ＭＴＰ活性に関する蛍光分析
【課題】自動化及び高処理量スクリーニングに利用できるＭＴＰ活性を分析する簡単かつ迅速そして高感度の方法の提供。
【解決手段】（ａ）その中に配合された蛍光ラベルされた脂質を有する供与体小胞を調製し、（ｂ）受容体小胞を調製し、（ｃ）ＭＴＰを含む細胞ホモジネートまたは受容体小胞を含む単離されたＭＴＰの何れかとラベルされた供与体小胞とを、供与体から受容体へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰによる蛍光ラベルされた脂質の結合を可能にするのに充分な時間及び条件下でインキュベートし、そして（ｄ）ＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を測定することからなるミクロソームトリグリセリド転移蛋白（ＭＴＰ）のレベルを測定する方法。
【解決手段】（ａ）その中に配合された蛍光ラベルされた脂質を有する供与体小胞を調製し、（ｂ）受容体小胞を調製し、（ｃ）ＭＴＰを含む細胞ホモジネートまたは受容体小胞を含む単離されたＭＴＰの何れかとラベルされた供与体小胞とを、供与体から受容体へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰによる蛍光ラベルされた脂質の結合を可能にするのに充分な時間及び条件下でインキュベートし、そして（ｄ）ＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を測定することからなるミクロソームトリグリセリド転移蛋白（ＭＴＰ）のレベルを測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＴＰ活性に関する蛍光分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミクロソームトリグリセリド転移蛋白（ＭＴＰ）は、アポリポ蛋白Ｂ（アポＢ）リポ蛋白のアセンブリに必要なデディケートシャペロンである（レビューでは非特許文献１−６参照）。ＭＴＰは、脂質をナセントアポＢへ小胞体中で転移させそして原始的なリポ蛋白粒子を形成することによってそれをセクレチン受容性にすると考えられている（レビューでは非特許文献１−９参照）。アポＢ分泌におけるＭＴＰの脂質転移活性の重要性は、３つの独立したアプローチにより確立されている。第一に、ＭＴＰにおける突然変異は、無βリポ蛋白質血症におけるアポＢリポ蛋白の不存在と相関している（非特許文献１０、１１）。第二に、生体外でＭＴＰの脂質転移活性を阻害する拮抗剤が、生体内でアポＢ分泌を低下させることを示している（非特許文献１２−１４）。第三に、アポＢとＭＴＰとの共発現は、アポＢ及びＭＴＰを発現しない細胞内のアポＢ分泌を助けることが立証されている（非特許文献１５、１６）。その脂質転移活性に加えて、ＭＴＰがアポＢと物理的に相互反応することが知られている（非特許文献１、２）。最近、ＭＴＰは、サイトゾルから小胞体のルーメンへのトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の移入に関係している（非特許文献１７−１９）。従って、ＭＴＰが、細胞内オルガネラ内のＴＡＧの輸送及び細胞外へのその分泌に重大な役割をはたしている多機能蛋白（非特許文献２）であると思われる。
【０００３】
ＭＴＰは、放射性同位元素分析に基づいてＷｅｔｔｅｒａｕ及びＺｉｌｖｅｒｓｍｉｔにより同定かつ精製された（非特許文献２０、２１）。この分析では、放射能ラベルされたＴＡＧは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びカルジオリピンからなる供与体小胞中に配合される。これらの小胞は、ＭＴＰの存在下受容体小胞とともにインキュベートされる。１−３時間のインキュベーション後、カルジオリピン含有供与体小胞は、ＤＥ５２に結合させられそして遠心分離によって取り出される。上清に残っている放射能活性は、シンチレーション計数により定量される。この方法は、労力を要しそして時間がかかる。負に電荷された脂質例えばカルジオリピンは、ＭＴＰの脂質転移活性を阻害することが知られている（非特許文献２２）。この方法に含まれる複数の工程のために、自動化するのは難しい。そのため、ＭＴＰ活性を測定するのに簡単な１工程の方法を有するのが有利と思われる。この方法は、例えばＭＴＰ活性を部分的に阻害する化合物を同定するのに有用であろうし、それ故リポ蛋白アセンブリ及び分泌を低下させるだろう。同定された化合物は、血漿コレステロール及び細胞中のトリグリセリドレベルを低下させるための医薬として非常に望ましい。
【０００４】
いくつかの製薬企業は、ＭＴＰ活性を阻害する拮抗剤を同定している（非特許文献１２−１４、２３）。これらの企業によりとられた一般的なアプローチは、ＨｅｐＧ２細胞によりアポＢの分泌を低下させる化合物を同定しそしてＭＴＰ活性を阻害するそれらの能力を決定することである（非特許文献３、２３）。アポＢ分泌の阻害を含む一次スクリーニングの欠点は、多段階放射能活性分析を使用してＭＴＰ阻害用の多数の化合物を評価することにあるものと思われていた（非特許文献２０、２１）。この２段階スクリーニングは、ＭＴＰ活性を阻害しそしてアポＢ分泌を低下させる化合物の同定を行うことができる。驚くべきことに、種々の企業により同定された異なる化合物は、構造的に非常に類似している（非特許文献２３）。残念ながら、これらの化合物は、細胞中にＴＡＧの顕著な蓄積を生じさせ、そのため選択された化合物がアポＢ分泌の有能な阻害剤である可能性を生じさせることになる。
【０００５】
【非特許文献１】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｊ．Ｓｈｉ，ａｎｄ Ｐ．ｒｅｉｚｅｎ．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｅｍｂｌｙ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４：２２−３２．
【非特許文献２】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｊ．Ｉｑｂａｌ，Ｋ．Ａｎｗａｒ，Ｐ．Ｒａｖａ，ａｎｄ Ｋ．Ｄａｉ．２００３．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：Ｓ５００−Ｓ５０６．
【非特許文献３】Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ａ．，ａｎｄ Ａ．Ｅｌ Ａｂｂｏｕｙｉ．２００３．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ：ａｎ ｕｐｄａｔｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：Ｄ２９４−Ｄ３０５．
【非特許文献４】Ｓｈｅｌｎｅｓｓ，Ｇ．Ｓ．ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｓｅｌｌｅｒｓ．２００１．Ｖｅｒｙ−ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１２：１５１−１５７．
【非特許文献５】Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ Ｈ．Ｊａｍｉｌ．２０００．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４８６：７２−８３．
【非特許文献６】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．，Ｍ．Ｃ．Ｍ．Ｌｉｎ，ａｎｄ Ｈ．Ｊａｍｉｌ．１９９７．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３４５：１３６−１５０．
【非特許文献７】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．２０００．Ａ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｈｙｌｏｍｉｃｒｏｎｓ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１４８：１−１５．
【非特許文献８】Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ａ．１９９９．Ｃｅｌｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４４０：１−３１．
【非特許文献９】Ｆｉｓｈｅｒ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ Ｈ．Ｎ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ．２００２．Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙ：ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１７３７７−１７３８０．
【非特許文献１０】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．，Ｌ．Ｐ．Ａｇｇｅｒｂｅｃｋ，Ｍ−Ｅ．Ｂｏｕｍａ，Ｃ．Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｍｕｎｋ，Ｍ．Ｈｅｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｇ．Ｇａｙ，Ｄ．Ｊ．Ｒａｄｅｒ，ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｇｒｅｇｇ．１９９２．Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ ａｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５８：９９９−１００１．
【非特許文献１１】Ｓｈｏｕｌｄｅｒｓ，Ｃ．Ｃ．，Ｄ．Ｊ．Ｂｒｅｔｔ，Ｊ．Ｄ．Ｂａｙｌｉｓｓ，Ｔ．Ｍ．Ｅ．Ｎａｒｃｉｓｉ，Ａ．Ｊａｒｍｕｚ，Ｔ．Ｔ．Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｐ．Ｒ．Ｄ．Ｌｅｏｎｉ，Ｓ．Ｂｈａｔｔａｃｙａｒｙａ，Ｒ．Ｊ．Ｐｅａｓｅ，Ｐ．Ｍ．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｓ．Ｌｅｖｉ，Ｐ．Ｇ．Ｈ．Ｂｙｆｉｅｌｄ，Ｐ．Ｐｕｒｋｉｓｓ，ａｎｄ Ｊ．Ｓｃｏｔｔ．１９９３．Ａｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｄｅｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ９７ｋＤａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ａ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：２１０９−２１１６．
【非特許文献１２】Ｊａｍｉｌ，Ｈ．，Ｄ．Ａ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ｃ．Ｅｕｓｔｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．Ｂｒｏｏｋｓ，Ｊ．Ｋ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｊｒ．，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｒｉｃｃｉ，Ｃ−Ｈ．Ｃｈｕ，Ｔ．Ｗ．Ｈａｒｒｉｔｙ，Ｃ．Ｐ．Ｃｉｏｓｅｋ，Ｊｒ．，Ｓ．Ａ．Ｂｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ｅ．Ｇｒｅｇｇ，Ｊ．Ｒ．Ｗｅｔｔｅｒａｕ．１９９６．Ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｐｏＢ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：１１９９１−１１９９５．
【非特許文献１３】Ｈａｇｈｐａｓｓａｎｄ，Ｍ．Ｄ．Ｗｉｌｄｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｍｏｂｅｒｌｙ．１９９６．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ（ＨｅｐＧ２）．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３７：１４６８−１４８０．
【非特許文献１４】Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｆ．，ａｎｄ Ｔ．Ｇｒａｎｄ−Ｐｅｒｒｅｔ．１９９７．Ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｌｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ１００ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｓ ｐｒｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｉｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０４３５−２０４４２．
【非特許文献１５】Ｇｏｒｄｏｎ．Ｄ．Ａ．Ｈ．Ｊａｍｉｌ，Ｄ．Ｓｈａｒｐ，Ｄ．Ｍｕｌｌａｎｅｙ，Ｚ．Ｙａｏ，Ｒ．Ｅ．Ｇｒｅｇｇ，ａｎｄ Ｊ．Ｗｅｔｔｅｒａｕ．１９９４．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：７６２８−７６３２．
【非特許文献１６】Ｌｅｉｐｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｊ．Ｄ．Ｂａｙｌｉｓｓ，Ｒ．Ｊ．Ｐｅａｓｅ，Ｄ．Ｊ．Ｂｒｅｔｔ，Ｊ．ｓｃｏｔｔ，ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｓｈｏｕｌｄｅｒｓ．１９９４．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｅ ａｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ，ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２１９５１−２１９５４．
【非特許文献１７】Ｒａａｂｅ，Ｍ．，Ｍ．Ｍ．Ｖｎｉａｎｔ，Ｍ．Ａ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｃ．Ｈ．Ｚｌｏｔ，Ｊ．Ｂｊｒｋｅｇｒｅｎ，Ｌ．Ｂ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｒ．Ｌ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｇ．Ｙｏｕｎｇ．１９９９．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１２８７−１２９８．
【非特許文献１８】Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｗ．，Ｋ．Ｔｒａｎ，ａｎｄ Ｍ．Ｙａｏ．１９９９．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｗｉｔｈｉｎ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ＭｃＡ−ＲＨ７７７７ ｃｅｌｌｓ−ａ ｕｎｉｆｉｅｄ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７７９３−２７８００．
【非特許文献１９】Ｋｕｌｉｎｓｋｉ，Ａ．，Ｓ．Ｒｕｓｔａｅｕｓ，ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｖａｎｃｅ．２００２．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｏｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｌｕｍｅｎａｌ ａｃｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｎｏｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＡｐｏＢ，ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｆｏｒ ＡｐｏＢ ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３１５１６−３１５２５．
【非特許文献２０】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｄ．Ｂ．Ｚｉｌｖｅｒｓｍｉｔ．１９８４．Ａ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１０８６３−１０８６６．
【非特許文献２１】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｄ．Ｂ．Ｚｉｌｖｅｒｓｍｉｔ．１９８５．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｌｉｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．３８：２０５−２２２．
【非特許文献２２】Ｊａｍｉｌ，Ｈ．，Ｊ．Ｋ．Ｄｉｃｋｓｏｎ．Ｊｒ．，Ｃ−Ｈ．Ｃｈｕ，Ｍ．Ｗ．Ｌａｇｏ，Ｊ．Ｋ．Ｒｉｎｅｈａｒｔ，Ｓ．Ａ．Ｂｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ｅ．Ｇｒｅｇｇ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｗｅｔｔｅｒａｕ．１９９５．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６５４９−６５５４．
【非特許文献２３】Ｃｈａｎｇ，Ｇ．，Ｒ．Ｂ．Ｒｕｇｇｅｒｉ，ａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｊｒ．２００２．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＴＰ）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｒａｄｉｇｍｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．５：５６２−５７０．
【非特許文献２４】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．，Ａ．Ｂａｋｉｌｌａｈ，ａｎｄ Ｈ．Ｊａｍｉｌ．１９９７．Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３６：１３０６０−１３０６７．
【非特許文献２５】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．，Ａ．Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ｎ．Ｎａｙａｋ，ａｎｄ Ｇ．Ｓ．Ｓｈｅｌｎｅｓｓ．１９９８．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ４３０−５７０ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ａｒｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｉｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２５６１２−２５６１５．
【非特許文献２６】Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ａ．，Ｈ．Ｊａｍｉｌ，ａｎｄ Ｍ．Ｈ．Ｈｕｓｓａｉｎ．１９９８．Ｌｙｓｉｎｅ ａｎｄ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ １８％ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ａｒｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｉｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３７：３７２７−３７３４．
【非特許文献２７】Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ａ．，Ｎ．Ｎａｙａｋ，Ｕ．Ｓａｘｅｎａ，Ｒ．Ｍ．Ｍｅｄｆｏｒｄ，ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｈｕｓｓａｉｎ．２０００．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏＢ ｆｏｌｌｏｗｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏＢ−ＭＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３９：４８９２−４８９９．
【非特許文献２８】Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ａ．，ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｈｕｓｓａｉｎ．２００１．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｌｉｐｉｄｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ＭＴＰ−ｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３１４６６−３１４７３．
【非特許文献２９】Ｔｉｅｔｇｅ，Ｕ．Ｊ．Ｆ．，Ａ．Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ｃ．Ｍａｕｇｅａｉｓ，Ｋ．Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｍ．Ｍ．Ｈｕｓｓａｉｎ，ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｒａｄｅｒ．１９９９．Ｈｅｐａｔｉｃ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＴＰ）ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＶＬＤＬ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ ａｎｄ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４０：２１３４−２１３９．
【非特許文献３０】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．，Ｌ．Ｐ．Ａｇｇｅｒｂｅｃｋ，Ｐ．Ｍ．Ｌａｐｌａｕｄ，ａｎｄ Ｌ．Ｒ．ＭｃＬｅａｎ．１９９１．Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３０：４４０６−４４１２．
【非特許文献３１】Ａｔｚｅｌ，Ａ．，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｗｅｔｔｅｒａｕ．１９９３．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｌｉｐｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１０４４４−１０４５０．
【非特許文献３２】Ａｔｚｅｌ，Ａ．，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｗｅｔｔｅｒａｕ．１９９４．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３３：１５３８２−１５３８８．
【非特許文献３３】Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．１９７６．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４．
【非特許文献３４】Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｙ．，Ｊ．Ｓ．Ｌｉｍａｎｅｃｋ，ａｎｄ Ｃ．Ｃ．ｃｈａｎｇ．１９８１．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６．２９８−３０２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
理想的に、ＭＴＰ活性を阻害するがリポ蛋白分泌には部分的な作用を有する化合物が求められている。この目的のために、ＭＴＰの脂質転移活性を阻害する能力に主に関して化合物をスクリーニングできる方法を開発することが望ましい。本発明は、自動化及び高処理量スクリーニングに利用できるＭＴＰ活性を分析する簡単かつ迅速そして高感度の方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＭＴＰ活性を測定する方法及び組成物を提供する。本発明の１つの構成では、（ａ）その中に蛍光ラベルされた脂質を配合された供与体小胞を調製する段階、（ｂ）受容体小胞を調製する段階、（ｃ）供与体小胞から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰと蛍光ラベルされた脂質との結合を可能にするのに充分な時間及び条件下で、受容体小胞及びラベルされた供与体小胞とともにＭＴＰ含有細胞ホモジネートまたは単離されたＭＴＰの何れかをインキュベートする段階、そして（ｄ）ＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を測定する段階からなるＭＴＰのレベルを測定する方法が提供される。細胞ホモジネートは、動物（ヒトを含む）、昆虫及び微生物の細胞を含むがこれらに限定されないＭＴＰを発現する肝臓細胞、小腸細胞、心臓細胞または任意の他の細胞からなる。
【０００８】
本発明で使用される蛍光ラベルされた脂質は、トリグリセリド、コレステロール
エステル（ＣＥ）または燐脂質を含むがこれらに限定されない。蛍光ラベルされたトリアシルグリセロールの例は、１、２ ジオレオイル３−ＮＢＤグリセロール（ＮＢＤ−ＴＡＧ）である。小胞は、好ましくは、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢ−リポ蛋白小胞、他のリポ蛋白またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である。
【０００９】
本発明は、またＭＴＰの脂質転移活性をモジュレートする化合物を同定する方法を提供する。方法は、（ａ）供与体小胞中に蛍光ラベルされた脂質を配合する段階、（ｂ）受容体小胞を調製する段階、（ｃ）受容体小胞及びラベルされた供与体小胞の分割量とテスト化合物とを混合し、テスト化合物はＭＴＰの周知または未知のモジュレーターである段階、（ｄ）ＭＴＰを含む細胞ホモジネートまたは単離されたＭＴＰを、供与体小胞、受容体小胞及びテスト化合物を含む混合物に添加する段階、（ｅ）供与体から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰとの蛍光ラベルされた脂質の結合を可能にするのに充分な時間及び条件下、受容体小胞、ラベルされた供与体小胞、テスト化合物及びＭＴＰの初めの分割量をインキュベートする段階、（ｆ）供与体から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰとの蛍光ラベルされた脂質の結合を可能にするのに充分な時間及び条件下、受容体小胞、ラベルされた供与体小胞、テスト化合物及びＭＴＰの第二の分割量をインキュベートする段階、（ｇ）工程（ｅ）及び（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を測定する段階、そして（ｈ）工程（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を比較するとき、ＭＴＰの脂質転移活性を増大する化合物の同定を、工程（ｅ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光の増大と相関させ、一方工程（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を比較するとき、ＭＴＰの脂質転移活性を低下する化合物の同定を、工程（ｅ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光の低下と相関させる段階からなる。
【００１０】
本発明は、またＭＴＰの脂質転移活性を測定するためのキットを提供する。キットは、受容体小胞及び蛍光ラベルされた供与体小胞からなる。好ましくは、キットの蛍光ラベルされた供与体小胞は、トリグリセリド、コレステロールエステルまたは燐脂質からなる。キットに含まれる小胞は、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である。キットに含まれる小胞は、好ましくは、適切な緩衝液と混合されそしてまた安定剤例えばＢＳＡを含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＭＴＰ活性は、従来では、精製されたＭＴＰまたは細胞ホモジネートを放射能ラベルされた脂質を含む供与体小胞とともに１−３時間インキュベートし、供与体小胞を沈澱させ、そして受容体小胞に転移した放射能活性を測定することにより測定される。
【００１２】
本発明によれば、ＭＴＰに関する新規な簡単かつ迅速そして高感度の蛍光分析が提供される。この分析では、単離及び／または精製されたＭＴＰまたは細胞ホモジネートは、クエンチングされた蛍光ラベルされた脂質（例えばトリグリセリド、コレステロールエステル及び／または燐脂質）を含む供与体小胞及び異なるタイプの受容体小胞とともにインキュベートされる。細胞ホモジネートは、ＭＴＰを発現する任意の細胞から製造できる。好ましくは、細胞は、動物の肝臓細胞、小腸細胞または心臓細胞である。好ましくは、動物の細胞は、哺乳動物例えばラット、マウス、モンキーまたはヒトからである。細胞ホモジネートは、また昆虫または微生物からの細胞からなる。
【００１３】
本発明によれば、蛍光ラベルされた脂質は、トリグリセリド、コレステロールエステル（ＣＥ）または燐脂質を含むことができるが、これらに限定されない。本発明で使用されるトリグリセリドの例は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）である。本発明で使用される燐脂質の例は、ホスファチジルエタノールアミンである。
【００１４】
脂質をラベルするのに使用できる異なるタイプの蛍光化合物の例は、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾール（ＮＢＤ）、ピレンまたはボジパイ（ｂｏｄｉｐｙ）を含むがこれらに限定されない。これらの蛍光化合物によりリピドをラベルする方法は、当業者では周知でありそして製造された蛍光ラベルされた脂質も容易に入手できる。本発明で使用するには、脂質は、任意の位置に少なくとも１つの蛍光ラベルを含むことができる。例えば、トリアシルグリセロールは、任意の位置に少なくとも１つのＮＢＤを含むことができるが、一方他の位置に脂肪酸を有する。
【００１５】
ピレンラベルされた脂質の例は、以下のものを含み、それらは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手でき、そしてかれらのオン・ラインカタログに以下のようにリストされている。
【００１６】
Ｂ−３７８２
１、２−ビス−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
Ｃ−２１２
コレステリル １−ピレンブチラート
Ｄ−６５６２
１、２−ジオレオイル−３−（１−ピレンドデカノイル）−ｒａｃ−グリセロール
【００１７】
Ｈ−３６１
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＨＰＣ）
Ｈ−３７８４
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＨＰＥ）
Ｈ−３８０９
【００１８】
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、アンモニウム塩（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＰＧ）
Ｈ−３８１０
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノール、ナトリウム塩（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＨＰＭ）
【００１９】
Ｈ−３８１８
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンヘキサノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ｐｙ−Ｃ６−ＨＰＣ）
Ｐ−５８
Ｎ−（１−ピレンスルホニル）−１、２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（ｐｙＳ ＤＨＰＥ）
【００２０】
ＢＯＤＩＰＹラベルされた脂質の例は、以下のものを含み、それらはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手できそしてそれらのオン・ラインカタログに以下のようにリストされている。
【００２１】
Ｂ−７７０１
１、２−ビス−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ウンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ビス−ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬＣ１１−ＰＣ）
【００２２】
Ｂ−３７９４
２−（５−ブチル−４、４−ジフルオロ−４−ボラ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ノナノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−Ｃ４−ＢＯＤＩＰＹ（商標）５００／５１０Ｃ９−ＨＰＣ）
【００２３】
Ｃ−３９２７
コレステリル ４、４−ジフルオロ−５、７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノエート（コレステリルＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬＣ１２）
【００２４】
Ｃ−１２６８０
コレステリル ４、４−ジフルオロ−５−（４−メトキシフェニル）−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ウンデカノエート（コレステリルＢＯＤＩＰＹ（商標）５４２／５６３Ｃ１１）
【００２５】
Ｃ−１２６８１
コレステリル ４、４−ジフルオロ−５−（２−ピロリル）−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ウンデカノエート（コレステリルＢＯＤＩＰＹ（商標）５７６／５８９Ｃ１１）
【００２６】
Ｄ−３７９２
２−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬＣ１２−ＨＰＣ）
【００２７】
Ｄ−３８０３
２−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬＣ５−ＨＰＣ）
【００２８】
Ｄ−３８００
Ｎ−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１、２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬ ＤＨＰＥ）
【００２９】
Ｄ−１２６５６
Ｎ−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１、２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬジカプロイル ＰＥ）
【００３０】
Ｄ−３８１３
２−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）５３０／５５０Ｃ１２−ＨＰＥ）
【００３１】
Ｄ−３８１５
２−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）５３０／５５０Ｃ５−ＨＰＣ）
【００３２】
Ｄ−３７９９
Ｎ−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１、２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（ＢＯＤＩＰＹ（商標）５３０／５５０ ＤＨＰＥ）
【００３３】
Ｄ−３７９３
２−（４、４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）５００／５１０Ｃ１２−ＨＰＣ）
【００３４】
Ｄ−３７９５
２−（４、４−ジフルオロ−５−オクチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）５００／５１０Ｃ５−ＨＰＣ）
【００３５】
Ｄ−３８０６
２−（４、４−ジフルオロ−５−（４−フェニル−１、３−ブタジエニル）−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）５８１／５９１Ｃ５−ＨＰＣ）
【００３６】
ＮＢＤラベルされた脂質は、またＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．によりカスタム合成でき、例えば、Ｄ−１６４０８：１、３−ジオレイン、２−ＮＢＤ−Ｘエステルのカスタム合成またはＢ−１８００：ＮＢＤラベルされたコレステロールオレエート（コレステロールエステル）のカスタム合成がある。
【００３７】
さらに、以下の化合物は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手でき、そしてカスタム合成を要しない。
Ｎ−００３６０（ＮＢＤ−ＰＥ）Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾール−４−イル）−１、２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム；
【００３８】
Ｎ−０３７８６（ＮＢＤ Ｃ６−ＨＰＣ）２−（６−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサノイル−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；及び
【００３９】
Ｎ−０３７８７（ＮＢＤ Ｃ１２−ＨＰＣ）２−（１２−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾール−４−イル）アミノドデカノイル−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン。
【００４０】
本発明で使用できる小胞の例は、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞を含む。本明細書で使用されそして当業者の理解とも一致するが、「単層小胞」は、１つの燐脂質二分子層を有する小胞（リポソーム）を意味する。「多重ラメラ小胞」は、いくつかの燐脂質二分子層を有する小胞（リポソーム）を意味する。図８は、二脂質（ｂｉｌｉｐｉｄ）膜に埋め込まれたラベルされたトリグリセリド、ＮＢＤ−ＴＧを有する単層小胞を概略的に画いている。受容体小胞を製造する方法は周知である。例えば、非特許文献２０、２１及び３０−３２参照。供与体小胞を製造する方法も周知である。例えば、非特許文献２０、２１、３０−３２参照。本発明によれば、目的とする供与体小胞を製造するとき、カルジオリピンを除くものであり、そして放射能ラベルされたＴＡＧは、蛍光ラベルされたＴＡＧにより置換される。
【００４１】
供与体小胞及び受容体小胞の両者は、好ましくは、ｐＨ約７．４で適切な緩衝液例えばトリス−ＨＣｌと混合される。供与体小胞及び受容体小胞は、別々に貯蔵できる。別に、小胞は、供与体／受容体の小胞の混合物が本発明の分析またはキットで直接使用できるように、ともに貯蔵できる。供与体小胞及び受容体小胞がともに貯蔵されるとき、供与体小胞対受容体小胞の比は、好ましくは、約１：４（供与体：受容体）から約１：１０（供与体：受容体）の範囲内にある。最も好ましくは、供与体対受容体の比は、約１：６である。小胞の調製物は、さらにそれぞれ約１５０ｍＭ及び１ｍｇ／ｍＬの最終濃度へのＮａＣｌ及びＢＳＡの添加によって安定化できる。
【００４２】
ＭＴＰは、周知の方法を使用して異なる源から単離され精製できる。例えば非特許文献２０及び２１参照。例えば、ＭＴＰは、前記のようにウシの肝臓から単離できる（非特許文献２０及び２１）。ヒトのＭＴＰは、非特許文献１５に記載されているように、ＭＴＰに関するコーディング配列からなる発現ベクターにより培養細胞をトランスフェクトすることにより調製できる。これらの文献及び他の引用した参考文献の記述は、もし充分に述べられているならば、本明細書において参考として引用される。
【００４３】
本発明によれば、ＭＴＰ媒介脂質転移による蛍光の増大は、短時間の後に測定できる。本発明の方法は、ＭＴＰ発現プラスミドによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞及びＨｅｐＧ２、Ｃａｃｏ−２細胞のＭＴＰ活性を測定するのに使用して成功した。その上、本発明の方法は、その拮抗剤による細胞ＭＴＰ及び精製されたＭＴＰの阻害を研究するのに有用である。方法は、自動化に使用でき、そして大規模な処理量のスクリーニングに容易に採用できる。
【００４４】
さらに、本発明は、種々の目的例えば同定、モジュレーション、診断などに任意のサンプル中のＭＴＰを分析するのに使用できる方法を提供する。例えば、方法は、精製されたＭＴＰサンプル、細胞のライン、組織などに存在するＭＴＰの活性を分析するのに使用できる。本発明により提供される分析は、非常に多面的であり、そして蛍光ラベルを含むＭＴＰによる任意の脂質の転移を測定できる。さらに、ＭＴＰ活性を測定する本発明の方法は、簡単かつ迅速である。それらは、供与体小胞と受容体小胞との間の脂質の転移中に生ずるＭＴＰと発蛍光団との結合による蛍光の増大の測定に基づく。
【００４５】
本発明の方法は、ＭＴＰを発現することが知られている細胞中の細胞活性を忠実に測定し、そしてＭＴＰを発現しない細胞中の活性は測定しない（図１）。その上、方法は、従来技術の放射性同位元素分析を使用して同定された拮抗剤の同様な阻害性を発揮する（図７）。ＭＴＰは、受容体小胞の存在下の顕著に高い活性を示す（図４）。受容体小胞の不存在下のＭＴＰの低い脂質結合活性は、脂質転移工程中の異なる受容体小胞の役割を理解する独特な機会をもたらす。
【００４６】
従って、本発明は、ＭＴＰ活性の測定に簡単かつ迅速な蛍光分析を提供する。新しい方法の利点は、容易さ、迅速さ、高感度、負に電荷した脂質の使用の回避、精製した細胞ＭＴＰによる異なる脂質転移活性の研究における多様性、拮抗剤の阻害活性を測定する能力並びに放射能活性の使用の先行性を含む。本発明による蛍光分析は、容易に自動化されそして大規模の処理量のスクリーニングに使用できる。このアプローチは、ＭＴＰ活性を部分的に阻害する化合物を同定しそして恐らく細胞中のＴＡＧ蓄積に関係する望ましくない副作用を最低にするために有用である。ＭＴＰが、デディケートされたリポ蛋白アセンブリシャペロンである以外の機能を有すると思われる多機能の蛋白であることが明らかになってきている。本発明による蛍光分析に基づくスクリーニングによって同定された化合物は、リポ蛋白アセンブリ及び分泌に無関係なＭＴＰの他の機能の同定に有用であろう。
【００４７】
本発明によれば、ＭＴＰ分析は、基本的に、３つのコンポーネントすなわち供与体小胞、受容体小胞及びＭＴＰからなる。本発明の方法は、分析混合物のすべての３つのコンポーネント及び時間と一次的な関係を示す（図１−４）。
【００４８】
代表的な分析は、以下に概説するように行うことができる。以下にリストされた異なる化合物の量は、もちろん、異なる化合物間の比が比較的同じである限り、変化できる。４つの異なる条件（ブランク、総計、正のコントロール及びテスト）が、各分析に勧められる。すべての分析では、反応は、ＭＴＰ源の最後の添加により開始する。受容体小胞及び供与体小胞のそれぞれの約３μＬをピペットで蛍光ミクロタイター（ブランク）プレートに注ぐ。２ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリスｐＨ７．４の約１０μＬ、及び１．５ＭのＮａＣｌ中の１％ＢＳＡストックの１０μＬを添加する。本明細書で記載された分析に使用される小胞の正確な数は、日常的に定量するのは難しい。しかし、小胞を定量するより容易な方法は、異なる小胞調製物中に存在する燐脂質及びトリグリセリドを測定することができる。従って、３μＬの供与体小胞は、１ｍＬあたり約４５０ｎモルのホスファチジルコリン（ＰＣ）及び約１４ｎモルのトリグリセリドに相関する。供与体小胞の濃度の範囲は、使用できる。好ましい範囲は、例えば約２００−約６００ｎモルのホスファチジルコリン（ＰＣ）及び７−２０ｎモルのトリグリセリドからの任意のものである。３μＬの受容体小胞は、約２４００ｎモルＰＣ／ｍＬに相当する。しかし、小胞の濃度の範囲が使用でき、例えば約１４００−約３４００ｎモルＰＣ／ｍＬからの任意のものである。
【００４９】
ブランクでは、コントロール緩衝液（正のコントロール及びテストサンプルのＭＴＰ源を含む）の必要量が添加され、そして容量を水により約１００μＬにする。正のコントロールでは、周知の量のＭＴＰ源を添加し、そして容量を水により約１００μＬにする。テストでは、未知のサンプルを添加し、そして最終の分析の容量にする。総計では、約３μＬの供与体小胞及び約９７μＬのイソプロパノールのみを添加する。混合物を約３０分間約３７℃でインキュベートする。蛍光単位は、それぞれ４６０−４７０ｎｍ及び５３０−５５０ｎｍの励起波長及び発光波長を使用して測定される。低い転移活性の場合には、インキュベーション時間は、延長できる。事実、同じタイタープレートは、時間による蛍光の増加を測定するために数回使用できる。しかし、発蛍光団は、長時間ではイソプロパノール中で不安定である。従って、３０分より長い時間では、３０分以内で測定される読み取りからの合計量が使用されるべきである。小胞及び正のコントロールを含む分析の成分は、本明細書で記述したように製造され、そしてまたＣｈｙｌｏｓ、Ｉｎｃ．（Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，ＮＹ）から入手できる。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、供与体小胞及び受容体小胞は、前述のように混合されて、ともに貯蔵されそして使用される。この態様では、分析が行われるとき、小胞（供与体及び受容体の両者）の唯一のピペット使用の段階が必要とされる。
【００５１】
小胞は、好ましくは、約７．４のｐＨで、適切な緩衝液例えばトリスＨＣｌと混合される。他の緩衝液も使用でき、例えばホスフェート緩衝液及びＨＥＰＥＳが使用できる。好ましい態様では、ＮａＣｌを添加して約１５０ｍＭの最終濃度にする。ＮａＣｌストック溶液（例えば３Ｍ）を製造しそして次に希釈して最終濃度にする。他の塩例えばＫＣｌ及びＭｇＣｌ２も使用できる。好ましくは、ＢＳＡは、小胞を安定化するために、添加して約１ｍｇ／ｍＬの最終濃度にする。ストック溶液（例えば２０ｍｇＢＳＡ／ｍＬ）を作り、次に希釈して最終濃度にする。なお他の態様では、インキュベーション段階を室温で行うことができる。
【００５２】
蛍光脂質を含む供与体小胞及び受容体小胞は、実施例１で記載したように調製される。好ましい態様では、等容量の供与体小胞及び受容体小胞が混合される。代表的な分析方法は、以下の通りである。
【００５３】
ｉ）以下の表に記載されたように、３検体の小胞を蛍光ミクロタイター（ブランク）プレートにピペットで加える。
ｉｉ）水、サンプルなどを加える。５分間待って成分を室温にする。
ｉｉｉ）コントロール及びテストでＭＴＰを加えることにより反応を開始しそして総計にイソプロパノールを加える。
ｉｖ）室温で３０分間インキュベートする。
【００５４】
【表１】
【００５５】
ＭＴＰ活性の測定：それぞれ４６０−４７０ｎｍ及び５３０−５５０ｎｍの励起波長及び発光波長を使用して蛍光単位（ＦＵ）を測定する。
ＭＴＰ活性の計算：
コントロール（Ｃ）中の転移％：［コントロール（ＦＵ）−ブランク（ＦＵ）］／［（総計（ＦＵ）−ブランク（ＦＵ）］×１００
テストサンプル（Ｄ）中の転移％：［テスト（ＦＵ）−ブランク（ＦＵ）］／［（総計（ＦＵ）−ブランク（ＦＵ）］×１００
【００５６】
ＭＴＰの脂質転移活性をモジュレートする化合物を同定する方法は、また本発明により提供される。方法は、（ａ）供与体小胞中に蛍光ラベルされた脂質を配合する段階、（ｂ）受容体小胞を調製する段階、（ｃ）テスト化合物と受容体小胞及びラベルされた供与体小胞の分割量とを混合し、テスト化合物はＭＴＰの周知または未知のモジュレーターである段階、（ｄ）ＭＴＰを含む細胞ホモジネートまたは単離されたＭＴＰを、供与体小胞、受容体小胞及びテスト化合物を含む混合物に添加する段階、（ｅ）供与体小胞から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰとの蛍光ラベルされた脂質の結合を可能にするのに充分な時間及び条件下、受容体小胞、ラベルされた供与体小胞、テスト化合物及びＭＴＰの初めの分割量をインキュベートする段階、（ｆ）供与体小胞から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰとの蛍光ラベルされた脂質の結合を可能にするのに充分な時間及び条件下、受容体小胞、ラベルされた供与体小胞、テスト化合物及びＭＴＰの第二の分割量をインキュベートする段階、（ｇ）工程（ｅ）及び（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を測定する段階、そして（ｈ）工程（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を比較するとき、ＭＴＰの脂質転移活性を増大する化合物の同定を、工程（ｅ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光の増大と相関させ、一方工程（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を比較するとき、ＭＴＰの脂質転移活性を低下する化合物の同定を、工程（ｅ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光の低下と相関させる段階からなる。
【００５７】
本発明の他の構成では、ＭＴＰの脂質転移活性を測定するためのキットが提供される。キットは、前述のように、受容体小胞及び蛍光ラベルされた供与体小胞からなる。好ましくは、蛍光ラベルされた供与体小胞は、トリグリセリド、コレステロールエステルまたは燐脂質からなる。他の好ましい態様では、トリグリセリドは、ＮＢＤラベルを含む任意のトリグリセリド例えば１、２、ジオレイル ３−ＮＢＤグリセロール（ＮＢＤ−ＴＡＧ）である。他の好ましい態様では、燐脂質は、ホスファチジルエタノールアミンである。
【００５８】
小胞は、好ましくは、約７．４のｐＨのトリスＨＣｌと混合される。他の緩衝液も使用でき、例えばホスフェート緩衝液及びＨＥＰＥＳがある。
キットの一部を形成する受容体及び／または供与体の小胞は、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞を含むことできる。小胞は、ＨＳＡの添加により安定化される。
【００５９】
以下の実施例は、本発明をさらに説明しそして本発明の範囲を制限することを決して意味しない。
【００６０】
（実施例）
実施例 １（材料及び方法）
材料
ＭＴＰを放射能活性分析（非特許文献２０、２１）を使用してウシの肝臓から精製し、そして既に使用されている（非特許文献２４−２９）。ＰＣ及びＴＡＧはＡｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から入手した。蛍光（ニトロベンゾオキサジアゾール）ラベルされたＴＡＧは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手した。蛍光ラベルされたコレステリルエステル（ＣＥ）及び燐脂質（ＰＬ）を含む小胞は、それぞれＲｏａｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）及びＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から入手した。イソプロパノール及び他の化学品は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。受容体小胞は、Ｗｅｔｔｅｒａｕ及び協力者により記載されたように調製した（非特許文献２０、２１、３０−３２）。供与体小胞もそれらの製造方法に従って作られるが、ただしカルジオリピンは省かれそして放射能ラベルされたＴＡＧは、蛍光ラベルされたＴＡＧにより置換された。既知量の蛍光脂質をイソプロパノールで希釈して標準曲線を作り、そして小胞中のラベルされた脂質の量は、イソプロパノールによるそれらの破壊後に決定された。小胞中のトリオレインの量は、比色定量分析（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ；Ｓｉｇｍａ）により定量した。ＭＴＰ阻害剤ＢＭＳ２００１５０（ジフェニル−プロピル−ピペリジニル−ジヒドロイソ−インドール）は記述されており（非特許文献１２）、そしてＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）のＨａｒｉｓ Ｊａｍｉｌ博士からの貴重な贈り物である。
【００６１】
転移分析
分析は、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ（商標）２ Ｂｌａｃｋ“Ｕ”Ｂｏｔｔｏｍ Ｍｉｃｒｏ−ｔｉｔｅｒ（商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）で行われた。穴に、３Ｌの供与体小胞（１ｍＬあたり４５０ｎモルのＰＣ及び１４ｎモルのＴＡＧ）、３Ｌの受容体小胞（２４００ｎモルＰＣ／ｍＬ）、１０Ｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４、２ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、蒸留水（添加して最終の分析容量を１００Ｌにする）、そして３検体の精製したＭＴＰ（０．１−１．５ｇ）を加えた。いくつかの実験では、ＮａＣｌ及びＢＳＡを加えてそれぞれ１５０ｍＭ及び１ｍｇ／ｍＬの最終濃度とした。プレートを異なる時間３７℃または室温でインキュベートし、そして４６０ｎｍの励起波長及び５３０ｎｍの発光波長を使用して蛍光プレートリーダー（７６２０Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）により読みとった。ブランク値を決定するために、ＭＴＰを穴から除いた。供与体小胞の総計蛍光は、３μＬの供与体小胞へ９７μＬのイソプロパノールを加えることにより決定した。ＭＴＰ阻害を検討するために、異なる濃度のＢＭＳ２００１５０を、ＭＴＰの添加前に反応混合物に添加した。ＭＴＰ活性（転移％）は、以下の式により計算した。転移％（分析穴中の任意の蛍光単位−ブランク値）／（総計蛍光単位−ブランク値）×１００。比活性は、毎時１ミクロｇあたりの転移％として示される。
【００６２】
Ｃｏｓ−７細胞のトランスフェクション
Ｃｏｓ−７細胞を、１０％ウシ胎児血清及び１％抗菌−抗かび剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を補足したＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で培養した（３７℃、５％ＣＯ２、含湿チェンバー）。細胞（１×１０６）を、トランスフェクションの２４時間前に７５ｃｍ２フラスコに入れた。トランスフェクションのときに、細胞は約５０−６０％密集生長していた。ＭＴＰ発現ベクター（非特許文献１５）ｐＲｃ−ｈＭＴＰ（７ｇ；サイトメガウイルスプロモーターのコントロール下ヒトＭＴＰを発現する）を、２１ＬのＦｕＧＥＮＥ−６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）により複合されたＣｏｓ−７細胞中に導入した。細胞を約７２時間７ｍＬの媒体中で３７℃及び５％ＣＯ２に維持した。Ｃｏｓ−７細胞は、またＦｕＧＥＮＥ−６単独により処理され（偽トランスフェクション）、そしてコントロールとして使用された。
【００６３】
細胞ホモジネートにおけるＭＴＰ活性の測定
細胞ホモジネートにおけるＭＴＰ活性は、Ｊａｍｉｌら（非特許文献１２）に記載されたように測定された。密集成長した細胞単層を氷冷した滅菌ＰＢＳ、ｐＨ７．４により洗い、５ｍＬのＰＢＳにかきとり、１５ｍＬ容の円錐管に移し、そして遠心分離（２５００ｒｐｍ、１０分、室温）によりペレット化した。この点で、細胞のペレットを７０℃で貯蔵した。ホモジネーションのために、７５０μＬのホモジネーション緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭＫＣｌ、及び５ｍＭＥＤＴＡ）及び７．５μＬのプロテアーゼ阻害剤反応混液（カタログナンバーＰ２７１４、Ｓｉｇｍａ）を細胞のペレットに添加した。細胞を次に３ｍＬの注射器に付けた針（２９Ｇ、１１／２インチ）を通る吸引の繰り返しにより懸濁し、そしてボールベアリングホモジナイザー（クリアランス０．２５３インチ、１０パス）で氷上でホモジナイズした。細胞ホモジネートを氷蔵し、そして蛋白濃縮物をＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してＢｒａｄｆｏｒｄ法（非特許文献３３）により測定し、そしてＢＳＡを標準として使用した。細胞ホモジネートを、１．５ｍｇ／ｍＬの蛋白濃度になるようにホモジネーション緩衝液により希釈した。ＭＴＰをデオキシコレート処理（非特許文献１２）によりミクロソームから解離した。この目的のために、細胞ホモジネートを、１０分の１容量の０．５４％ナトリウムデオキシコレート、ｐＨ７．４の添加により０．０５４％デオキシコレートに調節し、そしてときどき撹拌しつつ３０分間氷上に放置した。細胞膜を次に１０℃で１時間５００００ｒｐｍでＳＷ５５ Ｔｉローターでの遠心分離によって除いた。上清を１５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、４０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．０２％ＮａＮ３に対して１２−１４ｋＤａカットオフ透析バッグで透析し、１時間後の第一のチェンジそして２時間後の第二のチェンジそして１晩の透析を行った。細胞ホモジネートを透析バッグから取り出し、そして蛋白の測定及びＭＴＰ分析に使用した。阻害の研究のために、ＨｅｐＧ２細胞を２４時間異なる濃度のＭＴＰ阻害剤ＢＭＳ２００１５０とインキュベートし、そして細胞から得られた細胞ホモジネートをＭＴＰ分析に使用した。
【００６４】
細胞ＭＴＰを分析するさらに迅速な方法を開発するために、Ｃｈａｎｇ、Ｌｉｍａｎｅｋ及びＣｈａｎｇ（非特許文献３４）により記載された方法を細胞の破壊について評価した。この方法では、細胞はまず低張緩衝液に曝し、次にプレートからかきとった。低張緩衝液への曝露は、細胞の膨脹を生じさせ、そしてかきとりはこれらの細胞を破壊した。細胞の単層を４℃で、２回氷冷のＰＢＳにより洗い、そして１回５ｍＬの１ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭＥＧＴＡ及び１ｍＭＭｇＣｌ２で洗った。細胞を次に５ｍＬの氷冷の１ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭＥＧＴＡ及び１ｍＭＭｇＣｌ２中で室温で２分間インキュベートした。緩衝液を吸引し、そして０．５ｍＬの同じ緩衝液を細胞に添加した。細胞をかきとり、そして氷冷した管に集め、撹拌し、遠心分離（ＳＷ５５ Ｔｉローター、５００００ｒｐｍ、１０℃、１時間）し、そして上清をＭＴＰ分析及び蛋白の測定に使用した。
【００６５】
ラット肝臓ミクロソームにおけるＭＴＰ活性の測定
ラットの肝臓のミクロソームを、僅かに改変したＷｅｔｔｅｒａｕ及びＺｉｌｖｅｒｓｍｉｔ（非特許文献２０、２１）により記述されたように調製した。簡単に、２ｇのラット肝臓を細片に切断し、そして２回氷冷のＰＢＳにより洗った。細片を次にＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを使用して２ｍＬの５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭＥＤＴＡ、２５０ｍＭスクロース及び０．０２％ナトリウムアジド中でホモジナイズし、そして遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎミクロ遠心分離器、１０９００ｒｐｍ、３０分、４℃）した。上清を保持しそして濃ＨＣｌによりｐＨ５．１に調節し、３０分間冷却して撹拌し、そして遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎミクロ遠心分離器、１３０００ｒｐｍ、３０分、４℃）した。ペレットを２ｍＬの１ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭＥＧＴＡ及び１ｍＭＭｇＣｌ２中に懸濁し、撹拌しそして超遠心分離（ＳＷ５５ Ｔｉローター、５００００ｒｐｍ、１０℃、１時間）し、そして上清をＭＴＰ分析及び蛋白の測定に使用した。
【００６６】
実施例 ２
分析条件の最適化
ＭＴＰに関する蛍光分析を標準化するために、ＴＡＧを小単層ＰＣ小胞（供与体小胞）中に配合した。封入が発蛍光団のクエンチングを生ずることが予想された。事実、イソプロパノールによる増加した量の供与体小胞の破壊は、増加した測定可能な蛍光を生じた（図１Ａ、総計）。これは、小胞中に存在する全量の蛍光を表す。破壊の前に、この蛍光は、それは小胞でクエンチされるために、検出できない。また、供与体小胞が安定でありそしてＭＴＰの不存在下発蛍光団を解離しないと思われた。安定性を測定するために、供与体小胞は受容体小胞と混合され、そしてＭＴＰの不存在下の蛍光を３０分間後に測定した（図１Ａ、ブランク）。ブランクの蛍光値は、総計の１３％及び１９％［１５．７±２．７％（平均ＳＤ；ｎ＝３）］に及んだ。ブランクの値は、おそらく、発蛍光団の小さい漏洩を表す。転移のためのＭＴＰによる供与体小胞からのＴＡＧの抽出が、増加した検出可能な蛍光を表すものと仮定された。増加した量の供与体小胞とともに一定量のＭＴＰ及び受容体小胞をインキュベートすることは、蛍光の増加した検出を生じ、ＭＴＰによるＴＡＧの転移を示した（図１Ａ、転移）。「転移」は、小胞間でＭＴＰにより転移されるＴＡＧの量を表す。転移の間、ＭＴＰに結合した発蛍光団は、水性の環境に最も露出されたようであり、蛍光計により検出できるようになる。蛍光単位は、ブランク値より４０−４７％高かった。次に、データを使用してＴＡＧの転移％を計算した（図１Ｂ）。転移活性の％は供与体小胞の２μＬまで増加し（２０ｐモルのＴＡＧ）、そしてその後飽和するように見える。次に、異なる濃度の受容体小胞の作用が検討された。これらの実験では、一定量のＭＴＰ及び供与体小胞が異なる容量の受容体小胞とともにインキュベートされた（図１Ｃ）。転移されたＴＡＧの量は、増大した量の受容体小胞とともに増加し、そして２μＬで飽和した。低濃度の受容体小胞での転移の増加は、これらの小胞が分析条件において制限されたことを示した。しかし、２μＬ以上では、分析は受容体小胞の濃度に無関係になった。注意すべきことは、増大した濃度の受容体小胞による検出可能な蛍光の低下がないことであった。これは、ＭＴＰが小胞間で脂質を転移しそして受容体小胞への脂質の一方向溶着を生じさせないことを示す。これらの条件下では、ＭＴＰは、供与体小胞に存在する全ＴＡＧの２０％を転移する方法であった（図１Ｄ）。次の検討では、３μＬの受容体小胞を使用した。
【００６７】
分析内変量係数（ＣＶ）を測定するために、転移分析は、０．５ｇのＭＴＰ、３μＬの供与体小胞及び３μＬの受容体小胞を使用して１０本の管で行われた。観察された転移％は、１９．９±１．８（平均±ＳＤ；ｎ＝１０）であり、そして分析内ＣＶは０．０９であった。同様に、分析内変量を評価した。１μｇのＭＴＰを使用する３検体で行われた７つの異なる独立した測定の比較は、０．１９の分析内ＣＶを示した。これらの実験で観察された転移％は、３４．５±３．０であった。
【００６８】
図１は、ミクロソームトリグリセリド転移蛋白（ＭＴＰ）によるトリグリセリド（ＴＡＧ）の転移に対する供与体小胞及び受容体小胞の異なる量の効果を示す。Ａ：総計。異なる指示された容量の供与体小胞を、１００μＬのイソプロパノールの添加により破壊し、そして蛍光単位を直ぐに測定した。注意すべきことは、この値が小胞に存在する発蛍光団の全量を表し、そして「ブランク」及び「転移」値の単純な合計ではないことである。ブランク：異なる容量の供与体小胞及び３μＬの受容体小胞を、実施例１の材料及び方法に記載されたように分析緩衝液（１００μＬ）でインキュベートし、そして蛍光単位を３７℃のインキュベーションの３０分後に測定した。Ｃ。転移。インキュベーションは、ブランクについて記述されたのと同じであるが、ただしこれらのサンプルは、また０．５ｇの精製したＭＴＰを含んだ。これは、所定の時間ＭＴＰにより移動される脂質の量を表す。転移中、ＭＴＰ結合蛍光脂質は、水性環境に最も露出されるようであり、そして蛍光計により検出される。Ｂ：Ａからのデータは、材料及び方法に記載されたようにＴＡＧの転移％を計算するのに使用された。供与体小胞中のＴＡＧ濃度は、１４ｐモル／ｍＬであった。Ｃ：供与体小胞（３μＬ）を、０．５ｇの精製したＭＴＰとともに異なる容量の受容体小胞とインキュベート（３０分間、３７℃）した。蛍光単位は、分析管で観察された単位からブランクの蛍光単位を減ずることにより得られた。Ｄ：Ｃからのデータを使用して実施例１、材料及び方法に記載されたように転移％を計算した。この目的のため、ブランク及び総計の蛍光単位は、実施例１、材料及び方法に記載されたように、同時に３検体で測定された。線グラフ及び誤差のバーは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。
【００６９】
実験を次にＭＴＰ活性に必要な時間、温度及びＮａＣｌ濃度の効果を測定するのに行った（図２）。異なる指示された量のＭＴＰを、実施例１、材料及び方法に記載されたように受容体小胞及び供与体小胞とインキュベートした。適切な総計及びブランクを実施例１、材料及び方法に記載されたように含んだ。蛍光の読みは、ミクロプレートリーダーを使用して３検体で指示された時間で測定された。ＴＡＧの転移％は、時間に対してプロットされる。Ｂ：温度。実験は、２枚の異なるミクロタイタープレートで行われた。精製されたＭＴＰ（０．２５ｇ／穴）を、３検体で受容体小胞及び供与体受容体とインキュベートした。１枚のプレートは３７℃でインキュベートされ、そして他のものは室温（ＲＴ）で放置した。蛍光の読みは、室温（２２℃）で異なる時点でなされた。Ｃ：ＮａＣｌの効果。供与体小胞（３μＬ）、受容体小胞（３μＬ）及びＭＴＰ（１μｇ）を、種々の指示された濃度のＮａＣｌの存在下１ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４及び２ｍＭＥＤＴＡ中で３０分間３検体でインキュベートした。線グラフ及び誤差のバーは平均±ＳＤを表す。
【００７０】
使用されるＭＴＰのすべての異なる濃度で、ＴＡＧ転移活性は、３０分まで時間とともに増大した（図２Ａ）。その時間後、転移活性は飽和し始めた。転移活性に対する温度の効果が検討された（図２Ｂ）。ＭＴＰの脂質転移活性は、室温（２２℃）及び３７℃で同じであり、活性に対する温度の顕著な効果がないことを示していた。これらの結果は、ＭＴＰが２２℃で最適に活性であることを示しているものと思われる。ＭＴＰ活性に対するＮａＣｌの効果（図２Ｃ）も測定された。ＮａＣｌを１５０ｍＭまで濃度を増加させると、ＭＴＰ活性は増大した。より高い濃度のＮａＣｌは、転移活性を阻害するように思われる。それゆえ、３０分間のインキュベーション及び１５０ｍＭＮａＣｌがＭＴＰ活性を測定するのに最適であると結論される。
【００７１】
次に、ＴＡＧ転移に対する異なる濃度の精製ＭＴＰ及びＢＳＡを使用する分析の特異性を検討した（図３）。図３Ａに示される結果は、供与体［３μＬ；１ｍＬあたり４５０ｎモルのホスファチジルコリン（ＰＣ）及び１４ｎモルのＴＡＧ］及び受容体（３μＬ；２４００ｎモルＰＣ／ｍＬ）の小胞を３０分間３検体で異なる指示された量のＭＴＰまたはＢＳＡとともにインキュベートした後に得られた。蛍光単位は、分析管からブランクを減じた後に得られた。ＭＴＰに関するこれらの結果からのデータ（図３Ａ）を使用して転移活性％を測定した。ＢＳＡでは、これらの値は負でありプロットされなかった。分析は、また種々の指示された量の精製されたＭＴＰを使用してＢＳＡ（０．１％）の存在または不存在下行われた（図３Ｃ）。線グラフ及び誤差バーは平均±ＳＤを表す。
【００７２】
増加した量の添加するＭＴＰの量を増加させると、検出可能な蛍光を増加させた（図３Ａ）。対照的に、ＢＳＡの存在は、検出可能な蛍光の量を減少させ、そしてＢＳＡにより解離された蛍光のクエンチングまたはＢＳＡによる供与体小胞の安定化の何れかを表し、基礎的なＴＡＧの漏洩を防ぐ。図３Ｂでは、データは、小胞間で転移を行うＴＡＧの％を測定するために転換された。実験の条件下、転移されるＴＡＧの量は、２μｇのＭＴＰで飽和に達する。飽和では、全ＴＡＧの４０％は、転移の工程であり、そしておそらくＭＴＰの最大の結合容量を示した。
【００７３】
ＢＳＡがブランクサンプルにおいて蛍光単位を低下させたため、それがＭＴＰ分析に正の効果を有するものと考えられた。その上、ＢＳＡの存在は、管の表面への吸着によるＭＴＰ及び小胞の損失を低下させるだろう。この仮定をテストするために、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を分析に使用した。図３Ｃに示されるように、ＢＳＡの存在下測定された活性は、ＢＳＡの不存在下で観察されたもののほとんど２倍であった。これは、ＢＳＡの存在下のブランク値の低下に主として起因する。ＢＳＡの存在及び不存在下のブランク値は、総計の１２．５±０．７％及び１８．５±０．５％（ｎ＝３）であった。従って、ＢＳＡの包含は、おそらく供与体小胞からの発蛍光団の漏洩を防ぐことによって、分析の感度を改善する。
【００７４】
次に、放射能ラベル及び蛍光分析により測定されるＭＴＰの比活性を比較した。放射能ラベル分析を使用する種々の調製物の比活性（毎時１ミクロｇあたりの転移％）は、１２．５±２．４（ｎ＝２７）であった。ＢＳＡの不存在下の蛍光法による比活性は、９２．６±１９．７（ｎ＝２０）であったが、一方ＢＳＡの存在下で測定された比活性は、２０４．４±３３．１（ｎ＝７）であった。従って、蛍光分析により測定される比活性は、放射能分析を使用して観察されるのよりも高かった。高い比活性は、分析の高い感度に起因するだろう。相違に関する他の理由は、これらの２つの分析に使用される異なるパラメーターであろう。放射能分析では、受容体小胞に転移するＴＡＧの量が測定される。対照的に、本実施例で記載された蛍光分析は、ＭＴＰにより転移されるＴＡＧの量を測定する。
【００７５】
【表２】
【００７６】
受容体小胞の役割
ＭＴＰ分析は、３つの成分すなわち供与体小胞、受容体小胞及びＭＴＰからなる。明らかに、供与体小胞及びＭＴＰが必要である。ＭＴＰが供与体小胞間で脂質を転移でき、そして受容体小胞が活性の測定に必要としないと考えられた。この仮定をテストするために、異なる量の供与体小胞（１ｍＬあたり４５０ｎモルのＰＣ及び１４ｎモルのＴＡＧ）を、分析緩衝液（１００μＬ）中の受容体小胞及びＭＴＰなしで（ＤＶのみ）、０．５ｇの精製したＭＴＰとともに（ＤＶ＋ＭＴＰ）、３μＬの受容体小胞とともに（ＤＶ＋ＡＶ）または３μＬの受容体小胞（２４００ｎモルＰＣ／ｍＬ）及び０．５ｇの精製したＭＴＰとともに（ＤＶ＋ＡＶ＋ＭＴＰ）インキュベートした。蛍光単位を３７℃のインキュベーション３０分後に測定した。このデータを図４Ａでプロットされる。
【００７７】
図４Ａに示されるデータを使用して、材料及び方法に記載されたように転移％を計算した。線グラフ及び誤差バーは平均±ＳＤを示す。
受容体小胞とともに（ＤＶ＋ＡＶ）または受容体小胞なしで（ＤＶのみ）供与体小胞の増加した量のインキュベーションは、同様な蛍光の読みを与え、ＭＴＰの不存在下ではＴＡＧの転移がほとんどないことを示した（図４Ａ）。これらのデータは、図１Ａにおけるブランクと一致する。ＭＴＰとともに（ＤＶ＋ＭＴＰ）供与体小胞の増加した量のインキュベーションは、蛍光がいくらか増加し、脂質のある程度の転移を示した。対照的に、蛍光の顕著な増加は、受容体小胞が反応混合物に含まれるとき（ＤＶ＋ＡＶ＋ＭＴＰ）、観察された。データを次に使用してＴＡＧの転移％を計算した。受容体小胞の不存在では（ＤＶ＋ＭＴＰ）、ＴＡＧの転移は、４％と１６％との間に及んだ。しかし、受容体小胞の存在では（ＤＶ＋ＡＶ＋ＭＴＰ）、ＭＴＰは供与体小胞に存在するＴＡＧのほとんど４０％を転移するのに関係した。これらのデータは、受容体小胞の存在が転移工程を非常に助けることを立証する。
【００７８】
ＭＴＰによる種々の受容体への異なる脂質の転移
ＭＴＰによる種々の脂質の転移に対する異なるタイプの受容体小胞の効果を検討した。まず、ＰＣまたはＰＣ及び／またはＴＡＧ小胞を受容体として使用した。これらの受容体による３検体で観察された転移％は、それぞれ３３±２．６及び３０．９±１．３であり、受容体小胞におけるＴＡＧの不存在が転移活性に顕著な効果を有しないことを示した。
【００７９】
ＭＴＰは、ＴＡＧ以外に他の脂質を転移することが知られている（非特許文献２０）。従って、実験は、この分析の適合性を評価するために行われ、ＴＡＧに加えてＣＥ及びＰＬの転移を検討した（図５）。この実験では、小単層小胞（ＰＣ／ＴＡＧ小胞）、アポＢリポ蛋白（ＶＬＤＬ及びＬＤＬの両者を含んだ）及びＨＤＬを、受容体として使用し、そして転移を４時間にわたって検討した。この実験は、図２に記載された条件の最適化前に行われた。これらの最初の実験では、インキュベーションは、転移活性の測定前に長時間行われた。
【００８０】
ＴＡＧ（Ａ−Ｃ）、コレステリルエステル（Ｄ−Ｆ）または燐脂質（Ｇ−Ｉ）を含む３つの異なるタイプの供与体小胞を使用した。受容体小胞（３μＬ；２４００ｎモルＰＣ／ｍＬ）は、小単層小胞（ＰＣ／ＴＡＧ小胞；Ａ、Ｄ及びＧ）、アポリポ蛋白Ｂ（アポＢ）リポ蛋白（ＶＬＤＬ及びＬＤＬ；Ｂ、Ｅ及びＨ）並びにＨＤＬ（１０ｍｇ蛋白／ｍＬ；Ｃ、Ｆ及びＩ）であった。異なる供与体及び受容体の小胞は、指示された時間３検体で１μｇｎｏ精製したＭＴＰ（ＭＴＰ）とともにまたはそれなしでインキュベートし、そして蛍光を材料及び方法に記載されたように測定した。線グラフ及び誤差バーは平均±ＳＤを表す。
【００８１】
結果は、供与体小胞が小単層ＰＣ／ＴＡＧ小胞（図５Ａ）及びアポＢリポ蛋白（図５Ｂ）とともにインキュベートしたときＴＡＧを転移したが、ＨＤＬとともにインキュベートしたときにはそうでなかった（図５Ｃ）。転移は、４時間のインキュベーション後蛍光単位を１０９−１７２％増加させた（図５Ａ、Ｂ）。同様に、ＭＴＰは、ＰＣ／ＴＡＧ小胞（図５Ｄ）及びアポＢリポ蛋白（図５Ｅ）の存在下でＣＥを転移したが、ＨＤＬ（図５Ｆ）の存在下ではそうではなかった。ＭＴＰは、供与体小胞がＰＣ／ＴＡＧ小胞とともにインキュベートしたとき、ＰＬを転移でき、蛍光における増加は４時間で１８６％であった（図５Ｇ）。しかし、受容体としてのアポＢリポ蛋白の存在下のＭＴＰによるＰＬの転移の検討は、解釈するのが困難であった（図５Ｈ）。これは、供与体小胞がＭＴＰの不存在下アポＢリポ蛋白とインキュベートされたとき、バックグラウンド蛍光における顕著な増大に起因した（図５Ｇのコントロールを比較；またこれらのパネルの異なるｙ値に注意すること）。また、ＭＴＰは、ＨＤＬが受容体として使用されたとき、ＰＬを転移しなかった（図５Ｉ）。これらの検討は、小単層小胞及びアポＢリポ蛋白が受容体として使用されるとき、ＭＴＰ活性が中性の脂質両者、ＴＡＧ及びＣＥを転移することを示す。
【００８２】
細胞のＭＴＰ活性の測定
次の問題は、この分析が細胞のＭＴＰ活性を測定するのに使用できるかどうかを決めることであった（表２）。ミクロソームＭＴＰは、Ｊａｍｉｌら（非特許文献１２）により記述されたデオキシコレート処理によって解離した。Ｃｏｓ−７細胞は、トランスフェクトされたかまたはＭＴＰ発現ベクターなしで、ＭＴＰ分析の特異性を測定した（秒２）。予想されたように、どんなＭＴＰも偽トランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞で検出できなかった。しかし、ＭＴＰ発現ベクターによるトランスフェクションは、他の研究（非特許文献１５、２９）と一致して、Ｃｏｓ−７細胞における増大したＭＴＰを生じた。同様に、ＭＴＰ活性は、ＨｅｐＧ２及び判別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）Ｃａｃｏ−２細胞の細胞ホモジネートで測定できた。これらの検討は、新しい方法が細胞ＭＴＰ活性を測定するのに使用できることを示す。デオキシコレート法は面倒であり、いくつかの段階を含み、そして少なくとも２日を要する。この方法を単純化するために、Ｃｈａｎｇ、Ｌｉｍａｎｅｋ及びＣｈａｎｇの方法（非特許文献３４）を評価したが、それは低張緩衝液による細胞の破壊を含みそして分析のための細胞抽出物を調製する時間は、はるかに短い。
【００８３】
ラット肝臓ミクロソームを低張緩衝液で処理し、そして解離した内容物をＭＴＰ活性測定に使用した。肝臓ミクロソーム内容物のＭＴＰの比活性（毎時１ミクロｇあたり転移％）は、０．４９８±０．０９（平均±ＳＤ、ｎ＝９）であった。
【００８４】
転移分析のために、４０−５０ｇの細胞蛋白を３検体で使用し、そして活性は１時間まで測定された。図６及び１０に示されるように、両方の方法は、同様のＭＴＰ活性を与えた。従って、低張性の処理は、時間が短くそして処理が少ないために、細胞ＭＴＰ活性を測定するのにより良い方法である。
【００８５】
ＭＴＰ活性の阻害
実験を、次にその活性に対するＭＴＰ拮抗剤の効果を測定するために行った（図７）。この目的のために、Ｊａｍｉｌら（非特許文献１２）により記述されたＭＴＰ阻害剤ＢＭＳ２００１５０を使用した。精製したＭＴＰ（１ｇ）を、指示された濃度のＭＴＰ阻害剤ＢＭＳ２００１５０の存在下３０分間供与体及び受容体の小胞とインキュベートした。図７Ａに示されるように、増大した濃度のＢＭＳ２００１５０は、精製したＭＴＰ活性の投与量依存の阻害を生じた。ＩＣ５０は、０．０８Ｍであり、そして他のもの（非特許文献１２）により報告された範囲内にあった。
【００８６】
次に、ＨｅｐＧ２細胞を２４時間異なる濃度の阻害剤とインキュベートし、そしてホモジネートをデオキシコレート法（非特許文献１２）を使用して調製しそしてＭＴＰ活性について分析した。細胞を洗い、そしてライゼートを、材料及び方法に記載されたデオキシコレート法を使用して調製した。転移分析には、４０−５０ｇの細胞蛋白を３検体で使用した。図７Ｂに示されるように、増加した濃度のＢＭＳ２００１５０は、低下した細胞ＭＴＰ活性を生じた。〜１．３ＭのＩＣ５０値は、発表された研究（非特許文献１２）と一致する。精製したＭＴＰ及び細胞ライゼートについて得られたＩＣ５０値の相違は、阻害剤と相互反応しそしてその有効性を低下させると思われる細胞ライゼート中の他の蛋白の存在に起因するだろう。これらの検討は、分析がＭＴＰ活性及び拮抗剤によるその阻害を測定するのに有用であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ミクロソームトリグリセリド転移蛋白（ＭＴＰ）によりトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）に対する異なる量の供与体及び受容体の小胞の効果をグラフで示す。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。
【図２】ＭＴＰのＴＡＧ転移活性に対する時間、温度及びＮａＣｌの効果をグラフで示す。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤを示す。
【図３】ＴＡＧ転移活性の特異性をグラフで示す。
【図４】ＭＴＰによる脂質転移における受容体小胞の役割を画くグラフである。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤを示す。
【図５】異なる受容体の存在下の種々の脂質の転移をグラフで示す。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤを示す。
【図６−Ａ】細胞ホモジネートにおけるＭＴＰ活性を測定するための２つの方法の活性を比較するグラフである。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤを示す。
【図６−Ｂ】細胞ホモジネートにおけるＭＴＰ活性を測定するための２つの方法の比活性を比較するグラフである。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤを示す。
【図７】ＢＭＳ２００１５０によるＭＴＰ活性の阻害を画くグラフである。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤを示す。
【図８】二脂質膜に埋め込まれたラベルされたトリグリセリド、ＮＢＤ−ＴＡＧを有する単層小胞の概略図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＴＰ活性に関する蛍光分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミクロソームトリグリセリド転移蛋白（ＭＴＰ）は、アポリポ蛋白Ｂ（アポＢ）リポ蛋白のアセンブリに必要なデディケートシャペロンである（レビューでは非特許文献１−６参照）。ＭＴＰは、脂質をナセントアポＢへ小胞体中で転移させそして原始的なリポ蛋白粒子を形成することによってそれをセクレチン受容性にすると考えられている（レビューでは非特許文献１−９参照）。アポＢ分泌におけるＭＴＰの脂質転移活性の重要性は、３つの独立したアプローチにより確立されている。第一に、ＭＴＰにおける突然変異は、無βリポ蛋白質血症におけるアポＢリポ蛋白の不存在と相関している（非特許文献１０、１１）。第二に、生体外でＭＴＰの脂質転移活性を阻害する拮抗剤が、生体内でアポＢ分泌を低下させることを示している（非特許文献１２−１４）。第三に、アポＢとＭＴＰとの共発現は、アポＢ及びＭＴＰを発現しない細胞内のアポＢ分泌を助けることが立証されている（非特許文献１５、１６）。その脂質転移活性に加えて、ＭＴＰがアポＢと物理的に相互反応することが知られている（非特許文献１、２）。最近、ＭＴＰは、サイトゾルから小胞体のルーメンへのトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の移入に関係している（非特許文献１７−１９）。従って、ＭＴＰが、細胞内オルガネラ内のＴＡＧの輸送及び細胞外へのその分泌に重大な役割をはたしている多機能蛋白（非特許文献２）であると思われる。
【０００３】
ＭＴＰは、放射性同位元素分析に基づいてＷｅｔｔｅｒａｕ及びＺｉｌｖｅｒｓｍｉｔにより同定かつ精製された（非特許文献２０、２１）。この分析では、放射能ラベルされたＴＡＧは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びカルジオリピンからなる供与体小胞中に配合される。これらの小胞は、ＭＴＰの存在下受容体小胞とともにインキュベートされる。１−３時間のインキュベーション後、カルジオリピン含有供与体小胞は、ＤＥ５２に結合させられそして遠心分離によって取り出される。上清に残っている放射能活性は、シンチレーション計数により定量される。この方法は、労力を要しそして時間がかかる。負に電荷された脂質例えばカルジオリピンは、ＭＴＰの脂質転移活性を阻害することが知られている（非特許文献２２）。この方法に含まれる複数の工程のために、自動化するのは難しい。そのため、ＭＴＰ活性を測定するのに簡単な１工程の方法を有するのが有利と思われる。この方法は、例えばＭＴＰ活性を部分的に阻害する化合物を同定するのに有用であろうし、それ故リポ蛋白アセンブリ及び分泌を低下させるだろう。同定された化合物は、血漿コレステロール及び細胞中のトリグリセリドレベルを低下させるための医薬として非常に望ましい。
【０００４】
いくつかの製薬企業は、ＭＴＰ活性を阻害する拮抗剤を同定している（非特許文献１２−１４、２３）。これらの企業によりとられた一般的なアプローチは、ＨｅｐＧ２細胞によりアポＢの分泌を低下させる化合物を同定しそしてＭＴＰ活性を阻害するそれらの能力を決定することである（非特許文献３、２３）。アポＢ分泌の阻害を含む一次スクリーニングの欠点は、多段階放射能活性分析を使用してＭＴＰ阻害用の多数の化合物を評価することにあるものと思われていた（非特許文献２０、２１）。この２段階スクリーニングは、ＭＴＰ活性を阻害しそしてアポＢ分泌を低下させる化合物の同定を行うことができる。驚くべきことに、種々の企業により同定された異なる化合物は、構造的に非常に類似している（非特許文献２３）。残念ながら、これらの化合物は、細胞中にＴＡＧの顕著な蓄積を生じさせ、そのため選択された化合物がアポＢ分泌の有能な阻害剤である可能性を生じさせることになる。
【０００５】
【非特許文献１】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｊ．Ｓｈｉ，ａｎｄ Ｐ．ｒｅｉｚｅｎ．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｅｍｂｌｙ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４：２２−３２．
【非特許文献２】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｊ．Ｉｑｂａｌ，Ｋ．Ａｎｗａｒ，Ｐ．Ｒａｖａ，ａｎｄ Ｋ．Ｄａｉ．２００３．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：Ｓ５００−Ｓ５０６．
【非特許文献３】Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ａ．，ａｎｄ Ａ．Ｅｌ Ａｂｂｏｕｙｉ．２００３．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ：ａｎ ｕｐｄａｔｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：Ｄ２９４−Ｄ３０５．
【非特許文献４】Ｓｈｅｌｎｅｓｓ，Ｇ．Ｓ．ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｓｅｌｌｅｒｓ．２００１．Ｖｅｒｙ−ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１２：１５１−１５７．
【非特許文献５】Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ Ｈ．Ｊａｍｉｌ．２０００．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４８６：７２−８３．
【非特許文献６】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．，Ｍ．Ｃ．Ｍ．Ｌｉｎ，ａｎｄ Ｈ．Ｊａｍｉｌ．１９９７．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３４５：１３６−１５０．
【非特許文献７】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．２０００．Ａ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｈｙｌｏｍｉｃｒｏｎｓ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１４８：１−１５．
【非特許文献８】Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ａ．１９９９．Ｃｅｌｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４４０：１−３１．
【非特許文献９】Ｆｉｓｈｅｒ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ Ｈ．Ｎ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ．２００２．Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙ：ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１７３７７−１７３８０．
【非特許文献１０】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．，Ｌ．Ｐ．Ａｇｇｅｒｂｅｃｋ，Ｍ−Ｅ．Ｂｏｕｍａ，Ｃ．Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｍｕｎｋ，Ｍ．Ｈｅｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｇ．Ｇａｙ，Ｄ．Ｊ．Ｒａｄｅｒ，ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｇｒｅｇｇ．１９９２．Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ ａｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５８：９９９−１００１．
【非特許文献１１】Ｓｈｏｕｌｄｅｒｓ，Ｃ．Ｃ．，Ｄ．Ｊ．Ｂｒｅｔｔ，Ｊ．Ｄ．Ｂａｙｌｉｓｓ，Ｔ．Ｍ．Ｅ．Ｎａｒｃｉｓｉ，Ａ．Ｊａｒｍｕｚ，Ｔ．Ｔ．Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｐ．Ｒ．Ｄ．Ｌｅｏｎｉ，Ｓ．Ｂｈａｔｔａｃｙａｒｙａ，Ｒ．Ｊ．Ｐｅａｓｅ，Ｐ．Ｍ．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｓ．Ｌｅｖｉ，Ｐ．Ｇ．Ｈ．Ｂｙｆｉｅｌｄ，Ｐ．Ｐｕｒｋｉｓｓ，ａｎｄ Ｊ．Ｓｃｏｔｔ．１９９３．Ａｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｄｅｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ９７ｋＤａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ａ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：２１０９−２１１６．
【非特許文献１２】Ｊａｍｉｌ，Ｈ．，Ｄ．Ａ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ｃ．Ｅｕｓｔｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．Ｂｒｏｏｋｓ，Ｊ．Ｋ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｊｒ．，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｒｉｃｃｉ，Ｃ−Ｈ．Ｃｈｕ，Ｔ．Ｗ．Ｈａｒｒｉｔｙ，Ｃ．Ｐ．Ｃｉｏｓｅｋ，Ｊｒ．，Ｓ．Ａ．Ｂｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ｅ．Ｇｒｅｇｇ，Ｊ．Ｒ．Ｗｅｔｔｅｒａｕ．１９９６．Ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｐｏＢ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：１１９９１−１１９９５．
【非特許文献１３】Ｈａｇｈｐａｓｓａｎｄ，Ｍ．Ｄ．Ｗｉｌｄｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｍｏｂｅｒｌｙ．１９９６．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ（ＨｅｐＧ２）．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３７：１４６８−１４８０．
【非特許文献１４】Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｆ．，ａｎｄ Ｔ．Ｇｒａｎｄ−Ｐｅｒｒｅｔ．１９９７．Ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｌｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ１００ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｓ ｐｒｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｉｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０４３５−２０４４２．
【非特許文献１５】Ｇｏｒｄｏｎ．Ｄ．Ａ．Ｈ．Ｊａｍｉｌ，Ｄ．Ｓｈａｒｐ，Ｄ．Ｍｕｌｌａｎｅｙ，Ｚ．Ｙａｏ，Ｒ．Ｅ．Ｇｒｅｇｇ，ａｎｄ Ｊ．Ｗｅｔｔｅｒａｕ．１９９４．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：７６２８−７６３２．
【非特許文献１６】Ｌｅｉｐｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｊ．Ｄ．Ｂａｙｌｉｓｓ，Ｒ．Ｊ．Ｐｅａｓｅ，Ｄ．Ｊ．Ｂｒｅｔｔ，Ｊ．ｓｃｏｔｔ，ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｓｈｏｕｌｄｅｒｓ．１９９４．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｅ ａｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ，ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２１９５１−２１９５４．
【非特許文献１７】Ｒａａｂｅ，Ｍ．，Ｍ．Ｍ．Ｖｎｉａｎｔ，Ｍ．Ａ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｃ．Ｈ．Ｚｌｏｔ，Ｊ．Ｂｊｒｋｅｇｒｅｎ，Ｌ．Ｂ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｒ．Ｌ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｇ．Ｙｏｕｎｇ．１９９９．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１２８７−１２９８．
【非特許文献１８】Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｗ．，Ｋ．Ｔｒａｎ，ａｎｄ Ｍ．Ｙａｏ．１９９９．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｗｉｔｈｉｎ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ＭｃＡ−ＲＨ７７７７ ｃｅｌｌｓ−ａ ｕｎｉｆｉｅｄ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７７９３−２７８００．
【非特許文献１９】Ｋｕｌｉｎｓｋｉ，Ａ．，Ｓ．Ｒｕｓｔａｅｕｓ，ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｖａｎｃｅ．２００２．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｏｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｌｕｍｅｎａｌ ａｃｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｎｏｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＡｐｏＢ，ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｆｏｒ ＡｐｏＢ ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３１５１６−３１５２５．
【非特許文献２０】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｄ．Ｂ．Ｚｉｌｖｅｒｓｍｉｔ．１９８４．Ａ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１０８６３−１０８６６．
【非特許文献２１】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｄ．Ｂ．Ｚｉｌｖｅｒｓｍｉｔ．１９８５．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｌｉｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．３８：２０５−２２２．
【非特許文献２２】Ｊａｍｉｌ，Ｈ．，Ｊ．Ｋ．Ｄｉｃｋｓｏｎ．Ｊｒ．，Ｃ−Ｈ．Ｃｈｕ，Ｍ．Ｗ．Ｌａｇｏ，Ｊ．Ｋ．Ｒｉｎｅｈａｒｔ，Ｓ．Ａ．Ｂｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ｅ．Ｇｒｅｇｇ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｗｅｔｔｅｒａｕ．１９９５．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６５４９−６５５４．
【非特許文献２３】Ｃｈａｎｇ，Ｇ．，Ｒ．Ｂ．Ｒｕｇｇｅｒｉ，ａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｊｒ．２００２．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＴＰ）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｒａｄｉｇｍｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．５：５６２−５７０．
【非特許文献２４】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．，Ａ．Ｂａｋｉｌｌａｈ，ａｎｄ Ｈ．Ｊａｍｉｌ．１９９７．Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３６：１３０６０−１３０６７．
【非特許文献２５】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．，Ａ．Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ｎ．Ｎａｙａｋ，ａｎｄ Ｇ．Ｓ．Ｓｈｅｌｎｅｓｓ．１９９８．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ４３０−５７０ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ａｒｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｉｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２５６１２−２５６１５．
【非特許文献２６】Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ａ．，Ｈ．Ｊａｍｉｌ，ａｎｄ Ｍ．Ｈ．Ｈｕｓｓａｉｎ．１９９８．Ｌｙｓｉｎｅ ａｎｄ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ １８％ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ａｒｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｉｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３７：３７２７−３７３４．
【非特許文献２７】Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ａ．，Ｎ．Ｎａｙａｋ，Ｕ．Ｓａｘｅｎａ，Ｒ．Ｍ．Ｍｅｄｆｏｒｄ，ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｈｕｓｓａｉｎ．２０００．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏＢ ｆｏｌｌｏｗｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏＢ−ＭＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３９：４８９２−４８９９．
【非特許文献２８】Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ａ．，ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｈｕｓｓａｉｎ．２００１．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｌｉｐｉｄｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ＭＴＰ−ｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３１４６６−３１４７３．
【非特許文献２９】Ｔｉｅｔｇｅ，Ｕ．Ｊ．Ｆ．，Ａ．Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ｃ．Ｍａｕｇｅａｉｓ，Ｋ．Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｍ．Ｍ．Ｈｕｓｓａｉｎ，ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｒａｄｅｒ．１９９９．Ｈｅｐａｔｉｃ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＴＰ）ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＶＬＤＬ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ ａｎｄ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４０：２１３４−２１３９．
【非特許文献３０】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．，Ｌ．Ｐ．Ａｇｇｅｒｂｅｃｋ，Ｐ．Ｍ．Ｌａｐｌａｕｄ，ａｎｄ Ｌ．Ｒ．ＭｃＬｅａｎ．１９９１．Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３０：４４０６−４４１２．
【非特許文献３１】Ａｔｚｅｌ，Ａ．，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｗｅｔｔｅｒａｕ．１９９３．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｌｉｐｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１０４４４−１０４５０．
【非特許文献３２】Ａｔｚｅｌ，Ａ．，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｗｅｔｔｅｒａｕ．１９９４．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３３：１５３８２−１５３８８．
【非特許文献３３】Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．１９７６．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４．
【非特許文献３４】Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｙ．，Ｊ．Ｓ．Ｌｉｍａｎｅｃｋ，ａｎｄ Ｃ．Ｃ．ｃｈａｎｇ．１９８１．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６．２９８−３０２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
理想的に、ＭＴＰ活性を阻害するがリポ蛋白分泌には部分的な作用を有する化合物が求められている。この目的のために、ＭＴＰの脂質転移活性を阻害する能力に主に関して化合物をスクリーニングできる方法を開発することが望ましい。本発明は、自動化及び高処理量スクリーニングに利用できるＭＴＰ活性を分析する簡単かつ迅速そして高感度の方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＭＴＰ活性を測定する方法及び組成物を提供する。本発明の１つの構成では、（ａ）その中に蛍光ラベルされた脂質を配合された供与体小胞を調製する段階、（ｂ）受容体小胞を調製する段階、（ｃ）供与体小胞から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰと蛍光ラベルされた脂質との結合を可能にするのに充分な時間及び条件下で、受容体小胞及びラベルされた供与体小胞とともにＭＴＰ含有細胞ホモジネートまたは単離されたＭＴＰの何れかをインキュベートする段階、そして（ｄ）ＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を測定する段階からなるＭＴＰのレベルを測定する方法が提供される。細胞ホモジネートは、動物（ヒトを含む）、昆虫及び微生物の細胞を含むがこれらに限定されないＭＴＰを発現する肝臓細胞、小腸細胞、心臓細胞または任意の他の細胞からなる。
【０００８】
本発明で使用される蛍光ラベルされた脂質は、トリグリセリド、コレステロール
エステル（ＣＥ）または燐脂質を含むがこれらに限定されない。蛍光ラベルされたトリアシルグリセロールの例は、１、２ ジオレオイル３−ＮＢＤグリセロール（ＮＢＤ−ＴＡＧ）である。小胞は、好ましくは、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢ−リポ蛋白小胞、他のリポ蛋白またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である。
【０００９】
本発明は、またＭＴＰの脂質転移活性をモジュレートする化合物を同定する方法を提供する。方法は、（ａ）供与体小胞中に蛍光ラベルされた脂質を配合する段階、（ｂ）受容体小胞を調製する段階、（ｃ）受容体小胞及びラベルされた供与体小胞の分割量とテスト化合物とを混合し、テスト化合物はＭＴＰの周知または未知のモジュレーターである段階、（ｄ）ＭＴＰを含む細胞ホモジネートまたは単離されたＭＴＰを、供与体小胞、受容体小胞及びテスト化合物を含む混合物に添加する段階、（ｅ）供与体から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰとの蛍光ラベルされた脂質の結合を可能にするのに充分な時間及び条件下、受容体小胞、ラベルされた供与体小胞、テスト化合物及びＭＴＰの初めの分割量をインキュベートする段階、（ｆ）供与体から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰとの蛍光ラベルされた脂質の結合を可能にするのに充分な時間及び条件下、受容体小胞、ラベルされた供与体小胞、テスト化合物及びＭＴＰの第二の分割量をインキュベートする段階、（ｇ）工程（ｅ）及び（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を測定する段階、そして（ｈ）工程（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を比較するとき、ＭＴＰの脂質転移活性を増大する化合物の同定を、工程（ｅ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光の増大と相関させ、一方工程（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を比較するとき、ＭＴＰの脂質転移活性を低下する化合物の同定を、工程（ｅ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光の低下と相関させる段階からなる。
【００１０】
本発明は、またＭＴＰの脂質転移活性を測定するためのキットを提供する。キットは、受容体小胞及び蛍光ラベルされた供与体小胞からなる。好ましくは、キットの蛍光ラベルされた供与体小胞は、トリグリセリド、コレステロールエステルまたは燐脂質からなる。キットに含まれる小胞は、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である。キットに含まれる小胞は、好ましくは、適切な緩衝液と混合されそしてまた安定剤例えばＢＳＡを含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＭＴＰ活性は、従来では、精製されたＭＴＰまたは細胞ホモジネートを放射能ラベルされた脂質を含む供与体小胞とともに１−３時間インキュベートし、供与体小胞を沈澱させ、そして受容体小胞に転移した放射能活性を測定することにより測定される。
【００１２】
本発明によれば、ＭＴＰに関する新規な簡単かつ迅速そして高感度の蛍光分析が提供される。この分析では、単離及び／または精製されたＭＴＰまたは細胞ホモジネートは、クエンチングされた蛍光ラベルされた脂質（例えばトリグリセリド、コレステロールエステル及び／または燐脂質）を含む供与体小胞及び異なるタイプの受容体小胞とともにインキュベートされる。細胞ホモジネートは、ＭＴＰを発現する任意の細胞から製造できる。好ましくは、細胞は、動物の肝臓細胞、小腸細胞または心臓細胞である。好ましくは、動物の細胞は、哺乳動物例えばラット、マウス、モンキーまたはヒトからである。細胞ホモジネートは、また昆虫または微生物からの細胞からなる。
【００１３】
本発明によれば、蛍光ラベルされた脂質は、トリグリセリド、コレステロールエステル（ＣＥ）または燐脂質を含むことができるが、これらに限定されない。本発明で使用されるトリグリセリドの例は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）である。本発明で使用される燐脂質の例は、ホスファチジルエタノールアミンである。
【００１４】
脂質をラベルするのに使用できる異なるタイプの蛍光化合物の例は、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾール（ＮＢＤ）、ピレンまたはボジパイ（ｂｏｄｉｐｙ）を含むがこれらに限定されない。これらの蛍光化合物によりリピドをラベルする方法は、当業者では周知でありそして製造された蛍光ラベルされた脂質も容易に入手できる。本発明で使用するには、脂質は、任意の位置に少なくとも１つの蛍光ラベルを含むことができる。例えば、トリアシルグリセロールは、任意の位置に少なくとも１つのＮＢＤを含むことができるが、一方他の位置に脂肪酸を有する。
【００１５】
ピレンラベルされた脂質の例は、以下のものを含み、それらは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手でき、そしてかれらのオン・ラインカタログに以下のようにリストされている。
【００１６】
Ｂ−３７８２
１、２−ビス−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
Ｃ−２１２
コレステリル １−ピレンブチラート
Ｄ−６５６２
１、２−ジオレオイル−３−（１−ピレンドデカノイル）−ｒａｃ−グリセロール
【００１７】
Ｈ−３６１
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＨＰＣ）
Ｈ−３７８４
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＨＰＥ）
Ｈ−３８０９
【００１８】
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、アンモニウム塩（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＰＧ）
Ｈ−３８１０
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノール、ナトリウム塩（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＨＰＭ）
【００１９】
Ｈ−３８１８
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンヘキサノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ｐｙ−Ｃ６−ＨＰＣ）
Ｐ−５８
Ｎ−（１−ピレンスルホニル）−１、２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（ｐｙＳ ＤＨＰＥ）
【００２０】
ＢＯＤＩＰＹラベルされた脂質の例は、以下のものを含み、それらはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手できそしてそれらのオン・ラインカタログに以下のようにリストされている。
【００２１】
Ｂ−７７０１
１、２−ビス−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ウンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ビス−ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬＣ１１−ＰＣ）
【００２２】
Ｂ−３７９４
２−（５−ブチル−４、４−ジフルオロ−４−ボラ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ノナノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−Ｃ４−ＢＯＤＩＰＹ（商標）５００／５１０Ｃ９−ＨＰＣ）
【００２３】
Ｃ−３９２７
コレステリル ４、４−ジフルオロ−５、７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノエート（コレステリルＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬＣ１２）
【００２４】
Ｃ−１２６８０
コレステリル ４、４−ジフルオロ−５−（４−メトキシフェニル）−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ウンデカノエート（コレステリルＢＯＤＩＰＹ（商標）５４２／５６３Ｃ１１）
【００２５】
Ｃ−１２６８１
コレステリル ４、４−ジフルオロ−５−（２−ピロリル）−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ウンデカノエート（コレステリルＢＯＤＩＰＹ（商標）５７６／５８９Ｃ１１）
【００２６】
Ｄ−３７９２
２−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬＣ１２−ＨＰＣ）
【００２７】
Ｄ−３８０３
２−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬＣ５−ＨＰＣ）
【００２８】
Ｄ−３８００
Ｎ−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１、２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬ ＤＨＰＥ）
【００２９】
Ｄ−１２６５６
Ｎ−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１、２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬジカプロイル ＰＥ）
【００３０】
Ｄ−３８１３
２−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）５３０／５５０Ｃ１２−ＨＰＥ）
【００３１】
Ｄ−３８１５
２−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）５３０／５５０Ｃ５−ＨＰＣ）
【００３２】
Ｄ−３７９９
Ｎ−（４、４−ジフルオロ−５、７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１、２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（ＢＯＤＩＰＹ（商標）５３０／５５０ ＤＨＰＥ）
【００３３】
Ｄ−３７９３
２−（４、４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）５００／５１０Ｃ１２−ＨＰＣ）
【００３４】
Ｄ−３７９５
２−（４、４−ジフルオロ−５−オクチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）５００／５１０Ｃ５−ＨＰＣ）
【００３５】
Ｄ−３８０６
２−（４、４−ジフルオロ−５−（４−フェニル−１、３−ブタジエニル）−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（商標）５８１／５９１Ｃ５−ＨＰＣ）
【００３６】
ＮＢＤラベルされた脂質は、またＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．によりカスタム合成でき、例えば、Ｄ−１６４０８：１、３−ジオレイン、２−ＮＢＤ−Ｘエステルのカスタム合成またはＢ−１８００：ＮＢＤラベルされたコレステロールオレエート（コレステロールエステル）のカスタム合成がある。
【００３７】
さらに、以下の化合物は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手でき、そしてカスタム合成を要しない。
Ｎ−００３６０（ＮＢＤ−ＰＥ）Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾール−４−イル）−１、２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム；
【００３８】
Ｎ−０３７８６（ＮＢＤ Ｃ６−ＨＰＣ）２−（６−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサノイル−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；及び
【００３９】
Ｎ−０３７８７（ＮＢＤ Ｃ１２−ＨＰＣ）２−（１２−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾール−４−イル）アミノドデカノイル−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン。
【００４０】
本発明で使用できる小胞の例は、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞を含む。本明細書で使用されそして当業者の理解とも一致するが、「単層小胞」は、１つの燐脂質二分子層を有する小胞（リポソーム）を意味する。「多重ラメラ小胞」は、いくつかの燐脂質二分子層を有する小胞（リポソーム）を意味する。図８は、二脂質（ｂｉｌｉｐｉｄ）膜に埋め込まれたラベルされたトリグリセリド、ＮＢＤ−ＴＧを有する単層小胞を概略的に画いている。受容体小胞を製造する方法は周知である。例えば、非特許文献２０、２１及び３０−３２参照。供与体小胞を製造する方法も周知である。例えば、非特許文献２０、２１、３０−３２参照。本発明によれば、目的とする供与体小胞を製造するとき、カルジオリピンを除くものであり、そして放射能ラベルされたＴＡＧは、蛍光ラベルされたＴＡＧにより置換される。
【００４１】
供与体小胞及び受容体小胞の両者は、好ましくは、ｐＨ約７．４で適切な緩衝液例えばトリス−ＨＣｌと混合される。供与体小胞及び受容体小胞は、別々に貯蔵できる。別に、小胞は、供与体／受容体の小胞の混合物が本発明の分析またはキットで直接使用できるように、ともに貯蔵できる。供与体小胞及び受容体小胞がともに貯蔵されるとき、供与体小胞対受容体小胞の比は、好ましくは、約１：４（供与体：受容体）から約１：１０（供与体：受容体）の範囲内にある。最も好ましくは、供与体対受容体の比は、約１：６である。小胞の調製物は、さらにそれぞれ約１５０ｍＭ及び１ｍｇ／ｍＬの最終濃度へのＮａＣｌ及びＢＳＡの添加によって安定化できる。
【００４２】
ＭＴＰは、周知の方法を使用して異なる源から単離され精製できる。例えば非特許文献２０及び２１参照。例えば、ＭＴＰは、前記のようにウシの肝臓から単離できる（非特許文献２０及び２１）。ヒトのＭＴＰは、非特許文献１５に記載されているように、ＭＴＰに関するコーディング配列からなる発現ベクターにより培養細胞をトランスフェクトすることにより調製できる。これらの文献及び他の引用した参考文献の記述は、もし充分に述べられているならば、本明細書において参考として引用される。
【００４３】
本発明によれば、ＭＴＰ媒介脂質転移による蛍光の増大は、短時間の後に測定できる。本発明の方法は、ＭＴＰ発現プラスミドによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞及びＨｅｐＧ２、Ｃａｃｏ−２細胞のＭＴＰ活性を測定するのに使用して成功した。その上、本発明の方法は、その拮抗剤による細胞ＭＴＰ及び精製されたＭＴＰの阻害を研究するのに有用である。方法は、自動化に使用でき、そして大規模な処理量のスクリーニングに容易に採用できる。
【００４４】
さらに、本発明は、種々の目的例えば同定、モジュレーション、診断などに任意のサンプル中のＭＴＰを分析するのに使用できる方法を提供する。例えば、方法は、精製されたＭＴＰサンプル、細胞のライン、組織などに存在するＭＴＰの活性を分析するのに使用できる。本発明により提供される分析は、非常に多面的であり、そして蛍光ラベルを含むＭＴＰによる任意の脂質の転移を測定できる。さらに、ＭＴＰ活性を測定する本発明の方法は、簡単かつ迅速である。それらは、供与体小胞と受容体小胞との間の脂質の転移中に生ずるＭＴＰと発蛍光団との結合による蛍光の増大の測定に基づく。
【００４５】
本発明の方法は、ＭＴＰを発現することが知られている細胞中の細胞活性を忠実に測定し、そしてＭＴＰを発現しない細胞中の活性は測定しない（図１）。その上、方法は、従来技術の放射性同位元素分析を使用して同定された拮抗剤の同様な阻害性を発揮する（図７）。ＭＴＰは、受容体小胞の存在下の顕著に高い活性を示す（図４）。受容体小胞の不存在下のＭＴＰの低い脂質結合活性は、脂質転移工程中の異なる受容体小胞の役割を理解する独特な機会をもたらす。
【００４６】
従って、本発明は、ＭＴＰ活性の測定に簡単かつ迅速な蛍光分析を提供する。新しい方法の利点は、容易さ、迅速さ、高感度、負に電荷した脂質の使用の回避、精製した細胞ＭＴＰによる異なる脂質転移活性の研究における多様性、拮抗剤の阻害活性を測定する能力並びに放射能活性の使用の先行性を含む。本発明による蛍光分析は、容易に自動化されそして大規模の処理量のスクリーニングに使用できる。このアプローチは、ＭＴＰ活性を部分的に阻害する化合物を同定しそして恐らく細胞中のＴＡＧ蓄積に関係する望ましくない副作用を最低にするために有用である。ＭＴＰが、デディケートされたリポ蛋白アセンブリシャペロンである以外の機能を有すると思われる多機能の蛋白であることが明らかになってきている。本発明による蛍光分析に基づくスクリーニングによって同定された化合物は、リポ蛋白アセンブリ及び分泌に無関係なＭＴＰの他の機能の同定に有用であろう。
【００４７】
本発明によれば、ＭＴＰ分析は、基本的に、３つのコンポーネントすなわち供与体小胞、受容体小胞及びＭＴＰからなる。本発明の方法は、分析混合物のすべての３つのコンポーネント及び時間と一次的な関係を示す（図１−４）。
【００４８】
代表的な分析は、以下に概説するように行うことができる。以下にリストされた異なる化合物の量は、もちろん、異なる化合物間の比が比較的同じである限り、変化できる。４つの異なる条件（ブランク、総計、正のコントロール及びテスト）が、各分析に勧められる。すべての分析では、反応は、ＭＴＰ源の最後の添加により開始する。受容体小胞及び供与体小胞のそれぞれの約３μＬをピペットで蛍光ミクロタイター（ブランク）プレートに注ぐ。２ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリスｐＨ７．４の約１０μＬ、及び１．５ＭのＮａＣｌ中の１％ＢＳＡストックの１０μＬを添加する。本明細書で記載された分析に使用される小胞の正確な数は、日常的に定量するのは難しい。しかし、小胞を定量するより容易な方法は、異なる小胞調製物中に存在する燐脂質及びトリグリセリドを測定することができる。従って、３μＬの供与体小胞は、１ｍＬあたり約４５０ｎモルのホスファチジルコリン（ＰＣ）及び約１４ｎモルのトリグリセリドに相関する。供与体小胞の濃度の範囲は、使用できる。好ましい範囲は、例えば約２００−約６００ｎモルのホスファチジルコリン（ＰＣ）及び７−２０ｎモルのトリグリセリドからの任意のものである。３μＬの受容体小胞は、約２４００ｎモルＰＣ／ｍＬに相当する。しかし、小胞の濃度の範囲が使用でき、例えば約１４００−約３４００ｎモルＰＣ／ｍＬからの任意のものである。
【００４９】
ブランクでは、コントロール緩衝液（正のコントロール及びテストサンプルのＭＴＰ源を含む）の必要量が添加され、そして容量を水により約１００μＬにする。正のコントロールでは、周知の量のＭＴＰ源を添加し、そして容量を水により約１００μＬにする。テストでは、未知のサンプルを添加し、そして最終の分析の容量にする。総計では、約３μＬの供与体小胞及び約９７μＬのイソプロパノールのみを添加する。混合物を約３０分間約３７℃でインキュベートする。蛍光単位は、それぞれ４６０−４７０ｎｍ及び５３０−５５０ｎｍの励起波長及び発光波長を使用して測定される。低い転移活性の場合には、インキュベーション時間は、延長できる。事実、同じタイタープレートは、時間による蛍光の増加を測定するために数回使用できる。しかし、発蛍光団は、長時間ではイソプロパノール中で不安定である。従って、３０分より長い時間では、３０分以内で測定される読み取りからの合計量が使用されるべきである。小胞及び正のコントロールを含む分析の成分は、本明細書で記述したように製造され、そしてまたＣｈｙｌｏｓ、Ｉｎｃ．（Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，ＮＹ）から入手できる。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、供与体小胞及び受容体小胞は、前述のように混合されて、ともに貯蔵されそして使用される。この態様では、分析が行われるとき、小胞（供与体及び受容体の両者）の唯一のピペット使用の段階が必要とされる。
【００５１】
小胞は、好ましくは、約７．４のｐＨで、適切な緩衝液例えばトリスＨＣｌと混合される。他の緩衝液も使用でき、例えばホスフェート緩衝液及びＨＥＰＥＳが使用できる。好ましい態様では、ＮａＣｌを添加して約１５０ｍＭの最終濃度にする。ＮａＣｌストック溶液（例えば３Ｍ）を製造しそして次に希釈して最終濃度にする。他の塩例えばＫＣｌ及びＭｇＣｌ２も使用できる。好ましくは、ＢＳＡは、小胞を安定化するために、添加して約１ｍｇ／ｍＬの最終濃度にする。ストック溶液（例えば２０ｍｇＢＳＡ／ｍＬ）を作り、次に希釈して最終濃度にする。なお他の態様では、インキュベーション段階を室温で行うことができる。
【００５２】
蛍光脂質を含む供与体小胞及び受容体小胞は、実施例１で記載したように調製される。好ましい態様では、等容量の供与体小胞及び受容体小胞が混合される。代表的な分析方法は、以下の通りである。
【００５３】
ｉ）以下の表に記載されたように、３検体の小胞を蛍光ミクロタイター（ブランク）プレートにピペットで加える。
ｉｉ）水、サンプルなどを加える。５分間待って成分を室温にする。
ｉｉｉ）コントロール及びテストでＭＴＰを加えることにより反応を開始しそして総計にイソプロパノールを加える。
ｉｖ）室温で３０分間インキュベートする。
【００５４】
【表１】
【００５５】
ＭＴＰ活性の測定：それぞれ４６０−４７０ｎｍ及び５３０−５５０ｎｍの励起波長及び発光波長を使用して蛍光単位（ＦＵ）を測定する。
ＭＴＰ活性の計算：
コントロール（Ｃ）中の転移％：［コントロール（ＦＵ）−ブランク（ＦＵ）］／［（総計（ＦＵ）−ブランク（ＦＵ）］×１００
テストサンプル（Ｄ）中の転移％：［テスト（ＦＵ）−ブランク（ＦＵ）］／［（総計（ＦＵ）−ブランク（ＦＵ）］×１００
【００５６】
ＭＴＰの脂質転移活性をモジュレートする化合物を同定する方法は、また本発明により提供される。方法は、（ａ）供与体小胞中に蛍光ラベルされた脂質を配合する段階、（ｂ）受容体小胞を調製する段階、（ｃ）テスト化合物と受容体小胞及びラベルされた供与体小胞の分割量とを混合し、テスト化合物はＭＴＰの周知または未知のモジュレーターである段階、（ｄ）ＭＴＰを含む細胞ホモジネートまたは単離されたＭＴＰを、供与体小胞、受容体小胞及びテスト化合物を含む混合物に添加する段階、（ｅ）供与体小胞から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰとの蛍光ラベルされた脂質の結合を可能にするのに充分な時間及び条件下、受容体小胞、ラベルされた供与体小胞、テスト化合物及びＭＴＰの初めの分割量をインキュベートする段階、（ｆ）供与体小胞から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰとの蛍光ラベルされた脂質の結合を可能にするのに充分な時間及び条件下、受容体小胞、ラベルされた供与体小胞、テスト化合物及びＭＴＰの第二の分割量をインキュベートする段階、（ｇ）工程（ｅ）及び（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を測定する段階、そして（ｈ）工程（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を比較するとき、ＭＴＰの脂質転移活性を増大する化合物の同定を、工程（ｅ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光の増大と相関させ、一方工程（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を比較するとき、ＭＴＰの脂質転移活性を低下する化合物の同定を、工程（ｅ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光の低下と相関させる段階からなる。
【００５７】
本発明の他の構成では、ＭＴＰの脂質転移活性を測定するためのキットが提供される。キットは、前述のように、受容体小胞及び蛍光ラベルされた供与体小胞からなる。好ましくは、蛍光ラベルされた供与体小胞は、トリグリセリド、コレステロールエステルまたは燐脂質からなる。他の好ましい態様では、トリグリセリドは、ＮＢＤラベルを含む任意のトリグリセリド例えば１、２、ジオレイル ３−ＮＢＤグリセロール（ＮＢＤ−ＴＡＧ）である。他の好ましい態様では、燐脂質は、ホスファチジルエタノールアミンである。
【００５８】
小胞は、好ましくは、約７．４のｐＨのトリスＨＣｌと混合される。他の緩衝液も使用でき、例えばホスフェート緩衝液及びＨＥＰＥＳがある。
キットの一部を形成する受容体及び／または供与体の小胞は、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞を含むことできる。小胞は、ＨＳＡの添加により安定化される。
【００５９】
以下の実施例は、本発明をさらに説明しそして本発明の範囲を制限することを決して意味しない。
【００６０】
（実施例）
実施例 １（材料及び方法）
材料
ＭＴＰを放射能活性分析（非特許文献２０、２１）を使用してウシの肝臓から精製し、そして既に使用されている（非特許文献２４−２９）。ＰＣ及びＴＡＧはＡｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から入手した。蛍光（ニトロベンゾオキサジアゾール）ラベルされたＴＡＧは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手した。蛍光ラベルされたコレステリルエステル（ＣＥ）及び燐脂質（ＰＬ）を含む小胞は、それぞれＲｏａｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）及びＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から入手した。イソプロパノール及び他の化学品は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。受容体小胞は、Ｗｅｔｔｅｒａｕ及び協力者により記載されたように調製した（非特許文献２０、２１、３０−３２）。供与体小胞もそれらの製造方法に従って作られるが、ただしカルジオリピンは省かれそして放射能ラベルされたＴＡＧは、蛍光ラベルされたＴＡＧにより置換された。既知量の蛍光脂質をイソプロパノールで希釈して標準曲線を作り、そして小胞中のラベルされた脂質の量は、イソプロパノールによるそれらの破壊後に決定された。小胞中のトリオレインの量は、比色定量分析（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ；Ｓｉｇｍａ）により定量した。ＭＴＰ阻害剤ＢＭＳ２００１５０（ジフェニル−プロピル−ピペリジニル−ジヒドロイソ−インドール）は記述されており（非特許文献１２）、そしてＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）のＨａｒｉｓ Ｊａｍｉｌ博士からの貴重な贈り物である。
【００６１】
転移分析
分析は、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ（商標）２ Ｂｌａｃｋ“Ｕ”Ｂｏｔｔｏｍ Ｍｉｃｒｏ−ｔｉｔｅｒ（商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）で行われた。穴に、３Ｌの供与体小胞（１ｍＬあたり４５０ｎモルのＰＣ及び１４ｎモルのＴＡＧ）、３Ｌの受容体小胞（２４００ｎモルＰＣ／ｍＬ）、１０Ｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４、２ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、蒸留水（添加して最終の分析容量を１００Ｌにする）、そして３検体の精製したＭＴＰ（０．１−１．５ｇ）を加えた。いくつかの実験では、ＮａＣｌ及びＢＳＡを加えてそれぞれ１５０ｍＭ及び１ｍｇ／ｍＬの最終濃度とした。プレートを異なる時間３７℃または室温でインキュベートし、そして４６０ｎｍの励起波長及び５３０ｎｍの発光波長を使用して蛍光プレートリーダー（７６２０Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）により読みとった。ブランク値を決定するために、ＭＴＰを穴から除いた。供与体小胞の総計蛍光は、３μＬの供与体小胞へ９７μＬのイソプロパノールを加えることにより決定した。ＭＴＰ阻害を検討するために、異なる濃度のＢＭＳ２００１５０を、ＭＴＰの添加前に反応混合物に添加した。ＭＴＰ活性（転移％）は、以下の式により計算した。転移％（分析穴中の任意の蛍光単位−ブランク値）／（総計蛍光単位−ブランク値）×１００。比活性は、毎時１ミクロｇあたりの転移％として示される。
【００６２】
Ｃｏｓ−７細胞のトランスフェクション
Ｃｏｓ−７細胞を、１０％ウシ胎児血清及び１％抗菌−抗かび剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を補足したＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で培養した（３７℃、５％ＣＯ２、含湿チェンバー）。細胞（１×１０６）を、トランスフェクションの２４時間前に７５ｃｍ２フラスコに入れた。トランスフェクションのときに、細胞は約５０−６０％密集生長していた。ＭＴＰ発現ベクター（非特許文献１５）ｐＲｃ−ｈＭＴＰ（７ｇ；サイトメガウイルスプロモーターのコントロール下ヒトＭＴＰを発現する）を、２１ＬのＦｕＧＥＮＥ−６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）により複合されたＣｏｓ−７細胞中に導入した。細胞を約７２時間７ｍＬの媒体中で３７℃及び５％ＣＯ２に維持した。Ｃｏｓ−７細胞は、またＦｕＧＥＮＥ−６単独により処理され（偽トランスフェクション）、そしてコントロールとして使用された。
【００６３】
細胞ホモジネートにおけるＭＴＰ活性の測定
細胞ホモジネートにおけるＭＴＰ活性は、Ｊａｍｉｌら（非特許文献１２）に記載されたように測定された。密集成長した細胞単層を氷冷した滅菌ＰＢＳ、ｐＨ７．４により洗い、５ｍＬのＰＢＳにかきとり、１５ｍＬ容の円錐管に移し、そして遠心分離（２５００ｒｐｍ、１０分、室温）によりペレット化した。この点で、細胞のペレットを７０℃で貯蔵した。ホモジネーションのために、７５０μＬのホモジネーション緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭＫＣｌ、及び５ｍＭＥＤＴＡ）及び７．５μＬのプロテアーゼ阻害剤反応混液（カタログナンバーＰ２７１４、Ｓｉｇｍａ）を細胞のペレットに添加した。細胞を次に３ｍＬの注射器に付けた針（２９Ｇ、１１／２インチ）を通る吸引の繰り返しにより懸濁し、そしてボールベアリングホモジナイザー（クリアランス０．２５３インチ、１０パス）で氷上でホモジナイズした。細胞ホモジネートを氷蔵し、そして蛋白濃縮物をＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してＢｒａｄｆｏｒｄ法（非特許文献３３）により測定し、そしてＢＳＡを標準として使用した。細胞ホモジネートを、１．５ｍｇ／ｍＬの蛋白濃度になるようにホモジネーション緩衝液により希釈した。ＭＴＰをデオキシコレート処理（非特許文献１２）によりミクロソームから解離した。この目的のために、細胞ホモジネートを、１０分の１容量の０．５４％ナトリウムデオキシコレート、ｐＨ７．４の添加により０．０５４％デオキシコレートに調節し、そしてときどき撹拌しつつ３０分間氷上に放置した。細胞膜を次に１０℃で１時間５００００ｒｐｍでＳＷ５５ Ｔｉローターでの遠心分離によって除いた。上清を１５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、４０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．０２％ＮａＮ３に対して１２−１４ｋＤａカットオフ透析バッグで透析し、１時間後の第一のチェンジそして２時間後の第二のチェンジそして１晩の透析を行った。細胞ホモジネートを透析バッグから取り出し、そして蛋白の測定及びＭＴＰ分析に使用した。阻害の研究のために、ＨｅｐＧ２細胞を２４時間異なる濃度のＭＴＰ阻害剤ＢＭＳ２００１５０とインキュベートし、そして細胞から得られた細胞ホモジネートをＭＴＰ分析に使用した。
【００６４】
細胞ＭＴＰを分析するさらに迅速な方法を開発するために、Ｃｈａｎｇ、Ｌｉｍａｎｅｋ及びＣｈａｎｇ（非特許文献３４）により記載された方法を細胞の破壊について評価した。この方法では、細胞はまず低張緩衝液に曝し、次にプレートからかきとった。低張緩衝液への曝露は、細胞の膨脹を生じさせ、そしてかきとりはこれらの細胞を破壊した。細胞の単層を４℃で、２回氷冷のＰＢＳにより洗い、そして１回５ｍＬの１ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭＥＧＴＡ及び１ｍＭＭｇＣｌ２で洗った。細胞を次に５ｍＬの氷冷の１ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭＥＧＴＡ及び１ｍＭＭｇＣｌ２中で室温で２分間インキュベートした。緩衝液を吸引し、そして０．５ｍＬの同じ緩衝液を細胞に添加した。細胞をかきとり、そして氷冷した管に集め、撹拌し、遠心分離（ＳＷ５５ Ｔｉローター、５００００ｒｐｍ、１０℃、１時間）し、そして上清をＭＴＰ分析及び蛋白の測定に使用した。
【００６５】
ラット肝臓ミクロソームにおけるＭＴＰ活性の測定
ラットの肝臓のミクロソームを、僅かに改変したＷｅｔｔｅｒａｕ及びＺｉｌｖｅｒｓｍｉｔ（非特許文献２０、２１）により記述されたように調製した。簡単に、２ｇのラット肝臓を細片に切断し、そして２回氷冷のＰＢＳにより洗った。細片を次にＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを使用して２ｍＬの５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭＥＤＴＡ、２５０ｍＭスクロース及び０．０２％ナトリウムアジド中でホモジナイズし、そして遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎミクロ遠心分離器、１０９００ｒｐｍ、３０分、４℃）した。上清を保持しそして濃ＨＣｌによりｐＨ５．１に調節し、３０分間冷却して撹拌し、そして遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎミクロ遠心分離器、１３０００ｒｐｍ、３０分、４℃）した。ペレットを２ｍＬの１ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭＥＧＴＡ及び１ｍＭＭｇＣｌ２中に懸濁し、撹拌しそして超遠心分離（ＳＷ５５ Ｔｉローター、５００００ｒｐｍ、１０℃、１時間）し、そして上清をＭＴＰ分析及び蛋白の測定に使用した。
【００６６】
実施例 ２
分析条件の最適化
ＭＴＰに関する蛍光分析を標準化するために、ＴＡＧを小単層ＰＣ小胞（供与体小胞）中に配合した。封入が発蛍光団のクエンチングを生ずることが予想された。事実、イソプロパノールによる増加した量の供与体小胞の破壊は、増加した測定可能な蛍光を生じた（図１Ａ、総計）。これは、小胞中に存在する全量の蛍光を表す。破壊の前に、この蛍光は、それは小胞でクエンチされるために、検出できない。また、供与体小胞が安定でありそしてＭＴＰの不存在下発蛍光団を解離しないと思われた。安定性を測定するために、供与体小胞は受容体小胞と混合され、そしてＭＴＰの不存在下の蛍光を３０分間後に測定した（図１Ａ、ブランク）。ブランクの蛍光値は、総計の１３％及び１９％［１５．７±２．７％（平均ＳＤ；ｎ＝３）］に及んだ。ブランクの値は、おそらく、発蛍光団の小さい漏洩を表す。転移のためのＭＴＰによる供与体小胞からのＴＡＧの抽出が、増加した検出可能な蛍光を表すものと仮定された。増加した量の供与体小胞とともに一定量のＭＴＰ及び受容体小胞をインキュベートすることは、蛍光の増加した検出を生じ、ＭＴＰによるＴＡＧの転移を示した（図１Ａ、転移）。「転移」は、小胞間でＭＴＰにより転移されるＴＡＧの量を表す。転移の間、ＭＴＰに結合した発蛍光団は、水性の環境に最も露出されたようであり、蛍光計により検出できるようになる。蛍光単位は、ブランク値より４０−４７％高かった。次に、データを使用してＴＡＧの転移％を計算した（図１Ｂ）。転移活性の％は供与体小胞の２μＬまで増加し（２０ｐモルのＴＡＧ）、そしてその後飽和するように見える。次に、異なる濃度の受容体小胞の作用が検討された。これらの実験では、一定量のＭＴＰ及び供与体小胞が異なる容量の受容体小胞とともにインキュベートされた（図１Ｃ）。転移されたＴＡＧの量は、増大した量の受容体小胞とともに増加し、そして２μＬで飽和した。低濃度の受容体小胞での転移の増加は、これらの小胞が分析条件において制限されたことを示した。しかし、２μＬ以上では、分析は受容体小胞の濃度に無関係になった。注意すべきことは、増大した濃度の受容体小胞による検出可能な蛍光の低下がないことであった。これは、ＭＴＰが小胞間で脂質を転移しそして受容体小胞への脂質の一方向溶着を生じさせないことを示す。これらの条件下では、ＭＴＰは、供与体小胞に存在する全ＴＡＧの２０％を転移する方法であった（図１Ｄ）。次の検討では、３μＬの受容体小胞を使用した。
【００６７】
分析内変量係数（ＣＶ）を測定するために、転移分析は、０．５ｇのＭＴＰ、３μＬの供与体小胞及び３μＬの受容体小胞を使用して１０本の管で行われた。観察された転移％は、１９．９±１．８（平均±ＳＤ；ｎ＝１０）であり、そして分析内ＣＶは０．０９であった。同様に、分析内変量を評価した。１μｇのＭＴＰを使用する３検体で行われた７つの異なる独立した測定の比較は、０．１９の分析内ＣＶを示した。これらの実験で観察された転移％は、３４．５±３．０であった。
【００６８】
図１は、ミクロソームトリグリセリド転移蛋白（ＭＴＰ）によるトリグリセリド（ＴＡＧ）の転移に対する供与体小胞及び受容体小胞の異なる量の効果を示す。Ａ：総計。異なる指示された容量の供与体小胞を、１００μＬのイソプロパノールの添加により破壊し、そして蛍光単位を直ぐに測定した。注意すべきことは、この値が小胞に存在する発蛍光団の全量を表し、そして「ブランク」及び「転移」値の単純な合計ではないことである。ブランク：異なる容量の供与体小胞及び３μＬの受容体小胞を、実施例１の材料及び方法に記載されたように分析緩衝液（１００μＬ）でインキュベートし、そして蛍光単位を３７℃のインキュベーションの３０分後に測定した。Ｃ。転移。インキュベーションは、ブランクについて記述されたのと同じであるが、ただしこれらのサンプルは、また０．５ｇの精製したＭＴＰを含んだ。これは、所定の時間ＭＴＰにより移動される脂質の量を表す。転移中、ＭＴＰ結合蛍光脂質は、水性環境に最も露出されるようであり、そして蛍光計により検出される。Ｂ：Ａからのデータは、材料及び方法に記載されたようにＴＡＧの転移％を計算するのに使用された。供与体小胞中のＴＡＧ濃度は、１４ｐモル／ｍＬであった。Ｃ：供与体小胞（３μＬ）を、０．５ｇの精製したＭＴＰとともに異なる容量の受容体小胞とインキュベート（３０分間、３７℃）した。蛍光単位は、分析管で観察された単位からブランクの蛍光単位を減ずることにより得られた。Ｄ：Ｃからのデータを使用して実施例１、材料及び方法に記載されたように転移％を計算した。この目的のため、ブランク及び総計の蛍光単位は、実施例１、材料及び方法に記載されたように、同時に３検体で測定された。線グラフ及び誤差のバーは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。
【００６９】
実験を次にＭＴＰ活性に必要な時間、温度及びＮａＣｌ濃度の効果を測定するのに行った（図２）。異なる指示された量のＭＴＰを、実施例１、材料及び方法に記載されたように受容体小胞及び供与体小胞とインキュベートした。適切な総計及びブランクを実施例１、材料及び方法に記載されたように含んだ。蛍光の読みは、ミクロプレートリーダーを使用して３検体で指示された時間で測定された。ＴＡＧの転移％は、時間に対してプロットされる。Ｂ：温度。実験は、２枚の異なるミクロタイタープレートで行われた。精製されたＭＴＰ（０．２５ｇ／穴）を、３検体で受容体小胞及び供与体受容体とインキュベートした。１枚のプレートは３７℃でインキュベートされ、そして他のものは室温（ＲＴ）で放置した。蛍光の読みは、室温（２２℃）で異なる時点でなされた。Ｃ：ＮａＣｌの効果。供与体小胞（３μＬ）、受容体小胞（３μＬ）及びＭＴＰ（１μｇ）を、種々の指示された濃度のＮａＣｌの存在下１ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４及び２ｍＭＥＤＴＡ中で３０分間３検体でインキュベートした。線グラフ及び誤差のバーは平均±ＳＤを表す。
【００７０】
使用されるＭＴＰのすべての異なる濃度で、ＴＡＧ転移活性は、３０分まで時間とともに増大した（図２Ａ）。その時間後、転移活性は飽和し始めた。転移活性に対する温度の効果が検討された（図２Ｂ）。ＭＴＰの脂質転移活性は、室温（２２℃）及び３７℃で同じであり、活性に対する温度の顕著な効果がないことを示していた。これらの結果は、ＭＴＰが２２℃で最適に活性であることを示しているものと思われる。ＭＴＰ活性に対するＮａＣｌの効果（図２Ｃ）も測定された。ＮａＣｌを１５０ｍＭまで濃度を増加させると、ＭＴＰ活性は増大した。より高い濃度のＮａＣｌは、転移活性を阻害するように思われる。それゆえ、３０分間のインキュベーション及び１５０ｍＭＮａＣｌがＭＴＰ活性を測定するのに最適であると結論される。
【００７１】
次に、ＴＡＧ転移に対する異なる濃度の精製ＭＴＰ及びＢＳＡを使用する分析の特異性を検討した（図３）。図３Ａに示される結果は、供与体［３μＬ；１ｍＬあたり４５０ｎモルのホスファチジルコリン（ＰＣ）及び１４ｎモルのＴＡＧ］及び受容体（３μＬ；２４００ｎモルＰＣ／ｍＬ）の小胞を３０分間３検体で異なる指示された量のＭＴＰまたはＢＳＡとともにインキュベートした後に得られた。蛍光単位は、分析管からブランクを減じた後に得られた。ＭＴＰに関するこれらの結果からのデータ（図３Ａ）を使用して転移活性％を測定した。ＢＳＡでは、これらの値は負でありプロットされなかった。分析は、また種々の指示された量の精製されたＭＴＰを使用してＢＳＡ（０．１％）の存在または不存在下行われた（図３Ｃ）。線グラフ及び誤差バーは平均±ＳＤを表す。
【００７２】
増加した量の添加するＭＴＰの量を増加させると、検出可能な蛍光を増加させた（図３Ａ）。対照的に、ＢＳＡの存在は、検出可能な蛍光の量を減少させ、そしてＢＳＡにより解離された蛍光のクエンチングまたはＢＳＡによる供与体小胞の安定化の何れかを表し、基礎的なＴＡＧの漏洩を防ぐ。図３Ｂでは、データは、小胞間で転移を行うＴＡＧの％を測定するために転換された。実験の条件下、転移されるＴＡＧの量は、２μｇのＭＴＰで飽和に達する。飽和では、全ＴＡＧの４０％は、転移の工程であり、そしておそらくＭＴＰの最大の結合容量を示した。
【００７３】
ＢＳＡがブランクサンプルにおいて蛍光単位を低下させたため、それがＭＴＰ分析に正の効果を有するものと考えられた。その上、ＢＳＡの存在は、管の表面への吸着によるＭＴＰ及び小胞の損失を低下させるだろう。この仮定をテストするために、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を分析に使用した。図３Ｃに示されるように、ＢＳＡの存在下測定された活性は、ＢＳＡの不存在下で観察されたもののほとんど２倍であった。これは、ＢＳＡの存在下のブランク値の低下に主として起因する。ＢＳＡの存在及び不存在下のブランク値は、総計の１２．５±０．７％及び１８．５±０．５％（ｎ＝３）であった。従って、ＢＳＡの包含は、おそらく供与体小胞からの発蛍光団の漏洩を防ぐことによって、分析の感度を改善する。
【００７４】
次に、放射能ラベル及び蛍光分析により測定されるＭＴＰの比活性を比較した。放射能ラベル分析を使用する種々の調製物の比活性（毎時１ミクロｇあたりの転移％）は、１２．５±２．４（ｎ＝２７）であった。ＢＳＡの不存在下の蛍光法による比活性は、９２．６±１９．７（ｎ＝２０）であったが、一方ＢＳＡの存在下で測定された比活性は、２０４．４±３３．１（ｎ＝７）であった。従って、蛍光分析により測定される比活性は、放射能分析を使用して観察されるのよりも高かった。高い比活性は、分析の高い感度に起因するだろう。相違に関する他の理由は、これらの２つの分析に使用される異なるパラメーターであろう。放射能分析では、受容体小胞に転移するＴＡＧの量が測定される。対照的に、本実施例で記載された蛍光分析は、ＭＴＰにより転移されるＴＡＧの量を測定する。
【００７５】
【表２】
【００７６】
受容体小胞の役割
ＭＴＰ分析は、３つの成分すなわち供与体小胞、受容体小胞及びＭＴＰからなる。明らかに、供与体小胞及びＭＴＰが必要である。ＭＴＰが供与体小胞間で脂質を転移でき、そして受容体小胞が活性の測定に必要としないと考えられた。この仮定をテストするために、異なる量の供与体小胞（１ｍＬあたり４５０ｎモルのＰＣ及び１４ｎモルのＴＡＧ）を、分析緩衝液（１００μＬ）中の受容体小胞及びＭＴＰなしで（ＤＶのみ）、０．５ｇの精製したＭＴＰとともに（ＤＶ＋ＭＴＰ）、３μＬの受容体小胞とともに（ＤＶ＋ＡＶ）または３μＬの受容体小胞（２４００ｎモルＰＣ／ｍＬ）及び０．５ｇの精製したＭＴＰとともに（ＤＶ＋ＡＶ＋ＭＴＰ）インキュベートした。蛍光単位を３７℃のインキュベーション３０分後に測定した。このデータを図４Ａでプロットされる。
【００７７】
図４Ａに示されるデータを使用して、材料及び方法に記載されたように転移％を計算した。線グラフ及び誤差バーは平均±ＳＤを示す。
受容体小胞とともに（ＤＶ＋ＡＶ）または受容体小胞なしで（ＤＶのみ）供与体小胞の増加した量のインキュベーションは、同様な蛍光の読みを与え、ＭＴＰの不存在下ではＴＡＧの転移がほとんどないことを示した（図４Ａ）。これらのデータは、図１Ａにおけるブランクと一致する。ＭＴＰとともに（ＤＶ＋ＭＴＰ）供与体小胞の増加した量のインキュベーションは、蛍光がいくらか増加し、脂質のある程度の転移を示した。対照的に、蛍光の顕著な増加は、受容体小胞が反応混合物に含まれるとき（ＤＶ＋ＡＶ＋ＭＴＰ）、観察された。データを次に使用してＴＡＧの転移％を計算した。受容体小胞の不存在では（ＤＶ＋ＭＴＰ）、ＴＡＧの転移は、４％と１６％との間に及んだ。しかし、受容体小胞の存在では（ＤＶ＋ＡＶ＋ＭＴＰ）、ＭＴＰは供与体小胞に存在するＴＡＧのほとんど４０％を転移するのに関係した。これらのデータは、受容体小胞の存在が転移工程を非常に助けることを立証する。
【００７８】
ＭＴＰによる種々の受容体への異なる脂質の転移
ＭＴＰによる種々の脂質の転移に対する異なるタイプの受容体小胞の効果を検討した。まず、ＰＣまたはＰＣ及び／またはＴＡＧ小胞を受容体として使用した。これらの受容体による３検体で観察された転移％は、それぞれ３３±２．６及び３０．９±１．３であり、受容体小胞におけるＴＡＧの不存在が転移活性に顕著な効果を有しないことを示した。
【００７９】
ＭＴＰは、ＴＡＧ以外に他の脂質を転移することが知られている（非特許文献２０）。従って、実験は、この分析の適合性を評価するために行われ、ＴＡＧに加えてＣＥ及びＰＬの転移を検討した（図５）。この実験では、小単層小胞（ＰＣ／ＴＡＧ小胞）、アポＢリポ蛋白（ＶＬＤＬ及びＬＤＬの両者を含んだ）及びＨＤＬを、受容体として使用し、そして転移を４時間にわたって検討した。この実験は、図２に記載された条件の最適化前に行われた。これらの最初の実験では、インキュベーションは、転移活性の測定前に長時間行われた。
【００８０】
ＴＡＧ（Ａ−Ｃ）、コレステリルエステル（Ｄ−Ｆ）または燐脂質（Ｇ−Ｉ）を含む３つの異なるタイプの供与体小胞を使用した。受容体小胞（３μＬ；２４００ｎモルＰＣ／ｍＬ）は、小単層小胞（ＰＣ／ＴＡＧ小胞；Ａ、Ｄ及びＧ）、アポリポ蛋白Ｂ（アポＢ）リポ蛋白（ＶＬＤＬ及びＬＤＬ；Ｂ、Ｅ及びＨ）並びにＨＤＬ（１０ｍｇ蛋白／ｍＬ；Ｃ、Ｆ及びＩ）であった。異なる供与体及び受容体の小胞は、指示された時間３検体で１μｇｎｏ精製したＭＴＰ（ＭＴＰ）とともにまたはそれなしでインキュベートし、そして蛍光を材料及び方法に記載されたように測定した。線グラフ及び誤差バーは平均±ＳＤを表す。
【００８１】
結果は、供与体小胞が小単層ＰＣ／ＴＡＧ小胞（図５Ａ）及びアポＢリポ蛋白（図５Ｂ）とともにインキュベートしたときＴＡＧを転移したが、ＨＤＬとともにインキュベートしたときにはそうでなかった（図５Ｃ）。転移は、４時間のインキュベーション後蛍光単位を１０９−１７２％増加させた（図５Ａ、Ｂ）。同様に、ＭＴＰは、ＰＣ／ＴＡＧ小胞（図５Ｄ）及びアポＢリポ蛋白（図５Ｅ）の存在下でＣＥを転移したが、ＨＤＬ（図５Ｆ）の存在下ではそうではなかった。ＭＴＰは、供与体小胞がＰＣ／ＴＡＧ小胞とともにインキュベートしたとき、ＰＬを転移でき、蛍光における増加は４時間で１８６％であった（図５Ｇ）。しかし、受容体としてのアポＢリポ蛋白の存在下のＭＴＰによるＰＬの転移の検討は、解釈するのが困難であった（図５Ｈ）。これは、供与体小胞がＭＴＰの不存在下アポＢリポ蛋白とインキュベートされたとき、バックグラウンド蛍光における顕著な増大に起因した（図５Ｇのコントロールを比較；またこれらのパネルの異なるｙ値に注意すること）。また、ＭＴＰは、ＨＤＬが受容体として使用されたとき、ＰＬを転移しなかった（図５Ｉ）。これらの検討は、小単層小胞及びアポＢリポ蛋白が受容体として使用されるとき、ＭＴＰ活性が中性の脂質両者、ＴＡＧ及びＣＥを転移することを示す。
【００８２】
細胞のＭＴＰ活性の測定
次の問題は、この分析が細胞のＭＴＰ活性を測定するのに使用できるかどうかを決めることであった（表２）。ミクロソームＭＴＰは、Ｊａｍｉｌら（非特許文献１２）により記述されたデオキシコレート処理によって解離した。Ｃｏｓ−７細胞は、トランスフェクトされたかまたはＭＴＰ発現ベクターなしで、ＭＴＰ分析の特異性を測定した（秒２）。予想されたように、どんなＭＴＰも偽トランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞で検出できなかった。しかし、ＭＴＰ発現ベクターによるトランスフェクションは、他の研究（非特許文献１５、２９）と一致して、Ｃｏｓ−７細胞における増大したＭＴＰを生じた。同様に、ＭＴＰ活性は、ＨｅｐＧ２及び判別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）Ｃａｃｏ−２細胞の細胞ホモジネートで測定できた。これらの検討は、新しい方法が細胞ＭＴＰ活性を測定するのに使用できることを示す。デオキシコレート法は面倒であり、いくつかの段階を含み、そして少なくとも２日を要する。この方法を単純化するために、Ｃｈａｎｇ、Ｌｉｍａｎｅｋ及びＣｈａｎｇの方法（非特許文献３４）を評価したが、それは低張緩衝液による細胞の破壊を含みそして分析のための細胞抽出物を調製する時間は、はるかに短い。
【００８３】
ラット肝臓ミクロソームを低張緩衝液で処理し、そして解離した内容物をＭＴＰ活性測定に使用した。肝臓ミクロソーム内容物のＭＴＰの比活性（毎時１ミクロｇあたり転移％）は、０．４９８±０．０９（平均±ＳＤ、ｎ＝９）であった。
【００８４】
転移分析のために、４０−５０ｇの細胞蛋白を３検体で使用し、そして活性は１時間まで測定された。図６及び１０に示されるように、両方の方法は、同様のＭＴＰ活性を与えた。従って、低張性の処理は、時間が短くそして処理が少ないために、細胞ＭＴＰ活性を測定するのにより良い方法である。
【００８５】
ＭＴＰ活性の阻害
実験を、次にその活性に対するＭＴＰ拮抗剤の効果を測定するために行った（図７）。この目的のために、Ｊａｍｉｌら（非特許文献１２）により記述されたＭＴＰ阻害剤ＢＭＳ２００１５０を使用した。精製したＭＴＰ（１ｇ）を、指示された濃度のＭＴＰ阻害剤ＢＭＳ２００１５０の存在下３０分間供与体及び受容体の小胞とインキュベートした。図７Ａに示されるように、増大した濃度のＢＭＳ２００１５０は、精製したＭＴＰ活性の投与量依存の阻害を生じた。ＩＣ５０は、０．０８Ｍであり、そして他のもの（非特許文献１２）により報告された範囲内にあった。
【００８６】
次に、ＨｅｐＧ２細胞を２４時間異なる濃度の阻害剤とインキュベートし、そしてホモジネートをデオキシコレート法（非特許文献１２）を使用して調製しそしてＭＴＰ活性について分析した。細胞を洗い、そしてライゼートを、材料及び方法に記載されたデオキシコレート法を使用して調製した。転移分析には、４０−５０ｇの細胞蛋白を３検体で使用した。図７Ｂに示されるように、増加した濃度のＢＭＳ２００１５０は、低下した細胞ＭＴＰ活性を生じた。〜１．３ＭのＩＣ５０値は、発表された研究（非特許文献１２）と一致する。精製したＭＴＰ及び細胞ライゼートについて得られたＩＣ５０値の相違は、阻害剤と相互反応しそしてその有効性を低下させると思われる細胞ライゼート中の他の蛋白の存在に起因するだろう。これらの検討は、分析がＭＴＰ活性及び拮抗剤によるその阻害を測定するのに有用であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ミクロソームトリグリセリド転移蛋白（ＭＴＰ）によりトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）に対する異なる量の供与体及び受容体の小胞の効果をグラフで示す。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。
【図２】ＭＴＰのＴＡＧ転移活性に対する時間、温度及びＮａＣｌの効果をグラフで示す。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤを示す。
【図３】ＴＡＧ転移活性の特異性をグラフで示す。
【図４】ＭＴＰによる脂質転移における受容体小胞の役割を画くグラフである。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤを示す。
【図５】異なる受容体の存在下の種々の脂質の転移をグラフで示す。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤを示す。
【図６−Ａ】細胞ホモジネートにおけるＭＴＰ活性を測定するための２つの方法の活性を比較するグラフである。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤを示す。
【図６−Ｂ】細胞ホモジネートにおけるＭＴＰ活性を測定するための２つの方法の比活性を比較するグラフである。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤを示す。
【図７】ＢＭＳ２００１５０によるＭＴＰ活性の阻害を画くグラフである。線グラフ及び誤差バーは、平均±ＳＤを示す。
【図８】二脂質膜に埋め込まれたラベルされたトリグリセリド、ＮＢＤ−ＴＡＧを有する単層小胞の概略図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）その中に蛍光ラベルされた脂質を配合する供与体小胞を調製し、
（ｂ）受容体小胞を調製し、
（ｃ）供与体小胞から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰと蛍光ラベルされた脂質との結合を可能にするのに充分な時間及び条件下で、受容体小胞及びラベルされた供与体小胞とともにＭＴＰ含有細胞ホモジネートまたは単離されたＭＴＰの何れかをインキュベートし、そして
（ｄ）ＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を測定する
ことからなることを特徴とするミクロソームトリグリセリド転移蛋白（ＭＴＰ）のレベルを測定する方法。
【請求項２】
細胞ホモジネートが、ＭＴＰを発現する動物細胞を含む請求項１の方法。
【請求項３】
細胞ホモジネートが、ＭＴＰを発現する昆虫または微生物からの細胞を含む請求項１の方法。
【請求項４】
蛍光ラベルされた脂質が、トリグリセリド、コレステロールエステル（ＣＥ）または燐脂質である請求項１の方法。
【請求項５】
トリグリセリドがトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）である請求項４の方法。
【請求項６】
蛍光ラベルされたＴＡＧが、任意の位置で少なくとも１つのＮＢＤを含み、そして脂肪酸がＴＡＧの他の位置に位置する請求項５の方法。
【請求項７】
蛍光ラベルされたトリアシルグリセロールが、１、２ ジオレオイル３−ＮＢＤグリセロール（ＮＢＤ−ＴＡＧ）である請求項５の方法。
【請求項８】
蛍光ラベルされたＣＥがＮＢＤ−ＣＥである請求項４の方法。
【請求項９】
燐脂質が少なくとも１つのＮＢＤを含む請求項４の方法。
【請求項１０】
受容体小胞が、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である請求項１の方法。
【請求項１１】
供与体小胞が、ＮＢＤラベルされた脂質を含むホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である請求項１の方法。
【請求項１２】
（ａ）供与体小胞中に蛍光ラベルされた脂質を配合し、
（ｂ）受容体小胞を調製し、
（ｃ）受容体小胞及びラベルされた供与体小胞の分割量とテスト化合物とを混合し、テスト化合物はＭＴＰの周知または未知のモジュレーターであり、
（ｄ）ＭＴＰを含む細胞ホモジネートまたは単離されたＭＴＰを、供与体小胞、受容体小胞及びテスト化合物を含む混合物に添加し、
（ｅ）供与体小胞から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰと蛍光ラベルされた脂質との結合を可能にするのに充分な時間及び条件下、受容体小胞、ラベルされた供与体小胞、テスト化合物及びＭＴＰの初めの分割量をインキュベートし、
（ｆ）供与体小胞から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰとの蛍光ラベルされた脂質の結合を可能にするのに充分な時間及び条件下、受容体小胞、ラベルされた供与体小胞、テスト化合物及びＭＴＰの第二の分割量をインキュベートし、
（ｇ）工程（ｅ）及び（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を測定し、そして
（ｈ）ＭＴＰの脂質転移活性を増大する化合物の同定により、工程（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を比較するとき、工程（ｅ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光の増大を相関させ、一方ＭＴＰの脂質転移活性を低下する化合物の同定により、工程（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を比較するとき、工程（ｅ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光の低下を相関させる
ことからなることを特徴とするＭＴＰの脂質転移活性をモジュレートする化合物を同定する方法。
【請求項１３】
トリグリセリドが、ＮＢＤ（ＴＡＧ）を含むトリアシルグリセロールである請求項４または５の方法。
【請求項１４】
燐脂質が、ＮＢＤを含む任意の燐脂質である請求項４の方法。
【請求項１５】
受容体小胞が、小単層小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である請求項１の方法。
【請求項１６】
供与体小胞が、ＮＢＤラベルされた脂質を含む小単層小胞である請求項１の方法。
【請求項１７】
細胞ホモジネートが、ＭＴＰを発現する動物細胞を含む請求項１２の方法。
【請求項１８】
細胞ホモジネートが、ＭＴＰを発現する昆虫または微生物からの細胞を含む請求項１２の方法。
【請求項１９】
蛍光ラベルされた脂質が、トリグリセリド、コレステロールエステルまたは燐脂質である請求項１２の方法。
【請求項２０】
トリグリセリドが、任意のＮＢＤラベルされたトリアシルグリセロールである請求項１２の方法。
【請求項２１】
燐脂質がホスファチジルエタノールアミンである請求項１８の方法。
【請求項２２】
受容体小胞が、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である請求項１２の方法。
【請求項２３】
供与体小胞が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞、小単層小胞または多重ラメラ小胞である請求項１２の方法。
【請求項２４】
受容体小胞及び蛍光ラベルされた供与体小胞からなることを特徴とするＭＴＰの脂質転移活性を測定するためのキット。
【請求項２５】
蛍光ラベルされた供与体小胞が、トリグリセリド、コレステロールエステルまたは燐脂質からなる請求項２４のキット。
【請求項２６】
トリグリセリドが、ＮＢＤラベルを含む任意のトリアシルグリセロールである請求項２５のキット。
【請求項２７】
トリアシルグリセロールが、１、２、ジオレオイル３−ＮＢＤグリセロール（ＮＢＤ−ＴＡＧ）である請求項２６のキット。
【請求項２８】
燐脂質がホスファチジルエタノールアミンである請求項２５のキット。
【請求項２９】
受容体小胞が、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である請求項２４のキット。
【請求項３０】
供与体小胞が、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である請求項２４のキット。
【請求項３１】
小胞がＢＳＡの添加により安定化されている請求項２４のキット。
【請求項１】
（ａ）その中に蛍光ラベルされた脂質を配合する供与体小胞を調製し、
（ｂ）受容体小胞を調製し、
（ｃ）供与体小胞から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰと蛍光ラベルされた脂質との結合を可能にするのに充分な時間及び条件下で、受容体小胞及びラベルされた供与体小胞とともにＭＴＰ含有細胞ホモジネートまたは単離されたＭＴＰの何れかをインキュベートし、そして
（ｄ）ＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を測定する
ことからなることを特徴とするミクロソームトリグリセリド転移蛋白（ＭＴＰ）のレベルを測定する方法。
【請求項２】
細胞ホモジネートが、ＭＴＰを発現する動物細胞を含む請求項１の方法。
【請求項３】
細胞ホモジネートが、ＭＴＰを発現する昆虫または微生物からの細胞を含む請求項１の方法。
【請求項４】
蛍光ラベルされた脂質が、トリグリセリド、コレステロールエステル（ＣＥ）または燐脂質である請求項１の方法。
【請求項５】
トリグリセリドがトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）である請求項４の方法。
【請求項６】
蛍光ラベルされたＴＡＧが、任意の位置で少なくとも１つのＮＢＤを含み、そして脂肪酸がＴＡＧの他の位置に位置する請求項５の方法。
【請求項７】
蛍光ラベルされたトリアシルグリセロールが、１、２ ジオレオイル３−ＮＢＤグリセロール（ＮＢＤ−ＴＡＧ）である請求項５の方法。
【請求項８】
蛍光ラベルされたＣＥがＮＢＤ−ＣＥである請求項４の方法。
【請求項９】
燐脂質が少なくとも１つのＮＢＤを含む請求項４の方法。
【請求項１０】
受容体小胞が、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である請求項１の方法。
【請求項１１】
供与体小胞が、ＮＢＤラベルされた脂質を含むホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である請求項１の方法。
【請求項１２】
（ａ）供与体小胞中に蛍光ラベルされた脂質を配合し、
（ｂ）受容体小胞を調製し、
（ｃ）受容体小胞及びラベルされた供与体小胞の分割量とテスト化合物とを混合し、テスト化合物はＭＴＰの周知または未知のモジュレーターであり、
（ｄ）ＭＴＰを含む細胞ホモジネートまたは単離されたＭＴＰを、供与体小胞、受容体小胞及びテスト化合物を含む混合物に添加し、
（ｅ）供与体小胞から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰと蛍光ラベルされた脂質との結合を可能にするのに充分な時間及び条件下、受容体小胞、ラベルされた供与体小胞、テスト化合物及びＭＴＰの初めの分割量をインキュベートし、
（ｆ）供与体小胞から受容体小胞へのラベルされた脂質の転移中ＭＴＰとの蛍光ラベルされた脂質の結合を可能にするのに充分な時間及び条件下、受容体小胞、ラベルされた供与体小胞、テスト化合物及びＭＴＰの第二の分割量をインキュベートし、
（ｇ）工程（ｅ）及び（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を測定し、そして
（ｈ）ＭＴＰの脂質転移活性を増大する化合物の同定により、工程（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を比較するとき、工程（ｅ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光の増大を相関させ、一方ＭＴＰの脂質転移活性を低下する化合物の同定により、工程（ｆ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光を比較するとき、工程（ｅ）で得られたＭＴＰに結合した蛍光ラベルされた脂質の蛍光の低下を相関させる
ことからなることを特徴とするＭＴＰの脂質転移活性をモジュレートする化合物を同定する方法。
【請求項１３】
トリグリセリドが、ＮＢＤ（ＴＡＧ）を含むトリアシルグリセロールである請求項４または５の方法。
【請求項１４】
燐脂質が、ＮＢＤを含む任意の燐脂質である請求項４の方法。
【請求項１５】
受容体小胞が、小単層小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である請求項１の方法。
【請求項１６】
供与体小胞が、ＮＢＤラベルされた脂質を含む小単層小胞である請求項１の方法。
【請求項１７】
細胞ホモジネートが、ＭＴＰを発現する動物細胞を含む請求項１２の方法。
【請求項１８】
細胞ホモジネートが、ＭＴＰを発現する昆虫または微生物からの細胞を含む請求項１２の方法。
【請求項１９】
蛍光ラベルされた脂質が、トリグリセリド、コレステロールエステルまたは燐脂質である請求項１２の方法。
【請求項２０】
トリグリセリドが、任意のＮＢＤラベルされたトリアシルグリセロールである請求項１２の方法。
【請求項２１】
燐脂質がホスファチジルエタノールアミンである請求項１８の方法。
【請求項２２】
受容体小胞が、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である請求項１２の方法。
【請求項２３】
供与体小胞が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞、小単層小胞または多重ラメラ小胞である請求項１２の方法。
【請求項２４】
受容体小胞及び蛍光ラベルされた供与体小胞からなることを特徴とするＭＴＰの脂質転移活性を測定するためのキット。
【請求項２５】
蛍光ラベルされた供与体小胞が、トリグリセリド、コレステロールエステルまたは燐脂質からなる請求項２４のキット。
【請求項２６】
トリグリセリドが、ＮＢＤラベルを含む任意のトリアシルグリセロールである請求項２５のキット。
【請求項２７】
トリアシルグリセロールが、１、２、ジオレオイル３−ＮＢＤグリセロール（ＮＢＤ−ＴＡＧ）である請求項２６のキット。
【請求項２８】
燐脂質がホスファチジルエタノールアミンである請求項２５のキット。
【請求項２９】
受容体小胞が、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である請求項２４のキット。
【請求項３０】
供与体小胞が、小単層小胞、多重ラメラ小胞、アポＢリポ蛋白小胞またはホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である請求項２４のキット。
【請求項３１】
小胞がＢＳＡの添加により安定化されている請求項２４のキット。
【図８】
【公表番号】特表２００７−５２１００７（Ｐ２００７−５２１００７Ａ）
【公表日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７６９２（Ｐ２００６−５１７６９２）
【出願日】平成１６年６月２５日（２００４．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２０５４２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４３１１０
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５０４３１７６９５）ザ リサーチ ファンデーション オブ ステイト ユニバーシティ オブ ニューヨーク (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２５日（２００４．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２０５４２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４３１１０
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５０４３１７６９５）ザ リサーチ ファンデーション オブ ステイト ユニバーシティ オブ ニューヨーク (2)
【Ｆターム（参考）】
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