ＧＤＦ−５を含む細胞外マトリックスで軟骨形成を誘発又は増強する方法
【課題】インビボ又はインビトロで軟骨形成を誘発又は増強する方法及び組成物を提供すること。
【解決手段】インビボ又はインビトロで軟骨形成を誘発又は増強する方法は、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、又はコラーゲンＩ型若しくはコラーゲンＩＩ型とヒアルロン酸塩との混合物、であってＧＤＦ−５を更に含有しているものを含む細胞外マトリックスに、インビボ又はインビトロで細胞を晒すことにより実行される。
【解決手段】インビボ又はインビトロで軟骨形成を誘発又は増強する方法は、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、又はコラーゲンＩ型若しくはコラーゲンＩＩ型とヒアルロン酸塩との混合物、であってＧＤＦ−５を更に含有しているものを含む細胞外マトリックスに、インビボ又はインビトロで細胞を晒すことにより実行される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨形成を誘発又は増強する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨の限られた再生能力は、退行性及び外傷性の関節損傷処置における主な障害物であると指摘されている。機能的関節表面を維持するには、関節の軟骨細胞が、成長又は分化因子から発生する細胞外信号、機械的刺激、細胞外マトリックスの特定成分との相互作用に対して応答することが必要とされる。本発明は、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、ヒアルロン酸塩を加えたコラーゲンＩ型、又はヒアルロン酸塩を加えたコラーゲンＩＩ型、及び、軟骨形成の成長活性において関節発生に関与する骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーのメンバーである分化因子−５（ＧＤＦ−５）からなる細胞外マトリックスについてのものである。
【０００３】
多くの細胞種においての協調的機能は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の不溶性分子と、成長因子を誘発する可溶性因子とに由来する細胞外信号の統合化によって制御されている。脊椎動物四肢の骨格成分は、間葉細胞から胚の発生中に誘発される。その骨格成分は、凝縮して軟骨及び骨を作る分化プログラムを開始させる。骨形成タンパク質は、骨格パターン化において間葉の凝縮に重要な役割を果たしており、これには関節形成プロセスが含まれる。これは、発生中の長い骨の軟骨コアを通して間葉の前軟骨凝縮段階でＧＤＦ−５が主に発見されることを示す、インサイチュハイブリダイゼーション及び免疫染色法に基づくものである。また、これは、四肢関節形成の約３０％の破壊をもたらす、ＧＤＦ−５のヌル突然変異（マウスbrachypodism座でのフレームシフト突然変異）に基づくものである。この突然変異には、前足及び後足における基部指骨と中央指骨との間での関節発生の完全な欠如が含まれる。軟骨形成及び関節形成にとって必要とされる、細胞の凝縮を制御するＧＤＦ−５の役割は、骨形成タンパク質機能の既知のアンタゴニストであるノギン遺伝子のヌル突然変異により更に証明される。ＧＤＦ−５発現の欠如から判断されるところによると、ノギンを欠如しているマウスでは、軟骨凝縮が始まっても関節形成プロセスは行われなかった。
【０００４】
人間の疾患及び骨格パターン化においての関節形成の重要性にもかかわらず、いつどこで関節が形成されるかを制御する分子メカニズムについては、ごくわずかなことしか知られていない。典型的に、四肢では、別々の成分の衝突又は並置によってではなく、むしろ比較的大きな骨格前駆体の分割によって関節が生じる。このプロセスは、以下のステップを含む一連のステップを通して起こる。すなわち、１）発生中の軟骨成分にわたって、横縞に広がる高密度の特定領域が初期的に形成されるステップ、２）プログラム化された細胞死と、インターゾーンの中央におけるマトリックス生産性の変化とにより、３層構造が作られるステップ、３）インターゾーンの２端における関節軟骨が分化するステップ、４）対向する骨格成分の間にギャップを作るように合体している、流体で満たされた空間が蓄積されるステップ。ＧＤＦ−５の発現は、インターゾーンが形態的に出現する２４時間から３６時間前に、関節発生領域において始まる。この発現は、特定の部位において少なくとも２−３日間続き、関節発生の３層化されたインターゾーン段階においてもなお顕著である。関節発生の後段階においては、ＧＤＦ−５の発現量は減少する。組換えｈＧＤＦ−５についての生物学的及び生化学的インビトロ分析により、ＧＤＦ−５の主な生理学的役割は、間葉前駆細胞の軟骨形成の初期段階に制限されるだろうということが提案されている。これは、以下に基づくものである。すなわち、１）ＧＤＦ−５が、ラットの四肢芽細胞で軟骨形成及び間葉の凝集を刺激すること、２）ＧＤＦ−５が、高分化型の造骨細胞種であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を使って測定されるアルカリフォスファターゼ活性を刺激できないこと、３）ＧＤＦ−５が、より原始的でより低分化のラット骨原性細胞ＲＯＢ−２６内のアルカリフォスファターゼ活性を刺激すること、４）ＧＤＦ−５が、間葉由来の低分化細胞においてより優勢に発現される、ＢＭＰｓ受容体の特徴的なヘテロダイマーに結合すること。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９８／３１３４５号
【特許文献２】特開平７−１１６２４０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，１９９６年，１３巻，２号，６５−７４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＧＤＦ−５を含む細胞外マトリックスにより、細胞内の軟骨形成を誘発又は強化する方法及び組成物についてのものである。この細胞外マトリックスは、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、ヒアルロン酸塩を加えたコラーゲンＩ型又はヒアルロン酸塩を加えたコラーゲンＩＩ型から成り、成長及び分化因子−５（ＧＤＦ−５）を含む。軟骨形成を誘発又は増強するＧＤＦ−５の有効量は、約１ｎｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌのマトリックスタンパク質である。マトリックスは、比較的固定された三次元構造を持つ固形の多孔質組成のものである。
【０００８】
より具体的には、以下の発明を提供する。
［１］ 細胞内の軟骨形成を誘発又は増強するための方法であって、前記細胞を、コラーゲンＩ型及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物に晒すステップを含む前記方法。
［２］ 細胞内の軟骨形成を誘発又は増強するための方法であって、前記細胞を、コラーゲンＩＩ型及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物に晒すステップを含む前記方法。
［３］ 細胞内の軟骨形成を誘発又は増強するための方法であって、前記細胞を、コラーゲンＩ型、ヒアルロン酸塩及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物に晒すステップを含む前記方法。
［４］ 細胞内の軟骨形成を誘発又は増強するための方法であって、前記細胞を、コラーゲンＩＩ型、ヒアルロン酸塩及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物に晒すステップを含む前記方法。
［５］ 前記細胞を晒すステップがインビボで起こる、上記［１］、［２］、［３］又は［４］記載の方法。
［６］ 前記細胞を晒すステップがインビトロで起こる、上記［１］、［２］、［３］又は［４］記載の方法。
［７］ 前記細胞が結合組織を構成する、上記［５］記載の方法。
［８］ 軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩ型の細胞外マトリックスを含む組成物。
［９］ 軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩＩ型の細胞外マトリックスを含む組成物。
［１０］ 軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩ型及びヒアルロン酸塩の細胞外マトリックスを含む組成物。
［１１］ 軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩＩ型及びヒアルロン酸塩の細胞外マトリックスを含む組成物。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
軟骨形成は、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、ヒアルロン酸塩を加えたコラーゲンＩ型、又はヒアルロン酸塩を加えたコラーゲンＩＩ型の細胞外マトリックス組成物でＧＤＦ−５を含むものによって誘発される。コラーゲンＩ型及びコラーゲンＩＩ型の各々は、骨及び軟骨において最も多量のＥＣＭタンパク質の代表である。
【００１０】
コラーゲンは、骨、けん、皮膚等から得ることができる。コラーゲン源は、どんな好都合の動物源であっても、哺乳動物又は鳥類であってもよい。その中には、牛、豚、ウマ等、又はニワトリ、七面鳥、又はコラーゲンのその他の家畜源が含まれる。
【００１１】
ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ-グルクロン酸単糖類が交互にβ１−４結合で連結したユニットと、β１−３グリコシド結合で連結した二糖ユニットとを含んだ天然にある多糖類である。通常は、ナトリウム塩として生じて、約５００００から８×１０６の範囲の分子量を有する。
【００１２】
典型的に、コラーゲン又はコラーゲン−ヒアルロン酸塩の混合物は、凍結乾燥によるマトリックスとして提供される。コラーゲン−ヒアルロン酸塩は、本明細書に援用されている米国特許第５８６６１６５号において記載されているようにして、活性フォルミルアルデヒドヒアルロン酸塩でコラーゲンを処理することによって作られる。また、コラーゲン-ヒアルロン酸塩の組成物は、凍結乾燥によるマトリックスとして提供される。
【００１３】
マトリックスは、ＧＤＦ−５の有効量で植え付けられることが好ましい。この有効量は、約１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌのマトリックスタンパク質である。
【００１４】
インビトロでの使用を示すために、精製された種々の細胞外マトリックスタンパク質上で、組換えヒトＧＤＦ−５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、３週間にわたってラット胎児の頭頂骨細胞（ＦＲＣ’ｓ）を培養し、形態レベルにおける分化、プロテオグリカンの全体的な合成及び堆積、そしてアグリカン及びコラーゲンＩＩ型の発現を評価した。この結果より、コラーゲンＩ型又はコラーゲンＩＩ型上でＦＲＣｓが培養された場合にのみ、ＧＤＦ−５が軟骨小結節形成を刺激することが示された。免疫組織学的及び転写分析での判定によると、アルシアンブルーで強く染色された軟骨小結節は、コラーゲンＩＩ型及びアグリカン発現に対して陽性を示した。小結節を囲む単層内の細胞は、軟骨形成マーカーに対して陰性であった。明らかな対照として、ＦＲＣ’ｓがフィブロネクチン、コラーゲンＩＶ型又は組織培養用のプラスチック上で培養された場合には、ＧＤＦ−５は軟骨形成を刺激しなかった。
【００１５】
コラーゲンＩ型及びコラーゲンＩＩ型、コラーゲンＩＶ型又はフィブロネクチンを含む異なるＥＣＭタンパク質で、先ず、プラスチックプレートを塗布した。この結果より、ＧＤＦ−５が、アルシアンブルー色素に強く結合する軟骨形成細胞の凝集体形成を刺激することが示された。これらの条件下においては、媒体のみ、コラーゲンＩＶ型又はフィブロネクチンの存在下で培養されたＦＲＣ中では、ＧＤＦ−５は特徴的な小結節の形成を刺激しない。プラスチックの培養用１２ウエル（コースター社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を、０．０１％（ｗ／ｖ）の上記細胞外マトリックスタンパク質で、３７℃で２時間にわたって塗布した。その後、未吸着のタンパク質を除去し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で２×１０５細胞／ウエルの密度において、ラット胎児の頭頂骨細胞を培養した。ＧＤＦ−５（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充した又は補充しなかった媒地中で、培養プレートを２１日間にわたって維持した。その後、上記プレートをアルシアンブルー色素（０．５％（ｗ／ｖ）の３％酢酸溶液）で一晩にわたって染色し、そして洗浄した後写真撮影をした。アルシアンブルーを計量するために、細胞を８Ｍの尿素で溶解し、分光光度計（モレキュラーデバイス社、サニーヴェール、カリフォルニア州）を使って染色量を計った。アルシアンブルーは、プロテオグリカンを含むアニオン系のタンパク質に結合すると示されているカチオン系の色素であるので、これらの結果は、ＧＤＦ−５が、ＦＲＣ亜集団の細胞の形態に変化を誘発することを提案している。
【００１６】
細胞の形態変化と軟骨形成プロセスとの関連性を調べるために、コラーゲンＩ型の存在下でＧＤＦ−５により処理されたＦＲＣ培養物から、トータル細胞ＲＮＡ及び細胞タンパク質を単離した。ＦＲＣ培養物から単離したトータル細胞ＲＮＡを、アグリカン、コラーゲンＩＩ型又はコラーゲンＩ型を増強するように設計したプライマーを使って半定量的なＰＣＲ分析にかけた。ＧＤＦ−５で処理された培養物中では、コラーゲンＩＩ型及びアグリカンのｍＲＮＡ発現は、各々約２倍及び約３倍に増大するという結果が示された。このような条件下では、コラーゲンＩ型のｍＲＮＡ発現が約２０％減少した。アグリカン及びコラーゲンＩＩ型の発現は、スロットブロット分析を使うことにより確証した。
【００１７】
全細胞溶解物（１００μｇ）を、８％又は５％のＳＤＳＰＡＧＥ上で電気泳動により分離し、イモビロンＰへ移し、コラーゲンＩＩ型又はアグリカンに特異的な抗体を使って免疫ブロットした。この結果より、コラーゲンＩＩ型又はアグリカンの定常状態レベルを、ＧＤＦ−５が非常に増加させることが示された。これらの条件下においては、ＦＲＣ細胞がコラーゲンＩ型の非存在下で培養されると、ＧＤＦ−５はコラーゲンＩＩ型の発現もアグリカンの発現も刺激しない。
【００１８】
また、コラーゲンは、インビボでの使用のためにマトリックスで提供される。コラーゲンＩ型繊維を、蒸留水に２重量％の割合で分散させ、ヘビーデューティー用ブレンダー内で３回、各々５秒間にわたって低速で均質化した。その後、必要に応じてＨＣｌ又はＮａＯＨを加えることにより、スラリーのｐＨが、ａ）ｐＨ３．０、ｂ）ｐＨ７．０、又はｃ）ｐＨ１０．０になるように調製した。その後、スラリーを型に鋳造し、凍結乾燥前に以下の温度で冷凍した。
ａ）ｐＨ３．０のスラリー、−７８℃、−４０℃又は−２０℃
ｂ）ｐＨ７．０スラリー、−４０℃
ｃ）ｐＨ１０．０のスラリー、−４０℃
上記マトリックスの凍結乾燥サイクルは次の通りである：０℃で２時間、−４０℃で２時間、−２０℃で２時間、−４℃で４時間、２５℃で１時間。
【００１９】
上記のコラーゲンマトリックスを、ｐＨ７−８のヒアルロン酸塩ポリアルデヒドの２重量％溶液に浸すことにより、（米国特許第５８６６１６５号に開示されたように調製された）活性フォルミルアルデヒド基を含むヒアルロン酸塩をコラーゲンマトリックスに加えた。浸されたマトリックスを、４時間にわたって室温で振とうさせ、３回洗浄し、コラーゲンマトリックスを調製するために上述の凍結乾燥サイクルを使い凍結乾燥した。
【００２０】
コラーゲンＩ型から作られた多孔質マトリックスに、インプラント（２×３×３ｍｍ）当り１×１０５個になるように細胞を植え付けた。その後、マトリックスに包埋された細胞を、ＧＤＦ−５（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充した又は補充しなかった培養物中で、３週間にわたって培養した。各インプラントから単離されたトータルＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにかけた。この結果より、ＧＤＦ−５が、軟骨形成にとって周知の２つのマーカーであるアグリカン及びコラーゲンＩＩ型の発現を誘発したことが示された。これに平行して、インプラント材料について組織学的評価を行い、続けてアルシアン又はトルディンブルー染色を行った。この結果より、アルシアンブルー染色の増強と細胞形状の変化によって強調されるＦＲＣ細胞形態に対し、ＧＤＦ−５が著しい変化を誘発できるということが分かる。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の全量について組織学的評価で測定すると、これらの条件下においては、ＧＤＦ−５の欠如したＥＣＭ中ではＦＲＣ細胞は増殖も分化もできなかった。このような知見から、３Ｄマトリックス構造を所有するコラーゲンＩ型によって、ＧＤＦ−５の生物学的反応が非常に増強されるだろうということが提案される。
【００２１】
異なる多孔性を有するインプラント可能な一連の材料を調製することによって、コラーゲンをベースにした３Ｄマトリックスの表面特性又は多孔性を調べた。各マトリックス複合体をヒアルロン酸（軟骨の主成分）で、又はヒアルロン酸無しで塗布した。その後、インプラントに、インプラント当り１×１０５個になるように細胞を植え付け、ＧＤＦ−５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で３週間にわたって培養した。その後、各インプラントから抽出したトータルＲＮＡを、半定量的なＰＣＲ分析にかけた。その結果、ヒアルロン酸で塗布され最も高い多孔性（約３００ミクロン）を有するマトリックス内に植え付けられたときにのみ、ＦＲＣ細胞は、コラーゲンＩＩ型及びアグリカンの発現レベルを非常に増加させるということが示された。このような知見を合わせて、ＧＤＦ−５の軟骨形成活性は、以下のマトリックスによって充分に且つ効果的に補強されることが示される。すなわち、１）高い細孔サイズ（約１００から３００ミクロン）を含むマトリックス、且つ、２）ヒアルロン酸で塗布されたコラーゲンＩ型から構成されるマトリックス。
【００２２】
また、細胞内信号介在物質の特性が良く分かった阻害剤を使うことにより、コラーゲンＩ型の存在でＧＤＦ−５が軟骨形成を誘発する分子信号メカニズムを調べた。その結果、ジブチリルｃＡＭＰ、Ｎａ３ＶＯ４、又はＥＧＴＡによってではなく、カルシウムイオノホアＡ２３１８７及びラパマイシンによって、リガントに依存する軟骨形成が完全に阻害されることが示された。ｐ７０Ｓ６キナーゼ活性に対するラパマイシンの周知の阻害効果は、ＧＤＦ−５／コラーゲンＩ型により誘発された軟骨形成がｐ７０Ｓ６キナーゼ活性を介して媒介されることを示す。細胞内カルシウム濃度に対するＡ２３１８７の周知の効果は、ＧＤＦ−５／コラーゲンＩ型により誘発された軟骨形成が、細胞内カルシウム濃度の持続的な減少を介して媒介されることを示す。
【００２３】
これらの結果は、細胞がコラーゲンＩ型と相互作用することにより、ＧＤＦ−５の軟骨誘発活性が増強されることを示す。この効果は、下流マトリックスと因子受容体信号経路とが収束することによって媒介されると思われる。
【００２４】
上記データにより、ＧＤＦ−５を含むコラーゲンＩ型細胞外マトリックスの組成物及び構造体によって、ＧＤＦ−５の生物学的機能が調節されることが示される。時間的且つ空間的にこの事象が制御されることになり、細胞の形態形成及び関節発生をインビボで制御することが可能であることが示される。
【００２５】
成長及び分化因子により誘発された軟骨形成は、ＧＤＦ−５に非常に特異的である。分裂促進因子及び原型分化因子のうちの幾つかの能力を以下の条件の下で評価することにより、ＧＤＦ−５によるＥＣＭ依存型軟骨形成が非常に特異的であることが示された。コラーゲンＩ型及び種々の成長因子の存在下で培養したＦＲＣを単色染色することにより、軟骨形成を評価した。その結果、この種の分化因子の他の２つのメンバーであるＢＭＰｓ及びＴＧＦｂの粗調製物によると、軟骨形成が全く刺激されなかった。また、これらの条件下においては、ｂＦＧＦ又はＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩを含む成長因子によっても、軟骨形成は刺激されなかった。これらの知見を合わせて、ＴＧＦｂスーパーファミリーの他のメンバーによって示される反応と、ＧＤＦ−５の生物学的反応が区別されることが提案される。
【実施例】
【００２６】
（コラーゲンをベースにしたマトリックス上でのｒｈＧＤＦ−５のインビボ活性）
【００２７】
ｒｈＧＤＦ−５（１．５μｇ及び５０μｇ）が添加されたコラーゲン／ヒアルロン酸マトリックス（ＣＮ／ＨＡ）であってラットの筋肉内に１４日間インプラントしたものには、アルカリフォスファターゼ活性と軟骨形成において、用量に依存した増加があった。このような条件下では、ｒｈＧＤＦ−５と混合されたミネラル化コラーゲンによっての軟骨形成及び完全な終末分化の形跡がほとんど検出されなかった。
【００２８】
【表１】
【００２９】
方法
インビボアッセイ、ラット軟組織インプラント
生後８週間のSprague-Dawley種の雄ラットを平滑切開することによって作られた脛骨筋肉ポーチ後側の筋肉内に、又は、胸部域の皮下に、マトリックス／成長因子の組み合わせをインプラントした。手術から１４日後に、インプラントを回収し、その重さを量り、普通の組織学的処理を行った（１０％のホルマリンで固定して、パラフィンで包埋し、６μｍに切片化して、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した）。あるいは、インプラントを取り出して、アルカリフォスファターゼ活性についてのアッセイを行った。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨形成を誘発又は増強する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨の限られた再生能力は、退行性及び外傷性の関節損傷処置における主な障害物であると指摘されている。機能的関節表面を維持するには、関節の軟骨細胞が、成長又は分化因子から発生する細胞外信号、機械的刺激、細胞外マトリックスの特定成分との相互作用に対して応答することが必要とされる。本発明は、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、ヒアルロン酸塩を加えたコラーゲンＩ型、又はヒアルロン酸塩を加えたコラーゲンＩＩ型、及び、軟骨形成の成長活性において関節発生に関与する骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーのメンバーである分化因子−５（ＧＤＦ−５）からなる細胞外マトリックスについてのものである。
【０００３】
多くの細胞種においての協調的機能は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の不溶性分子と、成長因子を誘発する可溶性因子とに由来する細胞外信号の統合化によって制御されている。脊椎動物四肢の骨格成分は、間葉細胞から胚の発生中に誘発される。その骨格成分は、凝縮して軟骨及び骨を作る分化プログラムを開始させる。骨形成タンパク質は、骨格パターン化において間葉の凝縮に重要な役割を果たしており、これには関節形成プロセスが含まれる。これは、発生中の長い骨の軟骨コアを通して間葉の前軟骨凝縮段階でＧＤＦ−５が主に発見されることを示す、インサイチュハイブリダイゼーション及び免疫染色法に基づくものである。また、これは、四肢関節形成の約３０％の破壊をもたらす、ＧＤＦ−５のヌル突然変異（マウスbrachypodism座でのフレームシフト突然変異）に基づくものである。この突然変異には、前足及び後足における基部指骨と中央指骨との間での関節発生の完全な欠如が含まれる。軟骨形成及び関節形成にとって必要とされる、細胞の凝縮を制御するＧＤＦ−５の役割は、骨形成タンパク質機能の既知のアンタゴニストであるノギン遺伝子のヌル突然変異により更に証明される。ＧＤＦ−５発現の欠如から判断されるところによると、ノギンを欠如しているマウスでは、軟骨凝縮が始まっても関節形成プロセスは行われなかった。
【０００４】
人間の疾患及び骨格パターン化においての関節形成の重要性にもかかわらず、いつどこで関節が形成されるかを制御する分子メカニズムについては、ごくわずかなことしか知られていない。典型的に、四肢では、別々の成分の衝突又は並置によってではなく、むしろ比較的大きな骨格前駆体の分割によって関節が生じる。このプロセスは、以下のステップを含む一連のステップを通して起こる。すなわち、１）発生中の軟骨成分にわたって、横縞に広がる高密度の特定領域が初期的に形成されるステップ、２）プログラム化された細胞死と、インターゾーンの中央におけるマトリックス生産性の変化とにより、３層構造が作られるステップ、３）インターゾーンの２端における関節軟骨が分化するステップ、４）対向する骨格成分の間にギャップを作るように合体している、流体で満たされた空間が蓄積されるステップ。ＧＤＦ−５の発現は、インターゾーンが形態的に出現する２４時間から３６時間前に、関節発生領域において始まる。この発現は、特定の部位において少なくとも２−３日間続き、関節発生の３層化されたインターゾーン段階においてもなお顕著である。関節発生の後段階においては、ＧＤＦ−５の発現量は減少する。組換えｈＧＤＦ−５についての生物学的及び生化学的インビトロ分析により、ＧＤＦ−５の主な生理学的役割は、間葉前駆細胞の軟骨形成の初期段階に制限されるだろうということが提案されている。これは、以下に基づくものである。すなわち、１）ＧＤＦ−５が、ラットの四肢芽細胞で軟骨形成及び間葉の凝集を刺激すること、２）ＧＤＦ−５が、高分化型の造骨細胞種であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を使って測定されるアルカリフォスファターゼ活性を刺激できないこと、３）ＧＤＦ−５が、より原始的でより低分化のラット骨原性細胞ＲＯＢ−２６内のアルカリフォスファターゼ活性を刺激すること、４）ＧＤＦ−５が、間葉由来の低分化細胞においてより優勢に発現される、ＢＭＰｓ受容体の特徴的なヘテロダイマーに結合すること。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９８／３１３４５号
【特許文献２】特開平７−１１６２４０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，１９９６年，１３巻，２号，６５−７４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＧＤＦ−５を含む細胞外マトリックスにより、細胞内の軟骨形成を誘発又は強化する方法及び組成物についてのものである。この細胞外マトリックスは、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、ヒアルロン酸塩を加えたコラーゲンＩ型又はヒアルロン酸塩を加えたコラーゲンＩＩ型から成り、成長及び分化因子−５（ＧＤＦ−５）を含む。軟骨形成を誘発又は増強するＧＤＦ−５の有効量は、約１ｎｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌのマトリックスタンパク質である。マトリックスは、比較的固定された三次元構造を持つ固形の多孔質組成のものである。
【０００８】
より具体的には、以下の発明を提供する。
［１］ 細胞内の軟骨形成を誘発又は増強するための方法であって、前記細胞を、コラーゲンＩ型及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物に晒すステップを含む前記方法。
［２］ 細胞内の軟骨形成を誘発又は増強するための方法であって、前記細胞を、コラーゲンＩＩ型及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物に晒すステップを含む前記方法。
［３］ 細胞内の軟骨形成を誘発又は増強するための方法であって、前記細胞を、コラーゲンＩ型、ヒアルロン酸塩及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物に晒すステップを含む前記方法。
［４］ 細胞内の軟骨形成を誘発又は増強するための方法であって、前記細胞を、コラーゲンＩＩ型、ヒアルロン酸塩及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物に晒すステップを含む前記方法。
［５］ 前記細胞を晒すステップがインビボで起こる、上記［１］、［２］、［３］又は［４］記載の方法。
［６］ 前記細胞を晒すステップがインビトロで起こる、上記［１］、［２］、［３］又は［４］記載の方法。
［７］ 前記細胞が結合組織を構成する、上記［５］記載の方法。
［８］ 軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩ型の細胞外マトリックスを含む組成物。
［９］ 軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩＩ型の細胞外マトリックスを含む組成物。
［１０］ 軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩ型及びヒアルロン酸塩の細胞外マトリックスを含む組成物。
［１１］ 軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩＩ型及びヒアルロン酸塩の細胞外マトリックスを含む組成物。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
軟骨形成は、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、ヒアルロン酸塩を加えたコラーゲンＩ型、又はヒアルロン酸塩を加えたコラーゲンＩＩ型の細胞外マトリックス組成物でＧＤＦ−５を含むものによって誘発される。コラーゲンＩ型及びコラーゲンＩＩ型の各々は、骨及び軟骨において最も多量のＥＣＭタンパク質の代表である。
【００１０】
コラーゲンは、骨、けん、皮膚等から得ることができる。コラーゲン源は、どんな好都合の動物源であっても、哺乳動物又は鳥類であってもよい。その中には、牛、豚、ウマ等、又はニワトリ、七面鳥、又はコラーゲンのその他の家畜源が含まれる。
【００１１】
ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ-グルクロン酸単糖類が交互にβ１−４結合で連結したユニットと、β１−３グリコシド結合で連結した二糖ユニットとを含んだ天然にある多糖類である。通常は、ナトリウム塩として生じて、約５００００から８×１０６の範囲の分子量を有する。
【００１２】
典型的に、コラーゲン又はコラーゲン−ヒアルロン酸塩の混合物は、凍結乾燥によるマトリックスとして提供される。コラーゲン−ヒアルロン酸塩は、本明細書に援用されている米国特許第５８６６１６５号において記載されているようにして、活性フォルミルアルデヒドヒアルロン酸塩でコラーゲンを処理することによって作られる。また、コラーゲン-ヒアルロン酸塩の組成物は、凍結乾燥によるマトリックスとして提供される。
【００１３】
マトリックスは、ＧＤＦ−５の有効量で植え付けられることが好ましい。この有効量は、約１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌのマトリックスタンパク質である。
【００１４】
インビトロでの使用を示すために、精製された種々の細胞外マトリックスタンパク質上で、組換えヒトＧＤＦ−５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、３週間にわたってラット胎児の頭頂骨細胞（ＦＲＣ’ｓ）を培養し、形態レベルにおける分化、プロテオグリカンの全体的な合成及び堆積、そしてアグリカン及びコラーゲンＩＩ型の発現を評価した。この結果より、コラーゲンＩ型又はコラーゲンＩＩ型上でＦＲＣｓが培養された場合にのみ、ＧＤＦ−５が軟骨小結節形成を刺激することが示された。免疫組織学的及び転写分析での判定によると、アルシアンブルーで強く染色された軟骨小結節は、コラーゲンＩＩ型及びアグリカン発現に対して陽性を示した。小結節を囲む単層内の細胞は、軟骨形成マーカーに対して陰性であった。明らかな対照として、ＦＲＣ’ｓがフィブロネクチン、コラーゲンＩＶ型又は組織培養用のプラスチック上で培養された場合には、ＧＤＦ−５は軟骨形成を刺激しなかった。
【００１５】
コラーゲンＩ型及びコラーゲンＩＩ型、コラーゲンＩＶ型又はフィブロネクチンを含む異なるＥＣＭタンパク質で、先ず、プラスチックプレートを塗布した。この結果より、ＧＤＦ−５が、アルシアンブルー色素に強く結合する軟骨形成細胞の凝集体形成を刺激することが示された。これらの条件下においては、媒体のみ、コラーゲンＩＶ型又はフィブロネクチンの存在下で培養されたＦＲＣ中では、ＧＤＦ−５は特徴的な小結節の形成を刺激しない。プラスチックの培養用１２ウエル（コースター社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を、０．０１％（ｗ／ｖ）の上記細胞外マトリックスタンパク質で、３７℃で２時間にわたって塗布した。その後、未吸着のタンパク質を除去し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で２×１０５細胞／ウエルの密度において、ラット胎児の頭頂骨細胞を培養した。ＧＤＦ−５（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充した又は補充しなかった媒地中で、培養プレートを２１日間にわたって維持した。その後、上記プレートをアルシアンブルー色素（０．５％（ｗ／ｖ）の３％酢酸溶液）で一晩にわたって染色し、そして洗浄した後写真撮影をした。アルシアンブルーを計量するために、細胞を８Ｍの尿素で溶解し、分光光度計（モレキュラーデバイス社、サニーヴェール、カリフォルニア州）を使って染色量を計った。アルシアンブルーは、プロテオグリカンを含むアニオン系のタンパク質に結合すると示されているカチオン系の色素であるので、これらの結果は、ＧＤＦ−５が、ＦＲＣ亜集団の細胞の形態に変化を誘発することを提案している。
【００１６】
細胞の形態変化と軟骨形成プロセスとの関連性を調べるために、コラーゲンＩ型の存在下でＧＤＦ−５により処理されたＦＲＣ培養物から、トータル細胞ＲＮＡ及び細胞タンパク質を単離した。ＦＲＣ培養物から単離したトータル細胞ＲＮＡを、アグリカン、コラーゲンＩＩ型又はコラーゲンＩ型を増強するように設計したプライマーを使って半定量的なＰＣＲ分析にかけた。ＧＤＦ−５で処理された培養物中では、コラーゲンＩＩ型及びアグリカンのｍＲＮＡ発現は、各々約２倍及び約３倍に増大するという結果が示された。このような条件下では、コラーゲンＩ型のｍＲＮＡ発現が約２０％減少した。アグリカン及びコラーゲンＩＩ型の発現は、スロットブロット分析を使うことにより確証した。
【００１７】
全細胞溶解物（１００μｇ）を、８％又は５％のＳＤＳＰＡＧＥ上で電気泳動により分離し、イモビロンＰへ移し、コラーゲンＩＩ型又はアグリカンに特異的な抗体を使って免疫ブロットした。この結果より、コラーゲンＩＩ型又はアグリカンの定常状態レベルを、ＧＤＦ−５が非常に増加させることが示された。これらの条件下においては、ＦＲＣ細胞がコラーゲンＩ型の非存在下で培養されると、ＧＤＦ−５はコラーゲンＩＩ型の発現もアグリカンの発現も刺激しない。
【００１８】
また、コラーゲンは、インビボでの使用のためにマトリックスで提供される。コラーゲンＩ型繊維を、蒸留水に２重量％の割合で分散させ、ヘビーデューティー用ブレンダー内で３回、各々５秒間にわたって低速で均質化した。その後、必要に応じてＨＣｌ又はＮａＯＨを加えることにより、スラリーのｐＨが、ａ）ｐＨ３．０、ｂ）ｐＨ７．０、又はｃ）ｐＨ１０．０になるように調製した。その後、スラリーを型に鋳造し、凍結乾燥前に以下の温度で冷凍した。
ａ）ｐＨ３．０のスラリー、−７８℃、−４０℃又は−２０℃
ｂ）ｐＨ７．０スラリー、−４０℃
ｃ）ｐＨ１０．０のスラリー、−４０℃
上記マトリックスの凍結乾燥サイクルは次の通りである：０℃で２時間、−４０℃で２時間、−２０℃で２時間、−４℃で４時間、２５℃で１時間。
【００１９】
上記のコラーゲンマトリックスを、ｐＨ７−８のヒアルロン酸塩ポリアルデヒドの２重量％溶液に浸すことにより、（米国特許第５８６６１６５号に開示されたように調製された）活性フォルミルアルデヒド基を含むヒアルロン酸塩をコラーゲンマトリックスに加えた。浸されたマトリックスを、４時間にわたって室温で振とうさせ、３回洗浄し、コラーゲンマトリックスを調製するために上述の凍結乾燥サイクルを使い凍結乾燥した。
【００２０】
コラーゲンＩ型から作られた多孔質マトリックスに、インプラント（２×３×３ｍｍ）当り１×１０５個になるように細胞を植え付けた。その後、マトリックスに包埋された細胞を、ＧＤＦ−５（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充した又は補充しなかった培養物中で、３週間にわたって培養した。各インプラントから単離されたトータルＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにかけた。この結果より、ＧＤＦ−５が、軟骨形成にとって周知の２つのマーカーであるアグリカン及びコラーゲンＩＩ型の発現を誘発したことが示された。これに平行して、インプラント材料について組織学的評価を行い、続けてアルシアン又はトルディンブルー染色を行った。この結果より、アルシアンブルー染色の増強と細胞形状の変化によって強調されるＦＲＣ細胞形態に対し、ＧＤＦ−５が著しい変化を誘発できるということが分かる。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の全量について組織学的評価で測定すると、これらの条件下においては、ＧＤＦ−５の欠如したＥＣＭ中ではＦＲＣ細胞は増殖も分化もできなかった。このような知見から、３Ｄマトリックス構造を所有するコラーゲンＩ型によって、ＧＤＦ−５の生物学的反応が非常に増強されるだろうということが提案される。
【００２１】
異なる多孔性を有するインプラント可能な一連の材料を調製することによって、コラーゲンをベースにした３Ｄマトリックスの表面特性又は多孔性を調べた。各マトリックス複合体をヒアルロン酸（軟骨の主成分）で、又はヒアルロン酸無しで塗布した。その後、インプラントに、インプラント当り１×１０５個になるように細胞を植え付け、ＧＤＦ−５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で３週間にわたって培養した。その後、各インプラントから抽出したトータルＲＮＡを、半定量的なＰＣＲ分析にかけた。その結果、ヒアルロン酸で塗布され最も高い多孔性（約３００ミクロン）を有するマトリックス内に植え付けられたときにのみ、ＦＲＣ細胞は、コラーゲンＩＩ型及びアグリカンの発現レベルを非常に増加させるということが示された。このような知見を合わせて、ＧＤＦ−５の軟骨形成活性は、以下のマトリックスによって充分に且つ効果的に補強されることが示される。すなわち、１）高い細孔サイズ（約１００から３００ミクロン）を含むマトリックス、且つ、２）ヒアルロン酸で塗布されたコラーゲンＩ型から構成されるマトリックス。
【００２２】
また、細胞内信号介在物質の特性が良く分かった阻害剤を使うことにより、コラーゲンＩ型の存在でＧＤＦ−５が軟骨形成を誘発する分子信号メカニズムを調べた。その結果、ジブチリルｃＡＭＰ、Ｎａ３ＶＯ４、又はＥＧＴＡによってではなく、カルシウムイオノホアＡ２３１８７及びラパマイシンによって、リガントに依存する軟骨形成が完全に阻害されることが示された。ｐ７０Ｓ６キナーゼ活性に対するラパマイシンの周知の阻害効果は、ＧＤＦ−５／コラーゲンＩ型により誘発された軟骨形成がｐ７０Ｓ６キナーゼ活性を介して媒介されることを示す。細胞内カルシウム濃度に対するＡ２３１８７の周知の効果は、ＧＤＦ−５／コラーゲンＩ型により誘発された軟骨形成が、細胞内カルシウム濃度の持続的な減少を介して媒介されることを示す。
【００２３】
これらの結果は、細胞がコラーゲンＩ型と相互作用することにより、ＧＤＦ−５の軟骨誘発活性が増強されることを示す。この効果は、下流マトリックスと因子受容体信号経路とが収束することによって媒介されると思われる。
【００２４】
上記データにより、ＧＤＦ−５を含むコラーゲンＩ型細胞外マトリックスの組成物及び構造体によって、ＧＤＦ−５の生物学的機能が調節されることが示される。時間的且つ空間的にこの事象が制御されることになり、細胞の形態形成及び関節発生をインビボで制御することが可能であることが示される。
【００２５】
成長及び分化因子により誘発された軟骨形成は、ＧＤＦ−５に非常に特異的である。分裂促進因子及び原型分化因子のうちの幾つかの能力を以下の条件の下で評価することにより、ＧＤＦ−５によるＥＣＭ依存型軟骨形成が非常に特異的であることが示された。コラーゲンＩ型及び種々の成長因子の存在下で培養したＦＲＣを単色染色することにより、軟骨形成を評価した。その結果、この種の分化因子の他の２つのメンバーであるＢＭＰｓ及びＴＧＦｂの粗調製物によると、軟骨形成が全く刺激されなかった。また、これらの条件下においては、ｂＦＧＦ又はＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩを含む成長因子によっても、軟骨形成は刺激されなかった。これらの知見を合わせて、ＴＧＦｂスーパーファミリーの他のメンバーによって示される反応と、ＧＤＦ−５の生物学的反応が区別されることが提案される。
【実施例】
【００２６】
（コラーゲンをベースにしたマトリックス上でのｒｈＧＤＦ−５のインビボ活性）
【００２７】
ｒｈＧＤＦ−５（１．５μｇ及び５０μｇ）が添加されたコラーゲン／ヒアルロン酸マトリックス（ＣＮ／ＨＡ）であってラットの筋肉内に１４日間インプラントしたものには、アルカリフォスファターゼ活性と軟骨形成において、用量に依存した増加があった。このような条件下では、ｒｈＧＤＦ−５と混合されたミネラル化コラーゲンによっての軟骨形成及び完全な終末分化の形跡がほとんど検出されなかった。
【００２８】
【表１】
【００２９】
方法
インビボアッセイ、ラット軟組織インプラント
生後８週間のSprague-Dawley種の雄ラットを平滑切開することによって作られた脛骨筋肉ポーチ後側の筋肉内に、又は、胸部域の皮下に、マトリックス／成長因子の組み合わせをインプラントした。手術から１４日後に、インプラントを回収し、その重さを量り、普通の組織学的処理を行った（１０％のホルマリンで固定して、パラフィンで包埋し、６μｍに切片化して、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した）。あるいは、インプラントを取り出して、アルカリフォスファターゼ活性についてのアッセイを行った。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨形成を誘発又は増強するための医薬品を製造する方法であって、コラーゲンＩＩ型及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物を形成するステップを含む前記方法。
【請求項２】
軟骨形成を誘発又は増強するための医薬品を製造する方法であって、コラーゲンＩ型、ヒアルロン酸塩及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物を形成するステップを含む前記方法。
【請求項３】
軟骨形成を誘発又は増強するための医薬品を製造する方法であって、コラーゲンＩＩ型、ヒアルロン酸塩及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物を形成するステップを含む前記方法。
【請求項４】
軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩＩ型の細胞外マトリックスを含む組成物。
【請求項５】
軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩ型及びヒアルロン酸塩の細胞外マトリックスを含む組成物。
【請求項６】
軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩＩ型及びヒアルロン酸塩の細胞外マトリックスを含む組成物。
【請求項１】
軟骨形成を誘発又は増強するための医薬品を製造する方法であって、コラーゲンＩＩ型及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物を形成するステップを含む前記方法。
【請求項２】
軟骨形成を誘発又は増強するための医薬品を製造する方法であって、コラーゲンＩ型、ヒアルロン酸塩及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物を形成するステップを含む前記方法。
【請求項３】
軟骨形成を誘発又は増強するための医薬品を製造する方法であって、コラーゲンＩＩ型、ヒアルロン酸塩及びＧＤＦ−５を含むマトリックス組成物を形成するステップを含む前記方法。
【請求項４】
軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩＩ型の細胞外マトリックスを含む組成物。
【請求項５】
軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩ型及びヒアルロン酸塩の細胞外マトリックスを含む組成物。
【請求項６】
軟骨形成を誘発又は増強するのに十分な有効量のＧＤＦ−５を含有する、コラーゲンＩＩ型及びヒアルロン酸塩の細胞外マトリックスを含む組成物。
【公開番号】特開２０１０−２４８２６７（Ｐ２０１０−２４８２６７Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７６４０１（Ｐ２０１０−１７６４０１）
【出願日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【分割の表示】特願２０００−５７５５２３（Ｐ２０００−５７５５２３）の分割
【原出願日】平成１１年１０月１４日（１９９９．１０．１４）
【出願人】（５９９０５４９５０）デピュイ スパイン、インコーポレイテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＤＥＰＵＹ ＳＰＩＮＥ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【分割の表示】特願２０００−５７５５２３（Ｐ２０００−５７５５２３）の分割
【原出願日】平成１１年１０月１４日（１９９９．１０．１４）
【出願人】（５９９０５４９５０）デピュイ スパイン、インコーポレイテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＤＥＰＵＹ ＳＰＩＮＥ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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