ＲＮＡ検出用試薬およびＲＮＡ検出方法
【課題】ＰＣＲ法によるＲＮＡ検出方法において、検出感度を向上させることのできるＲＮＡ検出用試薬、およびＲＮＡ検出方法を提供することを課題とする。
【解決手段】ＲＮＡ検出用試薬においては、ＲＮＡウイルスを含む試料から前記ＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出し、前記抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法により増幅させて前記ＲＮＡを検出するために前記試料に添加されるＲＮＡ検出用試薬であって、ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含むことを特徴としている。
【解決手段】ＲＮＡ検出用試薬においては、ＲＮＡウイルスを含む試料から前記ＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出し、前記抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法により増幅させて前記ＲＮＡを検出するために前記試料に添加されるＲＮＡ検出用試薬であって、ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含むことを特徴としている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いてＲＮＡウイルスのＲＮＡを検出する方法において使用されるＲＮＡ検出用試薬、およびこれらの試薬を用いてＲＮＡを検出するＲＮＡ検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、感染性ウイルスのスクリーニングや、疾患患者のウイルス感染の有無を判断する場合にＲＮＡウイルス中のＲＮＡを検出する方法としてＲＴ（リアルタイム）−ＰＣＲ法を含むＰＣＲ法（以下、単にＰＣＲ法と記載する場合がある。）が広く用いられている。
【０００３】
ＰＣＲ法によって試料中のＲＮＡウイルスのＲＮＡを検出するには、フェノールを含む抽出液によって試料から抽出されたＲＮＡを、逆転写して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させてその増幅産物を測定する事で、試料中のＲＮＡを検出する。
【０００４】
ＰＣＲ法の中でも、特にＲＴ−ＰＣＲ法は、ｃＤＮＡの増幅を、例えば、蛍光色素存在下で行い、蛍光検出により増幅産物量をリアルタイムで測定しながら増幅量を測定するために、高感度のＲＮＡ検出が行うことができる。
前記ＲＴ−ＰＣＲ法は、通常のＰＣＲ法に比べるとＲＮＡを高感度で検出できるものの、例えば感染初期の患者から試料を採取してＲＮＡの検出を行った場合には、ウイルスの量が少ないため、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてもＲＮＡを検出できない場合があり、実際には感染していたとしても陰性と判断されることがある。
【０００５】
また、ＲＮＡは同じ核酸であるＤＮＡと比較すると、環境中に多く存在するＲＮＡ分解酵素で分解されてしまうため、ＲＮＡが少量の場合には検出が困難になる。
さらに、ＲＮＡを検出する場合にはＲＮＡを逆転写する工程が増えるためＤＮＡを検出する場合に比べて試料のロスも生じやすく、ＲＮＡ量が少ない試料の検出が難しい。
従って、初期においても感染しているかどうかを判断したい病原性ウイルスなど、少量のＲＮＡウイルスのＲＮＡ検出についてはさらに高感度の検出方法が望まれている。
【０００６】
前記ＰＣＲ法におけるＲＮＡ検出感度を高める方法としては、(1)試料からのＲＮＡの抽出時、（2）逆転写時、(3)ＰＣＲ反応時などにおける各処理の効率や感度を向上させることが考えられるが、この中でも(1)のＲＮＡ抽出時における抽出効率を向上させることで、効果的にＲＮＡ検出の感度を向上させることが可能である。
【０００７】
前記(1)のＲＮＡを試料から抽出する抽出工程における具体的な処理としては、例えば、フェノ−ルやクロロホルムを含む抽出液に試料を溶解して試料中のタンパクや炭水化物を沈殿させて、ＲＮＡを含む水溶液を上澄みとして分離する工程と、前記上澄みとして分離されたＲＮＡを含む水溶液に、さらにアルコールなどを添加して、水溶液中のＲＮＡを沈殿させて分離工程とを行なうことで、試料中のＲＮＡを抽出する処理が行なわれる。
【０００８】
前記ＲＮＡの分離工程において、ＲＮＡの量が極めて少量の場合には、ＲＮＡを確実に沈殿させることが困難になる。
そこで、微量のＲＮＡを確実に沈殿させるために、ＲＮＡの沈殿を促す共沈剤を添加することで、抽出効率を向上させることが検討されている。
【０００９】
例えば、特許文献１乃至５には、ＲＮＡまたはＤＮＡ等の核酸を含む水溶液にデキストランを共沈剤として添加して、核酸の沈殿を促進することが記載されている。
共沈剤としては、デキストランの他に、アクリルアミドまたはカルボキシメチル（特許文献２）や、グリコーゲン（特許文献３および５）、あるいはセルロースやでんぷん（特許文献６）、あるいはアミロペクチンアズール（特許文献７）なども各文献に記載されている。
【００１０】
しかしながら、前記のような共沈剤を用いるいずれの方法においても、核酸、特にウイルスＲＮＡのＲＮＡ検出感度を十分に向上させうるものではない。
さらに、アクリルアミドやグリコーゲンは低温で保管する必要があり、保管や取り扱いが難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平７−２３８１０１号公報
【特許文献２】特開平７−５９５７２号公報
【特許文献３】特開２００１−１７１７３号公報
【特許文献４】特開２００３−２４８号公報
【特許文献５】特開２００６−８７３９４号公報
【特許文献６】特許第４２６４１３３号公報
【特許文献７】特許第３１０８１０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、本発明は、上記のような従来の問題を鑑みて、ＲＮＡの検出感度を向上させることのできるＲＮＡ検出用試薬、およびＲＮＡ検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するための手段として、本発明のＲＮＡ検出用試薬は、ＲＮＡウイルスを含む試料から前記ＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出し、前記抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法により増幅させて前記ＲＮＡを検出するために前記試料に添加されるＲＮＡ検出用試薬であって、ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含むことを特徴としている。
【００１４】
また、本発明のＲＮＡ検出方法は、ＲＮＡウイルスを含む試料からＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出する抽出工程と、前記抽出工程で抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ反応工程とを備えるＲＮＡ検出方法において、前記試料にポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含む試薬を添加することを特徴としている。
【００１５】
前記のようにＲＮＡウイルスを含む試料にポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含むＲＮＡ検出用試薬を添加して、ウイルスのＲＮＡの抽出を行い、さらにＰＣＲ法によってＲＮＡを増幅させることによって、ＰＣＲ法におけるＲＮＡの検出感度が向上し、微量なＲＮＡでも検出することが可能になる。
尚、本発明でいうＲＮＡ検出用試薬とは、特に限定する記載がない限り、ＲＮＡ検出するためのすべての工程で用いられる試薬をいう。
【００１６】
また、本発明のＲＮＡ検出方法では、前記抽出工程の前に前記試料に前記試薬を添加することが好ましい。
【００１７】
前記抽出工程の前に前記試薬を添加することによって、よりＲＮＡ検出感度を向上させることができる。
【００１８】
本発明において、前記抽出工程では、前記試料にフェノールを含む液を接触させることで試料からＲＮＡを抽出することを実施することが好ましい。
【００１９】
試料にフェノールを含む液を接触させる抽出を行なう方法において、試料にポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含む試薬を添加することで、効果的にＲＮＡの検出感度が向上する。
【００２０】
また、本発明においては、ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルス、ネコカリシウイルス、ノロウイルス、デングウイルスからなる群から選択される一種または二種以上であることが好ましい。
【００２１】
前記ＲＮＡウイルスを含む試料からのＲＮＡ検出を行なう場合には、本発明のＲＮＡ検出用試薬、またはＲＮＡ検出方法によれば、特に高い検出感度が得られる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、ＲＮＡの検出感度を向上させることができ、従って、試料中に含まれるＲＮＡウイルスが微量あっても、精度よくＲＮＡウイルスのＲＮＡを検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に、本実施形態のＲＮＡ検出用試薬およびこれらの試薬を用いたＲＮＡ検出方法について具体的に説明する。
【００２４】
本実施形態のＲＮＡ検出用試薬は、ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含むものである。
【００２５】
前記ポリアクリル酸とは、構成単量体の主成分がアクリル酸単量体（質量比率５０％以上）である重合体をいう。
【００２６】
前記ポリアクリル酸は、好ましくは、重量平均分子量（Ｍｗ）が、約４，０００〜約３０万程度、好ましくは、約１００００〜約５００００程度のものが好ましい。
【００２７】
前記ポリアクリル酸塩とは、構成単量体の主成分がアクリル酸塩単量体（質量比率５０％以上）である重合体をいう。
前記アクリル酸塩単量体としては、アクリル酸ナトリウム、アクリル酸アンモニウム、アクリル酸カリウムなどが挙げられ、特にアクリル酸ナトリウムを用いることが好ましい。
【００２８】
前記ポリアクリル酸塩は、好ましくは、重量平均分子量（Ｍｗ）が、約２０００〜１０万程度、好ましくは約１００００〜約５００００程度のものが好ましい。
【００２９】
前記ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩は、それぞれアクリル酸またはアクリル酸塩の単量体と他の単量体との共重合体であってもよい。
また、前記ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩には、前記各単量体以外に架橋剤が添加されて架橋されていてもよい。
【００３０】
前記ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩の各重量平均分子量は、ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）法により、例えば、下記装置および条件で求められる。
【００３１】
（分析装置）
恒温槽：昭和電工株式会社製 ＳＨＯＤＥＸ ＯＶＥＮ Ａ０−３０
送液ポンプ：昭和電工株式会社製 ＳＨＯＤＥＸ ＤＳ−４
検出器：昭和電工株式会社製 ＳＨＯＤＥＸ ＲＩ−１０１
デガッサー：昭和電工株式会社製 ＳＨＯＤＥＸ ＥＲＣ−３１１５α
解析ソフト：システムインスルツメンツ社製 ＳＩＣ ４８０II データステーション
カラム：昭和電工株式会社製 ＳＢ−８０６ＭＨＱ ＋ ＳＢ−８０４ＨＱ 直列
【００３２】
（分析条件）
溶離液：０．１Ｍ ＮａＮＯ3水溶液
恒温槽温度：４０℃
流量：１ｍｌ／分
ＧＰＣカラム用標準試料：昭和電工株式会社製 プルラン(商品名) Ｐ−５、Ｐ−１０、Ｐ−２０、Ｐ−５０、Ｐ−１００、Ｐ−２００、Ｐ−４００、Ｐ−８００
試料注入量：前記試料の１質量％水溶液を５０μｌ注入
【００３３】
前記標準試料のピーク時間から検量線を作成し、試料のクロマトグラムを前記解析ソフトを用いて解析し、分子量を算出する。
【００３４】
本実施形態のＲＮＡ検出用試薬は、前記ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を水、その他の溶媒に溶解させて、試薬として調整することができる。
前記ＲＮＡ検出用試薬におけるポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩の濃度は、１０００〜１００００μｇ／ｍｌ程度である。
ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩の濃度範囲を前記範囲に調整することで、試料への添加濃度の調整が容易に行える。
【００３５】
前記前記ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を試薬として調整する調整方法としては、例えば、溶媒の温度１０℃から３５℃(室温)で、６０〜１８０分間程度攪拌することで調整することができる。
【００３６】
本実施形態のＲＮＡ検出用試薬には、さらに抗生物質などが添加されていてもよい。
使用可能な抗生物質としては、例えば、ペニシリンやストレプトマイシンなどが挙げられる。
さらに本実施形態のＲＮＡ検出用試薬には、抽出性を高めるために界面活性剤などが添加されていてもよい。
【００３７】
あるいは、本実施形態のＲＮＡ検出用試薬は、ＲＮＡ検出に使用される他の試薬、例えば、タンパク質変性剤、ＲＮＡ分解酵素阻害剤などと共に混合した混合液として調整してもよい。このように他の試薬と混合しておくことで、試薬をその都度添加する手間が省略できる。
【００３８】
次に前記のようなＲＮＡ検出用試薬を用いて試料中のＲＮＡを検出する方法について説明する。
【００３９】
（１）試料の準備
血液などの検査用試料を準備する。通常の検出方法と同様に必要に応じて適当な倍率に希釈してもよい。
また、検査用試料としては血液の他、咽頭ぬぐい液や気管吸引液（例インフルエンザウイルス）、血清（例：Ｃ型肝炎ウイルス）、組織、細胞の他に、尿・便（例ノロウイルス）等の排泄物、環境試料（下水、河川水等）などを検査用試料として用いることが可能である。
【００４０】
本発明では、種々のＲＮＡウイルスから抽出されるＲＮＡの検出に適用可能であるが、例えば、エンベロープを有するＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、デングウイルス、エンベローブを有しないノロウイルスの実験室での代替ウイルスとして用いられることが多いネコカリシウイルスなどのウイルスＲＮＡの検出に用いることができる。
これらのウイルスの中でも、特に、エンベロープを有するウイルスには検出感度向上効果が高い。
【００４１】
（２）ＲＮＡの抽出工程
前記試料からＲＮＡを抽出する。
まず、前記試料に前記のＲＮＡ検出用試薬を添加する。
試料に対するＲＮＡ検出用試薬の添加量は、試料の濃度や、ウイルスの種類などによって適宜調整可能である。例えば、前記ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩が好ましくは０．２μｇ／ｍｌ〜２０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２〜５００μｇ／ｍｌとなるようにＲＮＡ検出用試薬を試料に添加することが好ましい。
【００４２】
前記ＲＮＡ検出用試薬を添加した試料から、公知の手法、例えばフェノール・クロロフォルム抽出法によってＲＮＡを抽出する。
ＲＮＡ抽出には市販のＲＮＡ抽出用試薬キット、例えば、ＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロジェン社製））等を添付のプロトコールに従って使用することができる。
例えば、下記のような手順でＲＮＡ抽出を行なう。
【００４３】
まず、試料をＴＲＩＺＯＬ試薬に溶解させる。試料が血液などの液体の場合には、適宜希釈した液を、試料が培養細胞などの固体の場合には予めホモジェナイズしておいたものを、ＴＲＩＺＯＬ試薬に混合して溶解させる。
ＴＲＩＺＯＬ試薬に試料を溶解させた液を1５分間静置して、クロロホルムを添加し、チューブに入れ遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、４℃）する。
遠心分離後、ＲＮＡを含む上澄みと、その他の成分（タンパク質、炭水化物など）を含む沈殿に分離し、上澄みを取り出すことでＲＮＡ成分を含む水溶液が抽出できる。
さらに、上澄みを別のチューブにいれて、イソプロパノールを添加し、１０分間静置した後、遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、４℃）した上澄みを除去するとＲＮＡの沈殿が生成する。その沈殿にエタノール（７５％）を添加しさらに遠心分離（７５００×ｇ、５分間、４℃）するとＲＮＡが洗浄できる。
沈殿・洗浄したＲＮＡ沈殿を乾燥後、ＤＮａｓｅ Ｗａｔｅｒに再溶解させることで、ＲＮＡが回収できる。
【００４４】
（３）逆転写工程
前記のように試料から抽出されたＲＮＡを用いて、逆転写によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。
逆転写は、市販の逆転写酵素用試薬キット、例えば、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステムズ社製）等を、添付のプロトコールに従って使用することができる。
例えば、逆転写酵素、ランダムプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＲＮＡ分解酵素阻害剤（ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、付属のバッファーおよびＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水をプロトコールに従って調整し（１試料あたり全量で１０μｌとなるように調整）、前記回収されたＲＮＡを調整した試薬に同量の１０μｌ添加してピペッティングで混合する。
混合後、１０分間室温で静置し、３７℃で２時間逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成する。
逆転写反応後のｃＤＮＡは、８５℃で１０秒保温させることで、酵素を不活化させておく。
【００４５】
（４）ＰＣＲ反応工程
次に、前記逆転写によって生成されたｃＤＮＡをＰＣＲ反応によって増幅させて検出を行う。
ＰＣＲ反応によるｃＤＮＡの検出は、公知のＰＣＲ法を用いたＰＣＲ装置を適宜用いて行うことができる。
ＰＣＲ装置で検出されるデータはｃＤＮＡの量であるため、これを元の試料中に含まれるＲＮＡ量に換算することで、試料中に含まれていたＲＮＡ量およびＲＮＡウイルスの検出が可能となる。
尚、ＲＮＡ量とｃＤＮＡ量は同量であるが、生データとして得られるｃＤＮＡ量は、最終的にＰＣＲ反応させたｃＤＮＡ量であるため、元の試料中に含まれるＲＮＡ量に換算する場合には、希釈を考慮して換算する。
【００４６】
前記のようなＰＣＲ反応工程において試料中に含まれるウイルスＲＮＡを検出する場合、血液などの試料に含まれている不純物が残存物質として各工程における酵素反応などを阻害している可能性があり、これらの残存物質が、最終的なウイルスＲＮＡの検出感度に悪影響を及ぼしていると考えられる。
【００４７】
本発明のＲＮＡ検出用試薬が実際にどのような作用でＲＮＡ検出の感度を向上させているのか、その詳細な原理は不明だが、おそらく、前記ＲＮＡの抽出工程において、ＲＮＡの抽出効率を向上させていると考えられる。
また、本発明のＲＮＡ検出用試薬は前記のようにＲＮＡの抽出前の試料に添加し、その後試料を抽出工程、逆転写工程、ＰＣＲ反応工程において各処理を実施するため、各工程における残存物質の阻害作用を低下させて、ＲＮＡ検出感度を向上させているとも考えられる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例および比較例を用いて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
［実施例１］
（ＲＮＡ検出用試薬）
ＲＮＡ検出用試薬として、下記の各ポリアクリル酸（Ａ〜Ｃ）、ポリアクリル酸ナトリウム（Ａ〜Ｃ）、ポリカルボン酸系コンクリート混和剤（Ａ、Ｂ）ポリカルボン酸ナトリウム、アクリル系ポリマー、ポリビニルアルコール（Ａ〜Ｃ）、ポリエチレングリコール（Ａ〜Ｄ）、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（Ａ，Ｂ）、エチルセルロース、メチルセルロースを、それぞれ各成分濃度が１０００μｇ／ｍｌとなるように水（超純水）に溶解させたものを準備した。
尚、下記各成分のうち、ポリアクリル酸ナトリウムＡ，ポリカルボン酸系コンクリート混和剤（ＡおよびＢ）については、濃度が不明であったため、１００倍希釈したものを各量用いた。
また、下記の分子量は、前記装置および条件でＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）法により測定した重量平均分子量であって、測定値の有効数値を２桁または１桁で示した。
【００５０】
各ポリアクリル酸およびポリアクリル酸ナトリウムは下記のものを使用した。
ポリアクリル酸Ａ：ポリアクリル酸 ５，０００（和光純薬工業株式会社製、分子量５０００、等級 和光１級）
ポリアクリル酸Ｂ：ポリアクリル酸 ２５，０００（和光純薬工業株式会社製、分子量２５０００、等級 和光１級）
ポリアクリル酸Ｃ：ポリアクリル酸 ２５０，０００（和光純薬工業株式会社製、分子量２５００００、等級 和光１級）
ポリアクリル酸ナトリウムＡ：ポリアクリル酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、重合度２，７００〜７，５００）
ポリアクリル酸ナトリウムＢ：ポリアクリル酸ナトリウム（Ａ−２０ＵＮ 東亜合成株式会社製、分子量２０，０００ 固形分４２％）
ポリアクリル酸ナトリウムＣ：ポリアクリル酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、重合度３０，０００〜４０，０００）
ポリカルボン酸系コンクリート混和剤Ａ：（シーカメント１１００ＮＴ、日本シーカ株式社製）
ポリカルボン酸系コンクリート混和剤Ｂ：（チューポールＨＰ−８、竹本油脂株式会社製）
ポリカルボン酸ナトリウム：（Ａ−６３１０、東亜合成株式会社製）
アクリル系ポリマー：（Ａ−６３８０、東亜合成株式会社製）
ポリビニルアルコールＡ：（和光純薬工業株式会社製、重合度５００）
ポリビニルアルコールＢ：（和光純薬工業株式会社製、重合度１５００）
ポリビニルアルコールＣ：（和光純薬工業株式会社製、重合度２０００）
ポリエチレングリコールＡ：（和光純薬工業株式会社製 分子量３００、等級1級）
ポリエチレングリコールＢ：（和光純薬工業株式会社製 分子量２０００、等級1級）
ポリエチレングリコールＣ：（和光純薬工業株式会社製 分子量６０００、等級1級）
ポリエチレングリコールＤ：（和光純薬工業株式会社製 分子量２００００、等級1級）
ポリエチレンスルホン酸ナトリウムＡ：（ポリサイエンス社製、分子量４６００）
ポリエチレンスルホン酸ナトリウムＢ：（ポリサイエンス社製、分子量１８０００）
エチルセルロース：（和光純薬工業株式会社製）
メチルセルロース：（和光純薬工業株式会社製）
【００５１】
（試料）
ウイルスとしてＡ型インフルエンザウイルス（株：Ａ／ＰＲ／８／３４）を用い、ウイルス液の濃度が２５０μｌ中に１×１０4ＰＦＵとなるように調整した。
培養液として、ＭＥＭ培地、Ｌ−グリタミン、非必須アミノ酸、炭酸水素ナトリウム（ｐＨ調整用）からなる培養液を用いた。
【００５２】
表１及び表２に示すように、前記ＲＮＡ検出用試薬を５〜２４５μｌと前記培養液を合わせ各２５０μｌになるように調整した試験例１〜４２、および、ＲＮＡ検出用試薬を添加せずにウイルス液５μｌと培養液２４５μｌからなる標準液を準備した。
尚、試験例１、８、１５、２２、２９および３６については、前記ＲＮＡ検出用試薬を１０００倍希釈したものを、試験例２、９、１６、２３、３０および３７については、前記ＲＮＡ検出用試薬を１００倍希釈したものを、試験例３、１０、１７、２４、３１および３８については、前記ＲＮＡ検出用試薬を１０倍希釈したものを各５μｌずつ用いた。
【００５３】
（ＲＮＡ抽出工程）
抽出用の試薬としては、ＴＲＩＺＯＬ（商品名、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。
各液２５０μｌに対し、前記ＴＲＩＺＯＬを７５０μｌ添加した。
この溶液をよく混和し、１５分間室温で静置した後、２００μｌのクロロホルムを添加して、遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、４℃）する。
その後、水層を回収した。
回収した水層約７００μｌあたり５００μｌのイソプロパノールを添加して、１０分間室温で静置し、遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、４℃）して、ＲＮＡ成分を沈殿させ、上澄みを除去する。
残ったＲＮＡ沈殿物に、７５％エタノールを 1ｍｌ添加し、ボルテックス後、5分間室温で静置し、さらに遠心分離（９０００×ｇ、５分間、４℃）することによってＲＮＡ沈殿を洗浄した。
一度、上清を除去した後、さらに遠心分離（９０００×g、2分間、4℃）し、残存している上清を除去した。上清除去後のＲＮＡ沈殿物を、15分間風乾させ、エタノールを除去した。
風乾後のＲＮＡ沈殿物に、ＤＥＰＣ処理水を１５μl加え、ピペッティングし、ＲＮＡ溶解液を得た。
【００５４】
（逆転写工程およびＰＣＲ反応工程）
前記抽出されたＲＮＡを、ＤＥＰＣ処理水１５μｌで溶解し、そのうちの１０μｌのＲＮＡを用いて、２０μｌのｃＤＮＡを合成した（逆転写工程）。
合成したｃＤＮＡのうち５μｌを使用し、下記のＰＣＲ装置を用いてＲＮＡ量を測定した（ＰＣＲ反応工程）。
前記逆転写工程および、ＰＣＲ反応の手順は、以下の試薬またはキットの方法に準拠した。
尚、ウイルスのプライマーおよびプローブは、ウイルス株の遺伝子配列を基に、遺伝子解析ソフトウエアＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０(アプライドバイオシステム社製)を用いて設計した。
本実施例のウイルスのプライマーおよびプローブは、Ａ型インフルエンザウイルス株を１４１株抽出し、その中で相同性の高い共通プライマー、プローブとなるプライマーおよびプローブを選定した。
【００５５】
逆転写キット：Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステムズ社製）
ＰＣＲ反応キット：イーグルタックマスターミックス（ＲＯＸ）（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）
ＰＣＲ装置（リアルタイムＰＣＲ）：アプライドバイオシステムズ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）
【００５６】
各試験例および標準液においてＰＣＲ装置で測定した生データと、この生データから換算した２５０μｌ中のＲＮＡ量（ｃｏｐｙ）を表１および表２に記載した。
尚、換算値は、生データを０．１６７で除した数値である。その理由は、前記抽出したＲＮＡ１５μｌのうち、１０μｌをｃＤＮＡ合成に使い、合成したｃＤＮＡ２０μｌのうち、５μｌをＰＣＲ装置にかけてＰＣＲ反応させたため、生データ（ｃＤＮＡ数）を０．１６７で除した値が２５０μｌの検査用試料に含まれるＲＮＡ量となるためである。
すなわち、換算値が検出されたＲＮＡ量となる。
【００５７】
尚、今回のＰＣＲ測定条件において、使用したＰＣＲ装置の検出限界値は、１０ｃｏｐｙであった。
【００５８】
【表１】
【００５９】
【表２】
【００６０】
ＲＮＡ検出用試薬を添加しない標準液では、検出されたＲＮＡ量（換算値）が１．７×１０2ｃｏｐｙであった。
この標準液に対して、ポリアクリル酸またはポリアクリル酸ナトリウムを添加した各試験例では、前記標準液と同等以上のＲＮＡ量（ｃｏｐｙ数）が検出された。
特に、ポリアクリル酸またはポリアクリル酸ナトリウムの含有量を１．５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌになるようにＲＮＡ検出用試薬を添加した場合に、前記標準液よりも１０倍以上のＲＮＡ量（ｃｏｐｙ数）が検出された。
一方、試験例４７〜１０４では、特に標準液と比べても有意な差は見られなかった。
【００６１】
［実施例２］
実施例２では、前記実施例１のＲＮＡ検出用試薬の中から、ポリアクリル酸Ｂを用いたＲＮＡ検出用試薬を準備し、ウイルスとして、ネコカリシウイルス（株：ＦＣＶ−２２８０）を用いた。
前記実施例１と同様に、濃度が１．０×１０4ＰＦＵ／２５０μｌとなるように調整したウイルス液を各５μｌずつ準備し、これに対して前記ＲＮＡ検出用試薬を２．５，５．０，５０μｌ、培養液を２４２．５、２４０、１９５μｌずつ準備した。
前記ＲＮＡ検出用試薬を、前記実施例１と同様にＲＮＡ抽出前にウイルス液および培養液に混合した場合のＲＮＡ検出量と、ＲＮＡ抽出工程におけるアルコール沈殿のアルコール添加前のウイルス液および培養液にＲＮＡ検出用試薬を添加した場合のＲＮＡ検出量をそれぞれ測定した。
【００６２】
尚、逆転写に必要な各ウイルスのプライマーおよびプローブは、前記ネコシリカウイルス株の遺伝子配列を基に、遺伝子解析ソフトウエアＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０(アプライドバイオシステム社製)を用いて、アプライド社の設計ガイドラインに最も近くなる、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０で示されるペナルティスコアが最も低くなるものを選定して用いた。
【００６３】
前記以外の条件は実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出工程、逆転写工程およびＰＣＲ反応工程を実施し、ＲＮＡ抽出前にウイルス液および培養液に混合した場合のＲＮＡ検出量をＡ（２５０μｌ中のウイルス量換算値ｃｏｐｙ）とし、ＲＮＡ抽出工程におけるアルコール沈殿のアルコール添加前のウイルス液および培養液にＲＮＡ検出用試薬を添加した場合のＲＮＡ検出量をＢ（２５０μｌ中のウイルス量換算値ｃｏｐｙ）としＡ／Ｂの値を表３に示した。
【００６４】
【表３】
【００６５】
表３で示すように、ネコカリシウイルスの場合には、ＲＮＡ抽出前に本実施例の試薬を試料中に添加する方が、アルコール沈殿の前に添加する場合よりもよりＲＮＡ検出感度が向上していることが明らかである。
【００６６】
［実施例３］
実施例３では、前記実施例１のＲＮＡ検出用試薬の中から、ポリアクリル酸Ｂを用いたＲＮＡ検出用試薬を準備し、ウイルスとして、デングウイルス（株：ＮＥＷ Ｇｕｉｎｅａ Ｃ）を用い、前記実施例１と同様に、濃度が１．０×１０4ＰＦＵ／２５０μｌとなるように調整したウイルス液を各５μｌずつ準備し、これに対して前記ＲＮＡ検出用試薬を５．０μｌ、培養液を２４０μｌ準備した。比較として、培養液２４２．５μｌのみのものを準備した。
前記以外の条件は実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出工程、逆転写工程およびＰＣＲ反応工程を実施し、ＲＮＡ検出量を測定した（２５０μｌ中のウイルス量換算値ｃｏｐｙ）。
結果を表４に示す。
【００６７】
【表４】
【００６８】
実施例１と同様に、ＲＮＡ検出用試薬を添加した試験例１０８では標準液よりも１００倍程度多いＲＮＡ量（ｃｏｐｙ数）が検出された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いてＲＮＡウイルスのＲＮＡを検出する方法において使用されるＲＮＡ検出用試薬、およびこれらの試薬を用いてＲＮＡを検出するＲＮＡ検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、感染性ウイルスのスクリーニングや、疾患患者のウイルス感染の有無を判断する場合にＲＮＡウイルス中のＲＮＡを検出する方法としてＲＴ（リアルタイム）−ＰＣＲ法を含むＰＣＲ法（以下、単にＰＣＲ法と記載する場合がある。）が広く用いられている。
【０００３】
ＰＣＲ法によって試料中のＲＮＡウイルスのＲＮＡを検出するには、フェノールを含む抽出液によって試料から抽出されたＲＮＡを、逆転写して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させてその増幅産物を測定する事で、試料中のＲＮＡを検出する。
【０００４】
ＰＣＲ法の中でも、特にＲＴ−ＰＣＲ法は、ｃＤＮＡの増幅を、例えば、蛍光色素存在下で行い、蛍光検出により増幅産物量をリアルタイムで測定しながら増幅量を測定するために、高感度のＲＮＡ検出が行うことができる。
前記ＲＴ−ＰＣＲ法は、通常のＰＣＲ法に比べるとＲＮＡを高感度で検出できるものの、例えば感染初期の患者から試料を採取してＲＮＡの検出を行った場合には、ウイルスの量が少ないため、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてもＲＮＡを検出できない場合があり、実際には感染していたとしても陰性と判断されることがある。
【０００５】
また、ＲＮＡは同じ核酸であるＤＮＡと比較すると、環境中に多く存在するＲＮＡ分解酵素で分解されてしまうため、ＲＮＡが少量の場合には検出が困難になる。
さらに、ＲＮＡを検出する場合にはＲＮＡを逆転写する工程が増えるためＤＮＡを検出する場合に比べて試料のロスも生じやすく、ＲＮＡ量が少ない試料の検出が難しい。
従って、初期においても感染しているかどうかを判断したい病原性ウイルスなど、少量のＲＮＡウイルスのＲＮＡ検出についてはさらに高感度の検出方法が望まれている。
【０００６】
前記ＰＣＲ法におけるＲＮＡ検出感度を高める方法としては、(1)試料からのＲＮＡの抽出時、（2）逆転写時、(3)ＰＣＲ反応時などにおける各処理の効率や感度を向上させることが考えられるが、この中でも(1)のＲＮＡ抽出時における抽出効率を向上させることで、効果的にＲＮＡ検出の感度を向上させることが可能である。
【０００７】
前記(1)のＲＮＡを試料から抽出する抽出工程における具体的な処理としては、例えば、フェノ−ルやクロロホルムを含む抽出液に試料を溶解して試料中のタンパクや炭水化物を沈殿させて、ＲＮＡを含む水溶液を上澄みとして分離する工程と、前記上澄みとして分離されたＲＮＡを含む水溶液に、さらにアルコールなどを添加して、水溶液中のＲＮＡを沈殿させて分離工程とを行なうことで、試料中のＲＮＡを抽出する処理が行なわれる。
【０００８】
前記ＲＮＡの分離工程において、ＲＮＡの量が極めて少量の場合には、ＲＮＡを確実に沈殿させることが困難になる。
そこで、微量のＲＮＡを確実に沈殿させるために、ＲＮＡの沈殿を促す共沈剤を添加することで、抽出効率を向上させることが検討されている。
【０００９】
例えば、特許文献１乃至５には、ＲＮＡまたはＤＮＡ等の核酸を含む水溶液にデキストランを共沈剤として添加して、核酸の沈殿を促進することが記載されている。
共沈剤としては、デキストランの他に、アクリルアミドまたはカルボキシメチル（特許文献２）や、グリコーゲン（特許文献３および５）、あるいはセルロースやでんぷん（特許文献６）、あるいはアミロペクチンアズール（特許文献７）なども各文献に記載されている。
【００１０】
しかしながら、前記のような共沈剤を用いるいずれの方法においても、核酸、特にウイルスＲＮＡのＲＮＡ検出感度を十分に向上させうるものではない。
さらに、アクリルアミドやグリコーゲンは低温で保管する必要があり、保管や取り扱いが難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平７−２３８１０１号公報
【特許文献２】特開平７−５９５７２号公報
【特許文献３】特開２００１−１７１７３号公報
【特許文献４】特開２００３−２４８号公報
【特許文献５】特開２００６−８７３９４号公報
【特許文献６】特許第４２６４１３３号公報
【特許文献７】特許第３１０８１０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、本発明は、上記のような従来の問題を鑑みて、ＲＮＡの検出感度を向上させることのできるＲＮＡ検出用試薬、およびＲＮＡ検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するための手段として、本発明のＲＮＡ検出用試薬は、ＲＮＡウイルスを含む試料から前記ＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出し、前記抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法により増幅させて前記ＲＮＡを検出するために前記試料に添加されるＲＮＡ検出用試薬であって、ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含むことを特徴としている。
【００１４】
また、本発明のＲＮＡ検出方法は、ＲＮＡウイルスを含む試料からＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出する抽出工程と、前記抽出工程で抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ反応工程とを備えるＲＮＡ検出方法において、前記試料にポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含む試薬を添加することを特徴としている。
【００１５】
前記のようにＲＮＡウイルスを含む試料にポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含むＲＮＡ検出用試薬を添加して、ウイルスのＲＮＡの抽出を行い、さらにＰＣＲ法によってＲＮＡを増幅させることによって、ＰＣＲ法におけるＲＮＡの検出感度が向上し、微量なＲＮＡでも検出することが可能になる。
尚、本発明でいうＲＮＡ検出用試薬とは、特に限定する記載がない限り、ＲＮＡ検出するためのすべての工程で用いられる試薬をいう。
【００１６】
また、本発明のＲＮＡ検出方法では、前記抽出工程の前に前記試料に前記試薬を添加することが好ましい。
【００１７】
前記抽出工程の前に前記試薬を添加することによって、よりＲＮＡ検出感度を向上させることができる。
【００１８】
本発明において、前記抽出工程では、前記試料にフェノールを含む液を接触させることで試料からＲＮＡを抽出することを実施することが好ましい。
【００１９】
試料にフェノールを含む液を接触させる抽出を行なう方法において、試料にポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含む試薬を添加することで、効果的にＲＮＡの検出感度が向上する。
【００２０】
また、本発明においては、ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルス、ネコカリシウイルス、ノロウイルス、デングウイルスからなる群から選択される一種または二種以上であることが好ましい。
【００２１】
前記ＲＮＡウイルスを含む試料からのＲＮＡ検出を行なう場合には、本発明のＲＮＡ検出用試薬、またはＲＮＡ検出方法によれば、特に高い検出感度が得られる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、ＲＮＡの検出感度を向上させることができ、従って、試料中に含まれるＲＮＡウイルスが微量あっても、精度よくＲＮＡウイルスのＲＮＡを検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に、本実施形態のＲＮＡ検出用試薬およびこれらの試薬を用いたＲＮＡ検出方法について具体的に説明する。
【００２４】
本実施形態のＲＮＡ検出用試薬は、ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含むものである。
【００２５】
前記ポリアクリル酸とは、構成単量体の主成分がアクリル酸単量体（質量比率５０％以上）である重合体をいう。
【００２６】
前記ポリアクリル酸は、好ましくは、重量平均分子量（Ｍｗ）が、約４，０００〜約３０万程度、好ましくは、約１００００〜約５００００程度のものが好ましい。
【００２７】
前記ポリアクリル酸塩とは、構成単量体の主成分がアクリル酸塩単量体（質量比率５０％以上）である重合体をいう。
前記アクリル酸塩単量体としては、アクリル酸ナトリウム、アクリル酸アンモニウム、アクリル酸カリウムなどが挙げられ、特にアクリル酸ナトリウムを用いることが好ましい。
【００２８】
前記ポリアクリル酸塩は、好ましくは、重量平均分子量（Ｍｗ）が、約２０００〜１０万程度、好ましくは約１００００〜約５００００程度のものが好ましい。
【００２９】
前記ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩は、それぞれアクリル酸またはアクリル酸塩の単量体と他の単量体との共重合体であってもよい。
また、前記ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩には、前記各単量体以外に架橋剤が添加されて架橋されていてもよい。
【００３０】
前記ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩の各重量平均分子量は、ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）法により、例えば、下記装置および条件で求められる。
【００３１】
（分析装置）
恒温槽：昭和電工株式会社製 ＳＨＯＤＥＸ ＯＶＥＮ Ａ０−３０
送液ポンプ：昭和電工株式会社製 ＳＨＯＤＥＸ ＤＳ−４
検出器：昭和電工株式会社製 ＳＨＯＤＥＸ ＲＩ−１０１
デガッサー：昭和電工株式会社製 ＳＨＯＤＥＸ ＥＲＣ−３１１５α
解析ソフト：システムインスルツメンツ社製 ＳＩＣ ４８０II データステーション
カラム：昭和電工株式会社製 ＳＢ−８０６ＭＨＱ ＋ ＳＢ−８０４ＨＱ 直列
【００３２】
（分析条件）
溶離液：０．１Ｍ ＮａＮＯ3水溶液
恒温槽温度：４０℃
流量：１ｍｌ／分
ＧＰＣカラム用標準試料：昭和電工株式会社製 プルラン(商品名) Ｐ−５、Ｐ−１０、Ｐ−２０、Ｐ−５０、Ｐ−１００、Ｐ−２００、Ｐ−４００、Ｐ−８００
試料注入量：前記試料の１質量％水溶液を５０μｌ注入
【００３３】
前記標準試料のピーク時間から検量線を作成し、試料のクロマトグラムを前記解析ソフトを用いて解析し、分子量を算出する。
【００３４】
本実施形態のＲＮＡ検出用試薬は、前記ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を水、その他の溶媒に溶解させて、試薬として調整することができる。
前記ＲＮＡ検出用試薬におけるポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩の濃度は、１０００〜１００００μｇ／ｍｌ程度である。
ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩の濃度範囲を前記範囲に調整することで、試料への添加濃度の調整が容易に行える。
【００３５】
前記前記ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を試薬として調整する調整方法としては、例えば、溶媒の温度１０℃から３５℃(室温)で、６０〜１８０分間程度攪拌することで調整することができる。
【００３６】
本実施形態のＲＮＡ検出用試薬には、さらに抗生物質などが添加されていてもよい。
使用可能な抗生物質としては、例えば、ペニシリンやストレプトマイシンなどが挙げられる。
さらに本実施形態のＲＮＡ検出用試薬には、抽出性を高めるために界面活性剤などが添加されていてもよい。
【００３７】
あるいは、本実施形態のＲＮＡ検出用試薬は、ＲＮＡ検出に使用される他の試薬、例えば、タンパク質変性剤、ＲＮＡ分解酵素阻害剤などと共に混合した混合液として調整してもよい。このように他の試薬と混合しておくことで、試薬をその都度添加する手間が省略できる。
【００３８】
次に前記のようなＲＮＡ検出用試薬を用いて試料中のＲＮＡを検出する方法について説明する。
【００３９】
（１）試料の準備
血液などの検査用試料を準備する。通常の検出方法と同様に必要に応じて適当な倍率に希釈してもよい。
また、検査用試料としては血液の他、咽頭ぬぐい液や気管吸引液（例インフルエンザウイルス）、血清（例：Ｃ型肝炎ウイルス）、組織、細胞の他に、尿・便（例ノロウイルス）等の排泄物、環境試料（下水、河川水等）などを検査用試料として用いることが可能である。
【００４０】
本発明では、種々のＲＮＡウイルスから抽出されるＲＮＡの検出に適用可能であるが、例えば、エンベロープを有するＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、デングウイルス、エンベローブを有しないノロウイルスの実験室での代替ウイルスとして用いられることが多いネコカリシウイルスなどのウイルスＲＮＡの検出に用いることができる。
これらのウイルスの中でも、特に、エンベロープを有するウイルスには検出感度向上効果が高い。
【００４１】
（２）ＲＮＡの抽出工程
前記試料からＲＮＡを抽出する。
まず、前記試料に前記のＲＮＡ検出用試薬を添加する。
試料に対するＲＮＡ検出用試薬の添加量は、試料の濃度や、ウイルスの種類などによって適宜調整可能である。例えば、前記ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩が好ましくは０．２μｇ／ｍｌ〜２０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２〜５００μｇ／ｍｌとなるようにＲＮＡ検出用試薬を試料に添加することが好ましい。
【００４２】
前記ＲＮＡ検出用試薬を添加した試料から、公知の手法、例えばフェノール・クロロフォルム抽出法によってＲＮＡを抽出する。
ＲＮＡ抽出には市販のＲＮＡ抽出用試薬キット、例えば、ＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロジェン社製））等を添付のプロトコールに従って使用することができる。
例えば、下記のような手順でＲＮＡ抽出を行なう。
【００４３】
まず、試料をＴＲＩＺＯＬ試薬に溶解させる。試料が血液などの液体の場合には、適宜希釈した液を、試料が培養細胞などの固体の場合には予めホモジェナイズしておいたものを、ＴＲＩＺＯＬ試薬に混合して溶解させる。
ＴＲＩＺＯＬ試薬に試料を溶解させた液を1５分間静置して、クロロホルムを添加し、チューブに入れ遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、４℃）する。
遠心分離後、ＲＮＡを含む上澄みと、その他の成分（タンパク質、炭水化物など）を含む沈殿に分離し、上澄みを取り出すことでＲＮＡ成分を含む水溶液が抽出できる。
さらに、上澄みを別のチューブにいれて、イソプロパノールを添加し、１０分間静置した後、遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、４℃）した上澄みを除去するとＲＮＡの沈殿が生成する。その沈殿にエタノール（７５％）を添加しさらに遠心分離（７５００×ｇ、５分間、４℃）するとＲＮＡが洗浄できる。
沈殿・洗浄したＲＮＡ沈殿を乾燥後、ＤＮａｓｅ Ｗａｔｅｒに再溶解させることで、ＲＮＡが回収できる。
【００４４】
（３）逆転写工程
前記のように試料から抽出されたＲＮＡを用いて、逆転写によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。
逆転写は、市販の逆転写酵素用試薬キット、例えば、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステムズ社製）等を、添付のプロトコールに従って使用することができる。
例えば、逆転写酵素、ランダムプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＲＮＡ分解酵素阻害剤（ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、付属のバッファーおよびＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水をプロトコールに従って調整し（１試料あたり全量で１０μｌとなるように調整）、前記回収されたＲＮＡを調整した試薬に同量の１０μｌ添加してピペッティングで混合する。
混合後、１０分間室温で静置し、３７℃で２時間逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成する。
逆転写反応後のｃＤＮＡは、８５℃で１０秒保温させることで、酵素を不活化させておく。
【００４５】
（４）ＰＣＲ反応工程
次に、前記逆転写によって生成されたｃＤＮＡをＰＣＲ反応によって増幅させて検出を行う。
ＰＣＲ反応によるｃＤＮＡの検出は、公知のＰＣＲ法を用いたＰＣＲ装置を適宜用いて行うことができる。
ＰＣＲ装置で検出されるデータはｃＤＮＡの量であるため、これを元の試料中に含まれるＲＮＡ量に換算することで、試料中に含まれていたＲＮＡ量およびＲＮＡウイルスの検出が可能となる。
尚、ＲＮＡ量とｃＤＮＡ量は同量であるが、生データとして得られるｃＤＮＡ量は、最終的にＰＣＲ反応させたｃＤＮＡ量であるため、元の試料中に含まれるＲＮＡ量に換算する場合には、希釈を考慮して換算する。
【００４６】
前記のようなＰＣＲ反応工程において試料中に含まれるウイルスＲＮＡを検出する場合、血液などの試料に含まれている不純物が残存物質として各工程における酵素反応などを阻害している可能性があり、これらの残存物質が、最終的なウイルスＲＮＡの検出感度に悪影響を及ぼしていると考えられる。
【００４７】
本発明のＲＮＡ検出用試薬が実際にどのような作用でＲＮＡ検出の感度を向上させているのか、その詳細な原理は不明だが、おそらく、前記ＲＮＡの抽出工程において、ＲＮＡの抽出効率を向上させていると考えられる。
また、本発明のＲＮＡ検出用試薬は前記のようにＲＮＡの抽出前の試料に添加し、その後試料を抽出工程、逆転写工程、ＰＣＲ反応工程において各処理を実施するため、各工程における残存物質の阻害作用を低下させて、ＲＮＡ検出感度を向上させているとも考えられる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例および比較例を用いて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
［実施例１］
（ＲＮＡ検出用試薬）
ＲＮＡ検出用試薬として、下記の各ポリアクリル酸（Ａ〜Ｃ）、ポリアクリル酸ナトリウム（Ａ〜Ｃ）、ポリカルボン酸系コンクリート混和剤（Ａ、Ｂ）ポリカルボン酸ナトリウム、アクリル系ポリマー、ポリビニルアルコール（Ａ〜Ｃ）、ポリエチレングリコール（Ａ〜Ｄ）、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（Ａ，Ｂ）、エチルセルロース、メチルセルロースを、それぞれ各成分濃度が１０００μｇ／ｍｌとなるように水（超純水）に溶解させたものを準備した。
尚、下記各成分のうち、ポリアクリル酸ナトリウムＡ，ポリカルボン酸系コンクリート混和剤（ＡおよびＢ）については、濃度が不明であったため、１００倍希釈したものを各量用いた。
また、下記の分子量は、前記装置および条件でＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）法により測定した重量平均分子量であって、測定値の有効数値を２桁または１桁で示した。
【００５０】
各ポリアクリル酸およびポリアクリル酸ナトリウムは下記のものを使用した。
ポリアクリル酸Ａ：ポリアクリル酸 ５，０００（和光純薬工業株式会社製、分子量５０００、等級 和光１級）
ポリアクリル酸Ｂ：ポリアクリル酸 ２５，０００（和光純薬工業株式会社製、分子量２５０００、等級 和光１級）
ポリアクリル酸Ｃ：ポリアクリル酸 ２５０，０００（和光純薬工業株式会社製、分子量２５００００、等級 和光１級）
ポリアクリル酸ナトリウムＡ：ポリアクリル酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、重合度２，７００〜７，５００）
ポリアクリル酸ナトリウムＢ：ポリアクリル酸ナトリウム（Ａ−２０ＵＮ 東亜合成株式会社製、分子量２０，０００ 固形分４２％）
ポリアクリル酸ナトリウムＣ：ポリアクリル酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、重合度３０，０００〜４０，０００）
ポリカルボン酸系コンクリート混和剤Ａ：（シーカメント１１００ＮＴ、日本シーカ株式社製）
ポリカルボン酸系コンクリート混和剤Ｂ：（チューポールＨＰ−８、竹本油脂株式会社製）
ポリカルボン酸ナトリウム：（Ａ−６３１０、東亜合成株式会社製）
アクリル系ポリマー：（Ａ−６３８０、東亜合成株式会社製）
ポリビニルアルコールＡ：（和光純薬工業株式会社製、重合度５００）
ポリビニルアルコールＢ：（和光純薬工業株式会社製、重合度１５００）
ポリビニルアルコールＣ：（和光純薬工業株式会社製、重合度２０００）
ポリエチレングリコールＡ：（和光純薬工業株式会社製 分子量３００、等級1級）
ポリエチレングリコールＢ：（和光純薬工業株式会社製 分子量２０００、等級1級）
ポリエチレングリコールＣ：（和光純薬工業株式会社製 分子量６０００、等級1級）
ポリエチレングリコールＤ：（和光純薬工業株式会社製 分子量２００００、等級1級）
ポリエチレンスルホン酸ナトリウムＡ：（ポリサイエンス社製、分子量４６００）
ポリエチレンスルホン酸ナトリウムＢ：（ポリサイエンス社製、分子量１８０００）
エチルセルロース：（和光純薬工業株式会社製）
メチルセルロース：（和光純薬工業株式会社製）
【００５１】
（試料）
ウイルスとしてＡ型インフルエンザウイルス（株：Ａ／ＰＲ／８／３４）を用い、ウイルス液の濃度が２５０μｌ中に１×１０4ＰＦＵとなるように調整した。
培養液として、ＭＥＭ培地、Ｌ−グリタミン、非必須アミノ酸、炭酸水素ナトリウム（ｐＨ調整用）からなる培養液を用いた。
【００５２】
表１及び表２に示すように、前記ＲＮＡ検出用試薬を５〜２４５μｌと前記培養液を合わせ各２５０μｌになるように調整した試験例１〜４２、および、ＲＮＡ検出用試薬を添加せずにウイルス液５μｌと培養液２４５μｌからなる標準液を準備した。
尚、試験例１、８、１５、２２、２９および３６については、前記ＲＮＡ検出用試薬を１０００倍希釈したものを、試験例２、９、１６、２３、３０および３７については、前記ＲＮＡ検出用試薬を１００倍希釈したものを、試験例３、１０、１７、２４、３１および３８については、前記ＲＮＡ検出用試薬を１０倍希釈したものを各５μｌずつ用いた。
【００５３】
（ＲＮＡ抽出工程）
抽出用の試薬としては、ＴＲＩＺＯＬ（商品名、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。
各液２５０μｌに対し、前記ＴＲＩＺＯＬを７５０μｌ添加した。
この溶液をよく混和し、１５分間室温で静置した後、２００μｌのクロロホルムを添加して、遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、４℃）する。
その後、水層を回収した。
回収した水層約７００μｌあたり５００μｌのイソプロパノールを添加して、１０分間室温で静置し、遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、４℃）して、ＲＮＡ成分を沈殿させ、上澄みを除去する。
残ったＲＮＡ沈殿物に、７５％エタノールを 1ｍｌ添加し、ボルテックス後、5分間室温で静置し、さらに遠心分離（９０００×ｇ、５分間、４℃）することによってＲＮＡ沈殿を洗浄した。
一度、上清を除去した後、さらに遠心分離（９０００×g、2分間、4℃）し、残存している上清を除去した。上清除去後のＲＮＡ沈殿物を、15分間風乾させ、エタノールを除去した。
風乾後のＲＮＡ沈殿物に、ＤＥＰＣ処理水を１５μl加え、ピペッティングし、ＲＮＡ溶解液を得た。
【００５４】
（逆転写工程およびＰＣＲ反応工程）
前記抽出されたＲＮＡを、ＤＥＰＣ処理水１５μｌで溶解し、そのうちの１０μｌのＲＮＡを用いて、２０μｌのｃＤＮＡを合成した（逆転写工程）。
合成したｃＤＮＡのうち５μｌを使用し、下記のＰＣＲ装置を用いてＲＮＡ量を測定した（ＰＣＲ反応工程）。
前記逆転写工程および、ＰＣＲ反応の手順は、以下の試薬またはキットの方法に準拠した。
尚、ウイルスのプライマーおよびプローブは、ウイルス株の遺伝子配列を基に、遺伝子解析ソフトウエアＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０(アプライドバイオシステム社製)を用いて設計した。
本実施例のウイルスのプライマーおよびプローブは、Ａ型インフルエンザウイルス株を１４１株抽出し、その中で相同性の高い共通プライマー、プローブとなるプライマーおよびプローブを選定した。
【００５５】
逆転写キット：Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステムズ社製）
ＰＣＲ反応キット：イーグルタックマスターミックス（ＲＯＸ）（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）
ＰＣＲ装置（リアルタイムＰＣＲ）：アプライドバイオシステムズ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）
【００５６】
各試験例および標準液においてＰＣＲ装置で測定した生データと、この生データから換算した２５０μｌ中のＲＮＡ量（ｃｏｐｙ）を表１および表２に記載した。
尚、換算値は、生データを０．１６７で除した数値である。その理由は、前記抽出したＲＮＡ１５μｌのうち、１０μｌをｃＤＮＡ合成に使い、合成したｃＤＮＡ２０μｌのうち、５μｌをＰＣＲ装置にかけてＰＣＲ反応させたため、生データ（ｃＤＮＡ数）を０．１６７で除した値が２５０μｌの検査用試料に含まれるＲＮＡ量となるためである。
すなわち、換算値が検出されたＲＮＡ量となる。
【００５７】
尚、今回のＰＣＲ測定条件において、使用したＰＣＲ装置の検出限界値は、１０ｃｏｐｙであった。
【００５８】
【表１】
【００５９】
【表２】
【００６０】
ＲＮＡ検出用試薬を添加しない標準液では、検出されたＲＮＡ量（換算値）が１．７×１０2ｃｏｐｙであった。
この標準液に対して、ポリアクリル酸またはポリアクリル酸ナトリウムを添加した各試験例では、前記標準液と同等以上のＲＮＡ量（ｃｏｐｙ数）が検出された。
特に、ポリアクリル酸またはポリアクリル酸ナトリウムの含有量を１．５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌになるようにＲＮＡ検出用試薬を添加した場合に、前記標準液よりも１０倍以上のＲＮＡ量（ｃｏｐｙ数）が検出された。
一方、試験例４７〜１０４では、特に標準液と比べても有意な差は見られなかった。
【００６１】
［実施例２］
実施例２では、前記実施例１のＲＮＡ検出用試薬の中から、ポリアクリル酸Ｂを用いたＲＮＡ検出用試薬を準備し、ウイルスとして、ネコカリシウイルス（株：ＦＣＶ−２２８０）を用いた。
前記実施例１と同様に、濃度が１．０×１０4ＰＦＵ／２５０μｌとなるように調整したウイルス液を各５μｌずつ準備し、これに対して前記ＲＮＡ検出用試薬を２．５，５．０，５０μｌ、培養液を２４２．５、２４０、１９５μｌずつ準備した。
前記ＲＮＡ検出用試薬を、前記実施例１と同様にＲＮＡ抽出前にウイルス液および培養液に混合した場合のＲＮＡ検出量と、ＲＮＡ抽出工程におけるアルコール沈殿のアルコール添加前のウイルス液および培養液にＲＮＡ検出用試薬を添加した場合のＲＮＡ検出量をそれぞれ測定した。
【００６２】
尚、逆転写に必要な各ウイルスのプライマーおよびプローブは、前記ネコシリカウイルス株の遺伝子配列を基に、遺伝子解析ソフトウエアＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０(アプライドバイオシステム社製)を用いて、アプライド社の設計ガイドラインに最も近くなる、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０で示されるペナルティスコアが最も低くなるものを選定して用いた。
【００６３】
前記以外の条件は実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出工程、逆転写工程およびＰＣＲ反応工程を実施し、ＲＮＡ抽出前にウイルス液および培養液に混合した場合のＲＮＡ検出量をＡ（２５０μｌ中のウイルス量換算値ｃｏｐｙ）とし、ＲＮＡ抽出工程におけるアルコール沈殿のアルコール添加前のウイルス液および培養液にＲＮＡ検出用試薬を添加した場合のＲＮＡ検出量をＢ（２５０μｌ中のウイルス量換算値ｃｏｐｙ）としＡ／Ｂの値を表３に示した。
【００６４】
【表３】
【００６５】
表３で示すように、ネコカリシウイルスの場合には、ＲＮＡ抽出前に本実施例の試薬を試料中に添加する方が、アルコール沈殿の前に添加する場合よりもよりＲＮＡ検出感度が向上していることが明らかである。
【００６６】
［実施例３］
実施例３では、前記実施例１のＲＮＡ検出用試薬の中から、ポリアクリル酸Ｂを用いたＲＮＡ検出用試薬を準備し、ウイルスとして、デングウイルス（株：ＮＥＷ Ｇｕｉｎｅａ Ｃ）を用い、前記実施例１と同様に、濃度が１．０×１０4ＰＦＵ／２５０μｌとなるように調整したウイルス液を各５μｌずつ準備し、これに対して前記ＲＮＡ検出用試薬を５．０μｌ、培養液を２４０μｌ準備した。比較として、培養液２４２．５μｌのみのものを準備した。
前記以外の条件は実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出工程、逆転写工程およびＰＣＲ反応工程を実施し、ＲＮＡ検出量を測定した（２５０μｌ中のウイルス量換算値ｃｏｐｙ）。
結果を表４に示す。
【００６７】
【表４】
【００６８】
実施例１と同様に、ＲＮＡ検出用試薬を添加した試験例１０８では標準液よりも１００倍程度多いＲＮＡ量（ｃｏｐｙ数）が検出された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡウイルスを含む試料から前記ＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出し、前記抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法により増幅させて前記ＲＮＡを検出するために前記試料に添加されるＲＮＡ検出用試薬であって、
ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含むことを特徴とするＲＮＡ検出用試薬。
【請求項２】
前記ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルス、ネコカリシウイルス、ノロウイルス、デングウイルスからなる群から選択される一種または二種以上である請求項１に記載のＲＮＡ検出用試薬。
【請求項３】
ＲＮＡウイルスを含む試料からＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出する抽出工程と、前記抽出工程で抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ反応工程とを備えるＲＮＡ検出方法において、
前記試料にポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含む試薬を添加することを特徴とするＲＮＡ検出方法。
【請求項４】
前記抽出工程の前に、前記試料に前記試薬を添加する請求項３に記載のＲＮＡ検出方法。
【請求項５】
前記抽出工程では、前記試料にフェノールを含む液を接触させることで試料からＲＮＡを抽出することを実施する請求項３または４に記載のＲＮＡ検出方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルス、ネコカリシウイルス、ノロウイルス、デングウイルスからなる群から選択される一種または二種以上である請求項３乃至５のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法。
【請求項１】
ＲＮＡウイルスを含む試料から前記ＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出し、前記抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法により増幅させて前記ＲＮＡを検出するために前記試料に添加されるＲＮＡ検出用試薬であって、
ポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含むことを特徴とするＲＮＡ検出用試薬。
【請求項２】
前記ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルス、ネコカリシウイルス、ノロウイルス、デングウイルスからなる群から選択される一種または二種以上である請求項１に記載のＲＮＡ検出用試薬。
【請求項３】
ＲＮＡウイルスを含む試料からＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出する抽出工程と、前記抽出工程で抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ反応工程とを備えるＲＮＡ検出方法において、
前記試料にポリアクリル酸および／またはポリアクリル酸塩を含む試薬を添加することを特徴とするＲＮＡ検出方法。
【請求項４】
前記抽出工程の前に、前記試料に前記試薬を添加する請求項３に記載のＲＮＡ検出方法。
【請求項５】
前記抽出工程では、前記試料にフェノールを含む液を接触させることで試料からＲＮＡを抽出することを実施する請求項３または４に記載のＲＮＡ検出方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルス、ネコカリシウイルス、ノロウイルス、デングウイルスからなる群から選択される一種または二種以上である請求項３乃至５のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法。
【公開番号】特開２０１２−２２３０９８（Ｐ２０１２−２２３０９８Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９１１７４（Ｐ２０１１−９１１７４）
【出願日】平成２３年４月１５日（２０１１．４．１５）
【出願人】（５１０２１６８６５）
【出願人】（０００１８３２６６）住友大阪セメント株式会社 (1,342)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月１５日（２０１１．４．１５）
【出願人】（５１０２１６８６５）
【出願人】（０００１８３２６６）住友大阪セメント株式会社 (1,342)
【Ｆターム（参考）】
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