ＰＤＧＦの制御放出のためのフィブリンゲルおよびその使用
本発明は、全般には、筋骨格障害、軟部組織障害および血管疾患などの治療用途に向けた、ｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出のための血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含有するフィブリンシーラントに関する。さらに、本発明は、シーラントを製剤するために使用されるフィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分の含有量を加減することによりフィブリンシーラントからのＰＤＧＦタンパク質の放出を加減する方法も提供する。状態または障害の治療のためには、フィブリンシーラントから一旦放出されたＰＤＧＦがその生物学的活性を保持することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでその期待される生物学的活性を当該ＰＤＧＦが媒介できるようにすることが企図される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／９３６，１９８号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、全般には、筋骨格疾患および血管疾患などの治療用途に向けた、可逆的結合によるｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出のための血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含有するフィブリンシーラントに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
フィブリンシーラントは、ヒトの血液凝固タンパク質で作製され、出血を制御するために外科手術中に典型的に使用される一種の外科手術用の「糊」である。こうしたシーラント中の成分は、施用中に相互作用して、血液タンパク質のフィブリンから構成される安定な凝血塊を形成する。フィブリンシーラントは、以下のようないくつかの異なる目的で、現在外科手術中に使用されている：外科医が手術している領域において出血を制御すること、創傷治癒を促進すること、中空の体器官を閉鎖し、または標準的な縫合糸によりできた孔を覆うこと、外科手術中に露出した組織への医薬の徐放送達をもたらすこと。
【０００４】
フィブリンシーラントは、一般に、以下の２つのヒト血漿由来成分から成る：（ａ）フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンで主に構成され、触媒量の第ＸＩＩＩ因子およびプラスミノーゲンを添加された高濃度のフィブリノーゲン複合体（ＦＣ）、ならびに（ｂ）強力なトロンビン。フィブリンシーラントは、アプロチニンを含有してもよい。トロンビンの作用により、まず（可溶性の）フィブリノーゲンがフィブリンモノマーに変換されるが、これが自然に凝集して、いわゆるフィブリン塊を形成する。同時に、この溶液中に存在する第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）がカルシウムイオンの存在下でトロンビンにより活性化されて第ＸＩＩＩａ因子となる。凝集したフィブリンモノマーと、存在する可能性がある残存フィブロネクチンとが架橋して、新しいペプチド結合が形成されることにより高重合体が形成される。この架橋反応により、形成される凝血塊の強度は実質的に高まる。一般に、凝血塊は、創傷および組織の表面に良好に付着し、このことが接着および止血の効果につながる。（特許文献１）。そのため、フィブリン接着剤は、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分と、カルシウムイオンを追加的に含有するトロンビン成分とを共に含む２成分接着剤として使用されることが多い。
【０００５】
フィブリンシーラントの格別な利点は、接着剤／ゲルは異物としてその施用部位に残るのではなく、自然な創傷治癒におけるのと全く同じように完全に再吸収され、新しく形成される組織で置き換わられることである。多様な細胞、例えば、マクロファージ、および、次いで線維芽細胞がゲル中に遊走し、ゲルの材料を溶解および再吸収して新しい組織を形成する。フィブリンシーラントは、ｉｎ ｓｉｔｕでフィブリンゲルを形成するために使用されており、こうしたフィブリンゲルは、細胞および成長因子の送達に使用されている（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００６】
組織修復のためには、フィブリンゲルなどのマトリックス中に成長因子および細胞を局在させることが望ましい。例えば、フィブリンゲルは、ウシ胎仔血清、サンゴ顆粒およびリポソームなどの多様な複合混合物の形態で、ＴＧＦ−βの送達のために使用されている（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。フィブリンゲルから成長因子を送達するための代替手段には、成長因子に結合されるトランスグルタミナーゼ基質、抗体およびＶＥＧＦ断片を含むコンジュゲートが含まれる（例えば、特許文献２、特許文献３および特許文献４を参照、これらは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。さらに、創傷治癒を促進するための薬物送達マトリックスについて記載された特許文献４も参照。加えて、フィブリンゲルは、細胞の成長（例えば、ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ））および増殖のみならず、マトリックス中でのＦＣおよびトロンビンの濃度によっては骨形成分化もある程度誘導することが示されている（非特許文献７）。
【０００７】
フィブリンシーラントが成長因子を体内の特定の部位に送達する能力は有益である可能性があるが、組織の適切な再成長には、適切な処理が確実に行われるように、当該部位へ特定の速度で送達される成長因子またはサイトカインが継続的／安定的に供給されることが必要である場合が多い。このことは、治療用タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が短い場合に特に当てはまる。現在使用されているフィブリンシーラントにより、中に入れてある薬物または薬剤を遅延放出させることはいくらか可能ではあるが、シーラント中に薬剤がとどまる期間を延ばすことができれば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける長期の組織修復が改善されると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，２４１，６０３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５０６，３６５号明細書
【特許文献３】米国特許第６，７１３，４５３号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／００１２８１８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｏｘら、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ、１０巻、９４２〜９５４頁、２００４年
【非特許文献２】Ｗｏｎｇら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ、８９巻、５７３〜５８２頁、２００３年
【非特許文献３】Ｆｏｒｔｉｅｒら、Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ、５８巻（１号）、６６〜７０頁、１９９７年
【非特許文献４】Ａｒｎａｕｄら、Ｃｈｉｒｕｒｇｉｅ Ｐｌａｓｔｉｑｕｅ Ｅｓｔｈｅｔｉｑｕｅ、３９巻（４号）、４９１〜４９８頁、１９９４年
【非特許文献５】Ａｒｎａｕｄら、Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ、５４巻、４９３〜４９８頁、１９９４年
【非特許文献６】Ｇｉａｎｎｏｎｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８３巻（１号）、１２１〜１２３頁、２００３年
【非特許文献７】Ｃａｔｅｌａｓら、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ、１２巻、２３８５〜２３９６頁、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、当技術分野では、多様な状態および障害の治療のためにｉｎ ｖｉｖｏで成長因子を送達するための有効な手段を開発する必要性、フィブリンゲルから成長因子を制御放出するための改善された方法を開発する必要性が、今も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの制御放出（成長因子の可逆的結合により）のための血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含むフィブリンシーラントの組成物を提供する。さらに、本発明は、シーラントを製剤するために使用されるフィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分の含有量を加減することによりフィブリンシーラントからのＰＤＧＦタンパク質の放出を加減する方法も提供する。状態または障害の治療のためには、フィブリンシーラントから一旦放出されたＰＤＧＦがその生物学的活性を保持することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでその期待される生物学的活性を当該ＰＤＧＦが媒介できるようにすることが企図される。
【００１２】
一態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質の、ＦＣ成分、トロンビン成分およびＰＤＧＦ成分の混合により作製されるフィブリンシーラントからの放出を加減する方法であって、ａ）公知の初期量のＰＤＧＦと公知の最終濃度のＦＣとを有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＰＤＧＦの量を定量することと、ｂ）ステップ（ａ）の該第１のフィブリンシーラント中で使用されるＦＣの該公知の最終濃度を加減して、第２のフィブリンシーラントであり、該第２のシーラント中のＦＣの濃度を該第１のシーラント中のＦＣの該公知の最終濃度と比較して高くすることにより、該第２のシーラントからのＰＤＧＦの放出速度がステップ（ａ）の該第１のシーラントからのＰＤＧＦの放出と比較して減少し、かつ、ステップ（ａ）における該第１のシーラントと同じ初期量のＰＤＧＦを有する第２のフィブリンシーラントを作製することとを含む方法を提供する。
【００１３】
関連する一態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択されるＰＤＧＦタンパク質の、ＦＣ成分、トロンビン成分およびＰＤＧＦ成分の混合により作製されているフィブリンシーラントからの放出を加減する方法であって、ａ）公知の初期量のＰＤＧＦと公知の最終濃度のＦＣとを有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＰＤＧＦの量を定量することと、ｂ）ステップ（ａ）の該第１のフィブリンシーラント中で使用されるＦＣの該公知の最終濃度を加減して、第２のフィブリンシーラントであり、該第２のシーラント中のＦＣの濃度を該第１のシーラント中のＦＣの該公知の最終濃度と比較して低くすることにより、該第２のシーラントからのＰＤＧＦの放出速度がステップ（ａ）の該第１のシーラントからのＰＤＧＦの放出と比較して増加し、かつ、ステップ（ａ）における該第１のシーラントと同じ初期量のＰＤＧＦを有する第２のフィブリンシーラントを作製することとを含む方法を提供する。
【００１４】
一実施形態では、第１または第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度は、約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内である。関連する一実施形態では、第１または第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度は、約５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
【００１５】
別の実施形態では、第１のフィブリンシーラント中の最終のＦＣ濃度は、第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度とは約１ｍｇ／ｍｌから約１４９ｍｇ／ｍｌ異なることが企図される。さらなる一実施形態では、第１のフィブリンシーラント中の最終のＦＣ濃度は、第２のシーラント中のＦＣ濃度とは約５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌ異なる。さらに別の実施形態では、第１のフィブリンシーラント中の最終のＦＣ濃度は、第２のシーラント中のＦＣ濃度とは、約１０ｍｇ／ｍｌから約６０ｍｇ／ｍｌ異なる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、第１または第２のシーラント中のトロンビン成分の最終濃度は、約１ＩＵ／ｍｌから２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内であることが企図される。別の実施形態では、第１または第２のシーラント中のＰＤＧＦの最終濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００１７】
別の態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択されるＰＤＧＦタンパク質の制御放出を必要とする患者において該タンパク質を制御放出する方法であって、前記患者に、ＰＤＧＦを含むフィブリンシーラントであり、該ＰＤＧＦの少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持されるフィブリンシーラントを投与することを含む方法を企図する。
【００１８】
関連する一態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択されるＰＤＧＦタンパク質の制御放出を必要とする患者において該タンパク質を制御放出する方法であって、前記患者に、ＰＤＧＦを含むフィブリンシーラントであり、該ＰＤＧＦの少なくとも２０％が該フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持されるフィブリンシーラントを投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
フィブリンシーラントから放出されたＰＤＧＦは生物学的に活性であることが企図される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも３５％から９０％が、フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される。関連する一実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも４５％から７５％が、フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される。さらなる一実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも６０％が、フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される。
【００２１】
別の実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも２５％から７５％が、フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される。関連する一実施形態では、前記ＰＤＧＦの少なくとも４５％から５５％が、フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される。
【００２２】
関連する一実施形態では、このフィブリンシーラントは、３日間または１０日間のいずれかまたは両方の期間にわたって前述の範囲の放出動態を有していてもよいことが企図される。
【００２３】
一実施形態では、このフィブリンシーラントは、ＦＣ成分とトロンビン成分とを合わせて混合物にすることにより作製される。別の実施形態では、ＰＤＧＦは、ＦＣ成分をトロンビン成分と混合する前にＦＣ成分に加えられる。さらなる一実施形態では、ＰＤＧＦはトロンビン成分に加えられる。
【００２４】
関連する一実施形態では、ＰＤＧＦの放出量は、毎日決まった量ずつ減少してもよいことが企図される。例えば、フィブリンシーラント中のＰＤＧＦの量は、１日約１％ずつ、１日約２％ずつ、１日約３％ずつ、１日約４％ずつ、１日約５％ずつ、１日約６％ずつ、１日約７％ずつ、１日約８％ずつ、１日約９％ずつもしくは１日約１０％ずつ減少してもよく、または、所望の放出量を、フィブリンシーラントを製剤するために用いられるＦＣ濃度もしくはトロンビン濃度に基づいて調節してもよい。
【００２５】
本発明は、シーラント中のＦＣ成分の最終濃度が約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内であることを企図する。さらに、いくつかの実施形態では、シーラント中のトロンビン成分の最終濃度は、約１ＩＵ／ｍｌから２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内であることが企図される。一実施形態では、最終のＦＣ濃度は、約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌまたは約４０ｍｇ／ｍｌであり、最終のトロンビン濃度は約２ＩＵ／ｍｌである。
【００２６】
一実施形態では、シーラント中の最終のＰＤＧＦ濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである。
【００２７】
さらなる一実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＡＢであることが企図される。一実施形態では、前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも４０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される。さらなる一実施形態では、前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも８０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される。
【００２８】
関連する一実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢであることが企図される。一実施形態では、前記ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも５５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される。
【００２９】
さらなる一態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択されるＰＤＧＦタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出から利益を得る障害または疾患に罹患している患者を治療する方法であって、前記患者に、ＰＤＧＦタンパク質を含むフィブリンシーラントであり、該ＰＤＧＦの制御放出であり、該ＰＤＧＦの少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦが、前記障害または疾患を治療するのに有効な速度で放出される制御放出をもたらすフィブリンシーラントを投与することを含む方法を企図する。
【００３０】
さらなる一態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される生物活性を有するＰＤＧＦタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出から利益を得る障害または疾患に罹患している患者を治療する方法であって、前記患者に、該ＰＤＧＦタンパク質を含むフィブリンシーラントであり、該ＰＤＧＦの制御放出であり、該ＰＤＧＦの少なくとも２０％が該フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持され、前記ＰＤＧＦが、前記障害または疾患を治療するのに有効な速度で放出される制御放出をもたらすフィブリンシーラントを投与することを含む方法を企図する。
【００３１】
さらに、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択されるＰＤＧＦタンパク質を含み前述のようなＰＤＧＦの制御放出をもたらすフィブリンシーラントの、ＰＤＧＦタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出から利益を得る障害または疾患に罹患している患者を治療するための医薬の製造における使用も提供する。
【００３２】
本発明は、前述の放出動態が、ＰＤＧＦタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出から利益を得る患者を治療する方法、または、前記患者を治療するための医薬の製造におけるフィブリンシーラントの使用に適用可能であることを企図する。
【００３３】
一態様では、患者は、ＰＤＧＦのｉｎ ｖｉｖｏでの制御放出から利益を得る疾患に罹患しており、そのような疾患は当業者には明らかと考えられる。一実施形態では、疾患または障害は、筋骨格の疾患または障害、軟部組織の疾患または障害および心血管疾患から成る群から選択される。
【００３４】
一実施形態では、フィブリンシーラントは、注射、噴霧、内視鏡による投与または予め形成されたゲルなど当技術分野で周知の方法を、単独で、または他の材料と組み合わせて、さらには当業者に公知の他の方法を用いて、患者に投与される。
【００３５】
さらに、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される生物活性を有するＰＤＧＦタンパク質を含み所望のＰＤＧＦ放出速度を有するフィブリンシーラントを調製するためのキットであって、ａ）場合によりＰＤＧＦ成分を含む、ＦＣ成分を含有する第１のバイアルまたは第１の保存容器と、ｂ）トロンビン成分を有する第２のバイアルまたは第２の保存容器とを備え、前記第１のバイアルまたは第１の保存容器にＰＤＧＦ成分を含まない場合にはＰＤＧＦ成分を有する第３のバイアルまたは第３の保存容器を場合により含有し、該キットの使用のための取扱説明書をさらに含有するキットを提供する。このキットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの該フィブリンシーラントの使用または投与のための取扱説明書をさらに備えてもよい。
【００３６】
本発明が有する他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この詳細な説明および具体例は、本発明の具体的な実施形態を示すものではあっても、例証のためにのみ提供するものであることは理解されるべきであり、それは、この詳細な説明から、本発明の精神および範囲内での多様な変形および改変が当業者には明らかになると考えられるからである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＰＤＧＦ−ＡＢの量がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌおよび［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）からのその累積放出量に及ぼす効果を示すグラフである。
【図２】ＰＤＧＦ−ＢＢの量がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌおよび［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）からのその累積放出量に及ぼす効果を示すグラフである。
【図３】ＦＣ濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル（［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）からのＰＤＧＦ−ＡＢの１日の放出量（図３Ａ）および累積放出量（図３Ｂ）に及ぼす効果を示すグラフである。
【図４】ＦＣ濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル（［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）からのＰＤＧＦ−ＢＢの１日の放出量（図４Ａ）および累積放出量（図４Ｂ）に及ぼす効果を示すグラフである。
【図５】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄのロット番号がＰＤＧＦ−ＡＢの累積放出量に及ぼす効果を示すグラフである（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）。
【図６】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄのロット番号がＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出量に及ぼす効果を示すグラフである（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）。
【図７】ＰＤＧＦ−ＢＢの量がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨゲル（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌおよび［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）からのその累積放出量に及ぼす効果を示すグラフである。
【図８】ＦＣ濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨゲル（［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）からのＰＤＧＦ−ＢＢの１日の放出量（図８Ａ）および累積放出量（図８Ｂ）に及ぼす効果を示すグラフである。
【図９】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨのロット番号がＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出量に及ぼす効果を示すグラフである（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）。
【図１０】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲルから放出されたＰＤＧＦ−ＡＢが、単層中で７日まで培養されたＨＭＳＣの増殖に及ぼす効果を示すグラフである。
【図１１】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲルから放出されたＰＤＧＦ−ＢＢが、単層中で７日まで培養されたＨＭＳＣの増殖に及ぼす効果を示すグラフである。
【図１２】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲルから放出されたＰＤＧＦ−ＡＢがＡＬＰ活性に及ぼす効果を示すグラフである（増殖について正規化）。
【図１３】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲルから放出されたＰＤＧＦ−ＢＢがＡＬＰ活性に及ぼす効果を示すグラフである（増殖について正規化）。
【図１４】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄに由来するＦＣと相互作用するＰＤＧＦ−ＡＢ（図１４Ａ）およびＰＤＧＦ−ＢＢ（図１４Ｂ）のセンサーグラムである。図１４Ｃは、ＰＤＧＦ−ＡＢの、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄに由来するＦＣとの相互作用についての結合・解離速度定数の、グラフによる定量を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、筋骨格疾患、軟部組織障害および血管疾患の治療などの治療用途における、可逆的結合によるｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出のためのＰＤＧＦを含有するフィブリンゲルを提供する。本発明は、このゲルから放出されるＰＤＧＦがその生物学的活性を保持することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのフィブリンシーラントからの放出で所望の生物学的活性が調節されるようにすることを企図する。本発明は、さらに、所望のＰＤＧＦ放出動態を得るためのフィブリンシーラントを製剤するうえで有用なＦＣ成分またはトロンビン成分の濃度を定量する方法も提供する。
【００３９】
別に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。以下の参考文献から、当業者は、本発明において使用する用語の多くの一般定義を得られる：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（第２版、１９９４年）；ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８年）；ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ、第５版、Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１年）；ならびに、ＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１年）。
【００４０】
本明細書中で引用する刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それぞれ、参照により、本開示と矛盾しない範囲でその全体が組み込まれる。
【００４１】
本明細書中および添付の特許請求の範囲中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうでないことが文脈により明らかに述べられる場合を除いて複数形への言及も包含することを、ここに記しておく。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、以下の用語は、他に明記しない限り、それらが元来持つ意味を有する。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、用語「フィブリンシーラント」、「フィブリンゲル」、「フィブリン接着剤」、「フィブリン塊」または「フィブリンマトリックス」は互換的に使用され、細胞成長と、時間の経過に伴う生物活性材料の放出とのための足場として作用できる、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分とトロンビン成分とを少なくとも含む三次元のネットワークを指す。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、用語「制御放出」と「遅延放出」とは同じ意味を有し、フィブリンゲル中で薬剤（例えば成長因子）が保持されることを指す。制御放出は、拡散により、または、結合された成長因子が解離し、次いでそれがゲルから拡散することにより、成長因子の分泌／放出を低速化および安定化させることによるのみならず、マトリックスの分解および酵素的切断によるものでもある。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、「ｉｎ ｓｉｔｕでの形成」は、生理的温度で、および体内の注射部位での形成、または、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件でのフィブリンシーラントの形成のいずれかを指す。この用語は、フィブリンシーラント中での前駆体分子（投与前および投与時点では実質的に架橋していない）間の共有連結の形成を記載するために典型的に用いられる。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、「フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分」は、トロンビンと混合されると凝血塊様のフィブリンシーラントになるフィブリン／フィブリノーゲン溶液を指す。ＦＣは、フィブリノーゲンとフィブロネクチンとから主に構成され、触媒量のＦＸＩＩＩおよびプラスミノーゲンを含有してもよい。ＦＣ成分は、シーラータンパク質と呼ぶこともある。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、「トロンビン成分」は、結果として凝血塊様のフィブリンシーラントになるＦＣ成分と混合されるトロンビン溶液を指す。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、「血小板由来成長因子成分」または「ＰＤＧＦ成分」は、液状のフィブリンシーラントに加える、溶液形態の成長因子の添加物を指す。ＰＤＧＦ成分、ＦＣ複合成分およびトロンビン成分のそれぞれを別々に加えて、ＰＤＧＦを含むフィブリンシーラントを形成してもよい。場合により、ＰＤＧＦ成分は、トロンビン成分と混合する前に液体ＦＣ成分に、または、ＦＣ成分と混合する前にトロンビン成分に、加える。ＰＤＧＦ成分は、ＰＤＧＦ−ＡＢもしくはＰＤＧＦ−ＢＢのいずれか、または、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢの両方を含んでもよい。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、「組換えヒトＰＤＧＦ」は、組換えＤＮＡ技術により得られる組換えヒト血小板由来成長因子（ｒｈＰＤＧＦ）を指す。組換えヒトＰＤＧＦは、当技術分野で公知の任意の方法により作製してもよい。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、用語「生物活性を有する」または「生物学的に活性である」は、溶液中またはフィブリンシーラント中のタンパク質（例えばＰＤＧＦタンパク質）が、自然に発現する（すなわち、組換えにより発現するか、またはｉｎ ｖｉｖｏで発現するかいずれかの場合の）タンパク質と比較した場合に、同じまたは同様の生物学的活性を呈する生物学的特性を指す。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、「検出可能な部分」、「検出可能な標識」または「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的な手段により検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるような）、ビオチンストレプトアビジン、ジオキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ハプテン、および、当該タンパク質に対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質、または、標的と相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能な部分は、放射性、発色性または蛍光性のシグナルなど測定可能なシグナルを発することが多く、このシグナルを用いて、試料中の結合している検出可能な部分の量を定量化できる。
【００５２】
フィブリンシーラント
多くの形態のフィブリンがフィブリンシーラントとして使用可能である。フィブリンゲルは、自己血漿、クリオプレシピテート血漿（例えば、市販のフィブリン糊キット）、血漿から精製したフィブリノーゲン、ならびに、組換えフィブリノーゲンおよび第ＸＩＩＩａ因子から合成できる。こうした材料のそれぞれからは、生化学組成物中での差異が小さい本質的に類似したマトリックスが得られる（Ｓｉｅｒｒａ ＤＨ、Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ａｐｐｌ、７巻、３０９〜３５２頁、（１９９３年））。これらの材料間の類似性は、特異的な酵素的生物活性および全般的な治癒応答の両方において存在する。
【００５３】
本発明において有用なフィブリンゲルは、フィブリンシーラントから形成されるが、フィブリンシーラントは、２つの主要な成分、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）およびトロンビンから成る。ＦＣは、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンで主に構成され、触媒量のＦＸＩＩＩおよびプラスミノーゲンを含有してもよい。ＦＣ成分およびトロンビン成分は、一般にはヒト血漿に由来するが、組換え／遺伝子工学の手法によって作製してもよい。フィブリンシーラントの例は、ＵＳ５，７１６，６４５、ＵＳ５，９６２，４０５、ＵＳ６，５７９，５３７に記載があり、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨおよびＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄ（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア）が挙げられる。
【００５４】
フィブリンゲルを形成するためには、パッケージの取扱説明書に従ってまずＦＣを再構成、解凍または他の方式で調製し、必要に応じて、希釈緩衝液を用いてさらに希釈してから、この液体ＦＣに治療剤を加える。あるいは、治療剤は、トロンビン成分中に加えてもよい。大部分の市販のフィブリンシーラントは、アプロチニンなどのゲル溶解阻害薬を含んでおり、使用者の判断で、これをＦＣに加えてもよい。アプロチニンおよび他のゲル溶解阻害薬についての説明は、ＷＯ９９／１１３０１に示されている。トロンビン成分も、ＣａＣｌ２溶液を用いて再構成して液状にし、必要に応じて、希釈緩衝液を用いてさらに希釈する。トロンビン成分は、ＰＤＧＦをさらに含むＦＣ成分と混合してフィブリンゲルを形成することが企図される。アプロチニン成分を含まないフィブリンシーラントも設計されている（ＥＶＩＣＥＬ、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）。
【００５５】
組織接着剤として使用できるフィブリノーゲン含有調製品を作製する追加的な方法としては、それぞれ、クリオプレシピテートからの作製（場合により、エタノール、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、グリシンまたはβアラニンを用いた洗浄および沈降ステップをさらに伴う）、および、公知の血漿分画法の範囲内での血漿からの作製が挙げられる（例えば、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ」、１９８０年、Ｃｕｒｌｉｎｇ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、３〜１５頁、３３〜３６頁および５７〜７４頁、または、Ｂｌｏｍｂｃｋ Ｂ． ａｎｄ Ｍ．、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ」、Ａｒｋｉｖ Ｋｅｍｉ、１０巻、１９５９年、４１５頁ｆ．を参照）。フィブリンシーラントは、患者自身の血漿を用いて作製してもよい。例えば、ＣＲＹＯＳＥＡＬ（Ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｃｏｒｐ．、Ｒａｎｃｈｏ Ｃｏｒｄｏｖａ、ＣＡ）またはＶＩＶＯＳＴＡＴ（Ｖｉｖｏｌｕｔｉｏｎ Ａ／Ｓ、デンマーク）のフィブリンシーラント系は、患者の血漿から自己フィブリンシーラント成分の作製を可能にする。フィブリンシーラントの成分は、凍結乾燥されたもの、液体を急速冷凍したもの、または液体の形で入手できる。
【００５６】
所望の制御放出の型をもたらすために、フィブリンゲルの成分は、適切な濃度で加える。ＦＣ成分は、限定されるものではないが５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、最大１５０ｍｇ／ｍｌ（ゲル中の最終濃度）などさまざまな濃度で、または必要に応じ中間の濃度で、加えてもよい。さらに、そのような濃度のＦＣ成分は、限定されるものではないが１ＩＵ／ｍｌ、２ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ、７ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、１５ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、２５ＩＵ／ｍｌ、３０ＩＵ／ｍｌ、３５ＩＵ／ｍｌ、４０ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ、６０ＩＵ／ｍｌ、７０ＩＵ／ｍｌ、８０ＩＵ／ｍｌ、９０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、１２５ＩＵ／ｍｌ、１５０ＩＵ／ｍｌ、１７５ＩＵ／ｍｌ、２００ＩＵ／ｍｌ、２２５ＩＵ／ｍｌおよび２５０ＩＵ／ｍｌなど適切な任意の濃度、または必要に応じ中間の濃度のトロンビン成分と組み合わせてもよい。
【００５７】
治療剤用の制御放出系を作製するためにＰＤＧＦなどの薬剤をフィブリンシーラント組成物に加えることが企図される。ＰＤＧＦは、適切な遅延放出製剤をもたらす任意の濃度（ＰＤＧＦは１ｎｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍＬの範囲内）で加えてもよい。フィブリンシーラント中のＰＤＧＦの例示的な濃度としては、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
フィブリンシーラント中で使用されるＦＣまたはトロンビンの濃度は、フィブリンゲル中に加えたＰＤＧＦが数日から数週間かけて治療上有効量で放出されるような濃度であることが企図される。一態様では、ＰＤＧＦは、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日またはそれより長い期間、フィブリンゲルから放出される。
【００５９】
ＰＤＧＦは、持続する期間にわたりｉｎ ｓｉｔｕでＰＤＧＦが使用できるように、制御放出または遅延放出の様式でフィブリンシーラントから放出される。ＰＤＧＦの放出量は、毎日決まった量ずつ減少してもよく、例えば、ＰＤＧＦの濃度は、１日約１％、１日約２％、１日約３％、１日約４％、１日約５％、１日約６％、１日約７％、１日約８％、１日約９％または１日約１０％またはそれを超える濃度ずつ減少してもよいことが企図される。
【００６０】
関連する一実施形態では、フィブリンゲル中でＰＤＧＦの少なくとも２５％が少なくとも３日間保持されることが企図される。さらなる一実施形態では、フィブリンゲル中でＰＤＧＦの少なくとも３５％から９０％、少なくとも４５％から７５％、または少なくとも６０％が少なくとも３日間保持される。ＰＤＧＦの少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％または９０％がフィブリンゲル中で少なくとも３日間保持されることが、さらに企図される。
【００６１】
別の実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも２０％がフィブリンゲル中で少なくとも１０日間保持される。さらなる一実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも２５％から７５％、または４５％から５５％が少なくとも１０日間保持される。ＰＤＧＦの少なくとも２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％または７５％がフィブリンゲル中で少なくとも１０日間保持されることがさらに企図される。
【００６２】
本発明は、フィブリンシーラントの成分の濃度を加減することにより、所望の放出動態を有するフィブリンシーラントを製剤する方法を提供する。一態様では、この方法は、公知の初期量のＰＤＧＦと公知の最終濃度のＦＣとを有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＰＤＧＦの量を定量することと、ステップ（ａ）の第１のフィブリンシーラント中で使用されるＦＣの該公知の最終濃度を加減して、第２のフィブリンシーラントであり、該第２のシーラント中のＦＣの濃度を該第１のシーラント中のＦＣの該公知の最終濃度と比較して高めまたは低下させることにより、ステップの該第１のシーラントからのＰＤＧＦの放出と比較して該第２のシーラントからのＰＤＧＦの放出速度を調節し、ステップにおける該第１のシーラントと同じ初期量のＰＤＧＦを有する第２のフィブリンシーラントを作製することとを企図する。
【００６３】
一実施形態では、第１または第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度は、約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内である。関連する一実施形態では、第１のフィブリンシーラントのＦＣ濃度は、第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度とは約１ｍｇ／ｍｌから約１４９ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌ、または約１０ｍｇ／ｍｌから約６０ｍｇ／ｍｌ異なる。さらなる一実施形態では、第１のフィブリンシーラントの最終のＦＣ濃度は、第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度とは、約１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌまたはこれらの濃度の間の任意の量、最大約１４９ｍｇ／ｍｌ、異なる。
【００６４】
本発明において有用なフィブリンシーラントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用する目的で追加的な材料または薬剤と組み合わせてもよいことが企図される。そのような薬剤としては、限定されるものではないが以下のような追加的な治療剤が挙げられる：成長因子、サイトカイン、ケモカイン、血液凝固因子、酵素、ケモカイン、可溶性の細胞表面受容体、細胞接着分子、抗体、ホルモン、細胞骨格タンパク質、マトリックスタンパク質、シャペロンタンパク質、構造タンパク質、代謝タンパク質、およびそれ以外に当技術分野で公知のもの（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第６２版、２００８年、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪを参照）。
【００６５】
フィブリンシーラント中で有用な追加的な材料としては、筋骨格疾患用のシーラントと組み合わせることができると考えられる材料が挙げられ、そのような材料は、ポリマー、サンゴ、セラミックス、ガラス、金属、骨由来材料、ヒドロキシアパタイト、合成の足場材料、こうした材料の組合せ、および当技術分野で公知の他の材料を非限定的に含む耐荷重材料であってもよい（例えば、Ｇｕｅｈｅｎｎｅｃら、（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、８巻、１〜１１頁、２００４年）、米国特許第７，１２２，０５７号および米国特許第６，６９６，０７３号を参照）。
【００６６】
一実施形態では、このフィブリンゲルは、可逆的結合後、ならびに、ＦＣおよびトロンビンの濃度を調節することにより制御された様式で、生物学的に活性であるＰＤＧＦを送達するための担体系として使用できる。
【００６７】
本発明の一実施形態では、５ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を使用してＴＩＳＳＥＥＬ Ｖａｐｏｒ Ｈｅａｔｅｄ Ｓｏｌｖｅｎｔ／Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ（ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄ）でフィブリンゲルを作製すると、添加したＰＤＧＦ−ＢＢ（１５ｎｇ）の少なくとも約６５％がゲル中で３日後保持される。本発明の別の実施形態では、４０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を使用してＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄでフィブリンゲルを作製すると、添加したＰＤＧＦ−ＢＢ（１５ｎｇ）の少なくとも約８５％がゲル中で３日後保持される。したがって、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄで作製したフィブリンゲルを用いた場合、ＰＤＧＦ−ＢＢの保持期間は、ＦＣ濃度が高くなるにつれ長くなる。
【００６８】
本発明の別の実施形態では、２０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を使用して、異なるロット番号のＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨでフィブリンゲルを作製すると、１つのロットに由来するゲル中ではＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約７０％、第２のロットに由来するゲルでは約６０％、第３のロットに由来するゲルでは約４０％が、１０日後保持される。これらのロット間の１つの違いは、第ＸＩＩＩ因子の含有量である（それぞれ、４２．２Ｕ／ｍｌ、３３．９Ｕ／ｍｌおよび＜１Ｕ／ｍｌ）。本発明の別の実施形態では、２０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を使用して、異なるロット番号のＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄでフィブリンゲルを作製すると、全てのロットに由来するゲル中で、１０日後ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約６０％が保持される。ＰＤＧＦ−ＡＢ放出については、３つのロットのうち２つにおいて１０日目まで少なくとも約７５％が保持され、第３のロットにおいては約６８％の成長因子が１０日間保持された。
【００６９】
前述の実施形態は、市販のフィブリンシーラントからのＰＤＧＦ放出の例示的な実施形態であって、決して本発明を限定することを意図するものではないことは、当業者には理解されよう。
【００７０】
ＰＤＧＦタンパク質
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、創傷および骨折の治癒の初期段階中に血小板により分泌される。ＰＤＧＦは、骨芽細胞および間葉系前駆細胞の遊走を刺激することが示されている（Ｍｅｈｒｏｔｒａら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、９３巻、７４１〜５２頁、２００４年；Ｆｉｅｄｌｅｒら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、９３巻、９９０〜９８頁、２００４年）が、骨折治癒および骨修復におけるその役割ははっきり定義されていない。ＰＤＧＦは、血管新生という異なる側面も制御するが、骨成長中はそれ自体も決定的に重要である。ＰＤＧＦは、組織の正常な成長および発達に必要な基本過程であり、既存の血管からの新しい毛細血管の増殖に関わる血管新生を刺激するうえでも役割を担っている。血管新生の速度を増加させることは、数例を挙げれば、冠動脈および末梢血管の疾患など組織灌流低下を伴うものなど特定の障害において有用である。
【００７１】
ＰＤＧＦ−Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２５９８）およびＰＤＧＦ−Ｂ（（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２５９９）をホモ二量体化またはヘテロ二量体化して、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢの３つの異なるアイソフォームを作製できる。ＰＤＧＦ−Ａは、ＰＤＧＦα受容体（ＰＤＧＦＲ−α／αホモ二量体などのＰＤＧＦＲ−α）に結合できるのみである。ＰＤＧＦ−Ｂは、ＰＤＧＦＲ−αおよび第２のＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ−β）の両方に結合できる。より具体的には、ＰＤＧＦ−Ｂは、ＰＤＧＦＲ−α／αおよびＰＤＧＦＲ−β／βのホモ二量体、ならびにＰＤＧＦＲ−α／βのヘテロ二量体に結合できる。
【００７２】
ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＢＢは、間葉系由来の細胞に対する主要な分裂促進物質および化学誘引物質であるが、ＰＤＧＦＲ−αおよびβが両方とも内皮細胞（ＥＣ）上に発現するにもかかわらず、内皮系統の細胞に対しては、全くまたはほとんど効果をもたない。ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢは、新しく形成される血管の安定化／成熟に関与することが示されている（Ｉｓｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４１５巻、２３４〜９頁、２００２年；Ｖａｌｅら、Ｊ Ｉｎｔｅｒｖ Ｃａｒｄｉｏｌ、１４巻、５１１〜２８頁、２００１年）；Ｈｅｌｄｉｎら、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ、７９巻、１２８３〜１３１６頁、１９９９年；Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、２３巻、４９４〜５０７頁、２００１年）。しかしながら、他のデータからは、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＰＤＧＦ−ＢＢはＰＤＧＦＲ−αのシグナル伝達によりｉｎ ｖｉｖｏでのｂＦＧＦ誘導性の血管新生を阻害することが示された。ＰＤＧＦ−ＡＡは間葉系細胞の遊走の最も強力な刺激の１つであるが、この因子は、ＥＣの遊走を刺激しないか、またはごくわずかに刺激するかのいずれかである。特定の条件では、ＰＤＧＦ−ＡＡはＥＣの遊走を阻害さえする（Ｔｈｏｍｍｅｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４巻、４０３〜１３頁、１９９７年；Ｄｅ Ｍａｒｃｈｉｓら、Ｂｌｏｏｄ、９９巻、２０４５〜５３頁、２００２年；Ｃａｏら、ＦＡＳＥＢ． Ｊ．、１６巻、１５７５〜８３頁、２００２年）。さらに、ＰＤＧＦＲ−αは、ＰＤＧＦＲ−β誘導性のＳＭＣの遊走を拮抗することが示されており（Ｙｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２８２巻、６９７〜７００頁、２００１年）、ＰＤＧＦ−ＡＡに対する中和抗体は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）の遊走を促進する（Ｐａｌｕｍｂｏ， Ｒ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ．、２２巻、４０５〜１１頁、２００２年）。したがって、ＰＤＧＦ−ＡおよびＢの血管新生／動脈新生活性（特に、ＰＤＧＦＲ−αを介してシグナル伝達する場合の）については、議論が分かれている。
【００７３】
ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＢＢは、心血管および神経の幹細胞／前駆細胞の両方の増殖および分化において重要な役割を果たすことが報告されている。ＰＤＧＦ−ＡＡは、αｖβ３インテグリンを介してオリゴデンドロサイト前駆体の増殖を刺激した（Ｂａｒｏｎら、Ｅｍｂｏ． Ｊ．、２１巻、１９５７〜６６頁、２００２年）が、ＰＤＧＦ−ＢＢは、Ｆｌｋ１＋胚性幹細胞の血管壁細胞への分化を誘導し（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ， Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０８巻、４３〜４５頁、２０００年；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ、４０８巻、９２〜６頁、２０００年）、また、神経球由来のニューロンの生存を強力に高めた（Ｃａｌｄｗｅｌｌら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻、４７５〜４７９頁、２００１年）。
【００７４】
ＰＤＧＦタンパク質は、フィブリンゲルの製剤に使用されてきたが、成功の内容はさまざまであった。Ｔｈｏｍｏｐｏｕｌｏｕｓら（Ｊ Ｏｒｔｈ Ｒｅｓ、２５巻、１３５８〜６８頁、２００７年）は、フィブリノーゲン、トロンビン、ペプチド成分およびヘパリンを含むフィブリンゲルを調製し、さまざまな濃度のＰＤＧＦ−ＢＢをさらに加えて、成長因子の受動的放出動態を定量した。この試験から、成長因子の放出量は、フィブリンゲル中のヘパリンの量に依存することが示された。ＰＤＧＦは、血漿血小板Ｔ調製品を含むフィブリンゲル中でも検出されており（例えば、Ｙａｚａｗａら、Ｊ Ｃｒａｎｉｏｆａｃ Ｓｕｒｇ、１５巻、４３９〜４６頁、２００４年を参照）、フィブリン足場中の胚性幹細胞を刺激するために使用されている（Ｗｉｌｌｅｒｔｈら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．、２５巻、２２３５〜２２４４頁、２００７年）。
【００７５】
本発明にとって有用なＰＤＧＦ分子としては、完全長のタンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質のサブユニットまたは断片、およびその機能的誘導体が挙げられる。ＰＤＧＦと言った場合は、天然由来のタンパク質調製品を含め、そのようなタンパク質の、可能性のある全ての形態を包含することを意図している。
【００７６】
本発明によれば、組換えＰＤＧＦという用語は、特定の限定の根拠となるものではなく、組換えＤＮＡ技術により得られる任意のＰＤＧＦ（異種の、または天然に存在する）またはその生物学的に活性である誘導体を包含することがある。特定の実施形態では、この用語は、（１）少なくとも約２５、５０、１００、１５０、２００またはそれを超えるアミノ酸の領域にわたり、本明細書に記載の参照される核酸またはアミノ酸の配列によりコードされるＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢポリペプチドに対して約６０％超のアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、（２）本明細書に記載のような参照されるアミノ酸配列を備える免疫原、その免疫原性の断片、および、保存的に変異したその変異体に対して生じた抗体（例えばポリクローナル抗体）に特異的に結合する、（３）本明細書に記載のような参照されるアミノ酸配列、および、保存的に変異したその変異体をコードする核酸と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする、（４）少なくとも約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００、１５００、２０００またはそれを超えるヌクレオチドの領域（最大、成熟したタンパク質のヌクレオチドの完全長の配列）にわたり、本明細書に記載のような参照される核酸配列に対して約９５％超、約９６％超、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有するタンパク質および核酸、例えば、遺伝子、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびポリペプチド、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間の相同体を包含する。
【００７７】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列は、霊長動物（例えばヒト）、齧歯動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジまたは他の任意の哺乳動物を非限定的に含む哺乳動物に典型的に由来する。本発明の核酸およびタンパク質は、組換え分子（例えば、異種の、および、野生型配列をコードするものまたはその変異体、または天然に存在しないもの）であってもよい。ヒトＰＤＧＦの構造については、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）により維持されているＧｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅを参照されたい：ヒトＰＤＧＦ−Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２５９８、ＮＭ＿００２６０７．４）およびＰＤＧＦ−Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２５９９、ＮＭ＿００２６０８）。ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢは、ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂの配列のホモ二量体またはヘテロ二量体である。
【００７８】
ＰＤＧＦの作製は、（ｉ）遺伝子工学による（例えば、ＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅による）組換えＤＮＡの作製、（ｉｉ）形質移入による（例えば、電気穿孔法またはマイクロインジェクションによる）、組換えＤＮＡの、原核細胞または真核細胞中への導入、（ｉｉｉ）前記形質転換された細胞の培養（例えば、連続的またはバッチ式の様式で）、（ｉｖ）ＰＤＧＦの発現（例えば、構成的に、または導入時に）、および（ｖ）例えば陰イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによる、精製されたＰＤＧＦを得るための前記ＰＤＧＦの単離（例えば、培養培地から、または、形質転換された細胞の回収による）について当技術分野で公知の任意の方法を含んでもよい。
【００７９】
ＰＤＧＦは、薬理学上許容されるＰＤＧＦ分子を生成する特徴を有する適当な原核または真核の宿主系中での発現により作製できる。一般に使用される宿主細胞としては、グラム陰性菌またはグラム陽性菌などの原核細胞、すなわち、任意の系統の、Ｅ．ｃｏｌｉ、バシラス属、放線菌属、サッカロミセス属、サルモネラ属などが挙げられる。真核細胞の例は、Ｄ．Ｍｅｌ−２、Ｓｆ４、Ｓｆ５、Ｓｆ９およびＳｆ２１ならびにＨｉｇｈ５などの昆虫細胞；植物細胞、ならびに、サッカロミセス属およびピキア属などの多様な酵母細胞；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞などの哺乳動物細胞；ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；ヒト腎臓２９３細胞；ＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ２９３、ＳＫ−ＨｅｐおよびＨｅｐＧ２、ならびに、それ以外に当技術分野で公知のものである。本発明によるＰＤＧＦを作製または単離するために用いられる試薬または条件に何ら制限はなく、当技術分野で公知の、または市販の、任意のシステムを採用できる。本発明の好ましい一実施形態では、ＰＤＧＦは、最新技術において記載されるような方法により得られる。
【００８０】
ＰＤＧＦの調製には多種多様なベクターが使用でき、こうしたベクターは、当技術分野で周知の真核および原核細胞用の発現ベクターから選択できる。原核細胞の発現用のベクターの例としては、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどのプラスミドが非限定的に挙げられ、このとき原核細胞発現用のベクター中で使用されるプロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤなどが挙げられる。真核細胞発現用のベクターの例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）酵母菌中での発現用としては、ベクターはｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴなど、使用するプロモーターはＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１など；（ｉｉ）昆虫細胞中での発現用としては、ベクターはｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなど、使用するプロモーターはＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなど、および（ｉｉｉ）哺乳動物細胞中での発現用としては、ベクターはｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなど、および、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどのウイルス系に由来するベクター、使用するプロモーターはＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶおよびβアクチンなど。
【００８１】
ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有する宿主細胞を、細胞の成長およびＤＮＡまたはＲＮＡの発現に適した条件下で培養する。ポリペプチドを発現するそうした細胞は公知の方法を用いて同定でき、組換えタンパク質は公知の方法を用いて単離および精製できるが、ポリペプチド生成物の増幅は行っても行わなくてもいずれでもよい。同定は、例えば、タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの存在を示す表現型を表す遺伝子組換え哺乳動物細胞のスクリーニング（ＰＣＲスクリーニングなど）、サザンブロット分析によるスクリーニングまたはタンパク質の発現のスクリーニングにより実施できる。タンパク質をコードするＤＮＡを組み込んである細胞の選択は、選択可能なマーカーをＤＮＡ構築物中に含ませ、選択可能なマーカー遺伝子を含有する形質移入した、または感染させた細胞を、その選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞のみの生存に適した条件下で培養することにより達成できる。導入されたＤＮＡ構築物のさらなる増幅は、増幅に適した条件下で遺伝子組換え細胞を培養すること（例えば、増幅可能なマーカー遺伝子を含有する遺伝子組換え細胞を、その増幅可能なマーカー遺伝子の複数のコピーを含有する細胞のみが生存できる濃度の薬物の存在下で培養すること）により影響を及ぼすことができる。
【００８２】
本発明の一実施形態では、フィブリンゲルから放出されたＰＤＧＦの生物学的活性をテストした。ＰＤＧＦが添加されているゲルに由来する培地上清中の単層中で（すなわち、放出されたＰＤＧＦ−ＢＢを含有する培地中で）の培養後のヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）の形態がより細長い形状に変化すること、および、細胞増殖量が増える傾向があることから、放出された成長因子は生物学的活性を有することが示唆された。
【００８３】
試料中のタンパク質濃度を定量する方法。
【００８４】
治療用タンパク質は、内因的に生成する、天然に存在するタンパク質とよく似ていることから、血清試料中での検出が難しい場合が多い。しかしながら、治療用タンパク質が、より高い可溶性または安定性、酵素消化への耐性、改善された生物学的半減期などの所望の特徴、およびそれ以外にも当業者に公知の特色を呈するかどうかを評価するために投与された、治療用のポリペプチド、その断片、変異体または類似体の量を定量することは有益な場合が多い。こうした方法を用いれば、知的所有権により保護されている可能性がある治療用タンパク質の使用許諾を確認することも可能である。
【００８５】
本発明は、ＰＤＧＦを含有するフィブリンゲルからのＰＤＧＦの放出を検出し、このタンパク質の放出動態を定量する方法を用いる。さまざまな濃度のＦＣ成分を使用して作製されたフィブリンシーラントからのこうした放出動態の比較は、治療目的のための所望の放出速度を定量するのに役立つ。時間の経過に伴いフィブリンシーラントから放出されるタンパク質の量を同定できれば、半減期、吸収、安定性などに基づく最適な治療薬の定量の助けとなる。検出アッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）、または当技術分野で公知の他の結合アッセイであってもよい。
【００８６】
一般に、試料中でのＰＤＧＦの存在を検出するには、ＰＤＧＦを、抗体、可溶性の受容体もしくは他のタンパク質などのＰＤＧＦ結合剤、または、ＰＤＧＦに結合する薬剤に結合させる。
【００８７】
生物学的活性の検出ステップまたはテストのためには、ＰＤＧＦタンパク質を、検出可能な部分または検出可能な標識に結合させてもよい。検出可能な部分または標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的な手段により検出可能な組成物を指す。検出可能な部分は、放射性、発色性または蛍光性のシグナルなど測定可能なシグナルを発することが多く、このシグナルを用いて、試料中の結合している検出可能な部分の量を定量化できる。検出可能な部分は、共有結合か、または、イオン結合、ファンデルワールス結合もしくは水素結合のいずれかにより、タンパク質中に組み込むか、またはタンパク質に結合できる（例えば、放射性ヌクレオチド、または、ストレプトアビジンにより認識されるビオチン標識ヌクレオチドの組込み）。検出可能な部分は、直接または間接的に検出可能なものであってもよい。間接的な検出は、第２の直接または間接的に検出可能な部分の、検出可能な部分への結合を含んでもよい。例えば、検出可能な部分は、ストレプトアビジンの結合相手であるビオチンなど、結合相手のリガンドであってもよい。結合相手は、それ自体が直接検出可能なものであってもよく、例えば、抗体を蛍光分子で標識してもよい。シグナルの方法定量化の選択は、例えば、シンチレーション計測法、濃度測定法またはフローサイトメトリーにより達成される。
【００８８】
本発明のアッセイ法における使用に適した標識の例としては、以下が挙げられる：放射性標識、フルオロフォア、電子密度の高い試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテン、ならびに、例えば、ハプテンまたはペプチド中に放射性標識を組み込むことにより検出可能にできる、または、ハプテンもしくはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用できるタンパク質。さらに、当該タンパク質に対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質、または、標的と相補的な配列を有する核酸分子、ナノタグ、分子量ビーズ、磁気剤、蛍光色素を含有するナノビーズもしくはマイクロビーズ、量子ドット、量子ビーズ、蛍光タンパク質、蛍光標識を有するデンドリマー、マイクロトランスポンダー、電子ドナー分子もしくは分子構造または光反射粒子も企図される。
【００８９】
本発明と共に使用することが企図される追加的な標識としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：蛍光色素（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、および、ＥＬＩＳＡにおいて通常使用される他の酵素）、および、コロイド金、色付きのガラスまたはプラスチックのビーズなどの比色用の標識（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）、および発光標識または化学発光標識（例えば、ユーロピウム（Ｅｕ）、ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ）。
【００９０】
標識は、当技術分野で周知の方法によるアッセイの所望の成分に直接または間接的に結合させてもよい。特定の実施形態では、標識は、本発明による活性剤のコンジュゲーションのために、イソシアネートまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの試薬を用いて、成分に共有結合させる。本発明の一態様では、二官能性のイソシアネート試薬を用いて標識をバイオポリマーにコンジュゲートさせて、そこに結合される活性剤が結合していない状態の標識生体ポリマーコンジュゲートを形成する。この標識バイオポリマーコンジュゲートは、本発明による標識されたコンジュゲートの合成のための中間物質として使用してもよく、または、バイオポリマーコンジュゲートを検出するために使用してもよい。前述のように、多種多様な標識を使用でき、標識の選択は、必要な感応性、アッセイの所望の成分とのコンジュゲーションの容易さ、安定性の要件、使用可能な器具類および廃棄規定に応じて行う。非放射性標識は、間接的な手段により結合させることが多い。一般に、リガンド分子（例えばビオチン）を当該分子に共有結合させる。リガンドは、次に別の分子（例えばストレプトアビジン）分子に結合するが、こうした分子は、もともと検出可能であるもの、または、検出可能な酵素、蛍光化合物もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合するもののいずれかである。
【００９１】
本発明の方法において有用な化合物は、例えば、酵素またはフルオロフォアとのコンジュゲーションにより、シグナルを発する化合物に直接コンジュゲートすることもできる。標識としての使用に適した酵素としては、加水分解酵素、とりわけホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドターゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅ）、とりわけペルオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。標識としての使用に適した蛍光化合物としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：前に挙げたものの他、フルオレセイン誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、エオシン、ＴＲＩＴＣアミン、キニーネ、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Ｂスルホニルクロリドエリトロセイン（ｅｒｙｔｈｒｏｓｃｅｉｎ）、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、ユーロピウム、テキサスレッド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチドなど。標識としての使用に適した化学発光化合物としては、ＭＳＤ Ｓｕｌｆａ−ＴＡＧ、ユーロピウム（Ｅｕ）、サマリウム（Ｓｍ）、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタルアジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法において使用できる多様な標識系またはシグナル生成系の概説については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照。
【００９２】
標識を検出する手段は、当業者に周知であり、検出される標識の型により決まる。したがって、例えば、標識が放射性である場合、検出の手段としては、シンチレーションカウンター（例えば、放射性免疫測定法、シンチレーション近接アッセイ）（Ｐｉｔａｓら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ．、３４巻、９０６〜１２頁、２００６年）が、または、オートラジオグラフィーの場合は写真フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合、そのような標識は、適切な光波長を有する蛍光色素を励起させ、その結果得られる蛍光を検出すること（例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または当技術分野で公知の他の方法）により検出してもよい。蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子倍増管などの電子検出装置の使用により、視覚的に検出してもよい。同様に、酵素標識は、当該酵素にとっての適切な基質を加え、その結果得られる反応産物を検出することにより検出してもよい。比色標識または化学発光標識は、標識に着いている色を観察することにより、簡単に検出できる。本発明の方法における使用に適した他の標識系および検出系は、当業者には容易に明らかとなろう。そのような標識されたモジュレーターおよびリガンドは、疾患または健康状態の診断において使用できる。
【００９３】
この方法は、場合により少なくとも１つまたは複数の洗浄ステップを含むが、このステップでは、結合していないポリペプチドが原因のバックグラウンド測定値を減らすために、タンパク質の結合を測定する前に、結合しているＰＤＧＦ組成物を洗浄する。ポリペプチド組成物のインキュベーション後およびＰＤＧＦの検出前のＰＤＧＦの洗浄は、適切な緩衝液プラス洗浄剤中で実施される。適切な洗浄剤としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルグルコシド、アルキルマルトシド、硫酸アルキル（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など）、ＮＰ−４０、アルキルチオグルコシド、ベタイン、胆汁酸、ＣＨＡＰシリーズ、ジギトニン、グルカミド、レシチン／リゾレシチン、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘなどの非イオン性ポリオキシエチレンベースの洗浄剤、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＢＲＩＪ（登録商標）、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）およびＴＨＥＳＩＴ（登録商標）などのポリソルベート、四級アンモニウム化合物など。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、付録１Ｂ、補遺１１、１９９８年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪも参照。適当な洗浄剤は、慣例的な実験法を用いて決定できる（Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ， Ｊ．、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、１９８８年を参照）。
【００９４】
フィブリンシーラントを投与する方法
本発明において有用なフィブリンシーラントは、当技術分野で周知の手法を用いて、例えば、所望の部位での注射または噴霧により、内視鏡により、スポンジ様の担体、予め形成されたシーラントまたは当技術分野で公知の他の方法を用いるなどにより、対象に投与することが企図される。一実施形態では、シーラントは、注射または噴霧して、ｉｎ ｓｉｔｕでゲルを形成させる。
【００９５】
これらのフィブリンシーラントは、当業者には明らかであろうが、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＤＧＦの持続／制御放出から利益を得る、下記の状態を非限定的に含む対象に投与されることが企図される。一実施形態では、患者は、骨および軟骨、筋肉、付随する靭帯、および他の結合組織の疾患を非限定的に含む筋骨格疾患；筋肉、線維組織、脂肪、血管および滑膜組織を冒す障害を非限定的に含む軟部組織の疾患もしくは障害；または血管疾患に罹患している。
【００９６】
一実施形態では、このフィブリンシーラントは、骨移植片の代替物として機能するので、同じ適応の多くにおいて施用でき、このような適応としては、脊椎固定ケージ、偽関節の不具合の治癒、骨の増強、骨折修復の加速、骨組織再構築および歯の再生が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、別の実施形態では、このシーラントは、インプラント統合において使用できる。インプラント統合では、インプラントは、隣接する骨領域がインプラントの表面の中へ成長するように誘導して緩みおよび付随する他の問題を防止するフィブリンシーラントで覆うことができる。別の実施形態では、成長因子に富むマトリックスは、皮膚中の慢性創傷を治癒するために使用できる。
【００９７】
骨または軟骨の追加的な障害または状態としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：変形性関節炎、骨粗鬆症、骨ジストロフィー、くる病、骨軟化症、マッキューン・オルブライト症候群、アルバース・シェーンベルグ病、パジェット病、関節リウマチ、変形性関節炎、軟骨損傷、人工関節周囲の骨溶解、骨形成不全症、転移性骨疾患、骨軟骨腫、骨形成、骨髄炎、骨症、大理石骨病、骨硬化症、多発性軟骨炎、関節軟骨傷害、軟骨石灰化症、軟骨形成不全、膝蓋軟骨軟化症、軟骨肉腫、肋軟骨炎、内軟骨腫、強剛母趾、半月板損傷、股関節唇損傷、離断性骨軟骨炎（ｏｃｄ）、再発性多発性軟骨炎、または、骨もしくは軟骨の形成の刺激が有効な任意の状態。
【００９８】
ＰＤＧＦタンパク質を含むフィブリンシーラントは、血管新生および血管成長の増加が有効と考えられる血管の疾患または状態の治療にも有用であり、そのような疾患または状態としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：虚血／再灌流、心筋梗塞、うっ血性心不全、アテローム性硬化症、高血圧症、再狭窄、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、血管または心臓の石灰化、血栓症、末梢血管疾患、血管壁リモデリング、心室リモデリング、急速心室ペーシング、冠動脈微小塞栓症、圧過負荷、大動脈屈曲症、冠動脈結紮、血管性心疾患、弁膜疾患（石灰化が原因の弁膜変性、リウマチ性心疾患、心内膜炎または人工弁の合併症を非限定的に含む）；狭心症、心不全、高血圧症、心房細動、心膜疾患（心膜液貯留および心膜炎を非限定的に含む）；心筋症、心肥大または心血管性の発達障害。
【００９９】
キット
キットも本発明の範囲内で企図される。典型的なキットは、ＦＣおよびトロンビン成分を含むフィブリンシーラントを備えることができる。一実施形態では、このキットは、フィブリンシーラント中に組み込むためのＰＤＧＦタンパク質をさらに備える。一態様では、各成分は、それ自体用の別々の保存容器、バイアルまたは入れ物の中に入っていてもよい。関連する一態様では、ＰＤＧＦはＦＣ成分との混合物の形態であってもよく、トロンビン成分は別の保存容器に入っていてもよい。関連する一態様では、ＰＤＧＦはトロンビン成分との混合物の形態であってもよく、ＦＣ成分は別の保存容器に入っていてもよい。関連する一実施形態では、保存容器は、バイアル、瓶、袋、貯蔵容器、管、ブリスター、小袋、パッチなどである。この製剤の構成物の１つまたは複数は、凍結乾燥された、フリーズドライ加工された、スプレーフリーズドライ加工された、または他の任意の再構成可能な形態をしていてもよい。必要に応じ、多様な再構成用媒体がさらに備えられていてもよい。
【０１００】
このキットの成分は、冷凍、液体または凍結乾燥された形態のいずれかをしていてもよい。このキットには、フィブリンゲルを対象に投与するための適当な器具が入っていることがさらに企図される。さらなる一実施形態では、このキットには、フィブリンシーラントを調製および投与するための取扱説明書も入っている。
【０１０１】
本発明の追加的な態様および詳細は、以下の実施例から明らかになると考えられるが、この実施例は、限定ではなく例証であることを意図したものである。
【実施例】
【０１０２】
（実施例１）
材料および方法
放出動態：
組換え（ｒｈ）−ＰＤＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の濃度が放出動態に及ぼす効果を、フィブリンシーラント（ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄ、Ｓ／Ｄは、安全性を高めるために追加で行われるウイルス不活性化ステップである；Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア）の単一製剤（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌおよび［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）を用いて分析した。異なる量の組換えヒトＰＤＧＦ−ＡＢまたはＢＢを分析した（０．３ｍｌのゲルについて５ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇ、４０ｎｇおよび８０ｎｇ）。ゲル調製時点でＰＤＧＦをＦＣ成分中で再懸濁させた。
【０１０３】
ＦＣ濃度が、フィブリンのＦＣ成分中で最初に再懸濁させたＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢ（ゲル０．３ｍｌ当たり１５ｎｇで固定）の放出動態に及ぼす効果を分析した。５〜４０ｍｇ／ｍｌ（ゲル中の最終濃度）の異なる濃度のＦＣと固定濃度のトロンビン（２ＩＵ／ｍｌ）とを用いて、フィブリンゲル（ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄ）の４つの異なる製剤を調製した。
【０１０４】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＢＢ（ゲル０．３ｍｌ当たり１５ｎｇで固定、すなわち、ゲル１ｍｌ当たり５０ｎｇ）の放出動態を、単一のゲル製剤（ゲル中の最終濃度は、［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌおよび［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）を用いて、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄの３つの異なるフィブリンシーラントの製品ロットについて比較して、フィブリンシーラントの製品ロットによる放出動態のばらつきを分析した。
【０１０５】
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨからのＰＤＧＦ−ＢＢの放出動態（ＰＤＧＦ−ＢＢ濃度の効果、ＦＣ濃度の効果およびフィブリンシーラントの製品ロットによるばらつき）を分析して、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨおよびＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄを用いた場合の潜在的な差を観察した。
【０１０６】
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄを用いた全ての実験用には、ポリプロピレンのエッペンドルフ管中でゲルを調製し、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨを用いた実験用には、２４ウェルのポリスチレン製培養プレート中でゲルを調製した。全ての場合において、ゲルは、標準的なヒトＭＳＣ（ＨＭＳＣ）成長培地（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用い、５％ＣＯ２中にて３７℃で１０日間までインキュベートした。培養培地は毎日交換し、培養培地試料は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によりＰＤＧＦの量についてテストするまで冷凍した。ＦＣ濃度の効果およびＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄについてのロット間の変動を評価する実験用には、ゲルは完全培地中のウロキナーゼ（１Ｕ／ｍｌ）を用いて１０日の放出後溶解させた。その結果得られた溶液中のＰＤＧＦの量を、ゲル中に最初に加えた成長因子の量の完全な回復を検証するためにテストした。
【０１０７】
生物学的活性：
放出されたＰＤＧＦがＨＭＳＣ単層に及ぼす効果：
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄ（ゲル中の最終濃度は、ＦＣが２０ｍｇ／ｍｌ、トロンビンが２ＩＵ／ｍｌ）の１つのフィブリン製剤を用いて、ゲルから放出されたＰＤＧＦの生物学的活性を分析した（ＰＤＧＦ−ＡＢ １２０ｎｇおよびＰＤＧＦ−ＢＢ ６０ｎｇをＦＣ成分中に加えてから重合させて、ＰＤＧＦが添加されているゲルとした）。ＨＭＳＣ単層用の培養培地としては、３日目にゲルから回収した培地の上清（培地は毎日交換していない）を使用した。まず、ＨＭＳＣを１２ウェルの培養プレート中に２５００細胞／ｃｍ２で予め播種し（１０，０００細胞／ウェル）、５％ＣＯ２中にて３７℃で４から５時間インキュベートして、付着させた。次に、細胞培養培地を取り除き、代わりにゲル由来の培地上清を入れた。対照試料用に、ＰＤＧＦが添加されていないゲルをいくつか調製したが、これは、ＰＤＧＦが添加されているゲル由来の培地で変化が観察される場合、その変化は、放出されたＰＤＧＦにより実際に誘導されたものであってゲル自体から放出された可能性のある他の何らかの潜在的な生物活性成分によるものではないことを保証するためであった。ｒｈ−ＰＤＧＦを３０ｎｇ（１５ｎｇ／ｍｌ）加えて新しく調製した培地の入ったウェルを、陽性対照として使用した。陽性対照のためのＰＤＧＦ３０ｎｇの添加は、実験用に使用する製剤でゲル中にＰＤＧＦ−ＡＢ １２０ｎｇまたはＰＤＧＦ−ＢＢ ６０ｎｇを加えた場合に３日目にゲルから放出されることが見出されたＰＤＧＦのおよその量を基準にしたので、この添加により、今回テストした条件、すなわち、放出されたＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢを含有する、３日目のゲル由来の培地上清が厳密に再現されるはずである。
【０１０８】
細胞増殖および細胞形態変化の分析：１日目、４日目および７日目に、細胞の増殖量および形態変化を分析した。細胞培養培地を捨て、カルセインＡＭおよびエチジウムホモ二量体−１を含有する生／死判定用の色素溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で細胞を染色した。添加されたＰＤＧＦを含有するゲル由来の培地上清でインキュベートした細胞の増殖量を、添加されたＰＤＧＦを含有しないゲル由来の上清でインキュベートした細胞の増殖量、および、ＰＤＧＦ３０ｎｇを加えて新しく調製した培地でインキュベートした細胞（陽性対照）の増殖量と比較した。Ｍｕｌｔｉ−Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｇｅｍｉｎｉ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて５０分の染色後の蛍光強度を測定することにより、細胞増殖量をモニターした。増殖量を読み取った後、プレートを基本培地で一度洗浄して残留染料を除去してから、デジタル画像取得システム（画像記録用のＳｐｏｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ．２．１．を備えたＳｐｏｔデジタルカメラ、Ｎｉｋｏｎ）を搭載した倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２００、Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いて細胞の形態変化を観察した。
【０１０９】
細胞分化（軟骨形成および骨形成）の分析：フィブリンゲルから放出されたＰＤＧＦの存在下におけるＨＭＳＣの軟骨形成または骨形成の分化の可能性を分析するために、培養の１日後、４日後および７日後にアルシアンブルー（軟骨形成用）またはアリザリンレッド（骨形成用）で細胞を染色した。ＰＤＧＦが添加されているゲル由来の培地でインキュベートした細胞の染色強度を、ＰＤＧＦが添加されていないゲル由来の培地でインキュベートした細胞のもの、および、ＰＤＧＦ３０ｎｇを加えて新しく調製した培地でインキュベートした細胞（陽性対照）と比較した。
【０１１０】
アルシアンブルー染色については、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で２回すすぎ、パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．）で１０分間固定させてから、０．１Ｎ ＨＣｌ中の１％アルシアンブルー（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．）で３０分間染色した。細胞をＰＢＳで５回（各２分）すすいでから、デジタル画像取得システム（前述の、画像記録用のＳｐｏｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ．２．１．を備えたＳｐｏｔデジタルカメラ、Ｎｉｋｏｎ）搭載の倒立光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２００）下で観察した。アリザリンレッド染色については、細胞をまずＰＢＳで２回すすぎ、氷冷の７０％エタノール中で１０分間固定させてから、ＰＢＳ中の２％アリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．）で３０分間染色した。次に、細胞をＰＢＳで５回（各２分）すすいでから、前述の倒立光学顕微鏡を用いて観察した。
【０１１１】
アリザリンレッドによる染色に加え、培養の１日後、４日後および７日後、初期の骨形成分化のマーカーとして、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。１２ウェルの培養プレートに入れた細胞をＨＢＳＳ（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．）で２回洗浄してから、数分間トリプシン処理して細胞を取り出した。次に、懸濁液中の細胞をエッペンドルフ管中に移し、ウェルを基本培養培地０．５ｍｌで洗浄してから、対応するエッペンドルフ管中に移した。次に、細胞を５分間遠心分離してから、ＮａＨＣＯ３を含有するタイロードの塩溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．）０．５ｍｌで一度洗浄した。上清を捨て、細胞のペレットをＡＭＰ緩衝液＋ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．）５０μｌ中で再懸濁させてから９６ウェルのプレート中に移した。管をＡＭＰ緩衝液＋ＭｇＣｌ２ ２５μｌで洗浄し、これを９６ウェルのプレートの対応するウェル中に移した。９６ウェルのプレートの３つのウェルにＡＭＰ緩衝液＋ＭｇＣｌ２ ７５μｌを加え、ブランクとした。最後に、ｐ−ＮＰＰ（リン酸ｐ−ニトロフェニル、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．）ストック基質溶液７５μｌを各ウェル中に加えてから、プレートを３７℃で３０分間置いた。形成されたｐ−ニトロフェノール生成物の４０５ｎｍでの吸光度（ＡＬＰ活性と比例する）を、Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）を用いて３０分時点で分析した。結果（最初はＩＵ／Ｌとして測定した）を、増殖量について正規化した。
【０１１２】
ＰＤＧＦ−ＢＢが、フィブリンゲル中に播種されたＨＭＳＣに及ぼす効果：
フィブリンゲル中に加えたＰＤＧＦ−ＢＢが、フィブリンゲル中に播種されたＨＭＳＣおよびゲル表面上に播種されたヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．）の挙動に及ぼす生物学的効果を分析するために、単一の培養細胞（ＨＭＳＣまたはＨＵＶＥＣ）またはＨＭＳＣ：ＨＵＶＥＣ比が４：１の共培養細胞を用いて、１０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を含有するＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲルを調製した。ＰＤＧＦ−ＢＢが添加されているゲルおよび添加されていないゲルにおける細胞の挙動を比較するために、ゲルの調製時点で、共培養ゲルの半分においてＦＣ中にＰＤＧＦ−ＢＢ（ゲル０．３ｍｌ当たり６０ｎｇ）を加えた。２４ウェルの培養プレート中で調製したゲルを、添加用血清を含有する内皮細胞成長培地（１ｍｌ／ゲル）を用いて、５％ＣＯ２中にて３７℃で最長２１日間インキュベートした。１日目、７日目、１４日目および２１日目に、細胞の形態および増殖ならびに骨形成分化の分析を実施した。カルセイン色素で染色した後、蛍光顕微鏡により、相互接続した細胞−細胞ネットワークへのＨＵＶＥＣの再構築などの、細胞の形態（血管新生分化の初期事象）を観察した。カルセイン色素で染色した後、精製したウシのトリプシン濃縮溶液中でゲルを溶解させた後の細胞懸濁液の全体的な蛍光強度を測定することにより、細胞増殖を分析した。最後に、精製したウシのトリプシン濃縮溶液中でのゲル溶解に続き細胞を再懸濁させた後で、骨形成分化の初期マーカーとしてＡＬＰを測定した（前述のプロトコール）。
【０１１３】
表面プラズモン共鳴によるＰＤＧＦの結合：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、リアルタイムでの２分子間相互作用を測定する手法である。この分析は、特定の分析対象物が所与のリガンドに結合する場合に定量でき、リガンドに結合する分析対象物の結合親和性および化学量を定量するものである。基本的な実験的アプローチは、まず、金めっきを施したチップをリガンドと合わせることである。次に、緩衝液（移動相）中で調製した分析対象物をフローセル中に注入するが、そこでは分析対象物は、緩衝液の流れにより、コーティングされたチップ全体に担持される。分析対象物とリガンドとの間で２分子間相互作用が生じると、表面での質量が局部的に増加する結果、金属表面上の屈折率単位（μＲＩＵ）が増加する。（μＲＩＵ）の変化は、時間の関数としてグラフ化できる。
【０１１４】
本試験では、組換えヒトＰＤＧＦ−ＡＢおよび組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢを分析対象物として使用し、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤのＦＣ成分をリガンドとして使用した。緩衝液としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、すなわち生理食塩状態の溶液）を使用した。異なる濃度のＰＤＧＦアイソフォームそれぞれを、ＦＣでコーティングしたセンサーチップの表面上に、離して流した。各実験について、および各濃度について、結合速度および解離速度を測定した。
【０１１５】
統計分析：
放出動態は３回行った。増殖、ＡＬＰ活性、アルシアンブルーおよびアリザリン染色についての結果は、３セットの実験を代表するものである。増殖およびＡＬＰ活性は３回、染色実験は２回行った。各ＰＤＧＦの濃度についてのＳＰＲ分析は３回行った。有意水準を５％としたＡＮＯＶＡ検定を用いて統計分析を実施した。
【０１１６】
（実施例２）
ＰＤＧＦの濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄからのその放出動態に及ぼす効果
ＰＤＧＦの濃度がフィブリンゲルからのその放出動態に及ぼす効果を、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄで作製された単一のフィブリンゲル製剤（ゲル中の最終濃度は、ＦＣ濃度が２０ｍｇ／ｍｌ、トロンビン濃度が２ＩＵ／ｍｌ）を用いて分析した。放出動態試験から、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＢＢの放出量は、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤのＦＣ成分に最初に加えた成長因子の量に従って増加することが示された（図１および２）。
【０１１７】
全体的に見ると、累積放出量の結果から、１０日後では、最初に加えたＰＤＧＦ−ＡＢの約２０％から３５％が放出されただけであることが示された（図１）。わずか３日後のＰＤＧＦ−ＡＢの累積放出量を見ると、ＰＤＧＦ−ＡＢの累積放出率はおよそ８〜１３％であった。言い換えれば、この結果から、１０日目では約６５〜８０％、３日目では約８７〜９２％が保持されていることが示された。
【０１１８】
ＰＤＧＦ−ＢＢを用いた場合の結果は同じ傾向をたどったが、より高い総放出率を示し、１０日後で約４５％から７０％が放出されていた（図２）。わずか３日後のＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出量を見ると、累積放出率は、およそ２０〜３５％であった。
【０１１９】
この結果から、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＢＢの両方ともフィブリンと強い結合相互作用を有することが示唆される。
【０１２０】
（実施例３）
ＦＣ濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤからのＰＤＧＦの放出動態に及ぼす効果
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄのフィブリンシーラントを使用した場合にＦＣ濃度がＰＤＧＦの放出動態に及ぼす効果を定量するために、固定されたトロンビン濃度（２ＩＵ／ｍｌ）を有するゲルを用いて、４つの異なるＦＣ濃度（ゲル中の最終濃度は５、１０、２０および４０ｍｇ／ｍｌ）のＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄについて放出量を分析した。
【０１２１】
ＥＬＩＳＡの結果から、１日目でスパイク放出が生じること、および、分析した全ての濃度のＦＣについて１０日目まで放出量が減少することが示された（図３Ａ）。ゲル中にＰＤＧＦ−ＡＢを１５ｎｇ加えた場合、ＦＣ濃度（５から４０ｍｇ／ｍｌ）は、放出動態に顕著には影響しなかった。累積放出量は、最初の量（１５ｎｇ）のおよそ２７％から３２％が１０日後で放出されており（図３Ｂ）、３日後ではわずか１０％から２０％であったことを示した。言い換えれば、保持率は１０日後では約７０％、わずか３日後では最大８０〜９０％であり、ＦＣ濃度には影響されなかったが、このことは、５ｍｇ／ｍｌのＦＣは１５ｎｇのＰＤＧＦ−ＡＢを結合するのに十分であったことを示唆するものである。
【０１２２】
しかしながら、ＰＤＧＦ−ＢＢの場合の結果からは、ＦＣ濃度が総放出率（％）に及ぼす効果が示された（図４）。事実、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤからのＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出率は、１０日目の時点では、ＦＣ濃度が低いほど高かった（ＦＣが５ｍｇ／ｍｌの場合は約６５％、４０ｍｇ／ｍｌの場合は２５％）。さらに、３日目の累積放出量の分析から、ＦＣ濃度への依存が示され、ＦＣが５ｍｇ／ｍｌの場合はおよそ３５％放出され、ＦＣが４０ｍｇ／ｍｌの場合は１０％放出された。言い換えれば、この結果から、１０日後では最低保持率は約３５％（ＦＣが５ｍｇ／ｍｌの場合）、最高保持率は約７５％（ＦＣが４０ｍｇ／ｍｌの場合）、３日後では最低保持率は約６５％、最高では約９０％であることが示された。放出動態がＦＣ濃度に依存することから、ＦＣ濃度を変化させることによりＰＤＧＦ−ＢＢの制御放出が可能であることが示唆される。
【０１２３】
ゲル中に残っているＰＤＧＦ−ＡＢを回復させるためにゲルを溶解させた後のＥＬＩＳＡの結果から、最初に加えた量の少なくとも８５％のＰＤＧＦ−ＡＢが回復したことが示された。ゲル中に残っているＰＤＧＦ−ＢＢを回復させるためにゲルを溶解させた後のＥＬＩＳＡの結果から、最初に加えた量の６５％から７５％のＰＤＧＦ−ＢＢが回復したことが示された。回復はＰＤＧＦ−ＢＢについては完全でなかったことから、ＰＤＧＦ−ＢＢの放出率（％）は、わずかに過小評価されている可能性がある。
【０１２４】
（実施例４）
異なる製品ロットのＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄを使用する効果
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄに由来する異なるＦＣ製品ロットを単一のゲル製剤（ゲル中の最終濃度は、ＦＣが２０ｍｇ／ｍｌ、トロンビンが２ＩＵ／ｍｌ）で使用する効果を調べると、結果は、分析した全てのロットについて、１０日目まで放出量が一定であることを示した。１０日後のＰＤＧＦ−ＡＢの累積放出率は、ＦＣのロットにより約２３％から３２％の範囲であり（図５）、したがって、３つのロットについては同程度であった。１０日後のＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出率は、ＦＣのロットにより約３８％から４２％の範囲であり（図６）、したがって、３つのロットについては同程度であった。
【０１２５】
この結果は、フィブリンのロット間でのＰＤＧＦ放出量には有意差がなく、したがって、放出動態におけるロット間の変動についてはほとんど気にする必要がないことを示すものである。
【０１２６】
ゲル中に残っているＰＤＧＦ−ＡＢを回復するためにゲルを溶解させた後のＥＬＩＳＡの結果から、最初に加えた量のＰＤＧＦ−ＡＢが完全に回復したことが示された。ゲル中に残っているＰＤＧＦ−ＢＢを回復するためにゲルを溶解させた後のＥＬＩＳＡの結果から、最初に加えた量の約６５％のＰＤＧＦ−ＢＢが回復したことが示された。回復はＰＤＧＦ−ＢＢについては完全でなかったことから、ＰＤＧＦ−ＢＢについての総放出率（％）は、わずかに過小評価されている可能性がある。
【０１２７】
（実施例５）
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨからのＰＤＧＦ−ＢＢの放出動態
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨからのＰＤＧＦ−ＢＢの放出動態を分析して、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨおよびＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄを使用した場合の潜在的な差を観察した。
【０１２８】
ＰＤＧＦ−ＢＢの濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨからの放出動態に及ぼす効果を測定した。結果から、放出される量は、ＦＣ成分に最初に加える成長因子の量に従って増加することが示された（図７）。全体的に見ると、累積放出の結果から、１０日後では、最初に加えたＰＤＧＦ−ＢＢの約２０％から４０％のみが放出される、すなわち、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄを使用した場合に観察される放出率の約２倍低いことが示された。わずか３日後では、結果は、約１５〜２０％のＰＤＧＦ−ＢＢが累積放出されたことを示した。しかしながら、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨを用いた実験はポリスチレンプレートを用いて行われており、ＰＤＧＦはポリスチレンプレートに非特異的に結合する可能性があることから、これらの値は過小評価されている（ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄの場合のポリプロピレン管と比較して）可能性があることに留意すべきである。この過小評価の可能性を確認するために１０日間の放出実験の終了時点でゲル中に残っている成長因子の回復を測定することはしなかった。
【０１２９】
ＦＣ濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨからの１日のＰＤＧＦ−ＢＢ放出量に及ぼす影響を調べると、ＥＬＩＳＡの結果から、１日目でスパイク放出が生じること、および、分析した全ての濃度について１０日目まで放出量が減少することが示された（図８Ａ）。さらに、結果からは、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨゲル中にＰＤＧＦ−ＢＢを１５ｎｇ加えた場合、ＦＣ濃度（５から４０ｍｇ／ｍｌ）は放出動態に影響しないことが示され、累積放出量から、１０日後には最初に加えた量（１５ｎｇ）の約３０％から３５％が放出されることが示された（図８Ｂ）。この結果は、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨに由来する５ｍｇ／ｍｌのＦＣは１５ｎｇのＰＤＧＦ−ＢＢを結合するのに十分であったことを示唆するものである。しかしながら、ＰＤＧＦ−ＢＢ濃度の効果についての結果に関しては、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨについてのこれらの値は、ポリスチレンプレートを使用しているため、過小評価されている可能性があることに留意すべきである。
【０１３０】
最後に、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨに由来する異なるＦＣ製品ロットを単一のゲル製剤（ゲル中の最終濃度は、ＦＣが２０ｍｇ／ｍｌ、トロンビンが２ＩＵ／ｍｌ）で使用する効果を調べると、結果は、分析した全てのロットについて１０日目まで放出量が一定であることを示した。１０日後のＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出率は、約３０％から６０％の範囲であり（図９）、したがってＦＣのロット番号に依存しており、このことは、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄの場合に見出された結果とは反対であった。分析したＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨの３つのロット間の違いの１つは、第ＸＩＩＩ因子の含有量であり（ロット１については無視できる量、ロット２については３３．９Ｕ／ｍｌ、ロット３については４２．２ＩＵ／ｍｌ）、このことから、第ＸＩＩＩ因子の量とＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨからのＰＤＧＦ−ＢＢの放出速度との間に相関がある可能性があることが示唆される。
【０１３１】
（実施例６）
放出されたＰＤＧＦがｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＭＳＣ単層に及ぼす生物学的活性
ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）は、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞および筋細胞などの異なる特化した組織細胞型に分化できる多能性前駆細胞である（Ｃａｐｌａｎ ＡＩ、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ、９巻、６４１〜６５０頁、１９９１年）。これらの細胞の関与および分化は、細胞の相互作用だけでなく特異的な成長因子などさまざまな要因により変わる。ＰＤＧＦファミリーに属するものは、ＭＳＣ成熟の制御因子として同定されている。
【０１３２】
放出された成長因子がＨＭＳＣに及ぼす効果を測定した。材料および方法の項で述べたように、３日目（培地は毎日交換していない）に培地上清をフィブリンゲルから回収して（ＰＤＧＦ−ＡＢ １２０ｎｇおよびＰＤＧＦ−ＢＢ ６０ｎｇをＦＣ成分中に加えてから重合させて、ＰＤＧＦが添加されているゲルとした）、ＨＭＳＣ単層用の培養培地として使用した。対照試料用に、ＰＤＧＦが添加されていないゲルをいくつか調製したが、これは、ＰＤＧＦが添加されているゲル由来の培地で変化が観察される場合、その変化は、放出されたＰＤＧＦにより実際に誘導されたものであってゲル自体から放出された可能性のある他の何らかの潜在的な生物活性成分によるものではないことを保証するためであった。
【０１３３】
ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢが添加されているＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル由来の培地の上清、すなわち、放出されたＰＤＧＦを含有する培地（２０ｍｇ／ｍｌのＦＣ、２ＩＵ／ｍｌのトロンビンを用いて最初に調製したゲル）で培養されたＨＭＳＣは、早くも４日目に細胞形態の変化を示し、７日目にはさらにより顕著になった。それらは、ＰＤＧＦが添加されていないゲル由来の培地上清で培養したものより細長い形状を有しており、新しく添加されたＰＤＧＦを含有する培地で培養されたものとのほうが類似していた。効果は、ＰＤＧＦ−ＢＢの場合のほうがさらに顕著であった。
【０１３４】
４日目および７日目時点での細胞増殖量を、１日目（ベースライン）時点での増殖量に正規化した。ＰＤＧＦが添加されているＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル由来の培地上清（すなわち、放出されたＰＤＧＦを含有する培地）で７日間培養した場合は、ＨＭＳＣ増殖量は増える傾向があったが、その差は有意ではなかった（ｐ＞０．０５）（図１０および１１）。新しく添加されたＰＤＧＦを有する培地で培養した細胞の増殖量のほうが、有意に多かった。
【０１３５】
ＰＤＧＦが添加されているＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル由来の上清で培養したＨＭＳＣ中でのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、ＰＤＧＦを添加されていないＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル由来の上清で培養したＨＭＳＣ中、および、新しく添加されたＰＤＧＦを含有する培地で培養したＨＭＳＣ中でのものより有意に低かった（図１２および１３）。
【０１３６】
アルシアンブルー（軟骨形成分化の指標）およびアリザリンレッド（後の骨形成分化の指標）は両方とも、７日までの全ての時点において芳しくなかった。
【０１３７】
全般に、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄフィブリンゲルから放出されたＰＤＧＦの存在下でのＨＭＳＣ挙動の観察された変化は全て、ＰＤＧＦ−ＢＢの場合のほうが、より顕著であった。全体的に見ると、結果は、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄフィブリンゲルから放出されたＰＤＧＦは、依然として生物学的活性を有し、ＨＭＳＣの形態変化およびＡＬＰ活性の阻害を主に誘導することを示した。
【０１３８】
（実施例７）
ＰＤＧＦ−ＢＢが、フィブリンゲル内部に播種されたＨＭＳＣおよびフィブリンゲルの表面上に播種されたＨＵＶＥＣに及ぼす効果
ＰＤＧＦが、フィブリンゲル中に播種されたＨＭＳＣおよびゲルの表面上に播種されたヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ Ｉｎｃ．）の挙動に及ぼす効果を分析するために、材料および方法に記載の要領で、細胞を含むゲルを調製した。
【０１３９】
手短に言えば、単一の培養細胞（ＨＭＳＣまたはＨＵＶＥＣ）またはＨＭＳＣ：ＨＵＶＥＣ比が４：１の共培養細胞を用いて、１０ｍｇ／ｍｌのＦＣと２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）とを含有するゲルを調製した。組換えＰＤＧＦ−ＢＢ（ゲル０．３ｍｌ当たり６０ｎｇ）を、ゲルの調製時点で、共培養ゲルの半分においてＦＣ中に加えた。添加用血清を含有する内皮細胞成長用の培養培地（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ Ｉｎｃ．）を用いて、ゲルを５％ＣＯ２中にて３７℃で最長２１日間インキュベートした。１日目、７日目、１４日目および２１日目に細胞の形態および増殖量ならびに骨形成分化の分析を実施した。
【０１４０】
蛍光顕微鏡分析からは、単一の培養ゲル中に播種した場合のほうが、時間の経過に伴い、ＨＭＳＣは、均等に分散し、数が多く、また、より細長い形状を有したことが示された。ＨＭＳＣは、ＰＤＧＦ−ＢＢが添加された共培養ゲル中でも均等に分散し細長くなったが、こちらのほうがサイズは小さく数が少なく、さらに、ＰＤＧＦ−ＢＢが添加されていない共培養ゲルの底に向かって遊走する傾向があった。相互接続した細胞−細胞ネットワークへのＨＵＶＥＣの再構築（血管新生の初期事象）は、ＰＤＧＦ−ＢＢが添加されていない共培養ゲルと比較して、単一の培養ゲル中および添加されたＰＤＧＦ−ＢＢを含有する共培養ゲル中におけるほうがより早く開始し、生じる程度はより大きかった。
【０１４１】
細胞増殖量は、時間の経過に伴って増加した。ＰＤＧＦ−ＢＢが添加されているゲルと添加されていないゲルとの間で有意差は観察されなかったが、添加されたＰＤＧＦ−ＢＢを含有するゲル中でのほうが、７日目および１４日目に増殖量が多い傾向が認められた。ＡＬＰ活性は低レベルのままであったが、これは、ゲル中に添加されたＰＤＧＦ−ＢＢはゲル中に播種されたＨＭＳＣの骨形成分化を誘導しなかったことを示唆するものである。
【０１４２】
（実施例８）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＰＤＧＦの結合
ＳＰＲを用いて、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢとＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤのＦＣ成分との間の相互作用を特徴付けた。この相互作用のセンサーグラムを図１４Ａ〜１４Ｂに示す。曲線の結合および解離部分をプロットし、非線形回帰分析を用いて、それぞれ１相の指数関数の結合・解離曲線に当てはめた（図１４Ｃ）。図１４Ｂが示すように、ＰＤＧＦ−ＢＢについての解離曲線は２相である。このため、ＰＤＧＦ−ＢＢとＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤのＦＣ成分との間の相互作用についてのＫＤ値の正確な定量は不可能であった。しかしながら、ＳＰＲは、ＰＤＧＦ−ＡＢのＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤのＦＣ成分との相互作用についてのＫＤ値を計算するためには首尾よく用いられた（緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の存在下で）。センサーグラムの結合相の分析により速度定数（Ｋｏｂｓ）が得られ、これを分析対象物の濃度に対してプロットした（図１４Ｃ）。このプロットを線形回帰により分析して勾配および切片を得たが、これらはそれぞれ、結合速度（Ｋｏｎ）定数、解離速度（Ｋｏｆｆ）定数に相当する。解離速度定数を結合速度定数で割ることにより、平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。
【０１４３】
平衡解離定数（ＫＤ）は、結合センサーグラムの解離相に頼った補足的な方法によっても定量した。この方法では、ＰＤＧＦ−ＡＢについての解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を、センサーグラムの解離相の非線形回帰分析から計算した。解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を結合速度定数（Ｋｏｎ）（これらの定数は、センサーグラムの結合相の分析から得た）で割ることにより、解離平衡定数（ＫＤ）を測定した。
【０１４４】
いずれの方法を使用した場合も、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤのＦＣ成分に結合するＰＤＧＦ−ＡＢについてのＫＤ値は、３４２±４１ｎＭであった。
【０１４５】
まとめ
前述のようにして測定した放出動態から、フィブリンゲル中に加えた組換えＰＤＧＦはゲルから徐々に放出されることが示されたが、このことは、ＰＤＧＦがフィブリン（フィブリノーゲン）と結合相互作用することを示唆するものである。この結合相互作用は、１０日後の累積放出量が、最初に加えたＰＤＧＦの量より少なかったことによりさらに確認された。ＰＤＧＦ−ＢＢは、ＰＤＧＦ−ＡＢより速く放出されるようであり（ＰＤＧＦ−ＢＢの保持率のほうが低い）、ＦＣ濃度は、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤフィブリンゲルからのＰＤＧＦ−ＢＢ放出速度に影響するようであったが、このことから、さまざまなＦＣ濃度を用いればＰＤＧＦ−ＢＢの放出速度を制御できるであろうということが示唆される。全体的に見ると、これらの結果から、この２つの型のＰＤＧＦとフィブリンとの結合相互作用（特にＰＤＧＦ−ＡＢ）が示唆される。ＳＰＲを用いると、結果は、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢは両方ともＴＩＳＳＥＥＬのＦＣ成分に結合することを示した。最後に、生物学的活性の結果から、放出されたＰＤＧＦは依然として生物学的活性を有し、ＨＭＳＣの形態変化を主に誘導するが、骨形成および／または軟骨形成の分化は誘導しないことが実証された。
【０１４６】
結論として、本試験から、フィブリンゲルは生物活性を有するＰＤＧＦを送達するための有望な担体系であることが示唆され、また、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＢＢを結合させる、ＴＩＳＳＥＥＬフィブリンシーラントのＦＣ成分に内在する特性が実証された。
【０１４７】
前述の例証的な実施例に記載したような本発明の多数の改変および変形が、当業者には思い浮かぶと考えられる。したがって、添付の特許請求の範囲中に記載されるとおりの制限のみが、本発明について設けられるべきである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／９３６，１９８号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、全般には、筋骨格疾患および血管疾患などの治療用途に向けた、可逆的結合によるｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出のための血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含有するフィブリンシーラントに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
フィブリンシーラントは、ヒトの血液凝固タンパク質で作製され、出血を制御するために外科手術中に典型的に使用される一種の外科手術用の「糊」である。こうしたシーラント中の成分は、施用中に相互作用して、血液タンパク質のフィブリンから構成される安定な凝血塊を形成する。フィブリンシーラントは、以下のようないくつかの異なる目的で、現在外科手術中に使用されている：外科医が手術している領域において出血を制御すること、創傷治癒を促進すること、中空の体器官を閉鎖し、または標準的な縫合糸によりできた孔を覆うこと、外科手術中に露出した組織への医薬の徐放送達をもたらすこと。
【０００４】
フィブリンシーラントは、一般に、以下の２つのヒト血漿由来成分から成る：（ａ）フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンで主に構成され、触媒量の第ＸＩＩＩ因子およびプラスミノーゲンを添加された高濃度のフィブリノーゲン複合体（ＦＣ）、ならびに（ｂ）強力なトロンビン。フィブリンシーラントは、アプロチニンを含有してもよい。トロンビンの作用により、まず（可溶性の）フィブリノーゲンがフィブリンモノマーに変換されるが、これが自然に凝集して、いわゆるフィブリン塊を形成する。同時に、この溶液中に存在する第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）がカルシウムイオンの存在下でトロンビンにより活性化されて第ＸＩＩＩａ因子となる。凝集したフィブリンモノマーと、存在する可能性がある残存フィブロネクチンとが架橋して、新しいペプチド結合が形成されることにより高重合体が形成される。この架橋反応により、形成される凝血塊の強度は実質的に高まる。一般に、凝血塊は、創傷および組織の表面に良好に付着し、このことが接着および止血の効果につながる。（特許文献１）。そのため、フィブリン接着剤は、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分と、カルシウムイオンを追加的に含有するトロンビン成分とを共に含む２成分接着剤として使用されることが多い。
【０００５】
フィブリンシーラントの格別な利点は、接着剤／ゲルは異物としてその施用部位に残るのではなく、自然な創傷治癒におけるのと全く同じように完全に再吸収され、新しく形成される組織で置き換わられることである。多様な細胞、例えば、マクロファージ、および、次いで線維芽細胞がゲル中に遊走し、ゲルの材料を溶解および再吸収して新しい組織を形成する。フィブリンシーラントは、ｉｎ ｓｉｔｕでフィブリンゲルを形成するために使用されており、こうしたフィブリンゲルは、細胞および成長因子の送達に使用されている（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００６】
組織修復のためには、フィブリンゲルなどのマトリックス中に成長因子および細胞を局在させることが望ましい。例えば、フィブリンゲルは、ウシ胎仔血清、サンゴ顆粒およびリポソームなどの多様な複合混合物の形態で、ＴＧＦ−βの送達のために使用されている（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。フィブリンゲルから成長因子を送達するための代替手段には、成長因子に結合されるトランスグルタミナーゼ基質、抗体およびＶＥＧＦ断片を含むコンジュゲートが含まれる（例えば、特許文献２、特許文献３および特許文献４を参照、これらは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。さらに、創傷治癒を促進するための薬物送達マトリックスについて記載された特許文献４も参照。加えて、フィブリンゲルは、細胞の成長（例えば、ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ））および増殖のみならず、マトリックス中でのＦＣおよびトロンビンの濃度によっては骨形成分化もある程度誘導することが示されている（非特許文献７）。
【０００７】
フィブリンシーラントが成長因子を体内の特定の部位に送達する能力は有益である可能性があるが、組織の適切な再成長には、適切な処理が確実に行われるように、当該部位へ特定の速度で送達される成長因子またはサイトカインが継続的／安定的に供給されることが必要である場合が多い。このことは、治療用タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が短い場合に特に当てはまる。現在使用されているフィブリンシーラントにより、中に入れてある薬物または薬剤を遅延放出させることはいくらか可能ではあるが、シーラント中に薬剤がとどまる期間を延ばすことができれば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける長期の組織修復が改善されると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，２４１，６０３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５０６，３６５号明細書
【特許文献３】米国特許第６，７１３，４５３号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／００１２８１８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｏｘら、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ、１０巻、９４２〜９５４頁、２００４年
【非特許文献２】Ｗｏｎｇら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ、８９巻、５７３〜５８２頁、２００３年
【非特許文献３】Ｆｏｒｔｉｅｒら、Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ、５８巻（１号）、６６〜７０頁、１９９７年
【非特許文献４】Ａｒｎａｕｄら、Ｃｈｉｒｕｒｇｉｅ Ｐｌａｓｔｉｑｕｅ Ｅｓｔｈｅｔｉｑｕｅ、３９巻（４号）、４９１〜４９８頁、１９９４年
【非特許文献５】Ａｒｎａｕｄら、Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ、５４巻、４９３〜４９８頁、１９９４年
【非特許文献６】Ｇｉａｎｎｏｎｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８３巻（１号）、１２１〜１２３頁、２００３年
【非特許文献７】Ｃａｔｅｌａｓら、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ、１２巻、２３８５〜２３９６頁、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、当技術分野では、多様な状態および障害の治療のためにｉｎ ｖｉｖｏで成長因子を送達するための有効な手段を開発する必要性、フィブリンゲルから成長因子を制御放出するための改善された方法を開発する必要性が、今も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの制御放出（成長因子の可逆的結合により）のための血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含むフィブリンシーラントの組成物を提供する。さらに、本発明は、シーラントを製剤するために使用されるフィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分の含有量を加減することによりフィブリンシーラントからのＰＤＧＦタンパク質の放出を加減する方法も提供する。状態または障害の治療のためには、フィブリンシーラントから一旦放出されたＰＤＧＦがその生物学的活性を保持することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでその期待される生物学的活性を当該ＰＤＧＦが媒介できるようにすることが企図される。
【００１２】
一態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質の、ＦＣ成分、トロンビン成分およびＰＤＧＦ成分の混合により作製されるフィブリンシーラントからの放出を加減する方法であって、ａ）公知の初期量のＰＤＧＦと公知の最終濃度のＦＣとを有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＰＤＧＦの量を定量することと、ｂ）ステップ（ａ）の該第１のフィブリンシーラント中で使用されるＦＣの該公知の最終濃度を加減して、第２のフィブリンシーラントであり、該第２のシーラント中のＦＣの濃度を該第１のシーラント中のＦＣの該公知の最終濃度と比較して高くすることにより、該第２のシーラントからのＰＤＧＦの放出速度がステップ（ａ）の該第１のシーラントからのＰＤＧＦの放出と比較して減少し、かつ、ステップ（ａ）における該第１のシーラントと同じ初期量のＰＤＧＦを有する第２のフィブリンシーラントを作製することとを含む方法を提供する。
【００１３】
関連する一態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択されるＰＤＧＦタンパク質の、ＦＣ成分、トロンビン成分およびＰＤＧＦ成分の混合により作製されているフィブリンシーラントからの放出を加減する方法であって、ａ）公知の初期量のＰＤＧＦと公知の最終濃度のＦＣとを有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＰＤＧＦの量を定量することと、ｂ）ステップ（ａ）の該第１のフィブリンシーラント中で使用されるＦＣの該公知の最終濃度を加減して、第２のフィブリンシーラントであり、該第２のシーラント中のＦＣの濃度を該第１のシーラント中のＦＣの該公知の最終濃度と比較して低くすることにより、該第２のシーラントからのＰＤＧＦの放出速度がステップ（ａ）の該第１のシーラントからのＰＤＧＦの放出と比較して増加し、かつ、ステップ（ａ）における該第１のシーラントと同じ初期量のＰＤＧＦを有する第２のフィブリンシーラントを作製することとを含む方法を提供する。
【００１４】
一実施形態では、第１または第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度は、約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内である。関連する一実施形態では、第１または第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度は、約５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
【００１５】
別の実施形態では、第１のフィブリンシーラント中の最終のＦＣ濃度は、第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度とは約１ｍｇ／ｍｌから約１４９ｍｇ／ｍｌ異なることが企図される。さらなる一実施形態では、第１のフィブリンシーラント中の最終のＦＣ濃度は、第２のシーラント中のＦＣ濃度とは約５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌ異なる。さらに別の実施形態では、第１のフィブリンシーラント中の最終のＦＣ濃度は、第２のシーラント中のＦＣ濃度とは、約１０ｍｇ／ｍｌから約６０ｍｇ／ｍｌ異なる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、第１または第２のシーラント中のトロンビン成分の最終濃度は、約１ＩＵ／ｍｌから２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内であることが企図される。別の実施形態では、第１または第２のシーラント中のＰＤＧＦの最終濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００１７】
別の態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択されるＰＤＧＦタンパク質の制御放出を必要とする患者において該タンパク質を制御放出する方法であって、前記患者に、ＰＤＧＦを含むフィブリンシーラントであり、該ＰＤＧＦの少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持されるフィブリンシーラントを投与することを含む方法を企図する。
【００１８】
関連する一態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択されるＰＤＧＦタンパク質の制御放出を必要とする患者において該タンパク質を制御放出する方法であって、前記患者に、ＰＤＧＦを含むフィブリンシーラントであり、該ＰＤＧＦの少なくとも２０％が該フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持されるフィブリンシーラントを投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
フィブリンシーラントから放出されたＰＤＧＦは生物学的に活性であることが企図される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも３５％から９０％が、フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される。関連する一実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも４５％から７５％が、フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される。さらなる一実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも６０％が、フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される。
【００２１】
別の実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも２５％から７５％が、フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される。関連する一実施形態では、前記ＰＤＧＦの少なくとも４５％から５５％が、フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される。
【００２２】
関連する一実施形態では、このフィブリンシーラントは、３日間または１０日間のいずれかまたは両方の期間にわたって前述の範囲の放出動態を有していてもよいことが企図される。
【００２３】
一実施形態では、このフィブリンシーラントは、ＦＣ成分とトロンビン成分とを合わせて混合物にすることにより作製される。別の実施形態では、ＰＤＧＦは、ＦＣ成分をトロンビン成分と混合する前にＦＣ成分に加えられる。さらなる一実施形態では、ＰＤＧＦはトロンビン成分に加えられる。
【００２４】
関連する一実施形態では、ＰＤＧＦの放出量は、毎日決まった量ずつ減少してもよいことが企図される。例えば、フィブリンシーラント中のＰＤＧＦの量は、１日約１％ずつ、１日約２％ずつ、１日約３％ずつ、１日約４％ずつ、１日約５％ずつ、１日約６％ずつ、１日約７％ずつ、１日約８％ずつ、１日約９％ずつもしくは１日約１０％ずつ減少してもよく、または、所望の放出量を、フィブリンシーラントを製剤するために用いられるＦＣ濃度もしくはトロンビン濃度に基づいて調節してもよい。
【００２５】
本発明は、シーラント中のＦＣ成分の最終濃度が約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内であることを企図する。さらに、いくつかの実施形態では、シーラント中のトロンビン成分の最終濃度は、約１ＩＵ／ｍｌから２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内であることが企図される。一実施形態では、最終のＦＣ濃度は、約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌまたは約４０ｍｇ／ｍｌであり、最終のトロンビン濃度は約２ＩＵ／ｍｌである。
【００２６】
一実施形態では、シーラント中の最終のＰＤＧＦ濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである。
【００２７】
さらなる一実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＡＢであることが企図される。一実施形態では、前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも４０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される。さらなる一実施形態では、前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも８０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される。
【００２８】
関連する一実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢであることが企図される。一実施形態では、前記ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも５５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される。
【００２９】
さらなる一態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択されるＰＤＧＦタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出から利益を得る障害または疾患に罹患している患者を治療する方法であって、前記患者に、ＰＤＧＦタンパク質を含むフィブリンシーラントであり、該ＰＤＧＦの制御放出であり、該ＰＤＧＦの少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦが、前記障害または疾患を治療するのに有効な速度で放出される制御放出をもたらすフィブリンシーラントを投与することを含む方法を企図する。
【００３０】
さらなる一態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される生物活性を有するＰＤＧＦタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出から利益を得る障害または疾患に罹患している患者を治療する方法であって、前記患者に、該ＰＤＧＦタンパク質を含むフィブリンシーラントであり、該ＰＤＧＦの制御放出であり、該ＰＤＧＦの少なくとも２０％が該フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持され、前記ＰＤＧＦが、前記障害または疾患を治療するのに有効な速度で放出される制御放出をもたらすフィブリンシーラントを投与することを含む方法を企図する。
【００３１】
さらに、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択されるＰＤＧＦタンパク質を含み前述のようなＰＤＧＦの制御放出をもたらすフィブリンシーラントの、ＰＤＧＦタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出から利益を得る障害または疾患に罹患している患者を治療するための医薬の製造における使用も提供する。
【００３２】
本発明は、前述の放出動態が、ＰＤＧＦタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出から利益を得る患者を治療する方法、または、前記患者を治療するための医薬の製造におけるフィブリンシーラントの使用に適用可能であることを企図する。
【００３３】
一態様では、患者は、ＰＤＧＦのｉｎ ｖｉｖｏでの制御放出から利益を得る疾患に罹患しており、そのような疾患は当業者には明らかと考えられる。一実施形態では、疾患または障害は、筋骨格の疾患または障害、軟部組織の疾患または障害および心血管疾患から成る群から選択される。
【００３４】
一実施形態では、フィブリンシーラントは、注射、噴霧、内視鏡による投与または予め形成されたゲルなど当技術分野で周知の方法を、単独で、または他の材料と組み合わせて、さらには当業者に公知の他の方法を用いて、患者に投与される。
【００３５】
さらに、本発明は、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される生物活性を有するＰＤＧＦタンパク質を含み所望のＰＤＧＦ放出速度を有するフィブリンシーラントを調製するためのキットであって、ａ）場合によりＰＤＧＦ成分を含む、ＦＣ成分を含有する第１のバイアルまたは第１の保存容器と、ｂ）トロンビン成分を有する第２のバイアルまたは第２の保存容器とを備え、前記第１のバイアルまたは第１の保存容器にＰＤＧＦ成分を含まない場合にはＰＤＧＦ成分を有する第３のバイアルまたは第３の保存容器を場合により含有し、該キットの使用のための取扱説明書をさらに含有するキットを提供する。このキットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの該フィブリンシーラントの使用または投与のための取扱説明書をさらに備えてもよい。
【００３６】
本発明が有する他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この詳細な説明および具体例は、本発明の具体的な実施形態を示すものではあっても、例証のためにのみ提供するものであることは理解されるべきであり、それは、この詳細な説明から、本発明の精神および範囲内での多様な変形および改変が当業者には明らかになると考えられるからである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＰＤＧＦ−ＡＢの量がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌおよび［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）からのその累積放出量に及ぼす効果を示すグラフである。
【図２】ＰＤＧＦ−ＢＢの量がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌおよび［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）からのその累積放出量に及ぼす効果を示すグラフである。
【図３】ＦＣ濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル（［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）からのＰＤＧＦ−ＡＢの１日の放出量（図３Ａ）および累積放出量（図３Ｂ）に及ぼす効果を示すグラフである。
【図４】ＦＣ濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル（［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）からのＰＤＧＦ−ＢＢの１日の放出量（図４Ａ）および累積放出量（図４Ｂ）に及ぼす効果を示すグラフである。
【図５】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄのロット番号がＰＤＧＦ−ＡＢの累積放出量に及ぼす効果を示すグラフである（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）。
【図６】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄのロット番号がＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出量に及ぼす効果を示すグラフである（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）。
【図７】ＰＤＧＦ−ＢＢの量がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨゲル（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌおよび［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）からのその累積放出量に及ぼす効果を示すグラフである。
【図８】ＦＣ濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨゲル（［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）からのＰＤＧＦ−ＢＢの１日の放出量（図８Ａ）および累積放出量（図８Ｂ）に及ぼす効果を示すグラフである。
【図９】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨのロット番号がＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出量に及ぼす効果を示すグラフである（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）。
【図１０】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲルから放出されたＰＤＧＦ−ＡＢが、単層中で７日まで培養されたＨＭＳＣの増殖に及ぼす効果を示すグラフである。
【図１１】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲルから放出されたＰＤＧＦ−ＢＢが、単層中で７日まで培養されたＨＭＳＣの増殖に及ぼす効果を示すグラフである。
【図１２】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲルから放出されたＰＤＧＦ−ＡＢがＡＬＰ活性に及ぼす効果を示すグラフである（増殖について正規化）。
【図１３】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲルから放出されたＰＤＧＦ−ＢＢがＡＬＰ活性に及ぼす効果を示すグラフである（増殖について正規化）。
【図１４】ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄに由来するＦＣと相互作用するＰＤＧＦ−ＡＢ（図１４Ａ）およびＰＤＧＦ−ＢＢ（図１４Ｂ）のセンサーグラムである。図１４Ｃは、ＰＤＧＦ−ＡＢの、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄに由来するＦＣとの相互作用についての結合・解離速度定数の、グラフによる定量を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、筋骨格疾患、軟部組織障害および血管疾患の治療などの治療用途における、可逆的結合によるｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出のためのＰＤＧＦを含有するフィブリンゲルを提供する。本発明は、このゲルから放出されるＰＤＧＦがその生物学的活性を保持することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのフィブリンシーラントからの放出で所望の生物学的活性が調節されるようにすることを企図する。本発明は、さらに、所望のＰＤＧＦ放出動態を得るためのフィブリンシーラントを製剤するうえで有用なＦＣ成分またはトロンビン成分の濃度を定量する方法も提供する。
【００３９】
別に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。以下の参考文献から、当業者は、本発明において使用する用語の多くの一般定義を得られる：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（第２版、１９９４年）；ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８年）；ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ、第５版、Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１年）；ならびに、ＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１年）。
【００４０】
本明細書中で引用する刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それぞれ、参照により、本開示と矛盾しない範囲でその全体が組み込まれる。
【００４１】
本明細書中および添付の特許請求の範囲中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうでないことが文脈により明らかに述べられる場合を除いて複数形への言及も包含することを、ここに記しておく。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、以下の用語は、他に明記しない限り、それらが元来持つ意味を有する。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、用語「フィブリンシーラント」、「フィブリンゲル」、「フィブリン接着剤」、「フィブリン塊」または「フィブリンマトリックス」は互換的に使用され、細胞成長と、時間の経過に伴う生物活性材料の放出とのための足場として作用できる、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分とトロンビン成分とを少なくとも含む三次元のネットワークを指す。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、用語「制御放出」と「遅延放出」とは同じ意味を有し、フィブリンゲル中で薬剤（例えば成長因子）が保持されることを指す。制御放出は、拡散により、または、結合された成長因子が解離し、次いでそれがゲルから拡散することにより、成長因子の分泌／放出を低速化および安定化させることによるのみならず、マトリックスの分解および酵素的切断によるものでもある。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、「ｉｎ ｓｉｔｕでの形成」は、生理的温度で、および体内の注射部位での形成、または、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件でのフィブリンシーラントの形成のいずれかを指す。この用語は、フィブリンシーラント中での前駆体分子（投与前および投与時点では実質的に架橋していない）間の共有連結の形成を記載するために典型的に用いられる。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、「フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分」は、トロンビンと混合されると凝血塊様のフィブリンシーラントになるフィブリン／フィブリノーゲン溶液を指す。ＦＣは、フィブリノーゲンとフィブロネクチンとから主に構成され、触媒量のＦＸＩＩＩおよびプラスミノーゲンを含有してもよい。ＦＣ成分は、シーラータンパク質と呼ぶこともある。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、「トロンビン成分」は、結果として凝血塊様のフィブリンシーラントになるＦＣ成分と混合されるトロンビン溶液を指す。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、「血小板由来成長因子成分」または「ＰＤＧＦ成分」は、液状のフィブリンシーラントに加える、溶液形態の成長因子の添加物を指す。ＰＤＧＦ成分、ＦＣ複合成分およびトロンビン成分のそれぞれを別々に加えて、ＰＤＧＦを含むフィブリンシーラントを形成してもよい。場合により、ＰＤＧＦ成分は、トロンビン成分と混合する前に液体ＦＣ成分に、または、ＦＣ成分と混合する前にトロンビン成分に、加える。ＰＤＧＦ成分は、ＰＤＧＦ−ＡＢもしくはＰＤＧＦ−ＢＢのいずれか、または、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢの両方を含んでもよい。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、「組換えヒトＰＤＧＦ」は、組換えＤＮＡ技術により得られる組換えヒト血小板由来成長因子（ｒｈＰＤＧＦ）を指す。組換えヒトＰＤＧＦは、当技術分野で公知の任意の方法により作製してもよい。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、用語「生物活性を有する」または「生物学的に活性である」は、溶液中またはフィブリンシーラント中のタンパク質（例えばＰＤＧＦタンパク質）が、自然に発現する（すなわち、組換えにより発現するか、またはｉｎ ｖｉｖｏで発現するかいずれかの場合の）タンパク質と比較した場合に、同じまたは同様の生物学的活性を呈する生物学的特性を指す。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、「検出可能な部分」、「検出可能な標識」または「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的な手段により検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるような）、ビオチンストレプトアビジン、ジオキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ハプテン、および、当該タンパク質に対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質、または、標的と相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能な部分は、放射性、発色性または蛍光性のシグナルなど測定可能なシグナルを発することが多く、このシグナルを用いて、試料中の結合している検出可能な部分の量を定量化できる。
【００５２】
フィブリンシーラント
多くの形態のフィブリンがフィブリンシーラントとして使用可能である。フィブリンゲルは、自己血漿、クリオプレシピテート血漿（例えば、市販のフィブリン糊キット）、血漿から精製したフィブリノーゲン、ならびに、組換えフィブリノーゲンおよび第ＸＩＩＩａ因子から合成できる。こうした材料のそれぞれからは、生化学組成物中での差異が小さい本質的に類似したマトリックスが得られる（Ｓｉｅｒｒａ ＤＨ、Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ａｐｐｌ、７巻、３０９〜３５２頁、（１９９３年））。これらの材料間の類似性は、特異的な酵素的生物活性および全般的な治癒応答の両方において存在する。
【００５３】
本発明において有用なフィブリンゲルは、フィブリンシーラントから形成されるが、フィブリンシーラントは、２つの主要な成分、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）およびトロンビンから成る。ＦＣは、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンで主に構成され、触媒量のＦＸＩＩＩおよびプラスミノーゲンを含有してもよい。ＦＣ成分およびトロンビン成分は、一般にはヒト血漿に由来するが、組換え／遺伝子工学の手法によって作製してもよい。フィブリンシーラントの例は、ＵＳ５，７１６，６４５、ＵＳ５，９６２，４０５、ＵＳ６，５７９，５３７に記載があり、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨおよびＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄ（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア）が挙げられる。
【００５４】
フィブリンゲルを形成するためには、パッケージの取扱説明書に従ってまずＦＣを再構成、解凍または他の方式で調製し、必要に応じて、希釈緩衝液を用いてさらに希釈してから、この液体ＦＣに治療剤を加える。あるいは、治療剤は、トロンビン成分中に加えてもよい。大部分の市販のフィブリンシーラントは、アプロチニンなどのゲル溶解阻害薬を含んでおり、使用者の判断で、これをＦＣに加えてもよい。アプロチニンおよび他のゲル溶解阻害薬についての説明は、ＷＯ９９／１１３０１に示されている。トロンビン成分も、ＣａＣｌ２溶液を用いて再構成して液状にし、必要に応じて、希釈緩衝液を用いてさらに希釈する。トロンビン成分は、ＰＤＧＦをさらに含むＦＣ成分と混合してフィブリンゲルを形成することが企図される。アプロチニン成分を含まないフィブリンシーラントも設計されている（ＥＶＩＣＥＬ、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）。
【００５５】
組織接着剤として使用できるフィブリノーゲン含有調製品を作製する追加的な方法としては、それぞれ、クリオプレシピテートからの作製（場合により、エタノール、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、グリシンまたはβアラニンを用いた洗浄および沈降ステップをさらに伴う）、および、公知の血漿分画法の範囲内での血漿からの作製が挙げられる（例えば、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ」、１９８０年、Ｃｕｒｌｉｎｇ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、３〜１５頁、３３〜３６頁および５７〜７４頁、または、Ｂｌｏｍｂｃｋ Ｂ． ａｎｄ Ｍ．、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ」、Ａｒｋｉｖ Ｋｅｍｉ、１０巻、１９５９年、４１５頁ｆ．を参照）。フィブリンシーラントは、患者自身の血漿を用いて作製してもよい。例えば、ＣＲＹＯＳＥＡＬ（Ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｃｏｒｐ．、Ｒａｎｃｈｏ Ｃｏｒｄｏｖａ、ＣＡ）またはＶＩＶＯＳＴＡＴ（Ｖｉｖｏｌｕｔｉｏｎ Ａ／Ｓ、デンマーク）のフィブリンシーラント系は、患者の血漿から自己フィブリンシーラント成分の作製を可能にする。フィブリンシーラントの成分は、凍結乾燥されたもの、液体を急速冷凍したもの、または液体の形で入手できる。
【００５６】
所望の制御放出の型をもたらすために、フィブリンゲルの成分は、適切な濃度で加える。ＦＣ成分は、限定されるものではないが５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、最大１５０ｍｇ／ｍｌ（ゲル中の最終濃度）などさまざまな濃度で、または必要に応じ中間の濃度で、加えてもよい。さらに、そのような濃度のＦＣ成分は、限定されるものではないが１ＩＵ／ｍｌ、２ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ、７ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、１５ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、２５ＩＵ／ｍｌ、３０ＩＵ／ｍｌ、３５ＩＵ／ｍｌ、４０ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ、６０ＩＵ／ｍｌ、７０ＩＵ／ｍｌ、８０ＩＵ／ｍｌ、９０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、１２５ＩＵ／ｍｌ、１５０ＩＵ／ｍｌ、１７５ＩＵ／ｍｌ、２００ＩＵ／ｍｌ、２２５ＩＵ／ｍｌおよび２５０ＩＵ／ｍｌなど適切な任意の濃度、または必要に応じ中間の濃度のトロンビン成分と組み合わせてもよい。
【００５７】
治療剤用の制御放出系を作製するためにＰＤＧＦなどの薬剤をフィブリンシーラント組成物に加えることが企図される。ＰＤＧＦは、適切な遅延放出製剤をもたらす任意の濃度（ＰＤＧＦは１ｎｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍＬの範囲内）で加えてもよい。フィブリンシーラント中のＰＤＧＦの例示的な濃度としては、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
フィブリンシーラント中で使用されるＦＣまたはトロンビンの濃度は、フィブリンゲル中に加えたＰＤＧＦが数日から数週間かけて治療上有効量で放出されるような濃度であることが企図される。一態様では、ＰＤＧＦは、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日またはそれより長い期間、フィブリンゲルから放出される。
【００５９】
ＰＤＧＦは、持続する期間にわたりｉｎ ｓｉｔｕでＰＤＧＦが使用できるように、制御放出または遅延放出の様式でフィブリンシーラントから放出される。ＰＤＧＦの放出量は、毎日決まった量ずつ減少してもよく、例えば、ＰＤＧＦの濃度は、１日約１％、１日約２％、１日約３％、１日約４％、１日約５％、１日約６％、１日約７％、１日約８％、１日約９％または１日約１０％またはそれを超える濃度ずつ減少してもよいことが企図される。
【００６０】
関連する一実施形態では、フィブリンゲル中でＰＤＧＦの少なくとも２５％が少なくとも３日間保持されることが企図される。さらなる一実施形態では、フィブリンゲル中でＰＤＧＦの少なくとも３５％から９０％、少なくとも４５％から７５％、または少なくとも６０％が少なくとも３日間保持される。ＰＤＧＦの少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％または９０％がフィブリンゲル中で少なくとも３日間保持されることが、さらに企図される。
【００６１】
別の実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも２０％がフィブリンゲル中で少なくとも１０日間保持される。さらなる一実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも２５％から７５％、または４５％から５５％が少なくとも１０日間保持される。ＰＤＧＦの少なくとも２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％または７５％がフィブリンゲル中で少なくとも１０日間保持されることがさらに企図される。
【００６２】
本発明は、フィブリンシーラントの成分の濃度を加減することにより、所望の放出動態を有するフィブリンシーラントを製剤する方法を提供する。一態様では、この方法は、公知の初期量のＰＤＧＦと公知の最終濃度のＦＣとを有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＰＤＧＦの量を定量することと、ステップ（ａ）の第１のフィブリンシーラント中で使用されるＦＣの該公知の最終濃度を加減して、第２のフィブリンシーラントであり、該第２のシーラント中のＦＣの濃度を該第１のシーラント中のＦＣの該公知の最終濃度と比較して高めまたは低下させることにより、ステップの該第１のシーラントからのＰＤＧＦの放出と比較して該第２のシーラントからのＰＤＧＦの放出速度を調節し、ステップにおける該第１のシーラントと同じ初期量のＰＤＧＦを有する第２のフィブリンシーラントを作製することとを企図する。
【００６３】
一実施形態では、第１または第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度は、約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内である。関連する一実施形態では、第１のフィブリンシーラントのＦＣ濃度は、第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度とは約１ｍｇ／ｍｌから約１４９ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌ、または約１０ｍｇ／ｍｌから約６０ｍｇ／ｍｌ異なる。さらなる一実施形態では、第１のフィブリンシーラントの最終のＦＣ濃度は、第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度とは、約１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌまたはこれらの濃度の間の任意の量、最大約１４９ｍｇ／ｍｌ、異なる。
【００６４】
本発明において有用なフィブリンシーラントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用する目的で追加的な材料または薬剤と組み合わせてもよいことが企図される。そのような薬剤としては、限定されるものではないが以下のような追加的な治療剤が挙げられる：成長因子、サイトカイン、ケモカイン、血液凝固因子、酵素、ケモカイン、可溶性の細胞表面受容体、細胞接着分子、抗体、ホルモン、細胞骨格タンパク質、マトリックスタンパク質、シャペロンタンパク質、構造タンパク質、代謝タンパク質、およびそれ以外に当技術分野で公知のもの（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第６２版、２００８年、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪを参照）。
【００６５】
フィブリンシーラント中で有用な追加的な材料としては、筋骨格疾患用のシーラントと組み合わせることができると考えられる材料が挙げられ、そのような材料は、ポリマー、サンゴ、セラミックス、ガラス、金属、骨由来材料、ヒドロキシアパタイト、合成の足場材料、こうした材料の組合せ、および当技術分野で公知の他の材料を非限定的に含む耐荷重材料であってもよい（例えば、Ｇｕｅｈｅｎｎｅｃら、（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、８巻、１〜１１頁、２００４年）、米国特許第７，１２２，０５７号および米国特許第６，６９６，０７３号を参照）。
【００６６】
一実施形態では、このフィブリンゲルは、可逆的結合後、ならびに、ＦＣおよびトロンビンの濃度を調節することにより制御された様式で、生物学的に活性であるＰＤＧＦを送達するための担体系として使用できる。
【００６７】
本発明の一実施形態では、５ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を使用してＴＩＳＳＥＥＬ Ｖａｐｏｒ Ｈｅａｔｅｄ Ｓｏｌｖｅｎｔ／Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ（ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄ）でフィブリンゲルを作製すると、添加したＰＤＧＦ−ＢＢ（１５ｎｇ）の少なくとも約６５％がゲル中で３日後保持される。本発明の別の実施形態では、４０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を使用してＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄでフィブリンゲルを作製すると、添加したＰＤＧＦ−ＢＢ（１５ｎｇ）の少なくとも約８５％がゲル中で３日後保持される。したがって、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄで作製したフィブリンゲルを用いた場合、ＰＤＧＦ−ＢＢの保持期間は、ＦＣ濃度が高くなるにつれ長くなる。
【００６８】
本発明の別の実施形態では、２０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を使用して、異なるロット番号のＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨでフィブリンゲルを作製すると、１つのロットに由来するゲル中ではＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約７０％、第２のロットに由来するゲルでは約６０％、第３のロットに由来するゲルでは約４０％が、１０日後保持される。これらのロット間の１つの違いは、第ＸＩＩＩ因子の含有量である（それぞれ、４２．２Ｕ／ｍｌ、３３．９Ｕ／ｍｌおよび＜１Ｕ／ｍｌ）。本発明の別の実施形態では、２０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を使用して、異なるロット番号のＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄでフィブリンゲルを作製すると、全てのロットに由来するゲル中で、１０日後ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約６０％が保持される。ＰＤＧＦ−ＡＢ放出については、３つのロットのうち２つにおいて１０日目まで少なくとも約７５％が保持され、第３のロットにおいては約６８％の成長因子が１０日間保持された。
【００６９】
前述の実施形態は、市販のフィブリンシーラントからのＰＤＧＦ放出の例示的な実施形態であって、決して本発明を限定することを意図するものではないことは、当業者には理解されよう。
【００７０】
ＰＤＧＦタンパク質
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、創傷および骨折の治癒の初期段階中に血小板により分泌される。ＰＤＧＦは、骨芽細胞および間葉系前駆細胞の遊走を刺激することが示されている（Ｍｅｈｒｏｔｒａら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、９３巻、７４１〜５２頁、２００４年；Ｆｉｅｄｌｅｒら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、９３巻、９９０〜９８頁、２００４年）が、骨折治癒および骨修復におけるその役割ははっきり定義されていない。ＰＤＧＦは、血管新生という異なる側面も制御するが、骨成長中はそれ自体も決定的に重要である。ＰＤＧＦは、組織の正常な成長および発達に必要な基本過程であり、既存の血管からの新しい毛細血管の増殖に関わる血管新生を刺激するうえでも役割を担っている。血管新生の速度を増加させることは、数例を挙げれば、冠動脈および末梢血管の疾患など組織灌流低下を伴うものなど特定の障害において有用である。
【００７１】
ＰＤＧＦ−Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２５９８）およびＰＤＧＦ−Ｂ（（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２５９９）をホモ二量体化またはヘテロ二量体化して、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢの３つの異なるアイソフォームを作製できる。ＰＤＧＦ−Ａは、ＰＤＧＦα受容体（ＰＤＧＦＲ−α／αホモ二量体などのＰＤＧＦＲ−α）に結合できるのみである。ＰＤＧＦ−Ｂは、ＰＤＧＦＲ−αおよび第２のＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ−β）の両方に結合できる。より具体的には、ＰＤＧＦ−Ｂは、ＰＤＧＦＲ−α／αおよびＰＤＧＦＲ−β／βのホモ二量体、ならびにＰＤＧＦＲ−α／βのヘテロ二量体に結合できる。
【００７２】
ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＢＢは、間葉系由来の細胞に対する主要な分裂促進物質および化学誘引物質であるが、ＰＤＧＦＲ−αおよびβが両方とも内皮細胞（ＥＣ）上に発現するにもかかわらず、内皮系統の細胞に対しては、全くまたはほとんど効果をもたない。ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢは、新しく形成される血管の安定化／成熟に関与することが示されている（Ｉｓｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４１５巻、２３４〜９頁、２００２年；Ｖａｌｅら、Ｊ Ｉｎｔｅｒｖ Ｃａｒｄｉｏｌ、１４巻、５１１〜２８頁、２００１年）；Ｈｅｌｄｉｎら、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ、７９巻、１２８３〜１３１６頁、１９９９年；Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、２３巻、４９４〜５０７頁、２００１年）。しかしながら、他のデータからは、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＰＤＧＦ−ＢＢはＰＤＧＦＲ−αのシグナル伝達によりｉｎ ｖｉｖｏでのｂＦＧＦ誘導性の血管新生を阻害することが示された。ＰＤＧＦ−ＡＡは間葉系細胞の遊走の最も強力な刺激の１つであるが、この因子は、ＥＣの遊走を刺激しないか、またはごくわずかに刺激するかのいずれかである。特定の条件では、ＰＤＧＦ−ＡＡはＥＣの遊走を阻害さえする（Ｔｈｏｍｍｅｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４巻、４０３〜１３頁、１９９７年；Ｄｅ Ｍａｒｃｈｉｓら、Ｂｌｏｏｄ、９９巻、２０４５〜５３頁、２００２年；Ｃａｏら、ＦＡＳＥＢ． Ｊ．、１６巻、１５７５〜８３頁、２００２年）。さらに、ＰＤＧＦＲ−αは、ＰＤＧＦＲ−β誘導性のＳＭＣの遊走を拮抗することが示されており（Ｙｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２８２巻、６９７〜７００頁、２００１年）、ＰＤＧＦ−ＡＡに対する中和抗体は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）の遊走を促進する（Ｐａｌｕｍｂｏ， Ｒ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ．、２２巻、４０５〜１１頁、２００２年）。したがって、ＰＤＧＦ−ＡおよびＢの血管新生／動脈新生活性（特に、ＰＤＧＦＲ−αを介してシグナル伝達する場合の）については、議論が分かれている。
【００７３】
ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＢＢは、心血管および神経の幹細胞／前駆細胞の両方の増殖および分化において重要な役割を果たすことが報告されている。ＰＤＧＦ−ＡＡは、αｖβ３インテグリンを介してオリゴデンドロサイト前駆体の増殖を刺激した（Ｂａｒｏｎら、Ｅｍｂｏ． Ｊ．、２１巻、１９５７〜６６頁、２００２年）が、ＰＤＧＦ−ＢＢは、Ｆｌｋ１＋胚性幹細胞の血管壁細胞への分化を誘導し（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ， Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０８巻、４３〜４５頁、２０００年；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ、４０８巻、９２〜６頁、２０００年）、また、神経球由来のニューロンの生存を強力に高めた（Ｃａｌｄｗｅｌｌら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻、４７５〜４７９頁、２００１年）。
【００７４】
ＰＤＧＦタンパク質は、フィブリンゲルの製剤に使用されてきたが、成功の内容はさまざまであった。Ｔｈｏｍｏｐｏｕｌｏｕｓら（Ｊ Ｏｒｔｈ Ｒｅｓ、２５巻、１３５８〜６８頁、２００７年）は、フィブリノーゲン、トロンビン、ペプチド成分およびヘパリンを含むフィブリンゲルを調製し、さまざまな濃度のＰＤＧＦ−ＢＢをさらに加えて、成長因子の受動的放出動態を定量した。この試験から、成長因子の放出量は、フィブリンゲル中のヘパリンの量に依存することが示された。ＰＤＧＦは、血漿血小板Ｔ調製品を含むフィブリンゲル中でも検出されており（例えば、Ｙａｚａｗａら、Ｊ Ｃｒａｎｉｏｆａｃ Ｓｕｒｇ、１５巻、４３９〜４６頁、２００４年を参照）、フィブリン足場中の胚性幹細胞を刺激するために使用されている（Ｗｉｌｌｅｒｔｈら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．、２５巻、２２３５〜２２４４頁、２００７年）。
【００７５】
本発明にとって有用なＰＤＧＦ分子としては、完全長のタンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質のサブユニットまたは断片、およびその機能的誘導体が挙げられる。ＰＤＧＦと言った場合は、天然由来のタンパク質調製品を含め、そのようなタンパク質の、可能性のある全ての形態を包含することを意図している。
【００７６】
本発明によれば、組換えＰＤＧＦという用語は、特定の限定の根拠となるものではなく、組換えＤＮＡ技術により得られる任意のＰＤＧＦ（異種の、または天然に存在する）またはその生物学的に活性である誘導体を包含することがある。特定の実施形態では、この用語は、（１）少なくとも約２５、５０、１００、１５０、２００またはそれを超えるアミノ酸の領域にわたり、本明細書に記載の参照される核酸またはアミノ酸の配列によりコードされるＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢポリペプチドに対して約６０％超のアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、（２）本明細書に記載のような参照されるアミノ酸配列を備える免疫原、その免疫原性の断片、および、保存的に変異したその変異体に対して生じた抗体（例えばポリクローナル抗体）に特異的に結合する、（３）本明細書に記載のような参照されるアミノ酸配列、および、保存的に変異したその変異体をコードする核酸と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする、（４）少なくとも約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００、１５００、２０００またはそれを超えるヌクレオチドの領域（最大、成熟したタンパク質のヌクレオチドの完全長の配列）にわたり、本明細書に記載のような参照される核酸配列に対して約９５％超、約９６％超、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有するタンパク質および核酸、例えば、遺伝子、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびポリペプチド、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間の相同体を包含する。
【００７７】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列は、霊長動物（例えばヒト）、齧歯動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジまたは他の任意の哺乳動物を非限定的に含む哺乳動物に典型的に由来する。本発明の核酸およびタンパク質は、組換え分子（例えば、異種の、および、野生型配列をコードするものまたはその変異体、または天然に存在しないもの）であってもよい。ヒトＰＤＧＦの構造については、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）により維持されているＧｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅを参照されたい：ヒトＰＤＧＦ−Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２５９８、ＮＭ＿００２６０７．４）およびＰＤＧＦ−Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２５９９、ＮＭ＿００２６０８）。ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢは、ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂの配列のホモ二量体またはヘテロ二量体である。
【００７８】
ＰＤＧＦの作製は、（ｉ）遺伝子工学による（例えば、ＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅による）組換えＤＮＡの作製、（ｉｉ）形質移入による（例えば、電気穿孔法またはマイクロインジェクションによる）、組換えＤＮＡの、原核細胞または真核細胞中への導入、（ｉｉｉ）前記形質転換された細胞の培養（例えば、連続的またはバッチ式の様式で）、（ｉｖ）ＰＤＧＦの発現（例えば、構成的に、または導入時に）、および（ｖ）例えば陰イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによる、精製されたＰＤＧＦを得るための前記ＰＤＧＦの単離（例えば、培養培地から、または、形質転換された細胞の回収による）について当技術分野で公知の任意の方法を含んでもよい。
【００７９】
ＰＤＧＦは、薬理学上許容されるＰＤＧＦ分子を生成する特徴を有する適当な原核または真核の宿主系中での発現により作製できる。一般に使用される宿主細胞としては、グラム陰性菌またはグラム陽性菌などの原核細胞、すなわち、任意の系統の、Ｅ．ｃｏｌｉ、バシラス属、放線菌属、サッカロミセス属、サルモネラ属などが挙げられる。真核細胞の例は、Ｄ．Ｍｅｌ−２、Ｓｆ４、Ｓｆ５、Ｓｆ９およびＳｆ２１ならびにＨｉｇｈ５などの昆虫細胞；植物細胞、ならびに、サッカロミセス属およびピキア属などの多様な酵母細胞；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞などの哺乳動物細胞；ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；ヒト腎臓２９３細胞；ＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ２９３、ＳＫ−ＨｅｐおよびＨｅｐＧ２、ならびに、それ以外に当技術分野で公知のものである。本発明によるＰＤＧＦを作製または単離するために用いられる試薬または条件に何ら制限はなく、当技術分野で公知の、または市販の、任意のシステムを採用できる。本発明の好ましい一実施形態では、ＰＤＧＦは、最新技術において記載されるような方法により得られる。
【００８０】
ＰＤＧＦの調製には多種多様なベクターが使用でき、こうしたベクターは、当技術分野で周知の真核および原核細胞用の発現ベクターから選択できる。原核細胞の発現用のベクターの例としては、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどのプラスミドが非限定的に挙げられ、このとき原核細胞発現用のベクター中で使用されるプロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤなどが挙げられる。真核細胞発現用のベクターの例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）酵母菌中での発現用としては、ベクターはｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴなど、使用するプロモーターはＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１など；（ｉｉ）昆虫細胞中での発現用としては、ベクターはｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなど、使用するプロモーターはＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなど、および（ｉｉｉ）哺乳動物細胞中での発現用としては、ベクターはｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなど、および、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどのウイルス系に由来するベクター、使用するプロモーターはＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶおよびβアクチンなど。
【００８１】
ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有する宿主細胞を、細胞の成長およびＤＮＡまたはＲＮＡの発現に適した条件下で培養する。ポリペプチドを発現するそうした細胞は公知の方法を用いて同定でき、組換えタンパク質は公知の方法を用いて単離および精製できるが、ポリペプチド生成物の増幅は行っても行わなくてもいずれでもよい。同定は、例えば、タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの存在を示す表現型を表す遺伝子組換え哺乳動物細胞のスクリーニング（ＰＣＲスクリーニングなど）、サザンブロット分析によるスクリーニングまたはタンパク質の発現のスクリーニングにより実施できる。タンパク質をコードするＤＮＡを組み込んである細胞の選択は、選択可能なマーカーをＤＮＡ構築物中に含ませ、選択可能なマーカー遺伝子を含有する形質移入した、または感染させた細胞を、その選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞のみの生存に適した条件下で培養することにより達成できる。導入されたＤＮＡ構築物のさらなる増幅は、増幅に適した条件下で遺伝子組換え細胞を培養すること（例えば、増幅可能なマーカー遺伝子を含有する遺伝子組換え細胞を、その増幅可能なマーカー遺伝子の複数のコピーを含有する細胞のみが生存できる濃度の薬物の存在下で培養すること）により影響を及ぼすことができる。
【００８２】
本発明の一実施形態では、フィブリンゲルから放出されたＰＤＧＦの生物学的活性をテストした。ＰＤＧＦが添加されているゲルに由来する培地上清中の単層中で（すなわち、放出されたＰＤＧＦ−ＢＢを含有する培地中で）の培養後のヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）の形態がより細長い形状に変化すること、および、細胞増殖量が増える傾向があることから、放出された成長因子は生物学的活性を有することが示唆された。
【００８３】
試料中のタンパク質濃度を定量する方法。
【００８４】
治療用タンパク質は、内因的に生成する、天然に存在するタンパク質とよく似ていることから、血清試料中での検出が難しい場合が多い。しかしながら、治療用タンパク質が、より高い可溶性または安定性、酵素消化への耐性、改善された生物学的半減期などの所望の特徴、およびそれ以外にも当業者に公知の特色を呈するかどうかを評価するために投与された、治療用のポリペプチド、その断片、変異体または類似体の量を定量することは有益な場合が多い。こうした方法を用いれば、知的所有権により保護されている可能性がある治療用タンパク質の使用許諾を確認することも可能である。
【００８５】
本発明は、ＰＤＧＦを含有するフィブリンゲルからのＰＤＧＦの放出を検出し、このタンパク質の放出動態を定量する方法を用いる。さまざまな濃度のＦＣ成分を使用して作製されたフィブリンシーラントからのこうした放出動態の比較は、治療目的のための所望の放出速度を定量するのに役立つ。時間の経過に伴いフィブリンシーラントから放出されるタンパク質の量を同定できれば、半減期、吸収、安定性などに基づく最適な治療薬の定量の助けとなる。検出アッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）、または当技術分野で公知の他の結合アッセイであってもよい。
【００８６】
一般に、試料中でのＰＤＧＦの存在を検出するには、ＰＤＧＦを、抗体、可溶性の受容体もしくは他のタンパク質などのＰＤＧＦ結合剤、または、ＰＤＧＦに結合する薬剤に結合させる。
【００８７】
生物学的活性の検出ステップまたはテストのためには、ＰＤＧＦタンパク質を、検出可能な部分または検出可能な標識に結合させてもよい。検出可能な部分または標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的な手段により検出可能な組成物を指す。検出可能な部分は、放射性、発色性または蛍光性のシグナルなど測定可能なシグナルを発することが多く、このシグナルを用いて、試料中の結合している検出可能な部分の量を定量化できる。検出可能な部分は、共有結合か、または、イオン結合、ファンデルワールス結合もしくは水素結合のいずれかにより、タンパク質中に組み込むか、またはタンパク質に結合できる（例えば、放射性ヌクレオチド、または、ストレプトアビジンにより認識されるビオチン標識ヌクレオチドの組込み）。検出可能な部分は、直接または間接的に検出可能なものであってもよい。間接的な検出は、第２の直接または間接的に検出可能な部分の、検出可能な部分への結合を含んでもよい。例えば、検出可能な部分は、ストレプトアビジンの結合相手であるビオチンなど、結合相手のリガンドであってもよい。結合相手は、それ自体が直接検出可能なものであってもよく、例えば、抗体を蛍光分子で標識してもよい。シグナルの方法定量化の選択は、例えば、シンチレーション計測法、濃度測定法またはフローサイトメトリーにより達成される。
【００８８】
本発明のアッセイ法における使用に適した標識の例としては、以下が挙げられる：放射性標識、フルオロフォア、電子密度の高い試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテン、ならびに、例えば、ハプテンまたはペプチド中に放射性標識を組み込むことにより検出可能にできる、または、ハプテンもしくはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用できるタンパク質。さらに、当該タンパク質に対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質、または、標的と相補的な配列を有する核酸分子、ナノタグ、分子量ビーズ、磁気剤、蛍光色素を含有するナノビーズもしくはマイクロビーズ、量子ドット、量子ビーズ、蛍光タンパク質、蛍光標識を有するデンドリマー、マイクロトランスポンダー、電子ドナー分子もしくは分子構造または光反射粒子も企図される。
【００８９】
本発明と共に使用することが企図される追加的な標識としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：蛍光色素（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、および、ＥＬＩＳＡにおいて通常使用される他の酵素）、および、コロイド金、色付きのガラスまたはプラスチックのビーズなどの比色用の標識（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）、および発光標識または化学発光標識（例えば、ユーロピウム（Ｅｕ）、ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ）。
【００９０】
標識は、当技術分野で周知の方法によるアッセイの所望の成分に直接または間接的に結合させてもよい。特定の実施形態では、標識は、本発明による活性剤のコンジュゲーションのために、イソシアネートまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの試薬を用いて、成分に共有結合させる。本発明の一態様では、二官能性のイソシアネート試薬を用いて標識をバイオポリマーにコンジュゲートさせて、そこに結合される活性剤が結合していない状態の標識生体ポリマーコンジュゲートを形成する。この標識バイオポリマーコンジュゲートは、本発明による標識されたコンジュゲートの合成のための中間物質として使用してもよく、または、バイオポリマーコンジュゲートを検出するために使用してもよい。前述のように、多種多様な標識を使用でき、標識の選択は、必要な感応性、アッセイの所望の成分とのコンジュゲーションの容易さ、安定性の要件、使用可能な器具類および廃棄規定に応じて行う。非放射性標識は、間接的な手段により結合させることが多い。一般に、リガンド分子（例えばビオチン）を当該分子に共有結合させる。リガンドは、次に別の分子（例えばストレプトアビジン）分子に結合するが、こうした分子は、もともと検出可能であるもの、または、検出可能な酵素、蛍光化合物もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合するもののいずれかである。
【００９１】
本発明の方法において有用な化合物は、例えば、酵素またはフルオロフォアとのコンジュゲーションにより、シグナルを発する化合物に直接コンジュゲートすることもできる。標識としての使用に適した酵素としては、加水分解酵素、とりわけホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドターゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅ）、とりわけペルオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。標識としての使用に適した蛍光化合物としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：前に挙げたものの他、フルオレセイン誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、エオシン、ＴＲＩＴＣアミン、キニーネ、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Ｂスルホニルクロリドエリトロセイン（ｅｒｙｔｈｒｏｓｃｅｉｎ）、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、ユーロピウム、テキサスレッド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチドなど。標識としての使用に適した化学発光化合物としては、ＭＳＤ Ｓｕｌｆａ−ＴＡＧ、ユーロピウム（Ｅｕ）、サマリウム（Ｓｍ）、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタルアジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法において使用できる多様な標識系またはシグナル生成系の概説については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照。
【００９２】
標識を検出する手段は、当業者に周知であり、検出される標識の型により決まる。したがって、例えば、標識が放射性である場合、検出の手段としては、シンチレーションカウンター（例えば、放射性免疫測定法、シンチレーション近接アッセイ）（Ｐｉｔａｓら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ．、３４巻、９０６〜１２頁、２００６年）が、または、オートラジオグラフィーの場合は写真フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合、そのような標識は、適切な光波長を有する蛍光色素を励起させ、その結果得られる蛍光を検出すること（例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または当技術分野で公知の他の方法）により検出してもよい。蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子倍増管などの電子検出装置の使用により、視覚的に検出してもよい。同様に、酵素標識は、当該酵素にとっての適切な基質を加え、その結果得られる反応産物を検出することにより検出してもよい。比色標識または化学発光標識は、標識に着いている色を観察することにより、簡単に検出できる。本発明の方法における使用に適した他の標識系および検出系は、当業者には容易に明らかとなろう。そのような標識されたモジュレーターおよびリガンドは、疾患または健康状態の診断において使用できる。
【００９３】
この方法は、場合により少なくとも１つまたは複数の洗浄ステップを含むが、このステップでは、結合していないポリペプチドが原因のバックグラウンド測定値を減らすために、タンパク質の結合を測定する前に、結合しているＰＤＧＦ組成物を洗浄する。ポリペプチド組成物のインキュベーション後およびＰＤＧＦの検出前のＰＤＧＦの洗浄は、適切な緩衝液プラス洗浄剤中で実施される。適切な洗浄剤としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルグルコシド、アルキルマルトシド、硫酸アルキル（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など）、ＮＰ−４０、アルキルチオグルコシド、ベタイン、胆汁酸、ＣＨＡＰシリーズ、ジギトニン、グルカミド、レシチン／リゾレシチン、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘなどの非イオン性ポリオキシエチレンベースの洗浄剤、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＢＲＩＪ（登録商標）、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）およびＴＨＥＳＩＴ（登録商標）などのポリソルベート、四級アンモニウム化合物など。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、付録１Ｂ、補遺１１、１９９８年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪも参照。適当な洗浄剤は、慣例的な実験法を用いて決定できる（Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ， Ｊ．、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、１９８８年を参照）。
【００９４】
フィブリンシーラントを投与する方法
本発明において有用なフィブリンシーラントは、当技術分野で周知の手法を用いて、例えば、所望の部位での注射または噴霧により、内視鏡により、スポンジ様の担体、予め形成されたシーラントまたは当技術分野で公知の他の方法を用いるなどにより、対象に投与することが企図される。一実施形態では、シーラントは、注射または噴霧して、ｉｎ ｓｉｔｕでゲルを形成させる。
【００９５】
これらのフィブリンシーラントは、当業者には明らかであろうが、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＤＧＦの持続／制御放出から利益を得る、下記の状態を非限定的に含む対象に投与されることが企図される。一実施形態では、患者は、骨および軟骨、筋肉、付随する靭帯、および他の結合組織の疾患を非限定的に含む筋骨格疾患；筋肉、線維組織、脂肪、血管および滑膜組織を冒す障害を非限定的に含む軟部組織の疾患もしくは障害；または血管疾患に罹患している。
【００９６】
一実施形態では、このフィブリンシーラントは、骨移植片の代替物として機能するので、同じ適応の多くにおいて施用でき、このような適応としては、脊椎固定ケージ、偽関節の不具合の治癒、骨の増強、骨折修復の加速、骨組織再構築および歯の再生が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、別の実施形態では、このシーラントは、インプラント統合において使用できる。インプラント統合では、インプラントは、隣接する骨領域がインプラントの表面の中へ成長するように誘導して緩みおよび付随する他の問題を防止するフィブリンシーラントで覆うことができる。別の実施形態では、成長因子に富むマトリックスは、皮膚中の慢性創傷を治癒するために使用できる。
【００９７】
骨または軟骨の追加的な障害または状態としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：変形性関節炎、骨粗鬆症、骨ジストロフィー、くる病、骨軟化症、マッキューン・オルブライト症候群、アルバース・シェーンベルグ病、パジェット病、関節リウマチ、変形性関節炎、軟骨損傷、人工関節周囲の骨溶解、骨形成不全症、転移性骨疾患、骨軟骨腫、骨形成、骨髄炎、骨症、大理石骨病、骨硬化症、多発性軟骨炎、関節軟骨傷害、軟骨石灰化症、軟骨形成不全、膝蓋軟骨軟化症、軟骨肉腫、肋軟骨炎、内軟骨腫、強剛母趾、半月板損傷、股関節唇損傷、離断性骨軟骨炎（ｏｃｄ）、再発性多発性軟骨炎、または、骨もしくは軟骨の形成の刺激が有効な任意の状態。
【００９８】
ＰＤＧＦタンパク質を含むフィブリンシーラントは、血管新生および血管成長の増加が有効と考えられる血管の疾患または状態の治療にも有用であり、そのような疾患または状態としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：虚血／再灌流、心筋梗塞、うっ血性心不全、アテローム性硬化症、高血圧症、再狭窄、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、血管または心臓の石灰化、血栓症、末梢血管疾患、血管壁リモデリング、心室リモデリング、急速心室ペーシング、冠動脈微小塞栓症、圧過負荷、大動脈屈曲症、冠動脈結紮、血管性心疾患、弁膜疾患（石灰化が原因の弁膜変性、リウマチ性心疾患、心内膜炎または人工弁の合併症を非限定的に含む）；狭心症、心不全、高血圧症、心房細動、心膜疾患（心膜液貯留および心膜炎を非限定的に含む）；心筋症、心肥大または心血管性の発達障害。
【００９９】
キット
キットも本発明の範囲内で企図される。典型的なキットは、ＦＣおよびトロンビン成分を含むフィブリンシーラントを備えることができる。一実施形態では、このキットは、フィブリンシーラント中に組み込むためのＰＤＧＦタンパク質をさらに備える。一態様では、各成分は、それ自体用の別々の保存容器、バイアルまたは入れ物の中に入っていてもよい。関連する一態様では、ＰＤＧＦはＦＣ成分との混合物の形態であってもよく、トロンビン成分は別の保存容器に入っていてもよい。関連する一態様では、ＰＤＧＦはトロンビン成分との混合物の形態であってもよく、ＦＣ成分は別の保存容器に入っていてもよい。関連する一実施形態では、保存容器は、バイアル、瓶、袋、貯蔵容器、管、ブリスター、小袋、パッチなどである。この製剤の構成物の１つまたは複数は、凍結乾燥された、フリーズドライ加工された、スプレーフリーズドライ加工された、または他の任意の再構成可能な形態をしていてもよい。必要に応じ、多様な再構成用媒体がさらに備えられていてもよい。
【０１００】
このキットの成分は、冷凍、液体または凍結乾燥された形態のいずれかをしていてもよい。このキットには、フィブリンゲルを対象に投与するための適当な器具が入っていることがさらに企図される。さらなる一実施形態では、このキットには、フィブリンシーラントを調製および投与するための取扱説明書も入っている。
【０１０１】
本発明の追加的な態様および詳細は、以下の実施例から明らかになると考えられるが、この実施例は、限定ではなく例証であることを意図したものである。
【実施例】
【０１０２】
（実施例１）
材料および方法
放出動態：
組換え（ｒｈ）−ＰＤＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の濃度が放出動態に及ぼす効果を、フィブリンシーラント（ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄ、Ｓ／Ｄは、安全性を高めるために追加で行われるウイルス不活性化ステップである；Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア）の単一製剤（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌおよび［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）を用いて分析した。異なる量の組換えヒトＰＤＧＦ−ＡＢまたはＢＢを分析した（０．３ｍｌのゲルについて５ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇ、４０ｎｇおよび８０ｎｇ）。ゲル調製時点でＰＤＧＦをＦＣ成分中で再懸濁させた。
【０１０３】
ＦＣ濃度が、フィブリンのＦＣ成分中で最初に再懸濁させたＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢ（ゲル０．３ｍｌ当たり１５ｎｇで固定）の放出動態に及ぼす効果を分析した。５〜４０ｍｇ／ｍｌ（ゲル中の最終濃度）の異なる濃度のＦＣと固定濃度のトロンビン（２ＩＵ／ｍｌ）とを用いて、フィブリンゲル（ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄ）の４つの異なる製剤を調製した。
【０１０４】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＢＢ（ゲル０．３ｍｌ当たり１５ｎｇで固定、すなわち、ゲル１ｍｌ当たり５０ｎｇ）の放出動態を、単一のゲル製剤（ゲル中の最終濃度は、［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌおよび［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）を用いて、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄの３つの異なるフィブリンシーラントの製品ロットについて比較して、フィブリンシーラントの製品ロットによる放出動態のばらつきを分析した。
【０１０５】
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨからのＰＤＧＦ−ＢＢの放出動態（ＰＤＧＦ−ＢＢ濃度の効果、ＦＣ濃度の効果およびフィブリンシーラントの製品ロットによるばらつき）を分析して、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨおよびＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄを用いた場合の潜在的な差を観察した。
【０１０６】
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄを用いた全ての実験用には、ポリプロピレンのエッペンドルフ管中でゲルを調製し、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨを用いた実験用には、２４ウェルのポリスチレン製培養プレート中でゲルを調製した。全ての場合において、ゲルは、標準的なヒトＭＳＣ（ＨＭＳＣ）成長培地（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用い、５％ＣＯ２中にて３７℃で１０日間までインキュベートした。培養培地は毎日交換し、培養培地試料は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によりＰＤＧＦの量についてテストするまで冷凍した。ＦＣ濃度の効果およびＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄについてのロット間の変動を評価する実験用には、ゲルは完全培地中のウロキナーゼ（１Ｕ／ｍｌ）を用いて１０日の放出後溶解させた。その結果得られた溶液中のＰＤＧＦの量を、ゲル中に最初に加えた成長因子の量の完全な回復を検証するためにテストした。
【０１０７】
生物学的活性：
放出されたＰＤＧＦがＨＭＳＣ単層に及ぼす効果：
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄ（ゲル中の最終濃度は、ＦＣが２０ｍｇ／ｍｌ、トロンビンが２ＩＵ／ｍｌ）の１つのフィブリン製剤を用いて、ゲルから放出されたＰＤＧＦの生物学的活性を分析した（ＰＤＧＦ−ＡＢ １２０ｎｇおよびＰＤＧＦ−ＢＢ ６０ｎｇをＦＣ成分中に加えてから重合させて、ＰＤＧＦが添加されているゲルとした）。ＨＭＳＣ単層用の培養培地としては、３日目にゲルから回収した培地の上清（培地は毎日交換していない）を使用した。まず、ＨＭＳＣを１２ウェルの培養プレート中に２５００細胞／ｃｍ２で予め播種し（１０，０００細胞／ウェル）、５％ＣＯ２中にて３７℃で４から５時間インキュベートして、付着させた。次に、細胞培養培地を取り除き、代わりにゲル由来の培地上清を入れた。対照試料用に、ＰＤＧＦが添加されていないゲルをいくつか調製したが、これは、ＰＤＧＦが添加されているゲル由来の培地で変化が観察される場合、その変化は、放出されたＰＤＧＦにより実際に誘導されたものであってゲル自体から放出された可能性のある他の何らかの潜在的な生物活性成分によるものではないことを保証するためであった。ｒｈ−ＰＤＧＦを３０ｎｇ（１５ｎｇ／ｍｌ）加えて新しく調製した培地の入ったウェルを、陽性対照として使用した。陽性対照のためのＰＤＧＦ３０ｎｇの添加は、実験用に使用する製剤でゲル中にＰＤＧＦ−ＡＢ １２０ｎｇまたはＰＤＧＦ−ＢＢ ６０ｎｇを加えた場合に３日目にゲルから放出されることが見出されたＰＤＧＦのおよその量を基準にしたので、この添加により、今回テストした条件、すなわち、放出されたＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢを含有する、３日目のゲル由来の培地上清が厳密に再現されるはずである。
【０１０８】
細胞増殖および細胞形態変化の分析：１日目、４日目および７日目に、細胞の増殖量および形態変化を分析した。細胞培養培地を捨て、カルセインＡＭおよびエチジウムホモ二量体−１を含有する生／死判定用の色素溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で細胞を染色した。添加されたＰＤＧＦを含有するゲル由来の培地上清でインキュベートした細胞の増殖量を、添加されたＰＤＧＦを含有しないゲル由来の上清でインキュベートした細胞の増殖量、および、ＰＤＧＦ３０ｎｇを加えて新しく調製した培地でインキュベートした細胞（陽性対照）の増殖量と比較した。Ｍｕｌｔｉ−Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｇｅｍｉｎｉ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて５０分の染色後の蛍光強度を測定することにより、細胞増殖量をモニターした。増殖量を読み取った後、プレートを基本培地で一度洗浄して残留染料を除去してから、デジタル画像取得システム（画像記録用のＳｐｏｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ．２．１．を備えたＳｐｏｔデジタルカメラ、Ｎｉｋｏｎ）を搭載した倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２００、Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いて細胞の形態変化を観察した。
【０１０９】
細胞分化（軟骨形成および骨形成）の分析：フィブリンゲルから放出されたＰＤＧＦの存在下におけるＨＭＳＣの軟骨形成または骨形成の分化の可能性を分析するために、培養の１日後、４日後および７日後にアルシアンブルー（軟骨形成用）またはアリザリンレッド（骨形成用）で細胞を染色した。ＰＤＧＦが添加されているゲル由来の培地でインキュベートした細胞の染色強度を、ＰＤＧＦが添加されていないゲル由来の培地でインキュベートした細胞のもの、および、ＰＤＧＦ３０ｎｇを加えて新しく調製した培地でインキュベートした細胞（陽性対照）と比較した。
【０１１０】
アルシアンブルー染色については、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で２回すすぎ、パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．）で１０分間固定させてから、０．１Ｎ ＨＣｌ中の１％アルシアンブルー（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．）で３０分間染色した。細胞をＰＢＳで５回（各２分）すすいでから、デジタル画像取得システム（前述の、画像記録用のＳｐｏｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ．２．１．を備えたＳｐｏｔデジタルカメラ、Ｎｉｋｏｎ）搭載の倒立光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２００）下で観察した。アリザリンレッド染色については、細胞をまずＰＢＳで２回すすぎ、氷冷の７０％エタノール中で１０分間固定させてから、ＰＢＳ中の２％アリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．）で３０分間染色した。次に、細胞をＰＢＳで５回（各２分）すすいでから、前述の倒立光学顕微鏡を用いて観察した。
【０１１１】
アリザリンレッドによる染色に加え、培養の１日後、４日後および７日後、初期の骨形成分化のマーカーとして、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。１２ウェルの培養プレートに入れた細胞をＨＢＳＳ（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．）で２回洗浄してから、数分間トリプシン処理して細胞を取り出した。次に、懸濁液中の細胞をエッペンドルフ管中に移し、ウェルを基本培養培地０．５ｍｌで洗浄してから、対応するエッペンドルフ管中に移した。次に、細胞を５分間遠心分離してから、ＮａＨＣＯ３を含有するタイロードの塩溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．）０．５ｍｌで一度洗浄した。上清を捨て、細胞のペレットをＡＭＰ緩衝液＋ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．）５０μｌ中で再懸濁させてから９６ウェルのプレート中に移した。管をＡＭＰ緩衝液＋ＭｇＣｌ２ ２５μｌで洗浄し、これを９６ウェルのプレートの対応するウェル中に移した。９６ウェルのプレートの３つのウェルにＡＭＰ緩衝液＋ＭｇＣｌ２ ７５μｌを加え、ブランクとした。最後に、ｐ−ＮＰＰ（リン酸ｐ−ニトロフェニル、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．）ストック基質溶液７５μｌを各ウェル中に加えてから、プレートを３７℃で３０分間置いた。形成されたｐ−ニトロフェノール生成物の４０５ｎｍでの吸光度（ＡＬＰ活性と比例する）を、Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）を用いて３０分時点で分析した。結果（最初はＩＵ／Ｌとして測定した）を、増殖量について正規化した。
【０１１２】
ＰＤＧＦ−ＢＢが、フィブリンゲル中に播種されたＨＭＳＣに及ぼす効果：
フィブリンゲル中に加えたＰＤＧＦ−ＢＢが、フィブリンゲル中に播種されたＨＭＳＣおよびゲル表面上に播種されたヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．）の挙動に及ぼす生物学的効果を分析するために、単一の培養細胞（ＨＭＳＣまたはＨＵＶＥＣ）またはＨＭＳＣ：ＨＵＶＥＣ比が４：１の共培養細胞を用いて、１０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を含有するＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲルを調製した。ＰＤＧＦ−ＢＢが添加されているゲルおよび添加されていないゲルにおける細胞の挙動を比較するために、ゲルの調製時点で、共培養ゲルの半分においてＦＣ中にＰＤＧＦ−ＢＢ（ゲル０．３ｍｌ当たり６０ｎｇ）を加えた。２４ウェルの培養プレート中で調製したゲルを、添加用血清を含有する内皮細胞成長培地（１ｍｌ／ゲル）を用いて、５％ＣＯ２中にて３７℃で最長２１日間インキュベートした。１日目、７日目、１４日目および２１日目に、細胞の形態および増殖ならびに骨形成分化の分析を実施した。カルセイン色素で染色した後、蛍光顕微鏡により、相互接続した細胞−細胞ネットワークへのＨＵＶＥＣの再構築などの、細胞の形態（血管新生分化の初期事象）を観察した。カルセイン色素で染色した後、精製したウシのトリプシン濃縮溶液中でゲルを溶解させた後の細胞懸濁液の全体的な蛍光強度を測定することにより、細胞増殖を分析した。最後に、精製したウシのトリプシン濃縮溶液中でのゲル溶解に続き細胞を再懸濁させた後で、骨形成分化の初期マーカーとしてＡＬＰを測定した（前述のプロトコール）。
【０１１３】
表面プラズモン共鳴によるＰＤＧＦの結合：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、リアルタイムでの２分子間相互作用を測定する手法である。この分析は、特定の分析対象物が所与のリガンドに結合する場合に定量でき、リガンドに結合する分析対象物の結合親和性および化学量を定量するものである。基本的な実験的アプローチは、まず、金めっきを施したチップをリガンドと合わせることである。次に、緩衝液（移動相）中で調製した分析対象物をフローセル中に注入するが、そこでは分析対象物は、緩衝液の流れにより、コーティングされたチップ全体に担持される。分析対象物とリガンドとの間で２分子間相互作用が生じると、表面での質量が局部的に増加する結果、金属表面上の屈折率単位（μＲＩＵ）が増加する。（μＲＩＵ）の変化は、時間の関数としてグラフ化できる。
【０１１４】
本試験では、組換えヒトＰＤＧＦ−ＡＢおよび組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢを分析対象物として使用し、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤのＦＣ成分をリガンドとして使用した。緩衝液としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、すなわち生理食塩状態の溶液）を使用した。異なる濃度のＰＤＧＦアイソフォームそれぞれを、ＦＣでコーティングしたセンサーチップの表面上に、離して流した。各実験について、および各濃度について、結合速度および解離速度を測定した。
【０１１５】
統計分析：
放出動態は３回行った。増殖、ＡＬＰ活性、アルシアンブルーおよびアリザリン染色についての結果は、３セットの実験を代表するものである。増殖およびＡＬＰ活性は３回、染色実験は２回行った。各ＰＤＧＦの濃度についてのＳＰＲ分析は３回行った。有意水準を５％としたＡＮＯＶＡ検定を用いて統計分析を実施した。
【０１１６】
（実施例２）
ＰＤＧＦの濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄからのその放出動態に及ぼす効果
ＰＤＧＦの濃度がフィブリンゲルからのその放出動態に及ぼす効果を、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄで作製された単一のフィブリンゲル製剤（ゲル中の最終濃度は、ＦＣ濃度が２０ｍｇ／ｍｌ、トロンビン濃度が２ＩＵ／ｍｌ）を用いて分析した。放出動態試験から、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＢＢの放出量は、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤのＦＣ成分に最初に加えた成長因子の量に従って増加することが示された（図１および２）。
【０１１７】
全体的に見ると、累積放出量の結果から、１０日後では、最初に加えたＰＤＧＦ−ＡＢの約２０％から３５％が放出されただけであることが示された（図１）。わずか３日後のＰＤＧＦ−ＡＢの累積放出量を見ると、ＰＤＧＦ−ＡＢの累積放出率はおよそ８〜１３％であった。言い換えれば、この結果から、１０日目では約６５〜８０％、３日目では約８７〜９２％が保持されていることが示された。
【０１１８】
ＰＤＧＦ−ＢＢを用いた場合の結果は同じ傾向をたどったが、より高い総放出率を示し、１０日後で約４５％から７０％が放出されていた（図２）。わずか３日後のＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出量を見ると、累積放出率は、およそ２０〜３５％であった。
【０１１９】
この結果から、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＢＢの両方ともフィブリンと強い結合相互作用を有することが示唆される。
【０１２０】
（実施例３）
ＦＣ濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤからのＰＤＧＦの放出動態に及ぼす効果
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄのフィブリンシーラントを使用した場合にＦＣ濃度がＰＤＧＦの放出動態に及ぼす効果を定量するために、固定されたトロンビン濃度（２ＩＵ／ｍｌ）を有するゲルを用いて、４つの異なるＦＣ濃度（ゲル中の最終濃度は５、１０、２０および４０ｍｇ／ｍｌ）のＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄについて放出量を分析した。
【０１２１】
ＥＬＩＳＡの結果から、１日目でスパイク放出が生じること、および、分析した全ての濃度のＦＣについて１０日目まで放出量が減少することが示された（図３Ａ）。ゲル中にＰＤＧＦ−ＡＢを１５ｎｇ加えた場合、ＦＣ濃度（５から４０ｍｇ／ｍｌ）は、放出動態に顕著には影響しなかった。累積放出量は、最初の量（１５ｎｇ）のおよそ２７％から３２％が１０日後で放出されており（図３Ｂ）、３日後ではわずか１０％から２０％であったことを示した。言い換えれば、保持率は１０日後では約７０％、わずか３日後では最大８０〜９０％であり、ＦＣ濃度には影響されなかったが、このことは、５ｍｇ／ｍｌのＦＣは１５ｎｇのＰＤＧＦ−ＡＢを結合するのに十分であったことを示唆するものである。
【０１２２】
しかしながら、ＰＤＧＦ−ＢＢの場合の結果からは、ＦＣ濃度が総放出率（％）に及ぼす効果が示された（図４）。事実、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤからのＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出率は、１０日目の時点では、ＦＣ濃度が低いほど高かった（ＦＣが５ｍｇ／ｍｌの場合は約６５％、４０ｍｇ／ｍｌの場合は２５％）。さらに、３日目の累積放出量の分析から、ＦＣ濃度への依存が示され、ＦＣが５ｍｇ／ｍｌの場合はおよそ３５％放出され、ＦＣが４０ｍｇ／ｍｌの場合は１０％放出された。言い換えれば、この結果から、１０日後では最低保持率は約３５％（ＦＣが５ｍｇ／ｍｌの場合）、最高保持率は約７５％（ＦＣが４０ｍｇ／ｍｌの場合）、３日後では最低保持率は約６５％、最高では約９０％であることが示された。放出動態がＦＣ濃度に依存することから、ＦＣ濃度を変化させることによりＰＤＧＦ−ＢＢの制御放出が可能であることが示唆される。
【０１２３】
ゲル中に残っているＰＤＧＦ−ＡＢを回復させるためにゲルを溶解させた後のＥＬＩＳＡの結果から、最初に加えた量の少なくとも８５％のＰＤＧＦ−ＡＢが回復したことが示された。ゲル中に残っているＰＤＧＦ−ＢＢを回復させるためにゲルを溶解させた後のＥＬＩＳＡの結果から、最初に加えた量の６５％から７５％のＰＤＧＦ−ＢＢが回復したことが示された。回復はＰＤＧＦ−ＢＢについては完全でなかったことから、ＰＤＧＦ−ＢＢの放出率（％）は、わずかに過小評価されている可能性がある。
【０１２４】
（実施例４）
異なる製品ロットのＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄを使用する効果
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄに由来する異なるＦＣ製品ロットを単一のゲル製剤（ゲル中の最終濃度は、ＦＣが２０ｍｇ／ｍｌ、トロンビンが２ＩＵ／ｍｌ）で使用する効果を調べると、結果は、分析した全てのロットについて、１０日目まで放出量が一定であることを示した。１０日後のＰＤＧＦ−ＡＢの累積放出率は、ＦＣのロットにより約２３％から３２％の範囲であり（図５）、したがって、３つのロットについては同程度であった。１０日後のＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出率は、ＦＣのロットにより約３８％から４２％の範囲であり（図６）、したがって、３つのロットについては同程度であった。
【０１２５】
この結果は、フィブリンのロット間でのＰＤＧＦ放出量には有意差がなく、したがって、放出動態におけるロット間の変動についてはほとんど気にする必要がないことを示すものである。
【０１２６】
ゲル中に残っているＰＤＧＦ−ＡＢを回復するためにゲルを溶解させた後のＥＬＩＳＡの結果から、最初に加えた量のＰＤＧＦ−ＡＢが完全に回復したことが示された。ゲル中に残っているＰＤＧＦ−ＢＢを回復するためにゲルを溶解させた後のＥＬＩＳＡの結果から、最初に加えた量の約６５％のＰＤＧＦ−ＢＢが回復したことが示された。回復はＰＤＧＦ−ＢＢについては完全でなかったことから、ＰＤＧＦ−ＢＢについての総放出率（％）は、わずかに過小評価されている可能性がある。
【０１２７】
（実施例５）
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨからのＰＤＧＦ−ＢＢの放出動態
ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨからのＰＤＧＦ−ＢＢの放出動態を分析して、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨおよびＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄを使用した場合の潜在的な差を観察した。
【０１２８】
ＰＤＧＦ−ＢＢの濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨからの放出動態に及ぼす効果を測定した。結果から、放出される量は、ＦＣ成分に最初に加える成長因子の量に従って増加することが示された（図７）。全体的に見ると、累積放出の結果から、１０日後では、最初に加えたＰＤＧＦ−ＢＢの約２０％から４０％のみが放出される、すなわち、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄを使用した場合に観察される放出率の約２倍低いことが示された。わずか３日後では、結果は、約１５〜２０％のＰＤＧＦ−ＢＢが累積放出されたことを示した。しかしながら、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨを用いた実験はポリスチレンプレートを用いて行われており、ＰＤＧＦはポリスチレンプレートに非特異的に結合する可能性があることから、これらの値は過小評価されている（ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄの場合のポリプロピレン管と比較して）可能性があることに留意すべきである。この過小評価の可能性を確認するために１０日間の放出実験の終了時点でゲル中に残っている成長因子の回復を測定することはしなかった。
【０１２９】
ＦＣ濃度がＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨからの１日のＰＤＧＦ−ＢＢ放出量に及ぼす影響を調べると、ＥＬＩＳＡの結果から、１日目でスパイク放出が生じること、および、分析した全ての濃度について１０日目まで放出量が減少することが示された（図８Ａ）。さらに、結果からは、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨゲル中にＰＤＧＦ−ＢＢを１５ｎｇ加えた場合、ＦＣ濃度（５から４０ｍｇ／ｍｌ）は放出動態に影響しないことが示され、累積放出量から、１０日後には最初に加えた量（１５ｎｇ）の約３０％から３５％が放出されることが示された（図８Ｂ）。この結果は、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨに由来する５ｍｇ／ｍｌのＦＣは１５ｎｇのＰＤＧＦ−ＢＢを結合するのに十分であったことを示唆するものである。しかしながら、ＰＤＧＦ−ＢＢ濃度の効果についての結果に関しては、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨについてのこれらの値は、ポリスチレンプレートを使用しているため、過小評価されている可能性があることに留意すべきである。
【０１３０】
最後に、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨに由来する異なるＦＣ製品ロットを単一のゲル製剤（ゲル中の最終濃度は、ＦＣが２０ｍｇ／ｍｌ、トロンビンが２ＩＵ／ｍｌ）で使用する効果を調べると、結果は、分析した全てのロットについて１０日目まで放出量が一定であることを示した。１０日後のＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出率は、約３０％から６０％の範囲であり（図９）、したがってＦＣのロット番号に依存しており、このことは、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄの場合に見出された結果とは反対であった。分析したＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨの３つのロット間の違いの１つは、第ＸＩＩＩ因子の含有量であり（ロット１については無視できる量、ロット２については３３．９Ｕ／ｍｌ、ロット３については４２．２ＩＵ／ｍｌ）、このことから、第ＸＩＩＩ因子の量とＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨからのＰＤＧＦ−ＢＢの放出速度との間に相関がある可能性があることが示唆される。
【０１３１】
（実施例６）
放出されたＰＤＧＦがｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＭＳＣ単層に及ぼす生物学的活性
ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）は、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞および筋細胞などの異なる特化した組織細胞型に分化できる多能性前駆細胞である（Ｃａｐｌａｎ ＡＩ、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ、９巻、６４１〜６５０頁、１９９１年）。これらの細胞の関与および分化は、細胞の相互作用だけでなく特異的な成長因子などさまざまな要因により変わる。ＰＤＧＦファミリーに属するものは、ＭＳＣ成熟の制御因子として同定されている。
【０１３２】
放出された成長因子がＨＭＳＣに及ぼす効果を測定した。材料および方法の項で述べたように、３日目（培地は毎日交換していない）に培地上清をフィブリンゲルから回収して（ＰＤＧＦ−ＡＢ １２０ｎｇおよびＰＤＧＦ−ＢＢ ６０ｎｇをＦＣ成分中に加えてから重合させて、ＰＤＧＦが添加されているゲルとした）、ＨＭＳＣ単層用の培養培地として使用した。対照試料用に、ＰＤＧＦが添加されていないゲルをいくつか調製したが、これは、ＰＤＧＦが添加されているゲル由来の培地で変化が観察される場合、その変化は、放出されたＰＤＧＦにより実際に誘導されたものであってゲル自体から放出された可能性のある他の何らかの潜在的な生物活性成分によるものではないことを保証するためであった。
【０１３３】
ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢが添加されているＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル由来の培地の上清、すなわち、放出されたＰＤＧＦを含有する培地（２０ｍｇ／ｍｌのＦＣ、２ＩＵ／ｍｌのトロンビンを用いて最初に調製したゲル）で培養されたＨＭＳＣは、早くも４日目に細胞形態の変化を示し、７日目にはさらにより顕著になった。それらは、ＰＤＧＦが添加されていないゲル由来の培地上清で培養したものより細長い形状を有しており、新しく添加されたＰＤＧＦを含有する培地で培養されたものとのほうが類似していた。効果は、ＰＤＧＦ−ＢＢの場合のほうがさらに顕著であった。
【０１３４】
４日目および７日目時点での細胞増殖量を、１日目（ベースライン）時点での増殖量に正規化した。ＰＤＧＦが添加されているＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル由来の培地上清（すなわち、放出されたＰＤＧＦを含有する培地）で７日間培養した場合は、ＨＭＳＣ増殖量は増える傾向があったが、その差は有意ではなかった（ｐ＞０．０５）（図１０および１１）。新しく添加されたＰＤＧＦを有する培地で培養した細胞の増殖量のほうが、有意に多かった。
【０１３５】
ＰＤＧＦが添加されているＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル由来の上清で培養したＨＭＳＣ中でのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、ＰＤＧＦを添加されていないＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄゲル由来の上清で培養したＨＭＳＣ中、および、新しく添加されたＰＤＧＦを含有する培地で培養したＨＭＳＣ中でのものより有意に低かった（図１２および１３）。
【０１３６】
アルシアンブルー（軟骨形成分化の指標）およびアリザリンレッド（後の骨形成分化の指標）は両方とも、７日までの全ての時点において芳しくなかった。
【０１３７】
全般に、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄフィブリンゲルから放出されたＰＤＧＦの存在下でのＨＭＳＣ挙動の観察された変化は全て、ＰＤＧＦ−ＢＢの場合のほうが、より顕著であった。全体的に見ると、結果は、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／Ｄフィブリンゲルから放出されたＰＤＧＦは、依然として生物学的活性を有し、ＨＭＳＣの形態変化およびＡＬＰ活性の阻害を主に誘導することを示した。
【０１３８】
（実施例７）
ＰＤＧＦ−ＢＢが、フィブリンゲル内部に播種されたＨＭＳＣおよびフィブリンゲルの表面上に播種されたＨＵＶＥＣに及ぼす効果
ＰＤＧＦが、フィブリンゲル中に播種されたＨＭＳＣおよびゲルの表面上に播種されたヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ Ｉｎｃ．）の挙動に及ぼす効果を分析するために、材料および方法に記載の要領で、細胞を含むゲルを調製した。
【０１３９】
手短に言えば、単一の培養細胞（ＨＭＳＣまたはＨＵＶＥＣ）またはＨＭＳＣ：ＨＵＶＥＣ比が４：１の共培養細胞を用いて、１０ｍｇ／ｍｌのＦＣと２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）とを含有するゲルを調製した。組換えＰＤＧＦ−ＢＢ（ゲル０．３ｍｌ当たり６０ｎｇ）を、ゲルの調製時点で、共培養ゲルの半分においてＦＣ中に加えた。添加用血清を含有する内皮細胞成長用の培養培地（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ Ｉｎｃ．）を用いて、ゲルを５％ＣＯ２中にて３７℃で最長２１日間インキュベートした。１日目、７日目、１４日目および２１日目に細胞の形態および増殖量ならびに骨形成分化の分析を実施した。
【０１４０】
蛍光顕微鏡分析からは、単一の培養ゲル中に播種した場合のほうが、時間の経過に伴い、ＨＭＳＣは、均等に分散し、数が多く、また、より細長い形状を有したことが示された。ＨＭＳＣは、ＰＤＧＦ−ＢＢが添加された共培養ゲル中でも均等に分散し細長くなったが、こちらのほうがサイズは小さく数が少なく、さらに、ＰＤＧＦ−ＢＢが添加されていない共培養ゲルの底に向かって遊走する傾向があった。相互接続した細胞−細胞ネットワークへのＨＵＶＥＣの再構築（血管新生の初期事象）は、ＰＤＧＦ−ＢＢが添加されていない共培養ゲルと比較して、単一の培養ゲル中および添加されたＰＤＧＦ−ＢＢを含有する共培養ゲル中におけるほうがより早く開始し、生じる程度はより大きかった。
【０１４１】
細胞増殖量は、時間の経過に伴って増加した。ＰＤＧＦ−ＢＢが添加されているゲルと添加されていないゲルとの間で有意差は観察されなかったが、添加されたＰＤＧＦ−ＢＢを含有するゲル中でのほうが、７日目および１４日目に増殖量が多い傾向が認められた。ＡＬＰ活性は低レベルのままであったが、これは、ゲル中に添加されたＰＤＧＦ−ＢＢはゲル中に播種されたＨＭＳＣの骨形成分化を誘導しなかったことを示唆するものである。
【０１４２】
（実施例８）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＰＤＧＦの結合
ＳＰＲを用いて、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢとＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤのＦＣ成分との間の相互作用を特徴付けた。この相互作用のセンサーグラムを図１４Ａ〜１４Ｂに示す。曲線の結合および解離部分をプロットし、非線形回帰分析を用いて、それぞれ１相の指数関数の結合・解離曲線に当てはめた（図１４Ｃ）。図１４Ｂが示すように、ＰＤＧＦ−ＢＢについての解離曲線は２相である。このため、ＰＤＧＦ−ＢＢとＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤのＦＣ成分との間の相互作用についてのＫＤ値の正確な定量は不可能であった。しかしながら、ＳＰＲは、ＰＤＧＦ−ＡＢのＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤのＦＣ成分との相互作用についてのＫＤ値を計算するためには首尾よく用いられた（緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の存在下で）。センサーグラムの結合相の分析により速度定数（Ｋｏｂｓ）が得られ、これを分析対象物の濃度に対してプロットした（図１４Ｃ）。このプロットを線形回帰により分析して勾配および切片を得たが、これらはそれぞれ、結合速度（Ｋｏｎ）定数、解離速度（Ｋｏｆｆ）定数に相当する。解離速度定数を結合速度定数で割ることにより、平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。
【０１４３】
平衡解離定数（ＫＤ）は、結合センサーグラムの解離相に頼った補足的な方法によっても定量した。この方法では、ＰＤＧＦ−ＡＢについての解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を、センサーグラムの解離相の非線形回帰分析から計算した。解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を結合速度定数（Ｋｏｎ）（これらの定数は、センサーグラムの結合相の分析から得た）で割ることにより、解離平衡定数（ＫＤ）を測定した。
【０１４４】
いずれの方法を使用した場合も、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤのＦＣ成分に結合するＰＤＧＦ−ＡＢについてのＫＤ値は、３４２±４１ｎＭであった。
【０１４５】
まとめ
前述のようにして測定した放出動態から、フィブリンゲル中に加えた組換えＰＤＧＦはゲルから徐々に放出されることが示されたが、このことは、ＰＤＧＦがフィブリン（フィブリノーゲン）と結合相互作用することを示唆するものである。この結合相互作用は、１０日後の累積放出量が、最初に加えたＰＤＧＦの量より少なかったことによりさらに確認された。ＰＤＧＦ−ＢＢは、ＰＤＧＦ−ＡＢより速く放出されるようであり（ＰＤＧＦ−ＢＢの保持率のほうが低い）、ＦＣ濃度は、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｓ／ＤフィブリンゲルからのＰＤＧＦ−ＢＢ放出速度に影響するようであったが、このことから、さまざまなＦＣ濃度を用いればＰＤＧＦ−ＢＢの放出速度を制御できるであろうということが示唆される。全体的に見ると、これらの結果から、この２つの型のＰＤＧＦとフィブリンとの結合相互作用（特にＰＤＧＦ−ＡＢ）が示唆される。ＳＰＲを用いると、結果は、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢは両方ともＴＩＳＳＥＥＬのＦＣ成分に結合することを示した。最後に、生物学的活性の結果から、放出されたＰＤＧＦは依然として生物学的活性を有し、ＨＭＳＣの形態変化を主に誘導するが、骨形成および／または軟骨形成の分化は誘導しないことが実証された。
【０１４６】
結論として、本試験から、フィブリンゲルは生物活性を有するＰＤＧＦを送達するための有望な担体系であることが示唆され、また、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＢＢを結合させる、ＴＩＳＳＥＥＬフィブリンシーラントのＦＣ成分に内在する特性が実証された。
【０１４７】
前述の例証的な実施例に記載したような本発明の多数の改変および変形が、当業者には思い浮かぶと考えられる。したがって、添付の特許請求の範囲中に記載されるとおりの制限のみが、本発明について設けられるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質の、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分、トロンビン成分およびＰＤＧＦ成分の混合により作製されるフィブリンシーラントからの放出を加減する方法であって、
ａ）公知の初期量のＰＤＧＦと公知の最終濃度のＦＣとを有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＰＤＧＦの量を定量するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の前記第１のフィブリンシーラント中で使用されるＦＣの前記公知の最終濃度を加減して、第２のフィブリンシーラントを作製するステップであって、前記第２のシーラント中のＦＣの濃度を前記第１のシーラント中のＦＣの前記公知の最終濃度と比較して高くすることにより、前記第２のシーラントからのＰＤＧＦの放出速度がステップ（ａ）の前記第１のシーラントからのＰＤＧＦの放出と比較して減少し、そして、前記第２のシーラントは、ステップ（ａ）における前記第１のシーラントと同じ初期量のＰＤＧＦを有する、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質の、ＦＣ成分、トロンビン成分およびＰＤＧＦ成分の混合により作製されるフィブリンシーラントからの放出を加減する方法であって、
ａ）公知の初期量のＰＤＧＦと公知の最終濃度のＦＣとを有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＰＤＧＦの量を定量するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の前記第１のフィブリンシーラント中で使用されるＦＣの前記公知の最終濃度を加減して、第２のフィブリンシーラントを作製するステップであって、前記第２のシーラント中のＦＣの濃度を前記第１のシーラント中のＦＣの前記公知の最終濃度と比較して低くすることにより、前記第２のシーラントからのＰＤＧＦの放出速度がステップ（ａ）の前記第１のシーラントからのＰＤＧＦの放出と比較して増加し、そして、前記第２のシーラントは、ステップ（ａ）における前記第１のシーラントと同じ初期量のＰＤＧＦを有する、ステップと
を含む方法。
【請求項３】
前記第１または第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度が約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１または第２のシーラント中のＦＣ濃度が約５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌの範囲内である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のフィブリンシーラント中の最終のＦＣ濃度が、前記第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度と約１ｍｇ／ｍｌから約１４９ｍｇ／ｍｌ異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のフィブリンシーラント中の最終のＦＣ濃度が、前記第２のシーラント中のＦＣ濃度と約５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌ異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のフィブリンシーラント中の最終のＦＣ濃度が、前記第２のシーラント中のＦＣ濃度と約１０ｍｇ／ｍｌから約６０ｍｇ／ｍｌ異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記第１または第２のシーラント中のトロンビン成分の最終濃度が約１ＩＵ／ｍｌから２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ＰＤＧＦの最終濃度が約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの範囲内である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質の制御放出を必要とする患者において前記タンパク質を制御放出する方法であって、前記患者に、ＰＤＧＦを含むフィブリンシーラントを投与するステップを含み、前記ＰＤＧＦの少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される、方法。
【請求項１１】
前記フィブリンシーラントが、ＦＣ成分とトロンビン成分とを合わせて混合物にすることにより作製される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＤＧＦが、前記ＦＣ成分を前記トロンビン成分と混合する前に前記ＦＣ成分に加えられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＤＧＦの少なくとも３５％から９０％が少なくとも３日間保持される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＤＧＦの少なくとも４５％から７５％が、前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＤＧＦの少なくとも６０％が、前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１６】
放出された前記ＰＤＧＦが生物学的に活性である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質の制御放出を必要とする患者において前記タンパク質を制御放出する方法であって、前記患者に、ＰＤＧＦを含むフィブリンシーラントを投与するステップを含み、前記ＰＤＧＦの少なくとも２０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、方法。
【請求項１８】
前記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分とトロンビン成分とを合わせて混合物にすることにより作製される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＤＧＦが、前記ＦＣ成分を前記トロンビン成分と混合する前に前記ＦＣ成分に加えられる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＤＧＦの少なくとも２５％から７５％が少なくとも１０日間保持される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＤＧＦの少なくとも４５％から５５％が、前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２２】
放出された前記ＰＤＧＦが生物学的に活性である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記シーラント中の最終のフィブリノーゲン複合体濃度が約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内である、請求項１１または１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記シーラント中の最終のトロンビン濃度が約１ＩＵ／ｍｌから２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内である、請求項１１または１８に記載の方法。
【請求項２５】
最終のフィブリノーゲン複合体濃度が４０ｍｇ／ｍｌであり、最終のトロンビン濃度が約２ＩＵ／ｍｌである、請求項１１または１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記シーラント中の最終のＰＤＧＦ濃度が約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである、請求項１０または１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ−ＡＢである、請求項１０または１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも４０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項１０または１７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも５５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記患者が、筋骨格の疾患または障害、軟部組織の疾患または障害および心血管疾患から成る群から選択される疾患に罹患している、請求項１０または１７に記載の方法。
【請求項３２】
前記筋骨格の障害が骨疾患または骨障害である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記患者が心血管疾患に罹患している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出から利益を得る障害または疾患に罹患している患者を治療する方法であって、前記患者に、前記ＰＤＧＦタンパク質を含むフィブリンシーラント投与するステップを含み、
前記フィブリンシーラントは、前記ＰＤＧＦの少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、または前記ＰＤＧＦの少なくとも２０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される前記ＰＤＧＦの制御放出をもたらし、前記ＰＤＧＦが、前記障害または疾患を治療するのに有効な速度で放出される、方法。
【請求項３５】
前記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分とトロンビン成分とを合わせて混合物にすることにより作製される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＰＤＧＦが、前記ＦＣ成分を前記トロンビン成分と混合する前に前記ＦＣ成分に加えられる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＤＧＦの少なくとも３５％から９０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＤＧＦの少なくとも４５％から７５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＰＤＧＦの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＰＤＧＦの少なくとも２０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰＤＧＦの少なくとも２５％から７５％が少なくとも１０日間保持される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＰＤＧＦの少なくとも４５％から５５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４３】
放出された前記ＰＤＧＦが生物学的に活性である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記シーラント中の最終のＦＣ濃度が約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記シーラント中の最終のトロンビン濃度が約１ＩＵ／ｍｌから２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
最終のフィブリノーゲン複合体濃度が約４０ｍｇ／ｍｌであり、最終のトロンビン濃度が約２ＩＵ／ｍｌである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
前記シーラント中の最終のＰＤＧＦ濃度が約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ−ＡＢである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも８０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項３４に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも５５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記患者が、筋骨格の疾患または障害、軟部組織障害および心血管疾患から成る群から選択される疾患に罹患している、請求項３４に記載の方法。
【請求項５３】
前記筋骨格の障害が骨疾患または骨障害である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記患者が血管疾患に罹患している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質を含むフィブリンシーラントを調製するためのキットであって、前記フィブリンシーラントは所望のＰＤＧＦ放出速度を有し、前記キットは、
ａ）場合によりＰＤＧＦ成分を含む、フィブリノーゲン複合体成分を含有する第１のバイアルまたは第１の保存容器と、ｂ）トロンビン成分を有する第２のバイアルまたは第２の保存容器とを備え、前記第１のバイアルまたは第１の保存容器がＰＤＧＦ成分を含まない場合にはＰＤＧＦ成分を有する第３のバイアルまたは第３の保存容器を場合により含有し、前記キットの使用のための取扱説明書をさらに含有するキット。
【請求項５６】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質むフィブリンシーラントを調製するためのキットであって、前記フィブリンシーラントは所望のＰＤＧＦ放出速度を有し、前記キットは、
ａ）フィブリノーゲン複合体成分を含有する第１のバイアルまたは第１の保存容器と、ｂ）場合によりＰＤＧＦ成分を含む、トロンビン成分を有する第２のバイアルまたは第２の保存容器とを備え、前記第２のバイアルまたは第２の保存容器にＰＤＧＦ成分を含まない場合にはＰＤＧＦ成分を有する第３のバイアルまたは第３の保存容器を場合により含有し、前記キットの使用のための取扱説明書をさらに含有するキット。
【請求項５７】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出から利益を得る障害または疾患に罹患している患者の治療のための医薬の製造における、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質を含むフィブリンシーラントの使用であって、前記フィブリンシーラントは所望のＰＤＧＦ放出速度を有する、使用。
【請求項１】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質の、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分、トロンビン成分およびＰＤＧＦ成分の混合により作製されるフィブリンシーラントからの放出を加減する方法であって、
ａ）公知の初期量のＰＤＧＦと公知の最終濃度のＦＣとを有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＰＤＧＦの量を定量するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の前記第１のフィブリンシーラント中で使用されるＦＣの前記公知の最終濃度を加減して、第２のフィブリンシーラントを作製するステップであって、前記第２のシーラント中のＦＣの濃度を前記第１のシーラント中のＦＣの前記公知の最終濃度と比較して高くすることにより、前記第２のシーラントからのＰＤＧＦの放出速度がステップ（ａ）の前記第１のシーラントからのＰＤＧＦの放出と比較して減少し、そして、前記第２のシーラントは、ステップ（ａ）における前記第１のシーラントと同じ初期量のＰＤＧＦを有する、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質の、ＦＣ成分、トロンビン成分およびＰＤＧＦ成分の混合により作製されるフィブリンシーラントからの放出を加減する方法であって、
ａ）公知の初期量のＰＤＧＦと公知の最終濃度のＦＣとを有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＰＤＧＦの量を定量するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の前記第１のフィブリンシーラント中で使用されるＦＣの前記公知の最終濃度を加減して、第２のフィブリンシーラントを作製するステップであって、前記第２のシーラント中のＦＣの濃度を前記第１のシーラント中のＦＣの前記公知の最終濃度と比較して低くすることにより、前記第２のシーラントからのＰＤＧＦの放出速度がステップ（ａ）の前記第１のシーラントからのＰＤＧＦの放出と比較して増加し、そして、前記第２のシーラントは、ステップ（ａ）における前記第１のシーラントと同じ初期量のＰＤＧＦを有する、ステップと
を含む方法。
【請求項３】
前記第１または第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度が約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１または第２のシーラント中のＦＣ濃度が約５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌの範囲内である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のフィブリンシーラント中の最終のＦＣ濃度が、前記第２のシーラント中の最終のＦＣ濃度と約１ｍｇ／ｍｌから約１４９ｍｇ／ｍｌ異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のフィブリンシーラント中の最終のＦＣ濃度が、前記第２のシーラント中のＦＣ濃度と約５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌ異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のフィブリンシーラント中の最終のＦＣ濃度が、前記第２のシーラント中のＦＣ濃度と約１０ｍｇ／ｍｌから約６０ｍｇ／ｍｌ異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記第１または第２のシーラント中のトロンビン成分の最終濃度が約１ＩＵ／ｍｌから２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ＰＤＧＦの最終濃度が約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの範囲内である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質の制御放出を必要とする患者において前記タンパク質を制御放出する方法であって、前記患者に、ＰＤＧＦを含むフィブリンシーラントを投与するステップを含み、前記ＰＤＧＦの少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される、方法。
【請求項１１】
前記フィブリンシーラントが、ＦＣ成分とトロンビン成分とを合わせて混合物にすることにより作製される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＤＧＦが、前記ＦＣ成分を前記トロンビン成分と混合する前に前記ＦＣ成分に加えられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＤＧＦの少なくとも３５％から９０％が少なくとも３日間保持される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＤＧＦの少なくとも４５％から７５％が、前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＤＧＦの少なくとも６０％が、前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１６】
放出された前記ＰＤＧＦが生物学的に活性である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質の制御放出を必要とする患者において前記タンパク質を制御放出する方法であって、前記患者に、ＰＤＧＦを含むフィブリンシーラントを投与するステップを含み、前記ＰＤＧＦの少なくとも２０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、方法。
【請求項１８】
前記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分とトロンビン成分とを合わせて混合物にすることにより作製される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＤＧＦが、前記ＦＣ成分を前記トロンビン成分と混合する前に前記ＦＣ成分に加えられる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＤＧＦの少なくとも２５％から７５％が少なくとも１０日間保持される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＤＧＦの少なくとも４５％から５５％が、前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２２】
放出された前記ＰＤＧＦが生物学的に活性である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記シーラント中の最終のフィブリノーゲン複合体濃度が約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内である、請求項１１または１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記シーラント中の最終のトロンビン濃度が約１ＩＵ／ｍｌから２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内である、請求項１１または１８に記載の方法。
【請求項２５】
最終のフィブリノーゲン複合体濃度が４０ｍｇ／ｍｌであり、最終のトロンビン濃度が約２ＩＵ／ｍｌである、請求項１１または１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記シーラント中の最終のＰＤＧＦ濃度が約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである、請求項１０または１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ−ＡＢである、請求項１０または１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも４０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項１０または１７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも５５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記患者が、筋骨格の疾患または障害、軟部組織の疾患または障害および心血管疾患から成る群から選択される疾患に罹患している、請求項１０または１７に記載の方法。
【請求項３２】
前記筋骨格の障害が骨疾患または骨障害である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記患者が心血管疾患に罹患している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出から利益を得る障害または疾患に罹患している患者を治療する方法であって、前記患者に、前記ＰＤＧＦタンパク質を含むフィブリンシーラント投与するステップを含み、
前記フィブリンシーラントは、前記ＰＤＧＦの少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、または前記ＰＤＧＦの少なくとも２０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される前記ＰＤＧＦの制御放出をもたらし、前記ＰＤＧＦが、前記障害または疾患を治療するのに有効な速度で放出される、方法。
【請求項３５】
前記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分とトロンビン成分とを合わせて混合物にすることにより作製される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＰＤＧＦが、前記ＦＣ成分を前記トロンビン成分と混合する前に前記ＦＣ成分に加えられる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＤＧＦの少なくとも３５％から９０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＤＧＦの少なくとも４５％から７５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＰＤＧＦの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＰＤＧＦの少なくとも２０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰＤＧＦの少なくとも２５％から７５％が少なくとも１０日間保持される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＰＤＧＦの少なくとも４５％から５５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４３】
放出された前記ＰＤＧＦが生物学的に活性である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記シーラント中の最終のＦＣ濃度が約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記シーラント中の最終のトロンビン濃度が約１ＩＵ／ｍｌから２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
最終のフィブリノーゲン複合体濃度が約４０ｍｇ／ｍｌであり、最終のトロンビン濃度が約２ＩＵ／ｍｌである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
前記シーラント中の最終のＰＤＧＦ濃度が約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ−ＡＢである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも８０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＡＢの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項３４に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも５５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも３日間保持され、前記ＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中で少なくとも１０日間保持される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記患者が、筋骨格の疾患または障害、軟部組織障害および心血管疾患から成る群から選択される疾患に罹患している、請求項３４に記載の方法。
【請求項５３】
前記筋骨格の障害が骨疾患または骨障害である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記患者が血管疾患に罹患している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質を含むフィブリンシーラントを調製するためのキットであって、前記フィブリンシーラントは所望のＰＤＧＦ放出速度を有し、前記キットは、
ａ）場合によりＰＤＧＦ成分を含む、フィブリノーゲン複合体成分を含有する第１のバイアルまたは第１の保存容器と、ｂ）トロンビン成分を有する第２のバイアルまたは第２の保存容器とを備え、前記第１のバイアルまたは第１の保存容器がＰＤＧＦ成分を含まない場合にはＰＤＧＦ成分を有する第３のバイアルまたは第３の保存容器を場合により含有し、前記キットの使用のための取扱説明書をさらに含有するキット。
【請求項５６】
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質むフィブリンシーラントを調製するためのキットであって、前記フィブリンシーラントは所望のＰＤＧＦ放出速度を有し、前記キットは、
ａ）フィブリノーゲン複合体成分を含有する第１のバイアルまたは第１の保存容器と、ｂ）場合によりＰＤＧＦ成分を含む、トロンビン成分を有する第２のバイアルまたは第２の保存容器とを備え、前記第２のバイアルまたは第２の保存容器にＰＤＧＦ成分を含まない場合にはＰＤＧＦ成分を有する第３のバイアルまたは第３の保存容器を場合により含有し、前記キットの使用のための取扱説明書をさらに含有するキット。
【請求項５７】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの制御放出から利益を得る障害または疾患に罹患している患者の治療のための医薬の製造における、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢから成る群から選択される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）タンパク質を含むフィブリンシーラントの使用であって、前記フィブリンシーラントは所望のＰＤＧＦ放出速度を有する、使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５３０８８２（Ｐ２０１０−５３０８８２Ａ）
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１３４１９（Ｐ２０１０−５１３４１９）
【出願日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６７５６２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５７７３３
【国際公開日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６７５６２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５７７３３
【国際公開日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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