組み換え宿主細胞内でプロセシングを受けた一次翻訳産物を用いて、タンパク質を発現させるのに有用である構築物及び方法を開示する。単一オープンリーディングフレーム（ｓＯＲＦ）を含む構築物を、複数のポリペプチドの発現を含めて、タンパク質発現用に記述する。一次翻訳産物（プロタンパク質又はポリタンパク質）は、複数の目的タンパク質サブユニット間にインフレームで挿入された、インテイン又はヘッジホッグファミリー自動プロセシングドメイン、その変種などのポリペプチドを含む。一次産物は、他のタンパク質分解性切断又はプロテアーゼ認識部位、複数のタンパク質サブユニットの少なくとも２個を分離する、シグナルペプチダーゼ用の認識配列を含むシグナルペプチドなどの切断配列も含み得る。挿入された自動プロセシングポリペプチド又は切断部位の配列は、別々の複数のタンパク質サブユニットの発現の効率を高めるように操作することができる。免疫グロブリンなどのタンパク質の効率的発現、分泌及び／又は多量体組立てを実施する独立した態様も開示する。ポリタンパク質が、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の各セグメント、又は抗原認識可能な断片を含む場合、一実施形態においては、選択可能な化学量論比は、重鎖セグメント１個当たりの軽鎖セグメントが少なくとも２コピーであり、その結果、適切に折り畳まれ、組み立てられた機能的抗体が作製される。免疫グロブリン軽鎖由来のものを含めて、修飾シグナルペプチドを記載する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓＯＲＦ挿入断片を含む１種類以上の組み換えタンパク質産物を産生するための発現ベクターであり、前記ｓＯＲＦ挿入断片が、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列と、及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列とを含み、前記第１のタンパク質切断部位をコードする前記介在核酸配列が前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間に作動可能に位置し、ならびに前記第１のタンパク質切断部位において切断可能であるｓＯＲＦポリペプチドを発現可能である、前記発現ベクター。
【請求項２】
前記第１のタンパク質切断部位が自己プロセシング切断部位を含む、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記自己プロセシング切断部位が、インテインセグメント又は修飾インテインセグメントを含み、修飾インテインセグメントは、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの切断を可能にするが、完全な連結を可能にしない、請求項１又は２の発現ベクター。
【請求項４】
前記自己プロセシング切断部位が、ヘッジホッグセグメント又は修飾ヘッジホッグセグメントを含み、修飾ヘッジホッグセグメントが、前記第１のポリペプチドの前記第２のポリペプチドからの切断を可能にする、請求項１又は２の発現ベクター。
【請求項５】
第１のポリペプチドと第２のポリペプチドが多量体組立て可能である、請求項１から４のいずれかの発現ベクター。
【請求項６】
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方が細胞外分泌可能である、請求項１から５のいずれかの発現ベクター。
【請求項７】
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方がほ乳動物起源である、請求項１から６のいずれかの発現ベクター。
【請求項８】
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方が免疫グロブリン重鎖又はその機能的断片を含む、請求項１から７のいずれかの発現ベクター。
【請求項９】
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方が免疫グロブリン軽鎖又はその機能的断片を含む、請求項１から８のいずれかの発現ベクター。
【請求項１０】
前記第１のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖又はその機能的断片を含み、前記第２のポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖又はその機能的断片を含み、前記第１のポリペプチドと第２のポリペプチドが任意の順序である、請求項１から９のいずれかの発現ベクター。
【請求項１１】
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドが多量体組立てにおいて会合して、機能的抗体又は他の抗原認識分子を形成可能である、請求項１から１０のいずれかの発現ベクター。
【請求項１２】
前記第１のポリペプチドが前記第２のポリペプチドの上流にある、請求項１から１１のいずれかの発現ベクター。
【請求項１３】
前記第２のポリペプチドが前記第１のポリペプチドの上流にある、請求項１から１２のいずれかの発現ベクター。
【請求項１４】
第３のポリペプチドをコードする第３の核酸配列を更に含み、前記第３の核酸配列が前記第２の核酸配列の後に作動可能に位置し、及び前記第３の配列が独立に前記第１の核酸配列又は前記第２の核酸配列のどちらかと同じでも、異なっていてもよい、請求項１から１３のいずれかの発現ベクター。
【請求項１５】
前記第１、第２及び第３のポリペプチドの少なくとも２種類が多量体組立てにおいて会合可能である、請求項１４の発現ベクター。
【請求項１６】
第２のタンパク質切断部位をコードする第２の介在核酸配列を更に含み、前記第２の介在核酸配列が前記第１及び前記第２の核酸配列の後に作動可能に位置し、及び前記第２の介在配列が前記第１の介在核酸配列と同じでも、異なっていてもよい、請求項１から１５のいずれかの発現ベクター。
【請求項１７】
第３のポリペプチドをコードする第３の核酸配列と、及び第２のタンパク質切断部位をコードする第２の介在核酸配列とを更に含み、第２の介在核酸配列と第３の核酸配列がこの順で前記第２の核酸配列の後に作動可能に位置する、請求項１から１６のいずれかの発現ベクター。
【請求項１８】
前記第３の核酸配列が、免疫グロブリン重鎖、軽鎖、又はそれぞれにその機能的断片をコードする、請求項１から１７のいずれかの発現ベクター。
【請求項１９】
前記第３の核酸配列が、免疫グロブリン軽鎖又はその機能的断片をコードする、請求項１４から１８のいずれかの発現ベクター。
【請求項２０】
前記第３の核酸配列が、免疫グロブリン重鎖又はその機能的断片をコードする、請求項１４から１８のいずれかの発現ベクター。
【請求項２１】
第１のタンパク質切断部位をコードする前記第１の介在核酸配列が、シグナルペプチド切断部位又は修飾シグナルペプチド切断部位配列をコードするシグナルペプチド核酸を含む、請求項１から２０のいずれかの発現ベクター。
【請求項２２】
前記第１の核酸配列又は前記第２の核酸配列の前に作動可能に位置する、シグナルペプチド切断部位をコードするシグナルペプチド核酸配列を更に含む、請求項１から２１のいずれかの発現ベクター。
【請求項２３】
シグナルペプチド切断部位を各々独立にコードする２個のシグナルペプチド核酸配列を更に含み、一方のシグナルペプチド核酸配列が、前記第１のポリペプチドをコードする前記第１の核酸の前に作動可能に位置し、及びもう一方のシグナルペプチド核酸配列が、前記第２のポリペプチドをコードする前記第２の核酸の前に作動可能に位置する、請求項１から２２のいずれかの発現ベクター。
【請求項２４】
前記シグナルペプチド核酸配列が、免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド切断部位又は修飾免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド切断部位をコードする、請求項２１から２３のいずれかの発現ベクター。
【請求項２５】
シグナルペプチド核酸配列が修飾又は非修飾免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド切断部位をコードし、及び前記修飾部位が、前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、及び前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの集合分子の少なくとも１つを切断し、その分泌を増大させることが可能であり、ならびに前記シグナルペプチド部位の存在下の分泌レベルが、前記シグナルペプチド部位の非存在下の分泌レベルの約１０％から約１００倍大きい、請求項２４の発現ベクター。
【請求項２６】
第１のタンパク質切断部位をコードする前記介在核酸配列が、パイロコッカス ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）Ｐｈｏ Ｐｏｌ Ｉ配列、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＶＭＡ配列、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種Ｓｔｒａｉｎ ＰＣＣ６８０３ ＤｎａＥ配列、マイコバクテリウム ゼノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ）ＧｙｒＡ配列、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａ型細菌インテイン様（ＢＩＬ）ドメイン及びＢ型ＢＩＬからなる群から選択されるインテイン又は修飾インテイン配列を含む、請求項１から３のいずれかの発現ベクター。
【請求項２７】
第１のタンパク質切断部位をコードする前記介在核酸配列が、ヘッジホッグファミリーメンバーのＣ末端自動プロセシング（ａｕｔｏ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）ドメインを含み、ヘッジホッグファミリーメンバーがショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、マウス、ヒト、又は他の昆虫若しくは動物種に由来する、請求項１、２及び４のいずれかの発現ベクター。
【請求項２８】
第１のタンパク質切断部位をコードする前記介在核酸配列が、線虫由来のｗａｒｔｈｏｇ、ｇｒｏｕｎｄｈｏｇ、若しくは他のホッグ（ｈｏｇ）含有遺伝子からのＣ末端自動プロセシングドメイン、又は襟鞭毛虫由来のＨｏｇｌｅｔドメインを含む、請求項１、２及び４のいずれかの発現ベクター。
【請求項２９】
前記第１及び前記第２のポリペプチドが、腫よう壊死因子α、エリスロポイエチン受容体、ＲＳＶ、ＥＬ／セレクチン、インターロイキン１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、インターロイキン１８、インターロイキン２３、ＣＸＣＬ−１３、ＧＬＰ−１Ｒ及びアミロイドベータからなる群から選択される抗原との結合に対する抗原特異性を有する、機能的抗体又は他の抗原認識分子を含む、請求項１から２８のいずれかの発現ベクター。
【請求項３０】
第１及び第２のポリペプチドが、Ｄ２Ｅ７、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５、ＥＬ２４６又はＡＢＴ−８７４の抗体由来の１対の免疫グロブリン鎖を含む、請求項１から２８のいずれかの発現ベクター。
【請求項３１】
第１及び第２のポリペプチドが、Ｄ２Ｅ７、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５、ＥＬ２４６、ＡＢＴ−８７４又は他の抗体の類似のセグメントに由来する、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖セグメントから各々独立に選択される、請求項１から２８のいずれかの発現ベクター。
【請求項３２】
前記ｓＯＲＦ挿入断片に対するプロモーター調節エレメントを更に含む、請求項１から３１のいずれかの発現ベクター。
【請求項３３】
前記プロモーター調節エレメントが誘導性又は構成的である、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３４】
前記プロモーター調節エレメントが組織特異的である、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３５】
前記プロモーターがアデノウイルス主要後期プロモーターを含む、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
前記第１のタンパク質切断部位を切断可能であるプロテアーゼをコードする核酸を更に含む、請求項１から３５のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項３７】
プロテアーゼをコードする前記核酸が、前記ｓＯＲＦ挿入断片内に作動可能に位置し、前記発現ベクターが、プロテアーゼをコードする前記核酸と、前記第１の核酸と前記第２の核酸の少なくとも一方との間に位置する第２の切断部位をコードする追加の核酸を更に含む、請求項３６に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
請求項１から３７のいずれかに記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３９】
原核細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
真核細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
前記真核細胞が、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
前記真核細胞が、ほ乳動物細胞、トリ細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
ＣＨＯ細胞又はジヒドロ葉酸還元酵素欠乏ＣＨＯ細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
ＣＯＳ細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
酵母細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
前記酵母細胞がサッカロミセス セレビシエである、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
昆虫ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
ヒト胎児腎細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
請求項３８に記載の宿主細胞を培地中で、ベクタータンパク質の発現に十分な条件下で培養することを含む、組み換えポリタンパク質又は複数のタンパク質を製造する方法。
【請求項５１】
前記ベクタータンパク質の回収及び／又は精製を更に含む、請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記複数のタンパク質が多量体組立て可能である、請求項５０から５１のいずれかの方法。
【請求項５３】
組み換えポリタンパク質又は複数のタンパク質が、生物学的に機能的である、及び／又は治療効果のある、請求項５０から５２のいずれかの方法。
【請求項５４】
請求項３８に記載の宿主細胞を培地中で、免疫グロブリンタンパク質若しくはその機能的断片、組み立てられた抗体、又は他の抗原認識分子の製造に十分な条件下で培養することを含む、免疫グロブリンタンパク質若しくはその機能的断片、組み立てられた抗体、又は他の抗原認識分子を製造する方法。
【請求項５５】
請求項５０から５４のいずれかの方法によって製造されたタンパク質。
【請求項５６】
請求項５０から５５のいずれかの方法によって製造されたポリタンパク質。
【請求項５７】
請求項５０から５６のいずれかの方法によって製造された、組み立てられた免疫グロブリン、組み立てられた他の抗原認識分子、又は個々の免疫グロブリン鎖若しくはその機能的断片。
【請求項５８】
腫よう壊死因子α、エリスロポイエチン受容体、インターロイキン１８、ＥＬ／セレクチン又はインターロイキン１２との特異的抗原結合をもたらす能力がある、又はその一因となる能力がある、請求項５７に記載の免疫グロブリン、他の抗原認識分子、又は個々の免疫グロブリン鎖若しくはその機能的断片。
【請求項５９】
免疫グロブリンがＤ２Ｅ７である、又は機能的断片がＤ２Ｅ７の断片である、請求項５８に記載の免疫グロブリン又はその機能的断片。
【請求項６０】
請求項５５から５９のいずれかに記載のタンパク質と、薬剤として許容される担体とを含む、薬剤組成物。
【請求項６１】
前記第１のタンパク質切断部位が、細胞のプロテアーゼ切断部位、又はウイルスのプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１又は２の発現ベクター。
【請求項６２】
前記第１のタンパク質切断部位が、フューリン；ＩＰＮＶのＶＰ４；タバコ エッチ（ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ）ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ；ライノウイルスの３Ｃプロテアーゼ；ＰＣ５／６プロテアーゼ；ＰＡＣＥプロテアーゼ、ＬＰＣ／ＰＣ７プロテアーゼ；エンテロキナーゼ；活性化第Ｘ因子プロテアーゼ；トロンビン；ｇｅｎｅｎａｓｅ Ｉ；ＭＭＰプロテアーゼ；カブモザイクポティウイルスの核封入タンパク質ａ（Ｎ１ａ）；デング熱４型フラビウイルスのＮＳ２Ｂ／ＮＳ３、黄熱病ウイルスのＮＳ３プロテアーゼ；カリフラワーモザイクウイルスのＯＲＦ Ｖ；ＫＥＸ２プロテアーゼ；ＣＢ２；又は２Ａによって認識される部位を含む、請求項１又は２に記載の発現ベクター。
【請求項６３】
前記第１のタンパク質切断部位が、ウイルス内部切断可能シグナルペプチド切断部位である、請求項１又は２の発現ベクター。
【請求項６４】
前記ウイルス内部切断可能シグナルペプチド切断部位が、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス又は風疹ウイルス由来の部位を含む、請求項６３の発現ベクター。
【請求項６５】
二重ハイブリッド系のタンパク質の発現方法であり、前記二重ハイブリッド系がベイト（ｂａｉｔ）タンパク質とプレイ（ｐｒｅｙ）タンパク質候補とを含み、ベイトタンパク質部分とプレイタンパク質候補部分とを含むポリタンパク質をコードする発現ベクターが導入された宿主細胞を用意する段階（前記各部分は自己プロセシング切断配列、シグナルペプチド配列又はプロテアーゼ切断部位によって分離されている）と、ポリタンパク質の発現、及びポリタンパク質の自己プロセシング又はプロテアーゼ切断が可能である条件下で宿主細胞を培養する段階とを含む、前記方法。
【請求項６６】
ポリタンパク質が三重ハイブリッド系の切断可能成分を更に含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
２Ａ配列を含まない、請求項１から３７及び６１から６４のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項６８】
前記第１のタンパク質切断部位が、ＦＭＤＶ ２Ａ配列、又は他のピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、トリパノソーマ若しくはサーモトガ マリチマ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来の２Ａ様ドメインを含む、請求項１又は２に記載の発現ベクター。
【請求項６９】
ポリタンパク質のコード配列を含む、組み換えタンパク質を発現するための発現ベクターであり、ポリタンパク質が少なくとも第１及び第２のタンパク質セグメントを含み、前記各タンパク質セグメントがその間のタンパク質切断部位によって分離されており、タンパク質切断部位が自己プロセシングペプチド切断配列、シグナルペプチド切断配列又はプロテアーゼ切断配列を含み、及び前記コード配列が宿主細胞中で発現可能であり、及び宿主細胞内で切断される、発現ベクター。
【請求項７０】
前記介在核酸配列がタグを更にコードする、請求項１から３７、６１から６４、６７及び６８のいずれかの発現ベクター。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【公表番号】特表２００９−５０８４７０（Ｐ２００９−５０８４７０Ａ）
【公表日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２３０４２（Ｐ２００８−５２３０４２）
【出願日】平成１８年７月２１日（２００６．７．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２８６９１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１４１６２
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】