ＲＮＡ二次構造の干渉による、ｍＲＮＡ前駆体におけるエクソン認識の調節

【課題】高等真核生物では、細胞内ＤＮＡのタンパク質に関する遺伝情報は、イントロンによって互いに隔てられているエクソンによってコードされており、エクソンとイントロンの両方を含むｍＲＮＡ前駆体が産生されるが、時には、ｍＲＮＡ前駆体の産生時に、早くもｍＲＮＡ前駆体に存在する複数のエクソンが１つにスプライシングされることがある。ＤＮＡレベルでの干渉に代わるものとして、ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡを生じる際の機構を提供する。
【解決手段】ｍＲＮＡ前駆体のエクソンをスキップし、そこから産生されるｍＲＮＡからエクソンを排除するためのオリゴヌクレオチドの製造方法、さらに、ｍＲＮＡ二次構造を改変してスプライシング過程に干渉する方法、ならびに該オリゴヌクレオチドおよび該方法を用いた疾病の治療方法。また、ｍＲＮＡ前駆体中の複数のエクソンのスキッピングを誘導するための医薬組成物、方法および手段。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの製造方法であって、
エクソンから転写したＲＮＡについて、ＲＮＡの一部分が該ＲＮＡ中の他の部分にハイブリダイズしている領域からなるクローズド構造と、ハイブリダイズしていない領域からなるオープン構造とを該ＲＮＡの二次構造から決定し、そして
少なくとも一部が該ＲＮＡのクローズド構造に相補的であり、且つ他の少なくとも一部が該ＲＮＡのオープン構造に相補的であることを特徴とするオリゴヌクレオチドを製造する
ことを包含する方法。
【請求項２】
該オリゴヌクレオチドが相補的なオープン構造とクローズド構造が、該ＲＮＡにおいて互いに隣接していることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
該オリゴヌクレオチドが、該ＲＮＡの連続した１４〜５０ヌクレオチドからなる部分に相補的であることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
該オリゴヌクレオチドがＲＮＡを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
該オリゴヌクレオチドに含まれるＲＮＡが修飾、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾リボースまたは２’−Ｏ−メチル修飾デオキシリボースによる修飾を有することを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
該エクソンを含むｍＲＮＡ前駆体が、対象生物において望ましくないスプライシングを示すことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
該ｍＲＮＡ前駆体から生じるｍＲＮＡ中に該エクソンが存在しない場合に、タンパク質のコード領域が生じることを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
該エクソンを含む該ＲＮＡが転写された遺伝子は、異常型のデュシェンヌ型筋ジストロフィー遺伝子（ＤＭＤ）、コラーゲンＶＩα１遺伝子（ＣＯＬ６Ａ１）、筋細管ミオパシー１遺伝子（ＭＴＭ１）、ジスフェリン遺伝子（ＤＹＳＦ）、ラミニン−α２遺伝子（ＬＡＭＡ２）、エメリー−ドレイファス型筋ジストロフィー遺伝子（ＥＭＤ）およびカルパイン３遺伝子（ＣＡＰＮ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種をコードすることを特徴とする、請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項９】
該遺伝子が、異常型のデュシェンヌ型筋ジストロフィーをコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
該エクソンが、エクソン２，８，９，１７，１９，２９，４０〜４６，４８〜５３，５５または５９を含むことを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
製造するオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの同等物であり、該同等物は該オリゴヌクレオチドと同種であるが、その強度は必ずしも同等ではないハイブリダイゼーション特性を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
該同等物が、ペプチド核酸、構造的にロックされた核酸およびモルフォリノ−ホスホロジアミデートからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
該同等物が、構造的にロックされた核酸を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドまたはその同等物が、該エクソンのスプライス供与部位配列およびスプライス受容部位配列の少なくとも１種と重複しないことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかの製造方法によって得られるオリゴヌクレオチドまたはその同等物。
【請求項１６】
遺伝子にコードされているｍＲＮＡ前駆体内の少なくとも２個のエクソンにハイブリダイズし得る化合物であって、該化合物は少なくとも２つの部分を含み、該少なくとも２つの部分には、該少なくとも２個のエクソンの内の第１のエクソンに相補的な配列中の連続した少なくとも８個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む第１の部分、および該ｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンに相補的な配列中の連続した少なくとも８個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む第２の部分が含まれる。
【請求項１７】
１６〜８０ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
該ｍＲＮＡ前駆体内の第１と第２のエクソンは、該化合物に含まれるオリゴヌクレオチドが相補性を示さない少なくとも１個のエクソンによって隔てられていることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の化合物。
【請求項１９】
該エクソンに相補的なヌクレオチド伸長鎖を含む少なくとも２つの部分は、それぞれ連結成分によって隔てられていることを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
該連結成分が４〜４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも４個のウラシルヌクレオチドを含む４〜４０ヌクレオチドを包含することを特徴とする、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
請求項１６〜２０のいずれかの化合物の同等物であって、好ましくは請求項１２の製造方法で得られる同等物。
【請求項２２】
請求項１５〜２１のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、ｍＲＮＡ前駆体内の１つまたは複数のエクソンに対する認識を少なくとも部分的に改変する方法。
【請求項２３】
請求項１５〜２１のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、医薬の製造方法。
【請求項２４】
請求項１５〜２１のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を包含する医薬用製剤。
【請求項２５】
請求項１５〜２１のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、伝達性遺伝疾患の治療用医薬の製造方法。
【請求項２６】
請求項１５〜２１のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、ｍＲＮＡ前駆体におけるエクソンスキッピングを誘導する方法。
【請求項２７】
請求項１５〜２１のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、ｍＲＮＡ前駆体内のエクソンの認識を改変する方法。
【請求項２８】
請求項１５〜２１のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、スプライシング機構によるスプライス供与部位配列またはスプライス受容部位配列の利用効率を改変する方法。
【請求項２９】
請求項１５〜２１のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、ｍＲＮＡ前駆体内の２個以上のエクソンのエクソンスキッピングを誘導する方法。
【請求項３０】
請求項１５〜２１のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、ｍＲＮＡ前駆体内の３個以上のエクソンのエクソンスキッピングを誘導する方法。
【請求項３１】
請求項１５〜２１のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、ｍＲＮＡ前駆体内の少なくとも２個のエクソンと、該少なくとも２個のエクソンの間に位置する配列である介在配列のスキッピングを誘導する方法。
【請求項３２】
該介在配列が、少なくとも１個のエクソンを含むことを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
スプライシング機構によるｍＲＮＡ前駆体内のエクソンの認識効率を改変する方法であって、ｍＲＮＡ前駆体は少なくとも２個のエクソンと少なくとも１個のイントロンを含む遺伝子によってコードされるものであり、該改変方法は以下の工程を包含する。
スプライシング機構と該遺伝子を包含する転写系に、請求項１５〜２１のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を第１成分として提供し、但し、該第１成分として用いるオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物は、該少なくとも２個のエクソンの内の少なくとも１個にハイブリダイズし得るものであり、そして
該転写系において転写とスプライシングを実施せしめる。
【請求項３４】
該遺伝子が、少なくとも３個のエクソンを含むことを特徴とする、請求項３３に記載の改変方法。
【請求項３５】
請求項１５〜２１のオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物であって、該少なくとも２個のエクソンの他の１個にハイブリダイズし得るものを第２成分として該転写系に提供することを特徴とする、請求項３３または３４に記載の改変方法。
【請求項３６】
該第１成分として用いるオリゴヌクレオチドまたはその同等物と、該第二成分として用いるオリゴヌクレオチドまたはその同等物とが、互いに物理的に結合していることを特徴とする、請求項３５に記載の改変方法。

【図２】