ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰの免疫アッセイに用いるための抗体と標準物質
本発明は、特定の形態のｐｒｏＢＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する抗体を提供する。このような抗体は、ヒト血液中の上記タンパク質の詳細な免疫検出に適している。上記の特定の形態のｐｒｏＢＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、抗体産生用の抗原のみならず、種々の免疫アッセイにおける検量物質または免疫標準物質としても使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに発見された形態のｐｒｏＢＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する抗体を提供する。これらタンパク質に存在する特定のエピトープも開示する。上記特定のエピトープに特異的な抗体は、正確な免疫検出法、即ち、ヒト血液中の２種のタンパク質の存在および／またはその量の検出に適している。新規形態の該タンパク質は、抗体産生用の抗原としてのみならず、種々の免疫アッセイにおける検量物質や免疫標準物質としての有用性が示唆されている。
【背景技術】
【０００２】
プロ型の脳性ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏＢＮＰ）のみならず、ＢＮＰとｐｒｏＢＮＰのＮ末端断片（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）は、心不全（ＨＦ）および左室機能障害のマーカーとして知られている。これらは、種々の心臓病を患う患者のリスクの層別化や、ＨＦ患者の治療のモニタリングにも使用されている。ＢＮＰは、ナトリウム利尿作用、血管拡張作用およびレニン阻害作用を有するペプチドホルモンである（文献１〜３に概説有り）。ＢＮＰは構造的に類似したペプチドホルモンのファミリーに属す。このファミリーには、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）およびウロジラチンも含まれる。ＢＮＰとＡＮＰは広いスペクトルにわたる生物学的特性を共有し、共に心筋由来であるが、一方、ＣＮＰは内皮由来である。これらペプチドは、２つのシステイン残基の間にジスルフィド結合を有する、１７個のアミノ酸からなる環状構造によって特徴付けられる。環状構造は、異なるナトリウム利尿ペプチドの間で高い同一性レベルを示す（各グループの代表間で、１７個のアミノ酸残基（ａａｒ）の内、１１個が同一である）。ＢＮＰ分子は３２アミノ酸残基からなり、Ｃｙｓ10とＣｙｓ26の間にジスルフィド結合が存在する。
【０００３】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとＢＮＰは、前駆体分子であるプレｐｒｏＢＮＰのタンパク分解性プロセシング産物である。プレｐｒｏＢＮＰは１３４アミノ酸残基からなり、心筋細胞によって合成される。シグナルペプチド（アミノ酸残基１〜２６）の除去は、ｐｒｏＢＮＰ分子（アミノ酸残基２７〜１３４）の出現をもたらす。続いて、ｐｒｏＢＮＰ（１０８アミノ酸残基）が未知のプロテアーゼによって開裂され、２つのペプチド、即ち、ＢＮＰ（アミノ酸残基７７〜１０８）とＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（アミノ酸残基１〜７６）、が形成される。ＢＮＰ（生物学的に活性な分子）とＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（生理活性は明らかではない）の両方が、プロセシングを受けていないｐｒｏＢＮＰと共に血流に分泌され、ヒト血液を循環する。
【０００４】
ｐｒｏＢＮＰ合成は、心臓の自動的な刺激または神経ホルモンによる刺激に応答して増加し、その結果、血液中のＢＮＰ濃度およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度が上昇することは事実として確立されている。上昇したＢＮＰレベルとＮＴ−ｐｒｏＢＮＰレベルは、種々の心血管病（心不全、左室機能障害、不安定狭心症および心筋梗塞）の患者について報告されている。ＨＦ患者における両検体の血中濃度は、疾患の重症度と相関する。心不全の非常に初期の段階（ニューヨーク心臓協会による、ＮＹＨＡの第Ｉステージ）にある無症候性の患者において、既にペプチド濃度が上昇しているという報告がある。重度のＨＦ（ＮＹＨＡクラスIIIまたはＩＶ）および心筋の機能不全の兆候を示す患者においては、ＢＮＰの値は著しく増加している。従って、ヒト血液のＢＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの測定は、ＨＦが疑われる患者の評価および疾患の重症度の特定のために広く使用されている。
【０００５】
ヒト血漿中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを測定するための種々の免疫アッセイ方法が文献に記載されている。免疫アッセイは、ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の種々の部位、即ち、エピトープ１〜１３（文献４）、６５〜７６（文献５）、１〜１２と６５〜７６（文献６）、８〜２９（Biomedica assay）、１〜２１と３９〜５０（Roche Elecsys）、に特異的なモノクローナル抗体のみならず、ポリクローナル抗体を使用する。近年、ｐｒｏＢＮＰの開裂部位に特異的な抗体とＢＮＰ特異的抗体を使用する新しいｐｒｏＢＮＰ免疫アッセイが報告された（文献７）。
【０００６】
アッセイに使用する抗体について未だコンセンサスは得られていない。しかし、いくつかの出版済みのデータは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央領域に特異的な抗体は、ヒト血液中の検体を認識することができないことを示している。Hughes（文献５）は、アミノ酸残基６５〜７６に特異的な抗体とは異なり、アミノ酸残基３７〜４９に特異的なウサギポリクローナル抗体は患者血液中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを認識しないことを示した。ヒト血液中を循環しているＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの生化学的性質に関して入手可能な情報の量が少ないため、ここでシグナルが観察されなかった理由は明確ではない。
【０００７】
未変性条件下で行うゲル濾過（ＧＦ）による研究によって、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとｐｒｏＢＮＰの免疫反応性は、見かけの分子量が予想値よりも３倍〜４倍高いタンパク質の画分に存在することが判明した。Seidler et al.（文献８）は、種々の条件下におけるクロマトグラフィーによって観察される分子量の差は、ヒト血液中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子およびｐｒｏＢＮＰ分子のオリゴマー化によるものと仮定した。しかし、この仮定は、合成したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰはin vitroでオリゴマーを形成しないことを明らかにしたCrimmins（文献９）によって否定された。その結果、今のところ、ヒト血液中を循環しているＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの形態は未だ特定されておらず、観察される異常に対する説明も存在しない。
【０００８】
ヒト血液中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの生化学的性質に関する情報は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ測定に関する近年のアプローチに重大な影響を与える可能性がある。現存する方法、即ち、分子の中央部分に特異的な抗体を使用する方法によって、サンプル中に存在する全てのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（ｐｒｏＢＮＰ）を検出することができるのかは不明である。従って、ヒト血液中を循環しているＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰを正確に特徴付ける必要がある。
【０００９】
発明の概要
ヒト血液中を循環しているＰｒｏＢＮＰとＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、それぞれ１０８アミノ酸残基と７６アミノ酸残基（分子量は約１２ｋＤａと８．６ｋＤａ）からなるポリペプチドであると文献に記載されている。患者血液のｐｒｏＢＮＰ濃度は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度よりも著しく低い。我々の最近の研究によると、血中ｐｒｏＢＮＰ濃度は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度の約１０〜２０％である。Seidler et al.（文献８）はゲル濾過による研究（未変性条件下）によって、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとｐｒｏＢＮＰは変則的な移動度を示し、これらの見かけの分子量は３０〜４０ｋＤａであると報告している。上記文献の著者らは、ヒト血液においてどちらのタンパク質もホモオリゴマーの形で存在することを示唆している。我々の研究においては、血液中に存在する両方のタンパク質の見かけの分子量（ゲル濾過による研究、スーパーデックス７５ １０／３００ ＧＬカラム）は約３０ｋＤａであることを明らかにした（図４）。
【００１０】
我々は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのエピトープに特異的な（ｐｒｏＢＮＰとも交差反応する）タンパク質の全長配列をカバーする、高親和性モノクローナル抗体（ＭＡｂ）のパネル（図１）を作製した。全てのＭＡｂを、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の種々の断片に対応する合成ペプチドでマウスを免疫した後に作製した。全てのＭＡｂについて、２つの部位を組み合わせた試験（サンドイッチ免疫蛍光アッセイ）を組み換えタンパク質のみならず、患者血液から単離した内因性タンパク質を用いて行った。これらの研究によって、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの中央部分（領域２８〜６０に位置するエピトープ）に特異的な抗体は、ヒト血液中の抗原を正しく認識しないことが明らかとなった（図２）。一方、ペプチド５〜２７および６１〜７６に位置するエピトープに対する抗体の大部分が、ヒト血液中の抗原を組み換えタンパク質と同等の効率で認識した。
【００１１】
アフィニティークロマトグラフィー（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの種々の領域に特異的なモノクローナル抗体を固定したアフィニティーカラム）の使用によって、ヒト血液から内因性の抗原を精製し、ウエスタンブロッティングで解析した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子とｐｒｏＢＮＰ分子を、いくつかのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ特異的モノクローナル抗体で染色した（図５）。試験したモノクローナル抗体の中には、内因性タンパク質を含むトラックから組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと同じ分子量のタンパク質バンドを検出するものはなかった。主要な免疫活性は、より高い分子量（１５〜７０ｋＤａ）のタンパク質に対応する範囲内の拡散ゾーンに集中していた。
【００１２】
ウエスタンブロッティング研究において観察されたこのようなＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとｐｒｏＢＮＰの広範囲わたる多様な形態（図５）は、ヒト血液中を循環しているＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子とｐｒｏＢＮＰ分子のグリコシル化によって説明することができる。
【００１３】
従って、本発明の１つの態様は、内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を特異的に認識するが、脱グリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは脱グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を認識しない抗体またはその断片に関する。更に本発明は、内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を認識し、該認識における親和性は対応する脱グリコシル化タンパク質もしくはその断片に対する親和性よりも高いことを特徴とする、抗体またはその断片を提供する。これに関連する本発明の別の態様においては、上記抗体と同じ特異性を示すアプタマーを提供する。更に上記抗体には、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片のみならず、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体断片も含まれる。また、上記抗体は、組み換え抗体または組み換え抗体断片でもよい。
【００１４】
本発明の別の態様においては、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片の定性的または定量的な検出のために、上記抗体または抗体断片を用いる診断的免疫アッセイ方法を提供する。これに関連して、患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片をアッセイするための診断方法であって、本明細書に記載した抗体あるいはアプタマーを用いて、サンプルのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含量またはｐｒｏＢＮＰ含量を定量的または半定量的に決定することを包含する方法も提供する。該診断方法は、脊椎動物の血液から単離した、内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ標品またはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ標品を標準物質として検量曲線を作製することを更に包含してもよい。また該診断方法は、標準曲線を作製し、決定したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含量値またはｐｒｏＢＮＰ含量値を標準曲線と比較することを更に包含してもよい。本発明の診断方法の例としては、免疫アッセイ方法が挙げられる。診断免疫アッセイの１例として、第１の捕捉抗体と第２の検出抗体を使用するサンドイッチ免疫アッセイ方法を挙げることができる。
【００１５】
本発明の別の態様は、患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰをアッセイするための診断方法であって、（ａ）サンプルに含まれる内因性のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰを脱グリコシル化し、そして（ｂ）ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰに特異的な抗体またはアプタマーを用いて、サンプルのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含量またはｐｒｏＢＮＰ含量を決定することを包含する方法に関する。
【００１６】
更に別の態様は、グリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を含む、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰの標準物質または検量物質に関する。この中のいくつかの態様においては、グリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片は、内因性のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰであり、別の態様においては、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰは、脊椎動物の血液から単離されたものである。これに関連した本発明の別の態様においては、グリコシル化した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは組み換えｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を単離したものを提供する。この中の更に具体的な態様においては、グリコシル化した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは組み換えｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片は、in vitroでグリコシル化したものである。いくつかの更に他の具体的な態様においては、グリコシル化した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは組み換えｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片は、培養細胞系または細胞を含まない翻訳系によって製造したものである。
【００１７】
本発明の更に別の態様は、上記分子を抗原として用いた、上記抗体と同じ特異性を有する抗体を製造するための方法に関する。
【００１８】
更に別の態様においては、本発明は、患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片の診断アッセイを行うための免疫アッセイ用キットであって、以下の（ａ）〜（ｃ）を包含するキットを提供する。（ａ）上記抗体と同じ特異性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、（ｂ）検出可能な標識、および（ｃ）本明細書に記載する標準物質または検量物質。代表的なキットは、患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片の診断アッセイを行うための免疫アッセイ用キットであって、以下の（ａ）〜（ｃ）を包含するキットである。（ａ）上記抗体と同じ特異性を有する、第１のモノクローナル捕捉抗体、（ｂ）請求項１または２の抗体と同じ特異性を有し、蛍光標識されている第２のモノクローナル検出抗体、および（ｃ）請求項１４の標準物質または検量物質。
【００１９】
本明細書において、タンパク質、抗体やその他の物質の断片とは、該物質の構造的および／または機能的な断片であって、所望の活性を保持するものである。
【００２０】
本発明のその他の特徴および利点については、添付の図面や実施例を含む以下の詳細な説明によってより明確に理解されるであろう。
【００２１】
発明の詳細の説明
我々は単離したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰを脱グリコシル化酵素で処理し、得られたタンパク質標品をサンドイッチ免疫アッセイ、ゲル濾過ＨＰＬＣおよびウエスタンブロッティングで解析した。後述する実施例で詳細に説明するこれらの実験では、次の結果が得られた。
【００２２】
サンドイッチ免疫アッセイ： 脱グリコシル化後には、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央領域に特異的なモノクローナル抗体（天然の内因性抗原を認識しない抗体）は、組み換え（非グリコシル化）型と同等の効率で内因性タンパク質を認識することができた（図６）。
【００２３】
ＨＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィー： 脱グリコシル化後には、免疫活性を示すピークの組み換えタンパク質側（即ち、より低い分子量のタンパク質側）へのシフトが観察された（図７）。
【００２４】
ウエスタンブロッティング：
１）脱グリコシル化後には、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと同レベルのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ免疫活性を示すタンパク質バンドが出現した。
２）ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央部分に特異的な抗体（天然の内因性抗原を認識しない抗体）がこのバンド（脱グリコシル化後の内因性タンパク質）を認識することができた（図８）。
【００２５】
まとめ
本明細書においては、ヒト血液中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰは、過去に考えられていたような単純なポリペプチド鎖としては存在しておらず、糖タンパク質として存在することを明確に開示した。これは、ヒト血液中の一方または両方の分子を検出するように設計したアッセイに使用するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、グリコシル化の影響を受けない分子内の部分を認識するか、あるいは分子のグリコシル化された部分を認識しなければならないことを意味する。
【００２６】
このようなアッセイに用いる標準物質および検量物質の調製には、両方のタンパク質のグリコシル化型を用いるべきである。
【００２７】
分子のグリコシル化された部分に特異的な抗体を得るためには、グリコシル化型の抗原を動物の免疫に使用すべきである。
【実施例】
【００２８】
実施例１： ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子に特異的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の調製と特徴づけ
ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の配列１〜２４、１３〜２７、２８〜４５、４６〜６０および６１〜７６に対応する合成ペプチド（フィンランド国、HyTest製）を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合し、マウスの免疫に使用した。小さなペプチドを担体タンパク質分子と結合することで、動物の免疫応答を増強することができる。
【００２９】
６〜１２週令のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを免疫に使用した。
【００３０】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子に特異的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するハイブリドーマ細胞系は、マウス脾臓細胞とミエローマＳＰ２／０細胞とのハイブリダイゼーションの後に得た。
【００３１】
培養上清の全長組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子（大腸菌で発現したもの）に対する反応性を試験し、８４株の陽性培養細胞を更なる研究のために選択した。この内、１４株は領域１〜２４、２４株は領域１３〜２７、１９株は領域２８〜４５、１３株は領域４６〜６０、そして１５株は領域６１〜７６にそれぞれ特異的な抗体を産生した。選択した培養細胞は、限界希釈法によってサブクローニングを２回行い、増殖後に凍結した。
【００３２】
モノクローナル抗体を含有する腹水をＢａｌｂ／Ｃマウスで作製した。
【００３３】
タンパク質Ａ−セファロース（GE Healthcare製）によるアフィニティークロマトグラフィーで抗体を腹水から単離した。
【００３４】
精製した抗体のアイソタイプをモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Pierce製）で決定した。全てのＭＡｂがＩｇＧと特定された。
【００３５】
実施例２： エピトープ解析
新たに産生した全ての抗体について、合成ペプチド１〜１２、５〜２０、１〜２４、１３〜２７、２８〜４５、３１〜３９、３４〜４２、３７〜４５、４８〜５６、５０〜５８、５２〜６０、４６〜６０、６３〜７１、６５〜７３、６７〜７６と６１〜７６からなる、重複する配列を含むライブラリーを用いて、詳細なエピトープマッピングを行った。合成ペプチドは、担体タンパク質（オブアルブミン）と結合させた。１μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のペプチド結合体でプレートを被覆した。洗浄後、ＰＢＳＴで復元したモノクローナル抗体をウェルに加えた。室温で３０分のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＦｃ特異的ポリクローナル抗体を各ウェルに添加した。３０分のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン基質系によって発色させた。ビクター１４２０マルチラベルカウンター（Victor 1420 Multilabel Counter）を用い、４９２ｎｍで吸光度を測定した。領域１〜２４に特異的なＭＡｂは、エピトープが領域１〜１２、５〜１２、５〜２０および１３〜２４にそれぞれ位置する４つの抗体群に分けられた。領域１３〜２７に特異的な抗体は、エピトープが領域１３〜２０と１３〜２４にそれぞれ位置する２つの抗体群に分けられ、領域２８〜４５に特異的な抗体は、エピトープが領域３１〜３９と３４〜３９にそれぞれ位置する２つの抗体群に分けられた。ペプチド４６〜６０に特異的な抗体は、エピトープが領域４６〜５６、４８〜５６、４６〜６０および５２〜５８にそれぞれ位置する４つの抗体群に分けられ、ペプチド６１〜７６に特異的な抗体は、エピトープが領域６３〜７１、６７〜７３および６７〜７６にそれぞれ位置する３つの抗体群に分けられた。
【００３６】
実施例３： ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの定量的測定のための、サンドイッチ免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）の開発
本発明において、ヒト血液中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを定量するためのサンドイッチ型の免疫蛍光アッセイを確立した。このアッセイ法は、プレート表面に吸着させたモノクローナル抗体に対する抗原の結合による一次免疫複合体の形成と、安定なユーロピウム（III）キレートで標識された別のモノクローナル抗体による一次免疫複合体の検出に基づくものである。
【００３７】
実施例４： 抗体と安定なユーロピウムキレートとの結合
セファデックスＧ２５カラム（ＮＡＰ−５）によるゲル濾過を用いて、抗体を予備的にＮａＣｌの０．９％水溶液に移した。２，２’，２”，２’”；−［［４−［（４−イソチオシアナトフェニル）エチニル］ピリジン−２，６−ジイル］ビス（メチレンニトリロ）］テトラキス（酢酸）の安定なユーロピウム（III）キレートによる抗体の標識は、２００倍モル量過剰なユーロピウム（III）キレートを含有する５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ−カーボネート緩衝液（ｐＨ９．８）中、＋４°Ｃで一晩インキュベートすることで行った。０．０１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌおよび０．１％のＮａＮ3を含有する緩衝液を用いた、セファデックスＧ２５カラム（ＮＡＰ−５）によるゲル濾過で標識抗体を未反応キレートと分離した。
【００３８】
実施例５： 患者と血液サンプル
ＨＦを患う患者の診断は、呼吸困難、起座呼吸、肺の水泡音および下肢浮腫という症状に基づいて行い、心エコーとＸ線検査によって確認した。予備診断は心臓病専門医によって行われ、ＨＦの専門医によって更に確認された。血液サンプルは、左室駆出分画率が３０％未満で、左室収縮終末期容積が９０ｍｌ超の患者から収集した。静脈血はＥＤＴＡを含有するVacuetteチューブ（Greiner Bio-One製）に回収し、３０００ｇ（１５分、＋４℃）で遠心分離した。血清サンプルは、プラスチックチューブに回収した血液を室温で３０分インキュベートし、５０００ｇ（３０分、＋２０℃）で遠心分離して得た。血漿と血清のサンプルは使用するまで−７０℃で保存した。ＭＡｂの試験においては、プールした血清（重度ＨＦ患者３９人）またはプールした血漿（ＨＦ患者１０人）を内因性抗原の供給源として使用した。陰性の対照（ＨＦではないサンプル）としては、１０人の健常ドナーからプールした血清または血漿を使用した。
【００３９】
実施例６： サンドイッチＩＦＡ
作製した全てのＭＡｂについて、２つの部位に対するＭＡｂ（捕捉用および検出用）を組み合わせた試験を、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、および内因性抗原の供給源となるＨＦ患者からプールした血清または血漿を用いて実施した。濃度が１０μｇ／ｍｌの捕捉抗体をＥＩＡプレート（ウェル当たり１００μｌ）に添加し、リン酸生理食塩緩衝液中、室温で３０分間、ゆっくりと振とうさせながらインキュベートした。０．０１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０および０．０５％のＮａＮ3を含む緩衝液（バッファーＡ）を用いてタイタープレートを２回洗浄した後、抗原（プールした正常ヒト血漿で復元した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、またはＨＦ血漿または血清由来の内因性抗原、５０μｌ）と検出抗体（４μｇ／ｍｌ、５０μｌ）の混合物を０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、０．９％のＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、０．５％のＢＳＡおよび０．０５％のＮａＮ3を含有する緩衝液（バッファーＢ）に溶解したものをウェルに添加した。プレートを室温で３０分間、ゆっくりと振とうさせながらインキュベートし、バッファーＡを用いて６回洗浄した。増強溶液（１．７５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＳＣＮ、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｌ／Ｌ グリセリン、２００ｍｌ／Ｌ １−プロパノール、０．００５ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ2ＣＯ3、０．０５ｍｏｌ／Ｌ グリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ１０．０）の添加後、混合物を同じ条件下で３分間インキュベートした。ビクター１４２０マルチラベルカウンターで蛍光を測定した。
【００４０】
実施例７： 種々の免疫アッセイ法による血液サンプルの試験
２つの部位を組み合わせた試験（サンドイッチ免疫アッセイ）に使用した、個別のエピトープに対するＭＡｂの全てが、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよび組み換えｐｒｏＢＮＰを低い検出限界（１０〜１００ｎｇ／Ｌ）で検出することができた。同時に、わずかなＭＡｂの組み合わせのみがＨＦ患者の血清と血漿から抗原を認識することができた。領域１３〜２７に特異的なＭＡｂと領域６１〜７６に特異的な別のＭＡｂとの組み合わせのみが、内因性抗原を高感度で検出した。
【００４１】
領域４６〜６０に特異的な１３種のＭＡｂは、いかなる別の抗体と共に２つの部位を組み合わせた試験に使用しても、内因性抗原を認識することはできなかった。最もＮ末端側の領域に特異的なＭＡｂまたは領域２８〜４５に特異的なＭＡｂを配列６１〜７６を認識する抗体とペアにして試験すると、内因性ペプチドと組み換えペプチドのシグナル比は、エピトープ１３〜２７に特異的なＭＡｂを用いるアッセイよりも著しく低かった。ペプチド５〜１２に特異的なＭＡｂ ２９Ｄ１２のみが、ペプチド６７〜７６に特異的なＭＡｂとペアにして試験した際に、血清サンプルまたは血漿サンプルとの相互作用によって高いシグナルをもたらした。
【００４２】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の種々の領域に特異的な抗体を用いたサンドイッチ免疫アッセイによる、組み換え型および内因性（心不全対象者からプールした血漿）のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの試験結果を図２に示した。
【００４３】
組み換え抗原と天然抗原を同じ効率で認識できることから、更なる研究には、アッセイ１５Ｃ４63-71−１３Ｇ１２13-20を選択し、使用した。
【００４４】
この結果、我々は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央部分（領域２８〜６０）に特異的なＭＡｂは、ヒト血液中の抗原をほとんど認識することができないことを示した。
【００４５】
実施例８： １５Ｃ４−１３Ｇ１２免疫アッセイの特徴づけ
ＭＡｂ １５Ｃ４−１３Ｇ１２を使用するサンドイッチ免疫蛍光アッセイを実施例６と同様に実施した。
【００４６】
このアッセイに使用した抗体の特異性は、ウエスタンブロッティング解析で確認した（データは示さない）。両方の抗体が大腸菌に発現させた組み換えｐｒｏＢＮＰと組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを検出した。
【００４７】
大腸菌で発現したヒト組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを正常ヒト血漿で復元し、サンドイッチＩＦＡの検量物質として使用した。検出限界は、検体を含まない検量物質の平均シグナル値に標準偏差の２倍を足した値のシグナルを産生する濃度（１つの実験で２０回測定）と定義した。組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの典型的な検量曲線と、ヒト血漿サンプルの段階希釈系列を図３に示した。検出限界は１０ｎｇ／Ｌであり、免疫アッセイは１５〜１００，０００ｎｇ／Ｌの範囲で直線的だった。
【００４８】
実施例９： 組み換えおよび内因性のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのゲル濾過による研究
Seidler et al.（文献８）は、（非変性条件下の）ゲル濾過による研究において、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰは変則的な移動度を示し、それらの見かけの分子量は約３０〜４０ｋＤａであると報告した。著者らは、ヒト血液においていずれのタンパク質もホモ型−オリゴマー型であることを示唆している。我々の研究では、ＨＦ患者の血漿を内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの原料として用い、ゲル濾過による研究を実施した。
【００４９】
個別の患者血漿サンプルを１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清（１５０μｌ）を、０．１ｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌおよび０．００５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む緩衝液で平衡化したスーパーデックス７５ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラムにアプライした。タンパク質を流速０．８ｍｌ／分で溶出し、容積０．７ｍｌの画分を回収した。続いて、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ免疫活性を１５Ｃ４63-71−１３Ｇ１２13-20サンドイッチ免疫アッセイで測定した。
【００５０】
以下の一群の標準タンパク質（GE Healthcare製）を用いて、カラムを校正した： アルブミン（Ｍｒ ６７０００Ｄａ）、オブアルブミン（Ｍｒ ４３０００Ｄａ）、キモトリプシノーゲン（Ｍｒ ２５０００Ｄａ）、リボヌクレアーゼＡ（Ｍｒ １３７００Ｄａ）およびアプロチニン（Ｍｒ ６５１７．５Ｄａ、Sigma製）。スーパーデックス７５カラムにロードする前に、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを健康なドナーからプールした血漿で復元した。
【００５１】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰアッセイによる画分解析によって、ヒト血漿サンプルから１つの免疫反応性のピーク（約３０ｋＤａ）が見出された（図４）。最大ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ活性の位置は、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（約１６ｋＤａ）および組み換えｐｒｏＢＮＰ（約２１ｋＤａ）について確立されたものと一致しなかった。従って我々は、ＧＦにおいて内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、組み換えタンパク質よりも顕著に高い見かけの分子量を示すことを観察した。内因性タンパク質と組み換えタンパク質の間で観察された見かけの分子量の差は、内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの（分子の中央部分における）翻訳後修飾によって説明することができる。このような修飾の存在は、分子の中央領域に特異的な抗体が内因性抗原を認識することができないという事実も説明することができる。
【００５２】
実施例１０： 内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのウエスタンブロッティングによる研究
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰをプールしたＨＦ患者の血漿からアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。アフィニティーマトリクスを得るために、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の種々の領域に特異的な抗体（１５Ｃ４、２４Ｅ１１、１８Ｈ５、１５Ｆ１１）の混合物を、標準的なプロトコルに従ってＢｒＣＮ活性化セファロースＣＬ−４Ｂ（GE Healthcare製）に固定した。上述した実験（実施例８を参照）によって、上記ＭＡｂは内因性抗原を高い効率で認識しうることが示されている。抗体が固定されたアフィニティーマトリクスを０．１ｍｏｌ／Ｌのグリシン（ｐＨ２．０）で洗浄し、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．０２ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化した。ＨＦ患者のプールした血漿を、＋４℃、流速１ｍｌ／分の条件で抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−セファロースにロードした。ペプチドは０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌの水溶液で溶出した。溶出物を２ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌで中和した。アフィニティークロマトグラフィー後の回収率は８８％だった。
【００５３】
次に溶出物を、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと相互作用しないＭＡｂを固定化したセファロースＣＬ−４Ｂ（陰性クロマトグラフィー）にロードし、アフィニティーマトリクスに非特異的に結合するタンパク質を除去した。
【００５４】
続いて、２回目のアフィニティークロマトグラフィーによってＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを濃縮した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを含有する溶液を、＋４℃、流速１ｍｌ／分の条件で抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−セファロース（抗体量は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度に対して１０倍モル量過剰）にロードした。ペプチドを０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌで溶出し、凍結乾燥し、水で復元し、使用するまで−７０℃で保存した。
【００５５】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ標品へのｐｒｏＢＮＰの混入をｐｒｏＢＮＰ特異的免疫アッセイで検出したところ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの全量に対して９％未満だった。
【００５６】
内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのサンプルのみならず、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと組み換えｐｒｏＢＮＰも０．２５ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０ｍｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノール、２０ｇ／Ｌ ドデシル硫酸ナトリウムと１００ｍｌ／Ｌ グリセリン中で５分間煮沸し、Schagger and von Jagow（文献１０）に記載のトリシン電気泳動によるタンパク質分離のためのゲルにロードした。電気泳動は一定電圧（１５０Ｖ）、＋４℃の条件下で４時間行い、ゲルは１６．５％ Ｔ，３％ Ｃ分離ゲルを使用した。プールしたＨＦ患者の血漿から抽出した２００ｎｇのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（濃度は１５Ｃ４63-71−１３Ｇ１２13-20免疫アッセイで決定した）、または５０ｎｇの組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（ｐｒｏＢＮＰ）を各トラックにロードした。
【００５７】
電気泳動の後、ペプチドをニトロセルロースメンブラン（Trans-BlotR転写メンブラン、０．２μｍ、BioRad製）に転写した。転写は、一定電圧（１００Ｖ）で４０分間行った。非特異的な結合は、メンブランを無脂肪乾燥ミルクの１０％ＰＢＳＴ溶液中でインキュベートすることでブロックした。西洋ワサビパーオキシダーゼに結合したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ特異的ＭＡｂによるペプチドの免疫化学染色は、無脂肪乾燥ミルクの１０％ＰＢＳＴ溶液中、＋４℃で１２時間行った。免疫複合体は、ジアミノベンジジンと塩化ニッケルを含む基質溶液とインキュベートすることで可視化した。
【００５８】
内因性タンパク質を含むトラックにおいては、試験したいかなるモノクローナル抗体も、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと同じ分子量を有するタンパク質バンドを認識することはなかった（図５）。ＭＡｂ １５Ｆ１１（エピトープ１３〜２４）で試験すると、１５ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質に対応する範囲内のいくつかの拡散ゾーンにおいて免疫反応性タンパク質が検出された。ＭＡｂ １５Ｆ１１とは対照的に、内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、アミノ酸残基３１〜３９領域に特異的なＭＡｂ １１Ｄ１では染色されなかった。これらのデータは、１１Ｄ１はヒト血漿中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを稀にしか検出しないという実施例７に記載したＩＦＡの結果と一致する。
【００５９】
ウエスタンブロッティング研究における、ＭＡｂ １５Ｆ１１によって染色される種々の拡散ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰゾーンの存在は、ヒト血液中を循環しているＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子のグリコシル化によって説明することができる。
【００６０】
実施例１１： 脱グリコシル化内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのサンドイッチＩＦＡによる試験
プールしたヒト血漿から抽出したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを、脱グリコシル化酵素であるＯ−グリコシダーゼ（S. pneumoniae）およびシアリダーゼ（A. ureafaciens）（米国、QA-Bio製）で処理した。処理は、０．０７５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を含む緩衝液中、＋３７℃で１時間行った。陰性の対照としては、酵素を含まない０．０７５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）水溶液を検討するペプチドに添加した。
【００６１】
脱グリコシル化後、実施例７と同様に、分子の異なる部分に特異的なＭＡｂを使用した免疫アッセイで内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを試験した。
【００６２】
分子の中央部分に特異的なＭＡｂを用いるアッセイで測定した免疫活性は、脱グリコシル化後に顕著に増加した（図６）。ＭＡｂ ５Ｄ３28-45、１１Ｄ１31-39、５Ｅ２31-39、１６Ｅ６34-39を使用したアッセイにおいて、シグナル値は７．５〜１０倍に増加した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域４６〜５６に特異的なＭＡｂ １５Ｄ７48-56と１６Ｄ１０48-56については、免疫活性は約５０倍に増加した。図６に示した結果は、内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（処理済または未処理）／組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのシグナル比（％）で表されており、ＭＡｂ １５Ｃ４−１３Ｇ１２を用いたアッセイで得られた内因性脱グリコシル化体／組み換え体のシグナル比を１００％とした値である。
【００６３】
この結果、我々はＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央部分がグリコシル化されており、多糖残基が抗体と内因性抗原との相互作用を妨げていることを示した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央部分に特異的な抗体は内因性抗原を認識することができないので、グリコシル化による影響を受けない他の領域に特異的なＭＡｂをＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰのアッセイに使用すべきである。
【００６４】
実施例１２： 脱グリコシル化前後の内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのゲル濾過による研究
Ｏ−グリコシダーゼおよびシアリダーゼで処理済および未処理のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰをゲル濾過（ＧＦ）法で研究した。プールしたＨＦ患者の血漿から抽出したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを酵素で処理し、その後、画分中の免疫活性を免疫アッセイ１５Ｃ４−１３Ｇ１２と１１Ｄ１−１３Ｇ１２の２種で決定した。実施例１１に示したデータによると、アッセイ１５Ｃ４−１３Ｇ１２はグリコシル化に対して非感受性であり、一方、１１Ｄ１−１３Ｇ１２アッセイは、炭水化物構造の除去後にのみ内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを検出することができる。
【００６５】
以下のａ）〜ｄ）： ａ）プールしたＨＦ患者の血漿から抽出した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ｂ）プールしたＨＦ患者の血漿から、脱グリコシル化後に抽出した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ｃ）組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｄ）組み換えｐｒｏＢＮＰのそれぞれのサンプルを、同じ濃度（３３０ｎｇ／ｍｌ）となるように、０．７ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．００５ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡおよび５ｇ／Ｌのウシ血清アルブミンを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を１５０μｌ用いて復元した。０．７ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌおよび０．００５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で平衡化したスーパーデックス７５ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラムにサンプルをアプライした。タンパク質を流速０．７ｍｌ／分で溶出し、容積０．５ｍｌの画分を回収した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの免疫活性を、グリコシル化に非感受性のモノクローナル抗体を使用したサンドイッチ免疫アッセイ１５Ｃ５−１３Ｇ１２、およびグリコシル化内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと相互作用しない１１Ｄ１−１３Ｇ１２アッセイで測定した。
【００６６】
以下の一群の標準タンパク質を用いて、カラムを校正した： アルブミン（Ｍｒ ６７０００Ｄａ）、オブアルブミン（Ｍｒ ４３０００Ｄａ）、キモトリプシノーゲン（Ｍｒ ２５０００Ｄａ）、リボヌクレアーゼＡ（Ｍｒ １３７００Ｄａ）およびアプロチニン（Ｍｒ ６５１７．５Ｄａ）。スーパーデックス７５カラムにロードする前に、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと組み換えｐｒｏＢＮＰは健康なドナーからプールした血漿で復元した。
【００６７】
１５Ｃ４−１３Ｇ１２免疫アッセイで測定したところ、内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは２つの免疫反応性のピークを示し（図７）、主要なものは分子量が約２８ｋＤａのピークであり、小さなものは分子量が約５１ｋＤａのピークだった。脱グリコシル化後には、免疫活性を示す両方のピークがより低い分子量のタンパク質側にシフトするのが観察された。主要なピークは分子量が約１８ｋＤａのタンパク質に相当し、小さなピークは分子量が約５１ｋＤａのタンパク質に相当した。
【００６８】
１１Ｄ１−１３Ｇ１２免疫アッセイ（グリコシル化に感受性の抗体１１Ｄ１を使用）で測定したところ、内因性のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰはほとんど応答しなかったものの、脱グリコシル化タンパク質については、顕著な応答が観察された。免疫反応性のプロファイルは、１５Ｃ４−１３Ｇ１２免疫アッセイで測定したプロファイルと非常に類似していた。
【００６９】
実施例１３： ウエスタンブロッティングにおける、アフィニティ精製した（脱グリコシル化前後の）内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ特異的モノクローナル抗体による免疫化学染色
電気泳動とウエスタンブロッティングを実施例１０の記載と同様に実施した。
【００７０】
ここでは、脱グリコシル化前のサンプル中のタンパク質の可視化に、ＭＡｂ １５Ｆ１１（エピトープ１３〜２４）を使用した。主要な免疫活性は、約１５ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質に対応する範囲内のいくつかの拡散ゾーンから検出された。ＭＡｂ １５Ｆ１１とは異なり、内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、アミノ酸残基３１〜３９領域に特異的なＭＡｂ １１Ｄ１では染色されなかった。脱グリコシル化後には、両方の抗体が見かけの分子量が約１３ｋＤａのペプチドを検出することができた。このバンドが組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰバンドの少し上に位置することは、脱グリコシル化が不完全であったという事実によって説明することができる。
【００７１】
我々は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央領域に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング実験では内因性タンパク質を検出することはできないが、脱グリコシル化後には、このような抗体によって「可視化」できると結論付けた。
【００７２】
参考文献
１． Mair J, Hammerer-Lercher A, Puschendorf B. The impact of cardiac natriuretic peptide determination on the diagnosis and management of heart failure. Clin. Chem. Lab. Med. 2001; 39:571-88.
２． Cowie MR, Mendez GF. BNP and congestive heart failure. Prog. Cardiovasc. Dis. 2002; 44:293-321.
３． Pandey KN. Biology of natriuretic peptides and their receptors. Peptides 2005; 26:901-932.
４． Hunt PJ, Espiner EA, Nicholls MG, Richards AM, Yandle TG. The role of the circulation in processing pro-brain natriuretic peptide (proBNP) to amino-terminal BNP and BNP-32. Peptides 1997; 18:1475-1481.
５． Hughes D, Talwar S, Squire IB, Davies JE, Ng LL. An immunoluminometric assay for N-terminal pro-brain natriuretic peptide: development of a test for left ventricular dysfunction. Clin. Sci. (Lond) 1999; 96:373-380.
６． Karl J, Borgya A, Gallusser A, et al. Development of a novel, N-terminal-proBNP (NT-proBNP) assay with a low detection limit. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1999; 230:177-181.
７． Giuliani I, Rieunier F, Larue C, et al. Assay for measurement of intact B-type natriuretic peptide prohormone in blood. Clin. Chem. 2006; 52:1054-1061.
８． Seidler T, Pemberton C, Yandle T, Espiner E, Nicholls G, Richards M. The amino terminal regions of proBNP and proANP oligomerise through leucine zipper-like coiled-coil motifs. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 255:495-501.
９． Crimmins DL. Human N-terminal proBNP is a monomer. Clin. Chem. 2005; 51:1035-1038.
１０． Schagger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 1987; 166:368-379.
【００７３】
添付の図面は本発明の説明を容易にするために提供するものであり、それは以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本願で使用したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ特異的モノクローナル抗体のエピトープマップ。
【図２】内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（ＨＦ患者の血漿由来の抗原）に対する種々のＭＡｂの特異性。結果は、２つの部位に対するＭＡｂの種々の組み合わせにおける、血漿シグナル値と組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ標準物質のシグナル値の比として表した。このような組み合わせにおいては、１種のＭＡｂを内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと効果的に相互作用することができるもの（ＭＡｂ ２４Ｅ１１、エピトープ６７〜７６またはＭＡｂ １３Ｇ１２、エピトープ１３〜２０）とし、もう１種のＭＡｂを、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の異なる領域に特異的な一群の抗体から選んだものとした。組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの濃度は、１５Ｃ４−１３Ｇ１２アッセイで決定したＨＦ患者血漿の内因性抗原濃度と同じだった。
【図３】アッセイ１５Ｃ４−１３Ｇ１２の検量曲線と、２つの個別の血漿サンプルの希釈曲線。組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（大腸菌で発現、HyTest製）をプールした正常ヒト血漿で復元したものを検量物質として用いた。
【図４】ＨＦ患者の４つの血漿サンプルのゲル濾過（スーパーデックス７５ １０／３００ ＧＬカラム）による研究結果。画分中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ免疫反応性は、内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを認識するモノクローナル抗体である１５Ｃ４（エピトープ６３〜７１）と１３Ｇ１２（エピトープ１３〜２０）を用いたサンドイッチ免疫アッセイで定量した。
【図５】アフィニティ精製した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのウエスタンブロッティング研究の結果。トラック１，４： 組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（５０ｎｇ／トラック）、トラック２，５： 組み換えｐｒｏＢＮＰ（５０ｎｇ／トラック）、トラック３，６： ヒト血漿から精製した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（２００ｎｇ／トラック）。免疫染色には、ＭＡｂ １５Ｆ１１（エピトープ１３〜２４）をトラック１〜３に、ＭＡｂ １１Ｄ１（エピトープ３１〜３９）をトラック４〜６に使用した。
【図６】内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（黒いカラム）または脱グリコシル化（Ｏ−グリコシダーゼとシアリダーゼ処理）後の内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（灰色のカラム）に対する、種々のモノクローナル抗体の特異性。結果は、２つの部位に対するＭＡｂの種々の組み合わせで得られるシグナル比（内因性／組み換え体）で表した。３つの型のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、即ち、ａ）組み換え体（非グリコシル化）、ｂ）ＨＦ患者血漿から抽出した内因性のもの、およびｃ）血漿から抽出し、酵素処理した内因性のもの、を同じ濃度で使用し、種々のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ免疫アッセイで試験した。この免疫アッセイにおいては、１種のＭＡｂをグリコシル化の影響を受けないエピトープに特異的なもの（ＭＡｂ ２４Ｅ１１，エピトープ６７〜７６またはＭＡｂ １３Ｇ１２，エピトープ１３〜２０）とし、もう１種は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の他の領域に特異的な一群の抗体から選んだものとした。
【図７】血漿から抽出した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（実線）とＯ−グリコシダーゼおよびシアリダーゼで処理した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（点線）のゲル濾過（スーパーデックス７５ １０／３００ ＧＬカラム）による研究の結果。画分中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの免疫反応性は、２種のサンドイッチ免疫アッセイ、即ち、１５Ｃ４−１３Ｇ１２（黒い三角）および１１Ｄ１−１３Ｇ１２（黒い四角）で定量した。免疫アッセイ１５Ｃ４−１３Ｇ１２はグリコシル化に感受性ではない。免疫アッセイ１１Ｄ１−１３Ｇ１２はグリコシル化に感受性である。
【図８】脱グリコシル化前後のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアフィニティ精製標品に関するウエスタンブロッティング研究の結果。トラック１，５： 組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（大腸菌，トラック当たり５０ｎｇ）、トラック２，６： 組み換えｐｒｏＢＮＰ（大腸菌，トラック当たり５０ｎｇ）、トラック３，７： アフィニティ精製した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（トラック当たり２００ｎｇ）、トラック４，８： 脱グリコシル化後にアフィニティ精製した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（トラック当たり２００ｎｇ）。ＭＡｂ １５Ｆ１１（エピトープ１３〜２４）をトラック１〜４、またはＭＡｂ １１Ｄ１（エピトープ３１〜３９）をトラック５〜８の抗原免疫染色に使用した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに発見された形態のｐｒｏＢＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する抗体を提供する。これらタンパク質に存在する特定のエピトープも開示する。上記特定のエピトープに特異的な抗体は、正確な免疫検出法、即ち、ヒト血液中の２種のタンパク質の存在および／またはその量の検出に適している。新規形態の該タンパク質は、抗体産生用の抗原としてのみならず、種々の免疫アッセイにおける検量物質や免疫標準物質としての有用性が示唆されている。
【背景技術】
【０００２】
プロ型の脳性ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏＢＮＰ）のみならず、ＢＮＰとｐｒｏＢＮＰのＮ末端断片（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）は、心不全（ＨＦ）および左室機能障害のマーカーとして知られている。これらは、種々の心臓病を患う患者のリスクの層別化や、ＨＦ患者の治療のモニタリングにも使用されている。ＢＮＰは、ナトリウム利尿作用、血管拡張作用およびレニン阻害作用を有するペプチドホルモンである（文献１〜３に概説有り）。ＢＮＰは構造的に類似したペプチドホルモンのファミリーに属す。このファミリーには、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）およびウロジラチンも含まれる。ＢＮＰとＡＮＰは広いスペクトルにわたる生物学的特性を共有し、共に心筋由来であるが、一方、ＣＮＰは内皮由来である。これらペプチドは、２つのシステイン残基の間にジスルフィド結合を有する、１７個のアミノ酸からなる環状構造によって特徴付けられる。環状構造は、異なるナトリウム利尿ペプチドの間で高い同一性レベルを示す（各グループの代表間で、１７個のアミノ酸残基（ａａｒ）の内、１１個が同一である）。ＢＮＰ分子は３２アミノ酸残基からなり、Ｃｙｓ10とＣｙｓ26の間にジスルフィド結合が存在する。
【０００３】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとＢＮＰは、前駆体分子であるプレｐｒｏＢＮＰのタンパク分解性プロセシング産物である。プレｐｒｏＢＮＰは１３４アミノ酸残基からなり、心筋細胞によって合成される。シグナルペプチド（アミノ酸残基１〜２６）の除去は、ｐｒｏＢＮＰ分子（アミノ酸残基２７〜１３４）の出現をもたらす。続いて、ｐｒｏＢＮＰ（１０８アミノ酸残基）が未知のプロテアーゼによって開裂され、２つのペプチド、即ち、ＢＮＰ（アミノ酸残基７７〜１０８）とＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（アミノ酸残基１〜７６）、が形成される。ＢＮＰ（生物学的に活性な分子）とＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（生理活性は明らかではない）の両方が、プロセシングを受けていないｐｒｏＢＮＰと共に血流に分泌され、ヒト血液を循環する。
【０００４】
ｐｒｏＢＮＰ合成は、心臓の自動的な刺激または神経ホルモンによる刺激に応答して増加し、その結果、血液中のＢＮＰ濃度およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度が上昇することは事実として確立されている。上昇したＢＮＰレベルとＮＴ−ｐｒｏＢＮＰレベルは、種々の心血管病（心不全、左室機能障害、不安定狭心症および心筋梗塞）の患者について報告されている。ＨＦ患者における両検体の血中濃度は、疾患の重症度と相関する。心不全の非常に初期の段階（ニューヨーク心臓協会による、ＮＹＨＡの第Ｉステージ）にある無症候性の患者において、既にペプチド濃度が上昇しているという報告がある。重度のＨＦ（ＮＹＨＡクラスIIIまたはＩＶ）および心筋の機能不全の兆候を示す患者においては、ＢＮＰの値は著しく増加している。従って、ヒト血液のＢＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの測定は、ＨＦが疑われる患者の評価および疾患の重症度の特定のために広く使用されている。
【０００５】
ヒト血漿中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを測定するための種々の免疫アッセイ方法が文献に記載されている。免疫アッセイは、ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の種々の部位、即ち、エピトープ１〜１３（文献４）、６５〜７６（文献５）、１〜１２と６５〜７６（文献６）、８〜２９（Biomedica assay）、１〜２１と３９〜５０（Roche Elecsys）、に特異的なモノクローナル抗体のみならず、ポリクローナル抗体を使用する。近年、ｐｒｏＢＮＰの開裂部位に特異的な抗体とＢＮＰ特異的抗体を使用する新しいｐｒｏＢＮＰ免疫アッセイが報告された（文献７）。
【０００６】
アッセイに使用する抗体について未だコンセンサスは得られていない。しかし、いくつかの出版済みのデータは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央領域に特異的な抗体は、ヒト血液中の検体を認識することができないことを示している。Hughes（文献５）は、アミノ酸残基６５〜７６に特異的な抗体とは異なり、アミノ酸残基３７〜４９に特異的なウサギポリクローナル抗体は患者血液中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを認識しないことを示した。ヒト血液中を循環しているＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの生化学的性質に関して入手可能な情報の量が少ないため、ここでシグナルが観察されなかった理由は明確ではない。
【０００７】
未変性条件下で行うゲル濾過（ＧＦ）による研究によって、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとｐｒｏＢＮＰの免疫反応性は、見かけの分子量が予想値よりも３倍〜４倍高いタンパク質の画分に存在することが判明した。Seidler et al.（文献８）は、種々の条件下におけるクロマトグラフィーによって観察される分子量の差は、ヒト血液中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子およびｐｒｏＢＮＰ分子のオリゴマー化によるものと仮定した。しかし、この仮定は、合成したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰはin vitroでオリゴマーを形成しないことを明らかにしたCrimmins（文献９）によって否定された。その結果、今のところ、ヒト血液中を循環しているＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの形態は未だ特定されておらず、観察される異常に対する説明も存在しない。
【０００８】
ヒト血液中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの生化学的性質に関する情報は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ測定に関する近年のアプローチに重大な影響を与える可能性がある。現存する方法、即ち、分子の中央部分に特異的な抗体を使用する方法によって、サンプル中に存在する全てのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（ｐｒｏＢＮＰ）を検出することができるのかは不明である。従って、ヒト血液中を循環しているＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰを正確に特徴付ける必要がある。
【０００９】
発明の概要
ヒト血液中を循環しているＰｒｏＢＮＰとＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、それぞれ１０８アミノ酸残基と７６アミノ酸残基（分子量は約１２ｋＤａと８．６ｋＤａ）からなるポリペプチドであると文献に記載されている。患者血液のｐｒｏＢＮＰ濃度は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度よりも著しく低い。我々の最近の研究によると、血中ｐｒｏＢＮＰ濃度は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度の約１０〜２０％である。Seidler et al.（文献８）はゲル濾過による研究（未変性条件下）によって、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとｐｒｏＢＮＰは変則的な移動度を示し、これらの見かけの分子量は３０〜４０ｋＤａであると報告している。上記文献の著者らは、ヒト血液においてどちらのタンパク質もホモオリゴマーの形で存在することを示唆している。我々の研究においては、血液中に存在する両方のタンパク質の見かけの分子量（ゲル濾過による研究、スーパーデックス７５ １０／３００ ＧＬカラム）は約３０ｋＤａであることを明らかにした（図４）。
【００１０】
我々は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのエピトープに特異的な（ｐｒｏＢＮＰとも交差反応する）タンパク質の全長配列をカバーする、高親和性モノクローナル抗体（ＭＡｂ）のパネル（図１）を作製した。全てのＭＡｂを、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の種々の断片に対応する合成ペプチドでマウスを免疫した後に作製した。全てのＭＡｂについて、２つの部位を組み合わせた試験（サンドイッチ免疫蛍光アッセイ）を組み換えタンパク質のみならず、患者血液から単離した内因性タンパク質を用いて行った。これらの研究によって、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの中央部分（領域２８〜６０に位置するエピトープ）に特異的な抗体は、ヒト血液中の抗原を正しく認識しないことが明らかとなった（図２）。一方、ペプチド５〜２７および６１〜７６に位置するエピトープに対する抗体の大部分が、ヒト血液中の抗原を組み換えタンパク質と同等の効率で認識した。
【００１１】
アフィニティークロマトグラフィー（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの種々の領域に特異的なモノクローナル抗体を固定したアフィニティーカラム）の使用によって、ヒト血液から内因性の抗原を精製し、ウエスタンブロッティングで解析した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子とｐｒｏＢＮＰ分子を、いくつかのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ特異的モノクローナル抗体で染色した（図５）。試験したモノクローナル抗体の中には、内因性タンパク質を含むトラックから組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと同じ分子量のタンパク質バンドを検出するものはなかった。主要な免疫活性は、より高い分子量（１５〜７０ｋＤａ）のタンパク質に対応する範囲内の拡散ゾーンに集中していた。
【００１２】
ウエスタンブロッティング研究において観察されたこのようなＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとｐｒｏＢＮＰの広範囲わたる多様な形態（図５）は、ヒト血液中を循環しているＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子とｐｒｏＢＮＰ分子のグリコシル化によって説明することができる。
【００１３】
従って、本発明の１つの態様は、内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を特異的に認識するが、脱グリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは脱グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を認識しない抗体またはその断片に関する。更に本発明は、内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を認識し、該認識における親和性は対応する脱グリコシル化タンパク質もしくはその断片に対する親和性よりも高いことを特徴とする、抗体またはその断片を提供する。これに関連する本発明の別の態様においては、上記抗体と同じ特異性を示すアプタマーを提供する。更に上記抗体には、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片のみならず、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体断片も含まれる。また、上記抗体は、組み換え抗体または組み換え抗体断片でもよい。
【００１４】
本発明の別の態様においては、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片の定性的または定量的な検出のために、上記抗体または抗体断片を用いる診断的免疫アッセイ方法を提供する。これに関連して、患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片をアッセイするための診断方法であって、本明細書に記載した抗体あるいはアプタマーを用いて、サンプルのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含量またはｐｒｏＢＮＰ含量を定量的または半定量的に決定することを包含する方法も提供する。該診断方法は、脊椎動物の血液から単離した、内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ標品またはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ標品を標準物質として検量曲線を作製することを更に包含してもよい。また該診断方法は、標準曲線を作製し、決定したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含量値またはｐｒｏＢＮＰ含量値を標準曲線と比較することを更に包含してもよい。本発明の診断方法の例としては、免疫アッセイ方法が挙げられる。診断免疫アッセイの１例として、第１の捕捉抗体と第２の検出抗体を使用するサンドイッチ免疫アッセイ方法を挙げることができる。
【００１５】
本発明の別の態様は、患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰをアッセイするための診断方法であって、（ａ）サンプルに含まれる内因性のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰを脱グリコシル化し、そして（ｂ）ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰに特異的な抗体またはアプタマーを用いて、サンプルのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含量またはｐｒｏＢＮＰ含量を決定することを包含する方法に関する。
【００１６】
更に別の態様は、グリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を含む、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰの標準物質または検量物質に関する。この中のいくつかの態様においては、グリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片は、内因性のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰであり、別の態様においては、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰは、脊椎動物の血液から単離されたものである。これに関連した本発明の別の態様においては、グリコシル化した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは組み換えｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を単離したものを提供する。この中の更に具体的な態様においては、グリコシル化した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは組み換えｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片は、in vitroでグリコシル化したものである。いくつかの更に他の具体的な態様においては、グリコシル化した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは組み換えｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片は、培養細胞系または細胞を含まない翻訳系によって製造したものである。
【００１７】
本発明の更に別の態様は、上記分子を抗原として用いた、上記抗体と同じ特異性を有する抗体を製造するための方法に関する。
【００１８】
更に別の態様においては、本発明は、患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片の診断アッセイを行うための免疫アッセイ用キットであって、以下の（ａ）〜（ｃ）を包含するキットを提供する。（ａ）上記抗体と同じ特異性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、（ｂ）検出可能な標識、および（ｃ）本明細書に記載する標準物質または検量物質。代表的なキットは、患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片の診断アッセイを行うための免疫アッセイ用キットであって、以下の（ａ）〜（ｃ）を包含するキットである。（ａ）上記抗体と同じ特異性を有する、第１のモノクローナル捕捉抗体、（ｂ）請求項１または２の抗体と同じ特異性を有し、蛍光標識されている第２のモノクローナル検出抗体、および（ｃ）請求項１４の標準物質または検量物質。
【００１９】
本明細書において、タンパク質、抗体やその他の物質の断片とは、該物質の構造的および／または機能的な断片であって、所望の活性を保持するものである。
【００２０】
本発明のその他の特徴および利点については、添付の図面や実施例を含む以下の詳細な説明によってより明確に理解されるであろう。
【００２１】
発明の詳細の説明
我々は単離したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰを脱グリコシル化酵素で処理し、得られたタンパク質標品をサンドイッチ免疫アッセイ、ゲル濾過ＨＰＬＣおよびウエスタンブロッティングで解析した。後述する実施例で詳細に説明するこれらの実験では、次の結果が得られた。
【００２２】
サンドイッチ免疫アッセイ： 脱グリコシル化後には、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央領域に特異的なモノクローナル抗体（天然の内因性抗原を認識しない抗体）は、組み換え（非グリコシル化）型と同等の効率で内因性タンパク質を認識することができた（図６）。
【００２３】
ＨＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィー： 脱グリコシル化後には、免疫活性を示すピークの組み換えタンパク質側（即ち、より低い分子量のタンパク質側）へのシフトが観察された（図７）。
【００２４】
ウエスタンブロッティング：
１）脱グリコシル化後には、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと同レベルのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ免疫活性を示すタンパク質バンドが出現した。
２）ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央部分に特異的な抗体（天然の内因性抗原を認識しない抗体）がこのバンド（脱グリコシル化後の内因性タンパク質）を認識することができた（図８）。
【００２５】
まとめ
本明細書においては、ヒト血液中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰは、過去に考えられていたような単純なポリペプチド鎖としては存在しておらず、糖タンパク質として存在することを明確に開示した。これは、ヒト血液中の一方または両方の分子を検出するように設計したアッセイに使用するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、グリコシル化の影響を受けない分子内の部分を認識するか、あるいは分子のグリコシル化された部分を認識しなければならないことを意味する。
【００２６】
このようなアッセイに用いる標準物質および検量物質の調製には、両方のタンパク質のグリコシル化型を用いるべきである。
【００２７】
分子のグリコシル化された部分に特異的な抗体を得るためには、グリコシル化型の抗原を動物の免疫に使用すべきである。
【実施例】
【００２８】
実施例１： ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子に特異的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の調製と特徴づけ
ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の配列１〜２４、１３〜２７、２８〜４５、４６〜６０および６１〜７６に対応する合成ペプチド（フィンランド国、HyTest製）を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合し、マウスの免疫に使用した。小さなペプチドを担体タンパク質分子と結合することで、動物の免疫応答を増強することができる。
【００２９】
６〜１２週令のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを免疫に使用した。
【００３０】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子に特異的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するハイブリドーマ細胞系は、マウス脾臓細胞とミエローマＳＰ２／０細胞とのハイブリダイゼーションの後に得た。
【００３１】
培養上清の全長組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子（大腸菌で発現したもの）に対する反応性を試験し、８４株の陽性培養細胞を更なる研究のために選択した。この内、１４株は領域１〜２４、２４株は領域１３〜２７、１９株は領域２８〜４５、１３株は領域４６〜６０、そして１５株は領域６１〜７６にそれぞれ特異的な抗体を産生した。選択した培養細胞は、限界希釈法によってサブクローニングを２回行い、増殖後に凍結した。
【００３２】
モノクローナル抗体を含有する腹水をＢａｌｂ／Ｃマウスで作製した。
【００３３】
タンパク質Ａ−セファロース（GE Healthcare製）によるアフィニティークロマトグラフィーで抗体を腹水から単離した。
【００３４】
精製した抗体のアイソタイプをモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Pierce製）で決定した。全てのＭＡｂがＩｇＧと特定された。
【００３５】
実施例２： エピトープ解析
新たに産生した全ての抗体について、合成ペプチド１〜１２、５〜２０、１〜２４、１３〜２７、２８〜４５、３１〜３９、３４〜４２、３７〜４５、４８〜５６、５０〜５８、５２〜６０、４６〜６０、６３〜７１、６５〜７３、６７〜７６と６１〜７６からなる、重複する配列を含むライブラリーを用いて、詳細なエピトープマッピングを行った。合成ペプチドは、担体タンパク質（オブアルブミン）と結合させた。１μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のペプチド結合体でプレートを被覆した。洗浄後、ＰＢＳＴで復元したモノクローナル抗体をウェルに加えた。室温で３０分のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＦｃ特異的ポリクローナル抗体を各ウェルに添加した。３０分のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン基質系によって発色させた。ビクター１４２０マルチラベルカウンター（Victor 1420 Multilabel Counter）を用い、４９２ｎｍで吸光度を測定した。領域１〜２４に特異的なＭＡｂは、エピトープが領域１〜１２、５〜１２、５〜２０および１３〜２４にそれぞれ位置する４つの抗体群に分けられた。領域１３〜２７に特異的な抗体は、エピトープが領域１３〜２０と１３〜２４にそれぞれ位置する２つの抗体群に分けられ、領域２８〜４５に特異的な抗体は、エピトープが領域３１〜３９と３４〜３９にそれぞれ位置する２つの抗体群に分けられた。ペプチド４６〜６０に特異的な抗体は、エピトープが領域４６〜５６、４８〜５６、４６〜６０および５２〜５８にそれぞれ位置する４つの抗体群に分けられ、ペプチド６１〜７６に特異的な抗体は、エピトープが領域６３〜７１、６７〜７３および６７〜７６にそれぞれ位置する３つの抗体群に分けられた。
【００３６】
実施例３： ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの定量的測定のための、サンドイッチ免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）の開発
本発明において、ヒト血液中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを定量するためのサンドイッチ型の免疫蛍光アッセイを確立した。このアッセイ法は、プレート表面に吸着させたモノクローナル抗体に対する抗原の結合による一次免疫複合体の形成と、安定なユーロピウム（III）キレートで標識された別のモノクローナル抗体による一次免疫複合体の検出に基づくものである。
【００３７】
実施例４： 抗体と安定なユーロピウムキレートとの結合
セファデックスＧ２５カラム（ＮＡＰ−５）によるゲル濾過を用いて、抗体を予備的にＮａＣｌの０．９％水溶液に移した。２，２’，２”，２’”；−［［４−［（４−イソチオシアナトフェニル）エチニル］ピリジン−２，６−ジイル］ビス（メチレンニトリロ）］テトラキス（酢酸）の安定なユーロピウム（III）キレートによる抗体の標識は、２００倍モル量過剰なユーロピウム（III）キレートを含有する５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ−カーボネート緩衝液（ｐＨ９．８）中、＋４°Ｃで一晩インキュベートすることで行った。０．０１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌおよび０．１％のＮａＮ3を含有する緩衝液を用いた、セファデックスＧ２５カラム（ＮＡＰ−５）によるゲル濾過で標識抗体を未反応キレートと分離した。
【００３８】
実施例５： 患者と血液サンプル
ＨＦを患う患者の診断は、呼吸困難、起座呼吸、肺の水泡音および下肢浮腫という症状に基づいて行い、心エコーとＸ線検査によって確認した。予備診断は心臓病専門医によって行われ、ＨＦの専門医によって更に確認された。血液サンプルは、左室駆出分画率が３０％未満で、左室収縮終末期容積が９０ｍｌ超の患者から収集した。静脈血はＥＤＴＡを含有するVacuetteチューブ（Greiner Bio-One製）に回収し、３０００ｇ（１５分、＋４℃）で遠心分離した。血清サンプルは、プラスチックチューブに回収した血液を室温で３０分インキュベートし、５０００ｇ（３０分、＋２０℃）で遠心分離して得た。血漿と血清のサンプルは使用するまで−７０℃で保存した。ＭＡｂの試験においては、プールした血清（重度ＨＦ患者３９人）またはプールした血漿（ＨＦ患者１０人）を内因性抗原の供給源として使用した。陰性の対照（ＨＦではないサンプル）としては、１０人の健常ドナーからプールした血清または血漿を使用した。
【００３９】
実施例６： サンドイッチＩＦＡ
作製した全てのＭＡｂについて、２つの部位に対するＭＡｂ（捕捉用および検出用）を組み合わせた試験を、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、および内因性抗原の供給源となるＨＦ患者からプールした血清または血漿を用いて実施した。濃度が１０μｇ／ｍｌの捕捉抗体をＥＩＡプレート（ウェル当たり１００μｌ）に添加し、リン酸生理食塩緩衝液中、室温で３０分間、ゆっくりと振とうさせながらインキュベートした。０．０１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０および０．０５％のＮａＮ3を含む緩衝液（バッファーＡ）を用いてタイタープレートを２回洗浄した後、抗原（プールした正常ヒト血漿で復元した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、またはＨＦ血漿または血清由来の内因性抗原、５０μｌ）と検出抗体（４μｇ／ｍｌ、５０μｌ）の混合物を０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、０．９％のＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、０．５％のＢＳＡおよび０．０５％のＮａＮ3を含有する緩衝液（バッファーＢ）に溶解したものをウェルに添加した。プレートを室温で３０分間、ゆっくりと振とうさせながらインキュベートし、バッファーＡを用いて６回洗浄した。増強溶液（１．７５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＳＣＮ、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｌ／Ｌ グリセリン、２００ｍｌ／Ｌ １−プロパノール、０．００５ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ2ＣＯ3、０．０５ｍｏｌ／Ｌ グリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ１０．０）の添加後、混合物を同じ条件下で３分間インキュベートした。ビクター１４２０マルチラベルカウンターで蛍光を測定した。
【００４０】
実施例７： 種々の免疫アッセイ法による血液サンプルの試験
２つの部位を組み合わせた試験（サンドイッチ免疫アッセイ）に使用した、個別のエピトープに対するＭＡｂの全てが、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよび組み換えｐｒｏＢＮＰを低い検出限界（１０〜１００ｎｇ／Ｌ）で検出することができた。同時に、わずかなＭＡｂの組み合わせのみがＨＦ患者の血清と血漿から抗原を認識することができた。領域１３〜２７に特異的なＭＡｂと領域６１〜７６に特異的な別のＭＡｂとの組み合わせのみが、内因性抗原を高感度で検出した。
【００４１】
領域４６〜６０に特異的な１３種のＭＡｂは、いかなる別の抗体と共に２つの部位を組み合わせた試験に使用しても、内因性抗原を認識することはできなかった。最もＮ末端側の領域に特異的なＭＡｂまたは領域２８〜４５に特異的なＭＡｂを配列６１〜７６を認識する抗体とペアにして試験すると、内因性ペプチドと組み換えペプチドのシグナル比は、エピトープ１３〜２７に特異的なＭＡｂを用いるアッセイよりも著しく低かった。ペプチド５〜１２に特異的なＭＡｂ ２９Ｄ１２のみが、ペプチド６７〜７６に特異的なＭＡｂとペアにして試験した際に、血清サンプルまたは血漿サンプルとの相互作用によって高いシグナルをもたらした。
【００４２】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の種々の領域に特異的な抗体を用いたサンドイッチ免疫アッセイによる、組み換え型および内因性（心不全対象者からプールした血漿）のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの試験結果を図２に示した。
【００４３】
組み換え抗原と天然抗原を同じ効率で認識できることから、更なる研究には、アッセイ１５Ｃ４63-71−１３Ｇ１２13-20を選択し、使用した。
【００４４】
この結果、我々は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央部分（領域２８〜６０）に特異的なＭＡｂは、ヒト血液中の抗原をほとんど認識することができないことを示した。
【００４５】
実施例８： １５Ｃ４−１３Ｇ１２免疫アッセイの特徴づけ
ＭＡｂ １５Ｃ４−１３Ｇ１２を使用するサンドイッチ免疫蛍光アッセイを実施例６と同様に実施した。
【００４６】
このアッセイに使用した抗体の特異性は、ウエスタンブロッティング解析で確認した（データは示さない）。両方の抗体が大腸菌に発現させた組み換えｐｒｏＢＮＰと組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを検出した。
【００４７】
大腸菌で発現したヒト組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを正常ヒト血漿で復元し、サンドイッチＩＦＡの検量物質として使用した。検出限界は、検体を含まない検量物質の平均シグナル値に標準偏差の２倍を足した値のシグナルを産生する濃度（１つの実験で２０回測定）と定義した。組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの典型的な検量曲線と、ヒト血漿サンプルの段階希釈系列を図３に示した。検出限界は１０ｎｇ／Ｌであり、免疫アッセイは１５〜１００，０００ｎｇ／Ｌの範囲で直線的だった。
【００４８】
実施例９： 組み換えおよび内因性のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのゲル濾過による研究
Seidler et al.（文献８）は、（非変性条件下の）ゲル濾過による研究において、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰは変則的な移動度を示し、それらの見かけの分子量は約３０〜４０ｋＤａであると報告した。著者らは、ヒト血液においていずれのタンパク質もホモ型−オリゴマー型であることを示唆している。我々の研究では、ＨＦ患者の血漿を内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの原料として用い、ゲル濾過による研究を実施した。
【００４９】
個別の患者血漿サンプルを１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清（１５０μｌ）を、０．１ｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌおよび０．００５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む緩衝液で平衡化したスーパーデックス７５ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラムにアプライした。タンパク質を流速０．８ｍｌ／分で溶出し、容積０．７ｍｌの画分を回収した。続いて、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ免疫活性を１５Ｃ４63-71−１３Ｇ１２13-20サンドイッチ免疫アッセイで測定した。
【００５０】
以下の一群の標準タンパク質（GE Healthcare製）を用いて、カラムを校正した： アルブミン（Ｍｒ ６７０００Ｄａ）、オブアルブミン（Ｍｒ ４３０００Ｄａ）、キモトリプシノーゲン（Ｍｒ ２５０００Ｄａ）、リボヌクレアーゼＡ（Ｍｒ １３７００Ｄａ）およびアプロチニン（Ｍｒ ６５１７．５Ｄａ、Sigma製）。スーパーデックス７５カラムにロードする前に、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを健康なドナーからプールした血漿で復元した。
【００５１】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰアッセイによる画分解析によって、ヒト血漿サンプルから１つの免疫反応性のピーク（約３０ｋＤａ）が見出された（図４）。最大ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ活性の位置は、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（約１６ｋＤａ）および組み換えｐｒｏＢＮＰ（約２１ｋＤａ）について確立されたものと一致しなかった。従って我々は、ＧＦにおいて内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、組み換えタンパク質よりも顕著に高い見かけの分子量を示すことを観察した。内因性タンパク質と組み換えタンパク質の間で観察された見かけの分子量の差は、内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの（分子の中央部分における）翻訳後修飾によって説明することができる。このような修飾の存在は、分子の中央領域に特異的な抗体が内因性抗原を認識することができないという事実も説明することができる。
【００５２】
実施例１０： 内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのウエスタンブロッティングによる研究
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰをプールしたＨＦ患者の血漿からアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。アフィニティーマトリクスを得るために、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の種々の領域に特異的な抗体（１５Ｃ４、２４Ｅ１１、１８Ｈ５、１５Ｆ１１）の混合物を、標準的なプロトコルに従ってＢｒＣＮ活性化セファロースＣＬ−４Ｂ（GE Healthcare製）に固定した。上述した実験（実施例８を参照）によって、上記ＭＡｂは内因性抗原を高い効率で認識しうることが示されている。抗体が固定されたアフィニティーマトリクスを０．１ｍｏｌ／Ｌのグリシン（ｐＨ２．０）で洗浄し、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む０．０２ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化した。ＨＦ患者のプールした血漿を、＋４℃、流速１ｍｌ／分の条件で抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−セファロースにロードした。ペプチドは０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌの水溶液で溶出した。溶出物を２ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌで中和した。アフィニティークロマトグラフィー後の回収率は８８％だった。
【００５３】
次に溶出物を、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと相互作用しないＭＡｂを固定化したセファロースＣＬ−４Ｂ（陰性クロマトグラフィー）にロードし、アフィニティーマトリクスに非特異的に結合するタンパク質を除去した。
【００５４】
続いて、２回目のアフィニティークロマトグラフィーによってＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを濃縮した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを含有する溶液を、＋４℃、流速１ｍｌ／分の条件で抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−セファロース（抗体量は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度に対して１０倍モル量過剰）にロードした。ペプチドを０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌで溶出し、凍結乾燥し、水で復元し、使用するまで−７０℃で保存した。
【００５５】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ標品へのｐｒｏＢＮＰの混入をｐｒｏＢＮＰ特異的免疫アッセイで検出したところ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの全量に対して９％未満だった。
【００５６】
内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのサンプルのみならず、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと組み換えｐｒｏＢＮＰも０．２５ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０ｍｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノール、２０ｇ／Ｌ ドデシル硫酸ナトリウムと１００ｍｌ／Ｌ グリセリン中で５分間煮沸し、Schagger and von Jagow（文献１０）に記載のトリシン電気泳動によるタンパク質分離のためのゲルにロードした。電気泳動は一定電圧（１５０Ｖ）、＋４℃の条件下で４時間行い、ゲルは１６．５％ Ｔ，３％ Ｃ分離ゲルを使用した。プールしたＨＦ患者の血漿から抽出した２００ｎｇのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（濃度は１５Ｃ４63-71−１３Ｇ１２13-20免疫アッセイで決定した）、または５０ｎｇの組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（ｐｒｏＢＮＰ）を各トラックにロードした。
【００５７】
電気泳動の後、ペプチドをニトロセルロースメンブラン（Trans-BlotR転写メンブラン、０．２μｍ、BioRad製）に転写した。転写は、一定電圧（１００Ｖ）で４０分間行った。非特異的な結合は、メンブランを無脂肪乾燥ミルクの１０％ＰＢＳＴ溶液中でインキュベートすることでブロックした。西洋ワサビパーオキシダーゼに結合したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ特異的ＭＡｂによるペプチドの免疫化学染色は、無脂肪乾燥ミルクの１０％ＰＢＳＴ溶液中、＋４℃で１２時間行った。免疫複合体は、ジアミノベンジジンと塩化ニッケルを含む基質溶液とインキュベートすることで可視化した。
【００５８】
内因性タンパク質を含むトラックにおいては、試験したいかなるモノクローナル抗体も、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと同じ分子量を有するタンパク質バンドを認識することはなかった（図５）。ＭＡｂ １５Ｆ１１（エピトープ１３〜２４）で試験すると、１５ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質に対応する範囲内のいくつかの拡散ゾーンにおいて免疫反応性タンパク質が検出された。ＭＡｂ １５Ｆ１１とは対照的に、内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、アミノ酸残基３１〜３９領域に特異的なＭＡｂ １１Ｄ１では染色されなかった。これらのデータは、１１Ｄ１はヒト血漿中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを稀にしか検出しないという実施例７に記載したＩＦＡの結果と一致する。
【００５９】
ウエスタンブロッティング研究における、ＭＡｂ １５Ｆ１１によって染色される種々の拡散ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰゾーンの存在は、ヒト血液中を循環しているＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子のグリコシル化によって説明することができる。
【００６０】
実施例１１： 脱グリコシル化内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのサンドイッチＩＦＡによる試験
プールしたヒト血漿から抽出したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを、脱グリコシル化酵素であるＯ−グリコシダーゼ（S. pneumoniae）およびシアリダーゼ（A. ureafaciens）（米国、QA-Bio製）で処理した。処理は、０．０７５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を含む緩衝液中、＋３７℃で１時間行った。陰性の対照としては、酵素を含まない０．０７５ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）水溶液を検討するペプチドに添加した。
【００６１】
脱グリコシル化後、実施例７と同様に、分子の異なる部分に特異的なＭＡｂを使用した免疫アッセイで内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを試験した。
【００６２】
分子の中央部分に特異的なＭＡｂを用いるアッセイで測定した免疫活性は、脱グリコシル化後に顕著に増加した（図６）。ＭＡｂ ５Ｄ３28-45、１１Ｄ１31-39、５Ｅ２31-39、１６Ｅ６34-39を使用したアッセイにおいて、シグナル値は７．５〜１０倍に増加した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域４６〜５６に特異的なＭＡｂ １５Ｄ７48-56と１６Ｄ１０48-56については、免疫活性は約５０倍に増加した。図６に示した結果は、内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（処理済または未処理）／組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのシグナル比（％）で表されており、ＭＡｂ １５Ｃ４−１３Ｇ１２を用いたアッセイで得られた内因性脱グリコシル化体／組み換え体のシグナル比を１００％とした値である。
【００６３】
この結果、我々はＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央部分がグリコシル化されており、多糖残基が抗体と内因性抗原との相互作用を妨げていることを示した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央部分に特異的な抗体は内因性抗原を認識することができないので、グリコシル化による影響を受けない他の領域に特異的なＭＡｂをＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰのアッセイに使用すべきである。
【００６４】
実施例１２： 脱グリコシル化前後の内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのゲル濾過による研究
Ｏ−グリコシダーゼおよびシアリダーゼで処理済および未処理のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰをゲル濾過（ＧＦ）法で研究した。プールしたＨＦ患者の血漿から抽出したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを酵素で処理し、その後、画分中の免疫活性を免疫アッセイ１５Ｃ４−１３Ｇ１２と１１Ｄ１−１３Ｇ１２の２種で決定した。実施例１１に示したデータによると、アッセイ１５Ｃ４−１３Ｇ１２はグリコシル化に対して非感受性であり、一方、１１Ｄ１−１３Ｇ１２アッセイは、炭水化物構造の除去後にのみ内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを検出することができる。
【００６５】
以下のａ）〜ｄ）： ａ）プールしたＨＦ患者の血漿から抽出した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ｂ）プールしたＨＦ患者の血漿から、脱グリコシル化後に抽出した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ｃ）組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびｄ）組み換えｐｒｏＢＮＰのそれぞれのサンプルを、同じ濃度（３３０ｎｇ／ｍｌ）となるように、０．７ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．００５ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡおよび５ｇ／Ｌのウシ血清アルブミンを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を１５０μｌ用いて復元した。０．７ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌおよび０．００５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で平衡化したスーパーデックス７５ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラムにサンプルをアプライした。タンパク質を流速０．７ｍｌ／分で溶出し、容積０．５ｍｌの画分を回収した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの免疫活性を、グリコシル化に非感受性のモノクローナル抗体を使用したサンドイッチ免疫アッセイ１５Ｃ５−１３Ｇ１２、およびグリコシル化内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと相互作用しない１１Ｄ１−１３Ｇ１２アッセイで測定した。
【００６６】
以下の一群の標準タンパク質を用いて、カラムを校正した： アルブミン（Ｍｒ ６７０００Ｄａ）、オブアルブミン（Ｍｒ ４３０００Ｄａ）、キモトリプシノーゲン（Ｍｒ ２５０００Ｄａ）、リボヌクレアーゼＡ（Ｍｒ １３７００Ｄａ）およびアプロチニン（Ｍｒ ６５１７．５Ｄａ）。スーパーデックス７５カラムにロードする前に、組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと組み換えｐｒｏＢＮＰは健康なドナーからプールした血漿で復元した。
【００６７】
１５Ｃ４−１３Ｇ１２免疫アッセイで測定したところ、内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは２つの免疫反応性のピークを示し（図７）、主要なものは分子量が約２８ｋＤａのピークであり、小さなものは分子量が約５１ｋＤａのピークだった。脱グリコシル化後には、免疫活性を示す両方のピークがより低い分子量のタンパク質側にシフトするのが観察された。主要なピークは分子量が約１８ｋＤａのタンパク質に相当し、小さなピークは分子量が約５１ｋＤａのタンパク質に相当した。
【００６８】
１１Ｄ１−１３Ｇ１２免疫アッセイ（グリコシル化に感受性の抗体１１Ｄ１を使用）で測定したところ、内因性のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰはほとんど応答しなかったものの、脱グリコシル化タンパク質については、顕著な応答が観察された。免疫反応性のプロファイルは、１５Ｃ４−１３Ｇ１２免疫アッセイで測定したプロファイルと非常に類似していた。
【００６９】
実施例１３： ウエスタンブロッティングにおける、アフィニティ精製した（脱グリコシル化前後の）内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ特異的モノクローナル抗体による免疫化学染色
電気泳動とウエスタンブロッティングを実施例１０の記載と同様に実施した。
【００７０】
ここでは、脱グリコシル化前のサンプル中のタンパク質の可視化に、ＭＡｂ １５Ｆ１１（エピトープ１３〜２４）を使用した。主要な免疫活性は、約１５ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質に対応する範囲内のいくつかの拡散ゾーンから検出された。ＭＡｂ １５Ｆ１１とは異なり、内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、アミノ酸残基３１〜３９領域に特異的なＭＡｂ １１Ｄ１では染色されなかった。脱グリコシル化後には、両方の抗体が見かけの分子量が約１３ｋＤａのペプチドを検出することができた。このバンドが組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰバンドの少し上に位置することは、脱グリコシル化が不完全であったという事実によって説明することができる。
【００７１】
我々は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の中央領域に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング実験では内因性タンパク質を検出することはできないが、脱グリコシル化後には、このような抗体によって「可視化」できると結論付けた。
【００７２】
参考文献
１． Mair J, Hammerer-Lercher A, Puschendorf B. The impact of cardiac natriuretic peptide determination on the diagnosis and management of heart failure. Clin. Chem. Lab. Med. 2001; 39:571-88.
２． Cowie MR, Mendez GF. BNP and congestive heart failure. Prog. Cardiovasc. Dis. 2002; 44:293-321.
３． Pandey KN. Biology of natriuretic peptides and their receptors. Peptides 2005; 26:901-932.
４． Hunt PJ, Espiner EA, Nicholls MG, Richards AM, Yandle TG. The role of the circulation in processing pro-brain natriuretic peptide (proBNP) to amino-terminal BNP and BNP-32. Peptides 1997; 18:1475-1481.
５． Hughes D, Talwar S, Squire IB, Davies JE, Ng LL. An immunoluminometric assay for N-terminal pro-brain natriuretic peptide: development of a test for left ventricular dysfunction. Clin. Sci. (Lond) 1999; 96:373-380.
６． Karl J, Borgya A, Gallusser A, et al. Development of a novel, N-terminal-proBNP (NT-proBNP) assay with a low detection limit. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1999; 230:177-181.
７． Giuliani I, Rieunier F, Larue C, et al. Assay for measurement of intact B-type natriuretic peptide prohormone in blood. Clin. Chem. 2006; 52:1054-1061.
８． Seidler T, Pemberton C, Yandle T, Espiner E, Nicholls G, Richards M. The amino terminal regions of proBNP and proANP oligomerise through leucine zipper-like coiled-coil motifs. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 255:495-501.
９． Crimmins DL. Human N-terminal proBNP is a monomer. Clin. Chem. 2005; 51:1035-1038.
１０． Schagger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 1987; 166:368-379.
【００７３】
添付の図面は本発明の説明を容易にするために提供するものであり、それは以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本願で使用したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ特異的モノクローナル抗体のエピトープマップ。
【図２】内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（ＨＦ患者の血漿由来の抗原）に対する種々のＭＡｂの特異性。結果は、２つの部位に対するＭＡｂの種々の組み合わせにおける、血漿シグナル値と組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ標準物質のシグナル値の比として表した。このような組み合わせにおいては、１種のＭＡｂを内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと効果的に相互作用することができるもの（ＭＡｂ ２４Ｅ１１、エピトープ６７〜７６またはＭＡｂ １３Ｇ１２、エピトープ１３〜２０）とし、もう１種のＭＡｂを、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の異なる領域に特異的な一群の抗体から選んだものとした。組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの濃度は、１５Ｃ４−１３Ｇ１２アッセイで決定したＨＦ患者血漿の内因性抗原濃度と同じだった。
【図３】アッセイ１５Ｃ４−１３Ｇ１２の検量曲線と、２つの個別の血漿サンプルの希釈曲線。組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（大腸菌で発現、HyTest製）をプールした正常ヒト血漿で復元したものを検量物質として用いた。
【図４】ＨＦ患者の４つの血漿サンプルのゲル濾過（スーパーデックス７５ １０／３００ ＧＬカラム）による研究結果。画分中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ免疫反応性は、内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを認識するモノクローナル抗体である１５Ｃ４（エピトープ６３〜７１）と１３Ｇ１２（エピトープ１３〜２０）を用いたサンドイッチ免疫アッセイで定量した。
【図５】アフィニティ精製した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのウエスタンブロッティング研究の結果。トラック１，４： 組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（５０ｎｇ／トラック）、トラック２，５： 組み換えｐｒｏＢＮＰ（５０ｎｇ／トラック）、トラック３，６： ヒト血漿から精製した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（２００ｎｇ／トラック）。免疫染色には、ＭＡｂ １５Ｆ１１（エピトープ１３〜２４）をトラック１〜３に、ＭＡｂ １１Ｄ１（エピトープ３１〜３９）をトラック４〜６に使用した。
【図６】内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（黒いカラム）または脱グリコシル化（Ｏ−グリコシダーゼとシアリダーゼ処理）後の内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（灰色のカラム）に対する、種々のモノクローナル抗体の特異性。結果は、２つの部位に対するＭＡｂの種々の組み合わせで得られるシグナル比（内因性／組み換え体）で表した。３つの型のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、即ち、ａ）組み換え体（非グリコシル化）、ｂ）ＨＦ患者血漿から抽出した内因性のもの、およびｃ）血漿から抽出し、酵素処理した内因性のもの、を同じ濃度で使用し、種々のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ免疫アッセイで試験した。この免疫アッセイにおいては、１種のＭＡｂをグリコシル化の影響を受けないエピトープに特異的なもの（ＭＡｂ ２４Ｅ１１，エピトープ６７〜７６またはＭＡｂ １３Ｇ１２，エピトープ１３〜２０）とし、もう１種は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子の他の領域に特異的な一群の抗体から選んだものとした。
【図７】血漿から抽出した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（実線）とＯ−グリコシダーゼおよびシアリダーゼで処理した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（点線）のゲル濾過（スーパーデックス７５ １０／３００ ＧＬカラム）による研究の結果。画分中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの免疫反応性は、２種のサンドイッチ免疫アッセイ、即ち、１５Ｃ４−１３Ｇ１２（黒い三角）および１１Ｄ１−１３Ｇ１２（黒い四角）で定量した。免疫アッセイ１５Ｃ４−１３Ｇ１２はグリコシル化に感受性ではない。免疫アッセイ１１Ｄ１−１３Ｇ１２はグリコシル化に感受性である。
【図８】脱グリコシル化前後のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアフィニティ精製標品に関するウエスタンブロッティング研究の結果。トラック１，５： 組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（大腸菌，トラック当たり５０ｎｇ）、トラック２，６： 組み換えｐｒｏＢＮＰ（大腸菌，トラック当たり５０ｎｇ）、トラック３，７： アフィニティ精製した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（トラック当たり２００ｎｇ）、トラック４，８： 脱グリコシル化後にアフィニティ精製した内因性ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（トラック当たり２００ｎｇ）。ＭＡｂ １５Ｆ１１（エピトープ１３〜２４）をトラック１〜４、またはＭＡｂ １１Ｄ１（エピトープ３１〜３９）をトラック５〜８の抗原免疫染色に使用した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を特異的に認識するが、脱グリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは脱グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片は認識しない抗体またはその断片。
【請求項２】
内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を認識し、該認識における親和性は、対応する脱グリコシル化タンパク質もしくはその断片に対する親和性よりも高いことを特徴とする、抗体またはその断片。
【請求項３】
請求項１または２の抗体と同じ特異性を有するアプタマー。
【請求項４】
モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片であることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項５】
ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体断片であることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
組み換え抗体または組み換え抗体断片であることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項７】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片の定性的または定量的な検出のために、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体またはその断片を用いる診断的免疫アッセイ方法。
【請求項８】
患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片をアッセイするための診断方法であって、請求項１または２の抗体あるいは請求項３のアプタマーを用いて、サンプルのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含量またはｐｒｏＢＮＰ含量を定量的または半定量的に決定することを包含する方法。
【請求項９】
脊椎動物の血液から単離した内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ標品またはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ標品を標準物質として用いて検量曲線を作製することを更に包含する、請求項８に記載の診断方法。
【請求項１０】
標準曲線を作製し、決定したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含量値またはｐｒｏＢＮＰ含量値を標準曲線と比較することを更に包含する、請求項９に記載の診断方法。
【請求項１１】
診断方法が免疫アッセイ方法であることを特徴とする、請求項８に記載の診断方法。
【請求項１２】
免疫アッセイ方法が、第１の捕捉抗体と第２の検出抗体を使用するサンドイッチ免疫アッセイ方法であることを特徴とする、請求項１１に記載の診断方法。
【請求項１３】
患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰをアッセイするための診断方法であって、
（ａ） サンプルに含まれる内因性のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰを脱グリコシル化し、そして
（ｂ） ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰに特異的な抗体またはアプタマーを用いて、サンプルのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含量またはｐｒｏＢＮＰ含量を決定する
ことを包含する方法。
【請求項１４】
グリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を含む、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰの標準物質または検量物質。
【請求項１５】
脊椎動物の血液から単離した、内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片。
【請求項１６】
グリコシル化した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは組み換えｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片。
【請求項１７】
該グリコシル化がin vitroでのグリコシル化であることを特徴とする、請求項１６に記載のグリコシル化した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは組み換えｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片。
【請求項１８】
培養細胞系または細胞を含まない翻訳系で製造したことを特徴とする、請求項１６に記載のグリコシル化した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは組み換えｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれかの分子を抗原として用いることを包含する、請求項１または２の抗体と同じ特異性を有する抗体を製造するための方法。
【請求項２０】
患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片の診断アッセイを行うための免疫アッセイ用キットであって、以下の（ａ）〜（ｃ）を含むキット。
（ａ） 請求項１または２の抗体と同じ特異性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、
（ｂ） 検出可能な標識、および
（ｃ） 請求項１４の標準物質または検量物質。
【請求項２１】
患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片の診断アッセイを行うための免疫アッセイ用キットであって、以下の（ａ）〜（ｃ）を含むキット。
（ａ） 請求項１または２の抗体と同じ特異性を有する第１のモノクローナル捕捉抗体、
（ｂ） 請求項１または２の抗体と同じ特異性を有し、蛍光標識されている第２のモノクローナル検出抗体、および
（ｃ） 請求項１４の標準物質または検量物質。
【請求項１】
内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を特異的に認識するが、脱グリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは脱グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片は認識しない抗体またはその断片。
【請求項２】
内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を認識し、該認識における親和性は、対応する脱グリコシル化タンパク質もしくはその断片に対する親和性よりも高いことを特徴とする、抗体またはその断片。
【請求項３】
請求項１または２の抗体と同じ特異性を有するアプタマー。
【請求項４】
モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片であることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項５】
ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体断片であることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
組み換え抗体または組み換え抗体断片であることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項７】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片の定性的または定量的な検出のために、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体またはその断片を用いる診断的免疫アッセイ方法。
【請求項８】
患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片をアッセイするための診断方法であって、請求項１または２の抗体あるいは請求項３のアプタマーを用いて、サンプルのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含量またはｐｒｏＢＮＰ含量を定量的または半定量的に決定することを包含する方法。
【請求項９】
脊椎動物の血液から単離した内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ標品またはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ標品を標準物質として用いて検量曲線を作製することを更に包含する、請求項８に記載の診断方法。
【請求項１０】
標準曲線を作製し、決定したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含量値またはｐｒｏＢＮＰ含量値を標準曲線と比較することを更に包含する、請求項９に記載の診断方法。
【請求項１１】
診断方法が免疫アッセイ方法であることを特徴とする、請求項８に記載の診断方法。
【請求項１２】
免疫アッセイ方法が、第１の捕捉抗体と第２の検出抗体を使用するサンドイッチ免疫アッセイ方法であることを特徴とする、請求項１１に記載の診断方法。
【請求項１３】
患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰをアッセイするための診断方法であって、
（ａ） サンプルに含まれる内因性のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰを脱グリコシル化し、そして
（ｂ） ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰに特異的な抗体またはアプタマーを用いて、サンプルのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含量またはｐｒｏＢＮＰ含量を決定する
ことを包含する方法。
【請求項１４】
グリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片を含む、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰの標準物質または検量物質。
【請求項１５】
脊椎動物の血液から単離した、内因性のグリコシル化ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはグリコシル化ｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片。
【請求項１６】
グリコシル化した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは組み換えｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片。
【請求項１７】
該グリコシル化がin vitroでのグリコシル化であることを特徴とする、請求項１６に記載のグリコシル化した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは組み換えｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片。
【請求項１８】
培養細胞系または細胞を含まない翻訳系で製造したことを特徴とする、請求項１６に記載のグリコシル化した組み換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは組み換えｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれかの分子を抗原として用いることを包含する、請求項１または２の抗体と同じ特異性を有する抗体を製造するための方法。
【請求項２０】
患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片の診断アッセイを行うための免疫アッセイ用キットであって、以下の（ａ）〜（ｃ）を含むキット。
（ａ） 請求項１または２の抗体と同じ特異性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、
（ｂ） 検出可能な標識、および
（ｃ） 請求項１４の標準物質または検量物質。
【請求項２１】
患者から得たサンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ、もしくはそれらの断片の診断アッセイを行うための免疫アッセイ用キットであって、以下の（ａ）〜（ｃ）を含むキット。
（ａ） 請求項１または２の抗体と同じ特異性を有する第１のモノクローナル捕捉抗体、
（ｂ） 請求項１または２の抗体と同じ特異性を有し、蛍光標識されている第２のモノクローナル検出抗体、および
（ｃ） 請求項１４の標準物質または検量物質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５３８２８８（Ｐ２００９−５３８２８８Ａ）
【公表日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１１５３９（Ｐ２００９−５１１５３９）
【出願日】平成１９年５月２５日（２００７．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００７／０５０２９８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３８１６３
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３４７５７９）
【氏名又は名称原語表記】ＨＹＴＥＳＴ ＬＴＤ．
【出願人】（５０８３４７５８０）
【出願人】（５０８３４７５９１）
【出願人】（５０８３４７６０５）
【出願人】（５０８３４７６１６）
【出願人】（５０８３４７６２７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２５日（２００７．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００７／０５０２９８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３８１６３
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３４７５７９）
【氏名又は名称原語表記】ＨＹＴＥＳＴ ＬＴＤ．
【出願人】（５０８３４７５８０）
【出願人】（５０８３４７５９１）
【出願人】（５０８３４７６０５）
【出願人】（５０８３４７６１６）
【出願人】（５０８３４７６２７）
【Ｆターム（参考）】
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