Ｇ−ＣＳＦ液体製剤
本発明は、貯蔵寿命が長いＧ−ＣＳＦ液体製剤、及びそれを生成するための方法に関する。本発明は、また、有効成分としてＧ−ＣＳＦ、緩衝物質として酢酸塩、表面活性剤としてポリソルベート２０又はポリソルベート８０、及び任意選択で薬学的に許容できる補助剤を含む液体製剤に関し、製剤は４．１〜４．４の間のｐＨを有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦの貯蔵安定性の液体製剤、及びそれを生成するための方法に関する。特に、本発明は、有効成分としてＧ−ＣＳＦ、緩衝物質として酢酸塩、界面活性剤としてポリソルベート２０又はポリソルベート８０、ならびに任意選択で薬学的に許容できる賦形剤を含む液体製剤に関し、製剤は４．１〜４．４の間の範囲のｐＨ値を有する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）は、天然に存在する成長因子であり、より広義にはサイトカインのファミリーに、より正確にはコロニー刺激因子のグループに属する。Ｇ−ＣＳＦは、造血において決定的な役割を果たし、造血前駆細胞の増殖及び分化、ならびに好中球の活性化を増強する。例えば、化学療法もしくは照射法の後の正常の血球集団の再構成において、又は感染性の病原体に対する免疫反応を刺激するためなど、Ｇ−ＣＳＦを様々な医薬の領域に適用するのは、上記の特徴のためである。臨床的に実践する上で、Ｇ−ＣＳＦは、このように、主に、腫瘍の防止に、特に化学療法の結果としての好中球減少症の処置に、さらに骨髄移植の経過に、及び感染性疾患の処置に適用される。
【０００３】
Ｇ−ＣＳＦの組換えの生成は、１９８７年に、国際公開第８７／０１１３２号パンフレットにおける特許文献に最初に記載された。組換えＧ−ＣＳＦをベースにした、最初の市販のＧ−ＣＳＦ調製物は、１９９１年にドイツで認可され、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）の商標名の下にアムジェン（Ａｍｇｅｎ）が生成し、流通させている。
【０００４】
ドイツの医師用卓上参考書であるＲＯＴＥ ＬＩＳＴＥ ２００５によると、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）製品（プレフィルド・シリンジ）は、以下の成分からなる：６００μｇ／ｍｌ又は９６０μｇ／ｍｌの濃度のＧ−ＣＳＦ、酢酸ナトリウム、ソルビトール、ポリソルベート８０、及び水。
【０００５】
当技術分野では、様々な特許文献がＧ−ＣＳＦの薬剤調製物を扱っている。ＥＰ−Ａ−０ ３７３ ６７９では、Ｇ−ＣＳＦの製剤が記載されており、この製剤では、酸、酸性のｐＨ値、及び低伝導率の製剤の存在によって、タンパク質が安定化されている。
【０００６】
特許文献１は、概ね、薬学的に許容できる表面活性剤、糖類、タンパク質、又は薬学的に許容できる高分子化合物と組み合わせたＧ−ＣＳＦの使用に関する。
特許文献２には、マルトース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、ラフィノース、ショ糖、及びＧ−ＣＳＦを含む調製物を安定化させるためのさらなる糖の使用が記載されている。
【０００７】
特許文献３には、使用されるＧ−ＣＳＦの量より少ない量の界面活性剤及び緩衝物質を含む、Ｇ−ＣＳＦを含む調製物が開示されている。
特許文献４には、クロロブタノール、ベンジルアルコール、又はベンザルコニウムである保存剤を含む、Ｇ−ＣＳＦを含む製剤が記載されている。
【０００８】
特許文献５には、緩衝物質として、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、又はトリシンを含むＧ−ＣＳＦを含む製剤が開示されている。
特許文献６には、酸を含み界面活性剤を含まない、４．０を超えるｐＨ値を有するＧ−ＣＳＦの薬剤調製物が開示されている。
【特許文献１】ドイツ連邦共和国特許出願公開第３７２３７８１号明細書
【特許文献２】国際公開第９４／１４４６５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９４／１４４６６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９３／０３７４４号パンフレット
【特許文献５】ヨーロッパ特許出願公開第９８８８６１号明細書
【特許文献６】国際公開第２００５／０４２０２４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
より長期の間、液体の形態で貯蔵することができ、ＨＳＡ、アミノ酸、又は保存剤などの安定化の添加物を必要としないＧ−ＣＳＦ調製物を生成することが、本発明の根底をなす問題点である。この方法で、製剤の耐容性に関するあらゆるリスクを回避することが好ましい貯蔵安定性のＧ−ＣＳＦ液体製剤を提供しなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にしたがい、請求項１の主題によって、この問題は解決される。好ましい実施形態は従属請求項に規定されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＨＳＡ、アミノ酸、又は高分子の安定化剤の非存在下でも、緩衝物質として酢酸塩、ならびに界面活性剤としてポリソルベート２０及び／又はポリソルベート８０を含み、４．１〜４．４の間の範囲のｐＨ値を有する液体のＧ−ＣＳＦ組成物は、安定性を大幅に失わずに、より長期間、液体の形態で貯蔵することができることが見出された。
【００１２】
したがって、本発明は、有効薬剤としての組換えのヒトＧ−ＣＳＦの他に、バッファとして酢酸塩、及び界面活性剤としてポリソルベート２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ２０とも呼ばれる）又はポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Ｔｗｅｅｎ８０とも呼ばれる）又はこれらの混合物を含み、４．１〜４．４の間の範囲のｐＨ値を有する、Ｇ−ＣＳＦの、貯蔵安定性の水溶液製剤に関する。
【００１３】
好ましい１実施形態では、界面活性剤はポリソルベート２０である。
しかし、さらなるポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルは、本発明の製剤において、洗浄剤としての使用にも適することも見出された。
【００１４】
一般的に、界面活性剤は、溶液の全体積に関して、０．０００５％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）の間の範囲の、好適には０．００１％（ｗ／ｖ）〜０．０１％の間の範囲の、特に好適には０．００２％（ｗ／ｖ）〜０．００８％の間の範囲の、最適には０．００４％（ｗ／ｖ）〜０．００６％（ｗ／ｖ）の間の範囲の濃度で含まれる。通常、本発明による製剤は、０．００４％（ｗ／ｖ）、０．００５％（ｗ／ｖ）、又は０．００６％（ｗ／ｖ）の濃度の、表面活性剤であるポリソルベート２０及びポリソルベート８０のうちの少なくとも一方を含む。
【００１５】
緩衝物質である酢酸塩の濃度は、本発明にしたがって４．１〜４．４の間の範囲のｐＨ値で、ｐＨ安定化効果及び十分な緩衝能の両方が達成され、同時に、凝集物の形成を避けるために、イオン濃度、したがって電動度ができるだけ低く維持されるような方法で選択するのが好ましい。一般に、酢酸塩は、０．５〜１５０ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲の、好適には１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲の、特に好適には２〜５０ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲の、最適には５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの間の濃度で含まれる。通常、酢酸塩の濃度は１０ｍｍｏｌ／ｌである。
【００１６】
緩衝物質である酢酸塩は、遊離の酸の形態、及び塩の形態の両方で使用することができ
る。塩としては、特に、生理学的に許容できる塩、例えば、アルカリ又はアンモニウムの塩、好適にはナトリウム塩が使用される。
【００１７】
製剤のｐＨ値は、４．０より大きく４．５まで、特に４．１〜４．４の間、好適には４．１〜４．３の間、又は４．１５〜４．３５の間、特に好適には４．２と４．３の間、又は４．２５〜４．３５の間、特に好適には４．２５〜４．３の間の範囲内、最適には約４．２５もしくは約４．３にある。
【００１８】
所望により、組成物のｐＨ値を、さらなる酸又は塩基の助けで、４．０を超え４．５まで、４．１〜４．４まで、４．１〜４．３まで、４．１５〜４．３５まで、４．２〜４．３まで、又は４．２５〜４．３５まで、４．２５〜４．３まで、又は約４．２５もしくは約４．３に、さらに調節することができる。適切な酸は、例えば、塩酸、リン酸、クエン酸、及びリン酸水素ナトリウム又はカリウムである。適切な塩基は、例えば、アルカリ及びアルカリ土類の水酸化物、アルカリ炭酸塩、アルカリ酢酸塩、アルカリクエン酸塩、及びリン酸水素二アルカリ、例えば、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及び二カリウム、ならびにアンモニアである。
【００１９】
好適には、ＮａＯＨによってｐＨ値を調節する。１実施形態では、ＮａＯＨでｐＨ値を調節した結果として、本発明の製剤は、このようにナトリウムイオンをさらに含む。
１実施形態では、製剤は、薬学的に許容できる添加物として多価アルコール、特に糖アルコール、特に好適にはマンニトール又はソルビトールをさらに含む。前記の添加剤は、患者の血液と等張である本発明の組成物を作成するのに、等張化剤として特に適している。
【００２０】
通常、多価アルコールの濃度は、組成物の全体積に関して、最高１０．０％（ｗ／ｖ）である。好適には、濃度は最高８．０％（ｗ／ｖ）であり、特に好適には最高６．０％（ｗ／ｖ）である。特に好適には、５．０％（ｗ／ｖ）の濃度のソルビトール又はマンニトールが含まれる。
【００２１】
Ｇ−ＣＳＦの濃度は、本発明による液体製剤を貯蔵し、最終的に適用する、プレフィルド・シリンジにおける薬剤のそれぞれ望ましい濃度に依存する。Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）商品（ＲＯＴＥ ＬＩＳＴＥ ２００５、Ｎｏ．５１ ０３８）は、例えば、以下の濃度において入手可能である：３００μｇ／０．５ｍｌ；４８０μｇ／０．５ｍｌ及び３００μｇ／１．０ｍｌ。本明細書では、タンパク質１０μｇは、約１．０百万国際単位（ＩＵ）に相当する。グラノサイト商品（ＲＯＴＥ ＬＩＳＴＥ、Ｎｏ．５１ ０３６）の場合は、組換えのＧ−ＣＳＦの活性がわずかに高く、この場合、タンパク質１０μｇは１．２８百万ＩＵの活性に相当する。
【００２２】
本発明の範囲内では、典型的なＧ−ＣＳＦの濃度は、０．０１と３．０ｍｇ／ｍｌの間であり、好適には０．１と２．５ｍｇ／ｍｌの間であり、特に好適には０．５と２．０ｍｇ／ｍｌの間の範囲であり、最適には０．６と１．５ｍｇ／ｍｌの間である。０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．９６ｍｇ／ｍｌの濃度が、好ましい実施形態を代表する。ここでは、通常使用するＧ−ＣＳＦの活性は、約１．０±０．６ｘ１０８単位／ｍｇである。
【００２３】
しばしばバルク溶液と呼ばれる、より高濃度の出発溶液では、薬剤の濃度は、より高くてよく、場合によっては５μｇ／ｍｌであるか、あるいはそれを超える。
本発明による組成物は、さらに慣例的な、特に生理学的に許容できる、安定化剤、及び／又は賦形剤、又は添加剤を含むことができる。例えば、さらなる界面活性剤、等張化剤、還元剤、抗酸化剤、錯化剤、共溶媒、希釈剤、及びカオトロピック剤。
【００２４】
しかし、製剤があらゆる高分子の安定化剤を含まないのが好ましい。したがって、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、シクロデキストリンだけではなく、ＨＳＡ及び他の血漿タンパク質などのタンパク質、又はゼラチンも除外するべきである。
【００２５】
注射の目的では、純水を用いるのが好ましい。しかし、薬剤調製物に適するさらなる慣例的な溶媒も使用することができる。しかし、グリセロール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコールなどの溶媒は除外するのが好ましい。
【００２６】
酒石酸塩、コハク酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、及びトリシンなどの緩衝物質の使用も除外する。
好適には、アミノ酸の安定化剤も除外する。
【００２７】
全体的に、製剤における様々な賦形剤の数をできるだけ低く保つのが好ましい。それに応じて、マンニトール又はソルビトール以外の糖は避けるのが好適に、製剤に含まれる緩衝物質を、専ら酢酸塩に狭めることが好ましい。
【００２８】
製剤の成分は、従来の供給源、例えば、シグマ社又はメルク社から入手できる。
組換えのＧ−ＣＳＦは、最先端のプロトコルにしたがって、生成し、精製することができる。
【００２９】
Ｇ−ＣＳＦは、造血前駆細胞の分化及び増殖を増強することができ、造血系の成熟細胞の活性化をもたらすことができる、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦである。したがって、Ｇ−ＣＳＦ製剤は、Ｇ−ＣＳＦの投与が有利である場合に適応症を処置するのに適している。「生物学的に活性なヒトＧ−ＣＳＦ」の語は、Ｇ−ＣＳＦの突然変異体及び修飾も含み、これらのアミノ酸配列は、野性型の配列に比べて変更されているが、例えば、国際公開第０１／８７９２５号及びＥＰ０ ４５６ ２００に記載されているものなどの野生型のＧ−ＣＳＦと同様の生物学的活性を有する。本発明の意味におけるＧ−ＣＳＦは、例えば、ポリアルキレングリコールなどのポリマーと、特に、いわゆるＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦもしくはＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのように、ポリエチレングリコールと、又はヒドロキシアルキルデンプン、特にヒドロキシエチルデンプンと、タンパク質が複合型で存在するＧ−ＣＳＦ複合体も意味する。Ｇ−ＣＳＦは、グリコシル化されていてよく、又は非グリコシル化でもよい。大腸菌で生成される組換えのタンパク質は炭水化物構造を有さず、Ｎ末端がメチオニン残基で発現されるが、例えば、ＣＨＯ細胞などの真核細胞で生成されるＧ−ＣＳＦは、通常グリコシル化されている。
【００３０】
液体製剤に含まれるＧ−ＣＳＦが、大腸菌細胞で生成されるヒトＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦであるのが好ましい。大腸菌細胞における発現には、様々な発現系が市販されている。適切には、例えば、誘導プロモーター、例えばＩＰＴＧ誘導プロモーターのコントロール化での、ヒトＧ−ＣＳＦの発現である。例えば、サムブルック及びラッセル、分子クローニング−実験マニュアル、第３版、２００１年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス［コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州所在］、第１５章、又は、例えばプロメガもしくはストラタジーンによる、製造元の確立されたプロトコルを参照されたい。
【００３１】
宿主細胞の発酵は、それらが特許及び科学文献に記載されているように、大腸菌で過剰発現されるＧ−ＣＳＦを含む、いわゆる封入体を回収し、前記封入体をすすぎ、可溶化し、リフォールディングし、クロマトグラフィで精製することを含めた、その後の精製ができるように、標準のプロトコルにしたがって行うことができる。適切なプロトコルは、特
許文献及びタンパク質化学の標準の参考書の両方に、ならびに実験マニュアルに見ることができる。
【００３２】
可溶化及びリフォールディングを含めたＧ−ＣＳＦの単離及び精製は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ７１９ ８６０に記載されている。変性したタンパク質を可溶化し復元するための一般的な技術は、ヨーロッパ特許出願公開第５１２０９７号明細書、ヨーロッパ特許出願公開第３６４９２６号明細書、ヨーロッパ特許出願公開第２１９８７４号明細書、及び国際公開第０１／８７９２５号パンフレットに記載されており、タンパク質化学の科学文献及び標準的な参考書からさらに理解することができる。
【００３３】
リフォールディングしたタンパク質を、引き続きクロマトグラフィ法によって精製する、すなわち、リフォールディングしたタンパク質を他のタンパク質、ならびに可溶化及び復元後に含まれるさらなる汚染から分離する。
【００３４】
数ある中でも、上記ですでに言及し、大腸菌の宿主細胞におけるＧ−ＣＳＦの生成が始めて記載された特許文献である国際公開第８７／０１１３２Ａ１号パンフレットは、クロマトグラフィの精製を扱っている。組換えのＧ−ＣＳＦを精製する状況では、国際公開第８７／０１１３２Ａ１号パンフレットにおける実施例７で、ＣＭセルロースカラムを用いて陽イオン交換クロマトグラフィを行っている。
【００３５】
ヨーロッパ特許出願公開第７１９８９０Ａ１号明細書では、Ｇ−ＣＳＦを可溶化及び酸化の後で精製し、可溶化剤をＤｏｗｅｘ処理により、その後陰イオン交換クロマトグラフィ及び陽イオン交換クロマトグラフィにより除去している。ヨーロッパ特許出願公開第７１９８６０Ａ１号明細書では、ＣＭセファロースを、やはり陽イオン交換クロマトグラフィに用いている。
【００３６】
国際公開第０３／０５１９２２Ａ１号パンフレットには、Ｇ−ＣＳＦの精製方法が記載されており、そこでは金属親和性クロマトグラフィ、より正確には固定化金属親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を行っている。国際公開第０３／０５１９２２号パンフレットでは、金属アフィニティクロマトグラフィの後、陽イオン交換クロマトグラフィ及び／又はゲルろ過を行うことができる。
【００３７】
国際公開第０１／０４１５４Ａ１号パンフレットでは、Ｇ−ＣＳＦを精製するための方法が記載されており、そこでは最初に疎水性相互作用クロマトグラフィを、その後ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィを行う。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィの後、陽イオン交換クロマトグラフィを行う。
【００３８】
本発明の製剤に配合されるＧ−ＣＳＦの純度は、少なくとも９５％、好適には少なくとも９７％、特に好適には少なくとも９９％、最適には９９％を超える量でなければならない。ここでは、純度はＨＰＬＣ分析によって調べることができる。したがって、ｒｐ−ＳＥＣ及びＩＥＸ分析が適切である。当業者であれば、バイダック（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｙｄａｃ．ｃｏｍ）又は東ソーバイオサイエンス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｏｓｏｈｂｉｏｓｅｐ．ｄｅ）などの供給業者が供給する製品情報から、ｒｐＨＰＬＣ又はＳＥＣ−ＨＰＬＣを行うのに適する材料及びプロトコルを得ることができる。
【００３９】
本発明による調製物では、９９％を超える、好適には９９．５％を超える純度のＧ−ＣＳＦが、通常用いられる。 好適には、使用するＧ−ＣＳＦの活性は、５００００ＩＵ／μｇより低くてはならず、８００００ＩＵ／μｇの活性を有するＧ−ＣＳＦが特に適切であり、最も適切であるのは約１０００００ＩＵ／μｇ又はそれを超える活性を有するＧ−ＣＳＦである。
【００４０】
Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの収量の決定は、ハーマン（Ｈｅｒｍａｎ）ら、（１９９６年）Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９巻、３０３〜３２８頁にも記載されている。ここでは、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの抽出率を、ピーク面積を積分し、消衰係数に基づいて変換することによって決定する。
【００４１】
精製の後、Ｇ−ＣＳＦをその量及び活性に関して分析することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後クーマシー・ブリリアント・ブルー染色により、又はｒｐＨＰＬＣにより、定性分析を行うことができる。市販のＧ−ＣＳＦ調製物を、分析用の標準として用いることができる。さらに、ペプチドマップ又は質量分析を行うことができる。精製したＧ−ＣＳＦの活性を、例えば、シラフジら、（１９８９年）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１７巻（２）、１１６〜１１９頁；オーエダ（Ｏｈ−Ｅｄａ）ら、（１９９０年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻（２０）、１１４３２〜１１４３５頁；スチュート（Ｓｔｕｔｅ）ら、（１９９２年）Ｂｌｏｏｄ、７９巻（１１）、２８４９〜２８５４頁、及びオシマ（Ｏｓｈｉｍａ）ら、（２０００年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２６７巻（３）、９２４〜９２７頁に記載されているものなど、様々な生物学的試験方法によって決定することができる。
【００４２】
ちなみに、クロマトグラフィは全て、（例えば、流速、洗浄又は溶出に用いるカラム容積、カラムの直径及びベッド高さなどに関して）マトリックス又はカラムの供給業者の推奨及びプロトコルにしたがって行われる。
【００４３】
得られた組換えのＧ−ＣＳＦの生物学的活性を、バイオアッセイにより決定することができ、標準の、すなわち市販のＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））の生物学的活性と比較することができる。この目的では、Ｇ−ＣＳＦに反応性である、マウス細胞株ＮＦＳ−６０を用いることができる。この目的では、前記細胞株を、１．５ｇ／ｌ炭酸ナトリウム、４．５ｇ／ｌグルコース、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを含み、２ｍＭグルタミン、１０％ＦＣＳ、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、及び６０ｎｇ／ｍｌＧ−ＣＳＦを補ったＲＰＭＩ １６４０培地（バッヘム（Ｂａｃｈｅｍ）、［ドイツ、ハイデルベルグ所在］）で培養する。
【００４４】
活性試験用に、Ｇ−ＣＳＦを含まない培地で細胞を２回洗浄し、１ウェルあたり２ｘ１０４細胞の濃度で９６ウェルプレートに接種し、様々な濃度の、精製Ｇ−ＣＳＦ及びスタンダードで、３７℃、４．５％ＣＯ２で３日間培養した。引き続き、細胞をＸＴＴ試薬で染色し、マイクロタイター・プレート・リーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。この場合は、２つのＧ−ＣＳＦサンプルの等しい生物学的活性が想定できるので、得られたＧ−ＣＳＦで処理した細胞が、スタンダード（例えば、Ｎｅｕｐｏｒｇｅｎ商品（登録商標））で処理した細胞と同様に増殖するのが望ましい。
【００４５】
製剤の生成も、当技術分野では慣例的な方法にしたがって行う。
慣例的には、バッファ及び界面活性剤の成分、ならびに、任意選択でさらなる薬学的に許容できる賦形剤を、最初に、水性溶媒、通常は滅菌水に適量溶解する。所望により、ｐＨ値を、酢酸塩溶液により、又は上記に記載した例示のものなどの他の酸もしくは塩基で調節する。慣例的な滅菌ステップの後、例えば、滅菌フィルターによりろ過し、望ましい濃度のＧ−ＣＳＦを添加する。しかし、水溶液のＧ−ＣＳＦを提供し、その後ｐＨを酢酸塩及び／又は適切な酸もしくは塩基で、好適にはＮａＯＨで所望の値に調節することも容易に可能である。
【００４６】
最終的には、調製した液体製剤を、適切な容器中に充填し、それを適用まで貯蔵する。特に、容器はプレフィルド・シリンジ、バイアル、又はアンプルである。
本発明による組成物を、様々な投与形態で用いることができる。本発明による製剤は、例えば、特に、静脈内、筋肉内、又は皮下投与のための、注射又は注入の溶液として適している。しかし、組成物を、トランスフェルソーム、リポソーム、又はヒドロゲルなどの他の投与形態を生成するためにも用いることができる。
【００４７】
本発明による液体製剤は、免疫原性の可能性のある化合物を除外し、全体で可能な最小の数の成分を含むという利点を提供するだけではなく、あらゆる段階の生成過程で凍結乾燥を必要としないという利点も提供する。したがって、一方では、凍結乾燥に関する費用を省き、他方では、例えば、凍結乾燥物が完全に、又は十分に再構成できない場合などの、機械的な問題のリスクが回避される。
【００４８】
本発明の範囲内では、「貯蔵安定性」は、Ｇ−ＣＳＦ液体製剤を２５℃で３カ月貯蔵した後、活性なＧ−ＣＳＦ分子の含有量が、依然として最初の濃度の８０％又はそれを超えていることを意味することが理解される。好適には、Ｇ−ＣＳＦ活性の残留の含有量は、２５℃で３カ月間貯蔵後、依然として、最初の活性の少なくとも８５％であり、より好適には少なくとも９０％であり、最適には少なくとも９５％である。Ｇ−ＣＳＦの活性を、当技術分野においてＧ−ＣＳＦに対してすでに記載したような慣例的な活性試験によって決定することができる。
【００４９】
本発明の範囲内では、「液体製剤」の語は、Ｇ−ＣＳＦの製剤は、製剤に含まれるさらなる物質と一緒に、生成過程のあらゆる段階において、すなわち、物質を混合する前、又は間、又は後に凍結乾燥せず、また製剤は、注射溶液又は注入溶液として、静脈内又は皮下に適用するよう企図されることを意味することが理解される。
【００５０】
好ましい１実施形態では、製剤は、薬剤であるＧ−ＣＳＦ；ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、又はそれらの混合物から選択される界面活性剤；酢酸塩、ソルビトール、ナトリウムイオン、及び水以外のさらなる成分を含まず、４．２〜４．３の間の範囲の、又は４．２５〜４．３５の間の範囲の、特に４．２５〜４．３の間の範囲のｐＨ値を有する。製剤における唯一の界面活性剤としてポリソルベート２０を用いるのが、特に好ましい。
（実施例）
以下の実施例を用いて本発明を説明するが、それらによって本発明は限定されない。
【００５１】
Ｇ−ＣＳＦを含む組成物を、まず、緩衝物質であるナトリウム塩の形態の酢酸塩を、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０及びソルビトールと一緒に、蒸留かつ滅菌した水に溶解し、その後、ｐＨ値をＮａＯＨで、４．２と４．３の間の望ましい値に調節することによって調製した。望ましい濃度の非グリコシル化の組換えヒトＧ−ＣＳＦ（フィルグラスチム、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ）を加えた。プレフィルド・シリンジにおける、製剤の調製及び充填は、好適には、窒素雰囲気下で行った。
【００５２】
本発明にしたがって調製した組成物の具体的な処方、及びそのｐＨ値を、以下の表に示す。ポリソルベート２０の代わりにポリソルベート８０を使用しても、匹敵する結果がもたらされた。同様のことが、ソルビトールの代わりにマンニトールを使用することにも適用される。
【００５３】
【表１】
【００５４】
本発明による製剤を、様々な温度で、様々な期間、ｐＨ値４．０を有する対応する製剤と一緒に貯蔵したが、これらは最新技術を代表するものであり、比較製剤として役割を果たした。
【００５５】
長期間安定性の分析からのデータをいくつか、添付の図に表す（各場合においてＧ−ＣＳＦ濃度０．６ｍｇ／ｍｌ）。図１，２はＳＥＣ分析を示し、図３，４はＩＥＸ分析を表し、各場合とも、それぞれ３０℃及び４０℃で、貯蔵時間は最高６カ月である。
【００５６】
全般的に見て、本発明による製剤は、比較製剤に匹敵する結果を示し、本発明による試験した製剤とは、より酸性のｐＨ値、すなわちｐＨ４．０を示すことだけが異なっていた。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＳＥＣ分析を示すグラフ。
【図２】ＳＥＣ分析を示すグラフ。
【図３】ＩＥＸ分析を示すグラフ。
【図４】ＩＥＸ分析を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦの貯蔵安定性の液体製剤、及びそれを生成するための方法に関する。特に、本発明は、有効成分としてＧ−ＣＳＦ、緩衝物質として酢酸塩、界面活性剤としてポリソルベート２０又はポリソルベート８０、ならびに任意選択で薬学的に許容できる賦形剤を含む液体製剤に関し、製剤は４．１〜４．４の間の範囲のｐＨ値を有する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）は、天然に存在する成長因子であり、より広義にはサイトカインのファミリーに、より正確にはコロニー刺激因子のグループに属する。Ｇ−ＣＳＦは、造血において決定的な役割を果たし、造血前駆細胞の増殖及び分化、ならびに好中球の活性化を増強する。例えば、化学療法もしくは照射法の後の正常の血球集団の再構成において、又は感染性の病原体に対する免疫反応を刺激するためなど、Ｇ−ＣＳＦを様々な医薬の領域に適用するのは、上記の特徴のためである。臨床的に実践する上で、Ｇ−ＣＳＦは、このように、主に、腫瘍の防止に、特に化学療法の結果としての好中球減少症の処置に、さらに骨髄移植の経過に、及び感染性疾患の処置に適用される。
【０００３】
Ｇ−ＣＳＦの組換えの生成は、１９８７年に、国際公開第８７／０１１３２号パンフレットにおける特許文献に最初に記載された。組換えＧ−ＣＳＦをベースにした、最初の市販のＧ−ＣＳＦ調製物は、１９９１年にドイツで認可され、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）の商標名の下にアムジェン（Ａｍｇｅｎ）が生成し、流通させている。
【０００４】
ドイツの医師用卓上参考書であるＲＯＴＥ ＬＩＳＴＥ ２００５によると、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）製品（プレフィルド・シリンジ）は、以下の成分からなる：６００μｇ／ｍｌ又は９６０μｇ／ｍｌの濃度のＧ−ＣＳＦ、酢酸ナトリウム、ソルビトール、ポリソルベート８０、及び水。
【０００５】
当技術分野では、様々な特許文献がＧ−ＣＳＦの薬剤調製物を扱っている。ＥＰ−Ａ−０ ３７３ ６７９では、Ｇ−ＣＳＦの製剤が記載されており、この製剤では、酸、酸性のｐＨ値、及び低伝導率の製剤の存在によって、タンパク質が安定化されている。
【０００６】
特許文献１は、概ね、薬学的に許容できる表面活性剤、糖類、タンパク質、又は薬学的に許容できる高分子化合物と組み合わせたＧ−ＣＳＦの使用に関する。
特許文献２には、マルトース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、ラフィノース、ショ糖、及びＧ−ＣＳＦを含む調製物を安定化させるためのさらなる糖の使用が記載されている。
【０００７】
特許文献３には、使用されるＧ−ＣＳＦの量より少ない量の界面活性剤及び緩衝物質を含む、Ｇ−ＣＳＦを含む調製物が開示されている。
特許文献４には、クロロブタノール、ベンジルアルコール、又はベンザルコニウムである保存剤を含む、Ｇ−ＣＳＦを含む製剤が記載されている。
【０００８】
特許文献５には、緩衝物質として、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、又はトリシンを含むＧ−ＣＳＦを含む製剤が開示されている。
特許文献６には、酸を含み界面活性剤を含まない、４．０を超えるｐＨ値を有するＧ−ＣＳＦの薬剤調製物が開示されている。
【特許文献１】ドイツ連邦共和国特許出願公開第３７２３７８１号明細書
【特許文献２】国際公開第９４／１４４６５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９４／１４４６６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９３／０３７４４号パンフレット
【特許文献５】ヨーロッパ特許出願公開第９８８８６１号明細書
【特許文献６】国際公開第２００５／０４２０２４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
より長期の間、液体の形態で貯蔵することができ、ＨＳＡ、アミノ酸、又は保存剤などの安定化の添加物を必要としないＧ−ＣＳＦ調製物を生成することが、本発明の根底をなす問題点である。この方法で、製剤の耐容性に関するあらゆるリスクを回避することが好ましい貯蔵安定性のＧ−ＣＳＦ液体製剤を提供しなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にしたがい、請求項１の主題によって、この問題は解決される。好ましい実施形態は従属請求項に規定されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＨＳＡ、アミノ酸、又は高分子の安定化剤の非存在下でも、緩衝物質として酢酸塩、ならびに界面活性剤としてポリソルベート２０及び／又はポリソルベート８０を含み、４．１〜４．４の間の範囲のｐＨ値を有する液体のＧ−ＣＳＦ組成物は、安定性を大幅に失わずに、より長期間、液体の形態で貯蔵することができることが見出された。
【００１２】
したがって、本発明は、有効薬剤としての組換えのヒトＧ−ＣＳＦの他に、バッファとして酢酸塩、及び界面活性剤としてポリソルベート２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ２０とも呼ばれる）又はポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Ｔｗｅｅｎ８０とも呼ばれる）又はこれらの混合物を含み、４．１〜４．４の間の範囲のｐＨ値を有する、Ｇ−ＣＳＦの、貯蔵安定性の水溶液製剤に関する。
【００１３】
好ましい１実施形態では、界面活性剤はポリソルベート２０である。
しかし、さらなるポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルは、本発明の製剤において、洗浄剤としての使用にも適することも見出された。
【００１４】
一般的に、界面活性剤は、溶液の全体積に関して、０．０００５％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）の間の範囲の、好適には０．００１％（ｗ／ｖ）〜０．０１％の間の範囲の、特に好適には０．００２％（ｗ／ｖ）〜０．００８％の間の範囲の、最適には０．００４％（ｗ／ｖ）〜０．００６％（ｗ／ｖ）の間の範囲の濃度で含まれる。通常、本発明による製剤は、０．００４％（ｗ／ｖ）、０．００５％（ｗ／ｖ）、又は０．００６％（ｗ／ｖ）の濃度の、表面活性剤であるポリソルベート２０及びポリソルベート８０のうちの少なくとも一方を含む。
【００１５】
緩衝物質である酢酸塩の濃度は、本発明にしたがって４．１〜４．４の間の範囲のｐＨ値で、ｐＨ安定化効果及び十分な緩衝能の両方が達成され、同時に、凝集物の形成を避けるために、イオン濃度、したがって電動度ができるだけ低く維持されるような方法で選択するのが好ましい。一般に、酢酸塩は、０．５〜１５０ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲の、好適には１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲の、特に好適には２〜５０ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲の、最適には５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの間の濃度で含まれる。通常、酢酸塩の濃度は１０ｍｍｏｌ／ｌである。
【００１６】
緩衝物質である酢酸塩は、遊離の酸の形態、及び塩の形態の両方で使用することができ
る。塩としては、特に、生理学的に許容できる塩、例えば、アルカリ又はアンモニウムの塩、好適にはナトリウム塩が使用される。
【００１７】
製剤のｐＨ値は、４．０より大きく４．５まで、特に４．１〜４．４の間、好適には４．１〜４．３の間、又は４．１５〜４．３５の間、特に好適には４．２と４．３の間、又は４．２５〜４．３５の間、特に好適には４．２５〜４．３の間の範囲内、最適には約４．２５もしくは約４．３にある。
【００１８】
所望により、組成物のｐＨ値を、さらなる酸又は塩基の助けで、４．０を超え４．５まで、４．１〜４．４まで、４．１〜４．３まで、４．１５〜４．３５まで、４．２〜４．３まで、又は４．２５〜４．３５まで、４．２５〜４．３まで、又は約４．２５もしくは約４．３に、さらに調節することができる。適切な酸は、例えば、塩酸、リン酸、クエン酸、及びリン酸水素ナトリウム又はカリウムである。適切な塩基は、例えば、アルカリ及びアルカリ土類の水酸化物、アルカリ炭酸塩、アルカリ酢酸塩、アルカリクエン酸塩、及びリン酸水素二アルカリ、例えば、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及び二カリウム、ならびにアンモニアである。
【００１９】
好適には、ＮａＯＨによってｐＨ値を調節する。１実施形態では、ＮａＯＨでｐＨ値を調節した結果として、本発明の製剤は、このようにナトリウムイオンをさらに含む。
１実施形態では、製剤は、薬学的に許容できる添加物として多価アルコール、特に糖アルコール、特に好適にはマンニトール又はソルビトールをさらに含む。前記の添加剤は、患者の血液と等張である本発明の組成物を作成するのに、等張化剤として特に適している。
【００２０】
通常、多価アルコールの濃度は、組成物の全体積に関して、最高１０．０％（ｗ／ｖ）である。好適には、濃度は最高８．０％（ｗ／ｖ）であり、特に好適には最高６．０％（ｗ／ｖ）である。特に好適には、５．０％（ｗ／ｖ）の濃度のソルビトール又はマンニトールが含まれる。
【００２１】
Ｇ−ＣＳＦの濃度は、本発明による液体製剤を貯蔵し、最終的に適用する、プレフィルド・シリンジにおける薬剤のそれぞれ望ましい濃度に依存する。Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）商品（ＲＯＴＥ ＬＩＳＴＥ ２００５、Ｎｏ．５１ ０３８）は、例えば、以下の濃度において入手可能である：３００μｇ／０．５ｍｌ；４８０μｇ／０．５ｍｌ及び３００μｇ／１．０ｍｌ。本明細書では、タンパク質１０μｇは、約１．０百万国際単位（ＩＵ）に相当する。グラノサイト商品（ＲＯＴＥ ＬＩＳＴＥ、Ｎｏ．５１ ０３６）の場合は、組換えのＧ−ＣＳＦの活性がわずかに高く、この場合、タンパク質１０μｇは１．２８百万ＩＵの活性に相当する。
【００２２】
本発明の範囲内では、典型的なＧ−ＣＳＦの濃度は、０．０１と３．０ｍｇ／ｍｌの間であり、好適には０．１と２．５ｍｇ／ｍｌの間であり、特に好適には０．５と２．０ｍｇ／ｍｌの間の範囲であり、最適には０．６と１．５ｍｇ／ｍｌの間である。０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．９６ｍｇ／ｍｌの濃度が、好ましい実施形態を代表する。ここでは、通常使用するＧ−ＣＳＦの活性は、約１．０±０．６ｘ１０８単位／ｍｇである。
【００２３】
しばしばバルク溶液と呼ばれる、より高濃度の出発溶液では、薬剤の濃度は、より高くてよく、場合によっては５μｇ／ｍｌであるか、あるいはそれを超える。
本発明による組成物は、さらに慣例的な、特に生理学的に許容できる、安定化剤、及び／又は賦形剤、又は添加剤を含むことができる。例えば、さらなる界面活性剤、等張化剤、還元剤、抗酸化剤、錯化剤、共溶媒、希釈剤、及びカオトロピック剤。
【００２４】
しかし、製剤があらゆる高分子の安定化剤を含まないのが好ましい。したがって、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、シクロデキストリンだけではなく、ＨＳＡ及び他の血漿タンパク質などのタンパク質、又はゼラチンも除外するべきである。
【００２５】
注射の目的では、純水を用いるのが好ましい。しかし、薬剤調製物に適するさらなる慣例的な溶媒も使用することができる。しかし、グリセロール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコールなどの溶媒は除外するのが好ましい。
【００２６】
酒石酸塩、コハク酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、及びトリシンなどの緩衝物質の使用も除外する。
好適には、アミノ酸の安定化剤も除外する。
【００２７】
全体的に、製剤における様々な賦形剤の数をできるだけ低く保つのが好ましい。それに応じて、マンニトール又はソルビトール以外の糖は避けるのが好適に、製剤に含まれる緩衝物質を、専ら酢酸塩に狭めることが好ましい。
【００２８】
製剤の成分は、従来の供給源、例えば、シグマ社又はメルク社から入手できる。
組換えのＧ−ＣＳＦは、最先端のプロトコルにしたがって、生成し、精製することができる。
【００２９】
Ｇ−ＣＳＦは、造血前駆細胞の分化及び増殖を増強することができ、造血系の成熟細胞の活性化をもたらすことができる、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦである。したがって、Ｇ−ＣＳＦ製剤は、Ｇ−ＣＳＦの投与が有利である場合に適応症を処置するのに適している。「生物学的に活性なヒトＧ−ＣＳＦ」の語は、Ｇ−ＣＳＦの突然変異体及び修飾も含み、これらのアミノ酸配列は、野性型の配列に比べて変更されているが、例えば、国際公開第０１／８７９２５号及びＥＰ０ ４５６ ２００に記載されているものなどの野生型のＧ−ＣＳＦと同様の生物学的活性を有する。本発明の意味におけるＧ−ＣＳＦは、例えば、ポリアルキレングリコールなどのポリマーと、特に、いわゆるＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦもしくはＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのように、ポリエチレングリコールと、又はヒドロキシアルキルデンプン、特にヒドロキシエチルデンプンと、タンパク質が複合型で存在するＧ−ＣＳＦ複合体も意味する。Ｇ−ＣＳＦは、グリコシル化されていてよく、又は非グリコシル化でもよい。大腸菌で生成される組換えのタンパク質は炭水化物構造を有さず、Ｎ末端がメチオニン残基で発現されるが、例えば、ＣＨＯ細胞などの真核細胞で生成されるＧ−ＣＳＦは、通常グリコシル化されている。
【００３０】
液体製剤に含まれるＧ−ＣＳＦが、大腸菌細胞で生成されるヒトＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦであるのが好ましい。大腸菌細胞における発現には、様々な発現系が市販されている。適切には、例えば、誘導プロモーター、例えばＩＰＴＧ誘導プロモーターのコントロール化での、ヒトＧ−ＣＳＦの発現である。例えば、サムブルック及びラッセル、分子クローニング−実験マニュアル、第３版、２００１年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス［コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州所在］、第１５章、又は、例えばプロメガもしくはストラタジーンによる、製造元の確立されたプロトコルを参照されたい。
【００３１】
宿主細胞の発酵は、それらが特許及び科学文献に記載されているように、大腸菌で過剰発現されるＧ−ＣＳＦを含む、いわゆる封入体を回収し、前記封入体をすすぎ、可溶化し、リフォールディングし、クロマトグラフィで精製することを含めた、その後の精製ができるように、標準のプロトコルにしたがって行うことができる。適切なプロトコルは、特
許文献及びタンパク質化学の標準の参考書の両方に、ならびに実験マニュアルに見ることができる。
【００３２】
可溶化及びリフォールディングを含めたＧ−ＣＳＦの単離及び精製は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ７１９ ８６０に記載されている。変性したタンパク質を可溶化し復元するための一般的な技術は、ヨーロッパ特許出願公開第５１２０９７号明細書、ヨーロッパ特許出願公開第３６４９２６号明細書、ヨーロッパ特許出願公開第２１９８７４号明細書、及び国際公開第０１／８７９２５号パンフレットに記載されており、タンパク質化学の科学文献及び標準的な参考書からさらに理解することができる。
【００３３】
リフォールディングしたタンパク質を、引き続きクロマトグラフィ法によって精製する、すなわち、リフォールディングしたタンパク質を他のタンパク質、ならびに可溶化及び復元後に含まれるさらなる汚染から分離する。
【００３４】
数ある中でも、上記ですでに言及し、大腸菌の宿主細胞におけるＧ−ＣＳＦの生成が始めて記載された特許文献である国際公開第８７／０１１３２Ａ１号パンフレットは、クロマトグラフィの精製を扱っている。組換えのＧ−ＣＳＦを精製する状況では、国際公開第８７／０１１３２Ａ１号パンフレットにおける実施例７で、ＣＭセルロースカラムを用いて陽イオン交換クロマトグラフィを行っている。
【００３５】
ヨーロッパ特許出願公開第７１９８９０Ａ１号明細書では、Ｇ−ＣＳＦを可溶化及び酸化の後で精製し、可溶化剤をＤｏｗｅｘ処理により、その後陰イオン交換クロマトグラフィ及び陽イオン交換クロマトグラフィにより除去している。ヨーロッパ特許出願公開第７１９８６０Ａ１号明細書では、ＣＭセファロースを、やはり陽イオン交換クロマトグラフィに用いている。
【００３６】
国際公開第０３／０５１９２２Ａ１号パンフレットには、Ｇ−ＣＳＦの精製方法が記載されており、そこでは金属親和性クロマトグラフィ、より正確には固定化金属親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を行っている。国際公開第０３／０５１９２２号パンフレットでは、金属アフィニティクロマトグラフィの後、陽イオン交換クロマトグラフィ及び／又はゲルろ過を行うことができる。
【００３７】
国際公開第０１／０４１５４Ａ１号パンフレットでは、Ｇ−ＣＳＦを精製するための方法が記載されており、そこでは最初に疎水性相互作用クロマトグラフィを、その後ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィを行う。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィの後、陽イオン交換クロマトグラフィを行う。
【００３８】
本発明の製剤に配合されるＧ−ＣＳＦの純度は、少なくとも９５％、好適には少なくとも９７％、特に好適には少なくとも９９％、最適には９９％を超える量でなければならない。ここでは、純度はＨＰＬＣ分析によって調べることができる。したがって、ｒｐ−ＳＥＣ及びＩＥＸ分析が適切である。当業者であれば、バイダック（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｙｄａｃ．ｃｏｍ）又は東ソーバイオサイエンス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｏｓｏｈｂｉｏｓｅｐ．ｄｅ）などの供給業者が供給する製品情報から、ｒｐＨＰＬＣ又はＳＥＣ−ＨＰＬＣを行うのに適する材料及びプロトコルを得ることができる。
【００３９】
本発明による調製物では、９９％を超える、好適には９９．５％を超える純度のＧ−ＣＳＦが、通常用いられる。 好適には、使用するＧ−ＣＳＦの活性は、５００００ＩＵ／μｇより低くてはならず、８００００ＩＵ／μｇの活性を有するＧ−ＣＳＦが特に適切であり、最も適切であるのは約１０００００ＩＵ／μｇ又はそれを超える活性を有するＧ−ＣＳＦである。
【００４０】
Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの収量の決定は、ハーマン（Ｈｅｒｍａｎ）ら、（１９９６年）Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９巻、３０３〜３２８頁にも記載されている。ここでは、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの抽出率を、ピーク面積を積分し、消衰係数に基づいて変換することによって決定する。
【００４１】
精製の後、Ｇ−ＣＳＦをその量及び活性に関して分析することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後クーマシー・ブリリアント・ブルー染色により、又はｒｐＨＰＬＣにより、定性分析を行うことができる。市販のＧ−ＣＳＦ調製物を、分析用の標準として用いることができる。さらに、ペプチドマップ又は質量分析を行うことができる。精製したＧ−ＣＳＦの活性を、例えば、シラフジら、（１９８９年）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１７巻（２）、１１６〜１１９頁；オーエダ（Ｏｈ−Ｅｄａ）ら、（１９９０年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻（２０）、１１４３２〜１１４３５頁；スチュート（Ｓｔｕｔｅ）ら、（１９９２年）Ｂｌｏｏｄ、７９巻（１１）、２８４９〜２８５４頁、及びオシマ（Ｏｓｈｉｍａ）ら、（２０００年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２６７巻（３）、９２４〜９２７頁に記載されているものなど、様々な生物学的試験方法によって決定することができる。
【００４２】
ちなみに、クロマトグラフィは全て、（例えば、流速、洗浄又は溶出に用いるカラム容積、カラムの直径及びベッド高さなどに関して）マトリックス又はカラムの供給業者の推奨及びプロトコルにしたがって行われる。
【００４３】
得られた組換えのＧ−ＣＳＦの生物学的活性を、バイオアッセイにより決定することができ、標準の、すなわち市販のＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））の生物学的活性と比較することができる。この目的では、Ｇ−ＣＳＦに反応性である、マウス細胞株ＮＦＳ−６０を用いることができる。この目的では、前記細胞株を、１．５ｇ／ｌ炭酸ナトリウム、４．５ｇ／ｌグルコース、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを含み、２ｍＭグルタミン、１０％ＦＣＳ、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、及び６０ｎｇ／ｍｌＧ−ＣＳＦを補ったＲＰＭＩ １６４０培地（バッヘム（Ｂａｃｈｅｍ）、［ドイツ、ハイデルベルグ所在］）で培養する。
【００４４】
活性試験用に、Ｇ−ＣＳＦを含まない培地で細胞を２回洗浄し、１ウェルあたり２ｘ１０４細胞の濃度で９６ウェルプレートに接種し、様々な濃度の、精製Ｇ−ＣＳＦ及びスタンダードで、３７℃、４．５％ＣＯ２で３日間培養した。引き続き、細胞をＸＴＴ試薬で染色し、マイクロタイター・プレート・リーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。この場合は、２つのＧ−ＣＳＦサンプルの等しい生物学的活性が想定できるので、得られたＧ−ＣＳＦで処理した細胞が、スタンダード（例えば、Ｎｅｕｐｏｒｇｅｎ商品（登録商標））で処理した細胞と同様に増殖するのが望ましい。
【００４５】
製剤の生成も、当技術分野では慣例的な方法にしたがって行う。
慣例的には、バッファ及び界面活性剤の成分、ならびに、任意選択でさらなる薬学的に許容できる賦形剤を、最初に、水性溶媒、通常は滅菌水に適量溶解する。所望により、ｐＨ値を、酢酸塩溶液により、又は上記に記載した例示のものなどの他の酸もしくは塩基で調節する。慣例的な滅菌ステップの後、例えば、滅菌フィルターによりろ過し、望ましい濃度のＧ−ＣＳＦを添加する。しかし、水溶液のＧ−ＣＳＦを提供し、その後ｐＨを酢酸塩及び／又は適切な酸もしくは塩基で、好適にはＮａＯＨで所望の値に調節することも容易に可能である。
【００４６】
最終的には、調製した液体製剤を、適切な容器中に充填し、それを適用まで貯蔵する。特に、容器はプレフィルド・シリンジ、バイアル、又はアンプルである。
本発明による組成物を、様々な投与形態で用いることができる。本発明による製剤は、例えば、特に、静脈内、筋肉内、又は皮下投与のための、注射又は注入の溶液として適している。しかし、組成物を、トランスフェルソーム、リポソーム、又はヒドロゲルなどの他の投与形態を生成するためにも用いることができる。
【００４７】
本発明による液体製剤は、免疫原性の可能性のある化合物を除外し、全体で可能な最小の数の成分を含むという利点を提供するだけではなく、あらゆる段階の生成過程で凍結乾燥を必要としないという利点も提供する。したがって、一方では、凍結乾燥に関する費用を省き、他方では、例えば、凍結乾燥物が完全に、又は十分に再構成できない場合などの、機械的な問題のリスクが回避される。
【００４８】
本発明の範囲内では、「貯蔵安定性」は、Ｇ−ＣＳＦ液体製剤を２５℃で３カ月貯蔵した後、活性なＧ−ＣＳＦ分子の含有量が、依然として最初の濃度の８０％又はそれを超えていることを意味することが理解される。好適には、Ｇ−ＣＳＦ活性の残留の含有量は、２５℃で３カ月間貯蔵後、依然として、最初の活性の少なくとも８５％であり、より好適には少なくとも９０％であり、最適には少なくとも９５％である。Ｇ−ＣＳＦの活性を、当技術分野においてＧ−ＣＳＦに対してすでに記載したような慣例的な活性試験によって決定することができる。
【００４９】
本発明の範囲内では、「液体製剤」の語は、Ｇ−ＣＳＦの製剤は、製剤に含まれるさらなる物質と一緒に、生成過程のあらゆる段階において、すなわち、物質を混合する前、又は間、又は後に凍結乾燥せず、また製剤は、注射溶液又は注入溶液として、静脈内又は皮下に適用するよう企図されることを意味することが理解される。
【００５０】
好ましい１実施形態では、製剤は、薬剤であるＧ−ＣＳＦ；ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、又はそれらの混合物から選択される界面活性剤；酢酸塩、ソルビトール、ナトリウムイオン、及び水以外のさらなる成分を含まず、４．２〜４．３の間の範囲の、又は４．２５〜４．３５の間の範囲の、特に４．２５〜４．３の間の範囲のｐＨ値を有する。製剤における唯一の界面活性剤としてポリソルベート２０を用いるのが、特に好ましい。
（実施例）
以下の実施例を用いて本発明を説明するが、それらによって本発明は限定されない。
【００５１】
Ｇ−ＣＳＦを含む組成物を、まず、緩衝物質であるナトリウム塩の形態の酢酸塩を、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０及びソルビトールと一緒に、蒸留かつ滅菌した水に溶解し、その後、ｐＨ値をＮａＯＨで、４．２と４．３の間の望ましい値に調節することによって調製した。望ましい濃度の非グリコシル化の組換えヒトＧ−ＣＳＦ（フィルグラスチム、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ）を加えた。プレフィルド・シリンジにおける、製剤の調製及び充填は、好適には、窒素雰囲気下で行った。
【００５２】
本発明にしたがって調製した組成物の具体的な処方、及びそのｐＨ値を、以下の表に示す。ポリソルベート２０の代わりにポリソルベート８０を使用しても、匹敵する結果がもたらされた。同様のことが、ソルビトールの代わりにマンニトールを使用することにも適用される。
【００５３】
【表１】
【００５４】
本発明による製剤を、様々な温度で、様々な期間、ｐＨ値４．０を有する対応する製剤と一緒に貯蔵したが、これらは最新技術を代表するものであり、比較製剤として役割を果たした。
【００５５】
長期間安定性の分析からのデータをいくつか、添付の図に表す（各場合においてＧ−ＣＳＦ濃度０．６ｍｇ／ｍｌ）。図１，２はＳＥＣ分析を示し、図３，４はＩＥＸ分析を表し、各場合とも、それぞれ３０℃及び４０℃で、貯蔵時間は最高６カ月である。
【００５６】
全般的に見て、本発明による製剤は、比較製剤に匹敵する結果を示し、本発明による試験した製剤とは、より酸性のｐＨ値、すなわちｐＨ４．０を示すことだけが異なっていた。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＳＥＣ分析を示すグラフ。
【図２】ＳＥＣ分析を示すグラフ。
【図３】ＩＥＸ分析を示すグラフ。
【図４】ＩＥＸ分析を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてＧ−ＣＳＦ、バッファとして酢酸塩、表面活性剤としてポリソルベート２０及びポリソルベート８０のうちの少なくとも一方、ならびに任意選択で薬学的に許容できる賦形剤を含み、４．１〜４．４の間の範囲のｐＨ値を有する、Ｇ−ＣＳＦの液体製剤。
【請求項２】
４．１〜４．３の間の範囲のｐＨ値を有する、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項３】
４．２〜４．３の間の範囲のｐＨ値を有する、請求項１又は２に記載の液体製剤。
【請求項４】
４．２５のｐＨ値を有する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
前記酢酸バッファの濃度が２ｍｍｏｌ／ｌと５０ｍｍｏｌ／ｌの間である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６】
前記酢酸バッファの濃度が１０ｍｍｏｌ／ｌである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
薬学的に許容できる賦形剤としてソルビトール及びマンニトールのうちの少なくとも一方を含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８】
ソルビトールを含む、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
保存剤を含まない、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１０】
アミノ酸を含まない、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１１】
高分子の安定化剤を含まない、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１２】
前記ｐＨをＮａＯＨで調節した、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１３】
ナトリウムイオンを含む、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１４】
Ｇ−ＣＳＦ、ポリソルベート２０及び／又はポリソルベート８０、ソルビトール、酢酸塩、及びナトリウムを含み、他の成分を含まない、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１５】
前記表面活性剤が、専らポリソルベート２０である、請求項１乃至１３に記載の製剤。
【請求項１６】
前記Ｇ−ＣＳＦタンパク質を、バッファとして酢酸塩、表面活性剤としてポリソルベート２０及び／又はポリソルベート８０、ならびに任意選択で薬学的に許容できる賦形剤を含む溶液と混合することを含む、請求項１乃至１５のいずれかに記載のＧ−ＣＳＦの液体製剤を生成するための方法。
【請求項１】
有効成分としてＧ−ＣＳＦ、バッファとして酢酸塩、表面活性剤としてポリソルベート２０及びポリソルベート８０のうちの少なくとも一方、ならびに任意選択で薬学的に許容できる賦形剤を含み、４．１〜４．４の間の範囲のｐＨ値を有する、Ｇ−ＣＳＦの液体製剤。
【請求項２】
４．１〜４．３の間の範囲のｐＨ値を有する、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項３】
４．２〜４．３の間の範囲のｐＨ値を有する、請求項１又は２に記載の液体製剤。
【請求項４】
４．２５のｐＨ値を有する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
前記酢酸バッファの濃度が２ｍｍｏｌ／ｌと５０ｍｍｏｌ／ｌの間である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６】
前記酢酸バッファの濃度が１０ｍｍｏｌ／ｌである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
薬学的に許容できる賦形剤としてソルビトール及びマンニトールのうちの少なくとも一方を含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８】
ソルビトールを含む、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
保存剤を含まない、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１０】
アミノ酸を含まない、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１１】
高分子の安定化剤を含まない、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１２】
前記ｐＨをＮａＯＨで調節した、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１３】
ナトリウムイオンを含む、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１４】
Ｇ−ＣＳＦ、ポリソルベート２０及び／又はポリソルベート８０、ソルビトール、酢酸塩、及びナトリウムを含み、他の成分を含まない、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１５】
前記表面活性剤が、専らポリソルベート２０である、請求項１乃至１３に記載の製剤。
【請求項１６】
前記Ｇ−ＣＳＦタンパク質を、バッファとして酢酸塩、表面活性剤としてポリソルベート２０及び／又はポリソルベート８０、ならびに任意選択で薬学的に許容できる賦形剤を含む溶液と混合することを含む、請求項１乃至１５のいずれかに記載のＧ−ＣＳＦの液体製剤を生成するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５２８３２７（Ｐ２００９−５２８３２７Ａ）
【公表日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５６７８５（Ｐ２００８−５５６７８５）
【出願日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５１９４７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９９１４５
【国際公開日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【出願人】（５０６２９２９９６）ビオシューティカルズ アールツナイミテル アクチェンゲゼルシャフト (3)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＡＲＺＮＥＩＭＩＴＴＥＬ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５１９４７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９９１４５
【国際公開日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【出願人】（５０６２９２９９６）ビオシューティカルズ アールツナイミテル アクチェンゲゼルシャフト (3)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＡＲＺＮＥＩＭＩＴＴＥＬ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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