Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａの検出および／または監視のための組成物、キットおよび関連する方法
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの種特異的検出のための組成物、方法及びキットを提供する。本発明の一態様によれば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ転写媒介性増幅アッセイ用組成物が提供される。この組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡ参照配列（受託番号Ｖ００３３１）の塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にするＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドとを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００７年４月２日に出願された米国仮特許出願第６０／９０９，６８７号（この仮出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表に関する記載
本願に関連する配列表は、紙複製物の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、３９００８２＿４０２ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは、１８ＫＢであり、２００８年４月２日に作成され、明細書の出願と同時に米国ＰＣＴ受理官庁にＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子形式で提出される。
【０００３】
発明の分野
本発明は、試験のために、例えば、診断試験のために、血液製剤スクリーニングのために、バイオプロセス、食品、水、工業若しくは環境試料における微生物検出のために、さらに、他の目的のために採取された試料中の均一若しくは不均一な核酸混合物の大小様々な一成分として、又は単独で存在し得る、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを種特異的に同定するための組成物、方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
特定の核酸配列の検出及び／又は定量化は、微生物の同定及び分類、感染症の診断、遺伝子異常の検出及び特性分析、癌に関連した遺伝子変化の特定、疾患に対する遺伝的感受性の研究、種々の治療に対する応答の測定などに重要な技術である。かかる手順は、食料品、水、工業及び環境試料、保存用種（ｓｅｅｄ ｓｔｏｃｋｓ）、並びに特定の微生物の存在を監視する必要があり得る他のタイプの材料における、微生物の検出及び定量化にも有用である。
【０００５】
核酸増幅アッセイは、従来の微生物学的技術よりも高感度であり、短時間で結果が得られるので、臨床検査、バイオプロセスモニタリング、又は特別な試料タイプにおける特定の微生物の検出が要求される他のあらゆる状況において、微生物の検出に適切である。さらに、増幅方法は、合成培地上での培養が困難又は不可能である膨大な数の微生物の検出に使用することができる。それでも、これらの手法については制約があり、その多くは、核酸増幅方法の感度が高く、その結果、意図しない副生物が増幅されることに由来する。
【０００６】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、ヒトに感染するグラム陰性菌であり、治療が特に困難になり得るグラム陰性菌である。さらに、この生物体は、多数の生物薬剤工程における幾つかの公知汚染菌の一つである。したがって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及び他の関連生物体の存在を検出及び監視する高感度で迅速な方法が絶えず求められている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの迅速で正確な検出及び／又は定量化は極めて望ましいが、従来の試薬及び技術を用いて実際に達成することは困難であった。例えば、実験室での培養技術は、試料を２４〜４８時間インキュベートして、生物体を巨視的に検出可能なレベルに増殖させる必要がある。次いで、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを関連Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ及び他の腸内細菌から識別するために継代培養技術及び代謝アッセイが必要であり、更に２４〜４８時間を必要とし得る。
【０００７】
したがって、対象試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを特異的かつ選択的に同定することができる迅速で堅牢な検出システムが当分野では依然として必要とされている。本明細書で更に記述するように、本発明は、これらの要求を満たし、他の関連した利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、全般的に、検出の特異性、感度及び速度に関して改善及び他の利点を提供する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの検出に使用される組成物、キット及び方法をもたらすものである。以下に更に考察するように、本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの特別な領域が、これらの改善及び別の利点を与える核酸増幅反応の好ましい標的であることを確認した。
【０００９】
したがって、本発明の一態様によれば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ転写媒介性増幅アッセイ用組成物が提供される。この組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡ参照配列（受託番号Ｖ００３３１）の塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を標的にするＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドとを含む。本明細書で更に記述し、立証するように、この領域内で特に明確な特異性を有するＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドの使用によって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを検出するための転写媒介性増幅反応における感度及び選択性が改善される。
【００１０】
本発明のこの態様の特定の一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【００１１】
より特別な一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【００１２】
より具体的な一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、本明細書に定義される、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、非Ｔ７プライマーは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される。
【００１３】
本発明の特に好ましい一組成物は、本明細書に定義される、Ｔ７プロバイダー配列番号２及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド配列番号２４を含む。
【００１４】
上で考察したＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、本発明による組成物は、検出オリゴヌクレオチド、伸長オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチドなど、転写媒介性増幅反応の１つ以上の態様を促進又は改善するのに役立つ１種類以上の追加のオリゴヌクレオチドタイプ及び／又は別の増幅試薬を更に含むことができる。
【００１５】
例えば、一実施形態においては、本発明の組成物は、検出オリゴヌクレオチド、好ましくはトーチオリゴヌクレオチド又は分子ビーコンを更に含むことになる。特定の一実施形態においては、検出オリゴヌクレオチドは、本明細書に定義される、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択されるトーチオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
本発明の組成物は、伸長オリゴヌクレオチドも更に含むことができる。特定の一実施形態においては、伸長オリゴヌクレオチドは、本明細書に定義される、配列番号４３又は配列番号４４から選択される。
【００１７】
本発明の組成物は、ブロッカーオリゴヌクレオチドも更に含むことができる。特定の一実施形態においては、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、本明細書に定義される、配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０又は配列番号４２から選択される。
【００１８】
本発明の好ましい一実施形態においては、組成物は、本明細書に定義される、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド配列番号２及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド配列番号２４を含み、場合によってはブロッカーオリゴヌクレオチド配列番号２９、トーチオリゴヌクレオチド配列番号５４、伸長オリゴヌクレオチド配列番号４４、標的捕捉オリゴヌクレオチド配列番号６８を更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチド配列番号７３を更に含む。
【００１９】
本発明の別の一態様によれば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ転写媒介性増幅アッセイを実施するためのキットが提供される。このキットは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にするＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドとを含む。
【００２０】
本発明のこの態様の特定の一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【００２１】
別の特定の一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【００２２】
より具体的な一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、非Ｔ７プライマーは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される。
【００２３】
別の特定の一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは配列番号２であり、非Ｔ７プライマーは配列番号２４である。
【００２４】
本発明のキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、検出オリゴヌクレオチド、伸長オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチドなど、転写媒介性増幅反応において望まれる又は好ましい１種類以上の追加のオリゴヌクレオチド及び／又は別の試薬を更に含むことができる。例えば、本発明のキットは、トーチオリゴヌクレオチド、分子ビーコンなどの検出オリゴヌクレオチドを更に含むことができる。特定の一実施形態においては、例えば、キットは、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択されるトーチオリゴヌクレオチドを含む。
【００２５】
本発明のキットは、伸長オリゴヌクレオチドも更に含むことができる。特定の一実施形態においては、伸長オリゴヌクレオチドは、配列番号４３又は配列番号４４から選択される。
【００２６】
本発明のキットは、ブロッカーオリゴヌクレオチドも更に含むことができる。特定の一実施形態においては、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０又は配列番号４２から選択される。
【００２７】
より具体的な一実施形態においては、本発明のキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号２及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド、配列番号２４を含み、場合によってはブロッカーオリゴヌクレオチド配列番号２９、トーチオリゴヌクレオチド配列番号５４、伸長オリゴヌクレオチド配列番号４４、標的捕捉オリゴヌクレオチド配列番号６９を更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチド配列番号７３を更に含む。
【００２８】
本発明の更に別の一態様によれば、試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を検出する方法が提供される。この方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを用いて転写媒介性増幅アッセイを実施するものであって、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【００２９】
特定の一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【００３０】
別の特定の一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域の配列を標的にする。
【００３１】
より具体的な一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、非Ｔ７プライマーは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される。
【００３２】
別のより具体的な一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは配列番号２であり、非Ｔ７プライマーは配列番号２４である。
【００３３】
上で考察した組成物及びキットと同様に、本発明のこの態様による方法は、検出オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド、伸長オリゴヌクレオチドなど、転写媒介性増幅反応において有効である、追加の補助的なオリゴヌクレオチド及び／又は試薬を更に含むことができる。
【００３４】
例えば、方法は、トーチオリゴヌクレオチド、分子ビーコンなどの検出オリゴヌクレオチドの使用を利用することができる。一実施形態においては、トーチオリゴヌクレオチドは、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択される。
【００３５】
本方法は、配列番号４３、配列番号４４などの伸長オリゴヌクレオチド、又は配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０、配列番号４２などのブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を利用することもできる。
【００３６】
本発明のこの態様のより具体的な一実施形態においては、転写媒介性増幅方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド配列番号２及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド配列番号２４の使用を利用し、ブロッカーオリゴヌクレオチド配列番号２９、トーチオリゴヌクレオチド配列番号５４、伸長オリゴヌクレオチド配列番号４４、標的捕捉オリゴヌクレオチド配列番号６９の使用を更に利用し、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチド、配列番号７３の使用を利用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】近縁のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ１０５ＣＦＵで得られた実時間蛍光シグナルと比較したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ約１０ＣＦＵの増幅で得られた実時間蛍光シグナルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、臨床試料、バイオプロセス試料、食品試料、水試料、工業試料、環境試料、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むことが知られている、又は疑われる、任意の他の試料タイプなどの試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を検出、監視及び／又は定量化する組成物、方法及びキットに一般に関する。本発明の特定の組成物、方法及びキットは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの増幅による検出における感度、特異性及び選択性を改善する。
【００３９】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに特異的な増幅オリゴヌクレオチドの詳細な分析の結果として、本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの増幅による検出に好ましい標的として、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡ参照配列（受託番号Ｖ００３３１）約７００から１０００ヌクレオチド塩基の領域に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの特別な領域（以下「８００領域」と記述する。）を特定した。したがって、本発明は、対象試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの種特異的検出における、増幅オリゴヌクレオチド、組成物、反応混合物、キットなど、及びそれらの使用に関する。
【００４０】
本発明の用語及び概念は、それに反することを明記しない限り、及び／又は別段の記載がない限り、本明細書に記載の意味を有する。特に断らない限り、本明細書で使用する科学的・技術的用語は、当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。一般的定義は、分子生物学の技術に関連した技術書、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）、又はＴｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，１９９１，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。特に断らない限り、本明細書で利用又は企図される技術は、当業者に周知の標準方法である。本明細書に含まれる実施例は、一部の好ましい実施形態を説明するものである。
【００４１】
「１」の実体という用語は、その実体の１以上を指すことに留意されたい。例えば、「１個の核酸」は、１個以上の核酸を表すものと理解される。したがって、「１」、「１以上」及び「少なくとも１」という用語は、本明細書では区別なく使用することができる。さらに、本明細書に引用される各参考文献は、参照によってその全体が本明細書に具体的に援用される。
【００４２】
核酸増幅及び検出
当業者であればわかることであるが、本発明の好ましいオリゴヌクレオチド、組成物、反応混合物及びキットは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの検出を改善するために核酸増幅方法に使用される。かかる方法及び技術は、周知であり、確立されているが、核酸増幅、検出などの説明のための好ましい態様を以下に考察する。
【００４３】
核酸
「核酸」という用語は、単一の「核酸」及び複数の「核酸」を包含するものとし、共有結合した２個以上のヌクレオチド、ヌクレオシド又は核酸塩基（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）の任意の鎖を指す。核酸としては、ウイルスゲノム若しくはその一部、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、細菌ゲノム若しくはその一部、真菌、植物若しくは動物のゲノム又はその一部、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ若しくはＲＮＡが挙げられるが、これらだけに限定されない。核酸は、線状（例えば、ｍＲＮＡ）、環状（例えば、プラスミド）又は分枝状、さらには二本鎖又は一本鎖状であり得る。核酸は、核酸の機能又は挙動を変える修飾塩基を含み得る（例えば、更なるヌクレオチドが核酸に付加するのを防止する３’末端ジデオキシヌクレオチドの付加）。本明細書では核酸の「配列」とは、核酸を構成する塩基の配列を指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸鎖を意味するのに本明細書では使用することができる。本願を通して、核酸は、５’末端から３’末端方向に命名される。標準核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、「３’から５’方向」に、すなわち、成長する核酸の５’末端にヌクレオチドが付加することによって、典型的には合成される。
【００４４】
「ヌクレオチド」は、リン酸基、五炭糖及び窒素塩基からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡ中に存在する五炭糖はリボースである。ＤＮＡでは、五炭糖は２’−デオキシリボースである。この用語は、リボースの２’位のメトキシ基（２’−Ｏ−Ｍｅ）など、かかるサブユニットの類似体も含む。本明細書では、「Ｔ」残基を含むメトキシオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位のメトキシ基と、ヌクレオチドの塩基位置のウラシルとを有する。
【００４５】
「非ヌクレオチド単位」は、ポリマーのハイブリダイゼーションにさほど関与しない単位である。かかる単位は、例えば、ヌクレオチドとの重要な水素結合に関与してはならず、５種類のヌクレオチド塩基又はその類似体のうちの１種類を成分として有する単位を除外する。
【００４６】
標的核酸／標的配列
「標的核酸」とは、増幅すべき「標的配列」を含む核酸である。標的核酸は、本明細書に記載のＤＮＡ又はＲＮＡとすることができ、一本鎖又は二本鎖とすることができる。標的核酸は、標的配列に加えて、増幅されなくてもよい別の配列を含んでもよい。典型的な標的核酸としては、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、真菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、ウイルス、細菌又は真核細胞由来のｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、染色体ＤＮＡなどが挙げられる。
【００４７】
標的核酸は、実施する増幅アッセイの目的に基づいて、任意の数の出所から単離することができる。標的核酸の出所としては、犯罪の証拠から、環境試料（例えば、水又は土壌試料）から、食品から、工業試料から、ｃＤＮＡライブラリーから、又は全細胞ＲＮＡからの臨床検体（例えば、血液、尿、唾液、糞便、精液又は髄液）が挙げられるが、これらだけに限定されない。「単離する」とは、標的核酸を含む試料がその自然環境から採取されることを意味するが、この用語は、いかなる程度の精製も内包しない。必要に応じて、本発明の標的核酸は、本発明の種々のオリゴヌクレオチドとの相互作用に利用することができる。この用語は、例えば、標的核酸を細胞から遊離させる細胞溶解又は細胞透過処理を含み、続いて一連の単離及び洗浄段階などの１つ以上の精製段階を実施することができる。例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Ｃｌａｒｋ他、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ ａ Ｗｉｄｅ Ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、米国特許第５，７８６，２０８号を参照されたい。これは、例えば、血液試料中に存在するヘムなど、増幅反応を妨害し得る成分を含む可能性がある試料の場合に特に重要である。その内容を参照により本明細書に援用する、Ｒｙｄｅｒ他、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｒｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｇｅｎｔｓ」、米国特許第５，６３９，５９９号を参照されたい。増幅のために標的核酸を種々の出所から調製する方法は、当業者に周知である。本発明の標的核酸は、本明細書に記載の増幅反応前にある程度精製することができるが、試料をそれ以上操作せずに増幅反応に加える場合もある。
【００４８】
「標的配列」という用語は、増幅すべき標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」は、オリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチド及び／又はプロモーターオリゴヌクレオチド）が本発明のプロセス中に複合体を形成する相手となる、複合化配列（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。標的核酸が最初に一本鎖である場合、「標的配列」という用語は、標的核酸中に存在する「標的配列」に相補的である配列も指す。「標的核酸」が最初に二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）とアンチセンス（−）の両方の鎖を指す。当業者であればわかることであるが、標的配列を選択する際には、無関係な又は近縁の標的核酸を識別するように、「独特の」配列を選択すべきである。当業者であればわかることであるが、「独特の」配列は、試験環境から判断される。少なくとも、（より詳細に本明細書に記述する）検出プローブによって認識される配列は、試験環境下で独特であるべきであるが、可能な全配列の中で独特である必要はない。さらに、検出プローブによって認識されるには標的配列が「独特の」配列を含んでいなければならないが、プライミングオリゴヌクレオチド及び／又はプロモーターオリゴヌクレオチドが「独特の」配列を必ずしも認識しているとは限らない。一部の実施形態においては、関連生物体ファミリーに共通した標的配列、例えば、試料中に存在し得る１種類以上のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓに共通した配列を選択することが望ましい場合もある。別の状況では、極めて高度に特異的な標的配列、又は検出プローブ及び増幅オリゴヌクレオチドによって認識される少なくとも高度に特異的な領域を有する標的配列は、近縁の生物体、例えば、病原性と非病原性のＥ．ｃｏｌｉを識別するように選択される。本発明の標的配列は、任意の実用的な長さとすることができる。最小の標的配列は、より詳細に本明細書に記述する、プライミングオリゴヌクレオチド（又はその相補配列）とハイブリッド形成する領域、プロモーターオリゴヌクレオチド（又はその相補配列）のハイブリッド形成領域とハイブリッド形成する領域、及び検出に使用される領域、例えば、検出プローブとハイブリッド形成する領域を含む。検出プローブとハイブリッド形成する領域は、プライミングオリゴヌクレオチド（又はその相補配列）とハイブリッド形成する領域、又はプロモーターオリゴヌクレオチド（又はその相補配列）のハイブリッド形成領域とハイブリッド形成する領域と重複してもよく、又は該ハイブリッド形成する領域内に含まれてもよい。これら最低限の要件に加えて、標的配列の最適な長さは、幾つかの考慮事項、例えば、二次構造の量、又は配列内の自己ハイブリッド形成領域によって決まる。典型的には、本発明の標的配列は、約１００ヌクレオチド長から約１５０から約２５０ヌクレオチド長の範囲である。最適な又は好ましい長さは、本明細書に記載の方法によって決定することができる異なる条件下で変わり得る。「アンプリコン」という用語は、標的配列内に含まれる配列に相補的又は相同である、増幅手順中に生成する核酸分子を指す。
【００４９】
核酸「同一性」
ある実施形態においては、本発明の核酸は、参照核酸の連続塩基領域と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一である連続塩基領域を含む。低分子核酸、例えば、本発明のある種のオリゴヌクレオチドの場合、「問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）」核酸の塩基領域と参照核酸の塩基領域の同一性の程度は、手操作によるアラインメントによって決定することができる。「同一性」は、比較する核酸の糖及び骨格領域とは無関係に、窒素塩基の配列のみを比較することによって決定される。したがって、問い合わせ：参照塩基配列アラインメントは、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、又はその任意の組合せ若しくは類似物とすることができる。（ＲＮＡ中の）Ｕを（ＤＮＡ中の）Ｔに変換することによって、対応するＲＮＡとＤＮＡの塩基配列を比較することができる。
【００５０】
オリゴヌクレオチド及びプライマー
本明細書では「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」又は「オリゴマー」という用語は、単一の「オリゴヌクレオチド」及び複数の「オリゴヌクレオチド」を包含するものとし、本発明の増幅方法及び後続の検出方法における試薬として使用される、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基又は関連化合物の２個以上からなるポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はその類似体とすることができる。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬に対する特別な機能を意味するのではなく、本明細書に記載のすべてのかかる試薬を網羅するのに包括的に使用される。オリゴヌクレオチドは、多様な機能を果たすことができ、例えば、相補鎖に特異的であり、相補鎖とハイブリッド形成可能であり、さらに核酸ポリメラーゼの存在下で伸長することができる場合にはプライマーとして機能することができ、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含み、転写可能である場合にはプロモーターを与えることができ（例えば、Ｔ７プロバイダー）、適切に位置する及び／又は修飾されている場合には、ハイブリダイゼーションを阻止する、又はプライマー伸長を妨害する、機能を果たすことができる。本発明の特定のオリゴヌクレオチドをより詳細に以下に記述する。
【００５１】
本明細書では、オリゴヌクレオチドは、増幅反応における、又は増幅反応の増幅産物の検出における、その特定の機能によってのみ限定される、実質的に任意の長さとすることができる。しかし、ある実施形態においては、好ましいオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列又はその相補鎖の一領域に相補的である少なくとも約１０、１２、１４、１６、１８又は２０個の連続塩基を含む。連続塩基は、オリゴヌクレオチドが結合する標的配列に対して、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは完全に相補的である。ある種の好ましいオリゴヌクレオチドは、一般に約１０〜１００、１０〜７５、１０〜５０又は１０〜２５塩基長であり、場合によっては修飾ヌクレオチドを含む。
【００５２】
明確な配列及び化学構造のオリゴヌクレオチドは、化学又は生化学合成によって、さらに、組換え核酸分子（例えば、細菌又はウイルスベクター）からのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ発現によってなど、当業者に公知の技術によって生成させることができる。本開示によって意図されるように、オリゴヌクレオチドは、野生型染色体ＤＮＡ又はそのｉｎ ｖｉｖｏ転写産物のみからなるものではない。
【００５３】
オリゴヌクレオチドは、所与の修飾が所与のオリゴヌクレオチドの所望の機能に適合する限り、どのようにでも修飾することができる。当業者は、所与の修飾が本発明の所与のオリゴヌクレオチドに適切である、又は望ましいかどうかを容易に判断することができる。修飾としては、塩基修飾、糖修飾、骨格修飾などが挙げられる。塩基修飾としては、アデニン、シチジン、グアノシン、チミン及びウラシルに加えて以下の塩基、すなわち、Ｃ−５プロピン、２−アミノアデニン、５−メチルシチジン、イノシン、並びにｄＰ及びｄＫ塩基の使用が挙げられるが、これらだけに限定されない。ヌクレオシドサブユニットの糖類は、例えば、リボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含めて、リボース、デオキシリボース及びその類似体であり得る。Ｂｅｃｋｅｒ他、米国特許第６，１３０，０３８号を参照されたい。他の糖修飾としては、２’−アミノ、２’−フルオロ、（Ｌ）−アルファ−スレオフラノシル及びペントピラノシル修飾が挙げられるが、これらだけに限定されない。ヌクレオシドサブユニットは、リン酸ジエステル結合、修飾された結合などの結合によって、又はオリゴヌクレオチドとその相補標的核酸配列のハイブリダイゼーションを妨げない非ヌクレオチド部分によって、連結することができる。修飾された結合としては、標準リン酸ジエステル結合がホスホロチオアート結合、メチルホスホナート結合などの異なる結合で置換された結合などが挙げられる。核酸塩基サブユニットは、例えば、ＤＮＡの天然デオキシリボースホスファート骨格を（核酸塩基サブユニットをカルボキシメチルリンカーによって中央の第二級アミンに結合させる２−アミノエチルグリシン骨格などの）偽ペプチド骨格で置換することによって、連結することができる。偽ペプチド骨格を有するＤＮＡ類似体は、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」と一般に称され、Ｎｉｅｌｓｅｎ他、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」、米国特許第５，５３９，０８２号によって開示されている。別の結合修飾としては、モルホリノ結合が挙げられるが、これだけに限定されない。
【００５４】
本発明によって企図されるオリゴヌクレオチド又はオリゴの非限定的例としては、二環式及び三環式のヌクレオシド及びヌクレオチド類似体を含む核酸類似体（ＬＮＡ）が挙げられる。Ｉｍａｎｉｓｈｉ他、米国特許第６，２６８，４９０号、及びＷｅｎｇｅｌ他、米国特許第６，６７０，４６１号を参照されたい。修飾オリゴヌクレオチドがその意図された機能を果たすことができる（例えば、厳密なハイブリダイゼーション条件若しくは増幅条件下で標的核酸とハイブリッド形成し、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼと相互作用し、それによって伸長又は転写を惹起することができる）という前提で、任意の核酸類似体が本発明によって企図される。検出プローブの場合には、修飾オリゴヌクレオチドは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標的核酸と優先的にハイブリッド形成することもできなければならない。
【００５５】
本発明のためのオリゴヌクレオチドの設計及び配列は、以下に示すその機能によって決まるが、幾つかの変数を一般に考慮しなければならない。最も重要な変数としては、長さ、融解温度（Ｔｍ）、特異性、系中の他のオリゴヌクレオチドとの相補性、Ｇ／Ｃ含量、ポリピリミジン（Ｔ、Ｃ）又はポリプリン（Ａ、Ｇ）配列（ｓｔｒｅｔｃｈ）、及び３’末端配列が挙げられる。これら及び他の変数の制御は、オリゴヌクレオチド設計の標準で周知の側面であり、多数のオリゴヌクレオチド候補を最初にスクリーニングするのに種々のコンピュータプログラムを容易に利用することができる。
【００５６】
オリゴヌクレオチド（又は別の核酸）の３’末端は、以下に示すように、ブロッキング成分を用いて種々の方法でブロックすることができる。「ブロックされた」オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによってヌクレオチドがその３’末端に付加することによって効率的に伸長してＤＮＡの相補鎖を生成することがない。したがって、「ブロックされた」オリゴヌクレオチドは「プライマー」になり得ない。
【００５７】
本開示では、特定の配列の群から選択される配列「を含む」、「からなる」又は「から本質的になる」核酸配列を有するオリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドが、基本的で新規な特性として、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、群の列挙された核酸配列のうちの１個の正確な相補配列を有する核酸と安定にハイブリッド形成する能力のあることを意味する。正確な相補配列としては、対応するＤＮＡ又はＲＮＡ配列などが挙げられる。
【００５８】
指定の核酸配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドとは、言及されたオリゴヌクレオチドが、厳密なハイブリダイゼーション条件下で同じ標的核酸配列とハイブリッド形成する点で、参照核酸配列と類似したハイブリダイゼーション特性を有するように、該オリゴヌクレオチドが参照核酸配列に十分類似していることを意味する。
【００５９】
本発明の実質的に対応するオリゴヌクレオチドは、言及された配列とは異なり得るが、それでも同じ標的核酸配列とハイブリッド形成し得ることを当業者は理解されたい。核酸からのこの変化は、配列内の同一塩基の割合、又はプローブ若しくはプライマーとその標的配列との間の完全に相補的な塩基の割合として示すことができる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、塩基の同一性又は相補性のこれらの割合が１００％から約８０％である場合に、参照核酸配列に実質的に対応する。好ましい実施形態においては、割合は１００％から約８５％である。より好ましい実施形態においては、この割合は１００％から約９０％とすることができ、別の好ましい実施形態においては、この割合は１００％から約９５％である。当業者は、容認できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを引き起こさずに、相補性の様々な割合において特定の標的配列とハイブリッド形成するのに必要となり得るハイブリダイゼーション条件の種々の改変を理解するはずである。
【００６０】
「ヘルパーオリゴヌクレオチド」又は「ヘルパー」とは、例えば、その内容を参照により本明細書に援用する米国特許第５，０３０，５５７号に記載のように、標的核酸に結合し、異なる二次及び／又は三次構造を標的核酸に強制して、検出プローブ又は他のオリゴヌクレオチドと標的核酸のハイブリダイゼーションの速度及び程度を増加させるように設計されたオリゴヌクレオチドを指す。ヘルパーは、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションを補助するのに、さらに、プライマー、標的捕捉及び別のオリゴヌクレオチドの機能を補助するのに使用することもできる。
【００６１】
ブロッキング成分
本明細書では「ブロッキング成分」は、オリゴヌクレオチド又は別の核酸が核酸ポリメラーゼによって効率的に伸長することができないように、オリゴヌクレオチド又は別の核酸の３’末端を「ブロックする」のに使用される物質である。ブロッキング成分は、小分子、例えばリン酸基又はアンモニウム基とすることができ、或いは修飾ヌクレオチド、例えば、３’２’ジデオキシヌクレオチド若しくは３’デオキシアデノシン５’−三リン酸（コルジセピン）、又は別の修飾ヌクレオチドとすることができる。別のブロッキング成分としては、例えば、３’から５’方向の配向を有するヌクレオチド若しくは低分子ヌクレオチド配列の使用（その結果、３’末端に遊離ヒドロキシル基が存在しない。）、３’アルキル基、３’非ヌクレオチド部分（例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Ａｒｎｏｌｄ他、「Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」、米国特許第６，０３１，０９１号を参照されたい。）、ホスホロチオアート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、３’末端に３’ヒドロキシル基のないヌクレオチド残基、又は核酸結合タンパク質の使用が挙げられる。好ましくは、３’−ブロッキング成分は、３’から５’方向の配向を有するヌクレオチド若しくはヌクレオチド配列、又は３’非ヌクレオチド部分を含み、３’２’−ジデオキシヌクレオチドも遊離ヒドロキシル基を有する３’末端も含まない。３’−ブロッキングオリゴヌクレオチドを調製する別の方法は、当業者に周知である。
【００６２】
プライミングオリゴヌクレオチド又はプライマー
プライミングオリゴヌクレオチド又は「プライマー」は、少なくともその３’末端が核酸鋳型に相補的であるオリゴヌクレオチド、及び（水素結合又はハイブリダイゼーションによって）鋳型と複合体を形成して、ＲＮＡ又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって合成を開始するのに適切であるプライマー：鋳型複合体を生成するオリゴヌクレオチドである。プライミングオリゴヌクレオチドは、共有結合したヌクレオチド塩基がその３’末端に付加することによって伸長する。該塩基は、鋳型に相補的である。その結果は、プライマー伸長産物である。本発明のプライミングオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも１０ヌクレオチド長であり、最高１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド長以上まで伸長し得る。適切な好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。（逆転写酵素を含めて）実質的にすべての公知ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成を開始するためにオリゴヌクレオチドと一本鎖鋳型の複合体形成（「プライミング」）を必要とするのに対して、ＲＮＡ複製及び転写（ＤＮＡからのＲＮＡの複製）は、一般にプライマーを必要としない。ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるまさにその性質によって、プライミングオリゴヌクレオチドは、３’−ブロッキング成分を含まない。
【００６３】
プロモーターオリゴヌクレオチド／プロモーター配列
当分野で周知のとおり、「プロモーター」は、核酸に結合し、特定の部位におけるＲＮＡの転写を開始するシグナルとして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）によって認識される特異的核酸配列である。結合のためには、かかる転写酵素は、プロモーター配列を含む領域において伸長反応によって二本鎖になったＤＮＡを必要とすると一般に考えられたが、本発明者らは、ＲＮＡの効率的転写が、鋳型核酸を用いた伸長反応によって二本鎖プロモーターが形成されない条件下でも起こり得ることを確認した。鋳型核酸（転写される配列）は、二本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写促進効率が著しく異なり得る種々のプロモーター配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合して転写を開始するときには、プロモーター配列は、転写される配列の一部ではない。したがって、それによって産生されるＲＮＡ転写物は、プロモーター配列を含まない。
【００６４】
本明細書では「プロモーターオリゴヌクレオチド」又は「プロバイダー」とは、第１及び第２の領域を含むオリゴヌクレオチドであって、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を阻止するように修飾されたオリゴヌクレオチドである。本発明のプロモーターオリゴヌクレオチドの「第１の領域」は、鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成する塩基配列を含み、ハイブリッド形成配列は３’に位置するが、プロモーター領域に必ずしも隣接しない。本発明のプロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成部分は、典型的には少なくとも１０ヌクレオチド長であり、最高１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド長以上まで伸長し得る。「第２の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター配列を含む。本発明のプロモーターオリゴヌクレオチドは、上述したように、その３’末端にブロッキング成分を好ましくは含むＲＮＡ又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素によって伸長することができないように操作される。適切な好ましいプロモーターオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。
【００６５】
終結オリゴヌクレオチド
本発明においては、「終結オリゴヌクレオチド」又は「ブロッカーオリゴ」は、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「終結させ」、それによって新生核酸鎖に明確な３’末端を与えるように、標的配列の５’末端付近の標的核酸の領域に相補的である塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。終結オリゴヌクレオチドは、新生核酸鎖に所望の３’末端を与えるのに十分な位置において、標的核酸とハイブリッド形成するように設計される。終結オリゴヌクレオチドの位置決めは、その設計に応じて変更することができる。終結オリゴヌクレオチドは、修飾でも無修飾でもよい。ある実施形態においては、終結オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いて合成される。これらの修飾ヌクレオチドは、相補的二重鎖の熱安定性を向上させる。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高め、それによって修飾オリゴヌクレオチドの半減期を延長する機能も果たす。例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Ｍａｊｌｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６，２２２４−９を参照されたい。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドに加えて、又はその代わりに、本明細書に記載の別の修飾を利用することができる。例えば、終結オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡ又はＬＮＡを含むことができる。例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３，４４−５３を参照されたい。本発明の終結オリゴヌクレオチドは、典型的には、伸長を阻止するブロッキング成分をその３’末端に含む。終結オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによる新生核酸鎖の更なる伸長を終結させるために、オリゴヌクレオチドに結合したタンパク質又はペプチドも含むことができる。本発明の終結オリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも１０塩基長であり、最高１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド長以上まで伸長し得る。適切な好ましい終結オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。終結オリゴヌクレオチドは、典型的又は必然的に３’ブロッキング成分を含むが、「３’ブロックされた」オリゴヌクレオチドは、必ずしも終結オリゴヌクレオチドではないことに留意されたい。本発明の別のオリゴヌクレオチド、例えば、プロモーターオリゴヌクレオチド及びキャッピングオリゴヌクレオチドも、同様に、典型的又は必然的に３’ブロックされる。
【００６６】
伸長オリゴヌクレオチド
「伸長オリゴヌクレオチド」又は「伸長オリゴ」とは、Ｔ７プロバイダーと同じ意味のオリゴヌクレオチドを指し、構造を開く、又は特異性を改善する、ヘルパーオリゴヌクレオチドとして作用することができる。伸長オリゴヌクレオチドは、プロモーターオリゴヌクレオチドの第１の領域の３’末端に隣接する、又はその近くの鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成する。伸長オリゴヌクレオチドは、伸長オリゴヌクレオチドの５’末端塩基がプロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端塩基の３、２又は１塩基以内にあるように、鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成することが好ましい。最も好ましくは、伸長オリゴヌクレオチドの５’末端塩基は、伸長オリゴヌクレオチド及びプロモーターオリゴヌクレオチドが鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成するときに、プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端塩基に隣接する。伸長オリゴヌクレオチドの伸長を防止するために、３’末端ブロッキング成分が典型的には含まれる。伸長オリゴヌクレオチドは、好ましくは１０から５０ヌクレオチド長、より好ましくは２０から４０ヌクレオチド長、最も好ましくは３０から３５ヌクレオチド長である｛米国特許出願公開第２００６／００４６２６５号参照｝。
【００６７】
プローブ
「プローブ」又は「検出プローブ」とは、検出しようとする標的配列の領域と厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成するように、該領域に部分的又は完全に相補的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む分子を意味する。当業者には理解されるように、プローブは、人の介在なしには天然に存在しない形で（例えば、異質な核酸で組み換えられた、単離された、又はある程度精製された）、単離核酸分子、又はその類似体を含む。
【００６８】
本発明のプローブは、ヌクレオシド又は核酸塩基が厳密なハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションに実質的に影響を及ぼさない限り、さらに、検出プローブの場合には、標的核酸との優先的なハイブリダイゼーションを阻止しない限り、標的領域の外側に追加のヌクレオシド又は核酸塩基を有することができる。標的捕捉配列（一般に、ポリＡ、ポリＴ、ポリＵ末端などのホモポリマー鎖（ｔｒａｃｔ））、プロモーター配列、ＲＮＡ転写用結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位などの非相補配列も含まれる場合があり、又は非相補配列は、プローブ、標的核酸若しくはその両方に触媒作用活性部位、ヘアピン構造などの所望の二次若しくは三次構造を与える配列を含むことができる。
【００６９】
プローブは、好ましくは、少なくとも１個の検出可能な標識を含む。標識は、放射性同位体、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、発色団、所定の条件下で標的核酸と安定にハイブリッド形成することができない塩基配列領域、及びこれらの混合物を含めて、ただしこれらだけに限定されない任意の適切な標識化物質とすることができる。特に好ましい一実施形態においては、標識はアクリジニウムエステルである。本発明のある種のプローブは、標識を含まない。例えば、非標識「捕捉」プローブを使用して、標的配列又はその複製物を濃縮することができ、次いで標的配列又はその複製物を第２の「検出」プローブによって検出することができる。例えば、参照により本明細書に援用する、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ他、「Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」、米国特許第６，５３４，２７３号を参照されたい。検出プローブは典型的には標識されるが、ある種の検出技術では、プローブを標識する必要はない。例えば、Ｎｙｇｒｅｎ他、「Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、米国特許第６，０６０，２３７号を参照されたい。
【００７０】
「安定な」又は「検出が安定」とは、反応混合物の温度が核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも２℃低いことを意味する。反応混合物の温度は、より好ましくは、核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも５℃低く、更により好ましくは、反応混合物の融解温度よりも少なくとも１０℃低い。
【００７１】
「優先的にハイブリッド形成する」とは、厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、本発明のプローブがその標的配列又はその複製物とハイブリッド形成して、安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成し、同時に、安定なプローブ：非標的ハイブリッドの形成が最小限に抑えられることを意味する。したがって、プローブは、非標的配列よりも十分高い程度で標的配列又はその複製物とハイブリッド形成して、増幅中に形成される標的配列の複製ＲＮＡ又は相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を当業者が正確に定量することができる。
【００７２】
明確な配列のプローブは、化学合成によって、さらに、組換え核酸分子からのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ発現によってなど、当業者に公知の技術によって生成させることができる。好ましくは、プローブは１０から１００ヌクレオチド長、より好ましくは１２から５０塩基長、更により好ましくは１８から３５塩基長である。
【００７３】
ハイブリッド形成／ハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーションは、完全又は部分的に相補的であるヌクレオチド配列を有する２本の核酸鎖が所定の反応条件下で一体となって、安定な二本鎖ハイブリッドを形成するプロセスである。どちらの核酸鎖も、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）又はその類似体とすることができる。したがって、ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、又はその類似体を含み得る。この二本鎖構造の２本の構成鎖は、ハイブリッドとも称し、水素結合によって一体化される。この水素結合は、最も一般的には、塩基アデニンとチミン若しくはウラシル（ＡとＴ若しくはＵ）又はシトシンとグアニン（ＣとＧ）を単一核酸鎖上に含むヌクレオチド間で形成されるが、塩基対合は、これらの「正規の（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」対のメンバーではない塩基間でも形成され得る。非正規塩基対合は、当分野で周知である。（例えば、Ｒｏｇｅｒ Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”（１１ｔｈ ｅｄ．１９９２）を参照されたい。）
「厳密な」ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、特定の検出プローブが、試験試料中に存在する他の核酸よりも標的核酸とハイブリッド形成することができる条件を指す。これらの条件は、プローブのＧＣ含量及び長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬又は溶液の組成、並びに得ようとするハイブリダイゼーション特異性の程度を含めて、諸因子に応じて変わり得ることを理解されたい。特定の厳密なハイブリダイゼーション条件を以下に開示する。
【００７４】
「核酸ハイブリッド」、「ハイブリッド」又は「二重鎖」とは、各鎖が他方の鎖に相補的であり、化学発光若しくは蛍光検出、オートラジオグラフィー、又はゲル電気泳動を含めて、ただしこれらだけに限定されない手段によって検出するのに、厳密なハイブリダイゼーション条件下で領域が十分に安定である、二本鎖水素結合領域を含む核酸構造を意味する。かかるハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子を含み得る。
【００７５】
「相補的」とは、２個の一本鎖核酸の類似領域のヌクレオチド配列、又は同じ一本鎖核酸の異なる領域が、安定な二本鎖水素結合領域において、厳密なハイブリダイゼーション又は増幅条件下で、一本鎖領域同士がハイブリッド形成することを可能にする、ヌクレオチド塩基組成を有することを意味する。一方の一本鎖領域のヌクレオチドの連続配列が、他方の一本鎖領域のヌクレオチドの類似配列と一連の「正規」水素結合塩基対を形成することができ、その結果、ＡがＵ又はＴと対形成し、ＣがＧと対形成するときには、ヌクレオチド配列は「完全に」相補的である。
【００７６】
「優先的に」ハイブリッド形成するとは、厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ある種の相補的ヌクレオチド又は核酸塩基配列がハイブリッド形成して、安定なハイブリッドをより不安定な別の二重鎖よりも優先的に形成することを意味する。
【００７７】
核酸増幅
上述したように、本発明は、一般に、核酸増幅方法を用いて対象試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを検出するための組成物及び方法に関する。「増幅」又は「核酸増幅」とは、本明細書に更に記述するように、意図した特定の標的核酸配列の少なくとも一部を含む標的核酸の複数の複製体の産生を意味する。複数の複製体は、アンプリコン又は増幅産物とも称する。
【００７８】
本発明の組成物及び方法は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むことが知られている、又は疑われる、本質的にあらゆる対象試料タイプに対して実施することができる。これらの試料タイプとしては、生物試料、臨床試料、工業試料などが挙げられる。好ましい一実施形態においては、試料は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが公知の又は疑われる汚染菌である、生物薬剤学的プロセス（バイオプロセス）の流れである。本明細書では「バイオプロセス」とは、一般に、意図した、又は意図しない、生細胞若しくは生物体又はその成分が存在する任意のプロセスを指す。例えば、その少なくとも１個が、生細胞、生物体若しくはその成分を含み、又は意図しない汚染の結果としてかかる細胞、生物体若しくは成分を含む、１個以上の試料又は試料の流れを利用する本質的にあらゆる製造又は他のプロセスは、バイオプロセスとみなせる。多数のかかるプロセスにおいては、プロセス内の生細胞、生物体又はその成分の存在及び／又は出所を検出、特定及び／又は制御する能力を有することが望ましい。本発明の方法によって、例えば、１個以上のバイオプロセス試料及び／又は流れの中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在及び／又は出所を迅速に高感度で監視することができる。
【００７９】
多数の周知の核酸増幅方法は、二本鎖核酸の変性と、プライマーとのハイブリッド形成とを交互に行う熱サイクルを必要とするが、核酸増幅の別の周知の方法は等温である。ＰＣＲと一般に称されるポリメラーゼ連鎖反応法（米国特許第４，６８３，１９５号、同４，６８３，２０２号、同４，８００，１５９号、同４，９６５，１８８号）は、変性、逆ストランドへのプライマー対のアニーリング、及びプライマー伸長からなる複数のサイクルによって、標的配列のコピー数を指数関数的に増加させる。ＲＴ−ＰＣＲと称する変法では、逆転写酵素（ＲＴ）を使用して、ｍＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製し、次いでｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅してＤＮＡの複数の複製体を作製する。ＬＣＲと一般に称されるリガーゼ連鎖反応（Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１２９２）は、標的核酸の隣接領域とハイブリッド形成する２組の相補ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、熱変性、ハイブリダイゼーション及び連結の繰り返しサイクルにおいて、ＤＮＡリガーゼによって共有結合されて、検出可能な二本鎖連結オリゴヌクレオチド産物を産生する。別の方法は、ＳＤＡと一般に称される鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３９２−３９６、米国特許第５，２７０，１８４号及び同５，４５５，１６６号）である。ＳＤＡは、標的配列の逆ストランドへのプライマー配列対のアニーリングと、二重鎖ヘミホスホロチオアート化（ｈｅｍｉｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ）プライマー伸長産物を産生するｄＮＴＰαＳの存在下でのプライマー伸長と、半修飾（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介性ニッキングと、既存の鎖を置換し、次回のプライマーアニーリング、ニッキング及び鎖置換のための鎖を作製する、切れ目の３’末端からのポリメラーゼ媒介性プライマー伸長とからなるサイクルによって、産物の幾何級数的な増幅をもたらす。高温性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、高温性エンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼを本質的に同じ方法においてより高温で使用する（欧州特許第０ ６８４ ３１５号）。別の増幅方法としては、ＮＡＳＢＡと一般に称される、核酸配列に基づく増幅（米国特許第５，１３０，２３８号）、Ｑ−βレプリカーゼと一般に称される、プローブ分子自体を増幅するＲＮＡレプリカーゼを使用する増幅方法（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６：１１９７−１２０２）、転写に基づく増幅方法（Ｋｗｏｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３−１１７７）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１８７４−１８７８）、及びＴＭＡと一般に称される転写媒介性増幅（米国特許第５，４８０，７８４号及び同５，３９９，４９１号）が挙げられる。公知の増幅方法の更なる考察については、Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．，１９９３，”Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．），ｐｐ．５１−８７（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）を参照されたい。
【００８０】
本発明の好ましい一実施形態においては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、転写に基づく増幅技術によって検出される。好ましい転写に基づく一増幅システムは、ＲＮＡポリメラーゼを利用して、標的領域の複数のＲＮＡ転写物を産生する、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）である。例示的なＴＭＡ増幅方法は、その内容を参照によりその全体を本明細書に援用する、米国特許第５，４８０，７８４号、同５，３９９，４９１号、米国特許出願公開第２００６／００４６２６５号及びその中で引用されている参考文献に記載されている。ＴＭＡは、逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼの存在下で標的核酸とハイブリッド形成する「プロモーター−プライマー」を用いて、二本鎖プロモーターを形成する。この二本鎖プロモーターから、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ転写物を産生する。この転写物は、ＲＮＡ転写物とハイブリッド形成することができる第２のプライマーの存在下で次回以降のＴＭＡの鋳型となることができる。ＰＣＲ、ＬＣＲ、又は熱変性を必要とする別の方法とは異なり、ＴＭＡは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を利用して、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を消化し、それによってプライマー又はプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能なＤＮＡ鎖を作製する、等温方法である。一般に、増幅のために用意される逆転写酵素に付随するＲＮａｓｅ Ｈ活性を利用する。
【００８１】
ＴＭＡ法の一変法においては、一増幅プライマーは、増幅すべき配列に対して３’位において標的ＲＮＡの結合部位とハイブリッド形成することができる、標的結合配列の５’に位置する、二本鎖のときに機能的になるプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドプロモーター−プライマーである。プロモーター−プライマーは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識に特異的であるときには「Ｔ７プライマー」と称することができる。ある状況下では、プロモーター−プライマーの３’末端、又はかかるプロモーター−プライマーの亜集団は、プロモーター−プライマー伸長を妨害する、又は低下させるように修飾することができる。無修飾プロモーター−プライマーから、逆転写酵素は、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ複製体を作製するが、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は標的ＲＮＡを分解する。次いで、第２の増幅プライマーはｃＤＮＡに結合する。このプライマーは、「Ｔ７プライマー」と区別するために「非Ｔ７プライマー」と称することができる。この第２の増幅プライマーから、逆転写酵素は別のＤＮＡ鎖を作製し、機能的プロモーターを一端に有する二本鎖ＤＮＡを生成する。二本鎖のときには、プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合して、プロモーター−プライマーがハイブリッド形成する標的配列の転写を開始することができる。ＲＮＡポリメラーゼは、このプロモーター配列を使用して、複数のＲＮＡ転写物（すなわち、アンプリコン）、一般に約１００から１，０００個の複製体を産生する。新規に合成された各アンプリコンは、第２の増幅プライマーに付着する（ａｎｎｅａｌ）ことができる。次いで、逆転写酵素は、ＤＮＡ複製体を産生するが、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、このＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡを分解する。次いで、プロモーター−プライマーは、新規に合成されたＤＮＡに結合して、逆転写酵素が二本鎖ＤＮＡを産生できるようにする。この二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡポリメラーゼは複数のアンプリコンを産生する。したがって、２個の増幅プライマーを用いて、１０億倍の等温増幅を実施することができる。
【００８２】
ＴＭＡの別の変法は、１個のプライマーと１個以上の追加の増幅オリゴマーを使用して、核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅し、試料中の標的配列の存在を示す転写物（アンプリコン）を作製する（その詳細を参照により本明細書に援用する、Ｂｅｃｋｅｒ他、米国特許出願公開第２００６／００４６２６５号に詳述されている。）。手短に述べると、単一プライマーＴＭＡ法は、プライマー（又は「プライミングオリゴマー」）、（例えば、３’ブロッキング成分を含めることによって）その３’末端からＤＮＡ合成が開始するのを阻止するように修飾された修飾プロモーターオリゴマー（又は「プロモーター−プロバイダー」）を使用し、場合によっては、標的鎖からｃＤＮＡが伸長するのを停止させる結合性分子（例えば、３’ブロックされた伸長オリゴマー）を使用してもよい。この方法は、標的配列の複数の複製体を合成し、標的配列を含む標的ＲＮＡをプライミングオリゴマー及び結合性分子で処理する段階を含む。この段階で、プライマーは標的鎖の３’末端とハイブリッド形成する。ＲＴは、プライマーの３’末端からプライマー伸長を開始して、標的鎖との二重鎖のｃＤＮＡ（例えば、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ）を産生する。３’ブロックされた伸長オリゴマーなどの結合性分子を反応に使用すると、結合性分子は、標的配列の５’末端近くに隣接する標的核酸に結合する。すなわち、結合性分子は、増幅すべき標的配列の５’末端に隣接した標的鎖に結合する。プライマーがＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長されてｃＤＮＡを産生するときには、標的鎖に結合した結合性分子にプライマー伸長産物が達すると重合は停止するので、ｃＤＮＡの３’末端は、結合性分子の位置によって決まる。したがって、ｃＤＮＡの３’末端は、標的配列の５’末端に相補的である。ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＴのＲＮａｓｅ Ｈ）がＲＮＡ鎖を分解するときには、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖は分離するが、任意の形の鎖分離を使用できることを当業者は理解されたい。次いで、プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、ｃＤＮＡ鎖の３’末端近くでｃＤＮＡとハイブリッド形成する。プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、ＲＮＡポリメラーゼのための５’プロモーター配列と、ｃＤＮＡの３’領域中の配列に相補的である３’領域とを含む。プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、プロモーター−プロバイダーオリゴマーの３’末端からＤＮＡ合成が開始するのを阻止するブロッキング成分を含む修飾３’末端も有する。プロモーター−プロバイダー：ｃＤＮＡ二重鎖においては、ｃＤＮＡの３’末端は、プロモーターオリゴマーを鋳型として使用したＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長されて、プロモーター配列をｃＤＮＡに付加し、機能的二本鎖プロモーターを産生する。次いで、プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼは、機能的プロモーターに結合し、ｃＤＮＡに相補的であり、最初の標的鎖から増幅された標的領域配列と実質的に同一である、複数のＲＮＡ転写物を転写する。次いで、生成した増幅ＲＮＡは、プライマーに結合し、更なるｃＤＮＡ産生の鋳型として役立つことによって、プロセスを通して再度循環され、試料中に存在する最初の標的核酸から多数のアンプリコンを最終的に産生することができる。単一プライマー転写を伴う増幅方法の一部の実施形態は、結合性分子を含まず、したがって、プライマーから作製されるｃＤＮＡ産物は未確定の３’末端を有するが、増幅段階は、実質的にはすべての他の段階について上述したように進行する。
【００８３】
適切な増幅条件は、本開示を考慮して当業者が容易に決定することができる。「増幅条件」とは、本発明による核酸増幅を可能にする条件を指す。増幅条件は、一部の実施形態においては、本明細書に記載の「厳密なハイブリダイゼーション条件」よりも厳密性を低くすることができる。本発明の増幅反応に用いられるオリゴは、その意図された標的に増幅条件下で特異的であり、該標的とハイブリッド形成するが、より厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成しても、しなくてもよい。一方、本発明の検出プローブは、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成する。下記実施例の項は、本発明による標的核酸配列を増幅するのに好ましい増幅条件を提供するが、本発明による核酸増幅を実施する別の許容される条件は、使用する特定の増幅方法に応じて当業者が容易に確認することができる。
【００８４】
本発明の増幅方法は、ある実施形態においては、増幅反応の感度、選択性、効率などを向上させるのに有効である１種類以上の別のタイプのオリゴの使用も好ましくは利用する。これらのオリゴとしては、例えば、終結オリゴヌクレオチド、伸長又はヘルパーオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
【００８５】
標的捕捉
ある実施形態においては、増幅前に、例えば標的捕捉手法を用いて、試料から標的核酸を精製又は濃縮することが好ましい場合がある。「標的捕捉」（ＴＣ）とは、一般に、磁気的に誘引可能な粒子などの固体担体上に標的ポリヌクレオチドを捕捉することを指し、固体担体は、標的ポリヌクレオチド精製手順の１つ以上の洗浄段階中に標的ポリヌクレオチドを保持する。このようにして、標的ポリヌクレオチドは、後続の核酸増幅段階前に十分に精製される。多数の標的捕捉方法が公知であり、本明細書に記載の方法と併用するのに適切である。
【００８６】
「捕捉オリゴヌクレオチド」、「捕捉オリゴ」又は「捕捉プローブ」とは、標準塩基対合によって標的核酸中の標的配列と特異的にハイブリッド形成し、固定化プローブ上の結合相手に結合して、標的核酸を担体に捕捉する、核酸オリゴマーを指す。捕捉オリゴマーの一例は、２つの結合領域、すなわち配列結合領域（すなわち、標的特異的部分）と固定化プローブ結合領域を、通常は同じオリゴマー上に含むが、２つの領域は、１種類以上のリンカーによって連結された２種類のオリゴマー上に存在してもよい。
【００８７】
「固定化オリゴ」、「固定化プローブ」又は「固定化核酸」とは、捕捉オリゴマーを担体に直接又は間接的に連結する核酸結合相手を指す。担体に連結された固定化プローブは、捕捉プローブに結合した標的を試料中の結合していない材料から分離するのを容易にする。任意の担体、例えば、溶液中の遊離したマトリックス又は粒子を使用することができる。担体は、種々の材料、例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ガラス、ポリアクリラート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン又は金属のいずれかで構成され得る。説明のための例は、磁気的に誘引可能な粒子（例えば、固定化プローブが（例えば、共有結合、キレート化又はイオン相互作用によって）直接的又は（例えば、リンカーを介して）間接的に結合する単分散常磁性ビーズ（均一サイズ±５％））である担体を使用する。結合は核酸ハイブリダイゼーション条件中で安定である。
【００８８】
例えば、米国特許出願公開第２００６００６８４１７号に記載の説明のための一手法は、標的に相補的な領域を含む少なくとも１種類の捕捉プローブオリゴヌクレオチドと、捕捉担体上の固定化プローブに標的核酸を結合させる特異的結合対の１メンバーとを使用し、したがって別の試料成分から分離された後に標的核酸が捕捉担体から放出される、捕捉ハイブリッドを形成する。
【００８９】
別の説明のための一方法においては、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ他は、米国特許第６，１１０，６７８号において、捕捉プローブ、及び好ましくは温度のみが異なる、２通りのハイブリダイゼーション条件を用いることによって、結合した固定化プローブを用いて、試料中の標的ポリヌクレオチドを、磁気的に誘引可能な粒子などの固体担体上に捕捉する方法を記述した。２通りのハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの順序を制御し、第１のハイブリダイゼーション条件は、標的ポリヌクレオチドへの捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、第２のハイブリダイゼーション条件は、固定化プローブへの捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にする。この方法は、捕捉された標的ポリヌクレオチド、又は増幅された標的ポリヌクレオチドを検出することによって、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出するのに使用することができる。
【００９０】
別の説明のための標的捕捉技術（米国特許第４，４８６，５３９号）は、標的ポリヌクレオチドを捕捉し、その存在を検出する、ハイブリダイゼーションサンドイッチ技術を含む。この技術は、固体担体に結合したプローブによる標的ポリヌクレオチドの捕捉、及び検出プローブと捕捉された標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含む。標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しない検出プローブは、固体担体から容易に洗浄除去される。したがって、残存する標識は、試料中に最初に存在する標的ポリヌクレオチドと関連づけられる。
【００９１】
別の説明のための標的捕捉技術（米国特許第４，７５１，１７７号）は、標的ポリヌクレオチドと固体担体に固定されたポリヌクレオチドの両方とハイブリッド形成する媒介ポリヌクレオチドを使用する方法を含む。媒介ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドを固体担体に連結して、結合標的を生成する。標識されたプローブは、結合標的とハイブリッド形成することができ、結合していない標識されたプローブ（ｐｒｏ）は、固体担体から洗浄除去することができる。
【００９２】
更に別の説明のための標的捕捉技術は、標的ポリヌクレオチドを検出する方法を記述した米国特許第４，８９４，３２４号及び同５，２８８，６０９号に記載されている。この方法は、標的の同じ又は逆ストランドに相補的である２個の一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを利用し、標的ポリヌクレオチドとの二重ハイブリッドの形成をもたらす。一実施形態においては、ハイブリッドは担体上に捕捉される。
【００９３】
別の説明のための標的捕捉技術、欧州特許第０ ３７０ ６９４号においては、核酸を検出する方法及びキットは、特異的結合相手で標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー及びプライマー伸長産物を固定化する。標識は、固体担体に結合したその受容体と特異的に複合体を形成する。
【００９４】
上記捕捉技術は、単なる説明のためのものであって、限定的なものではない。実際、増幅前に対象の標的核酸配列を精製するのに有効であれば、当業者に利用可能な本質的にあらゆる技術を使用することができる。
【００９５】
核酸検出
特定の核酸ハイブリダイゼーションの監視に使用することができる本質的にあらゆる標識及び／又は検出システムを、本発明に関連して使用して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａアンプリコンを検出することができる。多数のかかるシステムが公知であり、当業者に利用可能であり、その説明のための例を以下に手短に考察する。
【００９６】
検出システムは、典型的には、対象となる標的核酸の検出を容易にするために、いずれかのタイプの検出オリゴを使用する。「検出オリゴ」又は「検出プローブ」とは、標的核酸を検出するために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、増幅された配列を含めた標的配列と特異的にハイブリッド形成する核酸オリゴを指す。検出は、直接的（すなわち、標的と直接的にハイブリッド形成するプローブ）でも間接的（すなわち、プローブを標的に連結する中間構造とハイブリッド形成するプローブ）でもよい。プローブの標的配列は、一般に、プローブが特異的にハイブリッド形成する、より大きい配列内の特定の配列を指す。検出プローブは、標的配列が存在するか否かによって、標的特異的配列と、プローブの３次元構造に寄与する別の配列又は構造とを含むことができる（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同５，３１２，７２８号、同６，８３５，５４２号及び同６，８４９，４１２号）。
【００９７】
幾つかの周知の標識化システムのいずれかを使用して、検出を容易にすることができる。「標識」とは、検出される、又は検出可能なシグナルをもたらす、プローブに直接的又は間接的に結合した部分又は化合物を指す。直接的結合は、共有結合又は非共有結合性相互作用（例えば、水素結合、疎水性又はイオン相互作用、及びキレート又は配位化合物形成）を使用することができるのに対して、間接的結合は、（例えば、検出可能なシグナルを増幅する抗体又は追加のオリゴヌクレオチド（単数又は複数）を介して）架橋部分又はリンカーを使用することができる。いずれの検出可能な部分も、例えば、放射性核種、ビオチン、アビジンなどのリガンド、酵素、酵素基質、反応基、検出可能な色を付与する色素、粒子（例えば、ラテックス又は金属ビーズ）などの発色団、発光化合物（例えば、生物発光、リン光又は化学発光化合物）、及び蛍光化合物を使用することができる。好ましい実施形態は、混合物中の結合した標識プローブが、結合していない標識プローブと比較して検出可能な変化を示す、均一系において検出可能である「均一な検出可能な標識」を含む。これによって、ハイブリッド形成した標識プローブをハイブリッド形成していない標識プローブから物理的に取り出さずに、標識を検出することができる（例えば、米国特許第６，００４，７４５号、同５，６５６，２０７号及び同５，６５８，７３７号）。好ましい均一な検出可能な標識としては、化学発光化合物、より好ましくは、周知の標準ＡＥ、ＡＥ誘導体などのアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物が挙げられる（米国特許第５，６５６，２０７号、同５，６５８，７３７号及び同５，９４８，８９９号）。標識を合成する方法、標識を核酸に結合させる方法、及び標識からのシグナルを検出する方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）第１０章、及び米国特許第６，４１４，１５２号、同５，１８５，４３９号、同５，６５８，７３７号、同５，６５６，２０７号、同５，５４７，８４２号、同５，６３９，６０４号、同４，５８１，３３３号及び同５，７３１，１４８号）。ＡＥ化合物を核酸に連結する好ましい方法は公知である（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号、並びに米国特許第５，６３９，６０４号、カラム１０、６行からカラム１１、３行、及び実施例８を参照されたい。）。好ましいＡＥ標識位置は、プローブの中央領域、及びＡ／Ｔ塩基対の領域近傍、プローブの３’若しくは５’末端、又は所望の標的配列と比較してプローブが検出すべきでない公知配列とのミスマッチ部位若しくはその近傍である。
【００９８】
好ましい一実施形態においては、少なくともある程度の自己相補性を示すオリゴは、ハイブリッド形成していないプローブを検出前にまず除去する必要なしに、試験試料中のプローブ：標的二重鎖の検出を容易にすることが望ましい。例として、「分子トーチ」と称する構造は、連結領域によって連結され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリッド形成する、（「標的結合ドメイン」及び「標的閉鎖ドメイン」と称する）自己相補性の明確な領域を含むように設計される。変性条件に曝されると、完全に相補的でも部分的に相補的でもよい、分子トーチの２個の相補的領域は、融解し、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件が復帰したときに標的配列とのハイブリダイゼーションに利用可能な標的結合ドメインが残る。分子トーチは、標的結合ドメインが、標的閉鎖ドメインよりも標的配列とのハイブリダイゼーションを優先するように設計される。分子トーチの標的結合ドメイン及び標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸とハイブリッド形成するときとは対照的に、分子トーチが自己ハイブリッド形成するときには異なるシグナルが生成されるように位置する相互作用標識（例えば、蛍光体／クエンチャー対）を含み、それによって付随する存続可能な標識を有する非ハイブリッド形成プローブの存在下で試験試料中のプローブ：標的二重鎖を検出することができる。分子トーチは、その開示を参照により本明細書に援用する米国特許第６，３６１，９４５号に詳細に記載されている。
【００９９】
本発明に関連して使用することができる自己相補的ハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、「分子ビーコン」と一般に称される構造である。分子ビーコンは、標的相補配列を有する核酸分子、標的核酸配列の非存在下でプローブを閉構造で保持する親和性対（又は核酸アーム）、及びプローブが閉構造であるときに相互作用する標識対を含む。分子ビーコン標的相補配列と標的核酸のハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離させ、それによってプローブを開構造に変化させる。開構造への変化は、例えば蛍光団とクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬとＥＤＡＮＳ）などであってもよい標識対の相互作用の低下によって検出可能である。分子ビーコンは、その開示を参照により本明細書に援用する米国特許第５，９２５，５１７号に詳細に記載されている。特定の核酸配列の検出に有用である分子ビーコンは、本明細書に開示するプローブ配列の１つのどちらかの端部に、蛍光団を含む第１の核酸アーム、及びクエンチャー成分を含む第２の核酸アームを取り付けることによって作製することができる。この構造では、本明細書に開示するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ特異的プローブ配列は、生成した分子ビーコンの標的相補的「ループ」部分として働く。
【０１００】
分子ビーコンは、好ましくは、検出可能な標識の相互作用対で標識される。好ましい検出可能な標識は、ＦＲＥＴ又は非ＦＲＥＴエネルギー移動機構によって相互作用する。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、原子間距離よりもかなり長い距離にわたって、熱エネルギーへの変換なしに、さらに、供与体と受容体が動力学的な衝突をせずに、発色団間の共鳴相互作用による、分子又は分子系における吸収部位からその利用部位へのエネルギー量子の無放射伝達を含む。「供与体」は、エネルギーを最初に吸収する部分であり、「受容体」は、その後にエネルギーが伝達される部分である。ＦＲＥＴに加えて、励起エネルギーが供与体から受容体分子に移動することができる少なくとも３つの別の「非ＦＲＥＴ」エネルギー移動プロセスがある。
【０１０１】
一方の標識によって放出されたエネルギーが、ＦＲＥＴ機構でも非ＦＲＥＴ機構でも、他方の標識によって受け取られ、又は吸収されるように、２個の標識が十分に接近して保持されるときには、２個の標識は「エネルギー移動関係」にあるとされる。これは、例えば、分子ビーコンがステム（ｓｔｅｍ）二重鎖の形成によって閉状態で維持され、分子ビーコンの一方のアームに結合した蛍光団からの蛍光発光が、他方のアームのクエンチャー成分によって消光される場合である。
【０１０２】
分子ビーコンの説明のための標識部分としては、蛍光団と、蛍光消光性を有する第２の部分（すなわち、「クエンチャー」）が挙げられる。この実施形態においては、特徴的なシグナルは、特別な波長の適当な蛍光であるが、代わりに可視光シグナルとすることもできる。蛍光が関与するときには、発光変化は、好ましくはＦＲＥＴ又は放射性エネルギー移動若しくは非ＦＲＥＴ形式による。閉状態の１対の相互作用標識を有する分子ビーコンが、適切な周波数の光によって刺激されると、蛍光シグナルが第１のレベルで発生するが、第１のレベルは極めて低い場合がある。この同じ分子ビーコンが開状態で、適切な周波数の光によって刺激されると、蛍光団とクエンチャー成分が互いに十分に分離され、その間のエネルギー移動が実質的に不可能になる。その条件下では、クエンチャー成分は、蛍光団成分からの蛍光を消光することができない。蛍光団が適切な波長の光エネルギーによって刺激されると、第１のレベルより高い第２のレベルの蛍光シグナルが発生する。蛍光の２つのレベルの差は、検出可能であり、測定可能である。蛍光団とクエンチャー成分をこのように使用すると、分子ビーコンは、「開」構造でのみ「オン」であり、容易に検出可能なシグナルを発することによってプローブが標的に結合したことを示す。プローブの構造状態は、標識部分間の相互作用を調節することによって、プローブから発生するシグナルを変化させる。
【０１０３】
非ＦＲＥＴ対からＦＲＥＴを識別しようとしない、本発明に関連して使用することができる供与体／受容体標識対の例としては、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２、及びフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が挙げられる。当業者は、供与体と受容体色素が異なるときには、エネルギー移動は、受容体の増感蛍光の出現によって、又は供与体蛍光の消光によって、検出できることを理解されたい。供与体と受容体種が同じときには、エネルギーは、結果として生じる蛍光偏光解消によって検出することができる。ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ ７色素などの非蛍光受容体は、有利には、直接（すなわち、非増感）受容体励起に起因するバックグラウンド蛍光の潜在的問題を解消する。供与体−受容体対の１メンバーとして使用することができる好ましい蛍光団成分としては、フルオレセイン、ＲＯＸ、（ＣＹ５などの）ＣＹ色素などが挙げられる。供与体−受容体対の別のメンバーとして使用することができる極めて好ましいクエンチャー成分としては、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆ）から入手可能であるＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ成分などが挙げられる。
【０１０４】
合成技術、並びに標識を核酸に結合させる方法、及び標識を検出する方法は、当分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）第１０章、Ｎｅｌｓｏｎ他、米国特許第５，６５８，７３７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄ他、米国特許第５，６５６，２０７号、Ｈｏｇａｎ他、米国特許第５，５４７，８４２号、Ａｒｎｏｌｄ他、米国特許第５，１８５，４３９号及び６，００４，７４５号、Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ他、米国特許第４，５８１，３３３号、並びにＢｅｃｋｅｒ他、米国特許第５，７３１，１４８号を参照されたい。）。
【０１０５】
好ましいＰＳＥＵＤＯＭＯＮＡＳ ＡＥＲＵＧＩＮＯＳＡオリゴ及びオリゴセット
本明細書に記載のとおり、本発明によるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸を増幅及び検出するのに好ましい部位は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの８００領域に存在することが判明した。さらに、この領域内の特に好ましいオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドセットが、改善された感度、選択性及び特異性でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓを増幅するために特定された。本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ標的配列と高い特異性でハイブリッド形成することができ、その結果、試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在及び／又はレベルを検出し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓの存在から区別するのに使用することができる核酸増幅反応に関与できることを理解されたい。
【０１０６】
例えば、一実施形態においては、本発明の増幅オリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの８００領域を高度の特異性で標的にする。言うまでもなく、本発明の増幅オリゴヌクレオチドを考察するときには、増幅反応に使用される第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、増幅すべき標的核酸配列の逆ストランドに対して特異性を有することを理解されたい。
【０１０７】
特定の一実施形態においては、本発明の増幅オリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、第２のオリゴヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【０１０８】
本発明の増幅オリゴヌクレオチドは、転写に基づく増幅反応、好ましくは転写媒介性増幅（ＴＭＡ）反応において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの標的核酸配列を増幅するのに特に有効である。
【０１０９】
本発明のある種の増幅オリゴヌクレオチドは、転写媒介性増幅反応に使用され、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【０１１０】
本発明のある種のより具体的な増幅オリゴヌクレオチドは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【０１１１】
本発明の別の特定の増幅オリゴヌクレオチドは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡを標的にする。
【０１１２】
特定の好ましい一実施形態においては、本発明の増幅オリゴヌクレオチドは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーは、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、非Ｔ７プライマーは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される。
【０１１３】
別の好ましい一実施形態においては、本発明の増幅オリゴヌクレオチドは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーは配列番号２であり、非Ｔ７プライマーは配列番号２４である。
【０１１４】
増幅反応に使用される特別なＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、追加のオリゴヌクレオチドも増幅反応に関連して一般に使用されることを理解されたい。例えば、ある実施形態においては、増幅反応は、検出オリゴヌクレオチド（例えば、トーチオリゴヌクレオチド）、ブロッカーオリゴヌクレオチド及び／又は伸長オリゴヌクレオチドの１種類以上の使用も利用する。
【０１１５】
下記表１は、特に好ましい特徴を有すると本発明によって確認された、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド、及び別の補助的なオリゴヌクレオチド（例えば、ブロッカーオリゴヌクレオチド、伸長オリゴヌクレオチド及びトーチオリゴヌクレオチド）の具体例である。
【０１１６】
【表１−１】
【０１１７】
【表１−２】
さらに、下記表２は、本発明の組成物、キット及び方法に使用するのに特に好ましいオリゴヌクレオチドセットであって、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド配列番号２及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド、配列番号２４を含み、場合によっては、ブロッカーオリゴヌクレオチド配列番号２９、トーチオリゴヌクレオチド配列番号５４、伸長オリゴヌクレオチド配列番号４４、標的捕捉オリゴヌクレオチド配列番号６９を更に含み、場合によっては、標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチド配列番号７３を更に含む。
【０１１８】
【表２】
優れたアッセイ性能をもたらす、８００領域に由来する特に好ましい増幅オリゴヌクレオチドが本発明によって特定されたが、同じ又は類似の性能目標が達成されるのであれば、８００領域に由来し、本明細書に具体的に記載のものからわずかに改変された別のオリゴヌクレオチドも使用できることを認識されたい。例えば、８００領域に由来し、本発明による増幅反応に有用であるオリゴヌクレオチドは、増幅及び／又は検出手順に実質的に影響を及ぼさないのであれば、本明細書で確認されるものとは異なる長さを有することができる。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドに対するこれら及び別の定常的なわずかな改変を従来の技術によって実施することができ、かかる改変が、本明細書で提供する１つ以上の利点を維持する程度まで、かかる改変は本発明の精神及び範囲内と考えられる。
【０１１９】
ＰＳＥＵＤＯＭＯＮＡＳ ＡＥＲＵＧＩＮＯＳＡの検出に好ましい組成物及びキット
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの２３ｓ ｒＲＮＡの８００領域を検出するポリヌクレオチド増幅反応を実施するための組成物、反応混合物及びキットも包含する。例示的なキットは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの２３ｓ ｒＲＮＡの８００領域の逆ストランドに相補的である第１及び第２の増幅オリゴヌクレオチドを含む。ある種の好ましいキットは、転写を伴う増幅反応、好ましくはＴＭＡ反応に使用される本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む。好ましい一実施形態においては、本発明のキットは、本明細書に記載のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、本明細書に記載の非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、場合によっては、本明細書に記載の検出オリゴヌクレオチド、捕捉オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド及び／又は伸長オリゴヌクレオチドの１種類以上を含めて、増幅及び／又は検出を容易にする１種類以上の別の補助的なオリゴヌクレオチドを更に含んでもよい。
【０１２０】
ある実施形態においては、本発明は、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１及び第２のオリゴヌクレオチドがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの８００領域を高い特異性で標的にする、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。言うまでもなく、この８００領域内のある種の残基を標的にする本発明の増幅オリゴヌクレオチドを考察するときには、増幅反応に使用される第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、増幅すべき標的核酸配列の逆ストランドに相補的であることを理解されたい。
【０１２１】
特定の一実施形態においては、本発明は、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、第２のオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする、増幅反応に使用される、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。
【０１２２】
別の一実施形態においては、本発明は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする、転写媒介性増幅反応に使用される、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。
【０１２３】
より特別な一実施形態においては、本発明は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする、転写媒介性増幅反応に使用される、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。
【０１２４】
より具体的な一実施形態においては、本発明は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする、転写媒介性増幅反応に使用される、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。
【０１２５】
好ましい一実施形態においては、本発明は、少なくともＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーが、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、非Ｔ７プライマーが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される、転写媒介性増幅反応に使用される、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。
【０１２６】
別の好ましい一実施形態においては、本発明は、少なくともＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーが配列番号２であり、非Ｔ７プライマーが配列番号２４である、転写媒介性増幅反応に使用される、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。
【０１２７】
増幅反応に使用される特別なＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、追加の補助的なオリゴヌクレオチドも増幅反応に関連して一般に使用されることを理解されたい。例えば、ある実施形態においては、本発明の組成物、反応混合物及びキットは、標的捕捉オリゴヌクレオチド、トーチオリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド及び／又は伸長オリゴヌクレオチドの１種類以上も更に含む。
【０１２８】
例えば、一実施形態においては、本発明の組成物、反応混合物及び／又はキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、トーチオリゴヌクレオチドを更に含む。特定の一実施形態においては、トーチオリゴヌクレオチドは、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択される。好ましい一実施形態においては、トーチオリゴヌクレオチドは配列番号５４である。
【０１２９】
別の一実施形態においては、本発明の組成物、反応混合物及び／又はキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、伸長オリゴヌクレオチドを更に含む。特定の一実施形態においては、伸長オリゴヌクレオチドは、配列番号４３又は配列番号４４から選択される。
【０１３０】
別の一実施形態においては、本発明の組成物、反応混合物及び／又はキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、ブロッカーオリゴヌクレオチドを更に含む。特定の一実施形態においては、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０又は配列番号４２から選択される。
【０１３１】
別の一実施形態においては、本発明の組成物、反応混合物及び／又はキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、標的捕捉オリゴヌクレオチドを更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチドを更に含む。特定の一実施形態においては、標的捕捉オリゴヌクレオチド配列番号６９及び標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチドは、配列番号７３である。
【０１３２】
特に好ましい一実施形態においては、本発明の組成物、反応混合物及び／又はキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号２及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド、配列番号２４を含み、場合によってはブロッカーオリゴヌクレオチド配列番号２９、トーチオリゴヌクレオチド配列番号５４、伸長オリゴヌクレオチド配列番号４４、標的捕捉オリゴヌクレオチド配列番号６９を更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチド配列番号７３を更に含む。
【０１３３】
本発明の一般的原理は、以下の非限定的実施例を参照することによって、より十分に理解されるであろう。
【実施例】
【０１３４】
本発明のある態様及び実施形態を説明する実施例を以下に示す。以下の実施例は、実際に実施された実験の詳細を正確に反映すると考えられるが、実際に実施された研究と以下に示す実験の詳細との間には、これらの実験の結論、又は実験を実施する当業者の能力に影響を及ぼさない、幾つかの軽微な不一致が存在する可能性がある。当業者は、これらの実施例が、実施例に記載する特定の実施形態に本発明を限定するものではないことを理解されたい。さらに、当業者は、本明細書に記載の技術、材料及び方法を用いて、依然として本発明の精神及び範囲内で、これら及び関連した方法を実施するための代替の増幅系を容易に考案し、最適化することができる。
【０１３５】
別段の記載がない限り、以下の実施例におけるオリゴヌクレオチド及び修飾オリゴヌクレオチドは、標準ホスホルアミダイト化学反応によって合成され、その種々の方法は当分野で周知である。例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，１５４ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２８７（１９８７）を参照されたい。本明細書に別段の記載がない限り、修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであり、そのホスホルアミダイト類似体として合成に使用された。単一プライマー増幅（参照により本明細書に援用する、Ｂｅｃｋｅｒ他、米国特許出願公開第２００６／００４６２６５号）に用いられるブロッカーオリゴヌクレオチドの場合、３’末端ブロッキング成分は、３’−ジメチルトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、５’−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２０−０１０２−０１）を用いて調製される「逆Ｃ」３’−３’結合からなった。分子トーチ（参照により本明細書に援用する、Ｂｅｃｋｅｒ他、米国特許第６，８４９，４１２号参照）は、オリゴヌクレオチドに結合した、Ｃ９非ヌクレオチドリンカー連結領域、５’−フルオレセイン（「Ｆ」）蛍光団及び３’−ダブシル（「Ｄ」）クエンチャー成分を用いて標準方法によって調製された。
【０１３６】
以下の実施例に記載するように、多種多様な増幅試薬及び条件の解析によって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの種特異的検出のための高感度で選択的な増幅プロセスが開発された。
【０１３７】
（実施例１）
説明のためのアッセイ試薬及び手順の記述
以下の実施例は、本明細書に記載のＴＭＡ実験に用いられる典型的なアッセイ試薬、手順、条件などを記述する。それに反することを明記しない限り、試薬調製、装置調製及びアッセイ手順は、本質的に以下に記載のように実施された。
【０１３８】
Ａ． 試薬及び試料
１． 増幅試薬。「増幅試薬」又は「Ａｍｐ試薬」は、近似濃度の以下の成分で構成された：０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、１０ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１２．７ｍＭ ＵＴＰ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び３３ｍＭ ＫＣｌのｐＨ７．７の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液。プライマー及び他のオリゴヌクレオチドをＡｍｐ試薬に添加した。
【０１３９】
２． 酵素試薬。「酵素試薬」は、近似濃度の以下の成分で構成された：１２０ｍＭ ＫＣｌ、１０％ ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１６０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ７．０の７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤中の１１８０ＲＴＵ／μＬモロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）逆転写酵素（「ＲＴ」）及び２６０ＰＵ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ。ここで、１ＲＴＵのＲＴ活性は、ｄＴ １ｎｍｏｌを基質に３７℃で２０分で取り込み、１ＰＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ活性は、ＲＮＡ転写物５ｆｍｏｌを３７℃で２０分で産生する。
【０１４０】
３． 洗浄溶液。「洗浄溶液」は、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡのｐＨ７．５の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液で構成された。
【０１４１】
４． 標的捕捉試薬。「標的捕捉試薬」（ＴＣＲ）は、近似濃度の以下の成分で構成された：ｐＨ６．５の、ｄＴ３ｄＡ３０末端を有する１種類以上の捕捉プローブ及び任意に選択される捕捉ヘルパープローブの各々６０ｐｍｏｌ／ｍＬ、常磁性オリゴ（ｄＴ）１４微粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ）２５０から３００ｕｇ／ｍＬ、２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ及び１．８８Ｍ ＬｉＣｌ。
【０１４２】
５． 溶解試薬。「溶解緩衝剤」は、１００ｍＭ ｔｒｉｓ、２．５ｍＭコハク酸、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び５００ｍＭ ＬｉＣｌを含むｐＨ６．５の緩衝剤中の１％ラウリル硫酸リチウムで構成された。
【０１４３】
６． 標的ｒＲＮＡ試料。ｒＲＮＡ試料は、本明細書に記載の実験において使用する前に、水、０．１％ＬｉＬＳ又は溶解試薬中で保存された。
【０１４４】
Ｂ． 標的捕捉
後続の増幅のために核酸試料を精製及び調製する典型的な標的捕捉手順は、本質的に以下に示すように実施される。
【０１４５】
１． 試験試料１００ｕＬ、標的捕捉オリゴヌクレオチドを含むＴＣＲ ５０μＬ、及び溶解試薬１ｍＬを混合する。混合物を６０℃で１５分間インキュベートする。
【０１４６】
２． 洗浄溶液及び適切な磁性粒子洗浄・分離装置（例えば、磁気分離ラック、ＧＥＮ−ＰＲＯＢＥ（登録商標）Ｔａｒｇｅｔ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．５２０７、又はＴｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）磁性粒子プロセッサシステム）を用いて、処理反応混合物からＴＣＲ磁性粒子を捕捉し、洗浄する。
【０１４７】
３． 洗浄後、磁性粒子を増幅試薬１００μＬに再懸濁させる。
【０１４８】
Ｃ． 標的の増幅及び検出
実時間ＴＭＡ増幅反応を本質的に以下のように実施した。試料３０μＬ、Ａｍｐ試薬中の増幅及び検出オリゴヌクレオチド、又は標的捕捉手順から得られたＡｍｐ試薬中の再懸濁粒子３０μＬを６０℃で１０分間インキュベートした。次いで、温度を低下させ、反応混合物を４２℃に平衡化した。酵素試薬１０μＬを添加した。反応混合物を混合し、実時間検出システム（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なＯｐｔｉｃｏｎ（商標）若しくはＣｈｒｏｍｏ４（商標）検出システム、又はＦｌｕｏＤｉａ（登録商標）Ｔ７０装置）中で４２℃でインキュベートした。
【０１４９】
（実施例２）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｐａｅ）オリゴセットの設計及び初期試験
Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡ（受託番号Ｖ００３３１）の約７００から１０００（「８００領域」）及び約１４００から１６００（「１５００領域」）ヌクレオチド塩基位置に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の２つの領域を標的にした増幅及び検出オリゴヌクレオチドを評価のために設計し、合成した。
【０１５０】
【表３−１】
【０１５１】
【表３−２】
【０１５２】
【表３−３】
【０１５３】
【表４】
２３Ｓ １５００領域設計を試験した。結果を下記サイクル時間として示す。サイクル時間はＴｔｉｍｅに比例する。オリゴの４つの組合せを試験した。オリゴセット番号２は、Ｐａｅ ｒＲＮＡの１Ｅ＋０６回の複製における曲線形状（図示せず）及び最も早いサイクル時間に基づいて、最良の候補であった。
【０１５４】
【表５−１】
【０１５５】
【表５−２】
１５００領域オリゴセット２を用いた幾つかの最適化実験を、オリゴ濃度を変えて実施した（結果示さず）。しかし、８００領域の長鎖アンプリコンオリゴセット（単数又は複数）を用いた同時試験は、汚染された試薬によるバックグラウンドのレベルが低下した。したがって、２３Ｓ ｒＲＮＡの８００領域に対してＴ７プロバイダー及び非Ｔ７プライマーが、試験した多数の他のオリゴセットに比べて、実時間単一プライマーＴＭＡアッセイにおいて最高シグナル及び最低バックグラウンドを示したとの結果に基づいて、８００領域を更なる最適化のための好ましい領域として選択した。実時間ＴＭＡアッセイにおけるオリゴのスクリーニングを実施し、異なるトーチ及びブロッカーも分析した。最良のオリゴセットを選択する判定基準としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｒＲＮＡの１０ｅ３回の複製において最低バックグラウンド及び最高シグナルを有することなどが挙げられた。
【０１５６】
ブロッカーオリゴヌクレオチド及びトーチオリゴヌクレオチドを含めて、３組の最初の好ましいオリゴセットをこの分析から選択した。これらのセットを標準短鎖アンプリコンセットＳ１及びＦ１１、並びに長鎖アンプリコンセットＬＡ２と称する（下記表６）。３組のセットの各々は良好に機能したが、ＬＡ２オリゴセットは、バックグラウンドがなく、最高の感度を示した。さらに、ＬＡ２オリゴセットは、生成したアンプリコンが約１９６塩基長であり、典型的な短鎖アンプリコン（８６〜１１０ヌクレオチド塩基）Ｆ１１及びＳ１よりも長く、異常であった。
【０１５７】
【表６−１】
【０１５８】
【表６−２】
（実施例３）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａオリゴセットの更なる特定
バックグラウンドシグナルを更に低下させ、特異性及び感度を改善するために、幾つかの追加のオリゴセットを設計し、試験した。感度を改善するために「伸長」オリゴも導入した。これらの実験を標的捕捉なしで実施した。
【０１５９】
伸長オリゴの添加及び再設計の前に、（「標準」系と称する）１組の試験オリゴセットは、「ＬＡ２」オリゴセットから得られた増幅オリゴと、「Ｆ１１」オリゴセットから得られたトーチとの組合せで構成された（下記表７）。しかし、このオリゴセットは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａに曝露したときに特異性の問題があり、わずかに高いバックグラウンドシグナルを有し、１×１０３回の複製におけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの出現時間が遅かった。再設計及びスクリーニングによって、これらの問題に対処する３組の有望な新しいオリゴセット（下記セット１〜３）が得られた。３組のオリゴセットはすべて、特異性を改善し、バックグラウンドシグナルを低下させるトーチ配列番号５４、アッセイ感度を改善する伸長オリゴ、及び再設計された増幅オリゴを含んだ。
【０１６０】
さらに、これらの新しいオリゴセットを別のオリゴセット（下記セット４）及び「標準ＬＡ」オリゴセットと比較した。新しいオリゴセットのすべては、トーチ配列番号５４を含み、「標準」オリゴセットより性能が優れていた。
【０１６１】
下記表７に、この分析段階における好ましいオリゴセットを要約する。下記表７に、好ましいＴ７プロバイダー、非Ｔ７プライマー、伸長オリゴ及びブロッカーオリゴの配列を示す。
【０１６２】
【表７】
【０１６３】
【表８−１】
【０１６４】
【表８−２】
（実施例４）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａオリゴセットの更なる特性分析及び最適化
下記表９〜１３に、本発明のある好ましいオリゴセットの特定及び最適化に関する代表的データを要約して示す。実時間ＴＭＡ反応から得られたＡｖｅＲａｎｇｅ（ＲＦＵ）及びＴＴｉｍｅ（ｍｉｎ）結果を示す。好ましいオリゴは、曲線形状（図示せず）並びにＡｖｅＲａｎｇｅ及びＴＴｉｍｅの結果によってこの分析から決定される。好ましいオリゴセットは、ゼロＰａｅ ｒＲＮＡ複製レベルにおいて、最低の相対蛍光単位（ＲＦＵ）及び最長ＴＴｉｍｅを有する。ゼロＰａｅ ｒＲＮＡ複製レベルにおける高いＲＦＵ値は、試薬内の汚染の可能性を示す。
【０１６５】
表９にオリゴセットＳ１の結果の概略を示す。
【０１６６】
【表９】
表１０は、Ｓ１オリゴセットをＦ１１オリゴセットと比較し、Ｆ１１のゼロ複製レベルにおけるＲＦＵの最初の低下を示す。この知見は、後続の試験のために蓄積された。
【０１６７】
【表１０】
オリゴセットＬＡ２及び以前にスクリーニングされたオリゴの組合せを試験し、０複製レベルにおけるＲＦＵ値の低下がやはり示された（例えば、表１１）。ＬＡ２オリゴセットは、以前に試験したセットよりもはるかに長鎖のアンプリコンを生成し、ゼロＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｒＲＮＡ複製レベルにおけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ汚染レベルは一層低下した（表１１）。
【０１６８】
【表１１】
さらに、ＬＡ２オリゴセットを用いて種々のトーチを試験した。結果を表１２に示す。
【０１６９】
【表１２】
表１３に、関連生物体との交差反応に対する異なるトーチの試験結果を要約する。約１Ｅ＋０８回のｒＲＮＡ複製である、約１Ｅ＋０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）における関連生物体Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｍｙｒｏｉｄｅｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉの細胞溶解物を用いて、特異性試験を実施した。
【０１７０】
【表１３】
（実施例５）
特異的標的捕捉と非特異的標的捕捉の評価
特異的標的捕捉（ＴＣ）オリゴヌクレオチド、配列番号６６〜７１及び特異的ＴＣヘルパーオリゴヌクレオチド、配列番号７２＆７３を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸を標的にするように設計した。ポリｄＴ３ｄＡ３０末端、（ｋ）１８−ｄＴ３ｄＡ３０（「ｋ」は、オリゴヌクレオチドに組み入れられたグアニン（Ｇ）とウラシル（Ｕ）又はチミン（Ｔ）塩基の無秩序な組合せである。）を含む無秩序な２’−メトキシポリ（ｋ）配列を有する非特異的捕捉オリゴヌクレオチド、配列番号６５も合成した。
【０１７１】
【表１４】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸に対する特異的標的捕捉オリゴ及びヘルパーオリゴを非特異的標的捕捉と比較した。表１５に、特異的標的捕捉及びヘルパーオリゴと非特異的標的捕捉オリゴを用いて得られた例示的な結果の概略を示す。
【０１７２】
【表１５】
表１６に、Ｐ．ｐｕｔｉｄａの存在下での特異的標的捕捉と非特異的標的捕捉の結果の概略を示す。これらの実験によれば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の捕捉、増幅及び検出を単体及びＰ．ｐｕｔｉｄａ核酸の存在下で試験したときの、特異的標的捕捉オリゴと非特異的標的捕捉オリゴの性能及び特異性は同等であった。
【０１７３】
【表１６】
（実施例６）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに関連した生物体との交差反応性の低下
この実施例は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの近縁の生物体の交差反応性及び増幅を低下させるために実施した追加の実験を記述する。１０５ＣＦＵレベルの近縁Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ及びＰ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａと比較して、１０ＣＦＵのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａで得られたシグナルを示す実時間アッセイデータの例示的なグラフ表示を図１に示す。
【０１７４】
グラフ表示に対して、ＡｖｅＲａｎｇｅ（ＲＦＵ）及びＴＴｉｍｅ（ｍｉｎ）又はサイクル時間（ｍｉｎ）結果を下表に示す。生データファイルを解析するスプレッドシートを作成し、陽性及び陰性Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの結果をアッセイの妥当性と一緒に求めた。陽性の結果は、バックグラウンドを減算したデータから、カットオフ値７５０、Ｔｒｉｍｍｅａｎサイクル７１〜７６に対する相対蛍光単位（ＲＦＵ）を用いて求められる。アッセイの妥当性は、ＵＩＣ（内部標準）の結果に基づいて、陰性Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの結果についてのみ確認される。
【０１７５】
表１７に示した情報は、終了した実験の一部である。表１７は、これらの最も近縁のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ生物体の溶解物の試験を、幾つかの周囲の生物体と一緒に示す。示したすべての実験結果は、表１７に示すオリゴセットを使用した。１コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、約１０００回のｒＲＮＡ複製に相当する。３種類の交差反応生物体として特定された同じＡＴＣＣ系統を試験し、結果を確認した。興味深いことに、これらの実験のグラフ表示（図示せず）を解析すると、交差反応生物体を用いた増幅は平坦部を示した。
【０１７６】
【表１７】
表１７の結果に基づいて、３種類の生物体を用いた次の実験では、同じ低レベルの平坦部が異なるレベルで生じるかどうかを判定するためにＣＦＵの滴定に注目した。
【０１７７】
表１８に、分析したＣＦＵ滴定の結果を示す。滴定は、同じ低レベルの増幅及び平坦部を示し、出現時間のみがＣＦＵレベルに基づいて変化する（図示せず）。
【０１７８】
【表１８】
次の実験（表１９）は、これらの交差反応生物体の１種類の存在下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの結果を評価することに焦点をおいた。以前の特異性実験では、Ｐ．ｐｕｔｉｄａは、選択された最終のオリゴセットとは異なるオリゴセットと交差反応し、したがって、Ｐ．ｐｕｔｉｄａをＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの回収に注目するための追加の対象として使用した。その結果、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシグナルは、Ｐ．ｐｕｔｉｄａのＣＦＵレベルが増加するにつれある程度抑制されるが（図示せず）、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａではそれよりも大きいＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ阻害が見られ、これは予想外であった。表１９のＰ．ｐｕｔｉｄａの陽性／陰性結果は、低レベルの陽性であり、同じ標的捕捉反応からの複製と比較して一貫していなかった。
【０１７９】
【表１９】
Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａとＰａｅ及びＰ．ｐｕｔｉｄａの配列比較に基づくと、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ増幅の完全な阻害は起こったはずがなく、したがって全３種類の交差反応生物体を用いて実験を繰り返し、ＴＴｉｍｅアルゴリズムによって解析した（表２０）。予想どおりに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ増幅は、最初の結果とは対照的に、これらの別の生物体の存在下では起こらず、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＲＦＵシグナルがある程度抑制されるにすぎない。
【０１８０】
【表２０】
示した結果は、ｒＲＮＡを用いて試験されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを除いて、細胞溶解物を用いて試験された。これらの溶解物を用いた予想外の結果に基づいて、生物体から得られた精製ＲＮＡを用いて、類似のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ回収実験を実施した（表２１）。Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ及びＰ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａで同じ交差反応が見られたが、これらのレベルにおけるこれらの生物体のｒＲＮＡの存在下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシグナルは抑制されない。
【０１８１】
【表２１】
これらの結果によれば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの種特異的検出は、近縁の生物体の存在下でも、実時間ＴＭＡデータの諸特性（例えば、実時間ＴＭＡ反応から作成されるＲＦＵ曲線のサイズ及び形状）に基づいて、本発明によって達成することができる。したがって、本発明の方法を使用して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を検出するだけでなく、存在し得る他の関連生物体を検出することもできる。例えば、観察されたＲＦＵ値が適切なしきい値を超える場合、試料はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むと結論することができ、さらに、他の近縁生物体の存在を示していると判断される範囲でより低いＲＦＵ値が観察される場合、試料はこれらの近縁生物体の１種類以上も含むと結論することができる。したがって、生物体によって示される異なるＴＭＡシグナル特性に基づいて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａとこれらの関連生物体の１種類以上の同時／差動的検出に本発明の方法を使用することができる。
【０１８２】
上記種々の実施形態を組み合わせて、更なる実施形態を提供することができる。本明細書で参照された、及び／又は出願データシートに列挙された、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許刊行物のすべてを参照によりその全体を本明細書に援用する。実施形態の態様は、必要に応じて、改変して、種々の特許、出願及び刊行物の概念を使用して、更なる実施形態を提供することができる。
【０１８３】
上記詳細な説明に照らして、これら及び他の変更を実施形態に加えることができる。一般に、以下の特許請求の範囲においては、使用する用語は、特許請求の範囲を、本明細書に開示する特定の実施形態及び特許請求の範囲に限定すると解釈すべきではなく、かかる特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲と一緒に、すべての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００７年４月２日に出願された米国仮特許出願第６０／９０９，６８７号（この仮出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表に関する記載
本願に関連する配列表は、紙複製物の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、３９００８２＿４０２ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは、１８ＫＢであり、２００８年４月２日に作成され、明細書の出願と同時に米国ＰＣＴ受理官庁にＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子形式で提出される。
【０００３】
発明の分野
本発明は、試験のために、例えば、診断試験のために、血液製剤スクリーニングのために、バイオプロセス、食品、水、工業若しくは環境試料における微生物検出のために、さらに、他の目的のために採取された試料中の均一若しくは不均一な核酸混合物の大小様々な一成分として、又は単独で存在し得る、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを種特異的に同定するための組成物、方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
特定の核酸配列の検出及び／又は定量化は、微生物の同定及び分類、感染症の診断、遺伝子異常の検出及び特性分析、癌に関連した遺伝子変化の特定、疾患に対する遺伝的感受性の研究、種々の治療に対する応答の測定などに重要な技術である。かかる手順は、食料品、水、工業及び環境試料、保存用種（ｓｅｅｄ ｓｔｏｃｋｓ）、並びに特定の微生物の存在を監視する必要があり得る他のタイプの材料における、微生物の検出及び定量化にも有用である。
【０００５】
核酸増幅アッセイは、従来の微生物学的技術よりも高感度であり、短時間で結果が得られるので、臨床検査、バイオプロセスモニタリング、又は特別な試料タイプにおける特定の微生物の検出が要求される他のあらゆる状況において、微生物の検出に適切である。さらに、増幅方法は、合成培地上での培養が困難又は不可能である膨大な数の微生物の検出に使用することができる。それでも、これらの手法については制約があり、その多くは、核酸増幅方法の感度が高く、その結果、意図しない副生物が増幅されることに由来する。
【０００６】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、ヒトに感染するグラム陰性菌であり、治療が特に困難になり得るグラム陰性菌である。さらに、この生物体は、多数の生物薬剤工程における幾つかの公知汚染菌の一つである。したがって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及び他の関連生物体の存在を検出及び監視する高感度で迅速な方法が絶えず求められている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの迅速で正確な検出及び／又は定量化は極めて望ましいが、従来の試薬及び技術を用いて実際に達成することは困難であった。例えば、実験室での培養技術は、試料を２４〜４８時間インキュベートして、生物体を巨視的に検出可能なレベルに増殖させる必要がある。次いで、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを関連Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ及び他の腸内細菌から識別するために継代培養技術及び代謝アッセイが必要であり、更に２４〜４８時間を必要とし得る。
【０００７】
したがって、対象試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを特異的かつ選択的に同定することができる迅速で堅牢な検出システムが当分野では依然として必要とされている。本明細書で更に記述するように、本発明は、これらの要求を満たし、他の関連した利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、全般的に、検出の特異性、感度及び速度に関して改善及び他の利点を提供する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの検出に使用される組成物、キット及び方法をもたらすものである。以下に更に考察するように、本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの特別な領域が、これらの改善及び別の利点を与える核酸増幅反応の好ましい標的であることを確認した。
【０００９】
したがって、本発明の一態様によれば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ転写媒介性増幅アッセイ用組成物が提供される。この組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡ参照配列（受託番号Ｖ００３３１）の塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を標的にするＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドとを含む。本明細書で更に記述し、立証するように、この領域内で特に明確な特異性を有するＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドの使用によって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを検出するための転写媒介性増幅反応における感度及び選択性が改善される。
【００１０】
本発明のこの態様の特定の一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【００１１】
より特別な一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【００１２】
より具体的な一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、本明細書に定義される、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、非Ｔ７プライマーは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される。
【００１３】
本発明の特に好ましい一組成物は、本明細書に定義される、Ｔ７プロバイダー配列番号２及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド配列番号２４を含む。
【００１４】
上で考察したＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、本発明による組成物は、検出オリゴヌクレオチド、伸長オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチドなど、転写媒介性増幅反応の１つ以上の態様を促進又は改善するのに役立つ１種類以上の追加のオリゴヌクレオチドタイプ及び／又は別の増幅試薬を更に含むことができる。
【００１５】
例えば、一実施形態においては、本発明の組成物は、検出オリゴヌクレオチド、好ましくはトーチオリゴヌクレオチド又は分子ビーコンを更に含むことになる。特定の一実施形態においては、検出オリゴヌクレオチドは、本明細書に定義される、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択されるトーチオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
本発明の組成物は、伸長オリゴヌクレオチドも更に含むことができる。特定の一実施形態においては、伸長オリゴヌクレオチドは、本明細書に定義される、配列番号４３又は配列番号４４から選択される。
【００１７】
本発明の組成物は、ブロッカーオリゴヌクレオチドも更に含むことができる。特定の一実施形態においては、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、本明細書に定義される、配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０又は配列番号４２から選択される。
【００１８】
本発明の好ましい一実施形態においては、組成物は、本明細書に定義される、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド配列番号２及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド配列番号２４を含み、場合によってはブロッカーオリゴヌクレオチド配列番号２９、トーチオリゴヌクレオチド配列番号５４、伸長オリゴヌクレオチド配列番号４４、標的捕捉オリゴヌクレオチド配列番号６８を更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチド配列番号７３を更に含む。
【００１９】
本発明の別の一態様によれば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ転写媒介性増幅アッセイを実施するためのキットが提供される。このキットは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にするＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドとを含む。
【００２０】
本発明のこの態様の特定の一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【００２１】
別の特定の一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【００２２】
より具体的な一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、非Ｔ７プライマーは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される。
【００２３】
別の特定の一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは配列番号２であり、非Ｔ７プライマーは配列番号２４である。
【００２４】
本発明のキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、検出オリゴヌクレオチド、伸長オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチドなど、転写媒介性増幅反応において望まれる又は好ましい１種類以上の追加のオリゴヌクレオチド及び／又は別の試薬を更に含むことができる。例えば、本発明のキットは、トーチオリゴヌクレオチド、分子ビーコンなどの検出オリゴヌクレオチドを更に含むことができる。特定の一実施形態においては、例えば、キットは、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択されるトーチオリゴヌクレオチドを含む。
【００２５】
本発明のキットは、伸長オリゴヌクレオチドも更に含むことができる。特定の一実施形態においては、伸長オリゴヌクレオチドは、配列番号４３又は配列番号４４から選択される。
【００２６】
本発明のキットは、ブロッカーオリゴヌクレオチドも更に含むことができる。特定の一実施形態においては、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０又は配列番号４２から選択される。
【００２７】
より具体的な一実施形態においては、本発明のキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号２及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド、配列番号２４を含み、場合によってはブロッカーオリゴヌクレオチド配列番号２９、トーチオリゴヌクレオチド配列番号５４、伸長オリゴヌクレオチド配列番号４４、標的捕捉オリゴヌクレオチド配列番号６９を更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチド配列番号７３を更に含む。
【００２８】
本発明の更に別の一態様によれば、試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を検出する方法が提供される。この方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを用いて転写媒介性増幅アッセイを実施するものであって、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【００２９】
特定の一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【００３０】
別の特定の一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域の配列を標的にする。
【００３１】
より具体的な一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、非Ｔ７プライマーは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される。
【００３２】
別のより具体的な一実施形態においては、Ｔ７プロバイダーは配列番号２であり、非Ｔ７プライマーは配列番号２４である。
【００３３】
上で考察した組成物及びキットと同様に、本発明のこの態様による方法は、検出オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド、伸長オリゴヌクレオチドなど、転写媒介性増幅反応において有効である、追加の補助的なオリゴヌクレオチド及び／又は試薬を更に含むことができる。
【００３４】
例えば、方法は、トーチオリゴヌクレオチド、分子ビーコンなどの検出オリゴヌクレオチドの使用を利用することができる。一実施形態においては、トーチオリゴヌクレオチドは、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択される。
【００３５】
本方法は、配列番号４３、配列番号４４などの伸長オリゴヌクレオチド、又は配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０、配列番号４２などのブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を利用することもできる。
【００３６】
本発明のこの態様のより具体的な一実施形態においては、転写媒介性増幅方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド配列番号２及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド配列番号２４の使用を利用し、ブロッカーオリゴヌクレオチド配列番号２９、トーチオリゴヌクレオチド配列番号５４、伸長オリゴヌクレオチド配列番号４４、標的捕捉オリゴヌクレオチド配列番号６９の使用を更に利用し、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチド、配列番号７３の使用を利用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】近縁のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ１０５ＣＦＵで得られた実時間蛍光シグナルと比較したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ約１０ＣＦＵの増幅で得られた実時間蛍光シグナルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、臨床試料、バイオプロセス試料、食品試料、水試料、工業試料、環境試料、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むことが知られている、又は疑われる、任意の他の試料タイプなどの試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を検出、監視及び／又は定量化する組成物、方法及びキットに一般に関する。本発明の特定の組成物、方法及びキットは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの増幅による検出における感度、特異性及び選択性を改善する。
【００３９】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに特異的な増幅オリゴヌクレオチドの詳細な分析の結果として、本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの増幅による検出に好ましい標的として、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡ参照配列（受託番号Ｖ００３３１）約７００から１０００ヌクレオチド塩基の領域に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの特別な領域（以下「８００領域」と記述する。）を特定した。したがって、本発明は、対象試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの種特異的検出における、増幅オリゴヌクレオチド、組成物、反応混合物、キットなど、及びそれらの使用に関する。
【００４０】
本発明の用語及び概念は、それに反することを明記しない限り、及び／又は別段の記載がない限り、本明細書に記載の意味を有する。特に断らない限り、本明細書で使用する科学的・技術的用語は、当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。一般的定義は、分子生物学の技術に関連した技術書、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）、又はＴｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，１９９１，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。特に断らない限り、本明細書で利用又は企図される技術は、当業者に周知の標準方法である。本明細書に含まれる実施例は、一部の好ましい実施形態を説明するものである。
【００４１】
「１」の実体という用語は、その実体の１以上を指すことに留意されたい。例えば、「１個の核酸」は、１個以上の核酸を表すものと理解される。したがって、「１」、「１以上」及び「少なくとも１」という用語は、本明細書では区別なく使用することができる。さらに、本明細書に引用される各参考文献は、参照によってその全体が本明細書に具体的に援用される。
【００４２】
核酸増幅及び検出
当業者であればわかることであるが、本発明の好ましいオリゴヌクレオチド、組成物、反応混合物及びキットは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの検出を改善するために核酸増幅方法に使用される。かかる方法及び技術は、周知であり、確立されているが、核酸増幅、検出などの説明のための好ましい態様を以下に考察する。
【００４３】
核酸
「核酸」という用語は、単一の「核酸」及び複数の「核酸」を包含するものとし、共有結合した２個以上のヌクレオチド、ヌクレオシド又は核酸塩基（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）の任意の鎖を指す。核酸としては、ウイルスゲノム若しくはその一部、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、細菌ゲノム若しくはその一部、真菌、植物若しくは動物のゲノム又はその一部、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ若しくはＲＮＡが挙げられるが、これらだけに限定されない。核酸は、線状（例えば、ｍＲＮＡ）、環状（例えば、プラスミド）又は分枝状、さらには二本鎖又は一本鎖状であり得る。核酸は、核酸の機能又は挙動を変える修飾塩基を含み得る（例えば、更なるヌクレオチドが核酸に付加するのを防止する３’末端ジデオキシヌクレオチドの付加）。本明細書では核酸の「配列」とは、核酸を構成する塩基の配列を指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸鎖を意味するのに本明細書では使用することができる。本願を通して、核酸は、５’末端から３’末端方向に命名される。標準核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、「３’から５’方向」に、すなわち、成長する核酸の５’末端にヌクレオチドが付加することによって、典型的には合成される。
【００４４】
「ヌクレオチド」は、リン酸基、五炭糖及び窒素塩基からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡ中に存在する五炭糖はリボースである。ＤＮＡでは、五炭糖は２’−デオキシリボースである。この用語は、リボースの２’位のメトキシ基（２’−Ｏ−Ｍｅ）など、かかるサブユニットの類似体も含む。本明細書では、「Ｔ」残基を含むメトキシオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位のメトキシ基と、ヌクレオチドの塩基位置のウラシルとを有する。
【００４５】
「非ヌクレオチド単位」は、ポリマーのハイブリダイゼーションにさほど関与しない単位である。かかる単位は、例えば、ヌクレオチドとの重要な水素結合に関与してはならず、５種類のヌクレオチド塩基又はその類似体のうちの１種類を成分として有する単位を除外する。
【００４６】
標的核酸／標的配列
「標的核酸」とは、増幅すべき「標的配列」を含む核酸である。標的核酸は、本明細書に記載のＤＮＡ又はＲＮＡとすることができ、一本鎖又は二本鎖とすることができる。標的核酸は、標的配列に加えて、増幅されなくてもよい別の配列を含んでもよい。典型的な標的核酸としては、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、真菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、ウイルス、細菌又は真核細胞由来のｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、染色体ＤＮＡなどが挙げられる。
【００４７】
標的核酸は、実施する増幅アッセイの目的に基づいて、任意の数の出所から単離することができる。標的核酸の出所としては、犯罪の証拠から、環境試料（例えば、水又は土壌試料）から、食品から、工業試料から、ｃＤＮＡライブラリーから、又は全細胞ＲＮＡからの臨床検体（例えば、血液、尿、唾液、糞便、精液又は髄液）が挙げられるが、これらだけに限定されない。「単離する」とは、標的核酸を含む試料がその自然環境から採取されることを意味するが、この用語は、いかなる程度の精製も内包しない。必要に応じて、本発明の標的核酸は、本発明の種々のオリゴヌクレオチドとの相互作用に利用することができる。この用語は、例えば、標的核酸を細胞から遊離させる細胞溶解又は細胞透過処理を含み、続いて一連の単離及び洗浄段階などの１つ以上の精製段階を実施することができる。例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Ｃｌａｒｋ他、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ ａ Ｗｉｄｅ Ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、米国特許第５，７８６，２０８号を参照されたい。これは、例えば、血液試料中に存在するヘムなど、増幅反応を妨害し得る成分を含む可能性がある試料の場合に特に重要である。その内容を参照により本明細書に援用する、Ｒｙｄｅｒ他、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｒｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｇｅｎｔｓ」、米国特許第５，６３９，５９９号を参照されたい。増幅のために標的核酸を種々の出所から調製する方法は、当業者に周知である。本発明の標的核酸は、本明細書に記載の増幅反応前にある程度精製することができるが、試料をそれ以上操作せずに増幅反応に加える場合もある。
【００４８】
「標的配列」という用語は、増幅すべき標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」は、オリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチド及び／又はプロモーターオリゴヌクレオチド）が本発明のプロセス中に複合体を形成する相手となる、複合化配列（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。標的核酸が最初に一本鎖である場合、「標的配列」という用語は、標的核酸中に存在する「標的配列」に相補的である配列も指す。「標的核酸」が最初に二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）とアンチセンス（−）の両方の鎖を指す。当業者であればわかることであるが、標的配列を選択する際には、無関係な又は近縁の標的核酸を識別するように、「独特の」配列を選択すべきである。当業者であればわかることであるが、「独特の」配列は、試験環境から判断される。少なくとも、（より詳細に本明細書に記述する）検出プローブによって認識される配列は、試験環境下で独特であるべきであるが、可能な全配列の中で独特である必要はない。さらに、検出プローブによって認識されるには標的配列が「独特の」配列を含んでいなければならないが、プライミングオリゴヌクレオチド及び／又はプロモーターオリゴヌクレオチドが「独特の」配列を必ずしも認識しているとは限らない。一部の実施形態においては、関連生物体ファミリーに共通した標的配列、例えば、試料中に存在し得る１種類以上のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓに共通した配列を選択することが望ましい場合もある。別の状況では、極めて高度に特異的な標的配列、又は検出プローブ及び増幅オリゴヌクレオチドによって認識される少なくとも高度に特異的な領域を有する標的配列は、近縁の生物体、例えば、病原性と非病原性のＥ．ｃｏｌｉを識別するように選択される。本発明の標的配列は、任意の実用的な長さとすることができる。最小の標的配列は、より詳細に本明細書に記述する、プライミングオリゴヌクレオチド（又はその相補配列）とハイブリッド形成する領域、プロモーターオリゴヌクレオチド（又はその相補配列）のハイブリッド形成領域とハイブリッド形成する領域、及び検出に使用される領域、例えば、検出プローブとハイブリッド形成する領域を含む。検出プローブとハイブリッド形成する領域は、プライミングオリゴヌクレオチド（又はその相補配列）とハイブリッド形成する領域、又はプロモーターオリゴヌクレオチド（又はその相補配列）のハイブリッド形成領域とハイブリッド形成する領域と重複してもよく、又は該ハイブリッド形成する領域内に含まれてもよい。これら最低限の要件に加えて、標的配列の最適な長さは、幾つかの考慮事項、例えば、二次構造の量、又は配列内の自己ハイブリッド形成領域によって決まる。典型的には、本発明の標的配列は、約１００ヌクレオチド長から約１５０から約２５０ヌクレオチド長の範囲である。最適な又は好ましい長さは、本明細書に記載の方法によって決定することができる異なる条件下で変わり得る。「アンプリコン」という用語は、標的配列内に含まれる配列に相補的又は相同である、増幅手順中に生成する核酸分子を指す。
【００４９】
核酸「同一性」
ある実施形態においては、本発明の核酸は、参照核酸の連続塩基領域と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一である連続塩基領域を含む。低分子核酸、例えば、本発明のある種のオリゴヌクレオチドの場合、「問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）」核酸の塩基領域と参照核酸の塩基領域の同一性の程度は、手操作によるアラインメントによって決定することができる。「同一性」は、比較する核酸の糖及び骨格領域とは無関係に、窒素塩基の配列のみを比較することによって決定される。したがって、問い合わせ：参照塩基配列アラインメントは、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、又はその任意の組合せ若しくは類似物とすることができる。（ＲＮＡ中の）Ｕを（ＤＮＡ中の）Ｔに変換することによって、対応するＲＮＡとＤＮＡの塩基配列を比較することができる。
【００５０】
オリゴヌクレオチド及びプライマー
本明細書では「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」又は「オリゴマー」という用語は、単一の「オリゴヌクレオチド」及び複数の「オリゴヌクレオチド」を包含するものとし、本発明の増幅方法及び後続の検出方法における試薬として使用される、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基又は関連化合物の２個以上からなるポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はその類似体とすることができる。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬に対する特別な機能を意味するのではなく、本明細書に記載のすべてのかかる試薬を網羅するのに包括的に使用される。オリゴヌクレオチドは、多様な機能を果たすことができ、例えば、相補鎖に特異的であり、相補鎖とハイブリッド形成可能であり、さらに核酸ポリメラーゼの存在下で伸長することができる場合にはプライマーとして機能することができ、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含み、転写可能である場合にはプロモーターを与えることができ（例えば、Ｔ７プロバイダー）、適切に位置する及び／又は修飾されている場合には、ハイブリダイゼーションを阻止する、又はプライマー伸長を妨害する、機能を果たすことができる。本発明の特定のオリゴヌクレオチドをより詳細に以下に記述する。
【００５１】
本明細書では、オリゴヌクレオチドは、増幅反応における、又は増幅反応の増幅産物の検出における、その特定の機能によってのみ限定される、実質的に任意の長さとすることができる。しかし、ある実施形態においては、好ましいオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列又はその相補鎖の一領域に相補的である少なくとも約１０、１２、１４、１６、１８又は２０個の連続塩基を含む。連続塩基は、オリゴヌクレオチドが結合する標的配列に対して、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは完全に相補的である。ある種の好ましいオリゴヌクレオチドは、一般に約１０〜１００、１０〜７５、１０〜５０又は１０〜２５塩基長であり、場合によっては修飾ヌクレオチドを含む。
【００５２】
明確な配列及び化学構造のオリゴヌクレオチドは、化学又は生化学合成によって、さらに、組換え核酸分子（例えば、細菌又はウイルスベクター）からのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ発現によってなど、当業者に公知の技術によって生成させることができる。本開示によって意図されるように、オリゴヌクレオチドは、野生型染色体ＤＮＡ又はそのｉｎ ｖｉｖｏ転写産物のみからなるものではない。
【００５３】
オリゴヌクレオチドは、所与の修飾が所与のオリゴヌクレオチドの所望の機能に適合する限り、どのようにでも修飾することができる。当業者は、所与の修飾が本発明の所与のオリゴヌクレオチドに適切である、又は望ましいかどうかを容易に判断することができる。修飾としては、塩基修飾、糖修飾、骨格修飾などが挙げられる。塩基修飾としては、アデニン、シチジン、グアノシン、チミン及びウラシルに加えて以下の塩基、すなわち、Ｃ−５プロピン、２−アミノアデニン、５−メチルシチジン、イノシン、並びにｄＰ及びｄＫ塩基の使用が挙げられるが、これらだけに限定されない。ヌクレオシドサブユニットの糖類は、例えば、リボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含めて、リボース、デオキシリボース及びその類似体であり得る。Ｂｅｃｋｅｒ他、米国特許第６，１３０，０３８号を参照されたい。他の糖修飾としては、２’−アミノ、２’−フルオロ、（Ｌ）−アルファ−スレオフラノシル及びペントピラノシル修飾が挙げられるが、これらだけに限定されない。ヌクレオシドサブユニットは、リン酸ジエステル結合、修飾された結合などの結合によって、又はオリゴヌクレオチドとその相補標的核酸配列のハイブリダイゼーションを妨げない非ヌクレオチド部分によって、連結することができる。修飾された結合としては、標準リン酸ジエステル結合がホスホロチオアート結合、メチルホスホナート結合などの異なる結合で置換された結合などが挙げられる。核酸塩基サブユニットは、例えば、ＤＮＡの天然デオキシリボースホスファート骨格を（核酸塩基サブユニットをカルボキシメチルリンカーによって中央の第二級アミンに結合させる２−アミノエチルグリシン骨格などの）偽ペプチド骨格で置換することによって、連結することができる。偽ペプチド骨格を有するＤＮＡ類似体は、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」と一般に称され、Ｎｉｅｌｓｅｎ他、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」、米国特許第５，５３９，０８２号によって開示されている。別の結合修飾としては、モルホリノ結合が挙げられるが、これだけに限定されない。
【００５４】
本発明によって企図されるオリゴヌクレオチド又はオリゴの非限定的例としては、二環式及び三環式のヌクレオシド及びヌクレオチド類似体を含む核酸類似体（ＬＮＡ）が挙げられる。Ｉｍａｎｉｓｈｉ他、米国特許第６，２６８，４９０号、及びＷｅｎｇｅｌ他、米国特許第６，６７０，４６１号を参照されたい。修飾オリゴヌクレオチドがその意図された機能を果たすことができる（例えば、厳密なハイブリダイゼーション条件若しくは増幅条件下で標的核酸とハイブリッド形成し、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼと相互作用し、それによって伸長又は転写を惹起することができる）という前提で、任意の核酸類似体が本発明によって企図される。検出プローブの場合には、修飾オリゴヌクレオチドは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標的核酸と優先的にハイブリッド形成することもできなければならない。
【００５５】
本発明のためのオリゴヌクレオチドの設計及び配列は、以下に示すその機能によって決まるが、幾つかの変数を一般に考慮しなければならない。最も重要な変数としては、長さ、融解温度（Ｔｍ）、特異性、系中の他のオリゴヌクレオチドとの相補性、Ｇ／Ｃ含量、ポリピリミジン（Ｔ、Ｃ）又はポリプリン（Ａ、Ｇ）配列（ｓｔｒｅｔｃｈ）、及び３’末端配列が挙げられる。これら及び他の変数の制御は、オリゴヌクレオチド設計の標準で周知の側面であり、多数のオリゴヌクレオチド候補を最初にスクリーニングするのに種々のコンピュータプログラムを容易に利用することができる。
【００５６】
オリゴヌクレオチド（又は別の核酸）の３’末端は、以下に示すように、ブロッキング成分を用いて種々の方法でブロックすることができる。「ブロックされた」オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによってヌクレオチドがその３’末端に付加することによって効率的に伸長してＤＮＡの相補鎖を生成することがない。したがって、「ブロックされた」オリゴヌクレオチドは「プライマー」になり得ない。
【００５７】
本開示では、特定の配列の群から選択される配列「を含む」、「からなる」又は「から本質的になる」核酸配列を有するオリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドが、基本的で新規な特性として、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、群の列挙された核酸配列のうちの１個の正確な相補配列を有する核酸と安定にハイブリッド形成する能力のあることを意味する。正確な相補配列としては、対応するＤＮＡ又はＲＮＡ配列などが挙げられる。
【００５８】
指定の核酸配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドとは、言及されたオリゴヌクレオチドが、厳密なハイブリダイゼーション条件下で同じ標的核酸配列とハイブリッド形成する点で、参照核酸配列と類似したハイブリダイゼーション特性を有するように、該オリゴヌクレオチドが参照核酸配列に十分類似していることを意味する。
【００５９】
本発明の実質的に対応するオリゴヌクレオチドは、言及された配列とは異なり得るが、それでも同じ標的核酸配列とハイブリッド形成し得ることを当業者は理解されたい。核酸からのこの変化は、配列内の同一塩基の割合、又はプローブ若しくはプライマーとその標的配列との間の完全に相補的な塩基の割合として示すことができる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、塩基の同一性又は相補性のこれらの割合が１００％から約８０％である場合に、参照核酸配列に実質的に対応する。好ましい実施形態においては、割合は１００％から約８５％である。より好ましい実施形態においては、この割合は１００％から約９０％とすることができ、別の好ましい実施形態においては、この割合は１００％から約９５％である。当業者は、容認できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを引き起こさずに、相補性の様々な割合において特定の標的配列とハイブリッド形成するのに必要となり得るハイブリダイゼーション条件の種々の改変を理解するはずである。
【００６０】
「ヘルパーオリゴヌクレオチド」又は「ヘルパー」とは、例えば、その内容を参照により本明細書に援用する米国特許第５，０３０，５５７号に記載のように、標的核酸に結合し、異なる二次及び／又は三次構造を標的核酸に強制して、検出プローブ又は他のオリゴヌクレオチドと標的核酸のハイブリダイゼーションの速度及び程度を増加させるように設計されたオリゴヌクレオチドを指す。ヘルパーは、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションを補助するのに、さらに、プライマー、標的捕捉及び別のオリゴヌクレオチドの機能を補助するのに使用することもできる。
【００６１】
ブロッキング成分
本明細書では「ブロッキング成分」は、オリゴヌクレオチド又は別の核酸が核酸ポリメラーゼによって効率的に伸長することができないように、オリゴヌクレオチド又は別の核酸の３’末端を「ブロックする」のに使用される物質である。ブロッキング成分は、小分子、例えばリン酸基又はアンモニウム基とすることができ、或いは修飾ヌクレオチド、例えば、３’２’ジデオキシヌクレオチド若しくは３’デオキシアデノシン５’−三リン酸（コルジセピン）、又は別の修飾ヌクレオチドとすることができる。別のブロッキング成分としては、例えば、３’から５’方向の配向を有するヌクレオチド若しくは低分子ヌクレオチド配列の使用（その結果、３’末端に遊離ヒドロキシル基が存在しない。）、３’アルキル基、３’非ヌクレオチド部分（例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Ａｒｎｏｌｄ他、「Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」、米国特許第６，０３１，０９１号を参照されたい。）、ホスホロチオアート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、３’末端に３’ヒドロキシル基のないヌクレオチド残基、又は核酸結合タンパク質の使用が挙げられる。好ましくは、３’−ブロッキング成分は、３’から５’方向の配向を有するヌクレオチド若しくはヌクレオチド配列、又は３’非ヌクレオチド部分を含み、３’２’−ジデオキシヌクレオチドも遊離ヒドロキシル基を有する３’末端も含まない。３’−ブロッキングオリゴヌクレオチドを調製する別の方法は、当業者に周知である。
【００６２】
プライミングオリゴヌクレオチド又はプライマー
プライミングオリゴヌクレオチド又は「プライマー」は、少なくともその３’末端が核酸鋳型に相補的であるオリゴヌクレオチド、及び（水素結合又はハイブリダイゼーションによって）鋳型と複合体を形成して、ＲＮＡ又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって合成を開始するのに適切であるプライマー：鋳型複合体を生成するオリゴヌクレオチドである。プライミングオリゴヌクレオチドは、共有結合したヌクレオチド塩基がその３’末端に付加することによって伸長する。該塩基は、鋳型に相補的である。その結果は、プライマー伸長産物である。本発明のプライミングオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも１０ヌクレオチド長であり、最高１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド長以上まで伸長し得る。適切な好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。（逆転写酵素を含めて）実質的にすべての公知ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成を開始するためにオリゴヌクレオチドと一本鎖鋳型の複合体形成（「プライミング」）を必要とするのに対して、ＲＮＡ複製及び転写（ＤＮＡからのＲＮＡの複製）は、一般にプライマーを必要としない。ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるまさにその性質によって、プライミングオリゴヌクレオチドは、３’−ブロッキング成分を含まない。
【００６３】
プロモーターオリゴヌクレオチド／プロモーター配列
当分野で周知のとおり、「プロモーター」は、核酸に結合し、特定の部位におけるＲＮＡの転写を開始するシグナルとして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）によって認識される特異的核酸配列である。結合のためには、かかる転写酵素は、プロモーター配列を含む領域において伸長反応によって二本鎖になったＤＮＡを必要とすると一般に考えられたが、本発明者らは、ＲＮＡの効率的転写が、鋳型核酸を用いた伸長反応によって二本鎖プロモーターが形成されない条件下でも起こり得ることを確認した。鋳型核酸（転写される配列）は、二本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写促進効率が著しく異なり得る種々のプロモーター配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合して転写を開始するときには、プロモーター配列は、転写される配列の一部ではない。したがって、それによって産生されるＲＮＡ転写物は、プロモーター配列を含まない。
【００６４】
本明細書では「プロモーターオリゴヌクレオチド」又は「プロバイダー」とは、第１及び第２の領域を含むオリゴヌクレオチドであって、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を阻止するように修飾されたオリゴヌクレオチドである。本発明のプロモーターオリゴヌクレオチドの「第１の領域」は、鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成する塩基配列を含み、ハイブリッド形成配列は３’に位置するが、プロモーター領域に必ずしも隣接しない。本発明のプロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成部分は、典型的には少なくとも１０ヌクレオチド長であり、最高１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド長以上まで伸長し得る。「第２の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター配列を含む。本発明のプロモーターオリゴヌクレオチドは、上述したように、その３’末端にブロッキング成分を好ましくは含むＲＮＡ又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素によって伸長することができないように操作される。適切な好ましいプロモーターオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。
【００６５】
終結オリゴヌクレオチド
本発明においては、「終結オリゴヌクレオチド」又は「ブロッカーオリゴ」は、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「終結させ」、それによって新生核酸鎖に明確な３’末端を与えるように、標的配列の５’末端付近の標的核酸の領域に相補的である塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。終結オリゴヌクレオチドは、新生核酸鎖に所望の３’末端を与えるのに十分な位置において、標的核酸とハイブリッド形成するように設計される。終結オリゴヌクレオチドの位置決めは、その設計に応じて変更することができる。終結オリゴヌクレオチドは、修飾でも無修飾でもよい。ある実施形態においては、終結オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いて合成される。これらの修飾ヌクレオチドは、相補的二重鎖の熱安定性を向上させる。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高め、それによって修飾オリゴヌクレオチドの半減期を延長する機能も果たす。例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Ｍａｊｌｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６，２２２４−９を参照されたい。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドに加えて、又はその代わりに、本明細書に記載の別の修飾を利用することができる。例えば、終結オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡ又はＬＮＡを含むことができる。例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３，４４−５３を参照されたい。本発明の終結オリゴヌクレオチドは、典型的には、伸長を阻止するブロッキング成分をその３’末端に含む。終結オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによる新生核酸鎖の更なる伸長を終結させるために、オリゴヌクレオチドに結合したタンパク質又はペプチドも含むことができる。本発明の終結オリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも１０塩基長であり、最高１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド長以上まで伸長し得る。適切な好ましい終結オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。終結オリゴヌクレオチドは、典型的又は必然的に３’ブロッキング成分を含むが、「３’ブロックされた」オリゴヌクレオチドは、必ずしも終結オリゴヌクレオチドではないことに留意されたい。本発明の別のオリゴヌクレオチド、例えば、プロモーターオリゴヌクレオチド及びキャッピングオリゴヌクレオチドも、同様に、典型的又は必然的に３’ブロックされる。
【００６６】
伸長オリゴヌクレオチド
「伸長オリゴヌクレオチド」又は「伸長オリゴ」とは、Ｔ７プロバイダーと同じ意味のオリゴヌクレオチドを指し、構造を開く、又は特異性を改善する、ヘルパーオリゴヌクレオチドとして作用することができる。伸長オリゴヌクレオチドは、プロモーターオリゴヌクレオチドの第１の領域の３’末端に隣接する、又はその近くの鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成する。伸長オリゴヌクレオチドは、伸長オリゴヌクレオチドの５’末端塩基がプロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端塩基の３、２又は１塩基以内にあるように、鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成することが好ましい。最も好ましくは、伸長オリゴヌクレオチドの５’末端塩基は、伸長オリゴヌクレオチド及びプロモーターオリゴヌクレオチドが鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成するときに、プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端塩基に隣接する。伸長オリゴヌクレオチドの伸長を防止するために、３’末端ブロッキング成分が典型的には含まれる。伸長オリゴヌクレオチドは、好ましくは１０から５０ヌクレオチド長、より好ましくは２０から４０ヌクレオチド長、最も好ましくは３０から３５ヌクレオチド長である｛米国特許出願公開第２００６／００４６２６５号参照｝。
【００６７】
プローブ
「プローブ」又は「検出プローブ」とは、検出しようとする標的配列の領域と厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成するように、該領域に部分的又は完全に相補的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む分子を意味する。当業者には理解されるように、プローブは、人の介在なしには天然に存在しない形で（例えば、異質な核酸で組み換えられた、単離された、又はある程度精製された）、単離核酸分子、又はその類似体を含む。
【００６８】
本発明のプローブは、ヌクレオシド又は核酸塩基が厳密なハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションに実質的に影響を及ぼさない限り、さらに、検出プローブの場合には、標的核酸との優先的なハイブリダイゼーションを阻止しない限り、標的領域の外側に追加のヌクレオシド又は核酸塩基を有することができる。標的捕捉配列（一般に、ポリＡ、ポリＴ、ポリＵ末端などのホモポリマー鎖（ｔｒａｃｔ））、プロモーター配列、ＲＮＡ転写用結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位などの非相補配列も含まれる場合があり、又は非相補配列は、プローブ、標的核酸若しくはその両方に触媒作用活性部位、ヘアピン構造などの所望の二次若しくは三次構造を与える配列を含むことができる。
【００６９】
プローブは、好ましくは、少なくとも１個の検出可能な標識を含む。標識は、放射性同位体、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、発色団、所定の条件下で標的核酸と安定にハイブリッド形成することができない塩基配列領域、及びこれらの混合物を含めて、ただしこれらだけに限定されない任意の適切な標識化物質とすることができる。特に好ましい一実施形態においては、標識はアクリジニウムエステルである。本発明のある種のプローブは、標識を含まない。例えば、非標識「捕捉」プローブを使用して、標的配列又はその複製物を濃縮することができ、次いで標的配列又はその複製物を第２の「検出」プローブによって検出することができる。例えば、参照により本明細書に援用する、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ他、「Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」、米国特許第６，５３４，２７３号を参照されたい。検出プローブは典型的には標識されるが、ある種の検出技術では、プローブを標識する必要はない。例えば、Ｎｙｇｒｅｎ他、「Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、米国特許第６，０６０，２３７号を参照されたい。
【００７０】
「安定な」又は「検出が安定」とは、反応混合物の温度が核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも２℃低いことを意味する。反応混合物の温度は、より好ましくは、核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも５℃低く、更により好ましくは、反応混合物の融解温度よりも少なくとも１０℃低い。
【００７１】
「優先的にハイブリッド形成する」とは、厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、本発明のプローブがその標的配列又はその複製物とハイブリッド形成して、安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成し、同時に、安定なプローブ：非標的ハイブリッドの形成が最小限に抑えられることを意味する。したがって、プローブは、非標的配列よりも十分高い程度で標的配列又はその複製物とハイブリッド形成して、増幅中に形成される標的配列の複製ＲＮＡ又は相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を当業者が正確に定量することができる。
【００７２】
明確な配列のプローブは、化学合成によって、さらに、組換え核酸分子からのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ発現によってなど、当業者に公知の技術によって生成させることができる。好ましくは、プローブは１０から１００ヌクレオチド長、より好ましくは１２から５０塩基長、更により好ましくは１８から３５塩基長である。
【００７３】
ハイブリッド形成／ハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーションは、完全又は部分的に相補的であるヌクレオチド配列を有する２本の核酸鎖が所定の反応条件下で一体となって、安定な二本鎖ハイブリッドを形成するプロセスである。どちらの核酸鎖も、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）又はその類似体とすることができる。したがって、ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、又はその類似体を含み得る。この二本鎖構造の２本の構成鎖は、ハイブリッドとも称し、水素結合によって一体化される。この水素結合は、最も一般的には、塩基アデニンとチミン若しくはウラシル（ＡとＴ若しくはＵ）又はシトシンとグアニン（ＣとＧ）を単一核酸鎖上に含むヌクレオチド間で形成されるが、塩基対合は、これらの「正規の（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」対のメンバーではない塩基間でも形成され得る。非正規塩基対合は、当分野で周知である。（例えば、Ｒｏｇｅｒ Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”（１１ｔｈ ｅｄ．１９９２）を参照されたい。）
「厳密な」ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、特定の検出プローブが、試験試料中に存在する他の核酸よりも標的核酸とハイブリッド形成することができる条件を指す。これらの条件は、プローブのＧＣ含量及び長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬又は溶液の組成、並びに得ようとするハイブリダイゼーション特異性の程度を含めて、諸因子に応じて変わり得ることを理解されたい。特定の厳密なハイブリダイゼーション条件を以下に開示する。
【００７４】
「核酸ハイブリッド」、「ハイブリッド」又は「二重鎖」とは、各鎖が他方の鎖に相補的であり、化学発光若しくは蛍光検出、オートラジオグラフィー、又はゲル電気泳動を含めて、ただしこれらだけに限定されない手段によって検出するのに、厳密なハイブリダイゼーション条件下で領域が十分に安定である、二本鎖水素結合領域を含む核酸構造を意味する。かかるハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子を含み得る。
【００７５】
「相補的」とは、２個の一本鎖核酸の類似領域のヌクレオチド配列、又は同じ一本鎖核酸の異なる領域が、安定な二本鎖水素結合領域において、厳密なハイブリダイゼーション又は増幅条件下で、一本鎖領域同士がハイブリッド形成することを可能にする、ヌクレオチド塩基組成を有することを意味する。一方の一本鎖領域のヌクレオチドの連続配列が、他方の一本鎖領域のヌクレオチドの類似配列と一連の「正規」水素結合塩基対を形成することができ、その結果、ＡがＵ又はＴと対形成し、ＣがＧと対形成するときには、ヌクレオチド配列は「完全に」相補的である。
【００７６】
「優先的に」ハイブリッド形成するとは、厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ある種の相補的ヌクレオチド又は核酸塩基配列がハイブリッド形成して、安定なハイブリッドをより不安定な別の二重鎖よりも優先的に形成することを意味する。
【００７７】
核酸増幅
上述したように、本発明は、一般に、核酸増幅方法を用いて対象試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを検出するための組成物及び方法に関する。「増幅」又は「核酸増幅」とは、本明細書に更に記述するように、意図した特定の標的核酸配列の少なくとも一部を含む標的核酸の複数の複製体の産生を意味する。複数の複製体は、アンプリコン又は増幅産物とも称する。
【００７８】
本発明の組成物及び方法は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むことが知られている、又は疑われる、本質的にあらゆる対象試料タイプに対して実施することができる。これらの試料タイプとしては、生物試料、臨床試料、工業試料などが挙げられる。好ましい一実施形態においては、試料は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが公知の又は疑われる汚染菌である、生物薬剤学的プロセス（バイオプロセス）の流れである。本明細書では「バイオプロセス」とは、一般に、意図した、又は意図しない、生細胞若しくは生物体又はその成分が存在する任意のプロセスを指す。例えば、その少なくとも１個が、生細胞、生物体若しくはその成分を含み、又は意図しない汚染の結果としてかかる細胞、生物体若しくは成分を含む、１個以上の試料又は試料の流れを利用する本質的にあらゆる製造又は他のプロセスは、バイオプロセスとみなせる。多数のかかるプロセスにおいては、プロセス内の生細胞、生物体又はその成分の存在及び／又は出所を検出、特定及び／又は制御する能力を有することが望ましい。本発明の方法によって、例えば、１個以上のバイオプロセス試料及び／又は流れの中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在及び／又は出所を迅速に高感度で監視することができる。
【００７９】
多数の周知の核酸増幅方法は、二本鎖核酸の変性と、プライマーとのハイブリッド形成とを交互に行う熱サイクルを必要とするが、核酸増幅の別の周知の方法は等温である。ＰＣＲと一般に称されるポリメラーゼ連鎖反応法（米国特許第４，６８３，１９５号、同４，６８３，２０２号、同４，８００，１５９号、同４，９６５，１８８号）は、変性、逆ストランドへのプライマー対のアニーリング、及びプライマー伸長からなる複数のサイクルによって、標的配列のコピー数を指数関数的に増加させる。ＲＴ−ＰＣＲと称する変法では、逆転写酵素（ＲＴ）を使用して、ｍＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製し、次いでｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅してＤＮＡの複数の複製体を作製する。ＬＣＲと一般に称されるリガーゼ連鎖反応（Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１２９２）は、標的核酸の隣接領域とハイブリッド形成する２組の相補ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、熱変性、ハイブリダイゼーション及び連結の繰り返しサイクルにおいて、ＤＮＡリガーゼによって共有結合されて、検出可能な二本鎖連結オリゴヌクレオチド産物を産生する。別の方法は、ＳＤＡと一般に称される鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３９２−３９６、米国特許第５，２７０，１８４号及び同５，４５５，１６６号）である。ＳＤＡは、標的配列の逆ストランドへのプライマー配列対のアニーリングと、二重鎖ヘミホスホロチオアート化（ｈｅｍｉｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ）プライマー伸長産物を産生するｄＮＴＰαＳの存在下でのプライマー伸長と、半修飾（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介性ニッキングと、既存の鎖を置換し、次回のプライマーアニーリング、ニッキング及び鎖置換のための鎖を作製する、切れ目の３’末端からのポリメラーゼ媒介性プライマー伸長とからなるサイクルによって、産物の幾何級数的な増幅をもたらす。高温性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、高温性エンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼを本質的に同じ方法においてより高温で使用する（欧州特許第０ ６８４ ３１５号）。別の増幅方法としては、ＮＡＳＢＡと一般に称される、核酸配列に基づく増幅（米国特許第５，１３０，２３８号）、Ｑ−βレプリカーゼと一般に称される、プローブ分子自体を増幅するＲＮＡレプリカーゼを使用する増幅方法（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６：１１９７−１２０２）、転写に基づく増幅方法（Ｋｗｏｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３−１１７７）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１８７４−１８７８）、及びＴＭＡと一般に称される転写媒介性増幅（米国特許第５，４８０，７８４号及び同５，３９９，４９１号）が挙げられる。公知の増幅方法の更なる考察については、Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．，１９９３，”Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．），ｐｐ．５１−８７（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）を参照されたい。
【００８０】
本発明の好ましい一実施形態においては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、転写に基づく増幅技術によって検出される。好ましい転写に基づく一増幅システムは、ＲＮＡポリメラーゼを利用して、標的領域の複数のＲＮＡ転写物を産生する、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）である。例示的なＴＭＡ増幅方法は、その内容を参照によりその全体を本明細書に援用する、米国特許第５，４８０，７８４号、同５，３９９，４９１号、米国特許出願公開第２００６／００４６２６５号及びその中で引用されている参考文献に記載されている。ＴＭＡは、逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼの存在下で標的核酸とハイブリッド形成する「プロモーター−プライマー」を用いて、二本鎖プロモーターを形成する。この二本鎖プロモーターから、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ転写物を産生する。この転写物は、ＲＮＡ転写物とハイブリッド形成することができる第２のプライマーの存在下で次回以降のＴＭＡの鋳型となることができる。ＰＣＲ、ＬＣＲ、又は熱変性を必要とする別の方法とは異なり、ＴＭＡは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を利用して、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を消化し、それによってプライマー又はプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能なＤＮＡ鎖を作製する、等温方法である。一般に、増幅のために用意される逆転写酵素に付随するＲＮａｓｅ Ｈ活性を利用する。
【００８１】
ＴＭＡ法の一変法においては、一増幅プライマーは、増幅すべき配列に対して３’位において標的ＲＮＡの結合部位とハイブリッド形成することができる、標的結合配列の５’に位置する、二本鎖のときに機能的になるプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドプロモーター−プライマーである。プロモーター−プライマーは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識に特異的であるときには「Ｔ７プライマー」と称することができる。ある状況下では、プロモーター−プライマーの３’末端、又はかかるプロモーター−プライマーの亜集団は、プロモーター−プライマー伸長を妨害する、又は低下させるように修飾することができる。無修飾プロモーター−プライマーから、逆転写酵素は、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ複製体を作製するが、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は標的ＲＮＡを分解する。次いで、第２の増幅プライマーはｃＤＮＡに結合する。このプライマーは、「Ｔ７プライマー」と区別するために「非Ｔ７プライマー」と称することができる。この第２の増幅プライマーから、逆転写酵素は別のＤＮＡ鎖を作製し、機能的プロモーターを一端に有する二本鎖ＤＮＡを生成する。二本鎖のときには、プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合して、プロモーター−プライマーがハイブリッド形成する標的配列の転写を開始することができる。ＲＮＡポリメラーゼは、このプロモーター配列を使用して、複数のＲＮＡ転写物（すなわち、アンプリコン）、一般に約１００から１，０００個の複製体を産生する。新規に合成された各アンプリコンは、第２の増幅プライマーに付着する（ａｎｎｅａｌ）ことができる。次いで、逆転写酵素は、ＤＮＡ複製体を産生するが、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、このＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡを分解する。次いで、プロモーター−プライマーは、新規に合成されたＤＮＡに結合して、逆転写酵素が二本鎖ＤＮＡを産生できるようにする。この二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡポリメラーゼは複数のアンプリコンを産生する。したがって、２個の増幅プライマーを用いて、１０億倍の等温増幅を実施することができる。
【００８２】
ＴＭＡの別の変法は、１個のプライマーと１個以上の追加の増幅オリゴマーを使用して、核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅し、試料中の標的配列の存在を示す転写物（アンプリコン）を作製する（その詳細を参照により本明細書に援用する、Ｂｅｃｋｅｒ他、米国特許出願公開第２００６／００４６２６５号に詳述されている。）。手短に述べると、単一プライマーＴＭＡ法は、プライマー（又は「プライミングオリゴマー」）、（例えば、３’ブロッキング成分を含めることによって）その３’末端からＤＮＡ合成が開始するのを阻止するように修飾された修飾プロモーターオリゴマー（又は「プロモーター−プロバイダー」）を使用し、場合によっては、標的鎖からｃＤＮＡが伸長するのを停止させる結合性分子（例えば、３’ブロックされた伸長オリゴマー）を使用してもよい。この方法は、標的配列の複数の複製体を合成し、標的配列を含む標的ＲＮＡをプライミングオリゴマー及び結合性分子で処理する段階を含む。この段階で、プライマーは標的鎖の３’末端とハイブリッド形成する。ＲＴは、プライマーの３’末端からプライマー伸長を開始して、標的鎖との二重鎖のｃＤＮＡ（例えば、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ）を産生する。３’ブロックされた伸長オリゴマーなどの結合性分子を反応に使用すると、結合性分子は、標的配列の５’末端近くに隣接する標的核酸に結合する。すなわち、結合性分子は、増幅すべき標的配列の５’末端に隣接した標的鎖に結合する。プライマーがＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長されてｃＤＮＡを産生するときには、標的鎖に結合した結合性分子にプライマー伸長産物が達すると重合は停止するので、ｃＤＮＡの３’末端は、結合性分子の位置によって決まる。したがって、ｃＤＮＡの３’末端は、標的配列の５’末端に相補的である。ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＴのＲＮａｓｅ Ｈ）がＲＮＡ鎖を分解するときには、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖は分離するが、任意の形の鎖分離を使用できることを当業者は理解されたい。次いで、プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、ｃＤＮＡ鎖の３’末端近くでｃＤＮＡとハイブリッド形成する。プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、ＲＮＡポリメラーゼのための５’プロモーター配列と、ｃＤＮＡの３’領域中の配列に相補的である３’領域とを含む。プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、プロモーター−プロバイダーオリゴマーの３’末端からＤＮＡ合成が開始するのを阻止するブロッキング成分を含む修飾３’末端も有する。プロモーター−プロバイダー：ｃＤＮＡ二重鎖においては、ｃＤＮＡの３’末端は、プロモーターオリゴマーを鋳型として使用したＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長されて、プロモーター配列をｃＤＮＡに付加し、機能的二本鎖プロモーターを産生する。次いで、プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼは、機能的プロモーターに結合し、ｃＤＮＡに相補的であり、最初の標的鎖から増幅された標的領域配列と実質的に同一である、複数のＲＮＡ転写物を転写する。次いで、生成した増幅ＲＮＡは、プライマーに結合し、更なるｃＤＮＡ産生の鋳型として役立つことによって、プロセスを通して再度循環され、試料中に存在する最初の標的核酸から多数のアンプリコンを最終的に産生することができる。単一プライマー転写を伴う増幅方法の一部の実施形態は、結合性分子を含まず、したがって、プライマーから作製されるｃＤＮＡ産物は未確定の３’末端を有するが、増幅段階は、実質的にはすべての他の段階について上述したように進行する。
【００８３】
適切な増幅条件は、本開示を考慮して当業者が容易に決定することができる。「増幅条件」とは、本発明による核酸増幅を可能にする条件を指す。増幅条件は、一部の実施形態においては、本明細書に記載の「厳密なハイブリダイゼーション条件」よりも厳密性を低くすることができる。本発明の増幅反応に用いられるオリゴは、その意図された標的に増幅条件下で特異的であり、該標的とハイブリッド形成するが、より厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成しても、しなくてもよい。一方、本発明の検出プローブは、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成する。下記実施例の項は、本発明による標的核酸配列を増幅するのに好ましい増幅条件を提供するが、本発明による核酸増幅を実施する別の許容される条件は、使用する特定の増幅方法に応じて当業者が容易に確認することができる。
【００８４】
本発明の増幅方法は、ある実施形態においては、増幅反応の感度、選択性、効率などを向上させるのに有効である１種類以上の別のタイプのオリゴの使用も好ましくは利用する。これらのオリゴとしては、例えば、終結オリゴヌクレオチド、伸長又はヘルパーオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
【００８５】
標的捕捉
ある実施形態においては、増幅前に、例えば標的捕捉手法を用いて、試料から標的核酸を精製又は濃縮することが好ましい場合がある。「標的捕捉」（ＴＣ）とは、一般に、磁気的に誘引可能な粒子などの固体担体上に標的ポリヌクレオチドを捕捉することを指し、固体担体は、標的ポリヌクレオチド精製手順の１つ以上の洗浄段階中に標的ポリヌクレオチドを保持する。このようにして、標的ポリヌクレオチドは、後続の核酸増幅段階前に十分に精製される。多数の標的捕捉方法が公知であり、本明細書に記載の方法と併用するのに適切である。
【００８６】
「捕捉オリゴヌクレオチド」、「捕捉オリゴ」又は「捕捉プローブ」とは、標準塩基対合によって標的核酸中の標的配列と特異的にハイブリッド形成し、固定化プローブ上の結合相手に結合して、標的核酸を担体に捕捉する、核酸オリゴマーを指す。捕捉オリゴマーの一例は、２つの結合領域、すなわち配列結合領域（すなわち、標的特異的部分）と固定化プローブ結合領域を、通常は同じオリゴマー上に含むが、２つの領域は、１種類以上のリンカーによって連結された２種類のオリゴマー上に存在してもよい。
【００８７】
「固定化オリゴ」、「固定化プローブ」又は「固定化核酸」とは、捕捉オリゴマーを担体に直接又は間接的に連結する核酸結合相手を指す。担体に連結された固定化プローブは、捕捉プローブに結合した標的を試料中の結合していない材料から分離するのを容易にする。任意の担体、例えば、溶液中の遊離したマトリックス又は粒子を使用することができる。担体は、種々の材料、例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ガラス、ポリアクリラート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン又は金属のいずれかで構成され得る。説明のための例は、磁気的に誘引可能な粒子（例えば、固定化プローブが（例えば、共有結合、キレート化又はイオン相互作用によって）直接的又は（例えば、リンカーを介して）間接的に結合する単分散常磁性ビーズ（均一サイズ±５％））である担体を使用する。結合は核酸ハイブリダイゼーション条件中で安定である。
【００８８】
例えば、米国特許出願公開第２００６００６８４１７号に記載の説明のための一手法は、標的に相補的な領域を含む少なくとも１種類の捕捉プローブオリゴヌクレオチドと、捕捉担体上の固定化プローブに標的核酸を結合させる特異的結合対の１メンバーとを使用し、したがって別の試料成分から分離された後に標的核酸が捕捉担体から放出される、捕捉ハイブリッドを形成する。
【００８９】
別の説明のための一方法においては、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ他は、米国特許第６，１１０，６７８号において、捕捉プローブ、及び好ましくは温度のみが異なる、２通りのハイブリダイゼーション条件を用いることによって、結合した固定化プローブを用いて、試料中の標的ポリヌクレオチドを、磁気的に誘引可能な粒子などの固体担体上に捕捉する方法を記述した。２通りのハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの順序を制御し、第１のハイブリダイゼーション条件は、標的ポリヌクレオチドへの捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、第２のハイブリダイゼーション条件は、固定化プローブへの捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にする。この方法は、捕捉された標的ポリヌクレオチド、又は増幅された標的ポリヌクレオチドを検出することによって、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出するのに使用することができる。
【００９０】
別の説明のための標的捕捉技術（米国特許第４，４８６，５３９号）は、標的ポリヌクレオチドを捕捉し、その存在を検出する、ハイブリダイゼーションサンドイッチ技術を含む。この技術は、固体担体に結合したプローブによる標的ポリヌクレオチドの捕捉、及び検出プローブと捕捉された標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含む。標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しない検出プローブは、固体担体から容易に洗浄除去される。したがって、残存する標識は、試料中に最初に存在する標的ポリヌクレオチドと関連づけられる。
【００９１】
別の説明のための標的捕捉技術（米国特許第４，７５１，１７７号）は、標的ポリヌクレオチドと固体担体に固定されたポリヌクレオチドの両方とハイブリッド形成する媒介ポリヌクレオチドを使用する方法を含む。媒介ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドを固体担体に連結して、結合標的を生成する。標識されたプローブは、結合標的とハイブリッド形成することができ、結合していない標識されたプローブ（ｐｒｏ）は、固体担体から洗浄除去することができる。
【００９２】
更に別の説明のための標的捕捉技術は、標的ポリヌクレオチドを検出する方法を記述した米国特許第４，８９４，３２４号及び同５，２８８，６０９号に記載されている。この方法は、標的の同じ又は逆ストランドに相補的である２個の一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを利用し、標的ポリヌクレオチドとの二重ハイブリッドの形成をもたらす。一実施形態においては、ハイブリッドは担体上に捕捉される。
【００９３】
別の説明のための標的捕捉技術、欧州特許第０ ３７０ ６９４号においては、核酸を検出する方法及びキットは、特異的結合相手で標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー及びプライマー伸長産物を固定化する。標識は、固体担体に結合したその受容体と特異的に複合体を形成する。
【００９４】
上記捕捉技術は、単なる説明のためのものであって、限定的なものではない。実際、増幅前に対象の標的核酸配列を精製するのに有効であれば、当業者に利用可能な本質的にあらゆる技術を使用することができる。
【００９５】
核酸検出
特定の核酸ハイブリダイゼーションの監視に使用することができる本質的にあらゆる標識及び／又は検出システムを、本発明に関連して使用して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａアンプリコンを検出することができる。多数のかかるシステムが公知であり、当業者に利用可能であり、その説明のための例を以下に手短に考察する。
【００９６】
検出システムは、典型的には、対象となる標的核酸の検出を容易にするために、いずれかのタイプの検出オリゴを使用する。「検出オリゴ」又は「検出プローブ」とは、標的核酸を検出するために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、増幅された配列を含めた標的配列と特異的にハイブリッド形成する核酸オリゴを指す。検出は、直接的（すなわち、標的と直接的にハイブリッド形成するプローブ）でも間接的（すなわち、プローブを標的に連結する中間構造とハイブリッド形成するプローブ）でもよい。プローブの標的配列は、一般に、プローブが特異的にハイブリッド形成する、より大きい配列内の特定の配列を指す。検出プローブは、標的配列が存在するか否かによって、標的特異的配列と、プローブの３次元構造に寄与する別の配列又は構造とを含むことができる（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同５，３１２，７２８号、同６，８３５，５４２号及び同６，８４９，４１２号）。
【００９７】
幾つかの周知の標識化システムのいずれかを使用して、検出を容易にすることができる。「標識」とは、検出される、又は検出可能なシグナルをもたらす、プローブに直接的又は間接的に結合した部分又は化合物を指す。直接的結合は、共有結合又は非共有結合性相互作用（例えば、水素結合、疎水性又はイオン相互作用、及びキレート又は配位化合物形成）を使用することができるのに対して、間接的結合は、（例えば、検出可能なシグナルを増幅する抗体又は追加のオリゴヌクレオチド（単数又は複数）を介して）架橋部分又はリンカーを使用することができる。いずれの検出可能な部分も、例えば、放射性核種、ビオチン、アビジンなどのリガンド、酵素、酵素基質、反応基、検出可能な色を付与する色素、粒子（例えば、ラテックス又は金属ビーズ）などの発色団、発光化合物（例えば、生物発光、リン光又は化学発光化合物）、及び蛍光化合物を使用することができる。好ましい実施形態は、混合物中の結合した標識プローブが、結合していない標識プローブと比較して検出可能な変化を示す、均一系において検出可能である「均一な検出可能な標識」を含む。これによって、ハイブリッド形成した標識プローブをハイブリッド形成していない標識プローブから物理的に取り出さずに、標識を検出することができる（例えば、米国特許第６，００４，７４５号、同５，６５６，２０７号及び同５，６５８，７３７号）。好ましい均一な検出可能な標識としては、化学発光化合物、より好ましくは、周知の標準ＡＥ、ＡＥ誘導体などのアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物が挙げられる（米国特許第５，６５６，２０７号、同５，６５８，７３７号及び同５，９４８，８９９号）。標識を合成する方法、標識を核酸に結合させる方法、及び標識からのシグナルを検出する方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）第１０章、及び米国特許第６，４１４，１５２号、同５，１８５，４３９号、同５，６５８，７３７号、同５，６５６，２０７号、同５，５４７，８４２号、同５，６３９，６０４号、同４，５８１，３３３号及び同５，７３１，１４８号）。ＡＥ化合物を核酸に連結する好ましい方法は公知である（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号、並びに米国特許第５，６３９，６０４号、カラム１０、６行からカラム１１、３行、及び実施例８を参照されたい。）。好ましいＡＥ標識位置は、プローブの中央領域、及びＡ／Ｔ塩基対の領域近傍、プローブの３’若しくは５’末端、又は所望の標的配列と比較してプローブが検出すべきでない公知配列とのミスマッチ部位若しくはその近傍である。
【００９８】
好ましい一実施形態においては、少なくともある程度の自己相補性を示すオリゴは、ハイブリッド形成していないプローブを検出前にまず除去する必要なしに、試験試料中のプローブ：標的二重鎖の検出を容易にすることが望ましい。例として、「分子トーチ」と称する構造は、連結領域によって連結され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリッド形成する、（「標的結合ドメイン」及び「標的閉鎖ドメイン」と称する）自己相補性の明確な領域を含むように設計される。変性条件に曝されると、完全に相補的でも部分的に相補的でもよい、分子トーチの２個の相補的領域は、融解し、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件が復帰したときに標的配列とのハイブリダイゼーションに利用可能な標的結合ドメインが残る。分子トーチは、標的結合ドメインが、標的閉鎖ドメインよりも標的配列とのハイブリダイゼーションを優先するように設計される。分子トーチの標的結合ドメイン及び標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸とハイブリッド形成するときとは対照的に、分子トーチが自己ハイブリッド形成するときには異なるシグナルが生成されるように位置する相互作用標識（例えば、蛍光体／クエンチャー対）を含み、それによって付随する存続可能な標識を有する非ハイブリッド形成プローブの存在下で試験試料中のプローブ：標的二重鎖を検出することができる。分子トーチは、その開示を参照により本明細書に援用する米国特許第６，３６１，９４５号に詳細に記載されている。
【００９９】
本発明に関連して使用することができる自己相補的ハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、「分子ビーコン」と一般に称される構造である。分子ビーコンは、標的相補配列を有する核酸分子、標的核酸配列の非存在下でプローブを閉構造で保持する親和性対（又は核酸アーム）、及びプローブが閉構造であるときに相互作用する標識対を含む。分子ビーコン標的相補配列と標的核酸のハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離させ、それによってプローブを開構造に変化させる。開構造への変化は、例えば蛍光団とクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬとＥＤＡＮＳ）などであってもよい標識対の相互作用の低下によって検出可能である。分子ビーコンは、その開示を参照により本明細書に援用する米国特許第５，９２５，５１７号に詳細に記載されている。特定の核酸配列の検出に有用である分子ビーコンは、本明細書に開示するプローブ配列の１つのどちらかの端部に、蛍光団を含む第１の核酸アーム、及びクエンチャー成分を含む第２の核酸アームを取り付けることによって作製することができる。この構造では、本明細書に開示するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ特異的プローブ配列は、生成した分子ビーコンの標的相補的「ループ」部分として働く。
【０１００】
分子ビーコンは、好ましくは、検出可能な標識の相互作用対で標識される。好ましい検出可能な標識は、ＦＲＥＴ又は非ＦＲＥＴエネルギー移動機構によって相互作用する。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、原子間距離よりもかなり長い距離にわたって、熱エネルギーへの変換なしに、さらに、供与体と受容体が動力学的な衝突をせずに、発色団間の共鳴相互作用による、分子又は分子系における吸収部位からその利用部位へのエネルギー量子の無放射伝達を含む。「供与体」は、エネルギーを最初に吸収する部分であり、「受容体」は、その後にエネルギーが伝達される部分である。ＦＲＥＴに加えて、励起エネルギーが供与体から受容体分子に移動することができる少なくとも３つの別の「非ＦＲＥＴ」エネルギー移動プロセスがある。
【０１０１】
一方の標識によって放出されたエネルギーが、ＦＲＥＴ機構でも非ＦＲＥＴ機構でも、他方の標識によって受け取られ、又は吸収されるように、２個の標識が十分に接近して保持されるときには、２個の標識は「エネルギー移動関係」にあるとされる。これは、例えば、分子ビーコンがステム（ｓｔｅｍ）二重鎖の形成によって閉状態で維持され、分子ビーコンの一方のアームに結合した蛍光団からの蛍光発光が、他方のアームのクエンチャー成分によって消光される場合である。
【０１０２】
分子ビーコンの説明のための標識部分としては、蛍光団と、蛍光消光性を有する第２の部分（すなわち、「クエンチャー」）が挙げられる。この実施形態においては、特徴的なシグナルは、特別な波長の適当な蛍光であるが、代わりに可視光シグナルとすることもできる。蛍光が関与するときには、発光変化は、好ましくはＦＲＥＴ又は放射性エネルギー移動若しくは非ＦＲＥＴ形式による。閉状態の１対の相互作用標識を有する分子ビーコンが、適切な周波数の光によって刺激されると、蛍光シグナルが第１のレベルで発生するが、第１のレベルは極めて低い場合がある。この同じ分子ビーコンが開状態で、適切な周波数の光によって刺激されると、蛍光団とクエンチャー成分が互いに十分に分離され、その間のエネルギー移動が実質的に不可能になる。その条件下では、クエンチャー成分は、蛍光団成分からの蛍光を消光することができない。蛍光団が適切な波長の光エネルギーによって刺激されると、第１のレベルより高い第２のレベルの蛍光シグナルが発生する。蛍光の２つのレベルの差は、検出可能であり、測定可能である。蛍光団とクエンチャー成分をこのように使用すると、分子ビーコンは、「開」構造でのみ「オン」であり、容易に検出可能なシグナルを発することによってプローブが標的に結合したことを示す。プローブの構造状態は、標識部分間の相互作用を調節することによって、プローブから発生するシグナルを変化させる。
【０１０３】
非ＦＲＥＴ対からＦＲＥＴを識別しようとしない、本発明に関連して使用することができる供与体／受容体標識対の例としては、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２、及びフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が挙げられる。当業者は、供与体と受容体色素が異なるときには、エネルギー移動は、受容体の増感蛍光の出現によって、又は供与体蛍光の消光によって、検出できることを理解されたい。供与体と受容体種が同じときには、エネルギーは、結果として生じる蛍光偏光解消によって検出することができる。ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ ７色素などの非蛍光受容体は、有利には、直接（すなわち、非増感）受容体励起に起因するバックグラウンド蛍光の潜在的問題を解消する。供与体−受容体対の１メンバーとして使用することができる好ましい蛍光団成分としては、フルオレセイン、ＲＯＸ、（ＣＹ５などの）ＣＹ色素などが挙げられる。供与体−受容体対の別のメンバーとして使用することができる極めて好ましいクエンチャー成分としては、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆ）から入手可能であるＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ成分などが挙げられる。
【０１０４】
合成技術、並びに標識を核酸に結合させる方法、及び標識を検出する方法は、当分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）第１０章、Ｎｅｌｓｏｎ他、米国特許第５，６５８，７３７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄ他、米国特許第５，６５６，２０７号、Ｈｏｇａｎ他、米国特許第５，５４７，８４２号、Ａｒｎｏｌｄ他、米国特許第５，１８５，４３９号及び６，００４，７４５号、Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ他、米国特許第４，５８１，３３３号、並びにＢｅｃｋｅｒ他、米国特許第５，７３１，１４８号を参照されたい。）。
【０１０５】
好ましいＰＳＥＵＤＯＭＯＮＡＳ ＡＥＲＵＧＩＮＯＳＡオリゴ及びオリゴセット
本明細書に記載のとおり、本発明によるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸を増幅及び検出するのに好ましい部位は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの８００領域に存在することが判明した。さらに、この領域内の特に好ましいオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドセットが、改善された感度、選択性及び特異性でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓを増幅するために特定された。本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ標的配列と高い特異性でハイブリッド形成することができ、その結果、試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在及び／又はレベルを検出し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓの存在から区別するのに使用することができる核酸増幅反応に関与できることを理解されたい。
【０１０６】
例えば、一実施形態においては、本発明の増幅オリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの８００領域を高度の特異性で標的にする。言うまでもなく、本発明の増幅オリゴヌクレオチドを考察するときには、増幅反応に使用される第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、増幅すべき標的核酸配列の逆ストランドに対して特異性を有することを理解されたい。
【０１０７】
特定の一実施形態においては、本発明の増幅オリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、第２のオリゴヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【０１０８】
本発明の増幅オリゴヌクレオチドは、転写に基づく増幅反応、好ましくは転写媒介性増幅（ＴＭＡ）反応において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの標的核酸配列を増幅するのに特に有効である。
【０１０９】
本発明のある種の増幅オリゴヌクレオチドは、転写媒介性増幅反応に使用され、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【０１１０】
本発明のある種のより具体的な増幅オリゴヌクレオチドは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする。
【０１１１】
本発明の別の特定の増幅オリゴヌクレオチドは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡを標的にする。
【０１１２】
特定の好ましい一実施形態においては、本発明の増幅オリゴヌクレオチドは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーは、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、非Ｔ７プライマーは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される。
【０１１３】
別の好ましい一実施形態においては、本発明の増幅オリゴヌクレオチドは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーは配列番号２であり、非Ｔ７プライマーは配列番号２４である。
【０１１４】
増幅反応に使用される特別なＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、追加のオリゴヌクレオチドも増幅反応に関連して一般に使用されることを理解されたい。例えば、ある実施形態においては、増幅反応は、検出オリゴヌクレオチド（例えば、トーチオリゴヌクレオチド）、ブロッカーオリゴヌクレオチド及び／又は伸長オリゴヌクレオチドの１種類以上の使用も利用する。
【０１１５】
下記表１は、特に好ましい特徴を有すると本発明によって確認された、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド、及び別の補助的なオリゴヌクレオチド（例えば、ブロッカーオリゴヌクレオチド、伸長オリゴヌクレオチド及びトーチオリゴヌクレオチド）の具体例である。
【０１１６】
【表１−１】
【０１１７】
【表１−２】
さらに、下記表２は、本発明の組成物、キット及び方法に使用するのに特に好ましいオリゴヌクレオチドセットであって、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド配列番号２及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド、配列番号２４を含み、場合によっては、ブロッカーオリゴヌクレオチド配列番号２９、トーチオリゴヌクレオチド配列番号５４、伸長オリゴヌクレオチド配列番号４４、標的捕捉オリゴヌクレオチド配列番号６９を更に含み、場合によっては、標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチド配列番号７３を更に含む。
【０１１８】
【表２】
優れたアッセイ性能をもたらす、８００領域に由来する特に好ましい増幅オリゴヌクレオチドが本発明によって特定されたが、同じ又は類似の性能目標が達成されるのであれば、８００領域に由来し、本明細書に具体的に記載のものからわずかに改変された別のオリゴヌクレオチドも使用できることを認識されたい。例えば、８００領域に由来し、本発明による増幅反応に有用であるオリゴヌクレオチドは、増幅及び／又は検出手順に実質的に影響を及ぼさないのであれば、本明細書で確認されるものとは異なる長さを有することができる。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドに対するこれら及び別の定常的なわずかな改変を従来の技術によって実施することができ、かかる改変が、本明細書で提供する１つ以上の利点を維持する程度まで、かかる改変は本発明の精神及び範囲内と考えられる。
【０１１９】
ＰＳＥＵＤＯＭＯＮＡＳ ＡＥＲＵＧＩＮＯＳＡの検出に好ましい組成物及びキット
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの２３ｓ ｒＲＮＡの８００領域を検出するポリヌクレオチド増幅反応を実施するための組成物、反応混合物及びキットも包含する。例示的なキットは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの２３ｓ ｒＲＮＡの８００領域の逆ストランドに相補的である第１及び第２の増幅オリゴヌクレオチドを含む。ある種の好ましいキットは、転写を伴う増幅反応、好ましくはＴＭＡ反応に使用される本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む。好ましい一実施形態においては、本発明のキットは、本明細書に記載のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、本明細書に記載の非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、場合によっては、本明細書に記載の検出オリゴヌクレオチド、捕捉オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド及び／又は伸長オリゴヌクレオチドの１種類以上を含めて、増幅及び／又は検出を容易にする１種類以上の別の補助的なオリゴヌクレオチドを更に含んでもよい。
【０１２０】
ある実施形態においては、本発明は、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１及び第２のオリゴヌクレオチドがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの８００領域を高い特異性で標的にする、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。言うまでもなく、この８００領域内のある種の残基を標的にする本発明の増幅オリゴヌクレオチドを考察するときには、増幅反応に使用される第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、増幅すべき標的核酸配列の逆ストランドに相補的であることを理解されたい。
【０１２１】
特定の一実施形態においては、本発明は、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、第２のオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする、増幅反応に使用される、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。
【０１２２】
別の一実施形態においては、本発明は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする、転写媒介性増幅反応に使用される、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。
【０１２３】
より特別な一実施形態においては、本発明は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする、転写媒介性増幅反応に使用される、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。
【０１２４】
より具体的な一実施形態においては、本発明は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列の相補配列を標的にし、非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓ ｒＲＮＡの領域中の配列を標的にする、転写媒介性増幅反応に使用される、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。
【０１２５】
好ましい一実施形態においては、本発明は、少なくともＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーが、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、非Ｔ７プライマーが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される、転写媒介性増幅反応に使用される、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。
【０１２６】
別の好ましい一実施形態においては、本発明は、少なくともＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドを含み、Ｔ７プロバイダーが配列番号２であり、非Ｔ７プライマーが配列番号２４である、転写媒介性増幅反応に使用される、組成物、反応混合物及びキットをもたらす。
【０１２７】
増幅反応に使用される特別なＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドと非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、追加の補助的なオリゴヌクレオチドも増幅反応に関連して一般に使用されることを理解されたい。例えば、ある実施形態においては、本発明の組成物、反応混合物及びキットは、標的捕捉オリゴヌクレオチド、トーチオリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド及び／又は伸長オリゴヌクレオチドの１種類以上も更に含む。
【０１２８】
例えば、一実施形態においては、本発明の組成物、反応混合物及び／又はキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、トーチオリゴヌクレオチドを更に含む。特定の一実施形態においては、トーチオリゴヌクレオチドは、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択される。好ましい一実施形態においては、トーチオリゴヌクレオチドは配列番号５４である。
【０１２９】
別の一実施形態においては、本発明の組成物、反応混合物及び／又はキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、伸長オリゴヌクレオチドを更に含む。特定の一実施形態においては、伸長オリゴヌクレオチドは、配列番号４３又は配列番号４４から選択される。
【０１３０】
別の一実施形態においては、本発明の組成物、反応混合物及び／又はキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、ブロッカーオリゴヌクレオチドを更に含む。特定の一実施形態においては、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０又は配列番号４２から選択される。
【０１３１】
別の一実施形態においては、本発明の組成物、反応混合物及び／又はキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドに加えて、標的捕捉オリゴヌクレオチドを更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチドを更に含む。特定の一実施形態においては、標的捕捉オリゴヌクレオチド配列番号６９及び標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチドは、配列番号７３である。
【０１３２】
特に好ましい一実施形態においては、本発明の組成物、反応混合物及び／又はキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号２及び非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチド、配列番号２４を含み、場合によってはブロッカーオリゴヌクレオチド配列番号２９、トーチオリゴヌクレオチド配列番号５４、伸長オリゴヌクレオチド配列番号４４、標的捕捉オリゴヌクレオチド配列番号６９を更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴヌクレオチド配列番号７３を更に含む。
【０１３３】
本発明の一般的原理は、以下の非限定的実施例を参照することによって、より十分に理解されるであろう。
【実施例】
【０１３４】
本発明のある態様及び実施形態を説明する実施例を以下に示す。以下の実施例は、実際に実施された実験の詳細を正確に反映すると考えられるが、実際に実施された研究と以下に示す実験の詳細との間には、これらの実験の結論、又は実験を実施する当業者の能力に影響を及ぼさない、幾つかの軽微な不一致が存在する可能性がある。当業者は、これらの実施例が、実施例に記載する特定の実施形態に本発明を限定するものではないことを理解されたい。さらに、当業者は、本明細書に記載の技術、材料及び方法を用いて、依然として本発明の精神及び範囲内で、これら及び関連した方法を実施するための代替の増幅系を容易に考案し、最適化することができる。
【０１３５】
別段の記載がない限り、以下の実施例におけるオリゴヌクレオチド及び修飾オリゴヌクレオチドは、標準ホスホルアミダイト化学反応によって合成され、その種々の方法は当分野で周知である。例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，１５４ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２８７（１９８７）を参照されたい。本明細書に別段の記載がない限り、修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであり、そのホスホルアミダイト類似体として合成に使用された。単一プライマー増幅（参照により本明細書に援用する、Ｂｅｃｋｅｒ他、米国特許出願公開第２００６／００４６２６５号）に用いられるブロッカーオリゴヌクレオチドの場合、３’末端ブロッキング成分は、３’−ジメチルトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、５’−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２０−０１０２−０１）を用いて調製される「逆Ｃ」３’−３’結合からなった。分子トーチ（参照により本明細書に援用する、Ｂｅｃｋｅｒ他、米国特許第６，８４９，４１２号参照）は、オリゴヌクレオチドに結合した、Ｃ９非ヌクレオチドリンカー連結領域、５’−フルオレセイン（「Ｆ」）蛍光団及び３’−ダブシル（「Ｄ」）クエンチャー成分を用いて標準方法によって調製された。
【０１３６】
以下の実施例に記載するように、多種多様な増幅試薬及び条件の解析によって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの種特異的検出のための高感度で選択的な増幅プロセスが開発された。
【０１３７】
（実施例１）
説明のためのアッセイ試薬及び手順の記述
以下の実施例は、本明細書に記載のＴＭＡ実験に用いられる典型的なアッセイ試薬、手順、条件などを記述する。それに反することを明記しない限り、試薬調製、装置調製及びアッセイ手順は、本質的に以下に記載のように実施された。
【０１３８】
Ａ． 試薬及び試料
１． 増幅試薬。「増幅試薬」又は「Ａｍｐ試薬」は、近似濃度の以下の成分で構成された：０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、１０ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１２．７ｍＭ ＵＴＰ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び３３ｍＭ ＫＣｌのｐＨ７．７の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液。プライマー及び他のオリゴヌクレオチドをＡｍｐ試薬に添加した。
【０１３９】
２． 酵素試薬。「酵素試薬」は、近似濃度の以下の成分で構成された：１２０ｍＭ ＫＣｌ、１０％ ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１６０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ７．０の７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤中の１１８０ＲＴＵ／μＬモロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）逆転写酵素（「ＲＴ」）及び２６０ＰＵ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ。ここで、１ＲＴＵのＲＴ活性は、ｄＴ １ｎｍｏｌを基質に３７℃で２０分で取り込み、１ＰＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ活性は、ＲＮＡ転写物５ｆｍｏｌを３７℃で２０分で産生する。
【０１４０】
３． 洗浄溶液。「洗浄溶液」は、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡのｐＨ７．５の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液で構成された。
【０１４１】
４． 標的捕捉試薬。「標的捕捉試薬」（ＴＣＲ）は、近似濃度の以下の成分で構成された：ｐＨ６．５の、ｄＴ３ｄＡ３０末端を有する１種類以上の捕捉プローブ及び任意に選択される捕捉ヘルパープローブの各々６０ｐｍｏｌ／ｍＬ、常磁性オリゴ（ｄＴ）１４微粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ）２５０から３００ｕｇ／ｍＬ、２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ及び１．８８Ｍ ＬｉＣｌ。
【０１４２】
５． 溶解試薬。「溶解緩衝剤」は、１００ｍＭ ｔｒｉｓ、２．５ｍＭコハク酸、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び５００ｍＭ ＬｉＣｌを含むｐＨ６．５の緩衝剤中の１％ラウリル硫酸リチウムで構成された。
【０１４３】
６． 標的ｒＲＮＡ試料。ｒＲＮＡ試料は、本明細書に記載の実験において使用する前に、水、０．１％ＬｉＬＳ又は溶解試薬中で保存された。
【０１４４】
Ｂ． 標的捕捉
後続の増幅のために核酸試料を精製及び調製する典型的な標的捕捉手順は、本質的に以下に示すように実施される。
【０１４５】
１． 試験試料１００ｕＬ、標的捕捉オリゴヌクレオチドを含むＴＣＲ ５０μＬ、及び溶解試薬１ｍＬを混合する。混合物を６０℃で１５分間インキュベートする。
【０１４６】
２． 洗浄溶液及び適切な磁性粒子洗浄・分離装置（例えば、磁気分離ラック、ＧＥＮ−ＰＲＯＢＥ（登録商標）Ｔａｒｇｅｔ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．５２０７、又はＴｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）磁性粒子プロセッサシステム）を用いて、処理反応混合物からＴＣＲ磁性粒子を捕捉し、洗浄する。
【０１４７】
３． 洗浄後、磁性粒子を増幅試薬１００μＬに再懸濁させる。
【０１４８】
Ｃ． 標的の増幅及び検出
実時間ＴＭＡ増幅反応を本質的に以下のように実施した。試料３０μＬ、Ａｍｐ試薬中の増幅及び検出オリゴヌクレオチド、又は標的捕捉手順から得られたＡｍｐ試薬中の再懸濁粒子３０μＬを６０℃で１０分間インキュベートした。次いで、温度を低下させ、反応混合物を４２℃に平衡化した。酵素試薬１０μＬを添加した。反応混合物を混合し、実時間検出システム（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なＯｐｔｉｃｏｎ（商標）若しくはＣｈｒｏｍｏ４（商標）検出システム、又はＦｌｕｏＤｉａ（登録商標）Ｔ７０装置）中で４２℃でインキュベートした。
【０１４９】
（実施例２）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｐａｅ）オリゴセットの設計及び初期試験
Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡ（受託番号Ｖ００３３１）の約７００から１０００（「８００領域」）及び約１４００から１６００（「１５００領域」）ヌクレオチド塩基位置に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の２つの領域を標的にした増幅及び検出オリゴヌクレオチドを評価のために設計し、合成した。
【０１５０】
【表３−１】
【０１５１】
【表３−２】
【０１５２】
【表３−３】
【０１５３】
【表４】
２３Ｓ １５００領域設計を試験した。結果を下記サイクル時間として示す。サイクル時間はＴｔｉｍｅに比例する。オリゴの４つの組合せを試験した。オリゴセット番号２は、Ｐａｅ ｒＲＮＡの１Ｅ＋０６回の複製における曲線形状（図示せず）及び最も早いサイクル時間に基づいて、最良の候補であった。
【０１５４】
【表５−１】
【０１５５】
【表５−２】
１５００領域オリゴセット２を用いた幾つかの最適化実験を、オリゴ濃度を変えて実施した（結果示さず）。しかし、８００領域の長鎖アンプリコンオリゴセット（単数又は複数）を用いた同時試験は、汚染された試薬によるバックグラウンドのレベルが低下した。したがって、２３Ｓ ｒＲＮＡの８００領域に対してＴ７プロバイダー及び非Ｔ７プライマーが、試験した多数の他のオリゴセットに比べて、実時間単一プライマーＴＭＡアッセイにおいて最高シグナル及び最低バックグラウンドを示したとの結果に基づいて、８００領域を更なる最適化のための好ましい領域として選択した。実時間ＴＭＡアッセイにおけるオリゴのスクリーニングを実施し、異なるトーチ及びブロッカーも分析した。最良のオリゴセットを選択する判定基準としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｒＲＮＡの１０ｅ３回の複製において最低バックグラウンド及び最高シグナルを有することなどが挙げられた。
【０１５６】
ブロッカーオリゴヌクレオチド及びトーチオリゴヌクレオチドを含めて、３組の最初の好ましいオリゴセットをこの分析から選択した。これらのセットを標準短鎖アンプリコンセットＳ１及びＦ１１、並びに長鎖アンプリコンセットＬＡ２と称する（下記表６）。３組のセットの各々は良好に機能したが、ＬＡ２オリゴセットは、バックグラウンドがなく、最高の感度を示した。さらに、ＬＡ２オリゴセットは、生成したアンプリコンが約１９６塩基長であり、典型的な短鎖アンプリコン（８６〜１１０ヌクレオチド塩基）Ｆ１１及びＳ１よりも長く、異常であった。
【０１５７】
【表６−１】
【０１５８】
【表６−２】
（実施例３）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａオリゴセットの更なる特定
バックグラウンドシグナルを更に低下させ、特異性及び感度を改善するために、幾つかの追加のオリゴセットを設計し、試験した。感度を改善するために「伸長」オリゴも導入した。これらの実験を標的捕捉なしで実施した。
【０１５９】
伸長オリゴの添加及び再設計の前に、（「標準」系と称する）１組の試験オリゴセットは、「ＬＡ２」オリゴセットから得られた増幅オリゴと、「Ｆ１１」オリゴセットから得られたトーチとの組合せで構成された（下記表７）。しかし、このオリゴセットは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａに曝露したときに特異性の問題があり、わずかに高いバックグラウンドシグナルを有し、１×１０３回の複製におけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの出現時間が遅かった。再設計及びスクリーニングによって、これらの問題に対処する３組の有望な新しいオリゴセット（下記セット１〜３）が得られた。３組のオリゴセットはすべて、特異性を改善し、バックグラウンドシグナルを低下させるトーチ配列番号５４、アッセイ感度を改善する伸長オリゴ、及び再設計された増幅オリゴを含んだ。
【０１６０】
さらに、これらの新しいオリゴセットを別のオリゴセット（下記セット４）及び「標準ＬＡ」オリゴセットと比較した。新しいオリゴセットのすべては、トーチ配列番号５４を含み、「標準」オリゴセットより性能が優れていた。
【０１６１】
下記表７に、この分析段階における好ましいオリゴセットを要約する。下記表７に、好ましいＴ７プロバイダー、非Ｔ７プライマー、伸長オリゴ及びブロッカーオリゴの配列を示す。
【０１６２】
【表７】
【０１６３】
【表８−１】
【０１６４】
【表８−２】
（実施例４）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａオリゴセットの更なる特性分析及び最適化
下記表９〜１３に、本発明のある好ましいオリゴセットの特定及び最適化に関する代表的データを要約して示す。実時間ＴＭＡ反応から得られたＡｖｅＲａｎｇｅ（ＲＦＵ）及びＴＴｉｍｅ（ｍｉｎ）結果を示す。好ましいオリゴは、曲線形状（図示せず）並びにＡｖｅＲａｎｇｅ及びＴＴｉｍｅの結果によってこの分析から決定される。好ましいオリゴセットは、ゼロＰａｅ ｒＲＮＡ複製レベルにおいて、最低の相対蛍光単位（ＲＦＵ）及び最長ＴＴｉｍｅを有する。ゼロＰａｅ ｒＲＮＡ複製レベルにおける高いＲＦＵ値は、試薬内の汚染の可能性を示す。
【０１６５】
表９にオリゴセットＳ１の結果の概略を示す。
【０１６６】
【表９】
表１０は、Ｓ１オリゴセットをＦ１１オリゴセットと比較し、Ｆ１１のゼロ複製レベルにおけるＲＦＵの最初の低下を示す。この知見は、後続の試験のために蓄積された。
【０１６７】
【表１０】
オリゴセットＬＡ２及び以前にスクリーニングされたオリゴの組合せを試験し、０複製レベルにおけるＲＦＵ値の低下がやはり示された（例えば、表１１）。ＬＡ２オリゴセットは、以前に試験したセットよりもはるかに長鎖のアンプリコンを生成し、ゼロＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｒＲＮＡ複製レベルにおけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ汚染レベルは一層低下した（表１１）。
【０１６８】
【表１１】
さらに、ＬＡ２オリゴセットを用いて種々のトーチを試験した。結果を表１２に示す。
【０１６９】
【表１２】
表１３に、関連生物体との交差反応に対する異なるトーチの試験結果を要約する。約１Ｅ＋０８回のｒＲＮＡ複製である、約１Ｅ＋０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）における関連生物体Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｍｙｒｏｉｄｅｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉの細胞溶解物を用いて、特異性試験を実施した。
【０１７０】
【表１３】
（実施例５）
特異的標的捕捉と非特異的標的捕捉の評価
特異的標的捕捉（ＴＣ）オリゴヌクレオチド、配列番号６６〜７１及び特異的ＴＣヘルパーオリゴヌクレオチド、配列番号７２＆７３を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸を標的にするように設計した。ポリｄＴ３ｄＡ３０末端、（ｋ）１８−ｄＴ３ｄＡ３０（「ｋ」は、オリゴヌクレオチドに組み入れられたグアニン（Ｇ）とウラシル（Ｕ）又はチミン（Ｔ）塩基の無秩序な組合せである。）を含む無秩序な２’−メトキシポリ（ｋ）配列を有する非特異的捕捉オリゴヌクレオチド、配列番号６５も合成した。
【０１７１】
【表１４】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸に対する特異的標的捕捉オリゴ及びヘルパーオリゴを非特異的標的捕捉と比較した。表１５に、特異的標的捕捉及びヘルパーオリゴと非特異的標的捕捉オリゴを用いて得られた例示的な結果の概略を示す。
【０１７２】
【表１５】
表１６に、Ｐ．ｐｕｔｉｄａの存在下での特異的標的捕捉と非特異的標的捕捉の結果の概略を示す。これらの実験によれば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の捕捉、増幅及び検出を単体及びＰ．ｐｕｔｉｄａ核酸の存在下で試験したときの、特異的標的捕捉オリゴと非特異的標的捕捉オリゴの性能及び特異性は同等であった。
【０１７３】
【表１６】
（実施例６）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに関連した生物体との交差反応性の低下
この実施例は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの近縁の生物体の交差反応性及び増幅を低下させるために実施した追加の実験を記述する。１０５ＣＦＵレベルの近縁Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ及びＰ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａと比較して、１０ＣＦＵのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａで得られたシグナルを示す実時間アッセイデータの例示的なグラフ表示を図１に示す。
【０１７４】
グラフ表示に対して、ＡｖｅＲａｎｇｅ（ＲＦＵ）及びＴＴｉｍｅ（ｍｉｎ）又はサイクル時間（ｍｉｎ）結果を下表に示す。生データファイルを解析するスプレッドシートを作成し、陽性及び陰性Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの結果をアッセイの妥当性と一緒に求めた。陽性の結果は、バックグラウンドを減算したデータから、カットオフ値７５０、Ｔｒｉｍｍｅａｎサイクル７１〜７６に対する相対蛍光単位（ＲＦＵ）を用いて求められる。アッセイの妥当性は、ＵＩＣ（内部標準）の結果に基づいて、陰性Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの結果についてのみ確認される。
【０１７５】
表１７に示した情報は、終了した実験の一部である。表１７は、これらの最も近縁のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ生物体の溶解物の試験を、幾つかの周囲の生物体と一緒に示す。示したすべての実験結果は、表１７に示すオリゴセットを使用した。１コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、約１０００回のｒＲＮＡ複製に相当する。３種類の交差反応生物体として特定された同じＡＴＣＣ系統を試験し、結果を確認した。興味深いことに、これらの実験のグラフ表示（図示せず）を解析すると、交差反応生物体を用いた増幅は平坦部を示した。
【０１７６】
【表１７】
表１７の結果に基づいて、３種類の生物体を用いた次の実験では、同じ低レベルの平坦部が異なるレベルで生じるかどうかを判定するためにＣＦＵの滴定に注目した。
【０１７７】
表１８に、分析したＣＦＵ滴定の結果を示す。滴定は、同じ低レベルの増幅及び平坦部を示し、出現時間のみがＣＦＵレベルに基づいて変化する（図示せず）。
【０１７８】
【表１８】
次の実験（表１９）は、これらの交差反応生物体の１種類の存在下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの結果を評価することに焦点をおいた。以前の特異性実験では、Ｐ．ｐｕｔｉｄａは、選択された最終のオリゴセットとは異なるオリゴセットと交差反応し、したがって、Ｐ．ｐｕｔｉｄａをＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの回収に注目するための追加の対象として使用した。その結果、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシグナルは、Ｐ．ｐｕｔｉｄａのＣＦＵレベルが増加するにつれある程度抑制されるが（図示せず）、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａではそれよりも大きいＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ阻害が見られ、これは予想外であった。表１９のＰ．ｐｕｔｉｄａの陽性／陰性結果は、低レベルの陽性であり、同じ標的捕捉反応からの複製と比較して一貫していなかった。
【０１７９】
【表１９】
Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａとＰａｅ及びＰ．ｐｕｔｉｄａの配列比較に基づくと、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ増幅の完全な阻害は起こったはずがなく、したがって全３種類の交差反応生物体を用いて実験を繰り返し、ＴＴｉｍｅアルゴリズムによって解析した（表２０）。予想どおりに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ増幅は、最初の結果とは対照的に、これらの別の生物体の存在下では起こらず、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＲＦＵシグナルがある程度抑制されるにすぎない。
【０１８０】
【表２０】
示した結果は、ｒＲＮＡを用いて試験されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを除いて、細胞溶解物を用いて試験された。これらの溶解物を用いた予想外の結果に基づいて、生物体から得られた精製ＲＮＡを用いて、類似のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ回収実験を実施した（表２１）。Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ及びＰ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａで同じ交差反応が見られたが、これらのレベルにおけるこれらの生物体のｒＲＮＡの存在下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシグナルは抑制されない。
【０１８１】
【表２１】
これらの結果によれば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの種特異的検出は、近縁の生物体の存在下でも、実時間ＴＭＡデータの諸特性（例えば、実時間ＴＭＡ反応から作成されるＲＦＵ曲線のサイズ及び形状）に基づいて、本発明によって達成することができる。したがって、本発明の方法を使用して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を検出するだけでなく、存在し得る他の関連生物体を検出することもできる。例えば、観察されたＲＦＵ値が適切なしきい値を超える場合、試料はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むと結論することができ、さらに、他の近縁生物体の存在を示していると判断される範囲でより低いＲＦＵ値が観察される場合、試料はこれらの近縁生物体の１種類以上も含むと結論することができる。したがって、生物体によって示される異なるＴＭＡシグナル特性に基づいて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａとこれらの関連生物体の１種類以上の同時／差動的検出に本発明の方法を使用することができる。
【０１８２】
上記種々の実施形態を組み合わせて、更なる実施形態を提供することができる。本明細書で参照された、及び／又は出願データシートに列挙された、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許刊行物のすべてを参照によりその全体を本明細書に援用する。実施形態の態様は、必要に応じて、改変して、種々の特許、出願及び刊行物の概念を使用して、更なる実施形態を提供することができる。
【０１８３】
上記詳細な説明に照らして、これら及び他の変更を実施形態に加えることができる。一般に、以下の特許請求の範囲においては、使用する用語は、特許請求の範囲を、本明細書に開示する特定の実施形態及び特許請求の範囲に限定すると解釈すべきではなく、かかる特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲と一緒に、すべての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ７プロバイダーオリゴ及び非Ｔ７オリゴを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸増幅アッセイに使用するための組成物であって、該Ｔ７プロバイダーオリゴが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、該非Ｔ７オリゴが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸増幅アッセイに使用するための組成物。
【請求項２】
前記Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、前記非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、前記非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、前記非Ｔ７プライマーが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号２であり、前記非Ｔ７プライマーが配列番号２４である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
検出オリゴを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記検出オリゴがトーチオリゴ又は分子ビーコンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記トーチオリゴが、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
伸長オリゴを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記伸長オリゴが、配列番号４３又は配列番号４４から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ブロッカーオリゴを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ブロッカーオリゴが、配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０又は配列番号４２から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｔ７プロバイダーオリゴ、配列番号２及び非Ｔ７オリゴ、配列番号２４を含み、場合によってはブロッカーオリゴ配列番号２９、トーチオリゴ配列番号５４、伸長オリゴ配列番号４４、標的捕捉オリゴ配列番号６９を更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴ配列番号７３を更に含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸増幅アッセイに使用するための組成物。
【請求項１４】
Ｔ７プロバイダーオリゴ及び非Ｔ７オリゴを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ増幅アッセイに使用するためのキットであって、該Ｔ７プロバイダーオリゴが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、該非Ｔ７オリゴが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ増幅アッセイに使用するためのキット。
【請求項１５】
前記Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、前記非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、前記非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、前記非Ｔ７プライマーが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１８】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号２であり、前記非Ｔ７プライマーが配列番号２４である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１９】
検出オリゴを更に含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項２０】
前記検出オリゴがトーチオリゴ又は分子ビーコンである、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記トーチオリゴが、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
伸長オリゴを更に含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項２３】
前記伸長オリゴが、配列番号４３又は配列番号４４から選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
ブロッカーオリゴを更に含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項２５】
前記ブロッカーオリゴが、配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０又は配列番号４２から選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
Ｔ７プロバイダーオリゴ、配列番号２及び非Ｔ７オリゴ、配列番号２４を含み、場合によってはブロッカーオリゴ配列番号２９、トーチオリゴ配列番号５４、伸長オリゴ配列番号４４、標的捕捉オリゴ配列番号６９を更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴ配列番号７３を更に含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸増幅アッセイ用キット。
【請求項２７】
試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を検出するための方法であって、該方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴ及び非Ｔ７オリゴを用いて核酸増幅アッセイを実施することを含み、該Ｔ７プロバイダーオリゴが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、該非Ｔ７オリゴが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、方法。
【請求項２８】
前記Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、前記非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、前記非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、前記非Ｔ７プライマーが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号２であり、前記非Ｔ７プライマーが配列番号２４である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
増幅された核酸を検出オリゴを用いて検出することを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出オリゴがトーチオリゴ又は分子ビーコンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記トーチオリゴが、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
伸長オリゴを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記伸長オリゴが、配列番号４３又は配列番号４４から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ブロッカーオリゴを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記ブロッカーオリゴが、配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０又は配列番号４２から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴが配列番号２であり、前記非Ｔ７オリゴが配列番号２４であり、前記方法は、場合によってはブロッカーオリゴ配列番号２９、トーチオリゴ配列番号５４、伸長オリゴ配列番号４４、標的捕捉オリゴ配列番号６９の使用を含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴ、配列番号７３の使用を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記増幅された核酸の検出が実時間で行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸が、近縁のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓの存在下で特異的に検出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
検出カットオフが設定され、それによってＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸、及びすべてではないが１種類以上の近縁のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓが検出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓリボソーム核酸の８００領域又は１５００領域を増幅するように設計された２種類以上の増幅オリゴヌクレオチドを含む試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを検出するための組成物。
【請求項４４】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓリボソーム核酸を検出するための１種類以上のプローブを更に含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を検出するための方法であって、該方法は、請求項４３に記載の増幅オリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅アッセイを実施すること、及び増幅された核酸を請求項４４に記載の１種類以上のプローブを用いて検出することを含む、方法。
【請求項１】
Ｔ７プロバイダーオリゴ及び非Ｔ７オリゴを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸増幅アッセイに使用するための組成物であって、該Ｔ７プロバイダーオリゴが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、該非Ｔ７オリゴが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸増幅アッセイに使用するための組成物。
【請求項２】
前記Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、前記非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、前記非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、前記非Ｔ７プライマーが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号２であり、前記非Ｔ７プライマーが配列番号２４である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
検出オリゴを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記検出オリゴがトーチオリゴ又は分子ビーコンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記トーチオリゴが、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
伸長オリゴを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記伸長オリゴが、配列番号４３又は配列番号４４から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ブロッカーオリゴを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ブロッカーオリゴが、配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０又は配列番号４２から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｔ７プロバイダーオリゴ、配列番号２及び非Ｔ７オリゴ、配列番号２４を含み、場合によってはブロッカーオリゴ配列番号２９、トーチオリゴ配列番号５４、伸長オリゴ配列番号４４、標的捕捉オリゴ配列番号６９を更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴ配列番号７３を更に含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸増幅アッセイに使用するための組成物。
【請求項１４】
Ｔ７プロバイダーオリゴ及び非Ｔ７オリゴを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ増幅アッセイに使用するためのキットであって、該Ｔ７プロバイダーオリゴが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、該非Ｔ７オリゴが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ増幅アッセイに使用するためのキット。
【請求項１５】
前記Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、前記非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、前記非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、前記非Ｔ７プライマーが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１８】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号２であり、前記非Ｔ７プライマーが配列番号２４である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１９】
検出オリゴを更に含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項２０】
前記検出オリゴがトーチオリゴ又は分子ビーコンである、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記トーチオリゴが、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
伸長オリゴを更に含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項２３】
前記伸長オリゴが、配列番号４３又は配列番号４４から選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
ブロッカーオリゴを更に含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項２５】
前記ブロッカーオリゴが、配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０又は配列番号４２から選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
Ｔ７プロバイダーオリゴ、配列番号２及び非Ｔ７オリゴ、配列番号２４を含み、場合によってはブロッカーオリゴ配列番号２９、トーチオリゴ配列番号５４、伸長オリゴ配列番号４４、標的捕捉オリゴ配列番号６９を更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴ配列番号７３を更に含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸増幅アッセイ用キット。
【請求項２７】
試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を検出するための方法であって、該方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴ及び非Ｔ７オリゴを用いて核酸増幅アッセイを実施することを含み、該Ｔ７プロバイダーオリゴが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約７２５〜８２５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、該非Ｔ７オリゴが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基約８４５〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、方法。
【請求項２８】
前記Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基７２５〜７７５に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、前記非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基９００〜９５０に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔ７プロバイダーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基７３９〜７６６に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列を標的にし、前記非Ｔ７プライマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの塩基９１８〜９４３に対応するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号２、配列番号１、配列番号１１又は配列番号１４から選択され、前記非Ｔ７プライマーが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１９又は配列番号１５から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号２であり、前記非Ｔ７プライマーが配列番号２４である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
増幅された核酸を検出オリゴを用いて検出することを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出オリゴがトーチオリゴ又は分子ビーコンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記トーチオリゴが、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５０又は配列番号５６から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
伸長オリゴを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記伸長オリゴが、配列番号４３又は配列番号４４から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ブロッカーオリゴを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記ブロッカーオリゴが、配列番号２９、配列番号２６、配列番号４０又は配列番号４２から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴが配列番号２であり、前記非Ｔ７オリゴが配列番号２４であり、前記方法は、場合によってはブロッカーオリゴ配列番号２９、トーチオリゴ配列番号５４、伸長オリゴ配列番号４４、標的捕捉オリゴ配列番号６９の使用を含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴ、配列番号７３の使用を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記増幅された核酸の検出が実時間で行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸が、近縁のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓの存在下で特異的に検出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
検出カットオフが設定され、それによってＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ核酸、及びすべてではないが１種類以上の近縁のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓが検出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓリボソーム核酸の８００領域又は１５００領域を増幅するように設計された２種類以上の増幅オリゴヌクレオチドを含む試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを検出するための組成物。
【請求項４４】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２３ｓリボソーム核酸を検出するための１種類以上のプローブを更に含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を検出するための方法であって、該方法は、請求項４３に記載の増幅オリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅アッセイを実施すること、及び増幅された核酸を請求項４４に記載の１種類以上のプローブを用いて検出することを含む、方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１１−５１０６１２（Ｐ２０１１−５１０６１２Ａ）
【公表日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０２２７６（Ｐ２０１０−５０２２７６）
【出願日】平成２０年４月２日（２００８．４．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５９１８６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２２０５３
【国際公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【出願人】（５００５０６５３０）ジェン−プロウブ インコーポレイテッド (58)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２日（２００８．４．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５９１８６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２２０５３
【国際公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【出願人】（５００５０６５３０）ジェン−プロウブ インコーポレイテッド (58)
【Ｆターム（参考）】
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