ＨＩＶに対する免疫のためのｇｐ１２０と、Ｎｅｆ及び／又はＴａｔを含むワクチン
【課題】 本発明は、ＨＩＶに対するヒトの予防用又は治療用免疫のためのワクチンを提供することに関する。
【解決手段】
本発明は、ＨＩＶに対するヒトの予防用又は治療用免疫のための初回免疫−追加免疫送達に適したワクチンの製造における、
ａ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｂ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｃ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチドと結合したＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；
及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質若しくはポリヌクレオチド、
の使用であって、上記タンパク質若しくはポリヌクレオチドがボンバートメント手法により送達される、上記使用を提供する。
【解決手段】
本発明は、ＨＩＶに対するヒトの予防用又は治療用免疫のための初回免疫−追加免疫送達に適したワクチンの製造における、
ａ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｂ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｃ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチドと結合したＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；
及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質若しくはポリヌクレオチド、
の使用であって、上記タンパク質若しくはポリヌクレオチドがボンバートメント手法により送達される、上記使用を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶタンパク質の新規な医薬用途及びかかるＨＩＶタンパク質を含有するワクチン組成物に関する。特に本発明は、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質とＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質の組み合わせの使用に関する。さらに本発明は、ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質とＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質の組み合わせの使用に関する。本発明はまた、ＨＩＶ Ｔａｔ及び／又はＮｅｆをコードするＤＮＡ（以下、Ｔａｔ ＤＮＡ及び／又はＮｅｆ ＤＮＡという）、ＨＩＶ ｇｐ１２０をコードするＤＮＡ（以下、ｇｐ１２０ ＤＮＡという）、並びにかかるＤＮＡを含むベクターに関する。本発明は特に、粒子ボンバートメント手法を用いた初回免疫−追加免疫計画におけるタンパク質及び／又はＤＮＡの投与に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ−１は、世界の主な健康問題の１つとされている後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の主因である。ワクチンを作製するために世界中で広範な研究が行われてきたが、このような努力は未だ成功を収めていない。
【０００３】
ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０は、宿主細胞への付着のために使用されるウイルスタンパク質である。この付着は、ヘルパーＴ細胞及びマクロファージの２つの表面分子（これらは、ＣＤ４、及び２つのケモカイン受容体ＣＣＲ−４又はＣＸＣＲ−５のうちの１つとして知られるものである）に結合することによって媒介される。ｇｐ１２０タンパク質は、はじめに大きな前駆分子（ｇｐ１６０）として発現された後、翻訳後切断されてｇｐ１２０及びｇｐ４１を生じる。ｇｐ１２０タンパク質は、ｇｐ４１分子との結合によりビリオンの表面上に保持され、ウイルス膜の中に挿入される。
【０００４】
ｇｐ１２０タンパク質は、中和抗体の主な標的であるが、残念なことに、そのタンパク質の最も免疫原性の高い領域（Ｖ３ループ）は、そのタンパク質の最も可変な部分でもある。従って、中和抗体を誘導するためのワクチン抗原としてのｇｐ１２０（又はその前駆体であるｇｐ１６０）の使用は、防御範囲の広いワクチンとしての使用に限定されると考えられる。ｇｐ１２０タンパク質は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により認識されるエピトープも含む。これらのエフェクター細胞は、ウイルス感染細胞を排除することができるので、２番目に重要な抗ウイルス性免疫機構を構成する。中和抗体の標的領域とは対照的に、幾つかのＣＴＬエピトープは、異なるＨＩＶ株の間で比較的保存されているようである。このため、ｇｐ１２０及びｇｐ１６０は、細胞性免疫応答（特にＣＴＬ）を引き出すことを目的としたワクチンにおける有用な抗原性成分であると考えられる。
【０００５】
ＨＩＶ−１の非エンベロープタンパク質が記載されており、例えばｇａｇ遺伝子やｐｏｌ遺伝子の産物などの内部構造タンパク質、並びにＲｅｖ、Ｎｅｆ、Ｖｉｆ及びＴａｔなどの他の非構造タンパク質等が挙げられる（非特許文献１、Greeneら, New England J. Med, 324,5,308以下参照(1991)、及び非特許文献２、Bryantら（Pizzo編）, Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390以下参照(1992)）。
【０００６】
ＨＩＶ Ｔａｔ及びＮｅｆタンパク質は初期タンパク質である。つまり、これらは感染初期に、構造タンパク質の不在下で発現される。
【０００７】
非特許文献３、学会発表（C. David Pauza, Immunization with Tat toxoid attenuates SHIV89.6PD infection in rhesus macaques, 12th Cent Gardes meeting, Marnes-La-Coquette, 26.10.1999）において、アカゲザル（rhesus macaques）を、Ｔａｔトキソイド単独又はエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１６０との組み合わせの組み合わせワクチン（１用量の組換えワクシニアウイルスと１用量の組換えタンパク質）で免疫した実験が記載されている。しかしながら、観察結果は、エンベロープ糖タンパク質の存在は、Ｔａｔ単独で行った実験よりも利点はなかったことを示していた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Greeneら, New England J. Med, 324,5,308 et seq(1991)
【非特許文献２】Bryantら（Pizzo編）, Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 et seq(1992)
【非特許文献３】C. David Pauza, Immunization with Tat toxoid attenuates SHIV89.6PD infection in rhesus macaques, 12th Cent Gardes meeting, Marnes-La-Coquette, 26.10.1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、本発明者は、キメラヒト−サル免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）による病原体の攻撃からのアカゲサルの防御において、Ｔａｔ及び／又はＮｅｆ含有免疫原（特にＮｅｆ−Ｔａｔ融合タンパク質）がｇｐ１２０と相乗的に作用することを見出した。現在まで、アカゲザルのＳＨＩＶ感染は、ヒトＡＩＤＳの最も関連性のある動物モデルと考えられている。従って、本発明者は、ｇｐ１２０抗原、並びにＮｅｆ及びＴａｔ含有抗原を単独又は組み合わせで含有するワクチンの防御効力を評価するためにこの前臨床モデルを使用した。ウイルス感染症と病原性の２つのマーカーの分析、すなわち末梢血におけるＣＤ４陽性細胞率（％）及びサルの血漿における遊離ＳＨＩＶ ＲＮＡゲノムの濃度は、２つの抗原が相乗的に作用していることを示した。ｇｐ１２０又はＮｅｆ Ｔａｔ＋ＳＩＶ Ｎｅｆのいずれか単独で免疫した場合には、アジュバント単独で免疫した場合と比較して差異はなかった。対照的に、ｇｐ１２０とＮｅｆ Ｔａｔ＋ＳＩＶ Ｎｅｆの抗原を組み合わせて投与することにより、特定の実験群の動物全てにおいて上記２つのパラメーターが顕著に改善された。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述したように、ＮｅｆＴａｔタンパク質、ＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質及びｇｐ１２０タンパク質は一緒に、ＮｅｆＴａｔ＋ＳＩＶ Ｎｅｆ又はｇｐ１２０を単独で使用する場合に観察される応答よりも強力な応答を生じる。この強力な応答又は相乗作用は、これらの組み合わせタンパク質によるワクチン接種の結果として、ウイルス負荷の低減に観察されうる。あるいは又はさらに、強力な応答はそれ自体として、ＨＩＶ ＮｅｆＴａｔ、ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＨＩＶ ｇｐ１２０でのワクチン接種の不在下で観察されるレベルを超えたＣＤ４＋レベルの維持により現れる。この相乗作用は、ｇｐ１２０とＴａｔの組み合わせ、又はｇｐ１２０とＮｅｆの組み合わせ、あるいはｇｐ１２０とＮｅｆ及びＴａｔの両方の組み合わせにより生じる。
【００１１】
Ｎｅｆ、Ｔａｔ又はＮｅｆＴａｔタンパク質をｇｐ１２０タンパク質と組み合わせる又は共に投与することだけが有利なわけではないことが見出されている。Ｎｅｆ、Ｔａｔ又はＮｅｆＴａｔをコードするＤＮＡをｇｐ１２０（タンパク質又は対応するＤＮＡ）と共に投与した場合に同様に利点があることがわかっている。
【００１２】
上記タンパク質、又は上記タンパク質をコードするＤＮＡは、初回免疫−追加免疫手法により投与することが有利であり得ることが見出されている。一態様において、本発明は、ボンバートメント手法による上記のような投与に関する。従って本発明は、ＨＩＶに対するヒトの予防用又は治療用免疫のための初回免疫−追加免疫送達に適したワクチンの製造における、
ａ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｂ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｃ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチドと結合したＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；
及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質若しくはポリヌクレオチド、
の使用を提供し、上記タンパク質若しくはポリヌクレオチドは、ボンバートメント手法により送達される。
【００１３】
粒子ボンバートメント手法を行うための多数の方法が知られている。例えば、ＷＯ９１／０７４８７号を参照されたい。１つの例においては、ガスにより駆動される粒子加速を、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＰＬＣ（Oxford, UK）及びＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ．（Madison, WI）により製造された装置などを用いて行うことができ、その例が、米国特許第５，８４６，７９６号、同第６，０１０，４７８号、同第５，８６５，７９６号、同第５，５８４，８０７号、及びＥＰ特許第０５００ ７９９号に記載されている。これは、ポリヌクレオチドなどの物質でコーティングされた微粒子の乾燥粉末製剤を、手持ち式装置により発生したヘリウムガス気流内で高速に加速し、目的の標的組織（典型的には皮膚）中に粒子を推進させる、針を使用しない送達手法である。粒子は、好ましくは直径０．４〜４．９μｍ、より好ましくは０．６〜２．０μｍの金ビーズであり、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡをこれら粒子にコーティングした後、「遺伝子ガン」に導入するためのカートリッジ内に入れる。
【００１４】
他のＨＩＶタンパク質又はそれらをコードするＤＮＡの添加は、さらに相乗的効果を増強させうるものであり、これは、ｇｐ１２０とＴａｔ及び／又はＮｅｆとの間で観察されている。これらの他のタンパク質は、完全な元の抗原の組み合わせの存在を必要とせずに、ｇｐ１２０、Ｔａｔ及び／又はＮｅｆ含有ワクチンの個々の成分と相乗的に作用しうる。別のタンパク質は、ＨＩＶの調節タンパク質、例えばＲｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＶｐｒなどでありうる。これらはまた、ＨＩＶ ｇａｇ又はｐｏｌ遺伝子から誘導された構造タンパク質である。
【００１５】
ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子は前駆体タンパク質ｐ５５をコードし、このｐ５５は自発的に集合して未成熟なウイルス様粒子（ＶＬＰ）となることができる。次にこの前駆体はタンパク質分解によって主たる構造タンパク質ｐ２４（キャプシド）及びｐ１８（マトリックス）並びに幾つかのより小さなタンパク質へと切断される。前駆体タンパク質ｐ５５並びにその主要な誘導体ｐ２４及びｐ１８の両方が、ｇｐ１２０とＴａｔ及び／又はＮｅｆとの間で観察された相乗効果をさらに高め得る適当なワクチン抗原であると考えられる。前駆体ｐ５５及びキャプシドタンパク質ｐ２４は、ＶＬＰとして又は単量体タンパク質として用い得る。
【００１６】
本発明において使用するためのＨＩＶ Ｔａｔタンパク質は、場合により、例えば融合タンパク質としてＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質と結合させてもよい。
【００１７】
本発明において用いるためのＨＩＶ Ｔａｔタンパク質、ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質、又はＮｅｆＴａｔ融合タンパク質は、好ましくは５〜１０のヒスチジン残基を含むＣ末端ヒスチジンテールを有してもよい。ヒスチジン（すなわち「Ｈｉｓ」）テールの存在によって、精製が容易になる。
【００１８】
好適な実施形態において、これらのタンパク質は、５〜１０個、好ましくは６個のヒスチジン残基を含むヒスチジン・テールを有して発現される。これらは、精製を助けるのに有利である。酵母（サッカロミセス・セレビシエ）内でのＮｅｆ（Macreadie I.G.ら, 1993, Yeast 9 (6) 565-573）及びＴａｔ（Braddock Mら, 1989, Cell 58 (2) 269-79）の分離発現が報告されている。Ｎｅｆタンパク質、並びにＧａｇタンパク質ｐ５５及びｐ１８はミリストイル化されている。ピヒア発現系におけるＮｅｆ及びＴａｔの別々の発現（Ｎｅｆ−Ｈｉｓ及びＴａｔ−Ｈｉｓ構築物）、並びに融合構築物Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓの発現は、国際公開第ＷＯ９９／１６８８４号に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｃ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｄ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｅ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｆ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｇ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｈ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図２】ｐＲＩＴ１４５９７組込みベクターのマップを示す。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ｈｉｓ融合タンパク質）を示す。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ｈｉｓ融合タンパク質）を示す。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件；１４％ポリアクリルアミドプレキャストゲル−Ｎｏｖｅｘ）を示す。
【図７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（４〜２０％ポリアクリルアミドプレキャストゲル−Ｎｏｖｅｘ）を示す。
【図８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（４〜２０％ポリアクリルアミドプレキャストゲル−Ｎｏｖｅｘ）を示す。
【図９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件；１４％ポリアクリルアミドプレキャストゲル−Ｎｏｖｅｘ）を示す。
【図１０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件；１４％ポリアクリルアミドプレキャストゲル−Ｎｏｖｅｘ）を示す。
【図１１】ｐＲＩＴ１４９０８組込みベクターのマップを示す。
【図１２】ピヒア発現ＳＩＶ−ＮＥＦ−Ｈｉｓタンパク質の配列を示す。
【図１３】組換えピヒア・パストリスＳＩＶ／ＮＥＦ発現株のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１４】サル試験１（ＳＨＩＶによる免疫前及び後のＰＢＭＣにおけるＣＤ４陽性細胞の分析）の結果を示す。
【図１５】サル試験１（ＳＨＩＶによる免疫後のＳＨＩＶ血漿ウイルス負荷の分析）の結果を示す。
【図１６】サル試験２（ＳＨＩＶによる免疫前及び後のＰＢＭＣにおけるＣＤ４陽性細胞の分析）の結果を示す。
【図１７】サル試験２（ＳＨＩＶによる免疫後のＳＨＩＶ血漿ウイルス負荷の分析）の結果を示す。
【図１８】２９３Ｔ細胞抽出物において検出されたＮｅｆ、並びに細胞抽出物及び上清培地中のｇｐ１２０のレベルを示すウエスタンブロットを示す。
【図１９】２９３Ｔ細胞抽出物において検出されたＮｅｆ、及び上清中のｇｐ１２０のレベルを示すウエスタンブロットを示す。
【図２０】プラスミドマップを示す。
【図２１】ｇｐ１２０のコドン最適化及び配列決定のためのオリゴ、最適化ｇｐ１２０の配列決定用プライマー、及び野生型ｇｐ１２０の配列決定用プライマーを示す。
【図２２】ｐ７３１３のマップを示す。
【図２３】抗原のための典型的な発現プラスミドを示す。
【図２４】追加免疫後５日目においてＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔにより測定した、免疫感作Ｆ１（Ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ３Ｈ）マウスのｇｐ１２０ペプチドに対する応答を示す。
【図２５】追加免疫後５日目においてＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔにより測定した、２０ｍｅｒのＮｅｆペプチドライブラリーに対する応答を示す。
【図２６】追加免疫後７日目においてＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔにより測定した、免疫感作Ｂａｌｂ／ｃマウスのｇｐ１２０ペプチドプールに対する応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
代表的なＮｅｆ−Ｈｉｓ（配列番号８及び９）、Ｔａｔ−Ｈｉｓ（配列番号１０及び１１）、及びＮｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質（配列番号１２及び１３）のＤＮＡ及びアミノ酸配列を図１に示す。
【００２１】
ＨＩＶタンパク質は、その天然のコンホメーションで用いることができ、又はより好ましくはワクチン用途のために改変してもよい。これらの改変は、精製方法に関連する技術的理由のために必要であるか、又はＴａｔ若しくはＮｅｆタンパク質の１以上の機能的性質を生物学的に不活化するために用い得る。従って、本発明は、例えば、変異型でありうるＨＩＶタンパク質又はポリヌクレオチド、特にＤＮＡの誘導体の使用を包含する。「変異型」という用語は、部位特異的突然変異誘発のための周知の技法又は任意の他の慣用法を用いて得られる、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するＤＮＡ又はタンパク質分子を意味する。
【００２２】
例えば、変異型Ｔａｔタンパク質は、生物学的に不活性であるが、それでもなお免疫原性エピトープを維持するように変異させうる。Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ（Tulane University）により構築された１つの可能性ある変異型ｔａｔ遺伝子（ＢＨ１０分子クローンに由来する）は、活性部位領域（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ７８→Ｌｙｓ及びＡｓｐ８０→Ｇｌｕ）に変異を有する（Virology 235: 48-64, 1997）。
【００２３】
変異型Ｔａｔを図１（配列番号２２及び２３）に記載するが、これはＮｅｆ−Ｔａｔ Ｍｕｔａｎｔ−Ｈｉｓ（配列番号２４及び２５）と同じである。
【００２４】
本発明において使用するためのＨＩＶ Ｔａｔ又はＮｅｆタンパク質は、そのタンパク質を安定かつ単量体にするために、精製過程において化学的方法により修飾してもよい。Ｔａｔ又はＮｅｆなどのタンパク質の酸化的凝集を防ぐための１つの方法においては、タンパク質のチオール基の化学的修飾を利用する。最初のステップでは、ＤＴＴ、βメルカプトエタノール又はグルタチオンなどの還元剤を用いた処理によってジスルフィド架橋を還元する。第２ステップでは、生じたチオールをアルキル化剤を用いた反応によりブロッキングする（例えば、タンパク質をヨードアセトアミドと反応させうる）。かかる化学的修飾は、細胞結合アッセイ、ヒト末梢血単核球のリンパ増殖の阻害により評価されるＴａｔ又はＮｅｆの機能的性質を改変するものではない。
【００２５】
本発明がまた、少なくとも１つの免疫原性エピトープを含むことを条件に全長タンパク質のフラグメントの使用も包含することは理解されるだろう。
【００２６】
ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質は、本明細書の実施例に概説した方法により精製しうる。
【００２７】
本発明において使用するためのＴａｔ及び／若しくはＮｅｆ、又はＮｅｆＴａｔと、ｇｐ１２０成分（タンパク質又はＤＮＡ）の免疫防御量又は免疫治療量は、慣例的な方法により調製しうる。
【００２８】
ワクチンの調製は、New Trends and Developments in Vaccines, Vollerら編, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に一般的に記載されている。リポソーム中へのカプセル封入は、例えばＦｕｌｌｅｒｔｏｎの米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子へのタンパク質の結合は、例えばＬｉｋｈｉｔｅの米国特許第４，３７２，９４５号及びＡｒｍｏｒらの米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
【００２９】
ワクチン用量中のタンパク質の量は、通常のワクチン被接種者において重大かつ有害な副作用を引き起こすことなく免疫防御応答を誘導する量として選択される。このような量は、具体的にどの免疫原を使用するかによって異なる。一般に、各用量は、Ｔａｔ、Ｎｅｆ又はＮｅｆＴａｔの各タンパク質を１〜１０００μｇ、好ましくは２〜２００μｇ、最も好ましくは４〜４０μｇ含み、ｇｐ１２０を好ましくは１〜１５０μｇ、最も好ましくは２〜２５μｇ含むと予測される。特定のワクチンに対して最適な量は、被験者における抗体力価及び他の応答の観察を含む標準的な検査によって確かめることができる。ワクチン用量の１つの具体的な例は、ＮｅｆＴａｔ２０μｇとｇｐ１２０の５又は２０μｇを含みうる。最初のワクチン接種を行った後、被験者に約４週間で追加免疫を行うことができ、その後２回目の追加免疫を行ってもよい。
【００３０】
本発明のタンパク質は、好ましくは本発明のワクチン製剤においてアジュバントが添加されているものである。本発明において用いられるポリヌクレオチドは、場合によりアジュバントを使用してもよく、アジュバントと共に製剤として、又はアジュバントとは別々であるが同時に若しくは連続して送達することができる。アジュバントは、一般的にはVaccine Design − the Subunit and Adjuvant Approach, Powell及びNewman編, Plenum Press, New York, 1995に記載されている。
【００３１】
好適なアジュバントとしては、アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）又はリン酸アルミニウムが挙げられるが、カルシウム、鉄又は亜鉛の塩であってもよいし、あるいは、アシル化チロシン、若しくはアシル化糖、カチオン又はアニオンに誘導体化した多糖、又はポリホスファゼン（polyphosphazene）の不溶性懸濁液であってもよい。
【００３２】
本発明において使用するためのワクチン製剤においては、アジュバント組成物が選択的なＴｈ１応答を誘導することが好ましい。しかしながら、他の応答（例えば他の体液性応答）を排除するものではないことが理解されよう。
【００３３】
免疫応答は、抗原と免疫系細胞との相互作用により抗原に対して生じる。生じる免疫応答は、２つの極端なカテゴリー、つまり体液性免疫応答又は細胞性免疫応答（伝統的に、防御のための抗体によるエフェクター機能及び細胞によるエフェクター機構をそれぞれ特徴とする）に大きく分けることができる。これらの応答のカテゴリーは、Ｔｈ１型応答（細胞媒介性応答）及びＴｈ２型免疫応答（体液性応答）と名付けられている。
【００３４】
極端なＴｈ１型免疫応答は、抗原特異的なハプロタイプ拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球の産生及びナチュラルキラー細胞応答を特徴とする。マウスにおいて、Ｔｈ１型応答はしばしばＩｇＧ２ａサブタイプの抗体の生成を特徴とするが、ヒトにおいては、これらはＩｇＧ１型抗体に相当する。Ｔｈ２型免疫応答は、マウスにおけるＩｇＧ１、ＩｇＡ及びＩｇＭを含む広範囲の免疫グロブリンアイソタイプの生成を特徴とする。
【００３５】
これら２つのタイプの免疫応答の生起の背後にある駆動力はサイトカイン（免疫系細胞を補助し、結果として生じる免疫応答をＴｈ１又はＴｈ２応答のいずれかに導く働きをする、多数の同定されたタンパク質メッセンジャー）であると考えられる。高レベルのＴｈ１型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を促進する傾向があるが、高レベルのＴｈ２型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫応答の誘導を促進する傾向がある。
【００３６】
Ｔｈ１型及びＴｈ２型免疫応答の区別は絶対的なものではないことに留意することが重要である。現実には、個体は、Ｔｈ１型優位又はＴｈ２型優位といわれる免疫応答を保持する。しかし、Ｍｏｓｍａｎｎ及び Ｃｏｆｆｍａｎ（Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173）によりマウスＣＤ４＋ｖｅ Ｔ細胞クローンの場合に記載された観点で、サイトカインのファミリーを考慮することがしばしば便利である。伝統的に、Ｔｈ１型応答は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γサイトカインの産生と関連付けられている。Ｔｈ１型免疫応答の誘導としばしば直接関連付けられる他のサイトカインは、ＩＬ−１２等のＴ細胞によって産生されない。これに対し、Ｔｈ２型応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及び腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）の分泌と関連付けられている。
【００３７】
特定のワクチンアジュバントはＴｈ１型若しくはＴｈ２型のいずれかのサイトカイン応答の刺激に特に適していることが分かっている。伝統的に、ワクチン接種後又は感染後の免疫応答のＴｈ１：Ｔｈ２バランスを最も良く示す指標としては、抗原で再刺激した後にｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴリンパ球によるＴｈ１若しくはＴｈ２サイトカインの産生を直接測定すること、及び／又は抗原特異的抗体反応のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比を測定すること、が挙げられる。
【００３８】
このように、Ｔｈ１型アジュバントは、単離されたＴ細胞集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて抗原で再刺激したときに高レベルのＴｈ１型サイトカインを産生するよう刺激して、Ｔｈ１型アイソタイプに関連付けられる抗原特異的免疫グロブリン反応を誘導するものである。
【００３９】
好ましいＴｈ１型免疫刺激剤は、本発明に使用するのに好適なアジュバントを生成するように製剤化されていてもよく、限定するものではないが以下が挙げられる。
【００４０】
モノホスホリルリピドＡ、特に３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）は、本発明において用いるための好ましいＴｈ１型免疫刺激剤である。３Ｄ−ＭＰＬはＲｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ（Ｍｏｎｔａｎａ）により製造される周知のアジュバントである。化学的にはこれは３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡと４−、５−若しくは６−アシル化鎖との混合物として供給されることが多い。これは、ＧＢ２１２２２０４Ｂに教示される方法により精製及び調製することができ、この文献は、ジホスホリルリピドＡ及びその３−Ｏ−脱アシル化変異体の調製も開示している。他の精製及び合成リポ多糖類が記載されている（米国特許第６，００５，０９９号及びＥＰ０ ７２９ ４７３Ｂ１；Hilgersら, 1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 79(4):392-6；Hilgersら, 1987, Immunology, 60(1):141-6；並びにＥＰ０ ５４９ ０７４Ｂ１）。３Ｄ−ＭＰＬの好適な形態は、直径０．２μｍ未満の小さな粒径を有する粒状製剤の形態であり、その製造方法はＥＰ０ ６８９ ４５４に開示されている。
【００４１】
サポニンはまた、本発明において好ましいＴｈ１免疫刺激剤である。サポニンは周知のアジュバントであり、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ及びＷａｇｎｅｒ Ｈ．（1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386）に教示されている。例えば、ＱｕｉｌＡ（南米の樹木キラハ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮から得られる）及びその画分は、米国特許第５，０５７，５４０号、「Saponins as vaccine adjuvants」 Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55、及びＥＰ０ ３６２ ２７９Ｂ１に記載されている。溶血性サポニンＱＳ２１及びＱＳ１７（ＱｕｉｌＡをＨＰＬＣで精製した画分）は、強力な全身性アジュバントとして記載されており、それらの製造方法は米国特許第５，０５７，５４０号及びＥＰ０ ３６２ ２７９Ｂ１に開示されている。これらの参考文献には、全身性ワクチンのための強力なアジュバントとして作用するＱＳ７（ＱｕｉｌＡの非溶血性画分）の使用も記載されている。ＱＳ２１の使用は、Ｋｅｎｓｉｌら（1991. J. Immunology vol 146, 431-437）にさらに記載されている。またＱＳ２１とポリソルベート又はシクロデキストリンとの組み合わせが知られている（ＷＯ９９／１０００８号）。ＱｕｉｌＡの画分を含む粒子アジュバント系（ＱＳ２１及びＱＳ７など）はＷＯ９６／３３７３９号及びＷＯ９６／１１７１１号に記載されている。
【００４２】
別の好ましい免疫刺激剤は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧは、ＤＮＡに存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略称である。ＣｐＧは、当技術分野においては、全身及び経粘膜経路の両方により投与した場合にアジュバントとして知られている（ＷＯ９６／０２５５５号、ＥＰ４６８５２０号、Davisら, J.Immunol, 1998, 160(2):870-876；McCluskie及びDavis, J.Immunol., 1998, 161(9):4463-6）。従来、ＢＣＧのＤＮＡ画分が抗腫瘍作用を発揮しうることが観察されていた。さらなる研究においては、ＢＣＧ遺伝子配列から誘導された合成オリゴヌクレオチドが免疫刺激作用を誘導しうる（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で）ことが示された。これらの研究の著者は、中心のＣＧモチーフを含む特定のパリンドローム配列がこの活性を担っていると結論付けている。免疫刺激におけるＣＧモチーフの中心的な役割は、後にKrieg, Nature 374, p546 1995による刊行物において解明された。詳細な分析により、ＣＧモチーフが特定の配列に存在する必要があり、その配列が細菌ＤＮＡでは共通するが哺乳動物ＤＮＡでは稀少であることが示された。免疫刺激性配列は、プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン（ここでＣＧモチーフはメチル化されてない）であることが多いが、他の非メチル化ＣｐＧ配列も免疫刺激性であることが知られており、本発明において用いることができる。
【００４３】
上記６ヌクレオチドの特定の組み合わせにおいては、パリンドローム配列が存在する。これらのモチーフのいくつかは、１つのモチーフの繰返し又は異なるモチーフの組み合わせのいずれかとして、同じオリゴヌクレオチドに存在しうる。オリゴヌクレオチドを含む１以上のこれらの免疫刺激性配列の存在が、ナチュラルキラー細胞（インターフェロンγを産生し、細胞溶解活性を有する）及びマクロファージ（Wooldrigeら、Vol 89 (no. 8), 1977）を含む種々の免疫細胞集団を活性化しうる。このコンセンサス配列を含まない他の非メチル化ＣｐＧ含有配列もまた免疫調節性であることが示されている。
【００４４】
ＣｐＧはワクチンとして製剤化される場合、一般に、遊離抗原と一緒にした（ＷＯ９６／０２５５５号、McCluskie及びDavis（前掲））又は抗原に共有結合させた（ＷＯ９８／１６２４７号）自由溶液（free solution）として、あるいは水酸化アルミニウム等の担体と一緒に製剤化して（(Hepatitis surface antigen) Davisら（前掲）; Brazolot-Millanら, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8）、投与される。
【００４５】
上述したような免疫刺激剤は、担体、例えばリポソーム、水中油型エマルジョン又は金属塩（例えばアルミニウム塩（水酸化アルミニウムなど））と共に製剤化しうる。例えば、３Ｄ−ＭＰＬは、水酸化アルミニウム（ＥＰ０ ６８９ ４５４）又は水中油エマルジョン（ＷＯ９５／１７２１０号）と共に製剤化しうる。ＱＳ２１は、コレステロール含有リポソーム（ＷＯ９６／３３７３９号）、水中油型エマルジョン（ＷＯ９５／１７２１０号）又はミョウバン（ＷＯ９８／１５２８７号）と共に製剤化することが有利でありうる。ＣｐＧは、ミョウバン（Davisら、前掲；Brazolot-Millan 前掲）又は他のカチオン性担体と共に製剤化しうる。
【００４６】
免疫刺激剤の組み合わせもまた好ましく、特にモノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体（ＷＯ９４／００１５３号；ＷＯ９５／１７２１０号；ＷＯ９６／３３７３９号；ＷＯ９８／５６４１４号；ＷＯ９９／１２５６５号；ＷＯ９９／１１２４１号）、さらに具体的には、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ（ＷＯ９４／００１５３号）が好ましい。あるいは、ＣｐＧとサポニン（ＱＳ２１など）の組み合わせもまた本発明において使用するための強力なアジュバントを形成する。
【００４７】
従って、好適なアジュバント系としては、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３Ｄ−ＭＰＬとアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。強力な系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組み合わせ、特にＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ（ＷＯ９４／００１５３号に記載）、又は、ＱＳ２１がコレステロール含有リポソームにおいてクエンチされている反応原性の低い組成物（ＤＱ；ＷＯ９６／３３７３９号に記載）を含む。
【００４８】
水中油型エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを含む特に効力の高いアジュバント製剤は、ＷＯ９５／１７２１０号に記載されており、これは本発明において使用するための別の好ましい製剤である。
【００４９】
別の好ましい製剤は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを単独で又はアルミニウム塩と共に含む。
【００５０】
特に好ましいアジュバント及び／又は担体の組み合わせは以下のとおりである：
ｉ）３Ｄ−ＭＰＬ＋ＤＱ中のＱＳ２１
ｉｉ）ミョウバン＋３Ｄ−ＭＰＬ
ｉｉｉ）ミョウバン＋ＤＱ中のＱＳ２１＋３Ｄ−ＭＰＬ
ｉｖ）ミョウバン＋ＣｐＧ
ｖ）３Ｄ−ＭＰＬ＋ＤＱ中のＱＳ２１＋水中油型エマルジョン
ｖｉ）ＣｐＧ
【００５１】
既に記載したように、ワクチンは、１以上のＴａｔ、Ｎｅｆ及びｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡを含むことができ、そのポリペプチドはｉｎ ｓｉｔｕで生成される。
【００５２】
ＤＮＡ構築物自体、特に本明細書に記載ものもまた、本発明の一部を構成するものである。
【００５３】
ポリヌクレオチドは、当業者に公知の種々の送達系、例えば核酸発現系（例えばプラスミドＤＮＡ、細菌及びウイルス発現系）の任意のものに存在させることができる。多数の遺伝子送達技法が当技術分野で周知であり、Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998及びこれに引用される参考文献（参照により本明細書に組み入れる）に記載された技法がある。
【００５４】
プラスミドに基づく遺伝子送達は、特に免疫感作又は遺伝子治療の目的のための遺伝子送達が知られている。例えば、マウス筋肉への注射によるＤＮＡそのままの投与がＶｉｃａｌの国際特許出願第ＷＯ９０／１１０９２号に概説されている。
【００５５】
Ｊｏｈｎｓｔｏｎら（ＷＯ９１／０７４８７号）は、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドでコーティングし、微粒子が標的細胞を透過するよう微粒子を加速するマイクロ弾道を利用して、遺伝子を哺乳動物細胞に移入する方法を記載している。
【００５６】
ＤＮＡワクチンは、通常、強力なウイルスプロモーター、抗原ペプチドをコードする目的遺伝子、及びポリアデニル化／転写終結配列が挿入された細菌プラスミドベクターから構成される。目的遺伝子は、全長タンパク質、種々の抗原を含む融合タンパク質、又は単に防御しようとする目的の病原体、腫瘍若しくは他の因子に関連する抗原ペプチド配列をコードするものである。従って、プラスミドは、全長タンパク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープを含むことを条件に全長タンパク質のフラグメントをコードするものであってもよい。プラスミドは、細菌、例えば大腸菌で増殖させることができ、その後、単離し、宿主への投与前に、意図する投与経路に応じて適当な媒質中で調製しうる。投与後、宿主細胞によりプラスミドが取り込まれ、そこでコードされたペプチドが産生される。プラスミドベクターは、哺乳動物宿主においてプラスミドが複製し、動物の染色体ＤＮＡ内に組み込まれることを防止するため、真核細胞において機能する複製起点を含まないよう作製することが好ましい。これらの特徴は全て単独で又は組み合わせて本発明に適用しうる。
【００５７】
典型的なワクチン技法に関連するＤＮＡワクチン接種の利点はいくつかある。第１には、ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質が宿主において合成されるため、該タンパク質の構造又はコンホメーションは疾患状態に関連する天然タンパク質と類似することが予測される。また、ＤＮＡワクチン接種は、保存されたタンパク質に由来するエピトープを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球応答を引き起こすことにより、種々のウイルス株に対する防御を付与する可能性もある。さらに、プラスミドは宿主細胞によって取り込まれ、そこで抗原タンパク質が産生されるため、長期間持続する免疫応答が誘発されうる。この技術はまた、いくつかの疾患状態に関連する同時免疫感作を行うために単一調製物中に多様な免疫原を組み合わせることの可能性を提供しうる。
【００５８】
ＤＮＡワクチン接種に関連する有用な背景情報は、Donnellyら“DNA vaccines” Ann. Rev Immunol. 1997 15: 617-648に記載されており、この開示内容を参照によりその全文を本明細書に含めるものとする。
【００５９】
好ましい一実施形態においては、ＤＮＡは、粒子ボンバートメント手法、例えば、上述した「遺伝子ガン」手法により送達しうる。
【００６０】
適当な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列（適当なプロモーター及び終結シグナル等）を含む。発現系が、ウイルスや細菌等の組換え生微生物である場合、目的の遺伝子は組換え生ウイルス又は組換え生細菌のゲノムの中に挿入することができる。この生ベクターを接種及びｉｎ ｖｉｖｏ感染させると、その抗原のｉｎ ｖｉｖｏ発現及び免疫応答の誘導につながる。この目的で使用されるウイルス及び細菌としては、例えばポックスウイルス（例えばワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、又は、改変型ウイルスアンカラ（Modified Virus Ankara；ＭＶＡ）等の改変型ポックスウイルス）、アルファウイルス（シンドビスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、フラビウイルス（黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、ライノウイルス）、ヘルペスウイルス（水痘-帯状疱疹ウイルス等）、リステリア、サルモネラ、赤痢菌、ナイセリア、ＢＣＧなどが挙げられる。これらのウイルス及び細菌は、有毒なものであってもよいし、生ワクチンを得るために様々な方法で弱毒化されたものであってもよい。
【００６１】
従って、本発明に係る好ましいワクチンのＮｅｆ、Ｔａｔ及びｇｐ１２０成分は、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチド又は組換えＤＮＡの形態で提供しうる。本発明において使用するポリヌクレオチドは、全長タンパク質、種々の抗原を含む融合タンパク質、又は１以上の抗原ペプチド配列をコードしうる。従って、ポリヌクレオチドは、全長タンパク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープを含むという条件で全長タンパク質のフラグメントをコードするものであってもよい。
【００６２】
Ｎｅｆ、Ｔａｔ、ＮｅｆＴａｔ又はｇｐ１２０のＤＮＡの少なくとも１つは、例えば、Andre S. Seed B. Eberle J. Schraut W. Bultmann A. Haas J. (1998): Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage, Journal of Virology. 72(2):1497-503に記載のようにコドン最適化されていることが好ましい。一つの好ましい態様において、ｇｐ１２０をコードするＤＮＡをコドン最適化する。
【００６３】
コドン最適化は、哺乳動物細胞における発現のためにポリヌクレオチド配列を最適化するために用いる。すなわち、哺乳動物細胞における遺伝子のコドン使用頻度と類似するように配列が最適化される。
【００６４】
本発明の一実施形態において、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、ＮｅｆＴａｔ又はｇｐ１２０ポリヌクレオチド配列は、高発現哺乳動物遺伝子、特にヒト遺伝子のコドン使用頻度パターンと類似するコドン使用頻度パターンを有する。好ましくは、ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。望ましくは、ポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンは、高発現ヒト遺伝子に典型的なものである。
【００６５】
ＤＮＡコードは４文字（Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ）あり、これらを用いて３文字の「コドン」を形成する。これらの「コドン」は、生物の遺伝子中にコードされるタンパク質のアミノ酸を表す。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直鎖状配列は、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質（１種若しくは複数）の中のアミノ酸の直鎖状配列に翻訳される。このコードは高度に縮重しており、６１種類のコドンは２０種類の天然アミノ酸をコードし、３種類のコドンは「停止」シグナルを表す。このように、多くのアミノ酸は２種類以上のコドンによってコードされる。事実、幾つかのアミノ酸は４つ以上の異なるコドンによってコードされる。
【００６６】
所与のアミノ酸をコードするために２種類以上のコドンが利用される場合、生物のコドン使用頻度パターンは、常にランダムにあるわけではないことが分かった。種が異なると、そのコドン選択は異なった偏りを見せ、更に、単一の種において高レベルで発現される遺伝子と低レベルで発現される遺伝子との間では、コドンの利用が大きく異なる場合がる。この偏りは、ウイルス、植物、細菌、及び哺乳動物細胞において異なるものであり、幾つかの種は、他の種に比べて、ランダムなコドン選択とはかけ離れた非常に大きな偏りを見せる。例えば、ヒト及び他の哺乳動物は、ある種の細菌又はウイルスに比べて偏りが少ない。これらの理由により、大腸菌中で発現される哺乳動物遺伝子又は哺乳動物細胞中で発現されるウイルス遺伝子が効率の良い発現に適さないコドン分布を有する、という可能性が大いにある。異種ＤＮＡ配列の中に、発現が起こる宿主において稀にしか見られないコドンからなるクラスターが存在すると、その宿主中において異種遺伝子の発現レベルが低くなる可能性が高い、と予想される。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドにおいて、コドン使用頻度パターンは、ヒト免疫不全ウイルスに典型的なものから標的生物（例えば哺乳動物、特にヒト）のコドン偏りとより類似したものに改変する。「コドン使用頻度係数」とは、所定のポリヌクレオチド配列のコドンパターンが標的種のものとどの程度近似して類似しているかを表す尺度である。コドン頻度は、多くの種の高発現遺伝子についての文献群から導きうる（例えば、Nakamuraら、Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215参照）。６１種のコドンの各々についてのコドン頻度（選択した遺伝子クラスの１０００コドン当たりの発生数として表す）を、２０種の天然アミノ酸の各々について正規化する。その結果、各アミノ酸について最も高頻度に使用されるコドンの値を１と設定し、最も低い共通コドンの頻度を０〜１の間に存在するよう比率を設定する。従って、６１種のコドンの各々が、標的種の高発現遺伝子について１又はそれ以下の値を割り当てられる。ある種の高発現遺伝子に関して特定のポリヌクレオチドについてコドン使用頻度係数を計算するために、特定のポリヌクレオチドの各コドンについて一定比率の値を記録し、これらの値全ての幾何平均を求める（これらの値の自然対数の合計をコドンの総数で割り、逆対数をとる）。係数は、０〜１の値を有し、係数が高いほど、ポリヌクレオチドにおける高頻度に使用されるコドン数が多い。ポリヌクレオチド配列がコドン使用頻度係数１を有する場合には、コドンは全て、標的種の高発現遺伝子について「最も高頻度な」コドンである。
【００６８】
本発明においては、ポリヌクレオチドのコドン使用頻度パターンは、標的生物の高発現遺伝子におけるアミノ酸についてコドン使用頻度が１０％未満を示す稀少コドンを排除することが好ましい。別の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、標的生物の高発現遺伝子における０．２未満のＲＳＣＵ値を有するコドンを排除しうる。比較的同義のコドン使用頻度（ＲＳＣＵ）値は、観察されたコドン数を全コドンがそのアミノ酸について同じ頻度で使用される場合に予測される数で割った値である。本発明のポリヌクレオチドは、高発現ヒト遺伝子のコドン使用頻度係数が０．３以上、好ましくは０．４以上、最も好ましくは０．５以上を有するものである。ヒトについてのコドン使用頻度表はＧｅｎｅｂａｎｋで見出し得る。
【００６９】
比較すると高発現βアクチン遺伝子はＲＳＣＵが０．７４７である。ホモ・サピエンスのコドン使用頻度表を以下に示す。
【００７０】
コドン使用頻度表：
Homo sapiens [gbpri]: 27143 CDS (12816923コドン)
標準コドン使用頻度表
フィールド：[トリプレット] [1000当たりの頻度] ([数])
UUU 17.0(217684) UCU 14.8(189419) UAU 12.1(155645) UGU 10.0(127719)
UUC 20.5(262753) UCC 17.5(224470) UAC 15.8(202481) UGC 12.3(157257)
UUA 7.3( 93924) UCA 11.9(152074) UAA 0.7( 9195) UGA 1.3( 16025)
UUG 12.5(159611) UCG 4.5( 57572) UAG 0.5( 6789) UGG 12.9(165930)
CUU 12.8(163707) CCU 17.3(222146) CAU 10.5(134186) CGU 4.6( 59454)
CUC 19.3(247391) CCC 20.0(256235) CAC 14.9(190928) CGC 10.8(137865)
CUA 7.0( 89078) CCA 16.7(214583) CAA 12.0(153590) CGA 6.3( 80709)
CUG 39.7(509096) CCG 7.0( 89619) CAG 34.5(441727) CGG 11.6(148666)
AUU 15.8(202844) ACU 12.9(165392) AAU 17.0(218508) AGU 12.0(154442)
AUC 21.6(277066) ACC 19.3(247805) AAC 19.8(253475) AGC 19.3(247583)
AUA 7.2( 92133) ACA 14.9(191518) AAA 24.0(308123) AGA 11.5(147264)
AUG 22.3(285776) ACG 6.3( 80369) AAG 32.6(418141) AGG 11.3(145276)
GUU 10.9(139611) GCU 18.5(236639) GAU 22.4(286742) GGU 10.8(138606)
GUC 14.6(187333) GCC 28.3(362086) GAC 26.1(334158) GGC 22.7(290904)
GUA 7.0( 89644) GCA 15.9(203310) GAA 29.1(373151) GGA 16.4(210643)
GUG 28.8(369006) GCG 7.5( 96455) GAG 40.2(515485) GGG 16.4(209907)
コードGC 52.51% 第１文字GC 56.04% 第２文字GC 42.35% 第３文字GC 59.13%.
【００７１】
本発明のさらなる態様においては、発現ベクターは、本発明の第１の態様に従ってＮｅｆ及び／若しくはＴａｔ又はＮｅｆＴａｔと、ｇｐ１２０ポリヌクレオチド配列を含み、該配列の発現を指令可能なように提供され、特に、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、ＮｅｆＴａｔ又はｇｐ１２０ポリヌクレオチド配列、特にｇｐ１２０配列の少なくとも１つのコドン使用頻度パターンが、高発現哺乳動物遺伝子、好ましくは高発現ヒト遺伝子に典型的なものとなっている。ベクターは、哺乳動物細胞、特にヒト細胞において異種ＤＮＡの発現を駆動するために好適である。一実施形態において、発現ベクターはｐ７３１３（図２２参照）である。
【００７２】
さらなる態様において、本発明は、ｇｐ１２０と、ｎｅｆ及び／若しくはｔａｔ又はｎｅｆｔａｔをコードする１以上のベクターを含むＤＮＡでコーティングされた複数の粒子（好ましくは金ビーズ）を提供する。好ましくは、粒子は、ｇｐ１２０と、ｎｅｆ及びｔａｔをコードする単一ベクターでコーティングされ、最も好ましくはｎｅｆとｔａｔがＮｅｆＴａｔ融合タンパク質の形態である。最も好ましくは、上記配列の１以上がヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている。
【００７３】
好ましい態様において、ｎｅｆ、ｔａｔ及びｇｐ１２０をコードするＤＮＡは単一ベクター上に存在する。
【００７４】
好ましくは、ベクターは、効率的な発現のために強化ＨＣＭＶ ＩＥ１プロモーターの３’側に挿入されたｎｅｆ、ｔａｔ及びｇｐ１２０配列を含む。これは、好ましくはイントロンＡを含まないがエキソン１を含むＨＣＭＶ極初期プロモーターである。
【００７５】
本発明に係る１つの好適なベクターは、さらに後述するｐ７３１３と称するものである。
【００７６】
本明細書に記載のヌクレオチド配列を含むベクターは、予防又は治療上有効となるような量で投与される。投与する量は、一般的には、本明細書に記載する粒子媒介送達については１ピコグラムから１ミリグラム、好ましくは１ピコグラムから１０マイクログラムの範囲内である。正確な量は、免疫しようとする患者の体重、及び正確な投与経路に応じて異なり得る。
【００７７】
本発明の免疫は、タンパク質及びＤＮＡをベースとした製剤の組合せを用いて実施することができる。アジュバントを加えたタンパク質ワクチンは、主に抗体及びＴヘルパー免疫応答を誘導するが、プラスミド若しくは生ベクターとしてＤＮＡを送達すると、強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が誘導される。このように、タンパク質及びＤＮＡワクチン接種の組合せは、様々な免疫応答をもたらす。これは特に、ＨＩＶの場合に関して言えることである。なぜなら、ＨＩＶに対する免疫防御では、中和抗体及びＣＴＬの両方が重要であると考えられるからである。
【００７８】
ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡとして又は組換え生ベクター（例えばポックスウイルスベクター、若しくは本明細書に記載するような他の任意の好適な生ベクター）の形態で送達しうる。タンパク質抗原を１回又は複数回注射し、その後１回以上ＤＮＡを投与することができ、あるいは、ＤＮＡを最初に１回以上投与した後、１回以上タンパク質で免疫してもよい。
【００７９】
本発明の初回免疫−追加免疫の具体的な例は、改変ポックスウイルスベクターなどの組換え生ベクター、例えば改変ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）又は継代若しくは遺伝子操作によるその誘導体、又はアルファウイルスベクター（例えばベネズエラウマ脳炎ウイルス）の形態でのＤＮＡの初回免疫、続いて、タンパク質、好ましくはアジュバント添加タンパク質を用いた追加免疫を含む。場合により、当技術分野で公知の好適なＤＮＡワクチンアジュバントをＤＮＡに添加してもよい。
【００８０】
本発明はさらに、予防又は治療用免疫方法を提供し、該方法は、初回免疫−追加免疫送達において、以下：
ａ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｂ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｃ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチドと結合したＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；
及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質若しくはポリヌクレオチドを含む組成物を、その必要がある被験者に投与することを含むものであり、該タンパク質若しくはポリヌクレオチドは、ボンバートメント手法により送達される。
【００８１】
さらなる態様において、本発明は、ａ）本明細書に記載のｇｐ１２０と、ｎｅｆ及び／若しくはｔａｔ又はｎｅｆｔａｔをコードするＤＮＡでコーティングされた複数の粒子を含む組成物、並びにｂ）本明細書に記載のｇｐ１２０と、ｎｅｆ及び／若しくはｔａｔ又はｎｅｆｔａｔのＤＮＡ又はタンパク質を含む組成物（ここで、ｂ）のＤＮＡ又はタンパク質は粒子上にコーティングされていない）を含む、少なくとも２種のワクチン組成物を含むキットを提供する。
【００８２】
（実施例）
本発明の以下の実施例及び添付の図面において説明する。
【００８３】
一般
本実験の構築物のために、Ｂｒｕ／Ｌａｉ単離物由来のＮｅｆ遺伝子（Cell 40:9-17, 1985）を選択した。この遺伝子がコンセンサスＮｅｆに最も密接に関連するものだからである。
【００８４】
Ｂｒｕ／Ｌａｉ Ｎｅｆ遺伝子の出発材料は、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３にクローニングした１１７０ｂｐのＤＮＡ断片（ｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｆ）であった。
【００８５】
Ｔａｔ遺伝子はＢＨ１０分子クローンに由来する。この遺伝子をｐＣＶ１と呼ばれるＨＴＬＶ ＩＩＩ ｃＤＮＡとして入手した。これはScience, 229, p69-73, 1985に記載されている。
【００８６】
Ｎｅｆ及びＴａｔ遺伝子は、ピヒア属又は他の任意の宿主で発現させることができた。
【実施例１】
【００８７】
ピヒア・パストリスにおけるＨＩＶ−１ ｎｅｆ及びｔａｔ配列の発現
Ｎｅｆタンパク質、Ｔａｔタンパク質及び融合Ｎｅｆ−Ｔａｔを、誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターの制御下にメチロトローフ酵母ピヒア・パストリスで発現させた。
【００８８】
これらのＨＩＶ−１遺伝子を発現させるために、改変型の組込みベクターＰＨＩＬ−Ｄ２（INVITROGEN）を用いた。このベクターを、異種タンパク質の発現がＡＯＸ１遺伝子の天然ＡＴＧコドンの直後から始まり、そして１個のグリシン及び６個のヒスチジン残基のテールを有する組換えタンパク質を産生するように改変した。このＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを、ＰＨＩＬ−Ｄ２ベクターに隣接するＡｓｕＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間にオリゴヌクレオチドリンカーをクローニングすることによって構築した（配列番号２６及び２７を含む図２参照）。Ｈｉｓテールに加えて、このリンカーはＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ及びＸｂａＩ制限部位を有し、これらの間にｎｅｆ、ｔａｔ及びｎｅｆ−ｔａｔ融合体を挿入した。
【００８９】
１．１ 組込みベクターｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質をコードする）、ｐＲＩＴ１４５９８（Ｔａｔ−Ｈｉｓタンパク質をコードする）及びｐＲＩＴ１４５９９（Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体をコードする）の構築
ｎｅｆ遺伝子を、ＰＣＲによってプライマー０１及び０２を用いてｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｆプラスミドから増幅した。
【００９０】
【００９１】
得られたＰＣＲ断片及び組込みベクターＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤを、両方ともＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで制限消化し、アガロースゲル上で精製し、連結して組込みプラスミドｐＲＩＴ１４５９７を作製した（図２参照）。
【００９２】
ｔａｔ遺伝子を、ＰＣＲによってプライマー０５及び０４を用いてｐＣＶ１プラスミドの誘導体から増幅した：
【００９３】
ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲ断片の５’末端に導入した一方で、ＳｐｅＩ部位を３’末端にプライマー０４を用いて導入した。得られたＰＣＲ断片及びＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを、両方ともＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで制限消化し、アガロースゲル上で精製し、連結して組込みプラスミドｐＲＩＴ１４５９８を作製した。
【００９４】
ｐＲＩＴ１４５９９を構築するために、ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓコード配列に相当する９１０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターの平滑化ＥｃｏＲＩ（Ｔ４ポリメラーゼ）及びＮｃｏＩ部位間で連結した。ｐＲＩＴ１４５９６の平滑化ＸｂａＩ（Ｔ４ポリメラーゼ）及びＮｃｏＩ消化によって、ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓコード断片を得た。
【００９５】
１．２ ピヒア・パストリス株ＧＳ１１５（ｈｉｓ４）の形質転換
Ｎｅｆ−Ｈｉｓ、Ｔａｔ−Ｈｉｓ及び融合Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓを発現するピヒア・パストリス株を得るために、それぞれの発現カセット及びＨＩＳ４遺伝子を有する線状ＮｏｔＩ断片を用いて、株ＧＳ１１５を形質転換し、宿主ゲノム中のｈｉｓを補完した。ＮｏｔＩ線状断片によるＧＳ１１５の形質転換は、ＡＯＸＩ座での組換えを容易にする。
【００９６】
複数コピー組込みクローンを定量ドットブロット分析によって選択し、そして組込み、挿入（Ｍｕｔ＋表現型）又は転位（transplacement；Ｍｕｔｓ表現型）の種類を決定した。
【００９７】
各形質転換体から、組換えタンパク質の高産生レベルを示す１つの形質転換体を選択した。
【００９８】
Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を産生する株Ｙ１７３８（Ｍｕｔ＋表現型）、以下を含む２１５アミノ酸のミリスチル化タンパク質：
ｏ ミリスチン酸
ｏ ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＮｃｏＩクローニング部位を用いて作製した１個のメチオニン
ｏ Ｎｅｆタンパク質の２０５アミノ酸（アミノ酸２から始まり、アミノ酸２０６まで伸びる）
ｏ クローニング手順（ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＳｐｅＩ部位でのクローニング）によって作製した１個のスレオニン及び１個のセリン
ｏ １個のグリシン及び６個のヒスチジン。
【００９９】
Ｔａｔ−Ｈｉｓタンパク質を産生する株Ｙ１７３９（Ｍｕｔ＋表現型）、以下を含む９５アミノ酸のタンパク質：
ｏ ＮｃｏＩクローニング部位を用いて作製した１個のメチオニン
ｏ Ｔａｔタンパク質の８５アミノ酸（アミノ酸２から始まり、アミノ酸８６まで伸びる）
ｏ クローニング手順によって導入した１個のスレオニン及び１個のセリン
ｏ １個のグリシン及び６個のヒスチジン。
【０１００】
組換えＮｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質を産生する株Ｙ１７３７（ＭｕｔＳ表現型）、以下を含む３０２アミノ酸のミリスチル化タンパク質：
ｏ ミリスチン酸
ｏ ＮｃｏＩクローニング部位を用いて作製した１個のメチオニン
ｏ Ｎｅｆタンパク質の２０５アミノ酸（アミノ酸２から始まり、アミノ酸２０６まで伸びる）
ｏ クローニング手順によって作製した１個のスレオニン及び１個のセリン
ｏ Ｔａｔタンパク質の８５アミノ酸（アミノ酸２から始まり、アミノ酸８６まで伸びる）
ｏ クローニング手順によって導入した１個のスレオニン及び１個のセリン
ｏ １個のグリシン及び６個のヒスチジン。
【実施例２】
【０１０１】
ピヒア・パストリスにおけるＨＩＶ−１ Ｔａｔ変異体の発現
変異型組換えＴａｔタンパク質も発現させた。変異型Ｔａｔタンパク質は生物学的に不活性である必要がある一方で、その免疫原性エピトープを維持している必要がある。
【０１０２】
これらの構築物のために、Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ（Tulane University）によって構築された二重変異体ｔａｔ遺伝子を選択した。
【０１０３】
このｔａｔ遺伝子（ＢＨ１０分子クローンに由来する）は、活性部位領域の変異（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）及びＲＧＤモチーフの変異（Ａｒｇ７８→Ｌｙｓ及びＡｓｐ８０→Ｇｌｕ）を有する（Virology 235:48-64, 1997）。
【０１０４】
変異体ｔａｔ遺伝子を、ＣＭＶ発現プラスミド内のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でサブクローニングしたｃＤＮＡ断片（ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥ）として得た。
【０１０５】
２．１ 組込みベクターｐＲＩＴ１４９１２（Ｔａｔ変異体−Ｈｉｓタンパク質をコードする）及びｐＲＩＴ１４９１３（融合Ｎｅｆ−Ｔａｔ変異体−Ｈｉｓタンパク質をコードする）の構築
ｔａｔ変異体遺伝子をＰＣＲによってプライマー０５及び０６を用いてｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミドから増幅した（１．１章、ｐＲＩＴ１４５９８の構築を参照）。
【０１０６】
ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲ断片の５’末端に導入した一方で、ＳｐｅＩ部位をプライマー０４を用いて３’末端に導入した。得られたＰＣＲ断片及びＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを、両方ともＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで制限消化し、アガロースゲル上で精製し、連結して組込みプラスミドｐＲＩＴ１４９１２を作製した。
【０１０７】
ｐＲＩＴ１４９１３を構築するために、ｔａｔ変異体遺伝子をＰＣＲによってプライマー０３及び０４を用いてｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミドから増幅した。
【０１０８】
【０１０９】
得られたＰＣＲ断片及びプラスミドｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を発現する）を、両方ともＳｐｅＩ制限酵素で消化し、アガロースゲル上で精製し、連結して組込みプラスミドｐＲＩＴ１４９１３を作製した。
【０１１０】
２．２ ピヒア・パストリス株ＧＳ１１５の形質転換
上記１．２章に記載した組込み及び組換え株の選択方法を応用することによって、Ｔａｔ変異体−Ｈｉｓタンパク質及び融合Ｎｅｆ−Ｔａｔ変異体−Ｈｉｓを発現するピヒア・パストリス株を得た。
【０１１１】
Ｔａｔ変異体−Ｈｉｓタンパク質（９５アミノ酸タンパク質）を産生する２つの組換え株を選択した：Ｙ１７７５（Ｍｕｔ＋表現型）及びＹ１７７６（ＭｕｔＳ表現型）。
【０１１２】
Ｎｅｆ−Ｔａｔ変異体−Ｈｉｓ融合タンパク質、３０２アミノ酸のタンパク質を発現する１つの組換え株を選択した：Ｙ１７７４（Ｍｕｔ＋表現型）。
【実施例３】
【０１１３】
組換えＴａｔ−Ｈｉｓを産生するピヒア・パストリスの発酵
典型的な方法を以下の表に記載する。
【０１１４】
発酵は、高細胞密度培養物に導く増殖期（適切な曲線に従ってグリセロールベースの培地を供給する）及び誘導期（メタノール及び塩／微量元素溶液を供給する）を含む。発酵中に、サンプルを採り、それらの６２０ｎｍでの吸光度を測定することによって増殖を追跡する。誘導期中に、メタノールをポンプから加え、その濃度をガスクロマトグラフィー（培養サンプルについて）及び質量分析計を用いるオンラインガス分析によってモニターした。発酵ののち、２〜８℃で５０２０ｇにて３０秒間遠心することによって細胞を回収し、そして細胞ペーストを−２０℃で保存する。さらに作業するために、細胞ペーストを解凍し、緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ７ ５０ｍＭ、ＰＭＳＦ５％、イソプロパノール４ｍＭ）中にＯＤ＝１５０（６２０ｎｍ）で再懸濁させ、そしてＤｙｎｏＭｉｌｌ（空間０．６Ｌ、３０００ｒｐｍ、６Ｌ／Ｈ、ビーズ直径０．４０〜０．７０ｍｍ）に４回通過させて破壊した。
【０１１５】
発現を評価するために、誘導中にサンプルを取り出し、破壊し、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ又はウエスタンブロット法によって分析した。クーマシーブルー染色ＳＤＳゲル上で、組換えＴａｔ−ｈｉｓは、約７２〜９６時間の誘導後に最大強度を示す強いバンドとして明確に同定された。
【表１】
【０１１６】
発酵に用いた培地：
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【実施例４】
【０１１７】
Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質（ピヒア・パストリス）の精製
精製スキームは、組換えピヒア・パストリス細胞（湿重量）１４６ｇ又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ５５の２Ｌから開始した。クロマトグラフィーステップは室温で行う。ステップ間でＮｅｆ−Ｔａｔ陽性分画を寒冷室（＋４℃）に一夜保存し、より長時間のためにはサンプルを−２０℃で凍結する。
【表７】
【０１１８】
【０１１９】
純度
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した純度レベルを、Ｄａｉｉｃｈｉ銀染色によるものを図３に、クーマシーブルーＧ２５０によるものを図４に示す。
【０１２０】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ステップ後： ＞９５％
透析及び滅菌濾過ステップ後： ＞９５％
【０１２１】
回収
組換えピヒア・パストリス細胞（＝Ｄｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ５５の２Ｌ）１４６ｇから、Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質５１ｍｇを精製する。
【実施例５】
【０１２２】
ピヒア・パストリス中の酸化Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質の精製
精製スキームは、組換えピヒア・パストリス細胞７３ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ５５の１Ｌから開始した。クロマトグラフィーステップを室温で行う。ステップ間でＮｅｆ−Ｔａｔ陽性分画を寒冷室（＋４℃）に一夜保存し；より長時間のためにはサンプルを−２０℃で凍結する。
【表８】
【０１２３】
【０１２４】
→ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した純度レベルを図６に示す（Ｄａｉｉｃｈｉ銀染色、クーマシーブルーＧ２５０、ウェスタンブロッティング）：
透析及び滅菌濾過ステップ後： ＞９５％
→回収（比色タンパク質アッセイにより評価：ＤＯＣ ＴＣＡ ＢＣＡ）
組換えピヒア・パストリス細胞７３ｍｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ５０の１Ｌから、酸化Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質２．８ｍｇを精製する。
【実施例６】
【０１２５】
還元Ｔａｔ−Ｈｉｓタンパク質（ピヒア・パストリス）の精製
精製スキームは、組換えピヒア・パストリス細胞１６０ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ６６の２Ｌから開始した。クロマトグラフィーステップを室温で行う。ステップ間でＴａｔ陽性分画を寒冷室（＋４℃）に一夜保存し、より長時間のためにはサンプルを−２０℃で凍結する。
【表９】
【０１２６】
【０１２７】
→ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した純度レベルを図７に示す（Ｄａｉｉｃｈｉ銀染色、クーマシーブルーＧ２５０、ウェスタンブロッティング）：
透析及び滅菌濾過ステップ後： ＞９５％
→回収（比色タンパク質アッセイにより評価：ＤＯＣ ＴＣＡ ＢＣＡ）
組換えピヒア・パストリス細胞１６０ｇ（湿潤重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ６６の２Ｌから、還元Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質４８ｍｇを精製する。
【実施例７】
【０１２８】
酸化Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質（ピヒア・パストリス）の精製
精製スキームは、組換えピヒア・パストリス細胞７４ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ６０の１Ｌから開始した。クロマトグラフィーステップを室温で行う。ステップ間でＴａｔ陽性分画を寒冷室（＋４℃）に一夜保存し、より長時間のためにはサンプルを−２０℃で凍結する。
【表１０】
【０１２９】
→ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した純度レベルを図８に示す（Ｄａｉｉｃｈｉ銀染色、クーマシーブルーＧ２５０、ウェスタンブロッティング）：
透析及び滅菌濾過ステップ後： ＞９５％
→回収（比色タンパク質アッセイにより評価：ＤＯＣ ＴＣＡ ＢＣＡ）
組換えピヒア・パストリス細胞７４ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ６０の１Ｌから、酸化Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質１９ｍｇを精製する。
【実施例８】
【０１３０】
ＳＩＶ還元Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質（ピヒア・パストリス）の精製
精製スキームは、組換えピヒア・パストリス細胞３４０ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ１００の４Ｌから開始した。クロマトグラフィーステップを室温で行う。ステップ間でＮｅｆ陽性分画を寒冷室（＋４℃）に一夜保存し、より長時間のためにはサンプルを−２０℃で凍結する。
【表１１】
【０１３１】
→ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した純度レベルを図９に示す（Ｄａｉｉｃｈｉ銀染色、クーマシーブルーＧ２５０、ウェスタンブロッティング）：
透析及び滅菌濾過段階後： ＞９５％
→回収（比色タンパク質アッセイにより評価：ＤＯＣ ＴＣＡ ＢＣＡ）
組換えピヒア・パストリス細胞３４０ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ１００の４Ｌから、ＳＩＶ還元Ｎｅｆ−ｈｉｓタンパク質２０ｍｇを精製する。
【実施例９】
【０１３２】
ＨＩＶ還元Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質（ピヒア・パストリス）の精製
精製スキームは、組換えピヒア・パストリス細胞１６０ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ５０の３Ｌから開始した。クロマトグラフィーステップを室温で行う。ステップ間でＮｅｆ陽性分画を寒冷室（＋４℃）に一夜保存し、より長時間のためにはサンプルを−２０℃で凍結する。
【表１２】
【０１３３】
→ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した純度レベルを図１０に示す（Ｄａｉｉｃｈｉ銀染色、クーマシーブルーＧ２５０、ウェスタンブロッティング）：
透析及び滅菌濾過段階後： ＞９５％
→回収（比色タンパク質アッセイにより評価：ＤＯＣ ＴＣＡ ＢＣＡ）
組換えピヒア・パストリス細胞１６０ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ５０の３Ｌから、ＨＩＶ還元Ｎｅｆ−ｈｉｓタンパク質２０ｍｇを精製する。
【実施例１０】
【０１３４】
ピヒア・パストリスにおけるＳＩＶ ｎｅｆ配列の発現
病原性ＳＨＩＶチャレンジ（challenge）モデルにおいてＮｅｆ及びＴａｔ抗原を評価するために、マカーク（アカゲザル）のサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＮｅｆタンパク質、ＳＩＶｍａｃ２３９を発現させた（Aids Research and Human Retroviruses, 6:1221-1231, 1990）。
【０１３５】
Ｎｅｆコード領域に、ＳＩＶｍａｃ２３９は、９２アミノ酸の後にリーディングフレーム内の停止コドンを有し、僅か１０ｋＤの末端切断産物が予測される。Ｎｅｆリーディングフレームの残りはオープンリーディングフレームであり、そして２６３アミノ酸（３０ｋＤ）のタンパク質をその完全なオープンリーディングフレームの形態でコードすると予測されるであろう。
【０１３６】
ＳＩＶｍａｃ２３９ｎｅｆ遺伝子のための出発材料は、ＬＸ５Ｎプラスミドにクローニングした完全コード配列に相当するＤＮＡ断片であった（Ｄｒ Ｒ．Ｃ．Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，Southborough, MA, USAより提供を受けた）。
【０１３７】
完全長ＳＩＶｍａｃ２３９Ｎｅｆタンパク質を発現させるために、このＳＩＶｎｅｆ遺伝子を、成熟前の停止コドンにおいて変異させる（位置９３５３のヌクレオチドＧが元のＴヌクレオチドに取って代わる）。
【０１３８】
このＳＩＶｎｅｆ遺伝子をピヒア・パストリスにおいて発現させるために、（ＨＩＶ−１ ｎｅｆ及びｔａｔ配列の発現のために前に用いた）ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを用いた。誘導アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターの制御下で組換えタンパク質を発現させ、そしてこのタンパク質のC末端をヒスチジンアフィニティテール（これは精製を容易にする）によって伸長する。
【０１３９】
１０．１ 組込みベクターｐＰＩＴ１４９０８の構築
ｐＰＩＴ１４９０８を構築するために、ＳＩＶ ｎｅｆ遺伝子をｐＬＸ５Ｎ／ＳＩＶ−ＮＥＦプラスミドからプライマーＳＮＥＦ１及びＳＮＥＦ２を用いてＰＣＲにより増幅した：
【０１４０】
増幅したＳＩＶ ｎｅｆ ＤＮＡ領域は、ヌクレオチド９０７７で始まり、そしてヌクレオチド９８６５で終わる（Aids Research and Human Retroviruses, 6:1221-1231, 1990）。
【０１４１】
（ｎｅｆ遺伝子のＡＴＧコドンを有する）ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲ断片の５’末端に導入した一方で、ＳｐｅＩ部位を３’末端に導入した。得られたＰＣＲ断片及び組込みＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを、両方ともＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで制限消化した。ＳＩＶ ｎｅｆ増幅配列には（位置９２８６に）１つのＮｃｏＩ制限部位が存在するので、それぞれ±２００ｂｐ及び±６００ｂｐの２つの断片が得られ、アガロースゲル上で精製し、そしてＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターに連結した。得られた組換えプラスミドに、自動配列決定によりｎｅｆ増幅領域を確認したのち、ｐＲＩＴ１４９０８という名称を与えた。
【０１４２】
１０．２ ピヒア・パストリス株ＧＳ１１５の形質転換（ｈｉｓ４）
ＳＩＶ ｎｅｆ−Ｈｉｓを発現するピヒア・パストリス株を得るために、発現カセット及びＨＩＳ４遺伝子だけを有する線状ＮｏｔＩ断片を用いて株ＧＳ１１５を形質転換した（図１１参照）。
【０１４３】
両末端でＡＯＸ１存在（resident）ピヒア・パストリス遺伝子との相同性を有するこの線状ＮｏｔＩＤＮＡ断片は、ＡＯＸ１座での組換えを容易にする。
【０１４４】
多コピー組込みクローンを定量ドットブロット分析によって選択した。
【０１４５】
最良の組換えタンパク質産生レベルを示す１つ形質転換物を選択し、そしてＹ１７７２という名称を与えた。
【０１４６】
株Ｙ１７７２は組換えＳＩＶ Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質（２７２アミノ酸を含むタンパク質）を産生し、これは以下から構成されるであろう：
ｏ ミリスチン酸
ｏ ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＮｃｏＩクローニング部位を用いて作成した１個のメチオニン
ｏ ２６２アミノ酸のＮｅｆタンパク質（アミノ酸２から始まり、アミノ酸２６３まで伸長する、図１２参照）
ｏ クローニング手順（ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＳｐｅＩ部位でのクローニング）によって作製した１個のスレオニン及び１個のセリン（図１１参照−配列番号２９を含む）
ｏ １個のグリシン及び６個のヒスチジン。
【０１４７】
核酸及びタンパク質配列を図１２に示す（配列番号３０及び３１）。
【０１４８】
１０．３ 株Ｙ１７７２の発現産物の特性決定
発現レベル
炭素源として１％メタノールを含む培地で１６時間誘導したのち、組換えＮｅｆ−Ｈｉｓタンパク質の存在量を全タンパク質の１０％と推定した（図１３、レーン３−４）。
【０１４９】
溶解性
Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を産生する組換え株Ｙ１７７２の誘導培養物を遠心した。細胞ペレットを破壊緩衝液に再懸濁させ、０．５ｍｍガラスビーズで破壊し、細胞抽出物を遠心した。不溶性ペレット（Ｐ）及び可溶性上清液（Ｓ）に含まれたタンパク質をクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０％で比較した。
【０１５０】
図１３に示すように、株Ｙ１７７２由来の組換えタンパク質の大部分（レーン３−４）は、不溶性分画に関連した。
【０１５１】
十分な組換えタンパク質発現レベルを示す株Ｙ１７７２を、ＳＩＶ Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質の産生及び精製のために用いる。
【実施例１１】
【０１５２】
ＣＨＯにおけるＧＰ１２０の発現
組換えｇＰ１２０糖タンパク質を産生する安定ＣＨＯ−Ｋ１細胞系を確立した。組換えｇＰ１２０糖タンパク質は、ＨＩＶ−１単離物Ｗ６１ＤのｇＰ１２０エンベロープタンパク質の組換え末端切断形態である。タンパク質を細胞培養培地に分泌させ、次いで、これからタンパク質を精製する。
【０１５３】
ｇｐ１２０トランスフェクションプラスミドｐＲＩＴ１３９６８の構築
ＨＩＶ−１単離物Ｗ６１ＤのエンベロープＤＮＡコード配列（ｔａｔ及びｒｅｖの５’エクソンを含む）を、ゲノムｇｐ１６９エンベロープ含有プラスミドＷ６１Ｄ（Ｎｃｏ−ＸｈｏＩ）として入手した（Ｄｒ．Ｔｅｒｓｍｅｔｔｅ，CCB, Amsterdam）。このプラスミドをｐＲＩＴ１３９６５と命名した。
【０１５４】
ｇｐ１２０発現カセットを構築するために、プライマーオリゴヌクレオチド配列（ＤＩＲ１３１）及びＰＣＲ技術を用いて、停止コドンをｐＲＩＴ１３９６５のｇｐ１６０コード配列のアミノ酸ｇｌｕ５１５コドンに挿入する必要がある。プライマーＤＩＲ１３１は、３つの停止コドン（全てオープンリーディングフレーム中）及び１つのＳａｌＩ制限部位を含む。
【０１５５】
次いで、ｐＲＩＴ１３９６５から誘導したｇｐ１６０プラスミドサブクローンｐＷ６１ｄ ｅｎｖ（ｐＲＩＴ１３９６６）のＮ末端ＢａｍＨ１−ＤｒａＩ断片（１７０ｂｐ）から完全ｇｐ１２０エンべローブ配列を再構築し、そしてＰＣＲによりｐＲＩＴ１３９６５からＤｒａＩ−ＳａｌＩ断片（５１０ｂｐ）を作製した。両方の断片をゲル精製し、そして一緒に大腸菌プラスミドｐＵＣ１８に連結し、最初にＳａｌＩで切断し（クレノウ処理）、次いでＢａｍＨ１で切断した。これによりプラスミドｐＲＩＴ１３９６７が生じた。ｇｐ１２０コードカセットを含むＸｍａＩ−ＳａｌＩ断片（１５８０ｂｐ）の遺伝子配列を配列決定し、そして推定配列と一致することを見出した。最初にＢｃｌＩで切断し（クレノウ処理）、次いでＸｍａＩで切断することにより、プラスミドｐＲＩＴ１３９６７をＣＨＯ ＧＳ−発現ベクターｐＥＥ１４（Celltech Ltd., UK）に連結した。生成したプラスミドをｐＲＩＴ１３９６８と命名した。
【０１５６】
マスター細胞バンクの調製
典型的なＣａＰＯ４沈殿／グリセロールショック手順によって、ｇｐ１２０−構築物（ｐＲＩＴ１３９６８）をＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。２日後に、ＣＨＯＫ１細胞を、選択的増殖培地（ＧＭＥＭ＋メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）２５μＭ＋グルタメート＋アスパラギン＋１０％ウシ胎児血清）に供した。３つのトランスフェクタントクローンを１７５ｍ２フラスコ中でさらに増幅し、そして数本の細胞バイアルを−８０℃で保存した。さらなる実験のために、Ｃ−ｅｎｖ２３，９を選択した。
【０１５７】
小さい細胞予備バンクを調製し、そして２０のアンプルを凍結した。予備バンク及びＭＣＢを調製するために、７．５％ウシ胎児血清を添加し、かつ５０μＭ ＭＳＸを含むＧＭＥＭ培地で細胞を増殖させた。これらの細胞培養物を無菌性及びマイコプラズマについて試験し、そして陰性であることを証明した。
【０１５８】
予備マスター細胞バンクから誘導した細胞を用いて、マスター細胞バンクＣＨＯＫ１ ｅｎｖ２３．９（１２継代）を調製した。簡単に述べると、７．５％透析ウシ胎児血清を添加した培地に、２アンプルの予備マスター種を接種した。細胞を４本の培養フラスコに分配し、そして３７℃で培養した。細胞が付着したのち、培地を、５０μＭ ＭＳＸを添加した新たな培地と交換した。コンフルエントに達したとき、細胞をトリプシン処理により集め、そしてＴ−フラスコ−ローラービン−細胞製造ユニットにおいて、１／８分割比で継代培養した。細胞製造ユニットからトリプシン処理して細胞を集め、そして遠心した。低温保存剤としてＤＭＳＯを添加した培地に細胞ペレットを再懸濁させた。アンプルを予め標識し、オートクレーブ処理し、そして加熱密封した（２５０バイアル）。それらを漏れについて試験し、そして−７０℃で一夜保存したのち、液体窒素中で保存した。
【０１５９】
細胞培養及び粗回収物の製造
マスター細胞バンクからの２本のバイアルを急速解凍する。細胞をプールし、そして７．５％透析ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した適切な培地を入れた２つのＴ−フラスコに３７±１℃で接種する。コンフルエントに達したとき（１３継代）、細胞をトリプシン処理により集め、プールし、そして１０のＴ−フラスコで上記のように増殖させる。コンフルエントに達した細胞（１４継代）をトリプシン処理し、２つの細胞製造ユニット（それぞれ６０００ｃｍ２；１５継代）、次いで１０の細胞製造ユニット（１６継代）で連続的に増殖させる。増殖培地に７．５％透析ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ＭＳＸを添加する。細胞がコンフルエントに達したとき、増殖培地を捨て、そして１％透析ウシ胎児血清（ＦＢＳ）だけを含みＭＳＸを含まない「製造培地」と交換する。２日ごとに（４８時間の間隔で）３２日まで上清液を集める。回収した培養液を直ちに１．２−０．２２μｍフィルターユニットに通して清澄化し、そして−２０℃で保存したのち、精製する。
【実施例１２】
【０１６０】
細胞培養液からのＨＩＶ ｇｐ１２０（Ｗ６１Ｄ ＣＨＯ）の精製
全ての精製ステップを２−８℃の寒冷室内で行う。緩衝液のｐＨをこの温度で調節し、そして０．２μｍフィルターで濾過する。それらを発熱物質含有量について試験する（ＬＡＬアッセイ）。カラム溶出物の２８０ｎｍでの光学濃度、ｐＨ及び伝導率を連続的にモニターする。
【０１６１】
（ｉ）清澄化培養液
回収した清澄化細胞培養液（ＣＣＦ）をフィルター滅菌し、そしてトリス緩衝液、ｐＨ８．０を３０ｍＭ最終濃度まで加える。精製するまでＣＣＦを−２０℃で凍結保存する。
【０１６２】
（ｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー
解凍したのち、清澄化培養液に硫酸アンモニウムを１Ｍまで加える。この溶液を、３０ｍＭトリス緩衝液−ｐＨ８．０−１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化したＴＳＫ／ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ−ＢＵＴＹＬ ６５０Ｍ（ＴＯＳＯＨＡＡＳ）カラムに一夜通過させる。これらの条件下で、抗原はゲルマトリックスに結合する。段階的に低下する硫酸アンモニウム勾配でカラムを洗浄する。３０ｍＭトリス緩衝液−ｐＨ８．０−０．２５Ｍ硫酸アンモニウムで抗原を溶出させる。
【０１６３】
（ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー
溶液の伝導率を５〜６ｍＳ／ｃｍに低下させたのち、分画のｇＰ１２０プールをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Pharmacia）カラムに導入し、トリス−生理食塩水−ｐＨ８．０で平衡化する。カラムを陰性形式で操作し、すなわちｇＰ１２０はゲルに結合しないが、不純物の大部分は保持される。
【０１６４】
（ｉｖ）濃縮及び限外濾過による透析濾過
タンパク質濃度を高めるために、ｇＰ１２０プールをＦＩＬＴＲＯＮ膜”Ｏｍｅｇａ Ｓｃｒｅｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌ” 、５０ｋＤａカットオフに導入する。濃縮が終了したのち、緩衝液の透析濾過により、ＣａＣｌ２ ０．３ｍＭ、ｐＨ７．０を含む５ｍＭリン酸緩衝液と交換する。さらなる処理を直ちに行わない場合には、ｇＰ１２０プールを−２０℃で凍結保存する。解凍したのち、不溶性物質を除去するために、この溶液を０．２μＭ膜で濾過する。
【０１６５】
（ｖ）ヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィー
５ｍＭリン酸緩衝液＋ＣａＣｌ２ ０．３ｍＭ、ｐＨ７．０で平衡化したｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ、ＩＩ型（BioRad）カラムにｇＰ１２０ＵＦプールを導入する。カラムを同じ緩衝液で洗浄する。抗原はカラムを通過し、そして不純物はカラムに結合する。
【０１６６】
（ｖｉ）陽イオン交換クロマトグラフィー
酢酸塩緩衝液２０ｍＭ、ｐＨ５．０で平衡化したＣＭ／ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ−６５０Ｓ（ＴＯＳＯＨＡＡＳ）カラムにｇＰ１２０プールを導入する。カラムを同じ緩衝液、次いで酢酸塩２０ｍＭ、ｐＨ５．０及びＮａＣｌ １０ｍＭで洗浄する。次いで８０ｍＭ ＮａＣｌを含む同じ緩衝液で抗原を溶出させる。
【０１６７】
（ｖｉｉ）限外濾過
精製方法のウイルスクリアランス能を示すために、さらなる限外濾過ステップを行う。ｇＰ１２０プールをＦＩＬＴＲＯＮ膜 ”Ｏｍｅｇａ Ｓｃｒｅｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌ”、１５０ｋＤａカットオフでの限外濾過に供する。この孔サイズ膜は抗原を保持しない。処理したのち、同じ種類の膜（Ｆｉｌｔｒｏｎ）であるが５０ｋＤａのカットオフを有するもので希釈抗原を濃縮する。
【０１６８】
（ｖｉｉｉ）サイズ排除ゲルクロマトグラフィー
緩衝液を交換し、かつ残留夾雑物を除去するために、ｇＰ１２０プールをＳＵＰＥＲＤＥＸ２００（PHARMACIA）カラムにアプライする。カラムをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶出させる。
【０１６９】
（ｉｘ）滅菌濾過及び保存
０．２μＭ ＰＶＤＦ膜（Millipore）で濾過することにより、画分を滅菌する。滅菌濾過したのち、精製バルクを製剤化するまで−２０℃で凍結保存する。精製スキームを以下のフローシートにまとめる。
【０１７０】
→ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価した精製バルクの純度レベル（銀染色／クーマシーブルー／ウェスタンブロット法）は９５％以上である。
【０１７１】
→製造収率は約２．５ｍｇ／Ｌ ＣＣＦである（Ｌｏｗｒｙアッセイによる）− 全体的収率は約２５％である（Ｅｌｉｓａアッセイによる）。
【０１７２】
→精製材料は３７℃で約１週間安定である（ＷＢ分析による）。
【表１３】
【実施例１３】
【０１７３】
ワクチン調製物
本発明により製造されるワクチンは、抗原をコードする１以上のＤＮＡ組換え体の発現産物を含む。さらに、製剤は、水中油型エマルジョン中に担体としての３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）及びＱＳ２１の混合物、又は非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドモチーフを含むオリゴヌクレオチド及び水酸化アルミニウムを含む。
【０１７４】
３Ｄ−ＭＰＬ：グラム陰性細菌サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）のリポ多糖（ＬＰＳ）の化学的解毒形態である。
【０１７５】
実験は、種々のビヒクルと組み合わせた３Ｄ−ＭＰＬが体液性免疫及びＴＨ１型細胞性免疫の両方を強く増強することを示した。
【０１７６】
ＱＳ２１：強いアジュバント活性を有するキラハ・サポナリア（Quillaja Saponaria）の樹皮の粗製抽出物から精製したサポニンである。抗原特異的リンパ球増殖、及び幾つかの抗原に対するＣＴＬの両方を誘導する。
【０１７７】
実験は、体液性及びＴＨ１型細胞性免疫応答の両方の誘導において、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１の組み合わせの明確な相乗効果を示した。
【０１７８】
水中油型エマルジョンは、２つの油（トコフェロール及びスクワレン）、及び乳化剤としてのＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳからなる。このエマルジョンは、５％スクワレン、５％トコフェロール、２％Ｔｗｅｅｎ８０を含み、そして１８０ｎｍの平均粒径を有する（ＷＯ９５／１７２１０号参照）。
【０１７９】
行った実験は、このＯ／Ｗエマルジョンを３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１に添加すると、それらの免疫刺激特性をさらに増大させることを示した。
【０１８０】
水中油型エマルジョン（２倍濃縮）の製造
Ｔｗｅｅｎ８０をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解してＰＢＳ中２％溶液を得る。２倍濃縮エマルジョン１００ｍｌを得るために、ＤＬαトコフェロール５ｇ及びスクワレン５ｍｌを回転させてよく混合する。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液９０ｍｌを加えてよく混合する。次いで、生成したエマルジョンをシリンジに通し、そして最後にＭ１１０Ｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ機を用いて微細流動化する。生成した油滴は約１８０ｎｍの大きさを有する。
【０１８１】
水中油型製剤の製造
抗原（１００μｇ ｇｐ１２０、２０μｇ ＮＥＦＴａｔ及び２０μｇ ＳＩＶ Ｎｅｆ、単独又は組み合わせ）を１０倍濃縮ＰＢＳ ｐＨ６．８及びＨ２Ｏで希釈したのち、水中油型エマルジョン、３Ｄ−ＭＰＬ（５０μｇ）、ＱＳ２１（５０μｇ）及び保存剤としての１μｇ／ｍｌチオメルサールを順次に５分間隔で加える。エマルジョン容量は全容量の５０％（投与量５００μｌにつき２５０μｌ）である。
【０１８２】
全てのインキュベーションを室温で撹拌しながら行う。
【０１８３】
ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）は、１以上のＣｐＧ配列モチーフを含む合成の非メチル化オリゴヌクレオチドである。混合ＴＨ１／ＴＨ２型応答を主に誘導する水中油型製剤と比較して、ＣｐＧはＴＨ１型免疫の極めて強力な誘導因子である。ＣｐＧは、水中油型製剤よりも低レベルの抗体及び良好な細胞媒介免疫応答を誘導する。ＣｐＧは、低い局所反応原性を誘導すると予想される。
【０１８４】
ＣｐＧオリゴヌクレオチド溶液の製造：ＣｐＧ乾燥粉末をＨ２Ｏに溶解して５ｍｇ／ｍｌ ＣｐＧ溶液を得る。
【０１８５】
ＣｐＧ製剤の製造
３つの抗原をＮａＣｌ １５０ｍＭに対して透析して水酸化アルミニウムへのｇｐ１２０の吸着を阻害するリン酸イオンを除去する。
【０１８６】
Ｈ２Ｏに希釈した抗原（１００μｇ ｇｐ１２０、２０μｇ ＮｅｆＴａｔ及び２０μｇ ＳＩＶ ＮＥＦ）を、ＣｐＧ溶液（５００μｇ ＣｐＧ）とともに３０分間インキュベートしたのち、Ａｌ（ＯＨ）３に吸着させて、ＮｅｆＴａｔ及びＮｅｆ抗原のＨｉｓテールとオリゴヌクレオチドとの間の潜在的相互作用を容易にする（抗原に結合した場合は遊離ＣｐＧと比較してＣｐＧの免疫刺激効果が強いことが記載されている）。次いで、Ａｌ（ＯＨ）３（５００μｇ）、１０倍濃縮ＮａＣｌ及び保存剤としての１μｇ／ｍｌチオメルサールを順次に５分間隔で加える。
【０１８７】
全てのインキュベーションを室温で撹拌しながら行う。
【実施例１４】
【０１８８】
アカゲザルにおける免疫感作及びＳＨＩＶチャレンジの実験
第１研究
アカゲザル４匹のグループを、０、１及び３ヶ月に下記ワクチン組成物の筋肉内投与により免疫した：
グループ１： アジュバント２ ＋ｇｐ１２０
グループ２： アジュバント２ ＋ｇｐ１２０ ＋ＮｅｆＴａｔ ＋ＳＩＶ Ｎｅｆ
グループ３： アジュバント２ ＋ＮｅｆＴａｔ＊ ＋ＳＩＶ Ｎｅｆ
グループ４： アジュバント６ ＋ｇｐ１２０ ＋ＮｅｆＴａｔ ＋ＳＩＶ Ｎｅｆ
グループ５： アジュバント２ ＋ＮｅｆＴａｔ ＋ＳＩＶ Ｎｅｆ
グループ６： アジュバント２
アジュバント２はスクワレン／トコフェロール／Ｔｗｅｅｎ８０／３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１を含み、そして
アジュバント６はミョウバン及びＣｐＧを含む
Ｔａｔ＊は変異型Ｔａｔを示し、Ｌｙｓ４１→Ａｌａ並びにＲＧＤモチーフ中にＡｒｇ７８→Ｌｙｓ及びＡｓｐ８０→Ｇｌｕの変異を有する（Virology 235:48-64, 1997）。
【０１８９】
最後に免疫処置した１ヶ月後に、全ての動物に病原性ＳＨＩＶ（株８９．６ｐ）をチャレンジした。チャレンジしたその週（ｗｋ１６）から、所定の時点で周期的に血液サンプルを採取し、ＦＡＣＳ分析によって末梢血液単核球中のＣＤ４陽性細胞の％（図１４）、及びｂＤＮＡアッセイによって血清中のＲＮＡウイルスゲノム濃度（図１５）を決定した。
【０１９０】
結果
全ての動物はＳＨＩＶ８９．６ｐのチャレンジ後に感染状態になる。
【０１９１】
ＣＤ４陽性細胞は、チャレンジ後に、グループ１及び６（対照グループ）のそれぞれで１匹の動物を除き、グループ１、３、５及び６の全ての動物で低下する。グループ２の全ての動物はＣＤ４陽性細胞のわずかな減少を示し、そして経時的に基線値レベルに回復する。同様の傾向はグループ４の動物でも観察される（図１４）。
【０１９２】
ウイルス負荷データは、ほとんどがＣＤ４データと逆である。ウイルス負荷は、グループ２の動物の３／４（及びそのＣＤ４陽性細胞を維持している１匹の対照動物）で、検出レベル未満に低下し、そして第４の動物は境界的ウイルス負荷のみを示す。他の動物の大部分は高いか又は中等度のウイルス負荷を維持する（図１５）。
【０１９３】
驚くべきことに、ＥＬＩＳＡによって測定した抗Ｔａｔ及び抗Ｎｅｆ抗体力価は、研究過程全体を通して、グループ３（変異型Ｔａｔを有する）ではグループ５（非変異型Ｔａｔを有する同等のグループ）よりも２〜３倍高かった。
【０１９４】
６８週目（チャレンジ後５６週）に、完全な混合抗原を投与したグループ（グループ２及び４）の全ての動物は依然として生存したが、他のグループの動物の大部分は、ＡＩＤＳ様症状のために安楽死させねばならなかった。グループ当たりの生存動物は下記のとおりであった：
グループ１： ２／４
グループ２： ４／４
グループ３： ０／４
グループ４： ４／４
グループ５： ０／４
グループ６： １／４
【０１９５】
結論
（ＳＩＶ Ｎｅｆの存在下の）ｇｐ１２及びＮｅｆＴａｔの組み合わせは、ＣＤ４陽性細胞の損失を防止し、病原性ＳＨＩＶ８９．６ｐに感染した動物のウイルス負荷を減少させ、そしてＡＩＤＳ様疾患症状の発生を遅らせるか又は防止するが、ｇｐ１２０又はＮｅｆＴａｔ／ＳＩＶ Ｎｅｆ単独はＳＨＩＶチャレンジの病理学的結果から動物を防御しない。
【０１９６】
スクワレン、トコフェロール及びＴｗｅｅｎ８０を３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１と一緒に含む水中油型エマルジョンであるアジュバント２は、研究の終点で、ミョウバン／ＣｐＧアジュバントよりも強い効果を有するようである。
【０１９７】
第２研究
第２のアカゲザルＳＨＩＶチャレンジ研究を行って、候補ワクチンｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ＋アジュバントの効力を確認し、そしてＴａｔに基づく種々の抗原を比較した。この研究は異なる実験室で行った。
【０１９８】
研究計画は下記のとおりであった。
【０１９９】
アカゲザル６匹のグループを、０、４及び１２週に筋肉内注射により免疫し、そして１６週に病原性ＳＨＩＶ８９．６ｐの標準用量をチャレンジした。
【０２００】
グループ１は第１研究のグループ２の繰り返しである。
【０２０１】
グループ１： アジュバント２ ＋ｇｐ１２０ ＋ＮｅｆＴａｔ ＋ＳＩＶ Ｎｅｆ
グループ２： アジュバント２ ＋ｇｐ１２０ ＋Ｔａｔ（酸化）
グループ３： アジュバント２ ＋ｇｐ１２０ ＋Ｔａｔ（還元）
グループ４： アジュバント２
追跡／終点は、この場合にもＣＤ４陽性細胞率（％）、ＲＴ−ＰＣＲによるウイルス負荷、罹患率及び致死率とした。
【０２０２】
結果
グループ２の１匹を除き、全ての動物はＳＨＩＶ８９．６ｐのチャレンジ後に感染状態になる。ＣＤ４陽性細胞は、対照グループ４及びグループ３の全ての動物、並びにグループ２の動物１匹を除き、全ての動物において、チャレンジ後に有意に低下する。グループ１の動物の１匹だけがＣＤ４陽性細胞の顕著な減少を示す。第１研究の動物とは異なり、第２実験のサルは、ウイルスチャレンジ後１ヶ月に、種々のレベルでＣＤ４陽性細胞の安定化を示す（図１６）。この安定化はＣＤ４陽性細胞の初期％よりも一般的に低いが、該細胞の完全喪失には決して導かないと考えられる。これは、第２実験に用いたサル母集団においてＳＨＩＶ誘導疾患に対する感受性が低いことを示す可能性がある。それにもかかわらず、ｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ／ＳＩＶ Ｎｅｆワクチン及び２つのｇｐ１２０／Ｔａｔワクチンの有益な効果を実証できる。２０％を超えるＣＤ４陽性細胞を有する動物数はワクチン接種動物で５匹であるが、アジュバントグループの何れの対照動物も、このレベル以上を維持するものはいない。
【０２０３】
ＲＮＡ血漿ウイルス負荷の分析は、実験動物の比較的低い感受性を確証する（図１７）。対照動物６匹のうち２匹だけが高いウイルス負荷を維持するが、他の動物の血漿からウイルスが消失する。このように、ウイルス負荷パラメーターについてワクチン効果を実証することは困難である。
【０２０４】
結論
ＣＤ４陽性細胞の分析は、（ＳＩＶ Ｎｅｆの存在下の）ワクチンｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ＋アジュバントが、大部分のワクチン接種動物のＣＤ４陽性細胞の低下を防止することを示す。これは、第１のＳＨＩＶ研究で得られた結果の確認である。実験動物が感受性を欠いているために、ウイルス負荷パラメーターを用いてワクチン効果を実証することはできないだろう。併せて考えると、ｇｐ１２０とＴａｔ及びＮｅｆ ＨＩＶ抗原の組み合わせは、ＳＨＩＶモデルで証明されたように、ＨＩＶ感染の病理学的結果に対する防御を付与する。
【０２０５】
ｇｐ１２０と組み合わせたＴａｔ単独抗原も、ＣＤ４陽性細胞の低下に対して若干の防御を付与する。この効果は、ｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ／ＳＩＶ Ｎｅｆ抗原の組み合わせよりも顕著でないが、ｇｐ１２０及びＴａｔはＳＨＩＶ誘導疾患の発症に対して若干の防御効力を仲介できることを実証する。
【０２０６】
第２のＳＨＩＶチャレンジ研究は、第１研究の動物源とはとは全く無関係の源に由来するアカゲザルを用いて行った。両方のパラメーター、すなわちＣＤ４陽性細胞率％及び血漿ウイルス負荷は、第２研究の動物がＳＨＩＶ誘導疾患に対して感受性が低いこと、及び動物間にかなり大きな変動があることを示唆する。それにもかかわらず、ＣＤ４陽性細胞の維持に対するｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ／ＳＩＶ Ｎｅｆワクチンの有益な効果が、ｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ及びＳＩＶ Ｎｅｆを含む実験ワクチンで見られた。これは、このワクチン効果が別の研究で繰り返されただけでなく、さらに無関係なサル母集団でも実証されたことを示す。
【実施例１５】
【０２０７】
ｇｐ１２０及びＮｅｆ／ＴａｔのためのＰＭＩＤベクターの作製
発現ベクターを下記のように構築した。エンドトキシン不含のプラスミド調製物を調製し、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、ＤＮＡ １μｇを含む２４ウェル組織培養プレートで半コンフルエント状態の２９３Ｔ細胞単層をトランスフェクトするために用いた。トランスフェクション後２４時間にサンプルを集め、そしてウェスタンブロット法により検査して発現レベルを評価した（図１８及び１９）。
【０２０８】
ｇｐ１２０のコドン最適化は、ＲＥＶ非依存的発現を実質的に増加させた。
【０２０９】
プラスミドの作製
図２０〜２３も参照されたい。
【０２１０】
ｇｐ１２０：
野生型及び最適化ｇｐ１２０の両者を比較した。
【０２１１】
【０２１２】
遺伝子をベクターｐ７３１３−ｉｅにＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片としてクローニングし、そして配列決定した。参照配列に対して単一の塩基変化（保存性）が見出されたが、この変化はｐＲＩＴ１３９６８の配列決定でも見出された（ｇｐ１２０のＴ１１７０Ｃ）。
【０２１３】
最適化したコドン（ｐｇｐ１２０ｃ）
遺伝子配列はｐＲＩＴ１３９６８由来のｇｐ１２０配列に基づいていた。これはＲＳＣＵ値が０．２９７だった。最適化は、ＳＹｎＧｅｎｅ２ｄを用いて行い、ＲＳＣＵ値が０．７４９となるようにした。この配列を４０の重複オリゴヌクレオチドに分割し、そして最終プライマーを用いてＰＣＲで構成し、再生させた。遺伝子をベクターｐ７３１３−ｉｅにＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片としてクローニングし、そして配列決定した。３つの初期クローンに由来する制限断片を結合して単一の正確なクローンを作製した。
【０２１４】
Ｎｅｆ／Ｔａｔ（ｐＮＴｍ及びｐｔｒＮＴｍ）
Ｎｅｆ／Ｔａｔ融合タンパク質のための遺伝子をプラスミドｐＲＩＴ１５２４４に準備した。プラスミドｐＲＩＴ１５２４４は、Ｈｉｓテールが欠失している以外は上記のｐＲＩＴ１４９１３と同一である。このプラスミドのＴａｔは上記のような３つの変異を含む。融合物は、免疫調節機能を有する完全長Ｎｅｆを含み（Collins及びBaltimore (1999)）、これはＮ末端切断によって排除できる。従って、完全長Ｎｅｆ／変異型Ｔａｔ（ｐＮＴｍ）、及びＮｅｆの最初の６５アミノ酸が除去された末端切断Ｎｅｆ／変異型Ｔａｔ（ｐｔｒＮＴｍ）の両者のための構築物を作製した。これらの配列をｐＲＩＴ１５２４４から、下記のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
【０２１５】
遺伝子をベクターｐ７３１３−ｉｅにＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片としてクローニングし、そして配列決定した。
【０２１６】
二重発現ベクター：（ｐＲＩＸ１及びｐＲＩＸ２）
Ｎｅｆ／Ｔａｔ及びｔｒＮｅｆ／Ｔａｔ発現カセットをＣｌａＩ−ＸｍｎＩ制限断片として切り出し、そしてコドン最適化ｇｐ１２０を含むベクターのＣｌａＩ及び平滑化Ｓｓｅ８３８７ Ｉ部位に連結して、両方のタンパク質を発現させるための単一プラスミド（それぞれｐＲＩＸ１及びｐＲＩＸ２）を得た。
【０２１７】
プラスミドｐ７３１３−ｉｅの構成
このプラスミドは、ｐＵＣ１９のＥａｍ１１０５Ｉ−Ｐｓｔ１断片を含むβラクタマーゼ遺伝子（Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., Amersham Place,Little Chalfont,Bucks,HP7 9NAから入手可能）を、カナマイシン耐性遺伝子を含むｐＵＣ４ＫのＥｃｏＲＩ断片（Amersham-Pharmacia）と置換して、構築した。Ｄｒ Ｈａｒｒｉｅｔ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（University of Massachusetts）から得たプラスミドＪＷ４３０３から、ヒトサイトメガロウイルスＩＥ１プロモーター／エンハンサー、イントロンＡを誘導し、そしてｐＵＣ１９のＳａｌ１部位にＸｈｏＩ−Ｓａｌ１断片として挿入し、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを導入した。プロモーターから５’ＳａｌＩ−ＢａｎＩ断片を削除してベクターに用いる最小プロモーターを作製した（ＷＯ００／２３５９２号、Powderject Vaccines Inc.）。Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｄｗから、ベクターｐＡＭ６にＨＢＶ表面抗原３’ＵＴＲを誘導した（Moriartyら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78, 2606-10, 1981）。ｐＡＭ６（ｐＢＲ３２２に基づくベクター）は、American Type Culture Collection、カタログ番号ＡＴＣＣ４５０２０から得た。３’ＵＴＲを、挿入のために平滑末端化した１．４ｋｇのＢａｍＨＩ断片としてポリアデニル化シグナルの５’側に挿入してＢａｍＨＩ部位を除去した。一連のステップ（ＢｇｌＩＩ消化、クレノウポリメラーゼ処理、ＢｓｔＸＩ消化、ＮｃｏＩ消化、突出末端を除去するためのマングビーンヌクレアーゼ処理、及びさらなるＢｓｔＸＩ消化を含む）において、ＨＢＶ Ｓ遺伝子の３’非翻訳エンハンサー領域とｂＧＨｐＡシグナルとの間の領域に改変を加えて、Ｘ遺伝子プロモーターとｂＧＨｐＡシグナルとの間の５コドンより大きい全てのオープンリーディングフレームを除去した。これは、Ｘタンパク質の翻訳可能な部分（９アミノ酸）及びＸ遺伝子開始コドンをコードする配列の欠失を生じた。ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをウサギβグロビンポリアデニル化シグナルで置換した。Ｓ抗原の５’非コード配列及びコード配列を切除し
、そしてオリゴヌクレオチドリンカーと交換して、示すようなマルチクローニング部位を得、プラスミドｐ７３１３−ＰＬを作製した。
【０２１８】
【０２１９】
このポリリンカーは、ＫｐｎＩとＳａｌＩ部位の間に別のオリゴヌクレオチドリンカーが挿入されてさらに伸長されていた。
【０２２０】
【０２２１】
Ｄａｖｉｄ Ｈｏｄｇｅｓｏｎ（Warwick University）から入手したプラスミドｐＤＡＨ２１２由来のサブクローンから、ＣｏｌＥ１ ｃｅｒ配列を得、そしてプライマーを用いたＰＣＲによって増幅して、配列の末端にＥｃｏＲＩ制限部位を配置した。次いで、ｃｅｒ配列をｐ７３１３−ＰＬのＥｃｏＲＩ部位に挿入してプラスミドｐ７３１３−ＰＬｃを生成した。増幅したｃｅｒ配列をＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１１４１１について確認した。
【０２２２】
下記プライマーを用いたポリアデニル化シグナルのＰＣＲ増幅によって、プロモーターとポリアデニル化シグナルとの間のＨＢＶ ３’ＵＴＲ配列を切り出した：
【０２２３】
生成した産物をＢａｍＨＩ及びＸｍｎＩで切断し、そしてポリアデニル化シグナル及び３’ＵＴＲの両者を含む相当する断片を交換するために用いた。下記プライマーを用いたＣＭＶプロモーター／エンハンサーのＰＣＲ増幅によって、プラスミドからイントロンＡ配列を切り出した：
【０２２４】
生成した産物をＳｓｅ８３８７Ｉ及びＮｏｔＩで切断し、そして親ベクターのＳｓｅ８３８７Ｉ及びＮｏｔＩ部位に挿入し戻した。
【実施例１６】
【０２２５】
免疫原性研究
粒子媒介免疫治療送達（ＰＭＩＤ）によって送達されたｇｐ１２０及びＮｅｆＴａｔ構築物の免疫原性を試験して、該構築物がｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を生じさせうることを示すために、マウス免疫原性研究を行うことができる。ＤＮＡ構築物をタンパク質と組み合わせて用いて、個々の成分での免疫処置と比較して、組み合わせ手法の利点があるかどうかを判定することができる。その目的は、タンパク質での初回免疫及びＤＮＡでの追加免疫（ＰＭＩＤ）、又はＤＮＡでの初回免疫（ＰＭＩＤ）及びタンパク質での追加免疫によって、マウスにおける細胞性及び体液性免疫応答を検出し、そして定量することである。
【０２２６】
ＤＮＡを金微粒子上に凝集させ、これらをｔｅｆｚｅｌカートリッジ内壁のコーティングに用いる。カートリッジ当たり約０．５μｇのＤＮＡを与えるＤＮＡ負荷率２を用いて、ＰＭＩＤカートリッジを調製する。
【０２２７】
ｇｐ１２０又はＮｅｆＴａｔを含む２回のショットを与えることによって、ＰＭＩＤでマウスの腹部に免疫する。ＰＭＩＤ追加免疫したのち、脾臓を取り出し、そして脾臓細胞を用いて個々の構築物の免疫原性を決定する。ＩＦＮ−γ ＥＬＩｓｐｏｔアッセイを用いて応答を評価する。このアッセイでは、ｇｐ１２０及びＮｅｆ由来のペプチドを用いて、脾臓細胞をＩＦＮγ分泌に対して刺激し、これを抗体に基づく検出系によって捕捉する。ｇｐ１２０及びＮｅｆに対する体液性応答をＥＬＩＳＡによって測定して測定値を得る。
【０２２８】
ｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ初回免疫、追加免疫研究
この研究の目的は、タンパク質での初回免疫及びＤＮＡでの追加免疫（ＰＭＩＤ）、又はＤＮＡでの初回免疫（ＰＭＩＤ）及びタンパク質での追加免疫によって、マウスにおける細胞性及び体液性免疫応答を検出し、そして定量することである。
【０２２９】
カートリッジの調製
カートリッジ当たり約０．５μｇのＤＮＡを与えるＤＮＡ負荷率（ＤＬＲ）２を用いて、遺伝子ガンカートリッジを好適に調製する。
【０２３０】
ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性
１つの実験（実験Ｉ）を下記表に示すようにして好適に行うことができる。この実験のための読み取りは、細胞性応答を測定する場合にはＢａｌｂ／ｃのｇｐ１２０及びＮｅｆ由来のペプチドに対してＩＦＮ−γ ＥＬＩｓｐｏｔによって行い、そして体液性応答の場合にはＥＬＩＳＡによるｇｐ１２０及びＮｅｆに対する抗体の検出によって行う。
【表１４】
【０２３１】
さらなる実験（実験ＩＩ）を以下のように実施し得る。
【表１５】
【０２３２】
サンプルプロトコール
雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いる。実験開始前に、全てのマウスから前採血する（尾静脈）。初回免疫したのち、１グループ当たりマウス３匹のグループを選び、脾臓を採取し、そしてｇｐ１２０及びＮｅｆＫｄ拘束ペプチドを用いるＥＬＩｓｐｏｔアッセイによってＩＦＮ−γ産生ＣＤ８細胞を計数する。
【０２３３】
２回目の免疫後、少なくとも２つの時点で１グループ当たりマウス３匹のグループを選び、心血液サンプルを採取する。これらを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてｇｐ１２０及びＮｅｆに対する抗体について分析する。また、脾臓を採取し、そしてｇｐ１２０及びＮｅｆＫｄ拘束ペプチドを用いるＥＬＩｓｐｏｔアッセイによってＩＦＮ−γ産生ＣＤ８細胞を計数する。
【０２３４】
免疫学的アッセイ
ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ
インターフェロン−γＥＬＩｓｐｏｔアッセイを用いて細胞性応答を検出する。グループ当たり３匹のマウスから、それぞれの選択された時点で（初回免疫後に１回及び追加免疫後に最低２回）脾細胞を単離し、そしてα−インターフェロン−γで被覆したプレートを用いて、既知ＣＤ８エピトープ（Ｋｄ（Ｂａｌｂ／ｃ）バックグラウンド拘束）ペプチドと共にインキュベートする。脾細胞を溶解し、そして第２のα−インターフェロン−γ抗体及びビオチン−ストレプトアビジン増幅系を用いてプレートを現像する。
【０２３５】
ＥＬＩＳＡアッセイ
標準抗体ＥＬＩＳＡアッセイを用いて体液性応答を検出する。９６ウェル平底マイクロタイタープレートをタンパク質で被覆し、そしてブロッキングする。免疫処置の前及び追加免疫の後に採取した血清の連続希釈物を集め、そしてプレートでインキュベートする。抗−マウス抗体と共にインキュベートしたのち、プレートを現像する。ｇｐ１２０、Ｎｅｆ及びＴａｔに対する応答を分析する。
【実施例１７】
【０２３６】
免疫原性研究
プロトコール
標準法を用いた遺伝子ガンを用いて、粒子媒介送達のためのカートリッジを調製した。約０．５μｇのＤＮＡ／カートリッジを与えるＤＮＡ負荷率２を用いた。
【０２３７】
Ｆ１（Ｃ３Ｈ×Ｂａｌｂ／ｃ）マウスに、アジュバント中のｇｐ１２０タンパク質及びＮｅｆＴａｔ（筋肉内経路で投与）で、又は実施例１５に記載したようにしてコドンを最適化し、かつベクターｐ７３１７−ｉｅにクローニングしたｇｐ１２０ＤＮＡ及びＮｅｆ融合タンパク質を発現するベクター（ＤＮＡが金ビーズ上にコーティングされている粒子媒介送達を用いて）のいずれかで、初回免疫を行った。２３日後、アジュバント中のタンパク質で（筋肉内経路で投与）、又はＤＮＡで（ＤＮＡが金ビーズ上に被覆されている粒子媒介送達を使用）、マウスを追加免疫した。５日後にマウスを選び、そして脾臓を採取した。脾細胞をかき取って回収して、白血球を溶解し、そして脾細胞を洗浄して計数した。（インターフェロン−γ捕捉抗体で被覆し、そしてブロッキングした）特殊ＥＬＩｓｐｏｔプレートを用いた。これらのプレートに脾細胞を移し、そして中程度の対照ｇｐ１２０Ｅ７ペプチド又は種々のｎｅｆペプチドの存在下に３７℃／５％ＣＯ２で一夜インキュベートした。脾細胞を溶解し、そして標準手順を用いてプレートを現像して、存在するインターフェロン−γ分泌細胞の数を確認した。
【０２３８】
結論
最適以下の濃度のｇｐ１２０Ｅ７ペプチドを用いてＥＬＩｓｐｏｔアッセイを行ったにもかかわらず、結果は、マウスを、アジュバント中のタンパク質で初回免疫（筋肉内投与）し、次いでＤＮＡで追加免疫（粒子媒介送達により投与）することが、最も有効なスケジュールであることを示した。図２４を参照されたい。類似の結果はｎｅｆの場合にも得られ、タンパク質で初回免疫され、そしてＤＮＡで追加免疫されたマウスによって、２つのペプチドＮｅｆ１９及び２０のみが認識された。これら２つのペプチドの配列は、Ｎｅｆ２９：ＨＩＶ−１ Ｂｒｕ（１７１−１９０）ＧＭＤＤＰＥＲＥＶＬＥＷＲＦＤＳＲＬＡＦ（配列番号４３）、及びＮｅｆ２０：ＨＩＶ−１ Ｂｒｕ（１８１−２００）ＥＷＲＦＤＳＲＬＡＦＨＨＶＡＲＥＬＨＰＥ（配列番号４４）であった。図２５を参照されたい。
【実施例１８】
【０２３９】
免疫原性研究
プロトコール
ＰＭＩＤ免疫処置（ＤＮＡ）のために、標準法を用いてカートリッジを調製した。約０．５μｇのＤＮＡ／カートリッジを与えるＤＮＡ負荷率２を用い、そして各免疫処置は２ショットとした。使用直前に、スクワレン／トコフェロール／Ｔｗｅｅｎ８０／３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１を含むアジュバント中にタンパク質を製剤化した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、アジュバント中のｇｐ１２０（筋肉内経路で投与）で、又は実施例１５に記載したようにして調製したｇｐ１２０コドン最適化ＤＮＡ（ＰＭＩＤを用いて）で初回免疫を行った。２１日後、アジュバント中のタンパク質（筋肉内経路で投与）で、又はＤＮＡ（ＰＭＩＤを使用）でマウスを追加免疫した。７日後にマウスを選び、そして脾臓を採取した。脾臓細胞をかきとって脾細胞を回収し、白血球を溶解化した。脾細胞を洗浄して計数した。（インターフェロン−γ捕捉抗体で被覆し、そしてブロッキングした）特殊ＥＬＩｓｐｏｔプレートを用いた。これらのプレートに脾細胞を移し、そしてｇｐ１２０ １５量体ペプチドのプールの存在下にて３７℃／５％ＣＯ２で一夜インキュベートした。脾細胞を溶解し、そして標準手順を用いてプレートを現像して、存在するインターフェロン−γ分泌細胞の数を確認した。結果を図２６に示す。
【０２４０】
結論
ｇｐ１２０ １５量体ペプチドの３つのプールは、タンパク質で初回免疫され、そしてＤＮＡで追加免疫されたマウスによって認識された。これら３つのプールに対するｇｐ１２０ １５量体の応答は、ＤＮＡで初回免疫され、そしてタンパク質で追加免疫されたか、あるいはタンパク質又はＤＮＡの何れかで２回免疫された動物では検出されなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶタンパク質の新規な医薬用途及びかかるＨＩＶタンパク質を含有するワクチン組成物に関する。特に本発明は、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質とＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質の組み合わせの使用に関する。さらに本発明は、ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質とＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質の組み合わせの使用に関する。本発明はまた、ＨＩＶ Ｔａｔ及び／又はＮｅｆをコードするＤＮＡ（以下、Ｔａｔ ＤＮＡ及び／又はＮｅｆ ＤＮＡという）、ＨＩＶ ｇｐ１２０をコードするＤＮＡ（以下、ｇｐ１２０ ＤＮＡという）、並びにかかるＤＮＡを含むベクターに関する。本発明は特に、粒子ボンバートメント手法を用いた初回免疫−追加免疫計画におけるタンパク質及び／又はＤＮＡの投与に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ−１は、世界の主な健康問題の１つとされている後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の主因である。ワクチンを作製するために世界中で広範な研究が行われてきたが、このような努力は未だ成功を収めていない。
【０００３】
ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０は、宿主細胞への付着のために使用されるウイルスタンパク質である。この付着は、ヘルパーＴ細胞及びマクロファージの２つの表面分子（これらは、ＣＤ４、及び２つのケモカイン受容体ＣＣＲ−４又はＣＸＣＲ−５のうちの１つとして知られるものである）に結合することによって媒介される。ｇｐ１２０タンパク質は、はじめに大きな前駆分子（ｇｐ１６０）として発現された後、翻訳後切断されてｇｐ１２０及びｇｐ４１を生じる。ｇｐ１２０タンパク質は、ｇｐ４１分子との結合によりビリオンの表面上に保持され、ウイルス膜の中に挿入される。
【０００４】
ｇｐ１２０タンパク質は、中和抗体の主な標的であるが、残念なことに、そのタンパク質の最も免疫原性の高い領域（Ｖ３ループ）は、そのタンパク質の最も可変な部分でもある。従って、中和抗体を誘導するためのワクチン抗原としてのｇｐ１２０（又はその前駆体であるｇｐ１６０）の使用は、防御範囲の広いワクチンとしての使用に限定されると考えられる。ｇｐ１２０タンパク質は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により認識されるエピトープも含む。これらのエフェクター細胞は、ウイルス感染細胞を排除することができるので、２番目に重要な抗ウイルス性免疫機構を構成する。中和抗体の標的領域とは対照的に、幾つかのＣＴＬエピトープは、異なるＨＩＶ株の間で比較的保存されているようである。このため、ｇｐ１２０及びｇｐ１６０は、細胞性免疫応答（特にＣＴＬ）を引き出すことを目的としたワクチンにおける有用な抗原性成分であると考えられる。
【０００５】
ＨＩＶ−１の非エンベロープタンパク質が記載されており、例えばｇａｇ遺伝子やｐｏｌ遺伝子の産物などの内部構造タンパク質、並びにＲｅｖ、Ｎｅｆ、Ｖｉｆ及びＴａｔなどの他の非構造タンパク質等が挙げられる（非特許文献１、Greeneら, New England J. Med, 324,5,308以下参照(1991)、及び非特許文献２、Bryantら（Pizzo編）, Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390以下参照(1992)）。
【０００６】
ＨＩＶ Ｔａｔ及びＮｅｆタンパク質は初期タンパク質である。つまり、これらは感染初期に、構造タンパク質の不在下で発現される。
【０００７】
非特許文献３、学会発表（C. David Pauza, Immunization with Tat toxoid attenuates SHIV89.6PD infection in rhesus macaques, 12th Cent Gardes meeting, Marnes-La-Coquette, 26.10.1999）において、アカゲザル（rhesus macaques）を、Ｔａｔトキソイド単独又はエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１６０との組み合わせの組み合わせワクチン（１用量の組換えワクシニアウイルスと１用量の組換えタンパク質）で免疫した実験が記載されている。しかしながら、観察結果は、エンベロープ糖タンパク質の存在は、Ｔａｔ単独で行った実験よりも利点はなかったことを示していた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Greeneら, New England J. Med, 324,5,308 et seq(1991)
【非特許文献２】Bryantら（Pizzo編）, Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 et seq(1992)
【非特許文献３】C. David Pauza, Immunization with Tat toxoid attenuates SHIV89.6PD infection in rhesus macaques, 12th Cent Gardes meeting, Marnes-La-Coquette, 26.10.1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、本発明者は、キメラヒト−サル免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）による病原体の攻撃からのアカゲサルの防御において、Ｔａｔ及び／又はＮｅｆ含有免疫原（特にＮｅｆ−Ｔａｔ融合タンパク質）がｇｐ１２０と相乗的に作用することを見出した。現在まで、アカゲザルのＳＨＩＶ感染は、ヒトＡＩＤＳの最も関連性のある動物モデルと考えられている。従って、本発明者は、ｇｐ１２０抗原、並びにＮｅｆ及びＴａｔ含有抗原を単独又は組み合わせで含有するワクチンの防御効力を評価するためにこの前臨床モデルを使用した。ウイルス感染症と病原性の２つのマーカーの分析、すなわち末梢血におけるＣＤ４陽性細胞率（％）及びサルの血漿における遊離ＳＨＩＶ ＲＮＡゲノムの濃度は、２つの抗原が相乗的に作用していることを示した。ｇｐ１２０又はＮｅｆ Ｔａｔ＋ＳＩＶ Ｎｅｆのいずれか単独で免疫した場合には、アジュバント単独で免疫した場合と比較して差異はなかった。対照的に、ｇｐ１２０とＮｅｆ Ｔａｔ＋ＳＩＶ Ｎｅｆの抗原を組み合わせて投与することにより、特定の実験群の動物全てにおいて上記２つのパラメーターが顕著に改善された。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述したように、ＮｅｆＴａｔタンパク質、ＳＩＶ Ｎｅｆタンパク質及びｇｐ１２０タンパク質は一緒に、ＮｅｆＴａｔ＋ＳＩＶ Ｎｅｆ又はｇｐ１２０を単独で使用する場合に観察される応答よりも強力な応答を生じる。この強力な応答又は相乗作用は、これらの組み合わせタンパク質によるワクチン接種の結果として、ウイルス負荷の低減に観察されうる。あるいは又はさらに、強力な応答はそれ自体として、ＨＩＶ ＮｅｆＴａｔ、ＳＩＶ Ｎｅｆ及びＨＩＶ ｇｐ１２０でのワクチン接種の不在下で観察されるレベルを超えたＣＤ４＋レベルの維持により現れる。この相乗作用は、ｇｐ１２０とＴａｔの組み合わせ、又はｇｐ１２０とＮｅｆの組み合わせ、あるいはｇｐ１２０とＮｅｆ及びＴａｔの両方の組み合わせにより生じる。
【００１１】
Ｎｅｆ、Ｔａｔ又はＮｅｆＴａｔタンパク質をｇｐ１２０タンパク質と組み合わせる又は共に投与することだけが有利なわけではないことが見出されている。Ｎｅｆ、Ｔａｔ又はＮｅｆＴａｔをコードするＤＮＡをｇｐ１２０（タンパク質又は対応するＤＮＡ）と共に投与した場合に同様に利点があることがわかっている。
【００１２】
上記タンパク質、又は上記タンパク質をコードするＤＮＡは、初回免疫−追加免疫手法により投与することが有利であり得ることが見出されている。一態様において、本発明は、ボンバートメント手法による上記のような投与に関する。従って本発明は、ＨＩＶに対するヒトの予防用又は治療用免疫のための初回免疫−追加免疫送達に適したワクチンの製造における、
ａ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｂ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｃ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチドと結合したＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；
及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質若しくはポリヌクレオチド、
の使用を提供し、上記タンパク質若しくはポリヌクレオチドは、ボンバートメント手法により送達される。
【００１３】
粒子ボンバートメント手法を行うための多数の方法が知られている。例えば、ＷＯ９１／０７４８７号を参照されたい。１つの例においては、ガスにより駆動される粒子加速を、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＰＬＣ（Oxford, UK）及びＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ．（Madison, WI）により製造された装置などを用いて行うことができ、その例が、米国特許第５，８４６，７９６号、同第６，０１０，４７８号、同第５，８６５，７９６号、同第５，５８４，８０７号、及びＥＰ特許第０５００ ７９９号に記載されている。これは、ポリヌクレオチドなどの物質でコーティングされた微粒子の乾燥粉末製剤を、手持ち式装置により発生したヘリウムガス気流内で高速に加速し、目的の標的組織（典型的には皮膚）中に粒子を推進させる、針を使用しない送達手法である。粒子は、好ましくは直径０．４〜４．９μｍ、より好ましくは０．６〜２．０μｍの金ビーズであり、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡをこれら粒子にコーティングした後、「遺伝子ガン」に導入するためのカートリッジ内に入れる。
【００１４】
他のＨＩＶタンパク質又はそれらをコードするＤＮＡの添加は、さらに相乗的効果を増強させうるものであり、これは、ｇｐ１２０とＴａｔ及び／又はＮｅｆとの間で観察されている。これらの他のタンパク質は、完全な元の抗原の組み合わせの存在を必要とせずに、ｇｐ１２０、Ｔａｔ及び／又はＮｅｆ含有ワクチンの個々の成分と相乗的に作用しうる。別のタンパク質は、ＨＩＶの調節タンパク質、例えばＲｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＶｐｒなどでありうる。これらはまた、ＨＩＶ ｇａｇ又はｐｏｌ遺伝子から誘導された構造タンパク質である。
【００１５】
ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子は前駆体タンパク質ｐ５５をコードし、このｐ５５は自発的に集合して未成熟なウイルス様粒子（ＶＬＰ）となることができる。次にこの前駆体はタンパク質分解によって主たる構造タンパク質ｐ２４（キャプシド）及びｐ１８（マトリックス）並びに幾つかのより小さなタンパク質へと切断される。前駆体タンパク質ｐ５５並びにその主要な誘導体ｐ２４及びｐ１８の両方が、ｇｐ１２０とＴａｔ及び／又はＮｅｆとの間で観察された相乗効果をさらに高め得る適当なワクチン抗原であると考えられる。前駆体ｐ５５及びキャプシドタンパク質ｐ２４は、ＶＬＰとして又は単量体タンパク質として用い得る。
【００１６】
本発明において使用するためのＨＩＶ Ｔａｔタンパク質は、場合により、例えば融合タンパク質としてＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質と結合させてもよい。
【００１７】
本発明において用いるためのＨＩＶ Ｔａｔタンパク質、ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質、又はＮｅｆＴａｔ融合タンパク質は、好ましくは５〜１０のヒスチジン残基を含むＣ末端ヒスチジンテールを有してもよい。ヒスチジン（すなわち「Ｈｉｓ」）テールの存在によって、精製が容易になる。
【００１８】
好適な実施形態において、これらのタンパク質は、５〜１０個、好ましくは６個のヒスチジン残基を含むヒスチジン・テールを有して発現される。これらは、精製を助けるのに有利である。酵母（サッカロミセス・セレビシエ）内でのＮｅｆ（Macreadie I.G.ら, 1993, Yeast 9 (6) 565-573）及びＴａｔ（Braddock Mら, 1989, Cell 58 (2) 269-79）の分離発現が報告されている。Ｎｅｆタンパク質、並びにＧａｇタンパク質ｐ５５及びｐ１８はミリストイル化されている。ピヒア発現系におけるＮｅｆ及びＴａｔの別々の発現（Ｎｅｆ−Ｈｉｓ及びＴａｔ−Ｈｉｓ構築物）、並びに融合構築物Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓの発現は、国際公開第ＷＯ９９／１６８８４号に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｃ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｄ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｅ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｆ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｇ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｈ】Ｎｅｆ−Ｈｉｓ；Ｔａｔ−Ｈｉｓ；Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体及び変異型ＴａｔのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図２】ｐＲＩＴ１４５９７組込みベクターのマップを示す。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ｈｉｓ融合タンパク質）を示す。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ｈｉｓ融合タンパク質）を示す。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件；１４％ポリアクリルアミドプレキャストゲル−Ｎｏｖｅｘ）を示す。
【図７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（４〜２０％ポリアクリルアミドプレキャストゲル−Ｎｏｖｅｘ）を示す。
【図８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（４〜２０％ポリアクリルアミドプレキャストゲル−Ｎｏｖｅｘ）を示す。
【図９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件；１４％ポリアクリルアミドプレキャストゲル−Ｎｏｖｅｘ）を示す。
【図１０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件；１４％ポリアクリルアミドプレキャストゲル−Ｎｏｖｅｘ）を示す。
【図１１】ｐＲＩＴ１４９０８組込みベクターのマップを示す。
【図１２】ピヒア発現ＳＩＶ−ＮＥＦ−Ｈｉｓタンパク質の配列を示す。
【図１３】組換えピヒア・パストリスＳＩＶ／ＮＥＦ発現株のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１４】サル試験１（ＳＨＩＶによる免疫前及び後のＰＢＭＣにおけるＣＤ４陽性細胞の分析）の結果を示す。
【図１５】サル試験１（ＳＨＩＶによる免疫後のＳＨＩＶ血漿ウイルス負荷の分析）の結果を示す。
【図１６】サル試験２（ＳＨＩＶによる免疫前及び後のＰＢＭＣにおけるＣＤ４陽性細胞の分析）の結果を示す。
【図１７】サル試験２（ＳＨＩＶによる免疫後のＳＨＩＶ血漿ウイルス負荷の分析）の結果を示す。
【図１８】２９３Ｔ細胞抽出物において検出されたＮｅｆ、並びに細胞抽出物及び上清培地中のｇｐ１２０のレベルを示すウエスタンブロットを示す。
【図１９】２９３Ｔ細胞抽出物において検出されたＮｅｆ、及び上清中のｇｐ１２０のレベルを示すウエスタンブロットを示す。
【図２０】プラスミドマップを示す。
【図２１】ｇｐ１２０のコドン最適化及び配列決定のためのオリゴ、最適化ｇｐ１２０の配列決定用プライマー、及び野生型ｇｐ１２０の配列決定用プライマーを示す。
【図２２】ｐ７３１３のマップを示す。
【図２３】抗原のための典型的な発現プラスミドを示す。
【図２４】追加免疫後５日目においてＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔにより測定した、免疫感作Ｆ１（Ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ３Ｈ）マウスのｇｐ１２０ペプチドに対する応答を示す。
【図２５】追加免疫後５日目においてＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔにより測定した、２０ｍｅｒのＮｅｆペプチドライブラリーに対する応答を示す。
【図２６】追加免疫後７日目においてＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔにより測定した、免疫感作Ｂａｌｂ／ｃマウスのｇｐ１２０ペプチドプールに対する応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
代表的なＮｅｆ−Ｈｉｓ（配列番号８及び９）、Ｔａｔ−Ｈｉｓ（配列番号１０及び１１）、及びＮｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質（配列番号１２及び１３）のＤＮＡ及びアミノ酸配列を図１に示す。
【００２１】
ＨＩＶタンパク質は、その天然のコンホメーションで用いることができ、又はより好ましくはワクチン用途のために改変してもよい。これらの改変は、精製方法に関連する技術的理由のために必要であるか、又はＴａｔ若しくはＮｅｆタンパク質の１以上の機能的性質を生物学的に不活化するために用い得る。従って、本発明は、例えば、変異型でありうるＨＩＶタンパク質又はポリヌクレオチド、特にＤＮＡの誘導体の使用を包含する。「変異型」という用語は、部位特異的突然変異誘発のための周知の技法又は任意の他の慣用法を用いて得られる、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するＤＮＡ又はタンパク質分子を意味する。
【００２２】
例えば、変異型Ｔａｔタンパク質は、生物学的に不活性であるが、それでもなお免疫原性エピトープを維持するように変異させうる。Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ（Tulane University）により構築された１つの可能性ある変異型ｔａｔ遺伝子（ＢＨ１０分子クローンに由来する）は、活性部位領域（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ７８→Ｌｙｓ及びＡｓｐ８０→Ｇｌｕ）に変異を有する（Virology 235: 48-64, 1997）。
【００２３】
変異型Ｔａｔを図１（配列番号２２及び２３）に記載するが、これはＮｅｆ−Ｔａｔ Ｍｕｔａｎｔ−Ｈｉｓ（配列番号２４及び２５）と同じである。
【００２４】
本発明において使用するためのＨＩＶ Ｔａｔ又はＮｅｆタンパク質は、そのタンパク質を安定かつ単量体にするために、精製過程において化学的方法により修飾してもよい。Ｔａｔ又はＮｅｆなどのタンパク質の酸化的凝集を防ぐための１つの方法においては、タンパク質のチオール基の化学的修飾を利用する。最初のステップでは、ＤＴＴ、βメルカプトエタノール又はグルタチオンなどの還元剤を用いた処理によってジスルフィド架橋を還元する。第２ステップでは、生じたチオールをアルキル化剤を用いた反応によりブロッキングする（例えば、タンパク質をヨードアセトアミドと反応させうる）。かかる化学的修飾は、細胞結合アッセイ、ヒト末梢血単核球のリンパ増殖の阻害により評価されるＴａｔ又はＮｅｆの機能的性質を改変するものではない。
【００２５】
本発明がまた、少なくとも１つの免疫原性エピトープを含むことを条件に全長タンパク質のフラグメントの使用も包含することは理解されるだろう。
【００２６】
ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質は、本明細書の実施例に概説した方法により精製しうる。
【００２７】
本発明において使用するためのＴａｔ及び／若しくはＮｅｆ、又はＮｅｆＴａｔと、ｇｐ１２０成分（タンパク質又はＤＮＡ）の免疫防御量又は免疫治療量は、慣例的な方法により調製しうる。
【００２８】
ワクチンの調製は、New Trends and Developments in Vaccines, Vollerら編, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に一般的に記載されている。リポソーム中へのカプセル封入は、例えばＦｕｌｌｅｒｔｏｎの米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子へのタンパク質の結合は、例えばＬｉｋｈｉｔｅの米国特許第４，３７２，９４５号及びＡｒｍｏｒらの米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
【００２９】
ワクチン用量中のタンパク質の量は、通常のワクチン被接種者において重大かつ有害な副作用を引き起こすことなく免疫防御応答を誘導する量として選択される。このような量は、具体的にどの免疫原を使用するかによって異なる。一般に、各用量は、Ｔａｔ、Ｎｅｆ又はＮｅｆＴａｔの各タンパク質を１〜１０００μｇ、好ましくは２〜２００μｇ、最も好ましくは４〜４０μｇ含み、ｇｐ１２０を好ましくは１〜１５０μｇ、最も好ましくは２〜２５μｇ含むと予測される。特定のワクチンに対して最適な量は、被験者における抗体力価及び他の応答の観察を含む標準的な検査によって確かめることができる。ワクチン用量の１つの具体的な例は、ＮｅｆＴａｔ２０μｇとｇｐ１２０の５又は２０μｇを含みうる。最初のワクチン接種を行った後、被験者に約４週間で追加免疫を行うことができ、その後２回目の追加免疫を行ってもよい。
【００３０】
本発明のタンパク質は、好ましくは本発明のワクチン製剤においてアジュバントが添加されているものである。本発明において用いられるポリヌクレオチドは、場合によりアジュバントを使用してもよく、アジュバントと共に製剤として、又はアジュバントとは別々であるが同時に若しくは連続して送達することができる。アジュバントは、一般的にはVaccine Design − the Subunit and Adjuvant Approach, Powell及びNewman編, Plenum Press, New York, 1995に記載されている。
【００３１】
好適なアジュバントとしては、アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）又はリン酸アルミニウムが挙げられるが、カルシウム、鉄又は亜鉛の塩であってもよいし、あるいは、アシル化チロシン、若しくはアシル化糖、カチオン又はアニオンに誘導体化した多糖、又はポリホスファゼン（polyphosphazene）の不溶性懸濁液であってもよい。
【００３２】
本発明において使用するためのワクチン製剤においては、アジュバント組成物が選択的なＴｈ１応答を誘導することが好ましい。しかしながら、他の応答（例えば他の体液性応答）を排除するものではないことが理解されよう。
【００３３】
免疫応答は、抗原と免疫系細胞との相互作用により抗原に対して生じる。生じる免疫応答は、２つの極端なカテゴリー、つまり体液性免疫応答又は細胞性免疫応答（伝統的に、防御のための抗体によるエフェクター機能及び細胞によるエフェクター機構をそれぞれ特徴とする）に大きく分けることができる。これらの応答のカテゴリーは、Ｔｈ１型応答（細胞媒介性応答）及びＴｈ２型免疫応答（体液性応答）と名付けられている。
【００３４】
極端なＴｈ１型免疫応答は、抗原特異的なハプロタイプ拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球の産生及びナチュラルキラー細胞応答を特徴とする。マウスにおいて、Ｔｈ１型応答はしばしばＩｇＧ２ａサブタイプの抗体の生成を特徴とするが、ヒトにおいては、これらはＩｇＧ１型抗体に相当する。Ｔｈ２型免疫応答は、マウスにおけるＩｇＧ１、ＩｇＡ及びＩｇＭを含む広範囲の免疫グロブリンアイソタイプの生成を特徴とする。
【００３５】
これら２つのタイプの免疫応答の生起の背後にある駆動力はサイトカイン（免疫系細胞を補助し、結果として生じる免疫応答をＴｈ１又はＴｈ２応答のいずれかに導く働きをする、多数の同定されたタンパク質メッセンジャー）であると考えられる。高レベルのＴｈ１型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を促進する傾向があるが、高レベルのＴｈ２型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫応答の誘導を促進する傾向がある。
【００３６】
Ｔｈ１型及びＴｈ２型免疫応答の区別は絶対的なものではないことに留意することが重要である。現実には、個体は、Ｔｈ１型優位又はＴｈ２型優位といわれる免疫応答を保持する。しかし、Ｍｏｓｍａｎｎ及び Ｃｏｆｆｍａｎ（Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173）によりマウスＣＤ４＋ｖｅ Ｔ細胞クローンの場合に記載された観点で、サイトカインのファミリーを考慮することがしばしば便利である。伝統的に、Ｔｈ１型応答は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γサイトカインの産生と関連付けられている。Ｔｈ１型免疫応答の誘導としばしば直接関連付けられる他のサイトカインは、ＩＬ−１２等のＴ細胞によって産生されない。これに対し、Ｔｈ２型応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及び腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）の分泌と関連付けられている。
【００３７】
特定のワクチンアジュバントはＴｈ１型若しくはＴｈ２型のいずれかのサイトカイン応答の刺激に特に適していることが分かっている。伝統的に、ワクチン接種後又は感染後の免疫応答のＴｈ１：Ｔｈ２バランスを最も良く示す指標としては、抗原で再刺激した後にｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴリンパ球によるＴｈ１若しくはＴｈ２サイトカインの産生を直接測定すること、及び／又は抗原特異的抗体反応のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比を測定すること、が挙げられる。
【００３８】
このように、Ｔｈ１型アジュバントは、単離されたＴ細胞集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて抗原で再刺激したときに高レベルのＴｈ１型サイトカインを産生するよう刺激して、Ｔｈ１型アイソタイプに関連付けられる抗原特異的免疫グロブリン反応を誘導するものである。
【００３９】
好ましいＴｈ１型免疫刺激剤は、本発明に使用するのに好適なアジュバントを生成するように製剤化されていてもよく、限定するものではないが以下が挙げられる。
【００４０】
モノホスホリルリピドＡ、特に３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）は、本発明において用いるための好ましいＴｈ１型免疫刺激剤である。３Ｄ−ＭＰＬはＲｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ（Ｍｏｎｔａｎａ）により製造される周知のアジュバントである。化学的にはこれは３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡと４−、５−若しくは６−アシル化鎖との混合物として供給されることが多い。これは、ＧＢ２１２２２０４Ｂに教示される方法により精製及び調製することができ、この文献は、ジホスホリルリピドＡ及びその３−Ｏ−脱アシル化変異体の調製も開示している。他の精製及び合成リポ多糖類が記載されている（米国特許第６，００５，０９９号及びＥＰ０ ７２９ ４７３Ｂ１；Hilgersら, 1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 79(4):392-6；Hilgersら, 1987, Immunology, 60(1):141-6；並びにＥＰ０ ５４９ ０７４Ｂ１）。３Ｄ−ＭＰＬの好適な形態は、直径０．２μｍ未満の小さな粒径を有する粒状製剤の形態であり、その製造方法はＥＰ０ ６８９ ４５４に開示されている。
【００４１】
サポニンはまた、本発明において好ましいＴｈ１免疫刺激剤である。サポニンは周知のアジュバントであり、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ及びＷａｇｎｅｒ Ｈ．（1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386）に教示されている。例えば、ＱｕｉｌＡ（南米の樹木キラハ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮から得られる）及びその画分は、米国特許第５，０５７，５４０号、「Saponins as vaccine adjuvants」 Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55、及びＥＰ０ ３６２ ２７９Ｂ１に記載されている。溶血性サポニンＱＳ２１及びＱＳ１７（ＱｕｉｌＡをＨＰＬＣで精製した画分）は、強力な全身性アジュバントとして記載されており、それらの製造方法は米国特許第５，０５７，５４０号及びＥＰ０ ３６２ ２７９Ｂ１に開示されている。これらの参考文献には、全身性ワクチンのための強力なアジュバントとして作用するＱＳ７（ＱｕｉｌＡの非溶血性画分）の使用も記載されている。ＱＳ２１の使用は、Ｋｅｎｓｉｌら（1991. J. Immunology vol 146, 431-437）にさらに記載されている。またＱＳ２１とポリソルベート又はシクロデキストリンとの組み合わせが知られている（ＷＯ９９／１０００８号）。ＱｕｉｌＡの画分を含む粒子アジュバント系（ＱＳ２１及びＱＳ７など）はＷＯ９６／３３７３９号及びＷＯ９６／１１７１１号に記載されている。
【００４２】
別の好ましい免疫刺激剤は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧは、ＤＮＡに存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略称である。ＣｐＧは、当技術分野においては、全身及び経粘膜経路の両方により投与した場合にアジュバントとして知られている（ＷＯ９６／０２５５５号、ＥＰ４６８５２０号、Davisら, J.Immunol, 1998, 160(2):870-876；McCluskie及びDavis, J.Immunol., 1998, 161(9):4463-6）。従来、ＢＣＧのＤＮＡ画分が抗腫瘍作用を発揮しうることが観察されていた。さらなる研究においては、ＢＣＧ遺伝子配列から誘導された合成オリゴヌクレオチドが免疫刺激作用を誘導しうる（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で）ことが示された。これらの研究の著者は、中心のＣＧモチーフを含む特定のパリンドローム配列がこの活性を担っていると結論付けている。免疫刺激におけるＣＧモチーフの中心的な役割は、後にKrieg, Nature 374, p546 1995による刊行物において解明された。詳細な分析により、ＣＧモチーフが特定の配列に存在する必要があり、その配列が細菌ＤＮＡでは共通するが哺乳動物ＤＮＡでは稀少であることが示された。免疫刺激性配列は、プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン（ここでＣＧモチーフはメチル化されてない）であることが多いが、他の非メチル化ＣｐＧ配列も免疫刺激性であることが知られており、本発明において用いることができる。
【００４３】
上記６ヌクレオチドの特定の組み合わせにおいては、パリンドローム配列が存在する。これらのモチーフのいくつかは、１つのモチーフの繰返し又は異なるモチーフの組み合わせのいずれかとして、同じオリゴヌクレオチドに存在しうる。オリゴヌクレオチドを含む１以上のこれらの免疫刺激性配列の存在が、ナチュラルキラー細胞（インターフェロンγを産生し、細胞溶解活性を有する）及びマクロファージ（Wooldrigeら、Vol 89 (no. 8), 1977）を含む種々の免疫細胞集団を活性化しうる。このコンセンサス配列を含まない他の非メチル化ＣｐＧ含有配列もまた免疫調節性であることが示されている。
【００４４】
ＣｐＧはワクチンとして製剤化される場合、一般に、遊離抗原と一緒にした（ＷＯ９６／０２５５５号、McCluskie及びDavis（前掲））又は抗原に共有結合させた（ＷＯ９８／１６２４７号）自由溶液（free solution）として、あるいは水酸化アルミニウム等の担体と一緒に製剤化して（(Hepatitis surface antigen) Davisら（前掲）; Brazolot-Millanら, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8）、投与される。
【００４５】
上述したような免疫刺激剤は、担体、例えばリポソーム、水中油型エマルジョン又は金属塩（例えばアルミニウム塩（水酸化アルミニウムなど））と共に製剤化しうる。例えば、３Ｄ−ＭＰＬは、水酸化アルミニウム（ＥＰ０ ６８９ ４５４）又は水中油エマルジョン（ＷＯ９５／１７２１０号）と共に製剤化しうる。ＱＳ２１は、コレステロール含有リポソーム（ＷＯ９６／３３７３９号）、水中油型エマルジョン（ＷＯ９５／１７２１０号）又はミョウバン（ＷＯ９８／１５２８７号）と共に製剤化することが有利でありうる。ＣｐＧは、ミョウバン（Davisら、前掲；Brazolot-Millan 前掲）又は他のカチオン性担体と共に製剤化しうる。
【００４６】
免疫刺激剤の組み合わせもまた好ましく、特にモノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体（ＷＯ９４／００１５３号；ＷＯ９５／１７２１０号；ＷＯ９６／３３７３９号；ＷＯ９８／５６４１４号；ＷＯ９９／１２５６５号；ＷＯ９９／１１２４１号）、さらに具体的には、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ（ＷＯ９４／００１５３号）が好ましい。あるいは、ＣｐＧとサポニン（ＱＳ２１など）の組み合わせもまた本発明において使用するための強力なアジュバントを形成する。
【００４７】
従って、好適なアジュバント系としては、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３Ｄ−ＭＰＬとアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。強力な系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組み合わせ、特にＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ（ＷＯ９４／００１５３号に記載）、又は、ＱＳ２１がコレステロール含有リポソームにおいてクエンチされている反応原性の低い組成物（ＤＱ；ＷＯ９６／３３７３９号に記載）を含む。
【００４８】
水中油型エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを含む特に効力の高いアジュバント製剤は、ＷＯ９５／１７２１０号に記載されており、これは本発明において使用するための別の好ましい製剤である。
【００４９】
別の好ましい製剤は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを単独で又はアルミニウム塩と共に含む。
【００５０】
特に好ましいアジュバント及び／又は担体の組み合わせは以下のとおりである：
ｉ）３Ｄ−ＭＰＬ＋ＤＱ中のＱＳ２１
ｉｉ）ミョウバン＋３Ｄ−ＭＰＬ
ｉｉｉ）ミョウバン＋ＤＱ中のＱＳ２１＋３Ｄ−ＭＰＬ
ｉｖ）ミョウバン＋ＣｐＧ
ｖ）３Ｄ−ＭＰＬ＋ＤＱ中のＱＳ２１＋水中油型エマルジョン
ｖｉ）ＣｐＧ
【００５１】
既に記載したように、ワクチンは、１以上のＴａｔ、Ｎｅｆ及びｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡを含むことができ、そのポリペプチドはｉｎ ｓｉｔｕで生成される。
【００５２】
ＤＮＡ構築物自体、特に本明細書に記載ものもまた、本発明の一部を構成するものである。
【００５３】
ポリヌクレオチドは、当業者に公知の種々の送達系、例えば核酸発現系（例えばプラスミドＤＮＡ、細菌及びウイルス発現系）の任意のものに存在させることができる。多数の遺伝子送達技法が当技術分野で周知であり、Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998及びこれに引用される参考文献（参照により本明細書に組み入れる）に記載された技法がある。
【００５４】
プラスミドに基づく遺伝子送達は、特に免疫感作又は遺伝子治療の目的のための遺伝子送達が知られている。例えば、マウス筋肉への注射によるＤＮＡそのままの投与がＶｉｃａｌの国際特許出願第ＷＯ９０／１１０９２号に概説されている。
【００５５】
Ｊｏｈｎｓｔｏｎら（ＷＯ９１／０７４８７号）は、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドでコーティングし、微粒子が標的細胞を透過するよう微粒子を加速するマイクロ弾道を利用して、遺伝子を哺乳動物細胞に移入する方法を記載している。
【００５６】
ＤＮＡワクチンは、通常、強力なウイルスプロモーター、抗原ペプチドをコードする目的遺伝子、及びポリアデニル化／転写終結配列が挿入された細菌プラスミドベクターから構成される。目的遺伝子は、全長タンパク質、種々の抗原を含む融合タンパク質、又は単に防御しようとする目的の病原体、腫瘍若しくは他の因子に関連する抗原ペプチド配列をコードするものである。従って、プラスミドは、全長タンパク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープを含むことを条件に全長タンパク質のフラグメントをコードするものであってもよい。プラスミドは、細菌、例えば大腸菌で増殖させることができ、その後、単離し、宿主への投与前に、意図する投与経路に応じて適当な媒質中で調製しうる。投与後、宿主細胞によりプラスミドが取り込まれ、そこでコードされたペプチドが産生される。プラスミドベクターは、哺乳動物宿主においてプラスミドが複製し、動物の染色体ＤＮＡ内に組み込まれることを防止するため、真核細胞において機能する複製起点を含まないよう作製することが好ましい。これらの特徴は全て単独で又は組み合わせて本発明に適用しうる。
【００５７】
典型的なワクチン技法に関連するＤＮＡワクチン接種の利点はいくつかある。第１には、ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質が宿主において合成されるため、該タンパク質の構造又はコンホメーションは疾患状態に関連する天然タンパク質と類似することが予測される。また、ＤＮＡワクチン接種は、保存されたタンパク質に由来するエピトープを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球応答を引き起こすことにより、種々のウイルス株に対する防御を付与する可能性もある。さらに、プラスミドは宿主細胞によって取り込まれ、そこで抗原タンパク質が産生されるため、長期間持続する免疫応答が誘発されうる。この技術はまた、いくつかの疾患状態に関連する同時免疫感作を行うために単一調製物中に多様な免疫原を組み合わせることの可能性を提供しうる。
【００５８】
ＤＮＡワクチン接種に関連する有用な背景情報は、Donnellyら“DNA vaccines” Ann. Rev Immunol. 1997 15: 617-648に記載されており、この開示内容を参照によりその全文を本明細書に含めるものとする。
【００５９】
好ましい一実施形態においては、ＤＮＡは、粒子ボンバートメント手法、例えば、上述した「遺伝子ガン」手法により送達しうる。
【００６０】
適当な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列（適当なプロモーター及び終結シグナル等）を含む。発現系が、ウイルスや細菌等の組換え生微生物である場合、目的の遺伝子は組換え生ウイルス又は組換え生細菌のゲノムの中に挿入することができる。この生ベクターを接種及びｉｎ ｖｉｖｏ感染させると、その抗原のｉｎ ｖｉｖｏ発現及び免疫応答の誘導につながる。この目的で使用されるウイルス及び細菌としては、例えばポックスウイルス（例えばワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、又は、改変型ウイルスアンカラ（Modified Virus Ankara；ＭＶＡ）等の改変型ポックスウイルス）、アルファウイルス（シンドビスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、フラビウイルス（黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、ライノウイルス）、ヘルペスウイルス（水痘-帯状疱疹ウイルス等）、リステリア、サルモネラ、赤痢菌、ナイセリア、ＢＣＧなどが挙げられる。これらのウイルス及び細菌は、有毒なものであってもよいし、生ワクチンを得るために様々な方法で弱毒化されたものであってもよい。
【００６１】
従って、本発明に係る好ましいワクチンのＮｅｆ、Ｔａｔ及びｇｐ１２０成分は、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチド又は組換えＤＮＡの形態で提供しうる。本発明において使用するポリヌクレオチドは、全長タンパク質、種々の抗原を含む融合タンパク質、又は１以上の抗原ペプチド配列をコードしうる。従って、ポリヌクレオチドは、全長タンパク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープを含むという条件で全長タンパク質のフラグメントをコードするものであってもよい。
【００６２】
Ｎｅｆ、Ｔａｔ、ＮｅｆＴａｔ又はｇｐ１２０のＤＮＡの少なくとも１つは、例えば、Andre S. Seed B. Eberle J. Schraut W. Bultmann A. Haas J. (1998): Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage, Journal of Virology. 72(2):1497-503に記載のようにコドン最適化されていることが好ましい。一つの好ましい態様において、ｇｐ１２０をコードするＤＮＡをコドン最適化する。
【００６３】
コドン最適化は、哺乳動物細胞における発現のためにポリヌクレオチド配列を最適化するために用いる。すなわち、哺乳動物細胞における遺伝子のコドン使用頻度と類似するように配列が最適化される。
【００６４】
本発明の一実施形態において、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、ＮｅｆＴａｔ又はｇｐ１２０ポリヌクレオチド配列は、高発現哺乳動物遺伝子、特にヒト遺伝子のコドン使用頻度パターンと類似するコドン使用頻度パターンを有する。好ましくは、ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。望ましくは、ポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンは、高発現ヒト遺伝子に典型的なものである。
【００６５】
ＤＮＡコードは４文字（Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ）あり、これらを用いて３文字の「コドン」を形成する。これらの「コドン」は、生物の遺伝子中にコードされるタンパク質のアミノ酸を表す。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直鎖状配列は、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質（１種若しくは複数）の中のアミノ酸の直鎖状配列に翻訳される。このコードは高度に縮重しており、６１種類のコドンは２０種類の天然アミノ酸をコードし、３種類のコドンは「停止」シグナルを表す。このように、多くのアミノ酸は２種類以上のコドンによってコードされる。事実、幾つかのアミノ酸は４つ以上の異なるコドンによってコードされる。
【００６６】
所与のアミノ酸をコードするために２種類以上のコドンが利用される場合、生物のコドン使用頻度パターンは、常にランダムにあるわけではないことが分かった。種が異なると、そのコドン選択は異なった偏りを見せ、更に、単一の種において高レベルで発現される遺伝子と低レベルで発現される遺伝子との間では、コドンの利用が大きく異なる場合がる。この偏りは、ウイルス、植物、細菌、及び哺乳動物細胞において異なるものであり、幾つかの種は、他の種に比べて、ランダムなコドン選択とはかけ離れた非常に大きな偏りを見せる。例えば、ヒト及び他の哺乳動物は、ある種の細菌又はウイルスに比べて偏りが少ない。これらの理由により、大腸菌中で発現される哺乳動物遺伝子又は哺乳動物細胞中で発現されるウイルス遺伝子が効率の良い発現に適さないコドン分布を有する、という可能性が大いにある。異種ＤＮＡ配列の中に、発現が起こる宿主において稀にしか見られないコドンからなるクラスターが存在すると、その宿主中において異種遺伝子の発現レベルが低くなる可能性が高い、と予想される。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドにおいて、コドン使用頻度パターンは、ヒト免疫不全ウイルスに典型的なものから標的生物（例えば哺乳動物、特にヒト）のコドン偏りとより類似したものに改変する。「コドン使用頻度係数」とは、所定のポリヌクレオチド配列のコドンパターンが標的種のものとどの程度近似して類似しているかを表す尺度である。コドン頻度は、多くの種の高発現遺伝子についての文献群から導きうる（例えば、Nakamuraら、Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215参照）。６１種のコドンの各々についてのコドン頻度（選択した遺伝子クラスの１０００コドン当たりの発生数として表す）を、２０種の天然アミノ酸の各々について正規化する。その結果、各アミノ酸について最も高頻度に使用されるコドンの値を１と設定し、最も低い共通コドンの頻度を０〜１の間に存在するよう比率を設定する。従って、６１種のコドンの各々が、標的種の高発現遺伝子について１又はそれ以下の値を割り当てられる。ある種の高発現遺伝子に関して特定のポリヌクレオチドについてコドン使用頻度係数を計算するために、特定のポリヌクレオチドの各コドンについて一定比率の値を記録し、これらの値全ての幾何平均を求める（これらの値の自然対数の合計をコドンの総数で割り、逆対数をとる）。係数は、０〜１の値を有し、係数が高いほど、ポリヌクレオチドにおける高頻度に使用されるコドン数が多い。ポリヌクレオチド配列がコドン使用頻度係数１を有する場合には、コドンは全て、標的種の高発現遺伝子について「最も高頻度な」コドンである。
【００６８】
本発明においては、ポリヌクレオチドのコドン使用頻度パターンは、標的生物の高発現遺伝子におけるアミノ酸についてコドン使用頻度が１０％未満を示す稀少コドンを排除することが好ましい。別の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、標的生物の高発現遺伝子における０．２未満のＲＳＣＵ値を有するコドンを排除しうる。比較的同義のコドン使用頻度（ＲＳＣＵ）値は、観察されたコドン数を全コドンがそのアミノ酸について同じ頻度で使用される場合に予測される数で割った値である。本発明のポリヌクレオチドは、高発現ヒト遺伝子のコドン使用頻度係数が０．３以上、好ましくは０．４以上、最も好ましくは０．５以上を有するものである。ヒトについてのコドン使用頻度表はＧｅｎｅｂａｎｋで見出し得る。
【００６９】
比較すると高発現βアクチン遺伝子はＲＳＣＵが０．７４７である。ホモ・サピエンスのコドン使用頻度表を以下に示す。
【００７０】
コドン使用頻度表：
Homo sapiens [gbpri]: 27143 CDS (12816923コドン)
標準コドン使用頻度表
フィールド：[トリプレット] [1000当たりの頻度] ([数])
UUU 17.0(217684) UCU 14.8(189419) UAU 12.1(155645) UGU 10.0(127719)
UUC 20.5(262753) UCC 17.5(224470) UAC 15.8(202481) UGC 12.3(157257)
UUA 7.3( 93924) UCA 11.9(152074) UAA 0.7( 9195) UGA 1.3( 16025)
UUG 12.5(159611) UCG 4.5( 57572) UAG 0.5( 6789) UGG 12.9(165930)
CUU 12.8(163707) CCU 17.3(222146) CAU 10.5(134186) CGU 4.6( 59454)
CUC 19.3(247391) CCC 20.0(256235) CAC 14.9(190928) CGC 10.8(137865)
CUA 7.0( 89078) CCA 16.7(214583) CAA 12.0(153590) CGA 6.3( 80709)
CUG 39.7(509096) CCG 7.0( 89619) CAG 34.5(441727) CGG 11.6(148666)
AUU 15.8(202844) ACU 12.9(165392) AAU 17.0(218508) AGU 12.0(154442)
AUC 21.6(277066) ACC 19.3(247805) AAC 19.8(253475) AGC 19.3(247583)
AUA 7.2( 92133) ACA 14.9(191518) AAA 24.0(308123) AGA 11.5(147264)
AUG 22.3(285776) ACG 6.3( 80369) AAG 32.6(418141) AGG 11.3(145276)
GUU 10.9(139611) GCU 18.5(236639) GAU 22.4(286742) GGU 10.8(138606)
GUC 14.6(187333) GCC 28.3(362086) GAC 26.1(334158) GGC 22.7(290904)
GUA 7.0( 89644) GCA 15.9(203310) GAA 29.1(373151) GGA 16.4(210643)
GUG 28.8(369006) GCG 7.5( 96455) GAG 40.2(515485) GGG 16.4(209907)
コードGC 52.51% 第１文字GC 56.04% 第２文字GC 42.35% 第３文字GC 59.13%.
【００７１】
本発明のさらなる態様においては、発現ベクターは、本発明の第１の態様に従ってＮｅｆ及び／若しくはＴａｔ又はＮｅｆＴａｔと、ｇｐ１２０ポリヌクレオチド配列を含み、該配列の発現を指令可能なように提供され、特に、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、ＮｅｆＴａｔ又はｇｐ１２０ポリヌクレオチド配列、特にｇｐ１２０配列の少なくとも１つのコドン使用頻度パターンが、高発現哺乳動物遺伝子、好ましくは高発現ヒト遺伝子に典型的なものとなっている。ベクターは、哺乳動物細胞、特にヒト細胞において異種ＤＮＡの発現を駆動するために好適である。一実施形態において、発現ベクターはｐ７３１３（図２２参照）である。
【００７２】
さらなる態様において、本発明は、ｇｐ１２０と、ｎｅｆ及び／若しくはｔａｔ又はｎｅｆｔａｔをコードする１以上のベクターを含むＤＮＡでコーティングされた複数の粒子（好ましくは金ビーズ）を提供する。好ましくは、粒子は、ｇｐ１２０と、ｎｅｆ及びｔａｔをコードする単一ベクターでコーティングされ、最も好ましくはｎｅｆとｔａｔがＮｅｆＴａｔ融合タンパク質の形態である。最も好ましくは、上記配列の１以上がヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている。
【００７３】
好ましい態様において、ｎｅｆ、ｔａｔ及びｇｐ１２０をコードするＤＮＡは単一ベクター上に存在する。
【００７４】
好ましくは、ベクターは、効率的な発現のために強化ＨＣＭＶ ＩＥ１プロモーターの３’側に挿入されたｎｅｆ、ｔａｔ及びｇｐ１２０配列を含む。これは、好ましくはイントロンＡを含まないがエキソン１を含むＨＣＭＶ極初期プロモーターである。
【００７５】
本発明に係る１つの好適なベクターは、さらに後述するｐ７３１３と称するものである。
【００７６】
本明細書に記載のヌクレオチド配列を含むベクターは、予防又は治療上有効となるような量で投与される。投与する量は、一般的には、本明細書に記載する粒子媒介送達については１ピコグラムから１ミリグラム、好ましくは１ピコグラムから１０マイクログラムの範囲内である。正確な量は、免疫しようとする患者の体重、及び正確な投与経路に応じて異なり得る。
【００７７】
本発明の免疫は、タンパク質及びＤＮＡをベースとした製剤の組合せを用いて実施することができる。アジュバントを加えたタンパク質ワクチンは、主に抗体及びＴヘルパー免疫応答を誘導するが、プラスミド若しくは生ベクターとしてＤＮＡを送達すると、強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が誘導される。このように、タンパク質及びＤＮＡワクチン接種の組合せは、様々な免疫応答をもたらす。これは特に、ＨＩＶの場合に関して言えることである。なぜなら、ＨＩＶに対する免疫防御では、中和抗体及びＣＴＬの両方が重要であると考えられるからである。
【００７８】
ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡとして又は組換え生ベクター（例えばポックスウイルスベクター、若しくは本明細書に記載するような他の任意の好適な生ベクター）の形態で送達しうる。タンパク質抗原を１回又は複数回注射し、その後１回以上ＤＮＡを投与することができ、あるいは、ＤＮＡを最初に１回以上投与した後、１回以上タンパク質で免疫してもよい。
【００７９】
本発明の初回免疫−追加免疫の具体的な例は、改変ポックスウイルスベクターなどの組換え生ベクター、例えば改変ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）又は継代若しくは遺伝子操作によるその誘導体、又はアルファウイルスベクター（例えばベネズエラウマ脳炎ウイルス）の形態でのＤＮＡの初回免疫、続いて、タンパク質、好ましくはアジュバント添加タンパク質を用いた追加免疫を含む。場合により、当技術分野で公知の好適なＤＮＡワクチンアジュバントをＤＮＡに添加してもよい。
【００８０】
本発明はさらに、予防又は治療用免疫方法を提供し、該方法は、初回免疫−追加免疫送達において、以下：
ａ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｂ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｃ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチドと結合したＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；
及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質若しくはポリヌクレオチドを含む組成物を、その必要がある被験者に投与することを含むものであり、該タンパク質若しくはポリヌクレオチドは、ボンバートメント手法により送達される。
【００８１】
さらなる態様において、本発明は、ａ）本明細書に記載のｇｐ１２０と、ｎｅｆ及び／若しくはｔａｔ又はｎｅｆｔａｔをコードするＤＮＡでコーティングされた複数の粒子を含む組成物、並びにｂ）本明細書に記載のｇｐ１２０と、ｎｅｆ及び／若しくはｔａｔ又はｎｅｆｔａｔのＤＮＡ又はタンパク質を含む組成物（ここで、ｂ）のＤＮＡ又はタンパク質は粒子上にコーティングされていない）を含む、少なくとも２種のワクチン組成物を含むキットを提供する。
【００８２】
（実施例）
本発明の以下の実施例及び添付の図面において説明する。
【００８３】
一般
本実験の構築物のために、Ｂｒｕ／Ｌａｉ単離物由来のＮｅｆ遺伝子（Cell 40:9-17, 1985）を選択した。この遺伝子がコンセンサスＮｅｆに最も密接に関連するものだからである。
【００８４】
Ｂｒｕ／Ｌａｉ Ｎｅｆ遺伝子の出発材料は、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３にクローニングした１１７０ｂｐのＤＮＡ断片（ｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｆ）であった。
【００８５】
Ｔａｔ遺伝子はＢＨ１０分子クローンに由来する。この遺伝子をｐＣＶ１と呼ばれるＨＴＬＶ ＩＩＩ ｃＤＮＡとして入手した。これはScience, 229, p69-73, 1985に記載されている。
【００８６】
Ｎｅｆ及びＴａｔ遺伝子は、ピヒア属又は他の任意の宿主で発現させることができた。
【実施例１】
【００８７】
ピヒア・パストリスにおけるＨＩＶ−１ ｎｅｆ及びｔａｔ配列の発現
Ｎｅｆタンパク質、Ｔａｔタンパク質及び融合Ｎｅｆ−Ｔａｔを、誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターの制御下にメチロトローフ酵母ピヒア・パストリスで発現させた。
【００８８】
これらのＨＩＶ−１遺伝子を発現させるために、改変型の組込みベクターＰＨＩＬ−Ｄ２（INVITROGEN）を用いた。このベクターを、異種タンパク質の発現がＡＯＸ１遺伝子の天然ＡＴＧコドンの直後から始まり、そして１個のグリシン及び６個のヒスチジン残基のテールを有する組換えタンパク質を産生するように改変した。このＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを、ＰＨＩＬ−Ｄ２ベクターに隣接するＡｓｕＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間にオリゴヌクレオチドリンカーをクローニングすることによって構築した（配列番号２６及び２７を含む図２参照）。Ｈｉｓテールに加えて、このリンカーはＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ及びＸｂａＩ制限部位を有し、これらの間にｎｅｆ、ｔａｔ及びｎｅｆ−ｔａｔ融合体を挿入した。
【００８９】
１．１ 組込みベクターｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質をコードする）、ｐＲＩＴ１４５９８（Ｔａｔ−Ｈｉｓタンパク質をコードする）及びｐＲＩＴ１４５９９（Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合体をコードする）の構築
ｎｅｆ遺伝子を、ＰＣＲによってプライマー０１及び０２を用いてｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｆプラスミドから増幅した。
【００９０】
【００９１】
得られたＰＣＲ断片及び組込みベクターＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤを、両方ともＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで制限消化し、アガロースゲル上で精製し、連結して組込みプラスミドｐＲＩＴ１４５９７を作製した（図２参照）。
【００９２】
ｔａｔ遺伝子を、ＰＣＲによってプライマー０５及び０４を用いてｐＣＶ１プラスミドの誘導体から増幅した：
【００９３】
ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲ断片の５’末端に導入した一方で、ＳｐｅＩ部位を３’末端にプライマー０４を用いて導入した。得られたＰＣＲ断片及びＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを、両方ともＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで制限消化し、アガロースゲル上で精製し、連結して組込みプラスミドｐＲＩＴ１４５９８を作製した。
【００９４】
ｐＲＩＴ１４５９９を構築するために、ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓコード配列に相当する９１０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターの平滑化ＥｃｏＲＩ（Ｔ４ポリメラーゼ）及びＮｃｏＩ部位間で連結した。ｐＲＩＴ１４５９６の平滑化ＸｂａＩ（Ｔ４ポリメラーゼ）及びＮｃｏＩ消化によって、ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓコード断片を得た。
【００９５】
１．２ ピヒア・パストリス株ＧＳ１１５（ｈｉｓ４）の形質転換
Ｎｅｆ−Ｈｉｓ、Ｔａｔ−Ｈｉｓ及び融合Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓを発現するピヒア・パストリス株を得るために、それぞれの発現カセット及びＨＩＳ４遺伝子を有する線状ＮｏｔＩ断片を用いて、株ＧＳ１１５を形質転換し、宿主ゲノム中のｈｉｓを補完した。ＮｏｔＩ線状断片によるＧＳ１１５の形質転換は、ＡＯＸＩ座での組換えを容易にする。
【００９６】
複数コピー組込みクローンを定量ドットブロット分析によって選択し、そして組込み、挿入（Ｍｕｔ＋表現型）又は転位（transplacement；Ｍｕｔｓ表現型）の種類を決定した。
【００９７】
各形質転換体から、組換えタンパク質の高産生レベルを示す１つの形質転換体を選択した。
【００９８】
Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を産生する株Ｙ１７３８（Ｍｕｔ＋表現型）、以下を含む２１５アミノ酸のミリスチル化タンパク質：
ｏ ミリスチン酸
ｏ ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＮｃｏＩクローニング部位を用いて作製した１個のメチオニン
ｏ Ｎｅｆタンパク質の２０５アミノ酸（アミノ酸２から始まり、アミノ酸２０６まで伸びる）
ｏ クローニング手順（ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＳｐｅＩ部位でのクローニング）によって作製した１個のスレオニン及び１個のセリン
ｏ １個のグリシン及び６個のヒスチジン。
【００９９】
Ｔａｔ−Ｈｉｓタンパク質を産生する株Ｙ１７３９（Ｍｕｔ＋表現型）、以下を含む９５アミノ酸のタンパク質：
ｏ ＮｃｏＩクローニング部位を用いて作製した１個のメチオニン
ｏ Ｔａｔタンパク質の８５アミノ酸（アミノ酸２から始まり、アミノ酸８６まで伸びる）
ｏ クローニング手順によって導入した１個のスレオニン及び１個のセリン
ｏ １個のグリシン及び６個のヒスチジン。
【０１００】
組換えＮｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質を産生する株Ｙ１７３７（ＭｕｔＳ表現型）、以下を含む３０２アミノ酸のミリスチル化タンパク質：
ｏ ミリスチン酸
ｏ ＮｃｏＩクローニング部位を用いて作製した１個のメチオニン
ｏ Ｎｅｆタンパク質の２０５アミノ酸（アミノ酸２から始まり、アミノ酸２０６まで伸びる）
ｏ クローニング手順によって作製した１個のスレオニン及び１個のセリン
ｏ Ｔａｔタンパク質の８５アミノ酸（アミノ酸２から始まり、アミノ酸８６まで伸びる）
ｏ クローニング手順によって導入した１個のスレオニン及び１個のセリン
ｏ １個のグリシン及び６個のヒスチジン。
【実施例２】
【０１０１】
ピヒア・パストリスにおけるＨＩＶ−１ Ｔａｔ変異体の発現
変異型組換えＴａｔタンパク質も発現させた。変異型Ｔａｔタンパク質は生物学的に不活性である必要がある一方で、その免疫原性エピトープを維持している必要がある。
【０１０２】
これらの構築物のために、Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ（Tulane University）によって構築された二重変異体ｔａｔ遺伝子を選択した。
【０１０３】
このｔａｔ遺伝子（ＢＨ１０分子クローンに由来する）は、活性部位領域の変異（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）及びＲＧＤモチーフの変異（Ａｒｇ７８→Ｌｙｓ及びＡｓｐ８０→Ｇｌｕ）を有する（Virology 235:48-64, 1997）。
【０１０４】
変異体ｔａｔ遺伝子を、ＣＭＶ発現プラスミド内のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でサブクローニングしたｃＤＮＡ断片（ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥ）として得た。
【０１０５】
２．１ 組込みベクターｐＲＩＴ１４９１２（Ｔａｔ変異体−Ｈｉｓタンパク質をコードする）及びｐＲＩＴ１４９１３（融合Ｎｅｆ−Ｔａｔ変異体−Ｈｉｓタンパク質をコードする）の構築
ｔａｔ変異体遺伝子をＰＣＲによってプライマー０５及び０６を用いてｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミドから増幅した（１．１章、ｐＲＩＴ１４５９８の構築を参照）。
【０１０６】
ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲ断片の５’末端に導入した一方で、ＳｐｅＩ部位をプライマー０４を用いて３’末端に導入した。得られたＰＣＲ断片及びＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを、両方ともＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで制限消化し、アガロースゲル上で精製し、連結して組込みプラスミドｐＲＩＴ１４９１２を作製した。
【０１０７】
ｐＲＩＴ１４９１３を構築するために、ｔａｔ変異体遺伝子をＰＣＲによってプライマー０３及び０４を用いてｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミドから増幅した。
【０１０８】
【０１０９】
得られたＰＣＲ断片及びプラスミドｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を発現する）を、両方ともＳｐｅＩ制限酵素で消化し、アガロースゲル上で精製し、連結して組込みプラスミドｐＲＩＴ１４９１３を作製した。
【０１１０】
２．２ ピヒア・パストリス株ＧＳ１１５の形質転換
上記１．２章に記載した組込み及び組換え株の選択方法を応用することによって、Ｔａｔ変異体−Ｈｉｓタンパク質及び融合Ｎｅｆ−Ｔａｔ変異体−Ｈｉｓを発現するピヒア・パストリス株を得た。
【０１１１】
Ｔａｔ変異体−Ｈｉｓタンパク質（９５アミノ酸タンパク質）を産生する２つの組換え株を選択した：Ｙ１７７５（Ｍｕｔ＋表現型）及びＹ１７７６（ＭｕｔＳ表現型）。
【０１１２】
Ｎｅｆ−Ｔａｔ変異体−Ｈｉｓ融合タンパク質、３０２アミノ酸のタンパク質を発現する１つの組換え株を選択した：Ｙ１７７４（Ｍｕｔ＋表現型）。
【実施例３】
【０１１３】
組換えＴａｔ−Ｈｉｓを産生するピヒア・パストリスの発酵
典型的な方法を以下の表に記載する。
【０１１４】
発酵は、高細胞密度培養物に導く増殖期（適切な曲線に従ってグリセロールベースの培地を供給する）及び誘導期（メタノール及び塩／微量元素溶液を供給する）を含む。発酵中に、サンプルを採り、それらの６２０ｎｍでの吸光度を測定することによって増殖を追跡する。誘導期中に、メタノールをポンプから加え、その濃度をガスクロマトグラフィー（培養サンプルについて）及び質量分析計を用いるオンラインガス分析によってモニターした。発酵ののち、２〜８℃で５０２０ｇにて３０秒間遠心することによって細胞を回収し、そして細胞ペーストを−２０℃で保存する。さらに作業するために、細胞ペーストを解凍し、緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ７ ５０ｍＭ、ＰＭＳＦ５％、イソプロパノール４ｍＭ）中にＯＤ＝１５０（６２０ｎｍ）で再懸濁させ、そしてＤｙｎｏＭｉｌｌ（空間０．６Ｌ、３０００ｒｐｍ、６Ｌ／Ｈ、ビーズ直径０．４０〜０．７０ｍｍ）に４回通過させて破壊した。
【０１１５】
発現を評価するために、誘導中にサンプルを取り出し、破壊し、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ又はウエスタンブロット法によって分析した。クーマシーブルー染色ＳＤＳゲル上で、組換えＴａｔ−ｈｉｓは、約７２〜９６時間の誘導後に最大強度を示す強いバンドとして明確に同定された。
【表１】
【０１１６】
発酵に用いた培地：
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【実施例４】
【０１１７】
Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質（ピヒア・パストリス）の精製
精製スキームは、組換えピヒア・パストリス細胞（湿重量）１４６ｇ又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ５５の２Ｌから開始した。クロマトグラフィーステップは室温で行う。ステップ間でＮｅｆ−Ｔａｔ陽性分画を寒冷室（＋４℃）に一夜保存し、より長時間のためにはサンプルを−２０℃で凍結する。
【表７】
【０１１８】
【０１１９】
純度
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した純度レベルを、Ｄａｉｉｃｈｉ銀染色によるものを図３に、クーマシーブルーＧ２５０によるものを図４に示す。
【０１２０】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ステップ後： ＞９５％
透析及び滅菌濾過ステップ後： ＞９５％
【０１２１】
回収
組換えピヒア・パストリス細胞（＝Ｄｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ５５の２Ｌ）１４６ｇから、Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質５１ｍｇを精製する。
【実施例５】
【０１２２】
ピヒア・パストリス中の酸化Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質の精製
精製スキームは、組換えピヒア・パストリス細胞７３ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ５５の１Ｌから開始した。クロマトグラフィーステップを室温で行う。ステップ間でＮｅｆ−Ｔａｔ陽性分画を寒冷室（＋４℃）に一夜保存し；より長時間のためにはサンプルを−２０℃で凍結する。
【表８】
【０１２３】
【０１２４】
→ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した純度レベルを図６に示す（Ｄａｉｉｃｈｉ銀染色、クーマシーブルーＧ２５０、ウェスタンブロッティング）：
透析及び滅菌濾過ステップ後： ＞９５％
→回収（比色タンパク質アッセイにより評価：ＤＯＣ ＴＣＡ ＢＣＡ）
組換えピヒア・パストリス細胞７３ｍｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ５０の１Ｌから、酸化Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質２．８ｍｇを精製する。
【実施例６】
【０１２５】
還元Ｔａｔ−Ｈｉｓタンパク質（ピヒア・パストリス）の精製
精製スキームは、組換えピヒア・パストリス細胞１６０ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ６６の２Ｌから開始した。クロマトグラフィーステップを室温で行う。ステップ間でＴａｔ陽性分画を寒冷室（＋４℃）に一夜保存し、より長時間のためにはサンプルを−２０℃で凍結する。
【表９】
【０１２６】
【０１２７】
→ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した純度レベルを図７に示す（Ｄａｉｉｃｈｉ銀染色、クーマシーブルーＧ２５０、ウェスタンブロッティング）：
透析及び滅菌濾過ステップ後： ＞９５％
→回収（比色タンパク質アッセイにより評価：ＤＯＣ ＴＣＡ ＢＣＡ）
組換えピヒア・パストリス細胞１６０ｇ（湿潤重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ６６の２Ｌから、還元Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質４８ｍｇを精製する。
【実施例７】
【０１２８】
酸化Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質（ピヒア・パストリス）の精製
精製スキームは、組換えピヒア・パストリス細胞７４ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ６０の１Ｌから開始した。クロマトグラフィーステップを室温で行う。ステップ間でＴａｔ陽性分画を寒冷室（＋４℃）に一夜保存し、より長時間のためにはサンプルを−２０℃で凍結する。
【表１０】
【０１２９】
→ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した純度レベルを図８に示す（Ｄａｉｉｃｈｉ銀染色、クーマシーブルーＧ２５０、ウェスタンブロッティング）：
透析及び滅菌濾過ステップ後： ＞９５％
→回収（比色タンパク質アッセイにより評価：ＤＯＣ ＴＣＡ ＢＣＡ）
組換えピヒア・パストリス細胞７４ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ６０の１Ｌから、酸化Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質１９ｍｇを精製する。
【実施例８】
【０１３０】
ＳＩＶ還元Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質（ピヒア・パストリス）の精製
精製スキームは、組換えピヒア・パストリス細胞３４０ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ１００の４Ｌから開始した。クロマトグラフィーステップを室温で行う。ステップ間でＮｅｆ陽性分画を寒冷室（＋４℃）に一夜保存し、より長時間のためにはサンプルを−２０℃で凍結する。
【表１１】
【０１３１】
→ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した純度レベルを図９に示す（Ｄａｉｉｃｈｉ銀染色、クーマシーブルーＧ２５０、ウェスタンブロッティング）：
透析及び滅菌濾過段階後： ＞９５％
→回収（比色タンパク質アッセイにより評価：ＤＯＣ ＴＣＡ ＢＣＡ）
組換えピヒア・パストリス細胞３４０ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ１００の４Ｌから、ＳＩＶ還元Ｎｅｆ−ｈｉｓタンパク質２０ｍｇを精製する。
【実施例９】
【０１３２】
ＨＩＶ還元Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質（ピヒア・パストリス）の精製
精製スキームは、組換えピヒア・パストリス細胞１６０ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ５０の３Ｌから開始した。クロマトグラフィーステップを室温で行う。ステップ間でＮｅｆ陽性分画を寒冷室（＋４℃）に一夜保存し、より長時間のためにはサンプルを−２０℃で凍結する。
【表１２】
【０１３３】
→ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した純度レベルを図１０に示す（Ｄａｉｉｃｈｉ銀染色、クーマシーブルーＧ２５０、ウェスタンブロッティング）：
透析及び滅菌濾過段階後： ＞９５％
→回収（比色タンパク質アッセイにより評価：ＤＯＣ ＴＣＡ ＢＣＡ）
組換えピヒア・パストリス細胞１６０ｇ（湿重量）又はＤｙｎｏ−ｍｉｌｌ均質化物ＯＤ５０の３Ｌから、ＨＩＶ還元Ｎｅｆ−ｈｉｓタンパク質２０ｍｇを精製する。
【実施例１０】
【０１３４】
ピヒア・パストリスにおけるＳＩＶ ｎｅｆ配列の発現
病原性ＳＨＩＶチャレンジ（challenge）モデルにおいてＮｅｆ及びＴａｔ抗原を評価するために、マカーク（アカゲザル）のサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＮｅｆタンパク質、ＳＩＶｍａｃ２３９を発現させた（Aids Research and Human Retroviruses, 6:1221-1231, 1990）。
【０１３５】
Ｎｅｆコード領域に、ＳＩＶｍａｃ２３９は、９２アミノ酸の後にリーディングフレーム内の停止コドンを有し、僅か１０ｋＤの末端切断産物が予測される。Ｎｅｆリーディングフレームの残りはオープンリーディングフレームであり、そして２６３アミノ酸（３０ｋＤ）のタンパク質をその完全なオープンリーディングフレームの形態でコードすると予測されるであろう。
【０１３６】
ＳＩＶｍａｃ２３９ｎｅｆ遺伝子のための出発材料は、ＬＸ５Ｎプラスミドにクローニングした完全コード配列に相当するＤＮＡ断片であった（Ｄｒ Ｒ．Ｃ．Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，Southborough, MA, USAより提供を受けた）。
【０１３７】
完全長ＳＩＶｍａｃ２３９Ｎｅｆタンパク質を発現させるために、このＳＩＶｎｅｆ遺伝子を、成熟前の停止コドンにおいて変異させる（位置９３５３のヌクレオチドＧが元のＴヌクレオチドに取って代わる）。
【０１３８】
このＳＩＶｎｅｆ遺伝子をピヒア・パストリスにおいて発現させるために、（ＨＩＶ−１ ｎｅｆ及びｔａｔ配列の発現のために前に用いた）ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを用いた。誘導アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターの制御下で組換えタンパク質を発現させ、そしてこのタンパク質のC末端をヒスチジンアフィニティテール（これは精製を容易にする）によって伸長する。
【０１３９】
１０．１ 組込みベクターｐＰＩＴ１４９０８の構築
ｐＰＩＴ１４９０８を構築するために、ＳＩＶ ｎｅｆ遺伝子をｐＬＸ５Ｎ／ＳＩＶ−ＮＥＦプラスミドからプライマーＳＮＥＦ１及びＳＮＥＦ２を用いてＰＣＲにより増幅した：
【０１４０】
増幅したＳＩＶ ｎｅｆ ＤＮＡ領域は、ヌクレオチド９０７７で始まり、そしてヌクレオチド９８６５で終わる（Aids Research and Human Retroviruses, 6:1221-1231, 1990）。
【０１４１】
（ｎｅｆ遺伝子のＡＴＧコドンを有する）ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲ断片の５’末端に導入した一方で、ＳｐｅＩ部位を３’末端に導入した。得られたＰＣＲ断片及び組込みＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを、両方ともＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで制限消化した。ＳＩＶ ｎｅｆ増幅配列には（位置９２８６に）１つのＮｃｏＩ制限部位が存在するので、それぞれ±２００ｂｐ及び±６００ｂｐの２つの断片が得られ、アガロースゲル上で精製し、そしてＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターに連結した。得られた組換えプラスミドに、自動配列決定によりｎｅｆ増幅領域を確認したのち、ｐＲＩＴ１４９０８という名称を与えた。
【０１４２】
１０．２ ピヒア・パストリス株ＧＳ１１５の形質転換（ｈｉｓ４）
ＳＩＶ ｎｅｆ−Ｈｉｓを発現するピヒア・パストリス株を得るために、発現カセット及びＨＩＳ４遺伝子だけを有する線状ＮｏｔＩ断片を用いて株ＧＳ１１５を形質転換した（図１１参照）。
【０１４３】
両末端でＡＯＸ１存在（resident）ピヒア・パストリス遺伝子との相同性を有するこの線状ＮｏｔＩＤＮＡ断片は、ＡＯＸ１座での組換えを容易にする。
【０１４４】
多コピー組込みクローンを定量ドットブロット分析によって選択した。
【０１４５】
最良の組換えタンパク質産生レベルを示す１つ形質転換物を選択し、そしてＹ１７７２という名称を与えた。
【０１４６】
株Ｙ１７７２は組換えＳＩＶ Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質（２７２アミノ酸を含むタンパク質）を産生し、これは以下から構成されるであろう：
ｏ ミリスチン酸
ｏ ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＮｃｏＩクローニング部位を用いて作成した１個のメチオニン
ｏ ２６２アミノ酸のＮｅｆタンパク質（アミノ酸２から始まり、アミノ酸２６３まで伸長する、図１２参照）
ｏ クローニング手順（ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＳｐｅＩ部位でのクローニング）によって作製した１個のスレオニン及び１個のセリン（図１１参照−配列番号２９を含む）
ｏ １個のグリシン及び６個のヒスチジン。
【０１４７】
核酸及びタンパク質配列を図１２に示す（配列番号３０及び３１）。
【０１４８】
１０．３ 株Ｙ１７７２の発現産物の特性決定
発現レベル
炭素源として１％メタノールを含む培地で１６時間誘導したのち、組換えＮｅｆ−Ｈｉｓタンパク質の存在量を全タンパク質の１０％と推定した（図１３、レーン３−４）。
【０１４９】
溶解性
Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を産生する組換え株Ｙ１７７２の誘導培養物を遠心した。細胞ペレットを破壊緩衝液に再懸濁させ、０．５ｍｍガラスビーズで破壊し、細胞抽出物を遠心した。不溶性ペレット（Ｐ）及び可溶性上清液（Ｓ）に含まれたタンパク質をクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０％で比較した。
【０１５０】
図１３に示すように、株Ｙ１７７２由来の組換えタンパク質の大部分（レーン３−４）は、不溶性分画に関連した。
【０１５１】
十分な組換えタンパク質発現レベルを示す株Ｙ１７７２を、ＳＩＶ Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質の産生及び精製のために用いる。
【実施例１１】
【０１５２】
ＣＨＯにおけるＧＰ１２０の発現
組換えｇＰ１２０糖タンパク質を産生する安定ＣＨＯ−Ｋ１細胞系を確立した。組換えｇＰ１２０糖タンパク質は、ＨＩＶ−１単離物Ｗ６１ＤのｇＰ１２０エンベロープタンパク質の組換え末端切断形態である。タンパク質を細胞培養培地に分泌させ、次いで、これからタンパク質を精製する。
【０１５３】
ｇｐ１２０トランスフェクションプラスミドｐＲＩＴ１３９６８の構築
ＨＩＶ−１単離物Ｗ６１ＤのエンベロープＤＮＡコード配列（ｔａｔ及びｒｅｖの５’エクソンを含む）を、ゲノムｇｐ１６９エンベロープ含有プラスミドＷ６１Ｄ（Ｎｃｏ−ＸｈｏＩ）として入手した（Ｄｒ．Ｔｅｒｓｍｅｔｔｅ，CCB, Amsterdam）。このプラスミドをｐＲＩＴ１３９６５と命名した。
【０１５４】
ｇｐ１２０発現カセットを構築するために、プライマーオリゴヌクレオチド配列（ＤＩＲ１３１）及びＰＣＲ技術を用いて、停止コドンをｐＲＩＴ１３９６５のｇｐ１６０コード配列のアミノ酸ｇｌｕ５１５コドンに挿入する必要がある。プライマーＤＩＲ１３１は、３つの停止コドン（全てオープンリーディングフレーム中）及び１つのＳａｌＩ制限部位を含む。
【０１５５】
次いで、ｐＲＩＴ１３９６５から誘導したｇｐ１６０プラスミドサブクローンｐＷ６１ｄ ｅｎｖ（ｐＲＩＴ１３９６６）のＮ末端ＢａｍＨ１−ＤｒａＩ断片（１７０ｂｐ）から完全ｇｐ１２０エンべローブ配列を再構築し、そしてＰＣＲによりｐＲＩＴ１３９６５からＤｒａＩ−ＳａｌＩ断片（５１０ｂｐ）を作製した。両方の断片をゲル精製し、そして一緒に大腸菌プラスミドｐＵＣ１８に連結し、最初にＳａｌＩで切断し（クレノウ処理）、次いでＢａｍＨ１で切断した。これによりプラスミドｐＲＩＴ１３９６７が生じた。ｇｐ１２０コードカセットを含むＸｍａＩ−ＳａｌＩ断片（１５８０ｂｐ）の遺伝子配列を配列決定し、そして推定配列と一致することを見出した。最初にＢｃｌＩで切断し（クレノウ処理）、次いでＸｍａＩで切断することにより、プラスミドｐＲＩＴ１３９６７をＣＨＯ ＧＳ−発現ベクターｐＥＥ１４（Celltech Ltd., UK）に連結した。生成したプラスミドをｐＲＩＴ１３９６８と命名した。
【０１５６】
マスター細胞バンクの調製
典型的なＣａＰＯ４沈殿／グリセロールショック手順によって、ｇｐ１２０−構築物（ｐＲＩＴ１３９６８）をＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。２日後に、ＣＨＯＫ１細胞を、選択的増殖培地（ＧＭＥＭ＋メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）２５μＭ＋グルタメート＋アスパラギン＋１０％ウシ胎児血清）に供した。３つのトランスフェクタントクローンを１７５ｍ２フラスコ中でさらに増幅し、そして数本の細胞バイアルを−８０℃で保存した。さらなる実験のために、Ｃ−ｅｎｖ２３，９を選択した。
【０１５７】
小さい細胞予備バンクを調製し、そして２０のアンプルを凍結した。予備バンク及びＭＣＢを調製するために、７．５％ウシ胎児血清を添加し、かつ５０μＭ ＭＳＸを含むＧＭＥＭ培地で細胞を増殖させた。これらの細胞培養物を無菌性及びマイコプラズマについて試験し、そして陰性であることを証明した。
【０１５８】
予備マスター細胞バンクから誘導した細胞を用いて、マスター細胞バンクＣＨＯＫ１ ｅｎｖ２３．９（１２継代）を調製した。簡単に述べると、７．５％透析ウシ胎児血清を添加した培地に、２アンプルの予備マスター種を接種した。細胞を４本の培養フラスコに分配し、そして３７℃で培養した。細胞が付着したのち、培地を、５０μＭ ＭＳＸを添加した新たな培地と交換した。コンフルエントに達したとき、細胞をトリプシン処理により集め、そしてＴ−フラスコ−ローラービン−細胞製造ユニットにおいて、１／８分割比で継代培養した。細胞製造ユニットからトリプシン処理して細胞を集め、そして遠心した。低温保存剤としてＤＭＳＯを添加した培地に細胞ペレットを再懸濁させた。アンプルを予め標識し、オートクレーブ処理し、そして加熱密封した（２５０バイアル）。それらを漏れについて試験し、そして−７０℃で一夜保存したのち、液体窒素中で保存した。
【０１５９】
細胞培養及び粗回収物の製造
マスター細胞バンクからの２本のバイアルを急速解凍する。細胞をプールし、そして７．５％透析ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した適切な培地を入れた２つのＴ−フラスコに３７±１℃で接種する。コンフルエントに達したとき（１３継代）、細胞をトリプシン処理により集め、プールし、そして１０のＴ−フラスコで上記のように増殖させる。コンフルエントに達した細胞（１４継代）をトリプシン処理し、２つの細胞製造ユニット（それぞれ６０００ｃｍ２；１５継代）、次いで１０の細胞製造ユニット（１６継代）で連続的に増殖させる。増殖培地に７．５％透析ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ＭＳＸを添加する。細胞がコンフルエントに達したとき、増殖培地を捨て、そして１％透析ウシ胎児血清（ＦＢＳ）だけを含みＭＳＸを含まない「製造培地」と交換する。２日ごとに（４８時間の間隔で）３２日まで上清液を集める。回収した培養液を直ちに１．２−０．２２μｍフィルターユニットに通して清澄化し、そして−２０℃で保存したのち、精製する。
【実施例１２】
【０１６０】
細胞培養液からのＨＩＶ ｇｐ１２０（Ｗ６１Ｄ ＣＨＯ）の精製
全ての精製ステップを２−８℃の寒冷室内で行う。緩衝液のｐＨをこの温度で調節し、そして０．２μｍフィルターで濾過する。それらを発熱物質含有量について試験する（ＬＡＬアッセイ）。カラム溶出物の２８０ｎｍでの光学濃度、ｐＨ及び伝導率を連続的にモニターする。
【０１６１】
（ｉ）清澄化培養液
回収した清澄化細胞培養液（ＣＣＦ）をフィルター滅菌し、そしてトリス緩衝液、ｐＨ８．０を３０ｍＭ最終濃度まで加える。精製するまでＣＣＦを−２０℃で凍結保存する。
【０１６２】
（ｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー
解凍したのち、清澄化培養液に硫酸アンモニウムを１Ｍまで加える。この溶液を、３０ｍＭトリス緩衝液−ｐＨ８．０−１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化したＴＳＫ／ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ−ＢＵＴＹＬ ６５０Ｍ（ＴＯＳＯＨＡＡＳ）カラムに一夜通過させる。これらの条件下で、抗原はゲルマトリックスに結合する。段階的に低下する硫酸アンモニウム勾配でカラムを洗浄する。３０ｍＭトリス緩衝液−ｐＨ８．０−０．２５Ｍ硫酸アンモニウムで抗原を溶出させる。
【０１６３】
（ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー
溶液の伝導率を５〜６ｍＳ／ｃｍに低下させたのち、分画のｇＰ１２０プールをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Pharmacia）カラムに導入し、トリス−生理食塩水−ｐＨ８．０で平衡化する。カラムを陰性形式で操作し、すなわちｇＰ１２０はゲルに結合しないが、不純物の大部分は保持される。
【０１６４】
（ｉｖ）濃縮及び限外濾過による透析濾過
タンパク質濃度を高めるために、ｇＰ１２０プールをＦＩＬＴＲＯＮ膜”Ｏｍｅｇａ Ｓｃｒｅｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌ” 、５０ｋＤａカットオフに導入する。濃縮が終了したのち、緩衝液の透析濾過により、ＣａＣｌ２ ０．３ｍＭ、ｐＨ７．０を含む５ｍＭリン酸緩衝液と交換する。さらなる処理を直ちに行わない場合には、ｇＰ１２０プールを−２０℃で凍結保存する。解凍したのち、不溶性物質を除去するために、この溶液を０．２μＭ膜で濾過する。
【０１６５】
（ｖ）ヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィー
５ｍＭリン酸緩衝液＋ＣａＣｌ２ ０．３ｍＭ、ｐＨ７．０で平衡化したｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ、ＩＩ型（BioRad）カラムにｇＰ１２０ＵＦプールを導入する。カラムを同じ緩衝液で洗浄する。抗原はカラムを通過し、そして不純物はカラムに結合する。
【０１６６】
（ｖｉ）陽イオン交換クロマトグラフィー
酢酸塩緩衝液２０ｍＭ、ｐＨ５．０で平衡化したＣＭ／ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ−６５０Ｓ（ＴＯＳＯＨＡＡＳ）カラムにｇＰ１２０プールを導入する。カラムを同じ緩衝液、次いで酢酸塩２０ｍＭ、ｐＨ５．０及びＮａＣｌ １０ｍＭで洗浄する。次いで８０ｍＭ ＮａＣｌを含む同じ緩衝液で抗原を溶出させる。
【０１６７】
（ｖｉｉ）限外濾過
精製方法のウイルスクリアランス能を示すために、さらなる限外濾過ステップを行う。ｇＰ１２０プールをＦＩＬＴＲＯＮ膜 ”Ｏｍｅｇａ Ｓｃｒｅｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌ”、１５０ｋＤａカットオフでの限外濾過に供する。この孔サイズ膜は抗原を保持しない。処理したのち、同じ種類の膜（Ｆｉｌｔｒｏｎ）であるが５０ｋＤａのカットオフを有するもので希釈抗原を濃縮する。
【０１６８】
（ｖｉｉｉ）サイズ排除ゲルクロマトグラフィー
緩衝液を交換し、かつ残留夾雑物を除去するために、ｇＰ１２０プールをＳＵＰＥＲＤＥＸ２００（PHARMACIA）カラムにアプライする。カラムをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶出させる。
【０１６９】
（ｉｘ）滅菌濾過及び保存
０．２μＭ ＰＶＤＦ膜（Millipore）で濾過することにより、画分を滅菌する。滅菌濾過したのち、精製バルクを製剤化するまで−２０℃で凍結保存する。精製スキームを以下のフローシートにまとめる。
【０１７０】
→ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価した精製バルクの純度レベル（銀染色／クーマシーブルー／ウェスタンブロット法）は９５％以上である。
【０１７１】
→製造収率は約２．５ｍｇ／Ｌ ＣＣＦである（Ｌｏｗｒｙアッセイによる）− 全体的収率は約２５％である（Ｅｌｉｓａアッセイによる）。
【０１７２】
→精製材料は３７℃で約１週間安定である（ＷＢ分析による）。
【表１３】
【実施例１３】
【０１７３】
ワクチン調製物
本発明により製造されるワクチンは、抗原をコードする１以上のＤＮＡ組換え体の発現産物を含む。さらに、製剤は、水中油型エマルジョン中に担体としての３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）及びＱＳ２１の混合物、又は非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドモチーフを含むオリゴヌクレオチド及び水酸化アルミニウムを含む。
【０１７４】
３Ｄ−ＭＰＬ：グラム陰性細菌サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）のリポ多糖（ＬＰＳ）の化学的解毒形態である。
【０１７５】
実験は、種々のビヒクルと組み合わせた３Ｄ−ＭＰＬが体液性免疫及びＴＨ１型細胞性免疫の両方を強く増強することを示した。
【０１７６】
ＱＳ２１：強いアジュバント活性を有するキラハ・サポナリア（Quillaja Saponaria）の樹皮の粗製抽出物から精製したサポニンである。抗原特異的リンパ球増殖、及び幾つかの抗原に対するＣＴＬの両方を誘導する。
【０１７７】
実験は、体液性及びＴＨ１型細胞性免疫応答の両方の誘導において、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１の組み合わせの明確な相乗効果を示した。
【０１７８】
水中油型エマルジョンは、２つの油（トコフェロール及びスクワレン）、及び乳化剤としてのＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳからなる。このエマルジョンは、５％スクワレン、５％トコフェロール、２％Ｔｗｅｅｎ８０を含み、そして１８０ｎｍの平均粒径を有する（ＷＯ９５／１７２１０号参照）。
【０１７９】
行った実験は、このＯ／Ｗエマルジョンを３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１に添加すると、それらの免疫刺激特性をさらに増大させることを示した。
【０１８０】
水中油型エマルジョン（２倍濃縮）の製造
Ｔｗｅｅｎ８０をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解してＰＢＳ中２％溶液を得る。２倍濃縮エマルジョン１００ｍｌを得るために、ＤＬαトコフェロール５ｇ及びスクワレン５ｍｌを回転させてよく混合する。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液９０ｍｌを加えてよく混合する。次いで、生成したエマルジョンをシリンジに通し、そして最後にＭ１１０Ｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ機を用いて微細流動化する。生成した油滴は約１８０ｎｍの大きさを有する。
【０１８１】
水中油型製剤の製造
抗原（１００μｇ ｇｐ１２０、２０μｇ ＮＥＦＴａｔ及び２０μｇ ＳＩＶ Ｎｅｆ、単独又は組み合わせ）を１０倍濃縮ＰＢＳ ｐＨ６．８及びＨ２Ｏで希釈したのち、水中油型エマルジョン、３Ｄ−ＭＰＬ（５０μｇ）、ＱＳ２１（５０μｇ）及び保存剤としての１μｇ／ｍｌチオメルサールを順次に５分間隔で加える。エマルジョン容量は全容量の５０％（投与量５００μｌにつき２５０μｌ）である。
【０１８２】
全てのインキュベーションを室温で撹拌しながら行う。
【０１８３】
ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）は、１以上のＣｐＧ配列モチーフを含む合成の非メチル化オリゴヌクレオチドである。混合ＴＨ１／ＴＨ２型応答を主に誘導する水中油型製剤と比較して、ＣｐＧはＴＨ１型免疫の極めて強力な誘導因子である。ＣｐＧは、水中油型製剤よりも低レベルの抗体及び良好な細胞媒介免疫応答を誘導する。ＣｐＧは、低い局所反応原性を誘導すると予想される。
【０１８４】
ＣｐＧオリゴヌクレオチド溶液の製造：ＣｐＧ乾燥粉末をＨ２Ｏに溶解して５ｍｇ／ｍｌ ＣｐＧ溶液を得る。
【０１８５】
ＣｐＧ製剤の製造
３つの抗原をＮａＣｌ １５０ｍＭに対して透析して水酸化アルミニウムへのｇｐ１２０の吸着を阻害するリン酸イオンを除去する。
【０１８６】
Ｈ２Ｏに希釈した抗原（１００μｇ ｇｐ１２０、２０μｇ ＮｅｆＴａｔ及び２０μｇ ＳＩＶ ＮＥＦ）を、ＣｐＧ溶液（５００μｇ ＣｐＧ）とともに３０分間インキュベートしたのち、Ａｌ（ＯＨ）３に吸着させて、ＮｅｆＴａｔ及びＮｅｆ抗原のＨｉｓテールとオリゴヌクレオチドとの間の潜在的相互作用を容易にする（抗原に結合した場合は遊離ＣｐＧと比較してＣｐＧの免疫刺激効果が強いことが記載されている）。次いで、Ａｌ（ＯＨ）３（５００μｇ）、１０倍濃縮ＮａＣｌ及び保存剤としての１μｇ／ｍｌチオメルサールを順次に５分間隔で加える。
【０１８７】
全てのインキュベーションを室温で撹拌しながら行う。
【実施例１４】
【０１８８】
アカゲザルにおける免疫感作及びＳＨＩＶチャレンジの実験
第１研究
アカゲザル４匹のグループを、０、１及び３ヶ月に下記ワクチン組成物の筋肉内投与により免疫した：
グループ１： アジュバント２ ＋ｇｐ１２０
グループ２： アジュバント２ ＋ｇｐ１２０ ＋ＮｅｆＴａｔ ＋ＳＩＶ Ｎｅｆ
グループ３： アジュバント２ ＋ＮｅｆＴａｔ＊ ＋ＳＩＶ Ｎｅｆ
グループ４： アジュバント６ ＋ｇｐ１２０ ＋ＮｅｆＴａｔ ＋ＳＩＶ Ｎｅｆ
グループ５： アジュバント２ ＋ＮｅｆＴａｔ ＋ＳＩＶ Ｎｅｆ
グループ６： アジュバント２
アジュバント２はスクワレン／トコフェロール／Ｔｗｅｅｎ８０／３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１を含み、そして
アジュバント６はミョウバン及びＣｐＧを含む
Ｔａｔ＊は変異型Ｔａｔを示し、Ｌｙｓ４１→Ａｌａ並びにＲＧＤモチーフ中にＡｒｇ７８→Ｌｙｓ及びＡｓｐ８０→Ｇｌｕの変異を有する（Virology 235:48-64, 1997）。
【０１８９】
最後に免疫処置した１ヶ月後に、全ての動物に病原性ＳＨＩＶ（株８９．６ｐ）をチャレンジした。チャレンジしたその週（ｗｋ１６）から、所定の時点で周期的に血液サンプルを採取し、ＦＡＣＳ分析によって末梢血液単核球中のＣＤ４陽性細胞の％（図１４）、及びｂＤＮＡアッセイによって血清中のＲＮＡウイルスゲノム濃度（図１５）を決定した。
【０１９０】
結果
全ての動物はＳＨＩＶ８９．６ｐのチャレンジ後に感染状態になる。
【０１９１】
ＣＤ４陽性細胞は、チャレンジ後に、グループ１及び６（対照グループ）のそれぞれで１匹の動物を除き、グループ１、３、５及び６の全ての動物で低下する。グループ２の全ての動物はＣＤ４陽性細胞のわずかな減少を示し、そして経時的に基線値レベルに回復する。同様の傾向はグループ４の動物でも観察される（図１４）。
【０１９２】
ウイルス負荷データは、ほとんどがＣＤ４データと逆である。ウイルス負荷は、グループ２の動物の３／４（及びそのＣＤ４陽性細胞を維持している１匹の対照動物）で、検出レベル未満に低下し、そして第４の動物は境界的ウイルス負荷のみを示す。他の動物の大部分は高いか又は中等度のウイルス負荷を維持する（図１５）。
【０１９３】
驚くべきことに、ＥＬＩＳＡによって測定した抗Ｔａｔ及び抗Ｎｅｆ抗体力価は、研究過程全体を通して、グループ３（変異型Ｔａｔを有する）ではグループ５（非変異型Ｔａｔを有する同等のグループ）よりも２〜３倍高かった。
【０１９４】
６８週目（チャレンジ後５６週）に、完全な混合抗原を投与したグループ（グループ２及び４）の全ての動物は依然として生存したが、他のグループの動物の大部分は、ＡＩＤＳ様症状のために安楽死させねばならなかった。グループ当たりの生存動物は下記のとおりであった：
グループ１： ２／４
グループ２： ４／４
グループ３： ０／４
グループ４： ４／４
グループ５： ０／４
グループ６： １／４
【０１９５】
結論
（ＳＩＶ Ｎｅｆの存在下の）ｇｐ１２及びＮｅｆＴａｔの組み合わせは、ＣＤ４陽性細胞の損失を防止し、病原性ＳＨＩＶ８９．６ｐに感染した動物のウイルス負荷を減少させ、そしてＡＩＤＳ様疾患症状の発生を遅らせるか又は防止するが、ｇｐ１２０又はＮｅｆＴａｔ／ＳＩＶ Ｎｅｆ単独はＳＨＩＶチャレンジの病理学的結果から動物を防御しない。
【０１９６】
スクワレン、トコフェロール及びＴｗｅｅｎ８０を３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１と一緒に含む水中油型エマルジョンであるアジュバント２は、研究の終点で、ミョウバン／ＣｐＧアジュバントよりも強い効果を有するようである。
【０１９７】
第２研究
第２のアカゲザルＳＨＩＶチャレンジ研究を行って、候補ワクチンｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ＋アジュバントの効力を確認し、そしてＴａｔに基づく種々の抗原を比較した。この研究は異なる実験室で行った。
【０１９８】
研究計画は下記のとおりであった。
【０１９９】
アカゲザル６匹のグループを、０、４及び１２週に筋肉内注射により免疫し、そして１６週に病原性ＳＨＩＶ８９．６ｐの標準用量をチャレンジした。
【０２００】
グループ１は第１研究のグループ２の繰り返しである。
【０２０１】
グループ１： アジュバント２ ＋ｇｐ１２０ ＋ＮｅｆＴａｔ ＋ＳＩＶ Ｎｅｆ
グループ２： アジュバント２ ＋ｇｐ１２０ ＋Ｔａｔ（酸化）
グループ３： アジュバント２ ＋ｇｐ１２０ ＋Ｔａｔ（還元）
グループ４： アジュバント２
追跡／終点は、この場合にもＣＤ４陽性細胞率（％）、ＲＴ−ＰＣＲによるウイルス負荷、罹患率及び致死率とした。
【０２０２】
結果
グループ２の１匹を除き、全ての動物はＳＨＩＶ８９．６ｐのチャレンジ後に感染状態になる。ＣＤ４陽性細胞は、対照グループ４及びグループ３の全ての動物、並びにグループ２の動物１匹を除き、全ての動物において、チャレンジ後に有意に低下する。グループ１の動物の１匹だけがＣＤ４陽性細胞の顕著な減少を示す。第１研究の動物とは異なり、第２実験のサルは、ウイルスチャレンジ後１ヶ月に、種々のレベルでＣＤ４陽性細胞の安定化を示す（図１６）。この安定化はＣＤ４陽性細胞の初期％よりも一般的に低いが、該細胞の完全喪失には決して導かないと考えられる。これは、第２実験に用いたサル母集団においてＳＨＩＶ誘導疾患に対する感受性が低いことを示す可能性がある。それにもかかわらず、ｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ／ＳＩＶ Ｎｅｆワクチン及び２つのｇｐ１２０／Ｔａｔワクチンの有益な効果を実証できる。２０％を超えるＣＤ４陽性細胞を有する動物数はワクチン接種動物で５匹であるが、アジュバントグループの何れの対照動物も、このレベル以上を維持するものはいない。
【０２０３】
ＲＮＡ血漿ウイルス負荷の分析は、実験動物の比較的低い感受性を確証する（図１７）。対照動物６匹のうち２匹だけが高いウイルス負荷を維持するが、他の動物の血漿からウイルスが消失する。このように、ウイルス負荷パラメーターについてワクチン効果を実証することは困難である。
【０２０４】
結論
ＣＤ４陽性細胞の分析は、（ＳＩＶ Ｎｅｆの存在下の）ワクチンｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ＋アジュバントが、大部分のワクチン接種動物のＣＤ４陽性細胞の低下を防止することを示す。これは、第１のＳＨＩＶ研究で得られた結果の確認である。実験動物が感受性を欠いているために、ウイルス負荷パラメーターを用いてワクチン効果を実証することはできないだろう。併せて考えると、ｇｐ１２０とＴａｔ及びＮｅｆ ＨＩＶ抗原の組み合わせは、ＳＨＩＶモデルで証明されたように、ＨＩＶ感染の病理学的結果に対する防御を付与する。
【０２０５】
ｇｐ１２０と組み合わせたＴａｔ単独抗原も、ＣＤ４陽性細胞の低下に対して若干の防御を付与する。この効果は、ｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ／ＳＩＶ Ｎｅｆ抗原の組み合わせよりも顕著でないが、ｇｐ１２０及びＴａｔはＳＨＩＶ誘導疾患の発症に対して若干の防御効力を仲介できることを実証する。
【０２０６】
第２のＳＨＩＶチャレンジ研究は、第１研究の動物源とはとは全く無関係の源に由来するアカゲザルを用いて行った。両方のパラメーター、すなわちＣＤ４陽性細胞率％及び血漿ウイルス負荷は、第２研究の動物がＳＨＩＶ誘導疾患に対して感受性が低いこと、及び動物間にかなり大きな変動があることを示唆する。それにもかかわらず、ＣＤ４陽性細胞の維持に対するｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ／ＳＩＶ Ｎｅｆワクチンの有益な効果が、ｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ及びＳＩＶ Ｎｅｆを含む実験ワクチンで見られた。これは、このワクチン効果が別の研究で繰り返されただけでなく、さらに無関係なサル母集団でも実証されたことを示す。
【実施例１５】
【０２０７】
ｇｐ１２０及びＮｅｆ／ＴａｔのためのＰＭＩＤベクターの作製
発現ベクターを下記のように構築した。エンドトキシン不含のプラスミド調製物を調製し、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、ＤＮＡ １μｇを含む２４ウェル組織培養プレートで半コンフルエント状態の２９３Ｔ細胞単層をトランスフェクトするために用いた。トランスフェクション後２４時間にサンプルを集め、そしてウェスタンブロット法により検査して発現レベルを評価した（図１８及び１９）。
【０２０８】
ｇｐ１２０のコドン最適化は、ＲＥＶ非依存的発現を実質的に増加させた。
【０２０９】
プラスミドの作製
図２０〜２３も参照されたい。
【０２１０】
ｇｐ１２０：
野生型及び最適化ｇｐ１２０の両者を比較した。
【０２１１】
【０２１２】
遺伝子をベクターｐ７３１３−ｉｅにＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片としてクローニングし、そして配列決定した。参照配列に対して単一の塩基変化（保存性）が見出されたが、この変化はｐＲＩＴ１３９６８の配列決定でも見出された（ｇｐ１２０のＴ１１７０Ｃ）。
【０２１３】
最適化したコドン（ｐｇｐ１２０ｃ）
遺伝子配列はｐＲＩＴ１３９６８由来のｇｐ１２０配列に基づいていた。これはＲＳＣＵ値が０．２９７だった。最適化は、ＳＹｎＧｅｎｅ２ｄを用いて行い、ＲＳＣＵ値が０．７４９となるようにした。この配列を４０の重複オリゴヌクレオチドに分割し、そして最終プライマーを用いてＰＣＲで構成し、再生させた。遺伝子をベクターｐ７３１３−ｉｅにＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片としてクローニングし、そして配列決定した。３つの初期クローンに由来する制限断片を結合して単一の正確なクローンを作製した。
【０２１４】
Ｎｅｆ／Ｔａｔ（ｐＮＴｍ及びｐｔｒＮＴｍ）
Ｎｅｆ／Ｔａｔ融合タンパク質のための遺伝子をプラスミドｐＲＩＴ１５２４４に準備した。プラスミドｐＲＩＴ１５２４４は、Ｈｉｓテールが欠失している以外は上記のｐＲＩＴ１４９１３と同一である。このプラスミドのＴａｔは上記のような３つの変異を含む。融合物は、免疫調節機能を有する完全長Ｎｅｆを含み（Collins及びBaltimore (1999)）、これはＮ末端切断によって排除できる。従って、完全長Ｎｅｆ／変異型Ｔａｔ（ｐＮＴｍ）、及びＮｅｆの最初の６５アミノ酸が除去された末端切断Ｎｅｆ／変異型Ｔａｔ（ｐｔｒＮＴｍ）の両者のための構築物を作製した。これらの配列をｐＲＩＴ１５２４４から、下記のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
【０２１５】
遺伝子をベクターｐ７３１３−ｉｅにＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片としてクローニングし、そして配列決定した。
【０２１６】
二重発現ベクター：（ｐＲＩＸ１及びｐＲＩＸ２）
Ｎｅｆ／Ｔａｔ及びｔｒＮｅｆ／Ｔａｔ発現カセットをＣｌａＩ−ＸｍｎＩ制限断片として切り出し、そしてコドン最適化ｇｐ１２０を含むベクターのＣｌａＩ及び平滑化Ｓｓｅ８３８７ Ｉ部位に連結して、両方のタンパク質を発現させるための単一プラスミド（それぞれｐＲＩＸ１及びｐＲＩＸ２）を得た。
【０２１７】
プラスミドｐ７３１３−ｉｅの構成
このプラスミドは、ｐＵＣ１９のＥａｍ１１０５Ｉ−Ｐｓｔ１断片を含むβラクタマーゼ遺伝子（Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., Amersham Place,Little Chalfont,Bucks,HP7 9NAから入手可能）を、カナマイシン耐性遺伝子を含むｐＵＣ４ＫのＥｃｏＲＩ断片（Amersham-Pharmacia）と置換して、構築した。Ｄｒ Ｈａｒｒｉｅｔ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（University of Massachusetts）から得たプラスミドＪＷ４３０３から、ヒトサイトメガロウイルスＩＥ１プロモーター／エンハンサー、イントロンＡを誘導し、そしてｐＵＣ１９のＳａｌ１部位にＸｈｏＩ−Ｓａｌ１断片として挿入し、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを導入した。プロモーターから５’ＳａｌＩ−ＢａｎＩ断片を削除してベクターに用いる最小プロモーターを作製した（ＷＯ００／２３５９２号、Powderject Vaccines Inc.）。Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｄｗから、ベクターｐＡＭ６にＨＢＶ表面抗原３’ＵＴＲを誘導した（Moriartyら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78, 2606-10, 1981）。ｐＡＭ６（ｐＢＲ３２２に基づくベクター）は、American Type Culture Collection、カタログ番号ＡＴＣＣ４５０２０から得た。３’ＵＴＲを、挿入のために平滑末端化した１．４ｋｇのＢａｍＨＩ断片としてポリアデニル化シグナルの５’側に挿入してＢａｍＨＩ部位を除去した。一連のステップ（ＢｇｌＩＩ消化、クレノウポリメラーゼ処理、ＢｓｔＸＩ消化、ＮｃｏＩ消化、突出末端を除去するためのマングビーンヌクレアーゼ処理、及びさらなるＢｓｔＸＩ消化を含む）において、ＨＢＶ Ｓ遺伝子の３’非翻訳エンハンサー領域とｂＧＨｐＡシグナルとの間の領域に改変を加えて、Ｘ遺伝子プロモーターとｂＧＨｐＡシグナルとの間の５コドンより大きい全てのオープンリーディングフレームを除去した。これは、Ｘタンパク質の翻訳可能な部分（９アミノ酸）及びＸ遺伝子開始コドンをコードする配列の欠失を生じた。ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをウサギβグロビンポリアデニル化シグナルで置換した。Ｓ抗原の５’非コード配列及びコード配列を切除し
、そしてオリゴヌクレオチドリンカーと交換して、示すようなマルチクローニング部位を得、プラスミドｐ７３１３−ＰＬを作製した。
【０２１８】
【０２１９】
このポリリンカーは、ＫｐｎＩとＳａｌＩ部位の間に別のオリゴヌクレオチドリンカーが挿入されてさらに伸長されていた。
【０２２０】
【０２２１】
Ｄａｖｉｄ Ｈｏｄｇｅｓｏｎ（Warwick University）から入手したプラスミドｐＤＡＨ２１２由来のサブクローンから、ＣｏｌＥ１ ｃｅｒ配列を得、そしてプライマーを用いたＰＣＲによって増幅して、配列の末端にＥｃｏＲＩ制限部位を配置した。次いで、ｃｅｒ配列をｐ７３１３−ＰＬのＥｃｏＲＩ部位に挿入してプラスミドｐ７３１３−ＰＬｃを生成した。増幅したｃｅｒ配列をＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１１４１１について確認した。
【０２２２】
下記プライマーを用いたポリアデニル化シグナルのＰＣＲ増幅によって、プロモーターとポリアデニル化シグナルとの間のＨＢＶ ３’ＵＴＲ配列を切り出した：
【０２２３】
生成した産物をＢａｍＨＩ及びＸｍｎＩで切断し、そしてポリアデニル化シグナル及び３’ＵＴＲの両者を含む相当する断片を交換するために用いた。下記プライマーを用いたＣＭＶプロモーター／エンハンサーのＰＣＲ増幅によって、プラスミドからイントロンＡ配列を切り出した：
【０２２４】
生成した産物をＳｓｅ８３８７Ｉ及びＮｏｔＩで切断し、そして親ベクターのＳｓｅ８３８７Ｉ及びＮｏｔＩ部位に挿入し戻した。
【実施例１６】
【０２２５】
免疫原性研究
粒子媒介免疫治療送達（ＰＭＩＤ）によって送達されたｇｐ１２０及びＮｅｆＴａｔ構築物の免疫原性を試験して、該構築物がｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を生じさせうることを示すために、マウス免疫原性研究を行うことができる。ＤＮＡ構築物をタンパク質と組み合わせて用いて、個々の成分での免疫処置と比較して、組み合わせ手法の利点があるかどうかを判定することができる。その目的は、タンパク質での初回免疫及びＤＮＡでの追加免疫（ＰＭＩＤ）、又はＤＮＡでの初回免疫（ＰＭＩＤ）及びタンパク質での追加免疫によって、マウスにおける細胞性及び体液性免疫応答を検出し、そして定量することである。
【０２２６】
ＤＮＡを金微粒子上に凝集させ、これらをｔｅｆｚｅｌカートリッジ内壁のコーティングに用いる。カートリッジ当たり約０．５μｇのＤＮＡを与えるＤＮＡ負荷率２を用いて、ＰＭＩＤカートリッジを調製する。
【０２２７】
ｇｐ１２０又はＮｅｆＴａｔを含む２回のショットを与えることによって、ＰＭＩＤでマウスの腹部に免疫する。ＰＭＩＤ追加免疫したのち、脾臓を取り出し、そして脾臓細胞を用いて個々の構築物の免疫原性を決定する。ＩＦＮ−γ ＥＬＩｓｐｏｔアッセイを用いて応答を評価する。このアッセイでは、ｇｐ１２０及びＮｅｆ由来のペプチドを用いて、脾臓細胞をＩＦＮγ分泌に対して刺激し、これを抗体に基づく検出系によって捕捉する。ｇｐ１２０及びＮｅｆに対する体液性応答をＥＬＩＳＡによって測定して測定値を得る。
【０２２８】
ｇｐ１２０／ＮｅｆＴａｔ初回免疫、追加免疫研究
この研究の目的は、タンパク質での初回免疫及びＤＮＡでの追加免疫（ＰＭＩＤ）、又はＤＮＡでの初回免疫（ＰＭＩＤ）及びタンパク質での追加免疫によって、マウスにおける細胞性及び体液性免疫応答を検出し、そして定量することである。
【０２２９】
カートリッジの調製
カートリッジ当たり約０．５μｇのＤＮＡを与えるＤＮＡ負荷率（ＤＬＲ）２を用いて、遺伝子ガンカートリッジを好適に調製する。
【０２３０】
ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性
１つの実験（実験Ｉ）を下記表に示すようにして好適に行うことができる。この実験のための読み取りは、細胞性応答を測定する場合にはＢａｌｂ／ｃのｇｐ１２０及びＮｅｆ由来のペプチドに対してＩＦＮ−γ ＥＬＩｓｐｏｔによって行い、そして体液性応答の場合にはＥＬＩＳＡによるｇｐ１２０及びＮｅｆに対する抗体の検出によって行う。
【表１４】
【０２３１】
さらなる実験（実験ＩＩ）を以下のように実施し得る。
【表１５】
【０２３２】
サンプルプロトコール
雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いる。実験開始前に、全てのマウスから前採血する（尾静脈）。初回免疫したのち、１グループ当たりマウス３匹のグループを選び、脾臓を採取し、そしてｇｐ１２０及びＮｅｆＫｄ拘束ペプチドを用いるＥＬＩｓｐｏｔアッセイによってＩＦＮ−γ産生ＣＤ８細胞を計数する。
【０２３３】
２回目の免疫後、少なくとも２つの時点で１グループ当たりマウス３匹のグループを選び、心血液サンプルを採取する。これらを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてｇｐ１２０及びＮｅｆに対する抗体について分析する。また、脾臓を採取し、そしてｇｐ１２０及びＮｅｆＫｄ拘束ペプチドを用いるＥＬＩｓｐｏｔアッセイによってＩＦＮ−γ産生ＣＤ８細胞を計数する。
【０２３４】
免疫学的アッセイ
ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ
インターフェロン−γＥＬＩｓｐｏｔアッセイを用いて細胞性応答を検出する。グループ当たり３匹のマウスから、それぞれの選択された時点で（初回免疫後に１回及び追加免疫後に最低２回）脾細胞を単離し、そしてα−インターフェロン−γで被覆したプレートを用いて、既知ＣＤ８エピトープ（Ｋｄ（Ｂａｌｂ／ｃ）バックグラウンド拘束）ペプチドと共にインキュベートする。脾細胞を溶解し、そして第２のα−インターフェロン−γ抗体及びビオチン−ストレプトアビジン増幅系を用いてプレートを現像する。
【０２３５】
ＥＬＩＳＡアッセイ
標準抗体ＥＬＩＳＡアッセイを用いて体液性応答を検出する。９６ウェル平底マイクロタイタープレートをタンパク質で被覆し、そしてブロッキングする。免疫処置の前及び追加免疫の後に採取した血清の連続希釈物を集め、そしてプレートでインキュベートする。抗−マウス抗体と共にインキュベートしたのち、プレートを現像する。ｇｐ１２０、Ｎｅｆ及びＴａｔに対する応答を分析する。
【実施例１７】
【０２３６】
免疫原性研究
プロトコール
標準法を用いた遺伝子ガンを用いて、粒子媒介送達のためのカートリッジを調製した。約０．５μｇのＤＮＡ／カートリッジを与えるＤＮＡ負荷率２を用いた。
【０２３７】
Ｆ１（Ｃ３Ｈ×Ｂａｌｂ／ｃ）マウスに、アジュバント中のｇｐ１２０タンパク質及びＮｅｆＴａｔ（筋肉内経路で投与）で、又は実施例１５に記載したようにしてコドンを最適化し、かつベクターｐ７３１７−ｉｅにクローニングしたｇｐ１２０ＤＮＡ及びＮｅｆ融合タンパク質を発現するベクター（ＤＮＡが金ビーズ上にコーティングされている粒子媒介送達を用いて）のいずれかで、初回免疫を行った。２３日後、アジュバント中のタンパク質で（筋肉内経路で投与）、又はＤＮＡで（ＤＮＡが金ビーズ上に被覆されている粒子媒介送達を使用）、マウスを追加免疫した。５日後にマウスを選び、そして脾臓を採取した。脾細胞をかき取って回収して、白血球を溶解し、そして脾細胞を洗浄して計数した。（インターフェロン−γ捕捉抗体で被覆し、そしてブロッキングした）特殊ＥＬＩｓｐｏｔプレートを用いた。これらのプレートに脾細胞を移し、そして中程度の対照ｇｐ１２０Ｅ７ペプチド又は種々のｎｅｆペプチドの存在下に３７℃／５％ＣＯ２で一夜インキュベートした。脾細胞を溶解し、そして標準手順を用いてプレートを現像して、存在するインターフェロン−γ分泌細胞の数を確認した。
【０２３８】
結論
最適以下の濃度のｇｐ１２０Ｅ７ペプチドを用いてＥＬＩｓｐｏｔアッセイを行ったにもかかわらず、結果は、マウスを、アジュバント中のタンパク質で初回免疫（筋肉内投与）し、次いでＤＮＡで追加免疫（粒子媒介送達により投与）することが、最も有効なスケジュールであることを示した。図２４を参照されたい。類似の結果はｎｅｆの場合にも得られ、タンパク質で初回免疫され、そしてＤＮＡで追加免疫されたマウスによって、２つのペプチドＮｅｆ１９及び２０のみが認識された。これら２つのペプチドの配列は、Ｎｅｆ２９：ＨＩＶ−１ Ｂｒｕ（１７１−１９０）ＧＭＤＤＰＥＲＥＶＬＥＷＲＦＤＳＲＬＡＦ（配列番号４３）、及びＮｅｆ２０：ＨＩＶ−１ Ｂｒｕ（１８１−２００）ＥＷＲＦＤＳＲＬＡＦＨＨＶＡＲＥＬＨＰＥ（配列番号４４）であった。図２５を参照されたい。
【実施例１８】
【０２３９】
免疫原性研究
プロトコール
ＰＭＩＤ免疫処置（ＤＮＡ）のために、標準法を用いてカートリッジを調製した。約０．５μｇのＤＮＡ／カートリッジを与えるＤＮＡ負荷率２を用い、そして各免疫処置は２ショットとした。使用直前に、スクワレン／トコフェロール／Ｔｗｅｅｎ８０／３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１を含むアジュバント中にタンパク質を製剤化した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、アジュバント中のｇｐ１２０（筋肉内経路で投与）で、又は実施例１５に記載したようにして調製したｇｐ１２０コドン最適化ＤＮＡ（ＰＭＩＤを用いて）で初回免疫を行った。２１日後、アジュバント中のタンパク質（筋肉内経路で投与）で、又はＤＮＡ（ＰＭＩＤを使用）でマウスを追加免疫した。７日後にマウスを選び、そして脾臓を採取した。脾臓細胞をかきとって脾細胞を回収し、白血球を溶解化した。脾細胞を洗浄して計数した。（インターフェロン−γ捕捉抗体で被覆し、そしてブロッキングした）特殊ＥＬＩｓｐｏｔプレートを用いた。これらのプレートに脾細胞を移し、そしてｇｐ１２０ １５量体ペプチドのプールの存在下にて３７℃／５％ＣＯ２で一夜インキュベートした。脾細胞を溶解し、そして標準手順を用いてプレートを現像して、存在するインターフェロン−γ分泌細胞の数を確認した。結果を図２６に示す。
【０２４０】
結論
ｇｐ１２０ １５量体ペプチドの３つのプールは、タンパク質で初回免疫され、そしてＤＮＡで追加免疫されたマウスによって認識された。これら３つのプールに対するｇｐ１２０ １５量体の応答は、ＤＮＡで初回免疫され、そしてタンパク質で追加免疫されたか、あるいはタンパク質又はＤＮＡの何れかで２回免疫された動物では検出されなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶに対するヒトの予防用又は治療用免疫のための初回免疫−追加免疫送達に適したワクチンの製造における、
ａ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｂ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｃ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチドと結合したＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；
及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質若しくはポリヌクレオチド、
の使用であって、上記タンパク質若しくはポリヌクレオチドがボンバートメント手法により送達される、上記使用。
【請求項２】
ボンバートメント手法が、目的の標的組織中、典型的には皮膚中への粒子の推進を含む、請求項１記載の使用。
【請求項３】
粒子が、前記タンパク質若しくはポリヌクレオチドがコーティングされた金ビーズである、請求項２記載の使用。
【請求項４】
粒子がヘリウムガス気流により高速に加速される、請求項２又は３記載の使用。
【請求項５】
金ビーズが直径０．４〜４．０μｍである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
金ビーズが直径０．６〜２．０μｍである、請求項５記載の使用。
【請求項７】
ｎｅｆ、ｔａｔ又はｇｐ１２０をコードするポリヌクレオチドがコドン最適化ＤＮＡである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ｎｅｆ、ｔａｔ及びｇｐ１２０をコードするポリヌクレオチドが単一ベクター上に存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
ベクターが、強化ＨＣＭＶ ＩＥ１プロモーターの３’側に挿入されたｎｅｆ、ｔａｔ及びｇｐ１２０ポリヌクレオチドを含む、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ベクターがｐ７３１３である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
ワクチン製剤中に、ＨＩＶの別の調節若しくは構造タンパク質（Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、及びＶｐｒなど）、又はＨＩＶ ｇａｇ若しくはｐｏｌ遺伝子から誘導されたタンパク質、（及び／又はかかる調節若しくは構造タンパク質をコードするポリヌクレオチド）が含まれる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
ベクター中にＮｅｆ及び／若しくはＴａｔ、並びに／又はｇｐ１２０遺伝子を含み、目的遺伝子が強化ＨＣＭＶ ＩＥ１プロモーターの３’側に挿入されている組換えＤＮＡ分子。
【請求項１３】
ベクターがｐ７３１３である、請求項１２記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１４】
目的遺伝子の少なくとも１つがコドン最適化されている、請求項１２又は１３記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１５】
ｇｐ１２０ ＤＮＡがコドン最適化されている組換えＤＮＡ分子。
【請求項１６】
ヒトの予防用又は治療用免疫のためのＨＩＶワクチンの製造における、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子の使用。
【請求項１７】
ベクター中にＮｅｆ及び／若しくはＴａｔ、並びに／又はｇｐ１２０遺伝子を含む組換えＤＮＡでコーティングされた複数の粒子（好ましくは金粒子）。
【請求項１８】
単一ベクター中にＮｅｆ、Ｔａｔ及びｇｐ１２０遺伝子（好ましくはＮｅｆ及びＴａｔがＮｅｆＴａｔ融合物の形態である）を含むＤＮＡでコーティングされた、請求項１７記載の粒子。
【請求項１９】
Ｎｅｆ、Ｔａｔ又はｇｐ１２０の少なくとも１つをコードするＤＮＡが、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１７又は１８記載の粒子。
【請求項２０】
１以上の目的遺伝子が強化ＨＣＭＶ ＩＥ１プロモーターの３’側に挿入されている、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項２１】
ベクターがＰ７３１３である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項２２】
ａ）本明細書に記載のｇｐ１２０と、ｎｅｆ及び／若しくはｔａｔ又はｎｅｆｔａｔをコードするＤＮＡでコーティングされた複数の粒子を含む組成物、並びにｂ）本明細書に記載のｇｐ１２０と、ｎｅｆ及び／若しくはｔａｔ又はｎｅｆｔａｔのＤＮＡ又はタンパク質を含む組成物であって、ｂ）のＤＮＡ又はタンパク質は粒子上にコーティングされていない組成物を含む、少なくとも２種のワクチン組成物を含むキット。
【請求項１】
ＨＩＶに対するヒトの予防用又は治療用免疫のための初回免疫−追加免疫送達に適したワクチンの製造における、
ａ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｂ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチド；又は
ｃ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質若しくはポリヌクレオチドと結合したＨＩＶ Ｔａｔタンパク質若しくはポリヌクレオチド；
及びＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質若しくはポリヌクレオチド、
の使用であって、上記タンパク質若しくはポリヌクレオチドがボンバートメント手法により送達される、上記使用。
【請求項２】
ボンバートメント手法が、目的の標的組織中、典型的には皮膚中への粒子の推進を含む、請求項１記載の使用。
【請求項３】
粒子が、前記タンパク質若しくはポリヌクレオチドがコーティングされた金ビーズである、請求項２記載の使用。
【請求項４】
粒子がヘリウムガス気流により高速に加速される、請求項２又は３記載の使用。
【請求項５】
金ビーズが直径０．４〜４．０μｍである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
金ビーズが直径０．６〜２．０μｍである、請求項５記載の使用。
【請求項７】
ｎｅｆ、ｔａｔ又はｇｐ１２０をコードするポリヌクレオチドがコドン最適化ＤＮＡである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ｎｅｆ、ｔａｔ及びｇｐ１２０をコードするポリヌクレオチドが単一ベクター上に存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
ベクターが、強化ＨＣＭＶ ＩＥ１プロモーターの３’側に挿入されたｎｅｆ、ｔａｔ及びｇｐ１２０ポリヌクレオチドを含む、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ベクターがｐ７３１３である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
ワクチン製剤中に、ＨＩＶの別の調節若しくは構造タンパク質（Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、及びＶｐｒなど）、又はＨＩＶ ｇａｇ若しくはｐｏｌ遺伝子から誘導されたタンパク質、（及び／又はかかる調節若しくは構造タンパク質をコードするポリヌクレオチド）が含まれる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
ベクター中にＮｅｆ及び／若しくはＴａｔ、並びに／又はｇｐ１２０遺伝子を含み、目的遺伝子が強化ＨＣＭＶ ＩＥ１プロモーターの３’側に挿入されている組換えＤＮＡ分子。
【請求項１３】
ベクターがｐ７３１３である、請求項１２記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１４】
目的遺伝子の少なくとも１つがコドン最適化されている、請求項１２又は１３記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１５】
ｇｐ１２０ ＤＮＡがコドン最適化されている組換えＤＮＡ分子。
【請求項１６】
ヒトの予防用又は治療用免疫のためのＨＩＶワクチンの製造における、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子の使用。
【請求項１７】
ベクター中にＮｅｆ及び／若しくはＴａｔ、並びに／又はｇｐ１２０遺伝子を含む組換えＤＮＡでコーティングされた複数の粒子（好ましくは金粒子）。
【請求項１８】
単一ベクター中にＮｅｆ、Ｔａｔ及びｇｐ１２０遺伝子（好ましくはＮｅｆ及びＴａｔがＮｅｆＴａｔ融合物の形態である）を含むＤＮＡでコーティングされた、請求項１７記載の粒子。
【請求項１９】
Ｎｅｆ、Ｔａｔ又はｇｐ１２０の少なくとも１つをコードするＤＮＡが、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１７又は１８記載の粒子。
【請求項２０】
１以上の目的遺伝子が強化ＨＣＭＶ ＩＥ１プロモーターの３’側に挿入されている、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項２１】
ベクターがＰ７３１３である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項２２】
ａ）本明細書に記載のｇｐ１２０と、ｎｅｆ及び／若しくはｔａｔ又はｎｅｆｔａｔをコードするＤＮＡでコーティングされた複数の粒子を含む組成物、並びにｂ）本明細書に記載のｇｐ１２０と、ｎｅｆ及び／若しくはｔａｔ又はｎｅｆｔａｔのＤＮＡ又はタンパク質を含む組成物であって、ｂ）のＤＮＡ又はタンパク質は粒子上にコーティングされていない組成物を含む、少なくとも２種のワクチン組成物を含むキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公開番号】特開２０１０−１８７６８１（Ｐ２０１０−１８７６８１Ａ）
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６８５３２（Ｐ２０１０−６８５３２）
【出願日】平成２２年３月２４日（２０１０．３．２４）
【分割の表示】特願２００３−５１６５６４（Ｐ２００３−５１６５６４）の分割
【原出願日】平成１４年７月２６日（２００２．７．２６）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２４日（２０１０．３．２４）
【分割の表示】特願２００３−５１６５６４（Ｐ２００３−５１６５６４）の分割
【原出願日】平成１４年７月２６日（２００２．７．２６）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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