Ｌ−リボースイソメラーゼとその製造方法並びに用途
【課題】 Ｌ−リボースやＤ−タロースなどの希少糖質を提供する。
【解決手段】 Ｌ−リボースイソメラーゼとその製造方法を確立し、併せて本Ｌ−リボースイソメラーゼを用いてＬ−リボース、Ｄ−タロースなどのアルドースを対応するケトースに異性化させるか、又はＬ−リブロース、Ｄ−タガトースなどのケトースを対応するアルドースに異性化させることにより各種希少糖質の製造方法を確立して解決する。
【解決手段】 Ｌ−リボースイソメラーゼとその製造方法を確立し、併せて本Ｌ−リボースイソメラーゼを用いてＬ−リボース、Ｄ−タロースなどのアルドースを対応するケトースに異性化させるか、又はＬ−リブロース、Ｄ−タガトースなどのケトースを対応するアルドースに異性化させることにより各種希少糖質の製造方法を確立して解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−リボースイソメラーゼとその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、Ｌ−リボースをＬ−リブロースに異性化し、Ｌ−リブロースをＬ−リボースに異性化するＬ−リボースイソメラーゼとその製造方法、それを産生する微生物、並びに該酵素を用いるケトース及びアルドースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生化学工業が発達し、糖質化学の分野においても、従来、殆ど必要としなかった各種希少糖質の需要が起こりつつあり、これらの糖質の安定な製造方法の確立が望まれている。これらの糖質の製造方法は、有機化学的手法によっても行うことができるが、一般的には、その製造条件が苛酷で、目的糖質の収率が低く、工業的生産方法としては不適である。一方、生化学的手段としては、酵素による糖質変換方法が想定されるものの希少糖質であるＬ−リボース、Ｄ−タロース等に作用するイソメラーゼは現在まで全く報告がなく、その生産方法も確立されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
工業的にＬ−リボースやＤ−タロース等の希少糖質を製造する方法を確立することが強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は上記課題を解決するために、Ｌ−リボースイソメラーゼに着目し、その酵素を産生する微生物を広く検索した。その結果、香川県木田郡三木町の土壌から分離したアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規な微生物ＬＲ７Ｃ株が、Ｌ−リボースイソメラーゼを産生することを見出した。本菌株の生産するＬ−リボースイソメラーゼを基質であるアルドースまたはケトースに作用させることにより各種の希少糖質を容易に製造しうることを見出し、本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によって、従来入手が困難であった希少糖質を容易に提供できることとなり、それが与える影響は、食品、化粧品、医薬品、化学品など多くの工業分野に及び、その工業的意義は極めて大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明のアシネトバクター属に属する微生物ＬＲ７Ｃ株の同定試験結果を示す。
【０００７】
＜アシネトバクター・カルコアセティカスＬＲ７Ｃ株の同定試験結果＞
＜Ａ 細胞形態＞
肉汁寒天培養、２７℃
通常１．０乃至１．５×１．５乃至２．５μｍ桿菌。単独。運動性あり
（回転あるいは振動）。無胞子。鞭毛あり。グラム陰性。
【０００８】
＜Ｂ 培養的性質＞
（１） 肉汁寒天平板培養、２７℃
形状 ： 円形。大きさは２日間培養で０．１乃至１ｍｍ。
周縁 ： 全縁
隆起 ： 半レンズ状
光沢 ： 鈍光
表面 ： 平滑
色調 ： 不透明、淡い黄色
（２） 肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育度 ： 良好
形状 ： 糸状
（３） トリプトソーヤ寒天斜面培養、２７℃
生育度 ： 良好
形状 ： 糸状
（４） 肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化しない。
【０００９】
＜Ｃ 生理学的性質＞
（１） 硝酸塩の還元性 ： 陽性
（２） ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積： 陰性
（３） メチルレッド試験 ： 陰性
（４） ＶＰ試験 ： 陰性
（５） インドールの生成 ： 陰性
（６） 硫化水素の生成 ： 陰性
（７） 澱粉の加水分解 ： 陰性
（８） クエン酸の利用 ： 陽性
（９） 色素の生成 ： なし
（１０） オキシダーゼ ： 陰性
（１１） カタラーゼ ： 陽性
（１２） 生育の温度範囲 ： ２０乃至３７℃
（１３） 酸素に対する態度 ： 好気性
（１４） Ｄ−グルコースからの酸の生成： 陽性
（１５） 溶血性 ： 陰性
（１６） β−キシロシダーゼ ： 陰性
（１７） 炭素源の利用： グルタル酸、マロン酸、フェニル乳酸、アゼライン酸、
Ｄ−リンゴ酸、エタノール、２，３−ブタンジオール、
アコニット酸、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−ア
ラビノース及びＤ−グルコースを利用する。
（１８） 窒素源の利用： Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラ
ギン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−チロシン、β−アラニン、
Ｌ−アルギニン及びＬ−オルニチンを利用する。
ヒスタミンを利用しない。
（１９） ＤＮａｓｅ ： 陽性
（２０） ３−ケトラクトースの生成： 陰性
（２１） ＤＮＡのＧ−Ｃ含量 ： ４２％
【００１０】
以上の菌学的性質をもとにして、『バージーズ・マニュアル・オブ・デターミナティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、第９版（１９９４年）を参考にして、公知の菌株とその異同を検討した。その結果、本菌は、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物であることが判明した。詳細には、４１℃で生育せず、ゼラチン分解と溶血性が陰性、グルコースからの酸生成が陽性及び炭素源と窒素源の利用状況からアシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）と同定した。
【００１１】
これらの結果から、本発明者等は、本微生物を『アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＬＲ７Ｃ』と命名し、平成７年１２月１４日付けで、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託し、受託番号『ＦＥＲＭ ＢＰ−５３３５』として受託された。
【００１２】
本発明では、上記菌株のみならず、アシネトバクター属に属し、Ｌ−リボースイソメラーゼ産生能を有する他の菌株やこれらの変異株なども適宜使用することができる。例えば、紫外線照射やガンマ線照射などの物理処理や、ニトロソグアニジンなどの化学処理、更にはＤ−リキソースを含有する培地で継代培養するなどにより変異株を得て、Ｌ−リボースイソメラーゼを安定して産生させたり、その産生量を高めたりすることも随意である。更に、本発明では、これら微生物に限ることなく、Ｌ−リボースイソメラーゼ産生能を有する微生物であれば広く利用することができる。加えて、Ｌ−リボースイソメラーゼをコードする遺伝子を他の微生物に組換え発現させて、Ｌ−リボースイソメラーゼを産生させることも可能である。更には、必要に応じて、蛋白質工学的手法により、本発明のＬ−リボースイソメラーゼの温度安定性を高めたり、ｐＨ安定性の範囲を広げたりして利用することも有利に実施できる。本発明の微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本発明のＬ−リボースイソメラーゼを産生するものであればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、アルドース、ケトース、糖アルコールなどから選ばれる１種または２種以上が適宜選ばれる。通常、前培養の培地としては、Ｄ−リキソースが有利に用いられる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、及び、例えば、尿素、コーンスティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩が適しており、通常、約１０乃至４０℃、望ましくは、約２０乃至３５℃、約ｐＨ５乃至９、望ましくは、約６乃至８．５から選ばれる条件で好気的に行われる。
【００１３】
このようにして、微生物を培養した後、得られる培養物から本発明の酵素を回収する。本酵素活性は、主に菌体に認められ、菌体を酵素剤として利用してもよい。菌体内酵素は、通常の手段をもちいて菌体から抽出し、粗酵素として用いることができる。粗酵素は、そのまま用いることもできるが、常法に従って、更に精製することもできる。例えば、菌体磨砕抽出液をポリエチレングリコール分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００１４】
本発明のＬ−リボースイソメラーゼの活性は次のようにして測定する。０．５Ｍグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）０．０５ｍｌ、０．０５ＭＬ−リボース０．０５ｍｌ、および酵素液を加えて全容を０．５ｍｌとし、３０℃で酵素反応を行い、生成するＬ−リブロースをシステイン・カルバゾール法により測定する。酵素活性１単位は、１分間に１μｍｏｌのＬ−リブロースを生成するに要する酵素量とする。
【００１５】
本発明のＬ−リボースイソメラーゼは、基質として、Ｌ−リボースのみならず、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロース及びＬ−グロースにも作用する。これらのアルドースは異性化され、それぞれ対応するケトースになる。
【００１６】
本発明のＬ−リボースイソメラーゼは、必ずしも高度に精製して用いる必要はなく、例えば、本Ｌ−リボースイソメラーゼを有する微生物をトルエン処理をしたものをそのまま用いることは、工業的に糖質変換反応する上で好都合である。また、本発明のＬ−リボースイソメラーゼを固定化して利用することも有利に実施できる。例えば、本酵素活性を有する微生物又は部分精製酵素を、包括法、吸着法、共有結合法などの固定化方法により固定化して、バッチ反応で繰り返し利用することも、また、カラムなどに充填して連続的に利用することも随意である。
【００１７】
このようにして得られる反応液は、通常、アルドースとケトースの両者を含有している。反応液は、常法、すなわち、濾過助剤、濾過膜、精密濾過膜などを用いる濾過や、遠心分離などによる不溶物の除去、活性炭を用いた脱色、Ｈ型及び／又はＯＨ型イオン交換樹脂等を用いた脱塩などを組み合わせて精製し、濃縮してシラップ状製品にすることも、乾燥して粉末状などの固状物にすることも随意である。また、必要ならば、更に高度な精製をすることも随意である。例えば、アルカリ金属型及び／又はアルカリ土類金属型の陽イオン交換樹脂や、亜硫酸水素型及び／又はほう酸型の陰イオン交換樹脂や、シリカゲル等を用いるカラムクロマトグラフィーにより目的糖質の高含有画分を採取する方法で高純度の糖質を得ることも容易である。更には、得られる糖質が結晶性の場合には、斯界において慣用の晶析技術を適用して結晶製品に仕上げることも随意である。例えば、上述のようにして得られる反応液又は当該反応液に適宜の精製手段の施された糖液に、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールをはじめとする低級アルキルアルコール類など通常の有機溶媒から選ばれる１種又は２種以上を添加・混合するか、これら糖液に濃縮及び／又は低温処理を施すか、更にはこれらの方法を組み合わせることにより、当該糖質の過飽和溶液とし、結晶化させ、これを分蜜するなどすれば結晶含有固状物が得られる。このようにして得られる各種糖質は、試薬はもとより、甘味料、品質改良剤などとして食品工業に、原材料、中間体などとして医薬品工業、化学工業など多くの用途に利用できる。
【００１８】
とりわけ、Ｌ−リボースの光学異性体であるＤ−リボースは、細胞の増殖と密接に関連しているＲＮＡの必須成分であるので、Ｌ−リボース自体を、又は、これを原料として誘導体としたものを、核酸の複製阻害剤などとして用いることができ、例えば、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗エイズ剤、抗癌剤などの医薬品に利用することも有利に実施できる。以上述べたようにＬ−リボースは、本発明のＬ−リボースイソメラーゼを用いることによりＬ−リブロースから容易に製造できる。Ｌ−リブロースの出所・由来は問わない。例えば、リビトールを原料として、グルコノバクター属やアセトバクター属に属する微生物、具体的には、例えば、グルコノバクター・フラテウリやアセトバクター・アセチなどによる、酸化反応で、Ｌ−リブロースを容易に得ることができる。以下、実験で本発明を詳細に説明する。
【００１９】
＜実験１：アシネトバクター・カルコアセティカスＬＲ７ＣからのＬ−リボースイソメラーゼの製造＞
酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、食塩０．５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地をｐＨ７．０に調整した。この培地２ｌを２．５ｌ容ジャーファーメンターに入れ、オートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌し、冷却して、あらかじめＤ−リキソースを単一炭素源とした培養基に４日間前培養したアシネトバクター・カルコアセティカスＬＲ７Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３３５）を接種し、３０℃で１４時間通気撹拌培養した。培養液を遠心分離して、菌体を培地１ｌ当たり湿質量約１５ｇを採取し、これを、常法に従って、アルミナ粉末とともに磨砕し、０．０５Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて酵素を抽出し遠心分離して上清（粗酵素液）２００ｍｌを得た。本液は、活性量２８７０単位、比活性１．７３単位／ｍｇ蛋白質であった。
【００２０】
＜実験２：Ｌ−リボースイソメラーゼの精製＞
【００２１】
＜実験２−１：ポリエチレングリコール分画＞
実験１で得た粗酵素液を、氷冷し、これに０．０１Ｍ塩化マンガンを添加し、３０分間放置したあと不溶物を遠心分離して除去した。次いで、ポリエチレングリコール粉末を１５ｗ／ｖ％になるように加え、撹拌溶解し、生じた不溶物を遠心分離して除去した。得られた上清にポリエチレングリコールを終末２５ｗ／ｖ％になるように加え、撹拌溶解し、生じた不溶物を遠心分離し、沈殿を採取した。
【００２２】
＜実験２−２：イオン交換クロマトグラフィー＞
実験２−１で得た沈殿物を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、不溶物を遠心分離して除去し、上清１３ｍｌを得た。本上清を弱塩基性陰イオン交換樹脂（東ソー製、商品名『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ』）を充填したカラムにかけて本酵素を吸着させ、次いで、塩化カリウムによる０乃至０．５Ｍの濃度勾配で溶出し、Ｌ−リボースイソメラーゼ画分を採取した。
【００２３】
＜実験２−３：ゲル濾過クロマトグラフィー＞
実験２−２で得た活性画分を濃縮し、これをビーズ状デキストランゲル（ファルマシア社製、商品名『セファデックス Ｇ−１５０』）を充填したカラムにかけ、０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出し、Ｌ−リボースイソメラーゼ活性画分を採取した。上述の各精製工程における蛋白質量、酵素活性量、回収率、精製倍率を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
表１の工程で『セファデックス Ｇ−１５０』を用いるゲル濾過溶出液として得られた精製酵素標品をポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法で純度を検定したところ、単一バンドであることが確認され、電気泳動的に極めて高純度の酵素標品であることが判明した。
【００２６】
＜実験３：Ｌ−リボースイソメラーゼの性質＞
実験２の方法で得た精製Ｌ−リボースイソメラーゼを用いて、その理化学的性質を調べた。
【００２７】
＜実験３−１：作用＞
活性測定法に準じて、Ｌ−リボースに作用させるとＬ−リブロースを生成し、Ｌ−リブロースに作用させるとＬ−リボースが生成する。この反応は可逆的であり平衡反応である。
【００２８】
＜実験３−２：基質特異性＞
活性測定法に準じて、各種アルドースを基質に活性を測定した。Ｌ−リボースを１００とした時の各種アルドースに対する相対活性を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
表２の結果からも明らかなように、Ｌ−リボースに対して最も高い活性を示した。他にＤ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロース及びＬ−グロースにも作用した。この反応は可逆的であり、またそれぞれのアルドースに対応するＬ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコース及びＬ−ソルボースを基質としても同様に作用した。これらの基質から生産されるケトースおよびアルドースをイオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等によって確認した結果を表３にまとめた。
【００３１】
【表３】
【００３２】
表３から明らかなように、本発明のＬ−リボースイソメラーゼは各種アルドースに作用し対応するケトースへ変換する。また同様に、各種ケトースに作用し対応するアルドースへ変換する。これらの反応様式は共通しており、その一例としてＬ−リボースの場合を示すと化１のとおりである。
【００３３】
【化１】
【００３４】
本イソメラーゼ反応は可逆的であり、それぞれアルドース、ケトース間の反応の、活性測定法の条件下における、平衡の量的関係を確認した結果を表４にまとめた。
【００３５】
【表４】
【００３６】
次にＬ−リボースに対するＫｍを求めた結果、４４ｍＭであった。
【００３７】
＜実験３−３：分子量＞
（１） ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と略記する。）で約２５，０００乃至３５，０００ダルトンを示す。
（２） ゲル濾過法で約１１０，０００乃至１３０，０００ダルトンを示す。
ゲル濾過法による分子量結果が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量結果の約４倍になることから、Ｌ−リボースイソメラーゼは、４量体で存在していることが推察される。
【００３８】
＜実験３−４：等電点＞
アガロースプレートを用いる等電点電気泳動法で、ｐＩ約４．０乃至５．５を示す。
【００３９】
＜実験３−５：活性阻害＞
Ｌ−アラビトールやリビトールの共存下で活性がわずかに阻害される。
【００４０】
＜実験３−６：至適温度＞
活性測定法に準じて調べた。結果は、図１に示すように、ｐＨ９．０、１０分間反応で、約３０℃が至適である。
【００４１】
＜実験３−７：至適ｐＨ＞
活性測定法に準じて調べた。結果は、図２に示すように、３０℃、１０分間反応で、ｐＨ約８乃至９が至適である。図中、○、●及び△は、緩衝液として、それぞれ、クエン酸塩緩衝液、ベルナール緩衝液及びグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液を用いて活性測定した結果を示す。
【００４２】
＜実験３−８：温度安定性＞
活性測定法に準じて調べた。結果は、図３に示すように、ｐＨ９．０、１０分間保持で、３０℃付近まで安定である。
【００４３】
＜実験３−９：ｐＨ安定性＞
活性測定法に準じて調べた。結果は図４に示すように、４℃、２４時間保持で、ｐＨ約７乃至９が安定であった。図中、○、●、△及び▲は、緩衝液として、それぞれ、クエン酸塩緩衝液、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液及びグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液を用いて活性測定した結果を示す。
【００４４】
以上の結果から、本発明のＬ−リボースイソメラーゼは、至適ｐＨ、ｐＨ安定性がほぼ一致しており、工業的に利用する上で有利である。
【００４５】
＜実験３−１０：Ｎ末端部分アミノ酸配列＞
実験２−３の方法で得た精製酵素標品の一部を蒸留水に対して透析した後、蛋白質量として約８０マイクログラムをＮ末端部の部分アミノ酸配列分析用の試料とした。アミノ酸配列は、『プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製造、米国）を用い、Ｎ末端から５残基まで分析した。Ｎ末端から得られた配列は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列であった。さらに、同じ試料を、同じ方法に供してより詳細に分析したところ、当該酵素はＮ末端部の部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を含んでいることが判明した。
【００４６】
以下、本発明の実施例を述べる。
【実施例１】
【００４７】
＜アルドースからケトースの製造＞
実験２の方法で調製した精製Ｌ−リボースイソメラーゼを用いて、アルドースからケトースを製造した。アルドースとして、Ｌ−リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロース及びＬ−グロースを用いた。０．０５Ｍアルドース溶液１０ｍｌをｐＨ９に維持しつつ、これに精製Ｌ−リボースイソメラーゼ５０単位を加えて３０℃で１０時間反応させた。この反応液を活性炭処理、脱イオン処理の後、カルシウム型の陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画し、生産物の画分を減圧濃縮することによって純粋な生産物を得た。高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーで分析したところ、原料のアルドースと生産物のケトースとの関係は表３と同じであった。
【実施例２】
【００４８】
＜ケトースからアルドースの製造＞
実験２の方法で調製した精製Ｌ−リボースイソメラーゼを用いて、ケトースからアルドースを製造した。ケトースとして、Ｌ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコース及びＬ−ソルボースを用いた。０．０５Ｍケトース溶液１０ｍｌをｐＨ９に維持しつつ、これに精製Ｌ−リボースイソメラーゼ５０単位を加えて３０℃で１０時間反応させた。この反応液を活性炭処理、脱イオン処理の後、ナトリウム型の陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画し、生産物の画分を減圧濃縮することによって純粋な生産物を得た。高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーで分析したところ、原料のケトースと生産物のアルドースとの関係は表３と同じであった。
【実施例３】
【００４９】
＜Ｌ−リボースの製造＞
実施例２の方法に準じて、０．１Ｍ Ｌ−リブロース２５ｍｌに精製Ｌ−リボースイソメラーゼ１０単位を加え、３０℃で１５時間反応させ、Ｌ−リブロースをＬ−リボースに変換させた。次いで、反応液を常法に従って活性炭で脱色し、Ｈ型、炭酸型イオン交換樹脂で脱塩精製し、更に４０℃に保温した亜硫酸水素型の陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画し、純粋なＬ−リボースの標品を得た。本精製Ｌ−リボースのＬ−リブロースに対する収率は、約６０％であった。本品は、甘味料、品質改良剤、保湿剤、核酸の複製阻害剤などとして、食品、化粧品、医薬品、又はそれらの原料などに有利に使用できる。
【実施例４】
【００５０】
＜Ｄ−タロースの製造＞
実施例２の方法に準じて、０．１Ｍ Ｄ−タガトース５０ｍｌに精製Ｌ−リボースイソメラーゼ１０単位を加え、３０℃で２０時間反応させ、Ｄ−タガトースをＤ−タロースに変換させた。次いで、反応液を常法に従って活性炭で脱色し、Ｈ型、炭酸型のイオン交換樹脂で脱塩し、カルシウム型の陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画し、生産物の画分を濃縮し、Ｄ−タロースの結晶を得た。本Ｄ−タロースのＤ−タガトースに対する収率は、約１０％であった。本品は、甘味料、品質改良剤、保湿剤、核酸の複製阻害剤などとして、食品、化粧品、医薬品、又はそれらの原料などに有利に使用できる。
【実施例５】
【００５１】
＜リビトールからＬ−リボースの製造＞
トリプトソーヤブイヨン２ｗ／ｖ％、グリセロール１ｗ／ｖ％及び脱イオン水からなる培養液１００ｍｌずつを５００ｍｌ容振盪フラスコ１０本にとり、１２０℃２０分間オートクレーブし、冷却した後、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｕｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）（ＩＦＯ３２５４）を１白金耳ずつ植菌し、３０℃で２日間振盪培養した。培養後、遠心分離により集菌し、得られた生菌体約１０ｇをリビトール５ｗ／ｖ％を含有する０．０５Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに加え混合し、この混合液１００ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコに分注し、３０℃で２０時間振盪し、リビトールをＬ−リブロースに変換させた。次いで遠心分離して細菌を除去した。この上清を、常法に従って、活性炭を用いて脱色し、次いで、『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ』（Ｈ型、三菱化成工業株式会社製造の商品名）及び『ダイヤイオンＷＡ３０』（ＯＨ型、三菱化成工業株式会社製造の商品名）を用いて脱塩し、減圧濃縮して濃度約６０％の透明なシラップを得た。さらに、『ダウエックス５０ＷＸ４』（カルシウム型の陽イオン交換樹脂、ダウケミカル社製造の商品名）を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画し、Ｌ−リブロース高含有画分を採取し、濃縮して、濃度約７０％のシラップを得た。『ＭＣＩＧＥＬ ＣＫ−０８ＥＣ』（カルシウム型、８×３００ｍｍ、三菱化学製造）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ、本品はＬ−リブロースを固形物当たり９７％以上含有していることが確認された。Ｌ−リブロースのリビトールに対する収率は、固形物当たり約９０％であった。
【００５２】
このようにして得られたＬ−リブロースを用いて、Ｌ−リボースを製造した。実験１の方法で、培養液を遠心分離して得た湿菌体約５０ｇをトルエン処理し、１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解した２．５％アルギン酸ナトリウム１００ｍｌに混練した。この菌体を含むスラリーを、マグネティックスターラーで攪拌している０．１ＭＣａＣｌ2 溶液中に滴下して、直径約２ｍｍのゲル化物を形成させ、濾過して、活性約５，０００単位の固定化酵素剤を得た。前述の方法で調製したＬ−リブロースシラップを水で希釈して約１．０Ｍ溶液とし、これに本固定化酵素剤をＬ−リブロース１グラム当たり約５０単位加え、ｐＨ８．５、１０℃で１５時間反応させ、Ｌ−リブロースをＬ−リボースに変換させた。次いで、固定化酵素剤を濾過、回収し、濾液を実施例３と同様に脱色、脱塩し、カラムクロマトグラフィーにより分画し、Ｌ−リボース高含有画分を採取し、Ｌ−リブロース高含有画分は除去した。本Ｌ−リボース高含有画分を濃縮し、種晶を加えて攪拌しつつ晶出させ、分蜜して、Ｌ−リボース結晶含有固状物を得た。この実施例５に記載した高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ、本品のＬ−リボース純度は約９８％であることが確認された。本Ｌ−リボース結晶のＬ−リブロースに対する収率は約２０％であった。本品は、甘味料、品質改良剤、保湿剤、核酸の複製阻害剤などとして、食品、化粧品、医薬品、又はそれらの原料などに有利に使用できる。また、回収した固定化酵素剤は、本発明の変換反応に繰り返し利用することができる。さらには、反応液から分画、除去したＬ−リブロース高含有画分は、原料に戻して再利用し、Ｌ−リボース結晶の収率を高めることも有利に実施できる。
【実施例６】
【００５３】
＜リビトールからＬ−リボースの製造＞
トリプトソーヤブイヨン２ｗ／ｖ％、グリセロール１ｗ／ｖ％及び水からなる培養液１００ｍｌずつを５００ｍｌ容振盪フラスコ２本にとり、１２０℃で２０分間オートクレーブし、冷却した後、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）（ＩＦＯ３２８１）を１白金耳ずつ植菌し、３０℃で２日間振盪培養して、種培養を行った。ポリペプトン１．１ｗ／ｖ％、『ハイニュートＳＭＰ』（不二製油株式会社製造の商品名）０．２ｗ／ｖ％、燐酸２水素カリウム１．６８ｗ／ｖ％、グリセリン１ｗ／ｖ％及び水からなる培養液１６．８ｌを３０ｌ容ジャーファメンターに入れ、１２０℃２０分間オートクレーブし、３０℃に冷却した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．２に調整した。この培地に対し種培養液を１ｖ／ｖ％加え、温度３０℃で２２時間通気攪拌培養した後、これに別途１２０℃２０分間オートクレーブしたリビトール水溶液３．２ｌ（リビトールを２ｋｇ含有）を加え、２７時間通気攪拌してリビトールをＬ−リブロースに変換させた。精密膜瀘過して濾液を採取した。この濾液を実施例５に記載の高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｌ−リブロースを固形物当たり９７％以上含有していることが確認された。
【００５４】
このようにして得られたＬ−リブロースを用いて、Ｌ−リボースを製造した。先ず、アシネトバクター・カルコアセティカスＬＲ７Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３３５）を、Ｄ−リキソースを単一炭素源とした培地中で温度３０℃で４日間振盪培養した。培養液の一部を、同じ組成の新鮮な培地に植えつぎ２日間培養する継代培養を５回繰り返した後、Ｄ−リキソースを単一炭素源とした寒天培地表面に接種して更に培養し、単一コロニーを形成させた。コロニーの１つを種菌として、酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、食塩０．５ｗ／ｖ％及び水からなる、１２０℃で２０分間オートクレーブした培地で、３０℃で振盪培養して種培養液を得た。次いで、種培養と同じ組成の培地１５ｌを３０ｌ容ジャーファーメンターに入れ、１２０℃で２０分間オートクレーブし、３０℃に冷却し、これに対し、種培養液を１ｖ／ｖ％加え、温度３０℃で２０時間通気攪拌培養した。培養液を遠心分離して得られる湿菌体約５０グラムをトルエン処理し、湿菌体１グラム当たり１ｍｌの５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）を加え、１２８単位／ｍｌのＬ−リボースイソメラーゼ剤１１０ｍｌを得た。前述の方法で調製したＬ−リブロースを含む瀘液を水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９．０に調整し、さらに塩化マンガンを終濃度で０．５ｍＭとなるように加えた後、これに本Ｌ−リボースイソメラーゼ剤をＬ−リブロース１グラム当たり約５単位加え、３０℃で２４時間反応させ、Ｌ−リブロースの約７０％をＬ−リボースに変換させた。
【００５５】
次いで、限外瀘過膜で瀘過した後、脱塩し、減圧濃縮して濃度約８５％のシラップを１．７７ｋｇ得た。このシラップにエタノールを加えＬ−リボースを結晶化させ、この結晶を分蜜・洗浄した後、真空乾燥し粉砕して、高純度Ｌ−リボースの結晶約６００グラムを得た。実施例５に記載の高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、本品のＬ−リボース純度は約９９．９％であることが確認された。本Ｌ−リボース結晶の原料リビトールからの収率は約３０％であった。本品の粉末Ｘ線回折図形を、Ｘ線回折装置（理学電機株式会社製造、商品名ガイガーフレックスＲＡＤ−ＩＩＢ、ＣｕＫα線使用）を用いる粉末Ｘ線回折法により求めたところ、図５に示すように、その主な回折角（２θ）として、１６．３°、２０．１°、２１．３°、２１．４°及び３３．０°を示すことが判明した。本品は、甘味料、品質改良剤、保湿剤、核酸の複製阻害剤などとして、食品、化粧品、医薬品、又はそれらの原料などに有利に使用できる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
上記から明らかなように、本発明のＬ−リボースイソメラーゼは、Ｌ−リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロース及びＬ−グロースに作用し、それぞれに対応するＬ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコース及びＬ−ソルボースに異性化する。また、この反応は可逆的であり、平衡反応である。従って、それぞれの糖質の異性化変換反応に利用することが可能である。しかも、本発明の酵素は、必ずしも高度に精製して作用させる必要はなく、各種希少糖質の工業生産に有利に利用することができる。本発明によって、従来入手が困難であった希少糖質を容易に提供できることとなり、それが与える影響は、食品、化粧品、医薬品、化学品など多くの工業分野に及び、その工業的意義は極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】アシネトバクター・カルコアセティカス由来のＬ−リボースイソメラーゼの活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】アシネトバクター・カルコアセティカス由来のＬ−リボースイソメラーゼの活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】アシネトバクター・カルコアセティカス由来のＬ−リボースイソメラーゼの温度安定性を示す図である。
【図４】アシネトバクター・カルコアセティカス由来のＬ−リボースイソメラーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図５】本発明により得られる高純度Ｌ−リボースの結晶にＣｕＫα線を用いた粉末Ｘ線回折法を適用して得たＸ線回折図形を示す図である。図中の数字は各ピークのピーク番号を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−リボースイソメラーゼとその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、Ｌ−リボースをＬ−リブロースに異性化し、Ｌ−リブロースをＬ−リボースに異性化するＬ−リボースイソメラーゼとその製造方法、それを産生する微生物、並びに該酵素を用いるケトース及びアルドースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生化学工業が発達し、糖質化学の分野においても、従来、殆ど必要としなかった各種希少糖質の需要が起こりつつあり、これらの糖質の安定な製造方法の確立が望まれている。これらの糖質の製造方法は、有機化学的手法によっても行うことができるが、一般的には、その製造条件が苛酷で、目的糖質の収率が低く、工業的生産方法としては不適である。一方、生化学的手段としては、酵素による糖質変換方法が想定されるものの希少糖質であるＬ−リボース、Ｄ−タロース等に作用するイソメラーゼは現在まで全く報告がなく、その生産方法も確立されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
工業的にＬ−リボースやＤ−タロース等の希少糖質を製造する方法を確立することが強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は上記課題を解決するために、Ｌ−リボースイソメラーゼに着目し、その酵素を産生する微生物を広く検索した。その結果、香川県木田郡三木町の土壌から分離したアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規な微生物ＬＲ７Ｃ株が、Ｌ−リボースイソメラーゼを産生することを見出した。本菌株の生産するＬ−リボースイソメラーゼを基質であるアルドースまたはケトースに作用させることにより各種の希少糖質を容易に製造しうることを見出し、本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によって、従来入手が困難であった希少糖質を容易に提供できることとなり、それが与える影響は、食品、化粧品、医薬品、化学品など多くの工業分野に及び、その工業的意義は極めて大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明のアシネトバクター属に属する微生物ＬＲ７Ｃ株の同定試験結果を示す。
【０００７】
＜アシネトバクター・カルコアセティカスＬＲ７Ｃ株の同定試験結果＞
＜Ａ 細胞形態＞
肉汁寒天培養、２７℃
通常１．０乃至１．５×１．５乃至２．５μｍ桿菌。単独。運動性あり
（回転あるいは振動）。無胞子。鞭毛あり。グラム陰性。
【０００８】
＜Ｂ 培養的性質＞
（１） 肉汁寒天平板培養、２７℃
形状 ： 円形。大きさは２日間培養で０．１乃至１ｍｍ。
周縁 ： 全縁
隆起 ： 半レンズ状
光沢 ： 鈍光
表面 ： 平滑
色調 ： 不透明、淡い黄色
（２） 肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育度 ： 良好
形状 ： 糸状
（３） トリプトソーヤ寒天斜面培養、２７℃
生育度 ： 良好
形状 ： 糸状
（４） 肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化しない。
【０００９】
＜Ｃ 生理学的性質＞
（１） 硝酸塩の還元性 ： 陽性
（２） ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積： 陰性
（３） メチルレッド試験 ： 陰性
（４） ＶＰ試験 ： 陰性
（５） インドールの生成 ： 陰性
（６） 硫化水素の生成 ： 陰性
（７） 澱粉の加水分解 ： 陰性
（８） クエン酸の利用 ： 陽性
（９） 色素の生成 ： なし
（１０） オキシダーゼ ： 陰性
（１１） カタラーゼ ： 陽性
（１２） 生育の温度範囲 ： ２０乃至３７℃
（１３） 酸素に対する態度 ： 好気性
（１４） Ｄ−グルコースからの酸の生成： 陽性
（１５） 溶血性 ： 陰性
（１６） β−キシロシダーゼ ： 陰性
（１７） 炭素源の利用： グルタル酸、マロン酸、フェニル乳酸、アゼライン酸、
Ｄ−リンゴ酸、エタノール、２，３−ブタンジオール、
アコニット酸、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−ア
ラビノース及びＤ−グルコースを利用する。
（１８） 窒素源の利用： Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラ
ギン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−チロシン、β−アラニン、
Ｌ−アルギニン及びＬ−オルニチンを利用する。
ヒスタミンを利用しない。
（１９） ＤＮａｓｅ ： 陽性
（２０） ３−ケトラクトースの生成： 陰性
（２１） ＤＮＡのＧ−Ｃ含量 ： ４２％
【００１０】
以上の菌学的性質をもとにして、『バージーズ・マニュアル・オブ・デターミナティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、第９版（１９９４年）を参考にして、公知の菌株とその異同を検討した。その結果、本菌は、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物であることが判明した。詳細には、４１℃で生育せず、ゼラチン分解と溶血性が陰性、グルコースからの酸生成が陽性及び炭素源と窒素源の利用状況からアシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）と同定した。
【００１１】
これらの結果から、本発明者等は、本微生物を『アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＬＲ７Ｃ』と命名し、平成７年１２月１４日付けで、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託し、受託番号『ＦＥＲＭ ＢＰ−５３３５』として受託された。
【００１２】
本発明では、上記菌株のみならず、アシネトバクター属に属し、Ｌ−リボースイソメラーゼ産生能を有する他の菌株やこれらの変異株なども適宜使用することができる。例えば、紫外線照射やガンマ線照射などの物理処理や、ニトロソグアニジンなどの化学処理、更にはＤ−リキソースを含有する培地で継代培養するなどにより変異株を得て、Ｌ−リボースイソメラーゼを安定して産生させたり、その産生量を高めたりすることも随意である。更に、本発明では、これら微生物に限ることなく、Ｌ−リボースイソメラーゼ産生能を有する微生物であれば広く利用することができる。加えて、Ｌ−リボースイソメラーゼをコードする遺伝子を他の微生物に組換え発現させて、Ｌ−リボースイソメラーゼを産生させることも可能である。更には、必要に応じて、蛋白質工学的手法により、本発明のＬ−リボースイソメラーゼの温度安定性を高めたり、ｐＨ安定性の範囲を広げたりして利用することも有利に実施できる。本発明の微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本発明のＬ−リボースイソメラーゼを産生するものであればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、アルドース、ケトース、糖アルコールなどから選ばれる１種または２種以上が適宜選ばれる。通常、前培養の培地としては、Ｄ−リキソースが有利に用いられる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、及び、例えば、尿素、コーンスティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩が適しており、通常、約１０乃至４０℃、望ましくは、約２０乃至３５℃、約ｐＨ５乃至９、望ましくは、約６乃至８．５から選ばれる条件で好気的に行われる。
【００１３】
このようにして、微生物を培養した後、得られる培養物から本発明の酵素を回収する。本酵素活性は、主に菌体に認められ、菌体を酵素剤として利用してもよい。菌体内酵素は、通常の手段をもちいて菌体から抽出し、粗酵素として用いることができる。粗酵素は、そのまま用いることもできるが、常法に従って、更に精製することもできる。例えば、菌体磨砕抽出液をポリエチレングリコール分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００１４】
本発明のＬ−リボースイソメラーゼの活性は次のようにして測定する。０．５Ｍグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）０．０５ｍｌ、０．０５ＭＬ−リボース０．０５ｍｌ、および酵素液を加えて全容を０．５ｍｌとし、３０℃で酵素反応を行い、生成するＬ−リブロースをシステイン・カルバゾール法により測定する。酵素活性１単位は、１分間に１μｍｏｌのＬ−リブロースを生成するに要する酵素量とする。
【００１５】
本発明のＬ−リボースイソメラーゼは、基質として、Ｌ−リボースのみならず、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロース及びＬ−グロースにも作用する。これらのアルドースは異性化され、それぞれ対応するケトースになる。
【００１６】
本発明のＬ−リボースイソメラーゼは、必ずしも高度に精製して用いる必要はなく、例えば、本Ｌ−リボースイソメラーゼを有する微生物をトルエン処理をしたものをそのまま用いることは、工業的に糖質変換反応する上で好都合である。また、本発明のＬ−リボースイソメラーゼを固定化して利用することも有利に実施できる。例えば、本酵素活性を有する微生物又は部分精製酵素を、包括法、吸着法、共有結合法などの固定化方法により固定化して、バッチ反応で繰り返し利用することも、また、カラムなどに充填して連続的に利用することも随意である。
【００１７】
このようにして得られる反応液は、通常、アルドースとケトースの両者を含有している。反応液は、常法、すなわち、濾過助剤、濾過膜、精密濾過膜などを用いる濾過や、遠心分離などによる不溶物の除去、活性炭を用いた脱色、Ｈ型及び／又はＯＨ型イオン交換樹脂等を用いた脱塩などを組み合わせて精製し、濃縮してシラップ状製品にすることも、乾燥して粉末状などの固状物にすることも随意である。また、必要ならば、更に高度な精製をすることも随意である。例えば、アルカリ金属型及び／又はアルカリ土類金属型の陽イオン交換樹脂や、亜硫酸水素型及び／又はほう酸型の陰イオン交換樹脂や、シリカゲル等を用いるカラムクロマトグラフィーにより目的糖質の高含有画分を採取する方法で高純度の糖質を得ることも容易である。更には、得られる糖質が結晶性の場合には、斯界において慣用の晶析技術を適用して結晶製品に仕上げることも随意である。例えば、上述のようにして得られる反応液又は当該反応液に適宜の精製手段の施された糖液に、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールをはじめとする低級アルキルアルコール類など通常の有機溶媒から選ばれる１種又は２種以上を添加・混合するか、これら糖液に濃縮及び／又は低温処理を施すか、更にはこれらの方法を組み合わせることにより、当該糖質の過飽和溶液とし、結晶化させ、これを分蜜するなどすれば結晶含有固状物が得られる。このようにして得られる各種糖質は、試薬はもとより、甘味料、品質改良剤などとして食品工業に、原材料、中間体などとして医薬品工業、化学工業など多くの用途に利用できる。
【００１８】
とりわけ、Ｌ−リボースの光学異性体であるＤ−リボースは、細胞の増殖と密接に関連しているＲＮＡの必須成分であるので、Ｌ−リボース自体を、又は、これを原料として誘導体としたものを、核酸の複製阻害剤などとして用いることができ、例えば、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗エイズ剤、抗癌剤などの医薬品に利用することも有利に実施できる。以上述べたようにＬ−リボースは、本発明のＬ−リボースイソメラーゼを用いることによりＬ−リブロースから容易に製造できる。Ｌ−リブロースの出所・由来は問わない。例えば、リビトールを原料として、グルコノバクター属やアセトバクター属に属する微生物、具体的には、例えば、グルコノバクター・フラテウリやアセトバクター・アセチなどによる、酸化反応で、Ｌ−リブロースを容易に得ることができる。以下、実験で本発明を詳細に説明する。
【００１９】
＜実験１：アシネトバクター・カルコアセティカスＬＲ７ＣからのＬ−リボースイソメラーゼの製造＞
酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、食塩０．５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地をｐＨ７．０に調整した。この培地２ｌを２．５ｌ容ジャーファーメンターに入れ、オートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌し、冷却して、あらかじめＤ−リキソースを単一炭素源とした培養基に４日間前培養したアシネトバクター・カルコアセティカスＬＲ７Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３３５）を接種し、３０℃で１４時間通気撹拌培養した。培養液を遠心分離して、菌体を培地１ｌ当たり湿質量約１５ｇを採取し、これを、常法に従って、アルミナ粉末とともに磨砕し、０．０５Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて酵素を抽出し遠心分離して上清（粗酵素液）２００ｍｌを得た。本液は、活性量２８７０単位、比活性１．７３単位／ｍｇ蛋白質であった。
【００２０】
＜実験２：Ｌ−リボースイソメラーゼの精製＞
【００２１】
＜実験２−１：ポリエチレングリコール分画＞
実験１で得た粗酵素液を、氷冷し、これに０．０１Ｍ塩化マンガンを添加し、３０分間放置したあと不溶物を遠心分離して除去した。次いで、ポリエチレングリコール粉末を１５ｗ／ｖ％になるように加え、撹拌溶解し、生じた不溶物を遠心分離して除去した。得られた上清にポリエチレングリコールを終末２５ｗ／ｖ％になるように加え、撹拌溶解し、生じた不溶物を遠心分離し、沈殿を採取した。
【００２２】
＜実験２−２：イオン交換クロマトグラフィー＞
実験２−１で得た沈殿物を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、不溶物を遠心分離して除去し、上清１３ｍｌを得た。本上清を弱塩基性陰イオン交換樹脂（東ソー製、商品名『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ』）を充填したカラムにかけて本酵素を吸着させ、次いで、塩化カリウムによる０乃至０．５Ｍの濃度勾配で溶出し、Ｌ−リボースイソメラーゼ画分を採取した。
【００２３】
＜実験２−３：ゲル濾過クロマトグラフィー＞
実験２−２で得た活性画分を濃縮し、これをビーズ状デキストランゲル（ファルマシア社製、商品名『セファデックス Ｇ−１５０』）を充填したカラムにかけ、０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出し、Ｌ−リボースイソメラーゼ活性画分を採取した。上述の各精製工程における蛋白質量、酵素活性量、回収率、精製倍率を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
表１の工程で『セファデックス Ｇ−１５０』を用いるゲル濾過溶出液として得られた精製酵素標品をポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法で純度を検定したところ、単一バンドであることが確認され、電気泳動的に極めて高純度の酵素標品であることが判明した。
【００２６】
＜実験３：Ｌ−リボースイソメラーゼの性質＞
実験２の方法で得た精製Ｌ−リボースイソメラーゼを用いて、その理化学的性質を調べた。
【００２７】
＜実験３−１：作用＞
活性測定法に準じて、Ｌ−リボースに作用させるとＬ−リブロースを生成し、Ｌ−リブロースに作用させるとＬ−リボースが生成する。この反応は可逆的であり平衡反応である。
【００２８】
＜実験３−２：基質特異性＞
活性測定法に準じて、各種アルドースを基質に活性を測定した。Ｌ−リボースを１００とした時の各種アルドースに対する相対活性を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
表２の結果からも明らかなように、Ｌ−リボースに対して最も高い活性を示した。他にＤ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロース及びＬ−グロースにも作用した。この反応は可逆的であり、またそれぞれのアルドースに対応するＬ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコース及びＬ−ソルボースを基質としても同様に作用した。これらの基質から生産されるケトースおよびアルドースをイオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等によって確認した結果を表３にまとめた。
【００３１】
【表３】
【００３２】
表３から明らかなように、本発明のＬ−リボースイソメラーゼは各種アルドースに作用し対応するケトースへ変換する。また同様に、各種ケトースに作用し対応するアルドースへ変換する。これらの反応様式は共通しており、その一例としてＬ−リボースの場合を示すと化１のとおりである。
【００３３】
【化１】
【００３４】
本イソメラーゼ反応は可逆的であり、それぞれアルドース、ケトース間の反応の、活性測定法の条件下における、平衡の量的関係を確認した結果を表４にまとめた。
【００３５】
【表４】
【００３６】
次にＬ−リボースに対するＫｍを求めた結果、４４ｍＭであった。
【００３７】
＜実験３−３：分子量＞
（１） ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と略記する。）で約２５，０００乃至３５，０００ダルトンを示す。
（２） ゲル濾過法で約１１０，０００乃至１３０，０００ダルトンを示す。
ゲル濾過法による分子量結果が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量結果の約４倍になることから、Ｌ−リボースイソメラーゼは、４量体で存在していることが推察される。
【００３８】
＜実験３−４：等電点＞
アガロースプレートを用いる等電点電気泳動法で、ｐＩ約４．０乃至５．５を示す。
【００３９】
＜実験３−５：活性阻害＞
Ｌ−アラビトールやリビトールの共存下で活性がわずかに阻害される。
【００４０】
＜実験３−６：至適温度＞
活性測定法に準じて調べた。結果は、図１に示すように、ｐＨ９．０、１０分間反応で、約３０℃が至適である。
【００４１】
＜実験３−７：至適ｐＨ＞
活性測定法に準じて調べた。結果は、図２に示すように、３０℃、１０分間反応で、ｐＨ約８乃至９が至適である。図中、○、●及び△は、緩衝液として、それぞれ、クエン酸塩緩衝液、ベルナール緩衝液及びグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液を用いて活性測定した結果を示す。
【００４２】
＜実験３−８：温度安定性＞
活性測定法に準じて調べた。結果は、図３に示すように、ｐＨ９．０、１０分間保持で、３０℃付近まで安定である。
【００４３】
＜実験３−９：ｐＨ安定性＞
活性測定法に準じて調べた。結果は図４に示すように、４℃、２４時間保持で、ｐＨ約７乃至９が安定であった。図中、○、●、△及び▲は、緩衝液として、それぞれ、クエン酸塩緩衝液、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液及びグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液を用いて活性測定した結果を示す。
【００４４】
以上の結果から、本発明のＬ−リボースイソメラーゼは、至適ｐＨ、ｐＨ安定性がほぼ一致しており、工業的に利用する上で有利である。
【００４５】
＜実験３−１０：Ｎ末端部分アミノ酸配列＞
実験２−３の方法で得た精製酵素標品の一部を蒸留水に対して透析した後、蛋白質量として約８０マイクログラムをＮ末端部の部分アミノ酸配列分析用の試料とした。アミノ酸配列は、『プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製造、米国）を用い、Ｎ末端から５残基まで分析した。Ｎ末端から得られた配列は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列であった。さらに、同じ試料を、同じ方法に供してより詳細に分析したところ、当該酵素はＮ末端部の部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を含んでいることが判明した。
【００４６】
以下、本発明の実施例を述べる。
【実施例１】
【００４７】
＜アルドースからケトースの製造＞
実験２の方法で調製した精製Ｌ−リボースイソメラーゼを用いて、アルドースからケトースを製造した。アルドースとして、Ｌ−リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロース及びＬ−グロースを用いた。０．０５Ｍアルドース溶液１０ｍｌをｐＨ９に維持しつつ、これに精製Ｌ−リボースイソメラーゼ５０単位を加えて３０℃で１０時間反応させた。この反応液を活性炭処理、脱イオン処理の後、カルシウム型の陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画し、生産物の画分を減圧濃縮することによって純粋な生産物を得た。高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーで分析したところ、原料のアルドースと生産物のケトースとの関係は表３と同じであった。
【実施例２】
【００４８】
＜ケトースからアルドースの製造＞
実験２の方法で調製した精製Ｌ−リボースイソメラーゼを用いて、ケトースからアルドースを製造した。ケトースとして、Ｌ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコース及びＬ−ソルボースを用いた。０．０５Ｍケトース溶液１０ｍｌをｐＨ９に維持しつつ、これに精製Ｌ−リボースイソメラーゼ５０単位を加えて３０℃で１０時間反応させた。この反応液を活性炭処理、脱イオン処理の後、ナトリウム型の陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画し、生産物の画分を減圧濃縮することによって純粋な生産物を得た。高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーで分析したところ、原料のケトースと生産物のアルドースとの関係は表３と同じであった。
【実施例３】
【００４９】
＜Ｌ−リボースの製造＞
実施例２の方法に準じて、０．１Ｍ Ｌ−リブロース２５ｍｌに精製Ｌ−リボースイソメラーゼ１０単位を加え、３０℃で１５時間反応させ、Ｌ−リブロースをＬ−リボースに変換させた。次いで、反応液を常法に従って活性炭で脱色し、Ｈ型、炭酸型イオン交換樹脂で脱塩精製し、更に４０℃に保温した亜硫酸水素型の陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画し、純粋なＬ−リボースの標品を得た。本精製Ｌ−リボースのＬ−リブロースに対する収率は、約６０％であった。本品は、甘味料、品質改良剤、保湿剤、核酸の複製阻害剤などとして、食品、化粧品、医薬品、又はそれらの原料などに有利に使用できる。
【実施例４】
【００５０】
＜Ｄ−タロースの製造＞
実施例２の方法に準じて、０．１Ｍ Ｄ−タガトース５０ｍｌに精製Ｌ−リボースイソメラーゼ１０単位を加え、３０℃で２０時間反応させ、Ｄ−タガトースをＤ−タロースに変換させた。次いで、反応液を常法に従って活性炭で脱色し、Ｈ型、炭酸型のイオン交換樹脂で脱塩し、カルシウム型の陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画し、生産物の画分を濃縮し、Ｄ−タロースの結晶を得た。本Ｄ−タロースのＤ−タガトースに対する収率は、約１０％であった。本品は、甘味料、品質改良剤、保湿剤、核酸の複製阻害剤などとして、食品、化粧品、医薬品、又はそれらの原料などに有利に使用できる。
【実施例５】
【００５１】
＜リビトールからＬ−リボースの製造＞
トリプトソーヤブイヨン２ｗ／ｖ％、グリセロール１ｗ／ｖ％及び脱イオン水からなる培養液１００ｍｌずつを５００ｍｌ容振盪フラスコ１０本にとり、１２０℃２０分間オートクレーブし、冷却した後、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｕｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）（ＩＦＯ３２５４）を１白金耳ずつ植菌し、３０℃で２日間振盪培養した。培養後、遠心分離により集菌し、得られた生菌体約１０ｇをリビトール５ｗ／ｖ％を含有する０．０５Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに加え混合し、この混合液１００ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコに分注し、３０℃で２０時間振盪し、リビトールをＬ−リブロースに変換させた。次いで遠心分離して細菌を除去した。この上清を、常法に従って、活性炭を用いて脱色し、次いで、『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ』（Ｈ型、三菱化成工業株式会社製造の商品名）及び『ダイヤイオンＷＡ３０』（ＯＨ型、三菱化成工業株式会社製造の商品名）を用いて脱塩し、減圧濃縮して濃度約６０％の透明なシラップを得た。さらに、『ダウエックス５０ＷＸ４』（カルシウム型の陽イオン交換樹脂、ダウケミカル社製造の商品名）を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画し、Ｌ−リブロース高含有画分を採取し、濃縮して、濃度約７０％のシラップを得た。『ＭＣＩＧＥＬ ＣＫ−０８ＥＣ』（カルシウム型、８×３００ｍｍ、三菱化学製造）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ、本品はＬ−リブロースを固形物当たり９７％以上含有していることが確認された。Ｌ−リブロースのリビトールに対する収率は、固形物当たり約９０％であった。
【００５２】
このようにして得られたＬ−リブロースを用いて、Ｌ−リボースを製造した。実験１の方法で、培養液を遠心分離して得た湿菌体約５０ｇをトルエン処理し、１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解した２．５％アルギン酸ナトリウム１００ｍｌに混練した。この菌体を含むスラリーを、マグネティックスターラーで攪拌している０．１ＭＣａＣｌ2 溶液中に滴下して、直径約２ｍｍのゲル化物を形成させ、濾過して、活性約５，０００単位の固定化酵素剤を得た。前述の方法で調製したＬ−リブロースシラップを水で希釈して約１．０Ｍ溶液とし、これに本固定化酵素剤をＬ−リブロース１グラム当たり約５０単位加え、ｐＨ８．５、１０℃で１５時間反応させ、Ｌ−リブロースをＬ−リボースに変換させた。次いで、固定化酵素剤を濾過、回収し、濾液を実施例３と同様に脱色、脱塩し、カラムクロマトグラフィーにより分画し、Ｌ−リボース高含有画分を採取し、Ｌ−リブロース高含有画分は除去した。本Ｌ−リボース高含有画分を濃縮し、種晶を加えて攪拌しつつ晶出させ、分蜜して、Ｌ−リボース結晶含有固状物を得た。この実施例５に記載した高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ、本品のＬ−リボース純度は約９８％であることが確認された。本Ｌ−リボース結晶のＬ−リブロースに対する収率は約２０％であった。本品は、甘味料、品質改良剤、保湿剤、核酸の複製阻害剤などとして、食品、化粧品、医薬品、又はそれらの原料などに有利に使用できる。また、回収した固定化酵素剤は、本発明の変換反応に繰り返し利用することができる。さらには、反応液から分画、除去したＬ−リブロース高含有画分は、原料に戻して再利用し、Ｌ−リボース結晶の収率を高めることも有利に実施できる。
【実施例６】
【００５３】
＜リビトールからＬ−リボースの製造＞
トリプトソーヤブイヨン２ｗ／ｖ％、グリセロール１ｗ／ｖ％及び水からなる培養液１００ｍｌずつを５００ｍｌ容振盪フラスコ２本にとり、１２０℃で２０分間オートクレーブし、冷却した後、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）（ＩＦＯ３２８１）を１白金耳ずつ植菌し、３０℃で２日間振盪培養して、種培養を行った。ポリペプトン１．１ｗ／ｖ％、『ハイニュートＳＭＰ』（不二製油株式会社製造の商品名）０．２ｗ／ｖ％、燐酸２水素カリウム１．６８ｗ／ｖ％、グリセリン１ｗ／ｖ％及び水からなる培養液１６．８ｌを３０ｌ容ジャーファメンターに入れ、１２０℃２０分間オートクレーブし、３０℃に冷却した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．２に調整した。この培地に対し種培養液を１ｖ／ｖ％加え、温度３０℃で２２時間通気攪拌培養した後、これに別途１２０℃２０分間オートクレーブしたリビトール水溶液３．２ｌ（リビトールを２ｋｇ含有）を加え、２７時間通気攪拌してリビトールをＬ−リブロースに変換させた。精密膜瀘過して濾液を採取した。この濾液を実施例５に記載の高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｌ−リブロースを固形物当たり９７％以上含有していることが確認された。
【００５４】
このようにして得られたＬ−リブロースを用いて、Ｌ−リボースを製造した。先ず、アシネトバクター・カルコアセティカスＬＲ７Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３３５）を、Ｄ−リキソースを単一炭素源とした培地中で温度３０℃で４日間振盪培養した。培養液の一部を、同じ組成の新鮮な培地に植えつぎ２日間培養する継代培養を５回繰り返した後、Ｄ−リキソースを単一炭素源とした寒天培地表面に接種して更に培養し、単一コロニーを形成させた。コロニーの１つを種菌として、酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、食塩０．５ｗ／ｖ％及び水からなる、１２０℃で２０分間オートクレーブした培地で、３０℃で振盪培養して種培養液を得た。次いで、種培養と同じ組成の培地１５ｌを３０ｌ容ジャーファーメンターに入れ、１２０℃で２０分間オートクレーブし、３０℃に冷却し、これに対し、種培養液を１ｖ／ｖ％加え、温度３０℃で２０時間通気攪拌培養した。培養液を遠心分離して得られる湿菌体約５０グラムをトルエン処理し、湿菌体１グラム当たり１ｍｌの５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）を加え、１２８単位／ｍｌのＬ−リボースイソメラーゼ剤１１０ｍｌを得た。前述の方法で調製したＬ−リブロースを含む瀘液を水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９．０に調整し、さらに塩化マンガンを終濃度で０．５ｍＭとなるように加えた後、これに本Ｌ−リボースイソメラーゼ剤をＬ−リブロース１グラム当たり約５単位加え、３０℃で２４時間反応させ、Ｌ−リブロースの約７０％をＬ−リボースに変換させた。
【００５５】
次いで、限外瀘過膜で瀘過した後、脱塩し、減圧濃縮して濃度約８５％のシラップを１．７７ｋｇ得た。このシラップにエタノールを加えＬ−リボースを結晶化させ、この結晶を分蜜・洗浄した後、真空乾燥し粉砕して、高純度Ｌ−リボースの結晶約６００グラムを得た。実施例５に記載の高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、本品のＬ−リボース純度は約９９．９％であることが確認された。本Ｌ−リボース結晶の原料リビトールからの収率は約３０％であった。本品の粉末Ｘ線回折図形を、Ｘ線回折装置（理学電機株式会社製造、商品名ガイガーフレックスＲＡＤ−ＩＩＢ、ＣｕＫα線使用）を用いる粉末Ｘ線回折法により求めたところ、図５に示すように、その主な回折角（２θ）として、１６．３°、２０．１°、２１．３°、２１．４°及び３３．０°を示すことが判明した。本品は、甘味料、品質改良剤、保湿剤、核酸の複製阻害剤などとして、食品、化粧品、医薬品、又はそれらの原料などに有利に使用できる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
上記から明らかなように、本発明のＬ−リボースイソメラーゼは、Ｌ−リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロース及びＬ−グロースに作用し、それぞれに対応するＬ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコース及びＬ−ソルボースに異性化する。また、この反応は可逆的であり、平衡反応である。従って、それぞれの糖質の異性化変換反応に利用することが可能である。しかも、本発明の酵素は、必ずしも高度に精製して作用させる必要はなく、各種希少糖質の工業生産に有利に利用することができる。本発明によって、従来入手が困難であった希少糖質を容易に提供できることとなり、それが与える影響は、食品、化粧品、医薬品、化学品など多くの工業分野に及び、その工業的意義は極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】アシネトバクター・カルコアセティカス由来のＬ−リボースイソメラーゼの活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】アシネトバクター・カルコアセティカス由来のＬ−リボースイソメラーゼの活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】アシネトバクター・カルコアセティカス由来のＬ−リボースイソメラーゼの温度安定性を示す図である。
【図４】アシネトバクター・カルコアセティカス由来のＬ−リボースイソメラーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図５】本発明により得られる高純度Ｌ−リボースの結晶にＣｕＫα線を用いた粉末Ｘ線回折法を適用して得たＸ線回折図形を示す図である。図中の数字は各ピークのピーク番号を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−リブロースに、Ｌ−リボースを異性化してＬ−リブロースを生成し、また、逆に、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生成する作用を有するＬ−リボースイソメラーゼを作用させる工程と、生成したＬ−リボースを採取する工程とを含んでなるＬ−リボースの製造方法。
【請求項２】
Ｌ−リブロースが、リビトールをグルコバクター属又はアセトバクター属に属する微生物によって酸化反応させて得られたものである請求項１記載のＬ−リボースの製造方法。
【請求項３】
Ｌ−リボースが、粉末Ｘ線回折法（ＣｕＫα線使用）における主な回折角（２θ）として、１６．３゜、２０．１゜、２１．３゜、２１．４゜、及び３３．０゜を示す結晶である請求項１又は２記載のＬ−リボースの製造方法。
【請求項１】
Ｌ−リブロースに、Ｌ−リボースを異性化してＬ−リブロースを生成し、また、逆に、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生成する作用を有するＬ−リボースイソメラーゼを作用させる工程と、生成したＬ−リボースを採取する工程とを含んでなるＬ−リボースの製造方法。
【請求項２】
Ｌ−リブロースが、リビトールをグルコバクター属又はアセトバクター属に属する微生物によって酸化反応させて得られたものである請求項１記載のＬ−リボースの製造方法。
【請求項３】
Ｌ−リボースが、粉末Ｘ線回折法（ＣｕＫα線使用）における主な回折角（２θ）として、１６．３゜、２０．１゜、２１．３゜、２１．４゜、及び３３．０゜を示す結晶である請求項１又は２記載のＬ−リボースの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−２２２１８６（Ｐ２００７−２２２１８６Ａ）
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１５７１４１（Ｐ２００７−１５７１４１）
【出願日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【分割の表示】特願平９−９１３１６の分割
【原出願日】平成９年３月２７日（１９９７．３．２７）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【分割の表示】特願平９−９１３１６の分割
【原出願日】平成９年３月２７日（１９９７．３．２７）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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