ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質、並びにそれらの製造法及びそれらを有効成分とする農園芸用殺菌剤
本発明は、下記の式（１）で表される新規なＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質並びにそれらの製造法及びそれらの少なくとも１つを有効成分とする農園芸用殺菌剤を提供する。本発明の新規化合物群は、畑、水田、果樹園、茶園、牧草地、芝生地などにおいて問題となる植物病害菌に対して優れた病原防除効果を示し、農園芸用殺菌剤としての利用が期待される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明はＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質、並びにそれらの製造法及びそれらの少なくとも１つを有効成分とする農園芸用殺菌剤に関する。
【背景技術】
従来、多くの農園芸用殺菌剤が知られているが、薬剤抵抗性や安全性などの問題から、より有効で安全に使える薬剤が必要とされている。果樹、野菜、穀類などに発生する、うどんこ病、べと病、たんそ病、さび病、いもち病などの植物病原菌に対してこれまで各種の薬剤が使用されているが、薬剤抵抗性などの問題からそれらの薬剤の使用が禁止されたり、あるいは制限されてきている。したがってこれらの分野では従来の薬剤とは異なる新規な薬剤の出現が課題となってきており、本発明はこれらを解決することを目的とするものである。本発明は微生物が生産する新規なＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質並びにそれらの製造法及びそれらの少なくとも１つを有効成分とする農園芸用殺菌剤を提供する。
【発明の開示】
農園芸用殺菌剤として利用できる新たな活性物質を、微生物の生産する培養物から探索したところ、本発明者らが新たに分離したＴＫ−５７株と命名したイサリア（Ｉｓａｒｉａ）属の子嚢菌の培養物中に植物病原菌に対し抗真菌活性を示す物質が生産されることを見出した。さらにこの抗真菌活性物質が下記の式（１）で表される化学構造を有することを見出し、新規な物質であることを確認して、本物質をＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質と命名した。
すなわち、本発明は下記の農園芸用殺菌活性物質ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を提供されるものである。
式（１）
Ｒ＝Ｅｔｈｙｌで示されるＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＲ＝Ｈで示されるＴＫ−５７−１６４Ｂ物質。
また、本発明は、イサリア（Ｉｓａｒｉａ）属に属するＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌を培養し、その培養物からＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を採取することを特徴とする上記に記載されているＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の製造法を提供するものである。
さらに、上記に記載されているＴＫ−５７−１６４Ａ物質およびＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の少なくとも１つを有効成分とする農園芸用殺菌剤およびイサリア（Ｉｓａｒｉａ）属に属する子嚢菌であって、上記のＴＫ−５７−１６４Ａ物質ならびにＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を生産する特性を有ＴＫ−５７株またはその変異株に関する。
＜発明の実施の態様＞
本発明の第１の要旨とするところは、前記の式（１）で表され、下記の理化学的性状を有するＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質にある。
１．ＴＫ−５７−１６４Ａ物質の理化学的性状
（１）色および形状 無色固体
（２）マススペクトル Ｍ／Ｚ ４１０．２５４６（Ｍ＋Ｈ）＋
（３）分子式 Ｃ２２Ｈ３５ＮＯ６
（４）比旋光度［α］Ｄ −２１．３°（ｃ０．１０，ＣＨＣｌ３，２５℃）
（５）紫外部吸収スペクトル λｍａｘ（ＭｅＯＨ） ２１３ｎｍ
（６）赤外部吸収スペクトル νｍａｘ（ＫＢｒ） ｃｍ−１
３４００，３３００，２９２４，２８５３，２３５９，２３４１，１７４２，１６８４，１６４９，１６３２，１５３３，１４６０，１３６９，１３４４，１２７３，１１９８，１１５５，１１０１，１０８４，１００１，９７４，９３４，９１６，８４５，８３５，８１２
（７）ＨＰＬＣ カラム；Ｗａｔｅｒｓ Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ １０φ×２５０ｍｍ、溶出溶媒；アセトニトリル−０．０５％ＴＦＡ（５２：４８）、流速；１．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＵＶ２５４ｎｍで保持時間４６．８４８分
（８）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル；δ（ｐｐｍ）（ＣＤＣＬ３、４００ＭＨｚ）
０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．２０−１．３１（１２Ｈ，ｍ），１．４４（２Ｈ，ｍ），２．０３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），２．１８（２Ｈ，ｍ），２．２１（１Ｈ，ｂｒｓ），２．４９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ１＝１２．７Ｈｚ，Ｊ２＝４．９Ｈｚ，Ｊ３＝１．７Ｈｚ），３．１５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ１＝７．６Ｈｚ，Ｊ２＝３．４Ｈｚ，Ｊ３＝１．５Ｈｚ），３．５０（３Ｈ，ｓ），３．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝３．６Ｈｚ，Ｊ２＝１．５Ｈｚ），３．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝３．６Ｈｚ，Ｊ２＝１．２Ｈｚ），３．７４（１Ｈ，ｂｒｓ），３．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝７．６Ｈｚ，Ｊ２＝１．２Ｈｚ），４．５０（１Ｈ，ｂｒｓ），４．８０（１Ｈ，ｍ），５．７７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ１＝１５．１Ｈｚ，Ｊ２＝１．５Ｈｚ），５．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．８９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ１＝１５．１Ｈｚ，Ｊ２＝７．１Ｈｚ）
（９）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル；δ（ｐｐｍ）（ＣＤＣＬ３、１００ＭＨｚ）
１４．１（ｑ），２２．７（ｔ），２８．２（ｔ），２９．２−２９．７（４Ｃ，ｔ），３１．９（ｔ），３２．１（ｔ），３７．８（ｔ），４６．０（ｄ），５５．０（ｄ），５５．１（ｄ），５８．７（ｑ），６３．７（ｄ），７２．３（ｄ），７５．８（ｓ），７７．３（ｄ），１２２．９（ｄ），１４６．３（ｄ），１６５．４（ｓ），２０７．６（ｓ）
２．ＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の理化学的性状
（１）色および形状 無色固体
（２）マススペクトル Ｍ／Ｚ ３８２．２２２７（Ｍ＋Ｈ）＋
（３）分子式 Ｃ２０Ｈ３１ＮＯ６
（４）比旋光度［α］Ｄ −１５．５°（ｃ０．１９，ＣＨＣｌ３，２５℃）
（５）紫外部吸収スペクトル λｍａｘ（ＭｅＯＨ） ２１３ｎｍ
（６）赤外部吸収スペクトル νｍａｘ（ＫＢｒ） ｃｍ−１
３４０２，３２９６，２９２６，２８５５，２３５９，２３４１，１７４２，１６８４，１６５１，１６３１，１５３１，１４５６，１３７１，１３４２，１２７３，１１９６，１１５５，１１０１，１０８４，１００１，９７４，９３４，９１６，８４５，８３３，８１２
（７）ＨＰＬＣ カラム；Ｓｅｎｓｈｕｐａｋ ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ １０φ×２５０ｍｍ、溶出溶媒；アセトニトリル−０．０５％ＴＦＡ（５２：４８）、流速；１．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＵＶ２１０ｎｍで保持時間１７．５３１分
（８）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル；δ（ｐｐｍ）（ＣＤＣＬ３、４００ＭＨｚ）
０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．２８（８Ｈ，ｍ），１．４３（２Ｈ，ｍ），２．０３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），２．１８（２Ｈ，ｍ），２．２１（１Ｈ，ｂｒｓ），２．４９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ１＝１２．７Ｈｚ，Ｊ２＝３．４Ｈｚ，Ｊ３＝１．９Ｈｚ），３．１５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ１＝７．８Ｈｚ，Ｊ２＝３．４Ｈｚ，Ｊ３＝１．９Ｈｚ），３．４９（３Ｈ，ｓ），３．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝３．９Ｈｚ，Ｊ２＝１．５Ｈｚ），３．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝３．９Ｈｚ，Ｊ２＝１．５Ｈｚ），３．７４（１Ｈ，ｂｒｓ），３．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝７．８Ｈｚ，Ｊ２＝１．５Ｈｚ），４．５０（１Ｈ，ｂｒｓ），４．８０（１Ｈ，ｍ），５．７７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ１＝１５．１Ｈｚ，Ｊ２＝１．５Ｈｚ），５．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．８９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ１＝１５．１Ｈｚ，Ｊ２＝７．１Ｈｚ）
（９）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル；δ（ｐｐｍ）（ＣＤＣＬ３、１００ＭＨｚ）
１４．１（ｑ），２２．６（ｔ），２８．２（ｔ），２９．１（２Ｃ，ｔ），３１．７（ｔ），３２．１（ｔ），３７．８（ｔ），４６．０（ｄ），５５．０（ｄ），５５．１（ｄ），５８．６（ｑ），６３．７（ｄ），７２．３（ｄ），７５．８（ｓ），７７．３（ｄ），１２２．９（ｄ），１４６．３（ｄ），１６５．４（ｓ），２０７．６（ｓ）
本発明の第２の要旨とするところは、イサリア属に属するＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌を培養し、その培養物からＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を採取することを特徴とする、ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の製造法である。
本発明に使用されるＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌の一例としては、本発明者らにより新たに分離され、以下のように独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６００として国際寄託されているイサリア属ＴＫ−５７株が挙げられる。
▲１▼寄託機関： 国際寄託機関、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
住所： 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
▲２▼寄託日： 原寄託日：２００２年８月６日
移管請求日：２００４年１月２７日（２００２年８月６日）に寄託されたＦＥＲＭ Ｐ−１８９６３号より移管）
▲３▼寄託番号： ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６００
このＴＫ−５７株の菌学的性状は以下の通りである。
１．ＴＫ−５７株の菌学的性状
（１）コロニーの性状
ツァペック酵母エキス寒天培地上で生育は良好で、２５℃、１０日間の培養でコロニーの直径は７５〜７８ｍｍに達する。 白色〜淡黄白色、綿毛状、平坦、やや密な菌糸層からなり、分生子を疎らに形成する。裏面は黄白色となる。酵母エキス寒天培地上で生育は良好で、２５℃、１０日間の培養でコロニーの直径は３５〜４２ｍｍに達する。白色、綿毛状、平坦、やや密な菌糸層からなり、分生子を疎らに形成する。裏面は黄土色となる。ポテトデキストロース寒天培地上で生育は良好で、２５℃、１０日間の培養でコロニーの直径は４０〜４２ｍｍに達する。黄白色、綿毛状、平坦、密な菌糸層からなり、分生子を豊富に形成する。コロニー表面に透明の抽出液を生じる。裏面は黄白色となる。３７℃の培養では、どの培地上でも生育しない。
（２）形態的性状
菌糸は一部束状になる。フィアライドはアンプル形もしくは細い円筒形、菌糸の側面から単生し、先端が彎曲する場合がある。分生子は、長円形〜円筒形、滑面、大きさ８〜１２×４〜６μｍである。
以上の菌学的性状よりＴＫ−５７株を、イサリア属に属すると同定した。なお、ＴＫ−５７株は、他の糸状菌と同様に、その性状が変化することがある。したがって、例えばＴＫ−５７株に由来する突然変異株、形質接合体または遺伝子組換え体であっても、ＴＫ−５７−１６４Ａ物質およびＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を生産するものは全て本発明に使用できる。なお、本発明で用いられるＴＫ−５７−１６４Ａ物質およびＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌は、これらの微生物に限定されるものではない。ＴＫ−５７−１６４Ａ物質およびＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を生産する能力を有している菌であればＴＫ−５７−１６４Ａ物質およびＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌としていずれを用いてもよい。
１．ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌の培養法
イサリア属であるＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌は、通常の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養する。栄養源としては、炭素源としては例えば、グルコース、水飴、デキストリン、澱粉、糖蜜、動・植物油などを使用でき、窒素源としては例えば、大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティーブ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などを使用でき、その他必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成し得る無機塩類を添加することができる。また菌の生育を助け、ＴＫ−５７−１６４Ａ物質の生産を促進するような有機物・無機物を適当に添加することができる。
培養方法としては、好気的条件で、２０〜３０℃が最適である。１５〜２３日間程度の培養で、培養を停止し、培養物から目的物質の単離精製を行う。
２．ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の精製法
ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質は、その理化学的性状を利用して、通常の分離手段、例えば、溶媒抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲルろ過法、透析法、沈殿法などを、単独であるいは適宜組み合わせて精製することができる。例えば、ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質は、培養菌体からアセトン−水、アセトン、メタノール、酢酸エチルなどで抽出される。ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を精製するには、シリカゲルやＯＤＳ系修飾シリカゲルを用いた吸着・分配クロマトを用いることができる。
本発明のＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質は各種の植物病害菌に対して優れた防除効果を示し、農園芸用殺菌剤として利用することができる。
その代表例は、ウリ類うどんこ病、べと病、たんそ病、灰色かび病、コムギ赤さび病、麦類うどんこ病、イネいもち病などである。
本発明化合物であるＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を、農園芸用殺菌剤の有効成分として用いる場合は、そのまま用いても良いが、通常は適当な固体担体、液体担体、ガス状担体、界面活性剤、分散剤その他の製剤用補助剤と混合して乳剤、液剤、懸濁剤、水和剤、粉剤、粒剤、錠剤、油剤、エアゾール、フロワブル剤等の任意の剤型にして使用する。
固体担体としては、例えばタルク、ベンナイト、クレー、カオリン、ケイソウ土、バーミキュライト、ホワイトカーボン、炭酸カルシウム等があげられる。
液体担体としては、例えばメタノール、ｎ−ヘキサノール、エチレングリコール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類、ｎ−ヘキサン、ケロシン、灯油等の脂肪族炭化水素類、トルエン、キシレン、メチルナフタレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、酢酸エチル等のエステル類、アセトニトリル、イソブチロニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の酸アミド類、ダイズ油、綿実油等の植物油類、ジメチルスルホキシド、水等があげられる。また、ガス担体としてはＬＰＧ、空気、窒素、炭酸ガス、ジメチルエーテル等があげられる。
乳化、分散、展着等のための界面活性剤、分散剤としては、例えばアルキル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩類、アリールスルホン酸塩類、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類、ポリオキシアルキレンアリールエーテル類、多価アルコールエステル類、リグニンスルホン酸塩等が用いられる。
更に、製剤の性状を改善するための補助剤としては、例えばカルボキシメチルセルロース、アラビアガム、ポリエチレングリコール、ステアリン酸カルシウム等が用いられる。
上記の担体、界面活性剤、分散剤、及び補助剤は、必要に応じて各々単独で、あるいは組み合わせて用いられる。
これらの製剤中の有効成分の含有量は、乳剤で通常１−７５重量％、粉剤では通常０．３−２５重量％、水和剤では通常１−９０重量％、粒剤では通常０．５−１０重量％が適当である。
これらの製剤は、そのまま用いても良いが、場合によっては希釈して用いる。また、これらの製剤は他の殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、除草剤、植物成長調節剤、肥料等と混合して用いることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明の製造例、試験例を示すが、本発明はこれらの例示のみに限定されるものではない。
【実施例１】
１００ｍｌ容量の大試験管に１０８液体培地（グルコース１．０％，スターチ２．０％，ペプトン０．５％，イーストエキス０．５％，炭酸カルシウム０．４％，ｐＨ７．０）１０ｍｌを分注し、オートクレーブにて滅菌処理（１２０℃ ３０分）を行った後、ＳＤＹ培地（グルコース２．０％，ペプトン１．０％，イーストエキス１．０％，寒天２．０％，ｐＨ６．０）のシャーレ上で生育させておいたＴＫ−５７の菌体を、カギ型白金耳にて１ｃｍ四方に切り取り培地に植菌した。２７℃の好気的環境で、３日間振盪培養（２００回転／分）して、第１種培養とした。
次に５００ｍｌ容量の三角フラスコに１０８液体培地１００ｍｌを分注し、滅菌処理（１２０℃３０分）の後、第１種培養液５ｍｌを植菌した。２７℃好気的環境で、３日間振盪培養（２００回転／分）して、第２種培養液とした。
５００ｍｌ容量の三角フラスコ７５本に生産培地（玄米３０％，イーストエキス０．０７％，酒石酸ナトリウム０．０３％，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０３％、ｐＨ無調整）を５０ｍｌ分注し、滅菌処理（１２０℃３０分）後、第２種培養液５ｍｌを植菌した。火炎滅菌したガラス棒でよくまぜ、２４℃２１日間静置培養を行った。生育状態は良好で、培地表面に純白の菌糸を形成した。
培養終了後、フラスコ１本につき水３０ｍｌを加えて全培養物を取り出し、これにアセトン１０Ｌを加えて３時間撹拌した後、抽出した。抽出液をセライトを用いて吸引ろ過し、濾液のアセトンを減圧下留去し、黄色を帯びた茶色の濃縮液を得た。
この濃縮液（ｐＨ５．７）を、等量の酢酸エチルで５回抽出し、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去して暗褐色の油状の培養抽出物８．２ｇを得た。
シリカゲル６０（７０−２３０ｍｅｓｈ、ＡＳＴＭ）１６０ｇをカラム管（６．６φ×７３ｃｍ）に充填し、培養抽出物を付し、クロロホルム−メタノール（６０：１〜４０：１）で活性物質の溶出を行った。さらにシリカゲルクロマト（シリカゲル６０、クロロホルム−メタノール（８０：１〜６０：１）に付し、粗精製物２６８ｍｇを得た。この粗精製物をＯＡＳＩＳ ＨＬＢ固相抽出カートリッジ（６ｇ／３５ｍｌＬＰ，粒径６０μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）に付し、メタノール−水（８０：２０）で溶出した画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（カラム；ｓｅｎｓｈｕｐａｋ ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ １０φ×２５０ｍｍ、溶出溶媒；アセトニトリル−０．０５％ＴＦＡ（５５：４５〜１００：０）、流速；１．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＵＶ２５４ｎｍ）、および（カラム；Ｗａｔｅｒｓ Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ １０φ×２５０ｍｍ、溶出溶媒；アセトニトリル−０．０５％ＴＦＡ（５２：４８）、流速；１．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＵＶ２５４ｎｍ）で溶出しＴＫ−５７−１６４Ａ物質を３．６ｍｇ得た。
また、メタノール−水（７０：３０）で溶出した画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（カラム；ｓｅｎｓｈｕｐａｋ ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ １０φ×２５０ｍｍ、溶出溶媒；アセトニトリル−０．０５％ＴＦＡ（５２：４８）、流速；１．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＵＶ２１０ｎｍ）で溶出しＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を３．１ｍｇ得た。
試験例
キュウリべと病（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）
培養土を入れたプラスチック製ポットに播種した後、１０日程度育苗し子葉が完全に展開したキュウリ苗（品種：四葉）を供試植物とした。ＴＫ−５７−１６４Ａ物質の６６７ｐｐｍに調整した薬液をスプレーガンを用いて３ポットあたり５ｍｌ散布処理し、風乾させた後、あらかじめべと病を発病させていたキュウリ葉より採集、調整した分生胞子懸濁液（１〜５×１０６個／ｍｌ）を均一に噴霧接種し、２１℃の湿室内に２４時間静置した。その後夜間１８℃、日中２２℃の人工気象室に移して発病させ、接種７日後に子葉での発病面積を調査し、下記に示す基準で指数を与え、下記の式によって発病度、防除価を算出した。
指数 ０：病斑なし
１：数個の病斑
２：発病面積が葉面積の１／４未満
３：発病面積が葉面積の１／４以上１／２未満
４：発病面積が葉面積の１／２以上３／４未満
５：発病面積が葉面積の３／４以上
発病度＝Σ（指数×該当株数）／（調査株数×５）×１００
防除価＝（１−処理区の発病度／無処理区の発病度）×１００
その結果、ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質はともに１００％の防除価を示した。
【産業上の利用可能性】
本発明のＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質は上記のように植物病害菌に対して優れた防除効果を示し、農園芸用殺菌剤としての利用が期待される。
【技術分野】
本発明はＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質、並びにそれらの製造法及びそれらの少なくとも１つを有効成分とする農園芸用殺菌剤に関する。
【背景技術】
従来、多くの農園芸用殺菌剤が知られているが、薬剤抵抗性や安全性などの問題から、より有効で安全に使える薬剤が必要とされている。果樹、野菜、穀類などに発生する、うどんこ病、べと病、たんそ病、さび病、いもち病などの植物病原菌に対してこれまで各種の薬剤が使用されているが、薬剤抵抗性などの問題からそれらの薬剤の使用が禁止されたり、あるいは制限されてきている。したがってこれらの分野では従来の薬剤とは異なる新規な薬剤の出現が課題となってきており、本発明はこれらを解決することを目的とするものである。本発明は微生物が生産する新規なＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質並びにそれらの製造法及びそれらの少なくとも１つを有効成分とする農園芸用殺菌剤を提供する。
【発明の開示】
農園芸用殺菌剤として利用できる新たな活性物質を、微生物の生産する培養物から探索したところ、本発明者らが新たに分離したＴＫ−５７株と命名したイサリア（Ｉｓａｒｉａ）属の子嚢菌の培養物中に植物病原菌に対し抗真菌活性を示す物質が生産されることを見出した。さらにこの抗真菌活性物質が下記の式（１）で表される化学構造を有することを見出し、新規な物質であることを確認して、本物質をＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質と命名した。
すなわち、本発明は下記の農園芸用殺菌活性物質ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を提供されるものである。
式（１）
Ｒ＝Ｅｔｈｙｌで示されるＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＲ＝Ｈで示されるＴＫ−５７−１６４Ｂ物質。
また、本発明は、イサリア（Ｉｓａｒｉａ）属に属するＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌を培養し、その培養物からＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を採取することを特徴とする上記に記載されているＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の製造法を提供するものである。
さらに、上記に記載されているＴＫ−５７−１６４Ａ物質およびＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の少なくとも１つを有効成分とする農園芸用殺菌剤およびイサリア（Ｉｓａｒｉａ）属に属する子嚢菌であって、上記のＴＫ−５７−１６４Ａ物質ならびにＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を生産する特性を有ＴＫ−５７株またはその変異株に関する。
＜発明の実施の態様＞
本発明の第１の要旨とするところは、前記の式（１）で表され、下記の理化学的性状を有するＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質にある。
１．ＴＫ−５７−１６４Ａ物質の理化学的性状
（１）色および形状 無色固体
（２）マススペクトル Ｍ／Ｚ ４１０．２５４６（Ｍ＋Ｈ）＋
（３）分子式 Ｃ２２Ｈ３５ＮＯ６
（４）比旋光度［α］Ｄ −２１．３°（ｃ０．１０，ＣＨＣｌ３，２５℃）
（５）紫外部吸収スペクトル λｍａｘ（ＭｅＯＨ） ２１３ｎｍ
（６）赤外部吸収スペクトル νｍａｘ（ＫＢｒ） ｃｍ−１
３４００，３３００，２９２４，２８５３，２３５９，２３４１，１７４２，１６８４，１６４９，１６３２，１５３３，１４６０，１３６９，１３４４，１２７３，１１９８，１１５５，１１０１，１０８４，１００１，９７４，９３４，９１６，８４５，８３５，８１２
（７）ＨＰＬＣ カラム；Ｗａｔｅｒｓ Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ １０φ×２５０ｍｍ、溶出溶媒；アセトニトリル−０．０５％ＴＦＡ（５２：４８）、流速；１．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＵＶ２５４ｎｍで保持時間４６．８４８分
（８）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル；δ（ｐｐｍ）（ＣＤＣＬ３、４００ＭＨｚ）
０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．２０−１．３１（１２Ｈ，ｍ），１．４４（２Ｈ，ｍ），２．０３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），２．１８（２Ｈ，ｍ），２．２１（１Ｈ，ｂｒｓ），２．４９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ１＝１２．７Ｈｚ，Ｊ２＝４．９Ｈｚ，Ｊ３＝１．７Ｈｚ），３．１５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ１＝７．６Ｈｚ，Ｊ２＝３．４Ｈｚ，Ｊ３＝１．５Ｈｚ），３．５０（３Ｈ，ｓ），３．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝３．６Ｈｚ，Ｊ２＝１．５Ｈｚ），３．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝３．６Ｈｚ，Ｊ２＝１．２Ｈｚ），３．７４（１Ｈ，ｂｒｓ），３．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝７．６Ｈｚ，Ｊ２＝１．２Ｈｚ），４．５０（１Ｈ，ｂｒｓ），４．８０（１Ｈ，ｍ），５．７７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ１＝１５．１Ｈｚ，Ｊ２＝１．５Ｈｚ），５．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．８９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ１＝１５．１Ｈｚ，Ｊ２＝７．１Ｈｚ）
（９）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル；δ（ｐｐｍ）（ＣＤＣＬ３、１００ＭＨｚ）
１４．１（ｑ），２２．７（ｔ），２８．２（ｔ），２９．２−２９．７（４Ｃ，ｔ），３１．９（ｔ），３２．１（ｔ），３７．８（ｔ），４６．０（ｄ），５５．０（ｄ），５５．１（ｄ），５８．７（ｑ），６３．７（ｄ），７２．３（ｄ），７５．８（ｓ），７７．３（ｄ），１２２．９（ｄ），１４６．３（ｄ），１６５．４（ｓ），２０７．６（ｓ）
２．ＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の理化学的性状
（１）色および形状 無色固体
（２）マススペクトル Ｍ／Ｚ ３８２．２２２７（Ｍ＋Ｈ）＋
（３）分子式 Ｃ２０Ｈ３１ＮＯ６
（４）比旋光度［α］Ｄ −１５．５°（ｃ０．１９，ＣＨＣｌ３，２５℃）
（５）紫外部吸収スペクトル λｍａｘ（ＭｅＯＨ） ２１３ｎｍ
（６）赤外部吸収スペクトル νｍａｘ（ＫＢｒ） ｃｍ−１
３４０２，３２９６，２９２６，２８５５，２３５９，２３４１，１７４２，１６８４，１６５１，１６３１，１５３１，１４５６，１３７１，１３４２，１２７３，１１９６，１１５５，１１０１，１０８４，１００１，９７４，９３４，９１６，８４５，８３３，８１２
（７）ＨＰＬＣ カラム；Ｓｅｎｓｈｕｐａｋ ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ １０φ×２５０ｍｍ、溶出溶媒；アセトニトリル−０．０５％ＴＦＡ（５２：４８）、流速；１．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＵＶ２１０ｎｍで保持時間１７．５３１分
（８）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル；δ（ｐｐｍ）（ＣＤＣＬ３、４００ＭＨｚ）
０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．２８（８Ｈ，ｍ），１．４３（２Ｈ，ｍ），２．０３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），２．１８（２Ｈ，ｍ），２．２１（１Ｈ，ｂｒｓ），２．４９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ１＝１２．７Ｈｚ，Ｊ２＝３．４Ｈｚ，Ｊ３＝１．９Ｈｚ），３．１５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ１＝７．８Ｈｚ，Ｊ２＝３．４Ｈｚ，Ｊ３＝１．９Ｈｚ），３．４９（３Ｈ，ｓ），３．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝３．９Ｈｚ，Ｊ２＝１．５Ｈｚ），３．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝３．９Ｈｚ，Ｊ２＝１．５Ｈｚ），３．７４（１Ｈ，ｂｒｓ），３．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝７．８Ｈｚ，Ｊ２＝１．５Ｈｚ），４．５０（１Ｈ，ｂｒｓ），４．８０（１Ｈ，ｍ），５．７７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ１＝１５．１Ｈｚ，Ｊ２＝１．５Ｈｚ），５．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．８９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ１＝１５．１Ｈｚ，Ｊ２＝７．１Ｈｚ）
（９）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル；δ（ｐｐｍ）（ＣＤＣＬ３、１００ＭＨｚ）
１４．１（ｑ），２２．６（ｔ），２８．２（ｔ），２９．１（２Ｃ，ｔ），３１．７（ｔ），３２．１（ｔ），３７．８（ｔ），４６．０（ｄ），５５．０（ｄ），５５．１（ｄ），５８．６（ｑ），６３．７（ｄ），７２．３（ｄ），７５．８（ｓ），７７．３（ｄ），１２２．９（ｄ），１４６．３（ｄ），１６５．４（ｓ），２０７．６（ｓ）
本発明の第２の要旨とするところは、イサリア属に属するＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌を培養し、その培養物からＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を採取することを特徴とする、ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の製造法である。
本発明に使用されるＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌の一例としては、本発明者らにより新たに分離され、以下のように独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６００として国際寄託されているイサリア属ＴＫ−５７株が挙げられる。
▲１▼寄託機関： 国際寄託機関、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
住所： 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
▲２▼寄託日： 原寄託日：２００２年８月６日
移管請求日：２００４年１月２７日（２００２年８月６日）に寄託されたＦＥＲＭ Ｐ−１８９６３号より移管）
▲３▼寄託番号： ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６００
このＴＫ−５７株の菌学的性状は以下の通りである。
１．ＴＫ−５７株の菌学的性状
（１）コロニーの性状
ツァペック酵母エキス寒天培地上で生育は良好で、２５℃、１０日間の培養でコロニーの直径は７５〜７８ｍｍに達する。 白色〜淡黄白色、綿毛状、平坦、やや密な菌糸層からなり、分生子を疎らに形成する。裏面は黄白色となる。酵母エキス寒天培地上で生育は良好で、２５℃、１０日間の培養でコロニーの直径は３５〜４２ｍｍに達する。白色、綿毛状、平坦、やや密な菌糸層からなり、分生子を疎らに形成する。裏面は黄土色となる。ポテトデキストロース寒天培地上で生育は良好で、２５℃、１０日間の培養でコロニーの直径は４０〜４２ｍｍに達する。黄白色、綿毛状、平坦、密な菌糸層からなり、分生子を豊富に形成する。コロニー表面に透明の抽出液を生じる。裏面は黄白色となる。３７℃の培養では、どの培地上でも生育しない。
（２）形態的性状
菌糸は一部束状になる。フィアライドはアンプル形もしくは細い円筒形、菌糸の側面から単生し、先端が彎曲する場合がある。分生子は、長円形〜円筒形、滑面、大きさ８〜１２×４〜６μｍである。
以上の菌学的性状よりＴＫ−５７株を、イサリア属に属すると同定した。なお、ＴＫ−５７株は、他の糸状菌と同様に、その性状が変化することがある。したがって、例えばＴＫ−５７株に由来する突然変異株、形質接合体または遺伝子組換え体であっても、ＴＫ−５７−１６４Ａ物質およびＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を生産するものは全て本発明に使用できる。なお、本発明で用いられるＴＫ−５７−１６４Ａ物質およびＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌は、これらの微生物に限定されるものではない。ＴＫ−５７−１６４Ａ物質およびＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を生産する能力を有している菌であればＴＫ−５７−１６４Ａ物質およびＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌としていずれを用いてもよい。
１．ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌の培養法
イサリア属であるＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌は、通常の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養する。栄養源としては、炭素源としては例えば、グルコース、水飴、デキストリン、澱粉、糖蜜、動・植物油などを使用でき、窒素源としては例えば、大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティーブ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などを使用でき、その他必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成し得る無機塩類を添加することができる。また菌の生育を助け、ＴＫ−５７−１６４Ａ物質の生産を促進するような有機物・無機物を適当に添加することができる。
培養方法としては、好気的条件で、２０〜３０℃が最適である。１５〜２３日間程度の培養で、培養を停止し、培養物から目的物質の単離精製を行う。
２．ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の精製法
ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質は、その理化学的性状を利用して、通常の分離手段、例えば、溶媒抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲルろ過法、透析法、沈殿法などを、単独であるいは適宜組み合わせて精製することができる。例えば、ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質は、培養菌体からアセトン−水、アセトン、メタノール、酢酸エチルなどで抽出される。ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を精製するには、シリカゲルやＯＤＳ系修飾シリカゲルを用いた吸着・分配クロマトを用いることができる。
本発明のＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質は各種の植物病害菌に対して優れた防除効果を示し、農園芸用殺菌剤として利用することができる。
その代表例は、ウリ類うどんこ病、べと病、たんそ病、灰色かび病、コムギ赤さび病、麦類うどんこ病、イネいもち病などである。
本発明化合物であるＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を、農園芸用殺菌剤の有効成分として用いる場合は、そのまま用いても良いが、通常は適当な固体担体、液体担体、ガス状担体、界面活性剤、分散剤その他の製剤用補助剤と混合して乳剤、液剤、懸濁剤、水和剤、粉剤、粒剤、錠剤、油剤、エアゾール、フロワブル剤等の任意の剤型にして使用する。
固体担体としては、例えばタルク、ベンナイト、クレー、カオリン、ケイソウ土、バーミキュライト、ホワイトカーボン、炭酸カルシウム等があげられる。
液体担体としては、例えばメタノール、ｎ−ヘキサノール、エチレングリコール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類、ｎ−ヘキサン、ケロシン、灯油等の脂肪族炭化水素類、トルエン、キシレン、メチルナフタレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、酢酸エチル等のエステル類、アセトニトリル、イソブチロニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の酸アミド類、ダイズ油、綿実油等の植物油類、ジメチルスルホキシド、水等があげられる。また、ガス担体としてはＬＰＧ、空気、窒素、炭酸ガス、ジメチルエーテル等があげられる。
乳化、分散、展着等のための界面活性剤、分散剤としては、例えばアルキル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩類、アリールスルホン酸塩類、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類、ポリオキシアルキレンアリールエーテル類、多価アルコールエステル類、リグニンスルホン酸塩等が用いられる。
更に、製剤の性状を改善するための補助剤としては、例えばカルボキシメチルセルロース、アラビアガム、ポリエチレングリコール、ステアリン酸カルシウム等が用いられる。
上記の担体、界面活性剤、分散剤、及び補助剤は、必要に応じて各々単独で、あるいは組み合わせて用いられる。
これらの製剤中の有効成分の含有量は、乳剤で通常１−７５重量％、粉剤では通常０．３−２５重量％、水和剤では通常１−９０重量％、粒剤では通常０．５−１０重量％が適当である。
これらの製剤は、そのまま用いても良いが、場合によっては希釈して用いる。また、これらの製剤は他の殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、除草剤、植物成長調節剤、肥料等と混合して用いることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明の製造例、試験例を示すが、本発明はこれらの例示のみに限定されるものではない。
【実施例１】
１００ｍｌ容量の大試験管に１０８液体培地（グルコース１．０％，スターチ２．０％，ペプトン０．５％，イーストエキス０．５％，炭酸カルシウム０．４％，ｐＨ７．０）１０ｍｌを分注し、オートクレーブにて滅菌処理（１２０℃ ３０分）を行った後、ＳＤＹ培地（グルコース２．０％，ペプトン１．０％，イーストエキス１．０％，寒天２．０％，ｐＨ６．０）のシャーレ上で生育させておいたＴＫ−５７の菌体を、カギ型白金耳にて１ｃｍ四方に切り取り培地に植菌した。２７℃の好気的環境で、３日間振盪培養（２００回転／分）して、第１種培養とした。
次に５００ｍｌ容量の三角フラスコに１０８液体培地１００ｍｌを分注し、滅菌処理（１２０℃３０分）の後、第１種培養液５ｍｌを植菌した。２７℃好気的環境で、３日間振盪培養（２００回転／分）して、第２種培養液とした。
５００ｍｌ容量の三角フラスコ７５本に生産培地（玄米３０％，イーストエキス０．０７％，酒石酸ナトリウム０．０３％，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０３％、ｐＨ無調整）を５０ｍｌ分注し、滅菌処理（１２０℃３０分）後、第２種培養液５ｍｌを植菌した。火炎滅菌したガラス棒でよくまぜ、２４℃２１日間静置培養を行った。生育状態は良好で、培地表面に純白の菌糸を形成した。
培養終了後、フラスコ１本につき水３０ｍｌを加えて全培養物を取り出し、これにアセトン１０Ｌを加えて３時間撹拌した後、抽出した。抽出液をセライトを用いて吸引ろ過し、濾液のアセトンを減圧下留去し、黄色を帯びた茶色の濃縮液を得た。
この濃縮液（ｐＨ５．７）を、等量の酢酸エチルで５回抽出し、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去して暗褐色の油状の培養抽出物８．２ｇを得た。
シリカゲル６０（７０−２３０ｍｅｓｈ、ＡＳＴＭ）１６０ｇをカラム管（６．６φ×７３ｃｍ）に充填し、培養抽出物を付し、クロロホルム−メタノール（６０：１〜４０：１）で活性物質の溶出を行った。さらにシリカゲルクロマト（シリカゲル６０、クロロホルム−メタノール（８０：１〜６０：１）に付し、粗精製物２６８ｍｇを得た。この粗精製物をＯＡＳＩＳ ＨＬＢ固相抽出カートリッジ（６ｇ／３５ｍｌＬＰ，粒径６０μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）に付し、メタノール−水（８０：２０）で溶出した画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（カラム；ｓｅｎｓｈｕｐａｋ ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ １０φ×２５０ｍｍ、溶出溶媒；アセトニトリル−０．０５％ＴＦＡ（５５：４５〜１００：０）、流速；１．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＵＶ２５４ｎｍ）、および（カラム；Ｗａｔｅｒｓ Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ １０φ×２５０ｍｍ、溶出溶媒；アセトニトリル−０．０５％ＴＦＡ（５２：４８）、流速；１．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＵＶ２５４ｎｍ）で溶出しＴＫ−５７−１６４Ａ物質を３．６ｍｇ得た。
また、メタノール−水（７０：３０）で溶出した画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（カラム；ｓｅｎｓｈｕｐａｋ ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ １０φ×２５０ｍｍ、溶出溶媒；アセトニトリル−０．０５％ＴＦＡ（５２：４８）、流速；１．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＵＶ２１０ｎｍ）で溶出しＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を３．１ｍｇ得た。
試験例
キュウリべと病（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）
培養土を入れたプラスチック製ポットに播種した後、１０日程度育苗し子葉が完全に展開したキュウリ苗（品種：四葉）を供試植物とした。ＴＫ−５７−１６４Ａ物質の６６７ｐｐｍに調整した薬液をスプレーガンを用いて３ポットあたり５ｍｌ散布処理し、風乾させた後、あらかじめべと病を発病させていたキュウリ葉より採集、調整した分生胞子懸濁液（１〜５×１０６個／ｍｌ）を均一に噴霧接種し、２１℃の湿室内に２４時間静置した。その後夜間１８℃、日中２２℃の人工気象室に移して発病させ、接種７日後に子葉での発病面積を調査し、下記に示す基準で指数を与え、下記の式によって発病度、防除価を算出した。
指数 ０：病斑なし
１：数個の病斑
２：発病面積が葉面積の１／４未満
３：発病面積が葉面積の１／４以上１／２未満
４：発病面積が葉面積の１／２以上３／４未満
５：発病面積が葉面積の３／４以上
発病度＝Σ（指数×該当株数）／（調査株数×５）×１００
防除価＝（１−処理区の発病度／無処理区の発病度）×１００
その結果、ＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質はともに１００％の防除価を示した。
【産業上の利用可能性】
本発明のＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質は上記のように植物病害菌に対して優れた防除効果を示し、農園芸用殺菌剤としての利用が期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
Ｒ＝Ｅｔｈｙｌで示されるＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＲ＝Ｈで示されるＴＫ−５７−１６４Ｂ物質。
【請求項２】
イサリア（Ｉｓａｒｉａ）属に属するＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌を培養し、その培養物からＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を採取することを特徴とする請求項１記載のＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の製造法。
【請求項３】
請求項１記載のＴＫ−５７−１６４Ａ物質、あるいはＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の少なくとも１つを有効成分とする農園芸用殺菌剤。
【請求項４】
イサリア（Ｉｓａｒｉａ）属に属する子嚢菌であって、請求項１記載のＴＫ−５７−１６４Ａ物質ならびにＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を生産する特性を有し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６００の受託番号で寄託されているＴＫ−５７株またはその変異株。
【請求項１】
式（１）
Ｒ＝Ｅｔｈｙｌで示されるＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＲ＝Ｈで示されるＴＫ−５７−１６４Ｂ物質。
【請求項２】
イサリア（Ｉｓａｒｉａ）属に属するＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質生産菌を培養し、その培養物からＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を採取することを特徴とする請求項１記載のＴＫ−５７−１６４Ａ物質及びＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の製造法。
【請求項３】
請求項１記載のＴＫ−５７−１６４Ａ物質、あるいはＴＫ−５７−１６４Ｂ物質の少なくとも１つを有効成分とする農園芸用殺菌剤。
【請求項４】
イサリア（Ｉｓａｒｉａ）属に属する子嚢菌であって、請求項１記載のＴＫ−５７−１６４Ａ物質ならびにＴＫ−５７−１６４Ｂ物質を生産する特性を有し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６００の受託番号で寄託されているＴＫ−５７株またはその変異株。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４２６９
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０２７５５（Ｐ２００５−５０２７５５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１８６２
【国際出願日】平成１６年２月１９日（２００４．２．１９）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【出願人】（５９４１６４５６４）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１８６２
【国際出願日】平成１６年２月１９日（２００４．２．１９）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【出願人】（５９４１６４５６４）
【Ｆターム（参考）】
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