒト生殖系列Vセグメント、例えばヒトVH1サブクラスと少なくとも80％の同一性、または85％、90％、95％、もしくはそれ以上の同一性を有する。したがって、いくつかの態様において、Vセグメントは、生殖系列セグメントVH1 1-02と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％、もしくはそれ以上の同一性を有するヒトVH1 1-02セグメントである。いくつかの態様において、Vセグメントは、VH1 1-02と15残基以下だけ、および好ましくは10残基以下だけ異なる。
【００７８】
いくつかの態様において、本発明の抗体は、生殖系列セグメントVH 1-02と；または図1に示されるVH領域のVセグメントの1つと少なくとも90％の同一性、または少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の同一性を有するVセグメントを含む。
【００７９】
本発明の抗体のFR4配列は、ヒトJH1、JH3、JH4、JH5、もしくはJH6遺伝子生殖系列セグメント、またはヒト生殖系列JHセグメントと比較して高度のアミノ酸配列同一性、例えば少なくとも90％もしくは95％の同一性を有するか、またはヒト生殖系列JHセグメントと比較して3アミノ酸残基以下において、典型的には2アミノ酸残基以下において異なる配列によって提供される。いくつかの態様において、Jセグメントはヒト生殖系列JH6配列に由来し、FR4は配列WGQGTTVTVSSを有する。
【００８０】
いくつかの態様において、VH領域のVセグメントは、図1に示されるCDR1および/またはCDR2を有する。例えば、本発明の抗体は、配列GYWMN、TYWIS、またはSYWINを有するCDR1を有し得る。本発明の抗体は、配列
を有するCDR2を有し得る。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗EphA3抗体は、配列
を有するVH領域CDR3、ならびにCDR1配列GYWMN、TYWIS、またはSYWIN、およびCDR2
を有し得る。
【００８１】
いくつかの態様において、本発明の抗EphA3抗体は、配列SGYYEDFDSを有するVH領域CDR3、ならびに図1に記載されるVH領域のCDR1および/またはCDR2を有し得る。
【００８２】
いくつかの態様において、本発明の抗体のVH領域Vセグメントは、図1に示されるVセグメント配列を有する。
【００８３】
典型的な態様において、本発明の抗体は、図1に記載されるVH領域配列を有する。
【００８４】
III. 軽鎖
本発明の抗EphA3抗体の軽鎖は、以下のエレメントを含む軽鎖V領域を含む：
1) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3を含むヒト軽鎖Vセグメント配列
2) 配列X1X2YX3X4PYTを含む配列CDR3を有するCDRL3領域、ここで、X1はVまたはAであり；X2はQ、R、またはGであり；X3はA、S、またはLであり；かつX4はNまたはKである；および
3) ヒト生殖系列J遺伝子セグメントによって付与されるFR4。
【００８５】
いくつかの態様において、CDR3は配列X1X2YX3X4YPYTを有し、ここで、X1はVであり、X2はQであり、X3はAであり、かつX4はNである。いくつかの態様において、VL CDR3は、
である。
【００８６】
VL領域は、Vλ VセグメントまたはVκ Vセグメントのいずれかを含む。相補的なVH領域と組み合わさって結合を支持するVκ配列の例を、図1に提供する。
【００８７】
Vκセグメントは任意のサブクラスのものであってよく、例えば多くの場合にはVκIサブクラスのものである。いくつかの態様において、セグメントは、ヒト生殖系列VκIと少なくとも80％の配列同一性、例えばヒト生殖系列VκI L15配列と少なくとも80％の同一性を有する。いくつかの態様において、Vκセグメントは、VκI L15と5残基以下だけ異なり得る。他の態様において、本発明の抗体のVL領域Vセグメントは、図1に示されるVL領域のヒトκVセグメント配列と少なくとも85％の同一性、または少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の同一性を有する。
【００８８】
本発明の抗体のVL領域のFR4配列は、ヒト生殖系列Jセグメント、例えばまたはヒト生殖系列Jセグメントと高度のアミノ酸配列同一性を有する配列によって提供される。いくつかの態様において、Jセグメントはヒト生殖系列Jκ2配列であり、抗体のFR4は配列FGQGKLEIKを有する。
【００８９】
いくつかの態様において、VL領域のVセグメントは、図1に示されるCDR1および/またはCDR2を有する。したがって、本発明の抗体は、
のCDR1配列、および/またはCDR2配列
を有し得る。
【００９０】
特定の態様において、本発明の抗EphA3抗体は、図1に記載されるVL領域のVセグメントの1つに示される組み合わせのVL領域CDR1およびCDR2、ならびに
を含むVL領域CDR3配列を有し得る。いくつかの態様において、そのような抗EphA3抗体は、FGQGKLEIKであるVL領域FR4領域を含み得る。したがって、本発明の抗EphA3抗体のVL領域は、例えば、CDR3
；CDR1配列RASQGIISYLA、QASQDISTYLN、RASQEISGYLG、またはRASQSISSYLA；およびCDR2配列
を含み得る。
【００９１】
いくつかの態様において、本発明の抗体のVL領域Vセグメントは、図1に示されるVセグメント配列を有する。
【００９２】
典型的な態様において、本発明の抗体は、図1に記載されるVL領域配列を有する。
【００９３】
いくつかの態様において、本発明の抗体は、SEQ ID NO: l〜10に記載されるVH領域のいずれか1つと共に、SEQ ID NO: 11〜23に記載されるVL領域のいずれか1つを含む。
【００９４】
IV. EphA3抗体の調製
抗体の親和性は、結合活性および親和性を測定するための周知のアッセイ法を用いて評価することができる。そのような技法には、ELISAアッセイ法、および表面プラズモン共鳴法または干渉法を使用する結合測定が含まれる。例えば、ForteBio(Mountain View, CA) Octetバイオサンサーを用いて、バイオレイヤー干渉法により親和性を測定することができる。
【００９５】
本発明の抗体は、典型的には、EphA3への結合に関してmIIIA4と競合する。本明細書に記載される抗体が、EphA3への結合に関してmIIIA4を阻止するかまたはmIIIA4と競合する能力は、該抗体が、EphA3に結合する際にmIIIA4が結合するエピトープと同じエピトープ、または近接した、例えば重複するエピトープに結合することを示す。他の態様において、本明細書に記載される抗体、例えば図1に提供される表に示されるVH領域とVL領域の組み合わせを含む抗体は、別の抗体がEphA3への結合に関して競合するかどうかを評価するための参照抗体として用いることができる。試験抗体は、抗原に対する参照抗体の結合が、該試験抗体の存在下において少なくとも30％、通常は少なくとも約40％、50％、60％、または75％、および多くの場合には少なくとも約90％減少する場合に、参照抗体の結合を競合的に阻害すると見なされる。ELISA法、および免疫ブロットなどの他のアッセイ法を含む多くのアッセイ法を用いて、結合を評価することができる。
【００９６】
典型的な態様において、抗体は活性化抗体である。抗体がEphA3を活性化する活性を保持することを確認するために、抗体を試験することができる。活性は、リン酸化アッセイ法を含むいくつものエンドポイント、またはアポトーシスのような間接的エンドポイントを用いて測定することができる。
【００９７】
ヒト生殖系列配列に近いV領域配列を有する抗体を単離する方法は、以前に記載されている(米国特許出願公開第20050255552号および第20060134098号)。抗体ライブラリーを、哺乳動物細胞、酵母細胞、または原核細胞を含む適切な宿主細胞で発現させることができる。いくつかの細胞系における発現に関しては、細胞外培地への分泌を指示するために、シグナルペプチドをN末端に導入することができる。抗体は、シグナルペプチドと共に、またはシグナルペプチドを伴わずに大腸菌(E. coli)などの細菌細胞から分泌させることができる。大腸菌から抗体断片をシグナルなしで分泌させる方法は、米国特許出願第20070020685号に記載されている。
【００９８】
EphA3結合抗体を作製するには、例えば図1に示される本発明のVH領域の1つを、例えば図1に示される本発明のVL領域の1つと組み合わせ、適切な発現系においていくつかの形式のいずれかで発現させる。したがって、抗体は、原核または真核宿主細胞において、宿主細胞内かまたは分泌によるかのいずれかで、scFv、Fab、Fab'(免疫グロブリンヒンジ配列を含む)、F(ab')2(2つのFab'分子のヒンジ配列間のジスルフィド結合形成によって形成される)、全免疫グロブリン、もしくは切断型免疫グロブリンとして、または融合タンパク質として発現させることができる。例えばシグナルなしの発現系で産生されるポリペプチドのN末端には、メチオニン残基が任意に存在してよい。本明細書に記載されるVH領域はそれぞれ、VL領域の各々と対を形成して、抗EphA3抗体を生じ得る。
【００９９】
抗体は、原核生物発現系および真核生物発現系の両方を含むいくつもの発現系を用いて産生させることができる。いくつかの態様において、発現系は、CHO細胞発現系などの哺乳動物細胞発現である。多くのそのような系は、商業的供給者から広く入手可能である。抗体がVH領域およびVL領域の両方を含む態様において、VH領域およびVL領域は、単一のベクターを用いて、例えばジシストロニック発現単位で、または異なるプロモーターの制御下で発現させてもよい。他の態様において、VH領域およびVL領域は、個別のベクターを用いて発現させてもよい。本明細書において記載されるVH領域またはVL領域は、任意にN末端にメチオニンを含んでよい。
【０１００】
本発明の抗体は、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、またはdABを含むいくつもの形式で産生させることができる。本発明の抗体はまた、ヒト定常領域を含み得る。軽鎖の定常領域は、ヒトのκ定常領域またはλ定常領域であってよい。重鎖定常領域は、多くの場合にはγ鎖定常領域、例えばγ-1、γ-2、γ-3、またはγ-4定常領域である。他の態様において、抗体はIgAまたはIgMであってよい。
【０１０１】
本発明のいくつかの態様では、抗体VL領域、例えば図1に記載されるVL領域をヒトκ定常領域(例えば、SEQ ID NO:25)と組み合わせて、完全な軽鎖を形成させる。
【０１０２】
本発明のいくつかの態様では、VH領域をヒトγ-1定常領域と組み合わせる。任意の適切なγ-1アロタイプを選択することができる。したがって、いくつかの態様において、抗体は、図1に記載されるVH領域配列より選択されるVHを有する、定常領域、例えばSEQ ID NO:24を有するIgGである。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載されるVL領域配列より選択されるVLを有する。特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO:25に記載されるκ定常領域、およびSEQ ID NO:24に記載される重鎖定常領域を有し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、図1に記載される配列からの以下の組み合わせの1つを含む。
【０１０３】
例えば抗体が断片であるいくつかの態様では、インビボにおける半減期の延長を提供するために、抗体を別の分子、例えばポリエチレングリコール(ペグ化)または血清アルブミンに結合することができる。抗体断片のペグ化の例は、Knight et al. Platelets 15:409, 2004(アブシキシマブに関する)；Pedley et al., Br. J. Cancer 70:1126, 1994(抗CEA抗体に関する)；Chapman et al., Nature Biotech. 17:780, 1999；およびHumphreys, et al., Protein Eng. Des. 20: 227,2007において提供される)。
【０１０４】
いくつかの態様において、本発明の抗体はFab'または(Fab')2の形態である。
【０１０５】
全長軽鎖は、VL領域をヒトκ定常領域またはヒトλ定常領域に融合させることによって作製される。いずれの定常領域を任意の軽鎖に対して用いてもよいが、典型的な態様では、κ定常領域はVκ可変領域と組み合わせて用いられ、λ定常領域はVλ可変領域と共に用いられる。
【０１０６】
Fab'の重鎖は、本発明のVH領域の、ヒト重鎖定常領域配列、第1定常(CH1)ドメインおよびヒンジ領域への融合によって作製されたFd'断片である。重鎖定常領域配列は、免疫グロブリンクラスのいずれにも由来し得るが、多くの場合にはIgGに由来し、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4に由来してよい。本発明のFab'抗体はハイブリッド配列であってもよく、例えばヒンジ配列はある免疫グロブリンサブクラスに由来してよく、CH1ドメインは異なるサブクラスに由来してもよい。
【０１０７】
本発明において使用する抗体は多くの形式であってよい。いくつかの態様において、抗体は、Fc領域、例えばヒトFc領域を含み得る。例えば、このような抗体には、EphA3と結合し、かつ活性アイソタイプを有するIgG抗体が含まれる。いくつかの態様において、抗体は、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、または単一ドメイン抗体(「dAb」)などの、抗体の活性断片(例えば、これはEphA3を二量体化し得る)または誘導体であってよい。例えば、いくつかの態様において、抗体はF(ab')2であってよい。本発明において使用することができる抗体の他の例示的な態様には、活性化ナノボディまたは活性化ラクダ科動物抗体が含まれる。このような抗体はさらに、当業者に周知の方法によって組換えにより改変することができる。上記のように、このような抗体は公知の技法を用いて生成することができる。当業者によって理解されるように、抗体が一価であり得る形式、例えばFvまたはFab形式であるいくつかの態様では、該抗体を三価または四価抗体などの多価抗体として使用してもよい。多価抗体を作製する方法は公知である(例えば、King et al., Cancer Res. 54:6176-6185, 1994を参照されたい)。
【０１０８】
多くの態様において、本発明において使用するための抗体は、例えば免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に結合するといったエフェクター機能を有するFc定常領域を有する。例示的な「エフェクター機能」には、C1q結合；補体依存性細胞傷害；Fc受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)；食作用；細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)の下方制御等が含まれる。このようなエフェクター機能は一般に、Fc領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、公知のアッセイ法を用いて評価することができる(例えば、以下に引用する参考文献を参照されたい)。
【０１０９】
活性アイソタイプを有し、マクロファージ、単球、好中球、およびNK細胞などのエフェクター細胞上のFc受容体に結合する抗EphA3抗体は、ADCCによる細胞死を誘導し得る。
【０１１０】
Fc領域は、天然IgG1、またはIgG3、IgM、IgA、およびIgEを含むその他の活性アイソタイプに由来し得る。「活性アイソタイプ」には、Fc領域が、Fc受容体に対する結合を増大させるため、またはさもなくば抗体の効力を向上させるための修飾を含む抗体が含まれる。このようなFc定常領域は、Fc受容体に対する結合を増大させる変異、そのように増大させるグリコシル化レベルに対する変化等のような修飾を含み得る。Fc領域を修飾する多くの方法が当技術分野で公知である。例えば、米国特許出願公開第20060039904号は、1つまたは複数のFcリガンド(例えば、FcγR、C1q)に対する結合親和性の修飾を含む、エフェクター機能が強化されたFc受容体の変種を記載している。さらに、このようなFc変種は、変化した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害(CDC)活性を有する。その他のFc変種には、Ghetie et al., Nat Biotech. 15:637-40, 1997；Duncan et al, Nature 332:563-564, 1988；Lund et al., J. Immunol 147:2657-2662, 1991；Lund et al, Mol Immunol 29:53-59, 1992；Alegre et al, Transplantation 57:1537-1543, 1994；Hutchins et al., Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984, 1995；Jefferis et al, Immunol Lett. 44:111-117, 1995；Lund et al., FASEB J 9:115-119, 1995；Jefferis et al, Immunol Lett 54:101-104, 1996；Lund et al, J Immunol 157:4963-4969, 1996；Armour et al., Eur J Immunol 29:2613-2624, 1999；Idusogie et al, J Immunol 164:4178-4184, 200；Reddy et al, J Immunol 164:1925-1933, 2000；Xu et al., Cell Immunol 200:16-26, 2000；Idusogie et al, J Immunol 166:2571-2575, 2001；Shields et al., J Biol Chem 276:6591-6604, 2001；Jefferis et al, Immunol Lett 82:57-65. 2002；Presta et al., Biochem Soc Trans 30:487-490, 2002；Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005-4010, 2006；米国特許第5,624,821号；第5,885,573号；第5,677,425号；第6,165,745号；第6,277,375号；第5,869,046号；第6,121,022号；第5,624,821号；第5,648,260号；第6,194,551号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,277,375号；第7,335,742号；および第7,317,091号；ならびにPCT公開WO 94/2935；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 02/060919、およびWO 04/029207によって開示されているものが含まれる。
【０１１１】
グリコシル化は、炭水化物(糖質)が酵素的に高分子に結合してグリカンを生じる、翻訳後修飾の1つの形態である。本発明との関連において、炭水化物は典型的には、1つまたは複数のN結合(アスパラギンまたはアルギニン側鎖の窒素を介する)により、抗体Fc領域に付着する；しかしながら、O結合(セリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシリジン、またはヒロドキシプロリン側鎖のヒドロキシ酸素を介する)もまた可能である。一般的に、IgG抗体は、CH2ドメイン内の残基Asn297において保存されたN結合型グリコシル化部位を有し、例えばある種のIgDおよびIgAといったいくつかのクラスおよびサブクラスはまた、多くの場合にヒンジ領域内にO結合型糖質を有する。糖質は典型的には、複合高マンノース型分岐糖である；N結合の場合、アミノ酸側鎖窒素に直接付着する糖質は、典型的にはN-アセチルグルコサミンである。
【０１１２】
いくつかの態様では、Fc領域のグリコシル化を修飾することができる。例えば、修飾は、例えば抗体配列内の1つまたは複数のグリコシル化部位を変更することによる無グリコシル化であってよい。このようなアプローチは、米国特許第5,714,350号および第6,350,861号においてさらに詳述されている。また、フコシル残基の量が減少した低フコシル化Fc変種、またはフコシル残基を欠いている無フコシル化Fc変種、または二分岐GlcNAc構造が増加したFc変種など、グリコシル化の型が変化したFc領域を作製することもできる。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成することができる。ラット骨髄腫細胞ならびに酵母および植物を含む、グリコシル化機構が変化した細胞は当技術分野において記載されており、これを宿主細胞として使用し、そこで本発明の組換え抗体を発現させて、グリコシル化が変化した抗体を産生させることができる。10倍のADCCをもたらす二分岐GlcNacについて記載している、Umana et al, Nat. Biotechnol 17:176-180, 1999。Umanaは、そのような二分岐分子がフコシル化の低下をもたらすことを指摘している。Davies, et al., Biotechnol. Bioeng. 74:288-294, 2001は、抗CD20抗体のADCCの増加をもたらす、酵素β1-4-NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII)(二分岐GlcNac構造を引き起こす)が挿入されたCHO細胞について記載している。米国特許(Umana)第6,602,684号は、二分岐GlcNac糖タンパク質を産生するように改変された細胞について記載している。
【０１１３】
抗体調製物のフコシル化を減少させる方法の例は、Shields et al, J Biol Chem 277:26733-26740, 2002において提供され、これはIgG1を産生させるためのフコシル化が欠損したCHO細胞(Lec13)について記載しており、さらにヒトFcγRIIIAに対するフコース欠損IgG1の結合が50倍まで向上し、ADCCが増加したことを記載している。加えて、Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003は、YB2/0細胞とCHO細胞で産生されたIgGを比較している。YB2/0細胞ではフコシル化が減少し、二分岐GlcNac含量が増加した。Niwa et al., Clinc. Cancer Res. 1-:6248-6255, 2004は、抗CD20抗体をYB2/0細胞で作製された抗体(低フコシル化)と比較し、後者におけるADCCの増強を観察した。無フコシル化抗体を生成する技法の例は、例えば、Kanda et al, Glycobiology 17:104-118, 2006に記載されている。米国特許第6,946,292号(Kanda)は、無フコシル化抗体を産生させるためのフコシルトランスフェラーゼノックアウト細胞について記載している。米国特許第7,214,775号およびWO 00/61739は、抗体の100％が無フコシル化されている抗体調製物について記載している。
【０１１４】
グリコシル化を修飾するための他の技法もまた公知である。例えば、米国特許出願公開第20070248600号；第20070178551号(改変された下等真核細胞(酵母)を使用して「ヒト」グリコシル化構造をもたらすGlycoFi技術方法)；第20080060092号(改変された植物を使用して「ヒト」グリコシル化構造をもたらすBiolex技術方法)；第20060253928号(同様に、「ヒト」抗体を産生させるための植物の改変について記載している)を参照されたい。
【０１１５】
フコースを減少させるためのさらなる技法には、ProBioGen技術(von Horsten et al., Glycobiology, (advance access publication July 23, 2010)；Potelligent(商標)技術(Biowa, Inc. Princeton, N.J.)；およびGlycoMAb(商標)グリコシル化改変技術(GLYCART biotechnology AG、Zurich, Switzerland)が含まれる。
【０１１６】
抗体のN結合型オリゴ糖含量は、当技術分野で公知の方法により解析することができる。以下はそのような方法の一例である：抗体を、酵素N-グリコシダーゼF(Roche；TaKaRa)による消化に供する。放出された炭水化物を、陽イオンモードでマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)によって解析する(Papac et al., Glycobiol. 8: 445-454, 1998)。次に、単糖組成を、改良高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)により特徴づける(Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473, 2003)。
【０１１７】
本発明のいくつかの態様では、例えば抗体が反復投与に適するように、抗体をさらに改変して免疫原性を低減させる。免疫原性が低減された抗体を作製する方法には、ヒト化およびhumaneer化手順、ならびに例えば1つまたは複数のフレームワーク領域において抗体をさら改変して、T細胞エピトープを除去する脱免疫化などの修飾技法が含まれる。
【０１１８】
いくつかの態様では、抗体を、EphA3発現細胞、例えば血管原性骨髄前駆細胞の表面上に存在するEphA3を活性化し得るか、またはADCCによりそのような細胞を死滅させ得る形態で使用する。したがって、いくつかの態様において、抗体は二量体である。他の態様において、抗体は、活性アイソタイプを有する単量体型であってよい。いくつかの態様において、抗体は、EphA3を架橋し得る多価型、例えば三価または四価型である。
【０１１９】
V. EphA3が標的である疾患を治療するための抗EphA3抗体の投与
本発明はまた、EphA3発現細胞を死滅させることが望ましい疾患を有する患者を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、そのような疾患は新生物疾患であってよい。したがって、1つの局面において、本発明は、本発明の抗体を用いて新生物疾患を治療する方法であって、腫瘍の成長を阻害するために、本発明の抗EphA3抗体を患者(腫瘍を有する)に投与する段階を含む方法を提供する。治療することができる腫瘍には、乳房、肺、結腸、胃、肝臓、腎臓、卵巣、食道、および前立腺、ならびにその他の腫瘍が含まれる。したがって、本発明の抗体を用いて治療される固形腫瘍は、乳癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巣癌、外陰部癌、腎癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、絨毛癌、頭頸部癌、上咽頭癌、咽頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、膵癌、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経鞘腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、線維肉腫を含む肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、およびウィルムス腫瘍であってよい。母斑症に付随する異常な血管増殖、および浮腫(脳腫瘍に付随するものなど)もまた、本発明の抗体を用いて治療することができる。
【０１２０】
いくつかの態様では、抗EphA3抗体を、腫瘍細胞の表面上にEphA3を発現する患者に投与する。いくつかの態様では、抗EphA3抗体を、腫瘍内の血管の内皮上にEphA3を発現する患者に投与する。いくつかの態様において、患者は、腫瘍細胞表面および内皮の両方においてEphA3を発現し得る。いくつかの態様において、抗体は、例えばWO/2008/112192に記載される形式である。
【０１２１】
いくつかの態様では、本発明の抗体を用いて非新生物状態を治療する。非新生物状態は、望ましくないまたは異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム性動脈硬化プラーク、心筋梗塞からの浮腫、糖尿病性および他の増殖性網膜症、後水晶体線維増殖症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶反応、網膜/脈絡膜血管新生、隅角の血管新生(ルベオーシス)、眼性血管新生疾患、血管再狭窄、動静脈奇形(AVM)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺過形成(グレーブス病を含む)、角膜および他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性肺滲出、脳浮腫(例えば、急性脳卒中/閉鎖性頭部損傷/外傷に付随)、滑液炎、RAにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、変形性関節症(OA)、難治性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、第3腔の体液疾患(膵炎、区画症候群、熱傷、腸疾患)、子宮筋腫、早産、IBD(クローン病および潰瘍性大腸炎)などの慢性炎症、腎同種移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくないまたは異常な組織塊成長(非癌)、肥満症、脂肪組織量増殖、血友病関節、肥厚性瘢痕、発毛の阻害、オスラー・ウェーバー症候群、化膿肉芽腫 後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心膜液貯留、ならびに胸水からなる群より選択される。
【０１２２】
いくつかの態様では、本発明の抗体を、骨髄増殖性疾患に罹患している患者に投与する。いくつかの態様において、骨髄増殖性疾患は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、真性赤血球増加症(PV)、本態性血小板血症(ET)、または特発性骨髄線維症(IM)である。いくつかの態様では、患者由来の白血病幹細胞がEphA3を発現する慢性骨髄性白血病を有する患者を治療するために、本発明の抗EphA3抗体を1つまたは複数の付加的な治療薬と併用することができる。そのような治療薬には、様々な化学療法薬およびメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))が含まれる。
【０１２３】
抗体は、単独で、または関心対象の疾患を治療するための他の治療法と併用して投与することができる。いくつかの態様では、抗EphA3抗体をBv8アンタゴニスト、例えばBv8抗体アンタゴニストと併用して投与する。Bv8アンタゴニストは公知である(例えば、WO 2009039337、およびその中で引用されているBv8アンタゴニストに関する参考文献を参照されたい)。例えば、Bv8アンタゴニストには、天然配列Bv8ポリペプチドまたは天然配列Bv8受容体(PKR-I/EG-VEGFR1またはPKR-2/EG-VEGFR2)ポリペプチドに特異的に結合する抗体および抗体断片が含まれる。いくつかの態様では、患者をまた、例えば抗VEGF抗体アンタゴニストのようなVEGFアンタゴニストを含む付加的な治療薬、および他の治療薬で治療してもよく、それらの例をさらに以下に記載する。
【０１２４】
いくつかの態様では、抗EphA3抗体を、例えば抗VEGF抗体アンタゴニストのようなVEGFアンタゴニストによる治療を以前に受けたことがある患者に投与する。いくつかの態様において、腫瘍はVEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性であってよい。いくつかの態様では、抗EphA3抗体を、早期腫瘍、例えば病期I、病期II、または病期III腫瘍を有する患者に投与する。
【０１２５】
本明細書で使用する、例えばVEGF抗体アンタゴニストのようなVEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性であると見なされるか、またはVEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性である腫瘍を有する患者とは、治療法には反応するが副作用に苦しむ、耐性を生じる、治療法に反応しない、治療法に満足のいくように反応しない等の患者を指す。したがって、そのような患者またはそのような患者の腫瘍では、腫瘍細胞の数は有意に減少していないかもしくは増加しており、または腫瘍サイズは有意に減少していないかもしくは増加しており、または癌細胞のサイズもしくは数がさらに減少することはない。患者が治療に対して抵抗性であることの判定は、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当技術分野で公知の任意の方法により、インビボまたはインビトロのいずれかで行うことができる。同様に、本発明との関連における、例えばVEGF抗体のようなVEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性である非新生物状態を有する患者とは、VEGFアンタゴニストによる治療に満足のいくように反応しない患者、例えば副作用に苦しむ、耐性を生じる、またはその状態の治療指標の軽減を示さない患者を指す。
【０１２６】
本発明の方法は、疾患の治療に適した投与計画を用いて、抗EphA3抗体を薬学的組成物として治療有効量で患者に投与する段階を含む。様々な薬物送達系において使用するために、組成物を製剤化することができる。適切な製剤化のために、生理的に許容される1つまたは複数の賦形剤または担体を組成物中に含めることもできる。本発明において使用するのに適した製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins, 2005に見出される。
【０１２７】
抗EphA3抗体は、注射用滅菌等張水溶液などの、患者への注射に適した溶液として提供する。抗体を、許容される担体に適切な濃度で溶解または懸濁する。いくつかの態様において、担体は水性であり、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等である。組成物は、pH調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤等のような、おおよその生理的状態に必要とされる補助的な薬学的物質を含み得る。
【０１２８】
本発明の薬学的組成物は、疾患または疾患およびその合併症の症状を治癒するかまたは少なくとも部分的に止めるのに十分な量で、患者、例えば腫瘍または非新生物状態を有する患者に投与する。これを達成するのに適した量を「治療有効量」と定義する。治療有効量は、治療法に対する患者の反応をモニターすることにより決定する。治療有効量を示す典型的な基準には、患者における疾患の症状の改善が含まれる。この使用のために有効な量は、年齢、体重、性別、投与経路等の他の要因を含め、疾患の重症度および患者の健康の全般的状態に依存する。患者により必要とされかつ許容される投与量および頻度に応じて、抗体の単回投与または複数回投与を施行することができる。いずれにせよ、本方法は、患者を効果的に治療するために十分量の抗EphA3抗体を提供する。
【０１２９】
抗体は、これらに限定されないが、静脈内、皮下、筋肉内、または腹腔内経路を含む任意の適切な経路を介した注射または注入によって投与することができる。いくつかの態様において、抗体は吹送によって投与してもよい。例示的な態様において、抗体は、4℃の注射用滅菌等張生理食塩水溶液中に10 mg/mlで保存することができ、患者に投与する前に、注射用0.9％塩化ナトリウム100 mlまたは200 mlのいずれかで希釈する。抗体は、0.2〜10 mg/kgの用量で1時間かけて静脈内注入により投与する。他の態様において、抗体は15分〜2時間かけて静脈内注入により投与する。さらなる他の態様では、投与手順は皮下ボーラス注射による。
【０１３０】
抗体の用量は、患者に効果的な治療を提供するように選択され、0.1 mg未満/kg体重〜約25 mg/kg体重の範囲、または1 mg〜2 g/患者の範囲である。好ましくは、用量は、1〜10 mg/kgまたはおよそ50 mg〜1000 mg/患者の範囲である。用量は、抗体の薬物動態(例えば、循環中の抗体の半減期)および薬力学的反応(例えば、抗体の治療効果の持続)に応じて、1日に1回〜3ヵ月ごとに1回の範囲であり得る適切な頻度で繰り返すことができる。いくつかの態様では、約7日〜約25日のインビボ半減期および抗体の投薬を1週間に1回〜3ヵ月ごとに1回繰り返す。他の態様では、抗体を1ヵ月におよそ1回投与する。
【０１３１】
本発明のVH領域および/またはVL領域はまた、診断の目的で用いることもできる。例えば、VH領域および/またはVL領域を、患者由来の細胞におけるEphA3レベルの検出など、臨床解析のために用いることができる。本発明のVH領域またはVL領域はまた、例えば抗Id抗体を産生させるために用いることもできる。
【実施例】
【０１３２】
方法論
マウスV領域のサブクローニング
マウスモノクローナルmIIIA4由来のV領域DNAは、Dr. Martin Lackmann(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University、Victoria, Australia)により提供された。PCRを用いて、V重鎖領域およびVκ領域のV遺伝子を増幅し、所望のベクターにクローニングするのに適した制限酵素部位を組み込んだ。V領域はFab断片としてクローニングし、大腸菌内で発現させた。このFabをEphA3-Fc抗原結合について試験したが、このFabをこれらの実施例において参照配列FA4と称する。
【０１３３】
抗体精製
Fab断片を大腸菌から分泌により発現させた。細胞を2×YT培地中でOD600が0.6になるまで培養した。IPTGを用いて、発現を33℃で3時間誘導した。構築されたFabをペリプラズム画分から取得し、標準的な方法に従って、連鎖球菌プロテインGを使用するアフィニティークロマトグラフィー(HiTrapプロテインG HPカラム；GE Healthcare)により精製した。FabをpH 2.0緩衝液で溶出し、ただちにこれをpH 7.0に調整して、PBS pH 7.4(PBSはカルシウムおよびマグネシウムを含まない)に対して透析した。
【０１３４】
ELISA
典型的には、抗原50 ngを、4℃で一晩インキュベートすることにより96ウェルマイクロタイタープレートに結合させた。プレートを、5％ミルクのPBS溶液で33℃で1時間ブロッキングした。それぞれHumaneered Fabまたは最適化参照Fab FA106を発現する大腸菌からの誘導培地(50μl)を、各ウェルに添加した。33℃で１時間インキュベートした後、プレートをPBS＋0.1％ Tween 20(PBST)で3回リンスし、抗ヒトκ鎖HRPコンジュゲート(Sigma；PBSTで0.1 ng/mlに希釈) 50μlを各ウェルに添加し、プレートを33℃で40分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回およびPBSで1回洗浄した。基質3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(TMB)(Sigma) 100μlを各ウェルに添加し、プレートを室温で〜5分間インキュベートした。反応を停止させるため、0.2 N H2SO4 100μlを各ウェルに添加した。反応物を分光光度法により450 nmで読み取った。
【０１３５】
Ephファミリーメンバーに対する結合を検出するため、組換えヒトEph細胞外(ec)ドメインをR&D Systems Incから入手した：EphA1-Fc融合タンパク質、EphA2 ecドメイン、EphA5 ecドメイン、EphB4 ecドメイン、およびEphB6-Fc融合タンパク質。ELISAウェルを、Ephタンパク質100 ngで37℃で1時間コーティングした。PBSTで1度洗浄した後、ウェルをPBST中の5％ミルクで37℃で1時間ブロッキングした。ウェルを1度洗浄し、2倍希釈系列の候補humaneered抗体を、コーティングされたEphタンパク質の各セットに添加した。1時間後、ウェルをPBSTで3回洗浄し、抗ヒトκ鎖HRPコンジュゲート(Sigma；PBSTで0.1 ng/mlに希釈) 50μlを各ウェルに添加した。プレートを45分間インキュベートし、PBSTで3回洗浄し、PBSで1回洗浄し、TMB 100μlを各ウェルに添加した。0.2 N H2SO4を添加することにより反応を停止させ、450 nmにおける吸光度により結合を測定した。
【０１３６】
コロニーリフト結合アッセイ(CLBA)
Fab断片のHumaneeredライブラリーのスクリーニングは、抗原コーティングしたニトロセルロースフィルターを用いて、記載されている通りに実施した(米国特許出願公開第20050255552号および第20060134098号)。
【０１３７】
親和性測定
Fab断片の結合動態は、Biosensor Tools Incにおいて表面プラズモン共鳴解析(spr；Biacore T100)を用いて解析した。親和性は、3つの異なるFab濃度で測定された会合定数および解離定数から算出した。
【０１３８】
IgGの構築
ヒトIgG1定常領域および元のマウスIIIA4抗体に由来する可変領域を含むように、キメラIIIA4 IgGを構築した。PCRを用いて、Martin Lackmannによって提供されたマウスIIIA4 DNAから重鎖および軽鎖を増幅し、またクローニング用の制限部位も組み込んだ。重鎖可変領域を、UCOE配列の下流に位置するCMVプロモーターから発現される完全なIgG1重鎖を発現するベクターにクローニングした。このプラスミドは、哺乳動物細胞における選択用のNeo遺伝子、および大腸菌におけるプラスミド産生用のAmp遺伝子を含む。同様に、軽鎖可変領域を、UCOE配列の下流のCMVプロモーターから発現されるヒトκ軽鎖定常領域を発現するベクターにクローニングした。このプラスミドは、哺乳動物細胞におけるハイグロマイシン選択用の遺伝子、および大腸菌における産生用のAmp遺伝子を含む。改変抗体IgG重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターは、可変領域のDNAが上記の大腸菌発現ベクターから得られ、重鎖発現ベクターがネオマイシンの代わりにピューロマイシン耐性遺伝子を含むことを除いて、同様に構築した。Humaneered抗体IgGおよびキメラIIIA4 IgGは、Fugene 6試薬(Promega)を用いて重鎖構築物と軽鎖構築物を同時トランスフェクトすることにより、改良CHO細胞株において発現させた。
【０１３９】
フローサイトメトリー
典型的には、SKmel28、LnCAP、およびB16-F10の細胞3×106個を、3000 rpmで3分間の遠心分離により回収した。培地を除去し、細胞をPBS中の2％ BSAで4℃で30分間ブロッキングした後、10μg/mlラットIgGで4℃で30分間にわたり2回目のブロッキングを行った。細胞をペレット化し、PBS 1.5 mlに再懸濁し、500μlの一定分量に分割した。各分割量を個別に、5μg/mlの対照IgG、humaneered IgG、またはキメラIIIA4 IgGで4℃で45分間プロービングした。試料をPBSで1度洗浄し、抗ヒトIgG-フィコエリトリンコンジュゲートを添加した。45分後、細胞を1度洗浄し、PBSで再懸濁し、FACS Caliberフローサイトメトリーを用いてフローサイトメトリーにより解析した。解析の直前にヨウ化プロピジウムを添加して、死細胞を排除した。
【０１４０】
実施例1. 改変ヒト抗EphA3抗体の同定
マウスおよび参照のV領域アミノ酸配列
マウス(mIIIA4)および参照(FA4)のV領域配列を以下に示す。CDR配列を下線で示す。
mIIIA4およびFA4のVh：
mIIIA4およびFA4のVk：
【０１４１】
Fab FA4は、ヒト定常領域に融合された、mIIIA4由来の無傷のマウスV領域を有し、大腸菌から精製された。抗原に結合するFab断片の希釈ELISAは、抗体濃度に依存する結合曲線を生じた。
【０１４２】
参照Fab(FA4)に加えて、最適化参照Fab(FA106)を構築した。最適化参照Fab FA106では、FA4内のいくつかのフレームワークアミノ酸残基をヒト生殖系列に変更した。最適化参照FabのV領域配列を以下に提供する。ヒト生殖系列に変更した残基を太字フォントで示す。CDR配列を下線で示す。
FA106 Vh：
FA106 Vk：
【０１４３】
ライブラリー構築およびV領域カセット
エピトープに焦点を当てたライブラリーを、BSDおよびヒト生殖細胞系列Jセグメント配列を含む固有のCDR3-FR4領域に連結されたヒトVセグメントライブラリー配列から構築した。「全長」Vh(Vh1およびVh5)ライブラリーおよび「全長」Vk(VkI)ライブラリーを、マウスVセグメントの一部のみが最初にヒト配列のライブラリーで置換された「カセット」ライブラリーを構築するための基礎として使用した。Vh鎖およびVk鎖の両方について、いくつかの種類のカセット「ライブラリー」を構築した。V重鎖およびVκ鎖のためのカセットを、フレームワーク2領域内の重複共通配列を用いてブリッジPCRにより作製した。このようにして、「前端部」ヒトカセットライブラリーをヒトVh1およびVh5サブクラスの両方について構築し、「中央部」ヒトカセットライブラリーをヒトVh1について構築した。「前端部」および「中央部」カセットライブラリーをVkIサブクラスについて構築した。
【０１４４】
加えて、Vh CDR2-FR3からなるカセットライブラリーを構築した。模式図を図2に示す。参照CDR2の最初の4残基(枠で囲んである)は、5' PCRプライマーによってコードされた。また、mIIIA4 CDR2およびヒト生殖系列Vh1-58 CDR2における下線のアミノ酸残基は、フォワードプライマー中の対の組み合わせにおいて変化をもたせた(線の上下のアミノ酸残基によって示す)。3' PCRプライマーは、ヒト生殖系列Vh1 FR3に相補的である。これらのプライマーを用いて増幅を行い、改変されたCDR2ライブラリーに対してHu Vh1 FR3ライブラリー(脾臓mRNAに由来)を付加した。連続したブリッジPCR反応を用いて、「前端部」カセットとCDR3-FR4カセットを付着させて、機能的なV領域を構築した。
【０１４５】
抗原への結合を支持するヒトVhカセットまたはVkカセットを、コロニーリフト結合アッセイにより同定し、ELISAによる親和性に従って順位を決定した。V重鎖のスクリーニングにより、EphA3-Fc組換え融合タンパク質抗原結合を支持する「前端部」、「中央部」、およびCDR2/FR3カセットが同定された。Vκのスクリーニングにより、抗原結合を支持する「前端部」および「中央部」カセットが同定された。各鎖の機能的カセットを組み換えて、抗原と結合する完全に改変された高親和性Fabを構築した。
【０１４６】
高親和性の改変Fabのプールを同定した後、CDR3親和性成熟ライブラリーを構築した。一連の改変Fabクローンの共通CDR3 BSD配列を、縮重PCRプライマーを用いて変異させて、ライブラリーを作製した。これらの変異誘発ライブラリーを、コロニーリフト結合アッセイ法およびELISAアッセイ法を用いてスクリーニングした。選択されたFabを、ELISAによる親和性について順位付けした。FA106 Fabと比較した場合に同様のまたは改善された抗原親和性を支持する変異を同定した。抗原結合を支持するまたは改善する重鎖および軽鎖CDR3変異は、各CDRのBSD領域を規定するのに役立つ。
【０１４７】
参照FabとHumaneered Fabの配列アライメント
マウス参照Fabと2つの改変Fabのアミノ酸配列のアライメントしたVセグメントを、最も近い単一のヒト生殖系列V遺伝子、Vh1-02またはVkI L15と比較した。humaneered Fab Vh領域のFR4はヒト生殖系列JH6に由来し、配列WGQGTTVTVSSを有する。humaneered Fab Vk領域のFR4はヒト生殖系列Jk2に由来し、配列FGQGKLEIKを有する。
【０１４８】
改変FabのVh領域およびVk領域はそれぞれ、ヒト生殖系列アミノ酸配列と高い相同性を有する。例示的な相同性を表1に示す。
【０１４９】
（表１）2つの改変V領域のヒト生殖系列配列との同一性の割合：割合はいずれも、V領域にわたる単一のヒト生殖系列配列との同一性を示し、CDR3 BSD配列は除外する
【０１５０】
実施例2. 改変抗体の結合動態
改変Fabをコロニーリフト結合アッセイから単離し、抗原結合ELISAによって親和性を確認した。抗原結合ELISAにおいて強力な陽性シグナルを有する改変Fabクローンを精製し、最適化参照Fab FA106との動態比較によりさらに特徴づけした。
【０１５１】
2つの改変Fabおよび参照Fab FA106の結合動態を、Biacoreを用いて解析した。3つのFabを出発濃度500 nMから100 nMまで希釈し、0.005％ Tween-20および0.1 mg/ml BSAを含むPBS、pH 7.4を用いて3倍希釈系列でさらに試験した。5つの濃度をそれぞれ、3つの異なる密度表面で3回試験した。アッセイは25℃で行った。各表面からの反応データを、1：1相互作用モデルに適合させた。算出された会合定数および解離定数を表2に示す。改変Fabクローン1および2ならびに参照クローンFA106の動態解析はいずれも、抗原に対する低ナノモルの親和性を示した。
【０１５２】
（表２）25℃で測定したHumaneered Fab結合定数
括弧内の数字は、3つの異なる密度表面からのデータに基づいて最終報告された数字における標準誤差を示す。左欄の「低度」、「中度」、および「高度」という用語は、チップ密度を指す。
【０１５３】
Humaneered Fab1を哺乳動物細胞においてIgGとして発現させ、培養上清から精製した。一価結合親和性を解析するために、パパイン消化によりFab断片を作製した。ヒトおよびマウスEphA3-Fcに対するFabの結合を、ストレプトアビジンチップ上に捕捉されたビオチン化EphA3変種を用いてBiacore 3000で測定した。FabをHBSPランニング緩衝液で、50 nMから0.62 nMまで3倍希釈で希釈した。結果は、空の参照セルおよび複数回のHBSP緩衝液注入で二重にブランク処理した。1：1相互作用を仮定して、Biacoreデータの全体的適合解析を行った。結合動態パラメータを表3に示す。データから、哺乳動物細胞から産生されたHumaneered Fab1が、ヒトEphA3およびマウスEphA3の両方に高い親和性で結合することが示される。
【０１５４】
（表３）匹敵する親和性でヒトEphA3およびマウスEphA3と結合する改変Fab1
固定化されたマウスおよびヒトEphA3-Fc融合タンパク質に対するFab1の結合を、Biacore 3000装置を用いる表面プラズモン共鳴解析および全体的適合解析により解析した。ka＝会合定数；kd＝解離定数；KD＝総親和性。
【０１５５】
結合および特異性
全長抗体(IgG1κ)を構築し、CHO細胞から発現させ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ELISAプレートをEphA3-Fcでコーティングし、cIIIA4 IgG、例示的な改変IgG、および対照IgG1の結合を比較した(図3)。このアッセイにおけるEC50は、元のキメラ抗体よりも改変IgGでおよそ3倍低かった。
【０１５６】
EphA3は、エフリンリガンドと結合するEph受容体ファミリーのメンバーである。このファミリーの最も相同的なメンバーはEphA受容体であり、その細胞外ドメインはEphA3との配列同一性が39％〜62％の間で異なる。
【０１５７】
例示的な改変IgGの特異性を確認するため、3つのEphAタンパク質および2つのより遠縁のEphBタンパク質に対して結合を評価した(図4を参照されたい)。EphA5はEphA3との相同性が61％であり、EphA3と最も相同的なファミリーメンバーの1つである。改変抗体はEphA3と特異的に結合した；EphA1、EphA2、またはEphA5に対して、結合は認められなかった。試験した2つのEphB受容体(EphB4およびEphB6)のいずれに対しても、検出可能な結合は認められなかった。
【０１５８】
例示的な改変抗体を、生細胞の表面上に発現したEphA3に対する結合についても試験した。EphA3を発現することが知られている3つの腫瘍細胞株を使用した:マウス黒色腫(B16)、ヒト黒色腫(SKmel28)、および前立腺癌株(LnCAP)。生細胞を、改変IgG、キメラIIIA4、または対照抗体でプロービングした。結合した抗体を、抗ヒトIgGフィコエリトリンコンジュゲートにより、フローサイトメトリーを用いて検出した(図5)。B16細胞およびSKmel28細胞に対して、改変IgGおよびキメラIIIA4の両方で強力な結合が認められた。両IgGはまた、LnCAPとも結合した。
【０１５９】
実施例3. Fab断片およびF(ab')2断片がアポトーシスを誘導する能力の評価
本発明の例示的な改変IgG1抗体(Ab1)または対照ヒトIgG1抗体のパパイン消化により、Fab断片を作製した。100 mM酢酸ナトリウム pH 5.0中で、抗体1 mgをパパイン(Roche # 10108014001) 0.01 mgと共に37℃で18時間インキュベートした。F(ab')2はペプシン消化により生成された。100 mM酢酸ナトリウム pH 4.0中で、IgG 5 mgを固定化ペプシンアガローススラリー(Pierce # 20343) 250μlと共に37℃で18時間インキュベートした。切断の際には、両消化物をプロテインA樹脂と共に30分間インキュベートして、Fc断片を除去し、上清を回収した。Fab断片およびF(ab')2断片を、50 mMコハク酸Na pH 6.0、145 mM NaCl、および0.05％ Tween 80に対して透析した。
【０１６０】
Ab1のFab断片およびF(ab')2断片が、白血病患者から単離された初代細胞においてアポトーシスを誘導する能力を評価するため、細胞を96ウェル「U」底プレート中の培養液(10％ウシ胎仔血清を添加したRPMI 1640) 0.1 ml中に、2×105個細胞/ウェルで播種した。抗体または抗体断片を最終濃度が10μg/mlとなるように添加し、プレートを組織培養インキュベーター中で37℃および5％二酸化炭素にて24時間インキュベートした。アポトーシス誘導の陽性対照として、別個の細胞試料をカンプトテシン(10μM；Calbiochem)と共にインキュベートした。インキュベーションの終了時に、細胞を回収し、1000 rpmで5分間の遠心分離により洗浄した後、FITC結合アネキシンV(BD Pharmingen) 10μlを含む緩衝液0.1 ml中で氷上で30分間インキュベートした。細胞を遠心分離により1度洗浄し、1：1000希釈したヨウ化プロピジウム(Sigma)を含むフローサイトメトリー緩衝液に再懸濁した。アポトーシスを起こしているアネキシンV染色細胞を、フローサイトメトリーにより同定した。
【０１６１】
（表４）Ab1抗体およびAb1抗体断片によるアポトーシスの誘導
【０１６２】
表4の結果から、例示的な抗体(Ab1) F(ab')2断片が、EphA3を発現する初代白血病細胞においてアポトーシスの直接的誘導を誘導したことが示される。10μg/ml Ab1 F(ab')2を用いて、標的細胞のおよそ20％が24時間以内に殺傷された。対照的に、一価Fab断片は検出可能なレベルのアポトーシスを誘導することができず、これらの細胞において有意なレベルのアポトーシスを誘導するためには、EphA3の二量体化が必要かつ十分であり、アポトーシス誘導にはFcエフェクター機能は必要でないことが示される。
【０１６３】
実施例4. 無フコシル化抗体の評価
抗体1を、異なるCHO細胞株における発現により、2つのグリコシル型で産生させた。1つの形態(フコシル化抗体1)は、α 1,6フコースを含むIgG1κ(f-アロタイプ)治療抗体に典型的なグリコシル化パターンを有する。他方の形態(無フコシル化抗体1と称する)は、α-1,6フコースの付加を妨げるために、α-1,6フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8のホモ接合性欠失を含むCHO細胞株で産生させ、したがって無フコシル化されている。これらの抗体調製物を、NK細胞媒介性抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイにおいて比較した。
【０１６４】
様々な濃度の抗EphA3抗体調製物を、白血病初代標的細胞および正常ヒトPBMCエフェクター細胞(Stanford University Blood Bankによるバフィーコート)と共にインキュベートした。0.0001μg/mL〜10.0μg/mLのフコシル化抗体1および無フコシル化抗体1の両方を、急性骨髄性白血病(AML)患者由来の標的細胞1×104個、および正常PBMCエフェクター細胞1×106個(エフェクター：標的細胞比は100：1)を用いて試験した。37℃、5％ CO2で16時間インキュベートした後、LDH放出を、界面活性剤で溶解した細胞からのLDHと比較して測定して、細胞傷害性の割合を決定した(Promega Cytotox 96キットを使用)。
【０１６５】
無フコシル化抗体1は、フコシル化抗体1と比較して、EphA3陽性標的細胞に対する増加したADCC活性を示す(図6)。
【０１６６】
明確に理解できるように説明および実施例により前述の本発明をある程度詳細に記述してきたが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それらに対していくらかの変更および修正がなされ得ることは、本発明の教示に照らして当業者には容易に明白であろう。
【０１６７】
本明細書において引用した出版物、アクセッション番号、特許、および特許出願はすべて、それぞれが詳細にかつ個別に参照により組み入れられることが示されるがごとく、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６８】
本発明の抗EphA3抗体の例示的なVH領域配列：
【０１６９】
本発明の抗EphA3抗体の例示的なVL領域配列：
【０１７０】
SEQ ID NO:24：例示的な重鎖定常領域
【０１７１】
SEQ ID NO:25：例示的な軽鎖定常領域
【０１７２】
本発明の例示的な抗体(重鎖および軽鎖配列)：
SEQ ID NO:26(重鎖、SEQ ID NO:26/27を含む抗体)
SEQ ID NO:27(軽鎖、SEQ ID NO:26/27を含む抗体)
SEQ ID NO:28(重鎖、SEQ ID NO:28/29を含む抗体)
SEQ ID NO:29(軽鎖、SEQ ID NO:28/29を含む抗体)
SEQ ID NO:30(重鎖、SEQ ID NO:30/31を含む抗体)
SEQ ID NO:31(軽鎖、SEQ ID NO:30/31を含む抗体)
SEQ ID NO:32(重鎖、SEQ ID NO:32/33を含む抗体)
SEQ ID NO:33(軽鎖、SEQ ID NO:32/33を含む抗体)
SEQ ID NO:34(重鎖、SEQ ID NO:34/35を含む抗体)
SEQ ID NO:35(軽鎖、SEQ ID NO:34/35を含む抗体)
SEQ ID NO:36(重鎖、SEQ ID NO:36/37を含む抗体)
SEQ ID NO:37(軽鎖、SEQ ID NO:36/37を含む抗体)
【図１−１】
【図１−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、抗EphA3抗体：
アミノ酸配列X1GX2YEX3FDX4を含むCDR3を有するVH領域であり、ここで、X1はSまたはGであり、X2はYまたはVであり、X3はEまたはDであり、かつX4はS、V、またはIであるが、ただしアミノ酸配列がSGYYEDFDSである場合には、CDR1はSYWINではなく、かつアミノ酸配列がSGYYEEFDSである場合には、CDR1はTYWISではない；
ヒト生殖系列Jセグメントアミノ酸配列に対して2アミノ酸以下の変化を有するJセグメント；および
ヒト生殖系列Vセグメントアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含むVセグメント。
【請求項２】
JセグメントがヒトJH6アミノ酸配列に対して2アミノ酸以下の変化を有し、かつVセグメントがヒトVH1 1-02アミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含む、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
FR4がWGQGTTVTVSSを含む、請求項1または請求項2記載の抗体。
【請求項４】
CDR3が
を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５】
図1に記載のVH領域に示されるVH CDR1、またはVH CDR2、またはVH CDR1およびVH CDR2の両方を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項６】
VH領域CDR1が配列GYWMN、TYWIS、またはSYWINを有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
VH領域CDR2が配列
を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項８】
VH領域CDR1が配列GYWMN、TYWIS、またはSYWINを有し、かつVH領域CDR2が配列
を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
Vセグメント配列が図1に示されるVH Vセグメント配列を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０】
VHが図1に記載されるVH領域の配列を有する、請求項1記載の抗体。
【請求項１１】
以下を有する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体：
配列X1X2YX3X4YPYTを含むCDR3を有するVL領域であり、ここで、X1はG、V、またはAであり；X2はQ、R、またはGであり；X3はA、S、またはLであり；かつX4はNまたはKである；
ヒト生殖系列Jセグメントアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含むJセグメント；および
ヒト生殖系列Vセグメントアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含むVセグメント。
【請求項１２】
VL領域Jセグメントがヒト生殖系列Jκ2アミノ酸配列FGQGKLEIKと比較して2アミノ酸以下の変化を有し、かつVセグメントがヒト生殖系列JκI L15アミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含む、請求項11記載の抗体。
【請求項１３】
FR4がアミノ酸配列FGQGKLEIKを含む、請求項11または請求項12記載の抗体。
【請求項１４】
VL領域CDR3が
を含む、請求項11、12、または13のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１５】
VL領域が、図1に示される配列VL領域のCDR1、またはCDR2、またはCDR1およびCDR2の両方を含む、請求項11、12、13、または14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１６】
VL領域CDR1が配列
を有する、請求項11、12、13、または14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１７】
VL領域CDR2が配列
を有する、請求項11、12、13、または14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１８】
VL領域CDR1が配列
を有し；かつVL領域CDR2が配列
を有する、請求項11、12、13、または14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１９】
VL領域が図1に示されるVセグメント配列を有するVセグメントを含む、請求項11、12、13、または14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２０】
VL領域が図1に記載されるVL領域の配列を有する、請求項11記載の抗体。
【請求項２１】
を含むCDR3を有するVL領域を含む抗体。
【請求項２２】
アミノ酸配列X1GX2YEX3FDX4を含む重鎖CDR3を含み、ここで、X1はSまたはGであり、X2はYまたはVであり、X3はEまたはDであり、かつX4はS、V、またはIである、請求項21記載の抗体。
【請求項２３】
重鎖CDR3がアミノ酸配列
を含む、請求項22記載の抗体。
【請求項２４】
VL領域が、図1に示される配列VL領域のCDR1、またはCDR2、またはCDR1およびCDR2の両方を含む、請求項21、22、または23のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２５】
VL領域CDR1が配列
を有する、請求項21、22、または23のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２６】
VL領域CDR2が配列
を有する、請求項21、22、または23のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２７】
VL領域CDR1が配列
を有し；かつVL領域CDR2が配列
を有する、請求項21、22、または23のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２８】
VL領域が図1に示されるVセグメント配列を有するVセグメントを含む、請求項21、22、または23のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２９】
図1に記載されるVH領域または図1に記載されるVL領域を含む抗体。
【請求項３０】
図1に記載されるVH領域と図1に記載されるVL領域との組み合わせを含む抗体。
【請求項３１】
VH領域とVL領域との組み合わせが以下を含む、請求項30記載の抗体：
a) SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:20、
b) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:11、
c) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:12、
d) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:19、
e) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:21、
f) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:22、
g) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:23、
h) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:11、
i) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:12、
j) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:21、
k) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:22、
1) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:11、
m) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:13、
n) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:11、
o) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:13、
p) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:21、
q) SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:14、
r) SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:15、
s) SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:14、
t) SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:15、
u) SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:14、
v) SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:15、
w) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:16、
x) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:17、
y) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:19、
z) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:17、
aa) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:18、または
bb) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:20。
【請求項３２】
VH領域もしくはVL領域、またはVH領域およびVL領域の両方のアミノ酸配列がN末端にメチオニンを含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項３３】
IgGである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項３４】
IgG1またはIgG3である、請求項33記載の抗体。
【請求項３５】
IgG2またはIgG4である、請求項33記載の抗体。
【請求項３６】
SEQ ID NO:24に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を含む、請求項33記載の抗体。
【請求項３７】
SEQ ID NO:25に記載されるアミノ酸配列を有するκ軽鎖定常領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項３８】
SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、またはSEQ ID NO:36およびSEQ ID NO:27を含む重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を有する抗体。
【請求項３９】
重鎖定常領域が低フコシル化または無フコシル化されている、請求項33〜38のいずれか一項記載の抗体を含む抗体調製物。
【請求項４０】
(Fab')2である、請求項1〜32のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４１】
ペグ化されている、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４２】
EphA3を活性化する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４３】
10 nMよりも優れた親和性を有する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４４】
1 nMよりも優れた親和性を有する、請求項43記載の抗体。
【請求項４５】
EphA3への結合に関してエフリンA5と競合しない、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４６】
SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、またはSEQ ID NO:36およびSEQ ID NO:27を含む重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を有する抗EphA3抗体であって、無フコシル化されている、抗体。
【請求項４７】
低フコシル化されている、請求項46記載の抗体を含む抗体調製物。
【請求項４８】
EphA3依存性疾患を有する患者を治療する方法であって、前記請求項のいずれか一項記載の抗体を治療有効量で該患者に投与する段階を含む、方法。
【請求項４９】
疾患が癌である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
患者が、血管内皮増殖因子(VEGF)アンタゴニストによる治療を受けたことがあるか、または治療を受けている最中である、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
VEGFアンタゴニストが抗VEGF抗体である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
抗Bv8抗体アンタゴニストを患者に投与する段階をさらに含む、請求項49記載の方法。
【請求項５３】
患者が、腫瘍細胞がEphA3を発現しない固形腫瘍を有する、請求項49〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
患者が、腫瘍細胞がEphA3を発現する固形腫瘍を有する、請求項49〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
EphA3依存性疾患が急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病である、請求項49記載の方法。
【請求項５６】
EphA3依存性疾患が骨髄異形成症候群、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、または特発性骨髄線維症である、請求項48記載の方法。
【請求項１】
以下を含む、抗EphA3抗体：
アミノ酸配列X1GX2YEX3FDX4を含むCDR3を有するVH領域であり、ここで、X1はSまたはGであり、X2はYまたはVであり、X3はEまたはDであり、かつX4はS、V、またはIであるが、ただしアミノ酸配列がSGYYEDFDSである場合には、CDR1はSYWINではなく、かつアミノ酸配列がSGYYEEFDSである場合には、CDR1はTYWISではない；
ヒト生殖系列Jセグメントアミノ酸配列に対して2アミノ酸以下の変化を有するJセグメント；および
ヒト生殖系列Vセグメントアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含むVセグメント。
【請求項２】
JセグメントがヒトJH6アミノ酸配列に対して2アミノ酸以下の変化を有し、かつVセグメントがヒトVH1 1-02アミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含む、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
FR4がWGQGTTVTVSSを含む、請求項1または請求項2記載の抗体。
【請求項４】
CDR3が
を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５】
図1に記載のVH領域に示されるVH CDR1、またはVH CDR2、またはVH CDR1およびVH CDR2の両方を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項６】
VH領域CDR1が配列GYWMN、TYWIS、またはSYWINを有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
VH領域CDR2が配列
を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項８】
VH領域CDR1が配列GYWMN、TYWIS、またはSYWINを有し、かつVH領域CDR2が配列
を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
Vセグメント配列が図1に示されるVH Vセグメント配列を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０】
VHが図1に記載されるVH領域の配列を有する、請求項1記載の抗体。
【請求項１１】
以下を有する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体：
配列X1X2YX3X4YPYTを含むCDR3を有するVL領域であり、ここで、X1はG、V、またはAであり；X2はQ、R、またはGであり；X3はA、S、またはLであり；かつX4はNまたはKである；
ヒト生殖系列Jセグメントアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含むJセグメント；および
ヒト生殖系列Vセグメントアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含むVセグメント。
【請求項１２】
VL領域Jセグメントがヒト生殖系列Jκ2アミノ酸配列FGQGKLEIKと比較して2アミノ酸以下の変化を有し、かつVセグメントがヒト生殖系列JκI L15アミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を含む、請求項11記載の抗体。
【請求項１３】
FR4がアミノ酸配列FGQGKLEIKを含む、請求項11または請求項12記載の抗体。
【請求項１４】
VL領域CDR3が
を含む、請求項11、12、または13のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１５】
VL領域が、図1に示される配列VL領域のCDR1、またはCDR2、またはCDR1およびCDR2の両方を含む、請求項11、12、13、または14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１６】
VL領域CDR1が配列
を有する、請求項11、12、13、または14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１７】
VL領域CDR2が配列
を有する、請求項11、12、13、または14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１８】
VL領域CDR1が配列
を有し；かつVL領域CDR2が配列
を有する、請求項11、12、13、または14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１９】
VL領域が図1に示されるVセグメント配列を有するVセグメントを含む、請求項11、12、13、または14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２０】
VL領域が図1に記載されるVL領域の配列を有する、請求項11記載の抗体。
【請求項２１】
を含むCDR3を有するVL領域を含む抗体。
【請求項２２】
アミノ酸配列X1GX2YEX3FDX4を含む重鎖CDR3を含み、ここで、X1はSまたはGであり、X2はYまたはVであり、X3はEまたはDであり、かつX4はS、V、またはIである、請求項21記載の抗体。
【請求項２３】
重鎖CDR3がアミノ酸配列
を含む、請求項22記載の抗体。
【請求項２４】
VL領域が、図1に示される配列VL領域のCDR1、またはCDR2、またはCDR1およびCDR2の両方を含む、請求項21、22、または23のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２５】
VL領域CDR1が配列
を有する、請求項21、22、または23のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２６】
VL領域CDR2が配列
を有する、請求項21、22、または23のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２７】
VL領域CDR1が配列
を有し；かつVL領域CDR2が配列
を有する、請求項21、22、または23のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２８】
VL領域が図1に示されるVセグメント配列を有するVセグメントを含む、請求項21、22、または23のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２９】
図1に記載されるVH領域または図1に記載されるVL領域を含む抗体。
【請求項３０】
図1に記載されるVH領域と図1に記載されるVL領域との組み合わせを含む抗体。
【請求項３１】
VH領域とVL領域との組み合わせが以下を含む、請求項30記載の抗体：
a) SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:20、
b) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:11、
c) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:12、
d) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:19、
e) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:21、
f) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:22、
g) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:23、
h) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:11、
i) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:12、
j) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:21、
k) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:22、
1) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:11、
m) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:13、
n) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:11、
o) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:13、
p) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:21、
q) SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:14、
r) SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:15、
s) SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:14、
t) SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:15、
u) SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:14、
v) SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:15、
w) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:16、
x) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:17、
y) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:19、
z) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:17、
aa) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:18、または
bb) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:20。
【請求項３２】
VH領域もしくはVL領域、またはVH領域およびVL領域の両方のアミノ酸配列がN末端にメチオニンを含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項３３】
IgGである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項３４】
IgG1またはIgG3である、請求項33記載の抗体。
【請求項３５】
IgG2またはIgG4である、請求項33記載の抗体。
【請求項３６】
SEQ ID NO:24に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を含む、請求項33記載の抗体。
【請求項３７】
SEQ ID NO:25に記載されるアミノ酸配列を有するκ軽鎖定常領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項３８】
SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、またはSEQ ID NO:36およびSEQ ID NO:27を含む重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を有する抗体。
【請求項３９】
重鎖定常領域が低フコシル化または無フコシル化されている、請求項33〜38のいずれか一項記載の抗体を含む抗体調製物。
【請求項４０】
(Fab')2である、請求項1〜32のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４１】
ペグ化されている、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４２】
EphA3を活性化する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４３】
10 nMよりも優れた親和性を有する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４４】
1 nMよりも優れた親和性を有する、請求項43記載の抗体。
【請求項４５】
EphA3への結合に関してエフリンA5と競合しない、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４６】
SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、またはSEQ ID NO:36およびSEQ ID NO:27を含む重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を有する抗EphA3抗体であって、無フコシル化されている、抗体。
【請求項４７】
低フコシル化されている、請求項46記載の抗体を含む抗体調製物。
【請求項４８】
EphA3依存性疾患を有する患者を治療する方法であって、前記請求項のいずれか一項記載の抗体を治療有効量で該患者に投与する段階を含む、方法。
【請求項４９】
疾患が癌である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
患者が、血管内皮増殖因子(VEGF)アンタゴニストによる治療を受けたことがあるか、または治療を受けている最中である、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
VEGFアンタゴニストが抗VEGF抗体である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
抗Bv8抗体アンタゴニストを患者に投与する段階をさらに含む、請求項49記載の方法。
【請求項５３】
患者が、腫瘍細胞がEphA3を発現しない固形腫瘍を有する、請求項49〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
患者が、腫瘍細胞がEphA3を発現する固形腫瘍を有する、請求項49〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
EphA3依存性疾患が急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病である、請求項49記載の方法。
【請求項５６】
EphA3依存性疾患が骨髄異形成症候群、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、または特発性骨髄線維症である、請求項48記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１３−５０８２９２（Ｐ２０１３−５０８２９２Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３４３６８（Ｐ２０１２−５３４３６８）
【出願日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５２７２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５３４６５
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（５０６２４９２１１）カロバイオス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５２７２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５３４６５
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（５０６２４９２１１）カロバイオス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド (12)
【Ｆターム（参考）】
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