本発明は、遺伝子型の検査及び分析の際に、敏感度、特異度及び正確度を改善して診断に広く使われることができる、一つの本体内に２個のプローブ部位を有するＹ字型ヌクレオチドプローブ及びこれを利用したＤＮＡマイクロアレイ、キット及び遺伝子分析方法に関する。本発明のＹ字型プローブの構造は、左側プローブ部分、左側幹部分、リンカー(ｌｉｎｋｅｒ)、右側幹部分、右側プローブ部分の５種の部位からなる。本発明のＤＮＡマイクロアレイは、同一遺伝子を同時に重複検索するか相異である２個の標的遺伝子を同時に検索することで、検査の正確度を高めることができる。特に、標的遺伝子と対照遺伝子を一つのスポット(ｓｐｏｔ)で同時に検索することで、分析時のエラーを減らすことができ、定量的な分析が可能であり、標準化が容易である。本発明のＹ字型プローブは遺伝子型分析と遺伝子発現分析、突然変異やＳＮＰ分析に利用可能であり、疾病診断と予測、治療方針決定など遺伝子診断に広く使われることができる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つの本体に２個のプローブ部位を有すること
を特徴とするＹ字型のヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
前記プローブは、５’→３'の方向に、そして左側上方から右側上方への方向に順に、(１)左側プローブ部位、(２)左側幹部位、(３)リンカー部位、(４)右側幹部位及び、(５)右側プローブ部位からなること
を特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
請求項２によるプローブの、(１)左側プローブ部位は除去され、(２)左側幹部位、(３)リンカー部位、(４)右側幹部位及び、(５)右側プローブ部位からなること
を特徴とするｄ字型のヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
請求項２によるプローブの、(５)右側プローブ部位は除去され、(１)左側プローブ部位、(２)左側幹部位、(３)リンカー部位及び、(４)右側幹部位からなること
を特徴とするｂ字型のヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
前記左側幹部位と右側幹部位は、お互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで結合した構造であり、前記左側幹部位または右側幹部位は、各々に対する全体の塩基配列のうちＧ塩基が半分以上含まれること
を特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項６】
前記左側幹部位と右側幹部位は、お互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで結合した構造であり、幹部位の塩基配列がテロメアの塩基配列を含むこと
を特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項７】
前記左側幹部位または右側幹部位は、下記の塩基単位体からなる群より選択される塩基単位体が１回以上繰り返してなること
を特徴とする請求項５に記載のプローブ。
ＴＴＧＧＧ、
ＴＡＧＧＧ、
ＴＴＧＧＧＧ、
ＴＴＴＧＧＧ、
ＴＴＡＧＧＧ、
ＴＴＴＧＧＧＧ、
ＴＴＴＡＧＧＧ、
ＴＴＴＴＧＧＧＧ、
ＴＴＴＡＧＧＧＧ。
【請求項８】
前記左側プロブ部位または右側プロブ部位は、標的遺伝子に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであること
を特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項９】
前記左側プロブ部位または右側プロブ部位は、１５個乃至１５０個の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであること
を特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記左側プローブ部位は、上方から下方への塩基配列が５’→３'の手順に配列され、前記右側プローブ部位は、下方から上方への塩基配列が５’→３'の手順に配列されること
を特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記リンカー部位は、アルデヒドコーディングされた固体支持体に結合するために、アミノ変形ジデオキシチミジンとしてＣ６ｄＴ、Ｃ３ｄＴ、Ｃ１２ｄＴまたはＣ１８ｄＴで構成されること
を特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記プローブは、ペプチド核酸(ＰＮＡ)からなること
を特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１３】
前記プローブは、１)脱トリチル段階(ｄｅｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ)、２)カップリング段階(ｃｏｕｐｌｉｎｇ)、３)キャッピング段階(ｃａｐｐｉｎｇ)及び、４)酸化段階(ｏｘｉｄａｔｉｏｎ)を含む合成方法により製造されること
を特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１４】
前記左側プローブ部位と右側プローブ部位は、一つの標的遺伝子内の２個の相違である部位に対して各々相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなること
を特徴とする請求項１又は請求項２に記載のプローブ。
【請求項１５】
前記左側プローブ部位と右側プローブ部位は、各々一つの標的遺伝子内の同一な部位に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなること
を特徴とする請求項１又は請求項２に記載のプローブ。
【請求項１６】
前記左側プローブ部位と右側プローブ部位は、相違である標的遺伝子に対して各々相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなること
を特徴とする請求項１又は請求項２に記載のプローブ。
【請求項１７】
前記左側プローブ部位と右側プローブ部位の中で、一方のプローブ部位は、標的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、残り一方のプローブ部位は、対照遺伝子に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなること
を特徴とする請求項１又は請求項２に記載のプローブ。
【請求項１８】
本発明の前記対照遺伝子は、標的遺伝子と相補性がなく、検体で存在または発現されないこと
を特徴とする請求項１７に記載のプローブ。
【請求項１９】
前記対照遺伝子は、大膓菌のｍｏｔＤ遺伝子であること
を特徴とする請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２０】
前記プローブは、配列番号５乃至５０中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであること
を特徴とする請求項１又は請求項２に記載のプローブ。
【請求項２１】
請求項１乃至請求項４のいずれか１項のプローブが固型支持体に集積(ｓｐｏｔｔｉｎｇ)されてなること
を特徴とするＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２２】
前記固型支持体は、スライドガラス、ビーズ、マイクロプレートウェル、シリコーンウェハ及びナイロンメンブレンからなる群より選択されること
を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２３】
前記ＤＮＡマイクロアレイは、ヒトベータグロビン遺伝子がさらに集積されていること
を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２４】
前記プローブの集積部位としてウェル(ｗｅｌｌ)が８個に区画されていること
を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２５】
前記プローブは、配列番号５乃至５０の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、ＨＰＶの探知及び遺伝子型分析用であること
を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２６】
前記プローブは、５’末端がＣｙ５で標識された配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、５’末端がＣｙ３で標識された配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、相補的に結合すること
を特徴とする請求項２５に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２７】
前記プローブは、配列番号５１乃至５５の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、性感染疾患(ＳＴＤ)の原因菌として、各々淋菌(ＮＧ)、クラミジアトラコマチス(ＣＴ)、ヘルペスシンプレックスウイルス(ＨＳＶ)、トレポネマパリダム(ＴＰ)及びヘモフィルスデュクレイ(ＨＤ)の探知及び遺伝子型分析用であること
を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２８】
前記プローブは、配列番号５６乃至１９９の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、インフルエンザＡ型ウイルスの探知及び遺伝子型分析用であること
を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２９】
前記プローブは、配列番号２１２乃至２１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、上皮細胞成長因子受容体(ＥＧＦＲ)とβ−アクチン遺伝子の発現分析用であること
を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３０】
前記プローブは、左側プローブ部位と右側プローブ部位の中でいずれの一方が標的核酸のセンスストランドの単一ヌクレオチド多形成(ＳＮＰ)部位に対して相補的なオリゴヌクレオチドからなり、残りの一方が標的核酸のアンチセンスストランドのＳＮＰ部位がない部位に対して相補的なオリゴヌクレオチドからなり、ＳＮＰ分析用であること
を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３１】
前記プローブは、配列番号２２０乃至２３９の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、ＡＣＥ、ＡＤＲＢ２、Ａｐｏ Ｅ、ＣＥＴＰ、ＣＦＨ、ＥＳＲ１、ＩＬ１Ａ、ＭＴＨＦＲまたはＮＯＳ３遺伝子のＳＮＰ分析用であること
を特徴とする請求項３０に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３２】
前記プローブは、配列番号２５８乃至２７２の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異分析用であると
を特徴とする請求項２１に記載の ＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３３】
前記ｄ字型プローブは、右側プローブ部位がＡ、Ｃ、ＧまたはＴの点突然変異に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、この時、点突然変異に相補的な塩基を右側プローブ部位の中心部位に位置させて、右側プローブ部位の長さは、１５乃至３０ｂｐであり、点突然変異分析用であること
を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３４】
請求項２１の前記ＤＮＡマイクロアレイ、検体の標的遺伝子に対するＰＣＲ反応用プライマーセットとバッファー及び、ハイブリダイゼーション反応用バッファーを含むこと
を特徴とする検体の遺伝子分析用キット。
【請求項３５】
前記ＰＣＲ反応用プライマーセットは、インフルエンザウイルスＡ型ウイルスの遺伝子増幅用として、配列番号２０８乃至２１１の中で選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであること
を特徴とする請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
本発明の前記ＰＣＲ反応用プライマーセットは、β-アクチンとＥＧＦＲ遺伝子の定量型リアルタイムＰＣＲ用として、各々配列番号２１４及び２１５、配列番号２１７及び２１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオデドであること
を特徴とする請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
前記ＣＲ反応用プライマーセットは、ＳＮＰ検出用として、配列番号２４０乃至２５７の中で２個以上選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであること
を特徴とする請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
前記キットは、疾病の診断、予防、予測またはオーダーメイド治療用であること
を特徴とする請求項３４に記載のキット。
【請求項３９】
請求項２１のＤＮＡマイクロアレイ上に、標識物質で標識された検体の標的核酸を乗せて、前記プローブと標的核酸をハイブリダイゼーションさせる段階を含むこと
を特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項４０】
前記標識物質は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５３２、Ａｌｅｘａ ５４６、Ａｌｅｘａ ５６８、Ａｌｅｘａ ５９４、Ａｌｅｘａ ６６０、ロダミン(Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ)、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒａｎｇｅ ｇｒｅｅｎ ４８８Ｘ、Ｏｒａｎｇｅ ｇｒｅｅｎ ５１４Ｘ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５、Ｂｏｄｉｐｙ ６３０/６５０、Ｂｏｄｉｐｙ ６５０/６６５、Ｃａｌｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５４６、Ｃａｌｆｌｕｏｒ ｒｅｄ ６１０、Ｑｕａｓａｒ ６７０及びビオチンからなる群より一つ以上選択されること
を特徴とする請求項３９に記載の遺伝子分析方法。
【請求項４１】
前記標的核酸は、ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲまたは試験管内転写(ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ)方法を利用して標識物質で標識されること
を特徴とする請求項３９に記載の遺伝子分析方法。
【請求項４２】
前記ハイブリダイゼーション反応後に蛍光スキャナを利用して標識物質のシグナルを分析し、標的核酸の発現程度を調査する段階をさらに含むこと
を特徴とする請求項３９に記載の遺伝子分析方法。
【請求項４３】
前記シグナル分析は、正常化過程(ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ)を経て分析すること
を特徴とする請求項４２に記載の遺伝子分析方法 。
【請求項４４】
前記正常化過程は、各スポットでバックグラウンドのノイズシグナルを除外してＣｙ５とＣｙ３のシグナルを調査し、更にハウスキーピング遺伝子としてβ−アクチン遺伝子のＣｙ３シグナルと比較する３重の正常化過程であること
を特徴とする請求項４３に記載の遺伝子分析方法 。
【請求項４５】
前記標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡからなる群より選択されること
を特徴とする請求項３９に記載の遺伝子分析方法 。
【請求項４６】
前記ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＴを通じてＣｙ３で標識して、前記ｃＲＮＡは、試験管内転写を通じてＣｙ３で標識すること
を特徴とする請求項４５に記載の遺伝子分析方法 。
【請求項４７】
前記Ｃｙ３で標識されたｃＤＮＡまたはｃＲＮＡに、外部対照物質(ｅｘｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ)として大膓菌のｍｏｔＤ遺伝子をＣｙ５で標識したものを混合して得た混合物をハイブリダイゼーションすること
を特徴とする請求項４６に記載の遺伝子分析方法 。

【公表番号】特表２０１３−５２０１９５（Ｐ２０１３−５２０１９５Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５４８８６（Ｐ２０１２−５５４８８６）
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００１８７８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０５６５４
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５１２２２１３１５）グッドジーン　インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】