ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬及びその製造方法
【課題】 天然ウシ脳由来抽出物のトロンボプラスチン（組織因子−リン脂質複合体）の代替えとなることができる十分な活性を有し、しかも実用化できる規模の大量生産が可能な組換えウシ組織因子及びこれを用いたＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬、並びにこれらの製造方法を提供する。
【解決手段】 宿主としてカイコを用いて、少なくとも可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを含むウシ組織因子を発現させる。好ましくはバキュロウィルスベクターを用いてカイコに感染させる。得られた組換えウシ組織因子とリン脂質との複合体を、天然ウシ脳由来のトロンボプラスチンに代えて用いる。
【解決手段】 宿主としてカイコを用いて、少なくとも可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを含むウシ組織因子を発現させる。好ましくはバキュロウィルスベクターを用いてカイコに感染させる。得られた組換えウシ組織因子とリン脂質との複合体を、天然ウシ脳由来のトロンボプラスチンに代えて用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外因系の血液凝固検査に用いられる、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬、具体的には組換えウシ組織因子を含有するＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬、及び当該試薬に用いられる組換えウシ組織因子、並びに組換えウシ組織因子及び当該ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中のＩＩ因子、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、及びＸ因子の凝固能を総合的に調べる検査は、トロンボテストとも呼ばれている。この検査に用いられる試薬は、主要成分として、ウシ脳組織トロンボプラスチン、フィブリノゲン及び第Ｖ因子、カルシウム、リン脂質を含有している。
【０００３】
主要成分のウシ脳組織トロンボプラスチンは、非特許文献１のＦｉｇ．３で示されているように、Ｎ末端から２１３番目までの細胞外ドメイン（可溶性ドメイン）と２１４番目から２３６番目までの膜貫通ドメインと２３７番目から２５７番目までの細胞内ドメインからなる全アミノ酸２５７個の組織因子とよばれるタンパク質に、リン脂質が結合した複合体である。このような構成を有するトロンボプラスチンは、従来より、ウシ大脳を原料として、アセトン粉末あるいは生理食塩水を用いてトロンボプラスチンを抽出することにより製造される。
【０００４】
原料として用いられるウシ大脳は狂牛病（ＢＳＥ）の高度感染部位の１つであることから、近年、製造現場において、原料として、ウシの大脳を使用しない製造方法が求められている。また、天然のウシ脳より抽出された粗製のトロンボプラスチンを含んだ試薬では、季節の変動、ロット間の変動が問題となる。また、天然のウシ大脳から抽出されたトロンボプラスチンを含む試薬には、トロンボプラスチン以外にもウシ大脳由来の成分が不純物として含まれている。そして、この不純物の影響により試薬の安定性が悪く不溶性物質が析出してくるという問題がある。さらに、ウシの血液由来の他の凝固因子も、不純物として含むため、測定対象の凝固因子に対して感度不足になるという問題がある。さらにまた、天然のウシ大脳から抽出されたトロンボプラスチンを含む試薬では、上述した不純物が試薬自体の濁りを引き起こす原因となる。試薬自体に濁りが生じた場合、凝固に伴う測定用試料の濁度等の光学的特性の変化の検出感度が低くなるため、光学的特性を測定して凝固時間を算出する測定器では、脂質の含有量が多い検体など、使用する検体によっては、正確な凝固時間を測定できないといった問題もある。
【０００５】
上記のような問題解決のために、遺伝子組換え技術により生産された組換え組織因子を使用することが検討されている。
ここで、組換え組織因子及びこれを用いた試薬に関する技術としては、以下のようなものが報告されている。
【０００６】
例えば、特許文献１（特開平５−２１９９５７）には、ヒトの遺伝子組換え組織因子を大腸菌で発現させ、得られた組換えヒト組織因子を用いて、プロトロンビン時間測定試薬を調製することが提案されている。ここでは、組織因子高発現セルラインとしてＲＥＴ−１ＣＥＬＬを選択し、発現ベクターとしてはファルマシア社から販売されているｐＫＫ２３３−２を使用し、ヒト組織因子としてアミノ酸１−２１９番配列のｃＤＮＡを発現させた実施例が記載されている。また、発現ベクターとして、動物細胞（ＣＨＯ細胞）を用いた実施例も開示されている。しかしながら、ここで得られたヒト組織因子は、いずれも可溶性ドメインにとどまり、膜貫通ドメインを含む完全長の組織因子ではない。また、得られたヒト組織因子は、ベクターとして大腸菌を用いた場合、大腸菌を破壊し、ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーでタンパク質を抽出したものについて、血液凝固因子に対する結合アッセイを測定するにとどまり、プロトロンビン時間測定試薬の調製までは行なわれていない。同様に、発現ベクターとして動物細胞を用いた実施例では、上清を回収し、濃縮して得られた組織因子について、同様に血液凝固因子との結合アッセイを測定するに留まっている。すなわち、得られた組換えヒト組織因子の適用については、いずれも血液凝固因子に対する結合アッセイに留まり、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬への適用は開示されていない。
【０００７】
また、特許文献２（特表平６−５０５５６２）に、ヒトの遺伝子組換え組織因子を大腸菌で発現させ、ヒト組織因子に対して指向性の固定化モノクローナル抗体上でのアフィニティクロマトグラフィを用いて精製した組換えヒト組織因子をプロトロンビン試薬に適用したことが開示されている。ここでは、Ｎｅｍｅｒｓｏｎ及びＰａｂｒｏｓｋｙの方法にしたがって、完全長並びに切断した組換え分子を使用できると記載され、実施例においても完全長組換えヒト組織因子及び切断組換え組織因子が開示されている。ここでは、得られた組換えヒト組織因子を用いて、リン脂質で脂質化することにより、トロンボプラスチン試薬を調製し、調製した試薬を用いて凝固時間を測定している。しかしながら、得られた組換えヒト組織因子を、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬へ適用することについては開示されていない。
【０００８】
ウサギ組織因子については、Cheryl L Brucatolらが、非特許文献２（「Expression of recombinant rabbit tissue factor in Pichia pastoris，and its application in a prothrombin time reagent（Protein Expression and purification，26(2002)，386-393））において、組換えウサギ組織因子（ｒＴＦ）を酵母で発現させ、ヒスチジンタグを利用して精製し、得られた組換えウサギ組織因子をプロトロンビン時間測定試薬に適用したことが報告されている。発現させたウサギの組織因子は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインからなる完全長のものであると報告されている。
【０００９】
同様に、特許文献３（特表平１１−５１４１０１）においても、完全長の組換えウサギ組織因子を酵母で発現させ、細胞外ドメイン、脂質結合ドメイン、細胞内ドメイン、及び組換え組織因子を選択的に富化するヒスチジンタグを利用して精製したウサギ組織因子をプロトロンビン時間測定試薬に適用したことが開示されている。
【００１０】
しかしながら、いずれも、得られた組換えウサギ組織因子を、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬へ適用することについては開示されていない。
【００１１】
また、組換え組織因子を、測定用試薬の原料として商業ベースで使用しようとする場合、大量に生産できるシステムを構築できる方法でなければならないが、上述した特許文献及び非特許文献において、大量生産可能な方法の開示はない。
【００１２】
特許文献４（特開平１１−２２５７６０）では、段落番号８で、プロトロンビン時間試薬に用いることができ、生物学的に活性な組織因子を得るためには、膜貫通ドメインを有する完全長の組織因子を得る必要があり、この点、酵母、バキュロウィルスをベクターとして用いた昆虫細胞、培養哺乳動物細胞、ヒト細胞系等の真核性システムで発現させることが原理的に適しているとする一方、これらのシステムは経費に関して問題があると説明している。そこで、前記特許文献４では、比較的大量の純粋な組織因子をパイロットプラント規模で調製するための方法として、周辺腔中に発現産物を向けるシグナル配列を含有するベクターに、完全長の組換え組織因子のｃＤＮＡを組換え、この発現ベクターをトランスフェクトさせた大腸菌を、成分を工夫した培地で培養する方法を採用することにより、プロトロンビン試薬に用いることができるような組織因子を大量に発現できたことが実施例で示されている。しかしながら、ここで用いられた組織因子が、具体的にどの生物に由来するものなのかということについては、一切記載されていない。さらに、得られた組織因子を、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬へ適用することについては開示されていない。
【００１３】
ところで、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、ＶＩＩ因子がＶＩＩａ因子に変換する反応による外因系凝固機構を利用しており、第ＶＩＩ因子に対する感受性については、ウシ組織因子が優れていることが知られている。従って、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬に用いられる組織因子は、ウシ組織因子である必要がある。
【００１４】
特許文献５（特開平１１−１６０３２０）に、組換えウサギ組織因子又はウシ組織因子を再脂質化し、ＨＥＰＥＳ−ｔｒｉｓ緩衝液、吸着血漿、カルシウムを加えて、複合因子測定試薬を得ることが提案されている。また、この特許文献５には、使用される組換えウサギ組織因子又はウシ組織因子は、慣用の遺伝子工学的手法に準じて調製することができ、また市販されている組換えウサギまたはウシ組織因子タンパク質を使用してもよいと説明されている。しかしながら、遺伝子工学的手法を用いる場合の説明としては、「例えば、ウサギ組織因子又はウシ組織因子をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主に組み込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体を培養後、その培養物（培養上清、培養細胞等）を慣用の蛋白質精製法に準じて精製することにより目的とする組換えウサギ組織因子又はウシ組織因子を得ることができる。宿主細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる」（段落番号７)との開示にとどまり、大量生産可能な方法については、記載されていない。尚、特許文献５に開示されているペルフリーズ社の市販品では、完全長の組換えウサギ組織因子が用いられている。
【００１５】
実際のところ、遺伝子工学の技法を用いることにより、宿主に挿入されたｃＤＮＡ配列を翻訳したタンパク質を生産することはできるものの、翻訳後のＮ末端、Ｃ末端切断等の翻訳後プロセッシング、糖鎖修飾、アミド化等の二次修飾、タンパク質のフォールディングなどについても宿主の影響を受けるため、生産されたタンパク質が天然のタンパク質と同等の生理活性を有していないといった問題がしばしば起る。さらに、生産性の点においても、宿主の影響は避けられず、実用化できる組換え組織因子の生産という観点においては、宿主の選択がかなり重要となる。
【００１６】
組換えウシ組織因子を具体的に生産した報告としては、１９９２年生化学会で、重松欣克（九州大学、理学部）により、酵母を用いた発現系で、ウシ可溶性リコビナントの調製が報告されているだけである。この報告によれば、高榎ら（ＢＢＲＣ．１８１．１１４５−１１５０，１９９０年）がクローニングしたウシ組織因子のｃＤＮＡを用い、可溶性ヒト組織因子の発現に用いた方法に従って、ｐＡＭ８２にウシ組織因子の細胞外ドメイン（１−２１３）を挿入した発現ベクターを構築し、発現させたとある（非特許文献５）。重松欣克（九州大学、理学部）らは、ウシ組織因子の発現に先だって、酵母及び大腸菌を用いて、ヒト組織因子の発現を試み、全長のヒト組織因子ＤＮＡを大腸菌ｒｅｃＡプロモータ下流に挿入したが、発現された組織因子は十分な活性を示さなかったこと、抑制性Ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅプロモータと酵母インベルターゼのシグナル配列の下流に、成熟組織因子に対応するＤＮＡを挿入し、酵母ＡＨ２２株を形質転換し、発現させた結果、活性ある組織因子が得られたと報告している。つまり、ヒトの遺伝子の組換え組織因子を大腸菌や酵母で発現させたところ、大腸菌では発現活性がでなかったが、酵母発現系を用いることにより、比活性が高い、可溶性ヒト組織因子の大量調製に成功したと報告している（非特許文献３，非特許文献４）。
【００１７】
以上のように、ウサギ組織因子、ヒト組織因子では、大腸菌、酵母、動物培養細胞系で発現できた実施例が報告されているが、ウシ組織因子では実際に発現させた例としては、重松欣克（九州大学、理学部）の報告がある程度であり、しかも可溶性ドメインだけの発現にとどまっているので、凝固活性は不十分であり、トロンボテスト用試薬に用いることはできない。さらに、遺伝子組換えの手法により、目的とする活性を有する組織因子を実用化できる大量生産レベルで成功したとの報告は、せいぜい、ヒト組織因子を酵母で生産する系、ヒト組織因子を大腸菌で生産する系、ウサギ組織因子を酵母で生産する系程度である。ましてや、組換えウシ組織因子については、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬に用いることができる程度のものを実用化できるレベルで生産されたとの報告は見あたらない。
【００１８】
【特許文献１】特開平５−２１９９５７
【特許文献２】特表平６−５０５５６２（特許第３４１６７７８号）
【特許文献３】特開平１１−５１４１０１（特許第３２４６７４９号
【特許文献４】特開平１１−２２５７６０
【特許文献５】特開平１１−１６０３２０
【非特許文献１】Yuko Takayenokiら「cDNA and amino acid sequences of bovine tissue factor (Biochemical and Biophysical Research Communications, 181(1991), 1145-1150)」
【非特許文献２】Cheryl L Brucatolら「Expression of recombinant rabbit tissue factor in Pichia pstoris，and its application in a prothrombin time reagent（Protein Expression and purification，26(2002)，386-393）
【非特許文献３】生化学、第６２巻、１９９０年生化学会講演要旨、演題番号３２５
【非特許文献４】生化学、第６３巻、１９９１年生化学会講演要旨、演題番号１２５９
【非特許文献５】生化学、第６４巻、１９９２年生化学会講演要旨、演題番号２３５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、天然ウシ脳由来抽出物のトロンボプラスチン（組織因子−リン脂質複合体）の代替えとなることができる十分な活性を有し、しかも実用化できる規模の大量生産が可能な組換えウシ組織因子及びこれを用いたＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬、並びにこれらの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子は、少なくとも可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを含むもの、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列からなるものである。これらは、宿主としてのカイコにおいて発現された組換えウシ組織因子であることが好ましい。
【００２１】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子複合体は、上記本発明の組換えウシ組織因子とリン脂質とからなる複合体である。
【００２２】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、上記本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子複合体を含有するものである。
【００２３】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子の製造方法は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加、又は欠失したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程；前記カイコにおいて、前記ｃＤＮＡから組換えウシ組織因子を発現させる工程；及び前記組換えウシ組織因子を抽出する工程；を含む。
【００２４】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加、又は欠失したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程；前記カイコにおいて、前記ｃＤＮＡから組換えウシ組織因子を発現させる工程；前記組換えウシ組織因子を抽出する工程；及び前記組換えウシ組織因子とリン脂質とを混合して、ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程；を含む。
【００２５】
前記ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程において、前記組換えウシ組織因子と前記リン脂質とが、ニッケル存在下で混合されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の組換えウシ組織因子は、少なくともＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子との反応に必要な部分を含むように、遺伝子組換えにより生産したものであり、本発明の組換えウシ組織因子複合体は、当該組換えウシ組織因子とのリン脂質複合体であるから、従来の天然のウシ大脳からの抽出により生産されるウシのトロンボプラスチンと比べて、不純物の混入が少なく、またロット間でのばらつきが少なく品質が安定している。従って、本発明の組換えウシ組織因子を用いたＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、従来の天然のウシトロンボプラスチンを用いる測定試薬に匹敵する測定感度を有している。しかもカイコを宿主として用いた系では大量生産が可能で、従来の天然物からの抽出法よりも生産性に優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
〔組換えウシ組織因子〕
本発明に係るＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ測定用組換えウシ組織因子は、リン脂質と複合体化することによりヒト血液中のＶＩＩ因子を活性化するものであり、少なくとも天然のウシ組織因子の可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを有する。組換えウシ組織因子の可溶性ドメインはＶＩＩ因子と相互作用するのに必要なドメインであり、膜貫通ドメインはリン脂質との複合体を形成するのに必要なドメインである。
【００２８】
ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ測定用組換えウシ組織因子としては、好ましくは、リン脂質との複合体を形成してＶＩＩ因子を活性化する能力を損なわない範囲で、可溶性ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを有するものである。具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうちの１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したものでＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子と反応活性を示すものである。
【００２９】
ここで、配列番号１は、非特許文献１のＦｉｇ．３に示されている正常ウシ組織因子のアミノ酸配列であり、１番アミノ酸から２１３番アミノ酸までが可溶性ドメイン（細胞外ドメイン）に該当し、２１４番アミノ酸から２３６番目までが膜貫通ドメインに該当し、２３７番目から２５７番目までが細胞内ドメインに該当する。
【００３０】
本発明に係るＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用組換えウシ組織因子においては、糖鎖の有無は特に限定しないが、例えば、後述する製造方法により製造される組換えウシ組織因子の場合には、糖鎖がついている。
【００３１】
〔ウシ組織因子−リン脂質複合体〕
本発明のウシ組織因子−リン脂質複合体は、上述した組換えウシ組織因子とリン脂質とからなる複合体で、天然のウシ組織トロンボプラスチン（リン脂質複合体型の天然ウシ組織因子）と同程度の血液凝固活性を有するものである。このような複合体は、組換えウシ組織因子とリン脂質とを、例えば、ニッケル存在下で混合することにより、製造することができる。
【００３２】
複合体化に用いられるリン脂質は、一般に１２〜２２の炭素原子を有する脂肪酸を含有するリン脂質であり、当該脂肪酸は飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のいずれであってもよい。好ましいリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンなどが例示される。これらのリン脂質は、天然物、合成品のいずれであってもよく、異なる種類の脂肪酸を有するリン脂質であってもよい。さらに、これらのリン脂質は、所望する性状、特性などに応じて２種以上を混合して複合体の形成に用いてもよい。
【００３３】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬〕
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬とは、外因系の血液凝固検査に用いられる試薬で、血中の第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子及びＸ因子の凝固能を総合的に調べることができる試薬のことをいう。
【００３４】
ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、上記本発明の組換えウシ組織因子−リン脂質複合体を含有するもので、具体的には、後述の製造方法により生産された組換えウシ組織因子をリン脂質で複合体化させてなるウシ組織因子−リン脂質複合体を含有する。
【００３５】
さらに、測定用試薬は、第Ｉ因子及び第Ｖ因子を含有することが好ましい。第Ｉ因子及び第Ｖ因子の添加に代えて、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子及びＸ因子を除去した血漿を用いてもよい。当該血漿としては、血漿、好ましくはウシ血漿を硫酸バリウムで吸着させて得られる硫酸バリウム吸着血漿を用いることが好ましい。硫酸バリウム吸着血漿は、血漿（好ましくはウシ血漿）に硫酸バリウムを添加混合後、硫酸バリウムを除去することにより調製することができる。
【００３６】
さらに、測定用試薬はカルシウムイオンを含有することが好ましい。カルシウムイオン源としては、通常、塩化カルシウム、乳酸カルシウムやグルコン酸カルシウム等から選ばれる。
【００３７】
さらに、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＰＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＢＩＳＴＲＩＳ、Ｇｌｙｃｉｎｅなどの群から選ばれる緩衝液を、ｐＨ５〜９、最終濃度約１０〜１００ｍＭとなるように含有していてもよい。
【００３８】
〔組換えウシ組織因子の製造方法〕
本発明に係るＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用組換えウシ組織因子の製造方法は、ウシ組織因子をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程；前記カイコにおいて、前記ｃＤＮＡから組換えウシ組織因子を発現させる工程を含む。
【００３９】
本発明で用いられるｃＤＮＡは、ウシ組織因子の可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインをコードすることができる塩基配列を有するものである。好ましくはウシ組織因子の可溶性ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインをコードすることができる塩基配列を有するｃＤＮＡである。このようなｃＤＮＡとしては、具体的には配列番号２で示されるアミノ酸配列（ＡＡＢ２０７５５）又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列をコードすることができる塩基配列が好ましく用いられ、より具体的には、クローンテック社のｃＤＮＡライブラリー等から入手できるウシ組織因子のｃＤＮＡを用いることができる。
【００４０】
上述したようなウシ組織因子ｃＤＮＡを、バキュロウィルスへ組み込んで、組換えバキュロウィルスを作成する。
ここで、バキュロウィルスとしては、好ましくは核多角体病ウィルス（ＮＰＶ：ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）が用いられる。ＮＰＶに感染した細胞では、ウィルス粒子とは直接関係していない多角体タンパク質のみを多量に合成しはじめる。従って、多角体プロモータの下流に、この多角体タンパク質をコードする遺伝子に代えて、ウシ組織因子のｃＤＮＡを挿入すると、ウシ組織因子を感染細胞内で多量に合成させることができる。
【００４１】
さらに、バキュロウィルスとしては、ウィルスが産生するシステインプロテアーゼによるタンパク質分解の影響を避けるため、システインプロテアーゼ遺伝子を人為的に欠損したバキュロウィルスが好ましく用いられる。
【００４２】
バキュロウィルスに、目的のウシ組織因子のｃＤＮＡを挿入する方法としては、従来より公知の組換え技術を用いることができる。例えば、多角体タンパク質コード遺伝子を適当な制限酵素で切断除去したバキュロウィルスと、ウシ組織因子ｃＤＮＡライブラリーから同制限酵素を用いて切断して得られたウシ組織因子のｃＤＮＡ断片とを、常法にしたがって連結することにより、ウシ組織因子ｃＤＮＡが挿入されたバキュロウィルスの組換え体を得ることができる。尚、必要に応じて、多角体タンパク質コード遺伝子だけでなく、さらにシステインプロテアーゼ遺伝子の一部又は全部を適当な制限酵素で切断除去したバキュロウィルスを用いてもよい。
【００４３】
次に、作成した組換えバキュロウィルスを、カイコに感染させる。カイコの種類は特に限定しないが、裸蛹系統のカイコが好ましく用いられる。裸蛹系統のカイコは、繭形成にかかる遺伝子が変異したもので、蛹化はしても繭をつくらない。このような裸蛹系統のカイコとしては例えば、Ｎｄ系、Ｎｄｂ系、Ｎｄ−ｓ系、Ｎｄ−ｔ系等のカイコが知られている。
【００４４】
また、上述したようなカイコの蛹を用いることが好ましい。蛹は、カイコ幼虫の消化管に存在する、食物（桑）を分解するためのセリンプロテアーゼの活性が、カイコ虫体に比べてはるかに低いからである。これにより、カイコ内で発現されたタンパク質の分解を防止することができる。また、カイコ蛹は、バキュロウィルスに対する感受性が幼虫に比べても高く、容易に個体内でウィルスが増殖し、大量の組織因子の発現が可能となるからである。
【００４５】
感染方法としては、蛹に組換えバキュロウィルスを含有するウィルス液を注入する注射法、針に微量のウィルス液を塗布し蛹に接種する微量接種法等を適用することができる。あるいは、組換えバキュロウィルスをカイコ培養細胞にコトランスフェクトし、次いでコトランスフェクトされたカイコ培養細胞を所定期間培養して組換えバキュロウィルスを増殖させ、増殖した組換えバキュロウィルスをカイコに接種することにより行なっても良い。
【００４６】
カイコ蛹への組換えウィルスの接種は、組換えバキュロウィルスに感染したカイコを５〜１０日間飼育することにより行なうことができる。飼育中に、カイコ体内で、組換えバキュロウィルスに挿入されたｃＤＮＡが発現して、組換えウシ組織因子が産生され、カイコ体液中に分泌される。ここでカイコ体液中で分泌される組換えウシ組織因子は、配列番号２のアミノ酸配列で示されるタンパク質がさらに翻訳後のプロセッシングによりＮ末端が切断されたもので、配列番号１で示されるものである。所定期間の飼育後、生産された組換えウシ組織因子を、カイコから抽出する。
【００４７】
組換えウシ組織因子のカイコからの抽出は、組換えウシ組織因子を発現したカイコを破砕して得られる破砕物を含む溶液から、固形成分を除去することにより、前記組換えウシ組織因子を含む溶液を採取することにより行なう。
【００４８】
カイコ又はカイコの蛹の破砕は、ミキサー、ホモジナイザー、ブレンダーなどを用いて機械的に破砕すればよい。破砕に際しては、例えば、適当な緩衝液を加えて行なうことが好ましい。緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして破砕物を含む溶液を得る。
【００４９】
破砕物を含む溶液から固形成分を除去して固形成分除去液を得る。固形成分の除去は、濾過、遠心分離、又はこれらを適宜組み合わせて行なうことができる。固形成分除去液としては、具体的には、破砕物を含む溶液を濾過することにより得られる濾液、破砕物を含む溶液を遠心分離することにより得られる上清などが挙げられる。そして、このような固形成分除去液を、組換えウシ組織因子を含む溶液（組換えウシ組織因子含有液）として用いることができる。なお、得られた固形成分除去液には、組換えウシ組織因子とともに、遺伝子導入に使用したバキュロウィルスも含まれている。ゆえに、固形成分除去液に界面活性剤を加えてウィルスを不活化し、それを組換えウシ組織因子含有液として使用することが好ましい。
【００５０】
上記界面活性剤としては、ノニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤のいずれを用いてもよいが、殺ウィルス性の観点からノニオン系界面活性剤を用いることが好ましい。また、ノニオン系界面活性剤の添加は、固形成分除去液に含まれている組換えウシ組織因子の可溶化にも役立つ。組換えウシ組織因子を界面活性剤で、固形成分除去液に可溶化することで、最終的に得られる組換えウシ組織因子含有液の透明度を向上させたり、含有される組換えウシ組織因子の富化を図ることができる。
【００５１】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用組換えウシ組織の製造方法は、さらに、上述した固形成分除去液を、ＨＥＰＥＳ等の緩衝液（ｐＨ６〜７）等を外液として、透析してもよい。また、上述した固形成分除去液を、硫酸アンモニウム等を用いて塩析してもよい。透析、塩析を適宜組み合わせることで、組換えウシ組織因子が濃縮された組換えウシ組織因子含有液が得ることができ、ひいては不純物の含有量が少ない組換えウシ組織因子含有液を得ることができる。さらに、組換えウシ組織因子含有液における組換えウシ組織因子の富化のために、上述した固形成分除去液を、カイコ個体由来のタンパク質に特異的な抗体などを固相に結合させたカラムクロマトグラフィーに通してもよい。また、ヒスチジンタグなどのアフィニティタグを利用して、組換えウシ組織因子を精製してもよい。これらを組み合わせることによって、純度９５％以上のウシ組織因子を製造することが可能となる。
【００５２】
ここで、ヒスチジンタグによる精製を利用する場合、遺伝子組換えに使用するウシ組織因子のｃＤＮＡのＣ末端又はＮ末端にヒスチジンをコードするヌクレオチドを連結させておき、カイコにおいて、ヒスチジンタグが連結した組換えウシ組織因子を発現させればよい。
【００５３】
本発明のウシ組織因子の製造方法によれば、ウシ大脳から抽出されるウシ組織因子と同等の生物活性、凝固活性を有する。しかも製造現場において、ＢＳＥをはじめとする危険がない。さらに、製造の生産設備や生産コストの点においても、従来の生産方法と比べて低減することができる。また、本発明の製造方法で得られるウシ組織因子含有液は、可溶化された透明度の高いものであることから、光学的手法を利用して凝固時間を測定するのに用いられるＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬に好適に用いることができる。
【００５４】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法〕
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法は、ウシ組織因子をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程；前記カイコにおいて、前記ｃＤＮＡから組換えウシ組織因子を発現させる工程；前記組換えウシ組織因子を抽出する工程；及び前記組換えウシ組織因子とリン脂質とを混合して、ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程を含む。要するに、本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法は、上記組換えウシ組織因子の製造方法により得られた組換えウシ組織因子とリン脂質とを混合して、ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させ、さらに、当該試薬に必要な成分を適宜添加混合する方法である。
【００５５】
ウシ組織因子−リン脂質複合体の形成は、常法に準じて行なうことができ（Methods Enzymol.,２２２，ｐ１７３，１９９３などを参照）、好ましくは、上記組換えウシ組織因子製造方法により得られた組換えウシ組織因子含有液とリン脂質溶液とを、ニッケル存在下で混合することにより行なう。
【００５６】
組換えウシ組織因子含有液としては、組換えウシ組織因子の製造方法にもよるが、上述したような、破砕物を含む溶液から固形成分を除去しただけの固形成分除去液を使用してもよいし、さらに、当該固形成分除去液から界面活性剤による処理、透析、塩析、クロマトグラフィ等を行なって得られる高純度の組換えウシ組織因子含有液を用いてもよい。
【００５７】
リン脂質溶液としては、複合体化に使用するリン脂質、すなわち炭素数１２〜２２の脂肪酸又は不飽和脂肪酸を有するリン脂質が好ましく用いられる。具体的には、前述のウシ組織因子−リン脂質複合体で例示したリン脂質を用いることができる。組換えウシ組織因子含有液とリン脂質液とのモル比率が約１：１０〜２×１０７の範囲、より好ましくは１：３０００〜１５０００の範囲で使用するのが好ましい。
【００５８】
ニッケルとしては、通常、塩化ニッケル、硫酸ニッケル等のニッケル塩水溶液、あるいは緩衝液にニッケル塩を溶解させてなる溶液が用いられる。
リン脂質との複合体化は、以上のような組換えウシ組織因子含有液、リン脂質溶液、ニッケル塩溶液を混合攪拌し、１〜２時間ほど反応させればよい。複合体形成後、透析等を行なうことにより、ウシ組織因子−リン脂質複合体を富化してもよい。
【００５９】
製造しようとするＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬が、第Ｉ因子及び第Ｖ因子を含有する場合には、第Ｉ因子及び第Ｖ因子を添加する。第Ｉ因子及び第Ｖ因子の添加に代えて、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子及びＸ因子を除去した血漿を用いてもよい。当該血漿としては、血漿、好ましくはウシ血漿を硫酸バリウムで吸着させて得られる硫酸バリウム吸着血漿を用いてもよい。硫酸バリウム吸着血漿の調製は、特に限定しないが、例えば、Charlesら「One-stage Prothrombin Time techniques (Thrombosis and Bleeding Disorders Theory and Method, 1971, p92-97）」に記載されているOwrenらの方法により調製できる。
【００６０】
また、製造しようとするＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬がカルシウムイオンを含有する場合には、カルシウムイオン源として、塩化カルシウム、乳酸カルシウムやグルコン酸カルシウム等を添加する。
【００６１】
さらに必要に応じて、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＰＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＢＩＳＴＲＩＳ、Ｇｌｙｃｉｎｅなどの群から選ばれる緩衝液を、ｐＨ５〜９、最終濃度約１０〜１００ｍＭとなるように添加してもよい。
【００６２】
必要に応じて添加される第Ｉ因子及び第Ｖ因子（又は硫酸バリウム吸着血漿など）、カルシウムイオン源、緩衝剤は、ウシ組織因子−リン脂質複合体形成前に添加してもよいし、同複合体形成後に添加してもよい。また、第Ｉ因子及び第Ｖ因子、カルシウムイオン源、緩衝剤の添加順序も特に限定しない。
【００６３】
以上のようにして製造されるＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、保存安定性の観点から、通常凍結乾燥して保存され、使用時に精製水又は適当な緩衝液で溶解して使用する。
【実施例】
【００６４】
〔組換えウシ組織因子の製造〕
ウシ大脳のｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社）を、非特許文献１の方法に基づいて、ＰＣＲによりウシ組織因子の遺伝子を増幅させ、ウシ組織因子の可溶性ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインをコードする完全長のウシ組織因子コード遺伝子をクローニングした。ＰＣＲ法での増幅に際しては、ｆｏｒｗａｒｄプライマーとしてＢｇＩＩＩ切断配列を有するプライマー（５’−ａｇａｔｃｔａｔｇｇｃｇａｃｃｃｃｃａａｃｇｇｇｃｃ）を使用し、ｂａｃｋｗａｒｄプライマーとしてＥｃｏＲＩ切断配列を有するプライマー（５’−ａｃｔｔａａｇａａｔａｃｇｔｃｇｃａａｃｔｃｇｃｃｇｃ）を使用した。クローニングした遺伝子の塩基配列を、シーケンサー（４２００型、ライカ）で調べたところ、配列番号２のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡであることが確認できた。
【００６５】
クローニングしたｃＤＮＡを、システインプロテアーゼ欠損ウィルス（片倉工業、ｐＹＮＧ）のクローニングサイトに挿入して、ウシ組織因子組換えバキュロウィルス発現系を樹立させた。
【００６６】
ウシ組織因子組換えバキュロウィルスを、カイコの蛹にウィルス感染させ、５℃下で７日間放置し、十分に感染させた。感染後のカイコの蛹は−３０℃で一昼夜凍結保存された。なお、クローニングしたウシ組織因子のｃＤＮＡのバキュロウィルスへの挿入からカイコ蛹へのバキュロウィルスの感染までの工程は、片倉工業（株）の「Ｓｕｐｅｒｗｏｒｍ」サービスを利用した。
【００６７】
凍結保存された感染後のカイコ蛹を、片倉工業（株）より入手した。カイコ蛹１匹あたりに、緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭベンザミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＤＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．５）１０ｍＬを加えて、氷冷下、ポリトロンホモジナイザー（回転数１２０００ｒｐｍ、５分間）を用いてカイコ蛹を破砕し、破砕物を含む溶液（破砕液）を得た。この破砕液を滅菌したガーゼで濾過することにより、破砕液から固形成分を除去した後、さらに、テフロンホモジナイザー（アズワン、回転数５０００ｒｐｍで１０ストローク）を用いて破砕した。得られた破砕液を遠心分離（３０００×ｇ、８℃、１０分）し、上清を回収し、この上清を固形成分除去液とした。固形成分除去液８容量に対して、１０％ＮＰ−４０界面活性剤（カルビオケム）を２容量加えて、３０℃で３時間インキュベートして、バキュロウィルスを不活性化するとともに、組換えウシ組織因子を可溶化させた。
【００６８】
バキュロウィルスの不活性化の確認は、界面活性剤で処理された固形成分除去液のウィルス力価を、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ，Ｈ．：Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｙｇ．，２７，４９３（１９３８））に基づいて、顕微鏡で目視により９６穴のウィルス感染の有無を観察することにより行なった。
【００６９】
界面活性剤で処理された固形成分除去液を遠心分離（３０００×ｇ、８℃、３０分）して、リポタンパク質や脂質分画が除去された上清を得た。次に、得られた上清を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２））を用いて透析（透析膜用セルロースチューブ、三光純薬（株））を行なった。透析後、透析チューブ内の溶液に、３０％飽和濃度となるまで硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離して上清を回収した。続いて、この上清に、飽和濃度６０％となるまで硫酸アンモニウムを添加して、組換えウシ組織因子を含む沈殿を生成させた。沈殿が生成した溶液を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２、１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有）で透析（透析膜：透析膜用セルロースチューブ、三光純薬（株））し、透析後の透析チューブ内の溶液を回収し、これを組換えウシ組織因子含有液とした。得られた組換えウシ組織因子含有液の組換えウシ組織因子の純度を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により調べたところ、約７０％であった。この組換えウシ組織因子含有液を、さらにセファクリルＳ２００ゲルクロマトグラフィに供して、最終的に、組換えウシ組織因子の純度が約９５％の組換えウシ組織因子含有液を得た。
【００７０】
〔ウシ組織因子−リン脂質複合体の作製〕
０．２５％デオキシコール酸ナトリウムＤＯＣ（２０ｍＬ）にベイシス大豆レシチン０．４ｇ（日清製油（株））を溶解する。ローテータで室温下、完全に溶解させ、これに１，２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）０．１ｇ及び１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）０．３ｇ（Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ、Ｉｎｃ．）を懸濁させてリン脂質溶液を調製した。
【００７１】
このリン脂質溶液３７．５ｍＬに、０．５Ｍ塩化ニッケル溶液を５ｍＬ、１０ｍＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）２．５ｍＬ、上記で精製した組換えウシ組織因子含有溶液２．５ｍＬを添加し、ボルテックスで３０秒間攪拌した。攪拌後、ＢＲＡＮＳＯＮ＃２２１０型超音波装置で、３７℃、１５分間反応させた後、３７℃、１時間放置した。この溶液を透析膜（透析用セルロースチューブ、三光純薬（株））に移して、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム含有）で透析を３回行ない、透析後の透析チューブ内の溶液をウシ組織因子−リン脂質複合体含有液として得た。
【００７２】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の調製〕
（１）硫酸バリウム吸着血漿の調製
クエン酸を添加したウシ血漿に、ウシ血漿の３０ｗ／ｖ％量の硫酸バリウム、及びウシ血漿の２０ｖ／ｖ％量の生理食塩水を、６０分間ローテータで攪拌した。この混合液を、４℃、５０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した後、上清を回収した。この上清に、当該上清の３０ｗ／ｖ％の硫酸バリウムを少しずつ添加混合して、硫酸バリウムに血漿中のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子を吸着させた。その後、遠心分離して上清を回収した。その上清を、透析チューブ（透析用セルロースチューブ、三光純薬（株））にいれ、生理食塩水を外液として、２〜８℃で透析を行なった。透析後の透析チューブ内の溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過した濾液を、硫酸バリウム吸着血漿として、以下の試薬の調製に用いた。
【００７３】
（２）ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の調製
上記で調製したウシ組織因子−リン脂質複合体含有液と、硫酸バリウム吸着血漿と、４０ｍＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、４ｍＭの乳酸カルシウム含有）とを１：２：１の比率で混合して攪拌し、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬を調整した。
【００７４】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の凝固活性〕
上記調製方法に基づいて、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬を３ロット調製した（試薬ロットＮｏ．１〜３）。この測定用試薬（試薬ロットＮｏ．１〜３）を用いて、２種類の正常血漿（正常血漿１，２）、５種類のワルファリン投与血漿（ワルファリン血漿１〜５）の凝固活性（％）を、全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））を用いて、測定した。
尚、活性値（％）の算出に用いる検量線の作成には、血液凝固試験用標準ヒト血漿（シスメックス（株））を用いた。また、正常血漿には、コアグトロールＮ（シスメックス（株））及びコアグトロールＩ（シスメックス（株））を用い、ワルファリン投与患者血漿は、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｕｍａｄｉｎ Ｓｅｔ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）を用いた。さらに、対照試薬には、ウシ組織因子−リン脂質複合体として天然ウシ大脳トロンボプラスチンを用いた市販品のトロンボテスト試薬である複合因子Ｔ「コクサイ」（シスメックス（株））を用いた。
結果を表１に示す。
【００７５】
【表１】
【００７６】
表１から、正常血漿及びワルファリン血漿のいずれに対しても、本実施例の測定用試薬は、天然のウシ脳組織トロンボプラスチンを用いた測定試薬と同程度の凝固活性を示すことが確認できた。
【００７７】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の感度〕
上記で調製したＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬（調製ロットＮｏ．１〜３）及び既知ＩＳＩ値が算出されている対照試薬（複合因子Ｔ「コクサイ」）について、予めＥＱＵＳＴＡサーベイサンスでＩＮＲ表示値が決定された４種類のＡＫキャリブラント（ＡＫ−Ａ、ＡＫ−Ｂ、ＡＫ−Ｃ、ＡＫ−Ｄ、いずれもＩｍｍｕｎｏ社）の凝固時間（秒）及び国際標準感度指標（ＩＳＩ値）を、全自動血衛凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））で測定した。結果を表２に示す。
【００７８】
【表２】
【００７９】
試薬ロットＮｏ．１〜３のいずれも、キャリブラントＡＫ−Ａ〜ＡＫ−Ｄについて、対照試薬と同程度の凝固時間、感度を示すことが確認できた。
【００８０】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の検査精度（再現性）〕
上記で調製したＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬（試薬ロットＮｏ．１〜３）及び対照試薬（複合因子Ｔ「コクサイ」）を用いて、ワルファリン投与患者血漿の凝固時間を、全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））で、１０回ずつ測定し、測定値のばらつきを調べた。各試薬を用いた場合の凝固時間（測定値及び平均値）、標準偏差、ＣＶ値を、表３に示す。
【００８１】
【表３】
【００８２】
表３からわかるように、本発明の測定用試薬は、１０回の測定のばらつきは、従来の対照試薬と同程度であり、従来の対照試薬に匹敵する測定精度（再現性）を有することが確認できた。
【００８３】
〔従来の対照試薬との活性の相関性〕
正常血漿及びワルファリン投与患者血漿（Ｎ＝１９８）について、上記で調製で調製したＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬及び対照試薬（複合因子Ｔ「コクサイ」（シスメックス（株））の凝固活性（％）を、全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））で測定した。各血漿試料について、対照試薬を用いたときの活性値と本実施例の測定用試薬を用いたときの活性値の関係を図１に示す。図１中、横軸は、対照試薬を用いて測定したときの活性値（％）を示しており、縦軸は本実施例の測定用試薬を用いて測定したときの活性値（％）を示している。
【００８４】
図１から明らかなように、組換えウシ組織因子−リン脂質複合体を用いた本実施例のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の活性値（％）と従来の対照試薬の活性値（％）との間には高い相関性があることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、従来の天然ウシ組織大脳由来の組織因子を用いた同因子測定用試薬と同程度の凝固性能、測定精度を有しているので、従来のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の代替品として利用できる。
しかも、本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、カイコを宿主として産生した遺伝子組換えウシ組織因子を用いているので、従来の天然ウシ組織大脳からの抽出作業を要する試薬の製造方法と比べて、安全で、簡便化されるので、生産コストの低減化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本実施例のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬と対照試薬との凝固特性についての相関性を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外因系の血液凝固検査に用いられる、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬、具体的には組換えウシ組織因子を含有するＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬、及び当該試薬に用いられる組換えウシ組織因子、並びに組換えウシ組織因子及び当該ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中のＩＩ因子、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、及びＸ因子の凝固能を総合的に調べる検査は、トロンボテストとも呼ばれている。この検査に用いられる試薬は、主要成分として、ウシ脳組織トロンボプラスチン、フィブリノゲン及び第Ｖ因子、カルシウム、リン脂質を含有している。
【０００３】
主要成分のウシ脳組織トロンボプラスチンは、非特許文献１のＦｉｇ．３で示されているように、Ｎ末端から２１３番目までの細胞外ドメイン（可溶性ドメイン）と２１４番目から２３６番目までの膜貫通ドメインと２３７番目から２５７番目までの細胞内ドメインからなる全アミノ酸２５７個の組織因子とよばれるタンパク質に、リン脂質が結合した複合体である。このような構成を有するトロンボプラスチンは、従来より、ウシ大脳を原料として、アセトン粉末あるいは生理食塩水を用いてトロンボプラスチンを抽出することにより製造される。
【０００４】
原料として用いられるウシ大脳は狂牛病（ＢＳＥ）の高度感染部位の１つであることから、近年、製造現場において、原料として、ウシの大脳を使用しない製造方法が求められている。また、天然のウシ脳より抽出された粗製のトロンボプラスチンを含んだ試薬では、季節の変動、ロット間の変動が問題となる。また、天然のウシ大脳から抽出されたトロンボプラスチンを含む試薬には、トロンボプラスチン以外にもウシ大脳由来の成分が不純物として含まれている。そして、この不純物の影響により試薬の安定性が悪く不溶性物質が析出してくるという問題がある。さらに、ウシの血液由来の他の凝固因子も、不純物として含むため、測定対象の凝固因子に対して感度不足になるという問題がある。さらにまた、天然のウシ大脳から抽出されたトロンボプラスチンを含む試薬では、上述した不純物が試薬自体の濁りを引き起こす原因となる。試薬自体に濁りが生じた場合、凝固に伴う測定用試料の濁度等の光学的特性の変化の検出感度が低くなるため、光学的特性を測定して凝固時間を算出する測定器では、脂質の含有量が多い検体など、使用する検体によっては、正確な凝固時間を測定できないといった問題もある。
【０００５】
上記のような問題解決のために、遺伝子組換え技術により生産された組換え組織因子を使用することが検討されている。
ここで、組換え組織因子及びこれを用いた試薬に関する技術としては、以下のようなものが報告されている。
【０００６】
例えば、特許文献１（特開平５−２１９９５７）には、ヒトの遺伝子組換え組織因子を大腸菌で発現させ、得られた組換えヒト組織因子を用いて、プロトロンビン時間測定試薬を調製することが提案されている。ここでは、組織因子高発現セルラインとしてＲＥＴ−１ＣＥＬＬを選択し、発現ベクターとしてはファルマシア社から販売されているｐＫＫ２３３−２を使用し、ヒト組織因子としてアミノ酸１−２１９番配列のｃＤＮＡを発現させた実施例が記載されている。また、発現ベクターとして、動物細胞（ＣＨＯ細胞）を用いた実施例も開示されている。しかしながら、ここで得られたヒト組織因子は、いずれも可溶性ドメインにとどまり、膜貫通ドメインを含む完全長の組織因子ではない。また、得られたヒト組織因子は、ベクターとして大腸菌を用いた場合、大腸菌を破壊し、ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーでタンパク質を抽出したものについて、血液凝固因子に対する結合アッセイを測定するにとどまり、プロトロンビン時間測定試薬の調製までは行なわれていない。同様に、発現ベクターとして動物細胞を用いた実施例では、上清を回収し、濃縮して得られた組織因子について、同様に血液凝固因子との結合アッセイを測定するに留まっている。すなわち、得られた組換えヒト組織因子の適用については、いずれも血液凝固因子に対する結合アッセイに留まり、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬への適用は開示されていない。
【０００７】
また、特許文献２（特表平６−５０５５６２）に、ヒトの遺伝子組換え組織因子を大腸菌で発現させ、ヒト組織因子に対して指向性の固定化モノクローナル抗体上でのアフィニティクロマトグラフィを用いて精製した組換えヒト組織因子をプロトロンビン試薬に適用したことが開示されている。ここでは、Ｎｅｍｅｒｓｏｎ及びＰａｂｒｏｓｋｙの方法にしたがって、完全長並びに切断した組換え分子を使用できると記載され、実施例においても完全長組換えヒト組織因子及び切断組換え組織因子が開示されている。ここでは、得られた組換えヒト組織因子を用いて、リン脂質で脂質化することにより、トロンボプラスチン試薬を調製し、調製した試薬を用いて凝固時間を測定している。しかしながら、得られた組換えヒト組織因子を、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬へ適用することについては開示されていない。
【０００８】
ウサギ組織因子については、Cheryl L Brucatolらが、非特許文献２（「Expression of recombinant rabbit tissue factor in Pichia pastoris，and its application in a prothrombin time reagent（Protein Expression and purification，26(2002)，386-393））において、組換えウサギ組織因子（ｒＴＦ）を酵母で発現させ、ヒスチジンタグを利用して精製し、得られた組換えウサギ組織因子をプロトロンビン時間測定試薬に適用したことが報告されている。発現させたウサギの組織因子は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインからなる完全長のものであると報告されている。
【０００９】
同様に、特許文献３（特表平１１−５１４１０１）においても、完全長の組換えウサギ組織因子を酵母で発現させ、細胞外ドメイン、脂質結合ドメイン、細胞内ドメイン、及び組換え組織因子を選択的に富化するヒスチジンタグを利用して精製したウサギ組織因子をプロトロンビン時間測定試薬に適用したことが開示されている。
【００１０】
しかしながら、いずれも、得られた組換えウサギ組織因子を、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬へ適用することについては開示されていない。
【００１１】
また、組換え組織因子を、測定用試薬の原料として商業ベースで使用しようとする場合、大量に生産できるシステムを構築できる方法でなければならないが、上述した特許文献及び非特許文献において、大量生産可能な方法の開示はない。
【００１２】
特許文献４（特開平１１−２２５７６０）では、段落番号８で、プロトロンビン時間試薬に用いることができ、生物学的に活性な組織因子を得るためには、膜貫通ドメインを有する完全長の組織因子を得る必要があり、この点、酵母、バキュロウィルスをベクターとして用いた昆虫細胞、培養哺乳動物細胞、ヒト細胞系等の真核性システムで発現させることが原理的に適しているとする一方、これらのシステムは経費に関して問題があると説明している。そこで、前記特許文献４では、比較的大量の純粋な組織因子をパイロットプラント規模で調製するための方法として、周辺腔中に発現産物を向けるシグナル配列を含有するベクターに、完全長の組換え組織因子のｃＤＮＡを組換え、この発現ベクターをトランスフェクトさせた大腸菌を、成分を工夫した培地で培養する方法を採用することにより、プロトロンビン試薬に用いることができるような組織因子を大量に発現できたことが実施例で示されている。しかしながら、ここで用いられた組織因子が、具体的にどの生物に由来するものなのかということについては、一切記載されていない。さらに、得られた組織因子を、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬へ適用することについては開示されていない。
【００１３】
ところで、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、ＶＩＩ因子がＶＩＩａ因子に変換する反応による外因系凝固機構を利用しており、第ＶＩＩ因子に対する感受性については、ウシ組織因子が優れていることが知られている。従って、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬に用いられる組織因子は、ウシ組織因子である必要がある。
【００１４】
特許文献５（特開平１１−１６０３２０）に、組換えウサギ組織因子又はウシ組織因子を再脂質化し、ＨＥＰＥＳ−ｔｒｉｓ緩衝液、吸着血漿、カルシウムを加えて、複合因子測定試薬を得ることが提案されている。また、この特許文献５には、使用される組換えウサギ組織因子又はウシ組織因子は、慣用の遺伝子工学的手法に準じて調製することができ、また市販されている組換えウサギまたはウシ組織因子タンパク質を使用してもよいと説明されている。しかしながら、遺伝子工学的手法を用いる場合の説明としては、「例えば、ウサギ組織因子又はウシ組織因子をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主に組み込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体を培養後、その培養物（培養上清、培養細胞等）を慣用の蛋白質精製法に準じて精製することにより目的とする組換えウサギ組織因子又はウシ組織因子を得ることができる。宿主細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる」（段落番号７)との開示にとどまり、大量生産可能な方法については、記載されていない。尚、特許文献５に開示されているペルフリーズ社の市販品では、完全長の組換えウサギ組織因子が用いられている。
【００１５】
実際のところ、遺伝子工学の技法を用いることにより、宿主に挿入されたｃＤＮＡ配列を翻訳したタンパク質を生産することはできるものの、翻訳後のＮ末端、Ｃ末端切断等の翻訳後プロセッシング、糖鎖修飾、アミド化等の二次修飾、タンパク質のフォールディングなどについても宿主の影響を受けるため、生産されたタンパク質が天然のタンパク質と同等の生理活性を有していないといった問題がしばしば起る。さらに、生産性の点においても、宿主の影響は避けられず、実用化できる組換え組織因子の生産という観点においては、宿主の選択がかなり重要となる。
【００１６】
組換えウシ組織因子を具体的に生産した報告としては、１９９２年生化学会で、重松欣克（九州大学、理学部）により、酵母を用いた発現系で、ウシ可溶性リコビナントの調製が報告されているだけである。この報告によれば、高榎ら（ＢＢＲＣ．１８１．１１４５−１１５０，１９９０年）がクローニングしたウシ組織因子のｃＤＮＡを用い、可溶性ヒト組織因子の発現に用いた方法に従って、ｐＡＭ８２にウシ組織因子の細胞外ドメイン（１−２１３）を挿入した発現ベクターを構築し、発現させたとある（非特許文献５）。重松欣克（九州大学、理学部）らは、ウシ組織因子の発現に先だって、酵母及び大腸菌を用いて、ヒト組織因子の発現を試み、全長のヒト組織因子ＤＮＡを大腸菌ｒｅｃＡプロモータ下流に挿入したが、発現された組織因子は十分な活性を示さなかったこと、抑制性Ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅプロモータと酵母インベルターゼのシグナル配列の下流に、成熟組織因子に対応するＤＮＡを挿入し、酵母ＡＨ２２株を形質転換し、発現させた結果、活性ある組織因子が得られたと報告している。つまり、ヒトの遺伝子の組換え組織因子を大腸菌や酵母で発現させたところ、大腸菌では発現活性がでなかったが、酵母発現系を用いることにより、比活性が高い、可溶性ヒト組織因子の大量調製に成功したと報告している（非特許文献３，非特許文献４）。
【００１７】
以上のように、ウサギ組織因子、ヒト組織因子では、大腸菌、酵母、動物培養細胞系で発現できた実施例が報告されているが、ウシ組織因子では実際に発現させた例としては、重松欣克（九州大学、理学部）の報告がある程度であり、しかも可溶性ドメインだけの発現にとどまっているので、凝固活性は不十分であり、トロンボテスト用試薬に用いることはできない。さらに、遺伝子組換えの手法により、目的とする活性を有する組織因子を実用化できる大量生産レベルで成功したとの報告は、せいぜい、ヒト組織因子を酵母で生産する系、ヒト組織因子を大腸菌で生産する系、ウサギ組織因子を酵母で生産する系程度である。ましてや、組換えウシ組織因子については、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬に用いることができる程度のものを実用化できるレベルで生産されたとの報告は見あたらない。
【００１８】
【特許文献１】特開平５−２１９９５７
【特許文献２】特表平６−５０５５６２（特許第３４１６７７８号）
【特許文献３】特開平１１−５１４１０１（特許第３２４６７４９号
【特許文献４】特開平１１−２２５７６０
【特許文献５】特開平１１−１６０３２０
【非特許文献１】Yuko Takayenokiら「cDNA and amino acid sequences of bovine tissue factor (Biochemical and Biophysical Research Communications, 181(1991), 1145-1150)」
【非特許文献２】Cheryl L Brucatolら「Expression of recombinant rabbit tissue factor in Pichia pstoris，and its application in a prothrombin time reagent（Protein Expression and purification，26(2002)，386-393）
【非特許文献３】生化学、第６２巻、１９９０年生化学会講演要旨、演題番号３２５
【非特許文献４】生化学、第６３巻、１９９１年生化学会講演要旨、演題番号１２５９
【非特許文献５】生化学、第６４巻、１９９２年生化学会講演要旨、演題番号２３５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、天然ウシ脳由来抽出物のトロンボプラスチン（組織因子−リン脂質複合体）の代替えとなることができる十分な活性を有し、しかも実用化できる規模の大量生産が可能な組換えウシ組織因子及びこれを用いたＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬、並びにこれらの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子は、少なくとも可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを含むもの、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列からなるものである。これらは、宿主としてのカイコにおいて発現された組換えウシ組織因子であることが好ましい。
【００２１】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子複合体は、上記本発明の組換えウシ組織因子とリン脂質とからなる複合体である。
【００２２】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、上記本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子複合体を含有するものである。
【００２３】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子の製造方法は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加、又は欠失したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程；前記カイコにおいて、前記ｃＤＮＡから組換えウシ組織因子を発現させる工程；及び前記組換えウシ組織因子を抽出する工程；を含む。
【００２４】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加、又は欠失したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程；前記カイコにおいて、前記ｃＤＮＡから組換えウシ組織因子を発現させる工程；前記組換えウシ組織因子を抽出する工程；及び前記組換えウシ組織因子とリン脂質とを混合して、ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程；を含む。
【００２５】
前記ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程において、前記組換えウシ組織因子と前記リン脂質とが、ニッケル存在下で混合されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の組換えウシ組織因子は、少なくともＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子との反応に必要な部分を含むように、遺伝子組換えにより生産したものであり、本発明の組換えウシ組織因子複合体は、当該組換えウシ組織因子とのリン脂質複合体であるから、従来の天然のウシ大脳からの抽出により生産されるウシのトロンボプラスチンと比べて、不純物の混入が少なく、またロット間でのばらつきが少なく品質が安定している。従って、本発明の組換えウシ組織因子を用いたＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、従来の天然のウシトロンボプラスチンを用いる測定試薬に匹敵する測定感度を有している。しかもカイコを宿主として用いた系では大量生産が可能で、従来の天然物からの抽出法よりも生産性に優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
〔組換えウシ組織因子〕
本発明に係るＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ測定用組換えウシ組織因子は、リン脂質と複合体化することによりヒト血液中のＶＩＩ因子を活性化するものであり、少なくとも天然のウシ組織因子の可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを有する。組換えウシ組織因子の可溶性ドメインはＶＩＩ因子と相互作用するのに必要なドメインであり、膜貫通ドメインはリン脂質との複合体を形成するのに必要なドメインである。
【００２８】
ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ測定用組換えウシ組織因子としては、好ましくは、リン脂質との複合体を形成してＶＩＩ因子を活性化する能力を損なわない範囲で、可溶性ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを有するものである。具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうちの１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したものでＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子と反応活性を示すものである。
【００２９】
ここで、配列番号１は、非特許文献１のＦｉｇ．３に示されている正常ウシ組織因子のアミノ酸配列であり、１番アミノ酸から２１３番アミノ酸までが可溶性ドメイン（細胞外ドメイン）に該当し、２１４番アミノ酸から２３６番目までが膜貫通ドメインに該当し、２３７番目から２５７番目までが細胞内ドメインに該当する。
【００３０】
本発明に係るＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用組換えウシ組織因子においては、糖鎖の有無は特に限定しないが、例えば、後述する製造方法により製造される組換えウシ組織因子の場合には、糖鎖がついている。
【００３１】
〔ウシ組織因子−リン脂質複合体〕
本発明のウシ組織因子−リン脂質複合体は、上述した組換えウシ組織因子とリン脂質とからなる複合体で、天然のウシ組織トロンボプラスチン（リン脂質複合体型の天然ウシ組織因子）と同程度の血液凝固活性を有するものである。このような複合体は、組換えウシ組織因子とリン脂質とを、例えば、ニッケル存在下で混合することにより、製造することができる。
【００３２】
複合体化に用いられるリン脂質は、一般に１２〜２２の炭素原子を有する脂肪酸を含有するリン脂質であり、当該脂肪酸は飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のいずれであってもよい。好ましいリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンなどが例示される。これらのリン脂質は、天然物、合成品のいずれであってもよく、異なる種類の脂肪酸を有するリン脂質であってもよい。さらに、これらのリン脂質は、所望する性状、特性などに応じて２種以上を混合して複合体の形成に用いてもよい。
【００３３】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬〕
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬とは、外因系の血液凝固検査に用いられる試薬で、血中の第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子及びＸ因子の凝固能を総合的に調べることができる試薬のことをいう。
【００３４】
ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、上記本発明の組換えウシ組織因子−リン脂質複合体を含有するもので、具体的には、後述の製造方法により生産された組換えウシ組織因子をリン脂質で複合体化させてなるウシ組織因子−リン脂質複合体を含有する。
【００３５】
さらに、測定用試薬は、第Ｉ因子及び第Ｖ因子を含有することが好ましい。第Ｉ因子及び第Ｖ因子の添加に代えて、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子及びＸ因子を除去した血漿を用いてもよい。当該血漿としては、血漿、好ましくはウシ血漿を硫酸バリウムで吸着させて得られる硫酸バリウム吸着血漿を用いることが好ましい。硫酸バリウム吸着血漿は、血漿（好ましくはウシ血漿）に硫酸バリウムを添加混合後、硫酸バリウムを除去することにより調製することができる。
【００３６】
さらに、測定用試薬はカルシウムイオンを含有することが好ましい。カルシウムイオン源としては、通常、塩化カルシウム、乳酸カルシウムやグルコン酸カルシウム等から選ばれる。
【００３７】
さらに、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＰＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＢＩＳＴＲＩＳ、Ｇｌｙｃｉｎｅなどの群から選ばれる緩衝液を、ｐＨ５〜９、最終濃度約１０〜１００ｍＭとなるように含有していてもよい。
【００３８】
〔組換えウシ組織因子の製造方法〕
本発明に係るＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用組換えウシ組織因子の製造方法は、ウシ組織因子をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程；前記カイコにおいて、前記ｃＤＮＡから組換えウシ組織因子を発現させる工程を含む。
【００３９】
本発明で用いられるｃＤＮＡは、ウシ組織因子の可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインをコードすることができる塩基配列を有するものである。好ましくはウシ組織因子の可溶性ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインをコードすることができる塩基配列を有するｃＤＮＡである。このようなｃＤＮＡとしては、具体的には配列番号２で示されるアミノ酸配列（ＡＡＢ２０７５５）又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列をコードすることができる塩基配列が好ましく用いられ、より具体的には、クローンテック社のｃＤＮＡライブラリー等から入手できるウシ組織因子のｃＤＮＡを用いることができる。
【００４０】
上述したようなウシ組織因子ｃＤＮＡを、バキュロウィルスへ組み込んで、組換えバキュロウィルスを作成する。
ここで、バキュロウィルスとしては、好ましくは核多角体病ウィルス（ＮＰＶ：ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）が用いられる。ＮＰＶに感染した細胞では、ウィルス粒子とは直接関係していない多角体タンパク質のみを多量に合成しはじめる。従って、多角体プロモータの下流に、この多角体タンパク質をコードする遺伝子に代えて、ウシ組織因子のｃＤＮＡを挿入すると、ウシ組織因子を感染細胞内で多量に合成させることができる。
【００４１】
さらに、バキュロウィルスとしては、ウィルスが産生するシステインプロテアーゼによるタンパク質分解の影響を避けるため、システインプロテアーゼ遺伝子を人為的に欠損したバキュロウィルスが好ましく用いられる。
【００４２】
バキュロウィルスに、目的のウシ組織因子のｃＤＮＡを挿入する方法としては、従来より公知の組換え技術を用いることができる。例えば、多角体タンパク質コード遺伝子を適当な制限酵素で切断除去したバキュロウィルスと、ウシ組織因子ｃＤＮＡライブラリーから同制限酵素を用いて切断して得られたウシ組織因子のｃＤＮＡ断片とを、常法にしたがって連結することにより、ウシ組織因子ｃＤＮＡが挿入されたバキュロウィルスの組換え体を得ることができる。尚、必要に応じて、多角体タンパク質コード遺伝子だけでなく、さらにシステインプロテアーゼ遺伝子の一部又は全部を適当な制限酵素で切断除去したバキュロウィルスを用いてもよい。
【００４３】
次に、作成した組換えバキュロウィルスを、カイコに感染させる。カイコの種類は特に限定しないが、裸蛹系統のカイコが好ましく用いられる。裸蛹系統のカイコは、繭形成にかかる遺伝子が変異したもので、蛹化はしても繭をつくらない。このような裸蛹系統のカイコとしては例えば、Ｎｄ系、Ｎｄｂ系、Ｎｄ−ｓ系、Ｎｄ−ｔ系等のカイコが知られている。
【００４４】
また、上述したようなカイコの蛹を用いることが好ましい。蛹は、カイコ幼虫の消化管に存在する、食物（桑）を分解するためのセリンプロテアーゼの活性が、カイコ虫体に比べてはるかに低いからである。これにより、カイコ内で発現されたタンパク質の分解を防止することができる。また、カイコ蛹は、バキュロウィルスに対する感受性が幼虫に比べても高く、容易に個体内でウィルスが増殖し、大量の組織因子の発現が可能となるからである。
【００４５】
感染方法としては、蛹に組換えバキュロウィルスを含有するウィルス液を注入する注射法、針に微量のウィルス液を塗布し蛹に接種する微量接種法等を適用することができる。あるいは、組換えバキュロウィルスをカイコ培養細胞にコトランスフェクトし、次いでコトランスフェクトされたカイコ培養細胞を所定期間培養して組換えバキュロウィルスを増殖させ、増殖した組換えバキュロウィルスをカイコに接種することにより行なっても良い。
【００４６】
カイコ蛹への組換えウィルスの接種は、組換えバキュロウィルスに感染したカイコを５〜１０日間飼育することにより行なうことができる。飼育中に、カイコ体内で、組換えバキュロウィルスに挿入されたｃＤＮＡが発現して、組換えウシ組織因子が産生され、カイコ体液中に分泌される。ここでカイコ体液中で分泌される組換えウシ組織因子は、配列番号２のアミノ酸配列で示されるタンパク質がさらに翻訳後のプロセッシングによりＮ末端が切断されたもので、配列番号１で示されるものである。所定期間の飼育後、生産された組換えウシ組織因子を、カイコから抽出する。
【００４７】
組換えウシ組織因子のカイコからの抽出は、組換えウシ組織因子を発現したカイコを破砕して得られる破砕物を含む溶液から、固形成分を除去することにより、前記組換えウシ組織因子を含む溶液を採取することにより行なう。
【００４８】
カイコ又はカイコの蛹の破砕は、ミキサー、ホモジナイザー、ブレンダーなどを用いて機械的に破砕すればよい。破砕に際しては、例えば、適当な緩衝液を加えて行なうことが好ましい。緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして破砕物を含む溶液を得る。
【００４９】
破砕物を含む溶液から固形成分を除去して固形成分除去液を得る。固形成分の除去は、濾過、遠心分離、又はこれらを適宜組み合わせて行なうことができる。固形成分除去液としては、具体的には、破砕物を含む溶液を濾過することにより得られる濾液、破砕物を含む溶液を遠心分離することにより得られる上清などが挙げられる。そして、このような固形成分除去液を、組換えウシ組織因子を含む溶液（組換えウシ組織因子含有液）として用いることができる。なお、得られた固形成分除去液には、組換えウシ組織因子とともに、遺伝子導入に使用したバキュロウィルスも含まれている。ゆえに、固形成分除去液に界面活性剤を加えてウィルスを不活化し、それを組換えウシ組織因子含有液として使用することが好ましい。
【００５０】
上記界面活性剤としては、ノニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤のいずれを用いてもよいが、殺ウィルス性の観点からノニオン系界面活性剤を用いることが好ましい。また、ノニオン系界面活性剤の添加は、固形成分除去液に含まれている組換えウシ組織因子の可溶化にも役立つ。組換えウシ組織因子を界面活性剤で、固形成分除去液に可溶化することで、最終的に得られる組換えウシ組織因子含有液の透明度を向上させたり、含有される組換えウシ組織因子の富化を図ることができる。
【００５１】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用組換えウシ組織の製造方法は、さらに、上述した固形成分除去液を、ＨＥＰＥＳ等の緩衝液（ｐＨ６〜７）等を外液として、透析してもよい。また、上述した固形成分除去液を、硫酸アンモニウム等を用いて塩析してもよい。透析、塩析を適宜組み合わせることで、組換えウシ組織因子が濃縮された組換えウシ組織因子含有液が得ることができ、ひいては不純物の含有量が少ない組換えウシ組織因子含有液を得ることができる。さらに、組換えウシ組織因子含有液における組換えウシ組織因子の富化のために、上述した固形成分除去液を、カイコ個体由来のタンパク質に特異的な抗体などを固相に結合させたカラムクロマトグラフィーに通してもよい。また、ヒスチジンタグなどのアフィニティタグを利用して、組換えウシ組織因子を精製してもよい。これらを組み合わせることによって、純度９５％以上のウシ組織因子を製造することが可能となる。
【００５２】
ここで、ヒスチジンタグによる精製を利用する場合、遺伝子組換えに使用するウシ組織因子のｃＤＮＡのＣ末端又はＮ末端にヒスチジンをコードするヌクレオチドを連結させておき、カイコにおいて、ヒスチジンタグが連結した組換えウシ組織因子を発現させればよい。
【００５３】
本発明のウシ組織因子の製造方法によれば、ウシ大脳から抽出されるウシ組織因子と同等の生物活性、凝固活性を有する。しかも製造現場において、ＢＳＥをはじめとする危険がない。さらに、製造の生産設備や生産コストの点においても、従来の生産方法と比べて低減することができる。また、本発明の製造方法で得られるウシ組織因子含有液は、可溶化された透明度の高いものであることから、光学的手法を利用して凝固時間を測定するのに用いられるＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬に好適に用いることができる。
【００５４】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法〕
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法は、ウシ組織因子をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程；前記カイコにおいて、前記ｃＤＮＡから組換えウシ組織因子を発現させる工程；前記組換えウシ組織因子を抽出する工程；及び前記組換えウシ組織因子とリン脂質とを混合して、ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程を含む。要するに、本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法は、上記組換えウシ組織因子の製造方法により得られた組換えウシ組織因子とリン脂質とを混合して、ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させ、さらに、当該試薬に必要な成分を適宜添加混合する方法である。
【００５５】
ウシ組織因子−リン脂質複合体の形成は、常法に準じて行なうことができ（Methods Enzymol.,２２２，ｐ１７３，１９９３などを参照）、好ましくは、上記組換えウシ組織因子製造方法により得られた組換えウシ組織因子含有液とリン脂質溶液とを、ニッケル存在下で混合することにより行なう。
【００５６】
組換えウシ組織因子含有液としては、組換えウシ組織因子の製造方法にもよるが、上述したような、破砕物を含む溶液から固形成分を除去しただけの固形成分除去液を使用してもよいし、さらに、当該固形成分除去液から界面活性剤による処理、透析、塩析、クロマトグラフィ等を行なって得られる高純度の組換えウシ組織因子含有液を用いてもよい。
【００５７】
リン脂質溶液としては、複合体化に使用するリン脂質、すなわち炭素数１２〜２２の脂肪酸又は不飽和脂肪酸を有するリン脂質が好ましく用いられる。具体的には、前述のウシ組織因子−リン脂質複合体で例示したリン脂質を用いることができる。組換えウシ組織因子含有液とリン脂質液とのモル比率が約１：１０〜２×１０７の範囲、より好ましくは１：３０００〜１５０００の範囲で使用するのが好ましい。
【００５８】
ニッケルとしては、通常、塩化ニッケル、硫酸ニッケル等のニッケル塩水溶液、あるいは緩衝液にニッケル塩を溶解させてなる溶液が用いられる。
リン脂質との複合体化は、以上のような組換えウシ組織因子含有液、リン脂質溶液、ニッケル塩溶液を混合攪拌し、１〜２時間ほど反応させればよい。複合体形成後、透析等を行なうことにより、ウシ組織因子−リン脂質複合体を富化してもよい。
【００５９】
製造しようとするＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬が、第Ｉ因子及び第Ｖ因子を含有する場合には、第Ｉ因子及び第Ｖ因子を添加する。第Ｉ因子及び第Ｖ因子の添加に代えて、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子及びＸ因子を除去した血漿を用いてもよい。当該血漿としては、血漿、好ましくはウシ血漿を硫酸バリウムで吸着させて得られる硫酸バリウム吸着血漿を用いてもよい。硫酸バリウム吸着血漿の調製は、特に限定しないが、例えば、Charlesら「One-stage Prothrombin Time techniques (Thrombosis and Bleeding Disorders Theory and Method, 1971, p92-97）」に記載されているOwrenらの方法により調製できる。
【００６０】
また、製造しようとするＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬がカルシウムイオンを含有する場合には、カルシウムイオン源として、塩化カルシウム、乳酸カルシウムやグルコン酸カルシウム等を添加する。
【００６１】
さらに必要に応じて、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＰＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＢＩＳＴＲＩＳ、Ｇｌｙｃｉｎｅなどの群から選ばれる緩衝液を、ｐＨ５〜９、最終濃度約１０〜１００ｍＭとなるように添加してもよい。
【００６２】
必要に応じて添加される第Ｉ因子及び第Ｖ因子（又は硫酸バリウム吸着血漿など）、カルシウムイオン源、緩衝剤は、ウシ組織因子−リン脂質複合体形成前に添加してもよいし、同複合体形成後に添加してもよい。また、第Ｉ因子及び第Ｖ因子、カルシウムイオン源、緩衝剤の添加順序も特に限定しない。
【００６３】
以上のようにして製造されるＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、保存安定性の観点から、通常凍結乾燥して保存され、使用時に精製水又は適当な緩衝液で溶解して使用する。
【実施例】
【００６４】
〔組換えウシ組織因子の製造〕
ウシ大脳のｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社）を、非特許文献１の方法に基づいて、ＰＣＲによりウシ組織因子の遺伝子を増幅させ、ウシ組織因子の可溶性ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインをコードする完全長のウシ組織因子コード遺伝子をクローニングした。ＰＣＲ法での増幅に際しては、ｆｏｒｗａｒｄプライマーとしてＢｇＩＩＩ切断配列を有するプライマー（５’−ａｇａｔｃｔａｔｇｇｃｇａｃｃｃｃｃａａｃｇｇｇｃｃ）を使用し、ｂａｃｋｗａｒｄプライマーとしてＥｃｏＲＩ切断配列を有するプライマー（５’−ａｃｔｔａａｇａａｔａｃｇｔｃｇｃａａｃｔｃｇｃｃｇｃ）を使用した。クローニングした遺伝子の塩基配列を、シーケンサー（４２００型、ライカ）で調べたところ、配列番号２のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡであることが確認できた。
【００６５】
クローニングしたｃＤＮＡを、システインプロテアーゼ欠損ウィルス（片倉工業、ｐＹＮＧ）のクローニングサイトに挿入して、ウシ組織因子組換えバキュロウィルス発現系を樹立させた。
【００６６】
ウシ組織因子組換えバキュロウィルスを、カイコの蛹にウィルス感染させ、５℃下で７日間放置し、十分に感染させた。感染後のカイコの蛹は−３０℃で一昼夜凍結保存された。なお、クローニングしたウシ組織因子のｃＤＮＡのバキュロウィルスへの挿入からカイコ蛹へのバキュロウィルスの感染までの工程は、片倉工業（株）の「Ｓｕｐｅｒｗｏｒｍ」サービスを利用した。
【００６７】
凍結保存された感染後のカイコ蛹を、片倉工業（株）より入手した。カイコ蛹１匹あたりに、緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭベンザミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＤＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．５）１０ｍＬを加えて、氷冷下、ポリトロンホモジナイザー（回転数１２０００ｒｐｍ、５分間）を用いてカイコ蛹を破砕し、破砕物を含む溶液（破砕液）を得た。この破砕液を滅菌したガーゼで濾過することにより、破砕液から固形成分を除去した後、さらに、テフロンホモジナイザー（アズワン、回転数５０００ｒｐｍで１０ストローク）を用いて破砕した。得られた破砕液を遠心分離（３０００×ｇ、８℃、１０分）し、上清を回収し、この上清を固形成分除去液とした。固形成分除去液８容量に対して、１０％ＮＰ−４０界面活性剤（カルビオケム）を２容量加えて、３０℃で３時間インキュベートして、バキュロウィルスを不活性化するとともに、組換えウシ組織因子を可溶化させた。
【００６８】
バキュロウィルスの不活性化の確認は、界面活性剤で処理された固形成分除去液のウィルス力価を、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ，Ｈ．：Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｙｇ．，２７，４９３（１９３８））に基づいて、顕微鏡で目視により９６穴のウィルス感染の有無を観察することにより行なった。
【００６９】
界面活性剤で処理された固形成分除去液を遠心分離（３０００×ｇ、８℃、３０分）して、リポタンパク質や脂質分画が除去された上清を得た。次に、得られた上清を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２））を用いて透析（透析膜用セルロースチューブ、三光純薬（株））を行なった。透析後、透析チューブ内の溶液に、３０％飽和濃度となるまで硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離して上清を回収した。続いて、この上清に、飽和濃度６０％となるまで硫酸アンモニウムを添加して、組換えウシ組織因子を含む沈殿を生成させた。沈殿が生成した溶液を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２、１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有）で透析（透析膜：透析膜用セルロースチューブ、三光純薬（株））し、透析後の透析チューブ内の溶液を回収し、これを組換えウシ組織因子含有液とした。得られた組換えウシ組織因子含有液の組換えウシ組織因子の純度を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により調べたところ、約７０％であった。この組換えウシ組織因子含有液を、さらにセファクリルＳ２００ゲルクロマトグラフィに供して、最終的に、組換えウシ組織因子の純度が約９５％の組換えウシ組織因子含有液を得た。
【００７０】
〔ウシ組織因子−リン脂質複合体の作製〕
０．２５％デオキシコール酸ナトリウムＤＯＣ（２０ｍＬ）にベイシス大豆レシチン０．４ｇ（日清製油（株））を溶解する。ローテータで室温下、完全に溶解させ、これに１，２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）０．１ｇ及び１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）０．３ｇ（Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ、Ｉｎｃ．）を懸濁させてリン脂質溶液を調製した。
【００７１】
このリン脂質溶液３７．５ｍＬに、０．５Ｍ塩化ニッケル溶液を５ｍＬ、１０ｍＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）２．５ｍＬ、上記で精製した組換えウシ組織因子含有溶液２．５ｍＬを添加し、ボルテックスで３０秒間攪拌した。攪拌後、ＢＲＡＮＳＯＮ＃２２１０型超音波装置で、３７℃、１５分間反応させた後、３７℃、１時間放置した。この溶液を透析膜（透析用セルロースチューブ、三光純薬（株））に移して、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム含有）で透析を３回行ない、透析後の透析チューブ内の溶液をウシ組織因子−リン脂質複合体含有液として得た。
【００７２】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の調製〕
（１）硫酸バリウム吸着血漿の調製
クエン酸を添加したウシ血漿に、ウシ血漿の３０ｗ／ｖ％量の硫酸バリウム、及びウシ血漿の２０ｖ／ｖ％量の生理食塩水を、６０分間ローテータで攪拌した。この混合液を、４℃、５０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した後、上清を回収した。この上清に、当該上清の３０ｗ／ｖ％の硫酸バリウムを少しずつ添加混合して、硫酸バリウムに血漿中のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子を吸着させた。その後、遠心分離して上清を回収した。その上清を、透析チューブ（透析用セルロースチューブ、三光純薬（株））にいれ、生理食塩水を外液として、２〜８℃で透析を行なった。透析後の透析チューブ内の溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過した濾液を、硫酸バリウム吸着血漿として、以下の試薬の調製に用いた。
【００７３】
（２）ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の調製
上記で調製したウシ組織因子−リン脂質複合体含有液と、硫酸バリウム吸着血漿と、４０ｍＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、４ｍＭの乳酸カルシウム含有）とを１：２：１の比率で混合して攪拌し、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬を調整した。
【００７４】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の凝固活性〕
上記調製方法に基づいて、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬を３ロット調製した（試薬ロットＮｏ．１〜３）。この測定用試薬（試薬ロットＮｏ．１〜３）を用いて、２種類の正常血漿（正常血漿１，２）、５種類のワルファリン投与血漿（ワルファリン血漿１〜５）の凝固活性（％）を、全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））を用いて、測定した。
尚、活性値（％）の算出に用いる検量線の作成には、血液凝固試験用標準ヒト血漿（シスメックス（株））を用いた。また、正常血漿には、コアグトロールＮ（シスメックス（株））及びコアグトロールＩ（シスメックス（株））を用い、ワルファリン投与患者血漿は、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｕｍａｄｉｎ Ｓｅｔ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）を用いた。さらに、対照試薬には、ウシ組織因子−リン脂質複合体として天然ウシ大脳トロンボプラスチンを用いた市販品のトロンボテスト試薬である複合因子Ｔ「コクサイ」（シスメックス（株））を用いた。
結果を表１に示す。
【００７５】
【表１】
【００７６】
表１から、正常血漿及びワルファリン血漿のいずれに対しても、本実施例の測定用試薬は、天然のウシ脳組織トロンボプラスチンを用いた測定試薬と同程度の凝固活性を示すことが確認できた。
【００７７】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の感度〕
上記で調製したＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬（調製ロットＮｏ．１〜３）及び既知ＩＳＩ値が算出されている対照試薬（複合因子Ｔ「コクサイ」）について、予めＥＱＵＳＴＡサーベイサンスでＩＮＲ表示値が決定された４種類のＡＫキャリブラント（ＡＫ−Ａ、ＡＫ−Ｂ、ＡＫ−Ｃ、ＡＫ−Ｄ、いずれもＩｍｍｕｎｏ社）の凝固時間（秒）及び国際標準感度指標（ＩＳＩ値）を、全自動血衛凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））で測定した。結果を表２に示す。
【００７８】
【表２】
【００７９】
試薬ロットＮｏ．１〜３のいずれも、キャリブラントＡＫ−Ａ〜ＡＫ−Ｄについて、対照試薬と同程度の凝固時間、感度を示すことが確認できた。
【００８０】
〔ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の検査精度（再現性）〕
上記で調製したＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬（試薬ロットＮｏ．１〜３）及び対照試薬（複合因子Ｔ「コクサイ」）を用いて、ワルファリン投与患者血漿の凝固時間を、全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））で、１０回ずつ測定し、測定値のばらつきを調べた。各試薬を用いた場合の凝固時間（測定値及び平均値）、標準偏差、ＣＶ値を、表３に示す。
【００８１】
【表３】
【００８２】
表３からわかるように、本発明の測定用試薬は、１０回の測定のばらつきは、従来の対照試薬と同程度であり、従来の対照試薬に匹敵する測定精度（再現性）を有することが確認できた。
【００８３】
〔従来の対照試薬との活性の相関性〕
正常血漿及びワルファリン投与患者血漿（Ｎ＝１９８）について、上記で調製で調製したＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬及び対照試薬（複合因子Ｔ「コクサイ」（シスメックス（株））の凝固活性（％）を、全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））で測定した。各血漿試料について、対照試薬を用いたときの活性値と本実施例の測定用試薬を用いたときの活性値の関係を図１に示す。図１中、横軸は、対照試薬を用いて測定したときの活性値（％）を示しており、縦軸は本実施例の測定用試薬を用いて測定したときの活性値（％）を示している。
【００８４】
図１から明らかなように、組換えウシ組織因子−リン脂質複合体を用いた本実施例のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の活性値（％）と従来の対照試薬の活性値（％）との間には高い相関性があることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、従来の天然ウシ組織大脳由来の組織因子を用いた同因子測定用試薬と同程度の凝固性能、測定精度を有しているので、従来のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の代替品として利用できる。
しかも、本発明のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬は、カイコを宿主として産生した遺伝子組換えウシ組織因子を用いているので、従来の天然ウシ組織大脳からの抽出作業を要する試薬の製造方法と比べて、安全で、簡便化されるので、生産コストの低減化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本実施例のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬と対照試薬との凝固特性についての相関性を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを含むＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列からなるＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子。
【請求項３】
宿主としてのカイコにおいて発現された組換えウシ組織因子である請求項１又は２に記載の組換えウシ組織因子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の組換えウシ組織因子とリン脂質とからなる複合体であるＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子複合体。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えウシ組織因子複合体を含有するＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬。
【請求項６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加、又は欠失したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程；
前記カイコにおいて、前記ｃＤＮＡから組換えウシ組織因子を発現させる工程；及び
前記組換えウシ組織因子を抽出する工程；
を含むＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子の製造方法。
【請求項７】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加、又は欠失したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程；
前記カイコにおいて、前記ｃＤＮＡから組換えウシ組織因子を発現させる工程；
前記組換えウシ組織因子を抽出する工程；及び
前記組換えウシ組織因子とリン脂質とを混合して、ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程；
を含むＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法。
【請求項８】
前記ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程において、
前記組換えウシ組織因子と前記リン脂質とが、ニッケル存在下で混合される請求項７に記載のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法。
【請求項１】
少なくとも可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを含むＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列からなるＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子。
【請求項３】
宿主としてのカイコにおいて発現された組換えウシ組織因子である請求項１又は２に記載の組換えウシ組織因子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の組換えウシ組織因子とリン脂質とからなる複合体であるＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子複合体。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えウシ組織因子複合体を含有するＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬。
【請求項６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加、又は欠失したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程；
前記カイコにおいて、前記ｃＤＮＡから組換えウシ組織因子を発現させる工程；及び
前記組換えウシ組織因子を抽出する工程；
を含むＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用の組換えウシ組織因子の製造方法。
【請求項７】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換、付加、又は欠失したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程；
前記カイコにおいて、前記ｃＤＮＡから組換えウシ組織因子を発現させる工程；
前記組換えウシ組織因子を抽出する工程；及び
前記組換えウシ組織因子とリン脂質とを混合して、ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程；
を含むＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法。
【請求項８】
前記ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程において、
前記組換えウシ組織因子と前記リン脂質とが、ニッケル存在下で混合される請求項７に記載のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子測定用試薬の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００８−８８１０３（Ｐ２００８−８８１０３Ａ）
【公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７０１５９（Ｐ２００６−２７０１５９）
【出願日】平成１８年９月３０日（２００６．９．３０）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月３０日（２００６．９．３０）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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