ＦＡＤシンテターゼをアッセイする方法
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）シンテターゼの活性を決定する方法、およびこの酵素の活性を調節する化合物を同定する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）シンテターゼの活性を決定する方法、およびこの酵素の活性を調節する化合物を同定する方法に関する。
【０００２】
背景
ＦＡＤシンテターゼは、多くの酵素に必須の補因子である、補因子フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の生合成において、最後の工程を触媒する。
【０００３】
細菌におけるＦＡＤシンテターゼは、２つの酵素活性を持つ、二機能性タンパク質である。一方の酵素活性、フラボキナーゼ（ＦＫ）活性は、ＦＭＮを生じる、リボフラビン（ｒｆｌ）のリン酸化である。もう一方の酵素活性、ＦＡＤシンテターゼ（ＦＡＤＳ）活性は、ＦＡＤを生じる、ＦＭＮのアデニル化である。この生合成経路は、多くの病原性細菌種に存在すると予測されてきており、そしてＦＫおよびＦＡＤＳのどちらの酵素工程も、細菌生存性に必須であると予測される（Ｇｅｒｄｅｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４５５５−４５７２，２００２）。
【０００４】
ＦＡＤシンテターゼ酵素活性を調べる研究が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｋｅａｒｎｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：９５５１−９５５７，１９９７）およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（Ｓｐｅｎｃｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５：１０４３−１０５３，１９７６）を含む、いくつかの細菌に対して行われてきている。ＦＡＤシンテターゼは、枯草菌およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス両方のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、ＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性のため、ＡＴＰを用いることが示された。しかし、ＦＡＤシンテターゼ酵素活性は、フラビン基質が特定の酸化還元状態にあることを必要とする。例えば、枯草菌は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性のため、還元フラビンを必要とすることが示された。対照的に、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のＦＡＤシンテターゼ酵素は、添加される還元剤の非存在下で、ＲｆｌからＦＭＮの形成、およびＦＭＮからＦＡＤの形成を触媒すると報告されてきており、そしてしたがって、基質として酸化フラビンを用いる。
【０００５】
発明の概要
ＦＡＤシンテターゼは、２つの酵素活性：（１）ＦＭＮを生じる、リボフラビンのリン酸化である、フラボキナーゼ（ＦＫ）活性、および（２）ＦＡＤを生じる、ＦＭＮのアデニル化、またはこの反応の逆の、ＦＡＤからＦＭＮへの脱アデニル化である、ＦＡＤシンテターゼ（ＦＡＤＳ）活性、を有する二機能性タンパク質である。本発明は、部分的に、病原性種、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）由来の細菌ＦＡＤシンテターゼが、この酵素活性のため、還元基質を必要とするという発見に基づく。さらに、サルモネラ属由来の細菌ＦＫが、その活性のため、還元リボフラビンを必要とすることも見出された。
【０００６】
本発明はまた、試験化合物の存在下で、ＦＭＮまたはＦＡＤの形成または枯渇を決定することによって、ＦＡＤＳ活性の調節剤を同定する方法も含む。さらに、試験化合物の存在下でＦＭＮ形成に関してアッセイすることによって、ＦＫ活性の調節剤を決定することも可能である。本発明は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を用いて、関心対象の化合物を同定するのに特に適している。
【０００７】
したがって、１つの側面において、本発明は、細菌シンテターゼの活性を決定するための方法を含む。該方法は、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、サルモネラ属からなる群より選択される細菌ＦＡＤシンテターゼ、またはその機能性断片と、該ＦＡＤシンテターゼの還元基質を接触させ；そして細菌ＦＡＤシンテターゼの活性を決定することを含む。還元基質は、リボフラビン、ＦＭＮまたはＦＡＤであることも可能である。
【０００８】
別の側面において、本発明は、特にＦＡＤＳまたは細菌フラボキナーゼ（ＦＫ）の活性を決定するための方法を含む。例えば、該方法は、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、サルモネラ属からなる群より選択される細菌ＦＫ、またはその機能性断片を、還元リボフラビンと接触させ；そして細菌ＦＫの活性を決定することを含む。
【０００９】
さらに別の側面において、本発明は、細菌フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）シンテターゼ活性を調節可能な化合物を同定するための方法を含む。該方法は、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、サルモネラ属からなる群より選択される細菌ＦＡＤシンテターゼ、またはその機能性断片と、細菌ＦＡＤシンテターゼの還元基質および試験化合物を接触させ；そして細菌ＦＡＤシンテターゼの活性を決定することを含み、ここで、対照と比較した、化合物の存在下での活性の増加または減少は、該化合物がＦＡＤシンテターゼ活性を調節する指標となる。
【００１０】
さらに別の側面において、本発明は、細菌ＦＡＤＳまたはＦＫを調節可能な化合物を同定するための方法を含む。例えば、該方法は、サルモネラ属の細菌ＦＫまたはその機能性断片を、還元リボフラビンと共に試験化合物と接触させ；そして細菌ＦＫの活性を決定することを含み、ここで、対照と比較した、化合物の存在下での活性の増加または減少は、該化合物がＦＫ活性を調節する指標となる。
【００１１】
上述のスクリーニング法において、ブドウ球菌属は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）であることも可能であり；連鎖球菌属は肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であることも可能であり、そしてサルモネラ属はネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であることも可能である。本発明の方法で用いる試験化合物は、ペプチド、ペプチド擬似体、小分子、または他の薬剤などの化合物であることも可能である。
【００１２】
詳細な説明
本発明は、部分的に、新規抗細菌薬剤を同定するための方法を提供する。本発明は、特定の病原体由来のＦＡＤシンテターゼの酵素活性が、還元基質を必要とするという発見に基づく。本発明は、ＦＡＤシンテターゼの酵素活性を決定するための方法、およびその活性を増加させるかまたは減少させる調節剤を同定するための方法を提供する。関心対象の病原体には、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）由来の種（ネズミチフス菌など）、ブドウ球菌属種（黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、およびスタフィロコッカス・サプロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）など）、および連鎖球菌属種（肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、および化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）など）が含まれる。
【００１３】
ＦＡＤシンテターゼ
多様な細菌種由来のＦＡＤシンテターゼをコードする核酸が当該技術分野で知られている。例えば、ネズミチフス菌由来のＦＡＤシンテターゼをコードする核酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＡＥ００８６９５のもとに入手可能であり；黄色ブドウ球菌由来のＦＡＤシンテターゼをコードする核酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＣ＿００２７５８のもとに入手可能であり；そして肺炎連鎖球菌由来のＦＡＤシンテターゼをコードする核酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＡＥ００８４７４のもとに入手可能である。
【００１４】
細菌属のブドウ球菌属、連鎖球菌属、またはサルモネラ属由来のＦＡＤシンテターゼは、当該技術分野に周知の方法を用いて、容易に入手可能である。例えば、ネズミチフス菌由来のＦＡＤシンテターゼを用いて、同じ綱または他の細菌種から、ＦＡＤシンテターゼの相同体をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離することも可能である。方法の例には、限定されるわけではないが、核酸ハイブリダイゼーションの方法、ならびに核酸増幅技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応）の多様な使用によって例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法が含まれる。
【００１５】
例えば、当業者に周知の方法論を使用して、所望の細菌いずれか由来のライブラリーをスクリーニングするＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして、ネズミチフス菌由来の核酸のすべてまたは一部を用いることによって、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡとしてのＦＡＤシンテターゼを直接単離することも可能である。ネズミチフス菌のＦＡＤ核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブを設計して、そして合成することも可能である。さらに、全配列を直接用いて、ランダムプライマー、ＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、または末端標識技術などの、当業者に知られる方法によって、ＤＮＡプローブを合成することも可能である。さらに、特異的プライマーを設計し、そして用いて、本配列の一部または全長を増幅することも可能である。増幅反応中に、生じた増幅産物を直接標識するか、または増幅反応後に標識し、そして適切なストリンジェンシー条件下で、全長ｃＤＮＡまたはゲノム断片を単離するプローブとして用いることも可能である。これらの断片を配列決定することによって、ｃＤＮＡまたはゲノム断片の配列を得ることも可能である。既知の遺伝子配列に対する相同性に基づいて、未知の遺伝子を配列決定し、そして性質決定するための方法が、当該技術分野に周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ １９８９を参照されたい）。
【００１６】
ＦＡＤシンテターゼの変異体および機能性断片
ＦＡＤシンテターゼの変異体には、ＦＡＤシンテターゼの生物学的活性（例えばＦＫ活性および／またはＦＡＤＳ活性）を実質的に保持する変異体が含まれる。典型的には、変異体は、野生型ＦＡＤシンテターゼの活性の７０％を超える活性、例えば野生型ＦＡＤシンテターゼの活性の７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の活性を保持する。当該技術分野に周知の方法を用いて、変異体の活性をアッセイすることも可能である。変異体には、天然アレル変異または突然変異誘発のため、アミノ酸配列が異なるポリペプチドが含まれる。１つの例において、機能性変異体は、典型的には、保存的変異（conservative variation）、あるいは重要でない残基におけるかまたは重要でない領域における変異のみを含有する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野で定義されてきている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を持つアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００１７】
ＦＡＤシンテターゼは、ＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性を有する二機能性分子であるため、本発明の方法において、これらの活性を有するＦＡＤシンテターゼの機能性断片を用いることも可能である。機能性断片によって、ＦＫ活性またはＦＡＤＳ活性を有するＦＡＤシンテターゼの断片または変異体を意味する。典型的には、ＦＫ断片またはＦＡＤＳ断片は、野生型ＦＡＤシンテターゼの活性の７０％を超える活性、例えば野生型ＦＡＤシンテターゼの活性の７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の活性を保持する。
【００１８】
一般的に、ＦＡＤＳ活性は、ＦＡＤシンテターゼのＮ末端ドメイン中に存し、そしてＦＫ活性は、ＦＡＤシンテターゼのＣ末端ドメイン中に存する（Ｋｒｕｐａら，（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１０：１７１２−１７２８）。例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）において、タンパク質のＮ末端におけるＦＡＤシンテターゼ・アミノ酸突然変異は、ＦＡＤＳ活性を非常に減少させ、一方、タンパク質のＣ末端における突然変異は、ＦＫ活性を減少させることが示されている（米国特許第５５１４５７４号を参照されたい）。さらに、細菌サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＡＤ３５９３９）由来のＦＡＤシンテターゼのＸ線結晶構造によって、アデニリルトランスフェラーゼに構造的に相同なＮ末端ドメイン、およびフラビン結合性タンパク質に構造的に相同なＣ末端ドメインを持つ、２ドメイン構造が明らかになった（Ｗａｎｇら，（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，５２：６３３−６３５）。
【００１９】
日常的なコンピュータ化相同性検索法を用いて、ＦＡＤＳドメインまたはＦＫドメインを同定することも可能である。例えば、相同性研究を用いて、ＦＫ活性を有するタンパク質断片またはＦＡＤＳ活性を有する断片の設計のためのドメイン境界を予測することも可能である。多様な既知のアルゴリズムが公的に開示されており、そして検索手段を行うための多様な商業的に入手可能なソフトウェアを用いることも可能である。ソフトウェアの例には、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（ＮＣＢＩＡ）が含まれる。例えば、Ｓｙｂａｓｅシステム上のＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）およびＢＬＡＺＥ（Ｂｒｕｔｌａｇら（１９９３）Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１７：２０３−２０７）検索アルゴリズムを実行するソフトウェアを用いて、既知のＦＫドメインまたはＦＡＤＳドメインに相同なＦＫドメインまたはＦＡＤＳドメインを同定することも可能である。１つの例において、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行って、ＦＡＤＳドメインまたはＦＫドメインに相同なヌクレオチド配列を得ることも可能である。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を行って、ＦＡＤＳドメインまたはＦＫドメインに相同なアミノ酸配列を得ることも可能である。比較目的のためにギャップ化配列（gapped alignment）を得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるように、ギャップ化ＢＬＡＳＴを利用することも可能である。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いてもよい。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【００２０】
１つの例において、サーモトガ・マリティマＦＡＤＳ構造と比較することによって、黄色ブドウ球菌におけるＦＡＤＳドメインを同定することも可能である（Ｗａｎｇら（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５２：６３３−６３５）。例えば、サーモトガ・マリティマのＮ末端ドメイン、残基Ｖａｌ2〜Ｓｅｒ136を用いて、黄色ブドウ球菌酵素のＦＡＤＳドメイン境界を予測することも可能である。Ｎ末端ドメインを黄色ブドウ球菌酵素の配列と比較することによって、黄色ブドウ球菌のアミノ酸Ｍｅｔ1〜ほぼＳｅｒ148までのタンパク質がＦＡＤＳ活性を有すると予測され、そしてアミノ酸Ｓｅｒ148〜Ｉｌｅ323がＦＫ活性を有すると予測される。
【００２１】
次いで、変異体または予測されるポリペプチドを、活性に関して容易に試験することも可能である。簡潔には、その内容が本明細書に援用される、Ｅｆｉｍｏｖら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：９７１６−９７２３に記載されるように、ＦＭＮからのＦＡＤの形成を触媒する能力に関して、ＦＡＤＳ活性を有すると予測されるポリペプチド断片を試験することも可能であるし、そしてその内容が本明細書に援用される、Ｅｆｉｍｏｖら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：９７１６−９７２３における、リボフラビンからのＦＭＮの形成を触媒する能力に関して、ＦＫ活性を有すると予測されるポリペプチド断片を試験することも可能である。
【００２２】
ＦＡＤシンテターゼタンパク質
本発明の方法で用いる、ＦＡＤシンテターゼタンパク質、またはＦＡＤＳ活性を有する断片を、関心対象の細菌種から単離することも可能である。ＦＡＤシンテターゼを単離する方法が当該技術分野に知られ、例えば、その内容が本明細書に援用される、Ｅｆｉｍｏｖら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：９７１６−９７２３を参照されたい。あるいは、ＦＡＤシンテターゼまたはその機能性断片を、組換え的に産生することも可能である。ＦＡＤＳを組換え的に産生する場合、ＦＡＤシンテターゼを適切な発現ベクター内にクローニングすることも可能である。典型的には、組換え発現ベクターには、発現に用いようとする宿主細胞に基づいて選択される、１以上の制御配列が含まれる。制御配列は、発現されるべきＦＡＤシンテターゼ核酸配列に、機能可能であるように連結される。「機能可能であるように連結される」は、（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合、宿主細胞において）ＦＡＤシンテターゼ核酸配列の発現を可能にする方式で、ＦＡＤシンテターゼ核酸配列が、制御配列（単数または複数）に連結されることを意味すると意図される。用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むよう意図される。こうした制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３−７に記載される。
【００２３】
次いで、発現ベクターを関心対象の宿主細胞に導入することも可能である。例えば、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であることも可能である。例えば、ＦＡＤＳ活性を有する機能性断片を、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞において発現させることも可能である。他の適切な宿主細胞が当業者に知られる。慣用的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して、宿主細胞に発現ベクターを導入することも可能である。本明細書において、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための、当該技術分野に認められる多様な技術を指すよう意図され、こうした技術には、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクションするのに適した方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８９）、および他の実験室マニュアルに見出されうる。
【００２４】
還元基質
本発明の方法は、ＦＡＤＳ活性のため還元フラビン基質を、またはＦＫ活性のため還元リボフラビンを提供することを必要とする。
【００２５】
還元フラビンを提供するため、酸化フラビンの溶液に、還元剤を添加して、フラビンをその還元型に変換することも可能である。還元剤は、酵素系、例えば細菌ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）由来のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性酸化還元酵素（Ｔｕ，Ａｎｔｉｏｘ．Ｒｅｄｏｘ．Ｓｉｇｎａｌ．，３：８８１−８９７，２００１）などの酸化還元酵素タンパク質およびニコチンアミド基質であることも可能である。あるいは、還元剤は、亜ジチオン酸ナトリウム、限定されるわけではないが、水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化ホウ素などの化学薬品、または限定されるわけではないがパラジウムなどの触媒の存在下の水素であることも可能である（Ｇｈｉｓｌａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６６：３６１−３７３，１９８０）。当業者は、適切な還元性化学薬品を容易に同定可能である。
【００２６】
ＦＡＤＳ活性に関して基質を生成する能力に関して、還元剤の有効性を試験することも可能である。例えば、こうした実験を行うため、試験還元剤、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ７．５、ＡＴＰ、リボフラビン、およびＦＡＤシンテターゼの存在下で、反応を２５℃で行う。１５分間インキュベーションした後、反応を停止し、そして分析して、例えば産生されたＦＡＤの量を定量化する。
【００２７】
ＦＡＤシンテターゼ活性またはＦＫ活性の測定
ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応における基質（例えばリボフラビン、ＡＴＰ、またはＦＭＮ）代謝回転の量または産物形成（例えばＡＤＰ、ＦＭＮ、ＰＰｉ、またはＦＡＤ）の量を定量化することによって、ＦＡＤシンテターゼ酵素活性、すなわちＦＡＤＳ活性またはＦＫ活性を測定することも可能である。こうした方法は、当該技術分野に知られる。例えば、クロマトグラフィー分離と同時に、各個々のフラビンを吸光度または蛍光で検出することによって、基質枯渇および／または産生を直接測定することも可能である。さらに、代謝回転のためＦＭＮまたはＦＡＤを必要とする酵素に共役させることによって、ＦＭＮおよびＦＡＤを測定することも可能である。
【００２８】
簡潔には、１つの例において、ＦＡＤＳ活性を決定するため、正反応を分析することによって、枯渇するＦＭＮの量または産生されるＦＡＤの量を決定することも可能である。この例では、ＦＭＮの添加によって、ＦＡＤＳ反応を開始することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素反応を行うことも可能である。反応を停止した後、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィーによって、枯渇したＦＭＮの量または産生されたＦＡＤの量を定量化することも可能である（その内容が本明細書に援用される、Ｅｎｔｓｃｈら（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：４０１−４０８）。
【００２９】
あるいは、ＦＡＤＳが、ＦＡＤからのＦＭＮ形成を触媒する逆反応を決定することも可能である。簡潔には、この例では、ＦＡＤの添加によって、ＦＡＤＳ反応を開始することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素反応を行うことも可能である。反応を停止した後、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィーによって、枯渇したＦＡＤの量または産生されたＦＭＮの量を定量化することも可能である（Ｅｎｔｓｃｈら（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：４０１−４０８）。
【００３０】
別の例において、ＦＭＮまたはＦＡＤを必要とする酵素に共役させることによって、ＦＭＮおよびＦＡＤを測定することも可能である。ＦＭＮ共役酵素の例は、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）・ルシフェラーゼ（Ｓｔａｎｌｅｙ（１９７１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：４４１−４５３）である。ビブリオ・フィシェリ・ルシフェラーゼを用いて、産生される発光の量によって、ルシフェラーゼ活性を定量化する。ＦＡＤ共役酵素の例は、アポ−Ｄ−アミノ酸オキシダーゼである（Ｈｉｎｋｋａｎｅｎ（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：２０２−２０８）。産生される過酸化水素の量によって、アポ−Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの活性を定量化することも可能である。
【００３１】
ＦＫ活性に関しては、枯渇したリボフラビンの量または産生されたＦＭＮの量を決定することも可能である。この例では、リボフラビンの添加によって、ＦＫ反応を開始することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素反応を行うことも可能である。反応を停止した後、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィーによって、枯渇したリボフラビンの量または産生されたＦＭＮの量を定量化することも可能である（Ｅｎｔｓｃｈら（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：４０１−４０８）。
【００３２】
あるいは、基質ＡＴＰの枯渇の決定、または産物ＡＤＰおよびピロリン酸の産生の決定を用いて、ＦＡＤシンテターゼ酵素活性を決定することも可能である。ＦＫ反応に関しては、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィーによって、枯渇したＡＴＰの量または産生されたＡＤＰの量を決定することも可能である。ＦＫ反応に関しては、ピルビン酸キナーゼ、および消費されたＮＡＤＨの量によって乳酸デヒドロゲナーゼ活性が定量化される乳酸デヒドロゲナーゼなどの、代謝回転にＡＤＰを必要とする酵素系に共役させることによって、産生されたＡＤＰの量を決定することも可能である（Ｊａｗｏｒｅｋら（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｕ．監修）第３版中，７：３６５−３６９）。ＦＡＤＳ反応に関しては、ピロホスファターゼ酵素を添加することによって産生されたピロリン酸の量、および放出されたリン酸の検出を用いて、ＦＡＤＳ活性を決定することも可能である。１つの例において、比色読み取り値を生じる、マラカイトグリーンおよびモリブデン酸アンモニウムの使用によって、リン酸の量を定量化することも可能である（Ｌａｎｚｅｔｔａら（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１００：９５−９９）。
【００３３】
スクリーニング法
本発明は、細菌フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）シンテターゼ活性を調節可能な化合物を同定するための方法を含む。１つの例において、該方法は、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、サルモネラ属からなる群より選択される細菌ＦＡＤシンテターゼ、またはその機能性断片と、細菌ＦＡＤシンテターゼの還元基質および試験化合物を接触させ；そして細菌ＦＡＤシンテターゼの活性を決定することを含み、ここで、対照と比較した、化合物の存在下での活性の増加または減少は、該化合物がＦＡＤシンテターゼ活性を調節する指標となる。細菌ＦＡＤシンテターゼの活性を上述のように決定することができる。
【００３４】
別の例において、本発明は、細菌ＦＡＤＳまたはＦＫを調節可能な化合物を同定するための方法を含む。該方法は、サルモネラ属の細菌ＦＫまたはその機能性断片を、還元リボフラビンおよび試験化合物と接触させ；そして細菌ＦＫの活性を決定することを含むことができ、ここで、対照と比較して、化合物の存在下での活性の増加または減少は、該化合物がＦＫ活性を調節する指標となる。
【００３５】
上述の方法で用いる試験化合物には、ペプチド、ペプチド擬似体、小分子、または他の薬剤などの化合物が含まれる。
以下の実施例は、本発明を例示するよう意図され、そしていかなる意味でも、本発明を限定すると解釈されないものとする。当業者は、本発明の精神および範囲内である修飾を認識するであろう。
【００３６】
実施例
実施例１
黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、およびネズミチフス菌のｒｉｂＦ遺伝子の単離
ｒｉｂＦをクローニングするため、遺伝子の５’端に隣接したＮｄｅ１部位（下線）および３’端に隣接したＳａｌ１またはＥｃｏＲ１部位（下線）を持つ、ＰＣＲ順方向プライマーおよび逆方向プライマーを設計した。製造者によって記載されるように、高忠実度ＰＣＲマスターポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州）を用いて、黄色ブドウ球菌（５’ＡＡＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＴＣＡＴＡＧＡＡＧＴＧ３’（配列番号１））および（５’ＡＡＡＣＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＡＣ３’（配列番号２））、肺炎連鎖球菌（５’ＡＡＡＣＧＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＡＴＴＣＣ３’（配列番号３））および（５’ＡＡＡＣＧＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＡＣＣＡＡＴＴＣＣＧＡＧ３’（配列番号４））、ならびにネズミチフス菌（５’ＡＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＡＣＧＣＧ３’（配列番号５））および（５’ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣ３’（配列番号６））から、ＤＮＡを増幅した。
【００３７】
ＰＣＲ産物をＮｄｅ１およびＳａｌ１で消化し、そして両方の制限酵素で切断した発現ベクター内に連結した。連結混合物を用いて、ＴＯＰ１０コンピテント細胞を化学的に形質転換した。カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に細胞を蒔いて、そして３７℃で一晩インキュベーションした。ＤＮＡ配列決定によって、正しい挿入物に関して、異なる細菌コロニーから調製したプラスミドをチェックした。タンパク質過剰発現のため、正しいプラスミドで大腸菌を形質転換して、黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦ、肺炎連鎖球菌ＲｉｂＦ、およびネズミチフス菌ＲｉｂＦに関する株を生成した。
【００３８】
（１）黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、およびネズミチフス菌のＲｉｂＦタンパク質の精製
黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦを精製するため、ＯＤ600が０．５になるまで、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中、大腸菌細胞を３７℃で増殖させ、次いで０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、そして２０℃で４時間増殖させた。この発酵６Ｌからの細胞を、７０ｍＬの溶解緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁した。４℃で、１８，０００ｐｓｉ、２回のフレンチプレス処理によって、細胞を破壊し、次いで４℃、１０，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。上清分画を、緩衝液Ａ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した２０ｍＬ Ｑ−Ｓｅｐｈ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に適用した。６カラム容積の緩衝液Ａでカラムを洗浄し、そして１０カラム容積の２５ｍＭ〜３５０ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。主な分画をプールして、そして１Ｍ硫酸アンモニウムに調節した。この分画を、緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化した、２０ｍＬ Ｐｈ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）上に装填した。１Ｍ〜０Ｍ硫酸アンモニウムの直線勾配で、タンパク質を溶出した。タンパク質を含有する分画をプールし、Ａｍｉｃｏｎ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ濃縮装置中で濃縮し、そして２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化した、２００ｍＬ ＨｉＰｒｅｐ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）に適用した。純粋なタンパク質をアリコットし、そして−８０℃で保存した。
【００３９】
上記と同じ方法を用いて、肺炎連鎖球菌ＲｉｂＦを精製した。
ネズミチフス菌ＲｉｂＦを精製するため、ＯＤ600が０．５になるまで、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中、大腸菌細胞を３７℃で増殖させ、次いで０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、そして２０℃で３時間増殖させた。この発酵２Ｌからの細胞を、７５ｍＬの溶解緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁した。４℃で、１８，０００ｐｓｉ、２回のフレンチプレス処理によって、細胞を破壊し、次いで４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清分画を、緩衝液Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した１５ｍＬ ＳＰ−Ｓｅｐｈ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）上に適用した。３カラム容積の緩衝液Ａでカラムを洗浄し、そして２０カラム容積の２５ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。タンパク質を含有する分画をプールし、Ａｍｉｃｏｎ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ濃縮装置中で濃縮し、そして２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化した、２００ｍＬ ＨｉＰｒｅｐ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）に適用した。純粋なタンパク質をアリコットし、そして−８０℃で保存した。
【００４０】
実施例２
黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、およびネズミチフス菌のＲｉｂＦタンパク質の酵素アッセイ
黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦをｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイするため、時間経過実験を行って、そして高性能液体クロマトグラフィーによって分析した。５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、０．００２％Ｂｒｉｊ−３５、１ｍＭ塩化マグネシウム、および０．５ｍＭ ＡＴＰの１００μＬ中で、反応を行った。示した場合、上述のように調製した６０μＭのストック溶液から、最終濃度２００ｎＭになるまで、黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦを添加した。示した場合、窒素でバブリングした（ｂｕｂｂｌｅｄ）水中で調製した１０ｍＭのストック溶液から、最終濃度１ｍＭになるまで、亜ジチオン酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ、ウィスコンシン州）を添加した。示した場合、水中で調製した０．１０ｍＭのストック溶液から、最終濃度０．０５０ｍＭになるまで、リボフラビンを添加した。示した場合、水中で調製した０．１０ｍＭのストック溶液から、０．０５０ｍＭになるまで、ＦＭＮを添加した。反応を２５℃でインキュベーションし、そして１００μＬの２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０を用いて、多様な時点で反応を停止した。リン酸ナトリウムｐＨ２．８で平衡化した四級アミン陰イオン交換カラム４０２．ＩＣｘ２５０ｍｍ（Ｖｙｄａｃ、カリフォルニア州）上に２５μＬを注入することによって、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって試料を分析した。蛍光検出（４４２ｎｍ励起波長、５２０ｎｍ発光波長）、ならびに保持時間および面積の比較によってピークを同定した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
表１中のデータは、亜ジチオン酸ナトリウムの非存在下で、黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦが、検出可能でそして測定可能なＦＫ活性を示したが、検出可能でそして測定可能なＦＡＤＳ活性を示さなかったことを示す。亜ジチオン酸ナトリウムの存在下で、黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦは、検出可能でそして測定可能なＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性を示した。
【００４３】
肺炎連鎖球菌ＲｉｂＦをｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイするため、示した場合、上述のように調製した６．０μＭのストック溶液から、最終濃度２００ｎＭになるまで肺炎連鎖球菌ＲｉｂＦを添加したことを除いて、上述のように、時間経過実験を行って、そして高性能液体クロマトグラフィーによって分析した。４５分の時点でのデータを表２に示す。
【００４４】
【表２】
【００４５】
表２中のデータは、亜ジチオン酸ナトリウムの非存在下で、肺炎連鎖球菌ＲｉｂＦが、検出可能でそして測定可能なＦＫ活性を示したが、検出可能でそして測定可能なＦＡＤＳ活性を示さなかったことを示す。亜ジチオン酸ナトリウムの存在下で、肺炎連鎖球菌ＲｉｂＦは、検出可能でそして測定可能なＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性を示した。
【００４６】
ネズミチフス菌ＲｉｂＦをｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイするため、示した場合、上述のように調製した２６μＭのストック溶液から、最終濃度１．３μＭになるまでネズミチフス菌ＲｉｂＦを添加したことを除いて、上述のように、時間経過実験を行って、そして高性能液体クロマトグラフィーによって分析した。１０分の時点でのデータを表３に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
表３中のデータは、亜ジチオン酸ナトリウムの非存在下で、ネズミチフス菌ＲｉｂＦが、検出可能でそして測定可能なＦＫ活性を示さず、また、検出可能でそして測定可能なＦＡＤＳ活性を示さなかったことを示す。亜ジチオン酸ナトリウムの存在下で、ネズミチフス菌ＲｉｂＦは、検出可能でそして測定可能なＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性を示した。
【００４９】
実施例３
黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦの機能性断片の調製
Ｔ．マリティマ（T. maritima）構造と比較することによって、黄色ブドウ球菌フラボキナーゼドメインタンパク質を設計した。Ｌｙｓ146およびＩｌｅ147間のドメイン境界を選択した。Ｃ末端フラボキナーゼドメインタンパク質は、αヘリックス構造モチーフで始まると予測されるため、Ｎ末端αヘリックスの安定化を提供すると予測される２つの突然変異Ｔ１５０ＤおよびＳ１５１Ｅを含むように構築物設計を改変した（Ｓｅａｌｅら，（１９９４）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．３：１７４１−１７４５）。
【００５０】
全長黄色ブドウ球菌タンパク質に関して上述するものと類似の標準的分子生物学技術を用いて、黄色ブドウ球菌ＦＫドメインをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを調製した。大腸菌中で過剰発現した後、全長黄色ブドウ球菌タンパク質に関して上述するものと類似の標準的タンパク質精製技術を用いて、タンパク質を精製した。
【００５１】
全長黄色ブドウ球菌ＦＡＤシンテターゼに関して上述したＨＰＬＣアッセイを用いて、ＦＭＮ形成を検出することによって、ＦＫドメインタンパク質をアッセイした。１００μ
Ｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．００２％Ｂｒｉｊ−３５、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５．０ｍＭ ＡＴＰ、２０μＭリボフラビン、および５０ｎＭ酵素中で、反応を行った。全長黄色ブドウ球菌ＦＡＤシンテターゼに比較して、ＦＫドメインタンパク質で、同程度のＦＫ活性が見られた（表４）。
【００５２】
【表４】
【００５３】
実施例４
ＲｉｂＦ活性を調節する化合物の同定
増加する量の化合物Ａの存在下で、黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦのアッセイを行って、化合物Ａによる阻害の量を測定した。リボフラビンで反応を開始し、ピロリン酸産物を検出することによって、ＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性を同時にアッセイした。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．００２％Ｂｒｉｊ−３５、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１ｍｇ／ｍｌピロホスファターゼ、２％ジメチルスルホキシド、２ｍＭ塩化マグネシウム、１００μＭ ＡＴＰ、１０μＭリボフラビン、１０ｍＭ亜ジチオン酸ナトリウム、８０ｎＭ黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦ、および０．７８〜４００μＭで変動する化合物Ａを含含有する１００μＬを含む９６ウェルマイクロタイタープレート中、室温で反応を行った。２０分後、１０μＬの２００ｍＭエチレンジアミン四酢酸で反応を停止した。２時間後、１５０μＬのマラカイトグリーン・リン酸検出試薬（Ｌａｎｚｅｔｔａら（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１００：９５−９７）を添加した。化合物Ａを含まない反応（阻害なし）および２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む反応（完全阻害）に比較することによって、阻害パーセントを計算した。図３に見られるように、化合物Ａは、用量依存性の阻害を示し、２９μＭの濃度で５０％阻害（ＩＣ50）を生じた。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、ＦＡＤシンテターゼの系統学的距離を示す樹状図である。
【図２】図２は、ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌および肺炎連鎖球菌由来のＦＡＤシンテターゼのタンパク質配列を示す。
【図３】図３は、ＲｉｂＦ調節活性を有する化合物を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）シンテターゼの活性を決定する方法、およびこの酵素の活性を調節する化合物を同定する方法に関する。
【０００２】
背景
ＦＡＤシンテターゼは、多くの酵素に必須の補因子である、補因子フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の生合成において、最後の工程を触媒する。
【０００３】
細菌におけるＦＡＤシンテターゼは、２つの酵素活性を持つ、二機能性タンパク質である。一方の酵素活性、フラボキナーゼ（ＦＫ）活性は、ＦＭＮを生じる、リボフラビン（ｒｆｌ）のリン酸化である。もう一方の酵素活性、ＦＡＤシンテターゼ（ＦＡＤＳ）活性は、ＦＡＤを生じる、ＦＭＮのアデニル化である。この生合成経路は、多くの病原性細菌種に存在すると予測されてきており、そしてＦＫおよびＦＡＤＳのどちらの酵素工程も、細菌生存性に必須であると予測される（Ｇｅｒｄｅｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４５５５−４５７２，２００２）。
【０００４】
ＦＡＤシンテターゼ酵素活性を調べる研究が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｋｅａｒｎｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：９５５１−９５５７，１９９７）およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（Ｓｐｅｎｃｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５：１０４３−１０５３，１９７６）を含む、いくつかの細菌に対して行われてきている。ＦＡＤシンテターゼは、枯草菌およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス両方のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、ＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性のため、ＡＴＰを用いることが示された。しかし、ＦＡＤシンテターゼ酵素活性は、フラビン基質が特定の酸化還元状態にあることを必要とする。例えば、枯草菌は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性のため、還元フラビンを必要とすることが示された。対照的に、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のＦＡＤシンテターゼ酵素は、添加される還元剤の非存在下で、ＲｆｌからＦＭＮの形成、およびＦＭＮからＦＡＤの形成を触媒すると報告されてきており、そしてしたがって、基質として酸化フラビンを用いる。
【０００５】
発明の概要
ＦＡＤシンテターゼは、２つの酵素活性：（１）ＦＭＮを生じる、リボフラビンのリン酸化である、フラボキナーゼ（ＦＫ）活性、および（２）ＦＡＤを生じる、ＦＭＮのアデニル化、またはこの反応の逆の、ＦＡＤからＦＭＮへの脱アデニル化である、ＦＡＤシンテターゼ（ＦＡＤＳ）活性、を有する二機能性タンパク質である。本発明は、部分的に、病原性種、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）由来の細菌ＦＡＤシンテターゼが、この酵素活性のため、還元基質を必要とするという発見に基づく。さらに、サルモネラ属由来の細菌ＦＫが、その活性のため、還元リボフラビンを必要とすることも見出された。
【０００６】
本発明はまた、試験化合物の存在下で、ＦＭＮまたはＦＡＤの形成または枯渇を決定することによって、ＦＡＤＳ活性の調節剤を同定する方法も含む。さらに、試験化合物の存在下でＦＭＮ形成に関してアッセイすることによって、ＦＫ活性の調節剤を決定することも可能である。本発明は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を用いて、関心対象の化合物を同定するのに特に適している。
【０００７】
したがって、１つの側面において、本発明は、細菌シンテターゼの活性を決定するための方法を含む。該方法は、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、サルモネラ属からなる群より選択される細菌ＦＡＤシンテターゼ、またはその機能性断片と、該ＦＡＤシンテターゼの還元基質を接触させ；そして細菌ＦＡＤシンテターゼの活性を決定することを含む。還元基質は、リボフラビン、ＦＭＮまたはＦＡＤであることも可能である。
【０００８】
別の側面において、本発明は、特にＦＡＤＳまたは細菌フラボキナーゼ（ＦＫ）の活性を決定するための方法を含む。例えば、該方法は、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、サルモネラ属からなる群より選択される細菌ＦＫ、またはその機能性断片を、還元リボフラビンと接触させ；そして細菌ＦＫの活性を決定することを含む。
【０００９】
さらに別の側面において、本発明は、細菌フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）シンテターゼ活性を調節可能な化合物を同定するための方法を含む。該方法は、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、サルモネラ属からなる群より選択される細菌ＦＡＤシンテターゼ、またはその機能性断片と、細菌ＦＡＤシンテターゼの還元基質および試験化合物を接触させ；そして細菌ＦＡＤシンテターゼの活性を決定することを含み、ここで、対照と比較した、化合物の存在下での活性の増加または減少は、該化合物がＦＡＤシンテターゼ活性を調節する指標となる。
【００１０】
さらに別の側面において、本発明は、細菌ＦＡＤＳまたはＦＫを調節可能な化合物を同定するための方法を含む。例えば、該方法は、サルモネラ属の細菌ＦＫまたはその機能性断片を、還元リボフラビンと共に試験化合物と接触させ；そして細菌ＦＫの活性を決定することを含み、ここで、対照と比較した、化合物の存在下での活性の増加または減少は、該化合物がＦＫ活性を調節する指標となる。
【００１１】
上述のスクリーニング法において、ブドウ球菌属は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）であることも可能であり；連鎖球菌属は肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であることも可能であり、そしてサルモネラ属はネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であることも可能である。本発明の方法で用いる試験化合物は、ペプチド、ペプチド擬似体、小分子、または他の薬剤などの化合物であることも可能である。
【００１２】
詳細な説明
本発明は、部分的に、新規抗細菌薬剤を同定するための方法を提供する。本発明は、特定の病原体由来のＦＡＤシンテターゼの酵素活性が、還元基質を必要とするという発見に基づく。本発明は、ＦＡＤシンテターゼの酵素活性を決定するための方法、およびその活性を増加させるかまたは減少させる調節剤を同定するための方法を提供する。関心対象の病原体には、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）由来の種（ネズミチフス菌など）、ブドウ球菌属種（黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、およびスタフィロコッカス・サプロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）など）、および連鎖球菌属種（肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、および化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）など）が含まれる。
【００１３】
ＦＡＤシンテターゼ
多様な細菌種由来のＦＡＤシンテターゼをコードする核酸が当該技術分野で知られている。例えば、ネズミチフス菌由来のＦＡＤシンテターゼをコードする核酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＡＥ００８６９５のもとに入手可能であり；黄色ブドウ球菌由来のＦＡＤシンテターゼをコードする核酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＣ＿００２７５８のもとに入手可能であり；そして肺炎連鎖球菌由来のＦＡＤシンテターゼをコードする核酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＡＥ００８４７４のもとに入手可能である。
【００１４】
細菌属のブドウ球菌属、連鎖球菌属、またはサルモネラ属由来のＦＡＤシンテターゼは、当該技術分野に周知の方法を用いて、容易に入手可能である。例えば、ネズミチフス菌由来のＦＡＤシンテターゼを用いて、同じ綱または他の細菌種から、ＦＡＤシンテターゼの相同体をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離することも可能である。方法の例には、限定されるわけではないが、核酸ハイブリダイゼーションの方法、ならびに核酸増幅技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応）の多様な使用によって例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法が含まれる。
【００１５】
例えば、当業者に周知の方法論を使用して、所望の細菌いずれか由来のライブラリーをスクリーニングするＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして、ネズミチフス菌由来の核酸のすべてまたは一部を用いることによって、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡとしてのＦＡＤシンテターゼを直接単離することも可能である。ネズミチフス菌のＦＡＤ核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブを設計して、そして合成することも可能である。さらに、全配列を直接用いて、ランダムプライマー、ＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、または末端標識技術などの、当業者に知られる方法によって、ＤＮＡプローブを合成することも可能である。さらに、特異的プライマーを設計し、そして用いて、本配列の一部または全長を増幅することも可能である。増幅反応中に、生じた増幅産物を直接標識するか、または増幅反応後に標識し、そして適切なストリンジェンシー条件下で、全長ｃＤＮＡまたはゲノム断片を単離するプローブとして用いることも可能である。これらの断片を配列決定することによって、ｃＤＮＡまたはゲノム断片の配列を得ることも可能である。既知の遺伝子配列に対する相同性に基づいて、未知の遺伝子を配列決定し、そして性質決定するための方法が、当該技術分野に周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ １９８９を参照されたい）。
【００１６】
ＦＡＤシンテターゼの変異体および機能性断片
ＦＡＤシンテターゼの変異体には、ＦＡＤシンテターゼの生物学的活性（例えばＦＫ活性および／またはＦＡＤＳ活性）を実質的に保持する変異体が含まれる。典型的には、変異体は、野生型ＦＡＤシンテターゼの活性の７０％を超える活性、例えば野生型ＦＡＤシンテターゼの活性の７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の活性を保持する。当該技術分野に周知の方法を用いて、変異体の活性をアッセイすることも可能である。変異体には、天然アレル変異または突然変異誘発のため、アミノ酸配列が異なるポリペプチドが含まれる。１つの例において、機能性変異体は、典型的には、保存的変異（conservative variation）、あるいは重要でない残基におけるかまたは重要でない領域における変異のみを含有する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野で定義されてきている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を持つアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００１７】
ＦＡＤシンテターゼは、ＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性を有する二機能性分子であるため、本発明の方法において、これらの活性を有するＦＡＤシンテターゼの機能性断片を用いることも可能である。機能性断片によって、ＦＫ活性またはＦＡＤＳ活性を有するＦＡＤシンテターゼの断片または変異体を意味する。典型的には、ＦＫ断片またはＦＡＤＳ断片は、野生型ＦＡＤシンテターゼの活性の７０％を超える活性、例えば野生型ＦＡＤシンテターゼの活性の７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の活性を保持する。
【００１８】
一般的に、ＦＡＤＳ活性は、ＦＡＤシンテターゼのＮ末端ドメイン中に存し、そしてＦＫ活性は、ＦＡＤシンテターゼのＣ末端ドメイン中に存する（Ｋｒｕｐａら，（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１０：１７１２−１７２８）。例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）において、タンパク質のＮ末端におけるＦＡＤシンテターゼ・アミノ酸突然変異は、ＦＡＤＳ活性を非常に減少させ、一方、タンパク質のＣ末端における突然変異は、ＦＫ活性を減少させることが示されている（米国特許第５５１４５７４号を参照されたい）。さらに、細菌サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＡＤ３５９３９）由来のＦＡＤシンテターゼのＸ線結晶構造によって、アデニリルトランスフェラーゼに構造的に相同なＮ末端ドメイン、およびフラビン結合性タンパク質に構造的に相同なＣ末端ドメインを持つ、２ドメイン構造が明らかになった（Ｗａｎｇら，（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，５２：６３３−６３５）。
【００１９】
日常的なコンピュータ化相同性検索法を用いて、ＦＡＤＳドメインまたはＦＫドメインを同定することも可能である。例えば、相同性研究を用いて、ＦＫ活性を有するタンパク質断片またはＦＡＤＳ活性を有する断片の設計のためのドメイン境界を予測することも可能である。多様な既知のアルゴリズムが公的に開示されており、そして検索手段を行うための多様な商業的に入手可能なソフトウェアを用いることも可能である。ソフトウェアの例には、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（ＮＣＢＩＡ）が含まれる。例えば、Ｓｙｂａｓｅシステム上のＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）およびＢＬＡＺＥ（Ｂｒｕｔｌａｇら（１９９３）Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１７：２０３−２０７）検索アルゴリズムを実行するソフトウェアを用いて、既知のＦＫドメインまたはＦＡＤＳドメインに相同なＦＫドメインまたはＦＡＤＳドメインを同定することも可能である。１つの例において、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行って、ＦＡＤＳドメインまたはＦＫドメインに相同なヌクレオチド配列を得ることも可能である。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を行って、ＦＡＤＳドメインまたはＦＫドメインに相同なアミノ酸配列を得ることも可能である。比較目的のためにギャップ化配列（gapped alignment）を得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるように、ギャップ化ＢＬＡＳＴを利用することも可能である。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いてもよい。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【００２０】
１つの例において、サーモトガ・マリティマＦＡＤＳ構造と比較することによって、黄色ブドウ球菌におけるＦＡＤＳドメインを同定することも可能である（Ｗａｎｇら（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５２：６３３−６３５）。例えば、サーモトガ・マリティマのＮ末端ドメイン、残基Ｖａｌ2〜Ｓｅｒ136を用いて、黄色ブドウ球菌酵素のＦＡＤＳドメイン境界を予測することも可能である。Ｎ末端ドメインを黄色ブドウ球菌酵素の配列と比較することによって、黄色ブドウ球菌のアミノ酸Ｍｅｔ1〜ほぼＳｅｒ148までのタンパク質がＦＡＤＳ活性を有すると予測され、そしてアミノ酸Ｓｅｒ148〜Ｉｌｅ323がＦＫ活性を有すると予測される。
【００２１】
次いで、変異体または予測されるポリペプチドを、活性に関して容易に試験することも可能である。簡潔には、その内容が本明細書に援用される、Ｅｆｉｍｏｖら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：９７１６−９７２３に記載されるように、ＦＭＮからのＦＡＤの形成を触媒する能力に関して、ＦＡＤＳ活性を有すると予測されるポリペプチド断片を試験することも可能であるし、そしてその内容が本明細書に援用される、Ｅｆｉｍｏｖら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：９７１６−９７２３における、リボフラビンからのＦＭＮの形成を触媒する能力に関して、ＦＫ活性を有すると予測されるポリペプチド断片を試験することも可能である。
【００２２】
ＦＡＤシンテターゼタンパク質
本発明の方法で用いる、ＦＡＤシンテターゼタンパク質、またはＦＡＤＳ活性を有する断片を、関心対象の細菌種から単離することも可能である。ＦＡＤシンテターゼを単離する方法が当該技術分野に知られ、例えば、その内容が本明細書に援用される、Ｅｆｉｍｏｖら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：９７１６−９７２３を参照されたい。あるいは、ＦＡＤシンテターゼまたはその機能性断片を、組換え的に産生することも可能である。ＦＡＤＳを組換え的に産生する場合、ＦＡＤシンテターゼを適切な発現ベクター内にクローニングすることも可能である。典型的には、組換え発現ベクターには、発現に用いようとする宿主細胞に基づいて選択される、１以上の制御配列が含まれる。制御配列は、発現されるべきＦＡＤシンテターゼ核酸配列に、機能可能であるように連結される。「機能可能であるように連結される」は、（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合、宿主細胞において）ＦＡＤシンテターゼ核酸配列の発現を可能にする方式で、ＦＡＤシンテターゼ核酸配列が、制御配列（単数または複数）に連結されることを意味すると意図される。用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むよう意図される。こうした制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３−７に記載される。
【００２３】
次いで、発現ベクターを関心対象の宿主細胞に導入することも可能である。例えば、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であることも可能である。例えば、ＦＡＤＳ活性を有する機能性断片を、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞において発現させることも可能である。他の適切な宿主細胞が当業者に知られる。慣用的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して、宿主細胞に発現ベクターを導入することも可能である。本明細書において、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための、当該技術分野に認められる多様な技術を指すよう意図され、こうした技術には、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクションするのに適した方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８９）、および他の実験室マニュアルに見出されうる。
【００２４】
還元基質
本発明の方法は、ＦＡＤＳ活性のため還元フラビン基質を、またはＦＫ活性のため還元リボフラビンを提供することを必要とする。
【００２５】
還元フラビンを提供するため、酸化フラビンの溶液に、還元剤を添加して、フラビンをその還元型に変換することも可能である。還元剤は、酵素系、例えば細菌ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）由来のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性酸化還元酵素（Ｔｕ，Ａｎｔｉｏｘ．Ｒｅｄｏｘ．Ｓｉｇｎａｌ．，３：８８１−８９７，２００１）などの酸化還元酵素タンパク質およびニコチンアミド基質であることも可能である。あるいは、還元剤は、亜ジチオン酸ナトリウム、限定されるわけではないが、水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化ホウ素などの化学薬品、または限定されるわけではないがパラジウムなどの触媒の存在下の水素であることも可能である（Ｇｈｉｓｌａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６６：３６１−３７３，１９８０）。当業者は、適切な還元性化学薬品を容易に同定可能である。
【００２６】
ＦＡＤＳ活性に関して基質を生成する能力に関して、還元剤の有効性を試験することも可能である。例えば、こうした実験を行うため、試験還元剤、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ７．５、ＡＴＰ、リボフラビン、およびＦＡＤシンテターゼの存在下で、反応を２５℃で行う。１５分間インキュベーションした後、反応を停止し、そして分析して、例えば産生されたＦＡＤの量を定量化する。
【００２７】
ＦＡＤシンテターゼ活性またはＦＫ活性の測定
ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応における基質（例えばリボフラビン、ＡＴＰ、またはＦＭＮ）代謝回転の量または産物形成（例えばＡＤＰ、ＦＭＮ、ＰＰｉ、またはＦＡＤ）の量を定量化することによって、ＦＡＤシンテターゼ酵素活性、すなわちＦＡＤＳ活性またはＦＫ活性を測定することも可能である。こうした方法は、当該技術分野に知られる。例えば、クロマトグラフィー分離と同時に、各個々のフラビンを吸光度または蛍光で検出することによって、基質枯渇および／または産生を直接測定することも可能である。さらに、代謝回転のためＦＭＮまたはＦＡＤを必要とする酵素に共役させることによって、ＦＭＮおよびＦＡＤを測定することも可能である。
【００２８】
簡潔には、１つの例において、ＦＡＤＳ活性を決定するため、正反応を分析することによって、枯渇するＦＭＮの量または産生されるＦＡＤの量を決定することも可能である。この例では、ＦＭＮの添加によって、ＦＡＤＳ反応を開始することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素反応を行うことも可能である。反応を停止した後、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィーによって、枯渇したＦＭＮの量または産生されたＦＡＤの量を定量化することも可能である（その内容が本明細書に援用される、Ｅｎｔｓｃｈら（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：４０１−４０８）。
【００２９】
あるいは、ＦＡＤＳが、ＦＡＤからのＦＭＮ形成を触媒する逆反応を決定することも可能である。簡潔には、この例では、ＦＡＤの添加によって、ＦＡＤＳ反応を開始することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素反応を行うことも可能である。反応を停止した後、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィーによって、枯渇したＦＡＤの量または産生されたＦＭＮの量を定量化することも可能である（Ｅｎｔｓｃｈら（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：４０１−４０８）。
【００３０】
別の例において、ＦＭＮまたはＦＡＤを必要とする酵素に共役させることによって、ＦＭＮおよびＦＡＤを測定することも可能である。ＦＭＮ共役酵素の例は、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）・ルシフェラーゼ（Ｓｔａｎｌｅｙ（１９７１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：４４１−４５３）である。ビブリオ・フィシェリ・ルシフェラーゼを用いて、産生される発光の量によって、ルシフェラーゼ活性を定量化する。ＦＡＤ共役酵素の例は、アポ−Ｄ−アミノ酸オキシダーゼである（Ｈｉｎｋｋａｎｅｎ（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：２０２−２０８）。産生される過酸化水素の量によって、アポ−Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの活性を定量化することも可能である。
【００３１】
ＦＫ活性に関しては、枯渇したリボフラビンの量または産生されたＦＭＮの量を決定することも可能である。この例では、リボフラビンの添加によって、ＦＫ反応を開始することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素反応を行うことも可能である。反応を停止した後、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィーによって、枯渇したリボフラビンの量または産生されたＦＭＮの量を定量化することも可能である（Ｅｎｔｓｃｈら（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：４０１−４０８）。
【００３２】
あるいは、基質ＡＴＰの枯渇の決定、または産物ＡＤＰおよびピロリン酸の産生の決定を用いて、ＦＡＤシンテターゼ酵素活性を決定することも可能である。ＦＫ反応に関しては、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィーによって、枯渇したＡＴＰの量または産生されたＡＤＰの量を決定することも可能である。ＦＫ反応に関しては、ピルビン酸キナーゼ、および消費されたＮＡＤＨの量によって乳酸デヒドロゲナーゼ活性が定量化される乳酸デヒドロゲナーゼなどの、代謝回転にＡＤＰを必要とする酵素系に共役させることによって、産生されたＡＤＰの量を決定することも可能である（Ｊａｗｏｒｅｋら（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｕ．監修）第３版中，７：３６５−３６９）。ＦＡＤＳ反応に関しては、ピロホスファターゼ酵素を添加することによって産生されたピロリン酸の量、および放出されたリン酸の検出を用いて、ＦＡＤＳ活性を決定することも可能である。１つの例において、比色読み取り値を生じる、マラカイトグリーンおよびモリブデン酸アンモニウムの使用によって、リン酸の量を定量化することも可能である（Ｌａｎｚｅｔｔａら（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１００：９５−９９）。
【００３３】
スクリーニング法
本発明は、細菌フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）シンテターゼ活性を調節可能な化合物を同定するための方法を含む。１つの例において、該方法は、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、サルモネラ属からなる群より選択される細菌ＦＡＤシンテターゼ、またはその機能性断片と、細菌ＦＡＤシンテターゼの還元基質および試験化合物を接触させ；そして細菌ＦＡＤシンテターゼの活性を決定することを含み、ここで、対照と比較した、化合物の存在下での活性の増加または減少は、該化合物がＦＡＤシンテターゼ活性を調節する指標となる。細菌ＦＡＤシンテターゼの活性を上述のように決定することができる。
【００３４】
別の例において、本発明は、細菌ＦＡＤＳまたはＦＫを調節可能な化合物を同定するための方法を含む。該方法は、サルモネラ属の細菌ＦＫまたはその機能性断片を、還元リボフラビンおよび試験化合物と接触させ；そして細菌ＦＫの活性を決定することを含むことができ、ここで、対照と比較して、化合物の存在下での活性の増加または減少は、該化合物がＦＫ活性を調節する指標となる。
【００３５】
上述の方法で用いる試験化合物には、ペプチド、ペプチド擬似体、小分子、または他の薬剤などの化合物が含まれる。
以下の実施例は、本発明を例示するよう意図され、そしていかなる意味でも、本発明を限定すると解釈されないものとする。当業者は、本発明の精神および範囲内である修飾を認識するであろう。
【００３６】
実施例
実施例１
黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、およびネズミチフス菌のｒｉｂＦ遺伝子の単離
ｒｉｂＦをクローニングするため、遺伝子の５’端に隣接したＮｄｅ１部位（下線）および３’端に隣接したＳａｌ１またはＥｃｏＲ１部位（下線）を持つ、ＰＣＲ順方向プライマーおよび逆方向プライマーを設計した。製造者によって記載されるように、高忠実度ＰＣＲマスターポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州）を用いて、黄色ブドウ球菌（５’ＡＡＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＴＣＡＴＡＧＡＡＧＴＧ３’（配列番号１））および（５’ＡＡＡＣＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＡＣ３’（配列番号２））、肺炎連鎖球菌（５’ＡＡＡＣＧＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＡＴＴＣＣ３’（配列番号３））および（５’ＡＡＡＣＧＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＡＣＣＡＡＴＴＣＣＧＡＧ３’（配列番号４））、ならびにネズミチフス菌（５’ＡＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＡＣＧＣＧ３’（配列番号５））および（５’ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣ３’（配列番号６））から、ＤＮＡを増幅した。
【００３７】
ＰＣＲ産物をＮｄｅ１およびＳａｌ１で消化し、そして両方の制限酵素で切断した発現ベクター内に連結した。連結混合物を用いて、ＴＯＰ１０コンピテント細胞を化学的に形質転換した。カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に細胞を蒔いて、そして３７℃で一晩インキュベーションした。ＤＮＡ配列決定によって、正しい挿入物に関して、異なる細菌コロニーから調製したプラスミドをチェックした。タンパク質過剰発現のため、正しいプラスミドで大腸菌を形質転換して、黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦ、肺炎連鎖球菌ＲｉｂＦ、およびネズミチフス菌ＲｉｂＦに関する株を生成した。
【００３８】
（１）黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、およびネズミチフス菌のＲｉｂＦタンパク質の精製
黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦを精製するため、ＯＤ600が０．５になるまで、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中、大腸菌細胞を３７℃で増殖させ、次いで０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、そして２０℃で４時間増殖させた。この発酵６Ｌからの細胞を、７０ｍＬの溶解緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁した。４℃で、１８，０００ｐｓｉ、２回のフレンチプレス処理によって、細胞を破壊し、次いで４℃、１０，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。上清分画を、緩衝液Ａ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した２０ｍＬ Ｑ−Ｓｅｐｈ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に適用した。６カラム容積の緩衝液Ａでカラムを洗浄し、そして１０カラム容積の２５ｍＭ〜３５０ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。主な分画をプールして、そして１Ｍ硫酸アンモニウムに調節した。この分画を、緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化した、２０ｍＬ Ｐｈ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）上に装填した。１Ｍ〜０Ｍ硫酸アンモニウムの直線勾配で、タンパク質を溶出した。タンパク質を含有する分画をプールし、Ａｍｉｃｏｎ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ濃縮装置中で濃縮し、そして２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化した、２００ｍＬ ＨｉＰｒｅｐ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）に適用した。純粋なタンパク質をアリコットし、そして−８０℃で保存した。
【００３９】
上記と同じ方法を用いて、肺炎連鎖球菌ＲｉｂＦを精製した。
ネズミチフス菌ＲｉｂＦを精製するため、ＯＤ600が０．５になるまで、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中、大腸菌細胞を３７℃で増殖させ、次いで０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、そして２０℃で３時間増殖させた。この発酵２Ｌからの細胞を、７５ｍＬの溶解緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁した。４℃で、１８，０００ｐｓｉ、２回のフレンチプレス処理によって、細胞を破壊し、次いで４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清分画を、緩衝液Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した１５ｍＬ ＳＰ−Ｓｅｐｈ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）上に適用した。３カラム容積の緩衝液Ａでカラムを洗浄し、そして２０カラム容積の２５ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。タンパク質を含有する分画をプールし、Ａｍｉｃｏｎ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ濃縮装置中で濃縮し、そして２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化した、２００ｍＬ ＨｉＰｒｅｐ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）に適用した。純粋なタンパク質をアリコットし、そして−８０℃で保存した。
【００４０】
実施例２
黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、およびネズミチフス菌のＲｉｂＦタンパク質の酵素アッセイ
黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦをｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイするため、時間経過実験を行って、そして高性能液体クロマトグラフィーによって分析した。５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、０．００２％Ｂｒｉｊ−３５、１ｍＭ塩化マグネシウム、および０．５ｍＭ ＡＴＰの１００μＬ中で、反応を行った。示した場合、上述のように調製した６０μＭのストック溶液から、最終濃度２００ｎＭになるまで、黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦを添加した。示した場合、窒素でバブリングした（ｂｕｂｂｌｅｄ）水中で調製した１０ｍＭのストック溶液から、最終濃度１ｍＭになるまで、亜ジチオン酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ、ウィスコンシン州）を添加した。示した場合、水中で調製した０．１０ｍＭのストック溶液から、最終濃度０．０５０ｍＭになるまで、リボフラビンを添加した。示した場合、水中で調製した０．１０ｍＭのストック溶液から、０．０５０ｍＭになるまで、ＦＭＮを添加した。反応を２５℃でインキュベーションし、そして１００μＬの２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０を用いて、多様な時点で反応を停止した。リン酸ナトリウムｐＨ２．８で平衡化した四級アミン陰イオン交換カラム４０２．ＩＣｘ２５０ｍｍ（Ｖｙｄａｃ、カリフォルニア州）上に２５μＬを注入することによって、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって試料を分析した。蛍光検出（４４２ｎｍ励起波長、５２０ｎｍ発光波長）、ならびに保持時間および面積の比較によってピークを同定した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
表１中のデータは、亜ジチオン酸ナトリウムの非存在下で、黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦが、検出可能でそして測定可能なＦＫ活性を示したが、検出可能でそして測定可能なＦＡＤＳ活性を示さなかったことを示す。亜ジチオン酸ナトリウムの存在下で、黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦは、検出可能でそして測定可能なＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性を示した。
【００４３】
肺炎連鎖球菌ＲｉｂＦをｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイするため、示した場合、上述のように調製した６．０μＭのストック溶液から、最終濃度２００ｎＭになるまで肺炎連鎖球菌ＲｉｂＦを添加したことを除いて、上述のように、時間経過実験を行って、そして高性能液体クロマトグラフィーによって分析した。４５分の時点でのデータを表２に示す。
【００４４】
【表２】
【００４５】
表２中のデータは、亜ジチオン酸ナトリウムの非存在下で、肺炎連鎖球菌ＲｉｂＦが、検出可能でそして測定可能なＦＫ活性を示したが、検出可能でそして測定可能なＦＡＤＳ活性を示さなかったことを示す。亜ジチオン酸ナトリウムの存在下で、肺炎連鎖球菌ＲｉｂＦは、検出可能でそして測定可能なＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性を示した。
【００４６】
ネズミチフス菌ＲｉｂＦをｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイするため、示した場合、上述のように調製した２６μＭのストック溶液から、最終濃度１．３μＭになるまでネズミチフス菌ＲｉｂＦを添加したことを除いて、上述のように、時間経過実験を行って、そして高性能液体クロマトグラフィーによって分析した。１０分の時点でのデータを表３に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
表３中のデータは、亜ジチオン酸ナトリウムの非存在下で、ネズミチフス菌ＲｉｂＦが、検出可能でそして測定可能なＦＫ活性を示さず、また、検出可能でそして測定可能なＦＡＤＳ活性を示さなかったことを示す。亜ジチオン酸ナトリウムの存在下で、ネズミチフス菌ＲｉｂＦは、検出可能でそして測定可能なＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性を示した。
【００４９】
実施例３
黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦの機能性断片の調製
Ｔ．マリティマ（T. maritima）構造と比較することによって、黄色ブドウ球菌フラボキナーゼドメインタンパク質を設計した。Ｌｙｓ146およびＩｌｅ147間のドメイン境界を選択した。Ｃ末端フラボキナーゼドメインタンパク質は、αヘリックス構造モチーフで始まると予測されるため、Ｎ末端αヘリックスの安定化を提供すると予測される２つの突然変異Ｔ１５０ＤおよびＳ１５１Ｅを含むように構築物設計を改変した（Ｓｅａｌｅら，（１９９４）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．３：１７４１−１７４５）。
【００５０】
全長黄色ブドウ球菌タンパク質に関して上述するものと類似の標準的分子生物学技術を用いて、黄色ブドウ球菌ＦＫドメインをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを調製した。大腸菌中で過剰発現した後、全長黄色ブドウ球菌タンパク質に関して上述するものと類似の標準的タンパク質精製技術を用いて、タンパク質を精製した。
【００５１】
全長黄色ブドウ球菌ＦＡＤシンテターゼに関して上述したＨＰＬＣアッセイを用いて、ＦＭＮ形成を検出することによって、ＦＫドメインタンパク質をアッセイした。１００μ
Ｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．００２％Ｂｒｉｊ−３５、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５．０ｍＭ ＡＴＰ、２０μＭリボフラビン、および５０ｎＭ酵素中で、反応を行った。全長黄色ブドウ球菌ＦＡＤシンテターゼに比較して、ＦＫドメインタンパク質で、同程度のＦＫ活性が見られた（表４）。
【００５２】
【表４】
【００５３】
実施例４
ＲｉｂＦ活性を調節する化合物の同定
増加する量の化合物Ａの存在下で、黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦのアッセイを行って、化合物Ａによる阻害の量を測定した。リボフラビンで反応を開始し、ピロリン酸産物を検出することによって、ＦＫ活性およびＦＡＤＳ活性を同時にアッセイした。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．００２％Ｂｒｉｊ−３５、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１ｍｇ／ｍｌピロホスファターゼ、２％ジメチルスルホキシド、２ｍＭ塩化マグネシウム、１００μＭ ＡＴＰ、１０μＭリボフラビン、１０ｍＭ亜ジチオン酸ナトリウム、８０ｎＭ黄色ブドウ球菌ＲｉｂＦ、および０．７８〜４００μＭで変動する化合物Ａを含含有する１００μＬを含む９６ウェルマイクロタイタープレート中、室温で反応を行った。２０分後、１０μＬの２００ｍＭエチレンジアミン四酢酸で反応を停止した。２時間後、１５０μＬのマラカイトグリーン・リン酸検出試薬（Ｌａｎｚｅｔｔａら（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１００：９５−９７）を添加した。化合物Ａを含まない反応（阻害なし）および２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む反応（完全阻害）に比較することによって、阻害パーセントを計算した。図３に見られるように、化合物Ａは、用量依存性の阻害を示し、２９μＭの濃度で５０％阻害（ＩＣ50）を生じた。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、ＦＡＤシンテターゼの系統学的距離を示す樹状図である。
【図２】図２は、ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌および肺炎連鎖球菌由来のＦＡＤシンテターゼのタンパク質配列を示す。
【図３】図３は、ＲｉｂＦ調節活性を有する化合物を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）シンテターゼの活性を決定するための方法であって：
ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）からなる群より選択される細菌ＦＡＤシンテターゼ、またはその機能性断片と、細菌ＦＡＤシンテターゼの還元基質を接触させ；そして
細菌ＦＡＤシンテターゼの活性を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
ブドウ球菌属が黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）である、請求項１の方法。
【請求項３】
連鎖球菌属が肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である、請求項１の方法。
【請求項４】
サルモネラ属がネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）である、請求項１の方法。
【請求項５】
還元基質がＦＭＮまたはＦＡＤである、請求項１の方法。
【請求項６】
細菌フラボキナーゼ（ＦＫ）の活性を決定するための方法であって；
サルモネラ属の細菌ＦＫまたはその機能性断片を、還元リボフラビンと接触させ；そして
細菌ＦＫの活性を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項７】
サルモネラ属がネズミチフス菌である、請求項６の方法。
【請求項８】
細菌フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）シンテターゼ活性を調節可能な化合物を同定するための方法であって
ブドウ球菌属、連鎖球菌属、サルモネラ属からなる群より選択される細菌ＦＡＤシンテターゼ、またはその機能性断片と、細菌ＦＡＤシンテターゼの還元基質および試験化合物を接触させ；そして
細菌ＦＡＤシンテターゼの活性を決定する（ここで、対照と比較した、化合物の存在下での活性の増加または減少は、該化合物がＦＡＤシンテターゼ活性を調節する指標となる）、
ことを含む、前記方法。
【請求項９】
ブドウ球菌属が黄色ブドウ球菌である、請求項８の方法。
【請求項１０】
連鎖球菌属が肺炎連鎖球菌である、請求項８の方法。
【請求項１１】
サルモネラ属がネズミチフス菌である、請求項８の方法。
【請求項１２】
還元基質がＦＭＮまたはＦＡＤである、請求項８の方法。
【請求項１３】
細菌フラボキナーゼを調節可能な化合物を同定するための方法であって：
サルモネラ属の細菌ＦＫまたはその機能性断片を、還元リボフラビンおよび試験化合物と接触させ；そして
細菌ＦＫの活性を決定する（ここで、対照と比較した、化合物の存在下での活性の増加または減少は、該化合物がＦＫ活性を調節する指標となる）、
ことを含む、前記方法。
【請求項１４】
サルモネラ属がネズミチフス菌である、請求項１３の方法。
【請求項１】
細菌フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）シンテターゼの活性を決定するための方法であって：
ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）からなる群より選択される細菌ＦＡＤシンテターゼ、またはその機能性断片と、細菌ＦＡＤシンテターゼの還元基質を接触させ；そして
細菌ＦＡＤシンテターゼの活性を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
ブドウ球菌属が黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）である、請求項１の方法。
【請求項３】
連鎖球菌属が肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である、請求項１の方法。
【請求項４】
サルモネラ属がネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）である、請求項１の方法。
【請求項５】
還元基質がＦＭＮまたはＦＡＤである、請求項１の方法。
【請求項６】
細菌フラボキナーゼ（ＦＫ）の活性を決定するための方法であって；
サルモネラ属の細菌ＦＫまたはその機能性断片を、還元リボフラビンと接触させ；そして
細菌ＦＫの活性を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項７】
サルモネラ属がネズミチフス菌である、請求項６の方法。
【請求項８】
細菌フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）シンテターゼ活性を調節可能な化合物を同定するための方法であって
ブドウ球菌属、連鎖球菌属、サルモネラ属からなる群より選択される細菌ＦＡＤシンテターゼ、またはその機能性断片と、細菌ＦＡＤシンテターゼの還元基質および試験化合物を接触させ；そして
細菌ＦＡＤシンテターゼの活性を決定する（ここで、対照と比較した、化合物の存在下での活性の増加または減少は、該化合物がＦＡＤシンテターゼ活性を調節する指標となる）、
ことを含む、前記方法。
【請求項９】
ブドウ球菌属が黄色ブドウ球菌である、請求項８の方法。
【請求項１０】
連鎖球菌属が肺炎連鎖球菌である、請求項８の方法。
【請求項１１】
サルモネラ属がネズミチフス菌である、請求項８の方法。
【請求項１２】
還元基質がＦＭＮまたはＦＡＤである、請求項８の方法。
【請求項１３】
細菌フラボキナーゼを調節可能な化合物を同定するための方法であって：
サルモネラ属の細菌ＦＫまたはその機能性断片を、還元リボフラビンおよび試験化合物と接触させ；そして
細菌ＦＫの活性を決定する（ここで、対照と比較した、化合物の存在下での活性の増加または減少は、該化合物がＦＫ活性を調節する指標となる）、
ことを含む、前記方法。
【請求項１４】
サルモネラ属がネズミチフス菌である、請求項１３の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５０７９６８（Ｐ２００８−５０７９６８Ａ）
【公表日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２３１５４（Ｐ２００７−５２３１５４）
【出願日】平成１７年７月２９日（２００５．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２９８０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１０９４０
【国際公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【出願人】（３０００２２６４１）アストラゼネカ アクチボラグ (581)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月２９日（２００５．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２９８０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１０９４０
【国際公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【出願人】（３０００２２６４１）アストラゼネカ アクチボラグ (581)
【Ｆターム（参考）】
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