ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造内に制約されるアルファヘリックスのキメラペプチドを共有結合的に安定化する方法が開示される。本明細書内で開示されている方法により作られるコイルドコイル構造は、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の融合性立体配座内に含まれる内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部、特にＨＩＶ ｇｐ４１細胞外領域の内部コイルドコイル領域を模倣する。開示されているＨＩＶ由来のキメラペプチドは、ＨＩＶ ｇｐ４１のＮヘリックスの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合された非ＨＩＶ可溶性三量体型のコイルドコイルを含み、前記ペプチドの間のジスルフィド結合または化学選択的結合の形成を通じてホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造内で共有結合的に安定化される。本明細書で開示されている方法により作られる共有結合的に安定化されたＨＩＶ由来のホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造は、ＨＩＶ ｇｐ４１融合中間物質のよく似た模倣薬を表し、ＨＩＶ感染の強力阻害剤である。これらのＨＩＶ由来のキメラペプチドでは、ウイルス宿主細胞膜融合プロセスを阻害することによりＨＩＶ感染に対する治療処置を行うことができる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）エンベロープウイルス膜融合タンパク質の、ＮＨ_２末端７回繰り返し領域の全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域を含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、
（ｂ）前記ペプチド間の共有結合の形成により三量体コイルドコイル構造において（ａ）から３つのキメラペプチドを安定化させることとを含み、前記共有結合は、化学選択的反応から結果として生じるジスルフィド結合および共有結合からなる群から選択される、前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法。
【請求項２】
（ａ）
（ｉ）エンベロープウイルス膜融合タンパク質の、ＮＨ_２末端７回繰り返し領域の全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域と、
（ｉｉ）前記αヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基とを含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、
（ｂ）三量体コイルドコイル構造が形成される濃度で複数の前記可溶性キメラペプチドをインキュベートすることと、
（ｃ）（ｂ）において形成された前記三量体コイルドコイル構造を酸化させて、前記コイルドコイルの並列するキメラペプチド上のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して前記コイルドコイルを共有結合的に安定化することとを含む、前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法。
【請求項３】
（ａ）における前記可溶性キメラペプチドが、ＨＩＶ ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含む、請求項２に記載の三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法。
【請求項４】
（ａ）エンベロープウイルス膜融合タンパク質の、ＮＨ_２末端７回繰り返し領域の全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域を含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、
（ｂ）三量体コイルドコイル構造が形成される濃度で複数の前記可溶性キメラペプチドをインキュベートすることと、
（ｃ）前記キメラペプチド間の共有結合である化学結合の形成により（ｂ）において前記三量体コイルドコイル構造を安定化させることとを含み、前記化学結合は、化学選択的反応により形成される、前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法。
【請求項５】
（ａ）における前記可溶性キメラペプチドが、ＨＩＶ ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記化学結合が、チオエーテル結合である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
複数の前記可溶性キメラペプチドが、前記結果として得られる三量体コイルドコイル構造が、
（ａ）さらに前記ペプチドのαヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基を含む１つのキメラペプチドと、
（ｂ）それぞれ求電子性部分を組み込むように誘導体化された２つのキメラペプチドとからなる濃度で、インキュベートされ、
（ａ）における前記キメラペプチド中のそれぞれのシステイン残基の求核スルフヒドリル基は、（ｂ）における前記誘導体化されたキメラペプチドの求電子性部分とチオエーテル結合を形成する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ｂ）における前記２つのキメラペプチドは、ハロゲン化アルキル部分とマイケル受容体とからなる群から選択される求電子性部分を組み込むこように誘導体化される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）コイルドコイルの可溶性三量体型を含む骨格部分と、
（ｂ）ＨＩＶ ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含むＮペプチド部分、またはこの修飾型と、
（ｃ）少なくとも２つのシステイン残基を含むシステイン部分とを含み、
（ａ）における前記骨格部分は、（ｂ）における前記Ｎペプチド部分にヘリックスフェーズで融合されて、αヘリックス領域を形成し、（ｃ）における前記前記システイン部分は、前記αヘリックス領域の外に配置される可溶性キメラペプチド。
【請求項１０】
（ｂ）における前記Ｎペプチド部分が、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１に由来する請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項１１】
前記Ｎペプチド部分が、前記ペプチドの前記骨格部分のＣＯＯＨ末端に融合される請求項１０に記載のキメラペプチド。
【請求項１２】
前記Ｎペプチド部分が、Ｎヘリックスコイルドコイル疎水性ポケットを形成する、アミノ酸残基を含むＨＩＶ−１ ｇｐ４１ Ｎペプチドの十分な部分を含む請求項１１に記載のキメラペプチド。
【請求項１３】
前記Ｎペプチド部分が、Ｎ１７（ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４））を含む請求項１２に記載のキメラペプチド。
【請求項１４】
前記Ｎペプチド部分が、ｇｐ４１のアミノ酸５７７あたりからアミノ酸５８１あたりまでのところに配置されている潜在的免疫優勢エピトープを排除するように変異された修飾ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ Ｎペプチドである請求項１２に記載のキメラペプチド。
【請求項１５】
前記修飾Ｎペプチド部分が、Ｎ１７Ａｌａ４ （ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＡＬＡＡＡＩＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０））を含む請求項１４に記載のキメラペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドの前記骨格部分が、Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺコイルドコイルモチーフ（ＹＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９））の全部または一部、またはこれの修飾型を含む請求項１１に記載のキメラペプチド。
【請求項１７】
前記ペプチドの前記骨格部分が、ＩＺコイルドコイルモチーフ（ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１））を含む請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項１８】
前記ペプチドの前記骨格部分が、ＥＺコイルドコイルモチーフ（ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２））を含む請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドの前記骨格部分が、ＳＺコイルドコイルモチーフ（ＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７））を含む請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドの前記システイン部分が、前記ペプチドの前記αヘリックス領域のＮＨ_２末端に配置されている少なくとも２つの連続するシステイン残基を含む請求項１１に記載のキメラペプチド。
【請求項２１】
前記システイン残基が、スペーサー領域により前記αヘリックス領域から分離される請求項２０に記載のキメラペプチド。
【請求項２２】
前記ペプチドの前記システイン部分が、前記ペプチドの前記αヘリックス領域のＣＯＯＨ末端に配置されている少なくとも２つの連続するシステイン残基を含む請求項１１に記載のキメラペプチド。
【請求項２３】
前記システイン部分が、前記ペプチドの前記αヘリックス領域のＮＨ_２末端に配置されている３つの連続するシステイン残基を含む請求項１１に記載のキメラペプチド。
【請求項２４】
前記システイン残基が、スペーサー領域により前記αヘリックス領域から分離される請求項２３に記載のキメラペプチド。
【請求項２５】
前記ＮＨ_２末端に配置されている前記システイン残基が、保護されたチオール基を有する請求項２４に記載のキメラペプチド。
【請求項２６】
（ａ）ＣＣＩＺＮ１７と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と、
（ｂ）ＣＣＥＺＮ１７と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７と、
（ｃ）ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と、
（ｄ）ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９と、
（ｅ）ＣＣＩＺＮ２３と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３と、
（ｆ）ＣＣＥＺＮ２３と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と、
（ｇ）ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２と、
（ｈ）ＳＣＣＩＺＮ１７と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１と、
（ｉ）ＣＣＳＺＮ１７と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８と、
（ｊ）ＣＣＳ１７Ｎ１７と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００と、
（ｋ）ＣＣＥ１０Ｎ１７と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９と、
（ｌ）ＣＣＥ１７Ｎ１７と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６と、
（ｍ）ＣＣＥ１７ＧｌｕＮ１７と指定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０とからなる群から選択されたアミノ酸配列を含むキメラペプチド。
【請求項２７】
（ａ）ＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域と、
（ｂ）前記αヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基とを含み、前記キメラペプチドは、個々のペプチドの前記システイン残基間のジスルフィド結合を介してコイルドコイルとして共有結合的に安定化される３つのキメラペプチドを含むＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化された三量体コイルドコイル。
【請求項２８】
（ａ）
（ｉ）ＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域と、
（ｉｉ）前記ペプチドの前記αヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基とを含む１つのキメラペプチドと、
（ｂ）それぞれチオエーテル結合を形成することができる求電子性部分とともに誘導体化された、ＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域を含む２つのキメラペプチドとを含み、
（ａ）における前記キメラペプチド中のそれぞれのシステイン残基の求核スルフヒドリル基は、（ｂ）におけるそれぞれの誘導体化されたキメラペプチドの前記求電子性部分とチオエーテル結合を形成するＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル。
【請求項２９】
（ａ）（ＣＣＩＺＮ１７）_３（［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２］_３）と、
（ｂ）（ＣＣＥＺＮ１７）_３（［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７］_３）と、
（ｃ）（ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４）_３（［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５］_３）と、
（ｄ）（ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４）_３（［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９］_３）と、
（ｅ）（ＣＣＩＺＮ２３）_３（［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３］_３）と、
（ｆ）（ＣＣＥＺＮ２３）_３（［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５］_３）と、
（ｇ）（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）_３（［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２］_３）と、
（ｈ）（ＳＣＣＩＺＮ１７）_３（［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１］_３）と、
（ｉ）Ｃ（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）_３と、
（ｊ）Ｃ（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）_３と、
（ｋ）Ｃ（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）_３と、
（ｌ）Ｃ（ｔｈｉｏＥＺＮ１７）_３と、
（ｍ）Ｃ（ｔｈｉｏＥ１７Ｎ１７）_３と、
（ｎ）Ｃ（ｔｈｉｏＥ１７ＧｌｕＮ１７）_３とからなる群から選択されたＨＩＶ−１ Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化した三量体化コイルドコイル。
【請求項３０】
前記ペプチドが、免疫原性担体分子に共有結合される請求項９に記載のキメラペプチドの抗原性抱合体。
【請求項３１】
前記担体分子が、ＯＭＰＣである請求項３０に記載の抗原性抱合体。
【請求項３２】
前記三量体コイルドコイルが、免疫原性担体分子に共有結合される請求項２７に記載の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルの抗原性抱合体。
【請求項３３】
前記担体分子が、ＯＭＰＣである請求項３２に記載の抗原性抱合体。
【請求項３４】
前記三量体コイルドコイルが、免疫原性担体分子に共有結合される請求項２８に記載の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルの抗原性抱合体。
【請求項３５】
前記担体分子が、ＯＭＰＣである請求項３４に記載の抗原性抱合体。
【請求項３６】
前記免疫応答を高めることができる生物学的に有効なアジュバント、タンパク質、または他の薬剤と混合され、前記組成物が、哺乳類のＨＩＶ特異的中和抗体を顕在化させることができる免疫原として使用される請求項３３に記載の有効な量の抗原性抱合体を含む薬剤組成物。
【請求項３７】
前記免疫応答を高めることができる生物学的に有効なアジュバント、タンパク質、または他の薬剤と混合され、前記組成物が、哺乳類のＨＩＶ特異的中和抗体を顕在化させることができる免疫原として使用される請求項３５に記載の有効な量の抗原性抱合体を含む薬剤組成物。
【請求項３８】
ｇｐ４１融合中間物質上のエピトープに結合し、それにより細胞のＨＩＶ感染を阻害することによりｇｐ４１が前記細胞へのＨＩＶの融合を媒介する構造的立体配座をとることに干渉する請求項２７に記載の有効な量の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに前記細胞を接触させることを含む前記細胞へのＨＩＶ融合を阻害する方法。
【請求項３９】
ｇｐ４１融合中間物質上のエピトープに結合し、それにより細胞のＨＩＶ感染を阻害することによりｇｐ４１が前記細胞へのＨＩＶの融合を媒介する構造的立体配座をとることに干渉する請求項２８に記載の有効な量の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに前記細胞を接触させることを含む前記細胞へのＨＩＶ融合を阻害する方法。
【請求項４０】
（ａ）試験化合物、請求項２７に記載の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル、および前記ＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎペプチドコイルドコイル内の立体配座エピトープを認識する抗体を組み合わせることと、
（ｂ）前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルおよび前記抗体の親和性に対し前記試験化合物が有する効果を測定することと、
（ｃ）前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに対する前記抗体の親和性と前記試験化合物がない場合の前記コイルドコイルに対する前記抗体の親和性に対し前記試験化合物が有する効果を比較することとを含み、
前記試験化合物が、前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに対する前記抗体の親和性を減少させる場合に、前記試験化合物が、ＨＩＶ融合阻害剤として識別されるＨＩＶ融合阻害剤を識別する方法。
【請求項４１】
（ａ）試験化合物、請求項２８に記載の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル、および前記ＨＩＶ ｇｐ４１ Ｎペプチドコイルドコイル内の立体配座エピトープを認識する抗体を組み合わせることと、
（ｂ）前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルおよび前記抗体の親和性に対し前記試験化合物が有する効果を測定することと、
（ｃ）前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに対する前記抗体の親和性と前記試験化合物がない場合の前記コイルドコイルに対する前記抗体の親和性に対し前記試験化合物が有する効果を比較することとを含み、
前記試験化合物が、前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに対する前記抗体の親和性を減少させる場合に、前記試験化合物が、ＨＩＶ融合阻害剤として識別されるＨＩＶ融合阻害剤を識別する方法。
【請求項４２】
（ａ）コイルドコイルの可溶性三量体型を含む骨格部分と、
（ｂ）ＨＩＶ ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含むＮペプチド部分、またはこの修飾型とを含み、
前記キメラペプチドは、チオエーテル結合を形成することができる求電子性部分を組み込むように誘導体化されている可溶性キメラペプチド。
【請求項４３】
前記ペプチドが、ハロゲン化アルキル部分とマイケル受容体とからなる群から選択される求電子性部分を組み込むこように誘導体化される請求項４２に記載のキメラペプチド。
【請求項４４】
前記ハロゲン化アルキル部分は、ブロモアセチル部分である請求項４３に記載のキメラペプチド。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１１】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１７Ｃ】

【公表番号】特表２００８−５０１０２８（Ｐ２００８−５０１０２８Ａ）
【公表日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１５４０７（Ｐ２００７−５１５４０７）
【出願日】平成１７年５月２７日（２００５．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８８０８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１８８８６
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ　＆　ＣＯＭＰＡＮＹ　ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】