ＮＯＴＣＨ３タンパク質発現および／またはＮＯＴＣＨ３のコード領域を調節するための手段および方法；ＣＡＤＡＳＩＬの処置におけるその組成物および使用
本発明はとりわけ、ＮＯＴＣＨ３の発現および／またはタンパク質コードドメインを調節するための手段および方法を提供する。１つの局面において、本発明はＮＯＴＣＨ３を発現する細胞内またはそのすぐ近くのＮＯＴＣＨ３タンパク質の上昇したレベルを少なくとも低減させるための方法を提供し、前記方法は、ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供することによって、前記ＮＯＴＣＨ３タンパク質の生成を減少させるか、または前記ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡのタンパク質コード領域を変えるステップを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および医学の分野に関する。特に、本発明はＥＧＦ反復を含有するタンパク質、たとえばＮＯＴＣＨ３など、その中の突然変異、および突然変異を克服する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（Ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ ｗｉｔｈ ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌ ｉｎｆａｒｃｔｓ ａｎｄ ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＣＡＤＡＳＩＬ）は、ＮＯＴＣＨ３の突然変異によってもたらされる成人発症性（１４〜８６歳）の優性遺伝性の疾患であり、再発性の皮質下梗塞、認知症、ならびにより低頻度の偏頭痛および精神症状を特徴とする。ＮＯＴＣＨ３は３３個のエクソンを有し、ＣＡＤＡＳＩＬに関連するＮＯＴＣＨ３突然変異によって、所与の細胞外上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）様（−ｌｉｋｅ）の反復（ＥＧＦＬ反復）ドメイン内のシステイン残基の数が不均一となり、それは最初の５個のＥＧＦＬ反復をコードするエクソン３から６における強力なクラスター化を伴う。ＣＡＤＡＳＩＬにおける典型的なＭＲＩ特徴は、多巣性ラクナ梗塞、および前部側頭葉の関与する大脳白質のびまん性Ｔ２強調超強度を含む。電子顕微鏡観察（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＥＭ）では、平滑筋細胞の基底膜のすぐ近くの細動脈の媒質中に顆粒状オスミウム酸親和性材料（ｇｒａｎｕｌａｒ ｏｓｍｉｏｐｈｉｌｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ：ＧＯＭ）が存在することが示され、これはＣＡＤＡＳＩＬに特徴的なものである。
【０００３】
この顆粒状オスミウム酸親和性材料の同一性は部分的にしか知られていないが、変異型ＮＯＴＣＨ３タンパク質を含有することが示されている。
【０００４】
本発明のＣＡＤＡＳＩＬ表現型は、ＮＯＴＣＨ３遺伝子の突然変異によってもたらされる。この遺伝子は血管平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ：ＶＳＭＣ）および周皮細胞で発現され、細胞シグナル伝達機能を有する膜貫通型受容体であるＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードしている。ＣＡＤＡＳＩＬの患者においては、変性したＶＳＭＣの表面上にＮＯＴＣＨ３外部ドメインが蓄積しており、加えてＶＳＭＣの近くに顆粒状オスミウム酸親和性堆積物（ＧＯＭ）が蓄積している。ＶＳＭＣ変性は血管の反応性の障害および大脳の血流の減少をもたらすことによって、再発する脳梗塞および進行性の認知低下をもたらす。ＣＡＤＡＳＩＬは身体全体の動脈に影響するにもかかわらず、未知の理由からこの疾患は特に中枢神経系に現れる。
【０００５】
分子および細胞レベルでのこの疾患の病原性はまだわずかしか分かっていないが、タンパク質の３４個のＥＧＦＬ反復の１つ（ＥＧＦＬ反復）における不等数のシステイン残基をもたらす特徴的な突然変異によって、タンパク質のミスフォールディングが起こることが示されている。典型的に、各ＥＧＦＬ反復は６つのシステイン残基を含有する。不均一な数のシステイン残基（通常５残基または７残基のいずれか）をもたらすようなＮＯＴＣＨ３の突然変異がＣＡＤＡＳＩＬの原因となる。いくつかの研究から、研究されたほぼすべての突然変異について、変異体ＮＯＴＣＨ３の存在下でＮＯＴＣＨ３シグナル伝達は変化しないことが示された。問題の核心は、ＶＳＭＣにおける変異型ＮＯＴＣＨ３および、またはＧＯＭの蓄積の毒性効果であることが推測される。ＶＳＭＣにおけるＮＯＴＣＨ３およびＧＯＭの蓄積はＣＡＤＡＳＩＬに特徴的なものであり、ＮＯＴＣＨ３トランスジェニックマウスおよび細胞モデルにおいても観察されている。
【０００６】
本発明においては、より短いｍＲＮＡ産物を生成するか、および／または変異体ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡの発現を減らすことによって、ＮＯＴＣＨ３タンパク質の所与の変異型ＥＧＦＬ反復における同数のシステイン残基を再確立することで、ＶＳＭＣの表面におけるＮＯＴＣＨ３外部ドメインの蓄積が低減および／または遅延することが見出された。すべてのＥＧＦＬ反復に同数のシステインを有するＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡ、および／または変異体ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡ発現の低減によっても、ＣＡＤＡＳＩＬに罹患した対象またはＣＡＤＡＳＩＬに罹患する危険性のある対象におけるＶＳＭＣの変性が低減および／または遅延する。本発明においては、所与の変異型ＥＧＦＬ反復における同数のシステインの再確立、および／またはＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡ発現の低減によって、疾患をもたらす突然変異によって生成される不対のシステイン残基の毒性効果が低減されることが見出された。ＮＯＴＣＨ３遺伝子中の突然変異のほとんどはエクソン４に存在する。ｍＲＮＡからエクソン４およびエクソン５を排除することによって、残りのＥＧＦＬ反復のすべてが均一な数のシステインを有するコード領域が生じることが見出された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって本発明は、不均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を有する変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡから、均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを生成するための方法を提供する。これは、前記プレｍＲＮＡを発現する細胞に、前記プレｍＲＮＡと相補的であって前記プレｍＲＮＡとハイブリダイズすることによって、前記プレｍＲＮＡから生成されるｍＲＮＡからのエクソン４およびエクソン５の排除を誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することによって達成される。好ましくは、不均一な数のシステインを有する前記ＥＧＦＬ反復は、エクソン４および／またはエクソン５にコードされる。本発明は、不均一な数のシステインをもたらすエクソン４または５のあらゆる突然変異に対して有用である。突然変異のリストは、新たな患者が同定されて配列決定されることに伴って連続的に増加している。本発明が有用であることが実証された突然変異は、前記プレｍＲＮＡが、突然変異Ａｒｇ１３３Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１３４Ｔｒｐ、Ａｒｇ１４１Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１４４Ｐｈｅ、Ａｒｇ１５３Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１６２Ｔｒｐ、Ａｒｇ１８２Ｃｙｓ、Ｔｙｒ１８９Ｃｙｓ、Ａｒｇ２０７Ｃｙｓ、Ｃｙｓ２２４Ｔｙｒ、Ａｒｇ２０７Ｃｙｓ、Ｃｙｓ２２４Ｔｙｒ、またはその組み合わせを有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするものである。
【０００８】
本発明はさらに、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡを発現する細胞によって生成される前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるための方法を提供し、ここで前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質は不均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を含む。前記方法は、ＮＯＴＣＨ３遺伝子のエクソン４および／またはエクソン５における前記ＥＧＦＬ反復の不均一な数のシステインの原因である突然変異をコードするヌクレオチド配列と相補的であってそれにハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む。好ましい実施形態において、前記方法は、ＮＯＴＣＨ３遺伝子のエクソン５における前記ＥＧＦＬ反復の不均一な数のシステインの原因である突然変異をコードするヌクレオチド配列と相補的であってそれにハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む。別の好ましい実施形態において、前記方法は、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡと相補的であってそれに特異的にハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む。変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションは、ＣＡＤＡＳＩＬの原因となる突然変異に対して特異的なオリゴヌクレオチドを用いて達成されることが好ましい。ＣＡＤＡＳＩＬの原因となる突然変異はエクソン４またはエクソン５にあることが多いが、ＮＯＴＣＨ３プレｍＲＮＡ中のその他のＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異も本発明の範囲内にある。言換えると、このオリゴヌクレオチドは、ＣＡＤＡＳＩＬの原因となる突然変異と相補的であり、かつそれに重複している。この点に関して、オリゴヌクレオチドはエクソン２〜３２のいずれか１つに対して特異的であってもよく、好ましくはオリゴヌクレオチドはエクソン２〜２３のいずれか１つに対して特異的である。好ましくは、オリゴヌクレオチドはＮＯＴＣＨ３のエクソン４および／またはエクソン５における前記ＥＧＦＬ反復の不均一な数のシステインの原因である突然変異をコードするヌクレオチド配列に対して特異的である。
【０００９】
ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする遺伝子は多形性である。正常な機能を有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするさまざまなＮＯＴＣＨ３対立遺伝子が同定されている。変異体ＣＡＤＡＳＩＬ原因対立遺伝子に対してヘテロ接合性である細胞において、変異体対立遺伝子がその細胞中の正常な対立遺伝子と異なる点は、疾患の原因となる突然変異が存在することだけでなく、多形性部位に異なる配列が存在することでもあり得る。よって、この多形性部位もこのヘテロ接合体の変異体対立遺伝子を特徴付ける。
【００１０】
よって別の好ましい実施形態において、本発明は、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする第１のプレｍＲＮＡと、正常なＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする第２のプレｍＲＮＡとを発現する細胞によって生成される前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるための方法を提供し、ここで前記第１および前記第２のプレｍＲＮＡは、変異体対立遺伝子におけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異の存在と、部位突然変異とは異なる多形性部位における異なる配列の存在とが互いに異なっており、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるための前記方法は、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡ上に存在する多形性部位の配列と相補的であってそれに特異的にハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む。変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする第１のプレｍＲＮＡと、正常なＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする第２のプレｍＲＮＡとを発現する細胞によって生成される前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるための方法がさらに提供され、ここで前記第１および前記第２のプレｍＲＮＡは、変異体対立遺伝子におけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異の存在と、前記突然変異の部位とは異なる多形性部位における異なる配列の存在とが互いに異なっており、前記方法は、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡ上に存在する多形性部位の配列と相補的であってそれにハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む。
【００１１】
好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜３２のいずれか１つにおける多形性部位の配列に対して特異的である。好ましい実施形態において、ＣＡＤＡＳＩＬ原因変異体をコードするプレｍＲＮＡの量は、エクソンスキッピングによって低減される。好ましくは、変異体対立遺伝子のタンパク質コードドメインにフレームシフトを導入するエクソンスキッピングによる。好ましくは、前記フレームシフトはタンパク質の中途終止を導入する。この実施形態において、オリゴヌクレオチドは、エクソン２、３、４、５、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２のうち１つのエクソンに対して特異的であることが好ましい。
【００１２】
別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜２３のうち１つのエクソン、好ましくはエクソン２、３、４、５、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、および２３のうち１つのエクソンに対して特異的である。別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜１０のうち１つのエクソンに対して特異的である。特に好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜５のうち１つのエクソンに対して特異的である。好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書の上記において同定されるエクソンのいずれか１つにおけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異または多形性部位に対して特異的である。特に好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン２、３、４もしくは５におけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異に対して特異的であるか、および／またはエクソン２、３、４もしくは５における多形性部位に対して特異的である。
【００１３】
実施形態の好ましい局面において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは化学的に修飾されたアンチセンスヌクレオチドである（ホスホロチオエート主鎖を有するかまたは有さない２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：ＰＭＯ）、ホスホロチオエート主鎖を有するかまたは有さない２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ、および１つまたはそれ以上の異なる化学修飾ヌクレオチドの組み合わせからなるキメラオリゴ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｏｇｏｓ）を含むがそれに限定されない）。別の好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドはＳｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
【００１４】
本発明はさらに、ＮＯＴＣＨ３を発現する細胞内またはそのすぐ近くのＮＯＴＣＨ３タンパク質のレベルを少なくとも低減させるための方法を提供する。前記方法は、ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供することによって、前記ＮＯＴＣＨ３タンパク質の生成を減少させるか、または前記ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡのタンパク質コード領域を変えるステップを含む。後者の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＮＯＴＣＨ３プレｍＲＮＡのスプライシングの変化をもたらすことによって、代替的にスプライシングされたｍＲＮＡが得られることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドによって誘導される代替的スプライシングは典型的に、標的となるエクソンの排除に向かう。しかしながら、いわゆるエクソン包含（ｅｘｏｎ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）も可能である。代替的にスプライシングされたｍＲＮＡは、好ましくは少なくとも部分的に機能するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする。必然的ではないが典型的に、ｍＲＮＡに通常存在するエクソンがスキップされる。変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡのエクソンの特異的スキッピングは、２通りに有益である。好ましい実施形態において、前記細胞は、健康な個体のＮＯＴＣＨ３コード遺伝子と比べたときに表１に示されるとおりの突然変異を有するＮＯＴＣＨ３コード遺伝子を含む。エクソン４およびエクソン５をともにスキップすることによってもたらされるエクソン３〜６の連結はインフレームであって、残りのＥＧＦＬ反復すべてが均一な数のシステイン残基を有するようなＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする。よって、本発明の好ましい実施形態においては、エクソン４およびエクソン５の両方がスキップされる。変異型エクソン４のみ、または変異型エクソン５のみの特異的スキッピングでは、結果としてエクソン４スキッピングに対しては連結エクソン３〜５が、エクソン５スキッピングに対しては連結エクソン４〜６が得られる。これら後者の連結の結果、アウトオブフレームのタンパク質コードドメインがもたらされ、それによって中途終止が導入されて、切断型の非機能性タンパク質が得られる。このスキッピングによって、元の変異タンパク質の生成が減少することにより、ＣＡＤＡＳＩＬ患者の症状が緩和されると推定される。
【００１５】
好ましい実施形態において、処置されるべき細胞は、不均一な数のシステイン残基を有するＥＧＦＬ反復を含むＮＯＴＣＨ３タンパク質を発現する。前記突然変異は、好ましくは表１に列挙されるとおりの突然変異である。前記突然変異は、好ましくは表１のＡｒｇ１４１Ｃｙｓ；Ａｒｇ１５３Ｃｙｓ；Ａｒｇ１８２ＣｙｓおよびＡｒｇ２０７Ｃｙｓである。
【００１６】
罹患ファミリー内で多数の異なるＮＯＴＣＨ３突然変異が同定されている。無関係の個体における研究から、突然変異の強力なクラスター化が明らかとなり、それらの最大７０％がエクソン４および５で起こっている。この突然変異は個体内で自発的に起こり得ることも見出され、その観察はより広範囲の脳卒中集団におけるＮＯＴＣＨ３突然変異の診断テストに関する重要な問題を提起する。これまでに記述されたほとんどすべての症例はＮＯＴＣＨ３突然変異に対してヘテロ接合性である個体におけるものであるが、ホモ接合性の突然変異を有する患者も記述されている。
【００１７】
突然変異は、タンパク質のＥＧＦＬ反復の１つにおけるシステイン残基の減少または増加をもたらすという特徴を有する。こうした突然変異はタンパク質の高次構造を変化させるため、ＮＯＴＣＨ３タンパク質が血管平滑筋細胞膜に蓄積し、これは前記細胞にとって有毒であり得る。
【００１８】
Ｎｏｔｃｈ３遺伝子は、上皮成長因子様の反復（ＥＧＦＬ反復）のいくつかの縦列反復コピーを含有して、隣接する細胞間にシグナルを伝達する役割をする膜貫通型受容体をコードする。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、血管発生の多くの局面を含む胚発生の際の細胞シグナル伝達および運命に関与する高度に保存された経路であるが、正常な成体の血管平滑筋細胞の生理学におけるＮｏｔｃｈ３の役割は未知の点が多い。最近の研究では、Ｎｏｔｃｈ３が血管の損傷に関わっており、血管平滑筋細胞の生存決定因子であることが示唆されている。
【００１９】
本発明のＣＡＤＡＳＩＬ表現型は、本明細書の上記において言及したとおり、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の発現に関連している。ヒトにおける病原性は主に、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における変異タンパク質の発現に関連している。したがって、この種の細胞における発現が低減および／または変更されることが好ましい。本発明の特に好ましい実施形態においては、ＣＡＤＡＳＩＬに関連する変異タンパク質が修飾されることによって、均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を有する修飾変異体ＣＡＤＡＳＩＬタンパク質の生成を可能にする。言換えると、不均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復の存在をもたらすＮＯＴＣＨ３のＣＡＤＡＳＩＬ突然変異が、本発明の修飾によって打ち消されて、均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復のみを有する新たなＮＯＴＣＨ３変異体がもたらされる（ＮＯＴＣＨ３変異体が修復される）ことが好ましい。理論に結び付けられることなく、均一な数に修復することで、少なくとも部分的に機能するＮＯＴＣＨ３変異タンパク質が生成されると考えられる。さらに、修復ＮＯＴＣＨ３変異体は蓄積しないか、少なくともＣＡＤＡＳＩＬ表現型をもたらすＮＯＴＣＨ３変異体よりも少ない程度に蓄積すると考えられる。修復ＮＯＴＣＨ３変異体の生成は、さらにＧＯＭの量の減少をもたらす。それはさらにＶＳＭＣ変性の低減をもたらし、最終的にはＣＡＤＡＳＩＬに罹患しているかまたは罹患する危険性のある個体における虚血性脳卒中および認知症の危険性を低減させる。
【００２０】
修復ＮＯＴＣＨ３変異体は、好ましくはエクソンスキッピングを起こさせることによって生成される。エクソンスキッピングの結果、ＮＯＴＣＨ３をコードするｍＲＮＡからエクソンが排除される。エクソンスキッピングは典型的に、そのエクソンに隣接するスプライス部位に向けられたオリゴヌクレオチドによって誘導されるか、またはエクソン内部のオリゴヌクレオチドによって誘導される。ＮＯＴＣＨ３は３３個のエクソンを含有しており、そのエクソン１〜３３がタンパク質の部分をコードする。エクソン１およびエクソン３３は、それぞれ開始コドンおよび終止コドンを含有する。エクソン２から２３は、タンパク質のＥＧＦＬ反復をコードする。好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＴＣＨ３タンパク質のＥＧＦＬをコードするエクソンのスキッピングを誘導する。
【００２１】
エクソン４および５のスキッピングは、インフレーム変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をもたらす。特に好ましいのはエクソン４およびエクソン５のスキッピングである。なぜならこれらのエクソンは、現在同定されているすべてのＣＡＤＡＳＩＬ突然変異の約７０％を含むためである。これらのエクソンのスキッピングは、タンパク質レベルでＥＧＦＬ反復３、４および５を完全に失ったインフレーム生成物をもたらすが、ＥＧＦＬ反復２および６は正確に６個のシステイン残基を有する機能性融合ＥＧＦＬ反復を形成することが予測される。このスキッピングは、内部エクソン４および５の配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ＡＯＮｓ）を生成することによって誘導される。エクソン特異的なＡＯＮに加えて、好ましくは突然変異特異的なＡＯＮが用いられる。所与のＥＧＦＬ反復における突然変異をスキップするためにＡＯＮを用いてＥＧＦＬ反復をスキップするというこの技術は、ＥＧＦＬ反復の反復配列を有する他の細胞表面受容体、たとえばＮＯＴＣＨ３のＤＳＬリガンドであるデルタ様１、３および４などにも適用されてもよい。
【００２２】
エクソン４のスキッピングは、表１の突然変異Ａｒｇ１４１Ｃｙｓ；Ａｒｇ１５３Ｃｙｓ；Ａｒｇ１８２ＣｙｓおよびＡｒｇ２０７Ｃｙｓに対して好ましい。エクソン５のスキッピングは、表１の突然変異Ｃｙｓ２３３ＴｒｐおよびＴｙｒ２５８Ｃｙｓに対して好ましい。結果として得られる修復ＮＯＴＣＨ３変異タンパク質は、均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を有する。
【００２３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは前記ＮＯＴＣＨ３プレｍＲＮＡの１３ヌクレオチドから５０ヌクレオチドの間の連続した部分に対して相補的である。好ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＮＯＴＣＨ３プレｍＲＮＡの１６ヌクレオチドから５０ヌクレオチドの間の連続した部分に対して相補的である。好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対して特異的な１５〜４０ヌクレオチドを含む。エクソンスキッピングを誘導するために十分および／または最適な塩基の数は、いくつかの因子によって決まる。いくつかのタイプのオリゴヌクレオチドは通常いくらか長いオリゴヌクレオチドを必要とし、たとえばモルホリノは典型的に約２５〜３０個の連続した塩基を有するが、２’Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは典型的に約２０〜２５個の塩基にその活性最適値を有する。したがって本発明に対しては、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは約１５ヌクレオチドから３５ヌクレオチドの間の連続した部分に対して相補的であることが好ましい。より好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは約２０ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの間の連続した部分に対して相補的である。
【００２４】
オリゴヌクレオチドを生成するために異なるタイプの核酸が用いられてもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドはＲＮＡを含む。なぜならＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは非常に安定だからである。エクソンスキッピング技術の目的の１つは、対象におけるスプライシングを指示することであるため、オリゴヌクレオチドＲＮＡはＲＮＡに付加的な特性を与える修飾を含むことが好ましい。いくつかのタイプのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的（プレｍＲＮＡ）をＲＮＡｓｅＨなどのヌクレアーゼに対して感受性にする。アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的プレｍＲＮＡとによって形成される二本鎖をＲＮＡｓｅＨ分解に対して感受性にするようなオリゴヌクレオチドは、変異体をコードする（プレ）ｍＲＮＡの分解によって変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるような実施形態に対して好ましい。エクソンスキッピングのみが意図されるときは、アンチセンスオリゴヌクレオチドがこの特性を有さずに、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的プレｍＲＮＡとによって形成される二本鎖をＲＮＡｓｅＨに対して抵抗性にするような修飾を含むことが好ましい。さまざまなオリゴヌクレオチドならびにその修飾および変形は、標的（プレ）ｍＲＮＡのヌクレアーゼ分解を促進しない。こうしたタイプのオリゴヌクレオチドの例は、２’Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびモルホリノである。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに付加または強化されてもよいその他の特徴は、（たとえば体液などにおける）安定性の増加、柔軟性の増加または減少、毒性の低減、細胞内輸送の増加、組織特異性などである。好ましくは、前記修飾は２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド修飾を含む。好ましくは、前記修飾は２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド修飾を含む。実施形態の１つにおいて、本発明は、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾およびロックド核酸を含むオリゴヌクレオチドを含むハイブリッドオリゴヌクレオチドを提供する。この特定の組み合わせは、ロックド核酸からなる同等物よりも良好な配列特異性を含み、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾からなるオリゴヌクレオチドよりも改善された有効性を含む。
【００２５】
核酸模倣技術の出現によって、必ずしも核酸自体ほどの量ではない、類似または好ましくは同じ種類のハイブリダイゼーション特性を有する分子を生成することが可能になった。こうした同等物ももちろん本発明の部分である。こうした模倣同等物の例は、ペプチド核酸、ロックド核酸および／またはモルホリノホスホロジアミデートである。本発明のオリゴヌクレオチドの同等物の好適だが限定的でない例は、以下に見出すことができる（ワールステッド（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ），Ｃ．ら、「ロックド核酸を含有する強力で無毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）。」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７，５６３３−８．（２０００）。エラヤディ（Ｅｌａｙａｄｉ），Ａ．Ｎ．およびコーレイ（Ｃｏｒｅｙ），Ｄ．Ｒ．「ＰＮＡおよびＬＮＡオリゴマーの化学療法への適用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＮＡ ａｎｄ ＬＮＡ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｔｏ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）。」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ２，５５８−６１．（２００１）。ラーセン（Ｌａｒｓｅｎ），Ｈ．Ｊ．，ベンティン（Ｂｅｎｔｉｎ），Ｔ．およびニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ），Ｐ．Ｅ．「ペプチド核酸のアンチセンス特性（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）。」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８９，１５９−６６．（１９９９）。ブラーシュ（Ｂｒａａｓｃｈ），Ｄ．Ａ．およびコーレイ，Ｄ．Ｒ．「遺伝子発現を調節するための新規のアンチセンスおよびペプチド核酸戦略（Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）。」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１，４５０３−１０．（２００２）。サマートン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．およびウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．「モルホリノアンチセンスオリゴマー：設計、調製および特性（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：ｄｅｓｉｇｎ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）。」Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ７，１８７−９５．（１９９７））。１つまたはそれ以上の同等物が互いに、および／または核酸とともにハイブリッドになったものも、もちろん本発明の部分である。好ましい実施形態において、同等物はロックド核酸を含む。なぜならロックド核酸はより高い標的親和性およびより低い毒性を示すために、より高いエクソンスキッピング効率を示すからである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはヌクレオチドの連続した一続きにおいて相補的である。しかし典型的には、標的ＲＮＡのスキッピングまたは低減の効率を過度に低くすることなく、１つまたは２つのミスマッチが許容される。よって、こうした１つまたは２つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドも本発明において使用され得る。現在、その天然の対応物と同種の塩基対形成を示す塩基の類似物が利用可能である。したがって、こうした類似物も本発明のオリゴヌクレオチドに含まれてもよい。天然の対応物とは異なる態様で対形成するいくつかの塩基類似物が利用可能である。たとえば、イノシンは対向する塩基と対形成しない。こうした塩基類似物も本発明のオリゴヌクレオチドに含まれてもよい。非塩基対形成類似物は、典型的にオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション強度を低減させる。このため、オリゴヌクレオチドはこの低減を補償するための付加的なヌクレオチドを含むことが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的にエクソンのスプライス供与体またはスプライス受容体と重複する必要はない。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、それ自体として、または核酸送達媒体と関連して細胞に与えられてもよい。オリゴヌクレオチドは、たとえばリポソームまたはＰＥＩなどの形質移入剤を用いて細胞に形質移入されてもよい。代替的には、オリゴヌクレオチドはウイルス性またはウイルスに基づく遺伝子送達媒体によって細胞に導入される。加えて、オリゴヌクレオチドは前記細胞に与えられる発現カセットにコードされてもよい。典型的に、オリゴヌクレオチドは前記ウイルス性またはウイルスに基づく遺伝子送達媒体中の発現カセットにコードされる。次いでオリゴヌクレオチドは前記オリゴヌクレオチドを含む転写物に含まれてもよい。よって好ましくは、前記発現カセットは前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡをコードする。よって、遺伝子送達媒体は発現カセットを含有してもよい。発現カセットは発現されるべき配列を、たとえば好適なプロモーターおよび転写終止配列など、その配列の発現のために必要なすべての配列と一緒に含有する。発現ベクターは、好ましくは遺伝子送達媒体を介して細胞に導入される。好ましい送達媒体はウイルスベクター、たとえばアデノウイルスベクター、およびより好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターなどである。よって本発明は、こうした発現ベクターおよび送達媒体をも提供する。好適な転写物を設計することは当業者の技術の範囲内である。本発明に対して好ましいのはＰｏｌＩＩＩ駆動転写物である。好ましくはＵ１またはＵ７転写物との融合転写物の形である。こうした融合物は、ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）Ｌ，スーター（Ｓｕｔｅｒ）Ｄ，エメリック（Ｅｍｅｒｉｃｋ）Ｖら「修飾されたＵ７低分子核内ＲＮＡによるプレｍＲＮＡスプライシングパターンの安定な変更（Ｓｔａｂｌｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｕ７ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡｓ）。」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８；９５：４９２９ ４９３４、およびスーターＤ，トマシーニ（Ｔｏｍａｓｉｎｉ）Ｒ，レーバー（Ｒｅｂｅｒ）Ｕら「二重標的アンチセンスＵ７ｓｎＲＮＡは、３つのヒトベータサラセミア突然変異における異常なエクソンの効率的なスキッピングを促進する（Ｄｏｕｂｌｅ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｕ７ ｓｎＲＮＡｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｂｅｒｒａｎｔ ｅｘｏｎ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）。」Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １９９９；８：２４１５ ２４２３に記載されるとおりに生成されてもよい。
【００２７】
本発明はさらに、皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）の処置のための、本発明のＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、発現カセットおよび／または遺伝子送達媒体の使用を提供する。ＣＡＤＡＳＩＬの処置のための薬物の調製のための、本発明のＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、発現カセットおよび／または遺伝子送達媒体の使用も提供される。本発明はさらに、細胞中の変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるために、ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡ上の多形性部位の特異的配列と相補的であってそれに特異的にハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することも提供し、ここで前記細胞は前記変異タンパク質をコードして前記多形性部位の前記特異的配列を含む第１のプレｍＲＮＡを含み、前記細胞は正常なＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードして前記多形性部位の異なる配列を含む第２のプレｍＲＮＡを含む。
【００２８】
本発明はさらに、ＣＡＤＡＳＩＬに罹患しているかまたは罹患する危険性のある個体におけるＶＳＭＣ変性および／または顆粒状オスミウム酸親和性堆積物のレベルを減少させるための方法を提供し、この方法は、本発明の、本発明に従うＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡに対するオリゴヌクレオチド、発現カセットまたは遺伝子送達媒体を前記個体に提供するステップを含む。
【００２９】
本発明はさらに、３４個未満のＥＧＦＬ反復を有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする、ＮＯＴＣＨ３コード核酸を提供する。２２個またはそれ以上のＥＧＦＬ反復を有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする、ＮＯＴＣＨ３コード核酸がさらに提供される。好ましくは、ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする前記核酸は３０個のＥＧＦＬ反復を有する。エクソン４および５のＮＯＴＣＨ３コード配列を失ったＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする、ＮＯＴＣＨ３コード核酸がさらに提供される。本発明に従うＮＯＴＣＨ３変異体をコードするＮＯＴＣＨ３コード核酸は、好ましくは均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を含む。好ましくは、前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質に存在する本質的にすべてのＥＧＦＬ反復が、均一な数のシステインを有する。この段落に詳述されるとおりの核酸にコードされるアミノ酸配列を含む単離および／または組み換えＮＯＴＣＨ３タンパク質がさらに提供される。
【００３０】
ＮＯＴＣＨ３遺伝子の突然変異に対して特異的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドがさらに提供され、前記突然変異はＥＧＦＬ反復に不均一な数のシステインを含むＮＯＴＣＨ３タンパク質をもたらす。ＣＡＤＡＳＩＬは優性遺伝性の疾患であるため、ＣＡＤＡＳＩＬに罹患しているかまたは罹患する危険性のあるほとんどの個体は、冒された対立遺伝子に対してヘテロ接合性である。よって一方の対立遺伝子は正常なＮＯＴＣＨ３タンパク質を生成する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは変異体対立遺伝子に対して特異的であることが好ましい。このやり方で、冒された（プレ）ｍＲＮＡのみが標的にされる。好ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはＮＯＴＣＨ３遺伝子中の一般的な反復性の突然変異に対して特異的である。好ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはエクソン４またはエクソン５に対して特異的である。好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは表１のＣＡＤＡＳＩＬ突然変異、好ましくはＮＯＴＣＨ３遺伝子のＡｒｇ２０７Ｃｙｓ、Ａｒｇ１４１Ｃｙｓ、Ａｒｇ１８２ＣｙｓまたはＡｒｇ１５３Ｃｙｓ突然変異に対して特異的である。別の好ましい実施形態において、本発明は、エクソン２〜３２のいずれか１つにおける多形性部位中の配列に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。好ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＴＣＨ３のエクソンのスキッピングをもたらすオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、好ましくはエクソン２、３、４、５、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２のうち１つのエクソンに対して特異的である。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜２３のうち１つのエクソン、好ましくはエクソン２、３、４、５、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、および２３のうち１つのエクソンに対して特異的である。別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜１０のうち１つのエクソンに対して特異的である。特に好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜５のうち１つのエクソンに対して特異的である。好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書の上記において同定されるエクソンのいずれか１つにおけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異または多形性部位中の配列に対して特異的である。特に好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン２、３、４もしくは５におけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異に対して特異的であるか、および／またはエクソン２、３、４もしくは５における多形性部位中の配列に対して特異的である。
【００３２】
本発明はさらに、ＣＡＤＡＳＩＬに罹患しているかまたは罹患する危険性のある個体におけるＶＳＭＣ変性および／または顆粒状オスミウム酸親和性堆積物のレベルを減少させるための方法を提供し、この方法は、ＶＭＳＣ中のＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を減少させるための核酸、または前記個体のＶＭＳＣ中の変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質を修飾するための核酸を前記個体に提供するステップを含む。特定のｍＲＮＡの量またはその翻訳を低減させるためのさまざまな方法が当該技術分野において利用可能である。その例は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子ならびにその類似物を含むがそれに限定されない。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、必ずしも非修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドほどの量ではない、同じ種類のハイブリダイゼーション特徴を有するモルホリンである。本発明においては、これらがＣＡＤＡＳＩＬに関連するＮＯＴＣＨ３突然変異に対して特異的であることが好ましい。別の好ましい実施形態において、ＶＭＳＣ中のＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を減少させるための前記核酸は、ＮＯＴＣＨ３に対して特異的な抗体またはその断片もしくは類似物をコードする。好ましくは、前記抗体はＣＡＤＡＳＩＬに関連するＮＯＴＣＨ３タンパク質変異体に対して特異的である。
【００３３】
標的配列との単一のミスマッチは、このミスマッチが標的配列の中央に位置するときにはＡＯＮ有効性を（ほぼ）完全に失わせ得ることが公知である。突然変異特異的ＡＯＮの利点は、それらが野生型対立遺伝子の転写を顕著に妨げないことである。不利な点は、多様なＮＯＴＣＨ３突然変異を標的とするために複数のＡＯＮを設計する必要が出てくることである。エクソン特異的ＡＯＮの利点は、標的とされる突然変異ホットスポットエクソン４または５の単一または複数エクソンのスキッピングが、ＣＡＤＡＳＩＬ患者における突然変異の最大７０％に利益を与え得ることである。このアプローチの欠点は、野生型対立遺伝子も標的にされて修飾されることである。しかしながら、本発明において修飾されたタンパク質は正常な機能を保持するため、このことは問題を有さないはずである。しかし、好ましい実施形態においては、ＳＮＰ特異的ＡＯＮを用いて、エクソン特異的スキッピングにおいて野生型対立遺伝子の望ましくないターゲティングを回避できた。Ｎｏｔｃｈ３コード領域は多形性を示す。個体は２つの異なる多形性対立遺伝子を有することができ、ＣＡＤＡＳＩＬ患者においてこれらを特異的に標的にすることによって、変異型対立遺伝子を標的にしてもよい。よって、この対立遺伝子に排他的に存在するＳＮＰを標的にすることによって変異型対立遺伝子に特異的にハイブリダイズさせるために、異なるＡＯＮが設計されてもよい。ＮＯＴＣＨ３には多くの記述された共通のＳＮＰが存在するため、標的エクソンに異なる突然変異を有するが、共通のＳＮＰをシスで有する患者を処置するために、同じＡＯＮまたはＡＯＮキットを用いることが可能である。
【００３４】
ＮＯＴＣＨ３ダウンレギュレーション
ＮＯＴＣＨ３システイン量の修正（タンパク質の修飾）に対する代替案として、本発明はエクソンスキッピングを用いて変異タンパク質の発現をダウンレギュレートする。このやり方で、正常なＶＳＭＣのホメオスタシスのために十分な野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）ＮＯＴＣＨ３（ｗｔＮＯＴＣＨ３）発現を維持しながら、ＶＳＭＣ膜におけるＮＯＴＣＨ３蓄積の低減が達成される。これを達成するために、誘導されるスキップがアウトオブフレーム転写物およびナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構をもたらすようにＡＯＮが設計されている。ＡＯＮは突然変異またはＳＮＰに特異的になるように設計されることによって、ｗｔＮＯＴＣＨ３が標的にされないようにする。このＡＯＮに誘導されるＮＯＴＣＨ３発現の「ヘミ接合性」は、ＮＯＴＣＨ３の機能を損なわない。ヒトｗｔＮＯＴＣＨ３またはヒト変異体ＮＯＴＣＨ３をヘミ接合性で発現するトランスジェニックマウス系統は生存可能であって、Ｎｏｔｃｈ３−／−マウスの構造的な動脈の欠陥を救出でき、発明者らはあるＣＡＤＡＳＩＬ患者において、一方の対立遺伝子上の原型システインを変更する突然変異と、他方の対立遺伝子上のＮＯＴＣＨ３の欠失とを確認した。この患者はミスセンス突然変異に起因し得るＣＡＤＡＳＩＬだが、その他の明らかな医学的問題または血管の問題は有さない。よって、ＮＯＴＣＨ３発現の低減は生命および正常な血管機能と両立できる。この実施形態において、ＡＯＮは、突然変異および／または正常な対立遺伝子には存在しない対立遺伝子特異的ＳＮＰを標的にする。
【００３５】
ＣＡＤＡＳＩＬは全身性動脈疾患であり、つまり特定の口径のすべての動脈がＣＡＤＡＳＩＬに典型的な壁在性の変化を示す。しかし、理由は不明だが、小さいサイズから中程度のサイズの大脳動脈がこの病理の主力を担う。これらの動脈および特定的にはＶＳＭＣがＡＯＮの標的となる。ＡＯＮは静脈内に注射されてもよいし、脳脊髄液に直接注射されてもよい。本発明において用いられるＡＯＮは、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡのものであり（ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮａｓｅＨ誘導性ノックダウンを防ぐため）、これは安定性の改善のためにホスホロチオエート主鎖を有する。ホスホロチオエート修飾の付加的な利益は、細胞膜を越えるＡＯＮの取込みが改善されることである。加えてこの修飾は血清タンパク質への低親和性結合をもたらし、血清タンパク質は血流におけるＡＯＮの担体の働きをして、腎臓によるＡＯＮの排除を防ぐ。よってＡＯＮの血清半減期が増加することにより、より良好な組織分布が可能になる。
【００３６】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルにおいては、静脈内、皮下および腹腔内注射の後にＡＯＮを全身的に送達できることが示されている。加えて、それらは表皮の平滑筋細胞に吸収される（投稿中の原稿および印刷中の原稿）。よってＡＯＮはＶＳＭＣにも吸収される。
【００３７】
この化学のＡＯＮによる、高用量（最高６００ｍｇ／ｋｇ）での最長６ヵ月間の局部的および全身的処置は、癌、慢性免疫疾患、アテローム性動脈硬化およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する臨床試験中の患者によって、よく許容される。
【００３８】
ＮＯＴＣＨ３特異的配列に対して設計されたＡＯＮは、インフレームのリーディングフレームを維持しながら所与のＥＧＦＬドメインにおいて均一な数の６個のシステイン残基を再確立するような態様で、プレｍＲＮＡスキッピングをもたらすことができる。これは突然変異特異的ＡＯＮおよびエクソン特異的ＡＯＮの両方、ならびにＳＮＰ特異的ＡＯＮを含む。その目的は、好ましくはエクソン３、４および５のホットスポットに対するＮＯＴＣＨ３突然変異を標的とするＡＯＮを設計して、各ＡＯＮが最大数の突然変異を標的にできるようにすることである。ＮＯＴＣＨ３特異的配列に対して設計されるＡＯＮは、プレｍＲＮＡスキッピングがアウトオブフレーム産物をもたらして、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構が誘導されるように作製されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】第１９番染色体の短腕上のＮＯＴＣＨ３遺伝子のエクソン４およびエクソン５のスキッピングによって、ＥＧＦＬ反復３〜５ならびにＥＧＦＬ反復２および６の部分の排除がもたらされる様子を示す図である。ＥＧＦＬ反復２および６は、同数のシステイン残基を有する融合ＥＧＦＬ反復産物を形成する。よって修飾されたＮＯＴＣＨ３タンパク質は３０個のＥＧＦＬ反復を有し、各ＥＧＦＬ反復は同数のシステイン残基を有する。
【図２】ＡＯＮ ｈ５ＣＡＤ１で処理した細胞培養液のＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡ断片のＲＴ−ＰＣＲおよび配列分析を、エクソン５を含む領域に焦点を当てて示す図である。形質移入なしの細胞培養液（レーン２）およびＡＯＮなしで形質移入された細胞培養液（レーン３）と比べて、より短い新規の転写物が観察された（２９０ｂｐ、レーン４）。レーン１はサイズマーカー（ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ：ＳＭ）を含む。２９０ｂｐ断片の配列分析によって、エクソン５の正確なスキッピングが確認された。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
表１は、ＣＡＤＡＳＩＬをもたらすＮＯＴＣＨ３遺伝子のエクソン４およびエクソン５における一般的な突然変異を列挙するものである。このリストは一般的な突然変異を選択したものであり、ＮＯＴＣＨ３遺伝子のエクソン４およびエクソン５に見出される突然変異の完全なリストではない。左の列は、右側の列のＤＮＡ突然変異によってもたらされるアミノ酸置換を示す。
【００４１】
実験セクション
ＡＯＮ ｈ５ＣＡＤ１に対する組織培養、形質移入およびＲＴ−ＰＣＲ分析。
Ｎｏｔｃｈ３を発現する細胞系ＨＣＣ２４２９を、ダン（Ｄａｎｇ）ら（１）に記載されるとおりに培養した。形質移入に対しては、ＨＣＣ２４２９細胞を６ウェル培養皿中で６０〜７０％の培養密度まで生育させた。形質移入は、デュプロ（ｄｕｐｌｏ）中で、９００ｐｍｏｌのＡＯＮ ｈ５ＣＡＤ１と、１０μｌのポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ：ＰＥＩ、ＥｘＧｅｎ５００、ＭＢＩフェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））との組み合わせによって、製造者の指示に従って行なわれた。各ＡＯＮに対して、ＡＯＮ−ＰＥＩ複合体の別々の溶液を調製した。対照として蛍光標識したＡＯＮを用いた核蛍光シグナルの存在に基づくと、形質移入効率は概して８０％より高かった。形質移入の２４時間後にＲＮＡを単離し、過去の記載（２）のとおりにＲＴ−ＰＣＲ分析を行なった。標的となったエクソン５に隣接するエクソン４および６におけるプライマー（４Ｆ：ｃａａｃａｃａｃｃｔｇｇｃｔｃｃｔｔｃ；６Ｒ：ｇａｃｔｇｃａｇｃｔｃｔｃａｃｃｔｇｔｃ）によるＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＡＯＮ ｈ５ＣＡＤ１によるスキッピングの成功が確認された。エクソン５が正しくスキップされたかどうかを確認するために、アガロースゲルから予想サイズ（２９０ｂｐ）のＰＣＲ断片を単離し、過去の記載（３）のとおりにシーケンシング分析を行なった。
【００４２】
引用文献
１．ダン（Ｄａｎｇ）Ｔ Ｐら（２０００）。「第１９番染色体の転位、Ｎｏｔｃｈ３の過剰発現、およびヒト肺癌（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １９ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ，ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ３，ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）。」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ９２（１６）：１３５５−１３５７。
２．アールツマ−ルス（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ）Ａ、ブレマー−ボウト（Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔ）Ｍ、ヤンソン（Ｊａｎｓｏｎ）Ａ、デン・ダンネン（Ｄｅｎ Ｄｕｎｎｅｎ）Ｊ、ファン・オメン（ｖａｎ Ｏｍｍｅｎ）Ｇ、およびファン・デートコム（ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ）Ｊ。（２００２）。「デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する潜在的遺伝子修正療法としての標的エクソンスキッピング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）。」Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ １２：Ｓ７１−Ｓ７７。
３．ファン・デートコムＪＣら（２００１）。「アンチセンス誘導性エクソンスキッピングは、ＤＭＤ患者由来筋細胞におけるジストロフィン発現を修復する（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＤＭＤ ｐａｔｉｅｎｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ）。」Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １０：１５４７−１５５４。
【００４３】
表１。ＮＯＴＣＨ３のエクソン４およびエクソン５における突然変異
エクソン４
・Ａｒｇ１３３Ｃｙｓ；４７５ ＣＧＣ＞ＴＧＣ
・Ｃｙｓ１３４Ｔｒｐ；４８０ ＴＧＣ＞ＴＧＧ
・Ａｒｇ１４１Ｃｙｓ；４９９ ＣＧＣ＞ＴＧＣ
・Ｃｙｓ１４４Ｐｈｅ；５０９ ＴＧＣ＞ＴＴＣ
・Ａｒｇ１５３Ｃｙｓ；５３５ ＣＧＣ＞ＴＧＣ
・Ｃｙｓ１６２Ｔｒｐ；５６４ ＴＧＣ＞ＴＧＧ
・Ａｒｇ１８２Ｃｙｓ；６２２ ＣＧＣ＞ＴＧＣ
・Ｔｙｒ１８９Ｃｙｓ；６４４ ＴＡＣ＞ＴＧＣ
・Ａｒｇ２０７Ｃｙｓ；６９７ ＣＧＴ＞ＴＧＴ
・Ｃｙｓ２２４Ｔｙｒ；７４９ ＴＧＴ＞ＴＡＴ
エクソン５
・Ｃｙｓ２３３Ｔｒｐ；７７７ ＴＧＴ＞ＴＧＧ
・Ｔｙｒ２５８Ｃｙｓ；８５１ ＴＡＴ＞ＴＧＴ
【００４４】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および医学の分野に関する。特に、本発明はＥＧＦ反復を含有するタンパク質、たとえばＮＯＴＣＨ３など、その中の突然変異、および突然変異を克服する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（Ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ ｗｉｔｈ ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌ ｉｎｆａｒｃｔｓ ａｎｄ ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＣＡＤＡＳＩＬ）は、ＮＯＴＣＨ３の突然変異によってもたらされる成人発症性（１４〜８６歳）の優性遺伝性の疾患であり、再発性の皮質下梗塞、認知症、ならびにより低頻度の偏頭痛および精神症状を特徴とする。ＮＯＴＣＨ３は３３個のエクソンを有し、ＣＡＤＡＳＩＬに関連するＮＯＴＣＨ３突然変異によって、所与の細胞外上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）様（−ｌｉｋｅ）の反復（ＥＧＦＬ反復）ドメイン内のシステイン残基の数が不均一となり、それは最初の５個のＥＧＦＬ反復をコードするエクソン３から６における強力なクラスター化を伴う。ＣＡＤＡＳＩＬにおける典型的なＭＲＩ特徴は、多巣性ラクナ梗塞、および前部側頭葉の関与する大脳白質のびまん性Ｔ２強調超強度を含む。電子顕微鏡観察（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＥＭ）では、平滑筋細胞の基底膜のすぐ近くの細動脈の媒質中に顆粒状オスミウム酸親和性材料（ｇｒａｎｕｌａｒ ｏｓｍｉｏｐｈｉｌｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ：ＧＯＭ）が存在することが示され、これはＣＡＤＡＳＩＬに特徴的なものである。
【０００３】
この顆粒状オスミウム酸親和性材料の同一性は部分的にしか知られていないが、変異型ＮＯＴＣＨ３タンパク質を含有することが示されている。
【０００４】
本発明のＣＡＤＡＳＩＬ表現型は、ＮＯＴＣＨ３遺伝子の突然変異によってもたらされる。この遺伝子は血管平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ：ＶＳＭＣ）および周皮細胞で発現され、細胞シグナル伝達機能を有する膜貫通型受容体であるＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードしている。ＣＡＤＡＳＩＬの患者においては、変性したＶＳＭＣの表面上にＮＯＴＣＨ３外部ドメインが蓄積しており、加えてＶＳＭＣの近くに顆粒状オスミウム酸親和性堆積物（ＧＯＭ）が蓄積している。ＶＳＭＣ変性は血管の反応性の障害および大脳の血流の減少をもたらすことによって、再発する脳梗塞および進行性の認知低下をもたらす。ＣＡＤＡＳＩＬは身体全体の動脈に影響するにもかかわらず、未知の理由からこの疾患は特に中枢神経系に現れる。
【０００５】
分子および細胞レベルでのこの疾患の病原性はまだわずかしか分かっていないが、タンパク質の３４個のＥＧＦＬ反復の１つ（ＥＧＦＬ反復）における不等数のシステイン残基をもたらす特徴的な突然変異によって、タンパク質のミスフォールディングが起こることが示されている。典型的に、各ＥＧＦＬ反復は６つのシステイン残基を含有する。不均一な数のシステイン残基（通常５残基または７残基のいずれか）をもたらすようなＮＯＴＣＨ３の突然変異がＣＡＤＡＳＩＬの原因となる。いくつかの研究から、研究されたほぼすべての突然変異について、変異体ＮＯＴＣＨ３の存在下でＮＯＴＣＨ３シグナル伝達は変化しないことが示された。問題の核心は、ＶＳＭＣにおける変異型ＮＯＴＣＨ３および、またはＧＯＭの蓄積の毒性効果であることが推測される。ＶＳＭＣにおけるＮＯＴＣＨ３およびＧＯＭの蓄積はＣＡＤＡＳＩＬに特徴的なものであり、ＮＯＴＣＨ３トランスジェニックマウスおよび細胞モデルにおいても観察されている。
【０００６】
本発明においては、より短いｍＲＮＡ産物を生成するか、および／または変異体ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡの発現を減らすことによって、ＮＯＴＣＨ３タンパク質の所与の変異型ＥＧＦＬ反復における同数のシステイン残基を再確立することで、ＶＳＭＣの表面におけるＮＯＴＣＨ３外部ドメインの蓄積が低減および／または遅延することが見出された。すべてのＥＧＦＬ反復に同数のシステインを有するＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡ、および／または変異体ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡ発現の低減によっても、ＣＡＤＡＳＩＬに罹患した対象またはＣＡＤＡＳＩＬに罹患する危険性のある対象におけるＶＳＭＣの変性が低減および／または遅延する。本発明においては、所与の変異型ＥＧＦＬ反復における同数のシステインの再確立、および／またはＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡ発現の低減によって、疾患をもたらす突然変異によって生成される不対のシステイン残基の毒性効果が低減されることが見出された。ＮＯＴＣＨ３遺伝子中の突然変異のほとんどはエクソン４に存在する。ｍＲＮＡからエクソン４およびエクソン５を排除することによって、残りのＥＧＦＬ反復のすべてが均一な数のシステインを有するコード領域が生じることが見出された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって本発明は、不均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を有する変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡから、均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを生成するための方法を提供する。これは、前記プレｍＲＮＡを発現する細胞に、前記プレｍＲＮＡと相補的であって前記プレｍＲＮＡとハイブリダイズすることによって、前記プレｍＲＮＡから生成されるｍＲＮＡからのエクソン４およびエクソン５の排除を誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することによって達成される。好ましくは、不均一な数のシステインを有する前記ＥＧＦＬ反復は、エクソン４および／またはエクソン５にコードされる。本発明は、不均一な数のシステインをもたらすエクソン４または５のあらゆる突然変異に対して有用である。突然変異のリストは、新たな患者が同定されて配列決定されることに伴って連続的に増加している。本発明が有用であることが実証された突然変異は、前記プレｍＲＮＡが、突然変異Ａｒｇ１３３Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１３４Ｔｒｐ、Ａｒｇ１４１Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１４４Ｐｈｅ、Ａｒｇ１５３Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１６２Ｔｒｐ、Ａｒｇ１８２Ｃｙｓ、Ｔｙｒ１８９Ｃｙｓ、Ａｒｇ２０７Ｃｙｓ、Ｃｙｓ２２４Ｔｙｒ、Ａｒｇ２０７Ｃｙｓ、Ｃｙｓ２２４Ｔｙｒ、またはその組み合わせを有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするものである。
【０００８】
本発明はさらに、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡを発現する細胞によって生成される前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるための方法を提供し、ここで前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質は不均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を含む。前記方法は、ＮＯＴＣＨ３遺伝子のエクソン４および／またはエクソン５における前記ＥＧＦＬ反復の不均一な数のシステインの原因である突然変異をコードするヌクレオチド配列と相補的であってそれにハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む。好ましい実施形態において、前記方法は、ＮＯＴＣＨ３遺伝子のエクソン５における前記ＥＧＦＬ反復の不均一な数のシステインの原因である突然変異をコードするヌクレオチド配列と相補的であってそれにハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む。別の好ましい実施形態において、前記方法は、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡと相補的であってそれに特異的にハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む。変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションは、ＣＡＤＡＳＩＬの原因となる突然変異に対して特異的なオリゴヌクレオチドを用いて達成されることが好ましい。ＣＡＤＡＳＩＬの原因となる突然変異はエクソン４またはエクソン５にあることが多いが、ＮＯＴＣＨ３プレｍＲＮＡ中のその他のＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異も本発明の範囲内にある。言換えると、このオリゴヌクレオチドは、ＣＡＤＡＳＩＬの原因となる突然変異と相補的であり、かつそれに重複している。この点に関して、オリゴヌクレオチドはエクソン２〜３２のいずれか１つに対して特異的であってもよく、好ましくはオリゴヌクレオチドはエクソン２〜２３のいずれか１つに対して特異的である。好ましくは、オリゴヌクレオチドはＮＯＴＣＨ３のエクソン４および／またはエクソン５における前記ＥＧＦＬ反復の不均一な数のシステインの原因である突然変異をコードするヌクレオチド配列に対して特異的である。
【０００９】
ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする遺伝子は多形性である。正常な機能を有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするさまざまなＮＯＴＣＨ３対立遺伝子が同定されている。変異体ＣＡＤＡＳＩＬ原因対立遺伝子に対してヘテロ接合性である細胞において、変異体対立遺伝子がその細胞中の正常な対立遺伝子と異なる点は、疾患の原因となる突然変異が存在することだけでなく、多形性部位に異なる配列が存在することでもあり得る。よって、この多形性部位もこのヘテロ接合体の変異体対立遺伝子を特徴付ける。
【００１０】
よって別の好ましい実施形態において、本発明は、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする第１のプレｍＲＮＡと、正常なＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする第２のプレｍＲＮＡとを発現する細胞によって生成される前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるための方法を提供し、ここで前記第１および前記第２のプレｍＲＮＡは、変異体対立遺伝子におけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異の存在と、部位突然変異とは異なる多形性部位における異なる配列の存在とが互いに異なっており、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるための前記方法は、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡ上に存在する多形性部位の配列と相補的であってそれに特異的にハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む。変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする第１のプレｍＲＮＡと、正常なＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする第２のプレｍＲＮＡとを発現する細胞によって生成される前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるための方法がさらに提供され、ここで前記第１および前記第２のプレｍＲＮＡは、変異体対立遺伝子におけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異の存在と、前記突然変異の部位とは異なる多形性部位における異なる配列の存在とが互いに異なっており、前記方法は、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡ上に存在する多形性部位の配列と相補的であってそれにハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む。
【００１１】
好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜３２のいずれか１つにおける多形性部位の配列に対して特異的である。好ましい実施形態において、ＣＡＤＡＳＩＬ原因変異体をコードするプレｍＲＮＡの量は、エクソンスキッピングによって低減される。好ましくは、変異体対立遺伝子のタンパク質コードドメインにフレームシフトを導入するエクソンスキッピングによる。好ましくは、前記フレームシフトはタンパク質の中途終止を導入する。この実施形態において、オリゴヌクレオチドは、エクソン２、３、４、５、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２のうち１つのエクソンに対して特異的であることが好ましい。
【００１２】
別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜２３のうち１つのエクソン、好ましくはエクソン２、３、４、５、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、および２３のうち１つのエクソンに対して特異的である。別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜１０のうち１つのエクソンに対して特異的である。特に好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜５のうち１つのエクソンに対して特異的である。好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書の上記において同定されるエクソンのいずれか１つにおけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異または多形性部位に対して特異的である。特に好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン２、３、４もしくは５におけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異に対して特異的であるか、および／またはエクソン２、３、４もしくは５における多形性部位に対して特異的である。
【００１３】
実施形態の好ましい局面において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは化学的に修飾されたアンチセンスヌクレオチドである（ホスホロチオエート主鎖を有するかまたは有さない２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：ＰＭＯ）、ホスホロチオエート主鎖を有するかまたは有さない２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ、および１つまたはそれ以上の異なる化学修飾ヌクレオチドの組み合わせからなるキメラオリゴ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｏｇｏｓ）を含むがそれに限定されない）。別の好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドはＳｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
【００１４】
本発明はさらに、ＮＯＴＣＨ３を発現する細胞内またはそのすぐ近くのＮＯＴＣＨ３タンパク質のレベルを少なくとも低減させるための方法を提供する。前記方法は、ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供することによって、前記ＮＯＴＣＨ３タンパク質の生成を減少させるか、または前記ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡのタンパク質コード領域を変えるステップを含む。後者の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＮＯＴＣＨ３プレｍＲＮＡのスプライシングの変化をもたらすことによって、代替的にスプライシングされたｍＲＮＡが得られることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドによって誘導される代替的スプライシングは典型的に、標的となるエクソンの排除に向かう。しかしながら、いわゆるエクソン包含（ｅｘｏｎ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）も可能である。代替的にスプライシングされたｍＲＮＡは、好ましくは少なくとも部分的に機能するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする。必然的ではないが典型的に、ｍＲＮＡに通常存在するエクソンがスキップされる。変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡのエクソンの特異的スキッピングは、２通りに有益である。好ましい実施形態において、前記細胞は、健康な個体のＮＯＴＣＨ３コード遺伝子と比べたときに表１に示されるとおりの突然変異を有するＮＯＴＣＨ３コード遺伝子を含む。エクソン４およびエクソン５をともにスキップすることによってもたらされるエクソン３〜６の連結はインフレームであって、残りのＥＧＦＬ反復すべてが均一な数のシステイン残基を有するようなＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする。よって、本発明の好ましい実施形態においては、エクソン４およびエクソン５の両方がスキップされる。変異型エクソン４のみ、または変異型エクソン５のみの特異的スキッピングでは、結果としてエクソン４スキッピングに対しては連結エクソン３〜５が、エクソン５スキッピングに対しては連結エクソン４〜６が得られる。これら後者の連結の結果、アウトオブフレームのタンパク質コードドメインがもたらされ、それによって中途終止が導入されて、切断型の非機能性タンパク質が得られる。このスキッピングによって、元の変異タンパク質の生成が減少することにより、ＣＡＤＡＳＩＬ患者の症状が緩和されると推定される。
【００１５】
好ましい実施形態において、処置されるべき細胞は、不均一な数のシステイン残基を有するＥＧＦＬ反復を含むＮＯＴＣＨ３タンパク質を発現する。前記突然変異は、好ましくは表１に列挙されるとおりの突然変異である。前記突然変異は、好ましくは表１のＡｒｇ１４１Ｃｙｓ；Ａｒｇ１５３Ｃｙｓ；Ａｒｇ１８２ＣｙｓおよびＡｒｇ２０７Ｃｙｓである。
【００１６】
罹患ファミリー内で多数の異なるＮＯＴＣＨ３突然変異が同定されている。無関係の個体における研究から、突然変異の強力なクラスター化が明らかとなり、それらの最大７０％がエクソン４および５で起こっている。この突然変異は個体内で自発的に起こり得ることも見出され、その観察はより広範囲の脳卒中集団におけるＮＯＴＣＨ３突然変異の診断テストに関する重要な問題を提起する。これまでに記述されたほとんどすべての症例はＮＯＴＣＨ３突然変異に対してヘテロ接合性である個体におけるものであるが、ホモ接合性の突然変異を有する患者も記述されている。
【００１７】
突然変異は、タンパク質のＥＧＦＬ反復の１つにおけるシステイン残基の減少または増加をもたらすという特徴を有する。こうした突然変異はタンパク質の高次構造を変化させるため、ＮＯＴＣＨ３タンパク質が血管平滑筋細胞膜に蓄積し、これは前記細胞にとって有毒であり得る。
【００１８】
Ｎｏｔｃｈ３遺伝子は、上皮成長因子様の反復（ＥＧＦＬ反復）のいくつかの縦列反復コピーを含有して、隣接する細胞間にシグナルを伝達する役割をする膜貫通型受容体をコードする。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、血管発生の多くの局面を含む胚発生の際の細胞シグナル伝達および運命に関与する高度に保存された経路であるが、正常な成体の血管平滑筋細胞の生理学におけるＮｏｔｃｈ３の役割は未知の点が多い。最近の研究では、Ｎｏｔｃｈ３が血管の損傷に関わっており、血管平滑筋細胞の生存決定因子であることが示唆されている。
【００１９】
本発明のＣＡＤＡＳＩＬ表現型は、本明細書の上記において言及したとおり、変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の発現に関連している。ヒトにおける病原性は主に、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における変異タンパク質の発現に関連している。したがって、この種の細胞における発現が低減および／または変更されることが好ましい。本発明の特に好ましい実施形態においては、ＣＡＤＡＳＩＬに関連する変異タンパク質が修飾されることによって、均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を有する修飾変異体ＣＡＤＡＳＩＬタンパク質の生成を可能にする。言換えると、不均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復の存在をもたらすＮＯＴＣＨ３のＣＡＤＡＳＩＬ突然変異が、本発明の修飾によって打ち消されて、均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復のみを有する新たなＮＯＴＣＨ３変異体がもたらされる（ＮＯＴＣＨ３変異体が修復される）ことが好ましい。理論に結び付けられることなく、均一な数に修復することで、少なくとも部分的に機能するＮＯＴＣＨ３変異タンパク質が生成されると考えられる。さらに、修復ＮＯＴＣＨ３変異体は蓄積しないか、少なくともＣＡＤＡＳＩＬ表現型をもたらすＮＯＴＣＨ３変異体よりも少ない程度に蓄積すると考えられる。修復ＮＯＴＣＨ３変異体の生成は、さらにＧＯＭの量の減少をもたらす。それはさらにＶＳＭＣ変性の低減をもたらし、最終的にはＣＡＤＡＳＩＬに罹患しているかまたは罹患する危険性のある個体における虚血性脳卒中および認知症の危険性を低減させる。
【００２０】
修復ＮＯＴＣＨ３変異体は、好ましくはエクソンスキッピングを起こさせることによって生成される。エクソンスキッピングの結果、ＮＯＴＣＨ３をコードするｍＲＮＡからエクソンが排除される。エクソンスキッピングは典型的に、そのエクソンに隣接するスプライス部位に向けられたオリゴヌクレオチドによって誘導されるか、またはエクソン内部のオリゴヌクレオチドによって誘導される。ＮＯＴＣＨ３は３３個のエクソンを含有しており、そのエクソン１〜３３がタンパク質の部分をコードする。エクソン１およびエクソン３３は、それぞれ開始コドンおよび終止コドンを含有する。エクソン２から２３は、タンパク質のＥＧＦＬ反復をコードする。好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＴＣＨ３タンパク質のＥＧＦＬをコードするエクソンのスキッピングを誘導する。
【００２１】
エクソン４および５のスキッピングは、インフレーム変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をもたらす。特に好ましいのはエクソン４およびエクソン５のスキッピングである。なぜならこれらのエクソンは、現在同定されているすべてのＣＡＤＡＳＩＬ突然変異の約７０％を含むためである。これらのエクソンのスキッピングは、タンパク質レベルでＥＧＦＬ反復３、４および５を完全に失ったインフレーム生成物をもたらすが、ＥＧＦＬ反復２および６は正確に６個のシステイン残基を有する機能性融合ＥＧＦＬ反復を形成することが予測される。このスキッピングは、内部エクソン４および５の配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ＡＯＮｓ）を生成することによって誘導される。エクソン特異的なＡＯＮに加えて、好ましくは突然変異特異的なＡＯＮが用いられる。所与のＥＧＦＬ反復における突然変異をスキップするためにＡＯＮを用いてＥＧＦＬ反復をスキップするというこの技術は、ＥＧＦＬ反復の反復配列を有する他の細胞表面受容体、たとえばＮＯＴＣＨ３のＤＳＬリガンドであるデルタ様１、３および４などにも適用されてもよい。
【００２２】
エクソン４のスキッピングは、表１の突然変異Ａｒｇ１４１Ｃｙｓ；Ａｒｇ１５３Ｃｙｓ；Ａｒｇ１８２ＣｙｓおよびＡｒｇ２０７Ｃｙｓに対して好ましい。エクソン５のスキッピングは、表１の突然変異Ｃｙｓ２３３ＴｒｐおよびＴｙｒ２５８Ｃｙｓに対して好ましい。結果として得られる修復ＮＯＴＣＨ３変異タンパク質は、均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を有する。
【００２３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは前記ＮＯＴＣＨ３プレｍＲＮＡの１３ヌクレオチドから５０ヌクレオチドの間の連続した部分に対して相補的である。好ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＮＯＴＣＨ３プレｍＲＮＡの１６ヌクレオチドから５０ヌクレオチドの間の連続した部分に対して相補的である。好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対して特異的な１５〜４０ヌクレオチドを含む。エクソンスキッピングを誘導するために十分および／または最適な塩基の数は、いくつかの因子によって決まる。いくつかのタイプのオリゴヌクレオチドは通常いくらか長いオリゴヌクレオチドを必要とし、たとえばモルホリノは典型的に約２５〜３０個の連続した塩基を有するが、２’Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは典型的に約２０〜２５個の塩基にその活性最適値を有する。したがって本発明に対しては、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは約１５ヌクレオチドから３５ヌクレオチドの間の連続した部分に対して相補的であることが好ましい。より好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは約２０ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの間の連続した部分に対して相補的である。
【００２４】
オリゴヌクレオチドを生成するために異なるタイプの核酸が用いられてもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドはＲＮＡを含む。なぜならＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは非常に安定だからである。エクソンスキッピング技術の目的の１つは、対象におけるスプライシングを指示することであるため、オリゴヌクレオチドＲＮＡはＲＮＡに付加的な特性を与える修飾を含むことが好ましい。いくつかのタイプのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的（プレｍＲＮＡ）をＲＮＡｓｅＨなどのヌクレアーゼに対して感受性にする。アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的プレｍＲＮＡとによって形成される二本鎖をＲＮＡｓｅＨ分解に対して感受性にするようなオリゴヌクレオチドは、変異体をコードする（プレ）ｍＲＮＡの分解によって変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるような実施形態に対して好ましい。エクソンスキッピングのみが意図されるときは、アンチセンスオリゴヌクレオチドがこの特性を有さずに、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的プレｍＲＮＡとによって形成される二本鎖をＲＮＡｓｅＨに対して抵抗性にするような修飾を含むことが好ましい。さまざまなオリゴヌクレオチドならびにその修飾および変形は、標的（プレ）ｍＲＮＡのヌクレアーゼ分解を促進しない。こうしたタイプのオリゴヌクレオチドの例は、２’Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびモルホリノである。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに付加または強化されてもよいその他の特徴は、（たとえば体液などにおける）安定性の増加、柔軟性の増加または減少、毒性の低減、細胞内輸送の増加、組織特異性などである。好ましくは、前記修飾は２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド修飾を含む。好ましくは、前記修飾は２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド修飾を含む。実施形態の１つにおいて、本発明は、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾およびロックド核酸を含むオリゴヌクレオチドを含むハイブリッドオリゴヌクレオチドを提供する。この特定の組み合わせは、ロックド核酸からなる同等物よりも良好な配列特異性を含み、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾からなるオリゴヌクレオチドよりも改善された有効性を含む。
【００２５】
核酸模倣技術の出現によって、必ずしも核酸自体ほどの量ではない、類似または好ましくは同じ種類のハイブリダイゼーション特性を有する分子を生成することが可能になった。こうした同等物ももちろん本発明の部分である。こうした模倣同等物の例は、ペプチド核酸、ロックド核酸および／またはモルホリノホスホロジアミデートである。本発明のオリゴヌクレオチドの同等物の好適だが限定的でない例は、以下に見出すことができる（ワールステッド（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ），Ｃ．ら、「ロックド核酸を含有する強力で無毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）。」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７，５６３３−８．（２０００）。エラヤディ（Ｅｌａｙａｄｉ），Ａ．Ｎ．およびコーレイ（Ｃｏｒｅｙ），Ｄ．Ｒ．「ＰＮＡおよびＬＮＡオリゴマーの化学療法への適用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＮＡ ａｎｄ ＬＮＡ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｔｏ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）。」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ２，５５８−６１．（２００１）。ラーセン（Ｌａｒｓｅｎ），Ｈ．Ｊ．，ベンティン（Ｂｅｎｔｉｎ），Ｔ．およびニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ），Ｐ．Ｅ．「ペプチド核酸のアンチセンス特性（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）。」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８９，１５９−６６．（１９９９）。ブラーシュ（Ｂｒａａｓｃｈ），Ｄ．Ａ．およびコーレイ，Ｄ．Ｒ．「遺伝子発現を調節するための新規のアンチセンスおよびペプチド核酸戦略（Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）。」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１，４５０３−１０．（２００２）。サマートン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．およびウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．「モルホリノアンチセンスオリゴマー：設計、調製および特性（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：ｄｅｓｉｇｎ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）。」Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ７，１８７−９５．（１９９７））。１つまたはそれ以上の同等物が互いに、および／または核酸とともにハイブリッドになったものも、もちろん本発明の部分である。好ましい実施形態において、同等物はロックド核酸を含む。なぜならロックド核酸はより高い標的親和性およびより低い毒性を示すために、より高いエクソンスキッピング効率を示すからである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはヌクレオチドの連続した一続きにおいて相補的である。しかし典型的には、標的ＲＮＡのスキッピングまたは低減の効率を過度に低くすることなく、１つまたは２つのミスマッチが許容される。よって、こうした１つまたは２つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドも本発明において使用され得る。現在、その天然の対応物と同種の塩基対形成を示す塩基の類似物が利用可能である。したがって、こうした類似物も本発明のオリゴヌクレオチドに含まれてもよい。天然の対応物とは異なる態様で対形成するいくつかの塩基類似物が利用可能である。たとえば、イノシンは対向する塩基と対形成しない。こうした塩基類似物も本発明のオリゴヌクレオチドに含まれてもよい。非塩基対形成類似物は、典型的にオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション強度を低減させる。このため、オリゴヌクレオチドはこの低減を補償するための付加的なヌクレオチドを含むことが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的にエクソンのスプライス供与体またはスプライス受容体と重複する必要はない。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、それ自体として、または核酸送達媒体と関連して細胞に与えられてもよい。オリゴヌクレオチドは、たとえばリポソームまたはＰＥＩなどの形質移入剤を用いて細胞に形質移入されてもよい。代替的には、オリゴヌクレオチドはウイルス性またはウイルスに基づく遺伝子送達媒体によって細胞に導入される。加えて、オリゴヌクレオチドは前記細胞に与えられる発現カセットにコードされてもよい。典型的に、オリゴヌクレオチドは前記ウイルス性またはウイルスに基づく遺伝子送達媒体中の発現カセットにコードされる。次いでオリゴヌクレオチドは前記オリゴヌクレオチドを含む転写物に含まれてもよい。よって好ましくは、前記発現カセットは前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡをコードする。よって、遺伝子送達媒体は発現カセットを含有してもよい。発現カセットは発現されるべき配列を、たとえば好適なプロモーターおよび転写終止配列など、その配列の発現のために必要なすべての配列と一緒に含有する。発現ベクターは、好ましくは遺伝子送達媒体を介して細胞に導入される。好ましい送達媒体はウイルスベクター、たとえばアデノウイルスベクター、およびより好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターなどである。よって本発明は、こうした発現ベクターおよび送達媒体をも提供する。好適な転写物を設計することは当業者の技術の範囲内である。本発明に対して好ましいのはＰｏｌＩＩＩ駆動転写物である。好ましくはＵ１またはＵ７転写物との融合転写物の形である。こうした融合物は、ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）Ｌ，スーター（Ｓｕｔｅｒ）Ｄ，エメリック（Ｅｍｅｒｉｃｋ）Ｖら「修飾されたＵ７低分子核内ＲＮＡによるプレｍＲＮＡスプライシングパターンの安定な変更（Ｓｔａｂｌｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｕ７ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡｓ）。」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８；９５：４９２９ ４９３４、およびスーターＤ，トマシーニ（Ｔｏｍａｓｉｎｉ）Ｒ，レーバー（Ｒｅｂｅｒ）Ｕら「二重標的アンチセンスＵ７ｓｎＲＮＡは、３つのヒトベータサラセミア突然変異における異常なエクソンの効率的なスキッピングを促進する（Ｄｏｕｂｌｅ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｕ７ ｓｎＲＮＡｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｂｅｒｒａｎｔ ｅｘｏｎ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）。」Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １９９９；８：２４１５ ２４２３に記載されるとおりに生成されてもよい。
【００２７】
本発明はさらに、皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）の処置のための、本発明のＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、発現カセットおよび／または遺伝子送達媒体の使用を提供する。ＣＡＤＡＳＩＬの処置のための薬物の調製のための、本発明のＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、発現カセットおよび／または遺伝子送達媒体の使用も提供される。本発明はさらに、細胞中の変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるために、ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡ上の多形性部位の特異的配列と相補的であってそれに特異的にハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することも提供し、ここで前記細胞は前記変異タンパク質をコードして前記多形性部位の前記特異的配列を含む第１のプレｍＲＮＡを含み、前記細胞は正常なＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードして前記多形性部位の異なる配列を含む第２のプレｍＲＮＡを含む。
【００２８】
本発明はさらに、ＣＡＤＡＳＩＬに罹患しているかまたは罹患する危険性のある個体におけるＶＳＭＣ変性および／または顆粒状オスミウム酸親和性堆積物のレベルを減少させるための方法を提供し、この方法は、本発明の、本発明に従うＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡに対するオリゴヌクレオチド、発現カセットまたは遺伝子送達媒体を前記個体に提供するステップを含む。
【００２９】
本発明はさらに、３４個未満のＥＧＦＬ反復を有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする、ＮＯＴＣＨ３コード核酸を提供する。２２個またはそれ以上のＥＧＦＬ反復を有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする、ＮＯＴＣＨ３コード核酸がさらに提供される。好ましくは、ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする前記核酸は３０個のＥＧＦＬ反復を有する。エクソン４および５のＮＯＴＣＨ３コード配列を失ったＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする、ＮＯＴＣＨ３コード核酸がさらに提供される。本発明に従うＮＯＴＣＨ３変異体をコードするＮＯＴＣＨ３コード核酸は、好ましくは均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を含む。好ましくは、前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質に存在する本質的にすべてのＥＧＦＬ反復が、均一な数のシステインを有する。この段落に詳述されるとおりの核酸にコードされるアミノ酸配列を含む単離および／または組み換えＮＯＴＣＨ３タンパク質がさらに提供される。
【００３０】
ＮＯＴＣＨ３遺伝子の突然変異に対して特異的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドがさらに提供され、前記突然変異はＥＧＦＬ反復に不均一な数のシステインを含むＮＯＴＣＨ３タンパク質をもたらす。ＣＡＤＡＳＩＬは優性遺伝性の疾患であるため、ＣＡＤＡＳＩＬに罹患しているかまたは罹患する危険性のあるほとんどの個体は、冒された対立遺伝子に対してヘテロ接合性である。よって一方の対立遺伝子は正常なＮＯＴＣＨ３タンパク質を生成する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは変異体対立遺伝子に対して特異的であることが好ましい。このやり方で、冒された（プレ）ｍＲＮＡのみが標的にされる。好ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはＮＯＴＣＨ３遺伝子中の一般的な反復性の突然変異に対して特異的である。好ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはエクソン４またはエクソン５に対して特異的である。好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは表１のＣＡＤＡＳＩＬ突然変異、好ましくはＮＯＴＣＨ３遺伝子のＡｒｇ２０７Ｃｙｓ、Ａｒｇ１４１Ｃｙｓ、Ａｒｇ１８２ＣｙｓまたはＡｒｇ１５３Ｃｙｓ突然変異に対して特異的である。別の好ましい実施形態において、本発明は、エクソン２〜３２のいずれか１つにおける多形性部位中の配列に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。好ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＴＣＨ３のエクソンのスキッピングをもたらすオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、好ましくはエクソン２、３、４、５、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２のうち１つのエクソンに対して特異的である。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜２３のうち１つのエクソン、好ましくはエクソン２、３、４、５、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、および２３のうち１つのエクソンに対して特異的である。別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜１０のうち１つのエクソンに対して特異的である。特に好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、エクソン２〜５のうち１つのエクソンに対して特異的である。好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書の上記において同定されるエクソンのいずれか１つにおけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異または多形性部位中の配列に対して特異的である。特に好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン２、３、４もしくは５におけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異に対して特異的であるか、および／またはエクソン２、３、４もしくは５における多形性部位中の配列に対して特異的である。
【００３２】
本発明はさらに、ＣＡＤＡＳＩＬに罹患しているかまたは罹患する危険性のある個体におけるＶＳＭＣ変性および／または顆粒状オスミウム酸親和性堆積物のレベルを減少させるための方法を提供し、この方法は、ＶＭＳＣ中のＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を減少させるための核酸、または前記個体のＶＭＳＣ中の変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質を修飾するための核酸を前記個体に提供するステップを含む。特定のｍＲＮＡの量またはその翻訳を低減させるためのさまざまな方法が当該技術分野において利用可能である。その例は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子ならびにその類似物を含むがそれに限定されない。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、必ずしも非修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドほどの量ではない、同じ種類のハイブリダイゼーション特徴を有するモルホリンである。本発明においては、これらがＣＡＤＡＳＩＬに関連するＮＯＴＣＨ３突然変異に対して特異的であることが好ましい。別の好ましい実施形態において、ＶＭＳＣ中のＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を減少させるための前記核酸は、ＮＯＴＣＨ３に対して特異的な抗体またはその断片もしくは類似物をコードする。好ましくは、前記抗体はＣＡＤＡＳＩＬに関連するＮＯＴＣＨ３タンパク質変異体に対して特異的である。
【００３３】
標的配列との単一のミスマッチは、このミスマッチが標的配列の中央に位置するときにはＡＯＮ有効性を（ほぼ）完全に失わせ得ることが公知である。突然変異特異的ＡＯＮの利点は、それらが野生型対立遺伝子の転写を顕著に妨げないことである。不利な点は、多様なＮＯＴＣＨ３突然変異を標的とするために複数のＡＯＮを設計する必要が出てくることである。エクソン特異的ＡＯＮの利点は、標的とされる突然変異ホットスポットエクソン４または５の単一または複数エクソンのスキッピングが、ＣＡＤＡＳＩＬ患者における突然変異の最大７０％に利益を与え得ることである。このアプローチの欠点は、野生型対立遺伝子も標的にされて修飾されることである。しかしながら、本発明において修飾されたタンパク質は正常な機能を保持するため、このことは問題を有さないはずである。しかし、好ましい実施形態においては、ＳＮＰ特異的ＡＯＮを用いて、エクソン特異的スキッピングにおいて野生型対立遺伝子の望ましくないターゲティングを回避できた。Ｎｏｔｃｈ３コード領域は多形性を示す。個体は２つの異なる多形性対立遺伝子を有することができ、ＣＡＤＡＳＩＬ患者においてこれらを特異的に標的にすることによって、変異型対立遺伝子を標的にしてもよい。よって、この対立遺伝子に排他的に存在するＳＮＰを標的にすることによって変異型対立遺伝子に特異的にハイブリダイズさせるために、異なるＡＯＮが設計されてもよい。ＮＯＴＣＨ３には多くの記述された共通のＳＮＰが存在するため、標的エクソンに異なる突然変異を有するが、共通のＳＮＰをシスで有する患者を処置するために、同じＡＯＮまたはＡＯＮキットを用いることが可能である。
【００３４】
ＮＯＴＣＨ３ダウンレギュレーション
ＮＯＴＣＨ３システイン量の修正（タンパク質の修飾）に対する代替案として、本発明はエクソンスキッピングを用いて変異タンパク質の発現をダウンレギュレートする。このやり方で、正常なＶＳＭＣのホメオスタシスのために十分な野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）ＮＯＴＣＨ３（ｗｔＮＯＴＣＨ３）発現を維持しながら、ＶＳＭＣ膜におけるＮＯＴＣＨ３蓄積の低減が達成される。これを達成するために、誘導されるスキップがアウトオブフレーム転写物およびナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構をもたらすようにＡＯＮが設計されている。ＡＯＮは突然変異またはＳＮＰに特異的になるように設計されることによって、ｗｔＮＯＴＣＨ３が標的にされないようにする。このＡＯＮに誘導されるＮＯＴＣＨ３発現の「ヘミ接合性」は、ＮＯＴＣＨ３の機能を損なわない。ヒトｗｔＮＯＴＣＨ３またはヒト変異体ＮＯＴＣＨ３をヘミ接合性で発現するトランスジェニックマウス系統は生存可能であって、Ｎｏｔｃｈ３−／−マウスの構造的な動脈の欠陥を救出でき、発明者らはあるＣＡＤＡＳＩＬ患者において、一方の対立遺伝子上の原型システインを変更する突然変異と、他方の対立遺伝子上のＮＯＴＣＨ３の欠失とを確認した。この患者はミスセンス突然変異に起因し得るＣＡＤＡＳＩＬだが、その他の明らかな医学的問題または血管の問題は有さない。よって、ＮＯＴＣＨ３発現の低減は生命および正常な血管機能と両立できる。この実施形態において、ＡＯＮは、突然変異および／または正常な対立遺伝子には存在しない対立遺伝子特異的ＳＮＰを標的にする。
【００３５】
ＣＡＤＡＳＩＬは全身性動脈疾患であり、つまり特定の口径のすべての動脈がＣＡＤＡＳＩＬに典型的な壁在性の変化を示す。しかし、理由は不明だが、小さいサイズから中程度のサイズの大脳動脈がこの病理の主力を担う。これらの動脈および特定的にはＶＳＭＣがＡＯＮの標的となる。ＡＯＮは静脈内に注射されてもよいし、脳脊髄液に直接注射されてもよい。本発明において用いられるＡＯＮは、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡのものであり（ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮａｓｅＨ誘導性ノックダウンを防ぐため）、これは安定性の改善のためにホスホロチオエート主鎖を有する。ホスホロチオエート修飾の付加的な利益は、細胞膜を越えるＡＯＮの取込みが改善されることである。加えてこの修飾は血清タンパク質への低親和性結合をもたらし、血清タンパク質は血流におけるＡＯＮの担体の働きをして、腎臓によるＡＯＮの排除を防ぐ。よってＡＯＮの血清半減期が増加することにより、より良好な組織分布が可能になる。
【００３６】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルにおいては、静脈内、皮下および腹腔内注射の後にＡＯＮを全身的に送達できることが示されている。加えて、それらは表皮の平滑筋細胞に吸収される（投稿中の原稿および印刷中の原稿）。よってＡＯＮはＶＳＭＣにも吸収される。
【００３７】
この化学のＡＯＮによる、高用量（最高６００ｍｇ／ｋｇ）での最長６ヵ月間の局部的および全身的処置は、癌、慢性免疫疾患、アテローム性動脈硬化およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する臨床試験中の患者によって、よく許容される。
【００３８】
ＮＯＴＣＨ３特異的配列に対して設計されたＡＯＮは、インフレームのリーディングフレームを維持しながら所与のＥＧＦＬドメインにおいて均一な数の６個のシステイン残基を再確立するような態様で、プレｍＲＮＡスキッピングをもたらすことができる。これは突然変異特異的ＡＯＮおよびエクソン特異的ＡＯＮの両方、ならびにＳＮＰ特異的ＡＯＮを含む。その目的は、好ましくはエクソン３、４および５のホットスポットに対するＮＯＴＣＨ３突然変異を標的とするＡＯＮを設計して、各ＡＯＮが最大数の突然変異を標的にできるようにすることである。ＮＯＴＣＨ３特異的配列に対して設計されるＡＯＮは、プレｍＲＮＡスキッピングがアウトオブフレーム産物をもたらして、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構が誘導されるように作製されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】第１９番染色体の短腕上のＮＯＴＣＨ３遺伝子のエクソン４およびエクソン５のスキッピングによって、ＥＧＦＬ反復３〜５ならびにＥＧＦＬ反復２および６の部分の排除がもたらされる様子を示す図である。ＥＧＦＬ反復２および６は、同数のシステイン残基を有する融合ＥＧＦＬ反復産物を形成する。よって修飾されたＮＯＴＣＨ３タンパク質は３０個のＥＧＦＬ反復を有し、各ＥＧＦＬ反復は同数のシステイン残基を有する。
【図２】ＡＯＮ ｈ５ＣＡＤ１で処理した細胞培養液のＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡ断片のＲＴ−ＰＣＲおよび配列分析を、エクソン５を含む領域に焦点を当てて示す図である。形質移入なしの細胞培養液（レーン２）およびＡＯＮなしで形質移入された細胞培養液（レーン３）と比べて、より短い新規の転写物が観察された（２９０ｂｐ、レーン４）。レーン１はサイズマーカー（ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ：ＳＭ）を含む。２９０ｂｐ断片の配列分析によって、エクソン５の正確なスキッピングが確認された。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
表１は、ＣＡＤＡＳＩＬをもたらすＮＯＴＣＨ３遺伝子のエクソン４およびエクソン５における一般的な突然変異を列挙するものである。このリストは一般的な突然変異を選択したものであり、ＮＯＴＣＨ３遺伝子のエクソン４およびエクソン５に見出される突然変異の完全なリストではない。左の列は、右側の列のＤＮＡ突然変異によってもたらされるアミノ酸置換を示す。
【００４１】
実験セクション
ＡＯＮ ｈ５ＣＡＤ１に対する組織培養、形質移入およびＲＴ−ＰＣＲ分析。
Ｎｏｔｃｈ３を発現する細胞系ＨＣＣ２４２９を、ダン（Ｄａｎｇ）ら（１）に記載されるとおりに培養した。形質移入に対しては、ＨＣＣ２４２９細胞を６ウェル培養皿中で６０〜７０％の培養密度まで生育させた。形質移入は、デュプロ（ｄｕｐｌｏ）中で、９００ｐｍｏｌのＡＯＮ ｈ５ＣＡＤ１と、１０μｌのポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ：ＰＥＩ、ＥｘＧｅｎ５００、ＭＢＩフェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））との組み合わせによって、製造者の指示に従って行なわれた。各ＡＯＮに対して、ＡＯＮ−ＰＥＩ複合体の別々の溶液を調製した。対照として蛍光標識したＡＯＮを用いた核蛍光シグナルの存在に基づくと、形質移入効率は概して８０％より高かった。形質移入の２４時間後にＲＮＡを単離し、過去の記載（２）のとおりにＲＴ−ＰＣＲ分析を行なった。標的となったエクソン５に隣接するエクソン４および６におけるプライマー（４Ｆ：ｃａａｃａｃａｃｃｔｇｇｃｔｃｃｔｔｃ；６Ｒ：ｇａｃｔｇｃａｇｃｔｃｔｃａｃｃｔｇｔｃ）によるＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＡＯＮ ｈ５ＣＡＤ１によるスキッピングの成功が確認された。エクソン５が正しくスキップされたかどうかを確認するために、アガロースゲルから予想サイズ（２９０ｂｐ）のＰＣＲ断片を単離し、過去の記載（３）のとおりにシーケンシング分析を行なった。
【００４２】
引用文献
１．ダン（Ｄａｎｇ）Ｔ Ｐら（２０００）。「第１９番染色体の転位、Ｎｏｔｃｈ３の過剰発現、およびヒト肺癌（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １９ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ，ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ３，ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）。」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ９２（１６）：１３５５−１３５７。
２．アールツマ−ルス（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ）Ａ、ブレマー−ボウト（Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔ）Ｍ、ヤンソン（Ｊａｎｓｏｎ）Ａ、デン・ダンネン（Ｄｅｎ Ｄｕｎｎｅｎ）Ｊ、ファン・オメン（ｖａｎ Ｏｍｍｅｎ）Ｇ、およびファン・デートコム（ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ）Ｊ。（２００２）。「デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する潜在的遺伝子修正療法としての標的エクソンスキッピング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）。」Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ １２：Ｓ７１−Ｓ７７。
３．ファン・デートコムＪＣら（２００１）。「アンチセンス誘導性エクソンスキッピングは、ＤＭＤ患者由来筋細胞におけるジストロフィン発現を修復する（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＤＭＤ ｐａｔｉｅｎｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ）。」Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １０：１５４７−１５５４。
【００４３】
表１。ＮＯＴＣＨ３のエクソン４およびエクソン５における突然変異
エクソン４
・Ａｒｇ１３３Ｃｙｓ；４７５ ＣＧＣ＞ＴＧＣ
・Ｃｙｓ１３４Ｔｒｐ；４８０ ＴＧＣ＞ＴＧＧ
・Ａｒｇ１４１Ｃｙｓ；４９９ ＣＧＣ＞ＴＧＣ
・Ｃｙｓ１４４Ｐｈｅ；５０９ ＴＧＣ＞ＴＴＣ
・Ａｒｇ１５３Ｃｙｓ；５３５ ＣＧＣ＞ＴＧＣ
・Ｃｙｓ１６２Ｔｒｐ；５６４ ＴＧＣ＞ＴＧＧ
・Ａｒｇ１８２Ｃｙｓ；６２２ ＣＧＣ＞ＴＧＣ
・Ｔｙｒ１８９Ｃｙｓ；６４４ ＴＡＣ＞ＴＧＣ
・Ａｒｇ２０７Ｃｙｓ；６９７ ＣＧＴ＞ＴＧＴ
・Ｃｙｓ２２４Ｔｙｒ；７４９ ＴＧＴ＞ＴＡＴ
エクソン５
・Ｃｙｓ２３３Ｔｒｐ；７７７ ＴＧＴ＞ＴＧＧ
・Ｔｙｒ２５８Ｃｙｓ；８５１ ＴＡＴ＞ＴＧＴ
【００４４】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不均一な数のシステイン残基を有するＥＧＦＬ反復を有する変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡから、均一な数のシステイン残基を有するＥＧＦＬ反復を有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを生成するための方法であって、前記プレｍＲＮＡを発現する細胞に、前記プレｍＲＮＡと相補的であって前記プレｍＲＮＡとハイブリダイズすることによって、前記プレｍＲＮＡから生成されるｍＲＮＡからのエクソン４およびエクソン５の排除を誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供するステップを含む、方法。
【請求項２】
不均一な数のシステインを有する前記ＥＧＦＬ反復は、エクソン４および／またはエクソン５にコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プレｍＲＮＡは、突然変異Ａｒｇ１３３Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１３４Ｔｒｐ、Ａｒｇ１４１Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１４４Ｐｈｅ、Ａｒｇ１５３Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１６２Ｔｒｐ、Ａｒｇ１８２Ｃｙｓ、Ｔｙｒ１８９Ｃｙｓ、Ａｒｇ２０７Ｃｙｓ、Ｃｙｓ２２４Ｔｙｒ、Ａｒｇ２０７Ｃｙｓ、Ｃｙｓ２２４Ｔｙｒ、またはその組み合わせを有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと前記標的プレｍＲＮＡとによって形成される二本鎖をＲＮＡｓｅＨに対して抵抗性にするような修飾を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡを発現する細胞によって生成される前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるための方法であって、前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質は不均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を含み、前記方法は、前記ＮＯＴＣＨ３遺伝子のエクソン４および／またはエクソン５における前記ＥＧＦＬ反復の前記不均一な数のシステインの原因である突然変異をコードするヌクレオチド配列と相補的であって前記ヌクレオチド配列にハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む、方法。
【請求項６】
変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする第１のプレｍＲＮＡと、正常なＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする第２のプレｍＲＮＡとを発現する細胞によって生成される前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるための方法であって、前記第１および前記第２のプレｍＲＮＡは、前記変異体の対立遺伝子におけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異の存在、および／または前記突然変異の部位とは異なる多形性部位における異なる配列の存在が互いに異なっており、前記方法は、前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする前記プレｍＲＮＡ上に存在する前記突然変異および／または前記多形性部位の配列と相補的であって前記配列にハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む、方法。
【請求項７】
前記細胞は血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドは、前記ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対して特異的な１５〜４０個のヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）の処置のための、ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１０】
ＣＡＤＡＳＩＬの処置のための薬物の調製のための、ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１１】
ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対して特異的な１５〜４０個のヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
非修飾オリゴヌクレオチドと比べたときに、ＲＮＡｓｅＨの作用に対する抵抗性の増加をもたらす化学修飾を含む、請求項１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
３４個未満のＥＧＦＬ反復を有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする、ＮＯＴＣＨ３コード核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、ＮＯＴＣＨ３タンパク質。
【請求項１５】
ＥＧＦＬ反復に不均一な数のシステインを含むＮＯＴＣＨ３タンパク質をもたらすＮＯＴＣＨ３遺伝子の突然変異に対して特異的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１】
不均一な数のシステイン残基を有するＥＧＦＬ反復を有する変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡから、均一な数のシステイン残基を有するＥＧＦＬ反復を有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを生成するための方法であって、前記プレｍＲＮＡを発現する細胞に、前記プレｍＲＮＡと相補的であって前記プレｍＲＮＡとハイブリダイズすることによって、前記プレｍＲＮＡから生成されるｍＲＮＡからのエクソン４およびエクソン５の排除を誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供するステップを含む、方法。
【請求項２】
不均一な数のシステインを有する前記ＥＧＦＬ反復は、エクソン４および／またはエクソン５にコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プレｍＲＮＡは、突然変異Ａｒｇ１３３Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１３４Ｔｒｐ、Ａｒｇ１４１Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１４４Ｐｈｅ、Ａｒｇ１５３Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１６２Ｔｒｐ、Ａｒｇ１８２Ｃｙｓ、Ｔｙｒ１８９Ｃｙｓ、Ａｒｇ２０７Ｃｙｓ、Ｃｙｓ２２４Ｔｙｒ、Ａｒｇ２０７Ｃｙｓ、Ｃｙｓ２２４Ｔｙｒ、またはその組み合わせを有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと前記標的プレｍＲＮＡとによって形成される二本鎖をＲＮＡｓｅＨに対して抵抗性にするような修飾を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードするプレｍＲＮＡを発現する細胞によって生成される前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるための方法であって、前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質は不均一な数のシステインを有するＥＧＦＬ反復を含み、前記方法は、前記ＮＯＴＣＨ３遺伝子のエクソン４および／またはエクソン５における前記ＥＧＦＬ反復の前記不均一な数のシステインの原因である突然変異をコードするヌクレオチド配列と相補的であって前記ヌクレオチド配列にハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む、方法。
【請求項６】
変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする第１のプレｍＲＮＡと、正常なＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする第２のプレｍＲＮＡとを発現する細胞によって生成される前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質の量を低減させるための方法であって、前記第１および前記第２のプレｍＲＮＡは、前記変異体の対立遺伝子におけるＣＡＤＡＳＩＬ原因突然変異の存在、および／または前記突然変異の部位とは異なる多形性部位における異なる配列の存在が互いに異なっており、前記方法は、前記変異体ＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする前記プレｍＲＮＡ上に存在する前記突然変異および／または前記多形性部位の配列と相補的であって前記配列にハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供するステップを含む、方法。
【請求項７】
前記細胞は血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドは、前記ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対して特異的な１５〜４０個のヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）の処置のための、ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１０】
ＣＡＤＡＳＩＬの処置のための薬物の調製のための、ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１１】
ＮＯＴＣＨ３ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対して特異的な１５〜４０個のヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
非修飾オリゴヌクレオチドと比べたときに、ＲＮＡｓｅＨの作用に対する抵抗性の増加をもたらす化学修飾を含む、請求項１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
３４個未満のＥＧＦＬ反復を有するＮＯＴＣＨ３タンパク質をコードする、ＮＯＴＣＨ３コード核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、ＮＯＴＣＨ３タンパク質。
【請求項１５】
ＥＧＦＬ反復に不均一な数のシステインを含むＮＯＴＣＨ３タンパク質をもたらすＮＯＴＣＨ３遺伝子の突然変異に対して特異的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５１５５４７（Ｐ２０１２−５１５５４７Ａ）
【公表日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４７８４０（Ｐ２０１１−５４７８４０）
【出願日】平成２２年１月２６日（２０１０．１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／０５００３６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８５１５１
【国際公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（５１１１８１５３３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２６日（２０１０．１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／０５００３６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８５１５１
【国際公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（５１１１８１５３３）
【Ｆターム（参考）】
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