Ｌ−チロシン過剰産生細菌株の製造方法
【課題】Ｌ−チロシンの効率のよい産生手段の提供。
【解決手段】腸内細菌株を、一段階法を使用して、Ｌ−チロシンを過剰産生するように工作した。細菌ゲノムのｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ染色体領域を工作した染色体セグメントで置換し、ｐｈｅＡコーディング領域の不活性化およびｔｙｒＡコーディング領域の強発現をもたらし、高レベルのＬ−チロシン産生をもたらした。
【解決手段】腸内細菌株を、一段階法を使用して、Ｌ−チロシンを過剰産生するように工作した。細菌ゲノムのｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ染色体領域を工作した染色体セグメントで置換し、ｐｈｅＡコーディング領域の不活性化およびｔｙｒＡコーディング領域の強発現をもたらし、高レベルのＬ−チロシン産生をもたらした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学および微生物学の分野に関する。より具体的には、本発明はＬ−チロシンを過剰産生する株を製造するための一段階での細菌宿主の工作方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物からの化学物質の製造は生物工学の重要な応用となった。チロシンは、栄養補助食品および抗パーキンソン病薬Ｌ−ドーパの製造のための試薬であること等、その栄養および製薬学的用途により、微生物中での産生のための魅力的な化学物質である。加えて、チロシンは有益な工業的用途をもつ他の化合物の製造のための試薬としての可能性を有する。チロシンから潜在的に作製されうる化合物は、（Ｓ）−４−（２−クロロ−３−（４−ｎ−ドデシルオキシ）−フェニルプロピオナト）−４’，４（２−メチル）ブチルオキシ−ビフェニルカルボキシレート（ＣＤＰＭＢＢ；ＫｕｍａｒとＰｉｓｉｐａｔｉ（非特許文献１）、ｐ−ヒドロキシケイヒ酸（ｐＨＣＡ；特許文献１、特許文献２）、ｐ−ヒドロキシスチレン（ｐＨＳ；ｐ−ビニルフェノールとしてもまた知られる；特許文献３）、およびｐ−アセトキシスチレン（ＡＳＭとしてもまた知られる）のようなそれらのアセチル化誘導体を包含する。ＣＤＰＭＢＢは強誘電性液晶（ＦＬＣ）での使用のための強誘電体素材である。ｐＨＣＡは液晶高分子（ＬＣＰ）の製造のための有用な単量体である。ＬＣＰは電子コネクタならびに電気通信および航空宇宙科学の応用で使用されうる。滅菌放射に対するＬＣＰの耐性は、これらの素材が医療機器ならびに化学物質および食物包装の応用で使用されることもまた可能にした。ヒドロキシスチレンは樹脂、エラストマー、接着剤、コーティング、自動車の仕上げ塗料、インクおよびフォトレジストの製造のため、ならびに電子材料での単量体としての応用を有する。それらはまた、エラストマーおよび樹脂処方中の添加物としても使用しうる。
【０００３】
チロシンは微生物中で天然に作製されるが、しかし一般に、細胞の成長に十分である低レベルで存在する。チロシンの生合成経路は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でｔｙｒＡによりコードされるコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素酵素（コリスミ酸基質に作用する）でフェニルアラニン生合成経路から分岐する。フェニルアラニン経路では、コリスミ酸はコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水酵素（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではｐｈｅＡ遺伝子によりコードされる）の基質である。
【０００４】
増大されたレベルのチロシン産生を伴う微生物が、伝統的な遺伝子の方法ならびに遺伝子工学により得られている。ｐｈｅＡ若しくは他の生物体中でコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水酵素をコードする遺伝子のいずれかの発現が低下若しくは排除され、それによりコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水酵素によるコリスミ酸基質の競合を低下若しくは排除して、増大されたチロシン産生をもたらした［非特許文献２］。
【０００５】
別に、ｔｙｒＡ発現若しくは他の生物体中でのコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素酵素をコードする遺伝子のいずれかが増大され、それにより増大されたコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素酵素活性を伴い、コリスミ酸をチロシン産生に向ける細胞の能力を増大させた。特許文献４は、３−デオキシ−２−ケト−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７リン酸（ＤＡＨＰ）合成酵素（芳香族アミノ酸生合成経路の最初の酵素）、コリスミ酸ムターゼおよびプレフェン酸脱水素酵素をコードする遺伝子を保有するプラスミドで形質転換することによる、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）若しくはブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）宿主でのチロシン製造方法を開示する。特許文献５は、トリプトファンを産生するコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）若しくはブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）宿主でのチロシンの製造方法を開示する。トリプトファンを産生するコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）若しくはブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）宿主が、ＤＡＨＰ合成酵素およびコリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子を保有するプラスミドで形質転換される。
【０００６】
共通に所有される特許文献６は、変異体ｐｈｅＡ遺伝子を最初に導入することによる、チロシンを排出する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の工作を開示する。その後、第二の別個の段階で、ｔｒｃプロモーターに駆動されるｔｙｒＡ遺伝子を導入した。双方の導入を有するまれな形質導入体がチロシン排出株と同定された。
【０００７】
加えて、共通に所有される特許文献２は、フェニルアラニンをチロシンに転化するために組換え生物体中でフェニルアラニン加水分解酵素を発現させることによりチロシン産生を増大させることを開示する。
【０００８】
チロシンの製造のために微生物を工作するための努力にもかかわらず、最高の報告された濃度は、コリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）についてわずか２６ｇ／ｌである（非特許文献３）。従って、チロシンの商業生産を容易にするためのより高レベルでＬ−チロシンを産生する微生物に対する必要性が存続する。発明者は、２６ｇ／ｌを越えるレベルでＬ−チロシンを産生するように組換え腸内細菌を工作することにより、述べられた問題を解決した。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６３６８８３７号
【特許文献２】第ＵＳ２００５０１４８０５４Ａ１号
【特許文献３】第ＵＳ２００４００１８６０号
【特許文献４】欧州特許第０３３２２３４号
【特許文献５】欧州特許第０２６３５１５号
【特許文献６】第ＵＳ２００４０２４８２６７号
【非特許文献１】Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．５７ａ：８０３−８０６（２００２）
【非特許文献２】Ｍａｉｔｉら（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｈｉｎｄｕｓｔａｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔ．Ｂｕｌｌ．３７：５１−６５
【非特許文献３】Ｉｋｅｄａ，Ｍ．とＲ．Ｋａｔｓｕｍａｔａ．１９９２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：７８１−７８５
【発明の開示】
【００１０】
［発明の要約］
本発明は、チロシン過剰産生株およびそれの作製方法に関する。本発明の株は、ｐｈｅＡ遺伝子を非機能的にするためのそれの破壊、および遺伝子挿入のための単一挿入方法を使用するｔｙｒＡの上方制御すなわち過剰発現を含んでなる。該株は、芳香族アミノ酸経路の他の調節、およびチロシンの産生のための該株の利用性を高める他の表現型形質をさらに含みうる。
【００１１】
従って、本発明は、
ａ）ｉ）内因性ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ染色体領域；および
ｉｉ）コリスミ産を産生する芳香族アミノ酸生合成経路
を含んでなる腸内細菌株を提供すること；
ｂ）段階（ａ）の株の染色体に、
１）ｔｙｒＡをコードする１個のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたプロモーターを含んでなる核酸フラグメント；および
２）非機能的ｐｈｅＡ核酸配列
を含んでなる工作された染色体セグメントを挿入することであって、
該工作された染色体セグメントが、宿主染色体の内因性ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域を置換して、Ｌ−チロシンを過剰産生する株を創製する、
を含んでなる、Ｌ−チロシンを過剰産生する細胞株の作製方法を提供する。
【００１２】
好ましい一態様において、本発明は、本発明の方法により作製されたチロシン過剰産生株を提供する。あるいは、本発明は、以下の特徴：
ａ）ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＬ、ａｒｏＫ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ｔｙｒＡ、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＢよりなる群から選択される遺伝子を含んでなる、芳香族アミノ酸生合成経路の存在
ｂ）非機能的ｐｈｅＡ遺伝子
ｃ）ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λ ＰＬ、λ ＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｍａｌＥ、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、ｒｒｎＢ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｃｓｐＡ、ｇｙｒＡ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）スピーシーズのｎｐｒＭ、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）スピーシーズのグルコース異性化酵素よりなる群から選択されるプロモーターの制御下のｔｙｒＡ遺伝子の過剰発現；
ｄ）３−フルオロチロシンに対する耐性；
ｅ）パラ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性；
ｆ）β−２−チエニルアラニンに対する耐性；
ｇ）チロシンに対する耐性；ならびに
ｈ）高フェニルアラニンおよび高温に対する耐性
を含んでなる、チロシンを過剰産生する腸内細菌株を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、
ａ）本発明の方法により作製されたチロシンを過剰産生する腸内細菌株を提供すること；および
ｂ）Ｌ−チロシンが産生される条件下で前記チロシン過剰産生株を増殖させること
を含んでなる、Ｌ−チロシンの製造方法を提供する。
【００１４】
［図面の簡単な説明および配列の説明］
本発明は、本出願の一部を形成する以下の詳細な記述、図面および付随する配列表からより完全に理解され得る。
図１は、芳香族アミノ酸生合成経路の具体的説明である。
図２は、Ａ）プライマー相同性領域（ＡおよびＢ）を伴う、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域中およびその周囲のコーディング領域、ならびに欠失の標的とされる領域（Δ）の図解を示す。Ｂ）ＰＣＲ鋳型ｔｅｔＡおよびｔｅｔＲ遺伝子領域、ならびにＴｅｔＲＡ環形成のためのＤＮＡフラグメントを生じさせるための２種のＰＣＲ反応で使用されるプライマーの図解を示す。
図３は、図２Ｂに示されるプライマーからのＰＣＲ産物のＴｅｔＲＡ環の形成の図解を示す。
図４は、ＴｅｔＲＡ環と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体の間の組換え反応、および生じる染色体組込み産物の図解を示す。
図５は、ｐｈｅＬＡ領域に組込まれたＴｅｔＲＡ環を保有する株についてのテトラサイクリン感受性対選択の２種の可能な結果の図解を示す。
図６は、ｌａｃＩＺＹＡ領域中に組込まれたｓａｃＢプラスミドを保有する株についてのショ糖耐性選択の２種の可能な結果を示す。
【００１５】
以下の配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（“ヌクレオチド配列およ
び／若しくはアミノ酸配列開示を含有する特許出願の要件−配列の規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）”）に従い、また、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８）、ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
配列番号１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域のヌクレオチド配列である。
配列番号３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＦＴ０７３のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域のヌクレオチド配列である。
配列番号４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のＰｈｅＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７のＰｈｅＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＦＴ０７３のＰｈｅＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、ペスト菌（Ｙｅｒｓｈｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ ｂｉｏｖａｒ Ｍｅｄｉｅｖａｌｉｓ）株９１００１のＰｈｅＡタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のＰｈｅＡタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、エルウィニア カロトヴォラ サブスピーシーズ アトロセプティカ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）ＳＣＲＩ１０４３のＰｈｅＡタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、フォトラブドゥス ルミネセンス サブスピーシーズ ラウモンディイ（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｕｍｏｎｄｉｉ）ＴＴＯ１のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、シェワネラ オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）ＭＲ−１のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１６は、ザントモナス カンペストリス パリバー カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）株ＡＴＣＣ ３３９１３のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１７はプライマーＡＢＴＲのヌクレオチド配列である。
配列番号１８はプライマーＢＡＴＡのヌクレオチド配列である。
配列番号１９はプライマーＴＲのヌクレオチド配列である。
配列番号２０はプライマーＴＡのヌクレオチド配列である。
配列番号２１はプライマーＴ−ｋａｎ（ｔｙｒＡ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２２はプライマーＢ−ｋａｎ（ｔｒｃ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２３はプライマーＴ−ｔｒｃ（ｋａｎ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２４はプライマーＢ−ｔｒｃ（ｔｙｒＡ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２５はプライマーＴ−ｔｙ（ｔｅｓｔ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２６はプライマーＢ−ｔｙ（ｔｅｓｔ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２７はプライマーＬａｃ＿１のヌクレオチド配列である。
配列番号２８はプライマーＬａｃ＿２のヌクレオチド配列である。
配列番号２９はプライマーＬａｃ＿３のヌクレオチド配列である。
配列番号３０はプライマーＬａｃ＿４のヌクレオチド配列である。
配列番号３１は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のｔｙｒＲ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００１６】
［発明の詳細な記述］
本発明は、ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ染色体領域、および少なくともコリスミ酸産物までの芳香族アミノ酸生合成経路を有する腸内細菌宿主でのチロシン過剰産生株の工作方法を記述する。一段階の方法で、ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ染色体領域のｐｈｅＡコーディング領域を不活性化し、そして強力なプロモーターおよびｔｙｒＡコーディング領域を包含するキメラ遺伝子を染色体に挿入する。ｐｈｅＡ発現の非存在下でのｔｙｒＡの強力な発現は、該宿主株を過剰産生ともまた呼ばれる高レベルのチロシンを産生するものに転換し、その結果チロシンが該細胞から排出される。
【００１７】
本開示では多数の用語および略語を使用する。以下の定義を提供する。
【００１８】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記する。
【００１９】
「アンピシリン」はａｍｐと略記する。
【００２０】
「カナマイシン」はｋａｎと略記する。
【００２１】
本明細書で使用されるところの「発明」若しくは「本発明」という用語は、提示されるところの若しくは後に補正かつ追補されるところの請求の範囲、または本明細書に記述されるところの本発明の全部の態様に一般に当てはまることを意味している。
【００２２】
「遺伝子」は、コーディング配列に先行する（５’非コーディング配列）および後に続く（３’非コーディング配列）制御配列を包含する、特定の１タンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「天然の遺伝子」若しくは「野性型遺伝子」はそれ自身の制御配列とともに天然に見出されるところの遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見出されない制御およびコーディング配列を含んでなる、天然の遺伝子でないいかなる遺伝子も指す。従って、キメラ遺伝子は異なる供給源由来である制御配列およびコーディング配列、若しくは同一供給源由来のしかし天然に見出されるものと異なる様式で配列された制御配列およびコーディング配列を含みうる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム中のその天然の位置にある天然の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体で通常見出されないがしかし遺伝子移入により該宿主生物体に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然の生物体に挿入された天然の遺伝子若しくはキメラ遺伝子を含み得る。「オープンリーディングフレーム」という用語は、ポリヌクレオチドをコードするがしかしいかなる調節エレメントも欠くことができる遺伝子若しくは遺伝子構築物のその部分を指す。「遺伝子構築物」という用語は、限定されるものでないが、単一核酸配列内に集成されかつ適切な宿主に形質転換される場合に特定の遺伝若しくは表現型形質を遂げることが可能な遺伝子、調節エレメント、オープンリーディングフレームなどを挙げることができる、遺伝因子のいかなる組合せも指すことができる。
【００２３】
遺伝子、遺伝子構築物などに関して使用される場合の「欠失」若しくは「破壊」という用語は、それが正常に機能する際の核酸配列の部分的若しくは完全な不活性化を指すことができる。配列中の欠失は、該配列の完全な若しくは部分的な不活性化をもたらしうる該配列の全部若しくは一部の除去を意味している。配列中の破壊若しくは挿入は、再度、該配列の正常に機能する能力を減少若しくは排除することができる該配列内の一要素の付加を指すことができる。欠失若しくは破壊は、該遺伝子若しくはコーディング配列を本発明の意味内で「非機能的」にすることができる。
【００２４】
「コーディング配列」若しくは「コーディング領域」は特定の一アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００２５】
「適する制御配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内若しくは下流（３’非コーディング配列）に配置されかつ関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡのプロセシング若しくは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列を包含しうる。
【００２６】
「プロモーター」はコーディング配列若しくは機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモーター配列の３’に配置される。プロモーターは天然の遺伝子にそっくりそのまま由来しうるか、若しくは天然で見出される異なるプロモーター由来の異なる要素から構成されうるか、若しくは合成ＤＮＡセグメントを含むことさえできる。多様なプロモーターが多様な組織若しくは細胞型において、または発達の異なる段階で、または多様な環境条件に応答して遺伝子の発現を指図しうることが当業者により理解される。遺伝子をほとんどの時点で大部分の細胞型において発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と称される。大部分の場合に制御配列の正確な境界は完全に定義されているわけではないため、多様な長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有しうることがさらに認識される。
【００２７】
「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響されるような、単一核酸フラグメント上の核酸配列の連合を指す。例えば、プロモーターは、それがコーディング配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合（すなわち、コーディング配列が該プロモーターの転写制御下にあること）、そのコーディング配列と作動可能に連結されている。コーディング配列はセンス若しくはアンチセンスの向きで制御配列に作動可能に連結し得る。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメント由来のセンス（ｍＲＮＡ）若しくはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳もまた指すことができる。
【００２９】
「過剰発現」という用語は、正常のすなわち形質転換されていない生物体での産生のレベルを越えるトランスジェニック生物体での遺伝子産物の産生を指す。
【００３０】
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補コピーである場合、それは一次転写物と称されるか、若しくは、それは一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であることができ、そして成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まずかつ細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡに相補的でありかつそれ由来である二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを包含しかつ従って細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写物若しくはｍＲＮＡの全部若しくは一
部に相補的でありかつ標的遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のいかなる部分、すなわち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロン若しくはコーディング配列とであってもよい。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、若しくは翻訳されないがそれでもなお細胞の過程に対する影響を有する他のＲＮＡを指す。
【００３１】
「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす、宿主生物体のゲノムへの核酸フラグメントの移入を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体は「トランスジェニック」若しくは「組換え」若しくは「形質転換」生物体と称される。
【００３２】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中心的な代謝の一部でなく、かつ、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある遺伝子をしばしば保有する染色体外要素を指す。こうした要素は、プロモーターフラグメントおよび選択された遺伝子産物のＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と一緒に細胞中に導入することが可能である独特な構築物に多数のヌクレオチド配列が結合され若しくは組換えられた、いずれかの供給源由来の一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡの直鎖状若しくは環状の自律複製配列、ゲノムに組込む配列、ファージ若しくはヌクレオチド配列でありうる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有しかつ該外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特殊なベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有しかつ該外来遺伝子に加えて外来宿主中でのその遺伝子の高められた発現を見込む要素を有する特殊なベクターを指す。
【００３３】
「ｐｈｅＡ」はコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水酵素をコードする腸内細菌で見出される遺伝子を指し、また、ＰｈｅＡは対応するコードされるタンパク質を指す。
【００３４】
「ｔｙｒＡ」はコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素酵素をコードする腸内細菌で見出される遺伝子を指し、また、ＴｙｒＡは対応するコードされるタンパク質を指す。
【００３５】
「ｔｙｒＲ」は、ａｒｏＦ、ｔｙｒＡ、ａｒｏＧ、ａｒｏＬおよびｔｙｒＢ遺伝子の遺伝子産物を包含する芳香族アミノ酸生合成経路の多様な要素の発現を調節する、腸内細菌で見出される遺伝子を指す。
【００３６】
「ＰＥＰ」はホスホエノールピルビン酸の略語である。
【００３７】
「ＤＡＨＰ」は３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸７−リン酸の略語である。
【００３８】
「ＤＨＱ」はデヒドロキナ酸の略語である。
【００３９】
「ＤＨＳ」はデヒドロシキミ酸の略語である。
【００４０】
「ＳＨＫ」はシキミ酸の略語である。
【００４１】
「Ｓ−３Ｐ」はシキミ酸−３−リン酸の略語である。
【００４２】
「ＥＳＰＳ」はエノールエーテル−５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸の略語である。
【００４３】
「ＣＨＡ」はコリスミ酸の略語である。
【００４４】
「ＰＰＡ」はプレフェン酸の略語である。
【００４５】
「ＨＰＰ」は４−ＯＨ−フェニルピルビン酸の略語である。
【００４６】
「Ｔｙｒ」はチロシンの略語である。
【００４７】
「Ｐｈｅ」はフェニルアラニンの略語である。
【００４８】
「ａｒｏＧ３９７」という用語は、フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性であるＤＡＨＰ合成酵素の産生をもたらすａｒｏＧ遺伝子中の特殊な一突然変異である。ａｒｏＧ３９７突然変異は当該技術分野で一般的かつ公知であり、そして米国特許第４，６８１，８５２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に報告されている。
【００４９】
本明細書で使用されるところの「ｔｙｒＲ３６６突然変異」という用語は、ｔｙｒＲ遺伝子を不活性化、下方制御若しくは非機能的にするという効果を有する。チロシンの本製造方法の情況内で、ｔｙｒＲの下方制御は、ＴｙｒＲが発現を抑制する芳香族生合成経路の多数の酵素の上方制御をもたらす。ｔｙｒＲ３６６突然変異は当該技術分野で公知でありかつ［ＣａｍａｋａｒｉｓとＰｉｔｔａｒｄ（１９７３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１５：１１３５−１１４４］に十分に報告されている。
【００５０】
「芳香族アミノ酸生合成経路」という用語は、フェニルアラニンおよびチロシン産生を司る、多くの微生物で見出される偏在する酵素経路を指す。本明細書で使用されるところの芳香族アミノ酸生合成経路を図１に具体的に説明し、そして、遺伝子ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＬ、ａｒｏＫ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ｔｙｒＡ、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＢによりコードされる酵素を部分的に含んでなる。
【００５１】
「フェニルアラニン過剰産生株」という用語は、その株の野性型で見られるものより有意により高いフェニルアラニンの内因性レベルを生じる微生物株を指す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フェニルアラニン過剰産生体の特定の一例は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＮＳＴ７４（米国特許第４，６８１，８５２号明細書）である。他者は、コリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）［Ｉｋｅｄａ，Ｍ．とＫａｔｓｕｍａｔａ，Ｒ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｏｒ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎ ｉｎ ａ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｓｔｒａｉｎ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．（１９９２）、５８（３）、ｐｐ．７８１−７８５］を包含しうる。高レベルで産生される場合、フェニルアラニンは典型的に培地に排出され、そして従って、フェニルアラニン過剰産生株は一般に「フェニルアラニン排出株」でもまたある。
【００５２】
「チロシン過剰産生株」という用語は、その株の野性型で見られるものより有意により高いチロシンの内因性レベルを生じる微生物株を指す。高レベルで産生される場合、チロインは典型的に培地に排出され、そして従って、チロシン過剰産生株は一般に「チロシン排出株」でもまたある。
【００５３】
「チロシン」はＬ−チロシンを指し、「フェニルアラニン」はＬ−フェニルアラニンを指し、そして「トリプトファン」はＬ−トリプトファンを指す。これらは指名される化合物のＬ−異性体である。
【００５４】
「マーカー」という用語は、スクリーニング若しくは選択により容易に検出可能である表現型形質を賦与する遺伝子を意味している。選択可能なマーカーは、マーカー遺伝子を有する細胞が増殖に基づき識別され得るものである。例えば、抗生物質耐性マーカーは、細胞を特定の抗生物質を含有する培地で増殖させる場合にその抗生物質に耐性である細胞の検出を可能にするため、有用な選択可能なマーカーとしてはたらく。スクリーニングで使用されるマーカーは、例えばその賦与された形質を可視化し得るものである。カロテノイド産生に関与する遺伝子、若しくは無色の化合物を着色化合物に転化するタンパク質（すなわちβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ）をコードするものがこの型のマーカーの例である。スクリーニングマーカー遺伝子はまたレポーター遺伝子とも称しうる。
【００５５】
「マーカーを利用すること」という用語は、該マーカーにより提供される表現型形質に基づき細胞を同定することを意味している。該マーカーは、選択およびスクリーニングを包含する方法により細胞を同定するための形質を提供しうる。
【００５６】
「陰性選択マーカー」という用語は、特定の条件下で有害である特性を賦与するＤＮＡ配列を意味している。該特質はプラスミド若しくは全細胞に対し有害でありうる。例えば、ショ糖の存在下でのｓａｃＢ遺伝子の発現は該発現細胞に対し致死的である。別の例は、プラスミドが複製し得ないような非許容温度で非機能的である温度感受性複製起点である。
【００５７】
ここで使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．とＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）（下で「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎｎ，Ｍ．Ｌ．とＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８４）；およびＧｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージー州ホーボーケンにより出版されたＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）により記述されている。
【００５８】
本発明は、醗酵によるＬ−チロシンの産生での使用のためのチロシンを過剰産生する腸内細菌株の作製方法を提供する。該チロシン過剰産生体は、芳香族アミノ酸生合成経路を介してコリスミ酸を産生する能力を最小限に有することができ、かつ、ｐｈｅＡ遺伝子中の破壊を有してそれを非機能的にすることができ、また、ｔｙｒＡを過剰発現していることができる。他の態様において、チロシン過剰産生株は、限定されるものでないが、フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性のＤＡＨＰ合成酵素をコードする遺伝子、ｔｙｒＲ遺伝子の下方制御；３−フルオロチロシンに対する耐性；パラ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性；β−２−チエニルアラニンに対する耐性；チロシンに対する耐性、ならびに高フェニルアラニンおよび高温に対する耐性を挙げることができる多様な他の遺伝および表現型形質を有することができる。
【００５９】
本発明のチロシン過剰産生株は、好ましくは、フェニルアラニン過剰産生株で開始しかつｐｈｅＡ遺伝子の欠失若しくは破壊およびｔｙｒＡ遺伝子の過剰発現を遂げるための単一遺伝子構築物でその株を形質転換して構築する。ｐｈｅＡの破壊は、フェニルアラニンの産生への炭素を遮断するという効果を有し（図１）、そして、ｔｙｒＡの過剰発現は、この付加的な炭素をチロシン産生専用の経路の一部に移動する（図１）。上に示された多
様な化学物質に対する耐性の付加的な特質についての選択は、一般に、該株の確固たる性質に寄与して、チロシン産生をさらに高める。
【００６０】
宿主株の選択
本発明は、チロシンを過剰産生する腸内細菌株、およびその株の新規構築方法を提供する。構築のための出発株の不可欠の要件は、それが芳香族アミノ酸経路によりコリスミ酸を産生し（図１）、かつ、ｐｈｅＡコーディング領域およびｔｙｒＡコーディング領域を相互に近接して含んでなることである。場合によっては、選択した株がフェニルアラニンの過剰産生体である場合が有用であることができる。ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡコーディング領域を相互に近接して有するいかなる腸内細菌株も、株転換のための本一段階方法の潜在的宿主である。
【００６１】
本発明でとりわけ適する腸内細菌は、限定されるものでないがエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エルジニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）およびエルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）を挙げることができる。腸内細菌は腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）のメンバーであり、そしてエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）のようなメンバーを包含する。それらは周毛性鞭毛（タツメラ属（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）を除く）により運動性若しくは非運動性の０．３〜１．０×１．０〜６．０ｍｍのグラム陰性の直線状桿菌である。それらは酸素の存在および非存在下で増殖し、また、ペプトン、肉抽出物および（通常は）マッコイ培地で良好に増殖する。数種は単独炭素源としてＤ−グルコースで増殖する一方、他方はビタミンおよび／若しくはミネラル（１種若しくは複数）を必要とする。それらは呼吸および醗酵代謝を伴い有機栄養性であるが、しかし好塩性でない。酸、およびしばしば目に見えるガスを、Ｄ−グルコース、他の炭水化物およびポリヒドロキシアルコールの発酵中に産生する。それらは酸化酵素陰性であり、かつ、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）０グループ１およびゼノラブドゥス ネマトフィルス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）を除きカタラーゼ陽性である。硝酸は亜硝酸に還元される（エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）およびエルジニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）の数種の株を除く）。ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は３８〜６０モル％（Ｔｍ、Ｂｄ）である。大部分の属内の種からのＤＮＡは、相互におよび該科の基準種大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）と最低２０％関連している。顕著な例外はエルジニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、ハフニア属（Ｈａｆｎｉａ）およびエドワードシエラ属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）の種であり、それらのＤＮＡは他の属からの種のものと１０〜２０％関連している。ジャガイモ黒脚病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）を除き、試験した全種が腸内細菌共通抗原を含有する（Ｂｅｒｇｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｈ．Ｂｅｒｇｙら、ボルティモア：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９８４）。
【００６２】
腸内細菌では、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡ遺伝子は腸内細菌染色体のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の成分であり、そして典型的には相互に隣接する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域は、ｐｈｅＡプロモーター、コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水酵素のリーダーペプチドをコードする４８ｂｐの配列であるｐｈｅＬ、ｐｈｅＡコーディング領域、ｒｈｏ非依存性転写終結配列、および反対の向きにｔｙｒＡコーディング領域を包含する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株からのｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の配列を配列番号１として示し、これはヌクレオチド１と８０の間のｐｈｅＡプロモーター、ヌクレオチド８１と１２８の間のｐｈｅＬコーディング領域、ヌクレオチド１２９と２２６の間の非コーディング遺伝子間配列、ヌクレオチド２２７と１３８７の間のｐｈｅＡコー
ディング領域、ヌクレオチド１３９４と１４２２の間のｒｈｏ非依存性転写終結配列およびヌクレオチド１４３０と２５５１の間のｔｙｒＡコーディング領域を包含する。
【００６３】
腸内細菌のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域は高度に保存されており、そしてこの領域の改変方法は一般に該分類の多くのメンバーに適用可能である。例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）内で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｏ１５７：Ｈ７（配列番号２）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＣＦＴ０７３（配列番号３）のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の配列は、Ｋ１２のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の配列にそれぞれ９８％同一である。典型的には、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡのコーディング領域もまた個別に保存されており、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株間で９７％くらい近い配列同一性を示す。これらの類似性は、それぞれ配列番号４、５および６として示されるＫ１２、Ｏ１５７：Ｈ７およびＣＦＴ０７３株のｐｈｅＡコーディング領域の配列、ならびにそれぞれ配列番号７、８および９として示されるＫ１２、Ｏ１５７：Ｈ７およびＣＦＴ０７３株のｔｙｒＡコーディング領域の配列中で容易に見られる。ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡ領域の保存は、該２コーディング領域の近接もまた共通の特徴である、腸内微生物（ｅｎｔｅｒｉｃｓ）該分類の他メンバーに広がる。例えば、対応するペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ ｂｉｏｖａｒ Ｍｅｄｉｅｖａｌｉｓ）株９１００１のタンパク質（配列番号１０）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のｐｈｅＡ産物（配列番号１１）のアミノ酸配列に対し６９％の同一性を有し、また、対応するエルウィニア カロトヴォラ サブスピーシーズ アトロセプティカ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）ＳＣＲＩ１０４３のタンパク質（配列番号１２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のｐｈｅＡ産物に対する７０％の同一性を有する。
【００６４】
染色体中で相互に近接して配置されるｐｈｅＡおよびｔｙｒＡに対応する遺伝子を有するいかなる腸内細菌株も、本方法の標的宿主となりうる。エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の株がとりわけ適しており、ＡＴＣＣにより＃７００９２６、＃２７３２５、＃３１８８２、＃３１８８４および＃１３２８１と呼称される株が最も好ましい。
【００６５】
示されるとおり、一態様において、フェニルアラニンの確固たる産生を示す株を同定することが有用であることができる。これが完全かつ高められた芳香族アミノ酸経路を示唆するためである。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フェニルアラニン過剰産生体の特定の例は、双方とも米国特許第４，６８１，８５２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＮＳＴ３７（ＡＴＣＣ ＃３１８８２）およびＮＳＴ７４（ＡＴＣＣ ＃３１８８４）である。本株転換法を使用してチロシン過剰産生体に転換しうる、低レベルのフェニルアラニン排出を伴うＫ１２以外の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の一例は、ＡＴＣＣ＃１３２８１（米国特許第２，９７３，３０４号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる））である。
【００６６】
チロシン過剰産生体の構築：芳香族アミノ酸生合成経路の改変
適する宿主若しくは株が一旦同定されれば、芳香族アミノ酸経路の重要な要素の改変方法を使用してチロシン過剰産生株を生成しうる。
【００６７】
芳香族アミノ酸経路の関連する要素を図１に具体的に説明する。簡潔には、該経路は最終的にグルコースから炭素を受領し、そして、遺伝子のａｒｏＦＧＨの組によりコードされるＤＡＨＰ合成酵素により触媒される、ＤＡＨＰを形成するためのＥ４ＰおよびＰＥＰの縮合で合成が進行する。該経路は、図１に示されるところの遺伝子ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＬ、ａｒｏＫ、ａｒｏＡおよびａｒｏＣにコードされる酵素により触媒される多様な中間体を通って、コリスミ酸が産生される点まで進行する。コリスミ酸はアントラニル酸合成酵素（トリプトファン合成に至る）および、最初にプレフェン酸（それ自身は、フェニルアラニン合成に至るプレフェン酸脱水酵素（ｐｈｅＡによりコードさ
れる）、若しくは最初に４−ＯＨ−フェニルピルビン酸の産生および次にｔｙｒＢにコードされるアミノトランスフェラーゼによる触媒作用を介してチロシンに至るプレフェン酸脱水素酵素（ｔｙｒＡによりコードされる）により作用されうる）の合成に至るコリスミ酸ムターゼ双方の基質である。
【００６８】
該経路の要素を考えれば、チロシン産生の最大化における課題は、競合する産物（フェニルアラニン、トリプトファン）への炭素の浪費を制御すること、およびチロシン産物への炭素の流れを至適化することであろうことが明らかであろう。従って、ｔｙｒＡの遺伝子産物の上方制御およびｐｈｅＡの遺伝子産物の排除が示される。加えて、野性型ＤＡＨＰ合成酵素は該経路の最終生成物（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）により阻害されることが既知であるため、また、これは炭素の流れを制御する経路中の最初の酵素であるため、最終生成物によるその調節を低下させるためにこの変異体酵素を含有する株を得ることが有用であることができる。
【００６９】
非機能的ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡの過剰発現
腸内細菌の染色体のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域中のｐｈｅＡおよびｔｙｒＡコーディング領域の近接は、本一段階工作方法を使用してこれらのコーディング領域の双方の発現を変えることを可能にする。本一段階工作方法は、同時にｐｈｅＡコーディング領域を不活性化することおよび強力なプロモーターをｔｙｒＡコーディング領域に付加することを包含する。同時のｐｈｅＡおよびｔｙｒＡ遺伝子の工作は、単一の工作された染色体セグメントを、内因性ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域を置換するように宿主株の染色体中に動かすことにより達成される。双方の遺伝子を変えるこの過程は、単一の工作された染色体セグメントを使用して非常に高頻度で達成される。
【００７０】
工作された染色体セグメントは、機能的ｐｈｅＡタンパク質が産生されないことを確実にするｐｈｅＡ配列のいかなる変化も有しうる。従って、該工作された染色体セグメントは非機能的ｐｈｅＡ構築物を最初の要素として包含する。非機能的ｐｈｅＡ構築物は変えられたｐｈｅＡコーディング領域を有しうる。コーディング領域を変えてそれを非機能的にすることは当業者に公知である。例えば、変化は欠失および挿入を包含する突然変異でありうる。突然変異は、機能的タンパク質が作製されないような、終止コドンを導入するか若しくはタンパク質の読み枠を変える点突然変異を包含する。効果的な挿入は読み枠を中断する。欠失は、ＰｈｅＡタンパク質をコードする領域の部分的欠失、および完全なＰｈｅＡコーディング領域の欠失を包含する。欠失は、ｐｈｅＬコーディング領域ならびにｐｈｅＬおよびｐｈｅＡ発現のためのプロモーターを包含しうる。欠失は、欠失の標的とされる配列に隣接するＤＮＡ配列を結合してそれにより隣接配列を脱落させることにより作製される。ｐｈｅＡプロモーターの上流の配列をｐｈｅＡコーディング領域の下流の配列に結合する欠失がとりわけ有用である。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で、ｐｈｅＡ遺伝子全体の欠失は、ｙｆｉＡの３’端およびｐｈｅＡプロモーターの上流の遺伝子間領域を、ｐｈｅＡコーディング領域の下流の遺伝子間領域およびｔｙｒＡの３’端に結合することにより作製する（図２Ａを参照されたい）。この欠失は、ｐｈｅＡコーディング領域全体と一緒に、ｐｈｅＬコーディング領域ならびにｐｈｅＬおよびｐｈｅＡ発現を駆動するプロモーターを包含する。生じる構築物は、ｐｈｅＡ配列が包含されない場合でさえ、非機能的ｐｈｅＡ構築物であると言われることができる。
【００７１】
非機能的ｐｈｅＡ構築物を含有する染色体セグメントは、第二の要素として、強力なプロモーターから発現されるｔｙｒＡコーディング領域もまた包含する。ｔｙｒＡコーディング領域は標的宿主に由来してもよいか、若しくはそれは異種株の外来ｔｙｒＡ遺伝子に由来してもよい。Ｓｏｎｇら（２００５）ＢＭＣ Ｂｉｏｌ ３：１３）に記述されるもののような、機能的コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素酵素タンパク質をコードするいかなる配列も使用しうる。いくつかの例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（配列番
号７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７（配列番号８）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＦＴ０７３（配列番号９）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２（配列番号１３）、フォトラブドゥス ルミネセンス サブスピーシーズ ラウモンディイ（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｕｍｏｎｄｉｉ）ＴＴＯ１（配列番号１４）、シェワネラ オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）ＭＲ−１（配列番号１５）およびザントモナス カンペストリス パリバー カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）株ＡＴＣＣ ３３９１３（配列番号１６）のｔｙｒＡコーディング配列である。
【００７２】
一態様において、発現を高めるためにｔｙｒＡ遺伝子の上流で強力なプロモーターを使用することが有用であることができる。強力なプロモーターは、標的宿主からであろうと若しくは異種株からであろうと、天然のｔｙｒＡ発現プロモーターの代わりに用いられ、そしてｔｙｒＡの発現を制御するためそのコーディング領域に作動可能に連結される。構成的および調節されるプロモーターを包含する、腸内細菌標的細胞中で高レベルの発現を与えるいかなるプロモーターも使用しうる。こうしたプロモーターは多数でありかつ当業者になじみがあり、そして、例えばｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λ ＰＬ、λ ＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｍａｌＥ、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）スピーシーズのグルコース異性化酵素、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）スピーシーズのｎｐｒＭ、ｒｒｎＢ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｃｓｐＡおよびｇｙｒＡを包含しうる。ｔｒｃプロモーターがとりわけ適する。
【００７３】
ｔｒｃプロモーターはｌａｃリプレッサーにより調節されるプロモーターの一例である。これらのプロモーターは遺伝子発現の駆動において確実であるとは言え、遺伝子欠失若しくは標的突然変異誘発によりｌａｃリプレッサーを阻害することが必要でありうる。ｌａｃ欠失の作製方法は当該技術分野で公知であり、そして多くの腸内細菌のｌａｃ標的配列は一般に入手可能である。
【００７４】
非機能的ｐｈｅＡ構築物、およびｔｙｒＡを発現する強力なプロモーターを含有する染色体セグメントは、高レベルのチロシン産生を得るのに有用な他の遺伝因子もまた包含しうる。これらの任意の因子は高発現が望ましい遺伝子を包含しうる。例えば、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、ａｒｏＬ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣおよび／若しくはｔｙｒＢ遺伝子を染色体セグメントに挿入しうる。強力なプロモーターを使用して、包含される各コーディング領域を発現しうるか、若しくは複数のコーディング領域が高発現プロモーターの制御下のオペロンを形成しうる。上で本明細書に記述されるｔｙｒＡを発現するのに使用しうるもののようなプロモーターを使用しうる。
【００７５】
加えて、介在遺伝子を包含するｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域を有する腸内細菌標的宿主株を使用する場合、変えられたｐｈｅＡ、およびｔｙｒＡを発現する強力なプロモーターを含有する染色体セグメントは、該介在遺伝子配列もまた包含しうる。
【００７６】
工作された染色体セグメントの、非機能的ｐｈｅＡ構築物、およびｔｙｒＡを発現する強力なプロモーター、ならびに上述された任意の他の要素を、プラスミド若しくは細菌染色体中で組合せうる。当業者に公知のＰＣＲおよび／若しくはクローニング方法を使用して該要素を個々に構築しうる。クローニング法はまた、プラスミド中で要素を組合せるのにも使用しうる。あるいは、要素はプラスミドから細菌染色体に導入しうるか、若しくは要素は細菌染色体中で直接構築しうる。該要素をその後組合せうる。例えば、実施例１に記述されるとおり、ｐｈｅＡ遺伝子の欠失を細菌染色体中で直接構築しうる。別個の細菌株で、ｔｒｃプロモーターを細菌染色体中のｔｙｒＡプロモーターの代わりに直接用いう
る。細菌染色体中のこれらの個別に構築された要素をその後、バクテリオファージに媒介される普遍形質導入を使用して組合せうる。この方法は非効率的であり、そして、それ、ならびに既知のＰＣＲおよびクローニング方法のいずれかを使用して、工作された染色体セグメントの要素を組み合わせることは、多くの段階を必要とする。一旦分離されれば、工作された染色体セグメント（プラスミド上であれ若しくは細菌染色体中であれ）を一段階で標的宿主に挿入して、チロシン過剰産生株を生じさせうる。
【００７７】
工作された染色体セグメントを、内因性のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の部位で腸内細菌の標的宿主染色体に挿入し、そして内因性のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域を置換する。工作された染色体セグメントの挿入は、ファージ導入、接合、あるいはプラスミド導入またはプラスミド以外の二本若しくは一本鎖ＤＮＡ導入、次いで相同的組換えによるような、当業者に既知のいずれの方法によってもよい。バクテリオファージ形質導入においては、当該技術分野で公知でありかつＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９７２）により記述される標準的遺伝子形質導入方法を使用する。細菌染色体中で構築した工作された染色体セグメントをファージにパッケージングし、その後ファージ感染により標的宿主細胞に導入し、次いで相同的組換えで工作された染色体セグメントを標的宿主細胞の染色体に挿入する。
【００７８】
ＤＮＡフラグメントは、相同的組換えが生じることができる配列を提供するように、細菌染色体中でこの染色体セグメントに天然に隣接する配列を包含する方法により、工作された染色体セグメントをもつ細菌染色体から調製しうる。隣接相同配列は、Ｌｌｏｙｄ，Ｒ．Ｇ．とＫ．Ｂ．Ｌｏｗ（１９９６；Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ｐ．２２３６−２２５５．Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ（編）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤＣ中）に記述されるとおり、相同的組換えを支援するのに十分である。典型的には、相同的組換えに使用される相同配列は長さ１ｋｂ超であるが、しかし５０若しくは１００ｂｐくらい短くてもよい。工作された染色体セグメントおよび隣接相同配列を含有するＤＮＡフラグメントは、制限消化によるように、若しくは超音波処理のような無作為端を生成する方法を使用して、確定された端を伴い製造しうる。いずれの場合も、工作された染色体セグメントを保有するＤＮＡフラグメントは、例えば、電気穿孔法、凍結融解法を包含するいずれかのＤＮＡ取り込み法により、若しくは化学的にコンピテントな細胞を使用して、標的宿主細胞に導入しうる。該ＤＮＡフラグメントは、工作された染色体セグメントでの標的宿主の内因性染色体ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の置換をもたらす相同的組換えを受ける。
【００７９】
プラスミドを使用して、工作された染色体セグメントを挿入のため標的宿主細胞に保有しうる。典型的には、非複製プラスミドを使用して組込みを促進する。工作された染色体セグメントは、相同的組換えが起こることができる配列を提供するように、細菌標的宿主ゲノム中でこの染色体セグメントに天然に隣接するＤＮＡ配列によりプラスミド中で隣接されている。該隣接相同配列は上述されたとおりであり、そして、プラスミドＤＮＡの導入は上述されたとおりである。
【００８０】
これらの方法のいずれかを使用して、相同的組換えは、バクテリオファージλ Ｒｅｄ系［ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６６４０−６６４５］および［Ｅｌｌｉｓら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：６７４２−６７４６］、若しくはＲａｃファージＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ系［Ｚｈａｎｇら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：１３１４−１３１７］のようなバクテリオファージ相同的組換
え系の使用により高めうる。加えて、遺伝子挿入および変異体選択について、共通に所有される第ＵＳＳＮ １０／７３４９３６号明細書；および米国特許第６，６７３，５６７号明細書に開示されるもののような方法が本出願で有用であることができる。
【００８１】
方法のいずれにおいても、相同的組換えは、工作された染色体セグメントでの標的宿主の内因性の染色体ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の置換をもたらす。
【００８２】
工作された染色体セグメントの成功裏の挿入を伴うレシピエント株はマーカーを使用して同定しうる。スクリーニング若しくは選択いずれのマーカーも使用することができ、選択マーカーがとりわけ有用である。例えば、抗生物質耐性マーカーが、工作された染色体セグメント中に存在することができ、その結果、それが新たな宿主に移入される場合に、工作された染色体セグメントを受領する細胞が対応する抗生物質上での増殖により容易に同定され得る。あるいは、容易に検出可能である産物の産生を賦与するものであるスクリーニングマーカーを使用しうる。マーカーがレシピエント株中に留まらないことが望ましい場合には、それをその後、部位特異的組換えを使用することによるように除去しうる。この場合、部位特異的組換え部位は、組換え酵素の発現が該マーカーの欠失を引き起こすことができるようなマーカーＤＮＡ配列の５’および３’に位置する。
【００８３】
経路の要素の調節；ＤＡＨＰ合成酵素。ｔｙｒＲ
上に示されたとおり、ｐｈｅＡ機能の排除およびｔｙｒＡの上方制御に加え、芳香族アミノ酸経路の他の要素を、チロシンへの炭素の流れを高めるように調節することが付加的に有用でありうる。例えば、最終生成物のフィードバック阻害に抵抗性であるＤＡＨＰ合成酵素を含有する株についての選択が有用であることができる。こうした株は既知であり、そしてＢｏｎｇａｅｒｔｓら（２００１）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３：２８９−３００に記述されている。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）はａｒｏＧ、ａｒｏＦおよびａｒｏＨによりコードされるこの酵素の３種のアイソザイムを有する。野性型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、ａｒｏＧにコードされる酵素はフェニルアラニンにより阻害され、ａｒｏＦにコードされる酵素はチロシンにより阻害され、そしてａｒｏＨにコードされる酵素はトリプトファンにより阻害される。従って、これらのアイソザイムのいずれも、フィードバック耐性を賦与するよう変えることができる。米国特許第４，６８１，８５２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示されるａｒｏＧ３９７突然変異はフィードバック耐性ＤＡＨＰ酵素の創製においてとりわけ有用である。ＴｙｒＲもまた、米国特許第４，６８１，８５２号明細書に開示されるタンパク質中の突然変異によるか若しくはｔｙｒＲ遺伝子の発現を封鎖することによるかのいずれかで非機能的にすることができる。ＴｙｒＲは、芳香族アミノ酸生合成経路のａｒｏＦ、ｔｙｒＡ、ａｒｏＧ、ａｒｏＬおよびｔｙｒＢを包含する数種の遺伝子の発現を抑制する調節タンパク質である［Ｐｉｔｔａｒｄら（２００５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：１６−２６］。ｔｙｒＲ３６６突然変異［ＣａｍａｋａｒｉｓとＰｉｔｔａｒｄ（１９７３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１５：１１３５−１１４４］はＴｙｒＲを不活性化するのにとりわけ有用である。主題の腸の（ｅｎｔｅｒｉｃ）宿主のｔｙｒＲ配列を知る当業者は、遺伝子突然変異および破壊の技術分野で公知の手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋ 上記）を使用して破壊変異体を創製することが容易に可能であろう。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のｔｙｒＲ遺伝子の配列を配列番号３１として本明細書に示す。付加的なｔｙｒＲ配列が公的に入手可能であり；例えば
・大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７ ＤＮＡ、完全なゲノム：
ｇｉ｜４７１１８３０１｜ｄｂｊ｜ＢＡ０００００７．２｜［４７１１８３０１］
・大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＣＦＴ０７３、完全なゲノム
ｇｉ｜２６１１１７３０｜ｇｂ｜ＡＥ０１４０７５．１｜［２６１１１７３０］
・大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＵＴ１８９、完全なゲノム
ｇｉ｜９１２０９０５５｜ｒｅｆ｜ＮＣ＿００７９４６．１｜［９１２０９０５５］
・大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０ ＤＮＡ、完全なゲノム
ｇｉ｜８９１０６８８４｜ｒｅｆ｜ＡＣ＿００００９１．１｜［８９１０６８８４］
・ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２、完全なゲノム
ｇｉ｜１６７６３３９０｜ｒｅｆ｜ＮＣ＿００３１９７．１｜［１６７６３３９０］
を参照されたい。
【００８４】
従って、ＴｙｒＲの発現の影響を排除すること、ならびにＤＡＨＰ合成酵素をフィードバック耐性にすることは、芳香族アミノ酸生合成経路を通りコリスミ酸への中間体のより多い流れを創製し、それはチロシン過剰産生株への本転換方法で使用される宿主でとりわけ有用である。
【００８５】
表現型形質
芳香族アミノ酸生合成経路における中間体の流れを増大させることは、経路の産物および経路の産物のアナログに対する宿主株の耐性を選択することにより達成しうる。３−フルオロチロシン、パラ−フルオロフェニルアラニン、β−２−チエニルアラニン、チロシンおよびフェニルアラニンのような化合物を、それぞれ耐性細胞のスクリーニングで使用しうる。上で挙げられた化合物に適用されるところの、本明細書で使用されるところの「耐性」という用語は、米国特許第４，６８１，８５２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるところの、細胞の突然変異誘発、およびこれらの化合物に対する耐性についてのスクリーニングのプロトコルと一致した様式で使用する。芳香族アミノ酸生合成経路の産物および経路の産物のアナログに耐性の細胞は、ＤＡＨＰフィードバック耐性、ＴｙｒＲ調製若しくは他の経路の流れを制御する因子に影響を及ぼす突然変異を有しうる。耐性の特性を引き起こす特定の突然変異は、該突然変異を含有する細胞が本方法での宿主株として有用であるために完全に特徴づけられる必要はない。
【００８６】
チロシンの産生
本方法によりチロシン過剰産生体に転換された腸内細菌株はチロシンを作製し、チロシンは培地中に排出される。これらの株は、商業的量のチロシンを製造する醗酵槽で増殖させうる。本方法により製造される株は最低約２６ｇ／Ｌであるチロシンレベルを生じ、ここで最低約５０ｇ／Ｌの産生レベルが期待され、かつ、最低約７５ｇ／Ｌのレベルを企図している。最低約４５ｇ／Ｌであるチロシンレベルを生じる、本方法により製造される株がとりわけ有用である。１０リットル醗酵槽中で約４８ｇ／Ｌのチロシンを産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＤＰＤ４１１９、実施例６を参照されたい）を、本方法を使用して作製した。工作された染色体セグメントΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲに加え、本株は３−フルオロチロシン、パラ−フルオロフェニルアラニン、β−２−チエニルアラニン、チロシン、高フェニルアラニンおよび高温に耐性である。最低約５０ｇ／Ｌであるチロシンレベルを生じる、本方法により製造される株が最も好ましい。１０リットル醗酵槽中で約５４ｇ／Ｌのチロシンを産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＤＰＤ４１４５、実施例８）を、本方法を使用して作製した。工作された染色体セグメントΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡに加え、本株は、３−フルオロチロシン、パラ−フルオロフェニルアラニン、β−２−チエニルアラニン、チロシン、高フェニルアラニンおよび高温に耐性であり、かつ染色体突然変異ΔｌａｃＩＺＹＡもまた有する。
【００８７】
本開示の生産醗酵すなわち「スケールアップ醗酵」は１０Ｌ以上、および通常は２００Ｌ若しくはそれ以上の好気的バッチ醗酵を記述する。チロシンの商業的生産が望ましい場合、多様な培養の方法論を適用しうる。例えば、組換え微生物宿主からの大スケール生産は、バッチおよび連続双方の培養の方法論により生じうる。古典的なバッチ培養法は、培地の組成を培養の開始時に設定しそして培養工程中に人工的改変にかけない閉鎖系である
。従って、培養工程の開始時に、培地に所望の生物体（１種若しくは複数）を接種し、そして該系に何も添加せずに増殖若しくは代謝活動を起こさせる。典型的には、しかしながら、「バッチ」培養は炭素源の添加に関してバッチであり、そしてｐＨおよび酸素濃度のような因子の制御で試みがしばしばなされる。バッチ系では、該系の代謝物およびバイオマス組成は培養を終了する時点まで絶えず変化する。バッチ培養物内で、静的対数期から高増殖対数期および最終的には増殖速度が低下若しくは停止する静止期まで、細胞が加減する。処理されない場合、静止期の細胞はついには死ぬことができる。対数期の細胞はしばしば、いくつかの系の最終生成物若しくは中間体の大部分の産生を司る。静止期若しくは指数増殖期後の産生は他の系で得ることができる。
【００８８】
標準的バッチ系に対する一変形物は流加系である。流加培養工程もまた本発明で適し、そして培養が進行する際に基質を徐々に添加することを除き典型的なバッチ系を含んでなる。流加系は異化作用産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合、および培地中に制限された量の基質を有することが望ましい場合に有用である。流加系での実際の基質濃度の測定は困難であり、そして従ってｐＨ、溶解酸素（ＤＯ）、およびＣＯ２のような排ガスの分圧のような測定可能な因子の変化に基づき推定する。バッチおよび流加培養法は一般的でありかつ当該技術分野で公知であり、そして、例はＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州サンダーランド中、若しくはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６、２２７、（１９９２）（引用することにより本明細書に組み込まれる）に見出しうる。
【００８９】
醗酵培地は適する炭素基質を含有する。適する基質は、限定されるものでないが、グルコースおよび果糖のような単糖、乳糖若しくはショ糖のようなオリゴ糖、デンプン若しくはセルロースのような多糖、またはそれらの混合物、ならびにチーズホエイ透析物、コーンスティープリカー、サトウキビ糖蜜およびオオムギ麦芽のような再生可能な原材料からの未精製混合物を挙げることができる。炭素基質は例えばアルコール、有機酸、タンパク質若しくは加水分解タンパク質またはアミノ酸もまた含みうる。それ故に、本醗酵で利用される炭素源は、多様な炭素含有基質を包含しうることを企図している。
【００９０】
チロシンの商業生産は連続培養でもまた達成しうる。連続培養は、合成培地をバイオリアクターに連続的に添加し、そして等量の馴化培地を加工のため同時に除去する開放系である。連続培養は、一般に、細胞が主として対数期増殖にある一定の高液相密度に細胞を維持する。あるいは、連続培養は、炭素および栄養素を連続的に添加しそして有益な産物、副生成物若しくは廃棄物を細胞塊から連続的に除去する、固定した細胞で実施しうる。細胞固定は、天然および／若しくは合成素材から構成される広範な固体支持体を使用して実施しうる。
【００９１】
連続若しくは半連続培養は、細胞増殖若しくは最終生成物濃度に影響を及ぼす１因子若しくはいずれかの数の因子の調節を見込む。例えば、一方法は、炭素源若しくは窒素濃度のような制限栄養素を固定した率に維持しかつ全部の他のパラメータを加減することを可能にすることができる。他の系では、培地濁度により測定される細胞濃度を一定に保ちつつ、増殖に影響を及ぼす多数の因子を連続的に変えることができる。連続的系は、定常状態の増殖条件を維持するよう努め、そして従って抜き出されている培地による細胞の喪失は培養物中の細胞増殖に対し均衡を保たなければならない。連続培養工程のための栄養素および増殖因子の調節方法、ならびに生成物形成の速度を最大化するための技術は工業微生物学の分野で公知であり、そして多様な方法がＢｒｏｃｋ、上記により詳述されている。
【００９２】
後に続くところの醗酵形態がチロシン産生にとりわけ適する。本方法によりチロシン過剰産生株に転換される所望の株を、オービタルシェーカー中約３００ｒｐｍで振とうしながら約３５℃で半天然培地中で振とうフラスコ中で増殖させ、そしてその後類似の培地を含有する１０Ｌ種醗酵槽に移す。種培養物は、ＯＤ５５０が１０と２５の間になるまで一定の空気散布下に種醗酵槽中で増殖させ、その場合に、醗酵パラメータがチロシン産生に至適化されている生産醗酵槽にそれを移す。種タンクから生産タンクに移される典型的な接種物容量は２．０〜１０ｖ／ｖ％の範囲にわたる。典型的な醗酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜３．０ｇ／ｌ）、リン酸ナトリウム（０〜２．０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜１．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０．３〜５．０ｇ／ｌ）のようなミネラル培地成分、酵母抽出物若しくはダイズに基づく生成物（０〜１０ｇ／ｌ）のような複合窒素源を含有する。痕跡量のＬ−フェニルアラニンおよび微量元素もまた、該株の至適の増殖のため一連の種（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）の全段階で培地に添加する。グルコース（若しくはショ糖）のような炭素源は、チロシンの率および力価を最大化するために初期のバッチ炭素源（１０〜３０ｇ／ｌ）の枯渇に際して醗酵容器に連続的に添加する。炭素源供給速度は、該培養物がグルコースを過剰に蓄積（酢酸のような毒性の副生成物の形成に至り得る）していないことを確実にするために動的に調節する。グルコースのような利用される基質から産生されるチロシンの収量を最大化するため、リン酸（最初にバッチで添加するか若しくは醗酵の経過中に供給するかのいずれかである）の量によりバイオマスの増殖を制限する。醗酵は水酸化アンモニウムおよび硫酸若しくはリン酸いずれかを使用してｐＨ６．８〜７．２に制御する。醗酵槽の温度は３２〜３５℃に制御し、また、ＤＯは、変数として攪拌（ｒｐｍ）および空気流（ＳＬＰＭ）を使用するカスケード制御により約１０〜２５％酸素飽和を維持する。起泡を最小限にするため、消泡剤（いずれかの分類のシリコーンに基づく、有機に基づく、など）を必要に応じて容器に添加する。使用されるとりわけ適する消泡剤はＢｉｏｓｐｕｍｅｘ１５３Ｋである。チロシンの最大産生のため、培養物をＯＤ５５０８〜１０で低濃度のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（０〜１．０ｍＭ）で誘導しうる。カナマイシンのような、それに対する抗生物質耐性マーカーが株に存在する抗生物質を、汚染を最小限にするために場合によっては使用しうる。
【００９３】
［実施例］
本発明は以下の実施例でさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示す一方で、具体的説明としてのみ示されることが理解されるべきである。上の論考およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確かめることができ、また、その技術思想および範囲から離れることなく、多様な用途および条件にそれを適応させるために本発明の多様な変更および改変を行い得る。
【００９４】
一般的方法
実施例で使用される標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で公知であり、かつ、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」上記、Ｅｎｑｕｉｓｔ 上記；およびＡｕｓｕｂｅｌ 上記により記述されている。
【００９５】
実施例で使用される標準的な遺伝子形質導入方法は当該技術分野で公知であり、かつ、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９７２）により記述されている。
【００９６】
略語の意味は後に続くとおりである。すなわち、「ｋｂ」はキロ塩基対（１若しくは複数）を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチド（１若しくは複数）を意味し、「ｈｒ」は時間（１若しくは複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（１若しくは複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（１若しくは複数）を意味し、「ｄ」は日（１若しくは複
数）を意味し、「Ｌ」はリットル（１若しくは複数）を意味し、「ｍｌ」はミリリットル（１若しくは複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットル（１若しくは複数）を意味し、「μｇ」はマイクログラム（１若しくは複数）を意味し、「ｎｇ」はナノグラム（１若しくは複数）を意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートル（１若しくは複数）を意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモル（１若しくは複数）を意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモル（１若しくは複数）を意味し、「ｐｐｍ」は百万分率を意味し、「ｖｖｍ」は１分あたり液体容量あたり平均空気容量を意味し、「ＣＦＵ」はコロニー形成単位（１若しくは複数）を意味し、「ＮＴＧ」はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「フェニルアラニン」若しくは「ｐｈｅ」はＬ−フェニルアラニンを意味し、そして「チロシン」若しくは「ｔｙｒ」はＬ−チロシンを意味している。「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸であり、「ＡＣＮ」はアセトニトリルであり、「ＫａｎＲ」はカナマイシン耐性であり、「Ｐｈｅ」はフェニルアラニン栄養要求性であり、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールであり、「Ｋａｎ」はカナマイシンであり、「Ｔｅｔ」はテトラサイクリンであり、「ＣＩＰ」は仔ウシ腸アルカリホスファターゼである。
【００９７】
培地および培養条件：
細菌培養物の維持および増殖に適する材料および方法は、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９７２）；Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ Ｒ．ＫｒｉｅｇとＧ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）、ｐｐ．２１０−２１３、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ（１９８１）；若しくはＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州サンダーランド中に見出された。細菌細胞の増殖および維持に使用した全部の試薬および材料は、別の方法で明記されない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（メリーランド州スパークス）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（カリフォルニア州カールズバッド）若しくはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（ミズーリ州セントルイス）から得た。
【００９８】
ＬＢ培地は、以下を培地１リットルあたりグラムで含有する：バクト トリプトン（１０）、バクト 酵母エキス（５．０）およびＮａＣｌ（１０）。
【００９９】
Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ培地は以下を１リットルあたりグラムで含有する：ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．２）；クエン酸・１Ｈ２Ｏ（２．０）、Ｋ２ＨＰＯ４（１０）；およびＮａＮＨ４ＨＰＯ４・４Ｈ２Ｏ（３．５）。
【０１００】
ＳＯＢ培地は以下を１リットルあたりグラムで含有する：バクト トリプトン（２０）、バクト 酵母エキス（５．０）、およびＮａＣｌ（０．５）、２５０ｍＭ ＫＣｌ（１０ｍｌ）、ｐＨをＮａＯＨで７．０に調節。
【０１０１】
上の培地はオートクレーブ処理したか若しくは濾過滅菌したかのいずれかであった。ビタミンＢ１（チアミン）を０．０００１％でＶｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ培地に添加した。
ＭｇＣｌ２をＳＯＢ培地に添加した（１リットルあたり２Ｍ溶液５．０ｍｌ）。炭素源ならびに他の栄養素および補給物は実施例で挙げられるとおり添加した。全部の添加物はそれらを培地に添加する前に前滅菌した。
【０１０２】
１０×ＭＯＰＳに基づく最少培地はＴｅｋｎｏｖａ（カリフォルニア州ハーフムーンベイ）から購入した。ＭＯＰＳ最少培地は、１リットルあたり後に続くとおり作製した：１０×ＭＯＰＳ（１００ｍｌ）、０．１３２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４（１０ｍｌ）、２０％グルコース（１０ｍｌ）。他の補給物は実施例で挙げられるとおり添加した。全部の添加物はそれらを培地に添加する前に前滅菌した。
【０１０３】
ＳＯＣ培地はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッド）から得た。
【０１０４】
ＭａｌｏｙとＮｕｎｎ（１９８１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５：１１１０−１１１２）により改変されたところのＢｏｃｈｎｅｒ選択プレートは後に続くとおり作製した：
溶液Ａ
バクト トリプトン ５．０ｇ
バクト 酵母エキス ５．０ｇ
クロルテトラサイクリン ５０ｍｇ（水性１２．５ｍｇ／ｍｌの４．０ｍｌ、暗所４℃
保存）
寒天 １５ｇ
Ｈ２Ｏ ５００ｍｌ
溶液Ｂ
ＮａＣｌ １０ｇ
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ １０ｇ
Ｈ２Ｏ ５００ｍｌ
【０１０５】
溶液ＡおよびＢは個別に１５ｐｓｉで２０分間オートクレーブ処理し、その後混合しかつ注入温度まで冷却した。５．０ｍｌの２０ｍＭ ＺｎＣｌ２および６．０ｍｌの２ｍｇ／ｍｌフサル酸を、プレートに注ぐ前に添加した。
【０１０６】
分子生物学技術：
制限酵素消化、ライゲーション、形質転換、およびアガロースゲル電気泳動の方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓに記述されるとおり実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術はＷｈｉｔｅ，Ｂ．、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第１５巻（１９９３）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、ニュージャージー州トトワに見出された。
【０１０７】
ＨＰＬＣ法
高速液体クロマトグラフィーはＡｇｉｌｅｎｔ １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）で実施した。ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ−Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。使用した方法は、１１分の停止時間および５分の後時間を伴う１．００ｍｌ／ｍｉｎのカラム流速を必要とした。移動相は９５％溶媒Ａ（水＋０．１％ＴＦＡ）および５％溶媒Ｂ（ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ）から構成された。ポンプは最低２０ｂａｒおよび最大４００ｂａｒと定義される圧限界内で運転した。スペクトルは１００ｎｍから３８０ｎｍまで走査し、チロシンのシグナルは２２５ｎｍおよび３．５９８分の保持時間で記録した。フェニルアラニンは４．３８８分の保持時間を伴い、２１５ｎｍで検出した。
【実施例１】
【０１０８】
チロシン過剰産生株の構築に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のゲノム領域
本実施例は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２染色体中の１領域の、チロシン排出に有益な２特徴との集成を記述する。コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素をコードするｐｈｅＡコーディング領域、リーダーペプチドをコードするｐｈｅＬコーディング領域、ならびにｐｈｅＬおよびｐｈｅＡのプロモーターを完全に欠失した。コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素酵素をコードするｔｙｒＡ遺伝子の天然のプロモーターを強力なプロモーターで置換した。
【０１０９】
ｔｅｔＲＡ環法（ｃｉｒｃｌｅ ｍｅｔｈｏｄ）（図２ないし５に描かれる）を使用して、ｐｈｅＬ、ｐｈｅＡおよびそれらの発現を駆動するプロモーターの完全な欠失を行った。所望の欠失に隣接する上流（ｙｆｉＡの３’端およびプロモーターの上流の遺伝子間領域；Ａと呼ばれる）ならびに下流（ｔｙｒＡの３’端および遺伝子間領域；Ｂと呼ばれる）の染色体領域のそれぞれに相同な隣接する６０ヌクレオチド領域を有する２種の１４０ｍｅｒのＰＣＲプライマーを設計した（図２Ａを参照されたい）。これらの１４０ｍｅｒプライマーの一方（プライマーＡＢＴＲ；配列番号１７）はまた、トランスポゾンＴｎ１０からの調節遺伝子をコードするｔｅｔＲ遺伝子に相同な２０ヌクレオチド領域を３’端に有した（図２Ｂを参照されたい）。他方の１４０ｍｅｒプライマー（プライマーＢＡＴＡ；配列番号１８）はまた、テトラサイクリン耐性を賦与するテトラサイクリン流出対向輸送体をコードするｔｅｔＡ遺伝子に相同な２０ヌクレオチド領域を３’端に有した（図２Ｂを参照されたい）。加えてそれぞれＡＢＴＲおよびＢＡＴＡプライマーの３’端と同一のｔｅｔＲ（プライマーＴＲ；配列番号１９）若しくはｔｅｔＡ（プライマーＴＡ；配列番号２０）に相同な領域をもつ２０ｍｅｒプライマーを使用した（図２Ｂを参照されたい）。これらのプライマーはＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ（テキサス州ウッドランズ）から得た。
【０１１０】
これらのプライマーを使用するＰＣＲ反応のための鋳型ＤＮＡは、ｔｅｔＲおよびｔｅｔＡ遺伝子を保有するいかなる株からも得ることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ２１１２（ｚｉｂ６１５：：Ｔｎ１０）若しくはネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴＴ２３８５（ｚｉｉ６１４：：Ｔｎ１０）のような、染色体中のどこかに転位因子Ｔｎ１０が配置された株を使用することが便宜的である。ＰＣＲ反応あたり０．５μＬの鋳型ＤＮＡを、ＤＰＤ４１１２若しくはＴＴ２３８５の単一コロニーを３２．５μＬの水および７．５μＬのＤＭＳＯに再懸濁すること、ならびに９５℃で１０分間加熱することにより調製した。２回のＰＣＲ反応（５０μＬ）を実施した。第一のＰＣＲ反応には、ＴＴ２３８５からの鋳型ＤＮＡとともにプライマーＴＲおよびＢＡＴＡを使用した（１０ｐｍｏｌ／μＬの各プライマー３μＬ）。第二のＰＣＲ反応には、ＤＰＤ４１１２からの鋳型ＤＮＡとともにプライマーＴＡおよびＡＢＴＲを使用した（１０ｐｍｏｌ／μＬの各プライマー３μＬ）。水１８．５μＬおよびＥｘＴａｑ Ｐｒｅｍｉｘ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．滋賀県大津市）２５μＬを添加した。ＰＣＲ反応条件は、９４℃／５分＋３５×（９４℃／１分；６０℃／２分；７２℃／３分）＋７２℃／１５分であった。期待された大きさ（２１５１ｂｐ）の産物が生成され、そしてＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）で精製した。
【０１１１】
ＰＣＲ産物は、後に続くとおり変性しかつ再アニーリングしてｔｅｔＲＡ環を形成した。ほぼ等モル量の各ＰＣＲ産物を合わせ、そしてＮａＣｌを１５０ｍＭの最終濃度まで添加した。これらを１００℃に加熱し、その後１時間にわたり以下の条件、１００℃／５分、９５℃／３分、各サイクル５℃の温度低下で各３分の１８の付加的サイクル、４℃／保持を使用して、サーモサイクラーで４℃にゆっくり冷却した。反応を３０，０００ＭＷカットオフをもつＭｉｃｒｏｃｏｎスピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して脱塩した。滅菌水を５００μＬの総容量まで添加した。カラムを微小遠心機で速度１２で１０分間回転した。水を添加し（５００
μＬ）そしてカラムを再度回転した。最後の回転前に２００μＬの水を添加した。必要な場合は２５μＬの水を添加してサンプルを回収した。ｔｅｔＲＡ環は、完全なｔｅｔＲおよびｔｅｔＡ遺伝子ならびに所望の欠失に隣接する領域を保有する開放環状分子である（図３を参照されたい）。
【０１１２】
脱塩したｔｅｔＲＡ環（１０μＬ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ＃７００９２６）の電気穿孔で使用した。電気穿孔コンピテント細胞は、単一コロニーを接種したマグネシウムを含まないＳＯＢ中室温、静止一夜３５ｍＬ培養物から調製した。培養物を、培養物が赤色フィルターを伴うＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計で５０の示度に達するまで３０℃で振とうしながらインキュベートした。細胞を遠心分離（１５分、設定９、４℃、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｂ）によりペレットにし、その後３．０ｍｌ氷冷水に再懸濁し、そして微小遠心管に移し、これを微小遠心機で４℃で３０秒間回転した。もう４回の氷冷水洗浄後に細胞を１５０μＬの氷冷水に再懸濁し、そして５０若しくは６０μＬを各電気穿孔に使用した。電気穿孔条件は、０．１ｍｍキュベット、２５μＦ、１．８５ｋＶ、２００オームであった。その後、７５０μＬのＳＯＣを添加し、培養物を微小遠心管に移し、そして３０℃で４時間若しくは３０℃で一夜インキュベートした。電気穿孔した細胞は、１５〜２０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬＢプレート上にプレーティングし、そして３７℃で１〜３日間インキュベートした。コロニーがテトラサイクリン耐性となるためには、ｔｅｔＲおよびｔｅｔＡ遺伝子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体に組込まれなければならない。これは、図４に示されるとおり、染色体に対するＡ領域の相同性を使用する相同的組換えにより起こりうる。同様に、組込みは相同なＢ領域を使用してもまた可能である。
【０１１３】
組込まれたｔｅｔＡおよびｔｅｔＢ遺伝子を保有するテトラサイクリン耐性コロニー（図４を参照されたい）を、１５〜２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢプレート上で精製した。テトラサイクリンを含むＬＢプレートから選択した単一コロニーから、テトラサイクリンを欠くＬＢプレートに画線することにより、第二の非選択的精製を行った。フサル酸に耐性であるテトラサイクリン感受性派生物の対選択を、ＭａｌｏｙとＮｕｎｎ（１９８１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５：１１１０−１１１２）により改変されたところのＢｏｃｈｎｅｒ選択プレート上で行った。ＬＢプレートからの単一コロニーをこれらのテトラサイクリン感受性選択プレートに画線し、それらを４２℃で２日間インキュベートした。これらのプレートからのテトラサイクリン感受性コロニーをＬＢプレート上で精製し、そしてその後、フェニルアラニンを含む若しくは含まない最少プレート上での増殖について試験した。
【０１１４】
この方法を使用して、テトラサイクリン感受性の単離物（元はテトラサイクリン耐性株からの）の１２〜１８％が、フェニルアラニンを含まない最少プレート上で増殖しなかった。これらのフェニルアラニン栄養要求性は、ｔｅｔＲおよびｔｅｔＡ遺伝子ならびにｐｈｅＡおよびｐｈｅＬコーディング領域、ならびにそれらのプロモーターを除去した組換えにより形成された（図５に具体的に説明されるところのＢ×Ｂ組換え）。この方法の性質により、これらのフェニルアラニン栄養要求株はｐｈｅＡおよびｐｈｅＬコーディング領域ならびにそれらのプロモーターの正確な欠失を保有した（ΔｐｈｅＬＡ）。保持された１種のこうしたフェニルアラニン栄養要求株をＤＰＤ４０７２と命名した。
【０１１５】
２ＰＣＲフラグメント組込み法（ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ ２００４０５６９７３ Ａ２号明細書）を使用して、強力なｔｒｃプロモーターがｔｙｒＡ遺伝子の発現を駆動しうるように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の染色体中にそれを配置した。この方法は、ｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）にすぐ隣接して配置される隣接ｆｌｐ部位をもつカナマイシン耐性カセットもまたもたらす。
【０１１６】
部位特異的組換え酵素標的配列（ＦＲＴ）により隣接されるカナマイシンで選択可能なマーカーを含有する第一の直鎖状ＤＮＡフラグメント（１５８１ｂｐ）を、鋳型としてプラスミドｐＫＤ４（ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ、ＰＮＡＳ、９７：６６４０−６６４５（２０００））のカナマイシン耐性遺伝子を使用するＰＣＲにより合成した。使用したプライマー対は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体中のｔｙｒＡ遺伝子の上流にあるａｒｏＦ終止コドンの上流領域の配列に一致するよう選ばれた相同性アーム（下線、４６ｂｐ）、およびカナマイシン耐性遺伝子のプライミング配列（２０ｂｐ）を含有するＴ−ｋａｎ（ｔｙｒＡ）（配列番号２１：５’−ＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＣＧＴＧＧＣＴＴＡＡＣＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧ−３’）、ならびに、ｔｒｃプロモーターＤＮＡフラグメントの５’端領域の配列に一致するよう選ばれた相同性アーム（下線、４２ｂｐ）、およびカナマイシン耐性遺伝子のプライミング配列（２２ｂｐ）を含有するＢ−ｋａｎ（ｔｒｃ）（配列番号２２：５’−ＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＧＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＧＡＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＴＣＣ−３’）であった。−１０および−３５コンセンサス配列、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、ならびにリボソーム結合部位（ｒｂｓ）から構成されるｔｒｃプロモーターを含有する第二の直鎖状ＤＮＡフラグメント（１６３ｂｐ）は、プライマー対すなわちｋａｎのオープンリーディングフレームの下流領域の配列に一致するよう選ばれた相同性アーム（下線、１８ｂｐ）、およびｔｒｃプロモーターのプライミング配列（２２ｂｐ）を含有するＴ−ｔｒｃ（ｋａｎ）（配列番号２３：５’−ＣＴＡＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＴ−３’）、ならびに、ｔｙｒＡ開始コドンの下流領域の配列に一致するよう選ばれた相同性アーム（下線、４６ｂｐ）、およびｔｒｃプロモーターのプライミング配列（２０ｂｐ）を含有するＢ−ｔｒｃ（ｔｙｒＡ）（配列番号２４：５’−ＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴＧＡＴＣＧＣＧＴＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡ−３’）を用い、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）からＰＣＲにより合成した。下線を付けた配列は各それぞれの相同性アームを具体的に説明する一方、残部は、該ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡ上の相補ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションのためのプライミング配列である。後に続くところの標準的ＰＣＲ条件を使用して、直鎖状ＤＮＡフラグメントをＭａｓｔｅｒＡｍｐＴＭＥｘｔｒａ−Ｌｏｎｇ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州マディソン）で増幅した：
ＰＣＲ反応： ＰＣＲ反応混合物：
段階１ ９４℃３分 １μＬプラスミドＤＮＡ
段階２ ９３℃３０秒 ２５μＬ ２×ＰＣＲ緩衝液＃１
段階３ ５５℃１分 １μＬ ５’−プライマー（２０μＭ）
段階４ ７２℃３分 １μＬ ３’−プライマー（２０μＭ）
段階５ 段階２へ行く、２５サイクル ０．５μＬ ＭａｓｔｅｒＡｍｐＴＭ ＤＮＡ
ポリメラーゼ
段階６ ７２℃５分 ２１．５μＬ 滅菌ｄＨ２Ｏ
【０１１７】
ＰＣＲ反応を完了した後、ＰＣＲ産物を、Ｍｉｎｉ−ｅｌｕｔｅ ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＫｉｔＴＭ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．カリフォルニア州バレンシア）を使用して精製した。ＤＮＡを最高速度で２回回転することにより１０μＬの蒸留水で溶離した。ＰＣＲ ＤＮＡサンプルの濃度は約０．５〜１．０μｇ／μＬであった。
【０１１８】
λ−Ｒｅｄ組換え酵素発現プラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株をＰＣＲフラグメントの組換えのための宿主株として使用した。該株は、λ−Ｒｅｄ組換え酵素発現プラスミドｐＫＤ４６（ａｍｐＲ）（ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ、上記）での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＣ１０６１の形質転換により構築した。ｐＤＫ４６
中のλ−Ｒｅｄ組換え酵素は、アラビノースで誘導可能なプロモーターの制御下で発現される３種の遺伝子すなわちｅｘｏ、ｂｅｔおよびｇａｍから構成される。形質転換体を３０℃で１００μｇ／ｍＬアンピシリンＬＢプレートで選択した。ｐＫＤ４６を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株のエレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞は後に続くとおり調製した。ｐＫＤ４６を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１細胞を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１ｍＭ Ｌ−アラビノースを含むＳＯＢ培地中３０℃で０．５のＯＤ６００まで増殖させ、次いで氷上で２０分間冷却した。細菌細胞を、Ｓｏｒｖａｌｌ（Ｒ）ＲＴ７ ＰＬＵＳ（Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、コネチカット州ニュートン）を使用して４，５００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離した。上清をデカントした後、ペレットを氷冷水に再懸濁しかつ再度遠心分離した。これを２回反復し、そして細胞ペレットを１／１００容量の氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。
【０１１９】
カナマイシンマーカーＰＣＲ産物（約１．０μｇ）およびｔｒｃプロモーターＰＣＲ産物（約１．０μｇ）双方を５０μＬのコンピテント細胞と混合し、そして氷上で予め冷却した電気穿孔キュベット（０．１ｃｍ）にピペットで入れた。電気穿孔は、２００オームに設定したパルス制御装置を伴う１．８ｋＶ、２５μＦに設定したＢｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを使用することにより実施した。ＳＯＣ培地（１．０ｍＬ）を電気穿孔後に添加した。細胞を３７℃で１時間インキュベートした。細胞のおよそ半分を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢプレートに広げた。プレートを３７℃で一夜インキュベートした後に、６個のカナマイシン耐性形質転換体を選択した。ｔｙｒＡ遺伝子の前のカナマイシンで選択可能なマーカーおよびｔｒｃプロモーター双方の染色体組込みをＰＣＲ分析により確認にした。形質転換体のコロニーを、２３μＬのＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．０μＬの５’−プライマーＴ−ｔｙ（テスト）（配列番号２５：５’−ＣＡＡＣＣＧＣＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＧ−３’）および１．０μＬの３’−プライマーＢ−ｔｙ（テスト）（配列番号２６：５’−ＧＣＧＣＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣ−３’）を含有する２５μＬのＰＣＲ反応混合物に再懸濁した。試験プライマーは組込み領域の近傍に位置する領域を増幅するように選んだ。Ｔ−ｔｙ（テスト）およびＢ−ｔｙ（テスト）プライマー対を用いるＰＣＲ分析は、１．０％アガロースゲル上で１，９２８ｂｐの期待された大きさの産物を示した。Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲをもつ結果として生じる組換え体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＳ１５８と呼んだ。
【０１２０】
Ｐ１ｃｌｒ１００Ｃｍファージ（Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９７２．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）を使用する普遍形質導入を使用して、Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲをΔｐｈｅＬＡと組み合わせた。Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＷＳ１５８で増殖させたファージをドナーとして使用し、ΔｐｈｅＬＡをもつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４０７２がレシピエントであり、そして選択は１２．５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレートでのカナマイシン耐性についてであった。１２．５μｇ／ｍＬで選択された形質導入体は、その後、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するプレート上で増殖することが可能であった。ＫａｎＲ形質導入体のコロニーを、フェニルアラニンを含むおよび含まない最少培地での増殖について試験することにより、フェニルアラニン栄養要求性についてスクリーニングした。得られた３１３個のＫａｎＲコロニーのうち、４個が増殖にフェニルアラニンを要求した。これら４株でのＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲの存在をＰＣＲ増幅により確認した。従って、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡの観察された共形質導入頻度は、隣接遺伝子について期待されたとおり＞９８％であった。それらのそれぞれがＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍ溶原菌であったＫａｎＲ、Ｐｈｅ−株を保持し、そしてＤＰＤ４０８１、ＤＰＤ４０８２、ＤＰＤ４０８３およびＤＰＤ４０８４と命名した。これらの新たに構築したΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：Ｋａｎ
Ｒ二重変異体株をドナーとして使用するその後のＰ１媒介性の普遍形質導入は、ΔｐｈｅＬＡおよびＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ双方を送達する＞９８％の頻度を有すると期待することができる。従って、大部分のＫａｎＲ形質導入体について、ｐｈｅＡはΔｐｈｅＡに、およびｔｙｒＡはＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲに転換されることができる。
【０１２１】
上述された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＤＰＤ４０８１およびＤＰＤ４０８２は、元はチロシンを排出しない株ＭＧ１６５５由来であり、そしてΔｐｈｅＬＡおよびＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲを保有する。これらの株を、チロシン栄養要求株ＡＴ２４７１（ＣＧＳＣ ＃４５１０）を使用する交差供給試験（ｃｒｏｓｓ ｆｅｅｄｉｎｇ ｔｅｓｔ）を実施することにより、制限するフェニルアラニンの条件下でのチロシン排出について試験した。従って、ＤＰＤ４０８１若しくはＤＰＤ４０８２を、炭素源としてのグルコースおよびビタミンＢ１を補充したＶｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ最少培地プレートに画線した。非常に近くしかし接せずにＡＴ２４７１を画線した。３０℃で１日間および室温で２日のインキュベーション後に、最も近いＤＰＤ４０８１若しくはＤＰＤ４０８２の画線の部分でのみＡＴ２４７１の良好な増殖が存在した。これらのプレート上に単独で画線した株ＡＴ２４７１は増殖しなかった。従って、ＤＰＤ４０８１若しくはＤＰＤ４０８２により産生されるチロシンがＡＴ２４７１の増殖を可能にし、そして、これ故に、これらの結果はチロシンがＤＰＤ４０８１およびＤＰＤ４０８２により排出されたことを示した。
【実施例２】
【０１２２】
チロシンを排出しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株のチロシン排出株への一段階転換
本実施例は、ΔｐｈｅＬＡおよびＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を導入する一段階方法を使用する、チロシンを排出しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のチロシン排出株への転換を記述する。
【０１２３】
チロシンを排出しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ＃２７３２５）を、実施例１で記述されたΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲの染色体領域を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４０８１のＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍライセートを使用する普遍形質導入でレシピエントとして使用した。１２若しくは２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢプレートでカナマイシン耐性について選択を行った。フェニルアラニン栄養要求性形質導入体ＫａｎＲを保持しかつＤＰＤ４１９８と命名した。この株を、２ｇ／Ｌグルコースおよび１０μｇ／ｍＬフェニルアラニンを含むＭＰＯＳ緩衝最少培地を使用して、３７℃、３００ｒｐｍで二重の振とうフラスコ中で培養物を増殖させることにより、チロシン産生について試験した。グルコースが枯渇した２２時間に、培養物上清中のチロシンおよびフェニルアラニンをＨＰＬＣにより測定した。二重の培養物上清のそれぞれは７８ｐｐｍのチロシンおよび７ｐｐｍのフェニルアラニンを有した。従って、かなりの量のチロシンが、Ｗ３１１０から一形質導入段階で派生させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１９８により産生されかつ培地中に排出された。
【実施例３】
【０１２４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２フェニルアラニン排出株のチロシン排出株への一段階転換
本実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２由来のフェニルアラニン排出株をチロシン排出株に一段階で転換するための、実施例１のΔｐｈｅＬＡおよびＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域の使用を記述する。
【０１２５】
２種の以前に記述された（米国特許第４，６８１，８５２号明細書）フェニルアラニンを排出する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株すなわちＮＳＴ３７（ＡＴＣＣ＃３１８８２）およびＮＳＴ７４（ＡＴＣＣ＃３１８８４）をＡＴＣＣから得た。これらの株を一段階でチロシン排出株に転換した。株ＮＳＴ３７およびＮＳＴ７４を、実施例１に記述された
ΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４０８１若しくはＤＰＤ４０８３のＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍライセートを使用する普遍形質導入でレシピエントとして使用した。１２若しくは２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢプレートでカナマイシン耐性について選択を行った。形質導入体をフェニルアラニン栄養要求性についてスクリーニングした。８種のＫａｎＲ形質導入体の８種はＮＳＴ３７のＰｈｅＡでもまたあり、ＫａｎＲ、Ｐｈｅ−形質導入体を保持しそしてＤＰＤ４１９３と命名した。同様に、ＮＳＴ７４のＫａｎＲ、Ｐｈｅ−形質導入体を保持しそしてＤＰＤ４１９５と命名した。２ｇ／Ｌグルコースを含みかつ表１および２に示されるところの他の培地の修正を伴うＭＰＯＳ緩衝培地での３７℃若しくは３２℃、３００ｒｐｍでの数回の振とうフラスコ試験を、親株ならびに転換した株で実施した。培地への補充物は、増殖の改善について試験するための一実験で添加したビタミンＢ１を除き、株の遺伝子型に従って増殖に必要とされるとおりであった。培養物上清中のチロシンおよびフェニルアラニンを表に示された時点でＨＰＬＣにより測定し、そして検出された濃度を表１および２に示す（［Ｐｈｅ］ｐｐｍおよび［Ｔｙｒ］ｐｐｍ）。チロシンは表１の培養物の上清で検出されず、また、低レベルのフェニルアラニンが表２の培養物の上清で検出された。
【０１２６】
【表１】
【０１２７】
【表２】
【０１２８】
かように、チロシンは、一形質導入段階で取得されたΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を保有する株により明らかに排出された。
【実施例４】
【０１２９】
Ｋ１２以外の低レベルのフェニルアラニンを排出する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のチロシン排出株への転換
本実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２由来でない、低レベルのフェニルアラニンを排出する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を一段階でチロシン排出株に転換するための、実施例１のΔｐｈｅＬＡおよびＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域の使用を記述する。
【０１３０】
低レベルのフェニルアラニンを排出するＫ１２以外の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（米国
特許第２，９７３，３９４号明細書）をＡＴＣＣから得（ＡＴＣＣ＃１３２８１）、そしてＤＰＤ１４３０と改名した。増殖にチロシンを必要とする株ＤＰＤ４１３０を、実施例１で記述されたΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４０８３のＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍライセートを使用する普遍形質導入でレシピエントとして使用した。選択は２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートでであった。大型および非常に小型のコロニーが観察された。大型コロニーのうち２個を精製し、そしてフェニルアラニン栄養要求株であることが示され、増殖にチロシンを必要としなかった。フェニルアラニンを含まないプレート上で画線した場合にこれらの株は増殖しなかった一方、チロシンを含まないプレートで画線した場合、それらは親株と異なり増殖した。ＤＰＤ４１１４およびＤＰＤ４１１５と命名したこれら２種の形質導入体は、マッコンキー寒天指標（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）プレートを使用してショ糖を醗酵することもまた示され、これは最初の株ＤＰＤ４１３０の特徴であるがしかし大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株の特徴でない。
【０１３１】
株ＤＰＤ４１１４およびＤＰＤ４１１５を、チロシン栄養要求株ＡＴ２４７１（ＣＧＳＣ ＃４５１０）を使用する交差供給試験を実施することにより、制限するフェニルアラニンの条件下でチロシン排出について試験した。従って、ＤＰＤ４１１４およびＤＰＤ４１１５をそれぞれ、炭素源としてグルコースおよびビタミンＢ１を補充したＶｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ最少培地プレートに画線した。非常に接近して、しかし接せずにＡＴ２４７１を画線した。３２℃で１日間のインキュベーション後に、ＤＰＤ４１１４若しくはＤＰＤ４１１５に最も近い画線の一部にのみＡＴ２４７１の良好な増殖が存在した。チロシンを排出しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＭＧ１６５５は同一条件下でＡＴ２４７１のいかなる増殖も可能にしなかった。これ故に、これらの結果は、チロシンがＤＰＤ４１１４およびＤＰＤ４１１５により排出されたことを示した。かように、本実施例において、フェニルアラニンを排出しかつチロシンを要求する株が、フェニルアラニンを要求しかつチロシンを排出する株に一段階で転換された。
【実施例５】
【０１３２】
高レベルのフェニルアラニンを排出する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のチロシン排出株への転換
本実施例は、高レベルのフェニルアラニンを排出する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株をチロシン排出株に一形質導入段階で転換するための実施例１のΔｐｈｅＬＡおよびＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域の使用を記述する。
【０１３３】
高レベルのフェニルアラニンを排出する株をいくつかの段階で得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１３９をＮＴＧを使用する突然変異誘発にかけ、次いで３−フルオロチロシンを使用してアナログ耐性について選択した。結果として生じる３−フルオロチロシン耐性株をＮＴＧで突然変異誘発し、そしてアナログ、パラ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性について選択した。結果として生じる３−フルオロチロシンおよびパラ−フルオロフェニルアラニン耐性株をＮＴＧで突然変異誘発し、そしてアナログβ−２−チエニルアラニンに対する耐性について選択した。結果として生じる３−フルオロチロシン、パラ−フルオロフェニルアラニンおよびβ−２−チエニルアラニン耐性株をＮＴＧで突然変異誘発し、そしてチロシン栄養要求株（Ｔｙｒ−）を単離した。３−フルオロチロシン、パラ−フルオロフェニルアラニン、β−２−チエニルアラニン耐性かつＴｙｒ−のチロシン耐性変異体株を選択した。結果として生じるチロシン、３−フルオロチロシン、パラ−フルオロフェニルアラニン、β−２−チエニルアラニンおよびＴｙｒ−株をファージＰ１、タイプＩファージおよびタイプＩＩファージに対する耐性について選択し、そしてその後キシロース陰性変異体を単離した。結果として生じる株を、欠失されたアテニュエーター（Ｎｅｌｍｓら Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９２ ５８（８）：２５９２−８および米国特許第５，１２０，８３７号明細書に記述される）を伴
うフィードバック耐性ｐｈｅＡ遺伝子をコードするプラスミドｐＪＮ３０７で形質転換した。最後にＴｙｒ＋原栄養株を単離し、そしてその後高フェニルアラニンおよび高温に耐性の株を得、そしてＤＰＤ４００３と命名した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４００３は醗酵でグルコースから＞４０ｇ／ｌのフェニルアラニンを産生する。
【０１３４】
フェニルアラニン排出株ＤＰＤ４００３はファージＰ１に耐性であった。従って、新たな遺伝物質を導入するのにＰ１媒介性の普遍形質導入を使用し得るようにファージＰ１感受性復帰変異株を単離した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４００３をＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍに感染させ、そしてまれなＣｍＲコロニーを単離した。これらの自発的な推定のＰ１耐性復帰変異株をその後、温度感受性の溶原性ファージを治癒させる（ｃｕｒｅ）ように４２℃で増殖について選択した。ＤＰＤ４１１０と命名された、これらの温度抵抗性かつＣｍ感受性単離物の１種が、Ｐ１に感受性であることが確認された。この確認は、Ｐ１ｃｌｒ１００Ｃｍによる感染後のＣｍＲコロニーの頻度を試験することにより行った。ＤＰＤ４００３の元の親株であるＤＰＤ４１３０の感染について得られたと類似の数のＣｍＲコロニーが、ＤＰＤ４１１０の感染について得られた。
【０１３５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１１０はカナマイシン耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＪＮ３０７を含有する。従って、この小型のプラスミドを欠くＤＰＤ４１１０の派生物を単離した。これは、ＤＰＤ４１１０を、致死量以下の濃度（５０若しくは７５μｇ／ｍｌ）のノボビオシンでＬＢ培地中３７℃で２２時間処理することにより達成された。これらの培養物からの単一コロニーをカナマイシン感受性について試験し、そして２個のこうした派生物を保持した。ＫａｎＳ株ＤＰＤ４１１２およびＤＰＤ４１１３でのプラスミドＤＮＡの喪失が、全ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動により確認された。
【０１３６】
株ＤＰＤ４１１２を、実施例１に記述されたΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４０８３のＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍライセートを使用する普遍形質導入でレシピエントとして使用した。高濃度のドナーＰ１ファージ、１００μｌのファージライセート、および非常に低濃度のカナマイシン（３．０μｇ／ｍｌ）を使用した。２５μｇ／ｍｌのカナマイシンの存在下で増殖することが不可能であった自発的低レベルカナマイシン耐性コロニーがこの手順で発生した。高レベル（２５μｇ／ｍｌ）のカナマイシンでその後増殖した１コロニーを得た。この形質導入体は、レシピエントＤＰＤ４１１２へのΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域の形質導入から生じる株について期待されるとおり、フェニルアラニン栄養要求株でありかつショ糖を醗酵することが示された。この新たな株ＤＰＤ４１１８もまた、クロラムフェニコールに対するその耐性およびその温度感受性により示されるとおりＰ１ｃｌｒ１００溶原菌であった。従って４２℃での増殖についての選択を行った。２種の結果として生じる株ＤＰＤ４１１９およびＤＰＤ４１２０はそれぞれ、クロラムフェニコール感受性でありかつチロシン栄養要求性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＡＴ２４７１の交差供給についてのプレートアッセイでチロシンを排出することが示された。
【０１３７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１１９およびＤＰＤ４１２０を振とうフラスコ中でチロシン産生について試験した。これらの実験は、２．０ｇ／Ｌグルコースおよび１０μｇ／ｍｌフェニルアラニンを含むＭＯＰＳ緩衝培地を使用して３２℃および３００ｒｐｍで行った。２４時間後にグルコースが枯渇し、そして培地中のチロシンおよびフェニルアラニンをＨＰＬＣにより測定した。表３は該結果を要約する。
【０１３８】
【表３】
【０１３９】
かように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４１１９およびＤＰＤ４１２０はかなりの量のチロシンを排出した。蓄積したプレフェン酸がフェニルピルビン酸に非酵素的に転化され得、それがその後フェニルアラニンにアミノ基転移されることが公知である［Ｙｏｕｎｇ，Ｉ．Ｇ．、Ｆ．ＧｉｂｓｏｎとＣ．Ｇ．ＭａｃＤｏｎａｌｄ（１９６９）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９２：６２−７２］および［Ｚａｍｉｒ，Ｌ．Ｏ．、Ｒ．ＴｉｂｅｒｉｏとＲ．Ａ．Ｊｅｎｓｅｎ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２８：２８１５−２８１８］ため、ｐｈｅＡの完全な欠失にもかかわらずフェニルアラニンもまた排出されたことは、驚くべきことではない。
【実施例６】
【０１４０】
チロシンの製造のための株ＤＰＤ４１１９の醗酵
本実施例は、醗酵における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１１９による高レベルのチロシン産生を記述する。株ＤＰＤ４１１９をさらなる培養のため１０Ｌ種醗酵槽（Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ）に移す前に、それを２．０Ｌ振とうフラスコ中で５００ｍｌの培地中３５℃、３００ｒｐｍでおよそ８．０時間増殖させた。振とうフラスコ培地は（１リットルあたりグラムで）：ＫＨ２ＰＯ４（１．０）；Ｎａ２ＨＰＯ４（３．０）；（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．０）；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．３）；酵母抽出物（２．０）；ＭＯＰＳ（１５．７）；Ｌ−Ｐｈｅ（０．１）；グルコース（１５）およびカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含有した。バッチ種醗酵槽培地は（１リットルあたりグラムで）：ＫＨ２ＰＯ４（２．１）；Ｎａ２ＨＰＯ４（０．９）；（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．５）；チアミン（１．０ｍｇ／ｌ）；Ｌ−Ｐｈｅ（０．２）および消泡剤（Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ１５３Ｋ）１．０ｍｌ／ｌを含有した。滅菌後、グルコースを２０ｇ／ｌの最終濃度まで、酵母抽出物を１．０ｇ／ｌで、カナマイシンを５０ｍｇ／ｌで、１６ｍｌの微量元素、およびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを２ｍＭで添加した。温度およびｐＨは、醗酵の全持続期間中それぞれ３５℃および６．８で維持した。細胞密度がＯＤ５５０２３に達した場合に、種醗酵槽からの培養物のアリコート（０．５ｌ）を、種醗酵槽と類似の培地組成を含有した別の１０Ｌ生産醗酵槽（Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ）に移した。生産醗酵槽の醗酵パラメータは後に続くとおりであった：１０％の溶解酸素、空気流０．５〜１ｖｖｍの間、温度３５℃、およびｐＨ６．８。グルコース（６０％）を、醗酵槽中の残余のグルコースレベルが０．５ｇ／ｌより下で維持されたような流加段階中に供給した。消泡剤Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ１５３Ｋを必要に基づき添加した。チロシンの産生を最大化するため、培養物をＯＤ５５０９．０で１．０ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、そして１６ｍｌの１．０Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏをこの時点で容器に添加した。サンプルを醗酵槽から定期的に抜き出し、そしてチロシン、Ｌ−フェニルアラニンおよびバイオマスについて分析した。結果を表４に示す。
【０１４１】
【表４】
【０１４２】
チロシンの産生についての上に報告された醗酵プロトコルは一例として示す。当業者は、チロシンの率および力価をさらに至適化するように従来技術に基づき本プロトコルの改変を容易に生成し得る。一例としての１つのこうした改変は、培地の成分および組成に対する変更、または流加様式の稼働中のグルコース供給プロファイルおよび／若しくは戦略に対する変更を包含し得る。
【０１４３】
かように、高レベルフェニルアラニン産生株由来でありかつ実施例１に記述されたΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１１９は、醗酵で４５ｇ／ｌ以上のチロシンを産生した。
【実施例７】
【０１４４】
ＩＰＴＧの要件を未然に防ぐためのｌａｃリプレッサーをコードするｌａｃＩの欠失
本実施例は、ΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ染色体領域に加えて、ｔｒｃプロモーターからのｔｙｒＡの発現がＩＰＴＧの非存在下で抑制されないようなＬａｃリプレッサーをコードするｌａｃＩの欠失もまた保有する、改良されたチロシン排出株を記述する。
【０１４５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１１９は、それが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２制限系と異なる能動的ＤＮＡ制限系を有するためにさらなる遺伝子操作に最適でない。従って、ＤＰＤ４１１９の先行株である株ＤＰＤ４１１２（実施例５）を、λＫＡＮ２（Ｅｃｏ ＲＩ部位にクローン化した温度感受性リプレッサーおよびＫａｎＲ遺伝子をコードするｃｌ８５７をもつλ挿入ベクターλ ＮＭ４５９である）を使用する低下ＤＮＡ制限活性の選択にかけた。ＤＰＤ４１１２の多数のＫａｎＲおよび温度感受性変異体をλＫＡＮ２での溶原化および選択後に得た。低下された制限の確認は、λ５０７（異なる免疫性（ｉｍｍ２１）をもつ透明なｃｌ ｔｅｓｔファージ）に対する交差画線により行った。制限欠損単離物は、ファージの増殖およびその後細胞溶解を可能にしかつ交差画線の領域の細菌増殖を低下させたものであった。４２℃での増殖によるプロファージの除去後に、２種のＫａｎＳ株を保持し、そしてＤＰＤ６００６およびＤＰＤ６００７として保存した。これらの株のλ５０７ｔｅｓｔファージとの比較滴定で、株ＤＰＤ６００７は下の表５で見られるとおり、制限活性の最大の低下を有した。
【０１４６】
【表５】
【０１４７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ６００７（ＤＰＤ４１１９の先行体由来の制限欠損株）を使用して、制限欠損を除きＤＰＤ４１１９に同等である株を構築した。従って、ＤＰＤ６００７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４０８３（ΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を保有するＫ１２株）のＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍライセートを使用するＰ１形質導入でレシピエント株であった。選択プレート中のカナマイシンの多様な濃度および多様な濃度のファージを使用して、カナマイシン耐性について選択を行った。２５μｇ／ｍｌカナマイシンで増殖することが可能な合計１５超の形質導入体を、３０℃での２日のインキュベーション後に得た。Ｐ１ｃｌｒ１００Ｃｍの溶原菌が同時に形成されていたかどうか知るために、これらのうち１５種を試験した。７種のＫａｎＲ株は温度抵抗性かつクロラムフェニルコールに感受性であり、それらがＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍを保有していなかったことを示した。非溶原性株の全７種は、カナマイシン耐性とのｐｈｅＬＡ欠失の共形質導入を示すフェニルアラニン栄養要求株であった。これらの株の３種すなわちＤＰＤ４１２７、ＤＰＤ４１２８およびＤＰＤ４１２９を保存し、そしてチロシン産生について振とうフラスコで試験した。この振とうフラスコ比較のため、炭素源として２ｇ／Ｌグルコースを使用しかつ１５μｇ／ｍｌフェニルアラニンの初期濃度を補充したＭＯＰＳ培地中で該株を増殖させた。３２℃での２４時間（この時点でグルコースは枯渇された）のインキュベーション後にチロシンおよびフェニルアラニンの濃度をＨＰＬＣにより測定した。非常に類似のチロシン産生が試験した全部の株について観察され（下の表６を参照されたい）、制限欠損が期待されたとおりチロシン産生経路を妨害しなかったことを示した。
【０１４８】
【表６】
【０１４９】
上の株中のカナマイシン耐性カセットはｆｒｔ部位により隣接され、そして従ってＦｌｐ組換え酵素（Ｄａｔｓｅｎｋｏ、上記）を使用して除去し得る。染色体中にＦＲＴ瘢痕（ｓｃａｒ）を残すこの手順を、プラスミドｐＣＰ２０（Ｄａｔｓｅｎｋｏ、上記）を使用して株ＤＰＤ４１２８で行い、株ＤＰＤ７００１を生成した。チロシン産生に対する不利な影響はこの変化により期待されない。これを、３２℃でのインキュベーションを伴い、２ｇ／Ｌグルコースおよび１０μｇ／ｍｌフェニルアラニンを含むＭＯＰＳ培地を使用して振とうフラスコで試験した。ＤＰＤ４１１９およびＤＰＤ７００１の生物学的複製物を試験し、また、２２時間サンプルの技術的複製物を採取し、従って各株について４測定値をもたらした。これらの測定値の平均および標準偏差を下の表７に示す。
【０１５０】
【表７】
【０１５１】
期待されたとおり、株ＤＰＤ４１１９およびＤＰＤ７００１は非常に類似のチロシン産生を有する。
【０１５２】
チロシン産生株ＤＰＤ４１１９およびＤＰＤ７００１でコリスミ酸ムターゼおよびプレフェン酸脱水素酵素活性をコードするｔｙｒＡの発現は染色体のｔｒｃプロモーターから駆動される。従って、ＬａｃＩリプレッサーはｔｙｒＡ発現を低下させかつ結果としてチロシン産生を制限することができ、そして従ってＩＰＴＧをＤＰＤ４１１９での醗酵に慣例に添加した。ｔｙｒＡの誘導可能な発現はこれらの株で必要でなかったことが期待された。事実、連続的な高ｔｙｒＡ発現は有益であることができ、その結果、ｔｙｒＡレベルが制限する場合に発生する障害の後で中間体が蓄積しない。従って、ＩＰＴＧに対する必要性を排除するため、およびより高レベルのｔｙｒＡ発現を与えるため、株ＤＰＤ７００１の染色体ｌａｃＩ遺伝子を欠失した。
【０１５３】
温度感受性ｓａｃＢプラスミドｐＴｓＣＳＥ７．３（米国特許第６，６７３，５６７号明細書）を使用して、ＬａｃリプレッサーをコードするｌａｃＩ遺伝子およびｌａｃＺＹＡオペロンの欠失を構築した。ｌａｃＩＺＹＡ領域に隣接する１．０ｋｂの領域の増幅のため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ゲノム配列を使用してＰＣＲプライマーを設計した（Ｌａｃ＿１プライマー、配列番号２７；Ｌａｃ＿２プライマー、配列番号２８；Ｌａｃ＿３プライマー、配列番号２９；Ｌａｃ＿４プライマー、配列番号３０）。
【０１５４】
ｌａｃＩＺＹＡ領域に遠位のプライマーのそれぞれはｐＴｓＣＳＥ７．３へのクローニングのためのＥａｇＩ部位を含有した。加えて、ｌａｃオペロンに近位のプライマーのそれぞれは、第二のＰＣＲ反応で使用される相補的な３３ｂｐの領域を含有した。プライマーＬａｃ＿１およびＬａｃ＿２を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＭＧ１６５５からの鋳型ＤＮＡを用いて１ｋｂのＰＣＲ産物を生成させた。同様に、プライマーＬａｃ＿３およびＬａｃ＿４を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＭＧ１６５５からの鋳型ＤＮＡを用いて１ｋｂのＰＣＲ産物を生成させた。これら２種のＰＣＲ反応の産物を、Ｌａｃ＿１およびＬａｃ＿４プライマーを用いる交差ＰＣＲ反応で鋳型として使用して、ｌａｃＩＺＹＡ欠失を伴う２ｋｂの領域を生成させた。ゲル精製およびＥａｇＩ消化後に、交差ＰＣＲ産物を、ＥａｇＩ消化しかつＣＩＰ処理したｐＴｓＣＳＥ７．３に成功裏にクローン化した。
【０１５５】
電気穿孔法を使用して、４種の独立なｌａｃＩＺＹＡ欠失プラスミドでＤＰＤ７００１を形質転換した。２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上４２℃で、ＤＰＤ４１１９若しくはＤＰＤ７００１の温度抵抗性のＣｍＲ派生物についての選択を実施した。ＤＰＤ７００１中の１種の組込まれたプラスミドを単離した。
【０１５６】
組込まれた欠失プラスミドを保有するＤＰＤ７００１のこの派生物を、４２℃で５％ショ糖を保有するＬＢプレートを使用するショ糖対選択にかけた。この選択は、ＤＰＤ７００１がショ糖を炭素源として利用し得るという事実にもかかわらず良好にはたらいた。期
待されたとおり、Ｌａｃ＋およびＬａｃ−双方の株がショ糖耐性選択から得られた（図６を参照されたい）。Ｌａｃ＋株に至るプラスミドの切り出しは元の染色体構造を復帰させる。Ｌａｃ−株をもたらす交差事象はｌａｃＩＺＹＡの欠失を生じ、そして、元は欠失プラスミドを構築するのに使用した３３塩基対セグメント、５’−ＧＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＴＴＧＣＧＴＧ−３’を後に残す（図６を参照されたい）。
【０１５７】
ＤＰＤ７００１中に組込まれたプラスミドを保有する株からのＬａｃ−およびＬａｃ＋双方の派生物が、ＬＢプレート上に単一コロニーについて画線した場合に、親のような小型の、および中程度の大きさのコロニーを生じたことが観察された。従って、ＬＢプレートでの５回の単一コロニー精製を実施し、そして「小型コロニー」もしくは「中型コロニー」の形態を保持した。２ｋｂのｌａｃオペロンに隣接する領域の外側のプライマーを使用するＰＣＲ試験は、「小型コロニー」および「中型コロニー」双方の株でのｌａｃオペロンの欠失を確認した。
【０１５８】
数種の単離物を、２ｇ／ｌグルコースおよび最初の１０μｇ／ｍｌフェニルアラニンを含むＭＯＰＳ緩衝培地を使用し、振とうフラスコ中でチロシンおよびフェニルアラニン産生について二重で試験した（下の表８を参照されたい）。
【０１５９】
【表８】
【０１６０】
２種の「小型コロニー」Ｌａｃ−株ＤＰＤ４１４５およびＤＰＤ４１４６は、親株ＤＰＤ７００１より約２５％より多いチロシンおよび２５％より少ないフェニルアラニンを有した。従って、ＬａｃＩリプレッサーの遺伝子の欠失は、ｔｒｃプロモーターからのｔｙｒＡのより高レベル発現を明らかに可能にする。これ故に、ＴｙｒＡタンパク質により触媒されるコリスミ酸→プレフェン酸→フェニルピルビン酸の段階での障害が部分的に軽減され、そしてより多量のチロシンが排出される。
【実施例８】
【０１６１】
チロシンの産生のための株ＤＰＤ４１４５の醗酵
その構築が実施例７に記述される株ＤＰＤ４１４５を、１０Ｌ醗酵でグルコースからのチロシンの産生について評価した。使用した醗酵プロトコルおよび培地は、以下の顕著な差違を除き、実施例６に記述されたものに類似であった。ＤＰＤ４１１９と異なり、ＤＰＤ４１４５を使用する醗酵はＩＰＴＧで誘導せず、そして抗生物質をプロトコル全体で使用しなかった。チロシン力価の有意の増大が表９に示されるとおり達成された。さらに、ＩＰＴＧ若しくは抗生物質への依存の欠如が、この株を経済的スケールアップに従いやす
くする。
【０１６２】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】芳香族アミノ酸生合成経路の具体的説明である。
【図２】Ａ）プライマー相同性領域（ＡおよびＢ）を伴う、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域中およびその周囲のコーディング領域、ならびに欠失の標的とされる領域（Δ）の図解を示す。Ｂ）ＰＣＲ鋳型ｔｅｔＡおよびｔｅｔＲ遺伝子領域、ならびにＴｅｔＲＡ環形成のためのＤＮＡフラグメントを生じさせるための２種のＰＣＲ反応で使用されるプライマーの図解を示す。
【図３】図２Ｂに示されるプライマーからのＰＣＲ産物のＴｅｔＲＡ環の形成の図解を示す。
【図４】ＴｅｔＲＡ環と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体の間の組換え反応、および生じる染色体組込み産物の図解を示す。
【図５】ｐｈｅＬＡ領域に組込まれたＴｅｔＲＡ環を保有する株についてのテトラサイクリン感受性対選択の２種の可能な結果の図解を示す。
【図６】ｌａｃＩＺＹＡ領域中に組込まれたｓａｃＢプラスミドを保有する株についてのショ糖耐性選択の２種の可能な結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学および微生物学の分野に関する。より具体的には、本発明はＬ−チロシンを過剰産生する株を製造するための一段階での細菌宿主の工作方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物からの化学物質の製造は生物工学の重要な応用となった。チロシンは、栄養補助食品および抗パーキンソン病薬Ｌ−ドーパの製造のための試薬であること等、その栄養および製薬学的用途により、微生物中での産生のための魅力的な化学物質である。加えて、チロシンは有益な工業的用途をもつ他の化合物の製造のための試薬としての可能性を有する。チロシンから潜在的に作製されうる化合物は、（Ｓ）−４−（２−クロロ−３−（４−ｎ−ドデシルオキシ）−フェニルプロピオナト）−４’，４（２−メチル）ブチルオキシ−ビフェニルカルボキシレート（ＣＤＰＭＢＢ；ＫｕｍａｒとＰｉｓｉｐａｔｉ（非特許文献１）、ｐ−ヒドロキシケイヒ酸（ｐＨＣＡ；特許文献１、特許文献２）、ｐ−ヒドロキシスチレン（ｐＨＳ；ｐ−ビニルフェノールとしてもまた知られる；特許文献３）、およびｐ−アセトキシスチレン（ＡＳＭとしてもまた知られる）のようなそれらのアセチル化誘導体を包含する。ＣＤＰＭＢＢは強誘電性液晶（ＦＬＣ）での使用のための強誘電体素材である。ｐＨＣＡは液晶高分子（ＬＣＰ）の製造のための有用な単量体である。ＬＣＰは電子コネクタならびに電気通信および航空宇宙科学の応用で使用されうる。滅菌放射に対するＬＣＰの耐性は、これらの素材が医療機器ならびに化学物質および食物包装の応用で使用されることもまた可能にした。ヒドロキシスチレンは樹脂、エラストマー、接着剤、コーティング、自動車の仕上げ塗料、インクおよびフォトレジストの製造のため、ならびに電子材料での単量体としての応用を有する。それらはまた、エラストマーおよび樹脂処方中の添加物としても使用しうる。
【０００３】
チロシンは微生物中で天然に作製されるが、しかし一般に、細胞の成長に十分である低レベルで存在する。チロシンの生合成経路は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でｔｙｒＡによりコードされるコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素酵素（コリスミ酸基質に作用する）でフェニルアラニン生合成経路から分岐する。フェニルアラニン経路では、コリスミ酸はコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水酵素（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではｐｈｅＡ遺伝子によりコードされる）の基質である。
【０００４】
増大されたレベルのチロシン産生を伴う微生物が、伝統的な遺伝子の方法ならびに遺伝子工学により得られている。ｐｈｅＡ若しくは他の生物体中でコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水酵素をコードする遺伝子のいずれかの発現が低下若しくは排除され、それによりコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水酵素によるコリスミ酸基質の競合を低下若しくは排除して、増大されたチロシン産生をもたらした［非特許文献２］。
【０００５】
別に、ｔｙｒＡ発現若しくは他の生物体中でのコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素酵素をコードする遺伝子のいずれかが増大され、それにより増大されたコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素酵素活性を伴い、コリスミ酸をチロシン産生に向ける細胞の能力を増大させた。特許文献４は、３−デオキシ−２−ケト−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７リン酸（ＤＡＨＰ）合成酵素（芳香族アミノ酸生合成経路の最初の酵素）、コリスミ酸ムターゼおよびプレフェン酸脱水素酵素をコードする遺伝子を保有するプラスミドで形質転換することによる、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）若しくはブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）宿主でのチロシン製造方法を開示する。特許文献５は、トリプトファンを産生するコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）若しくはブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）宿主でのチロシンの製造方法を開示する。トリプトファンを産生するコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）若しくはブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）宿主が、ＤＡＨＰ合成酵素およびコリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子を保有するプラスミドで形質転換される。
【０００６】
共通に所有される特許文献６は、変異体ｐｈｅＡ遺伝子を最初に導入することによる、チロシンを排出する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の工作を開示する。その後、第二の別個の段階で、ｔｒｃプロモーターに駆動されるｔｙｒＡ遺伝子を導入した。双方の導入を有するまれな形質導入体がチロシン排出株と同定された。
【０００７】
加えて、共通に所有される特許文献２は、フェニルアラニンをチロシンに転化するために組換え生物体中でフェニルアラニン加水分解酵素を発現させることによりチロシン産生を増大させることを開示する。
【０００８】
チロシンの製造のために微生物を工作するための努力にもかかわらず、最高の報告された濃度は、コリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）についてわずか２６ｇ／ｌである（非特許文献３）。従って、チロシンの商業生産を容易にするためのより高レベルでＬ−チロシンを産生する微生物に対する必要性が存続する。発明者は、２６ｇ／ｌを越えるレベルでＬ−チロシンを産生するように組換え腸内細菌を工作することにより、述べられた問題を解決した。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６３６８８３７号
【特許文献２】第ＵＳ２００５０１４８０５４Ａ１号
【特許文献３】第ＵＳ２００４００１８６０号
【特許文献４】欧州特許第０３３２２３４号
【特許文献５】欧州特許第０２６３５１５号
【特許文献６】第ＵＳ２００４０２４８２６７号
【非特許文献１】Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．５７ａ：８０３−８０６（２００２）
【非特許文献２】Ｍａｉｔｉら（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｈｉｎｄｕｓｔａｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔ．Ｂｕｌｌ．３７：５１−６５
【非特許文献３】Ｉｋｅｄａ，Ｍ．とＲ．Ｋａｔｓｕｍａｔａ．１９９２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：７８１−７８５
【発明の開示】
【００１０】
［発明の要約］
本発明は、チロシン過剰産生株およびそれの作製方法に関する。本発明の株は、ｐｈｅＡ遺伝子を非機能的にするためのそれの破壊、および遺伝子挿入のための単一挿入方法を使用するｔｙｒＡの上方制御すなわち過剰発現を含んでなる。該株は、芳香族アミノ酸経路の他の調節、およびチロシンの産生のための該株の利用性を高める他の表現型形質をさらに含みうる。
【００１１】
従って、本発明は、
ａ）ｉ）内因性ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ染色体領域；および
ｉｉ）コリスミ産を産生する芳香族アミノ酸生合成経路
を含んでなる腸内細菌株を提供すること；
ｂ）段階（ａ）の株の染色体に、
１）ｔｙｒＡをコードする１個のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたプロモーターを含んでなる核酸フラグメント；および
２）非機能的ｐｈｅＡ核酸配列
を含んでなる工作された染色体セグメントを挿入することであって、
該工作された染色体セグメントが、宿主染色体の内因性ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域を置換して、Ｌ−チロシンを過剰産生する株を創製する、
を含んでなる、Ｌ−チロシンを過剰産生する細胞株の作製方法を提供する。
【００１２】
好ましい一態様において、本発明は、本発明の方法により作製されたチロシン過剰産生株を提供する。あるいは、本発明は、以下の特徴：
ａ）ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＬ、ａｒｏＫ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ｔｙｒＡ、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＢよりなる群から選択される遺伝子を含んでなる、芳香族アミノ酸生合成経路の存在
ｂ）非機能的ｐｈｅＡ遺伝子
ｃ）ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λ ＰＬ、λ ＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｍａｌＥ、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、ｒｒｎＢ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｃｓｐＡ、ｇｙｒＡ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）スピーシーズのｎｐｒＭ、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）スピーシーズのグルコース異性化酵素よりなる群から選択されるプロモーターの制御下のｔｙｒＡ遺伝子の過剰発現；
ｄ）３−フルオロチロシンに対する耐性；
ｅ）パラ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性；
ｆ）β−２−チエニルアラニンに対する耐性；
ｇ）チロシンに対する耐性；ならびに
ｈ）高フェニルアラニンおよび高温に対する耐性
を含んでなる、チロシンを過剰産生する腸内細菌株を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、
ａ）本発明の方法により作製されたチロシンを過剰産生する腸内細菌株を提供すること；および
ｂ）Ｌ−チロシンが産生される条件下で前記チロシン過剰産生株を増殖させること
を含んでなる、Ｌ−チロシンの製造方法を提供する。
【００１４】
［図面の簡単な説明および配列の説明］
本発明は、本出願の一部を形成する以下の詳細な記述、図面および付随する配列表からより完全に理解され得る。
図１は、芳香族アミノ酸生合成経路の具体的説明である。
図２は、Ａ）プライマー相同性領域（ＡおよびＢ）を伴う、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域中およびその周囲のコーディング領域、ならびに欠失の標的とされる領域（Δ）の図解を示す。Ｂ）ＰＣＲ鋳型ｔｅｔＡおよびｔｅｔＲ遺伝子領域、ならびにＴｅｔＲＡ環形成のためのＤＮＡフラグメントを生じさせるための２種のＰＣＲ反応で使用されるプライマーの図解を示す。
図３は、図２Ｂに示されるプライマーからのＰＣＲ産物のＴｅｔＲＡ環の形成の図解を示す。
図４は、ＴｅｔＲＡ環と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体の間の組換え反応、および生じる染色体組込み産物の図解を示す。
図５は、ｐｈｅＬＡ領域に組込まれたＴｅｔＲＡ環を保有する株についてのテトラサイクリン感受性対選択の２種の可能な結果の図解を示す。
図６は、ｌａｃＩＺＹＡ領域中に組込まれたｓａｃＢプラスミドを保有する株についてのショ糖耐性選択の２種の可能な結果を示す。
【００１５】
以下の配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（“ヌクレオチド配列およ
び／若しくはアミノ酸配列開示を含有する特許出願の要件−配列の規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）”）に従い、また、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８）、ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
配列番号１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域のヌクレオチド配列である。
配列番号３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＦＴ０７３のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域のヌクレオチド配列である。
配列番号４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のＰｈｅＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７のＰｈｅＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＦＴ０７３のＰｈｅＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、ペスト菌（Ｙｅｒｓｈｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ ｂｉｏｖａｒ Ｍｅｄｉｅｖａｌｉｓ）株９１００１のＰｈｅＡタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のＰｈｅＡタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、エルウィニア カロトヴォラ サブスピーシーズ アトロセプティカ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）ＳＣＲＩ１０４３のＰｈｅＡタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、フォトラブドゥス ルミネセンス サブスピーシーズ ラウモンディイ（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｕｍｏｎｄｉｉ）ＴＴＯ１のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、シェワネラ オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）ＭＲ−１のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１６は、ザントモナス カンペストリス パリバー カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）株ＡＴＣＣ ３３９１３のＴｙｒＡをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１７はプライマーＡＢＴＲのヌクレオチド配列である。
配列番号１８はプライマーＢＡＴＡのヌクレオチド配列である。
配列番号１９はプライマーＴＲのヌクレオチド配列である。
配列番号２０はプライマーＴＡのヌクレオチド配列である。
配列番号２１はプライマーＴ−ｋａｎ（ｔｙｒＡ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２２はプライマーＢ−ｋａｎ（ｔｒｃ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２３はプライマーＴ−ｔｒｃ（ｋａｎ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２４はプライマーＢ−ｔｒｃ（ｔｙｒＡ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２５はプライマーＴ−ｔｙ（ｔｅｓｔ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２６はプライマーＢ−ｔｙ（ｔｅｓｔ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２７はプライマーＬａｃ＿１のヌクレオチド配列である。
配列番号２８はプライマーＬａｃ＿２のヌクレオチド配列である。
配列番号２９はプライマーＬａｃ＿３のヌクレオチド配列である。
配列番号３０はプライマーＬａｃ＿４のヌクレオチド配列である。
配列番号３１は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のｔｙｒＲ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００１６】
［発明の詳細な記述］
本発明は、ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ染色体領域、および少なくともコリスミ酸産物までの芳香族アミノ酸生合成経路を有する腸内細菌宿主でのチロシン過剰産生株の工作方法を記述する。一段階の方法で、ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ染色体領域のｐｈｅＡコーディング領域を不活性化し、そして強力なプロモーターおよびｔｙｒＡコーディング領域を包含するキメラ遺伝子を染色体に挿入する。ｐｈｅＡ発現の非存在下でのｔｙｒＡの強力な発現は、該宿主株を過剰産生ともまた呼ばれる高レベルのチロシンを産生するものに転換し、その結果チロシンが該細胞から排出される。
【００１７】
本開示では多数の用語および略語を使用する。以下の定義を提供する。
【００１８】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記する。
【００１９】
「アンピシリン」はａｍｐと略記する。
【００２０】
「カナマイシン」はｋａｎと略記する。
【００２１】
本明細書で使用されるところの「発明」若しくは「本発明」という用語は、提示されるところの若しくは後に補正かつ追補されるところの請求の範囲、または本明細書に記述されるところの本発明の全部の態様に一般に当てはまることを意味している。
【００２２】
「遺伝子」は、コーディング配列に先行する（５’非コーディング配列）および後に続く（３’非コーディング配列）制御配列を包含する、特定の１タンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「天然の遺伝子」若しくは「野性型遺伝子」はそれ自身の制御配列とともに天然に見出されるところの遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見出されない制御およびコーディング配列を含んでなる、天然の遺伝子でないいかなる遺伝子も指す。従って、キメラ遺伝子は異なる供給源由来である制御配列およびコーディング配列、若しくは同一供給源由来のしかし天然に見出されるものと異なる様式で配列された制御配列およびコーディング配列を含みうる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム中のその天然の位置にある天然の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体で通常見出されないがしかし遺伝子移入により該宿主生物体に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然の生物体に挿入された天然の遺伝子若しくはキメラ遺伝子を含み得る。「オープンリーディングフレーム」という用語は、ポリヌクレオチドをコードするがしかしいかなる調節エレメントも欠くことができる遺伝子若しくは遺伝子構築物のその部分を指す。「遺伝子構築物」という用語は、限定されるものでないが、単一核酸配列内に集成されかつ適切な宿主に形質転換される場合に特定の遺伝若しくは表現型形質を遂げることが可能な遺伝子、調節エレメント、オープンリーディングフレームなどを挙げることができる、遺伝因子のいかなる組合せも指すことができる。
【００２３】
遺伝子、遺伝子構築物などに関して使用される場合の「欠失」若しくは「破壊」という用語は、それが正常に機能する際の核酸配列の部分的若しくは完全な不活性化を指すことができる。配列中の欠失は、該配列の完全な若しくは部分的な不活性化をもたらしうる該配列の全部若しくは一部の除去を意味している。配列中の破壊若しくは挿入は、再度、該配列の正常に機能する能力を減少若しくは排除することができる該配列内の一要素の付加を指すことができる。欠失若しくは破壊は、該遺伝子若しくはコーディング配列を本発明の意味内で「非機能的」にすることができる。
【００２４】
「コーディング配列」若しくは「コーディング領域」は特定の一アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００２５】
「適する制御配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内若しくは下流（３’非コーディング配列）に配置されかつ関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡのプロセシング若しくは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列を包含しうる。
【００２６】
「プロモーター」はコーディング配列若しくは機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモーター配列の３’に配置される。プロモーターは天然の遺伝子にそっくりそのまま由来しうるか、若しくは天然で見出される異なるプロモーター由来の異なる要素から構成されうるか、若しくは合成ＤＮＡセグメントを含むことさえできる。多様なプロモーターが多様な組織若しくは細胞型において、または発達の異なる段階で、または多様な環境条件に応答して遺伝子の発現を指図しうることが当業者により理解される。遺伝子をほとんどの時点で大部分の細胞型において発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と称される。大部分の場合に制御配列の正確な境界は完全に定義されているわけではないため、多様な長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有しうることがさらに認識される。
【００２７】
「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響されるような、単一核酸フラグメント上の核酸配列の連合を指す。例えば、プロモーターは、それがコーディング配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合（すなわち、コーディング配列が該プロモーターの転写制御下にあること）、そのコーディング配列と作動可能に連結されている。コーディング配列はセンス若しくはアンチセンスの向きで制御配列に作動可能に連結し得る。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメント由来のセンス（ｍＲＮＡ）若しくはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳もまた指すことができる。
【００２９】
「過剰発現」という用語は、正常のすなわち形質転換されていない生物体での産生のレベルを越えるトランスジェニック生物体での遺伝子産物の産生を指す。
【００３０】
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補コピーである場合、それは一次転写物と称されるか、若しくは、それは一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であることができ、そして成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まずかつ細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡに相補的でありかつそれ由来である二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを包含しかつ従って細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写物若しくはｍＲＮＡの全部若しくは一
部に相補的でありかつ標的遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のいかなる部分、すなわち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロン若しくはコーディング配列とであってもよい。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、若しくは翻訳されないがそれでもなお細胞の過程に対する影響を有する他のＲＮＡを指す。
【００３１】
「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす、宿主生物体のゲノムへの核酸フラグメントの移入を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体は「トランスジェニック」若しくは「組換え」若しくは「形質転換」生物体と称される。
【００３２】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中心的な代謝の一部でなく、かつ、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある遺伝子をしばしば保有する染色体外要素を指す。こうした要素は、プロモーターフラグメントおよび選択された遺伝子産物のＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と一緒に細胞中に導入することが可能である独特な構築物に多数のヌクレオチド配列が結合され若しくは組換えられた、いずれかの供給源由来の一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡの直鎖状若しくは環状の自律複製配列、ゲノムに組込む配列、ファージ若しくはヌクレオチド配列でありうる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有しかつ該外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特殊なベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有しかつ該外来遺伝子に加えて外来宿主中でのその遺伝子の高められた発現を見込む要素を有する特殊なベクターを指す。
【００３３】
「ｐｈｅＡ」はコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水酵素をコードする腸内細菌で見出される遺伝子を指し、また、ＰｈｅＡは対応するコードされるタンパク質を指す。
【００３４】
「ｔｙｒＡ」はコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素酵素をコードする腸内細菌で見出される遺伝子を指し、また、ＴｙｒＡは対応するコードされるタンパク質を指す。
【００３５】
「ｔｙｒＲ」は、ａｒｏＦ、ｔｙｒＡ、ａｒｏＧ、ａｒｏＬおよびｔｙｒＢ遺伝子の遺伝子産物を包含する芳香族アミノ酸生合成経路の多様な要素の発現を調節する、腸内細菌で見出される遺伝子を指す。
【００３６】
「ＰＥＰ」はホスホエノールピルビン酸の略語である。
【００３７】
「ＤＡＨＰ」は３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸７−リン酸の略語である。
【００３８】
「ＤＨＱ」はデヒドロキナ酸の略語である。
【００３９】
「ＤＨＳ」はデヒドロシキミ酸の略語である。
【００４０】
「ＳＨＫ」はシキミ酸の略語である。
【００４１】
「Ｓ−３Ｐ」はシキミ酸−３−リン酸の略語である。
【００４２】
「ＥＳＰＳ」はエノールエーテル−５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸の略語である。
【００４３】
「ＣＨＡ」はコリスミ酸の略語である。
【００４４】
「ＰＰＡ」はプレフェン酸の略語である。
【００４５】
「ＨＰＰ」は４−ＯＨ−フェニルピルビン酸の略語である。
【００４６】
「Ｔｙｒ」はチロシンの略語である。
【００４７】
「Ｐｈｅ」はフェニルアラニンの略語である。
【００４８】
「ａｒｏＧ３９７」という用語は、フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性であるＤＡＨＰ合成酵素の産生をもたらすａｒｏＧ遺伝子中の特殊な一突然変異である。ａｒｏＧ３９７突然変異は当該技術分野で一般的かつ公知であり、そして米国特許第４，６８１，８５２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に報告されている。
【００４９】
本明細書で使用されるところの「ｔｙｒＲ３６６突然変異」という用語は、ｔｙｒＲ遺伝子を不活性化、下方制御若しくは非機能的にするという効果を有する。チロシンの本製造方法の情況内で、ｔｙｒＲの下方制御は、ＴｙｒＲが発現を抑制する芳香族生合成経路の多数の酵素の上方制御をもたらす。ｔｙｒＲ３６６突然変異は当該技術分野で公知でありかつ［ＣａｍａｋａｒｉｓとＰｉｔｔａｒｄ（１９７３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１５：１１３５−１１４４］に十分に報告されている。
【００５０】
「芳香族アミノ酸生合成経路」という用語は、フェニルアラニンおよびチロシン産生を司る、多くの微生物で見出される偏在する酵素経路を指す。本明細書で使用されるところの芳香族アミノ酸生合成経路を図１に具体的に説明し、そして、遺伝子ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＬ、ａｒｏＫ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ｔｙｒＡ、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＢによりコードされる酵素を部分的に含んでなる。
【００５１】
「フェニルアラニン過剰産生株」という用語は、その株の野性型で見られるものより有意により高いフェニルアラニンの内因性レベルを生じる微生物株を指す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フェニルアラニン過剰産生体の特定の一例は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＮＳＴ７４（米国特許第４，６８１，８５２号明細書）である。他者は、コリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）［Ｉｋｅｄａ，Ｍ．とＫａｔｓｕｍａｔａ，Ｒ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｏｒ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎ ｉｎ ａ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｓｔｒａｉｎ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．（１９９２）、５８（３）、ｐｐ．７８１−７８５］を包含しうる。高レベルで産生される場合、フェニルアラニンは典型的に培地に排出され、そして従って、フェニルアラニン過剰産生株は一般に「フェニルアラニン排出株」でもまたある。
【００５２】
「チロシン過剰産生株」という用語は、その株の野性型で見られるものより有意により高いチロシンの内因性レベルを生じる微生物株を指す。高レベルで産生される場合、チロインは典型的に培地に排出され、そして従って、チロシン過剰産生株は一般に「チロシン排出株」でもまたある。
【００５３】
「チロシン」はＬ−チロシンを指し、「フェニルアラニン」はＬ−フェニルアラニンを指し、そして「トリプトファン」はＬ−トリプトファンを指す。これらは指名される化合物のＬ−異性体である。
【００５４】
「マーカー」という用語は、スクリーニング若しくは選択により容易に検出可能である表現型形質を賦与する遺伝子を意味している。選択可能なマーカーは、マーカー遺伝子を有する細胞が増殖に基づき識別され得るものである。例えば、抗生物質耐性マーカーは、細胞を特定の抗生物質を含有する培地で増殖させる場合にその抗生物質に耐性である細胞の検出を可能にするため、有用な選択可能なマーカーとしてはたらく。スクリーニングで使用されるマーカーは、例えばその賦与された形質を可視化し得るものである。カロテノイド産生に関与する遺伝子、若しくは無色の化合物を着色化合物に転化するタンパク質（すなわちβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ）をコードするものがこの型のマーカーの例である。スクリーニングマーカー遺伝子はまたレポーター遺伝子とも称しうる。
【００５５】
「マーカーを利用すること」という用語は、該マーカーにより提供される表現型形質に基づき細胞を同定することを意味している。該マーカーは、選択およびスクリーニングを包含する方法により細胞を同定するための形質を提供しうる。
【００５６】
「陰性選択マーカー」という用語は、特定の条件下で有害である特性を賦与するＤＮＡ配列を意味している。該特質はプラスミド若しくは全細胞に対し有害でありうる。例えば、ショ糖の存在下でのｓａｃＢ遺伝子の発現は該発現細胞に対し致死的である。別の例は、プラスミドが複製し得ないような非許容温度で非機能的である温度感受性複製起点である。
【００５７】
ここで使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．とＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）（下で「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎｎ，Ｍ．Ｌ．とＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８４）；およびＧｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージー州ホーボーケンにより出版されたＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）により記述されている。
【００５８】
本発明は、醗酵によるＬ−チロシンの産生での使用のためのチロシンを過剰産生する腸内細菌株の作製方法を提供する。該チロシン過剰産生体は、芳香族アミノ酸生合成経路を介してコリスミ酸を産生する能力を最小限に有することができ、かつ、ｐｈｅＡ遺伝子中の破壊を有してそれを非機能的にすることができ、また、ｔｙｒＡを過剰発現していることができる。他の態様において、チロシン過剰産生株は、限定されるものでないが、フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性のＤＡＨＰ合成酵素をコードする遺伝子、ｔｙｒＲ遺伝子の下方制御；３−フルオロチロシンに対する耐性；パラ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性；β−２−チエニルアラニンに対する耐性；チロシンに対する耐性、ならびに高フェニルアラニンおよび高温に対する耐性を挙げることができる多様な他の遺伝および表現型形質を有することができる。
【００５９】
本発明のチロシン過剰産生株は、好ましくは、フェニルアラニン過剰産生株で開始しかつｐｈｅＡ遺伝子の欠失若しくは破壊およびｔｙｒＡ遺伝子の過剰発現を遂げるための単一遺伝子構築物でその株を形質転換して構築する。ｐｈｅＡの破壊は、フェニルアラニンの産生への炭素を遮断するという効果を有し（図１）、そして、ｔｙｒＡの過剰発現は、この付加的な炭素をチロシン産生専用の経路の一部に移動する（図１）。上に示された多
様な化学物質に対する耐性の付加的な特質についての選択は、一般に、該株の確固たる性質に寄与して、チロシン産生をさらに高める。
【００６０】
宿主株の選択
本発明は、チロシンを過剰産生する腸内細菌株、およびその株の新規構築方法を提供する。構築のための出発株の不可欠の要件は、それが芳香族アミノ酸経路によりコリスミ酸を産生し（図１）、かつ、ｐｈｅＡコーディング領域およびｔｙｒＡコーディング領域を相互に近接して含んでなることである。場合によっては、選択した株がフェニルアラニンの過剰産生体である場合が有用であることができる。ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡコーディング領域を相互に近接して有するいかなる腸内細菌株も、株転換のための本一段階方法の潜在的宿主である。
【００６１】
本発明でとりわけ適する腸内細菌は、限定されるものでないがエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エルジニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）およびエルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）を挙げることができる。腸内細菌は腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）のメンバーであり、そしてエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）のようなメンバーを包含する。それらは周毛性鞭毛（タツメラ属（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）を除く）により運動性若しくは非運動性の０．３〜１．０×１．０〜６．０ｍｍのグラム陰性の直線状桿菌である。それらは酸素の存在および非存在下で増殖し、また、ペプトン、肉抽出物および（通常は）マッコイ培地で良好に増殖する。数種は単独炭素源としてＤ−グルコースで増殖する一方、他方はビタミンおよび／若しくはミネラル（１種若しくは複数）を必要とする。それらは呼吸および醗酵代謝を伴い有機栄養性であるが、しかし好塩性でない。酸、およびしばしば目に見えるガスを、Ｄ−グルコース、他の炭水化物およびポリヒドロキシアルコールの発酵中に産生する。それらは酸化酵素陰性であり、かつ、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）０グループ１およびゼノラブドゥス ネマトフィルス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）を除きカタラーゼ陽性である。硝酸は亜硝酸に還元される（エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）およびエルジニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）の数種の株を除く）。ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は３８〜６０モル％（Ｔｍ、Ｂｄ）である。大部分の属内の種からのＤＮＡは、相互におよび該科の基準種大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）と最低２０％関連している。顕著な例外はエルジニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、ハフニア属（Ｈａｆｎｉａ）およびエドワードシエラ属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）の種であり、それらのＤＮＡは他の属からの種のものと１０〜２０％関連している。ジャガイモ黒脚病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）を除き、試験した全種が腸内細菌共通抗原を含有する（Ｂｅｒｇｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｈ．Ｂｅｒｇｙら、ボルティモア：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９８４）。
【００６２】
腸内細菌では、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡ遺伝子は腸内細菌染色体のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の成分であり、そして典型的には相互に隣接する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域は、ｐｈｅＡプロモーター、コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水酵素のリーダーペプチドをコードする４８ｂｐの配列であるｐｈｅＬ、ｐｈｅＡコーディング領域、ｒｈｏ非依存性転写終結配列、および反対の向きにｔｙｒＡコーディング領域を包含する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株からのｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の配列を配列番号１として示し、これはヌクレオチド１と８０の間のｐｈｅＡプロモーター、ヌクレオチド８１と１２８の間のｐｈｅＬコーディング領域、ヌクレオチド１２９と２２６の間の非コーディング遺伝子間配列、ヌクレオチド２２７と１３８７の間のｐｈｅＡコー
ディング領域、ヌクレオチド１３９４と１４２２の間のｒｈｏ非依存性転写終結配列およびヌクレオチド１４３０と２５５１の間のｔｙｒＡコーディング領域を包含する。
【００６３】
腸内細菌のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域は高度に保存されており、そしてこの領域の改変方法は一般に該分類の多くのメンバーに適用可能である。例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）内で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｏ１５７：Ｈ７（配列番号２）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＣＦＴ０７３（配列番号３）のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の配列は、Ｋ１２のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の配列にそれぞれ９８％同一である。典型的には、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡのコーディング領域もまた個別に保存されており、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株間で９７％くらい近い配列同一性を示す。これらの類似性は、それぞれ配列番号４、５および６として示されるＫ１２、Ｏ１５７：Ｈ７およびＣＦＴ０７３株のｐｈｅＡコーディング領域の配列、ならびにそれぞれ配列番号７、８および９として示されるＫ１２、Ｏ１５７：Ｈ７およびＣＦＴ０７３株のｔｙｒＡコーディング領域の配列中で容易に見られる。ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡ領域の保存は、該２コーディング領域の近接もまた共通の特徴である、腸内微生物（ｅｎｔｅｒｉｃｓ）該分類の他メンバーに広がる。例えば、対応するペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ ｂｉｏｖａｒ Ｍｅｄｉｅｖａｌｉｓ）株９１００１のタンパク質（配列番号１０）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のｐｈｅＡ産物（配列番号１１）のアミノ酸配列に対し６９％の同一性を有し、また、対応するエルウィニア カロトヴォラ サブスピーシーズ アトロセプティカ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）ＳＣＲＩ１０４３のタンパク質（配列番号１２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のｐｈｅＡ産物に対する７０％の同一性を有する。
【００６４】
染色体中で相互に近接して配置されるｐｈｅＡおよびｔｙｒＡに対応する遺伝子を有するいかなる腸内細菌株も、本方法の標的宿主となりうる。エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の株がとりわけ適しており、ＡＴＣＣにより＃７００９２６、＃２７３２５、＃３１８８２、＃３１８８４および＃１３２８１と呼称される株が最も好ましい。
【００６５】
示されるとおり、一態様において、フェニルアラニンの確固たる産生を示す株を同定することが有用であることができる。これが完全かつ高められた芳香族アミノ酸経路を示唆するためである。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フェニルアラニン過剰産生体の特定の例は、双方とも米国特許第４，６８１，８５２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＮＳＴ３７（ＡＴＣＣ ＃３１８８２）およびＮＳＴ７４（ＡＴＣＣ ＃３１８８４）である。本株転換法を使用してチロシン過剰産生体に転換しうる、低レベルのフェニルアラニン排出を伴うＫ１２以外の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の一例は、ＡＴＣＣ＃１３２８１（米国特許第２，９７３，３０４号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる））である。
【００６６】
チロシン過剰産生体の構築：芳香族アミノ酸生合成経路の改変
適する宿主若しくは株が一旦同定されれば、芳香族アミノ酸経路の重要な要素の改変方法を使用してチロシン過剰産生株を生成しうる。
【００６７】
芳香族アミノ酸経路の関連する要素を図１に具体的に説明する。簡潔には、該経路は最終的にグルコースから炭素を受領し、そして、遺伝子のａｒｏＦＧＨの組によりコードされるＤＡＨＰ合成酵素により触媒される、ＤＡＨＰを形成するためのＥ４ＰおよびＰＥＰの縮合で合成が進行する。該経路は、図１に示されるところの遺伝子ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＬ、ａｒｏＫ、ａｒｏＡおよびａｒｏＣにコードされる酵素により触媒される多様な中間体を通って、コリスミ酸が産生される点まで進行する。コリスミ酸はアントラニル酸合成酵素（トリプトファン合成に至る）および、最初にプレフェン酸（それ自身は、フェニルアラニン合成に至るプレフェン酸脱水酵素（ｐｈｅＡによりコードさ
れる）、若しくは最初に４−ＯＨ−フェニルピルビン酸の産生および次にｔｙｒＢにコードされるアミノトランスフェラーゼによる触媒作用を介してチロシンに至るプレフェン酸脱水素酵素（ｔｙｒＡによりコードされる）により作用されうる）の合成に至るコリスミ酸ムターゼ双方の基質である。
【００６８】
該経路の要素を考えれば、チロシン産生の最大化における課題は、競合する産物（フェニルアラニン、トリプトファン）への炭素の浪費を制御すること、およびチロシン産物への炭素の流れを至適化することであろうことが明らかであろう。従って、ｔｙｒＡの遺伝子産物の上方制御およびｐｈｅＡの遺伝子産物の排除が示される。加えて、野性型ＤＡＨＰ合成酵素は該経路の最終生成物（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）により阻害されることが既知であるため、また、これは炭素の流れを制御する経路中の最初の酵素であるため、最終生成物によるその調節を低下させるためにこの変異体酵素を含有する株を得ることが有用であることができる。
【００６９】
非機能的ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡの過剰発現
腸内細菌の染色体のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域中のｐｈｅＡおよびｔｙｒＡコーディング領域の近接は、本一段階工作方法を使用してこれらのコーディング領域の双方の発現を変えることを可能にする。本一段階工作方法は、同時にｐｈｅＡコーディング領域を不活性化することおよび強力なプロモーターをｔｙｒＡコーディング領域に付加することを包含する。同時のｐｈｅＡおよびｔｙｒＡ遺伝子の工作は、単一の工作された染色体セグメントを、内因性ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域を置換するように宿主株の染色体中に動かすことにより達成される。双方の遺伝子を変えるこの過程は、単一の工作された染色体セグメントを使用して非常に高頻度で達成される。
【００７０】
工作された染色体セグメントは、機能的ｐｈｅＡタンパク質が産生されないことを確実にするｐｈｅＡ配列のいかなる変化も有しうる。従って、該工作された染色体セグメントは非機能的ｐｈｅＡ構築物を最初の要素として包含する。非機能的ｐｈｅＡ構築物は変えられたｐｈｅＡコーディング領域を有しうる。コーディング領域を変えてそれを非機能的にすることは当業者に公知である。例えば、変化は欠失および挿入を包含する突然変異でありうる。突然変異は、機能的タンパク質が作製されないような、終止コドンを導入するか若しくはタンパク質の読み枠を変える点突然変異を包含する。効果的な挿入は読み枠を中断する。欠失は、ＰｈｅＡタンパク質をコードする領域の部分的欠失、および完全なＰｈｅＡコーディング領域の欠失を包含する。欠失は、ｐｈｅＬコーディング領域ならびにｐｈｅＬおよびｐｈｅＡ発現のためのプロモーターを包含しうる。欠失は、欠失の標的とされる配列に隣接するＤＮＡ配列を結合してそれにより隣接配列を脱落させることにより作製される。ｐｈｅＡプロモーターの上流の配列をｐｈｅＡコーディング領域の下流の配列に結合する欠失がとりわけ有用である。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で、ｐｈｅＡ遺伝子全体の欠失は、ｙｆｉＡの３’端およびｐｈｅＡプロモーターの上流の遺伝子間領域を、ｐｈｅＡコーディング領域の下流の遺伝子間領域およびｔｙｒＡの３’端に結合することにより作製する（図２Ａを参照されたい）。この欠失は、ｐｈｅＡコーディング領域全体と一緒に、ｐｈｅＬコーディング領域ならびにｐｈｅＬおよびｐｈｅＡ発現を駆動するプロモーターを包含する。生じる構築物は、ｐｈｅＡ配列が包含されない場合でさえ、非機能的ｐｈｅＡ構築物であると言われることができる。
【００７１】
非機能的ｐｈｅＡ構築物を含有する染色体セグメントは、第二の要素として、強力なプロモーターから発現されるｔｙｒＡコーディング領域もまた包含する。ｔｙｒＡコーディング領域は標的宿主に由来してもよいか、若しくはそれは異種株の外来ｔｙｒＡ遺伝子に由来してもよい。Ｓｏｎｇら（２００５）ＢＭＣ Ｂｉｏｌ ３：１３）に記述されるもののような、機能的コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素酵素タンパク質をコードするいかなる配列も使用しうる。いくつかの例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（配列番
号７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７（配列番号８）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＦＴ０７３（配列番号９）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２（配列番号１３）、フォトラブドゥス ルミネセンス サブスピーシーズ ラウモンディイ（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｕｍｏｎｄｉｉ）ＴＴＯ１（配列番号１４）、シェワネラ オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）ＭＲ−１（配列番号１５）およびザントモナス カンペストリス パリバー カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）株ＡＴＣＣ ３３９１３（配列番号１６）のｔｙｒＡコーディング配列である。
【００７２】
一態様において、発現を高めるためにｔｙｒＡ遺伝子の上流で強力なプロモーターを使用することが有用であることができる。強力なプロモーターは、標的宿主からであろうと若しくは異種株からであろうと、天然のｔｙｒＡ発現プロモーターの代わりに用いられ、そしてｔｙｒＡの発現を制御するためそのコーディング領域に作動可能に連結される。構成的および調節されるプロモーターを包含する、腸内細菌標的細胞中で高レベルの発現を与えるいかなるプロモーターも使用しうる。こうしたプロモーターは多数でありかつ当業者になじみがあり、そして、例えばｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λ ＰＬ、λ ＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｍａｌＥ、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）スピーシーズのグルコース異性化酵素、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）スピーシーズのｎｐｒＭ、ｒｒｎＢ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｃｓｐＡおよびｇｙｒＡを包含しうる。ｔｒｃプロモーターがとりわけ適する。
【００７３】
ｔｒｃプロモーターはｌａｃリプレッサーにより調節されるプロモーターの一例である。これらのプロモーターは遺伝子発現の駆動において確実であるとは言え、遺伝子欠失若しくは標的突然変異誘発によりｌａｃリプレッサーを阻害することが必要でありうる。ｌａｃ欠失の作製方法は当該技術分野で公知であり、そして多くの腸内細菌のｌａｃ標的配列は一般に入手可能である。
【００７４】
非機能的ｐｈｅＡ構築物、およびｔｙｒＡを発現する強力なプロモーターを含有する染色体セグメントは、高レベルのチロシン産生を得るのに有用な他の遺伝因子もまた包含しうる。これらの任意の因子は高発現が望ましい遺伝子を包含しうる。例えば、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、ａｒｏＬ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣおよび／若しくはｔｙｒＢ遺伝子を染色体セグメントに挿入しうる。強力なプロモーターを使用して、包含される各コーディング領域を発現しうるか、若しくは複数のコーディング領域が高発現プロモーターの制御下のオペロンを形成しうる。上で本明細書に記述されるｔｙｒＡを発現するのに使用しうるもののようなプロモーターを使用しうる。
【００７５】
加えて、介在遺伝子を包含するｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域を有する腸内細菌標的宿主株を使用する場合、変えられたｐｈｅＡ、およびｔｙｒＡを発現する強力なプロモーターを含有する染色体セグメントは、該介在遺伝子配列もまた包含しうる。
【００７６】
工作された染色体セグメントの、非機能的ｐｈｅＡ構築物、およびｔｙｒＡを発現する強力なプロモーター、ならびに上述された任意の他の要素を、プラスミド若しくは細菌染色体中で組合せうる。当業者に公知のＰＣＲおよび／若しくはクローニング方法を使用して該要素を個々に構築しうる。クローニング法はまた、プラスミド中で要素を組合せるのにも使用しうる。あるいは、要素はプラスミドから細菌染色体に導入しうるか、若しくは要素は細菌染色体中で直接構築しうる。該要素をその後組合せうる。例えば、実施例１に記述されるとおり、ｐｈｅＡ遺伝子の欠失を細菌染色体中で直接構築しうる。別個の細菌株で、ｔｒｃプロモーターを細菌染色体中のｔｙｒＡプロモーターの代わりに直接用いう
る。細菌染色体中のこれらの個別に構築された要素をその後、バクテリオファージに媒介される普遍形質導入を使用して組合せうる。この方法は非効率的であり、そして、それ、ならびに既知のＰＣＲおよびクローニング方法のいずれかを使用して、工作された染色体セグメントの要素を組み合わせることは、多くの段階を必要とする。一旦分離されれば、工作された染色体セグメント（プラスミド上であれ若しくは細菌染色体中であれ）を一段階で標的宿主に挿入して、チロシン過剰産生株を生じさせうる。
【００７７】
工作された染色体セグメントを、内因性のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の部位で腸内細菌の標的宿主染色体に挿入し、そして内因性のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域を置換する。工作された染色体セグメントの挿入は、ファージ導入、接合、あるいはプラスミド導入またはプラスミド以外の二本若しくは一本鎖ＤＮＡ導入、次いで相同的組換えによるような、当業者に既知のいずれの方法によってもよい。バクテリオファージ形質導入においては、当該技術分野で公知でありかつＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９７２）により記述される標準的遺伝子形質導入方法を使用する。細菌染色体中で構築した工作された染色体セグメントをファージにパッケージングし、その後ファージ感染により標的宿主細胞に導入し、次いで相同的組換えで工作された染色体セグメントを標的宿主細胞の染色体に挿入する。
【００７８】
ＤＮＡフラグメントは、相同的組換えが生じることができる配列を提供するように、細菌染色体中でこの染色体セグメントに天然に隣接する配列を包含する方法により、工作された染色体セグメントをもつ細菌染色体から調製しうる。隣接相同配列は、Ｌｌｏｙｄ，Ｒ．Ｇ．とＫ．Ｂ．Ｌｏｗ（１９９６；Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ｐ．２２３６−２２５５．Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ（編）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤＣ中）に記述されるとおり、相同的組換えを支援するのに十分である。典型的には、相同的組換えに使用される相同配列は長さ１ｋｂ超であるが、しかし５０若しくは１００ｂｐくらい短くてもよい。工作された染色体セグメントおよび隣接相同配列を含有するＤＮＡフラグメントは、制限消化によるように、若しくは超音波処理のような無作為端を生成する方法を使用して、確定された端を伴い製造しうる。いずれの場合も、工作された染色体セグメントを保有するＤＮＡフラグメントは、例えば、電気穿孔法、凍結融解法を包含するいずれかのＤＮＡ取り込み法により、若しくは化学的にコンピテントな細胞を使用して、標的宿主細胞に導入しうる。該ＤＮＡフラグメントは、工作された染色体セグメントでの標的宿主の内因性染色体ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の置換をもたらす相同的組換えを受ける。
【００７９】
プラスミドを使用して、工作された染色体セグメントを挿入のため標的宿主細胞に保有しうる。典型的には、非複製プラスミドを使用して組込みを促進する。工作された染色体セグメントは、相同的組換えが起こることができる配列を提供するように、細菌標的宿主ゲノム中でこの染色体セグメントに天然に隣接するＤＮＡ配列によりプラスミド中で隣接されている。該隣接相同配列は上述されたとおりであり、そして、プラスミドＤＮＡの導入は上述されたとおりである。
【００８０】
これらの方法のいずれかを使用して、相同的組換えは、バクテリオファージλ Ｒｅｄ系［ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６６４０−６６４５］および［Ｅｌｌｉｓら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：６７４２−６７４６］、若しくはＲａｃファージＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ系［Ｚｈａｎｇら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：１３１４−１３１７］のようなバクテリオファージ相同的組換
え系の使用により高めうる。加えて、遺伝子挿入および変異体選択について、共通に所有される第ＵＳＳＮ １０／７３４９３６号明細書；および米国特許第６，６７３，５６７号明細書に開示されるもののような方法が本出願で有用であることができる。
【００８１】
方法のいずれにおいても、相同的組換えは、工作された染色体セグメントでの標的宿主の内因性の染色体ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域の置換をもたらす。
【００８２】
工作された染色体セグメントの成功裏の挿入を伴うレシピエント株はマーカーを使用して同定しうる。スクリーニング若しくは選択いずれのマーカーも使用することができ、選択マーカーがとりわけ有用である。例えば、抗生物質耐性マーカーが、工作された染色体セグメント中に存在することができ、その結果、それが新たな宿主に移入される場合に、工作された染色体セグメントを受領する細胞が対応する抗生物質上での増殖により容易に同定され得る。あるいは、容易に検出可能である産物の産生を賦与するものであるスクリーニングマーカーを使用しうる。マーカーがレシピエント株中に留まらないことが望ましい場合には、それをその後、部位特異的組換えを使用することによるように除去しうる。この場合、部位特異的組換え部位は、組換え酵素の発現が該マーカーの欠失を引き起こすことができるようなマーカーＤＮＡ配列の５’および３’に位置する。
【００８３】
経路の要素の調節；ＤＡＨＰ合成酵素。ｔｙｒＲ
上に示されたとおり、ｐｈｅＡ機能の排除およびｔｙｒＡの上方制御に加え、芳香族アミノ酸経路の他の要素を、チロシンへの炭素の流れを高めるように調節することが付加的に有用でありうる。例えば、最終生成物のフィードバック阻害に抵抗性であるＤＡＨＰ合成酵素を含有する株についての選択が有用であることができる。こうした株は既知であり、そしてＢｏｎｇａｅｒｔｓら（２００１）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３：２８９−３００に記述されている。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）はａｒｏＧ、ａｒｏＦおよびａｒｏＨによりコードされるこの酵素の３種のアイソザイムを有する。野性型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、ａｒｏＧにコードされる酵素はフェニルアラニンにより阻害され、ａｒｏＦにコードされる酵素はチロシンにより阻害され、そしてａｒｏＨにコードされる酵素はトリプトファンにより阻害される。従って、これらのアイソザイムのいずれも、フィードバック耐性を賦与するよう変えることができる。米国特許第４，６８１，８５２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示されるａｒｏＧ３９７突然変異はフィードバック耐性ＤＡＨＰ酵素の創製においてとりわけ有用である。ＴｙｒＲもまた、米国特許第４，６８１，８５２号明細書に開示されるタンパク質中の突然変異によるか若しくはｔｙｒＲ遺伝子の発現を封鎖することによるかのいずれかで非機能的にすることができる。ＴｙｒＲは、芳香族アミノ酸生合成経路のａｒｏＦ、ｔｙｒＡ、ａｒｏＧ、ａｒｏＬおよびｔｙｒＢを包含する数種の遺伝子の発現を抑制する調節タンパク質である［Ｐｉｔｔａｒｄら（２００５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：１６−２６］。ｔｙｒＲ３６６突然変異［ＣａｍａｋａｒｉｓとＰｉｔｔａｒｄ（１９７３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１５：１１３５−１１４４］はＴｙｒＲを不活性化するのにとりわけ有用である。主題の腸の（ｅｎｔｅｒｉｃ）宿主のｔｙｒＲ配列を知る当業者は、遺伝子突然変異および破壊の技術分野で公知の手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋ 上記）を使用して破壊変異体を創製することが容易に可能であろう。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のｔｙｒＲ遺伝子の配列を配列番号３１として本明細書に示す。付加的なｔｙｒＲ配列が公的に入手可能であり；例えば
・大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７ ＤＮＡ、完全なゲノム：
ｇｉ｜４７１１８３０１｜ｄｂｊ｜ＢＡ０００００７．２｜［４７１１８３０１］
・大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＣＦＴ０７３、完全なゲノム
ｇｉ｜２６１１１７３０｜ｇｂ｜ＡＥ０１４０７５．１｜［２６１１１７３０］
・大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＵＴ１８９、完全なゲノム
ｇｉ｜９１２０９０５５｜ｒｅｆ｜ＮＣ＿００７９４６．１｜［９１２０９０５５］
・大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０ ＤＮＡ、完全なゲノム
ｇｉ｜８９１０６８８４｜ｒｅｆ｜ＡＣ＿００００９１．１｜［８９１０６８８４］
・ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２、完全なゲノム
ｇｉ｜１６７６３３９０｜ｒｅｆ｜ＮＣ＿００３１９７．１｜［１６７６３３９０］
を参照されたい。
【００８４】
従って、ＴｙｒＲの発現の影響を排除すること、ならびにＤＡＨＰ合成酵素をフィードバック耐性にすることは、芳香族アミノ酸生合成経路を通りコリスミ酸への中間体のより多い流れを創製し、それはチロシン過剰産生株への本転換方法で使用される宿主でとりわけ有用である。
【００８５】
表現型形質
芳香族アミノ酸生合成経路における中間体の流れを増大させることは、経路の産物および経路の産物のアナログに対する宿主株の耐性を選択することにより達成しうる。３−フルオロチロシン、パラ−フルオロフェニルアラニン、β−２−チエニルアラニン、チロシンおよびフェニルアラニンのような化合物を、それぞれ耐性細胞のスクリーニングで使用しうる。上で挙げられた化合物に適用されるところの、本明細書で使用されるところの「耐性」という用語は、米国特許第４，６８１，８５２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるところの、細胞の突然変異誘発、およびこれらの化合物に対する耐性についてのスクリーニングのプロトコルと一致した様式で使用する。芳香族アミノ酸生合成経路の産物および経路の産物のアナログに耐性の細胞は、ＤＡＨＰフィードバック耐性、ＴｙｒＲ調製若しくは他の経路の流れを制御する因子に影響を及ぼす突然変異を有しうる。耐性の特性を引き起こす特定の突然変異は、該突然変異を含有する細胞が本方法での宿主株として有用であるために完全に特徴づけられる必要はない。
【００８６】
チロシンの産生
本方法によりチロシン過剰産生体に転換された腸内細菌株はチロシンを作製し、チロシンは培地中に排出される。これらの株は、商業的量のチロシンを製造する醗酵槽で増殖させうる。本方法により製造される株は最低約２６ｇ／Ｌであるチロシンレベルを生じ、ここで最低約５０ｇ／Ｌの産生レベルが期待され、かつ、最低約７５ｇ／Ｌのレベルを企図している。最低約４５ｇ／Ｌであるチロシンレベルを生じる、本方法により製造される株がとりわけ有用である。１０リットル醗酵槽中で約４８ｇ／Ｌのチロシンを産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＤＰＤ４１１９、実施例６を参照されたい）を、本方法を使用して作製した。工作された染色体セグメントΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲに加え、本株は３−フルオロチロシン、パラ−フルオロフェニルアラニン、β−２−チエニルアラニン、チロシン、高フェニルアラニンおよび高温に耐性である。最低約５０ｇ／Ｌであるチロシンレベルを生じる、本方法により製造される株が最も好ましい。１０リットル醗酵槽中で約５４ｇ／Ｌのチロシンを産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＤＰＤ４１４５、実施例８）を、本方法を使用して作製した。工作された染色体セグメントΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡに加え、本株は、３−フルオロチロシン、パラ−フルオロフェニルアラニン、β−２−チエニルアラニン、チロシン、高フェニルアラニンおよび高温に耐性であり、かつ染色体突然変異ΔｌａｃＩＺＹＡもまた有する。
【００８７】
本開示の生産醗酵すなわち「スケールアップ醗酵」は１０Ｌ以上、および通常は２００Ｌ若しくはそれ以上の好気的バッチ醗酵を記述する。チロシンの商業的生産が望ましい場合、多様な培養の方法論を適用しうる。例えば、組換え微生物宿主からの大スケール生産は、バッチおよび連続双方の培養の方法論により生じうる。古典的なバッチ培養法は、培地の組成を培養の開始時に設定しそして培養工程中に人工的改変にかけない閉鎖系である
。従って、培養工程の開始時に、培地に所望の生物体（１種若しくは複数）を接種し、そして該系に何も添加せずに増殖若しくは代謝活動を起こさせる。典型的には、しかしながら、「バッチ」培養は炭素源の添加に関してバッチであり、そしてｐＨおよび酸素濃度のような因子の制御で試みがしばしばなされる。バッチ系では、該系の代謝物およびバイオマス組成は培養を終了する時点まで絶えず変化する。バッチ培養物内で、静的対数期から高増殖対数期および最終的には増殖速度が低下若しくは停止する静止期まで、細胞が加減する。処理されない場合、静止期の細胞はついには死ぬことができる。対数期の細胞はしばしば、いくつかの系の最終生成物若しくは中間体の大部分の産生を司る。静止期若しくは指数増殖期後の産生は他の系で得ることができる。
【００８８】
標準的バッチ系に対する一変形物は流加系である。流加培養工程もまた本発明で適し、そして培養が進行する際に基質を徐々に添加することを除き典型的なバッチ系を含んでなる。流加系は異化作用産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合、および培地中に制限された量の基質を有することが望ましい場合に有用である。流加系での実際の基質濃度の測定は困難であり、そして従ってｐＨ、溶解酸素（ＤＯ）、およびＣＯ２のような排ガスの分圧のような測定可能な因子の変化に基づき推定する。バッチおよび流加培養法は一般的でありかつ当該技術分野で公知であり、そして、例はＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州サンダーランド中、若しくはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６、２２７、（１９９２）（引用することにより本明細書に組み込まれる）に見出しうる。
【００８９】
醗酵培地は適する炭素基質を含有する。適する基質は、限定されるものでないが、グルコースおよび果糖のような単糖、乳糖若しくはショ糖のようなオリゴ糖、デンプン若しくはセルロースのような多糖、またはそれらの混合物、ならびにチーズホエイ透析物、コーンスティープリカー、サトウキビ糖蜜およびオオムギ麦芽のような再生可能な原材料からの未精製混合物を挙げることができる。炭素基質は例えばアルコール、有機酸、タンパク質若しくは加水分解タンパク質またはアミノ酸もまた含みうる。それ故に、本醗酵で利用される炭素源は、多様な炭素含有基質を包含しうることを企図している。
【００９０】
チロシンの商業生産は連続培養でもまた達成しうる。連続培養は、合成培地をバイオリアクターに連続的に添加し、そして等量の馴化培地を加工のため同時に除去する開放系である。連続培養は、一般に、細胞が主として対数期増殖にある一定の高液相密度に細胞を維持する。あるいは、連続培養は、炭素および栄養素を連続的に添加しそして有益な産物、副生成物若しくは廃棄物を細胞塊から連続的に除去する、固定した細胞で実施しうる。細胞固定は、天然および／若しくは合成素材から構成される広範な固体支持体を使用して実施しうる。
【００９１】
連続若しくは半連続培養は、細胞増殖若しくは最終生成物濃度に影響を及ぼす１因子若しくはいずれかの数の因子の調節を見込む。例えば、一方法は、炭素源若しくは窒素濃度のような制限栄養素を固定した率に維持しかつ全部の他のパラメータを加減することを可能にすることができる。他の系では、培地濁度により測定される細胞濃度を一定に保ちつつ、増殖に影響を及ぼす多数の因子を連続的に変えることができる。連続的系は、定常状態の増殖条件を維持するよう努め、そして従って抜き出されている培地による細胞の喪失は培養物中の細胞増殖に対し均衡を保たなければならない。連続培養工程のための栄養素および増殖因子の調節方法、ならびに生成物形成の速度を最大化するための技術は工業微生物学の分野で公知であり、そして多様な方法がＢｒｏｃｋ、上記により詳述されている。
【００９２】
後に続くところの醗酵形態がチロシン産生にとりわけ適する。本方法によりチロシン過剰産生株に転換される所望の株を、オービタルシェーカー中約３００ｒｐｍで振とうしながら約３５℃で半天然培地中で振とうフラスコ中で増殖させ、そしてその後類似の培地を含有する１０Ｌ種醗酵槽に移す。種培養物は、ＯＤ５５０が１０と２５の間になるまで一定の空気散布下に種醗酵槽中で増殖させ、その場合に、醗酵パラメータがチロシン産生に至適化されている生産醗酵槽にそれを移す。種タンクから生産タンクに移される典型的な接種物容量は２．０〜１０ｖ／ｖ％の範囲にわたる。典型的な醗酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜３．０ｇ／ｌ）、リン酸ナトリウム（０〜２．０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜１．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０．３〜５．０ｇ／ｌ）のようなミネラル培地成分、酵母抽出物若しくはダイズに基づく生成物（０〜１０ｇ／ｌ）のような複合窒素源を含有する。痕跡量のＬ−フェニルアラニンおよび微量元素もまた、該株の至適の増殖のため一連の種（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）の全段階で培地に添加する。グルコース（若しくはショ糖）のような炭素源は、チロシンの率および力価を最大化するために初期のバッチ炭素源（１０〜３０ｇ／ｌ）の枯渇に際して醗酵容器に連続的に添加する。炭素源供給速度は、該培養物がグルコースを過剰に蓄積（酢酸のような毒性の副生成物の形成に至り得る）していないことを確実にするために動的に調節する。グルコースのような利用される基質から産生されるチロシンの収量を最大化するため、リン酸（最初にバッチで添加するか若しくは醗酵の経過中に供給するかのいずれかである）の量によりバイオマスの増殖を制限する。醗酵は水酸化アンモニウムおよび硫酸若しくはリン酸いずれかを使用してｐＨ６．８〜７．２に制御する。醗酵槽の温度は３２〜３５℃に制御し、また、ＤＯは、変数として攪拌（ｒｐｍ）および空気流（ＳＬＰＭ）を使用するカスケード制御により約１０〜２５％酸素飽和を維持する。起泡を最小限にするため、消泡剤（いずれかの分類のシリコーンに基づく、有機に基づく、など）を必要に応じて容器に添加する。使用されるとりわけ適する消泡剤はＢｉｏｓｐｕｍｅｘ１５３Ｋである。チロシンの最大産生のため、培養物をＯＤ５５０８〜１０で低濃度のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（０〜１．０ｍＭ）で誘導しうる。カナマイシンのような、それに対する抗生物質耐性マーカーが株に存在する抗生物質を、汚染を最小限にするために場合によっては使用しうる。
【００９３】
［実施例］
本発明は以下の実施例でさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示す一方で、具体的説明としてのみ示されることが理解されるべきである。上の論考およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確かめることができ、また、その技術思想および範囲から離れることなく、多様な用途および条件にそれを適応させるために本発明の多様な変更および改変を行い得る。
【００９４】
一般的方法
実施例で使用される標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で公知であり、かつ、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」上記、Ｅｎｑｕｉｓｔ 上記；およびＡｕｓｕｂｅｌ 上記により記述されている。
【００９５】
実施例で使用される標準的な遺伝子形質導入方法は当該技術分野で公知であり、かつ、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９７２）により記述されている。
【００９６】
略語の意味は後に続くとおりである。すなわち、「ｋｂ」はキロ塩基対（１若しくは複数）を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチド（１若しくは複数）を意味し、「ｈｒ」は時間（１若しくは複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（１若しくは複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（１若しくは複数）を意味し、「ｄ」は日（１若しくは複
数）を意味し、「Ｌ」はリットル（１若しくは複数）を意味し、「ｍｌ」はミリリットル（１若しくは複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットル（１若しくは複数）を意味し、「μｇ」はマイクログラム（１若しくは複数）を意味し、「ｎｇ」はナノグラム（１若しくは複数）を意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートル（１若しくは複数）を意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモル（１若しくは複数）を意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモル（１若しくは複数）を意味し、「ｐｐｍ」は百万分率を意味し、「ｖｖｍ」は１分あたり液体容量あたり平均空気容量を意味し、「ＣＦＵ」はコロニー形成単位（１若しくは複数）を意味し、「ＮＴＧ」はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「フェニルアラニン」若しくは「ｐｈｅ」はＬ−フェニルアラニンを意味し、そして「チロシン」若しくは「ｔｙｒ」はＬ−チロシンを意味している。「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸であり、「ＡＣＮ」はアセトニトリルであり、「ＫａｎＲ」はカナマイシン耐性であり、「Ｐｈｅ」はフェニルアラニン栄養要求性であり、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールであり、「Ｋａｎ」はカナマイシンであり、「Ｔｅｔ」はテトラサイクリンであり、「ＣＩＰ」は仔ウシ腸アルカリホスファターゼである。
【００９７】
培地および培養条件：
細菌培養物の維持および増殖に適する材料および方法は、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９７２）；Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ Ｒ．ＫｒｉｅｇとＧ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）、ｐｐ．２１０−２１３、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ（１９８１）；若しくはＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州サンダーランド中に見出された。細菌細胞の増殖および維持に使用した全部の試薬および材料は、別の方法で明記されない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（メリーランド州スパークス）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（カリフォルニア州カールズバッド）若しくはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（ミズーリ州セントルイス）から得た。
【００９８】
ＬＢ培地は、以下を培地１リットルあたりグラムで含有する：バクト トリプトン（１０）、バクト 酵母エキス（５．０）およびＮａＣｌ（１０）。
【００９９】
Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ培地は以下を１リットルあたりグラムで含有する：ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．２）；クエン酸・１Ｈ２Ｏ（２．０）、Ｋ２ＨＰＯ４（１０）；およびＮａＮＨ４ＨＰＯ４・４Ｈ２Ｏ（３．５）。
【０１００】
ＳＯＢ培地は以下を１リットルあたりグラムで含有する：バクト トリプトン（２０）、バクト 酵母エキス（５．０）、およびＮａＣｌ（０．５）、２５０ｍＭ ＫＣｌ（１０ｍｌ）、ｐＨをＮａＯＨで７．０に調節。
【０１０１】
上の培地はオートクレーブ処理したか若しくは濾過滅菌したかのいずれかであった。ビタミンＢ１（チアミン）を０．０００１％でＶｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ培地に添加した。
ＭｇＣｌ２をＳＯＢ培地に添加した（１リットルあたり２Ｍ溶液５．０ｍｌ）。炭素源ならびに他の栄養素および補給物は実施例で挙げられるとおり添加した。全部の添加物はそれらを培地に添加する前に前滅菌した。
【０１０２】
１０×ＭＯＰＳに基づく最少培地はＴｅｋｎｏｖａ（カリフォルニア州ハーフムーンベイ）から購入した。ＭＯＰＳ最少培地は、１リットルあたり後に続くとおり作製した：１０×ＭＯＰＳ（１００ｍｌ）、０．１３２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４（１０ｍｌ）、２０％グルコース（１０ｍｌ）。他の補給物は実施例で挙げられるとおり添加した。全部の添加物はそれらを培地に添加する前に前滅菌した。
【０１０３】
ＳＯＣ培地はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッド）から得た。
【０１０４】
ＭａｌｏｙとＮｕｎｎ（１９８１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５：１１１０−１１１２）により改変されたところのＢｏｃｈｎｅｒ選択プレートは後に続くとおり作製した：
溶液Ａ
バクト トリプトン ５．０ｇ
バクト 酵母エキス ５．０ｇ
クロルテトラサイクリン ５０ｍｇ（水性１２．５ｍｇ／ｍｌの４．０ｍｌ、暗所４℃
保存）
寒天 １５ｇ
Ｈ２Ｏ ５００ｍｌ
溶液Ｂ
ＮａＣｌ １０ｇ
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ １０ｇ
Ｈ２Ｏ ５００ｍｌ
【０１０５】
溶液ＡおよびＢは個別に１５ｐｓｉで２０分間オートクレーブ処理し、その後混合しかつ注入温度まで冷却した。５．０ｍｌの２０ｍＭ ＺｎＣｌ２および６．０ｍｌの２ｍｇ／ｍｌフサル酸を、プレートに注ぐ前に添加した。
【０１０６】
分子生物学技術：
制限酵素消化、ライゲーション、形質転換、およびアガロースゲル電気泳動の方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓに記述されるとおり実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術はＷｈｉｔｅ，Ｂ．、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第１５巻（１９９３）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、ニュージャージー州トトワに見出された。
【０１０７】
ＨＰＬＣ法
高速液体クロマトグラフィーはＡｇｉｌｅｎｔ １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）で実施した。ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ−Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。使用した方法は、１１分の停止時間および５分の後時間を伴う１．００ｍｌ／ｍｉｎのカラム流速を必要とした。移動相は９５％溶媒Ａ（水＋０．１％ＴＦＡ）および５％溶媒Ｂ（ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ）から構成された。ポンプは最低２０ｂａｒおよび最大４００ｂａｒと定義される圧限界内で運転した。スペクトルは１００ｎｍから３８０ｎｍまで走査し、チロシンのシグナルは２２５ｎｍおよび３．５９８分の保持時間で記録した。フェニルアラニンは４．３８８分の保持時間を伴い、２１５ｎｍで検出した。
【実施例１】
【０１０８】
チロシン過剰産生株の構築に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のゲノム領域
本実施例は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２染色体中の１領域の、チロシン排出に有益な２特徴との集成を記述する。コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素をコードするｐｈｅＡコーディング領域、リーダーペプチドをコードするｐｈｅＬコーディング領域、ならびにｐｈｅＬおよびｐｈｅＡのプロモーターを完全に欠失した。コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸脱水素酵素をコードするｔｙｒＡ遺伝子の天然のプロモーターを強力なプロモーターで置換した。
【０１０９】
ｔｅｔＲＡ環法（ｃｉｒｃｌｅ ｍｅｔｈｏｄ）（図２ないし５に描かれる）を使用して、ｐｈｅＬ、ｐｈｅＡおよびそれらの発現を駆動するプロモーターの完全な欠失を行った。所望の欠失に隣接する上流（ｙｆｉＡの３’端およびプロモーターの上流の遺伝子間領域；Ａと呼ばれる）ならびに下流（ｔｙｒＡの３’端および遺伝子間領域；Ｂと呼ばれる）の染色体領域のそれぞれに相同な隣接する６０ヌクレオチド領域を有する２種の１４０ｍｅｒのＰＣＲプライマーを設計した（図２Ａを参照されたい）。これらの１４０ｍｅｒプライマーの一方（プライマーＡＢＴＲ；配列番号１７）はまた、トランスポゾンＴｎ１０からの調節遺伝子をコードするｔｅｔＲ遺伝子に相同な２０ヌクレオチド領域を３’端に有した（図２Ｂを参照されたい）。他方の１４０ｍｅｒプライマー（プライマーＢＡＴＡ；配列番号１８）はまた、テトラサイクリン耐性を賦与するテトラサイクリン流出対向輸送体をコードするｔｅｔＡ遺伝子に相同な２０ヌクレオチド領域を３’端に有した（図２Ｂを参照されたい）。加えてそれぞれＡＢＴＲおよびＢＡＴＡプライマーの３’端と同一のｔｅｔＲ（プライマーＴＲ；配列番号１９）若しくはｔｅｔＡ（プライマーＴＡ；配列番号２０）に相同な領域をもつ２０ｍｅｒプライマーを使用した（図２Ｂを参照されたい）。これらのプライマーはＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ（テキサス州ウッドランズ）から得た。
【０１１０】
これらのプライマーを使用するＰＣＲ反応のための鋳型ＤＮＡは、ｔｅｔＲおよびｔｅｔＡ遺伝子を保有するいかなる株からも得ることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ２１１２（ｚｉｂ６１５：：Ｔｎ１０）若しくはネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴＴ２３８５（ｚｉｉ６１４：：Ｔｎ１０）のような、染色体中のどこかに転位因子Ｔｎ１０が配置された株を使用することが便宜的である。ＰＣＲ反応あたり０．５μＬの鋳型ＤＮＡを、ＤＰＤ４１１２若しくはＴＴ２３８５の単一コロニーを３２．５μＬの水および７．５μＬのＤＭＳＯに再懸濁すること、ならびに９５℃で１０分間加熱することにより調製した。２回のＰＣＲ反応（５０μＬ）を実施した。第一のＰＣＲ反応には、ＴＴ２３８５からの鋳型ＤＮＡとともにプライマーＴＲおよびＢＡＴＡを使用した（１０ｐｍｏｌ／μＬの各プライマー３μＬ）。第二のＰＣＲ反応には、ＤＰＤ４１１２からの鋳型ＤＮＡとともにプライマーＴＡおよびＡＢＴＲを使用した（１０ｐｍｏｌ／μＬの各プライマー３μＬ）。水１８．５μＬおよびＥｘＴａｑ Ｐｒｅｍｉｘ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．滋賀県大津市）２５μＬを添加した。ＰＣＲ反応条件は、９４℃／５分＋３５×（９４℃／１分；６０℃／２分；７２℃／３分）＋７２℃／１５分であった。期待された大きさ（２１５１ｂｐ）の産物が生成され、そしてＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）で精製した。
【０１１１】
ＰＣＲ産物は、後に続くとおり変性しかつ再アニーリングしてｔｅｔＲＡ環を形成した。ほぼ等モル量の各ＰＣＲ産物を合わせ、そしてＮａＣｌを１５０ｍＭの最終濃度まで添加した。これらを１００℃に加熱し、その後１時間にわたり以下の条件、１００℃／５分、９５℃／３分、各サイクル５℃の温度低下で各３分の１８の付加的サイクル、４℃／保持を使用して、サーモサイクラーで４℃にゆっくり冷却した。反応を３０，０００ＭＷカットオフをもつＭｉｃｒｏｃｏｎスピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して脱塩した。滅菌水を５００μＬの総容量まで添加した。カラムを微小遠心機で速度１２で１０分間回転した。水を添加し（５００
μＬ）そしてカラムを再度回転した。最後の回転前に２００μＬの水を添加した。必要な場合は２５μＬの水を添加してサンプルを回収した。ｔｅｔＲＡ環は、完全なｔｅｔＲおよびｔｅｔＡ遺伝子ならびに所望の欠失に隣接する領域を保有する開放環状分子である（図３を参照されたい）。
【０１１２】
脱塩したｔｅｔＲＡ環（１０μＬ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ＃７００９２６）の電気穿孔で使用した。電気穿孔コンピテント細胞は、単一コロニーを接種したマグネシウムを含まないＳＯＢ中室温、静止一夜３５ｍＬ培養物から調製した。培養物を、培養物が赤色フィルターを伴うＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計で５０の示度に達するまで３０℃で振とうしながらインキュベートした。細胞を遠心分離（１５分、設定９、４℃、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｂ）によりペレットにし、その後３．０ｍｌ氷冷水に再懸濁し、そして微小遠心管に移し、これを微小遠心機で４℃で３０秒間回転した。もう４回の氷冷水洗浄後に細胞を１５０μＬの氷冷水に再懸濁し、そして５０若しくは６０μＬを各電気穿孔に使用した。電気穿孔条件は、０．１ｍｍキュベット、２５μＦ、１．８５ｋＶ、２００オームであった。その後、７５０μＬのＳＯＣを添加し、培養物を微小遠心管に移し、そして３０℃で４時間若しくは３０℃で一夜インキュベートした。電気穿孔した細胞は、１５〜２０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬＢプレート上にプレーティングし、そして３７℃で１〜３日間インキュベートした。コロニーがテトラサイクリン耐性となるためには、ｔｅｔＲおよびｔｅｔＡ遺伝子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体に組込まれなければならない。これは、図４に示されるとおり、染色体に対するＡ領域の相同性を使用する相同的組換えにより起こりうる。同様に、組込みは相同なＢ領域を使用してもまた可能である。
【０１１３】
組込まれたｔｅｔＡおよびｔｅｔＢ遺伝子を保有するテトラサイクリン耐性コロニー（図４を参照されたい）を、１５〜２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢプレート上で精製した。テトラサイクリンを含むＬＢプレートから選択した単一コロニーから、テトラサイクリンを欠くＬＢプレートに画線することにより、第二の非選択的精製を行った。フサル酸に耐性であるテトラサイクリン感受性派生物の対選択を、ＭａｌｏｙとＮｕｎｎ（１９８１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５：１１１０−１１１２）により改変されたところのＢｏｃｈｎｅｒ選択プレート上で行った。ＬＢプレートからの単一コロニーをこれらのテトラサイクリン感受性選択プレートに画線し、それらを４２℃で２日間インキュベートした。これらのプレートからのテトラサイクリン感受性コロニーをＬＢプレート上で精製し、そしてその後、フェニルアラニンを含む若しくは含まない最少プレート上での増殖について試験した。
【０１１４】
この方法を使用して、テトラサイクリン感受性の単離物（元はテトラサイクリン耐性株からの）の１２〜１８％が、フェニルアラニンを含まない最少プレート上で増殖しなかった。これらのフェニルアラニン栄養要求性は、ｔｅｔＲおよびｔｅｔＡ遺伝子ならびにｐｈｅＡおよびｐｈｅＬコーディング領域、ならびにそれらのプロモーターを除去した組換えにより形成された（図５に具体的に説明されるところのＢ×Ｂ組換え）。この方法の性質により、これらのフェニルアラニン栄養要求株はｐｈｅＡおよびｐｈｅＬコーディング領域ならびにそれらのプロモーターの正確な欠失を保有した（ΔｐｈｅＬＡ）。保持された１種のこうしたフェニルアラニン栄養要求株をＤＰＤ４０７２と命名した。
【０１１５】
２ＰＣＲフラグメント組込み法（ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ ２００４０５６９７３ Ａ２号明細書）を使用して、強力なｔｒｃプロモーターがｔｙｒＡ遺伝子の発現を駆動しうるように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の染色体中にそれを配置した。この方法は、ｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）にすぐ隣接して配置される隣接ｆｌｐ部位をもつカナマイシン耐性カセットもまたもたらす。
【０１１６】
部位特異的組換え酵素標的配列（ＦＲＴ）により隣接されるカナマイシンで選択可能なマーカーを含有する第一の直鎖状ＤＮＡフラグメント（１５８１ｂｐ）を、鋳型としてプラスミドｐＫＤ４（ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ、ＰＮＡＳ、９７：６６４０−６６４５（２０００））のカナマイシン耐性遺伝子を使用するＰＣＲにより合成した。使用したプライマー対は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体中のｔｙｒＡ遺伝子の上流にあるａｒｏＦ終止コドンの上流領域の配列に一致するよう選ばれた相同性アーム（下線、４６ｂｐ）、およびカナマイシン耐性遺伝子のプライミング配列（２０ｂｐ）を含有するＴ−ｋａｎ（ｔｙｒＡ）（配列番号２１：５’−ＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＣＧＴＧＧＣＴＴＡＡＣＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧ−３’）、ならびに、ｔｒｃプロモーターＤＮＡフラグメントの５’端領域の配列に一致するよう選ばれた相同性アーム（下線、４２ｂｐ）、およびカナマイシン耐性遺伝子のプライミング配列（２２ｂｐ）を含有するＢ−ｋａｎ（ｔｒｃ）（配列番号２２：５’−ＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＧＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＧＡＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＴＣＣ−３’）であった。−１０および−３５コンセンサス配列、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、ならびにリボソーム結合部位（ｒｂｓ）から構成されるｔｒｃプロモーターを含有する第二の直鎖状ＤＮＡフラグメント（１６３ｂｐ）は、プライマー対すなわちｋａｎのオープンリーディングフレームの下流領域の配列に一致するよう選ばれた相同性アーム（下線、１８ｂｐ）、およびｔｒｃプロモーターのプライミング配列（２２ｂｐ）を含有するＴ−ｔｒｃ（ｋａｎ）（配列番号２３：５’−ＣＴＡＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＴ−３’）、ならびに、ｔｙｒＡ開始コドンの下流領域の配列に一致するよう選ばれた相同性アーム（下線、４６ｂｐ）、およびｔｒｃプロモーターのプライミング配列（２０ｂｐ）を含有するＢ−ｔｒｃ（ｔｙｒＡ）（配列番号２４：５’−ＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴＧＡＴＣＧＣＧＴＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡ−３’）を用い、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）からＰＣＲにより合成した。下線を付けた配列は各それぞれの相同性アームを具体的に説明する一方、残部は、該ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡ上の相補ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションのためのプライミング配列である。後に続くところの標準的ＰＣＲ条件を使用して、直鎖状ＤＮＡフラグメントをＭａｓｔｅｒＡｍｐＴＭＥｘｔｒａ−Ｌｏｎｇ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州マディソン）で増幅した：
ＰＣＲ反応： ＰＣＲ反応混合物：
段階１ ９４℃３分 １μＬプラスミドＤＮＡ
段階２ ９３℃３０秒 ２５μＬ ２×ＰＣＲ緩衝液＃１
段階３ ５５℃１分 １μＬ ５’−プライマー（２０μＭ）
段階４ ７２℃３分 １μＬ ３’−プライマー（２０μＭ）
段階５ 段階２へ行く、２５サイクル ０．５μＬ ＭａｓｔｅｒＡｍｐＴＭ ＤＮＡ
ポリメラーゼ
段階６ ７２℃５分 ２１．５μＬ 滅菌ｄＨ２Ｏ
【０１１７】
ＰＣＲ反応を完了した後、ＰＣＲ産物を、Ｍｉｎｉ−ｅｌｕｔｅ ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＫｉｔＴＭ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．カリフォルニア州バレンシア）を使用して精製した。ＤＮＡを最高速度で２回回転することにより１０μＬの蒸留水で溶離した。ＰＣＲ ＤＮＡサンプルの濃度は約０．５〜１．０μｇ／μＬであった。
【０１１８】
λ−Ｒｅｄ組換え酵素発現プラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株をＰＣＲフラグメントの組換えのための宿主株として使用した。該株は、λ−Ｒｅｄ組換え酵素発現プラスミドｐＫＤ４６（ａｍｐＲ）（ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ、上記）での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＣ１０６１の形質転換により構築した。ｐＤＫ４６
中のλ−Ｒｅｄ組換え酵素は、アラビノースで誘導可能なプロモーターの制御下で発現される３種の遺伝子すなわちｅｘｏ、ｂｅｔおよびｇａｍから構成される。形質転換体を３０℃で１００μｇ／ｍＬアンピシリンＬＢプレートで選択した。ｐＫＤ４６を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株のエレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞は後に続くとおり調製した。ｐＫＤ４６を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１細胞を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１ｍＭ Ｌ−アラビノースを含むＳＯＢ培地中３０℃で０．５のＯＤ６００まで増殖させ、次いで氷上で２０分間冷却した。細菌細胞を、Ｓｏｒｖａｌｌ（Ｒ）ＲＴ７ ＰＬＵＳ（Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、コネチカット州ニュートン）を使用して４，５００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離した。上清をデカントした後、ペレットを氷冷水に再懸濁しかつ再度遠心分離した。これを２回反復し、そして細胞ペレットを１／１００容量の氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。
【０１１９】
カナマイシンマーカーＰＣＲ産物（約１．０μｇ）およびｔｒｃプロモーターＰＣＲ産物（約１．０μｇ）双方を５０μＬのコンピテント細胞と混合し、そして氷上で予め冷却した電気穿孔キュベット（０．１ｃｍ）にピペットで入れた。電気穿孔は、２００オームに設定したパルス制御装置を伴う１．８ｋＶ、２５μＦに設定したＢｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを使用することにより実施した。ＳＯＣ培地（１．０ｍＬ）を電気穿孔後に添加した。細胞を３７℃で１時間インキュベートした。細胞のおよそ半分を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢプレートに広げた。プレートを３７℃で一夜インキュベートした後に、６個のカナマイシン耐性形質転換体を選択した。ｔｙｒＡ遺伝子の前のカナマイシンで選択可能なマーカーおよびｔｒｃプロモーター双方の染色体組込みをＰＣＲ分析により確認にした。形質転換体のコロニーを、２３μＬのＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．０μＬの５’−プライマーＴ−ｔｙ（テスト）（配列番号２５：５’−ＣＡＡＣＣＧＣＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＧ−３’）および１．０μＬの３’−プライマーＢ−ｔｙ（テスト）（配列番号２６：５’−ＧＣＧＣＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣ−３’）を含有する２５μＬのＰＣＲ反応混合物に再懸濁した。試験プライマーは組込み領域の近傍に位置する領域を増幅するように選んだ。Ｔ−ｔｙ（テスト）およびＢ−ｔｙ（テスト）プライマー対を用いるＰＣＲ分析は、１．０％アガロースゲル上で１，９２８ｂｐの期待された大きさの産物を示した。Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲをもつ結果として生じる組換え体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＳ１５８と呼んだ。
【０１２０】
Ｐ１ｃｌｒ１００Ｃｍファージ（Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９７２．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）を使用する普遍形質導入を使用して、Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲをΔｐｈｅＬＡと組み合わせた。Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＷＳ１５８で増殖させたファージをドナーとして使用し、ΔｐｈｅＬＡをもつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４０７２がレシピエントであり、そして選択は１２．５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレートでのカナマイシン耐性についてであった。１２．５μｇ／ｍＬで選択された形質導入体は、その後、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するプレート上で増殖することが可能であった。ＫａｎＲ形質導入体のコロニーを、フェニルアラニンを含むおよび含まない最少培地での増殖について試験することにより、フェニルアラニン栄養要求性についてスクリーニングした。得られた３１３個のＫａｎＲコロニーのうち、４個が増殖にフェニルアラニンを要求した。これら４株でのＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲの存在をＰＣＲ増幅により確認した。従って、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡの観察された共形質導入頻度は、隣接遺伝子について期待されたとおり＞９８％であった。それらのそれぞれがＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍ溶原菌であったＫａｎＲ、Ｐｈｅ−株を保持し、そしてＤＰＤ４０８１、ＤＰＤ４０８２、ＤＰＤ４０８３およびＤＰＤ４０８４と命名した。これらの新たに構築したΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：Ｋａｎ
Ｒ二重変異体株をドナーとして使用するその後のＰ１媒介性の普遍形質導入は、ΔｐｈｅＬＡおよびＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ双方を送達する＞９８％の頻度を有すると期待することができる。従って、大部分のＫａｎＲ形質導入体について、ｐｈｅＡはΔｐｈｅＡに、およびｔｙｒＡはＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲに転換されることができる。
【０１２１】
上述された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＤＰＤ４０８１およびＤＰＤ４０８２は、元はチロシンを排出しない株ＭＧ１６５５由来であり、そしてΔｐｈｅＬＡおよびＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲを保有する。これらの株を、チロシン栄養要求株ＡＴ２４７１（ＣＧＳＣ ＃４５１０）を使用する交差供給試験（ｃｒｏｓｓ ｆｅｅｄｉｎｇ ｔｅｓｔ）を実施することにより、制限するフェニルアラニンの条件下でのチロシン排出について試験した。従って、ＤＰＤ４０８１若しくはＤＰＤ４０８２を、炭素源としてのグルコースおよびビタミンＢ１を補充したＶｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ最少培地プレートに画線した。非常に近くしかし接せずにＡＴ２４７１を画線した。３０℃で１日間および室温で２日のインキュベーション後に、最も近いＤＰＤ４０８１若しくはＤＰＤ４０８２の画線の部分でのみＡＴ２４７１の良好な増殖が存在した。これらのプレート上に単独で画線した株ＡＴ２４７１は増殖しなかった。従って、ＤＰＤ４０８１若しくはＤＰＤ４０８２により産生されるチロシンがＡＴ２４７１の増殖を可能にし、そして、これ故に、これらの結果はチロシンがＤＰＤ４０８１およびＤＰＤ４０８２により排出されたことを示した。
【実施例２】
【０１２２】
チロシンを排出しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株のチロシン排出株への一段階転換
本実施例は、ΔｐｈｅＬＡおよびＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を導入する一段階方法を使用する、チロシンを排出しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のチロシン排出株への転換を記述する。
【０１２３】
チロシンを排出しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ＃２７３２５）を、実施例１で記述されたΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲの染色体領域を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４０８１のＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍライセートを使用する普遍形質導入でレシピエントとして使用した。１２若しくは２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢプレートでカナマイシン耐性について選択を行った。フェニルアラニン栄養要求性形質導入体ＫａｎＲを保持しかつＤＰＤ４１９８と命名した。この株を、２ｇ／Ｌグルコースおよび１０μｇ／ｍＬフェニルアラニンを含むＭＰＯＳ緩衝最少培地を使用して、３７℃、３００ｒｐｍで二重の振とうフラスコ中で培養物を増殖させることにより、チロシン産生について試験した。グルコースが枯渇した２２時間に、培養物上清中のチロシンおよびフェニルアラニンをＨＰＬＣにより測定した。二重の培養物上清のそれぞれは７８ｐｐｍのチロシンおよび７ｐｐｍのフェニルアラニンを有した。従って、かなりの量のチロシンが、Ｗ３１１０から一形質導入段階で派生させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１９８により産生されかつ培地中に排出された。
【実施例３】
【０１２４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２フェニルアラニン排出株のチロシン排出株への一段階転換
本実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２由来のフェニルアラニン排出株をチロシン排出株に一段階で転換するための、実施例１のΔｐｈｅＬＡおよびＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域の使用を記述する。
【０１２５】
２種の以前に記述された（米国特許第４，６８１，８５２号明細書）フェニルアラニンを排出する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株すなわちＮＳＴ３７（ＡＴＣＣ＃３１８８２）およびＮＳＴ７４（ＡＴＣＣ＃３１８８４）をＡＴＣＣから得た。これらの株を一段階でチロシン排出株に転換した。株ＮＳＴ３７およびＮＳＴ７４を、実施例１に記述された
ΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４０８１若しくはＤＰＤ４０８３のＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍライセートを使用する普遍形質導入でレシピエントとして使用した。１２若しくは２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢプレートでカナマイシン耐性について選択を行った。形質導入体をフェニルアラニン栄養要求性についてスクリーニングした。８種のＫａｎＲ形質導入体の８種はＮＳＴ３７のＰｈｅＡでもまたあり、ＫａｎＲ、Ｐｈｅ−形質導入体を保持しそしてＤＰＤ４１９３と命名した。同様に、ＮＳＴ７４のＫａｎＲ、Ｐｈｅ−形質導入体を保持しそしてＤＰＤ４１９５と命名した。２ｇ／Ｌグルコースを含みかつ表１および２に示されるところの他の培地の修正を伴うＭＰＯＳ緩衝培地での３７℃若しくは３２℃、３００ｒｐｍでの数回の振とうフラスコ試験を、親株ならびに転換した株で実施した。培地への補充物は、増殖の改善について試験するための一実験で添加したビタミンＢ１を除き、株の遺伝子型に従って増殖に必要とされるとおりであった。培養物上清中のチロシンおよびフェニルアラニンを表に示された時点でＨＰＬＣにより測定し、そして検出された濃度を表１および２に示す（［Ｐｈｅ］ｐｐｍおよび［Ｔｙｒ］ｐｐｍ）。チロシンは表１の培養物の上清で検出されず、また、低レベルのフェニルアラニンが表２の培養物の上清で検出された。
【０１２６】
【表１】
【０１２７】
【表２】
【０１２８】
かように、チロシンは、一形質導入段階で取得されたΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を保有する株により明らかに排出された。
【実施例４】
【０１２９】
Ｋ１２以外の低レベルのフェニルアラニンを排出する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のチロシン排出株への転換
本実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２由来でない、低レベルのフェニルアラニンを排出する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を一段階でチロシン排出株に転換するための、実施例１のΔｐｈｅＬＡおよびＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域の使用を記述する。
【０１３０】
低レベルのフェニルアラニンを排出するＫ１２以外の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（米国
特許第２，９７３，３９４号明細書）をＡＴＣＣから得（ＡＴＣＣ＃１３２８１）、そしてＤＰＤ１４３０と改名した。増殖にチロシンを必要とする株ＤＰＤ４１３０を、実施例１で記述されたΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４０８３のＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍライセートを使用する普遍形質導入でレシピエントとして使用した。選択は２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートでであった。大型および非常に小型のコロニーが観察された。大型コロニーのうち２個を精製し、そしてフェニルアラニン栄養要求株であることが示され、増殖にチロシンを必要としなかった。フェニルアラニンを含まないプレート上で画線した場合にこれらの株は増殖しなかった一方、チロシンを含まないプレートで画線した場合、それらは親株と異なり増殖した。ＤＰＤ４１１４およびＤＰＤ４１１５と命名したこれら２種の形質導入体は、マッコンキー寒天指標（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）プレートを使用してショ糖を醗酵することもまた示され、これは最初の株ＤＰＤ４１３０の特徴であるがしかし大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株の特徴でない。
【０１３１】
株ＤＰＤ４１１４およびＤＰＤ４１１５を、チロシン栄養要求株ＡＴ２４７１（ＣＧＳＣ ＃４５１０）を使用する交差供給試験を実施することにより、制限するフェニルアラニンの条件下でチロシン排出について試験した。従って、ＤＰＤ４１１４およびＤＰＤ４１１５をそれぞれ、炭素源としてグルコースおよびビタミンＢ１を補充したＶｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ最少培地プレートに画線した。非常に接近して、しかし接せずにＡＴ２４７１を画線した。３２℃で１日間のインキュベーション後に、ＤＰＤ４１１４若しくはＤＰＤ４１１５に最も近い画線の一部にのみＡＴ２４７１の良好な増殖が存在した。チロシンを排出しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＭＧ１６５５は同一条件下でＡＴ２４７１のいかなる増殖も可能にしなかった。これ故に、これらの結果は、チロシンがＤＰＤ４１１４およびＤＰＤ４１１５により排出されたことを示した。かように、本実施例において、フェニルアラニンを排出しかつチロシンを要求する株が、フェニルアラニンを要求しかつチロシンを排出する株に一段階で転換された。
【実施例５】
【０１３２】
高レベルのフェニルアラニンを排出する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のチロシン排出株への転換
本実施例は、高レベルのフェニルアラニンを排出する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株をチロシン排出株に一形質導入段階で転換するための実施例１のΔｐｈｅＬＡおよびＰｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域の使用を記述する。
【０１３３】
高レベルのフェニルアラニンを排出する株をいくつかの段階で得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１３９をＮＴＧを使用する突然変異誘発にかけ、次いで３−フルオロチロシンを使用してアナログ耐性について選択した。結果として生じる３−フルオロチロシン耐性株をＮＴＧで突然変異誘発し、そしてアナログ、パラ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性について選択した。結果として生じる３−フルオロチロシンおよびパラ−フルオロフェニルアラニン耐性株をＮＴＧで突然変異誘発し、そしてアナログβ−２−チエニルアラニンに対する耐性について選択した。結果として生じる３−フルオロチロシン、パラ−フルオロフェニルアラニンおよびβ−２−チエニルアラニン耐性株をＮＴＧで突然変異誘発し、そしてチロシン栄養要求株（Ｔｙｒ−）を単離した。３−フルオロチロシン、パラ−フルオロフェニルアラニン、β−２−チエニルアラニン耐性かつＴｙｒ−のチロシン耐性変異体株を選択した。結果として生じるチロシン、３−フルオロチロシン、パラ−フルオロフェニルアラニン、β−２−チエニルアラニンおよびＴｙｒ−株をファージＰ１、タイプＩファージおよびタイプＩＩファージに対する耐性について選択し、そしてその後キシロース陰性変異体を単離した。結果として生じる株を、欠失されたアテニュエーター（Ｎｅｌｍｓら Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９２ ５８（８）：２５９２−８および米国特許第５，１２０，８３７号明細書に記述される）を伴
うフィードバック耐性ｐｈｅＡ遺伝子をコードするプラスミドｐＪＮ３０７で形質転換した。最後にＴｙｒ＋原栄養株を単離し、そしてその後高フェニルアラニンおよび高温に耐性の株を得、そしてＤＰＤ４００３と命名した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４００３は醗酵でグルコースから＞４０ｇ／ｌのフェニルアラニンを産生する。
【０１３４】
フェニルアラニン排出株ＤＰＤ４００３はファージＰ１に耐性であった。従って、新たな遺伝物質を導入するのにＰ１媒介性の普遍形質導入を使用し得るようにファージＰ１感受性復帰変異株を単離した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４００３をＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍに感染させ、そしてまれなＣｍＲコロニーを単離した。これらの自発的な推定のＰ１耐性復帰変異株をその後、温度感受性の溶原性ファージを治癒させる（ｃｕｒｅ）ように４２℃で増殖について選択した。ＤＰＤ４１１０と命名された、これらの温度抵抗性かつＣｍ感受性単離物の１種が、Ｐ１に感受性であることが確認された。この確認は、Ｐ１ｃｌｒ１００Ｃｍによる感染後のＣｍＲコロニーの頻度を試験することにより行った。ＤＰＤ４００３の元の親株であるＤＰＤ４１３０の感染について得られたと類似の数のＣｍＲコロニーが、ＤＰＤ４１１０の感染について得られた。
【０１３５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１１０はカナマイシン耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＪＮ３０７を含有する。従って、この小型のプラスミドを欠くＤＰＤ４１１０の派生物を単離した。これは、ＤＰＤ４１１０を、致死量以下の濃度（５０若しくは７５μｇ／ｍｌ）のノボビオシンでＬＢ培地中３７℃で２２時間処理することにより達成された。これらの培養物からの単一コロニーをカナマイシン感受性について試験し、そして２個のこうした派生物を保持した。ＫａｎＳ株ＤＰＤ４１１２およびＤＰＤ４１１３でのプラスミドＤＮＡの喪失が、全ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動により確認された。
【０１３６】
株ＤＰＤ４１１２を、実施例１に記述されたΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４０８３のＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍライセートを使用する普遍形質導入でレシピエントとして使用した。高濃度のドナーＰ１ファージ、１００μｌのファージライセート、および非常に低濃度のカナマイシン（３．０μｇ／ｍｌ）を使用した。２５μｇ／ｍｌのカナマイシンの存在下で増殖することが不可能であった自発的低レベルカナマイシン耐性コロニーがこの手順で発生した。高レベル（２５μｇ／ｍｌ）のカナマイシンでその後増殖した１コロニーを得た。この形質導入体は、レシピエントＤＰＤ４１１２へのΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域の形質導入から生じる株について期待されるとおり、フェニルアラニン栄養要求株でありかつショ糖を醗酵することが示された。この新たな株ＤＰＤ４１１８もまた、クロラムフェニコールに対するその耐性およびその温度感受性により示されるとおりＰ１ｃｌｒ１００溶原菌であった。従って４２℃での増殖についての選択を行った。２種の結果として生じる株ＤＰＤ４１１９およびＤＰＤ４１２０はそれぞれ、クロラムフェニコール感受性でありかつチロシン栄養要求性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＡＴ２４７１の交差供給についてのプレートアッセイでチロシンを排出することが示された。
【０１３７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１１９およびＤＰＤ４１２０を振とうフラスコ中でチロシン産生について試験した。これらの実験は、２．０ｇ／Ｌグルコースおよび１０μｇ／ｍｌフェニルアラニンを含むＭＯＰＳ緩衝培地を使用して３２℃および３００ｒｐｍで行った。２４時間後にグルコースが枯渇し、そして培地中のチロシンおよびフェニルアラニンをＨＰＬＣにより測定した。表３は該結果を要約する。
【０１３８】
【表３】
【０１３９】
かように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４１１９およびＤＰＤ４１２０はかなりの量のチロシンを排出した。蓄積したプレフェン酸がフェニルピルビン酸に非酵素的に転化され得、それがその後フェニルアラニンにアミノ基転移されることが公知である［Ｙｏｕｎｇ，Ｉ．Ｇ．、Ｆ．ＧｉｂｓｏｎとＣ．Ｇ．ＭａｃＤｏｎａｌｄ（１９６９）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９２：６２−７２］および［Ｚａｍｉｒ，Ｌ．Ｏ．、Ｒ．ＴｉｂｅｒｉｏとＲ．Ａ．Ｊｅｎｓｅｎ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２８：２８１５−２８１８］ため、ｐｈｅＡの完全な欠失にもかかわらずフェニルアラニンもまた排出されたことは、驚くべきことではない。
【実施例６】
【０１４０】
チロシンの製造のための株ＤＰＤ４１１９の醗酵
本実施例は、醗酵における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１１９による高レベルのチロシン産生を記述する。株ＤＰＤ４１１９をさらなる培養のため１０Ｌ種醗酵槽（Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ）に移す前に、それを２．０Ｌ振とうフラスコ中で５００ｍｌの培地中３５℃、３００ｒｐｍでおよそ８．０時間増殖させた。振とうフラスコ培地は（１リットルあたりグラムで）：ＫＨ２ＰＯ４（１．０）；Ｎａ２ＨＰＯ４（３．０）；（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．０）；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．３）；酵母抽出物（２．０）；ＭＯＰＳ（１５．７）；Ｌ−Ｐｈｅ（０．１）；グルコース（１５）およびカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含有した。バッチ種醗酵槽培地は（１リットルあたりグラムで）：ＫＨ２ＰＯ４（２．１）；Ｎａ２ＨＰＯ４（０．９）；（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．５）；チアミン（１．０ｍｇ／ｌ）；Ｌ−Ｐｈｅ（０．２）および消泡剤（Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ１５３Ｋ）１．０ｍｌ／ｌを含有した。滅菌後、グルコースを２０ｇ／ｌの最終濃度まで、酵母抽出物を１．０ｇ／ｌで、カナマイシンを５０ｍｇ／ｌで、１６ｍｌの微量元素、およびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを２ｍＭで添加した。温度およびｐＨは、醗酵の全持続期間中それぞれ３５℃および６．８で維持した。細胞密度がＯＤ５５０２３に達した場合に、種醗酵槽からの培養物のアリコート（０．５ｌ）を、種醗酵槽と類似の培地組成を含有した別の１０Ｌ生産醗酵槽（Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ）に移した。生産醗酵槽の醗酵パラメータは後に続くとおりであった：１０％の溶解酸素、空気流０．５〜１ｖｖｍの間、温度３５℃、およびｐＨ６．８。グルコース（６０％）を、醗酵槽中の残余のグルコースレベルが０．５ｇ／ｌより下で維持されたような流加段階中に供給した。消泡剤Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ１５３Ｋを必要に基づき添加した。チロシンの産生を最大化するため、培養物をＯＤ５５０９．０で１．０ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、そして１６ｍｌの１．０Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏをこの時点で容器に添加した。サンプルを醗酵槽から定期的に抜き出し、そしてチロシン、Ｌ−フェニルアラニンおよびバイオマスについて分析した。結果を表４に示す。
【０１４１】
【表４】
【０１４２】
チロシンの産生についての上に報告された醗酵プロトコルは一例として示す。当業者は、チロシンの率および力価をさらに至適化するように従来技術に基づき本プロトコルの改変を容易に生成し得る。一例としての１つのこうした改変は、培地の成分および組成に対する変更、または流加様式の稼働中のグルコース供給プロファイルおよび／若しくは戦略に対する変更を包含し得る。
【０１４３】
かように、高レベルフェニルアラニン産生株由来でありかつ実施例１に記述されたΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１１９は、醗酵で４５ｇ／ｌ以上のチロシンを産生した。
【実施例７】
【０１４４】
ＩＰＴＧの要件を未然に防ぐためのｌａｃリプレッサーをコードするｌａｃＩの欠失
本実施例は、ΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ染色体領域に加えて、ｔｒｃプロモーターからのｔｙｒＡの発現がＩＰＴＧの非存在下で抑制されないようなＬａｃリプレッサーをコードするｌａｃＩの欠失もまた保有する、改良されたチロシン排出株を記述する。
【０１４５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４１１９は、それが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２制限系と異なる能動的ＤＮＡ制限系を有するためにさらなる遺伝子操作に最適でない。従って、ＤＰＤ４１１９の先行株である株ＤＰＤ４１１２（実施例５）を、λＫＡＮ２（Ｅｃｏ ＲＩ部位にクローン化した温度感受性リプレッサーおよびＫａｎＲ遺伝子をコードするｃｌ８５７をもつλ挿入ベクターλ ＮＭ４５９である）を使用する低下ＤＮＡ制限活性の選択にかけた。ＤＰＤ４１１２の多数のＫａｎＲおよび温度感受性変異体をλＫＡＮ２での溶原化および選択後に得た。低下された制限の確認は、λ５０７（異なる免疫性（ｉｍｍ２１）をもつ透明なｃｌ ｔｅｓｔファージ）に対する交差画線により行った。制限欠損単離物は、ファージの増殖およびその後細胞溶解を可能にしかつ交差画線の領域の細菌増殖を低下させたものであった。４２℃での増殖によるプロファージの除去後に、２種のＫａｎＳ株を保持し、そしてＤＰＤ６００６およびＤＰＤ６００７として保存した。これらの株のλ５０７ｔｅｓｔファージとの比較滴定で、株ＤＰＤ６００７は下の表５で見られるとおり、制限活性の最大の低下を有した。
【０１４６】
【表５】
【０１４７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ６００７（ＤＰＤ４１１９の先行体由来の制限欠損株）を使用して、制限欠損を除きＤＰＤ４１１９に同等である株を構築した。従って、ＤＰＤ６００７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰＤ４０８３（ΔｐｈｅＬＡ Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ：：ＫａｎＲ染色体領域を保有するＫ１２株）のＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍライセートを使用するＰ１形質導入でレシピエント株であった。選択プレート中のカナマイシンの多様な濃度および多様な濃度のファージを使用して、カナマイシン耐性について選択を行った。２５μｇ／ｍｌカナマイシンで増殖することが可能な合計１５超の形質導入体を、３０℃での２日のインキュベーション後に得た。Ｐ１ｃｌｒ１００Ｃｍの溶原菌が同時に形成されていたかどうか知るために、これらのうち１５種を試験した。７種のＫａｎＲ株は温度抵抗性かつクロラムフェニルコールに感受性であり、それらがＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍを保有していなかったことを示した。非溶原性株の全７種は、カナマイシン耐性とのｐｈｅＬＡ欠失の共形質導入を示すフェニルアラニン栄養要求株であった。これらの株の３種すなわちＤＰＤ４１２７、ＤＰＤ４１２８およびＤＰＤ４１２９を保存し、そしてチロシン産生について振とうフラスコで試験した。この振とうフラスコ比較のため、炭素源として２ｇ／Ｌグルコースを使用しかつ１５μｇ／ｍｌフェニルアラニンの初期濃度を補充したＭＯＰＳ培地中で該株を増殖させた。３２℃での２４時間（この時点でグルコースは枯渇された）のインキュベーション後にチロシンおよびフェニルアラニンの濃度をＨＰＬＣにより測定した。非常に類似のチロシン産生が試験した全部の株について観察され（下の表６を参照されたい）、制限欠損が期待されたとおりチロシン産生経路を妨害しなかったことを示した。
【０１４８】
【表６】
【０１４９】
上の株中のカナマイシン耐性カセットはｆｒｔ部位により隣接され、そして従ってＦｌｐ組換え酵素（Ｄａｔｓｅｎｋｏ、上記）を使用して除去し得る。染色体中にＦＲＴ瘢痕（ｓｃａｒ）を残すこの手順を、プラスミドｐＣＰ２０（Ｄａｔｓｅｎｋｏ、上記）を使用して株ＤＰＤ４１２８で行い、株ＤＰＤ７００１を生成した。チロシン産生に対する不利な影響はこの変化により期待されない。これを、３２℃でのインキュベーションを伴い、２ｇ／Ｌグルコースおよび１０μｇ／ｍｌフェニルアラニンを含むＭＯＰＳ培地を使用して振とうフラスコで試験した。ＤＰＤ４１１９およびＤＰＤ７００１の生物学的複製物を試験し、また、２２時間サンプルの技術的複製物を採取し、従って各株について４測定値をもたらした。これらの測定値の平均および標準偏差を下の表７に示す。
【０１５０】
【表７】
【０１５１】
期待されたとおり、株ＤＰＤ４１１９およびＤＰＤ７００１は非常に類似のチロシン産生を有する。
【０１５２】
チロシン産生株ＤＰＤ４１１９およびＤＰＤ７００１でコリスミ酸ムターゼおよびプレフェン酸脱水素酵素活性をコードするｔｙｒＡの発現は染色体のｔｒｃプロモーターから駆動される。従って、ＬａｃＩリプレッサーはｔｙｒＡ発現を低下させかつ結果としてチロシン産生を制限することができ、そして従ってＩＰＴＧをＤＰＤ４１１９での醗酵に慣例に添加した。ｔｙｒＡの誘導可能な発現はこれらの株で必要でなかったことが期待された。事実、連続的な高ｔｙｒＡ発現は有益であることができ、その結果、ｔｙｒＡレベルが制限する場合に発生する障害の後で中間体が蓄積しない。従って、ＩＰＴＧに対する必要性を排除するため、およびより高レベルのｔｙｒＡ発現を与えるため、株ＤＰＤ７００１の染色体ｌａｃＩ遺伝子を欠失した。
【０１５３】
温度感受性ｓａｃＢプラスミドｐＴｓＣＳＥ７．３（米国特許第６，６７３，５６７号明細書）を使用して、ＬａｃリプレッサーをコードするｌａｃＩ遺伝子およびｌａｃＺＹＡオペロンの欠失を構築した。ｌａｃＩＺＹＡ領域に隣接する１．０ｋｂの領域の増幅のため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ゲノム配列を使用してＰＣＲプライマーを設計した（Ｌａｃ＿１プライマー、配列番号２７；Ｌａｃ＿２プライマー、配列番号２８；Ｌａｃ＿３プライマー、配列番号２９；Ｌａｃ＿４プライマー、配列番号３０）。
【０１５４】
ｌａｃＩＺＹＡ領域に遠位のプライマーのそれぞれはｐＴｓＣＳＥ７．３へのクローニングのためのＥａｇＩ部位を含有した。加えて、ｌａｃオペロンに近位のプライマーのそれぞれは、第二のＰＣＲ反応で使用される相補的な３３ｂｐの領域を含有した。プライマーＬａｃ＿１およびＬａｃ＿２を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＭＧ１６５５からの鋳型ＤＮＡを用いて１ｋｂのＰＣＲ産物を生成させた。同様に、プライマーＬａｃ＿３およびＬａｃ＿４を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＭＧ１６５５からの鋳型ＤＮＡを用いて１ｋｂのＰＣＲ産物を生成させた。これら２種のＰＣＲ反応の産物を、Ｌａｃ＿１およびＬａｃ＿４プライマーを用いる交差ＰＣＲ反応で鋳型として使用して、ｌａｃＩＺＹＡ欠失を伴う２ｋｂの領域を生成させた。ゲル精製およびＥａｇＩ消化後に、交差ＰＣＲ産物を、ＥａｇＩ消化しかつＣＩＰ処理したｐＴｓＣＳＥ７．３に成功裏にクローン化した。
【０１５５】
電気穿孔法を使用して、４種の独立なｌａｃＩＺＹＡ欠失プラスミドでＤＰＤ７００１を形質転換した。２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上４２℃で、ＤＰＤ４１１９若しくはＤＰＤ７００１の温度抵抗性のＣｍＲ派生物についての選択を実施した。ＤＰＤ７００１中の１種の組込まれたプラスミドを単離した。
【０１５６】
組込まれた欠失プラスミドを保有するＤＰＤ７００１のこの派生物を、４２℃で５％ショ糖を保有するＬＢプレートを使用するショ糖対選択にかけた。この選択は、ＤＰＤ７００１がショ糖を炭素源として利用し得るという事実にもかかわらず良好にはたらいた。期
待されたとおり、Ｌａｃ＋およびＬａｃ−双方の株がショ糖耐性選択から得られた（図６を参照されたい）。Ｌａｃ＋株に至るプラスミドの切り出しは元の染色体構造を復帰させる。Ｌａｃ−株をもたらす交差事象はｌａｃＩＺＹＡの欠失を生じ、そして、元は欠失プラスミドを構築するのに使用した３３塩基対セグメント、５’−ＧＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＴＴＧＣＧＴＧ−３’を後に残す（図６を参照されたい）。
【０１５７】
ＤＰＤ７００１中に組込まれたプラスミドを保有する株からのＬａｃ−およびＬａｃ＋双方の派生物が、ＬＢプレート上に単一コロニーについて画線した場合に、親のような小型の、および中程度の大きさのコロニーを生じたことが観察された。従って、ＬＢプレートでの５回の単一コロニー精製を実施し、そして「小型コロニー」もしくは「中型コロニー」の形態を保持した。２ｋｂのｌａｃオペロンに隣接する領域の外側のプライマーを使用するＰＣＲ試験は、「小型コロニー」および「中型コロニー」双方の株でのｌａｃオペロンの欠失を確認した。
【０１５８】
数種の単離物を、２ｇ／ｌグルコースおよび最初の１０μｇ／ｍｌフェニルアラニンを含むＭＯＰＳ緩衝培地を使用し、振とうフラスコ中でチロシンおよびフェニルアラニン産生について二重で試験した（下の表８を参照されたい）。
【０１５９】
【表８】
【０１６０】
２種の「小型コロニー」Ｌａｃ−株ＤＰＤ４１４５およびＤＰＤ４１４６は、親株ＤＰＤ７００１より約２５％より多いチロシンおよび２５％より少ないフェニルアラニンを有した。従って、ＬａｃＩリプレッサーの遺伝子の欠失は、ｔｒｃプロモーターからのｔｙｒＡのより高レベル発現を明らかに可能にする。これ故に、ＴｙｒＡタンパク質により触媒されるコリスミ酸→プレフェン酸→フェニルピルビン酸の段階での障害が部分的に軽減され、そしてより多量のチロシンが排出される。
【実施例８】
【０１６１】
チロシンの産生のための株ＤＰＤ４１４５の醗酵
その構築が実施例７に記述される株ＤＰＤ４１４５を、１０Ｌ醗酵でグルコースからのチロシンの産生について評価した。使用した醗酵プロトコルおよび培地は、以下の顕著な差違を除き、実施例６に記述されたものに類似であった。ＤＰＤ４１１９と異なり、ＤＰＤ４１４５を使用する醗酵はＩＰＴＧで誘導せず、そして抗生物質をプロトコル全体で使用しなかった。チロシン力価の有意の増大が表９に示されるとおり達成された。さらに、ＩＰＴＧ若しくは抗生物質への依存の欠如が、この株を経済的スケールアップに従いやす
くする。
【０１６２】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】芳香族アミノ酸生合成経路の具体的説明である。
【図２】Ａ）プライマー相同性領域（ＡおよびＢ）を伴う、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体のｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域中およびその周囲のコーディング領域、ならびに欠失の標的とされる領域（Δ）の図解を示す。Ｂ）ＰＣＲ鋳型ｔｅｔＡおよびｔｅｔＲ遺伝子領域、ならびにＴｅｔＲＡ環形成のためのＤＮＡフラグメントを生じさせるための２種のＰＣＲ反応で使用されるプライマーの図解を示す。
【図３】図２Ｂに示されるプライマーからのＰＣＲ産物のＴｅｔＲＡ環の形成の図解を示す。
【図４】ＴｅｔＲＡ環と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体の間の組換え反応、および生じる染色体組込み産物の図解を示す。
【図５】ｐｈｅＬＡ領域に組込まれたＴｅｔＲＡ環を保有する株についてのテトラサイクリン感受性対選択の２種の可能な結果の図解を示す。
【図６】ｌａｃＩＺＹＡ領域中に組込まれたｓａｃＢプラスミドを保有する株についてのショ糖耐性選択の２種の可能な結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）内因性ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ染色体領域；および
ｉｉ）コリスミ酸を産生する芳香族アミノ酸生合成経路
を含んでなる腸内細菌株を提供すること；
ｂ）段階（ａ）の株の染色体に、
１）ｔｙｒＡをコードする１個のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたプロモーターを含んでなる核酸フラグメント；および
２）非機能的ｐｈｅＡ核酸配列
を含んでなる工作された染色体セグメントを挿入することを含んでなり、かつ、
該工作された染色体セグメントが、宿主染色体の内因性ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域を置換して、Ｌ−チロシン過剰産生株を創製するものである、
チロシンを過剰産生する細菌株の作製方法。
【請求項２】
腸内細菌株が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、ＡＴＣＣ ＃７００９２６、ＡＴＣＣ＃２７３２５、ＡＴＣＣ＃３１８８２、ＡＴＣＣ＃３１８８４およびＡＴＣＣ＃１３２８１よりなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
芳香族アミノ酸生合成経路が、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＬ、ａｒｏＫ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ｔｙｒＡ、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＢよりなる群から選択される遺伝子を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工作された染色体セグメントが場合によっては選択マーカーを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
非機能的ｐｈｅＡ核酸配列が、ｐｈｅＡコーディング領域の少なくとも一部分の欠失を含んでなる核酸フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｔｙｒＡをコードするオープンリーディングフレームが、配列番号７、８、９、１３、１４、１５および１６よりなる群から選択される核酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記腸内細菌株が、
ａ）フィードバック耐性ＤＡＨＰ合成酵素；および
ｂ）非機能的ｔｙｒＲ
よりなる群から選択される遺伝形質を含んでいてもよい、上記方法。
【請求項９】
フィードバック耐性ＤＡＨＰ合成酵素がａｒｏＧ３９７突然変異を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
非機能的ｔｙｒＲがｔｙｒＲ３６６突然変異を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
腸内細菌株が、以下の表現型形質：
ａ）３−フルオロチロシンに対する耐性；および
ｂ）パラ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性；および
ｃ）β−２−チエニルアラニンに対する耐性；および
ｄ）チロシンに対する耐性；および
ｅ）高フェニルアラニンおよび高温に対する耐性
のすべてを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記プロモーターが、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λ ＰＬ、λ ＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｍａｌＥ、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、ｒｒｎＢ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｃｓｐＡ、ｇｙｒＡ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）スピーシーズのｎｐｒＭ、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｖｅｓ）スピーシーズのグルコース異性化酵素よりなる群から選択される、上記方法。
【請求項１３】
請求項１、４、８若しくは１１のいずれか１つに記載の方法により作製される、チロシンを過剰産生する腸内細菌株。
【請求項１４】
以下の特徴：
ａ）ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＬ、ａｒｏＫ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ｔｙｒＡ、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＢよりなる群から選択される遺伝子を含んでなる、芳香族アミノ酸生合成経路の存在
ｂ）非機能的ｐｈｅＡ遺伝子
ｃ）ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λ ＰＬ、λ ＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｍａｌＥ、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、ｒｒｎＢ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｃｓｐＡ、ｇｙｒＡ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）スピーシーズのｎｐｒＭ、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）スピーシーズのグルコース異性化酵素よりなる群から選択されるプロモーターの制御下のその内因性のゲノム位置のｔｙｒＡ遺伝子の過剰発現；
ｄ）３−フルオロチロシンに対する耐性；
ｅ）パラ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性；
ｆ）β−２−チエニルアラニンに対する耐性；
ｇ）チロシンに対する耐性；ならびに
ｈ）高フェニルアラニンおよび高温に対する耐性
を含んでなる、チロシンを過剰産生する腸内細菌株。
【請求項１５】
ａ）フィードバック耐性ＤＡＨＰ合成酵素；および
ｂ）非機能的ｔｙｒＲ
よりなる群から選択される遺伝形質をコードする遺伝子を含んでなる、請求項１４に記載のチロシン過剰産生株。
【請求項１６】
フィードバック耐性ＤＡＨＰ合成酵素と関連する遺伝形質をコードする遺伝子がａｒｏＧ３９７突然変異を有する、請求項１５に記載のチロシン過剰産生株。
【請求項１７】
非機能的ｔｙｒＲと関連する遺伝形質をコードする遺伝子がｔｙｒＲ３６６突然変異を有する、請求項１５に記載のチロシン過剰産生株。
【請求項１８】
ａ）請求項１３に記載のチロシンを過剰産生する腸内細菌株を提供すること；および
ｂ）Ｌ−チロシンが産生される条件下で前記チロシン過剰産生株を増殖させること
を含んでなる、Ｌ−チロシンの製造方法。
【請求項１９】
ａ）請求項１４に記載のチロシンを過剰産生する腸内細菌株を提供すること；および
ｂ）Ｌ−チロシンが産生される条件下で前記チロシン過剰産生株を増殖させること
を含んでなる、Ｌ−チロシンの製造方法。
【請求項２０】
ｔｙｒＡ遺伝子がｌａｃに調節されるプロモーターの制御下にあり、かつ、腸内細菌株
がｌａｃＩＺＹＡ欠失を含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
Ｌ−チロシンが最低約２６ｇ／Ｌの濃度で産生される、請求項１８、１９若しくは２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｌ−チロシンが最低約５４ｇ／Ｌの濃度で産生される、請求項１８、１９若しくは２０に記載の方法。
【請求項２３】
Ｌ−チロシンが最低約７５ｇ／Ｌの濃度で産生される、請求項１８、１９若しくは２０に記載の方法。
【請求項１】
ａ）ｉ）内因性ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ染色体領域；および
ｉｉ）コリスミ酸を産生する芳香族アミノ酸生合成経路
を含んでなる腸内細菌株を提供すること；
ｂ）段階（ａ）の株の染色体に、
１）ｔｙｒＡをコードする１個のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたプロモーターを含んでなる核酸フラグメント；および
２）非機能的ｐｈｅＡ核酸配列
を含んでなる工作された染色体セグメントを挿入することを含んでなり、かつ、
該工作された染色体セグメントが、宿主染色体の内因性ｐｈｅＡ−ｔｙｒＡ領域を置換して、Ｌ−チロシン過剰産生株を創製するものである、
チロシンを過剰産生する細菌株の作製方法。
【請求項２】
腸内細菌株が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、ＡＴＣＣ ＃７００９２６、ＡＴＣＣ＃２７３２５、ＡＴＣＣ＃３１８８２、ＡＴＣＣ＃３１８８４およびＡＴＣＣ＃１３２８１よりなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
芳香族アミノ酸生合成経路が、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＬ、ａｒｏＫ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ｔｙｒＡ、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＢよりなる群から選択される遺伝子を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工作された染色体セグメントが場合によっては選択マーカーを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
非機能的ｐｈｅＡ核酸配列が、ｐｈｅＡコーディング領域の少なくとも一部分の欠失を含んでなる核酸フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｔｙｒＡをコードするオープンリーディングフレームが、配列番号７、８、９、１３、１４、１５および１６よりなる群から選択される核酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記腸内細菌株が、
ａ）フィードバック耐性ＤＡＨＰ合成酵素；および
ｂ）非機能的ｔｙｒＲ
よりなる群から選択される遺伝形質を含んでいてもよい、上記方法。
【請求項９】
フィードバック耐性ＤＡＨＰ合成酵素がａｒｏＧ３９７突然変異を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
非機能的ｔｙｒＲがｔｙｒＲ３６６突然変異を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
腸内細菌株が、以下の表現型形質：
ａ）３−フルオロチロシンに対する耐性；および
ｂ）パラ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性；および
ｃ）β−２−チエニルアラニンに対する耐性；および
ｄ）チロシンに対する耐性；および
ｅ）高フェニルアラニンおよび高温に対する耐性
のすべてを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記プロモーターが、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λ ＰＬ、λ ＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｍａｌＥ、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、ｒｒｎＢ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｃｓｐＡ、ｇｙｒＡ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）スピーシーズのｎｐｒＭ、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｖｅｓ）スピーシーズのグルコース異性化酵素よりなる群から選択される、上記方法。
【請求項１３】
請求項１、４、８若しくは１１のいずれか１つに記載の方法により作製される、チロシンを過剰産生する腸内細菌株。
【請求項１４】
以下の特徴：
ａ）ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＬ、ａｒｏＫ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ｔｙｒＡ、ｐｈｅＡおよびｔｙｒＢよりなる群から選択される遺伝子を含んでなる、芳香族アミノ酸生合成経路の存在
ｂ）非機能的ｐｈｅＡ遺伝子
ｃ）ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λ ＰＬ、λ ＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｍａｌＥ、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、ｒｒｎＢ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｃｓｐＡ、ｇｙｒＡ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）スピーシーズのｎｐｒＭ、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）スピーシーズのグルコース異性化酵素よりなる群から選択されるプロモーターの制御下のその内因性のゲノム位置のｔｙｒＡ遺伝子の過剰発現；
ｄ）３−フルオロチロシンに対する耐性；
ｅ）パラ−フルオロフェニルアラニンに対する耐性；
ｆ）β−２−チエニルアラニンに対する耐性；
ｇ）チロシンに対する耐性；ならびに
ｈ）高フェニルアラニンおよび高温に対する耐性
を含んでなる、チロシンを過剰産生する腸内細菌株。
【請求項１５】
ａ）フィードバック耐性ＤＡＨＰ合成酵素；および
ｂ）非機能的ｔｙｒＲ
よりなる群から選択される遺伝形質をコードする遺伝子を含んでなる、請求項１４に記載のチロシン過剰産生株。
【請求項１６】
フィードバック耐性ＤＡＨＰ合成酵素と関連する遺伝形質をコードする遺伝子がａｒｏＧ３９７突然変異を有する、請求項１５に記載のチロシン過剰産生株。
【請求項１７】
非機能的ｔｙｒＲと関連する遺伝形質をコードする遺伝子がｔｙｒＲ３６６突然変異を有する、請求項１５に記載のチロシン過剰産生株。
【請求項１８】
ａ）請求項１３に記載のチロシンを過剰産生する腸内細菌株を提供すること；および
ｂ）Ｌ−チロシンが産生される条件下で前記チロシン過剰産生株を増殖させること
を含んでなる、Ｌ−チロシンの製造方法。
【請求項１９】
ａ）請求項１４に記載のチロシンを過剰産生する腸内細菌株を提供すること；および
ｂ）Ｌ−チロシンが産生される条件下で前記チロシン過剰産生株を増殖させること
を含んでなる、Ｌ−チロシンの製造方法。
【請求項２０】
ｔｙｒＡ遺伝子がｌａｃに調節されるプロモーターの制御下にあり、かつ、腸内細菌株
がｌａｃＩＺＹＡ欠失を含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
Ｌ−チロシンが最低約２６ｇ／Ｌの濃度で産生される、請求項１８、１９若しくは２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｌ−チロシンが最低約５４ｇ／Ｌの濃度で産生される、請求項１８、１９若しくは２０に記載の方法。
【請求項２３】
Ｌ−チロシンが最低約７５ｇ／Ｌの濃度で産生される、請求項１８、１９若しくは２０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−３２５５９２（Ｐ２００７−３２５５９２Ａ）
【公開日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１５０６４９（Ｐ２００７−１５０６４９）
【出願日】平成１９年６月６日（２００７．６．６）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月６日（２００７．６．６）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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