Ｌ−グルタミン酸の製造法
特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法において、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させ、Ｌ−グルタミン酸のα型結晶を析出させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられている。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている。また、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属、セラチア属に属する微生物、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）、及びエシェリヒア・コリの変異株を用いる方法等が知られている。また、本発明者らは、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントエア属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法（米国特許第６，１９７，５５９号）、及びエンテロバクター属細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法（米国特許第６，３３１，４１９号）を提案している。
【０００３】
また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−グルタミン酸の生合成酵素の活性を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝子の導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（特公平７−１２１２２８号）。また、特開昭６１−２６８１８５号公報には、コリネバクテリウム属細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有した細胞が開示されている。さらに、特開昭６３−２１４１８９号公報には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸シンターゼ遺伝子を増幅することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
【０００４】
上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められている。
【０００５】
一方、培養液中に蓄積するＬ−グルタミン酸を析出させながら発酵を行う方法が開発されている（欧州特許出願公開第１０７８９８９号）。従来、通常のＬ−グルタミン酸生産菌は酸性条件下では生育できないため、Ｌ−グルタミン酸発酵は中性で行われていた。それに対し、酸性条件下でＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物が探索され、得られた微生物（エンテロバクター・アグロメランス）を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地に培養することによって、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させることができることが知られている。
【０００６】
また、上記のような酸性条件下で生育できるＬ−グルタミン酸生産菌を、同細菌の生育を阻害する有機酸の合計含有量が前記細菌の生育を阻害しない量である培地中で培養するＬ−グルタミン酸の製造法（欧州特許出願公開第１２３３０７０号）、及び、前記細菌を微生物の生育に適した第１のｐＨで培養し、次いで微生物によるＬ−グルタミン酸の生産に適した、第１のｐＨよりも低い第２のｐＨで培養することを含むＬ−グルタミン酸の製造法（欧州特許出願公開第１２３３０６８号）が開示されている。さらに、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながらＬ−グルタミン酸を生成蓄積させる際に、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときに、培地中にＬ−グルタミン酸の結晶を存在させる操作を行う方法（欧州特許公開公開第１２３３０６９号）が開示されている。
【０００７】
ところで、Ｌ−グルタミン酸の結晶にはα型とβ型の結晶が存在する（Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．Ｔａｋｅｎｉｓｈｉ，Ｎ．Ｎａｇａｓｈｉｍａ，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，３５，９２３（１９６２）、Ｊ．Ｄ．Ｂｅｒｎａｌ，Ｚ．Ｋｒｉｓｔ．，７８，３６３（１９３１）；Ｓ．Ｈｉｒｏｋａｗａ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．，８，６３７（１９５５））。水中ではβ型結晶の方が安定であるが、α型の結晶の方が沈降性が良好であり、晶析スラリーからの結晶分離を効率的に行うことができる等、取り扱いが容易である。欧州特許公開公開第１２３３０６９号明細書に記載の方法において、Ｌ−グルタミン酸の結晶を培地中に存在させる操作を行う際にα型結晶を用いると、α型結晶を選択的に晶析させることができる。
【０００８】
また、Ｌ−グルタミン酸結晶中のβ型結晶の含量を低くする方法として、Ｌ−グルタミン酸溶液中に、フェニルアラニン、ロイシン、チロシン、シスチン、アスパラギン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、又はアラニン（特公昭３６−１７７１２号、特公昭３８−１６４５９号）、あるいは、リボ核酸、カルボキシメチルセルロース、ペクチン、ポリアクリル酸もしくはその塩、又はアルギン酸もしくはその塩（特公昭４５−１１２８６号）を添加する方法が開示されている。しかしながら、これらの方法は、Ｌ−グルタミン酸の等電点（ｐＨ３．２）で検討されたものであり、ｐＨ４．５程度のやや高いｐＨにおける効果は示されていない。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するパントエア属細菌等の微生物を用いてＬ−グルタミン酸を生産する方法であって、より改良された方法を提供することを課題とする。
【００１０】
本発明者らは、培養液中に蓄積するＬ−グルタミン酸を析出させながら発３酵を行うＬ−グルタミン酸の製造法において、Ｌ−リジンを培地中に存在させることにより、Ｌ−グルタミン酸の過溶解度を高めることができ、Ｌ−リジンの濃度が一定量以上であると、Ｌ−グルタミン酸のα型結晶が選択的に起晶することを見い出した、さらに、培地中にＬ−グルタミン酸の結晶を存在させる操作を行う場合、同操作は、培地中のＬ−グルタミン酸が、飽和濃度以上、かつ、Ｌ−グルタミン酸の自然起晶が起こる濃度よりも低いときに前記操作を行う必要があるが、Ｌ−グルタミン酸の過溶解度を高めることにより、同操作を行うタイミングを広げることができることを見い出した。
【００１１】
本発明は、上記知見に基づき完成するに至ったものであり、その要旨は以下のとおりである。
（１）特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法において、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させ、Ｌ−グルタミン酸のα型結晶を析出させることを特徴とする方法。
（２）前記微生物がパントエア属に属することを特徴とする（１）の方法。
（３）前記微生物がパントエア・アナナティスである（２）の方法。
（４）Ｌ−リジンの添加量が、９００ｍｇ／Ｌ以上である（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）Ｌ−リジンを存在させるときの培地のｐＨが３．０〜５．０である（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）Ｌ−グルタミン酸の自然起晶が起こる前に、培地中にＬ−グルタミン酸のα型結晶を存在させる操作を行うことを特徴とする（１）〜（５）のいずれかの方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
［図１］ｐＴＷＶＥＫ１０１のパントエア・アナナティス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図。
［図２］ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰＧの構築を示す図。
［図３］広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点とテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドＲＳＦ−Ｔｅｔの構築を示す図。
［図４］広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドＲＳＦＣＰＧの構築を示す図。
［図５］ｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＳＴＶＣＢの構築を示す図。
［図６］Ｌ−リジン濃度と過溶解度の関係を示す図である。
［図７］Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン添加濃度とＬ−グルタミン酸の析出結晶形の関係を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物（以下、「Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物」ともいう）を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法において、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させ、Ｌ−グルタミン酸のα型結晶を析出させることを特徴とする方法である。
【００１４】
上記Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物は、例えば、以下のようにして取得することができる。微生物を含む試料を、特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地に接種し、炭素源を代謝する菌株を選抜する。特定のｐＨとは、特に制限されないが、通常、約５．０以下、好ましくは約４．５以下、さらに好ましくは約４．３以下である。Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物はＬ−グルタミン酸を析出させながら発酵生産するのに用いられるものであるが、前記ｐＨが高すぎると、析出させるのに十分なＬ−グルタミン酸を微生物に生産させることが困難になる。したがってｐＨは前記の範囲が好ましい。
【００１５】
Ｌ−グルタミン酸を含む水溶液のｐＨを低下させると、Ｌ−グルタミン酸はγ−カルボキシル基のｐＫａ（４．２５、２５℃）付近で溶解度は著しく減少し、等電点（ｐＨ３．２）で溶解度は最も低くなり、飽和濃度を越えるＬ−グルタミン酸は析出する。培地組成によっても異なるが、通常には、Ｌ−グルタミン酸は約３０℃においては、ｐＨ３．２では１０〜２０ｇ／Ｌ、ｐＨ４．０では３０〜４０ｇ／Ｌ、ｐＨ４．７では５０〜６０ｇ／Ｌ溶解する。尚、ｐＨが一定の値を下回るとＬ−グルタミン酸を析出させる効果は頭打ちになるので、通常３．０以下にする必要はない。しかし、ｐＨが３．０以下であっても差し支えない。
【００１６】
「炭素源を代謝できる」とは、増殖できるか、あるいは増殖しなくても炭素源を消費することができることをいい、すなわち、糖類、有機酸類等の炭素源を異化することをいう。具体的には、例えば、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはおよそｐＨ４．０の液体培地中で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２〜４日間培養したときに増殖する微生物は、同培地中で炭素源を代謝できる微生物である。さらに、例えば、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはおよそｐＨ４．０の液体合成培地中で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２〜４日間培養したときに増殖せずとも、培地中の炭素源を消費する微生物は、同培地中で炭素源を代謝できる微生物である。
【００１７】
炭素源を代謝できる微生物は、上記液体培地で生育できる微生物を包含する。
「生育できる」とは、増殖できるか、あるいは増殖しなくてもＬ−グルタミン酸を生産することができることをいう。具体的には、例えば、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはおよそｐＨ４．０の液体培地中で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２〜４日間培養したときに増殖する微生物は、同培地中で生育できる微生物である。さらに、例えば、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはおよそｐＨ４．０の液体合成培地中で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２〜４日間培養したときに増殖せずとも、培地中のＬ−グルタミン酸の量を増加させる微生物は、同培地中で生育できる微生物である。
【００１８】
上記の選抜は、同じ条件で、又はｐＨもしくはＬ−グルタミン酸の濃度を変えて２回又は３回以上繰り返してもよい。また、初期の選抜は、飽和濃度より低い濃度のＬ−グルタミン酸を含む培地で行い、後の選抜を飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含む培地で行ってもよい。さらに、増殖速度に優れる菌株等、好ましい特性を有する菌株を選抜する操作を行ってもよい。
【００１９】
Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物は、上記性質に加えて、液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物である。前記液体培地のｐＨは、前記の性質を有する微生物のスクリーニングに用いた培地のｐＨと同じか、又はそれに近いｐＨであることが好ましい。通常、微生物はｐＨが低くなると高濃度のＬ−グルタミン酸に対して感受性となるため、Ｌ−グルタミン酸に対する耐性という観点からはｐＨは低くない方が好ましいが、Ｌ−グルタミン酸を析出させながら生産させるという観点からは、ｐＨは低い方が好ましい。これらの条件を満足するｐＨ条件としては、３〜５、好ましくは４〜５、より好ましくは４．０〜４．７、さらに好ましくは４．０〜４．５、特に好ましくは４．０〜４．３が挙げられる。
【００２０】
Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物又はその育種の材料としては、例えば、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリサイクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等に属する微生物が挙げられる。これらの中ではパントエア属に属する微生物が好ましい。以下、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物について、パントエア属に属する微生物を中心に説明するが、パントエア属に限られず他の属に属する微生物も同様に使用できる。
【００２１】
パントエア属に属する微生物として具体的には、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）が、好ましくはパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低ｐＨでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。
【００２２】
パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１Ｈにブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５として寄託されたが、近年１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）に再分類されている（後記実施例参照）。
【００２３】
また、後述するＡＪ１３３５５から誘導された菌株ＡＪ１３３５６、及びＡＪ１３６０１も、同様にエンテロバクター・アグロメランスとして前記寄託機関に寄託されているが、本明細書ではパントエア・アナナティスと記述する。
Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物は、元来Ｌ−グルタミン酸生産能を有していてもよいし、変異処理又は組換えＤＮＡ技術等による育種によってＬ−グルタミン酸生産能を付与、又は増強したものであってもよい。
【００２４】
Ｌ−グルタミン酸生産能は、例えば、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性を高めることによって、付与又は増強することができる。また、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることによっても、Ｌ−グルタミン酸生産能を増強することができる。
【００２５】
Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種または２種もしくは３種が好ましい。さらに、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物においては、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの３種の酵素の活性がともに高められていることが好ましい。特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＣＳは、α−ケトグルタル酸、Ｌ−グルタミン酸及びＮＡＤＨによる阻害を受けないため、好ましいものである。
【００２６】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、例えば、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードする遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿主微生物を形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨをコードする遺伝子（以下、おのおのをこの順に「ｇｌｔＡ遺伝子」、「ｐｐｃ遺伝子」、「ｇｄｈＡ遺伝子」と略する）のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性が高められる。
【００２７】
クローニングされたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、単独または任意の２種または３種の組合わせで、上記出発親株に導入される。２種または３種の遺伝子を導入する場合には、一種類のプラスミド上に２種又は３種の遺伝子がクローン化されて宿主に導入されるか、あるいは共存可能な２種類または３種類のプラスミド上に別々にクローン化されて宿主に導入される。
尚、同種の酵素をコードする遺伝子であって、由来が異なる２又は３以上の遺伝子を同一の宿主に導入してもよい。
【００２８】
上記プラスミドとしては、例えばパントエア属等に属する微生物の細胞中で自律複製可能なプラスミドであれば特に制限されないが、例えばｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００２９】
形質転換は、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８，３２６（１９７９））、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））、あるいはエレクトロポレーション法（Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．，“Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９２）等により行うことができる。
【００３０】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めることは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子を、宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。パントエア属等に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子を多コピーで導入するには、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピート等、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列が利用できる。あるいは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子をトランスポゾンに搭載して、これを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。形質転換株の細胞内のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められる。
【００３１】
コピー数を上昇させるｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子の供給源となる生物としては、ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性を有する生物ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細菌、たとえばパントエア属、エンテロバクター属、クレブシェラ属、エルビニア属、セラチア属、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例としては、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等が挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生物の染色体ＤＮＡより得ることができる。
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣもしくはＧＤＨ活性を欠失した変異株を用いてその栄養要求性を相補するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離することによって取得できる。またエシェリヒア属のこれら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。尚、エンテロバクター属又はクレブシエラ属細菌等の腸内細菌においては、同種の細菌由来のｇｌｔＡ遺伝子に比べて、コリネ型細菌由来のｇｌｔＡ遺伝子の導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に有効であることが知られている（欧州特許出願公開第０９９９２８２号）。同公報においては、本願明細書に記載のパントエア・アナナティスの菌株はエンテロバクター・アグロメランスと記載されている。
【００３２】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、上記の遺伝子増幅による以外にも、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の発現が強化されることによって達成される。例えば、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターをそれよりも強力な他のプロモーターに置換することによって発現が強化される。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターが置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子は、プラスミド上にクローニングされて宿主微生物に導入されるか、またはレペッティブＤＮＡ、インバーティッド・リピート、またはトランスポゾン等を用いて宿主微生物の染色体ＤＮＡ上に導入される。
【００３３】
また、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、染色体上のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを、それらよりも強力なプロモーターで置換する（ＷＯ８７／０３００６号、特開昭６１−２６８１８３号参照）か、またはそれぞれの遺伝子のコード配列の上流に、強力なプロモーターを挿入すること（Ｇｅｎｅ ２９，（１９８４）２３１−２４１参照）によっても達成することができる。具体的には、強力なプロモーターに置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子もしくはｇｄｈＡ遺伝子またはそれらの一部を含むＤＮＡと、染色体上の対応する遺伝子との間で相同組換えを起こさせればよい。
【００３４】
Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下、「αＫＧＤＨ」ともいう）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等がある。これらの酵素の中では、αＫＧＤＨが好ましい。
【００３５】
パントエア属等に属する微生物において、上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。
【００３６】
変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。
【００３７】
また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子（欠失型遺伝子）を作製する。次いで、この欠失型遺伝子を宿主微生物の細胞に導入し、相同組み換えを利用して染色体上の目的遺伝子を前記欠失型遺伝子に置換する（遺伝子破壊）。
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と比較することによって確認することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性は、Ｒｅｅｄらの方法（Ｌ．Ｊ．Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｂ．Ｂ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９６９，１３，ｐ．５５−６１）に従って測定することができる。
【００３８】
また、目的とする酵素によっては、変異株の表現型によって目的変異株を選択することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株は、好気的培養条件ではグルコースを含む最少培地、あるいは、酢酸やＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として含む最少培地で増殖できないか、または増殖速度が著しく低下する。ところが、同一条件でもグルコースを含む最少培地にコハク酸またはリジン、メチオニン、及びジアミノピメリン酸を添加することによって通常の生育が可能となる。これらの現象を指標としてαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の選抜が可能である。
相同組換えを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのαＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作製法は、ＷＯ９５／３４６７２号に詳述されており、他の微生物にも同様の方法を適用することができる。
【００３９】
その他、遺伝子のクローニング、ＤＮＡの切断、連結、形質転換法等の技術については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９））等に詳述されている。
【００４０】
以上のようにして得られるαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６が挙げられる。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４５として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５が付与されている。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６は、αＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニット遺伝子（ｓｕｃＡ）が破壊された結果、αＫＧＤＨ活性を欠損している。同株は、構築された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５６として寄託されたが、近年１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）に再分類されている（後記実施例参照）。
【００４１】
また、本発明に用いられる微生物の一例であるパントエア・アナナティスは、糖を含有する培地で培養を行うと、菌体外に粘液質を生成するために、操作効率がよくないことがある。したがって、このような粘液質を生成する性質を有するパントエア・アナナティスを用いる場合には、粘液質の生成量が野生株よりも低下した変異株を用いることが好ましい。変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。また、粘液質の生成量が低下した変異株は、変異処理した菌株を、糖を含む培地、例えば５ｇ／Ｌのグルコースを含むＬＢ培地プレートに撒き、プレートを約４５°傾けて培養したときに、液質が流れ落ちないようになったコロニーを選抜することによって選択することができる。
本発明において、Ｌ−グルタミン酸生産能の付与又は増強、及び上記の粘液質低生産変異等の好ましい性質の付与は、任意の順序で行うことができる。
【００４２】
上記のようなＬ−グルタミン酸生産菌の育種に用いられる遺伝子として、パントエア・アナナティスのｓｕｃＡ遺伝子の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるαＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニットのアミノ酸配列を、配列番号１及び配列番号３に示す。
【００４３】
また、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子、ｇｄｈＡ遺伝子、及びｐｐｃ遺伝子を含むプラスミドＲＳＦＣＰＧ（参考例１参照）の塩基配列を配列番号８に示す。配列番号８において、ｇｌｔＡ遺伝子、、ｇｄｈＡ遺伝子、及びｐｐｃ遺伝子のコード領域は、それぞれ塩基番号１７７０〜４８７（相補鎖によってコードされる）、２５９８〜３９４１、７８６９〜５２１８（相補鎖によってコードされる）に相当する。これらの遺伝子によってコードされるＣＳ、ＧＤＨ及びＰＥＰＣのアミノ酸配列を、配列番号９、１０、１１に示す。さらに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を含むプラスミドｐＳＴＶＣＢ（参考例１参照）の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるＣＳのアミノ酸配列を、配列番号１２及び配列番号１３に示す。
【００４４】
ＣＳ、ＧＤＨ及びＰＥＰＣは、野生型の他に、各々の酵素の活性を実質的に損なわないような１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から３０個、好ましくは、２から２０個、より好ましくは２から１０個である。
【００４５】
上記のようなＣＳ、ＧＤＨ及びＰＥＰＣと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号１２に示す塩基配列、又は配列番号８に示す塩基配列中のそれぞれのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣＳ、ＧＤＨ又はＰＥＰＣの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００４６】
プローブとして、配列番号１２に示す塩基配列、又は配列番号８の塩基配列中の各ＯＲＦ又はそれらの一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号８又は１２の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号８もしくは１２又はそれらの一部の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００４７】
遺伝子破壊に用いる欠失型ｓｕｃＡ遺伝子は、目的とする微生物の染色体ＤＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していればよい。このような相同性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
上記のようにして得られる菌株として具体的には、前記パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株から誘導されたＡＪ１３６０１株が挙げられる。同株は、ＡＪ１３３５５株からの粘液質低生産株の選択、αＫＧＤＨ遺伝子の破壊、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ、ｐｐｃ、ｇｄｈＡの各遺伝子、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子の導入、低ｐＨにおける高濃度Ｌ−グルタミン酸耐性株の選択、及び増殖度及びＬ−グルタミン酸生産能が高い株の選択によって、取得された菌株である。
【００４８】
Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地に培養することにより、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させることができる。ここで「前記微生物が生産したＬ−グルタミン酸が析出する条件」とは、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物がＬ−グルタミン酸を生成蓄積したときにＬ−グルタミン酸が析出する条件をいう。この条件のｐＨは、微生物のＬ−グルタミン酸生産能に応じて変動するが、微生物がパントエア属細菌の場合には、通常３〜５、好ましくは４．５以下、より好ましくは４以下である。
【００４９】
尚、上記のＬ−グルタミン酸が析出する条件は、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物が、飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝することができ、かつ、液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を示すことができるｐＨであることが前提となる。
【００５０】
上記条件でＬ−グルタミン酸蓄積微生物を培地で培養して、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる際に、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときに一定量以上のＬ−リジンを培地中に存在させると、α型結晶を選択的に析出させることができる。Ｌ−リジンが培地に存在しない条件でＬ−グルタミン酸蓄積微生物を培養して、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる場合は、α型結晶を確実に析出させるためには、種晶としてＬ−グルタミン酸のα型結晶を培地に存在させる必要がある。一方、本発明の方法では、培地に一定量以上のＬ−リジンを存在させることにより、種晶を添加しなくても、α型結晶を析出させることができる。
【００５１】
培地にＬ−リジンを存在させるには、例えば、培地にＬ−リジンを添加する方法が挙げられる。Ｌ−リジンは、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときに培地に添加する。一旦、β型結晶の自然起晶が生じた後にＬ−リジンを培地に添加しても、α型結晶を析出させることは困難となるからである。好ましくは、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が飽和濃度以上となった後に、Ｌ−リジンを培地に添加する。尚、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が飽和濃度未満のときにＬ−リジンを培地に添加しても差し支えない。さらに、Ｌ−グルタミン酸とともにＬ−リジンを培地に蓄積する微生物（例えばＷＯ９６／０６１８０号参照）を用い、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に蓄積させてもよい。前記「自然起晶」とは、Ｌ−グルタミン酸を生産する能力を有する微生物がＬ−グルタミン酸を蓄積することにより、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が飽和濃度を超えて自然に培地中にＬ−グルタミン酸が析出することをいう。
【００５２】
本発明において培地中に存在させるＬ−リジンの量としては、５００ｍｇ／Ｌ以上であり、通常、６００ｍｇ／Ｌ〜１５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ以上、より好ましく１５００ｍｇ／Ｌ以上である。特に、種晶を添加しない場合は、前記Ｌ−リジンの量は、９００ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ以上、より好ましく１５００ｍｇ／Ｌ以上である。
【００５３】
また、培地中にＬ−グルタミン酸の結晶を析出させる際の培地のｐＨは、通常は、Ｌ−グルタミン酸を培地に蓄積させるときのｐＨと同じでよいが、好ましくは３．０〜５．０、より好ましくは３．０〜４．９、特に好ましくは４．５〜４．９である。
【００５４】
本発明は、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させること以外は、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物を用いて、培地中でＬ−グルタミン酸を析出させながらＬ−グルタミン酸を製造する公知の方法を適用することができる（例えば、特開２００１−３３３７６９（欧州特許出願公開第１０７８９８９号）、特開２００２−２３８５９１（欧州特許出願公開第１２３３０７０号）、特開２００２−２３８５９２（欧州特許出願公開第１２３３０６８号）、特開２００２−２３８５９３（欧州特許出願公開第１２３３０６９号））。
【００５５】
例えば、本発明の方法の好ましい形態の一つは、ｐＨが５．０以下である培地であって、このｐＨでＬ−グルタミン酸蓄積微生物の生育を阻害する有機酸の合計含有量が微生物の生育を阻害しない量である培地中で培養することを含む、Ｌ−グルタミン酸の製造法において、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させる方法である（特開２００２−２３８５９１号（欧州特許出願公開第１２３３０７０号）公報参照）。この態様において、培地のｐＨで微生物の生育を阻害する有機酸は、そのｐＨの培地中に或る程度の濃度（通常には０．５ｇ／Ｌ以上）で存在するときに微生物の生育の阻害を示す有機酸を意味し、通常には、炭素数１〜３の有機酸、すなわち、蟻酸、酢酸及びプロピオン酸である。
【００５６】
有機酸の合計含有量は、好ましくは０．４ｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．３ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．２ｇ／Ｌ以下である。
本発明の方法の好ましい他の態様は、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物を、同微生物の生育に適した第１のｐＨで培養し、次いで微生物によるＬ−グルタミン酸の生産に適した、第１のｐＨよりも低い第２のｐＨで培養することを含み、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させる、Ｌ−グルタミン酸の製造法である（（特開２００２−２３８５９２号（欧州特許出願公開第１２３３０６８号）公報参照））。
【００５７】
本発明の方法の好ましい別の態様は、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物を、培地中の有機酸による微生物の生育の阻害が生じない第１のｐＨで培養し、次いで微生物によるＬ−グルタミン酸の生産に適した、第１のｐＨより低い第２のｐＨで培養することを含み、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させる、Ｌ−グルタミン酸の製造法である（特開２００２−２３８５９１号（欧州特許出願公開第１２３３０７０号）公報参照）。
【００５８】
Ｌ−グルタミン酸生産菌は、一般に、酸性条件下で有機酸による生育の阻害を受ける一方、中性条件下では有機酸を消費することができる（特開２００２−２３８５９１号（欧州特許出願公開第１２３３０７０号）公報参照）。この性質を利用して中性ｐＨで菌体生育を行い、その後ｐＨを酸性に変化させてＬ−グルタミン酸を生成させることにより、より高い生産性を得るとともに、広範な材料を糖源として使用することが可能となる。
【００５９】
この態様において、有機酸は、第２のｐＨの培地中に或る程度の濃度（通常には０．５ｇ／Ｌ以上）で存在するときに微生物の生育の阻害を示す有機酸を意味し、通常には、炭素数１〜３の有機酸、すなわち、蟻酸、酢酸及びプロピオン酸である。
第１のｐＨ及び第２のｐＨは、使用されるＬ−グルタミン酸蓄積微生物の性質に適合するように選択される。これらのｐＨは、当業者であれば容易に測定できる。例えば、培地中の有機酸による微生物の生育の阻害が生じないｐＨは、種々のｐＨに調整した有機酸含有培地でＬ−グルタミン酸蓄積微生物を培養し、吸光度などにより菌体量を測定して、その菌体量を、有機酸を含有しないこと以外は同一の条件で培養されたＬ−グルタミン酸蓄積微生物の菌体量と比較することにより決定できる。Ｌ−グルタミン酸の生産に適したｐＨは、種々のｐＨの培地でＬ−グルタミン酸蓄積微生物を培養し、培地中にＬ−グルタミン酸が蓄積されるときのｐＨをいう。具体的には、当該種々のｐＨの培地中に蓄積されたＬ−グルタミン酸量を測定して比較することにより決定できる。
【００６０】
第１のｐＨは、培地中の有機酸による微生物の成育の阻害が生じなければ特に制限はなく、通常には５．０〜８．０である。
第２のｐＨは、生産されたＬ−グルタミン酸が析出するｐＨであることが好ましく、このようなｐＨは、通常には、３．０〜５．０である。生産されたＬ−グルタミン酸が析出するｐＨで培養することにより、Ｌ−グルタミン酸の高濃度蓄積による生産性の阻害を回避できる。
【００６１】
第１のｐＨ及び第２のｐＨは、本発明の効果が得られる限り、培養中において厳密に一定の値を示す必要はなく、変動しても差し支えない。
第１のｐＨでの培養は、このｐＨであっても、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物がＬ−グルタミン酸を生産するので、生産されるＬ−グルタミン酸によるｐＨの低下が生じるため、アルカリ化物質を培地に添加することにより培地のｐＨを第１のｐＨに維持しながら行うことが好ましい。
アルカリ化物質は、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物の生育やＬ−グルタミン酸生産に悪影響を与えないものであれば特に限定されないが、アンモニアガスが好ましい。
【００６２】
第１のｐＨから第２のｐＨへの、培地のｐＨの低下は、酸性物質を培地に添加することにより行ってもよいが、上述のように、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物により生産されるＬ−グルタミン酸によるｐＨの低下が培養中に生じるので、第１のｐＨから第２のｐＨへの、培地のｐＨの低下は、アルカリ化物質の添加量を調整することにより行うことが、酸性物質の添加を省略できるので好ましい。
【００６３】
第１のｐＨでの培養は、培地中の有機酸が枯渇するまで継続すればよい。枯渇とは、有機酸の量が第２のｐＨにおける培養において、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物の生育を阻害しないレベルに低下することをいう。このような有機酸のレベルを測定することは当業者にとって容易である。例えば、第２のｐＨにおいて種々の濃度の有機酸を含む培地で培養を行い、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物の菌体量を測定して、その菌体量を、有機酸を含有しないこと以外は同一の条件で培養されたＬ−グルタミン酸蓄積微生物の菌体量と比較することにより決定できる。一般に、第２のｐＨが低くなればなるほど、有機酸のレベルも低くなる。
【００６４】
本発明の方法の好ましいさらに別の態様は、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物を、ｐＨが当該微生物によって生産されたＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させることを含む、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法において、グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときに培地中にＬ−リジンを存在させ、かつ、Ｌ−グルタミン酸の自然起晶が起こる前にＬ−グルタミン酸のα型結晶（種晶）を存在させる操作を行う方法である（特開２００２−２３８５９３号（欧州特許出願公開第１２３３０６９号）公報参照）。
【００６５】
種晶を存在させる操作は、Ｌ−グルタミン酸のβ型結晶の自然起晶が起こる前に行う。尚、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が飽和濃度に達する前に種晶を添加すると、種晶は溶解してしまうことがある。したがって、種晶は、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が飽和濃度を超えた後であって、かつ、Ｌ−グルタミン酸の自然起晶が起こる前に添加することが好ましい。本発明においては、培地にＬ−リジンを存在させ、Ｌ−グルタミン酸の自然起晶が起こる濃度を高くすることによって、種晶を添加するタイミングを広げることができる。
【００６６】
培地中にＬ−グルタミン酸のα型結晶を存在させる操作とは、人為的に培地中に結晶を存在させる操作を意味する。このような操作の例としては、培地にα型結晶を添加すること、培養開始時に或る量のＬ−グルタミン酸を培地に溶解させておき、培養途中でｐＨを下げることにより、強制的に析出させること等が挙げられる。α型結晶を培地中に存在させる量は、通常には０．０１〜１０ｇ／Ｌである。培地中のＬ−グルタミン酸の結晶の存在量やＬ−グルタミン酸の濃度は、当業者に周知の方法で測定することができる。Ｌ−グルタミン酸の結晶は、培養液を静置し、デカントにより培養液から採取して存在量を測定する。培地中のＬ−グルタミン酸の濃度とは、溶解しているＬ−グルタミン酸の濃度である。培地中に結晶が析出している場合は、遠心分離（又は濾過）により固形分を分離し、得られた清澄液のＬ−グルタミン酸濃度の測定値を指す。
【００６７】
培地中にＬ−グルタミン酸のα型結晶を存在させる操作は、好ましくは、Ｌ−グルタミン酸のα型結晶を添加することである。
好ましい結晶の添加量は、通常には０．２ｇ／Ｌ以上である。この濃度以上であると、再現性良くα型の結晶を得ることができる。α型の結晶は、その形状の点から、β型の結晶に比べて取り扱いが容易である。
【００６８】
本発明に用いる培地は、ｐＨが所定の条件に調整されること以外は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は、培養する菌株の利用可能なものならばよい。
【００６９】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００７０】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００７１】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、代謝又は生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
【００７２】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養方法は、ｐＨが所定の値、好ましくは３〜５に調整される以外は、通常には、発酵温度２０ないし４２℃での通気培養である。
【００７３】
培養終了後、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。また、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸は、公知の方法に従って採取することができる。例えば、濃縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【００７４】
飽和濃度を超えるＬ−グルタミン酸が析出する態様では、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸の濃度は一定量に保たれ、微生物が高濃度のＬ−グルタミン酸から受ける影響を低減することができる。したがって、Ｌ−グルタミン酸生産能が一層向上した微生物を育種することも可能となる。また、Ｌ−グルタミン酸は結晶として析出してくるため、Ｌ−グルタミン酸の蓄積に伴う培養液の酸性化が少なく、培養液のｐＨを維持するために使用されるアルカリの量を大幅に削減することが可能となる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００７６】
参考例１
＜１＞酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する微生物の探索
酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する微生物の探索は、以下のようにして行った。１ｇの土壌、果実、植物体、河川水などの自然界より得られたサンプルおよそ５００点を、それぞれ５ｍＬの滅菌水に懸だくし、そのうち２００μＬを塩酸にてｐＨを４．０に調製した固体培地２０ｍＬに塗布した。同培地の組成は、以下のとおりである。グルコース３ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．２ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水塩０．１ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水塩０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン四水塩０．０１ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛二水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅五水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト六水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、ビオチン５０μｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム５０μｇ／Ｌ、葉酸５０μｇ／Ｌ、イノシトール５０μｇ／Ｌ、ナイアシン５０μｇ／Ｌ、パラアミノ安息香酸５０μｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩５０μｇ／Ｌ、リボフラビン５０μｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩５０μｇ／Ｌ、シクロヘキシミド５０ｍｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ。
【００７７】
上記のサンプルを塗布した培地を、２８℃、３７℃又は５０℃にて、２〜４日間培養し、コロニーを形成する菌株を３７８株取得した。
続いて、上記のようにして得られた菌株を、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含む液体培地（塩酸にてｐＨ４．０に調整）３ｍＬを注入した長さ１６．５ｃｍ、径１４ｍｍの試験管に植菌し、２４時間〜３日間、２８℃、３７℃又は５０℃にて振とう培養を行い、増殖する菌株を選抜した。前記培地の組成は、以下のとおりである。グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン四水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛二水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅五水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト六水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム二水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ。
このようにして、酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する微生物７８株を取得することに成功した。
【００７８】
＜２＞酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する微生物からの増殖速度に優れた菌株の選抜
上記のようにして得られた、酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する種々の微生物を、Ｍ９培地（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９）に２０ｇ／Ｌのグルタミン酸と２ｇ／Ｌのグルコースを加え、ｐＨを塩酸で４．０に調整した培地３ｍＬを注入した長さ１６．５ｃｍ、径１４ｍｍの試験管に植菌し、培地の濁度を経時的に測定することによって、増殖速度の良好な菌株の選抜を行った。その結果、生育が良好な菌株として、静岡県磐田市の土壌より採取されたＡＪ１３３５５株が得られた。本菌株は、菌学的性質から、エンテロバクター・アグロメランスと判定された。エンテロバクター・アグロメランスは、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）又はパントエア・アナナティス（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）等に再分類されているものがあり、前記ＡＪ１３３５５株は、これらのうち、パントエア・アナナティスに分類されている。
【００７９】
＜３＞パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株からの粘液質低生産株の取得
パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株は糖を含有する培地で培養を行うと、菌体外に粘液質を生成するために、操作効率がよくない。そこで、粘液質低生産株の取得を、紫外線照射法（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，”Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｃｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐ．１５０，１９９２）により行った。
【００８０】
６０Ｗの紫外線ランプから６０ｃｍ離した位置で、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株に紫外線を２分間照射した後、ＬＢ培地で終夜培養して変異を固定した。変異処理した菌株を、５ｇ／Ｌのグルコースと２０ｇ／Ｌの寒天を含むＬＢ培地に、プレート当たり約１００個程度のコロニーが出現するように希釈して撒き、プレートを約４５°傾けて３０℃で終夜培養を行い、粘液質が流れ落ちないようになったコロニーを２０個選抜した。
【００８１】
選抜された株の中から、５ｇ／Ｌのグルコースと２０ｇ／Ｌの寒天を含むＬＢ培地で５回継代培養を行っても復帰変異株が出現せず、さらに、ＬＢ培地及び５ｇ／Ｌのグルコースを含むＬＢ培地ならびにＭ９培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８９））に２０ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸と２ｇ／Ｌのグルコースを加え、ｐＨを塩酸で４．５に調製した培地で親株と同等の生育を示すという条件を満たす菌株として、ＳＣ１７株を選抜した。
【００８２】
＜４＞パントエア・アナナティスＳＣ１７株からのグルタミン酸生産菌の構築
（１）パントエア・アナナティスＳＣ１７株からのαＫＧＤＨ欠損株の作製
パントエア・アナナティスＳＣ１７株から、αＫＧＤＨを欠損し、さらにＬ−グルタミン酸生合成系が強化された株を作製した。
（ｉ）パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株のαＫＧＤＨ遺伝子（以後「ｓｕｃＡＢ」という）のクローニング
【００８３】
パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株のｓｕｃＡＢ遺伝子は、エシェリヒア・コリのαＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニット遺伝子（以後「ｓｕｃＡ」という）欠損株の酢酸非資化性を相補するＤＮＡ断片を、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株染色体ＤＮＡより選択することによって、クローニングした。
【００８４】
パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株の染色体ＤＮＡは、エシェリヒア・コリにおいて通常染色体ＤＮＡを抽出するのに使用されるのと同様の方法（生物工学実験書、日本生物工学会偏、９７−９８頁、培風館、１９９２年）で単離した。ベクターとして使用したｐＴＷＶ２２８（アンピシリン耐性）は宝酒造社製の市販品を用いた。
【００８５】
ＡＪ１３３５５株の染色体ＤＮＡをＥｃｏＴ２２１で消化したもの、およびｐＴＷＶ２２８をＰｓｔＩで消化したものをＴ４リガーゼにより連結し、ｓｕｃＡ欠損のエシェリヒア・コリＪＲＧ４６５株（Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｊ．らＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９６９，１０５巻、１８２頁）を形質転換した。こうして得た形質転換株より、酢酸最少培地にて増殖する株を選択し、これよりプラスミドを抽出してｐＴＷＶＥＫ１０１と命名した。ｐＴＷＶＥＫ１０１を持つエシェリヒア・コリＪＲＧ４６５株は酢酸非資化性という形質の他にコハク酸もしくはＬ−リジンおよびＬ−メチオニンの要求性も回復していた。このことよりｐＴＷＶＥＫ１０１にはパントエア・アナナティスのｓｕｃＡ遺伝子が含まれていると考えられる。
【００８６】
ｐＴＷＶＥＫ１０１のパントエア・アナナティス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に示した。図１の斜線にて示した部分の塩基配列を決定した結果を配列番号１に示した。この配列の中には、２つの完全長のＯＲＦと、２つのＯＲＦの部分配列と思われる塩基配列が見いだされた。これらのＯＲＦまたはその部分配列がコードし得るアミノ酸配列を、５’側から順に配列番号２〜５に示す。これらのホモロジー検索をした結果、塩基配列を決定した部分は、サクシネートデヒドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイン遺伝子（ｓｄｈＢ）の３’末端側の部分配列、完全長のｓｕｃＡとαＫＧＤＨ−Ｅ２サブユニット遺伝子（ｓｕｃＢ）、サクシニルＣｏＡシンセターゼβサブユニット遺伝子（ｓｕｃＣ）の５’末端側の部分配列を含んでいることが明らかとなった。これらの塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれエシェリヒア・コリのもの（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４１，３５１−３５９（１９８４）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４１，３６１−３７４（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，６２４５−６２５２（１９８５））と比較したところ、各アミノ酸配列は非常に高い相同性を示した。また、パントエア・アナナティス染色体上でもエシェリヒア・コリと同様に（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４１，３５１−３５９（１９８４）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４１，３６１−３７４（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，６２４５−６２５２（１９８５））、ｓｄｈＢ−ｓｕｃＡ−ｓｕｃＢ−ｓｕｃＣとクラスターを構成していることが判明した。
【００８７】
（ｉｉ）パントエア・アナナティスＳＣ１７株由来のαＫＧＤＨ欠損株の取得
上記のようにして取得されたパントエア・アナナティスのｓｕｃＡＢ遺伝子を用い、相同組換えによりパントエア・アナナティスのαＫＧＤＨ欠損株の取得を行った。
【００８８】
ｐＴＷＶＥＫ１０１をＳｐｈＩで切断してｓｕｃＡを含む断片を切り出した後、クレノーフラグメント（宝酒造（株））で平滑末端化した断片を、ＥｃｏＲＩで切断しクレノーフラグメントで平滑末端化したｐＢＲ３２２（宝酒造（株））とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株））を用いて結合した。得られたプラスミドを、ｓｕｃＡのほぼ中央部分に位置する制限酵素ＢｇｌＩＩ認識部位で同酵素を用いて切断し、クレノーフラグメントで平滑末端化し、再びＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。以上の操作によって、新たに構築されたプラスミド中のｓｕｃＡにはフレームシフト変異が導入され、同遺伝子は機能しなくなると考えられた。
【００８９】
上記のようにして構築されたプラスミドを制限酵素ＡｐａＬＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行い、フレームシフト変異が導入されたｓｕｃＡ及びｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を再びＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、αＫＧＤＨ遺伝子破壊用プラスミドを構築した。
【００９０】
上記のようにして得られたαＫＧＤＨ遺伝子破壊用プラスミドを用いて、パントエア・アナナティスＳＣ１７株を、エレクトロポレーション法（Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．，“Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐ．２７９，１９９２）によって形質転換し、テトラサイクリン耐性を指標にプラスミドが相同組換えによって染色体上のｓｕｃＡが変異型に置換された菌株を取得した。取得された株をＳＣ１７ｓｕｃＡ株と命名した。
【００９１】
ＳＣ１７ｓｕｃＡ株がαＫＧＤＨ活性を欠損していることを確認するために、ＬＢ培地で対数増殖期まで培養した同株の菌体を用いて、Ｒｅｅｄらの方法（Ｌ．Ｊ．Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｂ．Ｂ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９６９，１３，ｐ．５５−６１）に従って酵素活性を測定した。その結果、ＳＣ１７株からは０．０７３（ΔＡＢＳ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク）のαＫＧＤＨ活性が検出されたのに対し、ＳＣ１７ｓｕｃＡ株ではαＫＧＤＨ活性を検出できず、目的通りｓｕｃＡが欠損していることが確かめられた。
【００９２】
（２）パントエア・アナナティスＳＣ１７ｓｕｃＡ株のＬ−グルタミン酸生合成系の強化
続いてＳＣ１７ｓｕｃＡ株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した。
【００９３】
（ｉ）エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作製
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作成の手順を、図２、３に基づいて説明する。
【００９４】
エシェリヒア・コリ由来のｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＢＲＧＤＨ（特開平７−２０３９８０号）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理で両末端を平滑末端にした後、ｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収した。一方、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子およびｐｐｃ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰ（ＷＯ９７／０８２９４号）をＸｂａＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで両末端を平滑末端にした。これに、上で精製したｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ｐＭＷＣＰに更にｇｄｈＡ遺伝子を搭載したプラスミドｐＭＷＣＰＧを得た（図２）。
【００９５】
同時に、広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点を有するプラスミドｐＶＩＣ４０（特開平８−０４７３９７号）をＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものと、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＴ１４Ｉ消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものとを混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ１０１０の複製起点及びテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドＲＳＦ−Ｔｅｔを得た（図３）。
次に、ｐＭＷＣＰＧをＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収し、ＲＳＦ−Ｔｅｔを同様にＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ＲＳＦ１０１０の複製起点を有するＤＮＡ断片を精製回収したものと混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ−Ｔｅｔ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を搭載したプラスミドＲＳＦＣＰＧを得た（図４）。得られたプラスミドＲＳＦＣＰＧがｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を発現していることは、エシェリヒア・コリのｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、あるいはｇｄｈＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の相補と各酵素活性の測定によって確認した。
【００９６】
（ｉｉ）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドは、以下のようにして構築した。コリネバクテリウム・グルタミカムのｇｌｔＡ遺伝子の塩基配列（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，１４０，１８１７−１８２８）をもとに、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するプライマーＤＮＡを用い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子断片を得た。この断片をＳｍａＩ消化したプラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）より購入）に挿入し、プラスミドｐＨＳＧＣＢを得た（図５）。次に、ｐＨＳＧＣＢをＨｉｎｄＩＩＩで切断し切り出された約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩ消化したプラスミドｐＳＴＶ２９（宝酒造（株）より購入）に挿入し、プラスミドｐＳＴＶＣＢを得た（図５）。得られたプラスミドｐＳＴＶＣＢがｇｌｔＡ遺伝子を発現していることは、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株中での酵素活性の測定によって確認した。
【００９７】
（ｉｉｉ）ＲＳＦＣＰＧ及びｐＳＴＶＣＢのＳＣ１７ｓｕｃＡ株への導入
パントエア・アナナティスＳＣ１７ｓｕｃＡ株を、ＲＳＦＣＰＧを用いてエレクトロポレーション法にて形質転換し、テトラサイクリン耐性を示す形質転換体ＳＣ１７ｓｕｃＡ／ＲＳＦＣＰＧ株を取得した。さらにＳＣ１７ｓｕｃＡ／ＲＳＦＣＰＧ株をｐＳＴＶＣＢを用いてエレクトロポレーション法にて形質転換し、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体ＳＣ１７ｓｕｃＡ／ＲＳＦＣＰＧ＋ｐＳＴＶＣＢ株を取得した。
【００９８】
＜５＞低ｐＨ環境下でＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株の取得
パントエア・アナナティスＳＣ１７ｓｕｃＡ／ＲＳＦＣＰＧ＋ｐＳＴＶＣＢ株から、低ｐＨ環境下で高濃度のＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株（以下、「低ｐＨ下高濃度Ｇｌｕ耐性株」ともいう）の分離を行った。
【００９９】
ＳＣ１７ｓｕｃＡ／ＲＳＦＣＰＧ＋ｐＳＴＶＣＢ株をＬＢＧ培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、グルコース５ｇ／Ｌ）にて３０℃一夜培養後、生理食塩水にて洗浄した菌体を適宜希釈して、Ｍ９−Ｅ培地（グルコース４ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ １ｇ／Ｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０μＭ ＣａＣｌ２、Ｌ−リジン５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン５０ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−ジアミノピメリン酸５０ｍｇ／Ｌ、テトラサイクリン２５ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール２５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸３０ｇ／Ｌ、アンモニア水にてｐＨ４．５に調整）プレートに塗布した。３２℃、２日間培養後出現したコロニーを低ｐＨ下高濃度Ｇｌｕ耐性株として取得した。
【０１００】
得られた株について、Ｍ９−Ｅ液体培地での増殖度の測定、及びＬ−グルタミン酸生産試験培地（グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン四水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛二水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅五水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト六水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム二水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン塩酸塩２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−α，ε−ジアミノピメリン酸２００ｍｇ／Ｌ、テトラサイクリン塩酸塩２５ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール２５ｍｇ／Ｌ）５ｍｌを注入した５０ｍｌ容大型試験管におけるＬ−グルタミン酸生産能の検定を実施し、増殖度が最もよく、Ｌ−グルタミン酸生産能が親株ＳＣ１７／ＲＳＦＣＰＧ＋ｐＳＴＶＣＢ株と変わらなかった株は、パントエア・アナナティスＡＪ１３６０１と命名された。ＡＪ１３６０１株は、１９９９年８月１８日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、住所 郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７５１６として寄託され、２０００年７月６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７が付与されている。
【実施例１】
【０１０１】
＜１＞Ｌ−グルタミン酸の最大飽和濃度に対するＬ−リジンの影響に関する検討
パントエア・アナナティスＡＪ１３６０１株を、テトラサイクリン塩酸塩２５ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール２５ｍｇ／Ｌを含有するＬＢＧ寒天培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ／、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ）にて３０℃で１４時間培養した菌体を１枚のプレートから掻き取り、以下に示す組成の種培養培地３００ｍｌを注入した１Ｌ容ジャーファメンターに植菌し、３４℃、ｐＨ６．０の条件で種培養を行った。
【０１０２】
〔種培養培地組成〕
シュークロース ５０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ２．０ｇ／Ｌ
酵母エキス ４．０ｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ
Ｌ−リジン塩酸塩 ０．４ｇ／Ｌ
ＤＬ−メチオニン ０．４ｇ／Ｌ
ε−ジアミノピメリン酸 ０．４ｇ／Ｌ
テトラサイクリン塩酸塩 ２５ｍｇ／Ｌ
クロラムフェニコール ２５ｍｇ／Ｌ
【０１０３】
培養中のｐＨは、６．０となるようにアンモニアガスを添加することにより調整を行った。培地中の糖の枯渇を指標に種培養を終了し、本培養培地３００ｍｌを注入した１Ｌ容ジャーファメンターに、本培養培地体積の２０％に当たる種培養液を植菌し、３４℃、ｐＨ４．５で本培養を行った。本培養培地組成は以下に示す。
【０１０４】
〔本培養培地組成〕
グルコース ５０ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５．０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ６．０ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ １．５ｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ
Ｌ−リジン塩酸塩 ０．８ｇ／Ｌ
ＤＬ−メチオニン ０．６ｇ／Ｌ
ＤＬ−α，ε−ジアミノピメリン酸 ０．６ｇ／Ｌ
テトラサイクリン塩酸塩 ２５ｍｇ／Ｌ
クロラムフェニコール ２５ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム二水塩 ０．７５ｇ／Ｌ
【０１０５】
培養中のｐＨは、ｐＨ４．５となるようにアンモニアガスを添加することにより調整を行った。培地中の糖が消費され枯渇した後は、７００ｇ／Ｌのグルコース水溶液を連続的に添加した（６ｍｌ／ｈｒ）
【０１０６】
培地中のＬ−グルタミン酸濃度が４０ｇ／Ｌを越えたところで、Ｌ−リジン塩酸塩を、培養液３００ｍｌに対し０〜０．９ｇの量で添加した。その後、培養液上清中のＬ−グルタミン酸濃度を経時的に測定した。尚、培養液上清は、培養液を１００００×Ｇで１分間遠心分離したときの上澄み液とした。一方、培養液中に析出した結晶の多形を、顕微鏡観察により判別した。培養時間が経過につれて培養液中のＬ−グルタミン酸濃度が上昇し、結晶が析出すると上清液中のＬ−グルタミン酸濃度が低下する。したがって、上清液のＬ−グルタミン酸濃度の最高到達濃度を、析出濃度とした。結果を、図６に示す。
【０１０７】
ｐＨ４．５の培養系においては、Ｌ−リジンが存在しない培養液ではＬ−グルタミン酸のβ型結晶は４４ｇ／Ｌで析出する。また、ｐＨ４．５におけるＬ−グルタミン酸の溶解度は４０ｇ／Ｌである。したがって、種晶を添加する場合は、４０ｇ／Ｌ〜４４ｇ／Ｌの範囲で種晶を添加する必要がある。この範囲は、Ｌ−グルタミン酸生産速度が５ｇ／Ｌ／ｈの培養の場合、５０分に相当し、分析誤差も考えると非常に精密な制御が要求される。これに対し、６００ｍｇ／ＬのＬ−リジンが存在する系では、β晶が析出する濃度は６２ｇ／Ｌへ上昇し、種晶添加の許容範囲は４０ｇ／Ｌ〜６２ｇ／Ｌと大きく幅が広がる。これは、Ｌ−グルタミン酸生産速度が５ｇ／Ｌ／ｈの場合、４時間に相当することになり、制御が非常に容易になる。さらにＬ−リジン濃度が上昇すると、Ｌ−グルタミン酸の過溶解度も上昇する（図６）。
【０１０８】
上記の現象は、Ｌ−リジンがＬ−グルタミン酸のα晶の結晶面に吸着し、結晶成長を阻害することに起因すると考えられる。このため、培養によるグルタミン酸濃度の上昇を吸収するだけの結晶成長（核発生を含む）を得るには、大きな過飽和度を要する。このため、Ｌ−リジン濃度の上昇に従い、過飽和度が上昇すると推定される。
【０１０９】
培地に添加するＬ−リジン濃度が９００ｍｇ／Ｌを超えると、種晶を添加しなくてもα晶が自然起晶することが見出された。これは、Ｌ−リジンにはｐＨ４．５においてα晶よりβ晶表面に強く吸着し、結晶成長を阻害する性質があるためと考えられる。このことにより、一定濃度以上のＬ−リジンの存在により、β晶の結晶成長が抑えられ、α晶が起晶、成長すると推定される。
【０１１０】
（２）Ｌ−リジンによるＬ−グルタミン酸結晶の結晶形の制御
次に、水にＬ−グルタミン酸を過飽和度（Ｃｓｓ／Ｃｓ［−］）２となるように溶解させ、ｐＨ、及び培地に添加するＬ−リジン濃度を変化させて、冷却晶析系（３４℃）で析出するＬ−グルタミン酸結晶の結晶形を調べた。ｐＨ調整は、アンモニア水を添加することで行った。また、Ｌ−リジンの代わりにＬ−フェニルアラニンを添加し、同様の実験を行った。結果を図７に示す。また、各ｐＨにおける溶解度とグルタミン酸濃度を表１に示した。
図７に示されるように、ｐＨ４．５では、Ｌ−リジンの添加によって析出する結晶型をα型に制御することが可能であることがわかった。一方、Ｌ−フェニルアラニンは、ｐＨ３．２では同様の効果があるものの、ｐＨ４．５以上ではそのような効果はみられなかった。両者における違いは、ｐＨ毎の解離状態が、アミノ酸によって異なることに起因するものと考えられる。
【０１１１】
［表１］
【産業上の利用の可能性】
【０１１２】
培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法において、培地に一定量以上のＬ−リジンを存在させることにより、種晶を添加せずにＬ−グルタミン酸のα型結晶を析出させることができる。
また、培地に種晶を添加する場合は、培地にＬ−リジンを存在させることにより、種晶を添加するタイミングの制御が容易となる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられている。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている。また、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属、セラチア属に属する微生物、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）、及びエシェリヒア・コリの変異株を用いる方法等が知られている。また、本発明者らは、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントエア属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法（米国特許第６，１９７，５５９号）、及びエンテロバクター属細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法（米国特許第６，３３１，４１９号）を提案している。
【０００３】
また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−グルタミン酸の生合成酵素の活性を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝子の導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（特公平７−１２１２２８号）。また、特開昭６１−２６８１８５号公報には、コリネバクテリウム属細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有した細胞が開示されている。さらに、特開昭６３−２１４１８９号公報には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸シンターゼ遺伝子を増幅することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
【０００４】
上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められている。
【０００５】
一方、培養液中に蓄積するＬ−グルタミン酸を析出させながら発酵を行う方法が開発されている（欧州特許出願公開第１０７８９８９号）。従来、通常のＬ−グルタミン酸生産菌は酸性条件下では生育できないため、Ｌ−グルタミン酸発酵は中性で行われていた。それに対し、酸性条件下でＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物が探索され、得られた微生物（エンテロバクター・アグロメランス）を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地に培養することによって、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させることができることが知られている。
【０００６】
また、上記のような酸性条件下で生育できるＬ−グルタミン酸生産菌を、同細菌の生育を阻害する有機酸の合計含有量が前記細菌の生育を阻害しない量である培地中で培養するＬ−グルタミン酸の製造法（欧州特許出願公開第１２３３０７０号）、及び、前記細菌を微生物の生育に適した第１のｐＨで培養し、次いで微生物によるＬ−グルタミン酸の生産に適した、第１のｐＨよりも低い第２のｐＨで培養することを含むＬ−グルタミン酸の製造法（欧州特許出願公開第１２３３０６８号）が開示されている。さらに、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながらＬ−グルタミン酸を生成蓄積させる際に、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときに、培地中にＬ−グルタミン酸の結晶を存在させる操作を行う方法（欧州特許公開公開第１２３３０６９号）が開示されている。
【０００７】
ところで、Ｌ−グルタミン酸の結晶にはα型とβ型の結晶が存在する（Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．Ｔａｋｅｎｉｓｈｉ，Ｎ．Ｎａｇａｓｈｉｍａ，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，３５，９２３（１９６２）、Ｊ．Ｄ．Ｂｅｒｎａｌ，Ｚ．Ｋｒｉｓｔ．，７８，３６３（１９３１）；Ｓ．Ｈｉｒｏｋａｗａ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．，８，６３７（１９５５））。水中ではβ型結晶の方が安定であるが、α型の結晶の方が沈降性が良好であり、晶析スラリーからの結晶分離を効率的に行うことができる等、取り扱いが容易である。欧州特許公開公開第１２３３０６９号明細書に記載の方法において、Ｌ−グルタミン酸の結晶を培地中に存在させる操作を行う際にα型結晶を用いると、α型結晶を選択的に晶析させることができる。
【０００８】
また、Ｌ−グルタミン酸結晶中のβ型結晶の含量を低くする方法として、Ｌ−グルタミン酸溶液中に、フェニルアラニン、ロイシン、チロシン、シスチン、アスパラギン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、又はアラニン（特公昭３６−１７７１２号、特公昭３８−１６４５９号）、あるいは、リボ核酸、カルボキシメチルセルロース、ペクチン、ポリアクリル酸もしくはその塩、又はアルギン酸もしくはその塩（特公昭４５−１１２８６号）を添加する方法が開示されている。しかしながら、これらの方法は、Ｌ−グルタミン酸の等電点（ｐＨ３．２）で検討されたものであり、ｐＨ４．５程度のやや高いｐＨにおける効果は示されていない。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するパントエア属細菌等の微生物を用いてＬ−グルタミン酸を生産する方法であって、より改良された方法を提供することを課題とする。
【００１０】
本発明者らは、培養液中に蓄積するＬ−グルタミン酸を析出させながら発３酵を行うＬ−グルタミン酸の製造法において、Ｌ−リジンを培地中に存在させることにより、Ｌ−グルタミン酸の過溶解度を高めることができ、Ｌ−リジンの濃度が一定量以上であると、Ｌ−グルタミン酸のα型結晶が選択的に起晶することを見い出した、さらに、培地中にＬ−グルタミン酸の結晶を存在させる操作を行う場合、同操作は、培地中のＬ−グルタミン酸が、飽和濃度以上、かつ、Ｌ−グルタミン酸の自然起晶が起こる濃度よりも低いときに前記操作を行う必要があるが、Ｌ−グルタミン酸の過溶解度を高めることにより、同操作を行うタイミングを広げることができることを見い出した。
【００１１】
本発明は、上記知見に基づき完成するに至ったものであり、その要旨は以下のとおりである。
（１）特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法において、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させ、Ｌ−グルタミン酸のα型結晶を析出させることを特徴とする方法。
（２）前記微生物がパントエア属に属することを特徴とする（１）の方法。
（３）前記微生物がパントエア・アナナティスである（２）の方法。
（４）Ｌ−リジンの添加量が、９００ｍｇ／Ｌ以上である（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）Ｌ−リジンを存在させるときの培地のｐＨが３．０〜５．０である（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）Ｌ−グルタミン酸の自然起晶が起こる前に、培地中にＬ−グルタミン酸のα型結晶を存在させる操作を行うことを特徴とする（１）〜（５）のいずれかの方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
［図１］ｐＴＷＶＥＫ１０１のパントエア・アナナティス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図。
［図２］ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰＧの構築を示す図。
［図３］広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点とテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドＲＳＦ−Ｔｅｔの構築を示す図。
［図４］広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドＲＳＦＣＰＧの構築を示す図。
［図５］ｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＳＴＶＣＢの構築を示す図。
［図６］Ｌ−リジン濃度と過溶解度の関係を示す図である。
［図７］Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン添加濃度とＬ−グルタミン酸の析出結晶形の関係を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物（以下、「Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物」ともいう）を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法において、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させ、Ｌ−グルタミン酸のα型結晶を析出させることを特徴とする方法である。
【００１４】
上記Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物は、例えば、以下のようにして取得することができる。微生物を含む試料を、特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地に接種し、炭素源を代謝する菌株を選抜する。特定のｐＨとは、特に制限されないが、通常、約５．０以下、好ましくは約４．５以下、さらに好ましくは約４．３以下である。Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物はＬ−グルタミン酸を析出させながら発酵生産するのに用いられるものであるが、前記ｐＨが高すぎると、析出させるのに十分なＬ−グルタミン酸を微生物に生産させることが困難になる。したがってｐＨは前記の範囲が好ましい。
【００１５】
Ｌ−グルタミン酸を含む水溶液のｐＨを低下させると、Ｌ−グルタミン酸はγ−カルボキシル基のｐＫａ（４．２５、２５℃）付近で溶解度は著しく減少し、等電点（ｐＨ３．２）で溶解度は最も低くなり、飽和濃度を越えるＬ−グルタミン酸は析出する。培地組成によっても異なるが、通常には、Ｌ−グルタミン酸は約３０℃においては、ｐＨ３．２では１０〜２０ｇ／Ｌ、ｐＨ４．０では３０〜４０ｇ／Ｌ、ｐＨ４．７では５０〜６０ｇ／Ｌ溶解する。尚、ｐＨが一定の値を下回るとＬ−グルタミン酸を析出させる効果は頭打ちになるので、通常３．０以下にする必要はない。しかし、ｐＨが３．０以下であっても差し支えない。
【００１６】
「炭素源を代謝できる」とは、増殖できるか、あるいは増殖しなくても炭素源を消費することができることをいい、すなわち、糖類、有機酸類等の炭素源を異化することをいう。具体的には、例えば、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはおよそｐＨ４．０の液体培地中で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２〜４日間培養したときに増殖する微生物は、同培地中で炭素源を代謝できる微生物である。さらに、例えば、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはおよそｐＨ４．０の液体合成培地中で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２〜４日間培養したときに増殖せずとも、培地中の炭素源を消費する微生物は、同培地中で炭素源を代謝できる微生物である。
【００１７】
炭素源を代謝できる微生物は、上記液体培地で生育できる微生物を包含する。
「生育できる」とは、増殖できるか、あるいは増殖しなくてもＬ−グルタミン酸を生産することができることをいう。具体的には、例えば、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはおよそｐＨ４．０の液体培地中で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２〜４日間培養したときに増殖する微生物は、同培地中で生育できる微生物である。さらに、例えば、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはおよそｐＨ４．０の液体合成培地中で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２〜４日間培養したときに増殖せずとも、培地中のＬ−グルタミン酸の量を増加させる微生物は、同培地中で生育できる微生物である。
【００１８】
上記の選抜は、同じ条件で、又はｐＨもしくはＬ−グルタミン酸の濃度を変えて２回又は３回以上繰り返してもよい。また、初期の選抜は、飽和濃度より低い濃度のＬ−グルタミン酸を含む培地で行い、後の選抜を飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含む培地で行ってもよい。さらに、増殖速度に優れる菌株等、好ましい特性を有する菌株を選抜する操作を行ってもよい。
【００１９】
Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物は、上記性質に加えて、液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物である。前記液体培地のｐＨは、前記の性質を有する微生物のスクリーニングに用いた培地のｐＨと同じか、又はそれに近いｐＨであることが好ましい。通常、微生物はｐＨが低くなると高濃度のＬ−グルタミン酸に対して感受性となるため、Ｌ−グルタミン酸に対する耐性という観点からはｐＨは低くない方が好ましいが、Ｌ−グルタミン酸を析出させながら生産させるという観点からは、ｐＨは低い方が好ましい。これらの条件を満足するｐＨ条件としては、３〜５、好ましくは４〜５、より好ましくは４．０〜４．７、さらに好ましくは４．０〜４．５、特に好ましくは４．０〜４．３が挙げられる。
【００２０】
Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物又はその育種の材料としては、例えば、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリサイクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等に属する微生物が挙げられる。これらの中ではパントエア属に属する微生物が好ましい。以下、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物について、パントエア属に属する微生物を中心に説明するが、パントエア属に限られず他の属に属する微生物も同様に使用できる。
【００２１】
パントエア属に属する微生物として具体的には、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）が、好ましくはパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低ｐＨでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。
【００２２】
パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１Ｈにブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５として寄託されたが、近年１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）に再分類されている（後記実施例参照）。
【００２３】
また、後述するＡＪ１３３５５から誘導された菌株ＡＪ１３３５６、及びＡＪ１３６０１も、同様にエンテロバクター・アグロメランスとして前記寄託機関に寄託されているが、本明細書ではパントエア・アナナティスと記述する。
Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物は、元来Ｌ−グルタミン酸生産能を有していてもよいし、変異処理又は組換えＤＮＡ技術等による育種によってＬ−グルタミン酸生産能を付与、又は増強したものであってもよい。
【００２４】
Ｌ−グルタミン酸生産能は、例えば、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性を高めることによって、付与又は増強することができる。また、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることによっても、Ｌ−グルタミン酸生産能を増強することができる。
【００２５】
Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種または２種もしくは３種が好ましい。さらに、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物においては、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの３種の酵素の活性がともに高められていることが好ましい。特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＣＳは、α−ケトグルタル酸、Ｌ−グルタミン酸及びＮＡＤＨによる阻害を受けないため、好ましいものである。
【００２６】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、例えば、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードする遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿主微生物を形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨをコードする遺伝子（以下、おのおのをこの順に「ｇｌｔＡ遺伝子」、「ｐｐｃ遺伝子」、「ｇｄｈＡ遺伝子」と略する）のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性が高められる。
【００２７】
クローニングされたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、単独または任意の２種または３種の組合わせで、上記出発親株に導入される。２種または３種の遺伝子を導入する場合には、一種類のプラスミド上に２種又は３種の遺伝子がクローン化されて宿主に導入されるか、あるいは共存可能な２種類または３種類のプラスミド上に別々にクローン化されて宿主に導入される。
尚、同種の酵素をコードする遺伝子であって、由来が異なる２又は３以上の遺伝子を同一の宿主に導入してもよい。
【００２８】
上記プラスミドとしては、例えばパントエア属等に属する微生物の細胞中で自律複製可能なプラスミドであれば特に制限されないが、例えばｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００２９】
形質転換は、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８，３２６（１９７９））、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））、あるいはエレクトロポレーション法（Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．，“Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９２）等により行うことができる。
【００３０】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めることは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子を、宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。パントエア属等に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子を多コピーで導入するには、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピート等、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列が利用できる。あるいは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子をトランスポゾンに搭載して、これを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。形質転換株の細胞内のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められる。
【００３１】
コピー数を上昇させるｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子の供給源となる生物としては、ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性を有する生物ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細菌、たとえばパントエア属、エンテロバクター属、クレブシェラ属、エルビニア属、セラチア属、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例としては、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等が挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生物の染色体ＤＮＡより得ることができる。
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣもしくはＧＤＨ活性を欠失した変異株を用いてその栄養要求性を相補するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離することによって取得できる。またエシェリヒア属のこれら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。尚、エンテロバクター属又はクレブシエラ属細菌等の腸内細菌においては、同種の細菌由来のｇｌｔＡ遺伝子に比べて、コリネ型細菌由来のｇｌｔＡ遺伝子の導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に有効であることが知られている（欧州特許出願公開第０９９９２８２号）。同公報においては、本願明細書に記載のパントエア・アナナティスの菌株はエンテロバクター・アグロメランスと記載されている。
【００３２】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、上記の遺伝子増幅による以外にも、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の発現が強化されることによって達成される。例えば、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターをそれよりも強力な他のプロモーターに置換することによって発現が強化される。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターが置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子は、プラスミド上にクローニングされて宿主微生物に導入されるか、またはレペッティブＤＮＡ、インバーティッド・リピート、またはトランスポゾン等を用いて宿主微生物の染色体ＤＮＡ上に導入される。
【００３３】
また、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、染色体上のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを、それらよりも強力なプロモーターで置換する（ＷＯ８７／０３００６号、特開昭６１−２６８１８３号参照）か、またはそれぞれの遺伝子のコード配列の上流に、強力なプロモーターを挿入すること（Ｇｅｎｅ ２９，（１９８４）２３１−２４１参照）によっても達成することができる。具体的には、強力なプロモーターに置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子もしくはｇｄｈＡ遺伝子またはそれらの一部を含むＤＮＡと、染色体上の対応する遺伝子との間で相同組換えを起こさせればよい。
【００３４】
Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下、「αＫＧＤＨ」ともいう）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等がある。これらの酵素の中では、αＫＧＤＨが好ましい。
【００３５】
パントエア属等に属する微生物において、上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。
【００３６】
変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。
【００３７】
また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子（欠失型遺伝子）を作製する。次いで、この欠失型遺伝子を宿主微生物の細胞に導入し、相同組み換えを利用して染色体上の目的遺伝子を前記欠失型遺伝子に置換する（遺伝子破壊）。
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と比較することによって確認することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性は、Ｒｅｅｄらの方法（Ｌ．Ｊ．Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｂ．Ｂ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９６９，１３，ｐ．５５−６１）に従って測定することができる。
【００３８】
また、目的とする酵素によっては、変異株の表現型によって目的変異株を選択することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株は、好気的培養条件ではグルコースを含む最少培地、あるいは、酢酸やＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として含む最少培地で増殖できないか、または増殖速度が著しく低下する。ところが、同一条件でもグルコースを含む最少培地にコハク酸またはリジン、メチオニン、及びジアミノピメリン酸を添加することによって通常の生育が可能となる。これらの現象を指標としてαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の選抜が可能である。
相同組換えを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのαＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作製法は、ＷＯ９５／３４６７２号に詳述されており、他の微生物にも同様の方法を適用することができる。
【００３９】
その他、遺伝子のクローニング、ＤＮＡの切断、連結、形質転換法等の技術については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９））等に詳述されている。
【００４０】
以上のようにして得られるαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６が挙げられる。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４５として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５が付与されている。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６は、αＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニット遺伝子（ｓｕｃＡ）が破壊された結果、αＫＧＤＨ活性を欠損している。同株は、構築された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５６として寄託されたが、近年１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）に再分類されている（後記実施例参照）。
【００４１】
また、本発明に用いられる微生物の一例であるパントエア・アナナティスは、糖を含有する培地で培養を行うと、菌体外に粘液質を生成するために、操作効率がよくないことがある。したがって、このような粘液質を生成する性質を有するパントエア・アナナティスを用いる場合には、粘液質の生成量が野生株よりも低下した変異株を用いることが好ましい。変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。また、粘液質の生成量が低下した変異株は、変異処理した菌株を、糖を含む培地、例えば５ｇ／Ｌのグルコースを含むＬＢ培地プレートに撒き、プレートを約４５°傾けて培養したときに、液質が流れ落ちないようになったコロニーを選抜することによって選択することができる。
本発明において、Ｌ−グルタミン酸生産能の付与又は増強、及び上記の粘液質低生産変異等の好ましい性質の付与は、任意の順序で行うことができる。
【００４２】
上記のようなＬ−グルタミン酸生産菌の育種に用いられる遺伝子として、パントエア・アナナティスのｓｕｃＡ遺伝子の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるαＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニットのアミノ酸配列を、配列番号１及び配列番号３に示す。
【００４３】
また、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子、ｇｄｈＡ遺伝子、及びｐｐｃ遺伝子を含むプラスミドＲＳＦＣＰＧ（参考例１参照）の塩基配列を配列番号８に示す。配列番号８において、ｇｌｔＡ遺伝子、、ｇｄｈＡ遺伝子、及びｐｐｃ遺伝子のコード領域は、それぞれ塩基番号１７７０〜４８７（相補鎖によってコードされる）、２５９８〜３９４１、７８６９〜５２１８（相補鎖によってコードされる）に相当する。これらの遺伝子によってコードされるＣＳ、ＧＤＨ及びＰＥＰＣのアミノ酸配列を、配列番号９、１０、１１に示す。さらに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を含むプラスミドｐＳＴＶＣＢ（参考例１参照）の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるＣＳのアミノ酸配列を、配列番号１２及び配列番号１３に示す。
【００４４】
ＣＳ、ＧＤＨ及びＰＥＰＣは、野生型の他に、各々の酵素の活性を実質的に損なわないような１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から３０個、好ましくは、２から２０個、より好ましくは２から１０個である。
【００４５】
上記のようなＣＳ、ＧＤＨ及びＰＥＰＣと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号１２に示す塩基配列、又は配列番号８に示す塩基配列中のそれぞれのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣＳ、ＧＤＨ又はＰＥＰＣの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００４６】
プローブとして、配列番号１２に示す塩基配列、又は配列番号８の塩基配列中の各ＯＲＦ又はそれらの一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号８又は１２の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号８もしくは１２又はそれらの一部の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００４７】
遺伝子破壊に用いる欠失型ｓｕｃＡ遺伝子は、目的とする微生物の染色体ＤＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していればよい。このような相同性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
上記のようにして得られる菌株として具体的には、前記パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株から誘導されたＡＪ１３６０１株が挙げられる。同株は、ＡＪ１３３５５株からの粘液質低生産株の選択、αＫＧＤＨ遺伝子の破壊、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ、ｐｐｃ、ｇｄｈＡの各遺伝子、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子の導入、低ｐＨにおける高濃度Ｌ−グルタミン酸耐性株の選択、及び増殖度及びＬ−グルタミン酸生産能が高い株の選択によって、取得された菌株である。
【００４８】
Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地に培養することにより、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させることができる。ここで「前記微生物が生産したＬ−グルタミン酸が析出する条件」とは、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物がＬ−グルタミン酸を生成蓄積したときにＬ−グルタミン酸が析出する条件をいう。この条件のｐＨは、微生物のＬ−グルタミン酸生産能に応じて変動するが、微生物がパントエア属細菌の場合には、通常３〜５、好ましくは４．５以下、より好ましくは４以下である。
【００４９】
尚、上記のＬ−グルタミン酸が析出する条件は、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物が、飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝することができ、かつ、液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を示すことができるｐＨであることが前提となる。
【００５０】
上記条件でＬ−グルタミン酸蓄積微生物を培地で培養して、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる際に、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときに一定量以上のＬ−リジンを培地中に存在させると、α型結晶を選択的に析出させることができる。Ｌ−リジンが培地に存在しない条件でＬ−グルタミン酸蓄積微生物を培養して、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる場合は、α型結晶を確実に析出させるためには、種晶としてＬ−グルタミン酸のα型結晶を培地に存在させる必要がある。一方、本発明の方法では、培地に一定量以上のＬ−リジンを存在させることにより、種晶を添加しなくても、α型結晶を析出させることができる。
【００５１】
培地にＬ−リジンを存在させるには、例えば、培地にＬ−リジンを添加する方法が挙げられる。Ｌ−リジンは、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときに培地に添加する。一旦、β型結晶の自然起晶が生じた後にＬ−リジンを培地に添加しても、α型結晶を析出させることは困難となるからである。好ましくは、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が飽和濃度以上となった後に、Ｌ−リジンを培地に添加する。尚、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が飽和濃度未満のときにＬ−リジンを培地に添加しても差し支えない。さらに、Ｌ−グルタミン酸とともにＬ−リジンを培地に蓄積する微生物（例えばＷＯ９６／０６１８０号参照）を用い、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に蓄積させてもよい。前記「自然起晶」とは、Ｌ−グルタミン酸を生産する能力を有する微生物がＬ−グルタミン酸を蓄積することにより、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が飽和濃度を超えて自然に培地中にＬ−グルタミン酸が析出することをいう。
【００５２】
本発明において培地中に存在させるＬ−リジンの量としては、５００ｍｇ／Ｌ以上であり、通常、６００ｍｇ／Ｌ〜１５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ以上、より好ましく１５００ｍｇ／Ｌ以上である。特に、種晶を添加しない場合は、前記Ｌ−リジンの量は、９００ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ以上、より好ましく１５００ｍｇ／Ｌ以上である。
【００５３】
また、培地中にＬ−グルタミン酸の結晶を析出させる際の培地のｐＨは、通常は、Ｌ−グルタミン酸を培地に蓄積させるときのｐＨと同じでよいが、好ましくは３．０〜５．０、より好ましくは３．０〜４．９、特に好ましくは４．５〜４．９である。
【００５４】
本発明は、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させること以外は、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物を用いて、培地中でＬ−グルタミン酸を析出させながらＬ−グルタミン酸を製造する公知の方法を適用することができる（例えば、特開２００１−３３３７６９（欧州特許出願公開第１０７８９８９号）、特開２００２−２３８５９１（欧州特許出願公開第１２３３０７０号）、特開２００２−２３８５９２（欧州特許出願公開第１２３３０６８号）、特開２００２−２３８５９３（欧州特許出願公開第１２３３０６９号））。
【００５５】
例えば、本発明の方法の好ましい形態の一つは、ｐＨが５．０以下である培地であって、このｐＨでＬ−グルタミン酸蓄積微生物の生育を阻害する有機酸の合計含有量が微生物の生育を阻害しない量である培地中で培養することを含む、Ｌ−グルタミン酸の製造法において、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させる方法である（特開２００２−２３８５９１号（欧州特許出願公開第１２３３０７０号）公報参照）。この態様において、培地のｐＨで微生物の生育を阻害する有機酸は、そのｐＨの培地中に或る程度の濃度（通常には０．５ｇ／Ｌ以上）で存在するときに微生物の生育の阻害を示す有機酸を意味し、通常には、炭素数１〜３の有機酸、すなわち、蟻酸、酢酸及びプロピオン酸である。
【００５６】
有機酸の合計含有量は、好ましくは０．４ｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．３ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．２ｇ／Ｌ以下である。
本発明の方法の好ましい他の態様は、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物を、同微生物の生育に適した第１のｐＨで培養し、次いで微生物によるＬ−グルタミン酸の生産に適した、第１のｐＨよりも低い第２のｐＨで培養することを含み、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させる、Ｌ−グルタミン酸の製造法である（（特開２００２−２３８５９２号（欧州特許出願公開第１２３３０６８号）公報参照））。
【００５７】
本発明の方法の好ましい別の態様は、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物を、培地中の有機酸による微生物の生育の阻害が生じない第１のｐＨで培養し、次いで微生物によるＬ−グルタミン酸の生産に適した、第１のｐＨより低い第２のｐＨで培養することを含み、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させる、Ｌ−グルタミン酸の製造法である（特開２００２−２３８５９１号（欧州特許出願公開第１２３３０７０号）公報参照）。
【００５８】
Ｌ−グルタミン酸生産菌は、一般に、酸性条件下で有機酸による生育の阻害を受ける一方、中性条件下では有機酸を消費することができる（特開２００２−２３８５９１号（欧州特許出願公開第１２３３０７０号）公報参照）。この性質を利用して中性ｐＨで菌体生育を行い、その後ｐＨを酸性に変化させてＬ−グルタミン酸を生成させることにより、より高い生産性を得るとともに、広範な材料を糖源として使用することが可能となる。
【００５９】
この態様において、有機酸は、第２のｐＨの培地中に或る程度の濃度（通常には０．５ｇ／Ｌ以上）で存在するときに微生物の生育の阻害を示す有機酸を意味し、通常には、炭素数１〜３の有機酸、すなわち、蟻酸、酢酸及びプロピオン酸である。
第１のｐＨ及び第２のｐＨは、使用されるＬ−グルタミン酸蓄積微生物の性質に適合するように選択される。これらのｐＨは、当業者であれば容易に測定できる。例えば、培地中の有機酸による微生物の生育の阻害が生じないｐＨは、種々のｐＨに調整した有機酸含有培地でＬ−グルタミン酸蓄積微生物を培養し、吸光度などにより菌体量を測定して、その菌体量を、有機酸を含有しないこと以外は同一の条件で培養されたＬ−グルタミン酸蓄積微生物の菌体量と比較することにより決定できる。Ｌ−グルタミン酸の生産に適したｐＨは、種々のｐＨの培地でＬ−グルタミン酸蓄積微生物を培養し、培地中にＬ−グルタミン酸が蓄積されるときのｐＨをいう。具体的には、当該種々のｐＨの培地中に蓄積されたＬ−グルタミン酸量を測定して比較することにより決定できる。
【００６０】
第１のｐＨは、培地中の有機酸による微生物の成育の阻害が生じなければ特に制限はなく、通常には５．０〜８．０である。
第２のｐＨは、生産されたＬ−グルタミン酸が析出するｐＨであることが好ましく、このようなｐＨは、通常には、３．０〜５．０である。生産されたＬ−グルタミン酸が析出するｐＨで培養することにより、Ｌ−グルタミン酸の高濃度蓄積による生産性の阻害を回避できる。
【００６１】
第１のｐＨ及び第２のｐＨは、本発明の効果が得られる限り、培養中において厳密に一定の値を示す必要はなく、変動しても差し支えない。
第１のｐＨでの培養は、このｐＨであっても、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物がＬ−グルタミン酸を生産するので、生産されるＬ−グルタミン酸によるｐＨの低下が生じるため、アルカリ化物質を培地に添加することにより培地のｐＨを第１のｐＨに維持しながら行うことが好ましい。
アルカリ化物質は、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物の生育やＬ−グルタミン酸生産に悪影響を与えないものであれば特に限定されないが、アンモニアガスが好ましい。
【００６２】
第１のｐＨから第２のｐＨへの、培地のｐＨの低下は、酸性物質を培地に添加することにより行ってもよいが、上述のように、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物により生産されるＬ−グルタミン酸によるｐＨの低下が培養中に生じるので、第１のｐＨから第２のｐＨへの、培地のｐＨの低下は、アルカリ化物質の添加量を調整することにより行うことが、酸性物質の添加を省略できるので好ましい。
【００６３】
第１のｐＨでの培養は、培地中の有機酸が枯渇するまで継続すればよい。枯渇とは、有機酸の量が第２のｐＨにおける培養において、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物の生育を阻害しないレベルに低下することをいう。このような有機酸のレベルを測定することは当業者にとって容易である。例えば、第２のｐＨにおいて種々の濃度の有機酸を含む培地で培養を行い、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物の菌体量を測定して、その菌体量を、有機酸を含有しないこと以外は同一の条件で培養されたＬ−グルタミン酸蓄積微生物の菌体量と比較することにより決定できる。一般に、第２のｐＨが低くなればなるほど、有機酸のレベルも低くなる。
【００６４】
本発明の方法の好ましいさらに別の態様は、Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物を、ｐＨが当該微生物によって生産されたＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させることを含む、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法において、グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときに培地中にＬ−リジンを存在させ、かつ、Ｌ−グルタミン酸の自然起晶が起こる前にＬ−グルタミン酸のα型結晶（種晶）を存在させる操作を行う方法である（特開２００２−２３８５９３号（欧州特許出願公開第１２３３０６９号）公報参照）。
【００６５】
種晶を存在させる操作は、Ｌ−グルタミン酸のβ型結晶の自然起晶が起こる前に行う。尚、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が飽和濃度に達する前に種晶を添加すると、種晶は溶解してしまうことがある。したがって、種晶は、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が飽和濃度を超えた後であって、かつ、Ｌ−グルタミン酸の自然起晶が起こる前に添加することが好ましい。本発明においては、培地にＬ−リジンを存在させ、Ｌ−グルタミン酸の自然起晶が起こる濃度を高くすることによって、種晶を添加するタイミングを広げることができる。
【００６６】
培地中にＬ−グルタミン酸のα型結晶を存在させる操作とは、人為的に培地中に結晶を存在させる操作を意味する。このような操作の例としては、培地にα型結晶を添加すること、培養開始時に或る量のＬ−グルタミン酸を培地に溶解させておき、培養途中でｐＨを下げることにより、強制的に析出させること等が挙げられる。α型結晶を培地中に存在させる量は、通常には０．０１〜１０ｇ／Ｌである。培地中のＬ−グルタミン酸の結晶の存在量やＬ−グルタミン酸の濃度は、当業者に周知の方法で測定することができる。Ｌ−グルタミン酸の結晶は、培養液を静置し、デカントにより培養液から採取して存在量を測定する。培地中のＬ−グルタミン酸の濃度とは、溶解しているＬ−グルタミン酸の濃度である。培地中に結晶が析出している場合は、遠心分離（又は濾過）により固形分を分離し、得られた清澄液のＬ−グルタミン酸濃度の測定値を指す。
【００６７】
培地中にＬ−グルタミン酸のα型結晶を存在させる操作は、好ましくは、Ｌ−グルタミン酸のα型結晶を添加することである。
好ましい結晶の添加量は、通常には０．２ｇ／Ｌ以上である。この濃度以上であると、再現性良くα型の結晶を得ることができる。α型の結晶は、その形状の点から、β型の結晶に比べて取り扱いが容易である。
【００６８】
本発明に用いる培地は、ｐＨが所定の条件に調整されること以外は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は、培養する菌株の利用可能なものならばよい。
【００６９】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００７０】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００７１】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、代謝又は生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
【００７２】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養方法は、ｐＨが所定の値、好ましくは３〜５に調整される以外は、通常には、発酵温度２０ないし４２℃での通気培養である。
【００７３】
培養終了後、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。また、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸は、公知の方法に従って採取することができる。例えば、濃縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【００７４】
飽和濃度を超えるＬ−グルタミン酸が析出する態様では、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸の濃度は一定量に保たれ、微生物が高濃度のＬ−グルタミン酸から受ける影響を低減することができる。したがって、Ｌ−グルタミン酸生産能が一層向上した微生物を育種することも可能となる。また、Ｌ−グルタミン酸は結晶として析出してくるため、Ｌ−グルタミン酸の蓄積に伴う培養液の酸性化が少なく、培養液のｐＨを維持するために使用されるアルカリの量を大幅に削減することが可能となる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００７６】
参考例１
＜１＞酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する微生物の探索
酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する微生物の探索は、以下のようにして行った。１ｇの土壌、果実、植物体、河川水などの自然界より得られたサンプルおよそ５００点を、それぞれ５ｍＬの滅菌水に懸だくし、そのうち２００μＬを塩酸にてｐＨを４．０に調製した固体培地２０ｍＬに塗布した。同培地の組成は、以下のとおりである。グルコース３ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．２ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水塩０．１ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水塩０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン四水塩０．０１ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛二水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅五水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト六水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、ビオチン５０μｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム５０μｇ／Ｌ、葉酸５０μｇ／Ｌ、イノシトール５０μｇ／Ｌ、ナイアシン５０μｇ／Ｌ、パラアミノ安息香酸５０μｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩５０μｇ／Ｌ、リボフラビン５０μｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩５０μｇ／Ｌ、シクロヘキシミド５０ｍｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ。
【００７７】
上記のサンプルを塗布した培地を、２８℃、３７℃又は５０℃にて、２〜４日間培養し、コロニーを形成する菌株を３７８株取得した。
続いて、上記のようにして得られた菌株を、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含む液体培地（塩酸にてｐＨ４．０に調整）３ｍＬを注入した長さ１６．５ｃｍ、径１４ｍｍの試験管に植菌し、２４時間〜３日間、２８℃、３７℃又は５０℃にて振とう培養を行い、増殖する菌株を選抜した。前記培地の組成は、以下のとおりである。グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン四水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛二水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅五水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト六水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム二水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ。
このようにして、酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する微生物７８株を取得することに成功した。
【００７８】
＜２＞酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する微生物からの増殖速度に優れた菌株の選抜
上記のようにして得られた、酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する種々の微生物を、Ｍ９培地（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９）に２０ｇ／Ｌのグルタミン酸と２ｇ／Ｌのグルコースを加え、ｐＨを塩酸で４．０に調整した培地３ｍＬを注入した長さ１６．５ｃｍ、径１４ｍｍの試験管に植菌し、培地の濁度を経時的に測定することによって、増殖速度の良好な菌株の選抜を行った。その結果、生育が良好な菌株として、静岡県磐田市の土壌より採取されたＡＪ１３３５５株が得られた。本菌株は、菌学的性質から、エンテロバクター・アグロメランスと判定された。エンテロバクター・アグロメランスは、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）又はパントエア・アナナティス（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）等に再分類されているものがあり、前記ＡＪ１３３５５株は、これらのうち、パントエア・アナナティスに分類されている。
【００７９】
＜３＞パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株からの粘液質低生産株の取得
パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株は糖を含有する培地で培養を行うと、菌体外に粘液質を生成するために、操作効率がよくない。そこで、粘液質低生産株の取得を、紫外線照射法（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，”Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｃｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐ．１５０，１９９２）により行った。
【００８０】
６０Ｗの紫外線ランプから６０ｃｍ離した位置で、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株に紫外線を２分間照射した後、ＬＢ培地で終夜培養して変異を固定した。変異処理した菌株を、５ｇ／Ｌのグルコースと２０ｇ／Ｌの寒天を含むＬＢ培地に、プレート当たり約１００個程度のコロニーが出現するように希釈して撒き、プレートを約４５°傾けて３０℃で終夜培養を行い、粘液質が流れ落ちないようになったコロニーを２０個選抜した。
【００８１】
選抜された株の中から、５ｇ／Ｌのグルコースと２０ｇ／Ｌの寒天を含むＬＢ培地で５回継代培養を行っても復帰変異株が出現せず、さらに、ＬＢ培地及び５ｇ／Ｌのグルコースを含むＬＢ培地ならびにＭ９培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８９））に２０ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸と２ｇ／Ｌのグルコースを加え、ｐＨを塩酸で４．５に調製した培地で親株と同等の生育を示すという条件を満たす菌株として、ＳＣ１７株を選抜した。
【００８２】
＜４＞パントエア・アナナティスＳＣ１７株からのグルタミン酸生産菌の構築
（１）パントエア・アナナティスＳＣ１７株からのαＫＧＤＨ欠損株の作製
パントエア・アナナティスＳＣ１７株から、αＫＧＤＨを欠損し、さらにＬ−グルタミン酸生合成系が強化された株を作製した。
（ｉ）パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株のαＫＧＤＨ遺伝子（以後「ｓｕｃＡＢ」という）のクローニング
【００８３】
パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株のｓｕｃＡＢ遺伝子は、エシェリヒア・コリのαＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニット遺伝子（以後「ｓｕｃＡ」という）欠損株の酢酸非資化性を相補するＤＮＡ断片を、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株染色体ＤＮＡより選択することによって、クローニングした。
【００８４】
パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株の染色体ＤＮＡは、エシェリヒア・コリにおいて通常染色体ＤＮＡを抽出するのに使用されるのと同様の方法（生物工学実験書、日本生物工学会偏、９７−９８頁、培風館、１９９２年）で単離した。ベクターとして使用したｐＴＷＶ２２８（アンピシリン耐性）は宝酒造社製の市販品を用いた。
【００８５】
ＡＪ１３３５５株の染色体ＤＮＡをＥｃｏＴ２２１で消化したもの、およびｐＴＷＶ２２８をＰｓｔＩで消化したものをＴ４リガーゼにより連結し、ｓｕｃＡ欠損のエシェリヒア・コリＪＲＧ４６５株（Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｊ．らＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９６９，１０５巻、１８２頁）を形質転換した。こうして得た形質転換株より、酢酸最少培地にて増殖する株を選択し、これよりプラスミドを抽出してｐＴＷＶＥＫ１０１と命名した。ｐＴＷＶＥＫ１０１を持つエシェリヒア・コリＪＲＧ４６５株は酢酸非資化性という形質の他にコハク酸もしくはＬ−リジンおよびＬ−メチオニンの要求性も回復していた。このことよりｐＴＷＶＥＫ１０１にはパントエア・アナナティスのｓｕｃＡ遺伝子が含まれていると考えられる。
【００８６】
ｐＴＷＶＥＫ１０１のパントエア・アナナティス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に示した。図１の斜線にて示した部分の塩基配列を決定した結果を配列番号１に示した。この配列の中には、２つの完全長のＯＲＦと、２つのＯＲＦの部分配列と思われる塩基配列が見いだされた。これらのＯＲＦまたはその部分配列がコードし得るアミノ酸配列を、５’側から順に配列番号２〜５に示す。これらのホモロジー検索をした結果、塩基配列を決定した部分は、サクシネートデヒドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイン遺伝子（ｓｄｈＢ）の３’末端側の部分配列、完全長のｓｕｃＡとαＫＧＤＨ−Ｅ２サブユニット遺伝子（ｓｕｃＢ）、サクシニルＣｏＡシンセターゼβサブユニット遺伝子（ｓｕｃＣ）の５’末端側の部分配列を含んでいることが明らかとなった。これらの塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれエシェリヒア・コリのもの（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４１，３５１−３５９（１９８４）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４１，３６１−３７４（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，６２４５−６２５２（１９８５））と比較したところ、各アミノ酸配列は非常に高い相同性を示した。また、パントエア・アナナティス染色体上でもエシェリヒア・コリと同様に（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４１，３５１−３５９（１９８４）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４１，３６１−３７４（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，６２４５−６２５２（１９８５））、ｓｄｈＢ−ｓｕｃＡ−ｓｕｃＢ−ｓｕｃＣとクラスターを構成していることが判明した。
【００８７】
（ｉｉ）パントエア・アナナティスＳＣ１７株由来のαＫＧＤＨ欠損株の取得
上記のようにして取得されたパントエア・アナナティスのｓｕｃＡＢ遺伝子を用い、相同組換えによりパントエア・アナナティスのαＫＧＤＨ欠損株の取得を行った。
【００８８】
ｐＴＷＶＥＫ１０１をＳｐｈＩで切断してｓｕｃＡを含む断片を切り出した後、クレノーフラグメント（宝酒造（株））で平滑末端化した断片を、ＥｃｏＲＩで切断しクレノーフラグメントで平滑末端化したｐＢＲ３２２（宝酒造（株））とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株））を用いて結合した。得られたプラスミドを、ｓｕｃＡのほぼ中央部分に位置する制限酵素ＢｇｌＩＩ認識部位で同酵素を用いて切断し、クレノーフラグメントで平滑末端化し、再びＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。以上の操作によって、新たに構築されたプラスミド中のｓｕｃＡにはフレームシフト変異が導入され、同遺伝子は機能しなくなると考えられた。
【００８９】
上記のようにして構築されたプラスミドを制限酵素ＡｐａＬＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行い、フレームシフト変異が導入されたｓｕｃＡ及びｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を再びＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、αＫＧＤＨ遺伝子破壊用プラスミドを構築した。
【００９０】
上記のようにして得られたαＫＧＤＨ遺伝子破壊用プラスミドを用いて、パントエア・アナナティスＳＣ１７株を、エレクトロポレーション法（Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．，“Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐ．２７９，１９９２）によって形質転換し、テトラサイクリン耐性を指標にプラスミドが相同組換えによって染色体上のｓｕｃＡが変異型に置換された菌株を取得した。取得された株をＳＣ１７ｓｕｃＡ株と命名した。
【００９１】
ＳＣ１７ｓｕｃＡ株がαＫＧＤＨ活性を欠損していることを確認するために、ＬＢ培地で対数増殖期まで培養した同株の菌体を用いて、Ｒｅｅｄらの方法（Ｌ．Ｊ．Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｂ．Ｂ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９６９，１３，ｐ．５５−６１）に従って酵素活性を測定した。その結果、ＳＣ１７株からは０．０７３（ΔＡＢＳ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク）のαＫＧＤＨ活性が検出されたのに対し、ＳＣ１７ｓｕｃＡ株ではαＫＧＤＨ活性を検出できず、目的通りｓｕｃＡが欠損していることが確かめられた。
【００９２】
（２）パントエア・アナナティスＳＣ１７ｓｕｃＡ株のＬ−グルタミン酸生合成系の強化
続いてＳＣ１７ｓｕｃＡ株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した。
【００９３】
（ｉ）エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作製
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作成の手順を、図２、３に基づいて説明する。
【００９４】
エシェリヒア・コリ由来のｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＢＲＧＤＨ（特開平７−２０３９８０号）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理で両末端を平滑末端にした後、ｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収した。一方、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子およびｐｐｃ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰ（ＷＯ９７／０８２９４号）をＸｂａＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで両末端を平滑末端にした。これに、上で精製したｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ｐＭＷＣＰに更にｇｄｈＡ遺伝子を搭載したプラスミドｐＭＷＣＰＧを得た（図２）。
【００９５】
同時に、広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点を有するプラスミドｐＶＩＣ４０（特開平８−０４７３９７号）をＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものと、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＴ１４Ｉ消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものとを混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ１０１０の複製起点及びテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドＲＳＦ−Ｔｅｔを得た（図３）。
次に、ｐＭＷＣＰＧをＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収し、ＲＳＦ−Ｔｅｔを同様にＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ＲＳＦ１０１０の複製起点を有するＤＮＡ断片を精製回収したものと混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ−Ｔｅｔ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を搭載したプラスミドＲＳＦＣＰＧを得た（図４）。得られたプラスミドＲＳＦＣＰＧがｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を発現していることは、エシェリヒア・コリのｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、あるいはｇｄｈＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の相補と各酵素活性の測定によって確認した。
【００９６】
（ｉｉ）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドは、以下のようにして構築した。コリネバクテリウム・グルタミカムのｇｌｔＡ遺伝子の塩基配列（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，１４０，１８１７−１８２８）をもとに、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するプライマーＤＮＡを用い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子断片を得た。この断片をＳｍａＩ消化したプラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）より購入）に挿入し、プラスミドｐＨＳＧＣＢを得た（図５）。次に、ｐＨＳＧＣＢをＨｉｎｄＩＩＩで切断し切り出された約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩ消化したプラスミドｐＳＴＶ２９（宝酒造（株）より購入）に挿入し、プラスミドｐＳＴＶＣＢを得た（図５）。得られたプラスミドｐＳＴＶＣＢがｇｌｔＡ遺伝子を発現していることは、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株中での酵素活性の測定によって確認した。
【００９７】
（ｉｉｉ）ＲＳＦＣＰＧ及びｐＳＴＶＣＢのＳＣ１７ｓｕｃＡ株への導入
パントエア・アナナティスＳＣ１７ｓｕｃＡ株を、ＲＳＦＣＰＧを用いてエレクトロポレーション法にて形質転換し、テトラサイクリン耐性を示す形質転換体ＳＣ１７ｓｕｃＡ／ＲＳＦＣＰＧ株を取得した。さらにＳＣ１７ｓｕｃＡ／ＲＳＦＣＰＧ株をｐＳＴＶＣＢを用いてエレクトロポレーション法にて形質転換し、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体ＳＣ１７ｓｕｃＡ／ＲＳＦＣＰＧ＋ｐＳＴＶＣＢ株を取得した。
【００９８】
＜５＞低ｐＨ環境下でＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株の取得
パントエア・アナナティスＳＣ１７ｓｕｃＡ／ＲＳＦＣＰＧ＋ｐＳＴＶＣＢ株から、低ｐＨ環境下で高濃度のＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株（以下、「低ｐＨ下高濃度Ｇｌｕ耐性株」ともいう）の分離を行った。
【００９９】
ＳＣ１７ｓｕｃＡ／ＲＳＦＣＰＧ＋ｐＳＴＶＣＢ株をＬＢＧ培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、グルコース５ｇ／Ｌ）にて３０℃一夜培養後、生理食塩水にて洗浄した菌体を適宜希釈して、Ｍ９−Ｅ培地（グルコース４ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ １ｇ／Ｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０μＭ ＣａＣｌ２、Ｌ−リジン５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン５０ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−ジアミノピメリン酸５０ｍｇ／Ｌ、テトラサイクリン２５ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール２５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸３０ｇ／Ｌ、アンモニア水にてｐＨ４．５に調整）プレートに塗布した。３２℃、２日間培養後出現したコロニーを低ｐＨ下高濃度Ｇｌｕ耐性株として取得した。
【０１００】
得られた株について、Ｍ９−Ｅ液体培地での増殖度の測定、及びＬ−グルタミン酸生産試験培地（グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン四水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛二水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅五水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト六水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム二水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン塩酸塩２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−α，ε−ジアミノピメリン酸２００ｍｇ／Ｌ、テトラサイクリン塩酸塩２５ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール２５ｍｇ／Ｌ）５ｍｌを注入した５０ｍｌ容大型試験管におけるＬ−グルタミン酸生産能の検定を実施し、増殖度が最もよく、Ｌ−グルタミン酸生産能が親株ＳＣ１７／ＲＳＦＣＰＧ＋ｐＳＴＶＣＢ株と変わらなかった株は、パントエア・アナナティスＡＪ１３６０１と命名された。ＡＪ１３６０１株は、１９９９年８月１８日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、住所 郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７５１６として寄託され、２０００年７月６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７が付与されている。
【実施例１】
【０１０１】
＜１＞Ｌ−グルタミン酸の最大飽和濃度に対するＬ−リジンの影響に関する検討
パントエア・アナナティスＡＪ１３６０１株を、テトラサイクリン塩酸塩２５ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール２５ｍｇ／Ｌを含有するＬＢＧ寒天培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ／、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ）にて３０℃で１４時間培養した菌体を１枚のプレートから掻き取り、以下に示す組成の種培養培地３００ｍｌを注入した１Ｌ容ジャーファメンターに植菌し、３４℃、ｐＨ６．０の条件で種培養を行った。
【０１０２】
〔種培養培地組成〕
シュークロース ５０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ２．０ｇ／Ｌ
酵母エキス ４．０ｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ
Ｌ−リジン塩酸塩 ０．４ｇ／Ｌ
ＤＬ−メチオニン ０．４ｇ／Ｌ
ε−ジアミノピメリン酸 ０．４ｇ／Ｌ
テトラサイクリン塩酸塩 ２５ｍｇ／Ｌ
クロラムフェニコール ２５ｍｇ／Ｌ
【０１０３】
培養中のｐＨは、６．０となるようにアンモニアガスを添加することにより調整を行った。培地中の糖の枯渇を指標に種培養を終了し、本培養培地３００ｍｌを注入した１Ｌ容ジャーファメンターに、本培養培地体積の２０％に当たる種培養液を植菌し、３４℃、ｐＨ４．５で本培養を行った。本培養培地組成は以下に示す。
【０１０４】
〔本培養培地組成〕
グルコース ５０ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５．０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ６．０ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ １．５ｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ
Ｌ−リジン塩酸塩 ０．８ｇ／Ｌ
ＤＬ−メチオニン ０．６ｇ／Ｌ
ＤＬ−α，ε−ジアミノピメリン酸 ０．６ｇ／Ｌ
テトラサイクリン塩酸塩 ２５ｍｇ／Ｌ
クロラムフェニコール ２５ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム二水塩 ０．７５ｇ／Ｌ
【０１０５】
培養中のｐＨは、ｐＨ４．５となるようにアンモニアガスを添加することにより調整を行った。培地中の糖が消費され枯渇した後は、７００ｇ／Ｌのグルコース水溶液を連続的に添加した（６ｍｌ／ｈｒ）
【０１０６】
培地中のＬ−グルタミン酸濃度が４０ｇ／Ｌを越えたところで、Ｌ−リジン塩酸塩を、培養液３００ｍｌに対し０〜０．９ｇの量で添加した。その後、培養液上清中のＬ−グルタミン酸濃度を経時的に測定した。尚、培養液上清は、培養液を１００００×Ｇで１分間遠心分離したときの上澄み液とした。一方、培養液中に析出した結晶の多形を、顕微鏡観察により判別した。培養時間が経過につれて培養液中のＬ−グルタミン酸濃度が上昇し、結晶が析出すると上清液中のＬ−グルタミン酸濃度が低下する。したがって、上清液のＬ−グルタミン酸濃度の最高到達濃度を、析出濃度とした。結果を、図６に示す。
【０１０７】
ｐＨ４．５の培養系においては、Ｌ−リジンが存在しない培養液ではＬ−グルタミン酸のβ型結晶は４４ｇ／Ｌで析出する。また、ｐＨ４．５におけるＬ−グルタミン酸の溶解度は４０ｇ／Ｌである。したがって、種晶を添加する場合は、４０ｇ／Ｌ〜４４ｇ／Ｌの範囲で種晶を添加する必要がある。この範囲は、Ｌ−グルタミン酸生産速度が５ｇ／Ｌ／ｈの培養の場合、５０分に相当し、分析誤差も考えると非常に精密な制御が要求される。これに対し、６００ｍｇ／ＬのＬ−リジンが存在する系では、β晶が析出する濃度は６２ｇ／Ｌへ上昇し、種晶添加の許容範囲は４０ｇ／Ｌ〜６２ｇ／Ｌと大きく幅が広がる。これは、Ｌ−グルタミン酸生産速度が５ｇ／Ｌ／ｈの場合、４時間に相当することになり、制御が非常に容易になる。さらにＬ−リジン濃度が上昇すると、Ｌ−グルタミン酸の過溶解度も上昇する（図６）。
【０１０８】
上記の現象は、Ｌ−リジンがＬ−グルタミン酸のα晶の結晶面に吸着し、結晶成長を阻害することに起因すると考えられる。このため、培養によるグルタミン酸濃度の上昇を吸収するだけの結晶成長（核発生を含む）を得るには、大きな過飽和度を要する。このため、Ｌ−リジン濃度の上昇に従い、過飽和度が上昇すると推定される。
【０１０９】
培地に添加するＬ−リジン濃度が９００ｍｇ／Ｌを超えると、種晶を添加しなくてもα晶が自然起晶することが見出された。これは、Ｌ−リジンにはｐＨ４．５においてα晶よりβ晶表面に強く吸着し、結晶成長を阻害する性質があるためと考えられる。このことにより、一定濃度以上のＬ−リジンの存在により、β晶の結晶成長が抑えられ、α晶が起晶、成長すると推定される。
【０１１０】
（２）Ｌ−リジンによるＬ−グルタミン酸結晶の結晶形の制御
次に、水にＬ−グルタミン酸を過飽和度（Ｃｓｓ／Ｃｓ［−］）２となるように溶解させ、ｐＨ、及び培地に添加するＬ−リジン濃度を変化させて、冷却晶析系（３４℃）で析出するＬ−グルタミン酸結晶の結晶形を調べた。ｐＨ調整は、アンモニア水を添加することで行った。また、Ｌ−リジンの代わりにＬ−フェニルアラニンを添加し、同様の実験を行った。結果を図７に示す。また、各ｐＨにおける溶解度とグルタミン酸濃度を表１に示した。
図７に示されるように、ｐＨ４．５では、Ｌ−リジンの添加によって析出する結晶型をα型に制御することが可能であることがわかった。一方、Ｌ−フェニルアラニンは、ｐＨ３．２では同様の効果があるものの、ｐＨ４．５以上ではそのような効果はみられなかった。両者における違いは、ｐＨ毎の解離状態が、アミノ酸によって異なることに起因するものと考えられる。
【０１１１】
［表１］
【産業上の利用の可能性】
【０１１２】
培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法において、培地に一定量以上のＬ−リジンを存在させることにより、種晶を添加せずにＬ−グルタミン酸のα型結晶を析出させることができる。
また、培地に種晶を添加する場合は、培地にＬ−リジンを存在させることにより、種晶を添加するタイミングの制御が容易となる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法において、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させ、Ｌ−グルタミン酸のα型結晶を析出させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記微生物がパントエア属に属することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物がパントエア・アナナティスである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｌ−リジンの添加量が、９００ｍｇ／Ｌ以上である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｌ−リジンを存在させるときの培地のｐＨが３．０〜５．０である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｌ−グルタミン酸の自然起晶が起こる前に、培地中にＬ−グルタミン酸のα型結晶を存在させる操作を行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が析出する条件に調整された培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法において、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が、自然起晶が起こる濃度よりも低いときにＬ−リジンを培地中に存在させ、Ｌ−グルタミン酸のα型結晶を析出させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記微生物がパントエア属に属することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物がパントエア・アナナティスである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｌ−リジンの添加量が、９００ｍｇ／Ｌ以上である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｌ−リジンを存在させるときの培地のｐＨが３．０〜５．０である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｌ−グルタミン酸の自然起晶が起こる前に、培地中にＬ−グルタミン酸のα型結晶を存在させる操作を行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９９４２６
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【発行日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０５９８８（Ｐ２００５−５０５９８８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６０３１
【国際出願日】平成１６年５月７日（２００４．５．７）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【発行日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６０３１
【国際出願日】平成１６年５月７日（２００４．５．７）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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