ＭＮＴＦペプチドおよび組成物ならびに使用の方法
【課題】神経細胞における生存性および増殖を調節し得る新規のペプチドおよび組成物、ならびに新規のペプチドおよび組成物を用いて神経細胞の生存性および増殖を調節する方法の提供。
【解決手段】「ＷＭＬＳＡＦＳ」か「ＦＳＲＹＡＲドメイン」かのどちらかを含み、神経障害性機能もしくは神経向性機能のために十分である運動神経栄養因子１の新規ペプチドアナログであって、運動神経栄養因子の作用に対して一般的な有意性を有し、ＭＮＴＦ１分子の二つの短い部分的に重複する配列にマッピングされている新規タンパク質ドメイン。
【解決手段】「ＷＭＬＳＡＦＳ」か「ＦＳＲＹＡＲドメイン」かのどちらかを含み、神経障害性機能もしくは神経向性機能のために十分である運動神経栄養因子１の新規ペプチドアナログであって、運動神経栄養因子の作用に対して一般的な有意性を有し、ＭＮＴＦ１分子の二つの短い部分的に重複する配列にマッピングされている新規タンパク質ドメイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、出典明示により全体が本明細書に取り込まれる２００３年１月２１日に出願された米国仮出願番号６０／４４１，７７２の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
神経栄養因子（ＮＴＦ）は、神経の選択された集団の生存、増殖、維持および機能的な能力を促進するために機能する、タンパク質の特定の群である。最近の研究は、ニューロン死が、増殖および発達の特定の期間の間、脊椎動物の神経系において生じることを証明している。しかし、関連する標的組織由来の可溶性神経栄養因子の添加は、このニューロン死の現象を減ずるために役に立つ。以下の引用は、神経栄養因子について開示し、それらの開示は、出典明示により本明細書に取り込まれる：Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．ら、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ、６ Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ １２９（１９９０）；Ｋｕｎｏ，Ｍ．、Ｔａｒｇｅｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ：Ｔｈｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ、９ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１５５（１９９０）；Ｂａｎｄ，Ｙ．Ａ．、Ｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ、２ Ｎｅｕｒｏｎ １５２５（１９８９）；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｒ．Ｗ．、Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ Ｄｅａｔｈ、１２ ＴＩＮＳ ２５２（１９８９）：Ｂａｒｄ，Ｙ．Ａ．、Ｗｈａｔ，Ｉｆ Ａｎｙｔｈｉｎｇ，ｉｓ ａ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ？、１１ ＴＩＮＳ ３４３（１９８８）；ならびにＴｈｏｅｎｅｎ，Ｈ．、およびＥｄｇａｒ，Ｄ．、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ、２２９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８（１９８５）。
【０００３】
脊椎動物の神経筋系において、胚の運動ニューロンの生存は、関連する発達している骨格筋由来の特定の栄養物質に依存することが見出されている。骨格筋は、インビボでの研究とインビトロでの研究の両方で、変性および続いて生じる自然な細胞死から胚の運動ニューロンを防御することにより、運動ニューロンの生存および発達を促進し得る物質を生成することが示されている。Ｏ’Ｂｒｉａｎ、Ｒ．Ｊ．およびＦｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｇ．Ｄ．、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｃｈｉｃｋ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、６ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２６５（１９８６）；Ｈｏｌｌｙｄａｙ，Ｍ．およびＨａｍｂｕｒｇａｒ，Ｖ．、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｌｏｓｓ ｂｙ Ｅｎｇｌａｒｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ、１７０ Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３１１（１９７６）（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。同様に、何人かの研究者は、ニワトリおよびラットの骨格筋が、インビボとインビトロの両方で、胚の運動ニューロンの自然な細胞死を防御し得る特定の栄養因子を有することを報告している。ＭｃＭａｎａｍａｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｗｈｉｃｈ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｃｈｏｌｉｎｅ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ、２６３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５８９０（１９８８）；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｒ．Ｗ．ら、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ Ｄｅａｔｈ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｂｙ ａ Ｔａｒｇｅｔ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ、２４０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９１９（１９８８）；およびＳｍｉｔｈ，Ｒ．Ｇ．ら、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ、６ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４３９（１９８６）（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０００４】
さらに、インビボにおける胚のニワトリの運動ニューロンの生存、ならびにこれらの運動ニューロンにおけるコリンアセチルトランスフェラーゼの活性を選択的に高めることが見出されているラットの骨格筋から、ポリペプチドが単離されている。このポリペプチドは、コリンアセチルトランスフェラーゼ因子（Ｃｈｏｌｉｎｅ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ）（ＣＤＦ）と呼ばれ、そしてその生物学的機能は、神経増殖因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（ＮＧＦ）、毛様体神経節神経栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙ Ｇａｎｇｌｉｏｎ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）（ＢＤＮＦ）、および網膜神経節神経栄養因子（Ｒｅｔｉｎａｌ Ｇａｎｇｌｉｏｎ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）（ＲＧＮＴＦ）のような他の栄養因子とは異なることが証明されている。Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ」、５ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４１（１９８２）；Ｖａｒｏｎ，Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．４７：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｗａｘｍａｎ，Ｓ．Ｇ．（編）、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、４９３頁−５２１頁（１９８８）；Ｂａｒｄｅ，Ｙ．Ａ．、Ｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ、２ Ｎｅｕｒｏｎ １５２５（１９８９）；Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．ら、Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ３０ｋＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｔｅｃｔａｌ Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｒａｔ ｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ、３４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ、Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ、９０８（１９９１）を参照のこと（これらの開示は、参考により本明細書中で援用される）。
【０００５】
３５ｋＤおよび２２ｋＤの見かけの分子量を有する、ラット筋組織由来の二つの運動神経栄養因子の単離および特徴付けは、Ｃｈａｕらにより報告されている。Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．ら、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｈｏｒｎ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ ｏｆ Ｒａｔ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ．Ｉｎ：Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．５、Ｐｅｅｔｅｒｓ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ、８９頁−９４頁（１９９２）（これらの開示は、出典明示により本明細書に取り込まれる）を参照のこと。３５ｋＤタンパク質は、Ｄｒ．Ｃｈａｕにより運動神経栄養因子１（ＭＮＴＦ１）として規定されており、そして見かけの２２ｋＤタンパク質は、運動神経栄養因子２（ＭＮＴＦ２）として規定されている。これらの二つの栄養因子は、インビトロで、ラット腰部脊髄の単離された前角運動ニューロンと脊髄の移植片の両方の増殖および／もしくは再生を支持することが証明されている。
【０００６】
その後、１９９３年に、Ｃｈａｕらは、免疫プローブとしてＭＮＴＦ１に対するモノクローナル抗体を用いて、ヒト網膜芽腫ｃＤＮＡライブラリー由来のλｇｔ１１クローンの免疫学的スクリーニングを報告した。免疫陽性クローン由来の抽出物の免疫ブロット法は、５５ｋＤの見かけの分子量を有するＭＮＴＦ１タンパク質を染色した。Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．ら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ Ｍｕｓｃｌｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ１（ＭＮＴＦ１） ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｂｅｓ、（要約）１９ Ｓｏｃ．ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．ｐａｒｔ１、２５２（１９９３）（これらの開示は、本明細書により参考として援用される）を参照のこと。クローン化されたヒトＭＮＴＦ１を含む抽出物は、それが、ラット前角運動ニューロンのインビトロでの増殖を支える点で、「天然の」ＭＮＴＦ１タンパク質の生物学的活性と同様の生物学的活性を有することが示されている。
【０００７】
より最近になって、米国特許第６，３０９，８７７号は、運動ニューロンに栄養効果を与える能力を有する神経栄養因子のファミリーを開示した。この運動神経栄養因子は、単離され、これらの因子をコードする核酸配列は、クローン化され、そして発現され、そして核酸配列とポリペプチド配列の両方が提供された。詳細には、それぞれ、１４４３塩基対および９７２塩基対の挿入物によりコードされる組換えタンパク質、ＭＮＴＦ１−Ｆ３およびＭＮＴＦ１−Ｆ６は、融合タンパク質か精製されたフラグメントかのどちらかとして発現された。単離された因子および発現された組換え因子は、運動ニューロンの持続した生存能力および神経突起伸長を誘導可能であった。そのため、これらの因子は、「運動神経栄養因子」もしくは「ＭＮＴＦ」として分類されている。
【０００８】
米国特許第６，３０９，８７７号に報告されているＭＮＴＦ１−Ｆ６クローンは、ＭＮＴＦ１の３３アミノ酸フラグメントをコードしている。この配列を含む組換えタンパク質は、ＭＮＴＦ１に対するモノクローナル抗体と反応し、運動ニューロンの生存能力を維持し、神経突起伸長を上昇させ、細胞死／アポトーシスを減少させ、運動ニューロンの伸びた成長円錐含有軸索を有する巨大な活性ニューロンの伸長と「延展」を支持した。このＭＮＴＦ１フラグメントの生物学的活性をそれでも維持している「最小の」活性部位を含むペプチドが合成され得るかどうかを決定するために、その後の研究が行われた。
【発明の概要】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、神経細胞の生存能力および増殖を調節するために有用なＭＮＴＦ分子の部分を含む新規のペプチドおよび組成物に関し、それにより容易に合成され得る神経栄養ペプチドを提供する。
【００１０】
詳細には、本発明は、運動神経栄養因子の作用に対して一般的な有意性を有する新規タンパク質ドメインに関し、このタンパク質ドメインは、同定され、そしてＭＮＴＦ１分子の二つの短い重複する部分配列にマッピングされている。これらの今までに認識されていないタンパク質ドメインは、本明細書中で「ＷＭＬＳＡＦＳ」ドメインおよび「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインと呼ばれるが、神経細胞の生存能力および増殖を調節するために十分である。さらに、これらのドメインを含む短縮型のＭＮＴＦ１種は、それら自体、細胞増殖アッセイにおける運動ニューロン／神経芽腫細胞のハイブリッドの増殖を刺激するために十分である。
【００１１】
従って、１の態様において、本発明は、ＷＭＬＳＡＦＳドメインもしくはＦＳＲＹＡＲドメインを含む、精製および単離されたＭＮＴＦペプチドアナログ、ならびにその構造および／もしくは機能を模倣する分子に関し、これらは、神経細胞の生存能力および増殖を誘導もしくは調節するために有用である。このようなＭＮＴＦペプチドアナログの特定の実施形態は、本明細書中で配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７として開示される。
【００１２】
本発明はまた、インビトロで細胞培養物に、またはインビボで神経傷害もしくは神経変性障害に罹患している個体にＭＮＴＦペプチドアナログを投与することによる、神経細胞の生存能力および／もしくは増殖を調節するための組成物ならびに方法にも関し、これらは、細胞増殖を促進するか、もしくは不適切な細胞死を安定化させるため、および／またはインビボもしくはインビトロのいずれの場合において、正常細胞の挙動を回復させるためのものである。本発明はまた、非神経細胞に対するその抗増殖効果のためのＭＮＴＦペプチドアナログの使用、特に、創傷治癒における抗線維症剤もしくは抗炎症剤としてのその使用にも関する。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明および添付の図面においてより良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、種々のＭＮＴＦ１ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、種々の用量のＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーおよびそのペプチド誘導体による、ＶＳＣ４．１細胞の増殖のパーセント上昇を示す。
【図３】図３もまた、種々の用量の高度に精製された（ＧＬＰｇ）ＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーおよびそのペプチド誘導体による、ＶＳＣ４．１細胞の増殖のパーセント上昇を示す。
【図４】図４は、種々の用量のＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーおよびさらなるペプチド誘導体による、ＶＳＣ４．１細胞の増殖のパーセント上昇を示す。
【図５】図５は、種々の用量のＭＮＴＦ ６マーで処置された運動ニューロンによる、標的の筋肉細胞の選択的再神経支配を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（詳細な説明）
本明細書中で使用される技術的および科学的な用語は、特に定義されなければ、本発明の属する分野の当業者により一般的に理解される意味を示すものとする。当業者に公知の種々の方法について本明細書中で参照される。参照されるこのような公知の方法について述べる刊行物および他の資料は、完全に記載されるとおり、出典明示により本明細書に取り込まれる。組換えＤＮＡ技術の一般的な原理について述べている一般的な参考文献としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．、編、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）；Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２）；Ａｕｓｔｅｎ，Ｂ．Ｍ．およびＷｅｓｔｗｏｏｄ，Ｏ．Ｍ．Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）が挙げられる。当業者に知られる適切な物質および／または方法のいずれもが本発明の実施において利用することができるが、好ましい物質および／または方法は本明細書中に記載される。
【００１６】
（概論）
ラット筋肉組織由来の２つの運動神経栄養因子（ＭＮＴＦ１およびＭＮＴＦ２）の単離および特徴付け、ならびにその後のヒト網膜芽腫ｃＤＮＡライブラリー由来の組換えＭＮＴＦ１−Ｆ６のクローニングは、米国特許第６，３０９，８７７号（ならびに１９９７年９月１２日出願された同時係属中の米国特許出願第０９／９８９，４８１号、同第０８／９２８，８６２号、１９９６年１１月１５日に出願された同第０８／７５１，２２５号および１９９６年９月２７日に出願された米国仮特許出願６０／０２６，７９２；これらの全ては、出典明示により本明細書により全て援用される）に記載されている。ＭＮＴＦ１−Ｆ６遺伝子配列は、本明細書中で配列番号１と呼ばれる３３個のアミノ酸配列をコードする。
【００１７】
天然に存在するＭＮＴＦ１ポリペプチドおよび組換えＭＮＴＦ１ポリペプチドは、ラット腰部脊髄の移植片から単離された前角運動ニューロンのインビトロでの生存を選択的に高めることが示された。処置された培養物の顕微鏡写真は、ミエリン化された神経線維の神経突起伸長ならびに非神経細胞（例えば、グリア細胞および線維芽細胞）の増殖の顕著な減少を示した。同様に、外科的に軸索切断されたラット末梢神経へのＭＮＴＦ１のインビボ投与により、未処置コントロールよりも顕著に高い割合で生存している運動ニューロンが生じ、これは、抗ＭＮＴＦ１モノクローナル抗体の同時投与により阻害されうる。
【００１８】
ＭＮＴＦ１のさらなる有益な効果は、脊髄半切開に供され、末梢神経自己移植片により修復され、脊髄との神経移植片結合部に近接してＭＮＴＦ１含有ゲル切片を移植されたラットにおいて証明された。ＭＮＴＦ１処置された動物は、より多数の生存している運動ニューロン、運動機能および感覚機能の回復の改善、炎症反応の減少（より少ない浸潤しているマクロファージおよびリンパ球）、移植片部位でのコラーゲン含有瘢痕組織の形成の減少、正常なシュワン細胞形態ならびに正常なミエリン化および非ミエリン化神経線維の形成を示した。
【００１９】
神経変性疾患の処置におけるＭＮＴＦの効力はまた、ｗｏｂｂｌｅｒマウス（よろめきマウス）動物モデルにおいても証明されている。ｗｏｂｂｌｅｒマウスは、骨髄および脳幹の運動ニューロンの進行性変性を引き起こす常染色体二重劣性遺伝子の変異を保有している。産後約３週間のｗｏｂｂｌｅｒマウスは、頚運動ニューロンの同時に生じる変性を伴う「よろめく」総合症状を発症し始め（第１段階）、これは、前肢の筋肉のるいそうならびに指および爪を伸ばすことができないことの両方を引き起こした。３ヶ月齢までに、病理学的な総合症状は、前肢における全ての関連する関節（例えば、手首、肘および肩の関節）が「一緒にかたまってしまうこと」ならびに体重の大きな減少および慢性疲労をともなって第４段階に進行する。しかし、ほとんどのｗｏｂｂｌｅｒマウスは、３ヶ月齢に達する前に死亡する。僧帽筋と菱形筋と脊髄のＣ７−Ｔ３領域の間へのＭＮＴＦ１含有ゲル切片の移植は、ｗｏｂｂｌｅｒマウスの症状の進行を遅延させ、コントロール群に比べて、寿命、健康、呼吸、体重、前肢の強さの全般的な改善ならびにそれらの頚運動ニューロンの空胞形成および染色質溶解の減少をもたらした。
【００２０】
ＭＮＴＦ１の公知の生物学的活性のために十分であるようである、ＭＮＴＦ１−Ｆ６分子のこれまでに認識されていなかった部分的に重複する２つのドメインが、現在では同定されている。これらのドメインの各々は、本明細書中で「ＷＭＬＳＡＦＳ」ドメインおよび「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインと呼ばれ、ＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーと同様の様式で運動ニューロン由来の細胞株の増殖を刺激するのに十分である。同様に、「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインは、ＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーと同様の様式で、インビボにおいて、運動ニューロンにより筋肉を標的とする選択的な再神経支配を指示するのに十分である。さらに、「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインは、「ＦＳＲＹＡＲ」配列を含む任意のＭＮＴＦペプチド（ＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーを含む）を認識する抗体を生じるのに十分な抗原エピトープを提供する。
【００２１】
当該分野および本発明に精通している当業者は、ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインを含む配列が、インビトロおよびインビボにおいて、非神経細胞に対する、神経細胞の生存能力および形態の選択的な調節における使用のためにＭＮＴＦペプチドアナログを提供することを理解する。さらに、ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインに結合可能な化合物および組成物は、標的の細胞および組織におけるＭＮＴＦ１活性の検出および／もしくは調節における使用のための薬剤を提供する。
【００２２】
（ペプチド）
本明細書中で使用される場合、用語「ＷＭＬＳＡＦＳドメイン」もしくは「ＦＳＲＹＡＲドメイン」とは、神経細胞の選択的維持および軸索再生に十分であることが、本明細書中で証明されているポリペプチドドメインならびにそれらの構造および／もしくは機能を模倣可能なペプチドならびに／または分子をいう。本発明の好ましい実施形態は、アミノ酸配列：ＦＳＲＹＡＲ［配列番号２］もしくはＷＭＬＳＡＦＳ［配列番号３］を有するペプチド、およびその機能的な等価物を含む。
【００２３】
「機能的な等価物」は、ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインの生物学的活性と実質的に同様の生物学的活性を有するペプチドを意味し、このような活性もしくは特徴を有する「フラグメント」、「改変体」、「アナログ」、「ホモログ」、もしくは「化学誘導体」を含むものとされる。したがって、ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインの機能的な等価物は、同一のアミノ酸配列を共有しなくてもよく、従来のアミノ酸もしくは非従来のアミノ酸の保存性または非保存性のアミノ酸置換であり得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「生物学的に活性なペプチド」および「生物学的に活性なフラグメント」とは、上に記載の運動神経栄養因子（ＭＮＴＦ）に従うペプチドもしくはポリペプチドをいい、ここで、ＭＮＴＦは、運動ニューロンに対する保護効果および／もしくは運動ニューロン由来の細胞株に対する増殖効果を示す。
【００２５】
本発明のＭＮＴＦペプチドアナログを含むタンパク質もしくはペプチドにおけるアミノ酸残基の配列は、それらの一般的に用いられる三文字表記の使用によるか、もしくは一文字表記によるかのいずれかにより本明細書にて示されている。これらの三文字表記および一文字表記の列挙は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９７５）のごとき教科書中に見出すことができる。アミノ酸配列が水平に列挙されている場合、アミノ末端は左端にあるものとされ、一方、カルボキシ末端は右端にあるものとされる。
【００２６】
本明細書における「保存性の」アミノ酸置換との言及は、同様の側鎖を有するアミノ酸残基の相互置換可能性を意味するものとされる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群を構成し；セリンおよびスレオニンは、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸であり；アスパラギンおよびグルタミンは、アミド含有側鎖を有するアミノ酸であり；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンは、芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；リジン、アルギニンおよびヒスチジンは、塩基性側鎖を有するアミノ酸であり；ならびにシステインおよびメチオニンは、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸である。所定の群からの１つのアミノ酸と同じ群からの別のアミノ酸との相互置換は、保存性の置換と見なされる。好ましい保存性の置換群としては、アスパラギン−グルタミン、アラニン−バリン、リジン−アルギニン、フェニルアラニン−チロシンおよびバリン−ロイシン−イソロイシンが挙げられる。
【００２７】
種々のＭＮＴＦペプチドアナログを含むペプチドの正確な化学構造が多くの因子に依存して変化することは、当業者によって理解される。例えば、所定のポリペプチドは、酸性もしくは塩基性の塩または中性の形態として得られ得、これは、イオン化可能なカルボキシル基およびアミノ基がこの分子にて見出されるからである。そこで、本発明の目的のために、ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインを含むペプチドの任意の形態は、ＭＮＴＦ１ ３３マーペプチドの生物学的な活性を維持し、本発明の範囲内であることが意図される。
【００２８】
（ＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マー）
米国特許６，３０９，８７７号において、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチド（当該文献中においては配列番号４と呼ばれる）が提供される：
【００２９】
【表１】
この配列を含む組換えタンパク質は、ＭＮＴＦ−１に対するモノクローナル抗体と反応し、運動ニューロンの生存能力を維持し、神経突起の伸長を上昇させ、運動ニューロン細胞死／アポトーシスを減少させ、成長円錐含有軸索の伸長が伴った運動ニューロンの巨大な活性神経への伸長および「延展」を支持した。ＭＮＴＦ１ ３３マーは、本明細書中では配列番号１と呼ばれ、固相合成により合成され、以下の実施例に記載されるように、細胞増殖アッセイにおける陽性コントロールとして役割を果たした。この直鎖状の３３マーは、運動ニューロン／神経芽腫細胞の増殖の増加に効果的であり、他方でこのペプチドの環化型は効果がより小さいことが見出された。
【００３０】
本発明は、運動ニューロンの生存および維持を促進するＭＮＴＦ１の能力を維持するＭＮＴＦ１のペプチドアナログを含む。本発明に関するＭＮＴＦペプチドアナログは、典型的に、６個〜３２個のアミノ酸の長さであり、配列番号１の１２〜１８アミノ酸残基に対応するＷＭＬＳＡＦＳドメイン（配列番号３）、または配列番号１の１７〜２２アミノ酸残基に対応するＦＳＲＹＡＲドメイン（配列番号２）と呼ばれる２つのアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。ＭＮＴＦペプチドアナログの好ましい実施形態は、配列番号１の連続する６〜３２アミノ酸残基のフラグメントを含む。
【００３１】
別の実施形態において、運動神経栄養因子ペプチドアナログのアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴ分析により調べられたところ、配列番号１の連続する９〜３２アミノ酸残基と少なくとも７０％同一であり、配列番号１の連続する８〜３２アミノ酸残基と少なくとも８０％同一であり、最も好ましくは、配列番号１の連続する７〜３２アミノ酸残基と少なくとも９０％同一である。
【００３２】
対応する配列番号１のフラグメントとポリペプチド配列を比較するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＷＷＷ上、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて）から公的に入手可能なＢＬＡＳＴプログラムを用いて、配列の包括的アラインメントが実施され得る。包括的アラインメントを実施する前に、配列番号１はＧｅｎＢａｎｋに提出され得る。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより提供される初期設定パラメータは包括的アラインメントに使用され得る。
【００３３】
（６マー）
特に好ましい実施形態において、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが提供され：
【００３４】
【表２】
この配列は、配列番号１のアミノ酸残基１７〜２２に対応し、運動ニューロン／神経芽腫細胞の細胞増殖を上昇させるために十分であることが見出された。ＭＮＴＦ−１分子のこの部分は、本明細書中において、以下、「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインと記載される。
【００３５】
（７マー）
他の好ましい実施形態において、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが提供され：
【００３６】
【表３】
この配列は、配列番号１のアミノ酸残基１２〜１８に対応する。ＭＮＴＦ１のこの７アミノ酸フラグメントは、ＦＳＲＹＡＲドメインのＦＳ残基と重複する。このペプチドはまた、インビトロにおける、広範囲の投薬レベルにわたる運動ニューロン／神経芽腫細胞の強力な促進剤であることも見出された。ＭＮＴＦ−１分子のこの部分は、本明細書において、以下、「ＷＭＬＳＡＦＳ」ドメインと呼ばれる。
【００３７】
（１０マー）
別の好ましい実施形態において、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが提供され：
【００３８】
【表４】
この配列は、配列番号１のアミノ酸残基１３〜２２に対応する。このＭＮＴＦフラグメントは、「ＷＭＬＳＡＦＳ」ドメインのほとんどおよび「ＦＳＲＹＡＲ」ドメイン全体を含む。この１０マーは、インビトロで、０．０１μｇ／ｍｌほどの低い濃度で運動ニューロン／神経芽腫細胞を刺激した場合の、完全長ＭＮＴＦ ３３マーと少なくとも同じくらい効果的であった。
【００３９】
（１１マー）
別の好ましい実施形態において、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが提供され：
【００４０】
【表５】
この配列は、配列番号１のアミノ酸残基１７〜２７に対応する。この１１マーは、ＦＳＲＹＡＲドメインを含み、さらに、運動ニューロン／神経芽腫細胞の細胞増殖を増加させるのに十分であることも見出された。
【００４１】
（１３マー）
別の好ましい実施形態において、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが提供され：
【００４２】
【表６】
この配列は、配列番号１のアミノ酸残基１１〜２３に対応する。この１３マーは、ＷＭＬＳＡＦＳドメインとＦＳＲＹＡＲドメインとの両方を含み、さらに、運動ニューロン／神経芽腫細胞の細胞増殖を上昇させるために十分であることも見出された。しかし、この１３マーの環化型は、インビトロで細胞増殖を刺激した場合に効果的ではなかった。
【００４３】
（２１マー）
別の好ましい実施形態において、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが提供され：
【００４４】
【表７】
この配列は、配列番号１のアミノ酸残基１３〜３３に対応する。この２１マーは、ほとんどの「ＷＭＬＳＡＦＳ」ドメインおよび全ての「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインを含み、さらに、運動ニューロン／神経芽腫細胞の細胞増殖を上昇させるために十分であることも見出された。
【００４５】
（ＭＮＴＦペプチドアナログ）
１つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている、本明細書中に記載され、かつ同定されているようなペプチドアナログは、本発明の範囲内であることが理解されるべきである。好ましい代替において、運動神経栄養因子ペプチドアナログは、配列番号１の連続する７〜３２アミノ酸残基フラグメントに、１つまたはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を含む。
【００４６】
本発明の範囲内のＭＮＴＦペプチドアナログは、ペプチドの必須な活性が実質的に変化しないままであるという一般的な方向性を提供する、ＭＮＴＦ１ペプチドの改変形態であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「改変形態」とは、その天然に存在する構造を変化させるように施されているペプチドをいう。改変形態は、例えば、ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントの共有結合の改変によるか、不溶性支持マトリックスにＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントを架橋することによるか、もしくはキャリアタンパク質にＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントを架橋することにより調製され得る。
【００４７】
本発明の範囲内のＭＮＴＦ１ペプチドアナログは、抗原性についてＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントに関連する。抗原性について関連する２つのペプチドは、免疫学的な交差反応性を示す。例えば、第一のペプチドに対する抗体はまた、第二のペプチドを認識する。
【００４８】
本発明の範囲内のＭＮＴＦ１ペプチドアナログは、異種タンパク質に結合されるＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントを含む、融合タンパク質であり得る。異種タンパク質は、ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントとは実質的に同じではないアミノ酸配列を有する。この異種タンパク質は、ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントのＮ末端もしくはＣ末端に融合され得る。融合タンパク質としては、ポリＨｉｓ融合物、ＭＹＣ標識融合物、Ｉｇ融合物および酵素融合物（例えば、β−ガラクトシダーゼ融合物）が挙げられるが、これらに限定されない。かかる融合タンパク質、特に、ポリＨｉｓ融合物は、組換えＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントの精製を容易にすることができる。
【００４９】
ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインのペプチド模倣物もまた、本発明により提供され、そして例えば、ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインを含むタンパク質の機能の阻害による、神経細胞の生存能力および増殖の調節のための薬物として作用し得る。ペプチド模倣物は、模倣されたそれらのペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬物を含むことが、薬学産業において一般的に理解されている。例えば、Ｆａｕｃｈｅｒｅ Ｊ．、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；およびＥｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）において、当業者に公知のペプチド模倣物の設計の原理および実施が記載されている。
【００５０】
治療用に有用なペプチドと構造上の類似性を有するペプチド模倣物は、等価の治療効果もしくは予防効果を生成するために使用され得る。典型的に、このようなペプチド模倣物は、所望の特性（例えば、インビボにおける化学的な分解に対する耐性）に改変し得る結合によって必要に応じて置き換えられる、一つ以上のペプチド結合を有する。このような結合としては、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−が挙げられ得る。ペプチド模倣物は、特に所望される治療剤としてのそれらの用途を生む、上昇した薬理学的特性（生物学的半減期、吸収率など）、異なる特異性、上昇した安定性、生成の節約性、低下した抗原性などを示し得る。
【００５１】
ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメイン模倣分子または結合分子の合理的な設計は、模型の（または実験的に決定された）ペプチド構造に基づき、当業者によって合理的な薬物設計の公知の方法を用いて、実施され得る。合理的な薬物設計の目的は、生物学的に活性なポリペプチドまたは標的化合物の構造類似物を生成することである。そのような類似物を作製することによって、天然の分子よりもより活性が高いか、または安定である薬物を作製することが可能である。そのような類似物は、変化に対する異なった感受性を有するか、または種々の他の分子の機能に影響し得る。１つのアプローチにおいて、標的分子またはそのフラグメントのための３次元構造が作製される。これは、Ｘ線結晶学、コンピューターモデリング、または両方のアプローチの組み合わせによって達成され得る。
【００５２】
（作製の方法）
本発明のＭＮＴＦペプチド組成物が、当該分野で周知の方法によって作製され得ることが理解される。それらの方法としては、固相合成による化学合成およびＨＰＬＣによる化学反応の他の生成物からの精製、またはインビトロ翻訳系または生存細胞における本発明のＭＮＴＦペプチドを含有するペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）の発現による生成が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、この組成物のＭＮＴＦペプチドは、単離され、大量に透析されて１種またはそれ以上の所望されない低分子量分子を除去し、および／または、所望されるビヒクルへのより迅速な処方のために、凍結乾燥される。さらなるアミノ酸、変異、化学的改変などは、たとえＭＮＴＦペプチド成分中で作製されるにせよ、好ましくは、ＭＮＴＦドッキング配列のレセプター識別を実質的に干渉しない。
【００５３】
本発明のＭＮＴＦ１の１以上のフラグメントに対応するペプチドまたはポリペプチドは、概して、少なくとも５または６アミノ酸残基長であるべきであり、約７残基、約８残基、約９残基、約１０残基、約１１残基、約１２残基、約１３残基、約１５残基、約２０残基または約３０残基くらいまで含み得る。ペプチド配列は、当業者に公知の方法によって合成され得る。例えば、自動化ペプチド合成機械（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から利用可能）を用いたペプチド合成である。本発明はさらに、環式ペプチド（例えば、下記の表１に示すような（配列番号１）および（配列番号６）に由来するペプチド）の合成および使用を提供する。
【００５４】
共有結合修飾は、標的のアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化薬と反応させることによって、ペプチド中に導入され得る。有機誘導体化薬を用いるポリペプチドの共有結合修飾は、当業者に周知である。例えば、システイン残基は、α−ハロアセテート（および対応するアミン）（例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）と反応し得、カルボキシメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を生じ得る。ヒスチジン残基は、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．０においてジエチルピロカーボネートと反応させることによって、またはｐＨ６において１Ｍカコジル酸ナトリウム中のブロモフェナシルブロマイド（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎａｃｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ）と反応させることによって、誘導され得る。リジン（ｌｙｓｉｎｙｌ）残基およびアミノ末端残基は、コハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応し得る。アルギニン残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬との反応によって改変され得、それらの試薬は、中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロへキサンジオン、およびニンヒドリンである。分光標識は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、チロシン残基中に導入され得る；最も一般的には、Ｏ−アセチルチロシル類および３−ニトロ誘導体を形成するために、それぞれＮ−アセチルイミジゾル（ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌ）およびテトラニトロメタンが用いられる。カルボキシル側基（ｓｉｄｅ ｇｒｏｕｐ）（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）（例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３（４アゾニア（ａｚｏｎｉａ）４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド）との反応によって、選択的に改変され得る。さらに、アスパルギン酸残基およびグルタミン残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギン残基およびグルタミン残基に変換される。グルタミン残基およびアスパラギン残基は、対応するグルタミン残基およびアスパルギン酸残基に脱アミド化され得る。他の改変としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリン（ｓｅｒｙｌ）残基またはスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、ならびにいくつかの例においては、Ｃ−末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００５５】
本発明はさらに、アッセイおよびアッセイのためのキットにおける使用のための新規のＭＮＴＦペプチドアナログ（それらは、遊離形態またはキャリア分子（例えば、タンパク質または固体粒子）に結合する形態のいずれでもよい）ならびに、標識またはトレーサー（例えば、ビオチンもしくはフルオレセインイソチオシアネート）に結合する改変ペプチドを提供する。
【００５６】
ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントの水不溶性支持マトリックスへの架橋は、当該分野で周知の二官能性薬を用いて、実施され得る。それらの二官能性薬としては、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、ホモ二官能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステル（例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））が挙げられる）、および二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）が挙げられる。二官能性薬（例えば、メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート（ｐｒｏｐｉｏｉｍｉｄａｔｅ）は、光の存在下において架橋を形成することが可能である、光活性化可能中間体を産生する。あるいは、反応性水不溶性マトリックス（例えば、臭化シアン活性型炭水化物）は、タンパク質の固定化のために用いられ得る。
【００５７】
ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントの第二のタンパク質（第二のＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントを含む）への架橋は、本明細書に記載の二官能性試薬を用いて実施され得る。別の代替物には、挿入されたスペーサー（例えば、ジチオール基またはジアミノ基または複数のアミノ酸残基（例えば、グリシン））が存在する。このスペーサーはまた、ホモ二官能性架橋剤またはヘテロ二官能性架橋剤（例えば、ヘテロ二官能性架橋剤であるＮ−（４−カルボキシ−シクロヘキシル−メチル）−マレイミド）であり得る。
【００５８】
ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントに対する抗体は、当該分野で周知の方法によって調製され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと）。広範な範囲の動物種が、抗体の作製のために用いられ得る。抗体の作製のために用いられる動物は、代表的には、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットおよび／またはヤギである。抗血清は、種々の適用に用いられ得る。あるいは、所望される抗体分画は、周知の方法によって精製され得る。その方法は、例えば、別の抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィーおよびプロテインＧクロマトグラフィー、および固体マトリックスに結合するペプチドを用いるクロマトグラフィーである。
【００５９】
免疫学的交差反応性は、当該分野で周知の標準的な免疫学的アッセイを用いて決定され得る。例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は、ＭＮＴＦ１ペプチドアナログを、マイクロタイタープレートのウェル表面上に固定化し、次いで固定化されたＭＮＴＦ１ペプチドアナログを、ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントに対する抗体と接触させることによって実施され得る。結合していない抗体および非特異的に結合した抗体を除去するための洗浄の後に、結合した抗体が検出され得る。最初の抗体が検出可能なレベルで結合する場合、結合した抗体は、直接的に検出され得る。あるいは、結合した抗体は、一次抗体に対する結合親和性を有する二次抗体を用いて、二次抗体が検出可能なレベルで結合した状態で検出され得る。
【００６０】
より長いペプチドまたはポリペプチド（例えば、融合タンパク質）は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって生成され得る。例えば、ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントは、既に異種タンパク質を含む市販の発現ベクター中にクローニングされ得、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で異種タンパク質に融合するＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントとなる結果を伴う。
【００６１】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチドをコードする核酸および／または本明細書中に記載される構成要素は、例えば、本発明の種々の組成物および方法のためのペプチドを、インビトロまたはインビボで生成するために用いられ得る。例えば、特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチドをコードする核酸は、例えば、組み換え細胞中のベクターの構成要素である。その核酸は、ＭＮＴＦペプチド配列を含むペプチドまたはポリペプチドを生成するために発現され得る。そのペプチドまたはポリペプチドは、細胞から分泌され得るか、またはその細胞の一部であるかもしくはその細胞内に存在し得る。
【００６２】
（組成物）
本発明に従う薬学的組成物は、好ましくは、１つまたはそれ以上の本発明のＭＮＴＦ１ペプチドアナログを、薬学的に受容可能な希釈剤および／またはキャリアと一緒に含有する。適切なキャリア／希釈剤は、当該分野で周知であり、生理的食塩水または他の無菌の水性媒体を含み、必要に応じて、さらなる成分（例えば、緩衝塩、防腐剤、または砂糖、デンプン、塩、もしくはこれらの組み合わせ）を含む。
【００６３】
本発明の薬理学的組成物は、不活性な無毒性薬学的「キャリア」部分と共に認められた方法論に従って、哺乳動物被験体および、特にヒト被験体において所望される生理的活性を生成するために十分な無毒性濃度において、１以上のＭＮＴＦペプチドアナログを取り込むことによって、従来の投与単位形態中で調製される。好ましくは、この組成物は、生物学的に活性であるが無毒性の濃度（例えば、一投与単位あたり（例えば、被験体の体重１ｋｇあたり）、およそ５ｎｇ〜５０ｍｇの活性成分の濃度）中に活性成分を含有する。利用される濃度は、例えば、成分の全体的な特異的生物学的活性、所望される特異的生物学的活性、ならびに被験体の状態および体重のような因子に依存する。
【００６４】
使用される薬学的キャリアまたは薬学的ビヒクルは、例えば、固体または液体であり得、種々の薬学的形態が使用され得る。従って、固体キャリアが使用される場合、その調製物は、そのまま製粉され得るか、油中に微粉にされ得るか、錠剤にされ得るか、硬質ゼラチン中にか、または微粉化された粉末もしくはペレットの形態の腸溶性コートのカプセル中に配置されるか、またはトローチ、ロゼンジ剤もしくは坐薬の形態に配置される。この固体キャリアはまた、ＭＮＴＦペプチドアナログを含み、使用前に挽き砕かれ得る。
【００６５】
液体キャリア中で使用される場合、その調製物は、液体の形態中（例えば、アンプル、または水性懸濁剤もしくは非水性液体懸濁剤）であり得る。局所投与のために、その活性成分は、無刺激性の保湿基剤（例えば、軟膏またはクリーム）を用いて処方され得る。適切な軟膏基剤の例としては、ワクセリンを添加した揮発性シリコン、ラノリン、および水中油型エマルジョン（例えば、Ｅｕｃｅｒｉｎ（登録商標）（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ）が挙げられるが、これらに限定されない。適切なクリーム基剤の例としては、Ｎｉｖｅａ Ｃｒｅａｍ（登録商標）（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ）、コールドクリーム（ＵＳＰ）、Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｃｒｅａｍ（登録商標）（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）、親水性軟膏（ＵＳＰ）、およびＬｕｂｒｉｄｅｒｍ（登録商標）（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
さらに、本発明に関して、その活性成分は、作用する運動ニューロンの部位においてか、またはその部位近くで、内部で適用され得る。例えば、好ましくは、持続放出様式において、活性成分の放出を可能にするための十分な浸透性を有する固体媒体またはゲル状媒体が、このような内部適用のために利用され得る。そのようなゲルの例としては、ヒドロゲル（例えば、ポリアクリルアミド、アガロース、ゼラチン、アルギン酸塩、または他の多糖ガム）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、この活性成分は、固体材料（例えば、フィルター紙）中に包埋され得、それは、適切な時間および位置において、活性成分の吸収および持続的な放出を可能にする。
【００６７】
本発明に従うＭＮＴＦペプチドは、投与のプロトコルおよび／または患者の必要性に適した、任意の適切な形態における使用のために提供され得る。
【００６８】
上で言及した薬学的に受容可能な組成物の他に、このペプチドは、例えば、凍結乾燥した（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）固体形態もしくはフリーズドライした（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｉｅｄ）固体形態のどちらかで、単独もしくは組み合わせのどちらかで提供され得る。
【００６９】
（使用の方法）
ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／またはＦＳＲＹＡＲドメインを含む短縮ＭＮＴＦ分子（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７）、ならびに「最小限の」ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／またはＦＳＲＹＡＲドメインを構成する他の低分子ペプチド誘導体は、ＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーによって示される神経栄養機能および神経親和性機能を保持することが、本明細書中で実証される。これらＭＮＴＦペプチドアナログは、ＭＮＴＦ１の高いレベルの発現によって生成される同じ生物学的シグナルを提供することによって、神経細胞株の細胞増殖を誘導する（ＭＮＴＦ１は、インビトロおよびインビボで運動ニューロンの生存能力および軸索再生を、選択的に高めることが示されている）。このような薬剤は、新規の分類の神経栄養性薬および神経親和性薬を含む。
【００７０】
ＭＮＴＦ１および／またはそのペプチドアナログは、インビトロで哺乳動物の運動ニューロンの生存を促進し、ＶＳＣ４．１細胞株（運動ニューロンと神経芽細胞腫細胞との間のハイブリッド）の増殖を刺激する。従って、本発明は、神経細胞培養のための増殖因子／サプリメントとしてのＭＮＴＦペプチドアナログの使用を提供し、インビトロで、上に定義されたようなＭＮＴＦペプチドアナログの有効量と共に神経細胞を培養することによって、神経の初代培養物の生存を促進するか、または神経細胞株の細胞増殖を刺激するための方法を含む。
【００７１】
外科的に軸索切断されたラットの末梢神経に対するＭＮＴＦ１のインビボ投与は、未処置のコントロールよりも、顕著に高いパーセンテージの生存する運動ニューロンを生じ、この投与は、抗ＭＮＴＦ１モノクローナル抗体の同時投与によって、遮断され得る。ＭＮＴＦ１のさらなる有益な効果は、脊髄半側切除に供されたラットが、末梢神経の自己移植によって修復され、脊髄との神経移植片接合部のごく近くに、ＭＮＴＦ１含有ゲル切片を移植されて、実証された。ＭＮＴＦ１処置動物は、より多数の生存運動ニューロンを示し、運動機能および感覚機能の回復を改善された。さらに、以下の実施例でより詳細に記載された大腿神経モデルにおいて実証されたように、切除され、縫合されたラット大腿神経のＭＮＴＦ１ペプチドを用いた処置は、インビボの筋肉組織を標的とする運動ニューロンの適正な投射の顕著な増加、および皮膚への不適切な投射の数の顕著な減少を生じた。従って、本発明のＭＮＴＦ１ペプチドは、標的筋肉組織の選択的な神経再支配を促進することが可能である。
【００７２】
従って、本発明は、損傷を受けた運動ニューロンもしくは罹患した運動ニューロン、または病理学的状態（例えば、神経変性疾患など）を処置するための治療方法または予防方法を提供し、その治療方法または予防方法は、神経細胞の生存能力および／または軸索再生を特異的に促進し得る治療薬の有効量を投与することによって達成される。治療指示または予防指示は、以下の神経学的状態の（重症度の阻害および／もしくは重症度の減少）の処置を含み得る：
ａ）神経系に対する急性損傷傷害、亜急性傷害または慢性傷害であって、外傷性、化学的、血管傷害および欠損（例えば、脳卒中に起因する虚血）、感染性傷害／炎症性傷害および腫瘍に誘導された傷害を共に含む、傷害、
ｂ）神経系の老化、
ｃ）神経系の慢性免疫疾患または神経系に影響する慢性免疫疾患（多発性硬化症を含む）、
ｄ）神経系の慢性神経変性疾患および筋骨格障害（遺伝性運動ニューロン疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症）を含む）；
ｅ）末梢神経傷害、脊髄傷害および頭部傷害、
ｆ）末梢ニューロパシー、糖尿病性末梢ニューロパシー、ＡＩＤＳに起因する末梢ニューロパーシー、癌に対する放射線療法に起因する末梢ニューロパシー。
【００７３】
ＭＮＴＦ１の投与はまた、ラット脊髄の外科的切開および修復後、瘢痕形成の減少および炎症の減少に関連している。さらに、組み換えＭＮＴＦ１は、インビトロの脊髄の外植片中の非神経細胞（例えば、グリア細胞および繊維芽細胞）の増殖における顕著な減少に関連していた。従って、別の態様において、本発明は、抗増殖性薬（特に、抗炎症薬または抗繊維性（ａｎｔｉｆｉｂｒｏｔｉｃ）薬）としての使用のために、新規のＭＮＴＦペプチドアナログおよび、それらからなる組成物またはそれらを含有する組成物を提供する。さらに、本発明はまた、非神経細胞（特に、繊維芽細胞および炎症細胞）の増殖ならびに、または移動を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞培養物（より詳細には、過剰増殖の瘢痕組織もしくはケロイド繊維芽細胞）に対して、または哺乳動物宿主中の傷害部位および／もしくは瘢痕部位に対して、ＭＮＴＦペプチドアナログを投与することによって阻害する方法である。本発明はまた、そのような新規のＭＮＴＦペプチドアナログおよび、それらからなる組成物またはそれらを含む組成物を、創傷治癒および美容的適用の用途のために提供する。
【００７４】
本発明のＭＮＴＦペプチドは、従って、容易に薬理学的適用に利用され得る。インビボ適用は、哺乳動物被験体および、特にヒト被験体への、この因子の投与を含む。結果として所望される細胞への治療薬の送達となる任意の投与様式は、本発明の範囲内であると企図される。投与の部位および細胞は、処置される特定の障害の理解に基づいて、当業者によって選択される。薬学的投薬および薬物の送達の原理は、公知であり、例えば、Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．およびＰｏｐｏｖｉｃｈ，Ｎ．Ｇ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，第５版，Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９９０）に記載されている。
【００７５】
本明細書に記載される任意の方法での本発明のペプチドの投与は、任意の適切なプロトコルによってであり得る。投与の特定の様式はまた、当業者によって容易に選択され得、例えば、作用される部位においてか、またはその近くでの局所適用である好ましい様式により、経口、静脈内、皮下、筋肉内などが挙げられ得る。加えて、投薬量、投薬頻度、および処置の経過の長さは、処置される特定の変性障害に依存して、当業者によって決定され得、そして最適化され得る。本発明のペプチドのこのような投与は、意図される部位におけるペプチドの活性の、所望される有効な結果を与えるような量である。従って、「有効（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」量を構成する量は、種々のパラメータ（例えば、患者の体重、必要とされる活性の程度、意図される活性の部位、処置されるか、または予防される状態の重症度）に依存し得、それらのすべては、当業者によってよく理解され、認識される。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」は、作用される部位に十分に近い神経細胞もしくは組織または非神経細胞もしくは組織への精製されたペプチドの適用を含み、このポリペプチドは、哺乳動物神経の生存能力および／または非神経細胞（例えば、繊維芽細胞もしくは炎症性細胞）の減少した増殖または浸潤の促進において有効である。
【００７７】
なおさらなる態様において、本発明は、上に定義されたＭＮＴＦペプチドアナログ（詳細には、本発明の結合したペプチドアナログ）を提供する。これは、ＭＮＴＦ１に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生成のための免疫原としての使用のためのものであり、特に、診断用途、予後用途および治療用途のためのものである。このようなポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生成の方法はまた、本発明の範囲内である。
【実施例】
【００７８】
本発明は、一定の態様において、以下の実施例の参照とともに認識され得、この実施例は限定されるためではなく例示のために提供される。
【００７９】
以下の実施例中で作製される参照の材料、試薬などは、特に示されない限り、商業的供給源から入手できる。
【００８０】
（実施例１−ＭＮＴＦバイオペプチドについての生成手順）
この実施例は、ＭＮＴＦペプチドを製造する方法を示す。
【００８１】
１．）合成−すべてのペプチドを、ＣＳ５３６ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＣＳ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を用いたｔ−Ｂｏｃケミストリを介して合成した。Ｂｏｃ基の脱保護を、塩化メチレン中の４０％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を用いて実施した。カップリング反応を、ジイソプロピルカルボジイミド（ｄｉｉｏｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ＤＩＣ）を用いて２時間実施した。各カップリングサイクルの完了時にカップリング効率を確認するために、カイザー試験（ニンヒドリンベース）を実施した。
【００８２】
２．）次いで、ＨＦ（フッ化水素）を用いて、このペプチドを樹脂から切り離した。ＨＦ反応の後、次いでこのペプチドをＴＦＡと共に抽出した。次に、精製プロセスの前に正確な重量を得るために抽出した材料を凍結乾燥した。
【００８３】
３．）次いで、逆相Ｃ１８樹脂を詰めたＨＰＬＣカラム上に、粗製ペプチドをロードした。緩衝液Ａ（０．１％ ＴＦＡ（Ｈ２Ｏ中））から緩衝液Ｂ（６０％ アセトニトリル（０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中））への勾配に流し、溶出物の分画を回収した。結果として生じた分画を、分析用ＨＰＬＣによって分析し、純度＞９５％の適切な材料を含む分画をプールし、凍結乾燥した。
【００８４】
４．）次いで、このペプチドを凍結させ、凍結乾燥した。最終の凍結乾燥プロセスの後に、このペプチドを、ＨＰＬＣ純度および質量スペクトル立体構造について、ＣＳ Ｂｉｏにて確認した。
【００８５】
（実施例２−ＭＮＴＦ誘導体のインビトロアッセイ）
（導入）
運動ニューロンの機能の研究は、運動ニューロンの機能を模倣する細胞株の開発により発展してきた。感覚性−Ｆ１１神経芽細胞腫細胞、運動性−ＶＳＣ４．１神経芽細胞腫細胞、およびアドレナリン作動性−Ｎ１Ｅ−１１５神経芽細胞腫細胞、ならびにシュワン細胞を含むいくつかの神経細胞株は、プログラムされた細胞死（ＰＣＤ）もしくはアポトーシスをインビトロで検出するため、および／または増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、および分化におけるニューロパシーを有する筋萎縮性側索硬化症患者もしくは糖尿病患者に由来する血清の阻害効果を検出するための神経モデルとして用いられている。特に、ＶＳＣ４．１細胞株は、Ｓｔａｎｌｅｙ Ａｐｐｅｌ博士によって開発された運動ニューロンと神経芽腫細胞との間のハイブリッドであり、筋萎縮性側索硬化症の病原の研究において広く用いられている（Ｋｉｍｕｒａ Ｆら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３５：１６４−１７１，１９９４；Ｓｍｉｔｈ ＲＧら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ ９１：３３９３−３３９７，１９９４；Ａｌｅｘｉａｎｕ ＭＥら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６３：２３６５−２３６８，１９９４；Ａｐｐｅｌら，Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３：３６８−３７４，１９９５−１９９６；およびＭｏｓｉｅｒ ＤＲら，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ３７：１０２−１０９，１９９５（これらの全ては出典明示により本明細書中に援用される））。従って、ＶＳＣ４．１細胞は、運動ニューロパシーの病原の試験において、および全身性因子を考える場合に、細胞を損傷から保護し得る因子の試験に有用である。
【００８６】
この実施例は、特定の短縮ＭＮＴＦペプチドが、ＭＮＴＦ１ ３３マーと比較できる方法で、ＶＳＣ４．１細胞の増殖を刺激することを示す。これらの増殖効果は、運動神経の喪失をブロックするか、または逆転させるＭＮＴＦの能力に関し得る。
【００８７】
（方法）
増殖の実験を、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からの細胞増殖アッセイキットを利用して、９６ウェルプレートにて行った。ＶＳＣ４．１細胞（運動ニューロン／神経芽細胞腫細胞ハイブリッド）を、ＭＮＴＦを含まないか、または１０−８ｇ／ｍｌ〜１０−５ｇ／ｍｌの用量範囲のＭＮＴＦを含むかのいずれかである２％ＦＢＳを含有したＤＭＥＭ中で培養した。３つのウェルに、各処置を適用した。この細胞を２１時間培養し、このアッセイキットからの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を、各ウェルに加えた。３時間のＢｒｄＵ標識の後、細胞を洗浄し、固定して乾燥させた。次いで、細胞を固定し、ＤＮＡを変性させて、その後の抗体結合への対応を向上させた。アッセイキットからのＰＯＤ標識したマウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体を、２時間適用し、続いて洗浄した。比色アッセイ溶液（テトラメチルベンジジン）を加え、Ｗａｌｌａｃ Ｖｅｃｔｏｒ ２プレートリーダーにて４５０ｎｍで読み取ることにより、このアッセイを定量化した。同じプレート上で０〜２０，０００細胞／ウェルの勾配の細胞でプレートしたウェルとの比較により、処理群の細胞を定量化した。プレートごとの変動を考慮するために、データをコントロールの％として表す。
【００８８】
（結果）
以下の表は、別の機会（１０−２７−０２、３−２８−０３および８−４−０３）に行われた細胞増殖アッセイの３つのセットの結果をまとめたものである。
【００８９】
【表８】
【００９０】
提供された他のペプチドのうちで、このアッセイにおいて最も有効なものは、ＧＬＰグレードのＭＮＴＦ ３３マーであり、これは１００ｎｇ／ｍｌの用量でも３４．３％の最大反応を刺激した（図２）。他のペプチドのうち、ＭＮＴＦ ６マーおよびＭＮＴＦ １１マーは比較的有効であり（図２）、それぞれ３５．１％および３２．２％の最大反応を達成した。これらの反応はまた、試験した最も高い用量（１０μｇ／ｍｌ）において見られた。このＭＮＴＦ ７マーは、１μｇ／ｍｌの用量において２５．１％の最大効果を有し、若干有効性は低いが（図２）、このペプチドは他の調製物より広範な活性用量範囲を示した。この環式ＭＮＴＦ １３マーペプチドは、試験した全てのペプチドの中で最も有効性が低く、１μｇ／ｍｌで１７．３％の最大効果を示した（図２）。さらに、より高い用量において、環式ＭＮＴＦ １３マーペプチドは増殖を阻害するように見えた。
【００９１】
これらの予備実験において報告されたパーセンテージの増加は高くなかったが、このことは、基礎条件下で、これらの細胞の高増殖速度に起因する可能性が高かった。記載によると、ＭＮＴＦペプチドアナログは、そのペプチドの環式バージョンを除き、用量依存様式で比較的有効なように見える。試験されたペプチドのうち、ＧＬＰグレードの３３マー（配列番号１）が、このアッセイにおいて最も生物学的に活性であり、高い増殖速度をもたらし、低い用量を誘導のために必要とした。研究グレードの６マー（配列番号２）および１１マー（配列番号５）は、各々と比べてだけでなく、ＭＮＴＦ ３３マーと比べても有効であった。環式１３マー（配列番号４）は、他の誘導ペプチドよりも、顕著に有効が低かった。さらに、環式ＭＮＴＦ３３マーペプチドは、低用量で、非常に弱い増殖活性を示した。
【００９２】
本質的に上に記載されたように行われた、さらなる細胞増殖アッセイを実施し、いくつかのＧＬＰグレードのＭＮＴＦペプチドの効果を比較した。
【００９３】
このアッセイのために利用したＭＮＴＦ調製物は、以下：
【００９４】
【化１】
であった。
【００９５】
表１および図３で示すように、すべてのＭＮＴＦペプチド調製物は、異なった程度ではあるが、ＶＳＣ４．１細胞における増殖効果を発揮した。全体の用量範囲にわたって最も強力な調製物は、７マーであり、適用された最も低い用量でさえ２．５倍の増加を示した一方、最も高い用量で、ほぼ３．５倍の増殖の増加を発揮した。１３マーは、最も低い用量において、いくらかの効力を示したが、この効果はより高い用量においては低下した。２種の３３マーは、投薬量の増加とともに、安定した反応の増加を示し、研究グレードの３３マーは、最も高用量において約３倍の増加で最高点に達した一方、ＧＬＰグレードは、１０μｇ／ｍｌにおいてピークである３倍反応に達し、投薬量の増加とともにさらに増加することはなかった。このアッセイのセットにおいて、より強さの劣る動作物は、６マーおよび１１マーであった。これらの調製物は、１μｇ／ｍｌにおいて、ほぼ２．５倍の増殖の増加を刺激したが、用量範囲全体にわたる能力は、ＭＮＴＦの他のアイソフォームよりは強力でなかった。
【００９６】
第二回目の実験において、このアッセイ全体はより強く、最も活性の高い増殖剤である７マーを用いて、コントロールから３５０％の増加をもたらした。提供された６つのＭＮＴＦアイソフォームのうちの４つは、２５０％またはそれを超えるＶＳＣ４．１細胞の増殖を刺激した。しかし、これらのうちの１つの１３マーは、一回の投薬のみにおいて、増殖を刺激した。他の２つのＭＮＴＦアイソフォーム（すなわち、６マーおよび１１マー）は、増殖を刺激したが、他と比べてより有効性が低かった。相対的効力は、以下のとおりである：７マー（配列番号３）＞３３マー（配列番号１）＞＞６マー（配列番号２）、１１マー（配列番号５）＞１３マー（配列番号６）。
【００９７】
本質的に上に記載されるように、さらなる細胞増殖研究を実施し、運動ニューロン／神経芽細胞腫細胞の、３つの新規のＭＮＴＦ調製物に対する反応を試験した。これらのアッセイのために利用したＭＮＴＦ調製物は、以下：
１４５６ ３３マー
１５９７ １０マー
１６１６ ２１マー
であった。
【００９８】
表１および図４に示すように、コントロールを超えるパーセンテージ増加として表される場合、３つのＭＮＴＦアイソフォームの全ては、ＶＳＣ４．１細胞増殖を有意に刺激した（ＡＮＯＶＡで、示されるように）。さらに、１０マー、２１マーおよび３３マーは、有意に（ｐ＜０．０５）、特定の用量においてコントロールを超える増殖を刺激した。３３マー：ｐ＜０．０２。１０マー：ｐ＜０．００１。２１マー：ｐ＜０．００２。
【００９９】
以前の実験におけるように、アッセイ全体は強力であった。最も活性な増殖剤は、１０マーであるように見え、用いられた３つの最も低い用量において、コントロールを超えておよそ２００％の増加をもたらす（ｐ＜０．００５，ＡＮＯＶＡ）。これら３つの用量のすべては、コントロールと有意に異なる（テューキー−クレーマー事後分析）。３３マーは、低い用量で、１０マーとほとんど同様（１０−９ｇ／ｍｌおよび１０−８ｇ／ｍｌ、テューキー−クレーマー事後分析によって有意）に、細胞増殖を刺激し（ｐ＜０．０１，ＡＮＯＶＡ）、より高い用量では１０マーの反応にほぼ近かった。２１マーは、増殖を有意に刺激した（ｐ＜０．０５，ＡＮＯＶＡ）一方、コントロールを超えた増加は、他の２つのＭＮＴＦアイソフォームの約半分であって、いずれの用量においても有意には異ならなかった。しかし、高い用量においては、３つすべてに対する反応は、同様であった。
【０１００】
従って、３つのＭＮＴＦのアイソフォームのすべては、運動ニューロン増殖を有意に刺激するが、１０マー（配列番号４）および３３マー（配列番号１）は、明らかに２１マー（配列番号７）より優れていた。これらのパーセンテージ反応は、以前のアッセイにおいてよりもいくらか低いように見えるが、このことは、アッセイ間の変動性に起因し得、培養における異なる細胞継代の異なる活性によって引き起こされた可能性がある。
【０１０１】
（実施例３−神経栄養活性についてのインビボアッセイ）
（大腿神経モデル）
運動軸索再生の特異性をラットの大腿神経で調べた。近位で、神経切断および縫合の部位の近くで、皮枝および筋枝の両方に寄与する軸索は、この神経全体にわたって交錯する。これらの軸索が再生する場合、それらは、遠位の神経断端において近接する運動シュワン細胞管および感覚シュワン細胞管への等しい接近を示す。このことは、軸索レベルにおける、「選択」の要素を確信させる。遠位で、再生の特異性が測定される場合、軸索を末端の皮膚枝および筋肉枝に分けられる。運動軸索は、通常、筋枝中でのみ見出され、皮枝のいずれの運動神経再生も経路探索の失敗を表す。軸索再生の特異性は、大腿枝に対するセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびもう一方に対するフルオロ−ゴールド（ＦＧ）の同時適用により評価される。運動軸索の再生は、３週においてはランダムであるが、筋肉に対する適正な投射の数は、その後において劇的に増加する。多くの神経は、最初に両方のトレーサーを含み、それにより皮枝および筋枝の両方に対する側枝を投射する。これらの二重標識された神経の数は時間と共に減少する。従って、運動軸索側枝は、皮枝から除かれ、二重標識された神経を犠牲にして、筋肉に対する適正な投射の数が増加する。従って、再生する運動軸索と筋肉および／または本発明者らがＰｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ（ＰＭＲ）と名付けた筋肉神経との間で特異的な相互作用が生じる。
【０１０２】
（ＭＮＴＦポンプ実験）
予備実験において、本発明者らは、少なくとも２週間排出するＡｌｚｅｔ浸透圧ポンプを用いて、修復部位上にＭＮＴＦ ３３マーを１０−４Ｍでポンピングすることによって、大腿神経中の運動軸索再生を改変することを試みた。ポンプの出口は、修復する神経に隣接した筋肉に縫い付けられ、その神経創傷は、継続的にこの因子をあびた。遠位の大腿の皮枝および筋枝の再神経支配を、上に記載されたようなトレーサーを用いて定量した。
【０１０３】
これらの予備実験のためのコントロールは、再生の３週間後に、慣用的な縫合および評価を受けた１０個の神経の群であった。平均９２個の運動ニューロンが、３週において、筋肉に対して適正に投射したが、一方で、多数（平均１１７）は、皮膚に対して不適切に投射した。しかし、３匹の動物におけるＭＮＴＦ ３３マー処置は、適正な投射の数を二倍以上（平均＝２１０）にした一方、皮膚への不適切な投射の数を劇的に減少させた（平均＝３１）。これらの違いは、試験した動物の数が少ないにもかかわらず、非常に顕著であった。
【０１０４】
追跡実験において、ＭＮＴＦ ３３マーを、本質的に上に記載のように、８個の切断し、縫合したラット大腿神経に対して、１０−４Ｍで投与した。コントロールは、慣用的な縫合を受け、ＭＮＴＦでなく生理的食塩水を送達するポンプを用いた６個の神経の群であった。６つのコントロールにおいて、平均１００個の運動ニューロンは、適正に投射した一方、平均８７個の運動ニューロンは、皮膚に対して不適切に投射した。ＭＮＴＦ処置は、適正な投射の顕著な増加（平均＝１７３）および皮膚への不適切な投射の数の著しい減少（平均＝５９）という結果を再度もたらした。
【０１０５】
短縮ＭＮＴＦペプチドを、ＭＮＴＦ ３３マーと置換し得るかを決定するために、本質的に上に記載のとおり、１０−４Ｍ（ｎ＝８）、１０−５Ｍ（ｎ＝８）および１０−６Ｍ（ｎ＝８）でＭＮＴＦ ６マーＦＳＲＹＡＲを用いて、比較のための合計２２個の生理的食塩水コントロールと共に、その後の実験を実施した。図５に示すように、ＦＳＲＹＡＲペプチド（配列番号２）を用いた処置は、試験したすべての用量において、適正な投射の顕著な増加、ならびに皮膚への不適切な投射の数の著しい減少という結果となった。生理的食塩水のコントロールについて、適正に筋肉に対して投射した細胞の平均数は８５個であり、皮膚に対する不適当な投射の平均数は８５であり、そして二重標識された神経は、平均で約４１個であった。最適用量のＭＮＴＦ ６マー（１０−４Ｍ）において、適正な投射の平均数は１２５個まで増加し、不適切な投射の平均数は４６個まで減少し、そして二重標識した神経の平均数は２３個まで減少した。従って、６マーは、ＭＮＴＦ１ ３３マーと類似した様式で、標的筋肉の選択的な再神経支配を促進することが可能である。
【０１０６】
これらの結果は、ＭＮＴＦ ３３マー、およびＭＮＴＦ ６マーペプチドであるＦＳＲＹＡＲ（配列番号２）を用いた、ラット大腿神経モデルにおける再生の劇的な刺激を実証する。本発明者らは、この顕著な効果を示す他のモデルからのデータを知らない。ほとんどの操作は、せいぜい２０〜３０％の変化という結果であるが、一方、これらの結果は、３６％〜１００％を超える変化を示す。このような劇的な結果は、ＭＮＴＦおよびそのペプチドアナログが、現在利用可能な末梢神経再生の最も強力な刺激因子の１つであることを示唆する。
【０１０７】
（実施例４−抗ＭＮＴＦペプチド抗体の生成および免疫アッセイにおけるそれらの使用）
ＭＮＴＦ ３３マーおよびＭＮＴＦ ６マーであるＦＳＲＹＡＲに対するウサギポリクローナル抗体を、標準的生成プロトコルに従い、Ｈａｒｌａｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）によって生成した。このプロトコルは、ウサギへの接種の前に、ＭＮＴＦペプチドとＫＬＨとを結合する工程を含んだ。より多くのＭＮＴＦペプチドを、定期的な試験採血において、ＥＬＩＳＡのためにＯＶＡと結合させ、生成物の採取の前に、高い抗体力価を確認した。次いで、このポリクローナル抗体を、ＩｇＧ精製およびアフィニティ精製によって精製した。
【０１０８】
ＭＮＴＦ競合性ＥＬＩＳＡプロトコルは、Ｇｅｎｅｔｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＬＬＣ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって開発された。これは、ＭＮＴＦペプチドの検出および測定のためのものであり、例えば、精製した抗ＭＮＴＦ ６マーを用いて、未標識のＭＮＴＦペプチド（例えば、６マーまたは１０マー）が、抗体結合についてビオチン化対応部分と競合する能力を検出する。
【０１０９】
さらに、ＭＮＴＦサンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルが開発され、抗ＭＮＴＦ ６マー抗体を用いて、６マーエピトープを含む、より大きいＭＮＴＦペプチド（例えば、２１マーおよび３３マー）を固定化した。このペプチドを、続いて、ビオチン化抗ＭＮＴＦ ３３マー抗体を用いて検出した。
【０１１０】
本発明は、それらの特定の好ましいバージョンへの参照と共にかなり詳細に記載されているが、他のバージョンが可能である。本発明は、さらなる改変が可能であり、そして本適用は、本発明のあらゆる変数、使用、または採用（本発明が属する分野内の公知の習慣または慣行の範囲内で生じるような、本開示からの逸脱を含む）を対象とすることが意図される。従って、本発明の精神および範囲は、本明細書に含まれる好ましいバージョンの記載に限定されるべきではない。
【０１１１】
本明細書中に記載される全ての刊行物は、あたかも個々の刊行物の各々が、特別かつ個別に参考として援用されることが示唆されるのと同程度に出典明示により本明細書に取り込まれる。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、出典明示により全体が本明細書に取り込まれる２００３年１月２１日に出願された米国仮出願番号６０／４４１，７７２の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
神経栄養因子（ＮＴＦ）は、神経の選択された集団の生存、増殖、維持および機能的な能力を促進するために機能する、タンパク質の特定の群である。最近の研究は、ニューロン死が、増殖および発達の特定の期間の間、脊椎動物の神経系において生じることを証明している。しかし、関連する標的組織由来の可溶性神経栄養因子の添加は、このニューロン死の現象を減ずるために役に立つ。以下の引用は、神経栄養因子について開示し、それらの開示は、出典明示により本明細書に取り込まれる：Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．ら、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ、６ Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ １２９（１９９０）；Ｋｕｎｏ，Ｍ．、Ｔａｒｇｅｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ：Ｔｈｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ、９ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１５５（１９９０）；Ｂａｎｄ，Ｙ．Ａ．、Ｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ、２ Ｎｅｕｒｏｎ １５２５（１９８９）；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｒ．Ｗ．、Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ Ｄｅａｔｈ、１２ ＴＩＮＳ ２５２（１９８９）：Ｂａｒｄ，Ｙ．Ａ．、Ｗｈａｔ，Ｉｆ Ａｎｙｔｈｉｎｇ，ｉｓ ａ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ？、１１ ＴＩＮＳ ３４３（１９８８）；ならびにＴｈｏｅｎｅｎ，Ｈ．、およびＥｄｇａｒ，Ｄ．、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ、２２９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８（１９８５）。
【０００３】
脊椎動物の神経筋系において、胚の運動ニューロンの生存は、関連する発達している骨格筋由来の特定の栄養物質に依存することが見出されている。骨格筋は、インビボでの研究とインビトロでの研究の両方で、変性および続いて生じる自然な細胞死から胚の運動ニューロンを防御することにより、運動ニューロンの生存および発達を促進し得る物質を生成することが示されている。Ｏ’Ｂｒｉａｎ、Ｒ．Ｊ．およびＦｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｇ．Ｄ．、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｃｈｉｃｋ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、６ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２６５（１９８６）；Ｈｏｌｌｙｄａｙ，Ｍ．およびＨａｍｂｕｒｇａｒ，Ｖ．、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｌｏｓｓ ｂｙ Ｅｎｇｌａｒｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ、１７０ Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３１１（１９７６）（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。同様に、何人かの研究者は、ニワトリおよびラットの骨格筋が、インビボとインビトロの両方で、胚の運動ニューロンの自然な細胞死を防御し得る特定の栄養因子を有することを報告している。ＭｃＭａｎａｍａｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｗｈｉｃｈ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｃｈｏｌｉｎｅ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ、２６３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５８９０（１９８８）；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｒ．Ｗ．ら、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ Ｄｅａｔｈ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｂｙ ａ Ｔａｒｇｅｔ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ、２４０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９１９（１９８８）；およびＳｍｉｔｈ，Ｒ．Ｇ．ら、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ、６ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４３９（１９８６）（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０００４】
さらに、インビボにおける胚のニワトリの運動ニューロンの生存、ならびにこれらの運動ニューロンにおけるコリンアセチルトランスフェラーゼの活性を選択的に高めることが見出されているラットの骨格筋から、ポリペプチドが単離されている。このポリペプチドは、コリンアセチルトランスフェラーゼ因子（Ｃｈｏｌｉｎｅ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ）（ＣＤＦ）と呼ばれ、そしてその生物学的機能は、神経増殖因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（ＮＧＦ）、毛様体神経節神経栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙ Ｇａｎｇｌｉｏｎ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）（ＢＤＮＦ）、および網膜神経節神経栄養因子（Ｒｅｔｉｎａｌ Ｇａｎｇｌｉｏｎ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）（ＲＧＮＴＦ）のような他の栄養因子とは異なることが証明されている。Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ」、５ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４１（１９８２）；Ｖａｒｏｎ，Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．４７：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｗａｘｍａｎ，Ｓ．Ｇ．（編）、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、４９３頁−５２１頁（１９８８）；Ｂａｒｄｅ，Ｙ．Ａ．、Ｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ、２ Ｎｅｕｒｏｎ １５２５（１９８９）；Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．ら、Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ３０ｋＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｔｅｃｔａｌ Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｒａｔ ｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ、３４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ、Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ、９０８（１９９１）を参照のこと（これらの開示は、参考により本明細書中で援用される）。
【０００５】
３５ｋＤおよび２２ｋＤの見かけの分子量を有する、ラット筋組織由来の二つの運動神経栄養因子の単離および特徴付けは、Ｃｈａｕらにより報告されている。Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．ら、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｈｏｒｎ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ ｏｆ Ｒａｔ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ．Ｉｎ：Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．５、Ｐｅｅｔｅｒｓ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ、８９頁−９４頁（１９９２）（これらの開示は、出典明示により本明細書に取り込まれる）を参照のこと。３５ｋＤタンパク質は、Ｄｒ．Ｃｈａｕにより運動神経栄養因子１（ＭＮＴＦ１）として規定されており、そして見かけの２２ｋＤタンパク質は、運動神経栄養因子２（ＭＮＴＦ２）として規定されている。これらの二つの栄養因子は、インビトロで、ラット腰部脊髄の単離された前角運動ニューロンと脊髄の移植片の両方の増殖および／もしくは再生を支持することが証明されている。
【０００６】
その後、１９９３年に、Ｃｈａｕらは、免疫プローブとしてＭＮＴＦ１に対するモノクローナル抗体を用いて、ヒト網膜芽腫ｃＤＮＡライブラリー由来のλｇｔ１１クローンの免疫学的スクリーニングを報告した。免疫陽性クローン由来の抽出物の免疫ブロット法は、５５ｋＤの見かけの分子量を有するＭＮＴＦ１タンパク質を染色した。Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．ら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ Ｍｕｓｃｌｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ１（ＭＮＴＦ１） ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｂｅｓ、（要約）１９ Ｓｏｃ．ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．ｐａｒｔ１、２５２（１９９３）（これらの開示は、本明細書により参考として援用される）を参照のこと。クローン化されたヒトＭＮＴＦ１を含む抽出物は、それが、ラット前角運動ニューロンのインビトロでの増殖を支える点で、「天然の」ＭＮＴＦ１タンパク質の生物学的活性と同様の生物学的活性を有することが示されている。
【０００７】
より最近になって、米国特許第６，３０９，８７７号は、運動ニューロンに栄養効果を与える能力を有する神経栄養因子のファミリーを開示した。この運動神経栄養因子は、単離され、これらの因子をコードする核酸配列は、クローン化され、そして発現され、そして核酸配列とポリペプチド配列の両方が提供された。詳細には、それぞれ、１４４３塩基対および９７２塩基対の挿入物によりコードされる組換えタンパク質、ＭＮＴＦ１−Ｆ３およびＭＮＴＦ１−Ｆ６は、融合タンパク質か精製されたフラグメントかのどちらかとして発現された。単離された因子および発現された組換え因子は、運動ニューロンの持続した生存能力および神経突起伸長を誘導可能であった。そのため、これらの因子は、「運動神経栄養因子」もしくは「ＭＮＴＦ」として分類されている。
【０００８】
米国特許第６，３０９，８７７号に報告されているＭＮＴＦ１−Ｆ６クローンは、ＭＮＴＦ１の３３アミノ酸フラグメントをコードしている。この配列を含む組換えタンパク質は、ＭＮＴＦ１に対するモノクローナル抗体と反応し、運動ニューロンの生存能力を維持し、神経突起伸長を上昇させ、細胞死／アポトーシスを減少させ、運動ニューロンの伸びた成長円錐含有軸索を有する巨大な活性ニューロンの伸長と「延展」を支持した。このＭＮＴＦ１フラグメントの生物学的活性をそれでも維持している「最小の」活性部位を含むペプチドが合成され得るかどうかを決定するために、その後の研究が行われた。
【発明の概要】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、神経細胞の生存能力および増殖を調節するために有用なＭＮＴＦ分子の部分を含む新規のペプチドおよび組成物に関し、それにより容易に合成され得る神経栄養ペプチドを提供する。
【００１０】
詳細には、本発明は、運動神経栄養因子の作用に対して一般的な有意性を有する新規タンパク質ドメインに関し、このタンパク質ドメインは、同定され、そしてＭＮＴＦ１分子の二つの短い重複する部分配列にマッピングされている。これらの今までに認識されていないタンパク質ドメインは、本明細書中で「ＷＭＬＳＡＦＳ」ドメインおよび「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインと呼ばれるが、神経細胞の生存能力および増殖を調節するために十分である。さらに、これらのドメインを含む短縮型のＭＮＴＦ１種は、それら自体、細胞増殖アッセイにおける運動ニューロン／神経芽腫細胞のハイブリッドの増殖を刺激するために十分である。
【００１１】
従って、１の態様において、本発明は、ＷＭＬＳＡＦＳドメインもしくはＦＳＲＹＡＲドメインを含む、精製および単離されたＭＮＴＦペプチドアナログ、ならびにその構造および／もしくは機能を模倣する分子に関し、これらは、神経細胞の生存能力および増殖を誘導もしくは調節するために有用である。このようなＭＮＴＦペプチドアナログの特定の実施形態は、本明細書中で配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７として開示される。
【００１２】
本発明はまた、インビトロで細胞培養物に、またはインビボで神経傷害もしくは神経変性障害に罹患している個体にＭＮＴＦペプチドアナログを投与することによる、神経細胞の生存能力および／もしくは増殖を調節するための組成物ならびに方法にも関し、これらは、細胞増殖を促進するか、もしくは不適切な細胞死を安定化させるため、および／またはインビボもしくはインビトロのいずれの場合において、正常細胞の挙動を回復させるためのものである。本発明はまた、非神経細胞に対するその抗増殖効果のためのＭＮＴＦペプチドアナログの使用、特に、創傷治癒における抗線維症剤もしくは抗炎症剤としてのその使用にも関する。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明および添付の図面においてより良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、種々のＭＮＴＦ１ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、種々の用量のＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーおよびそのペプチド誘導体による、ＶＳＣ４．１細胞の増殖のパーセント上昇を示す。
【図３】図３もまた、種々の用量の高度に精製された（ＧＬＰｇ）ＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーおよびそのペプチド誘導体による、ＶＳＣ４．１細胞の増殖のパーセント上昇を示す。
【図４】図４は、種々の用量のＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーおよびさらなるペプチド誘導体による、ＶＳＣ４．１細胞の増殖のパーセント上昇を示す。
【図５】図５は、種々の用量のＭＮＴＦ ６マーで処置された運動ニューロンによる、標的の筋肉細胞の選択的再神経支配を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（詳細な説明）
本明細書中で使用される技術的および科学的な用語は、特に定義されなければ、本発明の属する分野の当業者により一般的に理解される意味を示すものとする。当業者に公知の種々の方法について本明細書中で参照される。参照されるこのような公知の方法について述べる刊行物および他の資料は、完全に記載されるとおり、出典明示により本明細書に取り込まれる。組換えＤＮＡ技術の一般的な原理について述べている一般的な参考文献としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．、編、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）；Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２）；Ａｕｓｔｅｎ，Ｂ．Ｍ．およびＷｅｓｔｗｏｏｄ，Ｏ．Ｍ．Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）が挙げられる。当業者に知られる適切な物質および／または方法のいずれもが本発明の実施において利用することができるが、好ましい物質および／または方法は本明細書中に記載される。
【００１６】
（概論）
ラット筋肉組織由来の２つの運動神経栄養因子（ＭＮＴＦ１およびＭＮＴＦ２）の単離および特徴付け、ならびにその後のヒト網膜芽腫ｃＤＮＡライブラリー由来の組換えＭＮＴＦ１−Ｆ６のクローニングは、米国特許第６，３０９，８７７号（ならびに１９９７年９月１２日出願された同時係属中の米国特許出願第０９／９８９，４８１号、同第０８／９２８，８６２号、１９９６年１１月１５日に出願された同第０８／７５１，２２５号および１９９６年９月２７日に出願された米国仮特許出願６０／０２６，７９２；これらの全ては、出典明示により本明細書により全て援用される）に記載されている。ＭＮＴＦ１−Ｆ６遺伝子配列は、本明細書中で配列番号１と呼ばれる３３個のアミノ酸配列をコードする。
【００１７】
天然に存在するＭＮＴＦ１ポリペプチドおよび組換えＭＮＴＦ１ポリペプチドは、ラット腰部脊髄の移植片から単離された前角運動ニューロンのインビトロでの生存を選択的に高めることが示された。処置された培養物の顕微鏡写真は、ミエリン化された神経線維の神経突起伸長ならびに非神経細胞（例えば、グリア細胞および線維芽細胞）の増殖の顕著な減少を示した。同様に、外科的に軸索切断されたラット末梢神経へのＭＮＴＦ１のインビボ投与により、未処置コントロールよりも顕著に高い割合で生存している運動ニューロンが生じ、これは、抗ＭＮＴＦ１モノクローナル抗体の同時投与により阻害されうる。
【００１８】
ＭＮＴＦ１のさらなる有益な効果は、脊髄半切開に供され、末梢神経自己移植片により修復され、脊髄との神経移植片結合部に近接してＭＮＴＦ１含有ゲル切片を移植されたラットにおいて証明された。ＭＮＴＦ１処置された動物は、より多数の生存している運動ニューロン、運動機能および感覚機能の回復の改善、炎症反応の減少（より少ない浸潤しているマクロファージおよびリンパ球）、移植片部位でのコラーゲン含有瘢痕組織の形成の減少、正常なシュワン細胞形態ならびに正常なミエリン化および非ミエリン化神経線維の形成を示した。
【００１９】
神経変性疾患の処置におけるＭＮＴＦの効力はまた、ｗｏｂｂｌｅｒマウス（よろめきマウス）動物モデルにおいても証明されている。ｗｏｂｂｌｅｒマウスは、骨髄および脳幹の運動ニューロンの進行性変性を引き起こす常染色体二重劣性遺伝子の変異を保有している。産後約３週間のｗｏｂｂｌｅｒマウスは、頚運動ニューロンの同時に生じる変性を伴う「よろめく」総合症状を発症し始め（第１段階）、これは、前肢の筋肉のるいそうならびに指および爪を伸ばすことができないことの両方を引き起こした。３ヶ月齢までに、病理学的な総合症状は、前肢における全ての関連する関節（例えば、手首、肘および肩の関節）が「一緒にかたまってしまうこと」ならびに体重の大きな減少および慢性疲労をともなって第４段階に進行する。しかし、ほとんどのｗｏｂｂｌｅｒマウスは、３ヶ月齢に達する前に死亡する。僧帽筋と菱形筋と脊髄のＣ７−Ｔ３領域の間へのＭＮＴＦ１含有ゲル切片の移植は、ｗｏｂｂｌｅｒマウスの症状の進行を遅延させ、コントロール群に比べて、寿命、健康、呼吸、体重、前肢の強さの全般的な改善ならびにそれらの頚運動ニューロンの空胞形成および染色質溶解の減少をもたらした。
【００２０】
ＭＮＴＦ１の公知の生物学的活性のために十分であるようである、ＭＮＴＦ１−Ｆ６分子のこれまでに認識されていなかった部分的に重複する２つのドメインが、現在では同定されている。これらのドメインの各々は、本明細書中で「ＷＭＬＳＡＦＳ」ドメインおよび「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインと呼ばれ、ＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーと同様の様式で運動ニューロン由来の細胞株の増殖を刺激するのに十分である。同様に、「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインは、ＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーと同様の様式で、インビボにおいて、運動ニューロンにより筋肉を標的とする選択的な再神経支配を指示するのに十分である。さらに、「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインは、「ＦＳＲＹＡＲ」配列を含む任意のＭＮＴＦペプチド（ＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーを含む）を認識する抗体を生じるのに十分な抗原エピトープを提供する。
【００２１】
当該分野および本発明に精通している当業者は、ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインを含む配列が、インビトロおよびインビボにおいて、非神経細胞に対する、神経細胞の生存能力および形態の選択的な調節における使用のためにＭＮＴＦペプチドアナログを提供することを理解する。さらに、ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインに結合可能な化合物および組成物は、標的の細胞および組織におけるＭＮＴＦ１活性の検出および／もしくは調節における使用のための薬剤を提供する。
【００２２】
（ペプチド）
本明細書中で使用される場合、用語「ＷＭＬＳＡＦＳドメイン」もしくは「ＦＳＲＹＡＲドメイン」とは、神経細胞の選択的維持および軸索再生に十分であることが、本明細書中で証明されているポリペプチドドメインならびにそれらの構造および／もしくは機能を模倣可能なペプチドならびに／または分子をいう。本発明の好ましい実施形態は、アミノ酸配列：ＦＳＲＹＡＲ［配列番号２］もしくはＷＭＬＳＡＦＳ［配列番号３］を有するペプチド、およびその機能的な等価物を含む。
【００２３】
「機能的な等価物」は、ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインの生物学的活性と実質的に同様の生物学的活性を有するペプチドを意味し、このような活性もしくは特徴を有する「フラグメント」、「改変体」、「アナログ」、「ホモログ」、もしくは「化学誘導体」を含むものとされる。したがって、ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインの機能的な等価物は、同一のアミノ酸配列を共有しなくてもよく、従来のアミノ酸もしくは非従来のアミノ酸の保存性または非保存性のアミノ酸置換であり得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「生物学的に活性なペプチド」および「生物学的に活性なフラグメント」とは、上に記載の運動神経栄養因子（ＭＮＴＦ）に従うペプチドもしくはポリペプチドをいい、ここで、ＭＮＴＦは、運動ニューロンに対する保護効果および／もしくは運動ニューロン由来の細胞株に対する増殖効果を示す。
【００２５】
本発明のＭＮＴＦペプチドアナログを含むタンパク質もしくはペプチドにおけるアミノ酸残基の配列は、それらの一般的に用いられる三文字表記の使用によるか、もしくは一文字表記によるかのいずれかにより本明細書にて示されている。これらの三文字表記および一文字表記の列挙は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９７５）のごとき教科書中に見出すことができる。アミノ酸配列が水平に列挙されている場合、アミノ末端は左端にあるものとされ、一方、カルボキシ末端は右端にあるものとされる。
【００２６】
本明細書における「保存性の」アミノ酸置換との言及は、同様の側鎖を有するアミノ酸残基の相互置換可能性を意味するものとされる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群を構成し；セリンおよびスレオニンは、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸であり；アスパラギンおよびグルタミンは、アミド含有側鎖を有するアミノ酸であり；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンは、芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；リジン、アルギニンおよびヒスチジンは、塩基性側鎖を有するアミノ酸であり；ならびにシステインおよびメチオニンは、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸である。所定の群からの１つのアミノ酸と同じ群からの別のアミノ酸との相互置換は、保存性の置換と見なされる。好ましい保存性の置換群としては、アスパラギン−グルタミン、アラニン−バリン、リジン−アルギニン、フェニルアラニン−チロシンおよびバリン−ロイシン−イソロイシンが挙げられる。
【００２７】
種々のＭＮＴＦペプチドアナログを含むペプチドの正確な化学構造が多くの因子に依存して変化することは、当業者によって理解される。例えば、所定のポリペプチドは、酸性もしくは塩基性の塩または中性の形態として得られ得、これは、イオン化可能なカルボキシル基およびアミノ基がこの分子にて見出されるからである。そこで、本発明の目的のために、ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインを含むペプチドの任意の形態は、ＭＮＴＦ１ ３３マーペプチドの生物学的な活性を維持し、本発明の範囲内であることが意図される。
【００２８】
（ＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マー）
米国特許６，３０９，８７７号において、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチド（当該文献中においては配列番号４と呼ばれる）が提供される：
【００２９】
【表１】
この配列を含む組換えタンパク質は、ＭＮＴＦ−１に対するモノクローナル抗体と反応し、運動ニューロンの生存能力を維持し、神経突起の伸長を上昇させ、運動ニューロン細胞死／アポトーシスを減少させ、成長円錐含有軸索の伸長が伴った運動ニューロンの巨大な活性神経への伸長および「延展」を支持した。ＭＮＴＦ１ ３３マーは、本明細書中では配列番号１と呼ばれ、固相合成により合成され、以下の実施例に記載されるように、細胞増殖アッセイにおける陽性コントロールとして役割を果たした。この直鎖状の３３マーは、運動ニューロン／神経芽腫細胞の増殖の増加に効果的であり、他方でこのペプチドの環化型は効果がより小さいことが見出された。
【００３０】
本発明は、運動ニューロンの生存および維持を促進するＭＮＴＦ１の能力を維持するＭＮＴＦ１のペプチドアナログを含む。本発明に関するＭＮＴＦペプチドアナログは、典型的に、６個〜３２個のアミノ酸の長さであり、配列番号１の１２〜１８アミノ酸残基に対応するＷＭＬＳＡＦＳドメイン（配列番号３）、または配列番号１の１７〜２２アミノ酸残基に対応するＦＳＲＹＡＲドメイン（配列番号２）と呼ばれる２つのアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。ＭＮＴＦペプチドアナログの好ましい実施形態は、配列番号１の連続する６〜３２アミノ酸残基のフラグメントを含む。
【００３１】
別の実施形態において、運動神経栄養因子ペプチドアナログのアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴ分析により調べられたところ、配列番号１の連続する９〜３２アミノ酸残基と少なくとも７０％同一であり、配列番号１の連続する８〜３２アミノ酸残基と少なくとも８０％同一であり、最も好ましくは、配列番号１の連続する７〜３２アミノ酸残基と少なくとも９０％同一である。
【００３２】
対応する配列番号１のフラグメントとポリペプチド配列を比較するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＷＷＷ上、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて）から公的に入手可能なＢＬＡＳＴプログラムを用いて、配列の包括的アラインメントが実施され得る。包括的アラインメントを実施する前に、配列番号１はＧｅｎＢａｎｋに提出され得る。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより提供される初期設定パラメータは包括的アラインメントに使用され得る。
【００３３】
（６マー）
特に好ましい実施形態において、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが提供され：
【００３４】
【表２】
この配列は、配列番号１のアミノ酸残基１７〜２２に対応し、運動ニューロン／神経芽腫細胞の細胞増殖を上昇させるために十分であることが見出された。ＭＮＴＦ−１分子のこの部分は、本明細書中において、以下、「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインと記載される。
【００３５】
（７マー）
他の好ましい実施形態において、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが提供され：
【００３６】
【表３】
この配列は、配列番号１のアミノ酸残基１２〜１８に対応する。ＭＮＴＦ１のこの７アミノ酸フラグメントは、ＦＳＲＹＡＲドメインのＦＳ残基と重複する。このペプチドはまた、インビトロにおける、広範囲の投薬レベルにわたる運動ニューロン／神経芽腫細胞の強力な促進剤であることも見出された。ＭＮＴＦ−１分子のこの部分は、本明細書において、以下、「ＷＭＬＳＡＦＳ」ドメインと呼ばれる。
【００３７】
（１０マー）
別の好ましい実施形態において、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが提供され：
【００３８】
【表４】
この配列は、配列番号１のアミノ酸残基１３〜２２に対応する。このＭＮＴＦフラグメントは、「ＷＭＬＳＡＦＳ」ドメインのほとんどおよび「ＦＳＲＹＡＲ」ドメイン全体を含む。この１０マーは、インビトロで、０．０１μｇ／ｍｌほどの低い濃度で運動ニューロン／神経芽腫細胞を刺激した場合の、完全長ＭＮＴＦ ３３マーと少なくとも同じくらい効果的であった。
【００３９】
（１１マー）
別の好ましい実施形態において、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが提供され：
【００４０】
【表５】
この配列は、配列番号１のアミノ酸残基１７〜２７に対応する。この１１マーは、ＦＳＲＹＡＲドメインを含み、さらに、運動ニューロン／神経芽腫細胞の細胞増殖を増加させるのに十分であることも見出された。
【００４１】
（１３マー）
別の好ましい実施形態において、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが提供され：
【００４２】
【表６】
この配列は、配列番号１のアミノ酸残基１１〜２３に対応する。この１３マーは、ＷＭＬＳＡＦＳドメインとＦＳＲＹＡＲドメインとの両方を含み、さらに、運動ニューロン／神経芽腫細胞の細胞増殖を上昇させるために十分であることも見出された。しかし、この１３マーの環化型は、インビトロで細胞増殖を刺激した場合に効果的ではなかった。
【００４３】
（２１マー）
別の好ましい実施形態において、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが提供され：
【００４４】
【表７】
この配列は、配列番号１のアミノ酸残基１３〜３３に対応する。この２１マーは、ほとんどの「ＷＭＬＳＡＦＳ」ドメインおよび全ての「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインを含み、さらに、運動ニューロン／神経芽腫細胞の細胞増殖を上昇させるために十分であることも見出された。
【００４５】
（ＭＮＴＦペプチドアナログ）
１つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている、本明細書中に記載され、かつ同定されているようなペプチドアナログは、本発明の範囲内であることが理解されるべきである。好ましい代替において、運動神経栄養因子ペプチドアナログは、配列番号１の連続する７〜３２アミノ酸残基フラグメントに、１つまたはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を含む。
【００４６】
本発明の範囲内のＭＮＴＦペプチドアナログは、ペプチドの必須な活性が実質的に変化しないままであるという一般的な方向性を提供する、ＭＮＴＦ１ペプチドの改変形態であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「改変形態」とは、その天然に存在する構造を変化させるように施されているペプチドをいう。改変形態は、例えば、ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントの共有結合の改変によるか、不溶性支持マトリックスにＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントを架橋することによるか、もしくはキャリアタンパク質にＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントを架橋することにより調製され得る。
【００４７】
本発明の範囲内のＭＮＴＦ１ペプチドアナログは、抗原性についてＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントに関連する。抗原性について関連する２つのペプチドは、免疫学的な交差反応性を示す。例えば、第一のペプチドに対する抗体はまた、第二のペプチドを認識する。
【００４８】
本発明の範囲内のＭＮＴＦ１ペプチドアナログは、異種タンパク質に結合されるＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントを含む、融合タンパク質であり得る。異種タンパク質は、ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントとは実質的に同じではないアミノ酸配列を有する。この異種タンパク質は、ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントのＮ末端もしくはＣ末端に融合され得る。融合タンパク質としては、ポリＨｉｓ融合物、ＭＹＣ標識融合物、Ｉｇ融合物および酵素融合物（例えば、β−ガラクトシダーゼ融合物）が挙げられるが、これらに限定されない。かかる融合タンパク質、特に、ポリＨｉｓ融合物は、組換えＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントの精製を容易にすることができる。
【００４９】
ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインのペプチド模倣物もまた、本発明により提供され、そして例えば、ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメインを含むタンパク質の機能の阻害による、神経細胞の生存能力および増殖の調節のための薬物として作用し得る。ペプチド模倣物は、模倣されたそれらのペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬物を含むことが、薬学産業において一般的に理解されている。例えば、Ｆａｕｃｈｅｒｅ Ｊ．、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；およびＥｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）において、当業者に公知のペプチド模倣物の設計の原理および実施が記載されている。
【００５０】
治療用に有用なペプチドと構造上の類似性を有するペプチド模倣物は、等価の治療効果もしくは予防効果を生成するために使用され得る。典型的に、このようなペプチド模倣物は、所望の特性（例えば、インビボにおける化学的な分解に対する耐性）に改変し得る結合によって必要に応じて置き換えられる、一つ以上のペプチド結合を有する。このような結合としては、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−が挙げられ得る。ペプチド模倣物は、特に所望される治療剤としてのそれらの用途を生む、上昇した薬理学的特性（生物学的半減期、吸収率など）、異なる特異性、上昇した安定性、生成の節約性、低下した抗原性などを示し得る。
【００５１】
ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／もしくはＦＳＲＹＡＲドメイン模倣分子または結合分子の合理的な設計は、模型の（または実験的に決定された）ペプチド構造に基づき、当業者によって合理的な薬物設計の公知の方法を用いて、実施され得る。合理的な薬物設計の目的は、生物学的に活性なポリペプチドまたは標的化合物の構造類似物を生成することである。そのような類似物を作製することによって、天然の分子よりもより活性が高いか、または安定である薬物を作製することが可能である。そのような類似物は、変化に対する異なった感受性を有するか、または種々の他の分子の機能に影響し得る。１つのアプローチにおいて、標的分子またはそのフラグメントのための３次元構造が作製される。これは、Ｘ線結晶学、コンピューターモデリング、または両方のアプローチの組み合わせによって達成され得る。
【００５２】
（作製の方法）
本発明のＭＮＴＦペプチド組成物が、当該分野で周知の方法によって作製され得ることが理解される。それらの方法としては、固相合成による化学合成およびＨＰＬＣによる化学反応の他の生成物からの精製、またはインビトロ翻訳系または生存細胞における本発明のＭＮＴＦペプチドを含有するペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）の発現による生成が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、この組成物のＭＮＴＦペプチドは、単離され、大量に透析されて１種またはそれ以上の所望されない低分子量分子を除去し、および／または、所望されるビヒクルへのより迅速な処方のために、凍結乾燥される。さらなるアミノ酸、変異、化学的改変などは、たとえＭＮＴＦペプチド成分中で作製されるにせよ、好ましくは、ＭＮＴＦドッキング配列のレセプター識別を実質的に干渉しない。
【００５３】
本発明のＭＮＴＦ１の１以上のフラグメントに対応するペプチドまたはポリペプチドは、概して、少なくとも５または６アミノ酸残基長であるべきであり、約７残基、約８残基、約９残基、約１０残基、約１１残基、約１２残基、約１３残基、約１５残基、約２０残基または約３０残基くらいまで含み得る。ペプチド配列は、当業者に公知の方法によって合成され得る。例えば、自動化ペプチド合成機械（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から利用可能）を用いたペプチド合成である。本発明はさらに、環式ペプチド（例えば、下記の表１に示すような（配列番号１）および（配列番号６）に由来するペプチド）の合成および使用を提供する。
【００５４】
共有結合修飾は、標的のアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化薬と反応させることによって、ペプチド中に導入され得る。有機誘導体化薬を用いるポリペプチドの共有結合修飾は、当業者に周知である。例えば、システイン残基は、α−ハロアセテート（および対応するアミン）（例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）と反応し得、カルボキシメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を生じ得る。ヒスチジン残基は、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．０においてジエチルピロカーボネートと反応させることによって、またはｐＨ６において１Ｍカコジル酸ナトリウム中のブロモフェナシルブロマイド（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎａｃｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ）と反応させることによって、誘導され得る。リジン（ｌｙｓｉｎｙｌ）残基およびアミノ末端残基は、コハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応し得る。アルギニン残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬との反応によって改変され得、それらの試薬は、中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロへキサンジオン、およびニンヒドリンである。分光標識は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、チロシン残基中に導入され得る；最も一般的には、Ｏ−アセチルチロシル類および３−ニトロ誘導体を形成するために、それぞれＮ−アセチルイミジゾル（ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌ）およびテトラニトロメタンが用いられる。カルボキシル側基（ｓｉｄｅ ｇｒｏｕｐ）（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）（例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３（４アゾニア（ａｚｏｎｉａ）４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド）との反応によって、選択的に改変され得る。さらに、アスパルギン酸残基およびグルタミン残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギン残基およびグルタミン残基に変換される。グルタミン残基およびアスパラギン残基は、対応するグルタミン残基およびアスパルギン酸残基に脱アミド化され得る。他の改変としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリン（ｓｅｒｙｌ）残基またはスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、ならびにいくつかの例においては、Ｃ−末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００５５】
本発明はさらに、アッセイおよびアッセイのためのキットにおける使用のための新規のＭＮＴＦペプチドアナログ（それらは、遊離形態またはキャリア分子（例えば、タンパク質または固体粒子）に結合する形態のいずれでもよい）ならびに、標識またはトレーサー（例えば、ビオチンもしくはフルオレセインイソチオシアネート）に結合する改変ペプチドを提供する。
【００５６】
ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントの水不溶性支持マトリックスへの架橋は、当該分野で周知の二官能性薬を用いて、実施され得る。それらの二官能性薬としては、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、ホモ二官能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステル（例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））が挙げられる）、および二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）が挙げられる。二官能性薬（例えば、メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート（ｐｒｏｐｉｏｉｍｉｄａｔｅ）は、光の存在下において架橋を形成することが可能である、光活性化可能中間体を産生する。あるいは、反応性水不溶性マトリックス（例えば、臭化シアン活性型炭水化物）は、タンパク質の固定化のために用いられ得る。
【００５７】
ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントの第二のタンパク質（第二のＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントを含む）への架橋は、本明細書に記載の二官能性試薬を用いて実施され得る。別の代替物には、挿入されたスペーサー（例えば、ジチオール基またはジアミノ基または複数のアミノ酸残基（例えば、グリシン））が存在する。このスペーサーはまた、ホモ二官能性架橋剤またはヘテロ二官能性架橋剤（例えば、ヘテロ二官能性架橋剤であるＮ−（４−カルボキシ−シクロヘキシル−メチル）−マレイミド）であり得る。
【００５８】
ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントに対する抗体は、当該分野で周知の方法によって調製され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと）。広範な範囲の動物種が、抗体の作製のために用いられ得る。抗体の作製のために用いられる動物は、代表的には、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットおよび／またはヤギである。抗血清は、種々の適用に用いられ得る。あるいは、所望される抗体分画は、周知の方法によって精製され得る。その方法は、例えば、別の抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィーおよびプロテインＧクロマトグラフィー、および固体マトリックスに結合するペプチドを用いるクロマトグラフィーである。
【００５９】
免疫学的交差反応性は、当該分野で周知の標準的な免疫学的アッセイを用いて決定され得る。例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は、ＭＮＴＦ１ペプチドアナログを、マイクロタイタープレートのウェル表面上に固定化し、次いで固定化されたＭＮＴＦ１ペプチドアナログを、ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントに対する抗体と接触させることによって実施され得る。結合していない抗体および非特異的に結合した抗体を除去するための洗浄の後に、結合した抗体が検出され得る。最初の抗体が検出可能なレベルで結合する場合、結合した抗体は、直接的に検出され得る。あるいは、結合した抗体は、一次抗体に対する結合親和性を有する二次抗体を用いて、二次抗体が検出可能なレベルで結合した状態で検出され得る。
【００６０】
より長いペプチドまたはポリペプチド（例えば、融合タンパク質）は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって生成され得る。例えば、ＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントは、既に異種タンパク質を含む市販の発現ベクター中にクローニングされ得、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で異種タンパク質に融合するＭＮＴＦ１ペプチドフラグメントとなる結果を伴う。
【００６１】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチドをコードする核酸および／または本明細書中に記載される構成要素は、例えば、本発明の種々の組成物および方法のためのペプチドを、インビトロまたはインビボで生成するために用いられ得る。例えば、特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチドをコードする核酸は、例えば、組み換え細胞中のベクターの構成要素である。その核酸は、ＭＮＴＦペプチド配列を含むペプチドまたはポリペプチドを生成するために発現され得る。そのペプチドまたはポリペプチドは、細胞から分泌され得るか、またはその細胞の一部であるかもしくはその細胞内に存在し得る。
【００６２】
（組成物）
本発明に従う薬学的組成物は、好ましくは、１つまたはそれ以上の本発明のＭＮＴＦ１ペプチドアナログを、薬学的に受容可能な希釈剤および／またはキャリアと一緒に含有する。適切なキャリア／希釈剤は、当該分野で周知であり、生理的食塩水または他の無菌の水性媒体を含み、必要に応じて、さらなる成分（例えば、緩衝塩、防腐剤、または砂糖、デンプン、塩、もしくはこれらの組み合わせ）を含む。
【００６３】
本発明の薬理学的組成物は、不活性な無毒性薬学的「キャリア」部分と共に認められた方法論に従って、哺乳動物被験体および、特にヒト被験体において所望される生理的活性を生成するために十分な無毒性濃度において、１以上のＭＮＴＦペプチドアナログを取り込むことによって、従来の投与単位形態中で調製される。好ましくは、この組成物は、生物学的に活性であるが無毒性の濃度（例えば、一投与単位あたり（例えば、被験体の体重１ｋｇあたり）、およそ５ｎｇ〜５０ｍｇの活性成分の濃度）中に活性成分を含有する。利用される濃度は、例えば、成分の全体的な特異的生物学的活性、所望される特異的生物学的活性、ならびに被験体の状態および体重のような因子に依存する。
【００６４】
使用される薬学的キャリアまたは薬学的ビヒクルは、例えば、固体または液体であり得、種々の薬学的形態が使用され得る。従って、固体キャリアが使用される場合、その調製物は、そのまま製粉され得るか、油中に微粉にされ得るか、錠剤にされ得るか、硬質ゼラチン中にか、または微粉化された粉末もしくはペレットの形態の腸溶性コートのカプセル中に配置されるか、またはトローチ、ロゼンジ剤もしくは坐薬の形態に配置される。この固体キャリアはまた、ＭＮＴＦペプチドアナログを含み、使用前に挽き砕かれ得る。
【００６５】
液体キャリア中で使用される場合、その調製物は、液体の形態中（例えば、アンプル、または水性懸濁剤もしくは非水性液体懸濁剤）であり得る。局所投与のために、その活性成分は、無刺激性の保湿基剤（例えば、軟膏またはクリーム）を用いて処方され得る。適切な軟膏基剤の例としては、ワクセリンを添加した揮発性シリコン、ラノリン、および水中油型エマルジョン（例えば、Ｅｕｃｅｒｉｎ（登録商標）（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ）が挙げられるが、これらに限定されない。適切なクリーム基剤の例としては、Ｎｉｖｅａ Ｃｒｅａｍ（登録商標）（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ）、コールドクリーム（ＵＳＰ）、Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｃｒｅａｍ（登録商標）（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）、親水性軟膏（ＵＳＰ）、およびＬｕｂｒｉｄｅｒｍ（登録商標）（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
さらに、本発明に関して、その活性成分は、作用する運動ニューロンの部位においてか、またはその部位近くで、内部で適用され得る。例えば、好ましくは、持続放出様式において、活性成分の放出を可能にするための十分な浸透性を有する固体媒体またはゲル状媒体が、このような内部適用のために利用され得る。そのようなゲルの例としては、ヒドロゲル（例えば、ポリアクリルアミド、アガロース、ゼラチン、アルギン酸塩、または他の多糖ガム）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、この活性成分は、固体材料（例えば、フィルター紙）中に包埋され得、それは、適切な時間および位置において、活性成分の吸収および持続的な放出を可能にする。
【００６７】
本発明に従うＭＮＴＦペプチドは、投与のプロトコルおよび／または患者の必要性に適した、任意の適切な形態における使用のために提供され得る。
【００６８】
上で言及した薬学的に受容可能な組成物の他に、このペプチドは、例えば、凍結乾燥した（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）固体形態もしくはフリーズドライした（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｉｅｄ）固体形態のどちらかで、単独もしくは組み合わせのどちらかで提供され得る。
【００６９】
（使用の方法）
ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／またはＦＳＲＹＡＲドメインを含む短縮ＭＮＴＦ分子（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７）、ならびに「最小限の」ＷＭＬＳＡＦＳドメインおよび／またはＦＳＲＹＡＲドメインを構成する他の低分子ペプチド誘導体は、ＭＮＴＦ１−Ｆ６ ３３マーによって示される神経栄養機能および神経親和性機能を保持することが、本明細書中で実証される。これらＭＮＴＦペプチドアナログは、ＭＮＴＦ１の高いレベルの発現によって生成される同じ生物学的シグナルを提供することによって、神経細胞株の細胞増殖を誘導する（ＭＮＴＦ１は、インビトロおよびインビボで運動ニューロンの生存能力および軸索再生を、選択的に高めることが示されている）。このような薬剤は、新規の分類の神経栄養性薬および神経親和性薬を含む。
【００７０】
ＭＮＴＦ１および／またはそのペプチドアナログは、インビトロで哺乳動物の運動ニューロンの生存を促進し、ＶＳＣ４．１細胞株（運動ニューロンと神経芽細胞腫細胞との間のハイブリッド）の増殖を刺激する。従って、本発明は、神経細胞培養のための増殖因子／サプリメントとしてのＭＮＴＦペプチドアナログの使用を提供し、インビトロで、上に定義されたようなＭＮＴＦペプチドアナログの有効量と共に神経細胞を培養することによって、神経の初代培養物の生存を促進するか、または神経細胞株の細胞増殖を刺激するための方法を含む。
【００７１】
外科的に軸索切断されたラットの末梢神経に対するＭＮＴＦ１のインビボ投与は、未処置のコントロールよりも、顕著に高いパーセンテージの生存する運動ニューロンを生じ、この投与は、抗ＭＮＴＦ１モノクローナル抗体の同時投与によって、遮断され得る。ＭＮＴＦ１のさらなる有益な効果は、脊髄半側切除に供されたラットが、末梢神経の自己移植によって修復され、脊髄との神経移植片接合部のごく近くに、ＭＮＴＦ１含有ゲル切片を移植されて、実証された。ＭＮＴＦ１処置動物は、より多数の生存運動ニューロンを示し、運動機能および感覚機能の回復を改善された。さらに、以下の実施例でより詳細に記載された大腿神経モデルにおいて実証されたように、切除され、縫合されたラット大腿神経のＭＮＴＦ１ペプチドを用いた処置は、インビボの筋肉組織を標的とする運動ニューロンの適正な投射の顕著な増加、および皮膚への不適切な投射の数の顕著な減少を生じた。従って、本発明のＭＮＴＦ１ペプチドは、標的筋肉組織の選択的な神経再支配を促進することが可能である。
【００７２】
従って、本発明は、損傷を受けた運動ニューロンもしくは罹患した運動ニューロン、または病理学的状態（例えば、神経変性疾患など）を処置するための治療方法または予防方法を提供し、その治療方法または予防方法は、神経細胞の生存能力および／または軸索再生を特異的に促進し得る治療薬の有効量を投与することによって達成される。治療指示または予防指示は、以下の神経学的状態の（重症度の阻害および／もしくは重症度の減少）の処置を含み得る：
ａ）神経系に対する急性損傷傷害、亜急性傷害または慢性傷害であって、外傷性、化学的、血管傷害および欠損（例えば、脳卒中に起因する虚血）、感染性傷害／炎症性傷害および腫瘍に誘導された傷害を共に含む、傷害、
ｂ）神経系の老化、
ｃ）神経系の慢性免疫疾患または神経系に影響する慢性免疫疾患（多発性硬化症を含む）、
ｄ）神経系の慢性神経変性疾患および筋骨格障害（遺伝性運動ニューロン疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症）を含む）；
ｅ）末梢神経傷害、脊髄傷害および頭部傷害、
ｆ）末梢ニューロパシー、糖尿病性末梢ニューロパシー、ＡＩＤＳに起因する末梢ニューロパーシー、癌に対する放射線療法に起因する末梢ニューロパシー。
【００７３】
ＭＮＴＦ１の投与はまた、ラット脊髄の外科的切開および修復後、瘢痕形成の減少および炎症の減少に関連している。さらに、組み換えＭＮＴＦ１は、インビトロの脊髄の外植片中の非神経細胞（例えば、グリア細胞および繊維芽細胞）の増殖における顕著な減少に関連していた。従って、別の態様において、本発明は、抗増殖性薬（特に、抗炎症薬または抗繊維性（ａｎｔｉｆｉｂｒｏｔｉｃ）薬）としての使用のために、新規のＭＮＴＦペプチドアナログおよび、それらからなる組成物またはそれらを含有する組成物を提供する。さらに、本発明はまた、非神経細胞（特に、繊維芽細胞および炎症細胞）の増殖ならびに、または移動を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞培養物（より詳細には、過剰増殖の瘢痕組織もしくはケロイド繊維芽細胞）に対して、または哺乳動物宿主中の傷害部位および／もしくは瘢痕部位に対して、ＭＮＴＦペプチドアナログを投与することによって阻害する方法である。本発明はまた、そのような新規のＭＮＴＦペプチドアナログおよび、それらからなる組成物またはそれらを含む組成物を、創傷治癒および美容的適用の用途のために提供する。
【００７４】
本発明のＭＮＴＦペプチドは、従って、容易に薬理学的適用に利用され得る。インビボ適用は、哺乳動物被験体および、特にヒト被験体への、この因子の投与を含む。結果として所望される細胞への治療薬の送達となる任意の投与様式は、本発明の範囲内であると企図される。投与の部位および細胞は、処置される特定の障害の理解に基づいて、当業者によって選択される。薬学的投薬および薬物の送達の原理は、公知であり、例えば、Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．およびＰｏｐｏｖｉｃｈ，Ｎ．Ｇ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，第５版，Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９９０）に記載されている。
【００７５】
本明細書に記載される任意の方法での本発明のペプチドの投与は、任意の適切なプロトコルによってであり得る。投与の特定の様式はまた、当業者によって容易に選択され得、例えば、作用される部位においてか、またはその近くでの局所適用である好ましい様式により、経口、静脈内、皮下、筋肉内などが挙げられ得る。加えて、投薬量、投薬頻度、および処置の経過の長さは、処置される特定の変性障害に依存して、当業者によって決定され得、そして最適化され得る。本発明のペプチドのこのような投与は、意図される部位におけるペプチドの活性の、所望される有効な結果を与えるような量である。従って、「有効（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」量を構成する量は、種々のパラメータ（例えば、患者の体重、必要とされる活性の程度、意図される活性の部位、処置されるか、または予防される状態の重症度）に依存し得、それらのすべては、当業者によってよく理解され、認識される。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」は、作用される部位に十分に近い神経細胞もしくは組織または非神経細胞もしくは組織への精製されたペプチドの適用を含み、このポリペプチドは、哺乳動物神経の生存能力および／または非神経細胞（例えば、繊維芽細胞もしくは炎症性細胞）の減少した増殖または浸潤の促進において有効である。
【００７７】
なおさらなる態様において、本発明は、上に定義されたＭＮＴＦペプチドアナログ（詳細には、本発明の結合したペプチドアナログ）を提供する。これは、ＭＮＴＦ１に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生成のための免疫原としての使用のためのものであり、特に、診断用途、予後用途および治療用途のためのものである。このようなポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生成の方法はまた、本発明の範囲内である。
【実施例】
【００７８】
本発明は、一定の態様において、以下の実施例の参照とともに認識され得、この実施例は限定されるためではなく例示のために提供される。
【００７９】
以下の実施例中で作製される参照の材料、試薬などは、特に示されない限り、商業的供給源から入手できる。
【００８０】
（実施例１−ＭＮＴＦバイオペプチドについての生成手順）
この実施例は、ＭＮＴＦペプチドを製造する方法を示す。
【００８１】
１．）合成−すべてのペプチドを、ＣＳ５３６ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＣＳ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を用いたｔ−Ｂｏｃケミストリを介して合成した。Ｂｏｃ基の脱保護を、塩化メチレン中の４０％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を用いて実施した。カップリング反応を、ジイソプロピルカルボジイミド（ｄｉｉｏｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ＤＩＣ）を用いて２時間実施した。各カップリングサイクルの完了時にカップリング効率を確認するために、カイザー試験（ニンヒドリンベース）を実施した。
【００８２】
２．）次いで、ＨＦ（フッ化水素）を用いて、このペプチドを樹脂から切り離した。ＨＦ反応の後、次いでこのペプチドをＴＦＡと共に抽出した。次に、精製プロセスの前に正確な重量を得るために抽出した材料を凍結乾燥した。
【００８３】
３．）次いで、逆相Ｃ１８樹脂を詰めたＨＰＬＣカラム上に、粗製ペプチドをロードした。緩衝液Ａ（０．１％ ＴＦＡ（Ｈ２Ｏ中））から緩衝液Ｂ（６０％ アセトニトリル（０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中））への勾配に流し、溶出物の分画を回収した。結果として生じた分画を、分析用ＨＰＬＣによって分析し、純度＞９５％の適切な材料を含む分画をプールし、凍結乾燥した。
【００８４】
４．）次いで、このペプチドを凍結させ、凍結乾燥した。最終の凍結乾燥プロセスの後に、このペプチドを、ＨＰＬＣ純度および質量スペクトル立体構造について、ＣＳ Ｂｉｏにて確認した。
【００８５】
（実施例２−ＭＮＴＦ誘導体のインビトロアッセイ）
（導入）
運動ニューロンの機能の研究は、運動ニューロンの機能を模倣する細胞株の開発により発展してきた。感覚性−Ｆ１１神経芽細胞腫細胞、運動性−ＶＳＣ４．１神経芽細胞腫細胞、およびアドレナリン作動性−Ｎ１Ｅ−１１５神経芽細胞腫細胞、ならびにシュワン細胞を含むいくつかの神経細胞株は、プログラムされた細胞死（ＰＣＤ）もしくはアポトーシスをインビトロで検出するため、および／または増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、および分化におけるニューロパシーを有する筋萎縮性側索硬化症患者もしくは糖尿病患者に由来する血清の阻害効果を検出するための神経モデルとして用いられている。特に、ＶＳＣ４．１細胞株は、Ｓｔａｎｌｅｙ Ａｐｐｅｌ博士によって開発された運動ニューロンと神経芽腫細胞との間のハイブリッドであり、筋萎縮性側索硬化症の病原の研究において広く用いられている（Ｋｉｍｕｒａ Ｆら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３５：１６４−１７１，１９９４；Ｓｍｉｔｈ ＲＧら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ ９１：３３９３−３３９７，１９９４；Ａｌｅｘｉａｎｕ ＭＥら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６３：２３６５−２３６８，１９９４；Ａｐｐｅｌら，Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３：３６８−３７４，１９９５−１９９６；およびＭｏｓｉｅｒ ＤＲら，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ３７：１０２−１０９，１９９５（これらの全ては出典明示により本明細書中に援用される））。従って、ＶＳＣ４．１細胞は、運動ニューロパシーの病原の試験において、および全身性因子を考える場合に、細胞を損傷から保護し得る因子の試験に有用である。
【００８６】
この実施例は、特定の短縮ＭＮＴＦペプチドが、ＭＮＴＦ１ ３３マーと比較できる方法で、ＶＳＣ４．１細胞の増殖を刺激することを示す。これらの増殖効果は、運動神経の喪失をブロックするか、または逆転させるＭＮＴＦの能力に関し得る。
【００８７】
（方法）
増殖の実験を、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からの細胞増殖アッセイキットを利用して、９６ウェルプレートにて行った。ＶＳＣ４．１細胞（運動ニューロン／神経芽細胞腫細胞ハイブリッド）を、ＭＮＴＦを含まないか、または１０−８ｇ／ｍｌ〜１０−５ｇ／ｍｌの用量範囲のＭＮＴＦを含むかのいずれかである２％ＦＢＳを含有したＤＭＥＭ中で培養した。３つのウェルに、各処置を適用した。この細胞を２１時間培養し、このアッセイキットからの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を、各ウェルに加えた。３時間のＢｒｄＵ標識の後、細胞を洗浄し、固定して乾燥させた。次いで、細胞を固定し、ＤＮＡを変性させて、その後の抗体結合への対応を向上させた。アッセイキットからのＰＯＤ標識したマウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体を、２時間適用し、続いて洗浄した。比色アッセイ溶液（テトラメチルベンジジン）を加え、Ｗａｌｌａｃ Ｖｅｃｔｏｒ ２プレートリーダーにて４５０ｎｍで読み取ることにより、このアッセイを定量化した。同じプレート上で０〜２０，０００細胞／ウェルの勾配の細胞でプレートしたウェルとの比較により、処理群の細胞を定量化した。プレートごとの変動を考慮するために、データをコントロールの％として表す。
【００８８】
（結果）
以下の表は、別の機会（１０−２７−０２、３−２８−０３および８−４−０３）に行われた細胞増殖アッセイの３つのセットの結果をまとめたものである。
【００８９】
【表８】
【００９０】
提供された他のペプチドのうちで、このアッセイにおいて最も有効なものは、ＧＬＰグレードのＭＮＴＦ ３３マーであり、これは１００ｎｇ／ｍｌの用量でも３４．３％の最大反応を刺激した（図２）。他のペプチドのうち、ＭＮＴＦ ６マーおよびＭＮＴＦ １１マーは比較的有効であり（図２）、それぞれ３５．１％および３２．２％の最大反応を達成した。これらの反応はまた、試験した最も高い用量（１０μｇ／ｍｌ）において見られた。このＭＮＴＦ ７マーは、１μｇ／ｍｌの用量において２５．１％の最大効果を有し、若干有効性は低いが（図２）、このペプチドは他の調製物より広範な活性用量範囲を示した。この環式ＭＮＴＦ １３マーペプチドは、試験した全てのペプチドの中で最も有効性が低く、１μｇ／ｍｌで１７．３％の最大効果を示した（図２）。さらに、より高い用量において、環式ＭＮＴＦ １３マーペプチドは増殖を阻害するように見えた。
【００９１】
これらの予備実験において報告されたパーセンテージの増加は高くなかったが、このことは、基礎条件下で、これらの細胞の高増殖速度に起因する可能性が高かった。記載によると、ＭＮＴＦペプチドアナログは、そのペプチドの環式バージョンを除き、用量依存様式で比較的有効なように見える。試験されたペプチドのうち、ＧＬＰグレードの３３マー（配列番号１）が、このアッセイにおいて最も生物学的に活性であり、高い増殖速度をもたらし、低い用量を誘導のために必要とした。研究グレードの６マー（配列番号２）および１１マー（配列番号５）は、各々と比べてだけでなく、ＭＮＴＦ ３３マーと比べても有効であった。環式１３マー（配列番号４）は、他の誘導ペプチドよりも、顕著に有効が低かった。さらに、環式ＭＮＴＦ３３マーペプチドは、低用量で、非常に弱い増殖活性を示した。
【００９２】
本質的に上に記載されたように行われた、さらなる細胞増殖アッセイを実施し、いくつかのＧＬＰグレードのＭＮＴＦペプチドの効果を比較した。
【００９３】
このアッセイのために利用したＭＮＴＦ調製物は、以下：
【００９４】
【化１】
であった。
【００９５】
表１および図３で示すように、すべてのＭＮＴＦペプチド調製物は、異なった程度ではあるが、ＶＳＣ４．１細胞における増殖効果を発揮した。全体の用量範囲にわたって最も強力な調製物は、７マーであり、適用された最も低い用量でさえ２．５倍の増加を示した一方、最も高い用量で、ほぼ３．５倍の増殖の増加を発揮した。１３マーは、最も低い用量において、いくらかの効力を示したが、この効果はより高い用量においては低下した。２種の３３マーは、投薬量の増加とともに、安定した反応の増加を示し、研究グレードの３３マーは、最も高用量において約３倍の増加で最高点に達した一方、ＧＬＰグレードは、１０μｇ／ｍｌにおいてピークである３倍反応に達し、投薬量の増加とともにさらに増加することはなかった。このアッセイのセットにおいて、より強さの劣る動作物は、６マーおよび１１マーであった。これらの調製物は、１μｇ／ｍｌにおいて、ほぼ２．５倍の増殖の増加を刺激したが、用量範囲全体にわたる能力は、ＭＮＴＦの他のアイソフォームよりは強力でなかった。
【００９６】
第二回目の実験において、このアッセイ全体はより強く、最も活性の高い増殖剤である７マーを用いて、コントロールから３５０％の増加をもたらした。提供された６つのＭＮＴＦアイソフォームのうちの４つは、２５０％またはそれを超えるＶＳＣ４．１細胞の増殖を刺激した。しかし、これらのうちの１つの１３マーは、一回の投薬のみにおいて、増殖を刺激した。他の２つのＭＮＴＦアイソフォーム（すなわち、６マーおよび１１マー）は、増殖を刺激したが、他と比べてより有効性が低かった。相対的効力は、以下のとおりである：７マー（配列番号３）＞３３マー（配列番号１）＞＞６マー（配列番号２）、１１マー（配列番号５）＞１３マー（配列番号６）。
【００９７】
本質的に上に記載されるように、さらなる細胞増殖研究を実施し、運動ニューロン／神経芽細胞腫細胞の、３つの新規のＭＮＴＦ調製物に対する反応を試験した。これらのアッセイのために利用したＭＮＴＦ調製物は、以下：
１４５６ ３３マー
１５９７ １０マー
１６１６ ２１マー
であった。
【００９８】
表１および図４に示すように、コントロールを超えるパーセンテージ増加として表される場合、３つのＭＮＴＦアイソフォームの全ては、ＶＳＣ４．１細胞増殖を有意に刺激した（ＡＮＯＶＡで、示されるように）。さらに、１０マー、２１マーおよび３３マーは、有意に（ｐ＜０．０５）、特定の用量においてコントロールを超える増殖を刺激した。３３マー：ｐ＜０．０２。１０マー：ｐ＜０．００１。２１マー：ｐ＜０．００２。
【００９９】
以前の実験におけるように、アッセイ全体は強力であった。最も活性な増殖剤は、１０マーであるように見え、用いられた３つの最も低い用量において、コントロールを超えておよそ２００％の増加をもたらす（ｐ＜０．００５，ＡＮＯＶＡ）。これら３つの用量のすべては、コントロールと有意に異なる（テューキー−クレーマー事後分析）。３３マーは、低い用量で、１０マーとほとんど同様（１０−９ｇ／ｍｌおよび１０−８ｇ／ｍｌ、テューキー−クレーマー事後分析によって有意）に、細胞増殖を刺激し（ｐ＜０．０１，ＡＮＯＶＡ）、より高い用量では１０マーの反応にほぼ近かった。２１マーは、増殖を有意に刺激した（ｐ＜０．０５，ＡＮＯＶＡ）一方、コントロールを超えた増加は、他の２つのＭＮＴＦアイソフォームの約半分であって、いずれの用量においても有意には異ならなかった。しかし、高い用量においては、３つすべてに対する反応は、同様であった。
【０１００】
従って、３つのＭＮＴＦのアイソフォームのすべては、運動ニューロン増殖を有意に刺激するが、１０マー（配列番号４）および３３マー（配列番号１）は、明らかに２１マー（配列番号７）より優れていた。これらのパーセンテージ反応は、以前のアッセイにおいてよりもいくらか低いように見えるが、このことは、アッセイ間の変動性に起因し得、培養における異なる細胞継代の異なる活性によって引き起こされた可能性がある。
【０１０１】
（実施例３−神経栄養活性についてのインビボアッセイ）
（大腿神経モデル）
運動軸索再生の特異性をラットの大腿神経で調べた。近位で、神経切断および縫合の部位の近くで、皮枝および筋枝の両方に寄与する軸索は、この神経全体にわたって交錯する。これらの軸索が再生する場合、それらは、遠位の神経断端において近接する運動シュワン細胞管および感覚シュワン細胞管への等しい接近を示す。このことは、軸索レベルにおける、「選択」の要素を確信させる。遠位で、再生の特異性が測定される場合、軸索を末端の皮膚枝および筋肉枝に分けられる。運動軸索は、通常、筋枝中でのみ見出され、皮枝のいずれの運動神経再生も経路探索の失敗を表す。軸索再生の特異性は、大腿枝に対するセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびもう一方に対するフルオロ−ゴールド（ＦＧ）の同時適用により評価される。運動軸索の再生は、３週においてはランダムであるが、筋肉に対する適正な投射の数は、その後において劇的に増加する。多くの神経は、最初に両方のトレーサーを含み、それにより皮枝および筋枝の両方に対する側枝を投射する。これらの二重標識された神経の数は時間と共に減少する。従って、運動軸索側枝は、皮枝から除かれ、二重標識された神経を犠牲にして、筋肉に対する適正な投射の数が増加する。従って、再生する運動軸索と筋肉および／または本発明者らがＰｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ（ＰＭＲ）と名付けた筋肉神経との間で特異的な相互作用が生じる。
【０１０２】
（ＭＮＴＦポンプ実験）
予備実験において、本発明者らは、少なくとも２週間排出するＡｌｚｅｔ浸透圧ポンプを用いて、修復部位上にＭＮＴＦ ３３マーを１０−４Ｍでポンピングすることによって、大腿神経中の運動軸索再生を改変することを試みた。ポンプの出口は、修復する神経に隣接した筋肉に縫い付けられ、その神経創傷は、継続的にこの因子をあびた。遠位の大腿の皮枝および筋枝の再神経支配を、上に記載されたようなトレーサーを用いて定量した。
【０１０３】
これらの予備実験のためのコントロールは、再生の３週間後に、慣用的な縫合および評価を受けた１０個の神経の群であった。平均９２個の運動ニューロンが、３週において、筋肉に対して適正に投射したが、一方で、多数（平均１１７）は、皮膚に対して不適切に投射した。しかし、３匹の動物におけるＭＮＴＦ ３３マー処置は、適正な投射の数を二倍以上（平均＝２１０）にした一方、皮膚への不適切な投射の数を劇的に減少させた（平均＝３１）。これらの違いは、試験した動物の数が少ないにもかかわらず、非常に顕著であった。
【０１０４】
追跡実験において、ＭＮＴＦ ３３マーを、本質的に上に記載のように、８個の切断し、縫合したラット大腿神経に対して、１０−４Ｍで投与した。コントロールは、慣用的な縫合を受け、ＭＮＴＦでなく生理的食塩水を送達するポンプを用いた６個の神経の群であった。６つのコントロールにおいて、平均１００個の運動ニューロンは、適正に投射した一方、平均８７個の運動ニューロンは、皮膚に対して不適切に投射した。ＭＮＴＦ処置は、適正な投射の顕著な増加（平均＝１７３）および皮膚への不適切な投射の数の著しい減少（平均＝５９）という結果を再度もたらした。
【０１０５】
短縮ＭＮＴＦペプチドを、ＭＮＴＦ ３３マーと置換し得るかを決定するために、本質的に上に記載のとおり、１０−４Ｍ（ｎ＝８）、１０−５Ｍ（ｎ＝８）および１０−６Ｍ（ｎ＝８）でＭＮＴＦ ６マーＦＳＲＹＡＲを用いて、比較のための合計２２個の生理的食塩水コントロールと共に、その後の実験を実施した。図５に示すように、ＦＳＲＹＡＲペプチド（配列番号２）を用いた処置は、試験したすべての用量において、適正な投射の顕著な増加、ならびに皮膚への不適切な投射の数の著しい減少という結果となった。生理的食塩水のコントロールについて、適正に筋肉に対して投射した細胞の平均数は８５個であり、皮膚に対する不適当な投射の平均数は８５であり、そして二重標識された神経は、平均で約４１個であった。最適用量のＭＮＴＦ ６マー（１０−４Ｍ）において、適正な投射の平均数は１２５個まで増加し、不適切な投射の平均数は４６個まで減少し、そして二重標識した神経の平均数は２３個まで減少した。従って、６マーは、ＭＮＴＦ１ ３３マーと類似した様式で、標的筋肉の選択的な再神経支配を促進することが可能である。
【０１０６】
これらの結果は、ＭＮＴＦ ３３マー、およびＭＮＴＦ ６マーペプチドであるＦＳＲＹＡＲ（配列番号２）を用いた、ラット大腿神経モデルにおける再生の劇的な刺激を実証する。本発明者らは、この顕著な効果を示す他のモデルからのデータを知らない。ほとんどの操作は、せいぜい２０〜３０％の変化という結果であるが、一方、これらの結果は、３６％〜１００％を超える変化を示す。このような劇的な結果は、ＭＮＴＦおよびそのペプチドアナログが、現在利用可能な末梢神経再生の最も強力な刺激因子の１つであることを示唆する。
【０１０７】
（実施例４−抗ＭＮＴＦペプチド抗体の生成および免疫アッセイにおけるそれらの使用）
ＭＮＴＦ ３３マーおよびＭＮＴＦ ６マーであるＦＳＲＹＡＲに対するウサギポリクローナル抗体を、標準的生成プロトコルに従い、Ｈａｒｌａｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）によって生成した。このプロトコルは、ウサギへの接種の前に、ＭＮＴＦペプチドとＫＬＨとを結合する工程を含んだ。より多くのＭＮＴＦペプチドを、定期的な試験採血において、ＥＬＩＳＡのためにＯＶＡと結合させ、生成物の採取の前に、高い抗体力価を確認した。次いで、このポリクローナル抗体を、ＩｇＧ精製およびアフィニティ精製によって精製した。
【０１０８】
ＭＮＴＦ競合性ＥＬＩＳＡプロトコルは、Ｇｅｎｅｔｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＬＬＣ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって開発された。これは、ＭＮＴＦペプチドの検出および測定のためのものであり、例えば、精製した抗ＭＮＴＦ ６マーを用いて、未標識のＭＮＴＦペプチド（例えば、６マーまたは１０マー）が、抗体結合についてビオチン化対応部分と競合する能力を検出する。
【０１０９】
さらに、ＭＮＴＦサンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルが開発され、抗ＭＮＴＦ ６マー抗体を用いて、６マーエピトープを含む、より大きいＭＮＴＦペプチド（例えば、２１マーおよび３３マー）を固定化した。このペプチドを、続いて、ビオチン化抗ＭＮＴＦ ３３マー抗体を用いて検出した。
【０１１０】
本発明は、それらの特定の好ましいバージョンへの参照と共にかなり詳細に記載されているが、他のバージョンが可能である。本発明は、さらなる改変が可能であり、そして本適用は、本発明のあらゆる変数、使用、または採用（本発明が属する分野内の公知の習慣または慣行の範囲内で生じるような、本開示からの逸脱を含む）を対象とすることが意図される。従って、本発明の精神および範囲は、本明細書に含まれる好ましいバージョンの記載に限定されるべきではない。
【０１１１】
本明細書中に記載される全ての刊行物は、あたかも個々の刊行物の各々が、特別かつ個別に参考として援用されることが示唆されるのと同程度に出典明示により本明細書に取り込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
６個〜３２個のアミノ酸の長さの運動神経栄養因子ペプチドアナログであって、該ペプチドアナログが:
（ａ）配列番号２；および
（ｂ）配列番号３
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、該ペプチドアナログが、運動ニューロンの生存能力を高める、ペプチドアナログ。
【請求項２】
請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログであって、ここで、該ペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号１の連続する９〜３２アミノ酸残基と少なくとも７０％同一である、ペプチドアナログ。
【請求項３】
請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログであって、ここで、該ペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号１の連続する８〜３２アミノ酸残基と少なくとも８０％同一である、ペプチドアナログ。
【請求項４】
請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログであって、ここで、該ペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号１の連続する７〜３２アミノ酸残基と少なくとも９０％同一である、ペプチドアナログ。
【請求項５】
配列番号１の連続する７〜３２アミノ酸残基に、一つ以上の保存性のアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログ。
【請求項６】
請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログであって、該ペプチドが、配列番号１の連続する６〜３２アミノ酸残基のフラグメントを含む、ペプチドアナログ。
【請求項７】
請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログであって、該ペプチドアナログが；
（ａ）配列番号２、
（ｂ）配列番号３、
（ｃ）配列番号４、
（ｄ）配列番号５、
（ｅ）配列番号６、および
（ｆ）配列番号７
からなる群より選択される、ペプチドアナログ。
【請求項８】
結合体であって、該結合体が：
（ａ）配列番号２および配列番号３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、６個〜３２個のアミノ酸の長さの運動神経栄養因子ペプチド；ならびに
（ｂ）該運動神経栄養因子ペプチドに連結された固体粒子、キャリアタンパク質もしくは標識
を含む、結合体。
【請求項９】
融合タンパク質であって、該融合タンパク質が：
（ａ）配列番号２および配列番号３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、６個〜３２個のアミノ酸の長さの運動神経栄養因子ペプチド；ならびに
（ｂ）該運動神経栄養因子ペプチドに融合された異種タンパク質
を含む、融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドアナログと、キャリアとを含有する、組成物。
【請求項１１】
運動ニューロンの生存能力および軸索の再生成を選択的に促進するための組成物であって、該組成物が、有効量の請求項１に記載のペプチドアナログと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、組成物。
【請求項１２】
標的の筋の再神経支配における使用のための組成物であって、該組成物が、有効量の請求項１に記載のペプチドアナログと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、組成物。
【請求項１３】
末梢神経傷害の処置における使用のための組成物であって、該組成物が、有効量の請求項１に記載のペプチドアナログと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、組成物。
【請求項１４】
神経変性疾患の処置における使用のための組成物であって、該組成物が、有効量の請求項１に記載のペプチドアナログと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、組成物。
【請求項１５】
創傷治癒における使用のための組成物であって、該組成物が、有効量の請求項１に記載のペプチドアナログと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、組成物。
【請求項１６】
前記有効量が、瘢痕組織の形成を減ずるために十分な量である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記有効量が、炎症細胞の増殖および浸潤を減ずるために十分な量である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
運動ニューロンの生存能力および軸索再生を選択的に促進するための方法であって、該方法が、インビボもしくはインビトロで、神経細胞に有効量の請求項１に記載のペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
損傷を受けた運動ニューロンおよび連結されているシュワン細胞のアポトーシスを減ずる方法であって、該方法が、創傷の部位に請求項１に記載のペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
線維芽細胞、マクロファージおよびリンパ球からなる群より選択される非神経細胞の増殖、生存能力もしくは移動を阻害する方法であって、該方法が、創傷の部位に有効量の請求項１に記載のペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
脊髄創傷を処置する方法であって、該方法が、該神経創傷に対する神経移植片部位に、有効量の請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
罹患している運動ニューロンと結合する筋が変性する、神経筋変性疾患を処置する方法であって、該方法が、影響を受けている部位に、有効量の請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
変性から運動ニューロンを防御する方法であって、該方法が、末梢神経傷害の部位に、有効量の請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
末梢神経障害および末梢神経障害性疼痛を軽減する方法であって、該方法が、神経障害性疼痛の部位に、請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１】
６個〜３２個のアミノ酸の長さの運動神経栄養因子ペプチドアナログであって、該ペプチドアナログが:
（ａ）配列番号２；および
（ｂ）配列番号３
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、該ペプチドアナログが、運動ニューロンの生存能力を高める、ペプチドアナログ。
【請求項２】
請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログであって、ここで、該ペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号１の連続する９〜３２アミノ酸残基と少なくとも７０％同一である、ペプチドアナログ。
【請求項３】
請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログであって、ここで、該ペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号１の連続する８〜３２アミノ酸残基と少なくとも８０％同一である、ペプチドアナログ。
【請求項４】
請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログであって、ここで、該ペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号１の連続する７〜３２アミノ酸残基と少なくとも９０％同一である、ペプチドアナログ。
【請求項５】
配列番号１の連続する７〜３２アミノ酸残基に、一つ以上の保存性のアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログ。
【請求項６】
請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログであって、該ペプチドが、配列番号１の連続する６〜３２アミノ酸残基のフラグメントを含む、ペプチドアナログ。
【請求項７】
請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログであって、該ペプチドアナログが；
（ａ）配列番号２、
（ｂ）配列番号３、
（ｃ）配列番号４、
（ｄ）配列番号５、
（ｅ）配列番号６、および
（ｆ）配列番号７
からなる群より選択される、ペプチドアナログ。
【請求項８】
結合体であって、該結合体が：
（ａ）配列番号２および配列番号３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、６個〜３２個のアミノ酸の長さの運動神経栄養因子ペプチド；ならびに
（ｂ）該運動神経栄養因子ペプチドに連結された固体粒子、キャリアタンパク質もしくは標識
を含む、結合体。
【請求項９】
融合タンパク質であって、該融合タンパク質が：
（ａ）配列番号２および配列番号３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、６個〜３２個のアミノ酸の長さの運動神経栄養因子ペプチド；ならびに
（ｂ）該運動神経栄養因子ペプチドに融合された異種タンパク質
を含む、融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドアナログと、キャリアとを含有する、組成物。
【請求項１１】
運動ニューロンの生存能力および軸索の再生成を選択的に促進するための組成物であって、該組成物が、有効量の請求項１に記載のペプチドアナログと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、組成物。
【請求項１２】
標的の筋の再神経支配における使用のための組成物であって、該組成物が、有効量の請求項１に記載のペプチドアナログと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、組成物。
【請求項１３】
末梢神経傷害の処置における使用のための組成物であって、該組成物が、有効量の請求項１に記載のペプチドアナログと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、組成物。
【請求項１４】
神経変性疾患の処置における使用のための組成物であって、該組成物が、有効量の請求項１に記載のペプチドアナログと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、組成物。
【請求項１５】
創傷治癒における使用のための組成物であって、該組成物が、有効量の請求項１に記載のペプチドアナログと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、組成物。
【請求項１６】
前記有効量が、瘢痕組織の形成を減ずるために十分な量である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記有効量が、炎症細胞の増殖および浸潤を減ずるために十分な量である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
運動ニューロンの生存能力および軸索再生を選択的に促進するための方法であって、該方法が、インビボもしくはインビトロで、神経細胞に有効量の請求項１に記載のペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
損傷を受けた運動ニューロンおよび連結されているシュワン細胞のアポトーシスを減ずる方法であって、該方法が、創傷の部位に請求項１に記載のペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
線維芽細胞、マクロファージおよびリンパ球からなる群より選択される非神経細胞の増殖、生存能力もしくは移動を阻害する方法であって、該方法が、創傷の部位に有効量の請求項１に記載のペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
脊髄創傷を処置する方法であって、該方法が、該神経創傷に対する神経移植片部位に、有効量の請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
罹患している運動ニューロンと結合する筋が変性する、神経筋変性疾患を処置する方法であって、該方法が、影響を受けている部位に、有効量の請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
変性から運動ニューロンを防御する方法であって、該方法が、末梢神経傷害の部位に、有効量の請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
末梢神経障害および末梢神経障害性疼痛を軽減する方法であって、該方法が、神経障害性疼痛の部位に、請求項１に記載の運動神経栄養因子ペプチドアナログを投与する工程を包含する、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−４２６５９（Ｐ２０１１−４２６５９Ａ）
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−２１５４３８（Ｐ２０１０−２１５４３８）
【出願日】平成２２年９月２７日（２０１０．９．２７）
【分割の表示】特願２００６−５０１０５７（Ｐ２００６−５０１０５７）の分割
【原出願日】平成１６年１月２１日（２００４．１．２１）
【出願人】（３０２０６２４０３）ジェナボン バイオファーマシューティカルズ エルエルシー (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１５４３８（Ｐ２０１０−２１５４３８）
【出願日】平成２２年９月２７日（２０１０．９．２７）
【分割の表示】特願２００６−５０１０５７（Ｐ２００６−５０１０５７）の分割
【原出願日】平成１６年１月２１日（２００４．１．２１）
【出願人】（３０２０６２４０３）ジェナボン バイオファーマシューティカルズ エルエルシー (6)
【Ｆターム（参考）】
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