ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞及びその用途
本発明の一つ以上の具体例は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞及びその用途を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、造血母細胞と共に、骨髄に存在する成体幹細胞であり、骨髄または臍帯血などから得られ、比較的分離及び増殖が容易である。間葉系幹細胞は、多様な水溶性因子を分泌して、多様な中胚葉性細胞系統（軟骨芽細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、脂肪細胞）及び組織に分化が可能であるために、組織損傷の治療に利用しようとする試みがなされており、移植及び自家免疫疾患のモデルで、免疫寛容及び免疫抑制の効果があると知られている。免疫調節性Ｔ細胞と、自家免疫性病因反応を引き起こすＴｈ１７細胞とを同時に調節することは、免疫疾患だけではなく、ガンや移植拒否反応でも、非常に重要な免疫反応である。
【０００３】
ＴＧＦβ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３と呼ばれる３つのアイソフォームが存在する分泌された蛋白質である。ＴＧＦβは、大きい蛋白質前駆体としてコーディングされるが、ＴＧＦβ１は、３９０個のアミノ酸を含み、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３は、それぞれ４１２個のアミノ酸を含む。ＴＧＦβは、細胞からの分泌に必要な２０〜３０個のアミノ酸のＮ末端信号ペプチドであり、潜在性関連ペプチド（ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）、またはＬＡＰと呼ばれるプロ領域（ｐｒｏ−ｒｅｇｉｏｎ）及び蛋白質切断によって、前記プロ領域から放出されて成熟したＴＧＦβ分子にする１１２〜１１４個のアミノ酸のＣ末端領域を有している。本明細書全体において、ＴＧＦβは、ＴＧＦβの前駆体及び成熟したＴＧＦβを含む意味に使われる。
【０００４】
一方、前記の先行技術にもかかわらず、自家抗原によって誘発された自家免疫疾患を有する個体に投与される場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３調節Ｔ細胞は増加させると同時に、Ｔｈ１７細胞は減少させることができる組成物が依然として要求されていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一具体例は、個体の自家免疫疾患治療用の組成物を提供するものである。
本発明の他の具体例は、個体で、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞を減少させるための組成物を提供するものである。
本発明の他の具体例は、個体の自家免疫疾患を治療する方法を提供するものである。
本発明の他の具体例は、自家抗原特異的ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞は減少させる方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一具体例は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む個体の自家免疫疾患治療用の組成物を提供する。
本発明の他の具体例は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む、個体で自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞を減少させるための組成物を提供する。
本発明の他の具体例は、前記の自家免疫疾患治療用の組成物を個体に投与する段階を含む個体の自家免疫疾患を治療する方法を提供する。
本発明の他の具体例は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞は減少させる方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の一具体例による個体の自家免疫疾患治療用の組成物によれば、個体の自家免疫疾患を効率的に治療することができる。
本発明の他の具体例による、個体で自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞を減少させるための組成物によれば、個体で自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させると同時に、Ｔｈ１７細胞を減少させることができる。
本発明の他の具体例による個体の自家免疫疾患を治療する方法によれば、個体で自家免疫疾患を効率的に治療することができる。
本発明の他の具体例による自家抗原特異的ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞は減少させる方法によれば、個体で自家抗原特異的ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させるＴｈ１７細胞は減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ｐＡｄｌｏｘ−ｅＧＦＰ ＴＧＦｂのベクター地図を示した図面であり、該ベクターは、配列番号１のＴＧＦβ１をコーディングするヌクレオチド配列（ＴＧＦ−ｂ）を含んでいる。
【図２】コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ：ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）動物に、骨髄由来間葉系幹細胞またはＴＧＦβ遺伝子挿入骨髄由来間葉系幹細胞を、腹腔内に１回注入した後、１５週まで観察した関節炎臨床指数を示したグラフである。
【図３】正常マウスの脾臓細胞で分離した、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞、骨髄由来間葉系幹細胞（＋ＭＳＣ）またはＴＧＦβ遺伝子挿入骨髄由来間葉系幹細胞（＋ＴＧＦｂＭＳＣ）を３日間共生培養した後、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞に分化した程度を、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を介して分析した結果である。
【図４】動物モデル脾臓細胞を培地単独、または自家抗原である第２型コラーゲン（ＣＩＩ：ＴｙｐｅＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ）刺激と共に３日間共生培養した後、免疫調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ））と、ＩＬ−１７を分泌するＴ細胞との分化を蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を介して分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の一具体例は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む個体の自家免疫疾患治療用の組成物を提供する。
【００１０】
ＴＧＦβ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３と呼ばれる３つのアイソフォームが存在する分泌された蛋白質である。ＴＧＦβは、大きい蛋白質前駆体としてコーディングされるが、ＴＧＦβ１は、３９０個のアミノ酸を含み、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３は、それぞれ４１２個のアミノ酸を含む。ＴＧＦβは、細胞からの分泌に必要な２０〜３０個のアミノ酸のＮ末端信号ペプチドであって、潜在性関連ペプチド（ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）、またはＬＡＰと呼ばれるプロ領域（ｐｒｏ−ｒｅｇｉｏｎ）及び蛋白質切断によって前記プロ領域から放出されて成熟したＴＧＦβ分子にする１１２〜１１４個のアミノ酸のＣ末端領域を有している。本明細書全体において、ＴＧＦβは、ＴＧＦβの前駆体、及び成熟したＴＧＦβを含む意味として使われる。ＴＧＦβは、例えば、ＴＧＦβ１の前駆体及び成熟したＴＧＦβ１であってもよい。前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸配列、すなわち、ＴＧＦβ１のアミノ酸配列をコーディングすることができる。また、前記前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列、すなわち、ＴＧＦβ１をコーディングするヌクレオチド配列を有してもよい。
【００１１】
前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、当業界に公知の方法によって、細胞内に導入されたものであってもよい。例えば、前記配列は、それ自体の配列、またはベクターに含まれて導入されたものであってもよい。核酸配列を細胞に導入する方法は、公知である。前記導入は、例えば、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウムを利用した方法、遺伝子ガン（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）及びリポソーム法を含む方法によってなされてもよい。また、前記導入は、担体としてウイルスを使用してなされてもよい。前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、細胞のゲノム内に統合されたり、あるいはゲノムとは別個に細胞内に存在することができる。
【００１２】
本発明において、「ベクター」とは、連結されている他の核酸を伝達することができる核酸分子を意味する。特定の遺伝子の導入を媒介する核酸配列という観点で、本発明でのベクターは、核酸構造体、及びカセットと相互交換可能に使われるものであると解釈される。ベクターには、例えば、プラスミドまたはウイルス由来ベクターなどが含まれる。プラスミドとは、追加のＤＮＡが連結される円形の二重鎖ＤＮＡ環をいう。本発明で使われるベクターには、例えば、プラスミド発現ベクター、ウイルス発現ベクター（例、ＳＶ４０、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）及びそれらと同等な機能を遂行することができるウイルスベクターが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００１３】
前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、例えば、アデノウイルス関連ベクターによって導入されたものであってもよい。アデノウイルス関連ベクターとは、ヒト及び他の霊長類種（ｐｒｉｍａｔｅ ｓｐｅｃｉｅｓ）を感染させる小さいウイルスであるアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）を利用したベクターをいう。ＡＡＶは、疾病を起こさずに、それによって、非常に弱い免疫反応を起こすと知られている。ＡＡＶは、分裂する細胞及び分裂しない細胞いずれも感染させることができ、宿主細胞のゲノム内に、そのゲノムを統合させることができる。これら特性によってＡＡＶは、遺伝子治療のためのウイルスベクターを作るための魅力的な候補になっている。前記アデノウイルス関連ベクターは、配列番号１のヌクレオチド配列を有するｐＡｄｌｏｘ−ｅＧＦＰ ＴＧＦｂであってもよい。
【００１４】
本発明において、間葉系幹細胞は、多様な細胞形態に分化可能である多分化能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）をいう。間葉系幹細胞は、例えば、造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、筋肉母細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）及び軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）に分化することができる。一般的に間葉系幹細胞は、以下の特性一つ以上を有する：２つの子細胞が分裂後に異なる表現型を有することができる非同期的増殖（ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）または対称的増殖（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を行うことができる能力；それらが存在する組織、例えば、骨髄の非造血細胞（ｎｏｎ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ）のクローナル再生（ｃｌｏｎａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）。前記間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞を含む。「骨髄由来間葉系幹細胞」とは、骨髄から分離された間葉系幹細胞、またはそれを培養して得られた骨髄由来間葉系幹細胞を含む。「脂肪由来間葉系幹細胞」とは、脂肪から分離された間葉系幹細胞、またはそれを培養して得られた骨髄由来間葉系幹細胞を含む。間葉系幹細胞を分離することは、当業界に公知である。例えば、骨髄由来間葉系幹細胞は、公知の方法によって得られる（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４（５４１１）；Ｌｉｅｃｈｔｙ ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：１２８２−１２８６）。骨髄由来間葉系幹細胞は、例えば、マウスの大腿骨または脛骨で骨髄細胞が分離した後、ＤＭＥＭ培地で継続的に継代培養、例えば、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータで継代培養した後、１０回継代以上になれば、表面抗原を、遊細胞分析を介して調べることによって分離可能である。骨髄由来間葉系幹細胞を培養する方法は、公知である。例えば、分離された骨髄由来間葉系幹細胞は、３７℃でＩＭＤＢ培地またはＤＭＥＭ培地において培養される。
【００１５】
本明細書において、「薬剤学的に許容可能な担体」は、薬剤学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤及び滑沢剤が含まれるが、それらに限定されるものではない。前記担体は、例えば、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞の培養に必要な培地、注射用水及びバッファなどが含まれるが、それらに限定されるものではない。前記バッファは、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）であってもよい。前記担体は、例えば、乳糖、トウモロコシ澱粉、大豆油、微晶質セルロース及びマンニトールから構成された群から選択された一つ以上を含む希釈剤であってもよい。
【００１６】
前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、間葉系幹細胞に発現可能な状態で導入されたものであってもよい。例えば、前記配列が、プロモーター及びポリアデニレーション部位のような調節配列と作動可能に連結されており、前記間葉系幹細胞内で発現可能になものであってもよい。従って、前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入されていない間葉系幹細胞に比べ、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞で、ＴＧＦβを過発現させることができる。前記過発現の程度は、例えば、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入されていない間葉系幹細胞に比べ、活性蛋白質の量を基準に５％以上、１０％以上または１５％以上過発現されるものであってもよい。
【００１７】
前記個体は、哺乳動物であってもよい。前記哺乳動物は、例えば、ヒトまたはヒトではない霊長類であってもよい。前記個体は、例えば、ヒト、猿、犬、猫、牛またはマウスであってもよい。
【００１８】
本明細書において、「自家免疫疾患」は、個体内に正常に存在する物質及び／または組織に対して、個体の過度な免疫反応によって引き起こされる疾患を意味する。前記自家免疫疾患は、例えば、急性散在性脳脊髓炎（ＡＤＥＭ：ａｃｕｔｅ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、自家免疫溶血性貧血（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、自家免疫肝炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ：ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｉ型糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｔｙｐｅ１）、特発血小板減少性紫斑病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）、紅班ループス（Ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、多発性硬化症（ＭＳ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、尋常性天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、乾癬関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、リューマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、シューグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、潰瘍性結腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）及び血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）から構成された群から選択されるものであってもよい。
【００１９】
前記組成物において、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入されていない間葉系幹細胞に比べ、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞を減少させるものであってもよい。従って、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞は、自家抗原に対する特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させるので、自家抗原に係わって引き起こされる疾患を予防または治療できると同時に、Ｔｈ１７細胞を減少させるので、自家免疫による疾患の原因を低減させることができる。
【００２０】
前記自家抗原は、例えば、コラーゲンタイプＩＩ蛋白質、平滑筋アクチン（ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）、水疱性類天疱瘡抗原１及び２（ｂｕｌｌｏｕｓ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ ａｎｔｉｇｅｎ １ ａｎｄ ２）、トランスグルタミナーゼ、エラスチン、基底膜コラーゲンタイプＩＶ蛋白質、ガングリオシド、デスモゲイン３（ｄｅｓｍｏｇｅｉｎ ３）、ｐ６２、ｓｐ１００、リューマチ因子（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｆａｃｔｏｒ）及びトポイソメラーゼからなる群から選択されるものであってもよい。
【００２１】
本発明において、「治療」とは、個体の疾患を軽減、治療及び改善するだけではなく、予防することを含む。
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８及びＦｏｘｐ３を発現する調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｏｒ Ｔｒｅｇ）である。調節性Ｔ細胞は、他の細胞の免疫反応を抑制する免疫体系の構成員である。これは、過度な反応を防止するための免疫体系に設けられた重要な「自己点検（ｓｅｌｆ−ｃｈｅｃｋ）」メカニズムである。調節性Ｔ細胞は、侵犯する個体を首尾よく防いだ後で免疫反応を除去するものに係わり、潜在的に自己組織を攻撃することがある免疫反応を調節するもの（自家免疫：ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）と関連する。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、インビトロで生成された「抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）」Ｔ細胞集団と区分させるために、「天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｇｉｎｇ）」調節性Ｔ細胞とも呼ばれる。自己抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、前記自己抗原を有した細胞の免疫反応を抑制することができる。調節Ｔ細胞は、フォークヘッドファミリー転写因子Ｆｏｘｐ３（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐ３）の発現によって定義される。ＦＯＸＰ３の発現は、調節Ｔ細胞発生に必要であり、この細胞の運命を特定する遺伝プログラムを制御しているようである。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、ＦＯＰＸ３、ＣＤ４及びＩＬ−２受容体アルファ（α）鎖（ＣＤ２５）を発現する。
【００２２】
Ｔｈ１７細胞（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ １７ ｃｅｌｌ）は、ＩＬ−１７を生産するＴへルパ細胞のサブセットである。過量のＴｈ１７細胞は、自家免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）発生に関与すると見なされる。また、Ｔｈ１７細胞は、炎症及び炎症条件で、組織損傷（ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ）に関与すると考えられる。Ｔｈ１７細胞は、深刻な自家免疫疾患を引き起こす。従来、マウス及びヒトにおいて、ＴＧＦβ、ＩＬ−６、ＩＬ−２１及びＩＬ−２３がＴｈ１７形成に関与すると知られていた（Ｄｏｎｇ Ｃ （Ｍａｙ２００８），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（５）：３３７−４８；Ｍａｎｅｌ Ｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｎｅ ２００８），Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（６）：６４１−９）。
【００２３】
従って、本発明の組成物は、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は増加させるので、過度な自家抗原による免疫反応を抑制すると同時に、自家免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）発生に関与するＴｈ１７細胞は減少させるので、自家免疫疾患の治療に顕著な効果を有している。
【００２４】
本発明の他の具体例はＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む個体で自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞を減少させるための組成物を提供する。
【００２５】
本発明の他の具体例は、前記の自家免疫疾患治療用の組成物を個体に投与する段階を含む個体の自家免疫疾患を治療する方法を提供する。
前記組成物を個体に投与することは、当業界に公知の方法によってなされてもよい。例えば、前記投与は、経口または非経口の投与によってなされる。前記非経口投与は、例えば、腹腔内、静脈内、髓膜腔内、筋肉内、皮下、静脈内、真皮内、鼻腔内、粘膜内及び膣内への投与によってなされてもよい。
【００２６】
前記組成物の投与量は、前記自家免疫疾患を治療するのに十分な量、すなわち、「治療学的に有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」であってもよい。前記治療学的に有効な量は、自家免疫疾患の症状を軽減、改善、治療または予防するのに十分な量である。かような投与量は、選択される自家免疫疾患の種類、疾病の軽重、体重、年齢及び性別などによって、当業者が適切に選択することができる。前記投与量は、１ｘ１０4細胞／ｋｇ体重ないし１ｘ１０6細胞／ｋｇ体重、例えば、５ｘ１０4細胞／ｋｇ体重ないし１ｘ１０6細胞／ｋｇ体重であってもよい。
【００２７】
前記方法において、「自家免疫疾患治療用の組成物」及び「個体」については、前記の通りである。
本発明の他の具体例は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞は減少させる方法を提供する。
【００２８】
前記方法において、前記組成物を個体に投与することは、当業界に公知の方法によってなされてもよい。例えば、前記投与は、経口または非経口の投与によってなされる。前記非経口投与は、例えば、腹腔内、静脈内、髓膜腔内、筋肉内、皮下、静脈内、真皮内、鼻腔内、粘膜内及び膣内への投与によってなされてもよい。
【００２９】
前記組成物の投与量は、投与前に比べ、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞は減少させるのに十分な量である。かような投与量は、選択される自家免疫疾患の種類、疾病の軽重、体重、年齢及び性別などによって、当業者が適切に選択することができる。前記投与量は、１ｘ１０4細胞／ｋｇ体重ないし１ｘ１０6細胞／ｋｇ体重、例えば、５ｘ１０4細胞／ｋｇ体重ないし１ｘ１０6細胞／ｋｇ体重であってもよい。
前記方法において、「薬学的組成物」、「個体」、「自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞」及び「Ｔｈ１７細胞」については、前記の通りである。
【００３０】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１
（１）間葉系幹細胞の分離
間葉系幹細胞を分化させるために、６週齢のＤＢＡ１Ｊマウスの表皮と筋肉とを除去した後、大腿骨と脛骨とを分離した。次に、２６Ｇ注射器で、ＢＳＡ ０．３％を含有するＲＰＭＩ培地を骨中へ透過させ、骨髄単核球を抽出した。得られた骨髄単核球を、１０％ウシ胎児血漿（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を含んだＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）で、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータで培養した。５〜７日後に飽和状態になれば、継代培養して、培養中に一定間隔で細胞の形態学的変化を、顕微鏡を介して観察した。継代が１０回以上になれば、分離された間葉系幹細胞が、幹細胞の特性を示す細胞表面抗原を表現しているか否かを知るために、ＣＤマーカーを利用して遊細胞分析を行った。培養された細胞は、中間葉細胞の表面抗原であるＣＤ２９，ＣＤ４４及びＳｃａ−１に対し陽性反応を示したが、造血母細胞の表面抗原であるＣＤ３４及びＣＤ４５に対して、陰性反応を示すことを確認した。
【００３２】
（２）ＴＧＦβ遺伝子の間葉系幹細胞への導入
アデノウイルスは、効率的に細胞内に感染され、外来遺伝子を多量に発現させることができ、さまざまな種類の疾病の治療遺伝子を、生体内に伝達する遺伝子伝達体として多用されている。組み換えアデノウイルスを製造、分離するために、ｐＡｄｌｏｘ−ｅＧＦＰ ＴＧＦｂベクターを培地中に、２×１０9／ｍｌの濃度で定量し、ウイルス・ストック（ｖｉｒｕｓ ｓｔｏｃｋ）を製造した。
【００３３】
図１は、ｐＡｄｌｏｘ−ｅＧＦＰ ＴＧＦｂのベクター地図を示した図面である。前記ベクターは、配列番号１のＴＧＦβ１をコーディングするヌクレオチド配列（ＴＧＦ−ｂ）を含んでいる。図１に示したベクターは、ＴＧＦβ１遺伝子を発現するベクターシステムであり、ＴＲ、ｐａｃ、ＩＲＥＳ及びｅＧＦＰは、ウイルス・パッケージングに必要な構成要素である。
【００３４】
ｐＡｄｌｏｘ−ｅＧＦＰ ＴＧＦβベクターは、血清を添加していないＤＭＥＭ培地に、前記ウイルス・ストックを希釈し、１００ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で、前記ＤＢＡ１Ｊマウスで分離した間葉系幹細胞に感染させた。その後、感染された細胞は、既存の１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータで２４時間培養して収穫した。ＴＧＦβ遺伝子を導入した間葉系幹細胞でのＴＧＦβの発現は、蛍光顕微鏡と遊細胞分析とを利用してｅＧＦＰ発現を確認し、免疫酵素測定法を介してＴＧＦβ濃度を確認した。
【００３５】
（３）ＴＧＦβが導入された間葉系幹細胞のマウス腹腔投与による関節炎治療効能の確認
（３．１）動物モデルの準備及び投与
コラーゲンによって誘導される関節炎（ＣＩＡ：ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）動物モデルの準備及びＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞の投与は、次の通りである。
試験動物は、６〜７週齢のオスＤＢＡ−１系マウスを使用した。第２型コラーゲン（ＣＩＩ）を４ｍｇ／ｍｌになるように０．１Ｎ酢酸溶液に溶かした後、透析緩衝液（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２Ｎ Ｎａｃｌ）で透析し、Ｍ．ツベルクロシス（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）と同量で混ぜた後、マウスの尻尾基底部に皮下注射し、免疫源を１匹当たり１００μｌ（すなわち、１００μｌ／１００μｇ）で注射した（一次注射）。一次から２週間後、同じＣＩＩを同量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ：Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）と混ぜた後、１００μｌ（、すなわち、１００μｌ／１００μｇ）を一方の後足に注射した（二次注射）。
それから７週間後、１ｘ１０6／２００μｌ容量の対照群間葉系幹細胞、またはＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞を２００μｌの体積で腹腔内に注射した。
各群は、６匹ずつを対象に行い、関節炎評価は、１５週間まで評価し、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）試験のために、関節炎指数が有意性あるように違いが生じる時期に、各動物を致死させ、脾臓細胞内で関節炎疾病の活性と関連した免疫細胞の変化を観察した。
【００３６】
（３．２）ＣＩＡ動物でのＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞のリューマチ関節炎治療活性の評価
最初の接種を開始点として、３週間後から実験の内容を知らない観察者３名が、１週間に３回ずつ関節炎症の重症度を評価して、１０週間まで観察した。このとき、関節炎評価は、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉｅｃら（Ｗｏｏｌｅｙ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４（３）：６８８−７００）による平均関節炎指数を基準にし、１匹当たり二次接種時、ＣＩＩ／ＣＦＡを投与した足を除外した残りの３本の足で、下記の尺度によって付けた点数を合わせて３で割った平均値を得て、さらに各動物モデルで、３名の観察者が得た数値を合算して割った平均値を使用した。関節炎評価による点数と基準は、次の通りである。
【００３７】
０点：浮腫や腫脹がない
１点：足または足首関節に局限された軽度の浮腫及び発赤
２点：足首関節から中足骨（ｍｅｔａｔａｒｓａｌ）にわたった軽度の浮腫及び発赤
３点：足首関節から中足骨にわたった中程度の浮腫及び発赤
４点：足首で足全体にわたる浮腫及び発赤
【００３８】
１匹当たり最高の関節炎指数が４点であるので、マウス１匹当たり最高の疾病指数は、１６である。
ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞を注入した試験動物では、関節染指数が順次低くなることを確認することができ、一方、ＣＩＡ動物及び間葉系幹細胞を注入した動物では、関節炎が正常に発生し、関節炎臨床症状が、ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞を注入した試験動物と持続的に大きい差を示した（図２）。
【００３９】
図２は、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）動物に、間葉系幹細胞またはＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞を腹腔内に１回注入した後、１５週間まで観察した関節炎臨床指数を示したグラフである。図２で、ＣＩＡは、コラーゲン誘導関節炎動物モデル、ＭＳＣは、コラーゲン誘導関節炎動物モデルに、間葉系幹細胞を投与した群、ＴｂＭＳＣは、コラーゲン誘導関節炎動物モデルに、ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞を投与した群に係わる結果である。
【００４０】
（４）ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞による調節ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導及びＴｈ１７細胞の抑制
ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞によるリューマチ関節炎の治療メカニズムを究明するために、ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞によって誘導されたり抑制される免疫体系について調べた。
【００４１】
（４．１）ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞による調節ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導
ＣＩＡ動物を致死させて得た脾臓細胞を分離した後、培地単独で３７℃、５％ＣＯ2インキュベータで培養するか、あるいは４０μｇ／ｍｌ濃度のＣＩＩと共に３日間３７℃、５％ＣＯ2インキュベータで共生培養した後、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を利用して、Ｆｏｘｐ３を発現する細胞とＴｈ１７細胞との変化程度を観察した。
【００４２】
結果として、ＣＩＡ動物と、対照群である間葉系幹細胞を入れたマウスグループとを比較したとき、ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞を入れたマウスグループで分離した脾臓細胞が、ＣＩＩと共に刺激したときの培地単独より、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞誘導が増大し、Ｔｈ１７細胞誘導は抑制された。その結果、ＣＩＩに特異的なＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞が作られ、リューマチ関節炎の病因と関連している慢性炎症ＩＬ−１７生産Ｔ細胞（Ｔｈ１７細胞）の過増殖が抑制され、炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインとの均衡がなされつつ、リューマチ関節炎の進行抑制と治療とが可能であるということが分かる。
【００４３】
図３は、正常マウスの脾臓細胞で分離したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞、骨髄由来間葉系幹細胞（＋ＭＳＣ）、ＴＧＦβ遺伝子挿入骨髄由来間葉系幹細胞（＋ＴＧＦｂＭＳＣ）を３日間共生培養した後、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞に分化した程度を、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を介して分析した結果である。
図３に示されているように、骨髄由来間葉系幹細胞（＋ＴＧＦｂＭＳＣ）と脾臓細胞とを共生培養する場合、そうではない場合に比べ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の比率が上昇した（図３）。
【００４４】
図４は、動物モデル脾臓細胞を、培地単独または４０μｇ／ｍｌ濃度の自家抗原である第２型コラーゲン（ＣＩＩ）刺激と共に３日間共生培養した後、免疫調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ））と、ＩＬ−１７を分泌するＴ細胞との分化を蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を介して分析した結果である。
図４で、ＣＩＡ、ＭＳＣ及びＴＧＦｂ−ＭＳＣは、それぞれ関節炎動物モデルで分離された脾臓細胞、関節炎動物モデルに間葉系幹細胞を投与した動物から分離された脾臓細胞、及び関節炎動物モデルに、ＴＧＦβ挿入間葉系幹細胞を投与した動物から分離された脾臓細胞に係わる結果であり、Ｎｉｌ及びＣＩＩは、それぞれ単独またはＣＩＩと共生培養した場合の結果である。図４に示されているように、関節炎動物モデルにＴＧＦβ挿入間葉系幹細胞を投与した動物から分離された脾臓細胞は、自家抗原であるＣＩＩと共生培養する場合、関節炎動物モデルに間葉系幹細胞だけを投与した動物から分離された脾臓細胞が自家抗原であるＣＩＩと共生培養する場合に比べ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、増加し、Ｔｈ１７細胞は、減少した。
【００４５】
以上の結果から、ＴＧＦβ挿入間葉系幹細胞は、自家抗原に対する過度な免疫反応の結果として引き起こされる自家免疫疾患の治療に効果的であるということが分かる。
本明細書に添付された配列表に記載された配列は、配列番号を参照して記載した。前記添付された配列表は、その全体内容が援用によって本明細書に含まれるものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、造血母細胞と共に、骨髄に存在する成体幹細胞であり、骨髄または臍帯血などから得られ、比較的分離及び増殖が容易である。間葉系幹細胞は、多様な水溶性因子を分泌して、多様な中胚葉性細胞系統（軟骨芽細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、脂肪細胞）及び組織に分化が可能であるために、組織損傷の治療に利用しようとする試みがなされており、移植及び自家免疫疾患のモデルで、免疫寛容及び免疫抑制の効果があると知られている。免疫調節性Ｔ細胞と、自家免疫性病因反応を引き起こすＴｈ１７細胞とを同時に調節することは、免疫疾患だけではなく、ガンや移植拒否反応でも、非常に重要な免疫反応である。
【０００３】
ＴＧＦβ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３と呼ばれる３つのアイソフォームが存在する分泌された蛋白質である。ＴＧＦβは、大きい蛋白質前駆体としてコーディングされるが、ＴＧＦβ１は、３９０個のアミノ酸を含み、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３は、それぞれ４１２個のアミノ酸を含む。ＴＧＦβは、細胞からの分泌に必要な２０〜３０個のアミノ酸のＮ末端信号ペプチドであり、潜在性関連ペプチド（ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）、またはＬＡＰと呼ばれるプロ領域（ｐｒｏ−ｒｅｇｉｏｎ）及び蛋白質切断によって、前記プロ領域から放出されて成熟したＴＧＦβ分子にする１１２〜１１４個のアミノ酸のＣ末端領域を有している。本明細書全体において、ＴＧＦβは、ＴＧＦβの前駆体及び成熟したＴＧＦβを含む意味に使われる。
【０００４】
一方、前記の先行技術にもかかわらず、自家抗原によって誘発された自家免疫疾患を有する個体に投与される場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３調節Ｔ細胞は増加させると同時に、Ｔｈ１７細胞は減少させることができる組成物が依然として要求されていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一具体例は、個体の自家免疫疾患治療用の組成物を提供するものである。
本発明の他の具体例は、個体で、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞を減少させるための組成物を提供するものである。
本発明の他の具体例は、個体の自家免疫疾患を治療する方法を提供するものである。
本発明の他の具体例は、自家抗原特異的ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞は減少させる方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一具体例は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む個体の自家免疫疾患治療用の組成物を提供する。
本発明の他の具体例は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む、個体で自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞を減少させるための組成物を提供する。
本発明の他の具体例は、前記の自家免疫疾患治療用の組成物を個体に投与する段階を含む個体の自家免疫疾患を治療する方法を提供する。
本発明の他の具体例は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞は減少させる方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の一具体例による個体の自家免疫疾患治療用の組成物によれば、個体の自家免疫疾患を効率的に治療することができる。
本発明の他の具体例による、個体で自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞を減少させるための組成物によれば、個体で自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させると同時に、Ｔｈ１７細胞を減少させることができる。
本発明の他の具体例による個体の自家免疫疾患を治療する方法によれば、個体で自家免疫疾患を効率的に治療することができる。
本発明の他の具体例による自家抗原特異的ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞は減少させる方法によれば、個体で自家抗原特異的ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させるＴｈ１７細胞は減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ｐＡｄｌｏｘ−ｅＧＦＰ ＴＧＦｂのベクター地図を示した図面であり、該ベクターは、配列番号１のＴＧＦβ１をコーディングするヌクレオチド配列（ＴＧＦ−ｂ）を含んでいる。
【図２】コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ：ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）動物に、骨髄由来間葉系幹細胞またはＴＧＦβ遺伝子挿入骨髄由来間葉系幹細胞を、腹腔内に１回注入した後、１５週まで観察した関節炎臨床指数を示したグラフである。
【図３】正常マウスの脾臓細胞で分離した、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞、骨髄由来間葉系幹細胞（＋ＭＳＣ）またはＴＧＦβ遺伝子挿入骨髄由来間葉系幹細胞（＋ＴＧＦｂＭＳＣ）を３日間共生培養した後、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞に分化した程度を、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を介して分析した結果である。
【図４】動物モデル脾臓細胞を培地単独、または自家抗原である第２型コラーゲン（ＣＩＩ：ＴｙｐｅＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ）刺激と共に３日間共生培養した後、免疫調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ））と、ＩＬ−１７を分泌するＴ細胞との分化を蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を介して分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の一具体例は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む個体の自家免疫疾患治療用の組成物を提供する。
【００１０】
ＴＧＦβ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３と呼ばれる３つのアイソフォームが存在する分泌された蛋白質である。ＴＧＦβは、大きい蛋白質前駆体としてコーディングされるが、ＴＧＦβ１は、３９０個のアミノ酸を含み、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３は、それぞれ４１２個のアミノ酸を含む。ＴＧＦβは、細胞からの分泌に必要な２０〜３０個のアミノ酸のＮ末端信号ペプチドであって、潜在性関連ペプチド（ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）、またはＬＡＰと呼ばれるプロ領域（ｐｒｏ−ｒｅｇｉｏｎ）及び蛋白質切断によって前記プロ領域から放出されて成熟したＴＧＦβ分子にする１１２〜１１４個のアミノ酸のＣ末端領域を有している。本明細書全体において、ＴＧＦβは、ＴＧＦβの前駆体、及び成熟したＴＧＦβを含む意味として使われる。ＴＧＦβは、例えば、ＴＧＦβ１の前駆体及び成熟したＴＧＦβ１であってもよい。前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸配列、すなわち、ＴＧＦβ１のアミノ酸配列をコーディングすることができる。また、前記前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列、すなわち、ＴＧＦβ１をコーディングするヌクレオチド配列を有してもよい。
【００１１】
前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、当業界に公知の方法によって、細胞内に導入されたものであってもよい。例えば、前記配列は、それ自体の配列、またはベクターに含まれて導入されたものであってもよい。核酸配列を細胞に導入する方法は、公知である。前記導入は、例えば、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウムを利用した方法、遺伝子ガン（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）及びリポソーム法を含む方法によってなされてもよい。また、前記導入は、担体としてウイルスを使用してなされてもよい。前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、細胞のゲノム内に統合されたり、あるいはゲノムとは別個に細胞内に存在することができる。
【００１２】
本発明において、「ベクター」とは、連結されている他の核酸を伝達することができる核酸分子を意味する。特定の遺伝子の導入を媒介する核酸配列という観点で、本発明でのベクターは、核酸構造体、及びカセットと相互交換可能に使われるものであると解釈される。ベクターには、例えば、プラスミドまたはウイルス由来ベクターなどが含まれる。プラスミドとは、追加のＤＮＡが連結される円形の二重鎖ＤＮＡ環をいう。本発明で使われるベクターには、例えば、プラスミド発現ベクター、ウイルス発現ベクター（例、ＳＶ４０、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）及びそれらと同等な機能を遂行することができるウイルスベクターが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００１３】
前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、例えば、アデノウイルス関連ベクターによって導入されたものであってもよい。アデノウイルス関連ベクターとは、ヒト及び他の霊長類種（ｐｒｉｍａｔｅ ｓｐｅｃｉｅｓ）を感染させる小さいウイルスであるアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）を利用したベクターをいう。ＡＡＶは、疾病を起こさずに、それによって、非常に弱い免疫反応を起こすと知られている。ＡＡＶは、分裂する細胞及び分裂しない細胞いずれも感染させることができ、宿主細胞のゲノム内に、そのゲノムを統合させることができる。これら特性によってＡＡＶは、遺伝子治療のためのウイルスベクターを作るための魅力的な候補になっている。前記アデノウイルス関連ベクターは、配列番号１のヌクレオチド配列を有するｐＡｄｌｏｘ−ｅＧＦＰ ＴＧＦｂであってもよい。
【００１４】
本発明において、間葉系幹細胞は、多様な細胞形態に分化可能である多分化能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）をいう。間葉系幹細胞は、例えば、造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、筋肉母細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）及び軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）に分化することができる。一般的に間葉系幹細胞は、以下の特性一つ以上を有する：２つの子細胞が分裂後に異なる表現型を有することができる非同期的増殖（ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）または対称的増殖（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を行うことができる能力；それらが存在する組織、例えば、骨髄の非造血細胞（ｎｏｎ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ）のクローナル再生（ｃｌｏｎａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）。前記間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞を含む。「骨髄由来間葉系幹細胞」とは、骨髄から分離された間葉系幹細胞、またはそれを培養して得られた骨髄由来間葉系幹細胞を含む。「脂肪由来間葉系幹細胞」とは、脂肪から分離された間葉系幹細胞、またはそれを培養して得られた骨髄由来間葉系幹細胞を含む。間葉系幹細胞を分離することは、当業界に公知である。例えば、骨髄由来間葉系幹細胞は、公知の方法によって得られる（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４（５４１１）；Ｌｉｅｃｈｔｙ ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：１２８２−１２８６）。骨髄由来間葉系幹細胞は、例えば、マウスの大腿骨または脛骨で骨髄細胞が分離した後、ＤＭＥＭ培地で継続的に継代培養、例えば、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータで継代培養した後、１０回継代以上になれば、表面抗原を、遊細胞分析を介して調べることによって分離可能である。骨髄由来間葉系幹細胞を培養する方法は、公知である。例えば、分離された骨髄由来間葉系幹細胞は、３７℃でＩＭＤＢ培地またはＤＭＥＭ培地において培養される。
【００１５】
本明細書において、「薬剤学的に許容可能な担体」は、薬剤学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤及び滑沢剤が含まれるが、それらに限定されるものではない。前記担体は、例えば、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞の培養に必要な培地、注射用水及びバッファなどが含まれるが、それらに限定されるものではない。前記バッファは、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）であってもよい。前記担体は、例えば、乳糖、トウモロコシ澱粉、大豆油、微晶質セルロース及びマンニトールから構成された群から選択された一つ以上を含む希釈剤であってもよい。
【００１６】
前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、間葉系幹細胞に発現可能な状態で導入されたものであってもよい。例えば、前記配列が、プロモーター及びポリアデニレーション部位のような調節配列と作動可能に連結されており、前記間葉系幹細胞内で発現可能になものであってもよい。従って、前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入されていない間葉系幹細胞に比べ、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞で、ＴＧＦβを過発現させることができる。前記過発現の程度は、例えば、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入されていない間葉系幹細胞に比べ、活性蛋白質の量を基準に５％以上、１０％以上または１５％以上過発現されるものであってもよい。
【００１７】
前記個体は、哺乳動物であってもよい。前記哺乳動物は、例えば、ヒトまたはヒトではない霊長類であってもよい。前記個体は、例えば、ヒト、猿、犬、猫、牛またはマウスであってもよい。
【００１８】
本明細書において、「自家免疫疾患」は、個体内に正常に存在する物質及び／または組織に対して、個体の過度な免疫反応によって引き起こされる疾患を意味する。前記自家免疫疾患は、例えば、急性散在性脳脊髓炎（ＡＤＥＭ：ａｃｕｔｅ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、自家免疫溶血性貧血（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、自家免疫肝炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ：ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｉ型糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｔｙｐｅ１）、特発血小板減少性紫斑病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）、紅班ループス（Ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、多発性硬化症（ＭＳ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、尋常性天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、乾癬関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、リューマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、シューグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、潰瘍性結腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）及び血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）から構成された群から選択されるものであってもよい。
【００１９】
前記組成物において、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入されていない間葉系幹細胞に比べ、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞を減少させるものであってもよい。従って、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞は、自家抗原に対する特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させるので、自家抗原に係わって引き起こされる疾患を予防または治療できると同時に、Ｔｈ１７細胞を減少させるので、自家免疫による疾患の原因を低減させることができる。
【００２０】
前記自家抗原は、例えば、コラーゲンタイプＩＩ蛋白質、平滑筋アクチン（ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）、水疱性類天疱瘡抗原１及び２（ｂｕｌｌｏｕｓ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ ａｎｔｉｇｅｎ １ ａｎｄ ２）、トランスグルタミナーゼ、エラスチン、基底膜コラーゲンタイプＩＶ蛋白質、ガングリオシド、デスモゲイン３（ｄｅｓｍｏｇｅｉｎ ３）、ｐ６２、ｓｐ１００、リューマチ因子（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｆａｃｔｏｒ）及びトポイソメラーゼからなる群から選択されるものであってもよい。
【００２１】
本発明において、「治療」とは、個体の疾患を軽減、治療及び改善するだけではなく、予防することを含む。
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８及びＦｏｘｐ３を発現する調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｏｒ Ｔｒｅｇ）である。調節性Ｔ細胞は、他の細胞の免疫反応を抑制する免疫体系の構成員である。これは、過度な反応を防止するための免疫体系に設けられた重要な「自己点検（ｓｅｌｆ−ｃｈｅｃｋ）」メカニズムである。調節性Ｔ細胞は、侵犯する個体を首尾よく防いだ後で免疫反応を除去するものに係わり、潜在的に自己組織を攻撃することがある免疫反応を調節するもの（自家免疫：ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）と関連する。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、インビトロで生成された「抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）」Ｔ細胞集団と区分させるために、「天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｇｉｎｇ）」調節性Ｔ細胞とも呼ばれる。自己抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、前記自己抗原を有した細胞の免疫反応を抑制することができる。調節Ｔ細胞は、フォークヘッドファミリー転写因子Ｆｏｘｐ３（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐ３）の発現によって定義される。ＦＯＸＰ３の発現は、調節Ｔ細胞発生に必要であり、この細胞の運命を特定する遺伝プログラムを制御しているようである。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、ＦＯＰＸ３、ＣＤ４及びＩＬ−２受容体アルファ（α）鎖（ＣＤ２５）を発現する。
【００２２】
Ｔｈ１７細胞（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ １７ ｃｅｌｌ）は、ＩＬ−１７を生産するＴへルパ細胞のサブセットである。過量のＴｈ１７細胞は、自家免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）発生に関与すると見なされる。また、Ｔｈ１７細胞は、炎症及び炎症条件で、組織損傷（ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ）に関与すると考えられる。Ｔｈ１７細胞は、深刻な自家免疫疾患を引き起こす。従来、マウス及びヒトにおいて、ＴＧＦβ、ＩＬ−６、ＩＬ−２１及びＩＬ−２３がＴｈ１７形成に関与すると知られていた（Ｄｏｎｇ Ｃ （Ｍａｙ２００８），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（５）：３３７−４８；Ｍａｎｅｌ Ｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｎｅ ２００８），Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（６）：６４１−９）。
【００２３】
従って、本発明の組成物は、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は増加させるので、過度な自家抗原による免疫反応を抑制すると同時に、自家免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）発生に関与するＴｈ１７細胞は減少させるので、自家免疫疾患の治療に顕著な効果を有している。
【００２４】
本発明の他の具体例はＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む個体で自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞を減少させるための組成物を提供する。
【００２５】
本発明の他の具体例は、前記の自家免疫疾患治療用の組成物を個体に投与する段階を含む個体の自家免疫疾患を治療する方法を提供する。
前記組成物を個体に投与することは、当業界に公知の方法によってなされてもよい。例えば、前記投与は、経口または非経口の投与によってなされる。前記非経口投与は、例えば、腹腔内、静脈内、髓膜腔内、筋肉内、皮下、静脈内、真皮内、鼻腔内、粘膜内及び膣内への投与によってなされてもよい。
【００２６】
前記組成物の投与量は、前記自家免疫疾患を治療するのに十分な量、すなわち、「治療学的に有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」であってもよい。前記治療学的に有効な量は、自家免疫疾患の症状を軽減、改善、治療または予防するのに十分な量である。かような投与量は、選択される自家免疫疾患の種類、疾病の軽重、体重、年齢及び性別などによって、当業者が適切に選択することができる。前記投与量は、１ｘ１０4細胞／ｋｇ体重ないし１ｘ１０6細胞／ｋｇ体重、例えば、５ｘ１０4細胞／ｋｇ体重ないし１ｘ１０6細胞／ｋｇ体重であってもよい。
【００２７】
前記方法において、「自家免疫疾患治療用の組成物」及び「個体」については、前記の通りである。
本発明の他の具体例は、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞は減少させる方法を提供する。
【００２８】
前記方法において、前記組成物を個体に投与することは、当業界に公知の方法によってなされてもよい。例えば、前記投与は、経口または非経口の投与によってなされる。前記非経口投与は、例えば、腹腔内、静脈内、髓膜腔内、筋肉内、皮下、静脈内、真皮内、鼻腔内、粘膜内及び膣内への投与によってなされてもよい。
【００２９】
前記組成物の投与量は、投与前に比べ、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞は減少させるのに十分な量である。かような投与量は、選択される自家免疫疾患の種類、疾病の軽重、体重、年齢及び性別などによって、当業者が適切に選択することができる。前記投与量は、１ｘ１０4細胞／ｋｇ体重ないし１ｘ１０6細胞／ｋｇ体重、例えば、５ｘ１０4細胞／ｋｇ体重ないし１ｘ１０6細胞／ｋｇ体重であってもよい。
前記方法において、「薬学的組成物」、「個体」、「自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞」及び「Ｔｈ１７細胞」については、前記の通りである。
【００３０】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１
（１）間葉系幹細胞の分離
間葉系幹細胞を分化させるために、６週齢のＤＢＡ１Ｊマウスの表皮と筋肉とを除去した後、大腿骨と脛骨とを分離した。次に、２６Ｇ注射器で、ＢＳＡ ０．３％を含有するＲＰＭＩ培地を骨中へ透過させ、骨髄単核球を抽出した。得られた骨髄単核球を、１０％ウシ胎児血漿（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を含んだＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）で、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータで培養した。５〜７日後に飽和状態になれば、継代培養して、培養中に一定間隔で細胞の形態学的変化を、顕微鏡を介して観察した。継代が１０回以上になれば、分離された間葉系幹細胞が、幹細胞の特性を示す細胞表面抗原を表現しているか否かを知るために、ＣＤマーカーを利用して遊細胞分析を行った。培養された細胞は、中間葉細胞の表面抗原であるＣＤ２９，ＣＤ４４及びＳｃａ−１に対し陽性反応を示したが、造血母細胞の表面抗原であるＣＤ３４及びＣＤ４５に対して、陰性反応を示すことを確認した。
【００３２】
（２）ＴＧＦβ遺伝子の間葉系幹細胞への導入
アデノウイルスは、効率的に細胞内に感染され、外来遺伝子を多量に発現させることができ、さまざまな種類の疾病の治療遺伝子を、生体内に伝達する遺伝子伝達体として多用されている。組み換えアデノウイルスを製造、分離するために、ｐＡｄｌｏｘ−ｅＧＦＰ ＴＧＦｂベクターを培地中に、２×１０9／ｍｌの濃度で定量し、ウイルス・ストック（ｖｉｒｕｓ ｓｔｏｃｋ）を製造した。
【００３３】
図１は、ｐＡｄｌｏｘ−ｅＧＦＰ ＴＧＦｂのベクター地図を示した図面である。前記ベクターは、配列番号１のＴＧＦβ１をコーディングするヌクレオチド配列（ＴＧＦ−ｂ）を含んでいる。図１に示したベクターは、ＴＧＦβ１遺伝子を発現するベクターシステムであり、ＴＲ、ｐａｃ、ＩＲＥＳ及びｅＧＦＰは、ウイルス・パッケージングに必要な構成要素である。
【００３４】
ｐＡｄｌｏｘ−ｅＧＦＰ ＴＧＦβベクターは、血清を添加していないＤＭＥＭ培地に、前記ウイルス・ストックを希釈し、１００ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で、前記ＤＢＡ１Ｊマウスで分離した間葉系幹細胞に感染させた。その後、感染された細胞は、既存の１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータで２４時間培養して収穫した。ＴＧＦβ遺伝子を導入した間葉系幹細胞でのＴＧＦβの発現は、蛍光顕微鏡と遊細胞分析とを利用してｅＧＦＰ発現を確認し、免疫酵素測定法を介してＴＧＦβ濃度を確認した。
【００３５】
（３）ＴＧＦβが導入された間葉系幹細胞のマウス腹腔投与による関節炎治療効能の確認
（３．１）動物モデルの準備及び投与
コラーゲンによって誘導される関節炎（ＣＩＡ：ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）動物モデルの準備及びＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞の投与は、次の通りである。
試験動物は、６〜７週齢のオスＤＢＡ−１系マウスを使用した。第２型コラーゲン（ＣＩＩ）を４ｍｇ／ｍｌになるように０．１Ｎ酢酸溶液に溶かした後、透析緩衝液（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２Ｎ Ｎａｃｌ）で透析し、Ｍ．ツベルクロシス（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）と同量で混ぜた後、マウスの尻尾基底部に皮下注射し、免疫源を１匹当たり１００μｌ（すなわち、１００μｌ／１００μｇ）で注射した（一次注射）。一次から２週間後、同じＣＩＩを同量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ：Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）と混ぜた後、１００μｌ（、すなわち、１００μｌ／１００μｇ）を一方の後足に注射した（二次注射）。
それから７週間後、１ｘ１０6／２００μｌ容量の対照群間葉系幹細胞、またはＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞を２００μｌの体積で腹腔内に注射した。
各群は、６匹ずつを対象に行い、関節炎評価は、１５週間まで評価し、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）試験のために、関節炎指数が有意性あるように違いが生じる時期に、各動物を致死させ、脾臓細胞内で関節炎疾病の活性と関連した免疫細胞の変化を観察した。
【００３６】
（３．２）ＣＩＡ動物でのＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞のリューマチ関節炎治療活性の評価
最初の接種を開始点として、３週間後から実験の内容を知らない観察者３名が、１週間に３回ずつ関節炎症の重症度を評価して、１０週間まで観察した。このとき、関節炎評価は、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉｅｃら（Ｗｏｏｌｅｙ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４（３）：６８８−７００）による平均関節炎指数を基準にし、１匹当たり二次接種時、ＣＩＩ／ＣＦＡを投与した足を除外した残りの３本の足で、下記の尺度によって付けた点数を合わせて３で割った平均値を得て、さらに各動物モデルで、３名の観察者が得た数値を合算して割った平均値を使用した。関節炎評価による点数と基準は、次の通りである。
【００３７】
０点：浮腫や腫脹がない
１点：足または足首関節に局限された軽度の浮腫及び発赤
２点：足首関節から中足骨（ｍｅｔａｔａｒｓａｌ）にわたった軽度の浮腫及び発赤
３点：足首関節から中足骨にわたった中程度の浮腫及び発赤
４点：足首で足全体にわたる浮腫及び発赤
【００３８】
１匹当たり最高の関節炎指数が４点であるので、マウス１匹当たり最高の疾病指数は、１６である。
ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞を注入した試験動物では、関節染指数が順次低くなることを確認することができ、一方、ＣＩＡ動物及び間葉系幹細胞を注入した動物では、関節炎が正常に発生し、関節炎臨床症状が、ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞を注入した試験動物と持続的に大きい差を示した（図２）。
【００３９】
図２は、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）動物に、間葉系幹細胞またはＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞を腹腔内に１回注入した後、１５週間まで観察した関節炎臨床指数を示したグラフである。図２で、ＣＩＡは、コラーゲン誘導関節炎動物モデル、ＭＳＣは、コラーゲン誘導関節炎動物モデルに、間葉系幹細胞を投与した群、ＴｂＭＳＣは、コラーゲン誘導関節炎動物モデルに、ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞を投与した群に係わる結果である。
【００４０】
（４）ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞による調節ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導及びＴｈ１７細胞の抑制
ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞によるリューマチ関節炎の治療メカニズムを究明するために、ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞によって誘導されたり抑制される免疫体系について調べた。
【００４１】
（４．１）ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞による調節ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導
ＣＩＡ動物を致死させて得た脾臓細胞を分離した後、培地単独で３７℃、５％ＣＯ2インキュベータで培養するか、あるいは４０μｇ／ｍｌ濃度のＣＩＩと共に３日間３７℃、５％ＣＯ2インキュベータで共生培養した後、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を利用して、Ｆｏｘｐ３を発現する細胞とＴｈ１７細胞との変化程度を観察した。
【００４２】
結果として、ＣＩＡ動物と、対照群である間葉系幹細胞を入れたマウスグループとを比較したとき、ＴＧＦβ遺伝子挿入間葉系幹細胞を入れたマウスグループで分離した脾臓細胞が、ＣＩＩと共に刺激したときの培地単独より、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞誘導が増大し、Ｔｈ１７細胞誘導は抑制された。その結果、ＣＩＩに特異的なＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞が作られ、リューマチ関節炎の病因と関連している慢性炎症ＩＬ−１７生産Ｔ細胞（Ｔｈ１７細胞）の過増殖が抑制され、炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインとの均衡がなされつつ、リューマチ関節炎の進行抑制と治療とが可能であるということが分かる。
【００４３】
図３は、正常マウスの脾臓細胞で分離したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞、骨髄由来間葉系幹細胞（＋ＭＳＣ）、ＴＧＦβ遺伝子挿入骨髄由来間葉系幹細胞（＋ＴＧＦｂＭＳＣ）を３日間共生培養した後、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞に分化した程度を、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を介して分析した結果である。
図３に示されているように、骨髄由来間葉系幹細胞（＋ＴＧＦｂＭＳＣ）と脾臓細胞とを共生培養する場合、そうではない場合に比べ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の比率が上昇した（図３）。
【００４４】
図４は、動物モデル脾臓細胞を、培地単独または４０μｇ／ｍｌ濃度の自家抗原である第２型コラーゲン（ＣＩＩ）刺激と共に３日間共生培養した後、免疫調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ））と、ＩＬ−１７を分泌するＴ細胞との分化を蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を介して分析した結果である。
図４で、ＣＩＡ、ＭＳＣ及びＴＧＦｂ−ＭＳＣは、それぞれ関節炎動物モデルで分離された脾臓細胞、関節炎動物モデルに間葉系幹細胞を投与した動物から分離された脾臓細胞、及び関節炎動物モデルに、ＴＧＦβ挿入間葉系幹細胞を投与した動物から分離された脾臓細胞に係わる結果であり、Ｎｉｌ及びＣＩＩは、それぞれ単独またはＣＩＩと共生培養した場合の結果である。図４に示されているように、関節炎動物モデルにＴＧＦβ挿入間葉系幹細胞を投与した動物から分離された脾臓細胞は、自家抗原であるＣＩＩと共生培養する場合、関節炎動物モデルに間葉系幹細胞だけを投与した動物から分離された脾臓細胞が自家抗原であるＣＩＩと共生培養する場合に比べ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、増加し、Ｔｈ１７細胞は、減少した。
【００４５】
以上の結果から、ＴＧＦβ挿入間葉系幹細胞は、自家抗原に対する過度な免疫反応の結果として引き起こされる自家免疫疾患の治療に効果的であるということが分かる。
本明細書に添付された配列表に記載された配列は、配列番号を参照して記載した。前記添付された配列表は、その全体内容が援用によって本明細書に含まれるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む個体の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項２】
前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするものであることを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項３】
前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項４】
前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、アデノウイルス関連ベクターによって導入されたものであることを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項５】
前記間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項６】
ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入されていない間葉系幹細胞に比べ、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された前記間葉系幹細胞は、個体内でＴＧＦβを過発現することを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項７】
前記自家免疫疾患は、急性散在性脳脊髓炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病（ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、自家免疫溶血性貧血（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、自家免疫肝炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｉ型糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｔｙｐｅ １）、特発血小板減少性紫斑病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）、紅班ループス（Ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、多発性硬化症（ＭＳ）、尋常性天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、乾癬関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、リューマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、シューグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、潰瘍性結腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）及び血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）から構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項８】
ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入されていない骨髄間葉系幹細胞に比べ、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ３５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞を減少させることを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項９】
前記個体は、哺乳動物であることを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項１０】
前記哺乳動物は、ヒトまたはマウスであることを特徴とする請求項９に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項１０のうち、いずれか１項に記載の自家免疫疾患治療用の組成物を個体に投与する段階を含む個体の自家免疫疾患を治療する方法。
【請求項１２】
ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞は減少させる方法。
【請求項１３】
前記個体は、ヒトではない哺乳動物であることを特徴とする請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む個体の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項２】
前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするものであることを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項３】
前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項４】
前記ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列は、アデノウイルス関連ベクターによって導入されたものであることを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項５】
前記間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項６】
ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入されていない間葉系幹細胞に比べ、ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された前記間葉系幹細胞は、個体内でＴＧＦβを過発現することを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項７】
前記自家免疫疾患は、急性散在性脳脊髓炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病（ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、自家免疫溶血性貧血（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、自家免疫肝炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｉ型糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｔｙｐｅ １）、特発血小板減少性紫斑病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）、紅班ループス（Ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、多発性硬化症（ＭＳ）、尋常性天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、乾癬関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、リューマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、シューグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、潰瘍性結腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）及び血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）から構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項８】
ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入されていない骨髄間葉系幹細胞に比べ、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ３５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞を減少させることを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項９】
前記個体は、哺乳動物であることを特徴とする請求項１に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項１０】
前記哺乳動物は、ヒトまたはマウスであることを特徴とする請求項９に記載の自家免疫疾患治療用の組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項１０のうち、いずれか１項に記載の自家免疫疾患治療用の組成物を個体に投与する段階を含む個体の自家免疫疾患を治療する方法。
【請求項１２】
ＴＧＦβをコーディングするヌクレオチド配列が導入された間葉系幹細胞と、薬剤学的に許容可能な担体と、を含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、自家抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増加させ、Ｔｈ１７細胞は減少させる方法。
【請求項１３】
前記個体は、ヒトではない哺乳動物であることを特徴とする請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１３−５０８３５３（Ｐ２０１３−５０８３５３Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３５１０６（Ｐ２０１２−５３５１０６）
【出願日】平成２２年８月２７日（２０１０．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００５７７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４９２９１
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５１００５８８６３）カトリック ユニバーシティ インダストリー アカデミック コーオペレイション ファウンデーション (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２７日（２０１０．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００５７７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４９２９１
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５１００５８８６３）カトリック ユニバーシティ インダストリー アカデミック コーオペレイション ファウンデーション (6)
【Ｆターム（参考）】
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