ＲＮＡの解析方法
【課題】固定液により固定された組織または細胞の遺伝子の発現情報や発現有無を解析することを課題とする。
【解決手段】固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡをマイクロアレイにより解析するＲＮＡの解析方法であって、該ＲＮＡを増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物を解析することを特徴とする、ＲＮＡの解析方法。
【解決手段】固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡをマイクロアレイにより解析するＲＮＡの解析方法であって、該ＲＮＡを増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物を解析することを特徴とする、ＲＮＡの解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡのマイクロアレイによる解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病院や研究機関等で莫大な数の検体が保管されている、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に代表されるような、固定液によって固定された組織、細胞の遺伝子を解析する技術に対して大いに期待が高まっている。特に、ＦＦＰＥ組織については、過去の膨大な疾患データが蓄積されていることから、ＦＦＰＥ組織から遺伝子を抽出し、それらの発現を解析できる技術を確立すれば、長期間保存された組織を用いた遡及的な研究が可能となり、将来的には疾患の治療や予防に大きく貢献できる。
【０００３】
しかしながら、ＦＦＰＥ等の固定組織や固定細胞から抽出したＲＮＡは、一般的な固定条件、保管条件において分解、断片化が進行することから、遺伝子発現解析を行うのが難しいと考えられている。また、固定液として最も一般的に用いられているホルムアルデヒド（ホルマリン）により、ＲＮＡ−ＲＮＡ間、ＲＮＡ−たんぱく質間が架橋されることや、ホルムアルデヒドがＲＮＡに付加、修飾されることがあり、ＲＮＡがそのような状態では、酵素反応および／または化学反応が進行しにくく、遺伝子発現解析が困難となる。よって、分解、断片化が進行したＲＮＡサンプルや、架橋、付加、修飾がなされたＲＮＡサンプルからの遺伝子発現解析を実施する技術が求められている。さらに、そのようなＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析を実施するにあたり、解析する前にＲＮＡサンプルの分解・断片化、あるいは架橋や付加・修飾の程度を確認して品質を判断し、解析の可否を確認することは、正確な遺伝子発現解析ならびにｍｉＲＮＡ発現解析を実施する上で非常に有用であり、それを可能にする技術が求められている。
【０００４】
特許文献１は、標的ポリヌクレオチドを増幅して、その多数のコピーを産生することに関連する方法、組成物およびキットを提供するものである。１回の増幅反応におけるｍＲＮＡの増幅倍数は、標準的に５０〜１００又は２５０倍まで、又は５００〜１０００倍又は５００〜２０００倍以上であり、ナノグラム量未満の総ＲＮＡからできるだけ多くの増幅ＲＮＡを得るものである。特許文献２は、新規なリニアＲＮＡ増幅法について開示されている。５’末端にアンカー配列を有し、かつ３’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有する２本鎖ｃＲＮＡを合成し、当該ｃＤＮＡから前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列依存的にｃＲＮＡを合成し、このｃＲＮＡから前記アンカー配列をプライミングすることによって再度ｃＤＮＡを合成する方法により、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションやセルソーターを利用して得られた少量の細胞・組織から得られる微量のＲＮＡを増幅することで、既存の増幅法の問題点であったｃＤＮＡ合成−ｃＲＮＡ合成サイクルを繰り返すたびに生じるｃＤＮＡおよびｃＲＮＡ上のｍＲＮＡ５’相当領域の欠失を抑制するものである。特許文献１、特許文献２ともに、増幅バイアスのない方法として記載されており、１サイクルあたりのバイアスは従来と比べて小さいと思われるが、少量のＲＮＡからできるだけ多く増幅することに主眼を置いていることから、増幅倍率としてはかなり大きい。したがって、その分だけバイアスが積み重なり、結局大きな増幅バイアスが生じることが否めない。
【０００５】
特許文献３は、例えば分解度等、核酸サンプル中の核酸の品質測定方法を含む、分解核酸サンプル中のターゲットの増幅用組成物および方法、更には分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成するための方法について開示されている。同一遺伝子に由来する異なるサイズのアンプリコン（増幅産物）の増幅効率を尺度とし、サンプルが分解するにつれて、サイズの大きなアンプリコンの増幅効率が低下することから品質を評価するものである。本方法は１０〜２０数種の遺伝子について、それぞれ複数のサイズのＰＣＲを行うものである。ＲＮＡの分解が進んでいる場合、ＰＣＲのプローブサイズが大きいものほど増幅されないことから、ある程度分解度を確認することはできると考えられるが、ＲＮＡ１サンプルあたり延べ数十種の遺伝子をＰＣＲ増幅する必要があるため、本方式を実際に行うのは困難と考えられる。
【０００６】
特許文献４には、分解していない状態では長鎖分画に含まれるＲＮＡの塩基配列を元にして設計した分解指標核酸プローブを核酸アレイに搭載し、トータルＲＮＡから短鎖を分画したＲＮＡサンプルを該核酸アレイに対してハイブリダイズさせ、分解指標核酸プローブのシグナルの有無によって、ＲＮＡサンプルの分解度を測定する方法、ならびにＲＮＡの分解度測定用核酸アレイに関する技術が開示されている。しかしながら、当該核酸アレイは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの短鎖ＲＮＡに特化したものであり、遺伝子発現解析への適用は困難であると考えられる。さらに、ＦＦＰＥ等の固定組織や固定細胞からＲＮＡを抽出する場合、細胞や凍結組織から抽出する場合とは異なり、多くのＲＮＡを得られないことがしばしばあるが、そのような状況において、ＲＮＡサンプルの品質確認のためだけに数〜数十μｇという大量のサンプルを使って実験を行うのは非現実的であり、コスト面からも決して好ましい方法とはいえない。
【０００７】
特許文献５には、核酸の断片化レベルを測定する方法に関する記載がある。当該特許文献の出願人は、ＲＮＡサンプルに含まれる２種のリボソームＲＮＡ（１８Ｓ、２８Ｓ）の量をそれぞれ測定し、２８Ｓ／１８Ｓの比から分析可能か否かを判定するキットを販売している。ＲＮＡが分解するとき、先ず２８Ｓが分解し、次いで１８Ｓが分解すると言われており、当該キットにおいては、２８Ｓ／１８Ｓが０．１以下の場合、ＲＮＡの品質が悪いと判定する。しかしながら、固定液により固定された組織、細胞から抽出されるＲＮＡは、一般的に固定の際にＲＮＡが分解し、さらに固定組織、細胞は常温保管が一般的であることから、経年につれてさらにＲＮＡが分解する。したがって、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から抽出したＲＮＡは、上記２種のリボゾームＲＮＡが検出されないことが少なからずあり、上記の基準でＲＮＡサンプルの品質を判定した場合、大半のサンプルが解析できないとみなされてしまう。したがって、上述のような、長期間保存された固定組織、固定細胞を用いて遡及的研究を実施するにあたり、当該キットを使用するのは極めて困難である。
【０００８】
その他、キャピラリー電気泳動システム（アジレント社バイオアナライザ）を用いる場合に、ＲＮＡ分解の指標として、アジレント社が開発した測定基準であるＲＩＮ（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）が算出される。ＲＩＮは、電気泳動したＲＮＡサンプル全体のエレクトロフェログラムをベースに算定され、その値は０〜１０の範囲である（非特許文献１）。バイオアナライザを使用した場合において、ＲＩＮはＲＮＡの品質を示す一般的な指標となっている。しかしながら、固定組織、固定細胞から抽出したＲＮＡをバイオアナライザで分析したとき、そのエレクトロフェログラムが明らかに異なり、分解挙動が様々であるＲＮＡにおいて、ＲＩＮの値は２〜３の間でほとんど変わらないことから、ＲＩＮは実際のＲＮＡの状態を必ずしも反映できていない可能性があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００６−５２０６０３号公報
【特許文献２】特開２００５−２２４１７２号公報
【特許文献３】特表２００８−５４１６９９号公報
【特許文献４】特開２００８−３５７７９号公報
【特許文献５】特開２００８−４３３３２
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ａ，Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｏ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｓ，Ｓａｌｏｗｓｋｙ Ｒ，Ｌｅｉｂｅｒ Ｍ，Ｇａｓｓｍａｎｎ Ｍ，Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ Ｓ，Ｍｅｎｚｅｌ Ｗ，Ｇｒａｎｚｏｗ Ｍ，Ｒａｇｇ Ｔ：Ｔｈｅ ＲＩＮ：ａｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ ｆｏｒ ａｓｓｉｇｎｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｖａｌｕｅｓ ｔｏ ＲＮＡ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ；ＢＭＣ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：３（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡをマイクロアレイ解析するとき、通常の増幅方法は、ＲＮＡの状態によらず、できるだけ多くの増幅産物を得ることを主眼に置いて、増幅倍率の高い手法を用いてサンプルを処理していた。その結果、得られた増幅産物をマイクロアレイで解析すると、増幅バイアスが原因と考えられる、解析結果の再現性の低さが問題となっていた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題に鑑みて、本発明者らは鋭意検討した結果、固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡをマイクロアレイにより遺伝子発現解析を行うにあたり、当該ＲＮＡを増幅するとき、その増幅倍率をもとの２〜２０倍とすれば、増幅によるバイアスを抑えられ、もとのＲＮＡの存在量に見合った妥当性の高いデータが得られることを見出し、またデータの再現性が高いことを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は次の（１）〜（５）で構成される。
【００１４】
（１）固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡをマイクロアレイにより解析するＲＮＡの解析方法であって、該ＲＮＡを増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物を解析することを特徴とする、ＲＮＡの解析方法。
【００１５】
（２）前記増幅産物がアンチセンス鎖ＲＮＡである、（１）に記載のＲＮＡの解析方法。
【００１６】
（３）前記固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡについて、該ＲＮＡ分子量分布における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ量の比率を確認する工程を含む、（１）または（２）に記載のＲＮＡの解析方法。
【００１７】
（４）固定液により固定された組織または細胞が、パラフィン包埋またはＯＣＴコンパウンド包埋されてなる、（１）〜（３）のいずれかに記載のＲＮＡサンプルの解析方法。
【００１８】
（５）固定液がホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む、（１）〜（４）のいずれかに記載のＲＮＡサンプルの解析方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のＲＮＡの解析方法により、固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡについて、もとの遺伝子の存在量を正確に反映したマイクロアレイ解析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】マウス小脳、肝臓のＦＦＰＥ組織からのマイクロアレイによる発現解析を２回行い、得られた各遺伝子のシグナル強度について、両者の小脳／肝臓の比をプロットした散布図を示す。
【図２】マウス小脳、肝臓の凍結組織およびＦＦＰＥ組織からのマイクロアレイによる発現解析を行い、得られた各遺伝子のシグナル強度について、両者の小脳／肝臓の比をプロットした散布図を示す。
【図３】各種ＲＮＡの１０００〜４０００ヌクレオチドの存在割合と増幅倍率についてプロットした図を示す。
【図４】各種ＲＮＡの１０００〜４０００ヌクレオチドの存在割合と増幅倍率についてプロットした図を示す。
【図５】各種分解ＲＮＡモデルの電気泳動パターンを示す。
【図６】各種ＲＮＡのＲＩＮと増幅量についてプロットした図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に、本発明をさらに具体的に説明する。
【００２２】
本発明は固定液により固定された組織または細胞（以下、固定組織または細胞という）から抽出されたＲＮＡをマイクロアレイによって解析する方法に関する。該ＲＮＡの抽出方法としては特に制限はなく、例えば、“ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（ＴＭ） Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＦＦＰＥ”（Ａｍｂｉｏｎ社製）、“ＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ”（Ｑｉａｇｅｎ社製）、“ＩＳＯＧＥＮ ＰＢ Ｋｉｔ”（ニッポンジーン株式会社製）、“ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（Ｎｏｒｇｅｎ社製）、 “ＰｕｒｅＬｉｎｋ（ＴＭ） ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、“Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ”（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）等のホルマリン固定パラフィン包埋組織用ＲＮＡ抽出キットを好適に用いることができる。
【００２３】
本発明のマイクロアレイ解析で用いられるマイクロアレイとしては、市販のマイクロアレイであれば特に制限はない。すなわち、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ステンレス、金（めっき）などの金属類、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴムなどの高分子材料からなる基板に、選択結合性物質が結合されてなるマイクロアレイを用いた解析を行う際に利用できる。ここで選択結合性物質とは、ＲＮＡと直接的又は間接的に選択的に結合しうる物質をいう。その例として、核酸または他の抗原性化合物が挙げられる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）などを含む。他の抗原性化合物としては、低分子化合物を含む。特に好ましい選択結合性物質は核酸である。このような選択結合性物質は、市販のものでもよいし、あるいは、合成したもの、生体組織又は細胞などの天然源から調製したものでもよい。
【００２４】
本発明で用いられるマイクロアレイの好ましい例としては、基板表面に凹凸部を具備していてもよく、さらに凸部の上面にカバーが設けられていてもよい。このとき、カバーには、空隙に連通する１つ以上の貫通孔を備えることが好ましい。この孔は、核酸溶液、結合用バッファーなどの液体を注入するためのものであり、また同時に、基板内部の圧力を大気圧に保持するためのものでもある。貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３〜６個とすることにより、検体溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、上記のようなカバーの製造方法は特に限定されず、例えば、樹脂の場合は射出成形法、ホットエンボス法、削り出しの方法等、ガラスやセラミックの場合はサンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスで使用される方法等が好ましく用いられる。さらに、マイクロアレイとカバーの間の空隙に微粒子を封入することで、空隙に検体溶液をアプライし検体溶液に振動を伝播させた際に、封入した微粒子が液中で激しく動き回る。その結果、攪拌効率が著しく高くなり、ハイブリダイゼーションの反応促進効果がもたらされるため好ましい。ここで、微粒子の材質は特に限定されないが、例えばガラス、セラミックス（例えばイットリア安定化ジルコニア）、金属類(例えばステンレス)、ポリマー（例えばナイロン、ポリスチレン）、磁性体などが好適に用いられる。中でも、物理的、化学的に安定であり、かつ比重が大きいことから、セラミックスの微粒子が好ましく用いられる。さらに、基板を回転させて重力方向に微粒子を落下させる方法や、基板を振盪させる方法、磁性微粒子を用いて磁力により微粒子を移動させる方法などを併用することで、より一層攪拌効率が向上する。
【００２５】
本発明においては、前記の通り固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡを、増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物をマイクロアレイ解析することを特徴としている。増幅倍率が２倍に満たない増幅産物しか得られないようなＲＮＡは、ＲＮＡの分解、断片化が激しく、ＲＮＡ鎖長が非常に短くなっているため、あるいはＲＮＡ分子間あるいはＲＮＡとタンパク質間で生じる架橋や、固定の際にホルムアルデヒド等の固定液由来物質がＲＮＡに結合することで生じる付加・修飾物の影響で、増幅反応が阻害されるため、増幅しない、あるいは増幅反応が不十分となることが考えられ、その結果として正確なマイクロアレイ解析ができないため、好ましくない。また、増幅産物が２０倍を超える増幅倍率である場合、分解等の影響が少ないＲＮＡは増幅しやすい一方、分解がかなり進行したＲＮＡはほとんど増幅しないといった、いわゆる増幅バイアスが顕著に現れる可能性が高いため、好ましくない。
【００２６】
本発明においてマイクロアレイ解析に供される増幅産物としては、ＲＴ−ＰＣＲ等によって得られるＤＮＡであってもＲＮＡポリメラーゼ等によって合成されたＲＮＡであってもよいが、本発明においてはＲＮＡであることが好ましい。また、増幅産物をＲＮＡとする場合、センス鎖ＲＮＡでも、アンチセンス鎖ＲＮＡでもよく、特に限定されないが、既存のマイクロアレイの大半は、搭載されているプローブがアンチセンス鎖ＲＮＡに対応しているため、既存のマイクロアレイを用いる場合、アンチセンス鎖ＲＮＡとして増幅するのが好ましい。
【００２７】
固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡを増幅する方法としては、各社から上市されているＦＦＰＥに対応する増幅用キットを用いればよく、例えば“ＥｘｐｒｅｓｓＡｒｔ ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（ＡｍｐＴｅｃ）、“ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ ＦＦＰＥ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２”（ＮｕＧｅｎ）等が好ましく利用される。また、“ＳｅｎｓｅＡＭＰ Ｐｌｕｓ”、“ＲｕｍｐＵｐ”、“ＲｕｍｐＵｐ Ｐｌｕｓ”（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ）を用いてセンス鎖ＲＮＡを合成し、それから当業者に公知の方法でアンチセンス鎖ＲＮＡを合成することも好ましい。このとき、増幅倍率が２〜２０倍とする方法としては、ＲＮＡの増幅に使用する酵素やプライマー、基質等の濃度を増減させることで、試薬の組成を最適化したり、反応時間を調整したりすることで対応できる。例えば、比較的増幅倍率の大きい試薬を用いて固定組織または細胞から抽出したＲＮＡサンプルを増幅する場合、反応時間を定められた時間より短くするとよい。また、増幅回数は１回とすることが好ましい。増幅反応を２回以上繰り返すと、１回目の増幅により増幅産物にわずかでもバイアスが生じた場合、２回目以降そのバイアスが際立つことになる場合がある。
【００２８】
前記増幅産物をマイクロアレイ解析する場合、増幅産物を蛍光標識する必要がある。蛍光標識は、マイクロアレイによるハイブリダイゼーション反応の前に行ってもよいし、ハイブリダイゼーションの後に行ってもよい。増幅反応の際に用いるヌクレオチド３リン酸（ＮＴＰ）（アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、グアニジン３リン酸（ＧＴＰ）、シチジン３リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン３リン酸（ＵＴＰ））の一部、例えばＵＴＰの一部にアミノアリル基やビオチンを付加させたものを用いて、増幅産物にアミノアリル基やビオチンといった反応基を導入することで、増幅産物が容易に蛍光標識できるため好ましい。アミノアリル基を導入した場合、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を末端に持つ蛍光色素と容易にカップリング反応する。ここで用いられる蛍光色素としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｈｙｐｅｒ５（ＧＥヘルスケア）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）等が挙げられる。また、アミノアリル基などの反応基を導入せず、増幅したＲＮＡを直接蛍光標識する試薬を使用してもよい。
【００２９】
前記増幅産物を蛍光標識したサンプルは、マイクロアレイに固定化された選択結合性物質との結合反応に供される。前記増幅産物とマイクロアレイに固定化された選択結合性物質を結合させる方法としては、当業者に公知の方法が採用され、特に選択結合性物質が核酸である場合、当業者に公知のハイブリダイゼーション方法によって結合させることができる。また、核酸と選択結合性物質を結合させる場合の反応液についても、当業者に公知の組成が採用され、特に選択結合性物質が核酸である場合、当業者に公知のハイブリダイゼーション緩衝液を使用することができる。また、マイクロアレイに固定化された選択結合性物質と結合した前記増幅産物の核酸量を検出する方法としては、当業者に公知の蛍光スキャナー装置により、核酸に標識した蛍光の強度を読み取ることで検出・測定することができる。
【００３０】
また本発明者らは、後述の実施例において示されるとおり、固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡにおいて、該ＲＮＡ分子量分布における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ量の比率を確認する工程により、ＲＮＡの分解や断片化の指標となる分子量の小さいＲＮＡ、および架橋や付加・修飾等の指標となる分子量の大きなＲＮＡの比率が多いＲＮＡサンプルを予め排除し、該ＲＮＡが前記マイクロアレイ解析に適するかどうかを判断可能であることを見いだした。ここでいう「マイクロアレイ解析に適する」とは、マイクロアレイによりＲＮＡの解析を実施した場合、当該サンプルが保有する情報を正確に測定しうる状態のことをいう。上述の通り、ＲＮＡを解析に供する場合、分解、断片化の程度が大きかったり、架橋あるいは付加・修飾物が多く存在したりすると、十分な増幅量が得られなかったり、増幅の際にバイアスが生じたりすることがあり、結果として正確な解析ができない可能性が極めて高い。
【００３１】
固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡにおいて、該ＲＮＡ分子量分布における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ量の比率を確認する方法としては、該ＲＮＡを分子量の大きさで分別して分子量分布を確認し、特定の分子量範囲におけるＲＮＡの存在割合を定量し、当該割合と増幅量の関係から基準値を設定することが好ましい。固定された組織、細胞等から抽出したＲＮＡサンプルを分子量の大きさで分別して分子量分布を確認する手段としては、電気泳動、ゲルろ過、静的光散乱などが挙げられ、電気泳動が好ましく利用される。このとき、一般的に核酸の分析に用いられる手法であれば特に限定されないが、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、チップ電気泳動等が好適に用いられる。ＲＮＡサンプルを電気泳動すると、分子量に応じて分離され、分子量分布が示される。ここでいう分子量とは、ＲＮＡのヌクレオチド単位のことを指し、「ヌクレオチド」（略号は「［ｎｔ］」）と表記する。特定の分子量範囲におけるＲＮＡの存在割合を定量する手段としては、ゲル電気泳動の場合、当業者に公知である各種デンシトメーターやＴｙｐｈｏｏｎ（ＧＥヘルスケア）等のイメージャーを使用してバンド強度を数値化する方法を利用すればよい。また、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（アジレント社）のような電気泳動システムで電気泳動を実施する場合は、専用ソフトウェアに備えられたＳｍｅａｒ解析を行うことにより、特定の分子量範囲におけるＲＮＡの存在割合を求めることができる。
【００３２】
なお、本発明で使用するマイクロアレイによって、本発明の解析に適した１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ量の比率の値は変わりうるが、例えば、東レ株式会社製の“３Ｄ−ｇｅｎｅ（登録商標）”シリーズのマイクロアレイにおいては、固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡにおける１０００〜４０００ヌクレオチドのＲＮＡ量の比率が２０％以上である場合は解析可能と判定することができ、一方、２０％未満の場合は、本発明の解析に供する増幅産物を調製する際の増幅効率が不十分となるため、解析に使用しないことが好ましい。
【００３３】
その他、固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡ中の特定遺伝子の存在有無を検出することで、該ＲＮＡがマイクロアレイによって解析可能か否かを詳細に判定することも好ましい。この操作を行うことで、より高率で解析の可否を判定することができる可能性がある。この場合、ＲＮＡの逆転写酵素反応を行ってｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを鋳型として特定遺伝子をＰＣＲによって増幅し、特定遺伝子の増幅産物が認められた場合に解析可能と判定する。本発明において、特定遺伝子の増幅産物が認められたというとき、ＰＣＲ増幅後のサンプルを電気泳動により評価した際の特定遺伝子に由来するバンド（ピーク）の強さは５０以上であることが好ましい。なお、ここでいう特定遺伝子としては、ハウスキーピング遺伝子、インターナルコントロールと呼ばれる、発現の変動が理論上ないと考えられる遺伝子を選ぶのが好ましく、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、β−アクチン、β２−マイクログロブリン、ヒポキサンチンリボシル転移酵素、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ等が挙げられる。
【００３４】
本発明で使用される固定組織または細胞の固定処理に用いられる固定液は、ホルムアルデヒド溶液、パラホルムアルデヒド溶液、エタノール等のアルコール類、アセトン、クロロホルム等を含む溶液や、ピクリン酸、重クロム酸カリウム等の酸を含む固定液、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛等の金属を含む溶液等が好適に使用される。ホルムアルデヒド溶液は、市販のホルマリン（ホルムアルデヒド濃度３７％）を水で希釈したものを使用してもよいし、水で希釈した溶液のｐＨを炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等で中性に調整したものや、リン酸緩衝液で希釈してｐＨを中性に調整したものを使用することも好ましい。なお、ホルムアルデヒド溶液中のホルムアルデヒド含量は、１〜３０％が好ましく、２〜２０％がより好ましい。
【００３５】
また、前記固定組織または細胞はパラフィンで包埋されていてもよい。固定組織または細胞をパラフィン包理する場合、当業者に公知である一般的な手法で操作すればよい。すなわち、固定組織または細胞をアルコールで置換して脱水し、次いでキシレン、ベンゼン等で置換した後、熱して液化したパラフィンを流し入れた型枠に組織、細胞を入れて包埋し、パラフィンブロックとする。なお、パラフィン包埋した組織、細胞からＲＮＡを抽出する際は、回転式ミクロトーム、滑走式ミクロトーム等のミクロトームを用いて薄切したものを使用する。そのとき、薄切片の厚さは特に限定されないが、１〜１００μｍが好ましく、２〜５０μｍがより好ましい。その他、パラフィンの代わりに、主に凍結組織切片作製に用いられるＯＣＴ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）コンパウンドを用いてもよい。
【実施例】
【００３６】
本発明を以下の参考例、実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３７】
参考例１
（ＲＮＡの蛍光標識操作における収量確認）
“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標） Ｍｏｕｓｅ ２４ｋ ｃｈｉｐ”（東レ株式会社）を使用してマイクロアレイ解析を行う場合、蛍光標識されたアンチセンス鎖ＲＮＡ（ａＲＮＡ）を１μｇ必要とする。そこで、１μｇ以上の蛍光標識ａＲＮＡを得るための条件について検討した。マウス小脳凍結組織から抽出したＲＮＡを増幅し、ａＲＮＡを５０μｇ合成した。なお、ａＲＮＡ合成におけるインビトロ転写（ＩＶＴ）反応の際に用いるＮＴＰ混合物（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）に、アミノアリル（ＡＡ）基を付加したＵＴＰ（ＡＡ−ＵＴＰ）を添加することで、合成ａＲＮＡにＡＡ基を導入した。合成したａＲＮＡ１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇにＣｙ５（ＧＥヘルスケア）を標識する操作を各３回行った。標識後の回収量を表１に示す。マイクロアレイにより網羅的な遺伝子解析を行う際に最低限必要となる１μｇの蛍光標識ａＲＮＡを確実に回収するには、未標識の増幅ａＲＮＡが３μｇ以上必要であることが示された。
【００３８】
【表１】
【００３９】
実施例１
（固定組織からのＲＮＡ抽出）
マウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）小脳および肝臓を摘出し、１０％リン酸緩衝ホルマリン溶液（ホルムアルデヒド４％）に２日間、室温で浸漬して固定後、パラフィン包埋してＦＦＰＥブロックを作製した。各ＦＦＰＥブロックから、ミクロトームを用いて１０μｍ厚の薄切片をそれぞれ採取し、小脳は５枚、肝臓は２枚をそれぞれ１．５ｍＬのチューブに入れた。そこにキシレン１ｍＬを加えて攪拌し、パラフィンを溶解させた。１６，０００×ｇで５分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないようにキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて攪拌し、１６，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないようにエタノールを十分に除去する操作を２回行った。チューブの蓋を開けた状態にして約１０分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加して組織を懸濁させ、３７℃で１６時間静置した。１６，０００×ｇで２分間遠心して残渣を除いた後、シリカカラムを用いてＲＮＡを精製した。収量および純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）により測定した結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
（ＲＮＡの増幅）
抽出したマウス小脳、肝臓のＲＮＡ１μｇから、Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成、Ｓｅｃｏｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成を行った。カラムを用いて合成したｃＤＮＡを精製した。続いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）を行い、ａＲＮＡの増幅反応を行った。なお、本反応の際、ＡＡ−ＵＴＰを用いて増幅ａＲＮＡにアミノアリル基を導入した。カラムを用いて増幅したａＲＮＡを精製し、分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）により収量を求め、増幅倍率を算定した結果を表３に示す。増幅倍率は、すべて２〜２０倍の範囲内であった。
【００４２】
（増幅ＲＮＡの蛍光標識、フラグメンテーション）
上記で増幅したａＲＮＡに蛍光色素をカップリングさせた。遠心濃縮機（ＭＶ−１００（トミー精工））を用いて各増幅ａＲＮＡ溶液を濃縮し、約１μＬとした。そこに３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のキットに添付のＳｏｄｉｕｍ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒを５ｍＬ添加してピペッティングにより攪拌し、さらにＤＭＳＯに溶解させたＣｙ５−ＮＨＳ（ＧＥヘルスケア）を５μＬ加えてピペッティングにより攪拌して、４０℃で１時間インキュベートすることでカップリング反応させた。各反応溶液をゲルろ過スピンカラム（バイオラッド）を用いて未反応のＣｙ５を除去、精製した後、ヌクレアーゼフリーの水で３２μＬにメスアップした。そこに３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のキットに添付の５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをそれぞれ８μＬ加え、軽くピペッティングして攪拌し、９４℃で１５分間処理した。各サンプルをクラッシュアイスで３分間急冷し、マイクロコンＹＭ−１０（ミリポア社）で精製した。
【００４３】
（マイクロアレイ解析）
標識、精製後のａＲＮＡを、以下の操作によりマイクロアレイ解析を行った。各１０００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で１６μＬに調製し、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ａを２μＬ加えて、９５℃で５分間熱処理した。クラッシュアイスで３分間急冷した後、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂを２３２μＬ加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、２５０μＬの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ株式会社）に２１０μＬアプライした。カバーの孔４箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。チャンバー庫内の温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００４４】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、分析用チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち、１７５０個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。有効スポット数を表３に示す。同一組織の有効スポットのバラつきが小さいことが示された。また、２回の実験における小脳、肝臓の各遺伝子のシグナルの比（小脳／肝臓）より作成した散布図を図１に示す。この結果より、２回の実験の相関が高いことが示された。
【００４５】
【表３】
【００４６】
実施例２
（固定組織からのＲＮＡ抽出）
マウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）小脳および肝臓を摘出し、二分割して一方は液体窒素で凍結し、もう一方は１０％リン酸緩衝ホルマリン溶液（ホルムアルデヒド４％）に２日間、室温で浸漬して固定後、パラフィン包埋してＦＦＰＥブロックを作製した。各ＦＦＰＥブロックから、ミクロトームを用いて１０μｍ厚の薄切片をそれぞれ１０枚採取し、１．５ｍＬのチューブに入れた。そこにキシレン１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、パラフィンを溶解させた。１６，０００×ｇで５分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないよう注意深くキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、１６，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないよう注意深くエタノールを除去する操作を繰り返した。チューブの蓋を開けて約１０分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加して組織を懸濁させ、３７℃で１６時間静置した。１６，０００×ｇで２分間遠心して残渣を除いた後、シリカカラムを用いてＲＮＡを精製した。一方、各凍結組織から、常法によりＲＮＡを抽出、精製した。表４に、収量および純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）により測定した結果を示す。
【００４７】
【表４】
【００４８】
（ＲＮＡの増幅）
抽出したマウス小脳、肝臓のＲＮＡ１μｇから、実施例１と同様にして、アミノアリル化ａＲＮＡ（ＡＡ−ａＲＮＡ）として増幅した。分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）により収量を求め、増幅倍率を算定した結果を表５に示す。増幅倍率は、すべて２〜２０倍の範囲内であった。
【００４９】
（増幅ＲＮＡの蛍光標識、マイクロアレイ解析）
上記で増幅したＦＦＰＥ由来ＲＮＡおよび凍結組織由来ＲＮＡに、実施例１と同様にして蛍光色素をカップリングし、標識反応を行った。標識、精製後のａＲＮＡの収量を表５に示す。
【００５０】
（マイクロアレイ解析）
標識、精製後のａＲＮＡ収量が１０００ｎｇ以上であったサンプル５種（１０サンプル）については、以下の操作によりマイクロアレイ解析を行った。各１０００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で１６μＬに調製し、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ａを２μＬ加えて、９５℃で５分間熱処理した。クラッシュアイスで３分間急冷した後、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂを２３２μＬ加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、２５０μＬの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ株式会社）に２１０μＬアプライした。カバーの孔４箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。チャンバー庫内の温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００５１】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、分析用チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち、１７５０個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。それぞれの有効スポット数を表５に示す。また、両者における小脳、肝臓の各遺伝子のシグナルの比（小脳／肝臓）より、共通の有効スポットで散布図を作成したものを図２に示す。凍結組織、ＦＦＰＥそれぞれから抽出したＲＮＡ間の相関がよかったことから、増幅倍率を２〜２０倍の範囲とすれば、両者に高い相関があることが示された。
【００５２】
【表５】
【００５３】
実施例３
（ＦＦＰＥからのＲＮＡ抽出）
作成条件、保存期間の異なるマウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）小脳、肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックを表７のとおり準備した。各ＦＦＰＥブロックから、ミクロトームを用いて１０μｍ厚の薄切片をそれぞれ１０枚採取し、１．５ｍＬのチューブに５枚ずつ入れた。そこにキシレン１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、パラフィンを溶解させた。１６，０００×ｇで５分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないよう注意深くキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、１６，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないよう注意深くエタノールを除去する操作を繰り返した。チューブの蓋を開けて約１０分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加して組織を懸濁させ、３７℃で１６時間静置した。１６，０００×ｇで２分間遠心して残渣を除いた後、シリカカラムを用いてＲＮＡを精製した。収量および純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）により測定した結果、ならびに、サイズが１０００〜４０００ヌクレオチドであるＲＮＡの比率をそれぞれ表６の（ａ）および（ｂ）に示す。
【００５４】
【表６】
【００５５】
（ＲＮＡの増幅）
各ＲＮＡサンプル１μｇを、実施例１と同様にして、アミノアリル化ａＲＮＡ（ＡＡ−ａＲＮＡ）として増幅した。このとき、マウス小脳、肝臓の凍結組織からそれぞれ抽出したＲＮＡも同様にして増幅した。増幅後の収量より算定した増幅倍率を表７に示す。ここで使用するマイクロアレイは、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ株式会社）であることから、参考例１より３μｇ以上の増幅ａＲＮＡが必要であり、ＲＮＡサンプル１μｇから増幅した場合、増幅倍率は３倍以上必要となる。そこで、横軸に１０００〜４０００ヌクレオチドの割合、縦軸に増幅倍率をとり、各サンプルにおける両者の関係をグラフ化して、３μｇ以上得られる分解度について算定した。その結果、図３に示すとおり、ＲＮＡサンプルの１０００〜４０００ヌクレオチドの存在割合が２０％以上の場合、すべてのサンプルで３μｇ以上のａＲＮＡが得られたことから、「１０００〜４０００ヌクレオチドの存在割合が２０％以上」を基準値とした。
【００５６】
（蛍光標識）
上記で３μｇ以上得られたａＲＮＡについて、蛍光色素をカップリングさせた。遠心濃縮機（ＭＶ−１００（トミー精工））を用いて各増幅ａＲＮＡ溶液を濃縮し、約１μＬとした。そこに３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のキットに添付のＳｏｄｉｕｍ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒを５ｍＬ添加してピペッティングにより攪拌し、さらにＤＭＳＯに溶解させたＣｙ５−ＮＨＳ（ＧＥヘルスケア）を加えてピペッティングにより攪拌したものを、４０℃で１時間インキュベートしてカップリング反応させた。各反応溶液をゲルろ過スピンカラム（バイオラッド）を用いて未反応のＣｙ５を除去、精製した後、ヌクレアーゼフリーの水で３２μＬにメスアップした。そこに３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のキットに添付の５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをそれぞれ８μＬ加え、軽くピペッティングして攪拌し、９４℃で１５分間処理した。処理後、各サンプルをクラッシュアイスで３分間急冷し、マイクロコンＹＭ−１０（ミリポア社）で精製した。標識、精製後のａＲＮＡの収量を表７に示す。表７より、上記で設定した基準値の妥当性を判断したところ、すべてのサンプルで増幅前の判定が妥当であることが示された。
【００５７】
（マイクロアレイ解析）
各１０００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で１６μＬに調製し、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ａを２μＬ加えて、９５℃で５分間熱処理した。クラッシュアイスで３分間急冷した後、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂを２３２μＬ加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、２５０μＬの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ株式会社）に２１０μＬアプライした。カバーの孔４箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。チャンバー庫内の温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００５８】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、分析用チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち、１７５０個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。表７の（ａ）および（ｂ）に示すとおり、有効スポット数は概ね同等であり、マイクロアレイ解析に適するかどうかを判定する方法の妥当性が確認された。
【００５９】
【表７】
【００６０】
実施例４
実施例３で設定した基準値に関して、実験の再現性を確認した。マウス小脳、肝臓、腎臓、ラット小脳、肝臓のＦＦＰＥから、それぞれ１０μｍ厚の薄切片を採取して、実施例１と同様にしてＲＮＡを抽出、増幅した。ＲＮＡの収量、純度、および分子量が１０００〜４０００ヌクレオチドであるＲＮＡの比率、および増幅倍率を表８の（ａ）および（ｂ）にそれぞれ示す。その結果、実施例３で設定した基準値、すなわちＲＮＡサンプルの１０００〜４０００ヌクレオチドの存在割合が２０％以上であれば、ほぼ全てのサンプルで増幅倍率は３倍以上であり、逆に当該割合が２０％に満たないサンプルについては、全て増幅倍率が３倍に達しなかった。したがって、実施例３のマイクロアレイ解析に適するかどうかを判定する方法の妥当性が確認された。
【００６１】
【表８】
【００６２】
実施例５
固定された組織から抽出したＲＮＡをさらに分解させて複数の分解パターンを示すサンプルを作製し、実施例３と同様にして基準値を設定した。１０％中性緩衝ホルマリンで１日固定後、パラフィン包埋したラット肝臓のＦＦＰＥ組織ブロックを作製し、厚さ１０μｍの薄切片を切り出した。実施例１と同様にしてＲＮＡを抽出、精製し、分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）により精製したＲＮＡの収量、純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を測定したところ、収量は４．８μｇ、純度（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）は２．０７であった。また、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（アジレント社）のＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏ ｃｈｉｐを用いて電気泳動を行った結果を図５（Ａ）に示す。抽出、精製したＲＮＡを３μｇずつ１．５ｍＬチューブ５本に分注して、ヌクレアーゼフリーの水で３２μＬにメスアップした。そこに３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のキットに添付の５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをそれぞれ８μＬ加え、軽くピペッティングして攪拌し、表２に示す条件で熱処理した。処理後、各サンプルをクラッシュアイスで３分間急冷し、マイクロコンＹＭ−１０（ミリポア社）で精製した。Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（アジレント社）のＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏ ｃｈｉｐを用いて電気泳動を行い、ＲＮＡの分解挙動を観察した。その結果、図５（Ｂ）〜（Ｅ）の通り、熱処理の条件によって分解挙動が異なっていた。また、表９に示すとおり、各ＲＮＡサンプルの１０００〜４０００ヌクレオチドの割合は、分解の進行とともに減少する傾向がみられた。
【００６３】
各種分解ＲＮＡ（サンプルＢ〜Ｅ）および未分解のＲＮＡ（サンプルＡ）それぞれ１μｇから、実施例１と同様にして、実施例１と同様にして、アミノアリル化ａＲＮＡ（ＡＡ−ａＲＮＡ）として増幅した。各ＲＮＡサンプルの収量から算定した増幅倍率を表９に示す。分解の程度が小さいサンプル、すなわち１０００〜４０００ヌクレオチドの割合が多いサンプルほど増幅倍率が高い傾向がみられた。参考例１より、増幅後のＲＮＡが３μｇ以上ある場合を解析可能とする場合、３μｇ以上のＲＮＡが得られたサンプル（１０００〜４０００ヌクレオチドの割合が６３％、４０％、２８％）はマイクロアレイ解析に適する、３μｇ得られなかったサンプル（１０００〜４０００ヌクレオチドの割合が１８％、３％）はマイクロアレイ解析に適さないとそれぞれ判定できた。したがって、分解させたＲＮＡを用いた場合においても、基準値は「１０００〜４０００ヌクレオチドが２０％以上」と設定でき、これは実施例３と同様の基準値であった。
（増幅ＲＮＡの蛍光標識）
上記のすべてのサンプルについて、実施例３と同様にして蛍光標識、フラグメンテーション（断片化）反応を行った。各サンプルの収量を表９に示す。収量が１μｇ以上である場合マイクロアレイ解析に適する、１μｇ未満である場合適さないと判定すると、上記のＲＮＡ増幅後における判定結果とすべて合致した。したがって、分解させたＲＮＡを用いても、同様に基準値を設定できることが示された。
【００６４】
【表９】
【００６５】
比較例１
実施例１と同様のマウス小脳、肝臓のＦＦＰＥから、実施例１と同様にしてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ５０ｎｇから、ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮｕＧｅｎ）を用いて、ｃＤＮＡとして増幅した。増幅後の収量は表１０に示すとおりであり、増幅倍率は１００倍前後であった。それぞれ検体溶液をＦＬ−Ｏｖａｔｉｏｎ ｃＤＮＡ Ｂｉｏｔｉｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｎｕｇｅｎ）で標識、断片化し、各１μｇを“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ株式会社）それぞれ２枚にアプライし、４２℃で１６時間反応させた。反応後、洗浄、乾燥させて、実施例１と同様にして蛍光シグナル値を測定した。その結果、表１０の通り、２回の実験の有効スポットに差異があり、実験再現性に乏しいことが示された。
【００６６】
【表１０】
【００６７】
比較例２
実施例３、４において、ＦＦＰＥから抽出したＲＮＡを、バイオアナライザで電気泳動した際に算定されたＲＩＮと、各ＲＮＡサンプル１μｇから増幅したときの収量の関係について、図６ならびに表１１の（ａ）〜（ｃ）にまとめた。その結果、ＲＩＮと収量の関係には相関関係がみられなかった。さらに、一部のサンプルについては、ＲＩＮを算定できなかったものもあった（表７において“Ｎ／Ａ”と表記）。よって、ＦＦＰＥをはじめとする固定組織や固定細胞から抽出したＲＮＡの場合、それらの品質をＲＩＮで判定するのは困難であることが示された。
【００６８】
【表１１】
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のＲＮＡの解析方法を用いることで、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等、病院や研究機関に莫大な数量が保存されている固定組織または細胞の遺伝子の発現増減や発現有無に関する正確な情報を得ることができ、それらの情報は、医薬品開発や遺伝子検査、遺伝子診断技術等に幅広く活用できる。さらに、解析が困難なサンプルを事前に見極めることにより、試薬等のコスト削減にも結びつくため、産業上非常に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡのマイクロアレイによる解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病院や研究機関等で莫大な数の検体が保管されている、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に代表されるような、固定液によって固定された組織、細胞の遺伝子を解析する技術に対して大いに期待が高まっている。特に、ＦＦＰＥ組織については、過去の膨大な疾患データが蓄積されていることから、ＦＦＰＥ組織から遺伝子を抽出し、それらの発現を解析できる技術を確立すれば、長期間保存された組織を用いた遡及的な研究が可能となり、将来的には疾患の治療や予防に大きく貢献できる。
【０００３】
しかしながら、ＦＦＰＥ等の固定組織や固定細胞から抽出したＲＮＡは、一般的な固定条件、保管条件において分解、断片化が進行することから、遺伝子発現解析を行うのが難しいと考えられている。また、固定液として最も一般的に用いられているホルムアルデヒド（ホルマリン）により、ＲＮＡ−ＲＮＡ間、ＲＮＡ−たんぱく質間が架橋されることや、ホルムアルデヒドがＲＮＡに付加、修飾されることがあり、ＲＮＡがそのような状態では、酵素反応および／または化学反応が進行しにくく、遺伝子発現解析が困難となる。よって、分解、断片化が進行したＲＮＡサンプルや、架橋、付加、修飾がなされたＲＮＡサンプルからの遺伝子発現解析を実施する技術が求められている。さらに、そのようなＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析を実施するにあたり、解析する前にＲＮＡサンプルの分解・断片化、あるいは架橋や付加・修飾の程度を確認して品質を判断し、解析の可否を確認することは、正確な遺伝子発現解析ならびにｍｉＲＮＡ発現解析を実施する上で非常に有用であり、それを可能にする技術が求められている。
【０００４】
特許文献１は、標的ポリヌクレオチドを増幅して、その多数のコピーを産生することに関連する方法、組成物およびキットを提供するものである。１回の増幅反応におけるｍＲＮＡの増幅倍数は、標準的に５０〜１００又は２５０倍まで、又は５００〜１０００倍又は５００〜２０００倍以上であり、ナノグラム量未満の総ＲＮＡからできるだけ多くの増幅ＲＮＡを得るものである。特許文献２は、新規なリニアＲＮＡ増幅法について開示されている。５’末端にアンカー配列を有し、かつ３’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有する２本鎖ｃＲＮＡを合成し、当該ｃＤＮＡから前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列依存的にｃＲＮＡを合成し、このｃＲＮＡから前記アンカー配列をプライミングすることによって再度ｃＤＮＡを合成する方法により、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションやセルソーターを利用して得られた少量の細胞・組織から得られる微量のＲＮＡを増幅することで、既存の増幅法の問題点であったｃＤＮＡ合成−ｃＲＮＡ合成サイクルを繰り返すたびに生じるｃＤＮＡおよびｃＲＮＡ上のｍＲＮＡ５’相当領域の欠失を抑制するものである。特許文献１、特許文献２ともに、増幅バイアスのない方法として記載されており、１サイクルあたりのバイアスは従来と比べて小さいと思われるが、少量のＲＮＡからできるだけ多く増幅することに主眼を置いていることから、増幅倍率としてはかなり大きい。したがって、その分だけバイアスが積み重なり、結局大きな増幅バイアスが生じることが否めない。
【０００５】
特許文献３は、例えば分解度等、核酸サンプル中の核酸の品質測定方法を含む、分解核酸サンプル中のターゲットの増幅用組成物および方法、更には分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成するための方法について開示されている。同一遺伝子に由来する異なるサイズのアンプリコン（増幅産物）の増幅効率を尺度とし、サンプルが分解するにつれて、サイズの大きなアンプリコンの増幅効率が低下することから品質を評価するものである。本方法は１０〜２０数種の遺伝子について、それぞれ複数のサイズのＰＣＲを行うものである。ＲＮＡの分解が進んでいる場合、ＰＣＲのプローブサイズが大きいものほど増幅されないことから、ある程度分解度を確認することはできると考えられるが、ＲＮＡ１サンプルあたり延べ数十種の遺伝子をＰＣＲ増幅する必要があるため、本方式を実際に行うのは困難と考えられる。
【０００６】
特許文献４には、分解していない状態では長鎖分画に含まれるＲＮＡの塩基配列を元にして設計した分解指標核酸プローブを核酸アレイに搭載し、トータルＲＮＡから短鎖を分画したＲＮＡサンプルを該核酸アレイに対してハイブリダイズさせ、分解指標核酸プローブのシグナルの有無によって、ＲＮＡサンプルの分解度を測定する方法、ならびにＲＮＡの分解度測定用核酸アレイに関する技術が開示されている。しかしながら、当該核酸アレイは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの短鎖ＲＮＡに特化したものであり、遺伝子発現解析への適用は困難であると考えられる。さらに、ＦＦＰＥ等の固定組織や固定細胞からＲＮＡを抽出する場合、細胞や凍結組織から抽出する場合とは異なり、多くのＲＮＡを得られないことがしばしばあるが、そのような状況において、ＲＮＡサンプルの品質確認のためだけに数〜数十μｇという大量のサンプルを使って実験を行うのは非現実的であり、コスト面からも決して好ましい方法とはいえない。
【０００７】
特許文献５には、核酸の断片化レベルを測定する方法に関する記載がある。当該特許文献の出願人は、ＲＮＡサンプルに含まれる２種のリボソームＲＮＡ（１８Ｓ、２８Ｓ）の量をそれぞれ測定し、２８Ｓ／１８Ｓの比から分析可能か否かを判定するキットを販売している。ＲＮＡが分解するとき、先ず２８Ｓが分解し、次いで１８Ｓが分解すると言われており、当該キットにおいては、２８Ｓ／１８Ｓが０．１以下の場合、ＲＮＡの品質が悪いと判定する。しかしながら、固定液により固定された組織、細胞から抽出されるＲＮＡは、一般的に固定の際にＲＮＡが分解し、さらに固定組織、細胞は常温保管が一般的であることから、経年につれてさらにＲＮＡが分解する。したがって、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から抽出したＲＮＡは、上記２種のリボゾームＲＮＡが検出されないことが少なからずあり、上記の基準でＲＮＡサンプルの品質を判定した場合、大半のサンプルが解析できないとみなされてしまう。したがって、上述のような、長期間保存された固定組織、固定細胞を用いて遡及的研究を実施するにあたり、当該キットを使用するのは極めて困難である。
【０００８】
その他、キャピラリー電気泳動システム（アジレント社バイオアナライザ）を用いる場合に、ＲＮＡ分解の指標として、アジレント社が開発した測定基準であるＲＩＮ（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）が算出される。ＲＩＮは、電気泳動したＲＮＡサンプル全体のエレクトロフェログラムをベースに算定され、その値は０〜１０の範囲である（非特許文献１）。バイオアナライザを使用した場合において、ＲＩＮはＲＮＡの品質を示す一般的な指標となっている。しかしながら、固定組織、固定細胞から抽出したＲＮＡをバイオアナライザで分析したとき、そのエレクトロフェログラムが明らかに異なり、分解挙動が様々であるＲＮＡにおいて、ＲＩＮの値は２〜３の間でほとんど変わらないことから、ＲＩＮは実際のＲＮＡの状態を必ずしも反映できていない可能性があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００６−５２０６０３号公報
【特許文献２】特開２００５−２２４１７２号公報
【特許文献３】特表２００８−５４１６９９号公報
【特許文献４】特開２００８−３５７７９号公報
【特許文献５】特開２００８−４３３３２
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ａ，Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｏ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｓ，Ｓａｌｏｗｓｋｙ Ｒ，Ｌｅｉｂｅｒ Ｍ，Ｇａｓｓｍａｎｎ Ｍ，Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ Ｓ，Ｍｅｎｚｅｌ Ｗ，Ｇｒａｎｚｏｗ Ｍ，Ｒａｇｇ Ｔ：Ｔｈｅ ＲＩＮ：ａｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ ｆｏｒ ａｓｓｉｇｎｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｖａｌｕｅｓ ｔｏ ＲＮＡ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ；ＢＭＣ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：３（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡをマイクロアレイ解析するとき、通常の増幅方法は、ＲＮＡの状態によらず、できるだけ多くの増幅産物を得ることを主眼に置いて、増幅倍率の高い手法を用いてサンプルを処理していた。その結果、得られた増幅産物をマイクロアレイで解析すると、増幅バイアスが原因と考えられる、解析結果の再現性の低さが問題となっていた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題に鑑みて、本発明者らは鋭意検討した結果、固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡをマイクロアレイにより遺伝子発現解析を行うにあたり、当該ＲＮＡを増幅するとき、その増幅倍率をもとの２〜２０倍とすれば、増幅によるバイアスを抑えられ、もとのＲＮＡの存在量に見合った妥当性の高いデータが得られることを見出し、またデータの再現性が高いことを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は次の（１）〜（５）で構成される。
【００１４】
（１）固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡをマイクロアレイにより解析するＲＮＡの解析方法であって、該ＲＮＡを増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物を解析することを特徴とする、ＲＮＡの解析方法。
【００１５】
（２）前記増幅産物がアンチセンス鎖ＲＮＡである、（１）に記載のＲＮＡの解析方法。
【００１６】
（３）前記固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡについて、該ＲＮＡ分子量分布における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ量の比率を確認する工程を含む、（１）または（２）に記載のＲＮＡの解析方法。
【００１７】
（４）固定液により固定された組織または細胞が、パラフィン包埋またはＯＣＴコンパウンド包埋されてなる、（１）〜（３）のいずれかに記載のＲＮＡサンプルの解析方法。
【００１８】
（５）固定液がホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む、（１）〜（４）のいずれかに記載のＲＮＡサンプルの解析方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のＲＮＡの解析方法により、固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡについて、もとの遺伝子の存在量を正確に反映したマイクロアレイ解析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】マウス小脳、肝臓のＦＦＰＥ組織からのマイクロアレイによる発現解析を２回行い、得られた各遺伝子のシグナル強度について、両者の小脳／肝臓の比をプロットした散布図を示す。
【図２】マウス小脳、肝臓の凍結組織およびＦＦＰＥ組織からのマイクロアレイによる発現解析を行い、得られた各遺伝子のシグナル強度について、両者の小脳／肝臓の比をプロットした散布図を示す。
【図３】各種ＲＮＡの１０００〜４０００ヌクレオチドの存在割合と増幅倍率についてプロットした図を示す。
【図４】各種ＲＮＡの１０００〜４０００ヌクレオチドの存在割合と増幅倍率についてプロットした図を示す。
【図５】各種分解ＲＮＡモデルの電気泳動パターンを示す。
【図６】各種ＲＮＡのＲＩＮと増幅量についてプロットした図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に、本発明をさらに具体的に説明する。
【００２２】
本発明は固定液により固定された組織または細胞（以下、固定組織または細胞という）から抽出されたＲＮＡをマイクロアレイによって解析する方法に関する。該ＲＮＡの抽出方法としては特に制限はなく、例えば、“ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（ＴＭ） Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＦＦＰＥ”（Ａｍｂｉｏｎ社製）、“ＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ”（Ｑｉａｇｅｎ社製）、“ＩＳＯＧＥＮ ＰＢ Ｋｉｔ”（ニッポンジーン株式会社製）、“ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（Ｎｏｒｇｅｎ社製）、 “ＰｕｒｅＬｉｎｋ（ＴＭ） ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、“Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ”（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）等のホルマリン固定パラフィン包埋組織用ＲＮＡ抽出キットを好適に用いることができる。
【００２３】
本発明のマイクロアレイ解析で用いられるマイクロアレイとしては、市販のマイクロアレイであれば特に制限はない。すなわち、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ステンレス、金（めっき）などの金属類、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴムなどの高分子材料からなる基板に、選択結合性物質が結合されてなるマイクロアレイを用いた解析を行う際に利用できる。ここで選択結合性物質とは、ＲＮＡと直接的又は間接的に選択的に結合しうる物質をいう。その例として、核酸または他の抗原性化合物が挙げられる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）などを含む。他の抗原性化合物としては、低分子化合物を含む。特に好ましい選択結合性物質は核酸である。このような選択結合性物質は、市販のものでもよいし、あるいは、合成したもの、生体組織又は細胞などの天然源から調製したものでもよい。
【００２４】
本発明で用いられるマイクロアレイの好ましい例としては、基板表面に凹凸部を具備していてもよく、さらに凸部の上面にカバーが設けられていてもよい。このとき、カバーには、空隙に連通する１つ以上の貫通孔を備えることが好ましい。この孔は、核酸溶液、結合用バッファーなどの液体を注入するためのものであり、また同時に、基板内部の圧力を大気圧に保持するためのものでもある。貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３〜６個とすることにより、検体溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、上記のようなカバーの製造方法は特に限定されず、例えば、樹脂の場合は射出成形法、ホットエンボス法、削り出しの方法等、ガラスやセラミックの場合はサンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスで使用される方法等が好ましく用いられる。さらに、マイクロアレイとカバーの間の空隙に微粒子を封入することで、空隙に検体溶液をアプライし検体溶液に振動を伝播させた際に、封入した微粒子が液中で激しく動き回る。その結果、攪拌効率が著しく高くなり、ハイブリダイゼーションの反応促進効果がもたらされるため好ましい。ここで、微粒子の材質は特に限定されないが、例えばガラス、セラミックス（例えばイットリア安定化ジルコニア）、金属類(例えばステンレス)、ポリマー（例えばナイロン、ポリスチレン）、磁性体などが好適に用いられる。中でも、物理的、化学的に安定であり、かつ比重が大きいことから、セラミックスの微粒子が好ましく用いられる。さらに、基板を回転させて重力方向に微粒子を落下させる方法や、基板を振盪させる方法、磁性微粒子を用いて磁力により微粒子を移動させる方法などを併用することで、より一層攪拌効率が向上する。
【００２５】
本発明においては、前記の通り固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡを、増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物をマイクロアレイ解析することを特徴としている。増幅倍率が２倍に満たない増幅産物しか得られないようなＲＮＡは、ＲＮＡの分解、断片化が激しく、ＲＮＡ鎖長が非常に短くなっているため、あるいはＲＮＡ分子間あるいはＲＮＡとタンパク質間で生じる架橋や、固定の際にホルムアルデヒド等の固定液由来物質がＲＮＡに結合することで生じる付加・修飾物の影響で、増幅反応が阻害されるため、増幅しない、あるいは増幅反応が不十分となることが考えられ、その結果として正確なマイクロアレイ解析ができないため、好ましくない。また、増幅産物が２０倍を超える増幅倍率である場合、分解等の影響が少ないＲＮＡは増幅しやすい一方、分解がかなり進行したＲＮＡはほとんど増幅しないといった、いわゆる増幅バイアスが顕著に現れる可能性が高いため、好ましくない。
【００２６】
本発明においてマイクロアレイ解析に供される増幅産物としては、ＲＴ−ＰＣＲ等によって得られるＤＮＡであってもＲＮＡポリメラーゼ等によって合成されたＲＮＡであってもよいが、本発明においてはＲＮＡであることが好ましい。また、増幅産物をＲＮＡとする場合、センス鎖ＲＮＡでも、アンチセンス鎖ＲＮＡでもよく、特に限定されないが、既存のマイクロアレイの大半は、搭載されているプローブがアンチセンス鎖ＲＮＡに対応しているため、既存のマイクロアレイを用いる場合、アンチセンス鎖ＲＮＡとして増幅するのが好ましい。
【００２７】
固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡを増幅する方法としては、各社から上市されているＦＦＰＥに対応する増幅用キットを用いればよく、例えば“ＥｘｐｒｅｓｓＡｒｔ ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（ＡｍｐＴｅｃ）、“ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ ＦＦＰＥ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２”（ＮｕＧｅｎ）等が好ましく利用される。また、“ＳｅｎｓｅＡＭＰ Ｐｌｕｓ”、“ＲｕｍｐＵｐ”、“ＲｕｍｐＵｐ Ｐｌｕｓ”（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ）を用いてセンス鎖ＲＮＡを合成し、それから当業者に公知の方法でアンチセンス鎖ＲＮＡを合成することも好ましい。このとき、増幅倍率が２〜２０倍とする方法としては、ＲＮＡの増幅に使用する酵素やプライマー、基質等の濃度を増減させることで、試薬の組成を最適化したり、反応時間を調整したりすることで対応できる。例えば、比較的増幅倍率の大きい試薬を用いて固定組織または細胞から抽出したＲＮＡサンプルを増幅する場合、反応時間を定められた時間より短くするとよい。また、増幅回数は１回とすることが好ましい。増幅反応を２回以上繰り返すと、１回目の増幅により増幅産物にわずかでもバイアスが生じた場合、２回目以降そのバイアスが際立つことになる場合がある。
【００２８】
前記増幅産物をマイクロアレイ解析する場合、増幅産物を蛍光標識する必要がある。蛍光標識は、マイクロアレイによるハイブリダイゼーション反応の前に行ってもよいし、ハイブリダイゼーションの後に行ってもよい。増幅反応の際に用いるヌクレオチド３リン酸（ＮＴＰ）（アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、グアニジン３リン酸（ＧＴＰ）、シチジン３リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン３リン酸（ＵＴＰ））の一部、例えばＵＴＰの一部にアミノアリル基やビオチンを付加させたものを用いて、増幅産物にアミノアリル基やビオチンといった反応基を導入することで、増幅産物が容易に蛍光標識できるため好ましい。アミノアリル基を導入した場合、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を末端に持つ蛍光色素と容易にカップリング反応する。ここで用いられる蛍光色素としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｈｙｐｅｒ５（ＧＥヘルスケア）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）等が挙げられる。また、アミノアリル基などの反応基を導入せず、増幅したＲＮＡを直接蛍光標識する試薬を使用してもよい。
【００２９】
前記増幅産物を蛍光標識したサンプルは、マイクロアレイに固定化された選択結合性物質との結合反応に供される。前記増幅産物とマイクロアレイに固定化された選択結合性物質を結合させる方法としては、当業者に公知の方法が採用され、特に選択結合性物質が核酸である場合、当業者に公知のハイブリダイゼーション方法によって結合させることができる。また、核酸と選択結合性物質を結合させる場合の反応液についても、当業者に公知の組成が採用され、特に選択結合性物質が核酸である場合、当業者に公知のハイブリダイゼーション緩衝液を使用することができる。また、マイクロアレイに固定化された選択結合性物質と結合した前記増幅産物の核酸量を検出する方法としては、当業者に公知の蛍光スキャナー装置により、核酸に標識した蛍光の強度を読み取ることで検出・測定することができる。
【００３０】
また本発明者らは、後述の実施例において示されるとおり、固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡにおいて、該ＲＮＡ分子量分布における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ量の比率を確認する工程により、ＲＮＡの分解や断片化の指標となる分子量の小さいＲＮＡ、および架橋や付加・修飾等の指標となる分子量の大きなＲＮＡの比率が多いＲＮＡサンプルを予め排除し、該ＲＮＡが前記マイクロアレイ解析に適するかどうかを判断可能であることを見いだした。ここでいう「マイクロアレイ解析に適する」とは、マイクロアレイによりＲＮＡの解析を実施した場合、当該サンプルが保有する情報を正確に測定しうる状態のことをいう。上述の通り、ＲＮＡを解析に供する場合、分解、断片化の程度が大きかったり、架橋あるいは付加・修飾物が多く存在したりすると、十分な増幅量が得られなかったり、増幅の際にバイアスが生じたりすることがあり、結果として正確な解析ができない可能性が極めて高い。
【００３１】
固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡにおいて、該ＲＮＡ分子量分布における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ量の比率を確認する方法としては、該ＲＮＡを分子量の大きさで分別して分子量分布を確認し、特定の分子量範囲におけるＲＮＡの存在割合を定量し、当該割合と増幅量の関係から基準値を設定することが好ましい。固定された組織、細胞等から抽出したＲＮＡサンプルを分子量の大きさで分別して分子量分布を確認する手段としては、電気泳動、ゲルろ過、静的光散乱などが挙げられ、電気泳動が好ましく利用される。このとき、一般的に核酸の分析に用いられる手法であれば特に限定されないが、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、チップ電気泳動等が好適に用いられる。ＲＮＡサンプルを電気泳動すると、分子量に応じて分離され、分子量分布が示される。ここでいう分子量とは、ＲＮＡのヌクレオチド単位のことを指し、「ヌクレオチド」（略号は「［ｎｔ］」）と表記する。特定の分子量範囲におけるＲＮＡの存在割合を定量する手段としては、ゲル電気泳動の場合、当業者に公知である各種デンシトメーターやＴｙｐｈｏｏｎ（ＧＥヘルスケア）等のイメージャーを使用してバンド強度を数値化する方法を利用すればよい。また、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（アジレント社）のような電気泳動システムで電気泳動を実施する場合は、専用ソフトウェアに備えられたＳｍｅａｒ解析を行うことにより、特定の分子量範囲におけるＲＮＡの存在割合を求めることができる。
【００３２】
なお、本発明で使用するマイクロアレイによって、本発明の解析に適した１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ量の比率の値は変わりうるが、例えば、東レ株式会社製の“３Ｄ−ｇｅｎｅ（登録商標）”シリーズのマイクロアレイにおいては、固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡにおける１０００〜４０００ヌクレオチドのＲＮＡ量の比率が２０％以上である場合は解析可能と判定することができ、一方、２０％未満の場合は、本発明の解析に供する増幅産物を調製する際の増幅効率が不十分となるため、解析に使用しないことが好ましい。
【００３３】
その他、固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡ中の特定遺伝子の存在有無を検出することで、該ＲＮＡがマイクロアレイによって解析可能か否かを詳細に判定することも好ましい。この操作を行うことで、より高率で解析の可否を判定することができる可能性がある。この場合、ＲＮＡの逆転写酵素反応を行ってｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを鋳型として特定遺伝子をＰＣＲによって増幅し、特定遺伝子の増幅産物が認められた場合に解析可能と判定する。本発明において、特定遺伝子の増幅産物が認められたというとき、ＰＣＲ増幅後のサンプルを電気泳動により評価した際の特定遺伝子に由来するバンド（ピーク）の強さは５０以上であることが好ましい。なお、ここでいう特定遺伝子としては、ハウスキーピング遺伝子、インターナルコントロールと呼ばれる、発現の変動が理論上ないと考えられる遺伝子を選ぶのが好ましく、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、β−アクチン、β２−マイクログロブリン、ヒポキサンチンリボシル転移酵素、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ等が挙げられる。
【００３４】
本発明で使用される固定組織または細胞の固定処理に用いられる固定液は、ホルムアルデヒド溶液、パラホルムアルデヒド溶液、エタノール等のアルコール類、アセトン、クロロホルム等を含む溶液や、ピクリン酸、重クロム酸カリウム等の酸を含む固定液、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛等の金属を含む溶液等が好適に使用される。ホルムアルデヒド溶液は、市販のホルマリン（ホルムアルデヒド濃度３７％）を水で希釈したものを使用してもよいし、水で希釈した溶液のｐＨを炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等で中性に調整したものや、リン酸緩衝液で希釈してｐＨを中性に調整したものを使用することも好ましい。なお、ホルムアルデヒド溶液中のホルムアルデヒド含量は、１〜３０％が好ましく、２〜２０％がより好ましい。
【００３５】
また、前記固定組織または細胞はパラフィンで包埋されていてもよい。固定組織または細胞をパラフィン包理する場合、当業者に公知である一般的な手法で操作すればよい。すなわち、固定組織または細胞をアルコールで置換して脱水し、次いでキシレン、ベンゼン等で置換した後、熱して液化したパラフィンを流し入れた型枠に組織、細胞を入れて包埋し、パラフィンブロックとする。なお、パラフィン包埋した組織、細胞からＲＮＡを抽出する際は、回転式ミクロトーム、滑走式ミクロトーム等のミクロトームを用いて薄切したものを使用する。そのとき、薄切片の厚さは特に限定されないが、１〜１００μｍが好ましく、２〜５０μｍがより好ましい。その他、パラフィンの代わりに、主に凍結組織切片作製に用いられるＯＣＴ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）コンパウンドを用いてもよい。
【実施例】
【００３６】
本発明を以下の参考例、実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３７】
参考例１
（ＲＮＡの蛍光標識操作における収量確認）
“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標） Ｍｏｕｓｅ ２４ｋ ｃｈｉｐ”（東レ株式会社）を使用してマイクロアレイ解析を行う場合、蛍光標識されたアンチセンス鎖ＲＮＡ（ａＲＮＡ）を１μｇ必要とする。そこで、１μｇ以上の蛍光標識ａＲＮＡを得るための条件について検討した。マウス小脳凍結組織から抽出したＲＮＡを増幅し、ａＲＮＡを５０μｇ合成した。なお、ａＲＮＡ合成におけるインビトロ転写（ＩＶＴ）反応の際に用いるＮＴＰ混合物（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）に、アミノアリル（ＡＡ）基を付加したＵＴＰ（ＡＡ−ＵＴＰ）を添加することで、合成ａＲＮＡにＡＡ基を導入した。合成したａＲＮＡ１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇにＣｙ５（ＧＥヘルスケア）を標識する操作を各３回行った。標識後の回収量を表１に示す。マイクロアレイにより網羅的な遺伝子解析を行う際に最低限必要となる１μｇの蛍光標識ａＲＮＡを確実に回収するには、未標識の増幅ａＲＮＡが３μｇ以上必要であることが示された。
【００３８】
【表１】
【００３９】
実施例１
（固定組織からのＲＮＡ抽出）
マウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）小脳および肝臓を摘出し、１０％リン酸緩衝ホルマリン溶液（ホルムアルデヒド４％）に２日間、室温で浸漬して固定後、パラフィン包埋してＦＦＰＥブロックを作製した。各ＦＦＰＥブロックから、ミクロトームを用いて１０μｍ厚の薄切片をそれぞれ採取し、小脳は５枚、肝臓は２枚をそれぞれ１．５ｍＬのチューブに入れた。そこにキシレン１ｍＬを加えて攪拌し、パラフィンを溶解させた。１６，０００×ｇで５分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないようにキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて攪拌し、１６，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないようにエタノールを十分に除去する操作を２回行った。チューブの蓋を開けた状態にして約１０分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加して組織を懸濁させ、３７℃で１６時間静置した。１６，０００×ｇで２分間遠心して残渣を除いた後、シリカカラムを用いてＲＮＡを精製した。収量および純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）により測定した結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
（ＲＮＡの増幅）
抽出したマウス小脳、肝臓のＲＮＡ１μｇから、Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成、Ｓｅｃｏｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成を行った。カラムを用いて合成したｃＤＮＡを精製した。続いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）を行い、ａＲＮＡの増幅反応を行った。なお、本反応の際、ＡＡ−ＵＴＰを用いて増幅ａＲＮＡにアミノアリル基を導入した。カラムを用いて増幅したａＲＮＡを精製し、分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）により収量を求め、増幅倍率を算定した結果を表３に示す。増幅倍率は、すべて２〜２０倍の範囲内であった。
【００４２】
（増幅ＲＮＡの蛍光標識、フラグメンテーション）
上記で増幅したａＲＮＡに蛍光色素をカップリングさせた。遠心濃縮機（ＭＶ−１００（トミー精工））を用いて各増幅ａＲＮＡ溶液を濃縮し、約１μＬとした。そこに３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のキットに添付のＳｏｄｉｕｍ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒを５ｍＬ添加してピペッティングにより攪拌し、さらにＤＭＳＯに溶解させたＣｙ５−ＮＨＳ（ＧＥヘルスケア）を５μＬ加えてピペッティングにより攪拌して、４０℃で１時間インキュベートすることでカップリング反応させた。各反応溶液をゲルろ過スピンカラム（バイオラッド）を用いて未反応のＣｙ５を除去、精製した後、ヌクレアーゼフリーの水で３２μＬにメスアップした。そこに３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のキットに添付の５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをそれぞれ８μＬ加え、軽くピペッティングして攪拌し、９４℃で１５分間処理した。各サンプルをクラッシュアイスで３分間急冷し、マイクロコンＹＭ−１０（ミリポア社）で精製した。
【００４３】
（マイクロアレイ解析）
標識、精製後のａＲＮＡを、以下の操作によりマイクロアレイ解析を行った。各１０００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で１６μＬに調製し、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ａを２μＬ加えて、９５℃で５分間熱処理した。クラッシュアイスで３分間急冷した後、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂを２３２μＬ加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、２５０μＬの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ株式会社）に２１０μＬアプライした。カバーの孔４箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。チャンバー庫内の温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００４４】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、分析用チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち、１７５０個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。有効スポット数を表３に示す。同一組織の有効スポットのバラつきが小さいことが示された。また、２回の実験における小脳、肝臓の各遺伝子のシグナルの比（小脳／肝臓）より作成した散布図を図１に示す。この結果より、２回の実験の相関が高いことが示された。
【００４５】
【表３】
【００４６】
実施例２
（固定組織からのＲＮＡ抽出）
マウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）小脳および肝臓を摘出し、二分割して一方は液体窒素で凍結し、もう一方は１０％リン酸緩衝ホルマリン溶液（ホルムアルデヒド４％）に２日間、室温で浸漬して固定後、パラフィン包埋してＦＦＰＥブロックを作製した。各ＦＦＰＥブロックから、ミクロトームを用いて１０μｍ厚の薄切片をそれぞれ１０枚採取し、１．５ｍＬのチューブに入れた。そこにキシレン１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、パラフィンを溶解させた。１６，０００×ｇで５分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないよう注意深くキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、１６，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないよう注意深くエタノールを除去する操作を繰り返した。チューブの蓋を開けて約１０分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加して組織を懸濁させ、３７℃で１６時間静置した。１６，０００×ｇで２分間遠心して残渣を除いた後、シリカカラムを用いてＲＮＡを精製した。一方、各凍結組織から、常法によりＲＮＡを抽出、精製した。表４に、収量および純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）により測定した結果を示す。
【００４７】
【表４】
【００４８】
（ＲＮＡの増幅）
抽出したマウス小脳、肝臓のＲＮＡ１μｇから、実施例１と同様にして、アミノアリル化ａＲＮＡ（ＡＡ−ａＲＮＡ）として増幅した。分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）により収量を求め、増幅倍率を算定した結果を表５に示す。増幅倍率は、すべて２〜２０倍の範囲内であった。
【００４９】
（増幅ＲＮＡの蛍光標識、マイクロアレイ解析）
上記で増幅したＦＦＰＥ由来ＲＮＡおよび凍結組織由来ＲＮＡに、実施例１と同様にして蛍光色素をカップリングし、標識反応を行った。標識、精製後のａＲＮＡの収量を表５に示す。
【００５０】
（マイクロアレイ解析）
標識、精製後のａＲＮＡ収量が１０００ｎｇ以上であったサンプル５種（１０サンプル）については、以下の操作によりマイクロアレイ解析を行った。各１０００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で１６μＬに調製し、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ａを２μＬ加えて、９５℃で５分間熱処理した。クラッシュアイスで３分間急冷した後、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂを２３２μＬ加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、２５０μＬの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ株式会社）に２１０μＬアプライした。カバーの孔４箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。チャンバー庫内の温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００５１】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、分析用チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち、１７５０個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。それぞれの有効スポット数を表５に示す。また、両者における小脳、肝臓の各遺伝子のシグナルの比（小脳／肝臓）より、共通の有効スポットで散布図を作成したものを図２に示す。凍結組織、ＦＦＰＥそれぞれから抽出したＲＮＡ間の相関がよかったことから、増幅倍率を２〜２０倍の範囲とすれば、両者に高い相関があることが示された。
【００５２】
【表５】
【００５３】
実施例３
（ＦＦＰＥからのＲＮＡ抽出）
作成条件、保存期間の異なるマウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）小脳、肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックを表７のとおり準備した。各ＦＦＰＥブロックから、ミクロトームを用いて１０μｍ厚の薄切片をそれぞれ１０枚採取し、１．５ｍＬのチューブに５枚ずつ入れた。そこにキシレン１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、パラフィンを溶解させた。１６，０００×ｇで５分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないよう注意深くキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、１６，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないよう注意深くエタノールを除去する操作を繰り返した。チューブの蓋を開けて約１０分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加して組織を懸濁させ、３７℃で１６時間静置した。１６，０００×ｇで２分間遠心して残渣を除いた後、シリカカラムを用いてＲＮＡを精製した。収量および純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）により測定した結果、ならびに、サイズが１０００〜４０００ヌクレオチドであるＲＮＡの比率をそれぞれ表６の（ａ）および（ｂ）に示す。
【００５４】
【表６】
【００５５】
（ＲＮＡの増幅）
各ＲＮＡサンプル１μｇを、実施例１と同様にして、アミノアリル化ａＲＮＡ（ＡＡ−ａＲＮＡ）として増幅した。このとき、マウス小脳、肝臓の凍結組織からそれぞれ抽出したＲＮＡも同様にして増幅した。増幅後の収量より算定した増幅倍率を表７に示す。ここで使用するマイクロアレイは、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ株式会社）であることから、参考例１より３μｇ以上の増幅ａＲＮＡが必要であり、ＲＮＡサンプル１μｇから増幅した場合、増幅倍率は３倍以上必要となる。そこで、横軸に１０００〜４０００ヌクレオチドの割合、縦軸に増幅倍率をとり、各サンプルにおける両者の関係をグラフ化して、３μｇ以上得られる分解度について算定した。その結果、図３に示すとおり、ＲＮＡサンプルの１０００〜４０００ヌクレオチドの存在割合が２０％以上の場合、すべてのサンプルで３μｇ以上のａＲＮＡが得られたことから、「１０００〜４０００ヌクレオチドの存在割合が２０％以上」を基準値とした。
【００５６】
（蛍光標識）
上記で３μｇ以上得られたａＲＮＡについて、蛍光色素をカップリングさせた。遠心濃縮機（ＭＶ−１００（トミー精工））を用いて各増幅ａＲＮＡ溶液を濃縮し、約１μＬとした。そこに３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のキットに添付のＳｏｄｉｕｍ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒを５ｍＬ添加してピペッティングにより攪拌し、さらにＤＭＳＯに溶解させたＣｙ５−ＮＨＳ（ＧＥヘルスケア）を加えてピペッティングにより攪拌したものを、４０℃で１時間インキュベートしてカップリング反応させた。各反応溶液をゲルろ過スピンカラム（バイオラッド）を用いて未反応のＣｙ５を除去、精製した後、ヌクレアーゼフリーの水で３２μＬにメスアップした。そこに３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のキットに添付の５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをそれぞれ８μＬ加え、軽くピペッティングして攪拌し、９４℃で１５分間処理した。処理後、各サンプルをクラッシュアイスで３分間急冷し、マイクロコンＹＭ−１０（ミリポア社）で精製した。標識、精製後のａＲＮＡの収量を表７に示す。表７より、上記で設定した基準値の妥当性を判断したところ、すべてのサンプルで増幅前の判定が妥当であることが示された。
【００５７】
（マイクロアレイ解析）
各１０００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で１６μＬに調製し、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ａを２μＬ加えて、９５℃で５分間熱処理した。クラッシュアイスで３分間急冷した後、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂを２３２μＬ加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、２５０μＬの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ株式会社）に２１０μＬアプライした。カバーの孔４箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。チャンバー庫内の温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００５８】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、分析用チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち、１７５０個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。表７の（ａ）および（ｂ）に示すとおり、有効スポット数は概ね同等であり、マイクロアレイ解析に適するかどうかを判定する方法の妥当性が確認された。
【００５９】
【表７】
【００６０】
実施例４
実施例３で設定した基準値に関して、実験の再現性を確認した。マウス小脳、肝臓、腎臓、ラット小脳、肝臓のＦＦＰＥから、それぞれ１０μｍ厚の薄切片を採取して、実施例１と同様にしてＲＮＡを抽出、増幅した。ＲＮＡの収量、純度、および分子量が１０００〜４０００ヌクレオチドであるＲＮＡの比率、および増幅倍率を表８の（ａ）および（ｂ）にそれぞれ示す。その結果、実施例３で設定した基準値、すなわちＲＮＡサンプルの１０００〜４０００ヌクレオチドの存在割合が２０％以上であれば、ほぼ全てのサンプルで増幅倍率は３倍以上であり、逆に当該割合が２０％に満たないサンプルについては、全て増幅倍率が３倍に達しなかった。したがって、実施例３のマイクロアレイ解析に適するかどうかを判定する方法の妥当性が確認された。
【００６１】
【表８】
【００６２】
実施例５
固定された組織から抽出したＲＮＡをさらに分解させて複数の分解パターンを示すサンプルを作製し、実施例３と同様にして基準値を設定した。１０％中性緩衝ホルマリンで１日固定後、パラフィン包埋したラット肝臓のＦＦＰＥ組織ブロックを作製し、厚さ１０μｍの薄切片を切り出した。実施例１と同様にしてＲＮＡを抽出、精製し、分光光度計（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）により精製したＲＮＡの収量、純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を測定したところ、収量は４．８μｇ、純度（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）は２．０７であった。また、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（アジレント社）のＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏ ｃｈｉｐを用いて電気泳動を行った結果を図５（Ａ）に示す。抽出、精製したＲＮＡを３μｇずつ１．５ｍＬチューブ５本に分注して、ヌクレアーゼフリーの水で３２μＬにメスアップした。そこに３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のキットに添付の５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをそれぞれ８μＬ加え、軽くピペッティングして攪拌し、表２に示す条件で熱処理した。処理後、各サンプルをクラッシュアイスで３分間急冷し、マイクロコンＹＭ−１０（ミリポア社）で精製した。Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（アジレント社）のＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏ ｃｈｉｐを用いて電気泳動を行い、ＲＮＡの分解挙動を観察した。その結果、図５（Ｂ）〜（Ｅ）の通り、熱処理の条件によって分解挙動が異なっていた。また、表９に示すとおり、各ＲＮＡサンプルの１０００〜４０００ヌクレオチドの割合は、分解の進行とともに減少する傾向がみられた。
【００６３】
各種分解ＲＮＡ（サンプルＢ〜Ｅ）および未分解のＲＮＡ（サンプルＡ）それぞれ１μｇから、実施例１と同様にして、実施例１と同様にして、アミノアリル化ａＲＮＡ（ＡＡ−ａＲＮＡ）として増幅した。各ＲＮＡサンプルの収量から算定した増幅倍率を表９に示す。分解の程度が小さいサンプル、すなわち１０００〜４０００ヌクレオチドの割合が多いサンプルほど増幅倍率が高い傾向がみられた。参考例１より、増幅後のＲＮＡが３μｇ以上ある場合を解析可能とする場合、３μｇ以上のＲＮＡが得られたサンプル（１０００〜４０００ヌクレオチドの割合が６３％、４０％、２８％）はマイクロアレイ解析に適する、３μｇ得られなかったサンプル（１０００〜４０００ヌクレオチドの割合が１８％、３％）はマイクロアレイ解析に適さないとそれぞれ判定できた。したがって、分解させたＲＮＡを用いた場合においても、基準値は「１０００〜４０００ヌクレオチドが２０％以上」と設定でき、これは実施例３と同様の基準値であった。
（増幅ＲＮＡの蛍光標識）
上記のすべてのサンプルについて、実施例３と同様にして蛍光標識、フラグメンテーション（断片化）反応を行った。各サンプルの収量を表９に示す。収量が１μｇ以上である場合マイクロアレイ解析に適する、１μｇ未満である場合適さないと判定すると、上記のＲＮＡ増幅後における判定結果とすべて合致した。したがって、分解させたＲＮＡを用いても、同様に基準値を設定できることが示された。
【００６４】
【表９】
【００６５】
比較例１
実施例１と同様のマウス小脳、肝臓のＦＦＰＥから、実施例１と同様にしてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ５０ｎｇから、ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮｕＧｅｎ）を用いて、ｃＤＮＡとして増幅した。増幅後の収量は表１０に示すとおりであり、増幅倍率は１００倍前後であった。それぞれ検体溶液をＦＬ−Ｏｖａｔｉｏｎ ｃＤＮＡ Ｂｉｏｔｉｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｎｕｇｅｎ）で標識、断片化し、各１μｇを“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ株式会社）それぞれ２枚にアプライし、４２℃で１６時間反応させた。反応後、洗浄、乾燥させて、実施例１と同様にして蛍光シグナル値を測定した。その結果、表１０の通り、２回の実験の有効スポットに差異があり、実験再現性に乏しいことが示された。
【００６６】
【表１０】
【００６７】
比較例２
実施例３、４において、ＦＦＰＥから抽出したＲＮＡを、バイオアナライザで電気泳動した際に算定されたＲＩＮと、各ＲＮＡサンプル１μｇから増幅したときの収量の関係について、図６ならびに表１１の（ａ）〜（ｃ）にまとめた。その結果、ＲＩＮと収量の関係には相関関係がみられなかった。さらに、一部のサンプルについては、ＲＩＮを算定できなかったものもあった（表７において“Ｎ／Ａ”と表記）。よって、ＦＦＰＥをはじめとする固定組織や固定細胞から抽出したＲＮＡの場合、それらの品質をＲＩＮで判定するのは困難であることが示された。
【００６８】
【表１１】
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のＲＮＡの解析方法を用いることで、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等、病院や研究機関に莫大な数量が保存されている固定組織または細胞の遺伝子の発現増減や発現有無に関する正確な情報を得ることができ、それらの情報は、医薬品開発や遺伝子検査、遺伝子診断技術等に幅広く活用できる。さらに、解析が困難なサンプルを事前に見極めることにより、試薬等のコスト削減にも結びつくため、産業上非常に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡをマイクロアレイにより解析するＲＮＡの解析方法であって、該ＲＮＡを増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物を解析することを特徴とする、ＲＮＡの解析方法。
【請求項２】
前記増幅産物がアンチセンス鎖ＲＮＡである、請求項１に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項３】
前記固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡについて、該ＲＮＡ分子量分布における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ量の比率を確認する工程を含む、請求項１または２に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項４】
固定液により固定された組織または細胞が、パラフィン包埋またはＯＣＴコンパウンド包埋されてなる、請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡサンプルの解析方法。
【請求項５】
固定液がホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のＲＮＡサンプルの解析方法。
【請求項１】
固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡをマイクロアレイにより解析するＲＮＡの解析方法であって、該ＲＮＡを増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物を解析することを特徴とする、ＲＮＡの解析方法。
【請求項２】
前記増幅産物がアンチセンス鎖ＲＮＡである、請求項１に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項３】
前記固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡについて、該ＲＮＡ分子量分布における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ量の比率を確認する工程を含む、請求項１または２に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項４】
固定液により固定された組織または細胞が、パラフィン包埋またはＯＣＴコンパウンド包埋されてなる、請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡサンプルの解析方法。
【請求項５】
固定液がホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のＲＮＡサンプルの解析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２５２７５４（Ｐ２０１０−２５２７５４Ａ）
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１０９４５８（Ｐ２００９−１０９４５８）
【出願日】平成２１年４月２８日（２００９．４．２８）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２８日（２００９．４．２８）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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